FI111958B - Menetelmä tuottaa/erittää proteiinia transformoidun homeen avulla käyttämällä Aspergilluksen endoksylanaasi II-geenistä saatuja ekspressioita/erittämistä sääteleviä alueita - Google Patents

Menetelmä tuottaa/erittää proteiinia transformoidun homeen avulla käyttämällä Aspergilluksen endoksylanaasi II-geenistä saatuja ekspressioita/erittämistä sääteleviä alueita Download PDF

Info

Publication number
FI111958B
FI111958B FI942691A FI942691A FI111958B FI 111958 B FI111958 B FI 111958B FI 942691 A FI942691 A FI 942691A FI 942691 A FI942691 A FI 942691A FI 111958 B FI111958 B FI 111958B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gene
sequence
exia
promoter
protein
Prior art date
Application number
FI942691A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI942691A (fi
FI942691A0 (fi
Inventor
Den Hondel Cornelis Antoni Van
Wouter Musters
Johannes Maria A Verbakel
Robertus Johannes Gouka
Hein Stam
Original Assignee
Unilever Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Unilever Nv filed Critical Unilever Nv
Publication of FI942691A publication Critical patent/FI942691A/fi
Publication of FI942691A0 publication Critical patent/FI942691A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI111958B publication Critical patent/FI111958B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01136—Glucuronoarabinoxylan endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.136), i.e. feraxanase or feraxan-endoxylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

j 111958
Menetelmä tuottaa/erittää proteiinia transformoidun homeen avulla käyttämällä Aspergilluksen endoksylanaasi II-geenistä saatuja ekspressiota/erittämistä sääteleviä alueita - Förfarande för producering/avsöndring av protein med hjälp av transformerat mögel genom användning av Aspergillus endoxylanas 5 II-gen erhällna expression/avsöndring reglerande omräden.
Keksinnön kohteena on menetelmä tuottaa ja valinnaisesti erittää proteiinia transformoidun homeen avulla, johon on viety sinänsä tunnettujen rekombi-nanttien DNA-tekniikoiden avulla ekspressointivektori, joka käsittää yhden tai 10 useamman homeperäisen ekspressiota ja/tai erittämistä säätelevän alueen.
Tämä alue kontrolloi tätä proteiinia koodaavan geenin ekspressiota ja kontrolloi valinnaisesti näin tuotetun proteiinin erittymistä. Tällainen menetelmä on tunnettu eri julkaisuista, joissa on kuvattu proteiinien tuottaminen transformoitujen homeiden avulla. Julkaisemattomassa patenttihakemuksessa PCT/EP 15 91/01135 (Unilever, julkaistu prioriteettivuonna 26.12.1991 patenttijulkaisuna WO 91/19782) on siten mm. kuvattu homologisen endoksylanaasi II-proteiinin tuottaminen transformoidun Aspergillus -kannan avulla.
Tunnetaan myös muita tapoja tuottaa proteiineja transformoitujen homeiden : 20 avulla, erityisesti käyttämällä Aspergillus -homeista peräisin olevia promootto reita.
, · - Ward, M. et ai., (Genencor, 1990) ovat kuvanneet maidon juoksutus-entsyy- 1 * min, kymosiinin, tai sen prokymosiini-prekursorin tuottamisen transformoidun 25 Aspergillus niger var. awamori-homeen avulla fuusioproteiinin, jossa proky-mosiini oli yhdistetty N-päästään Aspergilluksen glykoamylaasiproteiinin C-päähän, muodostamisen pääteltiin johtavan paljon suurempaan erittymi-seen kuin tuotettaessa pelkästään prokymosiinia. Näissä kummassakin tapa--: ‘ uksessa proteiinia edelsi glukoamylaasin signaalisekvenssi glukoamylaasin 30 promoottorin kontrollin alaisena.
- Patenttijulkaisussa CA-A-2024448 (Allelix Biopharmace) "Rekocombinant DNA expression Construct - containing promoter for use in Aspergillus", jul- 2 111958 kaistu 1.3.1991, on kuvattu Aspergillus n\^u\ms-homeen aldehydidehydro-genaasi-geenin konstitutiivinen promoottori ja sen käyttö heterologisten proteiinien tuottamiseen transformoidussa homeessa.
5 - Patenttijulkaisussa EP-A-0436858 (Green Cross Corp.) "Promotorer of glyce- raldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene - derived from Aspergillus orizae, used in new expression system in yellow-green or black koji mould", julkaistu 17.7.1991, on kuvattu GAPDH-geenin promoottorin ja ter-minaattorin käyttö vektorissa, jolla transformoidaan home tuottamaan vieraita 10 proteiineja, ja - Patenttijulkaisussa EP-A-0439997 (Giva Geigi AG). "A. niger pyruvate kinase promoter - used to construct vectors for expression of structural genes in sui-15 table hosts", julkaistu 7.8.1991, on kuvattu homologisen geenin tuotteen tai heterologisen geenin tuotteen ylituotto A. niger'ssa.
Homeet ovat proteiinien ja metaboliittien tuottamisessa usein käytettyjä organismeja. Homeiden eräs bioteknisesti hyvin tärkeä ominaisuus on, että ne . : 20 kykenevät tuottamaan proteiineja erittäin tehokkaasti ja haluttaessa erittä- mään ne alustaan. Homeita on myös mahdollista kasvattaa sopivasti kontrol-loituna suurissa bioreaktoreissa. Mahdollisuus muodostaa sienimassaa kustan-,: nustehokkaasti fermentoimalla ja korkea spesifinen ekspressio solua kohti te- :* kevät yhdessä homeet poikkeuksellisen mielenkiintoisiksi isäntäorganismeiksi v *: 25 sekä heterologisten että homologisten proteiinien valmistamisessa. Näiden heterologisten ja homologisten proteiinien tehokkaan tuoton kannalta on ; ’.·* oleellista, että käytetään homeissa toimivaa tehokasta promoottoria. Proteiinin alustaan erittämiseksi tarvitaan tästä huolehtivia spesifisiä sekvenssejä. Koska ;i* tuotettava proteiini voi olla toksinen homesolulle, on myös tärkeää, että pro- :’’j 30 moottorin aktiivisuutta voidaan säädellä, so. se voidaan kytkeä päälle sopivina •;v. ajankohtina. Siten on suositeltavaa käyttää indusoitavaa promoottoria.
• · 3 111958
Keksintö perustuu aikaisemmin julkaisemattoman, jäljempänä yksityiskohtaisemmin kuvatun promoottorin käyttämiseen sekä muiden ekspressiota ja/tai erittämistä säätelevien alueiden, kuten terminaattorin, signaalisekvenssiä koo-daavan DNA-sekvenssin ja DNA-sekvenssin, joka koodaa vähintään oleellista 5 osaa kypsästä endogeenisestä homeproteiinista, käyttämiseen.
Tutkittaessa proteiinien ekspressiota homeissa havaittiin, että tyypin II endok-sylanaasientsyymin (exIA) tuotto oli tehokasta exIA-geenin ekspression in-dusoinnin jälkeen ja että sitä myös erittyi tehokkaasti alustaan. Tämän prote-10 iinin tuottamista varten koodaava geeni kloonattiin yhdessä sen oman promoottorin kanssa. Endoksylanaasi II-promoottori osoittautui erityisen tehokkaaksi verrattuna muihin homepromoottoreihin. Endoksylanaasi II-entsyymiä koodaavan geenin ekspression (oman promoottorinsa säätelemänä) havaittiin indusoituvan tehokkaasti eri alustakomponenteilla, mukaan lukien vehnäle-15 seellä, ksylaanilla ja ksyloosilla. Tämän induktion havaittiin etenevän tehok-kasti eri homekannoilla (kts. WO 91/19782, Unilever). Näin oli mahdollista saada tehokas indusoituva promoottori sekä muita homeperäisiä ekspressiota ja/tai erittämistä sääteleviä alueita, mukaan lukien transkription terminaatto-risignaaleja ja erityssignaaleja, joita mahdollisesti voitaisiin käyttää heterolo-,: 20 gisten ja homologisten proteiinien tuottamiseen homeissa. Aspergillus niger ·. va. awamori'n endoksylanaasi II-geenin promoottorifragmentti, terminaattori- ’; fragmentti ja erityssignaalit kloonattiin ja tämän jälkeen määriteltiin edelleen.
•
I I
t · : · Esimerkkinä heterologisen proteiinin tuottamisesta transformoidussa 25 homeessa käytettiin E coH’n β-glukuronidaasigeeniä (uidA). Ekspressointi-vektorin rakentamiseen käytettiin Aspergillus niger var. awamori'n endo- ’ » * : ksylanaasi II-geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssejä. Tämän « * f :: ekspressointivektorin avulla ekspressoitiin homeissa £. coli'n B-glukuroni- ;: * daasiproteiinia koodaava heterologinen geeni endoksylanaasi II (exlA)-pro- ” ’: 30 moottorin kontrollin alaisena. Heterologisia ja homologisia proteiineja voidaan : *. ·; myös erittää käyttämällä exIA-erityssignaaleja. Toisena esimerkkinä exIA- I · : ‘ ·. j promoottorin ja -terminaattorin käyttämisestä heterologisten proteiinien tuottamiseen vietiin ekspressointivektoriin Thermomyces lanuginosa -lipaasia 4 111958 koodaava geeni exIA-säätelysekvenssien kontrollin alaisena ja tätä käytettiin Thermomyces lanuginosa -lipaasin tuottamiseen ja erittämiseen. Novo-Nordisk, entsyymejä valmistava yhtiö Tanskassa, markkinoi Thermomyces lanugnosa 'sta saatua lipaasia kauppanimellä "Lipolase", joka kuitenkin 5 tuotetaan toisen mikro-organismin avulla. Sen osoittamiseksi, että exIA-signaalisekvenssiä voidaan käyttää ohjaamaan muidenkin proteiinien kuin exlA:n erittymistä, fuusioitiin DNA-sekvenssi, joka koodaa Terhmomyces lanuginosa 'n kypsän lipaasin aminohapposekvenssiä, exIA-signaalisekvenssiin ja tämä laitettiin edellä mainittuun ekspressointiplasmidiin exlA:n säätelysek-10 venssien kontrollin alaiseksi ja osoitettiin Terhmomyces lanuginosa -lipaasin erittyvän.
Heterologiset geenit, joiden ekspressio on esitetty tässä julkaisussa esimerk-kimäisesti, voidaan luonnollisesti korvata millä tahansa DNA-sekvenssillä, joka 15 koodaa haluttua, hyvin erilaisista organismeista (bakteerit, hiivat, homeet, kasvit, eläimet ja ihmiset saatua proteiinia (sekvenssi koodaa entsyymejä, proteiineja jne.). Haluttu proteiini voidaan näin tuottaa homeiden avulla.
Täten keksinnön mukaiselle menetelmälle on pääasiallisesti tunnusomaista se, .,..: 20 että menetelmässä ainakin yksi ekspressiota ja/tai erittämistä säätelevä alue • · on valittu * » » » » · (1) Aspergillusniger var. awamori'n endoksylanaasi II-geenin (exIA-geenin) * · : · ekspressiota ja erittämistä säätelevistä alueista plasmidissa pAW14B (kuvio 3), :T: 25 joka on läsnä transformoidussa E coli-kannassa JM 109, joka on tallennettu 31.5.1990 numerolla CBS 237.90 Centraalbureau voor Schimmelcultures-kokoelmaan, Baarn, Hollanti, ja
I I I
...: (2) tämän muunnetuista sekvensseistä, joilla on (l):n nukleiinihapposek- ; I * venssiä vastaava tai parempi säätelevä aktiivisuus ja jotka kykenevät hybridi- 30 soitumaan (l):n nukleiinihapposekvenssin kanssa.
: ’ ·.: Keksinnön mukaisille edullisille suoritusmuodoille on tunnusomaista se, mikä • · jäljempänä epäitsenäisissä vaatimuksissa on esitetty.
5 111958
Keksinnön eräs suoritusmuoto tuo esiin menetelmän, jolla transformoiduissa homeissa tuotetaan muita proteiineja kuin tyypin II endoksylanaasia käyttämällä Aspergillus niger var. awamori'n endoksylanaasi II (exlA)-geenistä saatuja ekspressiota sääteleviä sekvenssejä kuten promoottoria tai terminaattoria 5 tai näiden säätelevien sekvenssien funktionaalisia johdannaisia. Eräässä toisessa tämän keksinnön suoritusmuodossa tuodaan esiin menetelmä, jonka avulla homeessa tuotettuja proteiineja voidaan haluttaessa erittää alustaan käyttämällä DNA-sekvenssiä, joka koodaa Aspergillus niger var. awamori'n endoksylanaasi II-geenin signaalisekvenssiä, erityisesti esisekvenssiä tai prep-10 ro-sekvenssiä tai näiden sekvenssien funktionaalisia johdannaisia. Keksintö tuo lopuksi myös esiin proteiinin tuottomenetelmän, jossa käytetään vektoria, joka käsittää ainakin oleellisen osan kypsää endoksylanaasi II-proteiinia koo-daavasta DNA-sekvenssistä, koska tiedetään, että homeissa saadaan hetero-loginen proteiini erittymään paremmin tuottamalla se aluksi fuusioproteiinina, 15 joka sisältää osan endogeenisestä homeproteiinista (kts. myös edellä mainittu Ward, M. et al./Genencor-viite).
