KR100319566B1 - 발효법에의한l-트레오닌의생산방법 - Google Patents

Abstract

에스케리챠 박테리아에서 기원한 아스파로토키나제 III을 암호화하고 이 암호화 도메인에 아스파르토키나제 III에 대한 리신에 의한 피이드백 억제를 해방시키는 돌연변이를 갖는 유전자를 함유하는 DNA, 이 DNA가 에스케리챠 박테리아에서 자가복제할 수 있는 벡터 DNA에 결합된 재조합 DNA, 상기 언급된 재조합 DNA의 세포로의 도입에 의해 형질전환된 에스케리챠속에 속하는 미생물, 및 발효배지에서 미생물을 배양하고 배양 배지에 L-트레오닌을 생산하고 축적시키고 상기 배양배지로부터 L-트레오닌을 수거함을 특징으로 하는 L-트레오닌을 생산하는 방법이 기술되어 있다.

리신에 기인한 피이드백 억제를 충분히 해방시키는 에스케리챠 박테리아-유도된 AK III 유전자가 수득된다. 이들 유전자의 트레오닌 생산 박테리아로의 도입은 선행 기술에 비해 트레오닌 생산면에서 훨씬 개선된 신규한 트레오닌-생산 박테리아를 초래한다. 이들 트레오닌-생산 박테리의 사용은 통상의 방법보다 훨씬 더 우수한, 발효법에 의한 L-트레오닌 생산 방법을 제공한다.

Description

발효법에 의한 L-트레오닌의 생산방법

과거에는, 천연 환경으로부터 분리된 세균 또는 이러한 세균의 인공 돌연변이체가 발효법에 의해 L-트레오닌을 생산하기 위한 미생물로서 사용되어 왔다. 많은 L-트레오닌-생성 인공 돌연변이체가 공지되어 있으며, 이들중 대부분은 α-아미노-β-하이드록시발레르산에 대해 내성이 있고 에스케리챠(Escherichia), 세라티아(Serratia), 브레비박테리움(Brevibacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속한다. 에스케리챠에 대하여는, 트레오닌 오페론을 함유하는 재조합 플라스미드에 의해 형질전환된 세균에 의해 L-트레오닌을 생산하는 방법이 JPA 55-131397, JPA 59-31691, JPA 56-15696 및 JPW 3-501682에 기술되어 있다.

또한, 지금까지 공지된 트레오닌-생성 세균중에서는 에스케리챠콜라이(Escherichia coli) BKIIM (VKPM) B-3996 균주가 가장 우수한 트레오닌 생산 수준 및 소비효율을 나타내었다(JPW 3-501682). 본 발명에 따르면, "소비 효율"은 트레오닌 1g을 생산하는데 요구되는 당의 g수를 의미한다. 상기 세균이 실험용 발효기에서 배양되는 경우, pH 센서로부터의 시그날에 반응하여 배양 배지에 당-암모니아를 가한 후, 최대 트레오닌 생합성도는 85g/l이고 소비 효율은 트레오닌 1g당 당 2g이다.

아스파르토키나제(이후로 AK로 약칭)는 아스파르트산을 β-포스포아스파르트산으로 전환시키는 효소이며 이것은 아스파르트산 및 이의 유도체 아미노산의 생합성 경로의 주 조절 부위이다. 제1도에 나타낸 바와 같이, 이.콜라이로 부터의 3개의 AK 유형(AKI, AK II, AK III)이 있으며, 이들중 앞쪽 2개는 호모세린 데하이드로게나제(이후로 때때로 HD로 약칭) 활성을 갖는 이작용성 효소이다. 이들중 하나는 thr A 유전자에 의해 암호화되는 AK I-HD I이고 나머지 하나는 metL (M) 유전자에 의해 암호화되는 AK II-HD II이다.

AK III만이 일작용성 효소이며 이것은 lys C로 명명되는 유전자의 생성물이며, 리신에 의해 억제 및 피이드백 억제되는 것으로 공지되어 있다. 한편, AK I은 트레오닌 및 이소루이신에 의해 공동 억제되고, 트레오닌에 의해 억제되는 반면, AK II는 메티오닌에 의한 억제된다. 이의 세포내 활성의 비는 AK I:AK II:AK III = 약 5:1:4이다.

이.콜라이의 lys C 유전자는 이미 클로닝되었으며 이의 염기 서열은 밝혀져 있다[참조: Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte. J.C., J. Biol.Chem., 261, 1052, 1986]. 또한 AK III 활성이 강화된 이.콜라이의 균주를 사용한 발효법에 의한 L-트레오닌의 생산은 문헌[Mizukami, T. et al., Agric. Biol. Chem., 50, 1015, 1986]에 기술되어 있다. 그러나, 미즈카미(Mizukami) 등에 의해 보고된 AK III에 대한 리신-의존적 피이드백의 충분한 해방은 아직 달성되지 않았다.

따라서, 본 발명의 주요 문제는 리신에 의한 피이드백 억제를 충분히 해방시켜 AK III를 수득하고, 선행 기술에 비해 훨씬 개선된 발효법에 의해 L-트레오닌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

(발명의 기술)

본 발명의 발명자들은 상기 문제를 극복하기 위해 수행한 결과로서 이.콜라이에서 AK III를 암호화하고 리신에 의한 피이드백 억제를 충분히 해방시키는 유전자(돌연변이체 lys C 또는 lys C^*)를 수득하는데에 성공했으며, 상기 유전자를 트레오닌-생성 세균내로 도입시킴으로써 L-트레오닌이 효과적으로 축적된다는 것을 밝혀냄으로써 본 발명을 완결했다.

달리는, 본 발명은 에스케리챠 세균에서 발견된 아스파르토키나제 III을 암호화하고, 암호화 영역중에 리신에 의한 상기 아스파르토키나제 III의 피이드백 억제를 해방시키는 돌연변이를 갖는 유전자를 함유하는 DNA에 관한 것이며, 구체적으로 본 발명은 리신에 의한 아스파르토키나제 III의 피이드백 억제를 해방시키는 돌연변이가, 예를 들어, 아스파르토키나제 III의 A 도메인 또는 B 도메인에 위치되어있는 상기 DNA에 관한 것이며, 더 구체적으로 본 발명은 리신에 의한 아스파르토키나제 III의 피이드백 억제를 해방시키는 돌연변이가, 하기 서열확인번호: 1을 참조로, 예를 들어, 323번 Gly이 Asp로 대체된 돌연변이; 323번 Gly이 Asp로 대체되고 408번 Gly이 Asp로 대체된 돌연변이; 34번 Arg가 Cys로 대체되고 323번 Gly이 Asp로 대체된 돌연변이; 325번 Leu이 Phe로 대체된 돌연변이; 318번 Met가 Ile로 대체된 돌연변이; 318번 Met가 Ile로 대체되고 349번 Val이 Met로 대체된 돌연변이; 345번 Ser이 Leu로 대체된 돌연변이; 347번 Val이 Met로 대체된 돌연변이; 325번 Thr이 Ile로 대체된 돌연변이; 352번 Thr이 Ile로 대체되고 369번 Ser이 Phe로 대체된 돌연변이; 164번 Glu이 Lys로 대체된 돌연변이; 및 417번 Met가 Ile로 대체되고 419번 Cys가 Tyr로 대체된 돌연변이로 이루어진 그룹 중에서 선택된 상기 DNA에 관한 것이다.

