DE69334208T2

DE69334208T2 - Verfahren für die Produktion von L-Threonin mittels Fermentation

Info

Publication number: DE69334208T2
Application number: DE69334208T
Authority: DE
Inventors: Konosuke Kawasaki-shi SANO; Hiroyuki Kawasaki-shi Kojima; Yuri Kawasaki-shi OGAWA
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1992-11-10
Filing date: 1993-11-10
Publication date: 2008-07-10
Anticipated expiration: 2013-11-11
Also published as: KR100319566B1; EP1020526A3; EP1020526A2; ATE389723T1; EP1020526B1; TW280832B; KR940703918A; DE69334208D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die mikrobiologische Industrie und beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Fermentation. L-Threonin ist eine essentielle Aminosäure, die als Bestandteil verschiedener Nahrungsmittelgemische für medizinische Zwecke verwendet wird. Außerdem wird es als Futterzusatzstoff für Tiere, als Reagenz in der pharmazeutischen und der chemischen Industrie und als Wachstumsfaktor für die Herstellung von Aminosäuren, wie Lysin und Homoserin, durch Mikroorganismen eingesetzt.
Stand der Technik
In der Vergangenheit sind Bakterien, die aus der natürlichen Umgebung gewonnen wurden, oder künstliche Mutanten solcher Bakterien als Mikroorganismen für die Herstellung von L-Threonin durch Fermentation eingesetzt worden. Es sind viele L-Threonin produzierende künstliche Mutanten bekannt, von denen die Mehrzahl gegen α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure resistent ist und die zur Gattung Escherichia, Serratia, Brevibacterium oder Corynebacterium gehören. Was Escherichia anbelangt, sind in JPA 55-131397 , JPA 59-31691 , JPA 56-15696 und JPW 3-501682 Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Bakterien beschrieben, die mit rekombinanten Plasmiden transformiert sind, welche Threoninoperons enthalten.
Von den bislang bekannten Threonin produzierenden Bakterien hat der Stamm Escherichia coli BKIIM (VKPM) B-3996 die stärkste Threoninproduktion und den besten Verbrauchskoeffizienten gezeigt ( JPW 3-501682 ). Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "Verbrauchskoeffizient" auf die Gramm Zucker, die für die Produktion von einem Gramm Threonin erforderlich sind. Wenn dieses Bakterium in einem experimentellen Fermenter kultiviert wird und Zucker-Ammoniak als Antwort auf die Signale des pH-Sensors zu dem Kulturmedium gegeben wird, ist die maximale Biosynthese von Threonin 85 g/l, und der Verbrauchskoeffizient 2 g Zucker pro Gramm Threonin.
Aspartokinase (im folgenden als AK abgekürzt) ist ein Enzym, das Asparaginsäure in β-Phosphoasparaginsäure umwandelt, und es ist der Hauptregulationspunkt des Biosyntheseweges von Asparaginsäure und ihrer Aminosäurederivate. Wie 1 zeigt, gibt es drei Arten von AK aus E. coli (AK I, AK II, AK III), wobei die ersten zwei dieser Arten bifunktionelle Enzyme mit Homoserindehydrogenase(in folgenden manchmal als HD abgekürzt)-Aktivität haben. Eines dieser Enzyme ist AK I-HD I, welches durch das thrA-Gen codiert wird, und das andere ist AK II-HD II, welches durch das metL(M)-Gen codiert wird.
Nur AK III ist ein monofunktionelles Enzym, es ist das Produkt des lysC-Gens und es unterliegt bekanntlich der Repression und der Rückkopplungsinhibition durch Lysin. Andererseits unterliegt AK I der gemeinschaftlichen Repression durch Lysin und Isoleucin und der Inhibition durch Threonin, während AK II der Repression durch Methionin unterliegt. Das Verhältnis der intrazellulären Aktivitäten von AK I:AK II:AK III ist etwa 5:1:4.
Das lysC-Gen von E. coli wurde bereits kloniert, und seine Basensequenz wurde bestimmt (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. und Patte. J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986). Es wurde auch die Produktion von L-Threonin durch Fermentation unter Verwendung von E. coli-Stämmen, deren AK III-Aktivität verstärkt worden ist, von Mizukami et al. (Mizukami, T. et al., Agric. Biol. Chem., 50, 1015, 1986) beschrieben. Es wurde jedoch bislang keine ausreichende Befreiung von der lysinabhängigen Rückkopplungshemmung der AK III erreicht, die von Mizukami et al. beschrieben wurde.
Somit ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von AK III mit zufriedenstellender Befreiung von der Rückkopplungsinhibition durch Lysin und die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von L-Threonin durch Fermentation, welches im Vergleich zum Stand der Technik erheblich verbessert ist.
Offenbarung der Erfindung
Als Ergebnis umfangreicher Forschung zur Lösung des vorstehend genannten Problems haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ein Gen bereitgestellt (Mutante lysC oder lysC*), welches für AK III in E. coli codiert und welches in ausreichendem Maß von der Rückkopplungsinhibition durch Lysin befreit ist, und sie haben gefunden, daß durch Einführen dieses Gens in Threonin produzierende Bakterien L-Threonin effizient akkumuliert werden kann, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
Mit anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA, welche für Aspartokinase III aus Escherichia coli kodiert und eine Mutation in der kodierenden Region aufweist, durch welche die Rückkopplungshemmung der Aspartokinase II durch Lysin aufgehoben wird, und sie betrifft genauer gesagt die vorstehende beschriebene DNA, worin sich die Mutation befindet, die zu der Befreiung der Aspartokinase II von der Rückkopplungshemmung durch Lysin führt, beispielsweise auf der A-Domäne oder B-Domäne der Aspartokinase III, und genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die vorstehend genannte DNA, wobei die Mutation, die zu der Befreiung der Aspartokinase II von der Rückkopplungshemmung durch Lysin führt, unter Bezugnahme auf die SEQ ID NO:1 der nachstehenden Sequenzliste ausgewählt ist aus der Gruppe, die beispielsweise besteht aus einer Mutation, bei der Gly 323 durch Asp ersetzt ist, einer Mutation, bei der Gly 323 durch Asp und Gly 408 durch Asp ersetzt sind, einer Mutation, bei der Arg 34 durch Cys und Gly 323 durch Asp ersetzt sind, einer Mutation, bei der Leu 325 durch Phe ersetzt ist, einer Mutation, bei der Met 318 durch Ile und Val 349 durch Met ersetzt sind, einer Mutation, bei der Ser 345 durch Leu ersetzt ist, einer Mutation, bei der Val 347 durch Met ersetzt ist, einer Mutation, bei der Thr 352 durch Ile und Ser 369 durch Phe ersetzt sind, einer Mutation, bei der Glu 164 durch Lys ersetzt ist und einer Mutation, bei der Met 417 durch Ile und Cys 419 durch Tyr ersetzt sind.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die vorstehend genannte DNA, welche eine rekombinante DNA ist, die mit Vektor-DNA verknüpft ist, die in Escherichia-Bakterien autonom replizieren kann. Außerdem betrifft sie Mikroorganismen, welche zur Gattung Escherichia gehören und die durch die Einführung der vorstehend genannten rekombinanten DNA in die Zellen transformiert worden sind. Außerdem fallen Mikroorganismen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung, welche durch Einführen der DNA, die für die vorstehend genannte, von Escherichia abgeleitete Aspartokinase III codiert und ein Gen mit einer Mutation in der codierenden Region hat, welches die vorstehend genannte Aspartokinase III von der Rückkopplungshemmung durch Lysin befreit, in ihre chromosomale DNA transformiert worden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, welches durch Kultivieren eines beliebigen der vorstehend genannten Mikroorganismen in einem Fermentationsmedium, Produzieren und Akkumulieren von L-Threonin in der Kultur und durch Gewinnen des L-Threonins aus dem Kulturmedium gekennzeichnet ist.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung eingehend beschrieben.
Als Donor-Bakterien zur Bereitstellung der DNA, welche das für AK III (lysC) codierende Gen enthält, können beliebige Mikroorganismen, die zur Gattung Escherichia gehören, eingesetzt werden. Im speziellen sind dies solche, die von Neidhardt beschrieben wurden (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1208, Tabelle 1). Beispiele davon umfassen die E. coli-Stämme JM109 und MC1061.
Wenn ein Wildtyp-Stamm als Donorbakterium eingesetzt wird, um die DNA bereitzustellen, welche das für AK III (lysC) codierende Gen enthält, kann eine DNA, welche einen Wildtyp des AK III-Gens enthält, erhalten werden. Für die Einführung einer Mutation in dieses Gen, um ein AK III-Gen zu erhalten, welches von der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin befreit ist (lysC*), kann eine in vitro-Mutation der DNA durch direkte Behandlung mit Hydroxylamin bewirkt werden. Hydroxylamin ist ein chemisches Mutationsmittel, welches durch Umwandlung von Cytosin in N⁴-Hydroxycytosin eine Mutation von C nach T bewirkt.