Piirustuksissa ja taulukoissa: 20 Kuvio 1 esittää pAW14B-plasmidissa olevaa Aspergillus niger var. awamori' n ’ noin 2,1 kb Pst \-Pst I-fragmentin DNA-sekvenssiä, joka fragmentti sisältää exIA-geeninä annetun, endoksylanaasi II:a koodaavan gee-•, i nin. Translaation aloitus- ja pysäytyskodonit on alleviivattu kahdesti.
49 bp introni on alleviivattu. Kypsän proteiinin N-terminaalinen pää j : 25 on annettu. Proteiinin (kypsän proteiinin sekä pre(pro)-muodon että kypsän proteiinin) aminohapposekvenssi on annettu käyttämällä yksi-: kirjaimista koodia.
I · ( ia *
Kuvio 2 on restriktiokartta Aspergillus niger var. awamori'n genomin 30 DNA-alueesta, joka käsittää lambda 1-ja lambda 14-faageihin kloo- natun exIA-geenin. Käytetyt lyhennykset ovat S: Sali) E: £coRI; H: :\i HindiII; P: Pstl) P*: PstI; B: Bam HI; S#: Sail lambda EMBL3:n polylinkkeristä saatu Sa/I-kohta; ja D: Sau3A. Paksulla janalla on an- 6 111958 nettu Xyl06:n kanssa hybridisoituva 1,2 kb PstlY-Bam HI-fragmentti. Kaksi läsnäolevaa £sfI-kohtaa on erotettu toisistaan symboleilla P' ja Pstl*.
5 Kuvio 3 esittää plasmidia PAW14B, joka on saatu insertoimalla Aspergillus niger var. awamori'n exIA-geenin käsittävä, 5,3 kb Sa/I-fragmentti pUC19:n 5a/I-kohtaan.
Kuvio 4 esittää plasmidia pAW15-l, joka on saatu korvaamalla exlA:n avoi-10 men lukukehyksen sisältävä £s/0HI-/1/7II-fragmentti PAW14B:ssa Neo I-y4/7Il-fragmentilla, joka sisältää E co/i'n uidA:a koodaavan sekvenssin. Plasmidi pAW15-l käsittää siten E a?//'uidA-geenin A. niger var. awamori'u promoottorin ja terminaattorin kontrollin alaisena.
15 Kuvio 5 esittää plasmidia pAW15-7, joka on saatu insertoimalla pAW15-l:n Eco RI-kohtaan 2,6 kb /Voi I-fragmentti, joka sisältää A. nidu/ans gpdA-promoottorin ja A. nidulans trpC-terminaattorin kontrolloiman E coll hygromysiiniresistenttiysgeenin.
.· 20 Kuvio 6 esittää plasmidia pAWTLl, joka on saatu korvaamalla exlA:n avoimen lukukehyksen sisältävä Bsp HI-/4/7II-fragmentti pAW14B:ssa Bsp HI-. Af!Il-fragmentilla, joka sisältää T. lanuginosa-\\paasia koodaavan : nukleotidisekvenssin yhdessää sen oman pre-pro-sekvenssin kanssa.
;· Plasmidi pAWTLl käsittää siten T /<?/7^//7ösa-lipaasigeenin yhdessä ; 25 sen omaa pre-pro-sekvenssiä koodaavaan alueen kanssa A. niger var. awamori'n promoottorin ja terminaattorin kontrollin alaisena.
* #
Kuvio 7 esittää plasmidia pAWTL2, joka on saatu korvaamalla kypsää exIA-: * proteiinia koodaavan alueen sisältävä Nru 1-,4/711-fragmentti : ‘ : 30 pAW14B:ssa Nru \-AflIl-fragmentilla, joka sisältää T lanuginosa- : .·. lipaasin kypsää osaa koodaavan nukleotidisekvenssin. Plasmidi
pAWTL2 käsittää siten T lanuginosa-\\paasigeenin fuusioituna exIA
7 111958 pre-pro-sekvenssiä koodaavaan alueeseen A. niger var. awamori'n promoottorin ja terminaattorin kontrollin alaisena.
Kuvio 8 esittää polasmidia pTLl, jossa on T. /anuginosa-\\paas\a koodaava 5 nukleotidisekvenssi yhdessä sen oma pre-pro-sekvenssin kanssa A.
niger 'in gpdA-promoottorin ja A. nidu/ans trpC-terminaattorin kontrollin alaisena pUC18:n polylinkkeriin insertoituna. Alue, joka koodaa T. ianuginosa-lipaasin pre-pro-sekvenssiä, on merkitty "ss":lla.
10 Kuvio 9 esittää sekvenssiä, joka käsittää T fanuginosa-\\paas\a koodaavan avoimen lukukehyksen sellaisena kuin se on plasmidissa pTLl. Kypsän proteiinin N-terminaalinen pää on annettu.
Taulukossa A on esitetty eri koettimia, jotka on johdettu endoksylanaasi II-15 proteiinin N-terminaalisesta aminohapposekvenssistä. Näitä koettimia käytettiin exIA-geenin eristämiseen, kts. esimerkin 1 kohta 1.1.
"Sekakoettimessa" läsnä olevien oligonukleotidien lukumäärä on annettu suluissa; tämä määrä saadaan ottamalla 1, 2, 3 tai 4 eri emästä joka kolman-20 teen asemaan riippuen aminohapon kodonien lukumäärästä. Xyl04:ssa nukleotidit valittiin G-C:n ja G-T:n hybridisaation perusteella ja/tai hyvänä pidetty-'; jen Aspergillus niger-qlukoamylaasin kodonien perusteella. Zyl05:ssa ja .! Xyl06:ssa kodonin kolmanteen asemaan ei viedä kaikkia mahdollisesti esiinty- ;· viä emäksiä, jotta seokseen ei saataisi enempää kuin 256 oligonukleotidiä.
25 Oligonukleotidien sekvenssi on komplementtinen DNA:n koodaavan säikeen kanssa, mikä muistuttaa vastaavaa mRNA:a.
XylOl: Seos 256 oligosta, joiden pituus on 23 deoksinukleotidiä ja joiden •. ·: sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja 5-12 koodaavan osan kanssa.
.,,: 30 Xyl04: Oligo, jonka pituus on 47 deoksinukleotidiä ja jonka sekvenssi on ' · ’: komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja 2-17 koodaa- > * ; ‘ ; van osan kanssa.
8 111958
Xyl05: Seos 144 oligosta, joiden pituus on 23 deoksinukleotidiä ja joiden sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja 10-17 koodaavan osan kanssa.
Xyl06: Seos 256 oligosta, joiden pituus on 47 deoksinukleotidiä ja joiden 5 sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja 2-17 koodaavan osan kanssa.
Taulukko B esittää lambda 1- ja lambda 14-fragmenttien erilaisia yksisäikeisiä alaklooneja, joita käytettiin exIA-geenin sekvenssin määrittämiseen, kts. esi-10 merkin 1 kohta 1.2.
Taulukko C esittää tuloksia E coiiβ-glukuronidaasin tuottamisesta Aspergillus niger var. awamori-homeen transformoimattomilla ja transformoiduilla kannoilla, kts. esimerkin 2 kohta 2.2.
15
Taulukko D osoittaa, että funktionaalista lipaasia muodostui ja erittyi exIA-promoottorin ksyloosilla indusoinnin jälkeen ja että heterologisen (Thermomy-ces lanuginosa) kypsän proteiinin erittymistä ohjattiin Aspergillus niger var. awamori'ssa käyttämällä joko exIA-signaalisekvenssiä (kts. AWLPL2-2) tai : 20 Thermomyces lanuginosa -signaalisekvenssiä (kts. AWLPL1-2), kts. esimerkin , 3 kohta 3.2.
, i Taulukko E esittää erilaisia, esimerkeissä 1-3 kuvatuissa konstruktioissa käy- ;i* tettyjä oligonukleotidien nukleotidisekvenssejä, kts. 1.4, 2.1, 3.1.1, 3.1.2, :T: 25 3.1.3 ja 3.1.4. Sekvenssin luettelonumerot viittaavat virallisessa formaatilla annettuihin luetteloihin.
:...: Koska Aspergillus niger var. awamori ekspressoi endoksylanaasi II-geenin ja ; i * saatu proteiini erittyy erittäin tehokkaasti sopivissa viljelyolosuhteissa, esillä 30 oleva keksintö kohdistuu erityisesti Aspergillus niger var. awamori 'n endoksy- : v: lanaasi II (exlA)-geenin säätelyalueiden, kuten promoottorisekvenssin, termi- » » : ’ ·. naattorisekvenssin ja signaalisekvenssin kloonaukseen ja näiden komponent tien käyttämiseen kehitettäessä menetelmää, jolla tuotetaan homeissa prote- 9 111958 iineja. Keksintö koskee siten yleisesti ottaen menetelmää, jossa käytetään hyödyksi nukleiinihapposekvenssiä, joka on saatavissa homeesta ja joka käsittää vähintään säätelyalueen, joka on saatavissa geenistä, joka koodaa endok-sylanaasi II-aktiivisuuden omaavaa polypeptidiä. Tämä nukleiinihapposek-5 venssi voidaan yhdistää muita homologisia tai heterologisia geenejä koodaavi-en nukleiinihapposekvenssien kanssa, jolloin nämä geenit saadaan vähintään yhden exIA-säätelysekvenssin kontrollin alaisiksi.
Tässä yhteydessä käytettynä "nukleiinihapposekvenssi" viittaa minkä tahansa 10 pituiseen nukleotidien polymeeriseen muotoon, sekä ribonukleiinihappo (RNA)-sekvensseihin että deoksiribonukleiinihappo (DNA)-sekvensseihin. Periaatteessa tämä nimitys viittaa molekyylin primäärirakenteeseen. Tämä termi käsittää siten sekä yksisäikeisen että kaksisäikeisen DNA:n sekä yksisäikeisen RNA:n että näiden modifikaatiot.
15
Yleisesti ottaen nimitys "proteiini" viittaa biologisen aktiivisuuden omaavaan aminohappojen molekyyliketjuun, eikä se viittaa mihinkään tiettyyn tuotteen pituuteen. Tarvittaessa se voi olla modifioitu in v/Votai in vitro. Tämä modifiointi voi tapahtua esimerkiksi amidointina, karboksylointina, glykolysointina tai 20 fosforylointina; siten tähän sisältyvät mm. peptidit, oligopeptidit ja polypepti- :·. dit. Tässä julkaisussa käytetään kumpaakin nimitystä, polypeptidiä ja proteii- . nia, synonyymeinä, ellei tarkempi merkitys ole selvä asian yhteydestä.
»» » ·:· Kuvatunlaisia nukleiinihapposekvenssejä sisältävää vektoria voidaan myös 25 käyttää muiden proteiinien kuin Aspergillus niger var. awamori'u endoksyla-naasi Il:n (exIA) tuottamiseen ja näitä vektoreita tai nukleiinihapposekvensse- 1 * » j V jä sisältäviä mikro-organismeja voidaan myös käyttää näiden proteiinien tuot- tamiseen.
I S * j 30 Edellä mainittuja keksinnön mukaisten nukleiinihapposekvenssien muunnettu- :·.·. ja sekvenssejä voidaan myös käyttää muiden proteiinien kuin Aspergillus niger * · :*·,; var. awamori'n endoksylanaasi II:n (exIA) tuottamiseen, jolloin näillä muun netuilla sekvensseillä on myös säätelyaktiivisuus. Nimitys "muunnettu sek- 111958 ίο venssi" käsittää nukleiinihapposekvenssit, joilla on yhtä hyvä tai parempi sää-telyaktiivisuus kuin homeesta saatavalla nukleiinihapposekvenssillä ja jotka käsittävät vähintään säätelyalueen, joka on saatavissa geenistä, joka koodaa endoksylanaasi II-aktiivisuutta omaavaa proteiinia. Tällaiseen samanarvoiseen 5 nukleiinihapposekvenssiin voi olla kohdistettu yhden tai useamman nukleotidin substituutio, deleetio tai insertio tai edellä mainittujen yhdistelmä, jolloin tuloksena on muunnettu nukleiinihapposekvenssi ilman, että samanaikaisesti olisi tapahtunut säätelyaktiivisuuden häviämistä. Menetelmät, joilla tuotetaan muita proteiineja kuin Aspergillus niger var. awamori'n endoksylanaasi II:a 10 (exIA), käyttämällä tällaisia muunnettuja nukleiinihapposekvenssejä lukeutuvat esillä olevan keksinnön piiriin. Erityisesti keksinnön piiriin kuuluvat menetelmät, joilla tuotetaan muita proteiineja kuin Aspergillus niger var. awamori'n endoksylanaasi lira (exIA), käyttämällä muunnettuja sekvenssejä, jotka kykenevät hybridisoitumaan muuntamattoman nukleiinihapposekvenssin kanssa ja 15 jotka yhä säilyttävät vähintäänkin muuntamattoman nukleiinisekvenssin säätelyaktiivisuuden.
Patenttivaatimuksissa käytetty ilmaisu "funktionaaliset johdannaiset" viittaavat tällaisiin muunnettuihin sekvensseihin.