더우기, 본 발명은 에스케리챠 세균에서 자가 복제할 수 있는 벡터 DNA와 연결된 재조합 DNA인 상기 DNA에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 DNA를 세포내로 도입시킴으로써 형질전환된 에스케리챠 속에 속하는 미생물에 관한 것이다. 또한 상기 에스케리챠-유도된 아스파르토키나제 III을 암호화하고 암호화 영역중에 리신에 의한 상기 아스파르토키나제 III의 피이드백 억제를 해방시키는 돌연변이를 갖는 유전자를 함유하는 DNA를 염색체 DNA내로 도입시킴으로써 형질전환된 미생물도 본 발명의 영역내에 있다.

본 발명은 발효 배지에서 상기 미생물을 배양하여, 배양물중에서 L-트레오닌을 생산 및 축적하고 배양물로부터 L-트레오닌을 회수함을 특징으로 하여 L-트레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명이 이제 기술될 것이다.

AK III를 암호화하는 유전자(lys C)를 함유하는 DNA를 공급하는 공여체 세균으로서, 에스케리챠속에 속하는 모든 미생물이 사용될 수 있다. 구체적으로, 문헌[Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbioloygy, Washington, D.C., 1208, Table 1]에 기술되어 있다. 이의 예로는 이.콜라이 균주 JM109 및 MC1061이 포함된다.

야생형 균주가 AK III를 암호화하는 유전자(lys C)를 함유하는 DNA를 공급하기 위한 공여체 세균으로서 사용되는 경우, AK III 유전자의 야생형 유형을 함유하는 DNA가 수득될 수 있다. L-리신에 의한 피이드백 억제를 해방하는 AK III 유전자(lys C^*)를 수득하기 위해, 상기 유전자내로 돌연변이를 도입시키고자 하는 경우, DNA의 시험관내 돌연변이는 하이드록실아민으로 직접 처리함으로써 수행될 수 있다. 하이드록실아민은 시토신을 N⁴-하이드록시시토신으로 전환시켜 돌연변이 C→T를 유도하는 화학적 돌연변이 유발제이다.

또한, L-리신에 의한 피이드백 억제를 해방하는 AK III 유전자를 함유하는 DNA는, L-리신에 의한 AK III 활성의 피이드백 억제를 해방하는 돌연변이체를 DNA공여체 균주로서 사용하여 수득할 수 있다. 이 돌연변이체는 예를 들어, 돌연변이 처리를 위한 통상의 방법(예: 자외선에의 노출) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)과 같은 돌연변이 유발제로 처리한 세포로부터 수득될 수 있다.

이제, AK III를 암호화하는 유전자(lys C)를 함유하는 DNA의 제조에 관한 설명이 제공될 것이다. 우선, 야생형의 lys C를 갖는 이.콜라이, 예를 들어, MC1061 균주를 배양하여 배양된 세포를 수득한다. 상기 미생물의 배양은 통상의 고체 배양 방법에 의해 수행될 수 있지만, 액체 배양 방법이 세포 회수의 관점에서 배양을 위해 바람직하게 사용된다. 또한, 배양 배지는 하나 이상의 무기염, 예를 들어, 인산일칼륨(KH₂PO₃), 인산이칼륨(K₂HPO₃), 황산마그네슘, 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화제이철, 황산제이철 또는 황산망간을 하나 이상의 질소 공급원, 예를 들어 효모 추출물, 펩톤, 육류 추출물, 옥수수 침적액, 또는 콩 또는 밀의 유출물에 가한 다음, 필요한 경우 탄수화물, 비타민 등을 추가로 가함으로써 제조된 것일 수 있다. 배양 배지의 개시 pH는 적당하게 7 내지 8로 조정된다. 또한, 배양은 30 내지 42 ℃에서, 바람직하게는 약 37℃에서 4 내지 24시간 동안 침수된 배양물의 통기 및 교반, 진탕 배양 또는 정치 배양 등에 의해 수행된다. 상기 방법에 의해 수득된 배양 생성물을 이.콜라이 MC1061 균주의 세포를 수득하기 위해 예를 들어, 3000rpm에서 5분 동안 원심분리시킨다.

염색체 DNA는 예를 들어 사이토(Saito) 및 미우라(Miura)의 방법[참조: Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, 1963], 케이.에스.커비(K.S. Kirby)의 방법[참조: Biochem. J. 64, 405, 1956] 등에 의해 상기 세포로부터 수득될 수 있다.

lys C 유전자를 분리하기 위해, 상기 방법에 의해 수득된 염색체 DNA를 적당한 제한 효소를 사용하여 절단한다. 절단의 정도가 절단 반응 시간 등을 조절함으로써 조절되는 경우, 다양한 제한 효소가 사용될 수 있다. 그 다음에, 유전자를 에스케리챠 세균내에서 복제될 수 있는 벡터 DNA에 연결할 수 있으며, 생성된 재조합 DNA는 에스케리챠의 돌연변이 균주, 예를 들어 아스파르토키나제 I, II 및 III가 결핍된 GT3를 (유전자 라이브러리를 작제하기 위해) 형질전환시키는데 사용될 수 있으며, 생성된 형질전환체는 리신이 없는 최소 배양 배지상에서 생장할 수 있는 균주로 분리될 수 있으므로, lys C 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 분리할 수 있다.

구체적으로, 염색체 DNA를, 30℃ 이상에서, 바람직하게는 37℃에서 1 내지 10단위/ml의 효소 농도로 다양한 시간(1분 내지 2시간)동안 제한 효소, 예를 들어, Sau 3AI을 사용하여 분해하여, 완전 분해 또는 부분 분해함으로써 다양한 염색체 DNA 단편을 함유하는 혼합물을 수득할 수 있다. 에스케리챠 세균에서 복제할 수 있는 벡터 DNA는 제한 효소, 예를 들어 염색체 DNA를 절단하는데 사용된 제한효소 Sau3A와 동일한 말단 염기 서열을 생성하는 BamHI를 사용하여 30℃ 이상의 온도에서, 1 내지 100단위/ml의 효소 농도로 1시간 이상, 바람직하게는 1 내지 3시간 동안 분해시켜, 이를 완전히 분해시킴으로써 절단된 DNA가 수득된다. 그 다음에, 이.콜라이 MC 1061로부터 유도되고 상기 방식으로 제조된 lys C 유전자를 포함하는 DNA 단편을 함유하는 혼합물을 절단된 벡터 DNA와 혼합하고, DNA 리가제, 바람직하게는 T4 DNA 리가제를 4 내지 16℃의 온도에서 1 내지 100단위/ml의 효소 농도로 1시간 이상 동안, 바람직하게는 6 내지 24시간 동안 반응시켜 재조합 DNA를 수득한다.

본 발명에 따라 사용될 벡터 DNA는 바람직하게는 플라스미드 벡터 DNA, 예를들어, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF 1010 등이다. 또한, 파아지 DNA 벡터가 사용될 수 있다. 미생물에서 작용하는 프로모터, 예를 들어, lac, trp, PL 등이 원하는 목적에 유용한 유전자의 효율적 발현을 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "재조합 DNA"는 트랜스포손[참조: Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417, 1983], Mu 파아지[참조: Japanes Patent Application Disclosure HEI 2-109985] 또는 상동 재조합체[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1972]를 이용한 방법에 의해 상기 유전자를 염색체내로 도입시켜 수득된 DNA가 포함된다.

이러한 재조합 DNA가 예를 들어, 이.콜라이 K-12 균주, 및 바람직하게는 GT3 균주 등을 형질전환시키는데 사용된 후, lys C 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 갖는 균주가 AK 활성이 증가된 균주 또는 보충된 영양 요구성을 갖는 균주로부터 수득된다. 형질전환은 디.엠. 모리슨(D.M. Morrison) [참조: Methods in Enzymology, 68, 326, 1979]의 방법 또는 수용체 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 침투 정도를 증가시키는 방법[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, 1970]에 따라 수행될 수 있다. 그 다음에, lys C 유전자를 함유하는 DNA를 벡터 DNA내로 삽입시킴으로써 제조된 재조합 DNA는 상기 균주로부터, 예를 들어, 피. 게리(P. Guerry) 등의 방법[참조: J. Bacteriol., 116, 1064, 1973] 또는 디.비. 클레웰(D.B. Clewell)의 방법[참조: J. Bacteriol., 110, 667, 1972]에 따라 분리될 수 있다.