Außerdem kann eine DNA, welche das AK III-Gen enthält, welches von der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin befreit ist, durch Verwendung einer Mutante, worin die AK III-Aktivität von der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin befreit ist, als DNA-Donorstamm erhalten werden. Diese Mutante kann aus Zellen erhalten werden, die beispielsweise einem herkömmlichen Mutationsbehandlungsverfahren, der Behandlung mit ultravioletten Strahlen oder der Behandlung mit einem Mutationsmittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) unterworfen worden sind, erhalten werden.
Im folgenden wird die Herstellung einer DNA beschrieben, welche ein Gen enthält, das für AK III (lysC) codiert. Zunächst wird E. coli mit einem Wildtyp von lysC, wie der MC1061-Stamm, kultiviert, um Zellkulturen zu erhalten. Die Kultivierung des vorstehend genannten Mikroorganismus kann durch ein herkömmliches Festkulturverfahren durchgeführt werden, es wird jedoch im Hinblick auf die Gewinnung der Zellen bevorzugt ein Flüssigkulturverfahren für die Kultivierung eingesetzt. Das Kulturmedium kann beispielsweise durch Zugeben eines oder mehrerer anorganischen Salze, wie Monokaliumphosphat (KH₂PO₃), Dikaliumphosphat (K₂HPO₃), Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Eisenchlorid, Eisensulfat oder Mangansulfat, zu einer oder mehreren Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt, Pepton, Rindfleischextrakt, Maisextrakt oder ein Extrakt von Sojabohnen oder Weizen, und dann durch weiteres Zugeben von Kohlenhydraten, Vitaminen usw., falls erforderlich, hergestellt werden. Der anfängliche pH-Wert des Kulturmediums wird auf etwa 7 bis 8 eingestellt. Die Kultivierung wird bei 30 bis 42°C, vorzugsweise etwa 37°C, während 4 bis 24 Stunden durch Belüftung und Rühren in einer Schüttelkultur, einer stehenden Kultur oder dergleichen durchgeführt. Das auf diese Weise erhaltene Kulturprodukt wird durch Zentrifugation bei beispielsweise 3000 Umdrehungen pro Minute während 5 Minuten getrennt, wobei Zellen des E. coli MC1061-Stamms erhalten werden.
Chromosomale DNA kann aus diesen Zellen beispielsweise durch das Verfahren von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta. 72, 619, 1963) dem Verfahren von K.S. Kirby (Biochem. J. 64, 405, 1956) und dergleichen erhalten werden.
Zur Isolierung des lysC-Gens wird die chromosomale DNA, die durch die vorstehenden Verfahren erhalten wurde, unter Einsatz geeigneter Restriktionsenzyme gespalten. Wenn der Grad der Spaltung durch Kontrollieren der Spaltungsreaktionszeit und dergleichen kontrolliert wird, können verschiedenste Restriktionsenzyme eingesetzt werden. Danach kann das Gen mit einer Vektor-DNA verknüpft werden, die in Escherichia-Bakterien replizieren kann, und die erhaltene rekombinante DNA kann eingesetzt werden, um einen Mutantenstamm von Escherichia, wie GT3, zu transformieren, welcher keine Aspartokinase I, II und III hat (um eine Genbibliothek zu erzeugen), und von den erhaltenen Transformanten kann ein Stamm isoliert werden, der die Fähigkeit erworben hat, in einem Minimalkulturmedium ohne Lysin zu wachsen, wodurch die rekombinante DNA, welche das lysC-Gen enthält, abgetrennt wird.
Genauer gesagt wird eine chromosomale DNA mit einem Restriktionsenzym, wie Sau3AI, bei einer Temperatur von 30°C oder höher, vorzugsweise 37°C, bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 10 Einheiten/ml während verschiedener Zeiträume (1 Minuten bis 2 Stunden) zur vollständigen oder teilweisen Verdauung verdaut, wobei ein Gemisch erhalten wird, das verschiedene chromosomale DNA-Fragmente enthält. Die Vektor-DNA, die in Escherichia-Bakterien replizieren kann, wird mit einem Restriktionsenzym, wie BamHI verdaut, welches dieselbe terminale Basensequenz produziert wie das Restriktionsenzym Sau3AI, das für die Spaltung der chromosomalen DNA eingesetzt wird, bei einer Temperatur von 30°C oder höher und einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten/ml während 1 Stunde oder länger, vorzugsweise 1 bis 3 Stunden, verdaut wird, um die vollständige Verdauung zu bewirken, wobei die gespaltene DNA erhalten wird. Danach wird das Gemisch, das DNA-Fragmente enthält, welche von E. coli MC1061 abgeleitet wurden und das lysC-Gen enthalten, welches auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt wurde, mit der gespaltenen Vektor-DNA gemischt, und eine DNA-Ligase, vorzugsweise T4 DNA-Ligase, wird mit diesem Gemisch bei einer Temperatur von 4 bis 16°C bei einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten/ml während einer Stunde oder länger, vorzugsweise 6 bis 24 Stunden, umgesetzt, wobei eine rekombinante DNA erhalten wird.
Die Vektor-DNA, die erfindungsgemäß eingesetzt wird, ist vorzugsweise eine Plasmidvektor-DNA, wie pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 und dergleichen. Zusätzlich können Phagen-DNA-Vektoren eingesetzt werden. Promotoren, die in Mikroorganismen funktionsfähig sind, wie lac, trp, PL und dergleichen, können für eine effiziente Expression des Gens eingesetzt werden, welches für den gewünschten Zweck nützlich ist. Der Ausdruck "rekombinante DNA", der hierin verwendet wird, umfaßt DNA, welche durch die Einführung des vorstehend genannten Gens durch Verfahren, welche Transposons (Berg, D.E. und Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417, 1983), Mu-Phagen (offengelegte japanische Patentanmeldung HEI 2-109985 ) oder homologe Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1972) einsetzen, erhalten wird.
Diese rekombinante DNA wird eingesetzt, um beispielsweise den E. coli-Stamm K-12, vorzugsweise den Stamm GT3 usw. zu transformieren, wobei ein Stamm, der rekombinante DNA aufweist, die das lysC-Gen enthält, aus den Stämmen mit erhöhter AK-Aktivität oder aus Stämmen mit komplementierten Nährstofferfordernissen erhalten wird. Die Transformation kann gemäß dem Verfahren von D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326, 1979) oder einem Verfahren durchgeführt werden, wodurch die Empfängerzellen mit Calciumchlorid behandelt werden, um den Grad des Eindringens der DNA zu erhöhen (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, 1970). Dann kann die rekombinante DNA, die durch den Einbau der DNA, welche das lysC-Gen enthält, in die Vektor-DNA hergestellt wird, aus den vorstehend genannten Stämmen beispielsweise gemäß dem Verfahren von P. Guerry et al. (J. Bacteriol., 116, 1064, 1973) oder dem Verfahren von D.B. Clewell (J. Bacteriol., 110, 667, 1972) isoliert werden.
Daß der Kandidatenstamm die rekombinante DNA mit dem lysC-Gen tatsächlich enthält, und kann dadurch bestätigt werden, daß eine Zellextraktlösung hergestellt wird und daraus dann eine Rohenzymlösung zur Untersuchung der Aspartokinaseaktivität hergestellt wird. Das Meßverfahren für die Enzymaktivität der Aspartokinase kann gemäß dem Verfahren von Stadtman et al. durchgeführt werden (Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras, G., und Robichon-Szulmajster, H., J.Biol. Chem., 236, 2033, 1961).
Alternativ dazu kann das lysC-Gen durch Amplifizieren des lysC-Gens aus der chromosomalen DNA, welche durch das Verfahren von Saito und Miura erhalten wird, durch PCR erhalten werden (Polymerase-Kettenreaktion; vergl. White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185, 1989). Der für die Amplifikation einzusetzende DNA Primer ist komplementär zu den 3'-Enden der doppelstängigen DNA, welche einen vollständigen Bereich des lysC-Gens oder ein Segment davon enthält. Wenn nur ein Teil des lysC-Gens zu amplifizieren ist, muß die Genbank auf die Anwesenheit von DNA-Fragmenten, welche den vollständigen Bereich enthalten, unter Einsatz des DNA-Fragments als Primer gescreent werden. Wenn der vollständige Bereich zu amplifizieren ist, muß das DNA-Fragment einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen werden, und dann wird die gewünschte Bande ausgeschnitten, um das DNA-Fragment, welches das lysC-Gen enthält, zu gewinnen.
Der DNA-Primer kann in geeigneter Weise beispielsweise auf der Grundlage einer bekannten Sequenz von E. coli (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. und Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986) hergestellt werden, wobei zwei bevorzugte Typen von Primern 5'-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3' (SEQ ID Nr.:2) und 5'-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3' (SEQ ID Nr.:3) sind, welche die 1347 Basen lange Region, welche für das lysC-Gen codiert, amplifizieren können. Die Synthese der DNA kann auf herkömmliche Weise unter Einsatz eines DNA-Synthetisiergeräts Modell 380B, hergestellt von Applied Biosystems Co., und der Phosphoamidid-Methode (vergl. Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981) durchgeführt werden. Die PCR-Reaktion kann unter Einsatz eines DNA-Thermocyclers Modell PJ2000, hergestellt von Takara Shuzo Co., und Tag DNA-Polymerase, hergestellt von Takara Shuzo Co., gemäß dem vom Hersteller angegebenen Verfahren durchgeführt werden.