20 • · :' i ’; Nimitys "osa jostakin" kattaa nukleiinihapposekvenssin, joka on homeesta saa- : tavissa olevan nukleiinihapposekvenssin alasekvenssi ja joka käsittää ainakin : \ S säätelyalueen, joka on saatavissa geenistä, joka koodaa endoksylanaasi II- aktiivisuutta omaavaa polypeptidiä. Keksinnön kohteena on erityisesti menevä 25 telmä, jossa käytetään Aspergillus -suvun homeesta saatavissa olevaa nukle-iinihapposekvenssiä. Eräs sopiva esimerkki homeesta, josta keksinnön mukai- > · · i sessa menetelmässä käytetty nukleiinihapposekvenssi voidaan saada, on As- •«· :: pergillus niger -lajin Aspergillus, erityisesti Aspergillus niger var. awamori.
Erityisesti Aspergillus niger var. awamori CBS 115.52 (ATCC 11358)-kanta I · * 30 sopii huomattavan hyvin keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyn nukle-iinihapposekvenssin saamiseen. Nukleiinihapposekvenssi, jota käytetään • » : ‘ : keksinnön mukaisessa menetelmässä, käsittää mieluummin ainakin • · promoottorin säätelyalueena. Nukleiinihapposekvenssi, jota käytetään esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä, voi myös käsittää indusori- tai Π 111958 nön mukaisessa menetelmässä, voi myös käsittää indusori- tai tehostesek-venssin, joka sallii minkä tahansa, toiminnallisesti promoottoriin kytketyn nuk-leiinihapposekvenssin korkeamman ekspressointitason. Lisäksi on mahdollista, että nukleiinihapposekvenssi, jota käytetään keksinnön mukaisessa menetel-5 mässä, käsittää terminaatiosignaalin säätelyalueena. Nukleiinihapposekvenssi, jota käytetään keksinnön mukaisessa menetelmässä, voi käsittää yhden tai useamman säätelyalueen. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä nukleiinihapposekvenssi voi käsittää yksinomaan promoottorin säätelyalueena tai sen yhdistelmän yhdessä tehosteosan tai muiden funktionaalisten element-10 tien kanssa. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä nukleiinihapposekvenssi voi lisäksi sisältää terminaattorisekvenssejä, vaikkakin halutun eks-pressiotuotteen tehokas ekspressointi ei aina edellytä näitä.
Keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaisesti voi nukleiinihapposek-15 venssi, jota käytetään keksinnön mukaisessa menetelmässä, sisältää lisäksi erityissignaalia koodaavan sekvenssin, joka tarvitaan geenin tuotteen erittämi-seen homeesta. Tämä on suositeltavaa, kun halutun ekspressointituotteen solunsisäinen tuotto ei riitä ja haluttu ekspressointituote on tuotettava solu-nulkoisesti.
20
Erityssignaaleihin kuuluu esimerkiksi endoksylanaasi II-geenin prepro- tai pre-sekvenssi. Erityisen suositeltava on Aspergillus -homeen endoksylanaasi II-·.: geenistä saatavissa oleva erityssignaali. Keksinnön mukaisessa menetelmässä _ ;; · käytettävän nukleiinihapposekvenssin täsmällinen suoritusmuoto riippuu kui- v ·' 25 tenkin siitä tavoitteesta, johon keksinnön mukaista menetelmää käyttämällä pyritään. Tässä yhteydessä käytettynä "signaalisekvenssi" viittaa yleisesti ot- i *.·* taen aminohappojen sekvenssiin, joka käynnistää proteiini- tai polypeptidiket- • · * jun ulosviennin. Kun signaalisekvenssi on käynnistänyt kasvavan proteiini- tai polypeptidiketjun ulosviennin, se voidaan lohkaista kypsästä proteiinista spesi- •«* :: 30 fisessä kohdassa. Nimitys sisältää myös johtosekvenssit tai johtopeptidit. Täs- » :' · ’: sä yhteydessä hyvänä pidetty signaalisekvenssi on johdettu signaalisekvenssi kuviossa 1 annetusta Aspergillusniger var. awamori'n endoksylanaasi II-geenistä.
12 111958
Signaalisekvenssi ja terminaatiosekvenssi on eristetty genomikirjastosta DNA-oligonukleotidien avulla, jotka on johdettu analysoimalla Aspergillus niger var. awamori'n kromosomaalisista DNA-fragmenteista, jotka käsittävät Aspergillus 5 niger var. awamori'n koko endoksylanaasi II (exlA)-geenin, mukaanlukien säätelyalueet, saadun endoksylanaasi II:n proteiinisekvenssi. Endoksylanaasi II (exlA)-geenin säätelyalueita on käytetty muidenkin proteiinien kuin endoksylanaasi II:n, esimerkiksi heterologisten proteiinien, tuottamiseen ja haluttaessa erittämiseen Aspergillus niger var. awamori'u avulla. Keksinnön koh-10 teenä on sen vuoksi erityisesti menetelmä, jossa Aspergillus niger var. awa-mori'n endoksylanaasi II-geenin yhtä tai useampaa säätelyaluetta tai vastaavaa nukleiinihapposekvenssiä käytetään muiden proteiinien kuin endoksylanaasi II:n tuottamiseen Aspergillus niger var. awamori'ssa. Nimitys "vastaava nukleiinihapposekvenssi" tarkoittaa samaa kuin edellä oleva "muunnettu nuk-15 leiinihapposekvenssi".
Saatujen exIA-promoottori- ja exIA-signaalisekvenssien ekspressointi- ja eri-tyspotentiaali on testattu jäljempänä annetuissa esimerkeissä rakentamalla uusia vektoreita heterologisen β-glukuronidaasigeenin ekspressointia ja As-....: 20 pergilluksessa tapahtuvaa heterologisen lipaasin tuottamista ja erittämistä varten. Saadut konstruktiot testattiin Aspergillus niger var. awamori'ssa.
’ ·.: Keksintö tuo siten yleisesti esiin menetelmän tuottaa ja valinnaisesti erittää ,_ ;;· proteiinia, joka on erilainen kuin endoksylanaasi tyyppi II-proteiini ex Aspergil· v : 25 /us niger var. awamori, transformoidun homeen avulla, johon on viety eks- pressointivektori sinänsä tunnettujen rekombinantti-DNA-tekniikoiden avulla, : jossa vektorissa on homeperäisiä ekspressiota ja/tai erittämistä sääteleviä alu- : : eitä, jossa menetelmässä ainakin yksi näistä ekspressiota ja/tai erittämistä .,;; säätelevistä alueista on valittu (1) Aspergillus niger var. awamori'n endoksy- :,.,: 30 lanaasi II-geenin (exIA-geeni) plasmidissa pAW14B (kuvio 3), joka on trans- formoidussa £ coii-kannassa JM109, joka on tallennettu 31.5.1990 numerolla : ’ ·. i CBS 237.90 Centraalbureau voor Schimmelcultures-kokoelmaan, Baarn, Hol lanti, ekspressiota ja erittämistä säätelevistä alueista, ja (2) näiden funktio- 13 111958 naalisista johdannaisista, joilla myös on ekspressiota ja/tai erittämistä säätelevä aktiivisuus.
Keksinnön hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa valittu ekspressiota säätelevä 5 alue on promoottori ja mainittu vektori käsittää tätä proteiinia koodaavan geenin promoottorin kontrollin alaisena, jolloin jälkimmäinen on valittu (1) Aspergillus niger var. awamori'n endoksylanaasi II-geenin (exIA-geeni), joka on plasmidissa pAW14B (kuvio 3), joka on transformoidussa E coll-kannassa JM109, joka on tallennettu 31.5.1990 numerolla CBS 237.90 Centraalbureau 10 voor Schimmelcultures-kokoelmaan, Baarn, Hollanti, promoottorista ja (2) tämän funktionaalisista johdannaisista, joilla myös on promoottoriaktiivisuus.
Vieläkin mieluummin tämä promoottori vastaa promoottoria, joka on exIA-geenissä vastavirtaan sijaitsevassa 5'-osassa, jonka koko on noin 2,5 kb ja joka sijaitsee Sai I-restriktiokohdan asemassa 0 ja exIA-geenin aloituskodonin 15 ATG välissä plasmidissa pAW14B. Erityisesti tämä promoottori käsittää ainakin kuvion 1 mukaisen nukleotidisekvenssin 1-350.
Tämä promoottori voi indusoitua vehnäleseen, ksylaanin tai ksyloosin vaikutuksesta tai näiden missä tahansa yhdistelmässä alustassa, jossa transformoi-..: 20 tua hometta inkuboidaan. Tällöin on suositeltavaa käyttää ksyloosia indusoin- tiaineena.
Keksinnön toisessa hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa valittu ekspressiota säätelevä alue on terminaattori ja mainittu vektori käsittää tätä proteiinia koo-25 daavan geenin terminaattorin seuraamana, joka jälkimmäinen on valittu (1) Aspergillus niger var. awamori'n endoksylanaasi II-geenin (exIA-geeni), joka : V on plasmidissa pAW14B (kuvio 3), joka on transformoidussa E coli -kannassa I · * JM 109, joka on tallennettu 31.5.1990 numerolla CBS 237.90 Centraalbureau voor Schimmelculters-kokoelmaan, Baarn, Hollanti, terminaattorista ja (2) tä-:: 30 män funktionaalisista johdannaisista, joilla myös on terminaattoriaktiivisuus.
:*· ’: Tämä terminaattori vastaa mieluummin terminaattoria, joka on exIA-geenin vastavirran puolella olevassa 3-osassa, jonka koko on noin 1,0 kb ja joka si- 14 111958 jaitsee heti myötävirtaan exIA-geenin pysäytyskodonista (TAA) plasmidissa pAW14B.
Keksinnön eräs suoritusmuoto on edelleen menetelmä tuottaa ja erittää eri-5 laista proteiinia kuin tyypin II endoksylanaasi-proteiinia ex Aspergillus niger var. awamori transformoidun homeen avulla, jossa menetelmässä valittu erittämistä säätelevä alue on signaalisekvenssiä koodaava DNA-sekvenssi ja mainittu vektori käsittää tätä proteiinia koodaavan geenin tämän signaalisekvenssiä koodaavan DNA-sekvenssin edeltämänä, joka jälkimmäinen on valittu (1) 10 Aspergillus niger var. awamori'n endoksylanaasi II-geenin (exIA-geeni), joka on plasmidissa pAW14B (kuvio 3), joka on transformoidussa E coli-kannassa JM109, joka on tallennettu 31.5.1990 numerolla CBS 237.90 Centraalbureau voor Schimmelcultures-kokoelmaan, Baarn, Hollanti, signaalisekvenssiä koo-daavasta DNA-sekvenssistä ja (2) tämän funktionaalisista johdannaisista, jotka 15 myös ohjaavat proteiinin erittämistä. Tätä proteiinia koodaavan geenin (1) edellä on mieluummin myös ainakin oleellinen osa DNA-sekvenssiä (2), joka koodaa kypsää endoksylanaasi II-proteiinia, jolloin tämä DNA-sekvenssi (2) on signaalisekvenssiä (3) koodaavan DNA-sekvenssin ja geenin (1) välissä. Eräs hyvänä pidetty signaalisekvenssi on kuviossa 1 annetun DNA-sekvenssin poly-20 nukleotidin 351-431 koodaama signaalisekvenssi, joka on plasmidissa pAW14B olevan, kypsää exIA-polypeptidiä koodaavan DNA-sekvenssin edellä. Yhteen-: vetona todettakoon, että menetelmässä, jolla tuotetaan keksinnön mukaista
» I I
proteiinia, homeen transformoi nti in käytetty vektori voi käsittää edellä kuva- ;: * tun exIA-peräisen promoottorin tai edellä kuvatun exIA-peräisen terminaattorin ν’ί 25 tai edellä kuvatun exIA-peräisen signaalisekvenssin tai ainakin oleellisen osan exIA-rakennegeenistä tai minkä tahansa näiden ekspressiota ja/tai erittämistä i säätelevien alueiden yhdistelmän.
»· * • ·
Keksintöä on havainnollistettu seuraavissa esimerkeissä niihin rajoittumatta.
:.J 30 Kaikki nukleiinihappomateriaalien manipulointiin ja analysoimiseen käytetyt • ‘ ‘: tekniikat suoritettiin oleellisesti Sambrook et ai. (1989)-julkaisussa kuvatulla : \i tavalla, ellei toisin ole mainittu.
15 111958
Esimerkki 1 Aspergillus niger var. awamori'n endoksylanaasi II-geenin (exIA) ja siihen liittyvien säätelysekvenssien kloonaus ja karakterisointi 5 1.1 Aspergillus niaer var. awamori'n exIA-aeenin eristäminen exIA-geenin eristämiseksi Aspergillus niger var. awamori'n kromosomaalises-ta DNA:sta syntetisoitiin erilaisia koettimia oligonukleotidien (taulukko A) seoksesta. Näiden seosten koostumus saatiin puhdistetun endoksylanaasi ΠΙΟ proteiinin N-terminaalisesta aminohapposekvenssistä.