사실상, 세포 추출물 용액을 제조한 다음, 이로부터 아스파르토키나제 활성의 확인을 위한 조 효소 용액을 제조함으로써, 후보자 균주가 lys C를 갖는 재조합 DNA를 보유하는지를 확인할 수 있다. 아스파르토키나제의 효소 활성을 측정하는 방법은 스타트만(stadtman) 등의 방법[참조: Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras, G., and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033, 1961]에 따라 수행될 수 있다.

달리는, lys C 유전자는 사이토 및 미우라의 방법, PCR(폴리머라제 쇄 반응)[참조: White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185, 1989]에 의해 수득된 염색체 DNA로부터 lys C 유전자를 증폭시킴으로써 수득될 수 있다. 증폭을 위해 사용된 DNA 프라이머는 lys C 유전자의 전체 영역 또는 이의 단편을 함유하는 이본쇄 DNA의 3' 말단에 상보적인 것이다. lys C 유전자의 단지 일부를 증폭하고자 하는 경우, 유전자 라이브러리는 프라이머로서 DNA 단편을 사용하여 전체 영역을 함유하는 DNA 단편에 대해 스크리닝하여야 한다. 전체 영역을 증폭하고자 하는 경우, DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 적용시킨 후, 목적하는 밴드를 절단하여 lys C 유전자를 함유하는 DNA 단편을 회수한다.

DNA 프라이머는 예를 들어, 이.콜라이의 공지된 서열[참조: Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol, Chem., 261, 1052, 1986]을 기초로 적당히 제조될 수 있으며, lys C 유전자를 암호화하는 1347-염기 영역을 증폭시킬 수 있는 2개 유형의 프라이머 즉, 5'-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3'(서열확인번호: 2) 5'-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3'(서열확인번호: 3)가 바람직하다. DNA의 합성은DNA 합성기 Model 380B(Applied Biosystems Co. 제품)를 사용하는 통상의 방법 및 포스포아미다이드 방법[참조: Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981]으로 수행될 수 있다. PCR 반응은 DNA 열 순환기 Model PJ 2000(Takara Shuzo Co. 제품) 및 Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo Co. 제품)를 이용하여 공급업자에 의해 제시된 방법에 따라 수행될 수 있다.

PCR 방법에 의해 증폭된 lys C 유전자는 에스케리챠 세균에서 복제될 수 있는 벡터 DNA에 연결되어 이의 세포내로 도입된다. 사용되는 벡터 DNA를 사용하여 숙주를 형질전환시키는 방법 및 lys C의 존재 여부를 확인하는 방법은 상기 기술된 바와 동일하다.

수득된 lys C로 돌연변이 예를 들어, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실을 유도하는 방법은 재조합 PCR 방법[참조: Higuchi, R., 61, in PCR Technology (Erlich, H.A., Eds., Stockton Press, 1989)], 부위-지시된 돌연변이 유발 방법[참조: Kramer, W. and Frits, H.J., Meth in Enzymol., 154, 350, 1987; Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367, 1987]등에 의해 수행될 수 있다. 이들 방법을 이용하여, 목적하는 돌연변이가 목적하는 부위에 도입될 수 있다. 더우기, 무작위 돌연변이의 도입을 위해 염색체 DNA 또는 플라스미드상의 목적 유전자를 하이드록실아민으로 직접 처리하는 방법[참조: Hashimoto, T. and Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159, 1039, 1984]; 통상의 방법, 예를 들어, 자외선에 목적 DNA를 함유하는 세포를 노출시키거나 N-메틸-N'-니트로소구아니딘, 아질산 등과 같은 화학제제로 처리하는 방법; 또는 목적 유전자를 화학적으로 합성하는 방법이 사용될 수있다.

억제-해방성 돌연변이체 유전자 lys C^*를 선별하는 방법은, 우선 돌연변이된 재조합 DNA를 사용하여 AK-결핍 균주, 예를 들어, 이 콜라이 GT3 균주를 형질전환시킴을 포함한다. 그 다음에, 형질전환체를 최소 배지, 예를 들어 상당 양의 리신을 함유하는 M9에서 배양한다. 야생형 lys C를 갖는 플라스미드를 포함하는 균주는 상기 균주에서의 유일한 AK인 AK III의 리신에 의한 억제를 나타내므로, 트레오닌, 이소루이신, 메티오닌 및 디아미노피메르산(DAP)의 합성은 더이상 가능하지 않고 생장이 억제된다. 반대로, 리신의 억제를 해방하는 lys C^*를 갖는 플라스미드를 포함하는 균주는 상당 양의 리신을 함유하는 최소 배지 상에서 생장할 수 있어야 한다. 이러한 현상을 이용하여, 목적하는 균주, 즉 억제를 해방하는 lys C^*를 갖는 플라스미드를 포함하는 균주, 즉, 리신 또는 리신의 동족체인 S-2-아미노에틸시스테인(AEC)에 대해 내성인 균주를 선별할 수 있다.

이런 방식으로 수득된 상기 돌연변이체 유전자는 적당한 미생물(숙주)내로의 도입을 위한 재조합 DNA로서 사용될 수 있으며, 피이드백 억제가 해방된 AK를 포함한 미생물을 수득하기 위해 발현시킬 수 있다.

에스케리챠 세균의 상기 야생 균주가, 수득된 lys C 유전자 또는 돌연변이체 lys C 유전자(lys C^*)를 도입한 후 증폭시켜 트레오닌을 생산하고자 하는 숙주로서 언급될 수 있지만, 이외에도, 기타 세균이, 본원에서 작제된 재조합 벡터 DNA의 복제 기원 및 lys C 유전자 또는 돌연변이된 lys C 유전자(lys C^*)가 작용하고 재조합 벡터 DNA가 복제될 수 있고 lys C 유전자 또는 돌연변이된 lys C 유전자(lys C^*)가 강화될 수 있는한, 숙주로서 언급될 수 있다. 가장 바람직한 숙주는 이.콜라이 B-3996 균주이다.

리신에 의한 피이드백 억제가 해방된 아스파르토키나제 III를 암호화하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 DNA를 포함하는, 상기 방식으로 수득된 형질전환체를 배양하여, 목적 L-트레오닌을 배양액중에 생산 및 축적시킨 다음 회수한다.

L-트레오닌의 생산을 위해 사용되는 배양 배지는 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기물 이온을 함유하는 통상의 배양 배지이며, 필요한 경우, 기타 유기물 성분을 함유한다.

사용되는 탄소 공급원은 사카라이드(예: 글루코오즈, 락토오즈, 갈락토오즈, 프럭토오즈), 가수분해된 전분, 알콜(예, 글리세롤 또는 소르비톨) 또는 유기산(예: 푸마르산, 시트르산, 석신산) 등일 수 있다.

사용되는 질소 공급원은 무기 암모늄염(예: 암모늄 설페이트, 염화암모늄, 인산암모늄 등), 유기 질소(예: 콩 가수분해물) 또는 암모니아 기체, 암모니아수 등일 수 있다.

필수 물질, 예를 들어, 비타민 B1 또는 L-호모세린 등 또는 효모 추출물은 바람직하게는 미량의 유기 영양 공급물로서 적당한 양으로 첨가된다. 이들 이외에, 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등이 필요한 경우 소량으로 첨가된다.