Das lysC-Gen, welches durch das PCR-Verfahren amplifiziert worden ist, wird mit der Vektor-DNA verknüpft, welche in Escherichia-Bakterien replizieren kann, und sie wird in solche Zellen eingeführt. Das zur Transformation der Wirtszelle mit der Vektor-DNA einzusetzende Verfahren und das Verfahren zur Bestätigung der Anwesenheit von lysC sind dieselben wie die vorstehend beschriebenen Verfahren.
Das Verfahren zum Einführen von Mutationen in das erhaltene lysC-Gen, wie Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren, kann durch das Verfahren der rekombinanten PCR (Higuchi, R., 61 in PCR Technology (Erlich, H.A., Eds., Stockton Press, 1989)) und durch das Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese (Kramer, W. und Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350, 1987; Kunkel, T.A. et al., Meth in Enzymol., 154, 367, 1987) usw. bewirkt werden. Unter Einsatz dieser Verfahren kann eine gewünschte Mutation an einer gewünschten Stelle bewirkt werden. Außerdem kann zum Einführen einer statistischen Mutation ein Verfahren eingesetzt werden, bei dem das zu behandelnde Gen direkt auf der chromosomalen DNA oder auf einem Plasmid mit Hydroxylamin behandelt wird (Hashimoto, T. und Sekiguchi, M., J. Bacteriol., 159, 1039, 1984); ein herkömmliches Verfahren, welches das Bestrahlen von Zellen, welche die zu behandelnde DNA enthalten, mit ultravioletten Strahlen oder das Behandeln mit einem chemischen Mittel, wie N-Methyl-N'-nitrosoguanidin, salpetriger Säure oder dergleichen, umfaßt; oder ein Verfahren, bei dem das gewünschte Gen chemisch synthetisiert wird.
Das Verfahren zum Auswählen des von der Rückkopplungshemmung befreiten Gens lysC* umfaßt als erstes die Transformation eines AK-defekten Stammes, wie E. coli GT3, mit der mutierten rekombinanten DNA. Danach wird die Transformante in einem Minimalmedium, wie M9, welches eine signifikante Menge von Lysin enthält, kultiviert. Die Stämme, welche Plasmide mit dem Wildtyp-lysC enthalten, zeigen die Inhibition durch Lysin von AK III, welche die einzige AK in dem Stamm ist, und dadurch ist die Synthese von Threonin, Isoleucin, Methionin und Diaminopimilinsäure (DAP) nicht mehr möglich und ist das Wachstum inhibiert. Im Gegensatz dazu sollten Stämme, welche Plasmide mit lysC* enthalten, welches keine Inhibition durch Lysin zeigt, auf einem Minimalmedium, welches eine signifikante Menge von Lysin enthält, wachsen können. Unter Einsatz dieses Phänomens können die gewünschten Stämme ausgewählt werden, d. h. Stämme, die Plasmide mit lysC* enthalten, welches keine Inhibition zeigt, d. h. solche, die gegen Lysin oder S-2-Aminoethylcystein (AEC), einem Analogon von Lysin, resistent sind.
Das auf diese Weise erhaltene vorstehend genannte mutierte Gen kann als rekombinante DNA zur Einführung in einen geeigneten Mikroorganismus (Wirtszelle) eingesetzt und darin exprimiert werden, wobei ein Mikroorganismus erhalten wird, der AK enthält, die keine Rückkopplungshemmung zeigt.
Die vorstehend erwähnten Wildtypstämme von Escherichia können als Wirtszellen eingesetzt werden, in die das erhaltene lysC-Gen oder das mutierte lysC-Gen (lysC*) eingeführt und dann zur Herstellung von Threonin amplifiziert werden soll, jedoch können abgesehen von diesen beliebige andere Bakterien als Wirtszellen eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß sowohl der Replikationsursprung der rekombinanten Vektor-DNA, die hier eingesetzt wird, als auch das lysC-Gen oder das mutierte lysC-Gen (lysC*) funktionieren, die rekombinante Vektor-DNA in diesen Bakterien replizieren kann und das lysC-Gen oder das mutierte lysC-Gen (lysC*) darin exprimiert werden kann. Die am stärksten bevorzugte Wirtszelle ist der E. coli-Stamm B-3996.
Die auf diese Weise erhaltenen Transformanten, welche die rekombinante Vektor-DNA aufweisen, welche das Gen enthält, das für Aspartokinase III ohne Rückkopplungshemmung durch Lysin codiert, werden kultiviert, und das gewünschte L-Threonin wird hergestellt und in der Kulturlösung akkumuliert und dann gewonnen.
Das für die Herstellung von L-Threonin einzusetzende Kulturmedium ist ein herkömmliches Kulturmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen, und, falls erforderlich, andere organische Komponenten enthält.
Die einzusetzende Kohlenstoffquelle kann ein Saccharid, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose und hydrolisierte Stärke, ein Alkohol, wie Glycerin oder Sorbit, oder eine organische Säure, wie Fumarsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure oder dergleichen, sein.
Die einzusetzende Stickstoffquelle kann ein anorganisches Ammoniumsalz, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat usw., ein organischer Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysat, oder Ammoniakgas, Ammoniakwasser oder dergleichen sein.
Eine erforderliche Substanz, wie Vitamin B1, L-Homoserin oder dergleichen, oder Hefeextrakt wird vorzugsweise in einer geeigneten Menge als Quelle für organische Spurenelemente zugegeben. Zusätzlich zu diesen werden Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen usw., falls erforderlich in kleinen Mengen zugegeben.
Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während 16 bis 72 Stunden durchgeführt, während die Kultivierungstemperatur auf 25 bis 45°C und der pH-Wert der Kultur auf 5 bis 8 reguliert wird. Für die Regulation des pH- Wertes können anorganische oder organische Säuren, alkalische Substanzen oder Ammoniakgas usw. eingesetzt werden. Die Gewinnung des L-Threonins aus der Fermentationsbrühe wird durch Kombinieren eines herkömmlichen Ionenaustauschverfahrens, eines Ausfällungsverfahrens und beliebigen anderen bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein schematisches Diagramm des Biosyntheseweges von Threonin.
2 ist eine Restriktionsenzymkarte für pLYSC1 und pLYSC2 (vergl. Beispiel 1).
3 ist ein Graph, der die Wirkungen der durch Hydroxylamin bewirkten Mutationen in lysC zeigt (vergl. Beispiel 2 (2-4)).
4 zeigt den Grad der lysinabhängigen Inhibition von Aspartokinasen, die durch die verschiedenen lysC*-Gene codiert werden (vergl. Beispiel 3 (3-4)). Die Lysinkonzentrationen auf der horizontalen Achse sind logarithmisch angegeben. Die spezifischen Aktivitäten auf der vertikalen Achse sind als Verhältnisse angegeben, wobei als 100% die Aktivität eines Wildtyps von AK III mit 0 mM Zugabe von Lysin definiert ist.
5 zeigt ein Diagramm für die Konstruktion von pLLC* (vergl. Beispiel 4 (4-1)).
6 zeigt ein Diagramm für die Konstruktion von pVICLC*A und pVICLC*B (vergl. Beispiel 4 (4-3)).
7. zeigt die Mutationsstellen jedes LysC* (vergl. Beispiel 5 (5-2)).
Beste Ausführungsform der Erfindung
Eine eingehendere Beschreibung vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele nachstehend gegeben.
Beispiel 1: Klonierung des Wildtypgens lysC
Die Basensequenz des lysC-Gens von E. coli ist bereits berichtet worden (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. und Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986), und es ist bekannt, daß sein offener Leserahmen (ORF) 1347 Basen hat, welche für 449 Aminosäuren codieren. Da ein Operator vorhanden ist, der für die Repression durch Lysin verantwortlich ist, wurde dieser Operator entfernt, und die Klonierung wurde dadurch bewirkt, daß nur die Region, welche die SD-Sequenz und den ORF enthält, unter Einsatz des PCR-Verfahrens amplifiziert wurde.
Es wurden zwei verschiedene Primer,
5'-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3' (Sequenz Nr. 2) und
5'-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3' (Sequenz Nr. 3) hergestellt, und die gesamte genomische DNA von E. coli K-12 MC1061 wurde durch das Verfahren von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, 1963) gewonnen. Diese DNA wurde in einer PCR-Reaktion gemäß dem Verfahren von Erlich et al. (PCR Technology, Stockton Press, 1989) eingesetzt, um die gewünschte DNA zu amplifizieren. Die erhaltene DNA wurde mit BamHI und AseI verdaut, und dann wurden deren Enden doppelsträngig gemacht und die DNA wurde in die SmaI-Stelle des Mehrkopienvektors pUC18 eingebaut. Somit wurden zwei Typen von Plasmiden erhalten, ein Gegensinnplasmid (pLYSC1) und ein Sinnplasmid (pLYSC2), bezogen auf den lacZ-Promotor (2).
Diese Plasmide wurden für die Transformation von E. colie GT3-Stämmen (thrA1016^b, metLM1005, lysC1004), welchen die AK I, II und III vollständig fehlen, eingesetzt, und da der Bedarf von GT3 an Homoserin und Diaminopimilinsäure komplementiert wurde, bestätigte dies, daß das für die aktive AK III codierende Gen lysC war.
Beispiel 2: Bereitstellung des von der Inhibition befreiten mutierten Gens lysC*
(2-1)
Um ein von der Inhibition befreites lysC-Gen (lysC*) effizient zu erhalten, wurde das Gen in der in Beispiel 1 hergestellten rekombinanten Plasmid-DNA einer Mutationsbehandlung unterworfen.