Southern blot-analyysin avulla todettiin, että kromosomaalisen DNA:n pilkko-misseoksissa hybridisoituu stringenteissä olosuhteissa vain yksi käytettyjen koettimien kanssa. Aspergillus niger var. awamori'n DNA:n Eco Rl-, Sali- ja 15 Bam HI-pilkkomisseoksissa hybridisoituu yksi pala, joka on vastaavasti 4,4, 5,3 ja 9,5 kb suuruinen, sekä Xyl01:n, Xyl04:n että Xyl06:n kanssa. Xyl05:lla ei saatu mitään selvää signaalia 41°C:ssa. Tämän tuloksen perusteella hybridisoi-tiin Aspergillus niger var. awamori'x\ DNA:n geenipankki 65°C:ssa käyttämällä koettimena oligonukleotidiseosta Xyl06. Kolme plakkia (lambda 1,14 ja 63) .: 20 65000 testatusta plakista (vastaten genomia 32-kertaisesti) hybridisoitui tä- ; män koettimen kanssa. Sen jälkeen, kun lambda l:n ja lambda 14:n DNA:n : pilkkomisseokset oli hybridisoitu Xyl06:n kanssa, löydettiin lambda l:n EcoRI- pilkkomisseoksesta yli 10 kb suuruinen hybridisoituva pala. Hybridisoituvan ; :· palan koko lambda 14:ssa ja kromosomaalisessa Eco RI-seoksessa oli 4,4 kb.
: 25 Lambda l:n Sa/I-seoksessa hybridisoituu 4,6 kb pala; tämä on lambda 14:n 5^/I-seoksessa 5,3 kb suuruinen pala, kuten myös kromosomaalisessa : DNA:ssa. Myös 1,2 kb Pstl-BamHI-fragmentti (kuvio 2) hybridisoituu Xyl06:n :: kanssa. Näiden lambda-plakkien vahvistettiin sisältävän Aspergillus niger var.
• awamori'n päällekkäisiä genomifragmentteja eri entsyymeillä saatujen restrik- 30 tiokuvioiden perusteella ja sen perusteella, että lambda 1 :n ja lambda 14:n pilkkomisseokset ristihybridisoituivat lambda 14:n 5,3 kb 5^/I-fragmentin :kanssa. Myös indusoidun totaali-RNA:n homologinen hybridisoituminen vastaavasti lambda l:nja lambda 14:n 5,3 kb Sa/I-fragmentin kanssa vahvisti 16 111958 exIA-sekvenssien mukanaolon näissä lambda-plakeissa. Hybridisaatio havaittiin ksylaanilla indusoidulla, noin 1 kb suuruisella mRNA:lla. Tämän koko vastaa Xyl06:n kanssa hybridisoituvan mRNA-molekyylien kokoa.
Ami nohappo sekvens s i 1 s 10 15
Ser Ala Gly He Asn Tyr Vai Gin Asn Tyr Asn Gly Asn i.eu Gly Asp Phe
Koetin Emäksiä Aminohapot (oligonukleotidien määrä)
Emässekvenssi 3' - 5'__
XylOl 23 5-12 (256)
TTA ATA CAX GTT TTA ΑΤΑ TTA CC G G C G G G
Xyl04 47 2-17 (1)
CGG CCG TAG TTG ATG CAG GTC TTG ATG TTG CCG TTG GAC CCG CTG AA
Xyl05 23 10-17 (144)
ATG TTG CCA TTA AAX CCA CTG AA G G G G
C C
Xyl06 47 2-17 (256)
CGG CCG TAG TTG ATG CAG GTC TTG ATG TTG CCG TTG GAG CCG CTG AA
C C · C CT C CC
15 -
x= a, g, c tai T
Taulukko A Endoksylanaasi II-proteiinin N-terminaalisesta aminohapposekvenssistä saadut koettimet . 20 :Oligonukleotidien määrä "sekakoettimessa" on annettu suluissa; tämä määrä : saadaan sisällyttämällä 1, 2, 3 tai 4 erilaista emästä jokaiseen kolmanteen : asemaan aminohapon kodoneiden lukumäärästä riippuen. Xyl04:ssa G valittiin ;:· G-C:n ja G-T:n hybridisoitumisen perusteella ja/tai Aspergillusniger-q\uVa- v : 25 amylaasin hyvänä pidettyjen kodonien perusteella. Xyl05:ssa ja Xyl06:ssa ei ole viety kaikkia mahdollisesti esiintyviä emäksiä kodonin kolmanteen ase-: maan, jotta seokseen ei saataisi enempää kuin 256 oligonukleotidiä. Oligonuk- : ; leotidien sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen sekvenssin kans- sa.
:! J 30 XylOl: Seos 256 oligosta, joiden pituus on 23 deoksinukleotidiä ja joiden j' · ‘. sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja : ’ ·. · 5-12 koodaavan osan kanssa.
• I
17 111958
Xyl04: Oligo, jonka pituus on 47 deoksinukleotidiä ja jonka sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja 2-17 koodaa-van osan kanssa.
Xyl05: Seos 144 oligosta, joiden pituus on 23 deoksinukleotidiä ja joiden 5 sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja 10-17 koodaavan osan kanssa.
Xyl06: Seos 256 oligosta, joiden pituus on 47 deoksinukleotidiä ja joiden sekvenssi on komplementtinen koodaavan säikeen aminohappoja 2-17 koodaavan osan kanssa.
10 1.2 Aspergillusniaer var. awamori'n exIA-oeenin iatkokloonaus
Vastaavasti lambda l:n (4,6 kb) ja lambda 14:n (5,3 kb) 5^/I-fragmentit, jotka hybridisoituvatXyl06:n kanssa, kloonattiin kahdessa orientaatiossa 15 pUC19:n 5a/I-kohtaan, jolloin saatiin vastaavasti plasmidi pAWl (A ja B) ja plasmidi pAW14 (Aja B, kts. kuvio 3). 1,2 kb /^fP-Äs/flHI-fragmentti, joka hybridisoitui Xyl06:n kanssa, ja viereinen 1,0 kb Bam Hl-Psf I-fragmentti vastaavasti pAW14A:sta ja pAWlA:sta kloonattiin edelleen Bam HI:lla ja £sf I:lla katkaistuihin M13mpl8:aan ja M13mpl9:aan. Näin saatiin taulukon B . 20 ml8/ml9 AW-vektorit.
: ; Fragmentti_Saadut vektorit_ :/,: pAW IA BamHI-^sfI* (1,2 kb) ml8AW 1A-1 / ml9AW 1A-1 .,:PAW14A BamHI-Zisfl* (1,2 kb) ml8AW14A-l / ml9AW14A-l 25 pAW IA />sfI-BamHI (1,0 kb) ml8AW 1A-2 / ml9AW 1A-2 PAW14A Psf I-BamHI (1,0 kb) ml8AW14A-2 / ml9AW14A-2 :Taulukko B Lambda 1- ia lambda 14-fraamenttien vksisäikeiset iatkokloonit 30 1.3. exIA-aeenin transkriDtiosuunnan määrittäminen I * | •,: exIA-geenin transkription suunta selvitettiin spot blot-hybridisoimalla vastaa vasti ml8AW14A-l:n ja ml9AW14A-l:n ss-DNA Xyl06:n kanssa.
18 111958 ml9AW14A-l:n ss-DNA:n (S'-Pst\*-BamHl-3') havaittiin hybridisoituvan tämän koettimen kanssa. Koska Xyl06:n sekvenssi vastaa ei-koodaavan säikeen sekvenssiä, ml9AW14A-l sisältää koodaavan säikeen. Tämän perusteella saatiin kuviossa 2 esitetty transkription suunta. Alukkeen jatkamiskokeen tulokset 5 vahvistavat tämän suunnan.
1.4 exIA-aeenin identifiointi
Promoottorialueen osan DNA-sekvenssi määritettiin sekvenssianalysoimalla 10 pAW14B käyttämällä alukkeena (geenin 5'-osana) Xyl06:a. Tällä alueella aluk-keeksi valittiin Xylll (taulukko E), jonka avulla määritettiin ml8AW14A-l:n ja ml8AWla-l:n komplementtisen säikeen DNA-sekvenssi. Nämä tulokset osoittivat, että nämä vektorit sisälsivät DNA-sekvenssin, joka oli oleellisesti samanlainen kuin Xyl06:n sekvenssi, kun taas emäsparisekvenssistä saatu amino-15 happosekvenssi oli identtinen kypsän endoksylanaasi II-proteiinin N-termin-aalisen aminohapposekvenssin kanssa. Tällä tavoin todistettiin ainakin exIA-geenin 5'-pään kloonautuminen. Koko exIA-geenin mukanaolo vektoreissa pAW14 ja pAWl näytti luultavalta geenin 5'-pään 5a/I-fragmenteissa olevan aseman (kuvio 2) ja exIA mRNA:n koon (noin 1 kb) perusteella.
20 1.5 Sekvenssianalyysi : ’ ·, · exIA-geenin ja ympäröivien alueiden nukleotidisekvenssi määritettiin dideok- :· simenetelmällä (Sanger et ai., 1977) molempiin suuntiin sekä ml3AW14- että : ’ ί ‘: 25 m 13AWl-jatkoklooneissa. Myötävirtaan Pst I*-kohdasta sijaitsevan Bam HI- kohdan ympärillä oleva sekvenssi määritettiin sekvenssianalysoimalla kaksi-I säikeiset pAW14- ja pAWl-DNA:t. Tiivistymät selvitettiin käyttämällä dGTP:n »tl :; asemesta dITP:a exIA-sekvenssien osoitettiin olevan identtiset toisistaan riip- pumattomissa klooneissa lambda 1 ja lambda 14. Kuviossa 1 on esitetty 30 2,1 kb £sf I*-#?/-I-fragmentin, joka käsittää koko pre(pro)endoksylanaasi • * ·'. II-geenin ja endoksylanaasi II-geenin promoottori- ja terminaattorisekvenssit, :\j täydellinen nukleotidisekvenssi. Kypsää endoksylanaasi II-proteiinia edeltää 27 19 111958 aminohapon johtopeptidi. Signaalipeptidaasin ennustettu tunnistamiskohta on asemissa 16 ja 17 sijaitsevien alaniiniryhmien välissä (..-T-A-F-A-j-A-P-V-..) (Van Heijne, 1986). Johtopeptidin pituudesta voidaan päätellä, että proteiinissa on mukana toinen prosessoi nti kohta. Arg (27):n ja Ser (28):n välissä mah-5 dollisesti sijaitseva sidos katkaistaan KEX2-maisella endoproteaasilla (Fuller et ai., 1988).
1.6 Intronin paikallistaminen 10 Koska Aspergillus -homeissa on intronien "donori"- ja "ekseptori"-kohtia vastaavia sekvenssejä, exIA-geenissä ennustettiin olevan joko 49 tai 76 bp introni (581-629 tai 581-656, kts. kuvio 1). Selvä todistus 76 bp intronin puuttumisesta saatiin eristämällä endoksylanaasi II-peräinen peptidi, jolla oli sekvensssi Tyr-Ser-Ala-Ser-Gly... Tämä peptidi voi sijaita vain proteiinissa, joka alkaa 15 nukleotidiasemasta 652 (kts. kuvio 1). Sen vuoksi exIA-geeni käsittää yhden, 49 bp suuruisen intronin (asemat 581-629, kts. kuvio 1).
1.7 exIA-oeenin 3'-pään määrittäminen 20 exIA-geenin pysäytyskodonin sijainti (asemat 1033-1035 kuviossa 1) saatiin . : ·. DNA:n sekvenssointitiedoista. Tämän pysäytyskodonin läsnäolo varmistettiin siitä, että yhden peptidin, joka oli saatu endoksylanaasi II:sta pilkkomalla ke- ' *.! miallisesti CNBnlla, aminohapposekvenssi osoittautui olevan identtinen DNA- > · ; i · sekvenssitiedoista saadun C-termianalisen aminohapposekvenssin kanssa, 25 asemat 991-1032 kuviossa 1).
i 1.8 DNA- ia proteiinitietoien arviointi • · · * * ;:· Edellä olevien tietojen perusteella todettiin, että Aspergillusniger var. awa- 30 mori'n endoksylanaasi II:a koodaava geeni oli kloonattu 5,3 kb SaiI-frag-:*·*. menttiin. Selvitettiin geenin DNA-sekvenssi, intronin asema ja mRNA:n pituus.
:\i DNA-sekvenssi vahvisti täysin kypsän proteiinin saadun N-terminaalisen ami nohapposekvenssin. Edellisten tietojen perusteella voidaan päätellä, että exIA- 20 111958 geeni koodaa 211 aminohapon proteiinia, ja että ensimmäiset 27 aminohappoa poistuvat post-translationaalisesti. Näistä arvoista satiin exIA-signaali-sekvenssi.
5 Myös exIA-promoottorin nukleotidisekvenssi saadaan saadusta sekvenssistä (kts. kuvio 1, asemat 1-350). Myös exIA-terminaattorin nukleotidisekvenssi saadaan saadusta sekvenssistä (kts. kuvio 1, asemat 1036-2059 tai näiden osa).