배양은 바람직하게는 16 내지 72시간 동안 호기성 조건하에서 수행되는 반면, 배양 온도는 25 내지 45℃로 조절되며, 배양물의 pH는 5 내지 8로 조절된다. pH의 조절을 위해, 무기 또는 유기산, 알칼리 물질 또는 암모니아 기체 등이 사용될 수 있다. 발효된 메쉬(mash)로부터의 L-트레오닌의 회수는 통상의 이온 교환수지 방법, 침전 방법 및 기타 공지된 방법을 병행하여 수행한다.

본 발명은 미생물학 산업에 관한 것이며 발효법에 의해 L-트레오닌을 생산하는 방법에 대해 기술하고 있다. L-트레오닌은 필수 아미노산이고 이것은 의학 목적을 위한 다양한 영양 혼합물의 성분으로서 사용된다. 더우기, 이것은 동물을 위한 사료 첨가제로서, 약제 및 화학 산업에서의 시약으로서, 및 미생물에 의해 리신 및 호모세린과 같은 아미노산을 생산하기 위한 생장 인자로서 사용된다.

제1도는 트레오닌의 생합성 경로를 도시한 것이다.

제2도는 pLYSC1 및 pLYSC2에 대한 제한 효소 지도를 도시한 것이다(실시예 1 참조).

제3도는 하이드록실아민에 의해 유도된 돌연변이의 도입이 lysC에 대해 미치는 효과를 보여주는 그래프이다(실시예 2(2-4) 참조).

제4도는 다양한 lysC^*유전자에 의해 암호화된 아스파르토키나제의 리신-의존성 억제도를 도시한 것이다(실시예 3 (3-4) 참조). 수평축의 리신 농도는 로그로서 표현된다. 수직축의 특이 활성은, 리신 OmM 첨가시 야생형 AK III의 활성을 100%로 정의한 비율로서 표현된다.

제5도는 pLLC^*의 작제를 도시한 것이다(실시예 4(4-1) 참조).

제6도는 pVICLC^*A 및 pVICLC^*B의 작제를 도시한 것이다(실시예 4 (4-3) 참조).

제7도는 각각의 Lys C^*의 돌연변이 지점을 도시한 것이다(실시예 5(5-3) 참조).

(발명을 실시하기 위한 최선의 양태)

본 발명에 대한 더욱 상세한 설명은 하기 실시예를 참조로 기술한다.

실시예 1 : 야생형 lysC 유전자의 클로닝

이.콜라이의 lysC 유전자의 염기 서열은 이미 보고되어 있으며 [참조: Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chcm., 261, 1052, 1986], 이의 개방 판독 프레임(ORF)은 449개의 아미노산을 암호화하는 1,347개의 염기를 갖는다는 공지되어 있다. 리신에 의한 억제에 관여하는 오퍼레이터가 존재하기 때문에, 이 오퍼레이터 영역을 제거한 후, PCR법을 사용하여 SD 서열과 ORF를 함유하는 영역만을 증폭시킴으로써 클로닝을 수행한다.

2개의 상이한 프라이머인 5'-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3' (서열확인번호 2) 및 5'-GAATTCCTTGCGAGCAG-3' (서열확인번호 3)가 제조되며, 사이토 및 미우라의 방법[참조: Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, 1963]에 의해, 이.콜라이 K-12 MC1061 균주의 전체 게놈성 DNA가 회수된다. 목적 DNA를 증폭시키기 위해 얼리히(Erlich)등의 방법(참조: PCR Technology, Stocktou Press, 1989)에 따른 PCR 반응이 사용된다. 수득된 DNA를 BamHI 및 AseI로 분해시킨 후, 이의 말단을 평활말단화하고 이 DNA를 다중복사체(multicopy) 벡터 pUC18의 SmaI 부위에 삽입시킨다. 이로써, lacZ 프로모터에 대해 1개는 안티센스(pLYSC1)이고 1개는 센스(pLYSC2)인 2개 형태의 플라스미드가 수득된다(제2도).

이 플라스미드는 AK I, II 및 III을 완전히 결실하고 있는 이.콜라이 GT3 균주(thrA1016^b, metLM1005, lysC 1004)를 형질전환하는데 사용되며, GT3의 호모세린 + 디아미노피메르산 요구가 보충되기 때문에, 이 사실은 상기 유전자가 활성 AK III을 암호화하는 lysC 임을 확인시켜 준다.

실시예 2 : 억제-해방된 돌연변이체 유전자 lysC^*의 획득

(2-1); 억제-해방된 lysC 유전자(lysC^*)를 효율적으로 수득하기 위해서, 실시예 1에서 제조한 재료합체 플라스미드 DNA 상의 유전자에 돌연변이 처리한다.

억제-해방된 돌연변이체 유전자 lysC^*를 수득하는 방법에서와 같이, 제1의 야생형 lysC 재조합체 플라스미드를 형질전환을 위해 AK가 완전히 결실된 이.콜라이 CT3에 도입한다. 상당한 양의 리신을 하기 표 1의 조성을 지닌 M9 최소 배지에 가하고, 이 형질전환체를 배지중에서 배양한다. 야생형의 lysC를 지닌 플라스미드를 보유한 균주는 리신에 의한 AK, 즉 AKIII만의 억제를 나타내므로, 트레오닌, 이소루이신, 메티오닌 및 디아미노피메르산(DAP)의 합성이 더이상 불가능하며, 생장이 억제된다.

표 1 : M9 최소 배지

A, B, C, D 및 물을 각각 멸균하고, A:B:C:D:물을 5:0.1:1:0.1:95의 비로 혼합한다.

이와는 대조적으로, 리신에 의한 억제를 해방하는 lysC^*를 갖는 플라스미드를 보유하고 있는 균주는 상당한 양의 리신을 함유하는 최소 배지중에서 생장 가능할 것으로 여겨진다. 이러한 현상을 이용하여, 리신 또는 S-2-아미노에틸시스테인(AEC), 리신 동족체에 대해 내성이 있어 생장이 가능한 균주, 즉 억제를 해방하는 lysC^*를 갖는 플라스미드를 지닌 균주를 선별한다.

(2-2); 피이드백 억제-내성 lysC 돌연변이체(lysC^*)의 선별 조건 연구

우선, pLYSC1 및 pLYSC2 각각을 형질전환을 위해 이.콜라이 GT3내로 도입하여 2개의 상이한 형질전환체를 수득하고, 리신 또는 AEC를 함유하는 M9 최소 아가평판 배지 상에서 배양한다. 또한, 리신 또는 AEC의 생장 억제 농도를 측정하고, lysC^*를 선별하기 위한 조건을 시험한다.

표 2에 나타낸 바와 같이, pLYSC2의 경우에 발현양이 lacZ 프로모터에 의해 증폭되므로, 심지어 야생형 lysC를 사용하는 경우에도 현저하게 고 농도인 리신 또는 AEC에 대해 내성이 있음은 분명하나, pLYSC1의 lysC 유전자는 lacZ 프로모터에 대해 안티센스이고 LysC 유전자 자체의 프로모터는 상실되어 있기 때문에, 저 농도의 리신 또는 AEC 하에서 발현 양은 적고 생장은 억제된다(약 0.2mM의 리신 또는 AEC를 첨가함으로써 생장은 완전히 억제된다. 표에서 "+"는 형질전환체가 생장함을 나타내며 "-"는 생장하지 않음을 나타낸다). 이 생장 억제는 호모세린 및 DAP를 동시에 첨가함으로써 회복할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

표 2 : lysC 플라스미드를 지니며 완전하게 AK-결핍성인 GT3 균주의 생장과 첨가되는 리신 또는 리신 동족체 AEC 농도간의 관계

(a) Lys 농도 및 생장

(b) : AEC 농도 및 생장

M9 아가 배지, 37℃, 2일간 배양

+: 생장, ±: 약간 생장, -: 생장 않음

따라서, 돌연변이 도입 실험에 pLYSC1을 사용하고, lysC^*선별에 사용된 선택 배지는 M9 최소 배치에 10mM의 리신 또는 0.2mM의 AEC를 가하여 제조한다.