Als Verfahren zur Herstellung des von der Inhibition befreiten mutierten Gens lysC* wurde zuerst das rekombinante Plasmid mit dem Wildtyp lysC in den vollständig AK-freien E. coli-Stamm GT3 eingeführt. Eine signifikante Menge von Lysin wurde zu einem M9 Minimalmedium gegeben, welches die in der nachstehenden Tabelle 1 aufgelistete Zusammensetzung hatte, und die Transformanten wurden in dem Medium kultiviert. Die Stämme, welche Plasmide mit dem Wildtyp von lysC enthielten, zeigten Inhibition der einzigen AK, nämlich AK III, durch Lysin, wodurch die Synthese von Threonin, Isoleucin, Methionin und Diaminopimilinsäure (DAP) nicht mehr möglich war und das Wachstum inhibiert wurde. Tabelle 1: M9 Minimalmedium

A:20 × M9	(g/l)
Na₂HPO₄·12H₂O	303
KH₂PO₄	60
NaCl	10
NH₄Cl	20
B:1 M MgSO₄
C:50% Glucose
D:1 g/l Thiamin
A, B, C, D und Wasser wurden getrennt sterilisiert und bei einem Verhältnis von A:B:C:D:Wasser = 5:0,1:1:0,1:95 gemischt.

Im Gegensatz dazu sind die Stämme, welche die Plasmide mit lysC* enthalten, welches von der Inhibition durch Lysin befreit ist, erwartungsgemäß fähig, in einem Minimalmedium zu wachsen, welches eine signifikante Menge von Lysin enthält. Unter Einsatz dieses Phänomens wurde die Selektion von Stämmen durchgeführt, deren Wachstum gegen Lysin oder S-2-Aminoethylcystein (AEC), einem Analogon von Lysin, resistent war, d. h. Stämme mit Plasmiden mit lysC*, welche von der Inhibition befreit sind.
(2-2) Untersuchung der Bedingungen für die Selektion der lysC-Mutanten (lysC*), welche von der Rückkopplungshemmung befreit sind
Zuerst wurden pLYSC1 und pLYSC2 jeweils in E. coli GT3 durch Transformation eingeführt, wobei zwei unterschiedliche Transformanten erhalten wurden, welche auf einem M9 Minimalagarplattenmedium, welches Lysin oder AEC enthält, kultiviert wurden. Es wurde auch die Konzentration von Lysin oder AEC für die Inhibition des Wachstums bestimmt, und die Bedingungen für die Selektion von lysC* wurden untersucht.
Wie 2 zeigt, war es klar, daß in Bezug auf pLYSC2 die exprimierte Menge durch den lacZ-Promotor amplifiziert wurde, und somit war selbst der Wildtyp von lysC gegen eine hohe Konzentration von Lysin oder AEC resistent. Da jedoch das lysC-Gen von pLYSC1 im Hinblick auf dem lacZ-Promotor in Gegensinnrichtung vorhanden war und der Promotor des lysC-Gens selbst fehlte, war die exprimierte Menge gering und das Wachstum wurde bei einer niedrigen Konzentration von Lysin oder AEC inhibiert (Wachstum wurde vollständig durch Zugabe von entweder Lysin oder AEC bei etwa 0,2 mM inhibiert. "+" in der Tabelle steht für Wachstum der Transformante und "–" steht für kein Wachstum der Transformante). Es wurde gefunden, daß diese Inhibition des Wachstums durch die gleichzeitige Zugabe von Homoserin und DAP wieder hergestellt werden konnte.
Tabelle 2: Beziehung zwischen dem Wachstum des vollständig AK-freien GT3-Stamms, welcher das lysC-Plasmid aufweist, und der Konzentration des zugegebenen Lysins oder des Lysinanalogons AEC (a): Lysin-Konzentration und Wachstum

0 0,2 0,4 0,8 1,5 3 6 12 25 50 100 200 (mM)

GT3/pLYSCl + – – – – – – – – – – –

GT3/pLYSC2 + + + + + + + + + + + +

(b): AEC-Konzentration und Wachstum

0 0,2 0,4 0,8 1,5 3 6 12 25 50

GT3/pLYSC1 + – – – – – – – – –

GT3/pLYSC2 + ± ± ± ± ± – – – –

M9 Agarmedium, 37°C, 2 Tage Kultivierung
+: Wachstum, ±: geringes Wachstum, –: kein Wachstum

Somit wurde pLYSC1 in dem Experiment zur Einführung der Mutation eingesetzt, und das für die Selektion des lysC* eingesetzte Selektionsmedium wurde durch Zugeben von 10 mM Lysin oder 0,2 mM AEC zu dem M9 Minimalmedium hergestellt.
(2-3) Mutationsbehandlung
Hydroxylamin ist ein chemisches Mutationsmittel, welches durch Umwandeln von Cytosin in N⁴-Hydroxycytosin eine Mutation von C nach T bewirkt. Um eine Mutation in dem Plasmid zu bewirken, werden zwei Verfahren eingesetzt, wobei eines eine in vitro Mutationsbehandlung ist, bei dem das Plasmid direkt mit Hydroxylamin behandelt wird, und das andere ein in vivo Mutationsbehandlungsverfahren ist, wobei verschiedene Mutationen bereitgestellt werden, d. h. andere als die Mutation von C nach T, wobei bei diesem Verfahren Zellen, welche die Plasmide enthalten, mit Nitrosoguanidin (NTG) behandelt werden und dann die Plasmide extrahiert werden.
(2-4) In vitro Mutationsbehandlung mit Hydroxylamin
Eine 2 µg Portion der DNA wurde in einer Reaktionslösung, die nachstehend in Tabelle 3 gezeigt ist, d. h. in 0,4 M Hydroxylamin, 1–4 Stunden bei 75°C behandelt.
Die behandelte DNA wurde mit Glaspulver gereinigt und dann für die Transformation in einen vollständig AK-freien GT3-Stamm eingesetzt, welcher auf ein Komplettmedium (L-broth; 1% Bactotrypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 1,5% Agar) plattiert wurde, um Kolonien zu bilden. Die gebildeten Kolonien wurden auf das in (2-1) erhaltene Selektionsmedium als Abdruck plattiert. Der Anteil der Transformanten und das Mutationsverhältnis variierte wie in 3 gezeigt. Nach einer vierstündigen Behandlung war die Ausbeute des Mutantenstamms 0,5 bis 0,8%, was ziemlich hoch ist. Tabelle 3: Reaktionslösungszusammensetzung

0,1 M KH₂PO₄–1 mM EDTA (pH 6,0) 100 µl

1 M Hydroxylamin–1 mM EDTA (pH 6,0) 80 µl

DNA 2 µg

Wasser Rest

-

Insgesamt 200 µl
(2-5) In vivo Mutationsbehandlung mit Nitrosoguanidin (NTG)

pLYSC1 wurde für die Transformation von E. coli MC1061 eingesetzt, und die Zellen wurden direkt mit NTG behandelt. Die behandelten Zellen wurden über Nacht kultiviert, um die Mutation zu etablieren. Danach wurden die Plasmide daraus extrahiert und für die Transformation in GT3 eingesetzt, dann wurde auf dieselbe Weise wie in (2-4) gescreent, wobei lysinresistente (Lys^R) oder AEC-resistente(AEC^R)-Mutanten erhalten wurden. Die Behandlung wird in der nachstehenden Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4: Beschreibung der Behandlung

(1) Kultivieren der Zellen, die das gewünschte Plasmid enthalten, in einem 2 × TV-Medium (1,6% Bactotrypton, 1% Hefeextrakt, 0,5% NaCl), danach wurden die Zellen bei einer O.D. 660 nm von etwa 0,3 gewonnen;
(2) Waschen mit TM-Puffer;
(3) Suspendieren in NTG-Lösung (0,2 mg/ml in TM-Puffer), danach Behandlung bei 37°C während 0–90 Minuten;
(4) Waschen mit TM-Puffer und 2 × TV-Medium, danach Kultivieren über Nacht in 2 × TV-Medium und Etablieren der Mutation;
(5) Extrahieren der Plasmid-DNA aus Zellen, Transformieren des GT3-Stamms und Screenen auf rekombinante Stämme.