10 Esimerkki 2 Escherichia ce>//6-glukuronidaasi (uidA)-geenin ekspressio käyttämällä exIA-promoottori- ja -terminaattorisekvenssejä 2.1 uidA-ekspressointivektorin rakentaminen 15 uidA-ekspressointiplasmidi (paW15-l) rakennettiin lähtemällä plasmidista pAW14B, joka sisältää noin 5,3 kb Sa/I-fragmentin, jossa sijaitsee 0,7 kb en-doksylanaasi II (exlA)-geeni yhdessä 5'-ympäröivien 2,5 kb sekvenssien ja 3'-ympäröivien 2,0 kb sekvenssien kanssa (kuvio 3). exlA:a koodaava alue korvattiin pAW14B:ssa uidA:a koodaavalla alueella. pAW15-l voitiin rakentaa 20 käyttämällä BspHI-kohtaa (5'-TCATGA-3'), joka käsittää exIA-geenin nesim-mäisen kodonin (ATG), ja Λ/711-kohtaa (5'-CTTAAG-3'), joka käsittää exIA- : geenin pysäytyskodonin (TAA).
* * · ♦ · * · · • Il I · _ Rakentaminen tehtiin seuraavasti: pAW14B (7,9 kb) pilkottiin osittain O '· 25 Bsp HI:lla (pAW14B sisältää viisi Bsp HI-kohtaa) ja linearisoitu plasmi- di /7,9 kb) eristettiin agaroosigeelistä. Sen jälkeen eristetty 7,9 kb fragmentti : V pilkottiin Bsml:\\a, joka katkaisee muutaman nukleotidin myötävirtaan mie- • · lenkiinnon kohteena olevasta BspHI-kohdasta, millä poistetaan muissa Bsp ,,;; HI-kohdissa linearisoidut plasmidit. Fragmentit erotettiin agaroosigeelillä ja 30 eristettiin 7,9 kb BspHl-BsmI-fragmentti. Tämä pilkottiin osittain Afl\l\Wa ja ·*·’: saatu 7,2 kb BspHl-zi/ni-fragmentti eristettiin. uidA-geeni eristettiin 1,9 kb • » :\i McoI-/4/7II-fragmenttina pNOM-7l/7II:sta, pNOM102:sta saadusta plasmidista (Roberts et ai., 1989). pNOM102:ssa on kaksi Neo I-kohtaa, joista toinen si- 21 111958 jaitsee uidA-geenin 5'-päässä ja sisältää geenin translaation ATG-aloitusko-donin. Toinen Atol-kohta sijaitsee muutaman nukleotidin verran myötävirtaan pysäytyskodonista. /4/7II-kohta myötävirtaan uidA-pysäytyskodonista saatiin muuntamalla jälkimmäinen A/faoI-kohta /4/7II-kohdaksi: pNOM102 pil-5 kottiin osittain Neo 1:11a ja ligatoitiin Neo Ι-Λ/711-linkkerin kanssa {Neo Afl, kts. taulukko E), jolloin saatiin vektori pNOM-/J/7II. pAW14B:n 7,2 kb BsfMl-Aflll-fragmentti ligatoitiin pNOM-7l/7II:n 1,9 kb /VcoI-zl/ZII-fragmenttiin, jolloin saatiin vektori pAW15-l (kuvio 4).
10 Rakennettu vektori (pAW15-l) voidaan tämän jälkeen siirtää homeisiin (esimerkiksi Aspergillus nigefm, Aspergillusniger var. awamori'\c\, Aspergillus nidu/ans'Wn jne.) tavanomaisilla ko-transformointimenetelmillä ja β-glukuroni-daasi voidaan sen jälkeen ekspressoida indusoimalla endoksylanaasi II-pro-moottori. Rakennettu vektori voidaan myös varustaa tavanomaisilla selektoin- 15 ti markkereina (esimerkiksi amdS tai pyrG, hygromysiini jne.) ja home voidaan transformoida saadulla vektorilla niin, että se tuottaa haluttua proteiinia.
£ co//hygromysiini-selektointimarkkeri vietiin esimerkkinä uidA-ekspressointi-vektoriin, jolloin saatiin pAW15-7 (kuvio 4). Tähän tarkoitukseen käytettiin fragmenttia, joka sisälsi E co//hygromysiini-resistenttiysgeenin, jota kont-....: 20 rolloivat Aspergillus /7/tf£//a/7sgpdA-promoottoria Aspergillus nidulans trpC-ter- minaattori. Tämä kasetti eristettiin 2,6 kb Not I-fragmenttina pBluekan7-l:sta, jossa hygromysiini-resistenttiyskasetin sivustoilla ovat /Voil-kohdat. pAW15-l:ssa muodostettiin Atofl-kohta muuntamalla EcoRI-kohta (joka on ;: * 1,2 kb vastavirtaan ATG-kodonista) NotI-kohdaksi käyttämällä synteettistä •V*: 25 oligonukleotidiä (Eco-Not, kts. taulukko E), jolloin saatiin pAW15-l-IMot. 2,6 kb /Voil-fragmentti pAWBIuekan7-l:sta eristettiin ja ligatoitiin /VofI:lla linearisoi-: .·' dun pAW15-l-Not:in kanssa. Saadulle vektorille annettiin nimeksi pAW15-7 (kuvio 5).
* * > 30 2.2 £ co/ZB-olukuronidaasin tuotto exlA:n ekspressointisianaalien ohjaamana • ·
Aspergillus niger var. awamoritransformoitiin pAW15-7:lla. Transformantti AW15.7-1 tunnistettiin selektoimalla hygromysiinin avulla. Tämän transfor- 22 111958 mäntin genomi-DNA:n Southern-hybridisointianalyysi osoitti, että tämä trans-formantti sisältää yhden kopion uidA-geenistä.
Aspergillus niger var. awamori'a (AW) ja transformanttia AW15.7-1 kasvatet-5 tiin seuraavissa olosuhteissa. Ravistelupullot (500 ml), joissa oli 200 ml synteettisiä alustoja (pH 6,5), siirostettiin itiöillä (loppukonsentraatio: 10E6/ml).
Alustalla oli seuraava koostumus (AW-alusta): 10 Sakkaroosi 10 g/l NaN03 6,0 g/l KCI 0,52 g/l KH2P04 1,52 g/l
MgS04-7H20 0,49 g/l Hiivauute 1,0 g/l
ZnS04-7H20 22 mg/l H3BO3 11 mg/l
MnCI2-4H20 5 mg/l FeS04-7H20 5 mg/l 15 CaCI2-6H20 1,7 mg/l CuS04-5H20 1,6 mg/l
NaH2Mo04-2H20 1,5 mg/l Na2EDTA 50 mg/l
Inkubointi suoritettiin 30°C:ssa 24 tunnin ajan nopeudella 200 k/min. Mk X inkubointiravistelijassa. Kasvun jälkeen solut poistettiin suodattamalla ...20 (0,45 pm suodatin), pestiin kaksi kertaa sakkaroosia ja hiivauutetta sisältä- . ; . mättömällä AW-alustalla (suolaliuos), suspendoitiin uudelleen 50 ml:aan suo- : laliuosta ja siirrettiin 300 ml ravistelupulloihin, jotka sisälsivät 50 ml suolaliuos- ta, johon oli lisätty ksyloosia 10 g/l loppukonsentraatioon (indusointialusta).
·· Uudelleensuspendoinnin ajankohdasta on käytetty merkintää "t=0" (indusoin- : : : 25 nin aloittaminen). Inkubointi tapahtuu samoissa olosuhteissa kuin mitä edellä on kuvattu. Näytteet otettiin 15 ja 22 tunnin kuluttua indusoinnista. Biomassa : otettiin talteen suodattamalla miracloth-suodattimen läpi, kuivattiin purista- :...: maila ja pakastettiin välittömästi nestemäisessä typessä. Rihmasto hajotettiin ;! jauhamalla pakastettu rihmasto ja β-glukuronidaasiaktiivisuus määritettiin 30 oleellisesti Roberts et ai. (1989)-viitteessä kuvatulla tavalla.
• * t 5 23 111958
Taulukosta C on ilmeistä, että ksyloosin läsnäolo indusoi spesifisesti exIA-promoottorin ja että exIA-promoottori ja -terminaattoria voidaan käyttää £ co//B-glukuronidaasin tuottamiseen transformantissa AW15.7-1.
Kanta Koe t=0 t=15 11=22 ÄW ~K (ΰΓΙΰϊ 0,1 ÄW B 0,0 AW15.7-1 "Ä 0,7 1110 823 10 AW15.7-1 1 0,6 1065 773
Taulukko C. β-glukuronidaasin tuottaminen 15 Transformantteja kasvatettiin tekstissä annetussa synteettisessä alustassa 24 tuntia ja siirrettiin hetkellä t=0 tekstissä annettuun indusointialustaan. Rihmastossa oleva B-glukurodinaasiaktiivisuus määritettiin tekstissä kuvatulla tavalla. Aktiivisuus on ilmoitettu entsymaattisina aktiivisuusyksiköinä kokonais-proteiinin mg kohti.
20 •; ·. Esimerkki 3 Thermomyces lanuginosa 'n lipaasin tuottaminen ja erittäminen ♦ f; käyttämällä exIA-promoottoria, -signaalisekvenssiä ja -termi- naattoria 25 3.1 exIA-eksoressointisianaaleihin perustuvien ekspressointiplasmidien raken taminen : 3.1.1 Vektori • t» ;! Käyttämällä lähtövektorina plasmidia pAW14A-Not rakennettiin joukko eks- 30 pressointiplasmideja, jotka sisälsivät exIA-ekspressointisignaaleja ja Thermo-;' ·'; myces lanuginosa 'n lipaasia koodaavan geenin. Plasmidi pAW14A sisältää : ‘ , i Aspergillus niger var. awamori 'n kromosomaalisen 5 kb SaiI-fragmentin, jossa sijaitsee 0,7 kb exIA-geeni, yhdessä 5'-ympäröivien 2,5 kb sekvenssien 24 111958 ja 3'-ympäröivien 2,0 kb sekvenssien kanssa (samankaltainen kuin pAW14B, kts. kuvio 3). pAW14A:ssa muunnettiin p(JC19-polylinkkeristä peräisin oleva ftöRI-kohta Not-kohdaksi insertoimalla synteettinen oligonukleotidi (Eco-Not, kts. taulukko E), jolloin saatiin pAW14A-Not. pAW14A-Not:sta lähtemällä val-5 niistettiin konstruktioita, joissa exIA-promoottori (2,5 kb) oli fuusioitunut Ther-momyces lanuginosa -lipaasigeenin translaation aloituskodoniin (ATG). Lisäksi tehtiin konstruktioita, joissa exIA-promoottori ja exIA-proteiinin ensimmäistä 27 aminohappoa koodaava DNA-sekvenssi, joka on preprosekvenssi, oli fuusioitu kypsää lipaasi-polypeptidiä koodaaviin sekvensseihin.
10
Kummassakin ekspressointivektorisarjassa käytettiin exlA:n transkription ter-minaattoria.
Seuraavat vektorifragmentit eristettiin pAW14A-Not:sta ja käytettiin konstruk-15 tioiden rakentamiseen: * lipaasin translaation aloituskohdan kanssa fuusioimista varten jäljestettiin 7,2 kb £syPHI-y4/7II-fragmentti pAW14A-Not:sta. Tämä on samankaltainen fragmentti kuin pAW15-l:n (kts. esimerkki 2) rakentamista varten eristetty 20 fragmentti, ja se eristettiin oleellisesti samalla tavalla kuin mitä on kuvattu ; . esimerkissä 2. Fragmentti sisältää 2,5 kb nukleotidisekvenssejä, jotka käsittä- : . vät Bsp HI-kohtaan asti ulottuvan exIA-promoottori n, jossa on ATG-kodoni, ja 2,0 kb nukleotidisekvenssejä, jotka käsittävät /1/7II-kohdasta alkavan exlA:n ’ · transkription terminaattorin, joka sisältää pysäytyskodonin.
25 * exIA-promoottoria ja exIA-pre-pro-peptidiä koodaavan alueen (exIA-geenin j V 27 ensimmäistä aminohappoa) ja kypsän lipaasi-polypeptidin koodausalueen :: fuusiointia varten eristettiin osittain pilkottu 7,2 kb Nru Ι-Λ/711-fragmentti pAW14A-Not:sta. Tämä fragmentti sisältää 2,5 kb nukleotidisekvenssejä, jotka *»* * ; ’ ‘ ‘: 30 käsittävät exIA-promoottorin ja exIA-proteiinin 26 ensimmäistä aminohappoa : v. koodaavan sekvenssin, joka päättyy Nru I-kohtaan, jolloin exIA-prosek- venssistä puuttuu vain yksi aminohappo. Fragmentti sisältää lisäksi 2 kb nuk- 25 111958 leotidisekvenssejä, jotka käsittävät Λ/711-kohdalla alkavan exlA:n transkription terminaattorin.
Thermomyces lanuginosa n lipaasigeeni eristettiin vektorista pTL-1, jossa on 5 lipaasigeenin 0,9 kb koodausalue (kuvio 9) Aspergillus /7/^erglaA-promoot-torin ja Aspergillus nidulans trpC-transkription terminaattorin reunustamana (kuvio 8).