(2-3); 돌연변이유발 처리

하이드록실아민은 시토신을 N⁴-하이드록시 시토신으로 전환시킴으로써 C→T의 돌연변이를 유도하는 화학적 돌연변이 유발제이다. 이 돌연변이를 플라스미드내로 도입하기 위해, 2가지 방법이 사용되는데, 하나는 플라스미드를 직접 하이드록실아민으로 처리하는 시험관내 돌연변이유발법이고, 다른것은 돌연변이에 다양성을 제공하는, 다시말해서 C→T 이외의 돌연변이를 발생시키기 위해, 플라스미드를 포함하는 세포를 니트로소구아니딘(NTG)으로 처리한 후 플라스미드를 추출해내는, 생체내 돌연변이 유발법이다.

(2-4); 하이드록실아민을 사용한 시험관내 돌연변이유발 처리

2㎍ 분량의 DNA를 하기 표 3에 나타낸 반응 용액, 즉 0.4M의 하이드록실아민 중에서 75℃의 온도로 1 내지 4시간 동안 처리한다. 처리된 DNA를 유리 분말로 정제하고 형질전환시키기 위해 완전하게 AK-결핍성인 GT3 균주내로 도입한 후, 이를 완전 배지(L-브로스; 1% 박토 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl, 1.5% 아가)상에 플레이팅시켜 콜로니를 형성시킨다. 형성된 콜로니를 (2-1)에서 수득한 선택 배지상에 복제한다. 형질전환체 발생율과 돌연변이 비율은 제3도에 나타낸 바와 같이 다양하다. 4시간 처리시, 돌연변이 균주의 수율은 0.5 내지 0.8%이며 이는 꽤 높은값이다.

표 3 : 반응용액 조성물

(2-5); 니트로소구아니딘(NTG)을 사용한 생체내 돌연변이 유발처리

이.콜라이 MC1061을 형질전환시키는데 pLYSC1을 사용하고, 세포를 NTG로 직접 처리한다. 처리한 세포를 밤새 배양하여 돌연변이를 고정시킨 후, 이로부터 플라스미드를 추출해내고, 형질전환시키기 위해 GT3내로 도입하며, (2-4)에서와 동일한 방법으로 스크리닝하여 리신 내성(Lys^R) 또는 AEC 내성(AEC^R) 돌연변이체를 수득한다. 처리 결과는 하기 표 4와 같다.

표 4 : 처리개요

TM 완층액의 조성은 다음과 같다;

트리스 50mM

말레산 50mM

(NH₄)₂SO₄1g/l

MgSO₄· 7H₂O 0.1g/l

Ca(NO₃)₂5mg/l

FeSO₄· 7H₂O 0.25mg/l

NaOH를 써서 pH 6.0으로 조정

실시예 3 : lysC^*유전자의 분리

(3-1);

실시예 2에서 수득한 총 180개체의 후보균주 (하이드록실아민-처리됨; 48개 균주, NTG-처리됨=132개 균주)를 다시 선택 배지상에 스포팅시키고, AEC 또는 리신 내성의 존재를 확인하여 153개체의 균주를 수득한다. 배지중 아미노산 축적 패턴의 차이를 주목하여 153개체의 균주를 14개 그룹으로 나누어, 각 그룹의 대표를 AK 활성 측정을 위해 선별한다. 하이드록실 아민으로 처리한 돌연변이체와 NTG로 처리한 돌연변이체 사이에 커다란 차이가 없기 때문에, 이 실험은 이 두가지 사이에 구별을 두지 않고 계속 진행시킨다.

(3-2); 아스파르토키나제 활성의 측정

완전하게 AK-결핍성인 GT3 균주를 숙주로서 사용하여, 이를 각각 상기 14개 돌연변이체 pLYSC1(pLYSC1^*계열로 명명) 및 야생형 pLYSC1 플라스미드로 형질전환시킨 후, 당해 형질전환체로부터 세포 추출물을 제조하고, AK III의 효소 활성을 측정한다. 효소 활성의 측정법은 다음과 같다.

(3-3) AK III 활성의 측정방법

(3-3-1); 조 효소 용액의 제조방법

(1) 2 x TY 배지중에 세포를 배양한 후, 0.D. 660nm=약 0.8에서 세포를 수거.

(2) 0.02M KH₂PO₄(pH 6.75)-0.03M β 머캅토에탄올(0℃)로 세척.

(3) 세포의 초음파 파쇄(0℃, 100W, 30초 x 4회).

(4) 0℃에서 33krpm으로 1시간 동안 원심분리한 후, 상등액에 80% 포화도까지 황산암모늄 첨가.

(5) 원심분리, 이어서 (2)의 완충액에 펠렛울 용해시키고 보존함 (-20℃).

(3-3-2); 효소활성의 측정법

효소활성의 측정법은 문헌[참조: Stadtman, E.R., Cohen, G.N., Lebras, G. and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 232, 2033, 1961]에 따른다.

반응 용액은 하기 표 5에 나타낸 조성을 갖는다.

표 5 : 반응 용액 조성

측정법은 하기 표 6에 개괄하였다.

표 6 : 측정법의 개괄

결과는 제4도에 제시되어 있다.

(3-4); 리신-의존성 억제의 해방 정도

AK의 효소 활성을 측정하기 위해, 각종 농도의 효소 반응 용액에 리신을 가하고, 리신-의존성 억제 수준을 측정한다. AK III의 야생형은 리신에 의해 매우 강하게 억제되는데, 예를 들어, 약 0.45mM의 리신으로 50% 억제되고 5mM의 리신으로는 대략 100% 억제된다(제4도 참조).

이와 대조적으로, 본원에서 수득되는 AK III의 돌연변이체는 다양한 해방정도를 나타내지만, 14개 균주 모두는 어느 정도 리신-의존성 억제 해방을 갖는다(제 4도 및 표 7 참조). 특히, 24, 80, 117, 169 및 172번의 경우, 100mM의 리신으로도실질적으로 아무런 억제도 관찰되지 않았으며, 50% 억제 농도는 200배 또는 그 이상이었다.

또한, 단위 단백질당 효소 활성인 비활성은, 세포의 생장 조건 및 샘플 제제의 영향을 고려하더라도 야생형과 같거나 높았으며, 돌연변이의 도입으로 인한 활성 감소의 문제는 발견되지 않았다(표 7 참조). 이로부터 AK III의 활성부위 및 리신에 의한 조절을 담당하는 부위는 서로가 독립적이라는 것을 가정할 수 있다.

표 7에서, 억제 해방은, 리신-무함유 반응 용액의 활성에 비추어 100mM의 리신 존재하에서의 활성(%)으로서 나타내며, 열 안정성은 가열없이 처리한 경우의 활성에 대한 55℃의 온도에서 1.5시간 동안 처리한 후의 활성 유지(%)로서 나타낸다.

표 7 : 리신 및 열안정성에 의한 억제 해방

(3-5); 열안정성

개선을 위해 특정 효소의 활성 수준을 상승시킬 때, 이들이 세포내에서 안정하게 유지되어야 한다는 것이 중요하다. 세포 내에서 및 세포 부재하에 프로테아제 활성의 차이 및 보존 완충액의 영향으로 인해, 이의 측정은 바람직하게는 생체내에서 수행하나, 본원에서는 편의상 AK III의 각 돌연변이체에 대한 매개변수로서 열안정성을 시험관내에서 측정한다.