Die Zusammensetzung des TM-Puffers war wie folgt:

Tris 50 mM

Maleinsäure 50 mM

(NH₄)₂SO₄ 1 g/l

MgSO₄·7H₂O 0,1 g/l

Ca(NO₃)₂ 5 mg/l

FeSO₄·7H₂fO 0,25 mg/l

Mit NaOH auf pH 6,0 eingestellt.

Beispiel 3: Isolierung des lysC*-Gens
(3-1)
Es wurden insgesamt 180 Kandidatenstämme, die in Beispiel 2 erhalten wurden (48 Stämme waren mit Hydroxylamin behandelt und 132 Stämme waren mit NTG behandelt), auf ein Selektionsmedium aufgetragen, und das Vorhandensein von AEC- oder Lysinresistenz wurde für 153 Stämme bestätigt. Unter Berücksichtigung der Differenz in den Mustern der Aminosäureakkumulation in dem Medium wurden 153 Stämme in 14 Gruppen aufgetrennt, und ein repräsentativer Stamm jeder Gruppe wurde für die Messung der AK-Aktivität ausgewählt. Da keine große Differenz zwischen den Mutanten, die mit Hydroxylamin behandelt wurden, und solchen, die mit NTG behandelt wurden, bestand, wurde das Experiment ohne Unterscheidung zwischen den zwei Mutanten weitergeführt.
(3-2) Messung der Aspartokinaseaktivität
Ein vollständig AK-freier GT3-Stamm wurde als Wirtsstamm für die vorstehend genannten 14 mutierten pLYSC1 (als pLYSC1*-Serien bezeichnet) bzw. Wildtyp pLYSC1-Plasmide transformiert, danach wurde ein zellfreier Extrakt aus den Transformanten hergestellt, und die Enzymaktivität von AK III wurde gemessen. Das Verfahren zur Messung der Enzymaktivität war wie folgt.
(3-3) Meßverfahren für die AK III-Aktivität.
(3-3-1) Verfahren zur Herstellung der Rohenzymlösung

(1) Kultivieren der Zellen in 2 × TV Medium, danach wurden die Zellen bei einer O.D. (660 nm von etwa 0,8) gewonnen;
(2) Waschen mit 0,02 M KH₂PO₉ (pH 6,75), 0,03 M β-Mercaptoethanol bei 0°C.
(3) Zerstören der Zellen durch Schallbehandlung (0°C, 100 W, 4 × 30 sec);
(4) Zentrifugieren bei 0°C, 33000 UpM während einer Stunden, danach Zugeben von Ammoniumsulfat zu dem Überstand bis 80% Sättigung;
(5) Zentrifugieren, danach Auflösen der Pellets in dem Puffer der vorstehenden Stufe (2) und Aufbewahren der Lösung (–20°C).

(3-2-2) Verfahren zur Messung der Enzymaktivität
Das Verfahren zur Messung der Enzymaktivität wurde gemäß dem Verfahren von Stadtman et al. durchgeführt (Stadtman, E.R., Cohen, G.N., Lebras, G. und Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem., 236, 2033, 1961).

Die nachstehende Tabelle 5 gibt die Zusammensetzung der Reaktionslösung an. Tabelle 5: Reaktionslösungszusammensetzung

Reaktionsgemisch^*1		0,3 ml
Hydroxylaminlösung^*2		0,2 ml
0,1 M Kaliumaspartat (pH 7,0)		0,1 ml
Enzymlösung
Wasser		Rest
Insgesamt		1,0 ml
^*1: 9 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,1) + 0,5 ml 0,3 M MgSO₄ + 5 ml 0,2 M ATP (pH 7,0)
^*2: 8 M Hydroxylamin, das unmittelbar vor der Verwendung mit KOH neutralisiert wurde.
Die Reaktionslösung ohne Kaliumaspartat wurde als Blindwert definiert.

Das Meßverfahren ist in der nachstehenden Tabelle 6 beschrieben. Tabelle 6: Beschreibung des Meßverfahrens

(1) Inkubation der Reaktionslösung bei 27°C während 45 Minuten;
(2) Zugeben einer FeCl₃-Lösung (0,4 ml 2,8 NHCl + 0,4 ml 12% TCA + 0,7 ml 5% FeCl₃·6H₂O/0,1 N HCl) zur Färbung;
(3) Zentrifugation, danach Messung des Absorptionswertes des Überstandes bei 540 nm (A₅₄₀). Die Aktivität wurde als Menge der während einer Minute hergestellten Hydroxamsäure ausgedrückt. 1 U = 1 μmol/min. Molarer Absorptionskoeffizient = 600.

Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
(3-4) Grad der Freisetzung der lysinabhängigen Inhibition
Für die Messung der Enzymaktivität von AK wurde Lysin zu den Enzymreaktionslösungen bei verschiedenen Konzentrationen gegeben, und es wurden die Werte der lysinabhängigen Inhibition bestimmt. Der Wildtyp von AK III wurde durch Lysin sehr stark inhibiert, beispielsweise ergab 0,45 mM Lysin eine Inhibition von 50%, und 5 mM Lysin ergaben etwa 100% Inhibition (4).
Im Gegensatz dazu zeigten die hierin erhaltenen Mutanten von AK III verschiedene Grade der Befreiung von der Inhibition, jedoch zeigten alle 14 eine gewisse Befreiung von der lysinabhängigen Inhibition (4 und Tabelle 7). Insbesondere wurde in den Fällen der Nr. 24, 80, 117, 169 und 172 selbst mit 100 mM Lysin praktisch keine Inhibition beobachtet, und die Konzentration für eine Inhibition von 50% war die 200 fache oder höher.
Auch war die spezifische Aktivität, d. h. die Aktivität des Enzyms pro Proteineinheit, gleich oder größer als diejenige des Wildtyps, selbst unter Berücksichtigung des Einflusses der Wachstumsbedingungen der Zellen und der Herstellung der Probe, und es zeigte sich kein Problem einer verminderten Aktivität aufgrund der Einführung der Mutationen (Tabelle 7). Daraus wurde geschlossen, daß die aktive Stelle der AK III und die Stelle, welche für die Regulation durch Lysin verantwortlich ist, unabhängig voneinander sind.

Tabelle 7 zeigt die Freisetzung von der Inhibition als Aktivität (%) in Anwesenheit von 100 mM Lysin, bezogen auf die Aktivität der lysinfreien Reaktionslösung, und die thermische Stabilität ist als Beibehaltung der Aktivität (%) nach der Behandlung bei 55°C während 1,5 Stunden, bezogen auf die Aktivität ohne Erwärmen, angegeben. Tabelle 7: Freisetzung der Inhibition durch Lysin und thermische Stabilität

	Spezifische Aktivität (µ/mg Protein)	Freisetzung der Inhibition (%f)	Thermische Stabilität (%)
Wildtyp	0,247	0	18
Nr. 117	0,0069	120	0
Nr. 24	0,0218	100	30
Nr. 80	0,0244	99	36
Nr. 172	0,0189	97	0
Nr. 169	0,0128	96	2
Nr. 150	0,0062	77	25
Nr. 126	0,0250	61	39
Nr. 149	0,0256	59	9
Nr. 167	0,0083	43	45
Nr. 48	0,0228	38	42
Nr. 60	0,0144	35	9
Nr. 158	0,0224	22	42
Nr. 156	0,0101	18	2
Nr. 43	0,0212	17	0