3.1.2 Lipaasigeenin fuusiointi exlA:n transkription terminaattorisekvenssin 10 kanssa
ExlA:n transkription terminaattorin ja lipaasigeenin fuusiointia varten muodostettiin Λ/711-kohta juuri myötävirtaan lipaasigeenin pysäytyskodonista. pTL-1 :ssa /7//7^III-kohta on 5 emäsparia myötävirtaan lipaasigeenin pysäytys-15 kodonista (kuviot 8 ja 9). Λ/711-kohta muodostettiin tähän käyttämällä synteettistä oligonukleotidiä. Rakentaminen suoritettiin seuraavasti: pTL-1 katkaistiin HindllV.Wa, jolloin saatiin lineaarinen 8,3 kb fragmentti, joka eristettiin agaroosigeelistä ja ligatoitiin oligonukleotidin Hind-Afl kanssa : 20 (kts. taulukko E). Saadussa pTLl-AfUI-vektorissa on////raTII-kohta hävinnyt ja . Λ/711-kohta on muodostettu juuri myötävirtaan lipaasigeenin pysäytyskodonis- . . ta. Lipaasigeeni on näin valmis fuusioitavaksi exIA-terminaattoriin Affll- kohdassa.
* % : ; : 25 3.1.3 exIA-promoottorin fuusiointi lipaasigeenin kanssa fATG-fuusio) i '.: Lipaasigeenin sisältävän DNA-fragmentin eristämiseen käytettiin lähtövektori- , : na pTLl-AflII:a. Lipaasigeenin fuusioimiseksi exIA-promoottoriin muunnettiin lipaasigeenin ATG-kodonin sisältävä alue (ATATGA) Bsp HI-kohdaksi (TCAT- ·.[[]: 30 GA). Tämä kohta sisältää yhä oikean lipaasigeenin koodaussekvenssin. Tähän tarkoitukseen käytettiin synteettistä DNA-fragmenttia, joka muodostui toisiinsa ; 1 ·, * liitetyistä BTFF09- ja BTFFlO-oligonukleotideistä (kts. taulukko E). Tämä syn- • > teettinen fragmentti sisältää Xho I-kohdan kloonausta varten ja sitä seuraavan 26 111958
Bsp HI-kohdan, jossa on ATG-kodoni ja lipaasigeenin seuraavat 7 emäsparia 5«?cI-kohtaan asti.
Vektori pTLl-Aflll linearisoitiin pilkkomalla osittain A7tol:lla ja sen jälkeen 5 Sac I: Ma, joka katkaisee lipaasin pre-pro-polypeptidiä koodaavaan avoimen lukukehyksen aseman +10 jälkeen. 6,3 kb Xho l-Sac I-vektorifragmentti (saatu katkaisemalla Xho I-kohdassa glaA-promoottorissa jättämällä samalla ehjäksi sisäinen Xho I-kohta lipaasigeenissä, kts. kuvio 8) agaroosigeelistä ja ligatoitiin synteettisen Aftol-^cl-fragmentin kanssa, jolloin saatiin vektori 10 pTLl-XS. pTLl-XS:sta eristettiin 0,9 kb, lipaasigeenin sisältävä BspHl-Aflll-fragmentti, ja ligatoitiin pAW14A-Not:n 7,2 kb Bsp ΗΙ-Λ/711-fragmenttiin, jolloin saatiin ekspressointivektori pAWTL-l (kuvio 6).
3.1.4 exIA-promoottorin ia exIA-preprosekvenssiä koodaavan alueen fuusiointi 15 kvosän lipaasiproteiinin koodaussekvenssin kanssa
Lipaasigeenin sisältävän DNA-fragmentin eristämiseen käytettiin lähtövektori-na pTLl->4/7II:a. Jotta kypsää lipaasipolypeptidiä koodaava sekvenssi saataisiin fuusioitumaan oikein exlA:n promoottorisekvenssin ja exlA:n johtopeptidiä 20 koodaavien sekvenssien kanssa, käytettiin synteettistä DNA-fragmenttia, joka ; ·. muodostui toisiinsa liitetyistä BTFF05- ja BTFF06-oligonukleotideistä (kts. tau- » · .·. lukko E). Tämä synteettinen fragmentti sisältää exIA-pre-pro-sekvenssin vii- ·.; meistä aminohappoa koodaavia sekvenssejä fuusioituna kypsän lipaasin 12 ensimmäistä kodonia koodaavaan sekvenssiin. Se sisältää Xho I-kohdan kloo-i ‘; 25 nausta varten ja Nru I-kohdan, joka käsittää exIA-prosekvenssin viimeiset kolme emäsparia. Fragmentti loppuu Ä^/II-kohtaan. Vektori pTLl->4/7II li-j V nearisoitiin pilkkomalla osittain Xho I:lla, ja sen jälkeen katkaisemalla ;: £^/II:lla, joka katkoo tarkalleen kypsää lipaasia koodaavan alueen sisällä. 6,3 kb Xho \-Bg! II-vektorifragmentti (saatu katkaisemalla Xho I-kohdassa glaA-30 promoottorissa ja samalla jättämällä ehjäksi sisäisen Xho I-kohta lipaasi-; v. geenissää (kts. kuvio 8) eristettiin agaroosigeelistä ja ligatoitiin synteettisen : ·, Xho l-Bgl II-fragmentin kanssa, jolloin saatiin pTLl-XB. pTLl-XB:sta eristettiin * » 0,83 kb Nru Ι-Λ/711-fragmentti, joka sisälsi exIA-prosekvenssin kolme viimeistä 27 111958 emäsparia sekvenssin, joka koodaa kypsää lipaasipolypeptidiä Λ/711-kohtaan asti juuri yli pysäytyskodonin, sekvenssin seuraamana (kts. esimerkki 2). Tämä fragmentti ligatoitiin pAW14A-Not:n 7,2 kb Nru K4/7 II-fragmentin kanssa, jolloin saatiin ekspressointivektori pAWTL2 (kuvio 7).
5 3.2 Thermomvces lanuainosa 'n lipaasin tuottaminen ia eristäminen käyttämällä exIA-promoottoria ia -terminaattoria
Rakennetut ekspressointivektorit (pAWTLl ja pAWTL2) voidaan tämän jälkeen 10 siirtää homeisiin (esimerkiksi Aspergillus niger'iin, Aspergillus niger var. awamori'\n, Aspergillus nidulans'm jne.) tavanomaisilla ko-transformointiteknii-koilla ja lipaasi voidaan sen jälkeen ekspressoida indusoimalla endoksylanaasi II-promoottori. Rakennettu vektori voidaan myös varustaa tavanomaisilla selektointimarkkereilla (esimerkiksi amdS tai pyrG, hygromysiini jne.) ja home 15 voidaan transformoida oleellisesti esimerkissä 2 kuvatulla tavalla saadulla vektorilla niin, että se tuottaa haluttua proteiinia. Plasmidit saatiin esimerkiksi pAWTLl :sta ja pAWTL2:sta liittämällä niihin Aspergillus niger var. awamori'n pyrG-geeni ja saadut plasmidit vietiin kannasta CBS 115.52 (ATCC 11358) saatuun Aspergillus niger var. awamori-kantaan AWPYR, jossa pyrG-geeni on . 20 tuhottu. Tätä reittiä noudattamalla saatiin transformantti AWLPL1-2 1 » · < · t · : , käyttämällä pAWTLl-plasmidia, kun taas transformantti AWLPL2-2 saatiin läh- ... temällä pAWTL2-plasmidista.
5 *
Transformanttia AWLPL1-2 (sisältää Thermomyces lanuginosa 'n kypsää lipaa-; :': 25 siä koodaavan alueen yhdessä Thermomyces lanuginosa -signaalisekvenssin kanssa Aspergillus niger var. awamori'n exIA-promoottorin ja -terminaattorin kontrollin alaisena) ja transformanttia AWLPL2-2 (sisältää Thermomyces lanuginosa 'n kypsää lipaasia koodaavan alueen yhdessä endoksylanaasi-signaali-sekvenssin kanssa Aspergillus niger awamori 'n exIA-promoottorin ja -termi-30 naattorin kontrollin alaisena) kasvatettiin ravistelupulloissa esimerkissä 2 ku- :·!·. vatulla AW-alustalla. Inkubointi suoritettiin 30°C:ssa 24 tunnin aikana nopeu- • · ;'. t: della 200 k/min. MkX-inkubointiravistelijassa. Kasvun jälkeen solut otettiin tal teen suodattamalla (0,45 pm suodatin), pestiin kaksi kertaa sakkaroosia ja 28 111958 hiivauutetta sisältämättömällä AW-alustalla (suolaliuos), suspendoitiin uudelleen 50 ml:aan suolaliuosta ja siirrettiin 300 ml ravistelupulloihin, jotka sisälsivät 50 ml suolaliuosta, johon oli lisätty ksyloosia 10 g/l loppukonsentraatioon (indusointialusta). Uudelleensuspendoinnin ajankohdasta käytetään merkink-5 tää "t=0" (indusoinnin aloittaminen). Inkubointi tapahtuu samoissa olosuhteissa kuin edellä on kuvattu. Näytteet otettiin 15, 22 ja 39 tuntia indusoinnin jälkeen. Näytteistä poistettiin biomassa suodattamalla miracloth-suodattimen läpi ja suodoksesta analysoitiin lipaasiaktiivisuus titrimetrisesti käyttämällä substraattina oliiviöljyä.
10
Jokaisella näytteellä lisättiin 100 - 200 pl suodosta sekoitettuun seokseen, joka sisälsi 5,0 ml I i paasi su bstraattia (Sigma, sisältää oliiviöljyä lipaasin substraattina) ja 25,0 ml puskuria (5 mM Tris-HCI pH 9,0, 40 mM NaCI, 20 mM CaCI2). Määritys suoritettiin 30°C:ssa ja rasvahappojen vapautuminen mitattiin 15 titraamalla automaattisesti 0,05 M NaOH:lla pH-arvoon 9,0 käyttämällä Mettler DL25-titrauslaitetta. Näin saatiin titrausaineen määrälle käyrä aikaa vasten.
Näytteen sisältämän lipaasiaktiivisuuden määrä laskettiin tämän käyrän maksimaalisesta kaltevuudesta. Entsymaattisen aktiivisuuden yhdeksi yksiköksi määritellään se määrä entsyymiä, joka vapauttaa 1 μ-moolin rasvahappoa , : 20 oliiviöljystä yhdessä minuutissa edellä määritellyissä olosuhteissa. Tällaiset t , , määritykset ovat alan ammattimiesten tuntemia.
*..; Tulokset on esitetty taulukossa D. Näistä tuloksista on ilmeistä, että exIA-
» I
promoottorin ksyloosilla indusoinnin jälkeen muodostuu ja erittyy toimivaa ': 25 lipaasia ja että exIA-signaalisekvenssi voi ohjata heterologisten proteiinien erit tymistä Aspergillus niger var. awamori'ssa.
f » I »
* f I
» I
• I
♦ # * 29 111958
Kanta = Koe t=0 t=15 t=22 t=39 AWLPL1-2 ~Ä X2 76 65 59 AWLPL1-2 B 7 84 32 35 5 AWLPL2-2 "Ä 9 77 50 49 AWLPL2-2 B ~8 72 51 46 "ÄW "Ä 7 9 8 8 ~ÄW B 6 7 7 8 10
Taulukko D. Lipaasin tuottaminen ja erittäminen
Transformantteja kasvatettiin tekstissä annetulla synteettisellä alustalla 24 tuntia ja ne siirrettiin hetkellä t=0 tekstissä annettuun indusointialustaan.
15 Alustan lipaasiaktiivisuus määritettiin titrimetrisesti käyttämällä substraattina oliiviöljyä. Aktiivisuus ilmoitetaan lipaasiaktiivisuus-yksikköinä. A ja B merkitsevät kaksoiskokeita.
BTFF05 5'-TCGAGTCGCGAGAGGTCTCGCAA-3' sekvenssi luettelo 5 , 20 BTFF06 S'-GATCTTGCGAGACCTCTCGCGAC-S’ sekvenssi luettelo 6 BTFF09 5'-TCGAGCGTCATGAGGAGCr-3' sekvenssi luettelo 7 ; : BFTT10 5'-CCTCATGACGC-3' sekvenssiluettelo 8 ' -. * Eco-Not 5'-AATTGCGGCCGC-3' sekvenssiluettelo 9 ; · Hind-Afl S'-AGCTCGCTTAAGCG^' sekvenssiluettelo 10 V: 25 Nco-Afl 5-CATGCCTTAAGG-3' sekvenssiluettelo 11
Xylll 5'-GCATATGATTAAGCrGC-3' sekvenssiluettelo 12 :: Taulukko E. Konstruktioissa käytetyt oligonukleotidien nukleotidisekvenssit ': ‘ Sekvenssiluetteloiden numerot viittaavat virallisessa formaatissa annettuihin I · t » 30 luetteloihin.
• · · • · • · » • »» 30 111958
Kirjallisuusviitteet - Fuller, R.S., Sterne, R.E. ja Thorner J. (1988) Enzymes required for yeast prohormone processing. Ann. Rev. Physiol. 50, 345-362 5 - van Heijne, G. (1986) A new method for preceding signal sequence cleavage sites. Nul. Acids Res. 16, 4683-4690.
- Roberts, N., Oliver, R.P., Punt, PJ. ja van den Hondel, C.A.MJ.J. (1989) Expression of the Escherichia coli β-glukuronidase gene in industrial and phyto-pathogenic filamentous fungi Curr. Genet. 15, 177-180.
10 - Sambrook, J. Fritsch, E.F. ja Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A labora tory manual (2nd ed). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
- Sanger, F., Nicklan, S. ja Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.