AK III의 불활성이 나타나는 온도에 대한 각종 시험의 결과, 온도는 56℃로 고정되고 활성 유지율은 90분간 처리한 후 측정한다. 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 돌연변이체의 절반이 야생형에 비해 뛰어났다. 일반적으로, 돌연변이된 단백질은 야생형에 비해 덜 안정한 경향이 있으나, 본원에서 수득한 AK III의 돌연변이된 유형의 일부는 야생형에 비해 훨씬 안정성이 크며, 다수는 L-트레오닌의 실제적 생산을 위한 효소로서 대단히 유용한 것으로 생각된다.

실시예 4 : lys^*C-도입 균주를 사용한 L-트레오닌의 발효법에 의한 생산

(4-1);

전술한 공지의 트레오닌-생성 이.콜라이 세균중 B-3996 균주는 최고의 트레오닌 생산 능력을 나타낸다. 본원에서는, lysC^*의 평가를 위한 숙주로서 B-3996 균주를 사용하기로 결정하였다. B-3996 균주는 리서치 인스티튜트 오브 제네틱스 앤드 셀렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오르가니즘에 기탁번호 BKIIM (VKPM) B-3996으로 기탁되어 있다. 또한, 다음 실험에 사용하기 위해, 평가될 lysC^*로서, 상이한억제 해방도 및 특이 활성을 갖는 6개 유형이 제공된다(표 7중에, No. 24, 43, 60, 80, 149 및 167).

먼저, lysC^*의 발현도를 증가시키기 위해, pLYSC1^*상의 상기 6개 유형의 lysC^*각각을 벡터 pHSG399(다카라 주조 가부시키가이샤 제조)의 lacZ 프로모터 하부에 이전시켜 각각의 lysC^*가 역 삽입되도록 한다. 이런 방법으로 수득한 플라스미드를 pLLC^*계열로 총칭한다(제5도 참조). 상기 lysC^*No. 80 및 167을 갖는 플라스미드가 삽입된 이.콜라이 HB101 균주가 각각 AJ12750 및 AJ12751로 명명되었고 1992년 9월 1일자로 내셔날 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼 테크놀러지(일본국)에 기탁되었다. AJ12750은 FERM P-13136(l993년 11월 4일 국제기탁기관에 기탁번호 FERM BP-4462로 전환됨)으로 기탁되었고, AJ12751은 FERM 13137(1993년 11월 4일 국제기탁기관에 기탁번호 FERM BP-4463으로 전환점)로 기탁되었다. 나머지는 기탁되지 않았으나, 각 lysC^*에 대한 모든 돌연변이 지점이 하기한 바와 같이 발견되었기 때문에, 당해분야의 일반적인 숙련가라면 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Moleular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1, 21, 1989]의 방법에 따라 상기 기탁 세균으로부터 플라스미드를 용이하게 회수하여, 부위 지시된 돌연변이유발법[참조: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15, 83, 1989]에 따라 목적하는나머지 lysC^*유전자를 수득할 수 있을 것이다. 평가를 위해, 통상의 방법 사용하여 이들 플라스미드를 B-3996내로 삽입시킨다.

하기 표 8에 나타낸 배양배지를 사용하여(성분 A, B 및 C는 개별적으로 멸균시켰다), 114-116rpm으로 교반시키면서 37℃의 온도에서 38시간 동안 배양을 수행한다.

표 8 : 트레오닌 생산 배지

KOH로 pH 7.0으로 조정하고, 115℃에서 10분간 가압멸균한다(16/20용적)

B : 20% 글루코오즈, 115℃에서 10분간 가압멸균 (4/20 용적).

C : 약전 CaCO₃, 180℃에서 2일간 가압멸균(30g/l).

D : 항생제(100㎍/ml의 스트렙토마이신, 및 5㎍/ml의 카나마이신).

(4-2); lysC^*의 평가

6개의 pLLC^*계열 플라스미드 각각을 B-3996 균주를 형질전환시키는데 사용하고, 각각의 형질전환체는 각각 1g/l의 리신 첨가 및 이의 미첨가 조건 모두에서 배양한다. 대조군으로서, 야생형의 lysC(pLLC1)를 보유하는 플라스미드를 갖거나 갖지 않는 숙주 B-3996 균주를 제조한다.

결과는 다음의 표 9와 같다. 표에서, 괄호안의 값은, 소모된 사카라이드 1g당 리신 수율(g) 대 B-3996을 리신 첨가없이 배양할때 (대조군) 수득된, 소모된 당 1g당 리신 수율(g)의 비이다. 이것은 후자의 수율을 1.00으로 나타냄을 의미한다. 리신 민감도는 (리신 첨가와 함께 소모된 사카라이드 당 리신 수율)/(리신 첨가 없이, 소모된 사카라이드 당 리신 수율)로 정의된다. B-3996 균주에 있어서, 리신이 첨가된 배양물에서 관찰된 소모된 사카라이드 당 수율의 감소는 미-첨가 배양물에서의 관찰을 기준으로 대략 0.74이다. 그러나, lysC^*가 도입된 균주, 예를 들어 B-3996/pLLC^*149의 경우, 리신이 첨가된 배양물에서 관찰되는 소모된 사카라이드 당 수율의 감소는 미-첨가 배양물에서의 관찰을 기준으로 대략 0.96이다. 이로부터 lysC에 의해 암호화된 AK III는 트레오닌의 생합성에 관여하며, 리신 첨가에 의한AK III 활성의 억제는 다시, 트레오닌 생합성 억제와 관련된 것으로 여겨진다. 이와 같은 현상은 본 발명에 따른 lysC^*가 사용될 때 감소된다.

표 9

또한, 리신-무함유 배양물의 트레오닌 생성에 있어서, 야생형 lysC 플라스미드를 갖는 균주는 이같은 플라스미드가 없는 B-3996 균주보다 개선된 생산성을 갖으며, 이 생산성은 돌연변이체 lysC^*를 갖는 균주에 의해 더 증가될 수 있음이 분명하다(No. 80의 경우 숙주보다 대략 1.3배).

이와 같은 결과는 AK III가 B-3996 균주에 의한 트레오닌 생산에서 속도-제한 인자의 하나임을 나타낸다. 돌연변이체 lysC^*가 도입된 세포를 사용하는 경우, 리신-무함유 배양은 야생형 lysC가 도입된 세포를 사용하는 경우에 비교하여 개선된 수율을 나타내며, 이것은 후자가 세포 자체내에서 생합성된 리신에 의해 야생형의 AK III에서 억제를 나타내기 때문인 것으로 고려된다.

(4-3); 돌연변이체 lysC^*플라스미드의 안정화

제6도에 나타낸 것과 같은 플라스미드는 B-3996 균주로부터 추출한 플라스미드 pVIC40의 BamHI 부위에서 양방향으로 도입된 lysC^*를 사용하여 제조한다. B-3996 균주로부터 pVIC40을 수거하는 방법은 이미 상술한바 있다. lysC^*로서 고수준의 트레오닌 생선을 갖는, No.80과 이와 비교 목적의 No.40이 선별되며 이로써 4가지 상이한 플라스미드, 예를 들어 pVICLC^*80A, pVICLC^*8OB, pVICLC^*43A 및 pVICLC^*43B가 수득된다.