(3-5) Thermische Stabilität
Wenn die Aktivität bestimmter Enzyme verbessert werden soll, ist es wichtig, daß sie in den Zellen stabil sind. Wegen des Unterschieds in der Aktivität von Proteasen innerhalb und außerhalb der Zellen und des Einflusses des Aufbewahrungspuffers wird deren Messung vorzugsweise in vivo durchgeführt, hier wird jedoch aus Zweckmäßigkeitsgründen die thermische Stabilität als Parameter jeder der Mutanten von AK III in vitro getestet.
Als ein Ergebnis der verschiedenen Tests bezüglich der Temperatur, bei der die Inaktivierung der AK III auftritt, wurde die Temperatur auf 56°C eingestellt und der Anteil der Beibehaltung der Aktivität wurde nach einer 90 minütigen Behandlung bestimmt. Die vorstehende Tabelle 7 zeigt, daß die Hälfte der Mutanten dem Wildtyp überlegen war. Im allgemeinen neigen mutierte Proteine dazu, weniger stabil als deren Wildtyp zu sein, jedoch hatten einige der hier erhaltenen mutierten Typen von AK III eine größere Stabilität als der Wildtyp, so daß man davon ausgeht, daß viele als Enzyme für die praktische Herstellung von L-Threonin sehr nützlich sind.
Beispiel 4: Produktion von L-Threonin durch Fermentation unter Einsatz eines Stammes in den lysC* eingeführt wurde
(4-1)
Von den bislang bekannten Threonin produzierenden E. coli-Stämmen zeigt der Stamm B-3996 größte Fähigkeit zur Produktion von Threonin. Es wurde deshalb beschlossen, den Stamm B-3996 als Wirtsstamm für die Untersuchung von lysC* zu verwenden. Der Stamm B-3996 wurde beim Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganism unter der Nr. BKIIM (VKPM) B-3996 hinterlegt. Außerdem wurden als zu untersuchende lysC* 6 Typen mit unterschiedlichen Graden der Freisetzung der Inhibition und spezifischen Aktivitäten (Nr. 24, 43, 60, 80, 149 und 167 in Tabelle 7) für den Einsatz in dem folgenden Experiment bereitgestellt.
Zuerst wurde, um den Grad der Exprimierung des lysC* zu erhöhen, jeder der vorstehend genannten 6 Typen von lysC* in dem Plasmid pLYSC1* in den Bereich stromabwärts des lacZ-Promotors des Vektor pHSG399 (hergestellt von Takara Shuzo Co.) eingeführt, um den invertierten Einbau jedes lysC* zu bewirken. Die auf diese Weise erhaltenen neuen Plasmide wurden unter der Bezeichnung pLLC*-Reihe zusammengefaßt (5). Die E. coli HB101-Stämme, in welche die Plasmide mit den vorstehend genannten lysC* Nr. 80 und 167 eingebaut worden waren, wurden als AJ12750 bzw. AJ12751 bezeichnet, und sie wurden ursprünglich beim National Institute of Bioscience and Human Technology (Japan) am 1. September 1992 hinterlegt. AJ12750 wurde mit der Nr. FERM P-13136 versehen (die Hinterlegung wurde am 4. November 1993 in eine internationale Hinterlegung mit der Nummer FERM BP-4462 umgewandelt), und AJ12751 wurde mit der Nr. FERM 13137 versehen (die Hinterlegung wurde am selben Tag in eine internationale Hinterlegung mit der Nr. FERM BP-4463 umgewandelt). Die anderen Stämme wurden nicht hinterlegt, da jedoch alle Mutationsstellen für jedes lysC* wie nachstehend beschrieben entdeckt wurden, kann der Fachmann die Plasmide aus den vorstehend genannten hinterlegten Bakterien nach dem Verfahren von Maniatis et al. (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1, 21, 1989) gewinnen, um das gewünschte lysC*-Gen mit ortsgerichteter Mutagenese zu erhalten (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15, 83, 1989). Ein herkömmliches Verfahren wurde eingesetzt, um diese Plasmide für die Untersuchungen in den Stamm B-3996 einzuführen.

Die Kultivierung wurde unter Einsatz des in der nächstehenden Tabelle 8 gezeigten Kulturmediums (die Komponenten A, B und C wurden getrennt voneinander sterilisiert) während einer Kultivierungszeit von 38 Stunden bei einer Temperatur von 37°C unter Rühren bei 114 bis 116 Umdrehungen pro Minute durchgeführt. Tabelle 8: Threoninproduktionsmedium

		(g/l)
A:	(NH₄)₂SO₄	16
	KH₂PO₄	1
	MgSO₄·7H₂O	1
	FeSO₄·7H₂O	0,01
	MnSO₄·5H₂O	0,01
	Hefeextrakt (Difco)	2
	L-Met	0,5
	Mit KOH aufpH 7,0 eingestellt und 10 Minuten bei 115°C autoklaviert(16/20vol.).
B:	20% Glucose, 10 Minuten bei 115°C autoklaviert (4/20 Vol.).
C:	pharmakopöetisches CaCO₃, 2 Tage bei 180°C autoklaviert (30g/l)
D:	Antibiotika (100 μg/ml Streptomycin und 5 μg/ml Kanamycin).

(4-2) Untersuchung von lysC*
Jedes der Plasmide der pLLC*-Serie wurde für die Transformation des Stammes B-3996 eingesetzt, und jede Transformante wurde sowohl unter den Bedingungen der Zugabe von I g/l Lysin bzw. ohne die Zugabe von Lysin kultiviert. Als Kontrollen wurden die Wirtsstämme B-3996 mit und ohne ein Plasmid, das den Wildtyp von lysC (pLLCl) trägt, hergestellt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. In dieser Tabelle sind die Werte in den Klammern die Verhältnisse der Lysinausbeuten (g) pro 1 g verbrauchtem Saccharid zu der Lysinausbeute (g) pro 1 g verbrauchtem Saccharid, die erhalten wird, wenn B-3996 ohne die Zugabe von Lysin (Kontrolle) kultiviert wurde. Das bedeutet, daß die letztere Ausbeute als 1,00 betrachtet wird. Die Lysinempfindlichkeit wird als (Lysinausbeute pro verbrauchtem Saccharid mit Zugabe von Lysin)/(Lysinausbeute pro verbrauchtem Saccharid ohne die Zugabe von Lysin) definiert. Bezogen auf den Stamm B-3996 war die Verringerung der Ausbeute pro verbrauchtem Saccharid, die bei der mit Lysin versetzten Kultur beobachtet wurde, etwa 0,74, bezogen auf diejenige, die bei der Kultur ohne zugegebenes Lysin beobachtet wurde. Im Fall der Stämme, in welche ein lysC* eingeführt worden war, wie B-3996/pLLC*149, war jedoch die Verringerung der Ausbeute pro verbrauchtem Saccharid, die in der mit Lysin versetzten Kultur beobachtet wurde, etwa 0,96, bezogen auf diejenige, die in der Kultur ohne Lysin beobachtet wurde. Daraus wird geschlossen, daß die AK III, die durch lysC codiert wird, zu der Biosynthese von Threonin beiträgt, und daß die Inhibition der AK III-Aktivität durch die Zugabe von Lysin andererseits mit der Inhibition der Threoninbiosynthese zusammenhängt. Dieses Phänomen wird verringert, wenn das lysC* gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird. Tabelle 9

	Menge an zugegebefern Lysin (g/l)	Restliches Saccharid (g/l)	Thr (g/l)	Ausbeute pro verbrauchtem Saccharid (%)	Lysinempfindlichkeit
B-3996	0	0,09	12,1	30,7 (1,00)
	1	0,12	8,9	22,6	0,74
B-3996/pLLCl	0	0,07	13,1	33,0 (1,07)
(Wild)	1	0,14	11,1	28,3	0,87
B-3996/	0	0,11	15,4	38,5 (1,25)
pLLC*24	1	0,08	12,7	32,3	0,84
B-3996/	0	0,09	15,1	38,3 (1,25)
pLLC*43	1	0,12	14,4	35,5	0,93
B-3996/	0	1,32	13,8	36,3 (1,18)
pLLC*60	1	2,66	11,6	31,4	0,86
B-3996/	0	0,10	15,7	39,7 (1,29)
pLLC*80	1	0,09	13,9	35,6	0,90
B-3996/	0	0,07	12,8	32,1 (1,04)
pLLC*149	1	1,80	11,3	30,7	0,96
B-3996/	0	0,07	15,5	39,8 (1,30)
pLLC*167	1	0,10	13,9	35,3	0,89

Im Bezug auf die Threoninproduktion der lysinfreien Kultur war auch klar, daß die Stämme, welche das Plasmid mit dem Wildtyp lysC tragen, verbesserte Produktivität gegenüber dem Stamm B-3996 ohne ein solches Plasmid ergaben und daß die Produktivität durch die Stämme mit den mutierten Genen lysC* weiter erhöht wurde (etwa 1,3 fach gegenüber der Wirtszelle im Fall der Nr. 80). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß AK III einer der geschwindigkeitsbestimmenden Faktoren bei der Produktion von Threonin durch den Stamm B-3996 ist. Die Kultivierung der Zellen, in welche ein mutiertes Gen lysC* eingeführt worden war, ergab in Abwesenheit von Lysin eine verbesserte Ausbeute im Vergleich zu solchen Zellen, in welche das Wildtypgen lysC eingeführt worden war, und man geht davon aus, daß dies auf den Umstand zurückzuführen ist, daß letztere Zellen eine Inhibition des Wildtyps von AK III durch das in diesen Zellen selbst biosynthetisierte Lysin zeigen.
(4-3) Stabilisierung der Plasmide mit mutierten lysC*
Plasmide, die in 6 gezeigt sind, wurden dadurch hergestellt, daß lysC* in beide Richtungen an der BamHI-Stelle des Plasmids pVIC40, welches aus dem Stamm B-3996 extrahiert wurde, eingebaut wurde. Das Verfahren zur Gewinnung von pVIC40 aus dem Stamm B-3996 wurde bereits vorstehend beschrieben. Es wurden als lysC* die Nr. 80, die eine hohe Threoninproduktion aufweist, und für Vergleichszwecke damit die Nr. 43 ausgewählt, wobei 4 unterschiedliche Plasmide erhalten wurden, nämlich pVICLC*80A, pVICLC*80B, pVICLC*43A und pVICLC*43B.