15 - Ward, M., Wilsn, L.J., Kodama, K.H., Rey, M.W. and Berka, R.M. (GENEN- COR) (May 1990) Improved Production of Chymosin in Aspergi/lus by expression as a glucoamylase-chymosin fusion. Bio/Technology 8, 435-440.
- CA-A-2024448 (ALLELIX BIOPHARMACE) "Recombinant DNA expression construct - containing promoter for use in Aspergilluä', julkaistu 1.3.1991.
20 - EP-A-0436858 (GREEN CROSS CORP.) "Promoter of glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase gene - derived from Aspergillus orizae, used in new expression system in yellow-green or black koji mould", julkaistu :/.: 17.7.1991.
- EP-A-0439997 (CIBA GEIGI AG) "A. niger pyruvate kinase promoter - used , ; 25 to construct vectors for expression of structural genes in suitable hosts", jul kaistu 7.8.1991.
! V - WO 91/19782 (UNILEVER) "Xylanase production", julkaistu 26.12.1991, siis prioriteettivuona.
* « I * t • t • · *
* I I
111958 31
SEKVENSSILUETTELO
(1) YLEISINFORMAATIO: 5 (i) HAKUA: (A) NIMI: Unilever N.V.
(B) KATU: Weena 455 (C) KAUPUNKI: Rotterdam (E) MAA: Hollanti
10 (F) POSTIKOODI: (ZIP): NL-3013 AL
(A) NIMI: Unilever PLC
(B) KATU: Unilever House Blackfriars (C) KAUPUNKI: Lontoo 15 (E) MAA: Iso-Britannia
(F) POSTIKOODI: (ZIP): EC4P 4BQ
(ii) KEKSINNÖN OTSIKKO: Menetelmä tuottaa proteiinia käyttämällä endoksyla-naasi II:n (exIA) ekspressiosignaaleja 20 (iii) SEKVENSSIEN MÄÄRÄ: 12 (iv) TIETOKONEELLA LUETTAVA MUOTO: ·. (A) TALLENNUSMUOTO: lerppu ': 25 (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensopiva
'.;! (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
, ; ·, (D) OHJELMISTO: Patent In Release #1,0, versio #1,25 (EPO) 30 (v) NYKYISET HAKEMUSTIEDOT: T’ HAKEMUSNUMERO: (2) SEQ NO NO: 1:N TIEDOT: 32 111958 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 2059 emäsparia 5 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: kaksois (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genomi-)
10 (iii) HYPOTEETTINEN: EI
(iv) ANTI-SENSE: EI
(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Aspergillus niger var. awamori (B) KANTA: CBS 115.52 (ATCC 11358) 15 (vii) VÄLITÖN LÄHDE:
(B) KLOONI: paW14B
(ix) TUNNUSMERKIT: 20 (A) NIMI/KOODI: introni (B) SIJAINTI: 581..629 * · | (C) TUNNISTAMISTAPA: kokeellinen
(D) MUU INFORMAATIO: todistamistapa = KOKEELLINEN
25 (ix) TUNNUSMERKIT: (A) NIMI/KOODI: promoottori (B) SIJAINTI: 1..350 (C) TUNNISTAMISTAPA: kokeellinen
·,·, (D) MUU INFORMAATIO: todistamistapa = KOKEELLINEN
: ·; 30 (ix) TUNNUSMERKIT: ' · ·: ’ (A) NIMI/KOODI: sig-peptidi :···: (B) SIJAINTI: 351..431 * » » 33 111958 (ix) TUNNUSMERKIT: (A) NIMI/KOODI: mat-peptidi (B) SIJAINTI: join(432..580, 630..1032) (C) TUNNISTAMISTAPA: kokeellinen 5 (D) MUU INFORMAATIO: /EC-numero= 3.2.1.8 /tuote= "endoksylanaasi Π" /todistamistapa= KOKEELLINEN /geeni = "exIA" 10 (ix) TUNNUSMERKIT:
(A) NIMI/KOODI: CDS
(B) SIJAINTI: join(351..580, 630..1035) (C) TUNNISTAMISTAPA: kokeellinen (D) MUU INFORMAATIO: /EC-numero= 3.2.1.8 15 /tuote= "pre-pro-endoksylanaasi II" /todistamistapa = KOKEELLINEN /geeni = "exIA" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:l: 20 GCCCTTTTA tccgtcxgcc gtccatttag ccaaatgtag TCCATTTAGC CAAGTGCGGT 60 CATTTAGCC AAGACGAGTG GCTAGAXTGG TGGCTACACA GCAAACGCAT GACTGAGACA 120 AACTATAGG ACTGTCTCTG GAAATAGGCT CGAGGTTGTT CAAGCGTTTA AGGTGATGCG 180 25 CAAAATGCA TATGACTAAG CTGCTTCATC TTGCAGGGGC AAGGGATAAA TAGTCTTTTT 240 . , GCAGAATAT AAATAGAGGT AGAGTGGGCT CGCAGCAATA TTGACCAGCA CAGTGCTTCT 300 TTCCAGTTG CATAAATCCA TTCACCAGCA XTXAGCTTTC TTCAATCATC ATG AAG 356
Met Lys -27 ‘; TG ACT GCG GCT TIT GCA GGT CTT TIG GTC ACG GCA TTC GCC GCT CCT 404 in al Thr Ala Ala Phe Ala Gly Leu Leu Val Thr Ala Phe Ala Ala Pro : . 25 -20 -15 -10 .:. IG CCG GAA CCT GTT CTG GTG TCG CGA AGT GCT GGT ATT AAC TAC GTG 452 · ·: al Pro Glu Pro Val Leu Vai Ser Arg Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val -5 15 * > I * *
• I
35 » » 34 111958 aa aac tac aac ggc aac ctt ggt gat ttc acc tat gac gag agt GCC 500
In Asu Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala 5 10 15 20
Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr Ser Leu Gly Thr Vai 90 95 100
Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Vai Cys Thr Asp Thr Arg Thr Asn 105 110 115 10 Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr Gin Tyr Phe Ser Vai 120 125 130
Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Vai Thr Vai Ala Asn His Phe 135 140 145
Asn Phe Trp Ala Gin His Gly Phe Gly Asn Ser Asp Phe Asn Tyr Gin 150 155 160 165 15 Vai Met Ala Vai Glu Al.a Trp Ser Gly Ala Gly Ser Ala Ser Vai Thr 170 175 180
Ile Ser Ser ICCAGATATT CTATACTAAC AGACTTCTAA TGACTGCGGA TAATATACAC GGCAAGAATT 1442 tctacagttc gacgcagttc aacgcaatca GAGAGGGAAT ACTGATGAGA GTGCAATCAC 1502 20 TTAGAGAAGG ACAACATGGC AGTCTTAGTG TGAACTTACA TAACGATATG GACTCTAGAA 1562 AAAAGGAAGG AGGTCCGTCT ATATATAGCG CCATTACGTG TATCTGATGC TTGCCCATTG 1622 CCACTGGGTA GGGTGACTTT TTGAAGCGAC TCGACATATA ATATGACAAA CTCATGCCCC 1682 • k CTTTGCAGGA AACTTAGCTT TTCCTGCCTT GCTTTGAAGC CACAATTATC ACCAAACTCA 1742 : ; ’: TTTAGAGATT TATCTTCCTG TAACCGAAAC AAATATTTCG GGATTGGAäT AGCCmTGC 1802 : ·,: cgaactcatt Anirmcc gacggtaaat ctgggagtat accatgtcct ttcacgtttc 1862 •: · TCAACAAAAC TCTGCCGCAC CGGGTAACCT ACGGATAGTA CTGTATCCAG ACTCAGTTTT 1922 • · · > •,: : TCTAAIAACA GGACACTCTG CAATTTGCGG GAAAATTCCT ATGTATATTA CTrTCTCGTT 1982 GCATCTCAAA TATTGTGGCT TITTGAGACC CACACTATGT CTTGCACATA TTGTACCATC 2042 : CTTGCTTGAG GCCAATT 2059 30 » · » * * • · ;\! 35 • · 35 111958 (2) SEQ ID N0:2:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 211 aminohappoa 5 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIN TYYPPI: proteiini 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:2:
Ket Lys Vai Thr Ala Ala Phe Ala Gly Leu Leu Vai Thr Ala Phe Ala -27 -25 -20 -15
Ala Pro Vai Pro Glu Pro Vai Leu Vai Ser Arg Ser Ala Gly Ile Asti 15 -l0 -5 1 5
Tyr Vai Gin Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp Phe Thr Tyr Asp Glu 10 15 20
Ser Ala Gly Thr Phe Ser Het Tyr Trp Glu Asp Gly Vai Ser Ser Asp 25 30 35
Phe Vai Vai Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Asn Ala Ile Thr 20 40 45 50
Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Vai 55 60 65 ’·*; Tyr Gly Trp Vai Asn Tyr Pro Gin Ala Glu Tyr Tyr Ile Vai Glu Asp 70 75 80 85 • · X! 25 ::: (2)SEQIDN0:3:NTIED0T: • · (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: : (’ 30 (A) PITUUS: 886 emäsparia ’ ·; · ‘ (B) TYYPPI: nukleiinihappo ,,; j * (C) SÄIKEISYYS: kaksois ; ’ ’ ’: (D) TOPOLOGIA: lineaarinen I · · 36 111958 (ix) TUNNUSMERKIT: (A) NIMI/KOODI: mat-peptidi (B) SDAINTI: 1..876 (C) TUNNISTAMISTAPA: kokeellinen 5 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= " Thermomyces lanuginosa pre-pro-lipaasi"
/todistustapa= KOKEELLINEN
(ix) TUNNUSMERKIT: (A) NIMI/KOODI: mat-peptidi 10 (B) SDAINTI: 67..873 (C) TUNNISTAMISTAPA: kokeellinen (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= " Thermomyces lanuginosa -lipaasi" /todistustapa: KOKEELLINEN 15 (x) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:3: AIG AGG AGG TCC CTT GIG CTG TTC TTT GTC TCI GCG TGG ACG GCC TEG 48
Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Set Ala Tip Xhr Ala Leu -22 -20 -15 -10 20 GCC AGT CCT ATE CGI CGA GAG GTC TCG CAA GAT CTG TTT AAC CAG TTC 96
Ala Ser fro lie Arg Arg Glu Val Ser Gin Asp Leu The Asn Gin Phe -5 1 5 10 ; · ·; AAX CTC TTT GCA CAG TAT TCT GCT GCC GCA TAC TGC GGA AAA AAC AAI 144
Asn Leu Phe Ala Gin Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn i': 15 20 25 : : GAT GCC CCA GCT GGT ACA AAC ATT ACG TGC ACG GGA AAT GCC TGC CCC 192 , , jr Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn lie Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro .I ^ 30 35 40 ’: · GAG GTA GAG AAG GCG GAT GCA ACG TTT CTC TAC TCG TTT GAA GAC TCT 240 ..! Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser ·* 45 50 55 GGA GIG GGC GAT GTC ACC GGC TTC CTT GCT CTA GAC AAC ACG AAC AAA 288 , · ( Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys . ·’ 60 65 70 30 • I * * * » :/.: 35 37 111958 TIG AXC GTC CTC TCT TTC CGT GGC TCT CGT TCC ATA GAA AAC TGG AXC 336 g Leu Ile Val Leu Sex Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Xrp He 75 80 85 90 GGA AAX CXT AAC IXC GAC XTG AAA GAA ΑΤΑ AAX GAC ATT TGC TCC GGC 384
Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu He Asn Asp He Cys Ser Gly 95 100 105 TGC AGG GGA CAT GAC GGC TTC ACC TCG AGC TGG AGG TCT GTA GCC GAT 432
Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp 110 115 120 ACG TTA AGG CAG AAG GTG GAG GAT GCT GTG AGG GAG CAT CCC GAC TAT 480
Thr Leu Arg Gin Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr 125 130 135 CGC GTG GTG TTT ACC GGA CAT AGC TTG GGT GGT GCA TTG GCA ACT GTT 528
Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val 140 145 150 15 GCC GGA GCA GAC CTG CGT GGA AAT GGG TAT GAC ATC GAC GTG TTT TCA 576
Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp He Asp Val Phe Ser 155 160 165 170 TAT GGC GCC CCC CGA GTC GGA AAC AGG GCT TTT GCA GAA TTC CTG ACC 624
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr 175 180 185 GTA CAG ACC GGC GGT ACC CTC TAG CGC ATT ACC CAC ACC AAT GAT ATT 672 in Val Gin Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg He Thr His Thr Asn Asp He 190 195 200 GTC CCT AGA CTC CCG CCC CGC GAG TTC GGT TAC AGC CAT TCT AGC CCA 720 ; Val.Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro ’ 205 210 215 GAG TAC TGG ATC. AAA TCT GGA ACC CTT GTC CCC GTC ACC CGA AAC GAC 768 , *, Glu Tyr Trp He Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp I ‘ ^ 220 225 230 ,: 25 ’ · ATC GTG AAG ATA GAA GGC ATC GAT GCC ACC GGC GGC AAT AAC CAG CCT 816 . I. Ile Val Lys He Glu Gly lie Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gin Pro 235 240 245 250
« I
• ’ ‘ AAC ATT CCG GAT ATC CCT GCG CAC CTA TGG TAC TTC GGG TTA ATT GGG 864
Asn lie Pro Asp He Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu He Gly 255 260 265 ,,’ 30 ACA TGT CTT TAGTGCGAAG CTT 886 ; Thr Cys Leu '; ‘ 270 35 I « » (2) SEQ ID N0:4:N TIEDOT: 38 111958 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 291 aminohappoa 5 (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIN TYYPPI: proteiini 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:4:
Met Arg Ser Ser Leu Vai Leu Phe Phe Vai Ser Ala Trp Thr Ala Leu -22 -20 -15 -10
Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Vai Ser Gin Asp Leu Phe Asn Gin Phe 15-5 15 10
Asn Leu Phe Ala Gin Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn 15 20 25
Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro 30 35 40 20 Glu Vai Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser 45 50 55
Gly Vai Gly Asp Vai Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys ί 60 65 70
Leu Ile Vai Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn. Trp Ile 75 80 S5 90 25 ,: Gly Asti Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly 95 100 105 :; >, Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Vai Ala Asp U0 115 120