숙주로서 사용하기 위해, B-3996 균주를 처리하여 새로이 B-399 균주(pVIC40가 제거된 B-3996 균주)를 제조한다. 이 처리는 B-3996 균주의 배양 용액에 대해, 스트렙토마이신- 무함유 L-브로쓰를 사용하여 1/100-희석을 3회 반복하여 성취한다. 본원에서의 배양 온도는 40 ℃였다. 이런 방법으로 수득한 B-399 균주에, lysC^*가 도입된 4가지 플라스미드중, pVICLC^*80A 및 pVICLC^*43A를 각각 도입하고 배양을 실시한다. 결과는 표 10에 나타내었다. pVICLC^*80A 또는 pVICLC^*43A가 도입된 균주는 대조군으로서 사용된 pVIC40 형질전환체 균주(B-3996)에 비해 수율의 증가를 나타내었다(pVILC^*80A에 대해 1.10배, pVICLC^*43A에 대해 1.07배).

표 10

(4-2)의 결과와 비교하여, 수율 증가도의 감소는 벡터를 pVIC40으로 변경시킴으로써 비롯된 낮은 복사체수에 의한 것으로 생각되나, 생장은 B-3996 균주와 동일하며 플라스미드는 안정하게 유지되었다.

(4-4); 염색체로의 돌연변이 lysC^*의 도입

상동 재조합 현상을 활용하여 돌연변이 유형 lysC^*를 이의 염색체상의 야생형 lysC 유전자를 표적으로 하여 트레오닌-생성 B-3996에 도입시킨다. 본원에서 사용된 방법은 러셀(Russel) 등[참조: Russel, M. and Model, P., J. Bacteriol., 159, 1034, 1984]의 방법을 변경한 것이다.

만일 숙주가, 이.콜라이 돌연변이주 즉, 이.콜라이 제네틱 스톡 센터(genetic stock center, U.S.A.)에서 입수가능한 MM382 균주(polA^ts)이라면, 플라스미드 pHSG399는 37℃(허용 온도)에서 복제될 수 있으나, 높은 온도(비-허용 온도)예를 들어, 42℃에서는 복제되지 않는다. 이 같은 사실은 상동 재조합에 활용된다.

먼저, pLLC43^*및 pLLC80^*을 각각 숙주로서 돌연변이주 MM383에 복제가능한 온도인 37℃에서 도입하여, 각각 MM383/pLLC^*43 및 MM383/pLLC^*80의 형질전환체를 수득한다. 이들 형질전환체를 42℃에서 배양하고, 플라스미드는 결여되어 있으나 클로람페니콜에 대해 여전히 내성을 나타내는 것을 선별한다. 플라스미드는 이들 균주의 염색체내주 통합된다. 수득된 균주를 각각 MM383-C43 및 MM383-C80으로 명명한다. 이들 균주를 P1 파아지로 감염시켜, 파아지 용액을 제조하고 이를 B-3996 균주를 감염시키는데 사용한다. 마커로서 클로람페니콜 내성을 사용하여, 염색체내로 형질도입된 lysC^*를 지닌 균주를 선별하고, 이들을 각각 B-3996-C43 및 B-3996-C80으로 명명한다.

(4-1)과 동일한 조건하에서 B-3996-C-43 및 B-3996-C-80의 배양을 수행하며, 하기 표 11에 나타낸 바와 같은 결과를 수득한다. 트레오닌 생산 수율에서 대략 4%의 개선이 관찰된다.

표 11

실시예 5 : 야생형 lysC 및 돌연변이체 lysC^*의 염기서열 결정 (5-1);

DNA 서열분석기[ABI Model 373A(ex ABI Co.)]를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 야생형 lysC 유전자의 염기 서열을 결정한다. 결과는 서열확인번호: 1로서 첨부된 서열 목록중에 제시되어 있다. 이 서열은 이.콜라이 K-12 JC411의 이미 공개된 lysC 염기 서열[참조: Casson, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patta, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986]과는 6개의 염기가 상이하다(결과적으로 2개 아미노산 잔기 변화로 나타남). 이러한 6개의 차이점은 사용된 균주의 차이에서 기인하는 것으로 볼 수 있다.

(5-2); 피이드백 억제-내성 돌연변이체 lysC^*의 염기 서열

실시예 3에서 조사된 14종의 lysC^*의 염기 서열은 (5-1)에서와 동일한 방법으로 결정하며, 돌연변이점은 명확히 밝혀졌다. 결과는 표 12에 나타내었다. 14종중 정확히 동일한 두쌍이 존재하므로, 실제로는 12종의 돌연변이체가 존재한다. 돌연변이체 No. 149, 150, 156, 158, 167, 169 및 172는 하이드록실아민을 처리하여 수득하며, No. 24, 43, 48, 60, 117 및 126은 NTG로 처리하여 수득한다. 그러나, 돌연변이 패턴은 모두가 C→T 또는 G→A이며; G→A 돌연변이는 상보성 쇄상에서 C→T 돌연변이를 통해 나타난다.

표 12 : lysC^*의 돌연변이점의 확인

(a) H : 하이드록실아민 처리, N : NTG 처리

(5-3); 피이드백 억제 해방에 관여하는 도메인의 확인

다수의 돌연변이가 C-말단에 나타나며, 이들은 특히 제7도의 A 도메인(318번 Met 잔기에서 325번 Leu 잔기까지) 및 B 도메인(345번 Ser 잔기에서 352번 Thr 잔기까지)에 집중되어 있다(표 12중의 "돌연변이점" 참조). 이.콜라이는 lysC(AKIII)외에 2가지 유형의 AK인 trhA (AK I-HD I) 및 metL(M) (AKII-HD II)을 갖는다. 돌연변이체 lysC^*는 이 2가지 유형과 고도로 상동인 두 위치를 가지며, 이들 도메인들은 AK의 활성 중심인 것으로 생각된다[참조: Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.H. and Patte, J.C., J. Biol. Chem, 261, 1052, 1986]. C-말단의 A와 B 도메인은 이들 공통 도메인에 속하지 않으며, 이에 따라 이들이 AK III에 특이적인 리신-조절된 도메인일 가능성이 대단히 높다. 특히, 고도의 억제해방을 보여주는 24/80, 172, 169 및 117은 B도메인에 돌연변이를 가지며, 이것은 중요한 것으로 생각된다. 12가지 유형중, 10개는 A 또는 B도메인에 돌연변이를 갖고 있다. 60과 158이 예외적이고, 억제 해방 및 열안정성 모두가 낮은 수준으로 나타나며(상기 표 7 참조), 이것은 전적으로 돌연변이에 의한 효소의 구조상 변화로 인한 부분적인 억제해방의 결과로 여겨진다. 또한, 복수의 돌연변이점을 갖는 돌연변이형의 경우, 어떠한 돌연변이점이 유효한가에 대한 의문이 남게 되며, 다음의 설명은 동일한 부위에 단일 돌연변이를 갖는 돌연변이 유형과의 비교를 토대로 한 것이다.

(1) No.126(1점), 43(2점) 및 149(2점)

A 도메인중 No.126의 돌연변이점은 3개의 전체 돌연변이 유형에 있어 공통적이나, 억제 해방정도는 No.149 및 126과 동일하며 No.43에서 보다 많은 수의 돌연변이점은 오히려 역효과를 초래한다. 이로써, A 도메인에서 No.126의 돌연변이점이 억제 해방을 부여하는 것중의 하나임을 가정할 수 있다.

(2) No.24/80(1점) 및 169(2점)

No.169에서 2개 돌연변이점중, B 도메인중의 하나는 No.24/80과 동일하다. 둘다는 100% 정도의 억제 해방을 나타내므로, No.24/80중의 돌연변이점이면 충분하다.