Für die Verwendung als Wirtszelle wurde der Stamm B-399 (Stamm B-3996, aus dem pVIC40 entfernt wurde) durch Entfernen des Plasmids (curing) aus dem Stamm B-3996 neu hergestellt. Das Entfernen des Plasmids wurde durch dreimaliges Wiederholen einer 1/100 fachen Verdünnung einer Kulturlösung des Stammes B-3996 mit einem streptomycinfreien Kulturmedium (L-broth) durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur war 40°C. In den auf diese Weise erhaltenen Stamm B-399 wurde pVICLC*80A bzw. pVICLC*43A aus den vier Plasmiden mit eingebautem lysC* eingeführt, und die Zellen wurden kultiviert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 10 gezeigt. Diese Stämme, in welche pVICLC*80A oder pVICLC*43A eingeführt worden waren, zeigten eine erhöhte Ausbeute gegenüber dem Stamm, der mit pVIC40 transformiert ist (B-3996), welcher als Kontrolle eingesetzt wurde (1,10 fache Ausbeute für pVICLC*80A und 1,07 fache Ausbeute für pVICLC*43A). Tabelle 10

Plasmid	Restliches Saccharid (g/l)	Thr (g/l)	Ausbeute pro verbrauchtem Saccharid (%)
pVIC40	0,15	14,0	35,7 (1,00)
pVICLC*43A	0,09	14,9	38,0 (1,07)
pVICLC*80A	0,09	15,3	39,1 (1,10)
pVIC40 + pLLC*43	0,97	15,8	41,1 (1,15)
PVIC40 + pLLC*80	0,15	13,7	41,3 (1,16)

Man geht davon aus, daß die verminderte Erhöhung der Ausbeuten im Vergleich mit den Ergebnissen in (4-2) auf die geringere Anzahl der Kopien zurückzuführen ist, die sich durch die Verwendung des Vektors pVIC40 ergibt, das Wachstum war jedoch für den Stamm B-3996 dasselbe, und die Plasmide wurden stabil aufrecht erhalten.
(4-4) Einbau des mutierten Gens lysC* in Chromosomen
Der mutierte Typ lysC* wurde unter Verwendung des Phänomens der homologen Rekombination in das Wildtyp-Gen lysC in das Chromosom des Threonin produzierenden Stammes B-3996 eingeführt. Das verwendete Verfahren war eine Modifikation des Verfahrens von Russel et al. (Russel, M. und Model, P., J. Bacteriol., 159, 1034, 1984).
Wenn die Wirtszelle eine E. coli-Mutante ist, nämlich der Stamm MM382 (polA^ta, erhältlich vom E. coli genetic stock center, USA), kann das Plasmid pHSG399 bei 37°C (permissive Temperatur) replizieren, jedoch nicht bei hohen Temperaturen, wie 42°C (nicht-permissive Temperatur). Dieser Umstand wurde für die homologe Rekombination ausgenutzt.
Zunächst wurden PLLC43* und PLLC80* jeweils in den Mutantenstamm MM383 als Wirtszelle bei einer Temperatur von 37°C, bei der die Replikation möglich ist, eingeführt, wobei die Transformanten MM383/pLLC* 43 bzw. MM383/pLLC* 80 erhalten wurden. Diese Transformanten wurden bei 42°C kultiviert, und es wurden diejenigen selektiert, welche keine Plasmide aufwiesen, jedoch resistent gegenüber Chloramphenicol blieben. Die Plasmide waren in die Chromosomen dieser Stämme eingeführt worden. Die erhaltenen Stämme wurden als MM383-C43 bzw. MM383-C80 bezeichnet. Diese Stämme wurden mit P1-Phagen infiziert, und es wurde eine Phagenlösung hergestellt, die eingesetzt wurde, um den Stamm B-3996 zu infizieren. Es wurden die Stämme, welche das lysC*-Gen in ihr Chromosom eingeführt aufwiesen, unter Einsatz der Chloramphenicolresistenz als Marker selektiert, und sie wurden als B-3996-C43 bzw. B-3996-C80 bezeichnet.

Die Kultivierung von B-3996-C-43 und B-3996-C-80 wurde unter denselben Bedingungen wie (4-1) durchgeführt, und die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 11 gezeigt. Es wurde eine etwa 4%ige Verbesserung der Ausbeute der Threoninproduktion beobachtet. Tabelle 11

	Menge an zugegebenen Lysin (g/l)	Thr (g/l)	Ausbeute pro verbrauchtem Saccharid (%)
B-3996	0	14,1	34,8 (1,00)
	1	9,9	24,6
B-3996-C43	0	14,3	35,4 (1,02)
	1	11,4	28,1
B-3996-C80	0	14,6	36,1 (1,04)
	1	11,2	27,7

Beispiel 5: Bestimmung der Basensequenzen des Wildtyp lysC und des mutierten lysC*
(5-1)
Unter Verwendung des DNA-Sequentiergeräts "ABI Model 373A) (von ABI Co.) wurde ein herkömmliches Verfahren durchgeführt, um die Basensequenz des Wildtypgens lysC zu bestim men. Das Ergebnis ist in der beigefügten Sequenzliste unter der SEQ ID Nr. 1 angegeben. Es wurde gefunden, daß sich die Sequenz von der bereits veröffentlichten Basensequenz von lysC von E. coli K-12 JC411 (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. und Patta, J.C., J. Biol. Chem. 261, 1052, 1986) in sechs Basen unterschied (was zum Austausch von zwei Aminosäureresten führt). Man geht davon aus, daß die sechs Unterschiede auf Unterschiede in den verwendeten Stämmen zurückzuführen sind.
(5-2) Basensequenz des von der Rückkopplungshemmung befreiten mutierten lysC*

Die Basensequenzen der 14 Arten von lysC*, die in Beispiel 3 untersucht wurden, wurden auf dieselbe Weise wie (5-1) bestimmt, wobei die Mutationsstellen eindeutig bestimmt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt. von den 14 Arten waren zwei exakt identische Paare vorhanden, so daß sich eine tatsächliche Anzahl von 12 Arten von Mutationen ergab. Die Mutationen Nr. 149, 150, 156, 158, 167, 169 und 172 waren durch Behandlung mit Hydroxylamin und die Nr. 24, 43, 48, 60, 80, 117 und 126 waren durch Behandlung mit NTG erhalten worden. Die Mutationsmuster waren jedoch alle von C nach T oder von G nach A. Die Mutation von G nach A hatte sich durch die Mutation von C nach T auf dem Komplementärstrang ergeben. Tabelle 12: Identifizierung der Mutationsstellen von lysC*

Mutierte Typen vonlys C*	Mutagen (a)	Mutationsstelle (Aminosäureaustausch)
Nr. 126	N	GGT nach GA*T (³²³Gly nach Asp)
Nr. 43	N	GGT nach GA*T (³²³Gly nach Asp)
		GGC nach GA*C (⁴⁰⁸Gly nach Asp)
Nr. 149	H	CGT nach T*GT (³⁴Arg nach Cys)
	N/H	GGT nach GA*T (³²³Gly nach Asp)
Nr. 43/167	H	CTC nach T*TC (³²⁵Leu nach Phe)
Nr. 150		ATG nach ATA* (³¹⁸Met nach Ile)
Nr. 172	H	⁷⁷⁵C nach T (folgenlos)
		ATG nach ATA (³¹⁸Met nach Ire)
		GTG nach A*TG (³⁴⁹Val nach Met)
Nr. 117	N	TCA nach TT*A (³⁴⁵SernachLeu)
Nr. 158	H	GTC nach A*TG (³⁴⁷Val nach Met)
Nr. 24/80	N/H	ACC nach AT*C (³⁵²Thr nach Ile)
Nr. 169	H	⁹²³C nach T (folgenlos)
		ACC nach AT*C (³⁵²Thr nach Ile)
		TCT nach TT*T (³⁶⁹Ser nach Phe)
Nr. 60	N	⁸⁵⁹G nach A (folgenlos)
		GAA nach A*AA (¹⁶⁴Glu nach Lys)
Nr. 156	H	ATG nach ATA* (⁴¹⁷Met nach Ile)
		TGT nach TA*T (⁴¹⁹Cys nach Tyr)
		²⁰¹⁴C nach T (folgenlos)