(3) No.150(1점) 및 172(2점)

No.150이 A 도메인에 하나의 돌연변이점을 가지는 반면에 No.172는 각각 A도메인(No. 150과 동일) 및 B 도메인에 2개의 돌연변이점을 갖는다. 억제 해방 정도는 No.172에서 보다 강하며, 이는 A 도메인 및 B 도메인 모두가 억제 해방에 관여함을 분명히 보여준다.

상기 기술한 방법에서, 본 발명자들은 A 도메인(아미노산 잔기 318번째 Met 잔기부터 325번째 Leu 잔기까지 발현될때) 및 B 도메인(345번째 Ser 잔기 내지 352번째 Thr 잔기까지)에서 아스파르토키나제 활성의 리신-의존성 억제의 해방과 관련된 도메인을 밝혀내었다. 그러나, 본 발명자들은 아스파르토키나제 활성의 리신-의존성 억제의 해방이, 특정의 일부 아미노산 잔기가 다른 특정한 아미노산 잔기로 변화된 돌연변이인 경우에만 발생한다는 결론을 내지는 않았다. 예를 들어, 표 12에서, 323번째 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 변화되었을때 피이드백 억제의 해방이 나타남을 보여주고 있으나, 당해분야의 일반적인 숙련가에게는 아스파르트산 잔기 대신에 글루탐산 잔기로 대체시켜도 동일한 해방이 발생한다는 것이 분명하다. 이것은 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 유사한 구조를 갖는 복수의 아미노산이 동종 아미노산으로 불려지는 이유이며, 아미노산을 이의 동종 아미노산으로 교환하는 것이 단백질의 기능에 어떠한 큰 변화를 유발하는 것으로 여겨지지 않는다(동종 아미노산의 목록은 Protein Engineering, p.31, CMC Co., 1985에 기술되어 있다).

종종, 아미노산이 비-동종 아미노산으로 대체되는 것 역시 동종 아미노산으로 대체되는 경우와 동일한 효과를 갖는 것으로 관찰된다. 역으로, 아미노산의 동종 아미노산으로의 교환은 종종 단백질의 기능에 심각한 변화를 초래하기도 한다[참조: Estell, D.A., Graycar, T.P., and Wells, J.A., J. Biol. Chem., 260, 6518, 1988; Schultz, S.C., and Richards, J.H., Procedure. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1588, 1986; Yutani, K., et al., J. Biol. Chem., 262, 13429, 1987; Yutani, K., et al., Procedure. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4441, 1987; Nishiyama, M., et al., J. Biol. Chem., 266, 14294, 1991].

게다가, 본 발명에 따르면, A 및 B 도메인중의 아미노산 잔기 일부는 변화하지 않으나, 단백질의 기능이 도메인 단위에 따라 한정되기 때문에, 피이드백 억제의 해방은, 이번 기회에는 도입된 바 없는 도메인내에 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 도입함으로써 관찰될 수 있다는 가정이 상당히 타당하다. 실제로 다수의 이같은 예가 보고된 바 있다[참조: Furuya, H., et al., Biochemistry, 28, 6848, 1989; Furuya, H., et al. Biochem. Biophys. Research. Commun., 160, 669,1989; Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science, 244, 1081, 1989).

단적으로, 본 발명은 특징적으로 본 발명자들의 피드백 억제와 관련된 도메인의 발견에 토대를 두고 있다. 실시예에서, 도메인중 단지 소수의 돌연변이 패턴만이 기술되고 있으나, 상술한 바와 같이, 당해 분야의 숙련가에게는 다른 패턴의 돌연변이라도 동일한 효과를 나타내게 될 것이라는 것은 자명한 일이다. 따라서, 이 같은 돌연변이 역시 본 발명의 범주내에 있다.

(산업적 적용)

상술한 바와 같이, 리신에 의해 피이드백 억제를 충분히 해방시키는 에스케리챠 세균-기원 AK III 유전자가 수득된다. 이들 유전자를 트레오닌-생성 세균내로 도입함으로써, 선행기술의 것보다 트레오닌 생산이 훨씬 개선된 다른 트레오닌-생산 세균을 수득하는 것이 가능하다. 이들 트레오닌-생산 세균의 성공적 이용은 통상적인 방법보다 발효법에 의해 L-트레오닌을 생산하는 보다 훨씬 뛰어난 방법을 제공한다.

서열 목록

서열 확인 번호 : 1

서열 길이 : 2147

서열 유형 : 핵산

쇄형 : 이본쇄

형태 : 선형

분자 유형 : 게놈성 DNA

기원 :

생물명 : 에스케리챠 콜라이

균주 : MC1061

특징 :

특징 요소 : -35 시그날

위치 : 242 .. 249

특징 측정 방법 : S

특징 :

특징 요소 : -10 시그날

위치 : 265 .. 273

특징 측정 방법 : S

특징 :

특징 요소 : 프라이머 결합

위치 : 536 .. 555

특징 측정 방법 : E

특징 :

특징 요소 : 프라이머 결합

위치 : 2128 .. 2147

특징 측정 방법 : E

특징 :

특징 요소 : RBS

위치 : 575 .. 578

특징 측정 방법 : S

특징 :

특징 요소 : 매트 펩타이드

위치 : 584 .. 1930

특징 측정 방법 : S

특징 :

특징 요소 : 터미네이터

위치 : 1941 .. 1968

특징 측정 방법 : S

서열 기술

서열 확인 번호 : 2

서열 길이 : 20

서열 유형 : 핵산

쇄형 : 일본쇄

형태 : 선형

분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA

서열 기술

CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20

서열 확인 번호 : 3

서열 길이 : 18

서열 유형 : 핵산

쇄형 : 일본쇄

형태 : 선형

분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA

서열 기술

GAATTCCTT GCGAGCAG 18

Claims (5)

1. 에스케리챠(Escherichia) 세균에서 기원한 아스파르토키나제 III을 암호화하고, 이 암호화 도메인내에 리신에 의한 아스파르토키나제 III의 피이드백 억제를 해방시키는 돌연변이로서, 서열 목록의 서열 확인 번호 : 1에서 323번 Gly가 Asp로 대체된 돌연변이; 323번 Gly가 Asp로 대체되고 408번 Gly가 Asp로 대체된 돌연변이; 34번 Arg가 Cys로 대체되고 323번 Gly가 Asp로 대체된 돌연변이; 325번 Leu이 Phe로 대체된 돌연변이; 318번 Met가 Ile로 대체된 돌연변이; 318번 Met가 Ile로 대체되고 349번 Val이 Met로 대체된 돌연변이; 345번 Ser이 Leu로 대체된 돌연변이; 347번 Val이 Met로 대체된 돌연변이; 352번 Thr이 Ile로 대체된 돌연변이; 352번 Thr이 Ile로 대체되고 369번 Ser이 Phe로 대체된 돌연변이; 164번 Glu이 Lys로 대체된 돌연변이 및 417번 Met가 Ile로 대체되고 419번 Cys가 Tyr로 대체된 돌연변이로 이루어진 그룹중에서 선택된 돌연변이를 갖는 유전자를 함유하는 DNA.
2. 제1항에 따른 DNA가 에스케리챠 세균 세포내에서 자가 복제할 수 있는 벡터 DNA에 연결된 재조합 DNA.
3. 제4항에 따른 재조합 DNA를 세포내로 도입시킴으로써 형질전환된, 에스케리챠 속에 속하는 미생물.
4. 제3항에 있어서, 제1항에 따른 DNA를 염색체 DNA내로 도입시킴으로써 형질전환된 미생물.
5. 발효배지에서 제3항 또는 제4항에 따른 미생물을 배양함으로써 L-트레오닌이 배양 배지중에 생산되고 축적되게 한 다음, 상기 배양 배지로부터 L-트레오닌을 수거함을 포함하는 L-트레오닌의 생산방법.