(a) H: Behandlung mit Hydroxylamin, N: Behandlung mit NTG

(5-3) Identifizierung der Domänen, die zur Freisetzung von der Rückkopplungshemmung beitragen
Eine große Anzahl von Mutationen befanden sich am C-Ende, und sie konzentrierten sich insbesondere in der A-Domäne (vom Methioninrest 318 bis zum Leucinrest 325) und der B-Domäne (vom Serinrest 345 bis zum Threoninrest 352) der 7 (vergl. die Spalte "Mutationsstellen" in Tab. 12). E. coli hat zwei Typen von AK, nämlich trhA (AK I-HD I) und metL(M) (AK II-HD II), zusätzlich zu lysC (AK III). Das mutierte lysC* hatte zwei Stellen mit hohem Grad an Homologie zu den zwei Arten, und man geht davon aus, daß diese Domänen das aktive Zentrum von AK sind (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052, 1986). Die A- und B-Domänen am C-Ende befinden sich außerhalb dieser gemeinsamen Domänen, und somit ist es hochwahrscheinlich, daß sie die von Lysin kontrollierten Domänen sind, die für AK III spezifisch sind. Insbesondere hatten die Nummern 24/80, 172, 169 und 117 mit einem hohen Maß an Befreiung von der Inbibition Mutationen in der B-Domäne, was vermutlich wichtig ist. Zehn der zwölf Arten hatten Mutationen entweder in der A- oder B-Domäne. Die Nummern 60 und 158 waren Ausnahmen und zeigten einen geringen Grad sowohl an Inhibitionsfreisetzung als auch an thermischer Stabilität (vergl. vorstehende Tabelle 7), und man geht davon aus, daß dies ein Ergebnis der teilweisen Inhibitionsbefreiung ist, die auf eine Änderung in der Struktur des Enzyms als ganzes durch die Mutation zurückzuführen ist. Im Fall der mutierten Arten mit mehreren mutierten Stellen stellt sich auch die Frage, welche Mutationsstelle wirksam ist, und aufgrund eines Vergleichs mit den mutierten Arten mit einer einzigen Mutation an derselben Stelle kann die folgende Erklärung gegeben werden.
(1) Nr. 126 (1 Stelle), 43 (2 Stellen) und 149 (2 Stellen)
Die Mutationsstelle der Nr. 126 in der A-Domäne ist allen drei Mutantenarten gemeinsam, während der Grad der Inhibtionsfreisetzung für die Nr. 149 und 126 derselbe ist, und die höhere Anzahl an Mutationsstellen in der Nummer 43 führte zu einer eher gegenteiligen Wirkung. Dies führt zu der Annahme, daß die Mutationsstelle der Nr. 126 in der A-Domäne diejenige ist, welche die Inhibitionsfreisetzung bewirkt.
(2) Nr. 24/80 (1 Stelle) und 169 (2 Stellen)
Von den zwei Mutationsstellen in der Nr. 169 war diejenige in der B-Domäne dieselbe wie die in der Nr. 24/80.
Beide führten zu einer 100%igen Inhibitionsfreisetzung, weshalb die Mutationsstelle in der Nr. 24/80 ausreichend ist.
(3) Nr. 150 (1 Stelle) und 172 (2 Stellen)
Die Nr. 150 hat eine Mutationsstelle in der A-Domäne, während die Nr. 172 zwei Mutationen jeweils in der A-Domäne, (dieselbe wie die Nr. 150) bzw. in der B-Domäne hat. Der Grad der Inhibitionsfreisetzung war bei der Nr. 172 stärker, was verdeutlicht, daß sowohl die A-Domäne als auch die B-Domäne zur Inhibitionsfreisetzung beitragen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben auf die vorstehend beschriebene Weise die Domäne identifiziert, die in Bezug zur lysinabhängigen Inhibition der Aspartokinaseaktivität in der A-Domäne (vom Methioninrest 318 bis zum Leucinrest 325) und der B-Domäne steht (vom Serinrest 345 bis zum Threoninrest 352). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung sind jedoch nicht zu dem Schluß gekommen, daß die Freisetzung von der lysinabhängigen Inhibition der Aspartokinaseaktivität nur in dem Fall von Mutationen auftritt, bei denen einige spezifische Aminosäurereste durch einige andere Aminosäurereste ausgetauscht werden. Beispielsweise zeigt die Tabelle 12, daß die Freisetzung von der Rückkopplungshemmung auftritt, wenn der Glycinrest 323 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt wird, es ist jedoch einem Fachmann klar, daß dieselbe Freisetzung auftritt, wenn dieser Rest durch einen Glutaminsäurerest anstelle eines Asparaginsäurerests ersetzt wird. Dies ist darauf zurückzuführen, daß mehrere Aminosäuren, welche ähnliche Struktur haben, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure, als homologe Aminosäuren bezeichnet werden, und der Austausch einer Aminosäure gegen eine homologe Aminosäure bewirkt keine große Veränderung in der Funktion des Proteins (eine Liste von homologen Aminosäuren findet sich in Protein Engineering, S. 31, CMC Co., 1985).
Es wird oft beobachtet, daß der Austausch einer Aminosäure gegen eine nicht homologe Aminosäure dieselbe Wirkung hat wie derjenige gegen eine homologe Aminosäure. Andererseits führt der Austausch einer Aminosäure gegen eine homologe Aminosäure manchmal zu drastischen Veränderungen in der Funktion des Proteins (Estell, D.A., Graycar, T.P., and Wells, J.A., J. Biol. Chem., 260, 6518, 1988; Schultz, S.C., and Richards, J.H., Procedure. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1588, 1986; Yutani, K., et al., J. Biol. Chem., 262, 13429, 1987; Yutani, K.., et al., Procedure. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4441, 1987; Nishiyama, M., et al., J. Biol. Chem., 266, 14294, 1991).
Außerdem wurden gemäß der vorliegenden Erfindung einige der Aminosäurereste in der A- und B-Domäne nicht verändert, da jedoch die Funktionen der Proteine auf der Grundlage von Domäneneinheiten definiert sind, ist es vernünftig anzunehmen, daß die Freisetzung von der Rückkopplungshemmung beobachtet wird, wenn eine oder mehrere Aminosäurerestmutationen in den Domänen bewirkt werden, welche vorliegend nicht bewirkt worden sind. Tatsächlich ist eine Reihe solcher Beispiele berichtet worden (Furuya, H., et al., Biochemistry, 28, 6848, 1989; Furuya, H., et al. Biochem. Biophys. Research. Commun., 160, 669, 1989; Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science, 244, 1081, 1989).
Kurz gesagt beruht die vorliegende Erfindung in charakteristischer Weise auf der Entdeckung der Domänen, die in Bezug zur Rückkopplungshemmung stehen. In den Beispielen sind nur wenige Mutationsmuster in den Domänen offenbart, wie jedoch vorstehend beschrieben wurde, ist es einem Durchschnittsfachmann klar, daß andere Mutationsmuster dieselbe Wirkung haben können. Deshalb fallen solche Mutationen auch unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Industrielle Anwendbarkeit
Wie vorstehend beschrieben wurde, wurden von Escherichia-Bakterien abgeleitete AK III-Gene erhalten, welche in ausreichendem Maß von der Rückkopplungshemmung durch Lysin befreit sind. Durch Einführen dieser Gene in Threonin produzierende Bakterien ist es möglich, andere Threonin produzierende Bakterien zu erhalten, die hinsichtlich der Threoininproduktion gegenüber Bakterien des Standes der Technik erheblich verbessert sind. Die erfolgreiche Verwendung dieser Threonin produzierenden Bakterien hat gegenüber herkömmlichen Verfahren ein hervorragendes Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch Fermentation bereitgestellt. Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Produktion von L-Threonin, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus von Escherichia umfaßt, der mit einer rekombinanten DNA transformiert worden ist, die eine DNA enthält, die für Aspartokinase III kodierende DNA umfaßt, die in der kodierenden Region eine Mutation aufweist, welche die Aspartokinase III von der Rückkopplungshemmung durch Lysin befreit.
Verfahren zur Produktion von L-Threonin nach Anspruch 1, wobei die Mutation sich in der A-Domäne (von Met 318 bis Leu 325) oder in der B-Domäne (von Ser 345 bis Thr 352) von Aspartokinase III befindet.
Verfahren zur Produktion von L-Threonin nach Anspruch 1, wobei die Mutation aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Austausch von Met 318 gegen Ile und dem Austausch von Thr 352 gegen Ile besteht.