Thr Leu Arg Gin Lys Vai Glu Asp Ala Vai Arg Glu His Pro Asp Tyr 125 130 135 ;..:t 30 '... * Arg Vai Vai Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Vai 140 145 150 * » > < , ·4 , Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asu Gly Tyr Asp Ile Asp Vai Phe Ser *·;·* 155 160 165 170 * · i !\i 35 39 111958
Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Lea Thr 175 150 185 5 Val Gin Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg lie Thr His Thr Asn Asp lie 190 195 200
Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro 205 210 215
Glu Tyr Trp He Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp 220 225 230 ^ Ilo Vai Lys He Glu Gly He Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gin Pro 235 240 245 250
Asn lie Pro Asp He Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu He Gly 255 260 265
Thr Cys Leu 15 SEQ ID N0:5:N TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 23 emäsparia 20 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) SÄIKEISYYS: yksi :·*: (D) TOPOLOGIA: lineaarinen r * • » (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:5: 25 I t
• · TCGAGTCGCG AGAGGTCTCG CAA
Ml ’ * * (2) SEQ ID NO:6: N TIEDOT: 30 » > (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: •;;; (A) PITUUS: 23 emäsparia ‘ ·; · * (B) TYYPPI: nukleiinihappo TV (C) SÄIKEISYYS: yksi :: 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 40 1 1 1958 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:6:
GATCTTGCGA GACCTCTCGC GAC 5 (2) SEQ ID NO:7:N TIEDOT
(i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo 10 (C) SÄIKEISYYS: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (x) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO:7:
15 TCGAGCGTCA TGAGGAGCT
» * · * · * » * * »* M I * >

Claims (13)

111958
1. Menetelmä tuottaa ja valinnaisesti erittää proteiinia transformoidun homeen avulla, johon on viety sinänsä tunnettujen rekombinanttien DNA-tekniikoiden 5 avulla ekspressoi nti vektori, joka käsittää yhden tai useamman homeperäisen ekspressiota ja/tai erittämistä säätelevän alueen, tunnettu siitä, että menetelmässä ainakin yksi ekspressiota ja/tai erittämistä säätelevä alue on valittu (1) Aspergillus niger var. awamori'n endoksylanaasi II-geenin (exIA-geenin) 10 ekspressiota ja erittämistä säätelevistä alueista plasmidissa pAW14B (kuvio 3), joka on läsnä transformoidussa £ coli-kannassa JM 109, joka on tallennettu 31.5.1990 numerolla CBS 237.90 Centraalbureau voor Schimmelcultures-kokoelmaan, Baarn, Hollanti, ja 15 (2) tämän muunnetuista sekvensseistä, joilla on (l):n nukleiinihapposek- venssiä vastaava tai parempi säätelevä aktiivisuus ja jotka kykenevät hybridi-soitumaan (l):n nukleiinihapposekvenssin kanssa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mene- ..: 20 telmässä valittu ekspressiota säätelevä alue on promoottori, ja mainittu vekto- ri käsittää mainittua proteiinia koodaavan geenin tämän promoottorin kontrol-Iin alaisena, joka jälkimmäinen on valittu ♦ » • 4 ; !· (1) Aspergillus niger var. awamori'n endoksylanaasi II-geenin (exIA-geenin) , i ’** 25 promoottorista plasmidissa pAW14B (kuvio 3), joka on läsnä transformoidussa £ coli-kannassa JM109, joka on tallennettu 31.5.1990 numerolla CBS 237.90 : Centraalbureau voor Schimmelcultures-kokoelmaan, Baarn, Hollanti, ja *»» ,;· (2) tämän muunnetuista sekvensseistä, joilla on (l):n nukleiinihapposek- ;: 30 venssiä vastaava tai parempi säätelevä aktiivisuus ja jotka kykenevät hybridi- :*·*: soitumaan (l):n nukleiinihapposekvenssin kanssa. • * · 111958
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että promoottori vastaa promoottoria, joka on läsnä exIA-geenistä ylävirtaan olevassa 5'-osassa ja jonka koko on noin 2,5 kb ja joka sijaitsee exIA-geenin Sal I-restriktiokohdan asemassa 0 ja aloituskodonin ATG välissä plasmidissa 5 pAW14B.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että promoottori käsittää ainakin kuvion 1 mukaisen polynukleotidisekvenssin 1-350.
5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että promoot tori indusoidaan alustassa, jossa transformoitua hometta inkuboidaan, läsnäolevalla vehnänleseellä, ksylaanilla tai ksyloosilla tai minkä tahansa näiden yhdistelmän seoksella.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että promoot tori indusoidaan alustassa, jossa transformoitua hometta inkuboidaan, läsnäolevalla ksyloosilla.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valittu ·· 20 ekspressiota säätelevä alue on terminaattori, ja että mainittu vektori käsittää mainittua proteiinia koodaavan geenin terminaattorin seuraamana, joka jälkimmäinen on valittu j’ (1) Aspergillusniger var. awamori'x\ endoksylanaasi II-geenin (exIA-geenin) 25 terminaattorista plasmidissa pAW14B (kuvio 3), joka on läsnä transformoidussa E coH-kannassa JM109, joka on tallannettu 31.5.1990 numerolla CBS • ; 237.90 Centraalbureau voor Schimmelcultures-kokoelmaan, Baarn, Hollanti, ja i a > ..!;' (2) tämän muunnetuista sekvensseistä, joilla on (l):n nukleiinihapposek- :: 30 venssiä vastaava terminaattoriaktiivisuus ja jotka kykenevät hybridisoitumaan (l):n nukleiinihapposekvenssin kanssa. 111958
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ter-minaattori vastaa terminaattoria, joka on läsnä exIA-geenistä alavirtaan olevassa 3'-osassa ja jonka koko on noin 1,0 kb ja joka sijaitsee heti alavirtaan exIA-geenin pysäytyskodonista (TAA) plasmidissa pAW14B. 5
9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori käsittää myös patenttivaatimuksen 2 mukaisen promoottorin.
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tuottaa ja erittää proteiinia 10 transformoidun homeen avulla, tunnettu siitä, että menetelmässä valittu erittämistä säätelevä alue on signaalisekvenssiä koodaava DNA-sekvenssi, ja että vektori käsittää tätä proteiinia koodaavan geenin mainitun signaalisekvenssiä koodaavan DNA-sekvenssin edeltämänä, joka jälkimmäinen on valittu 15 (1) Aspergillusniger var. awamori'n endoksylanaasi II-geenin (exIA-geenin) signaalisekvenssiä koodaavasta DNA-sekvenssistä plasmidissa pAW14B (kuvio 3), joka on läsnä transformoidussa £ coli-kannassa JM 109, joka on tallennettu 31.5.1990 numerolla CBC 237.90 Centraalbureau voor Schimmelcultures-kokoelmaan, Baarn, Hollanti, ja .: 20 (2) tämän muunnetuista sekvensseistä, jotka myös ohjaavat proteiinin erittymistä ja jotka kykenevät hybridisoitumaan (l):n nukleiinihapposekvenssin kanssa. 1 · v : 25 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että prote iinia koodaavan geenin (1) edessä on lisäksi ainakin oleellinen osa kypsää επί '.: doksylanaasi II-proteiinia koodaavasta DNA-sekvenssistä (2), jolloin tämä ' : ‘ DNA-sekvenssi (2) on signaalisekvenssiä (3) koodaavan DNA-sekvenssin ja geenin (1) välissä. O 30
12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sig-:’· : naalisekvenssi on kuviossa 1 annetun DNA-sekvenssin polynukleotidin 351- 111958 431 koodaama signaalisekvenssi, joka polynukleotidi edeltää exIA-geeniä plasmidissa pAW14B.
13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori 5 myös käsittää patenttivaatimuksen 2 mukaisen promoottorin tai patenttivaatimuksen 7 mukaisen terminaattorin tai molemmat. 1 > » * # 111958
FI942691A 1991-12-09 1994-06-08 Menetelmä tuottaa/erittää proteiinia transformoidun homeen avulla käyttämällä Aspergilluksen endoksylanaasi II-geenistä saatuja ekspressioita/erittämistä sääteleviä alueita FI111958B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9102051 1991-12-09
NL9102051 1991-12-09
PCT/EP1992/002896 WO1993012237A1 (en) 1991-12-09 1992-12-09 Process for producing/secreting a protein by a transformed mould using expression/secretion regulating regions derived from an aspergillus endoxylanase ii gene
EP9202896 1992-12-09

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI942691A FI942691A (fi) 1994-06-08
FI942691A0 FI942691A0 (fi) 1994-06-08
FI111958B true FI111958B (fi) 2003-10-15

Family

ID=19860011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI942691A FI111958B (fi) 1991-12-09 1994-06-08 Menetelmä tuottaa/erittää proteiinia transformoidun homeen avulla käyttämällä Aspergilluksen endoksylanaasi II-geenistä saatuja ekspressioita/erittämistä sääteleviä alueita

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5705358A (fi)
EP (1) EP0672149B1 (fi)
JP (1) JP2866739B2 (fi)
AT (1) ATE204022T1 (fi)
AU (1) AU664223B2 (fi)
CA (1) CA2123416C (fi)
DE (1) DE69231995T2 (fi)
DK (1) DK0672149T3 (fi)
ES (1) ES2159519T3 (fi)
FI (1) FI111958B (fi)
WO (1) WO1993012237A1 (fi)
ZA (1) ZA929539B (fi)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5571697A (en) * 1989-05-05 1996-11-05 Baylor College Of Medicine Texas Medical Center Expression of processed recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptide fragments from a fusion product in Aspergillus
WO1994014965A1 (en) * 1992-12-24 1994-07-07 Gist-Brocades N.V. Cloning and expression of xylanase b
WO1994021785A1 (en) * 1993-03-10 1994-09-29 Novo Nordisk A/S Enzymes with xylanase activity from aspergillus aculeatus
US5811381A (en) * 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
US7883872B2 (en) * 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
EP0870835A1 (en) * 1997-04-07 1998-10-14 Unilever N.V. Agrobacterium mediated transformation of moulds, in particular those belonging to the genus Aspergillus
CA2286307A1 (en) * 1997-04-07 1998-10-15 Unilever Plc Agrobacterium mediated transformation of moulds, in particular those belonging to the genus aspergillus
US6015703A (en) * 1998-03-10 2000-01-18 Iogen Corporation Genetic constructs and genetically modified microbes for enhanced production of beta-glucosidase
KR100618495B1 (ko) * 1998-10-06 2006-08-31 마크 아론 에말파브 섬유상의 진균성 숙주 영역에서의 형질전환 시스템:크리소스포륨속에서
CN1875029B (zh) * 2003-11-06 2010-06-16 金克克国际有限公司 蛋白酶抑制剂及其变异体在丝状真菌中的表达
WO2007087503A1 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
US8586330B2 (en) * 2006-07-14 2013-11-19 Novozymes A/S Methods for producing secreted polypeptides having biological activity
WO2008073914A2 (en) 2006-12-10 2008-06-19 Dyadic International Inc. Expression and high-throughput screening of complex expressed dna libraries in filamentous fungi
US9862956B2 (en) 2006-12-10 2018-01-09 Danisco Us Inc. Expression and high-throughput screening of complex expressed DNA libraries in filamentous fungi
EP2197893B1 (en) * 2007-09-07 2013-07-24 Dyadic International, Inc. Novel fungal enzymes
EP3635112A2 (en) 2017-06-06 2020-04-15 Zymergen, Inc. A htp genomic engineering platform for improving fungal strains
JP2021526799A (ja) 2018-06-06 2021-10-11 ザイマージェン インコーポレイテッド 発酵および産生中の真菌の形態を制御するためのシグナル伝達に関与する遺伝子の操作
US11479779B2 (en) 2020-07-31 2022-10-25 Zymergen Inc. Systems and methods for high-throughput automated strain generation for non-sporulating fungi

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341226C (en) * 1988-08-16 2001-05-01 Wim Van Hartingsveldt Gene replacement as a tool for the construction of aspergillus strains
US5171672A (en) * 1989-08-31 1992-12-15 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Recombinant DNA system for Aspergillus
EP0421919A3 (en) * 1989-09-02 1992-04-15 Ciba-Geigy Ag Polygalacturonase encoding fungal expression system
JP2995770B2 (ja) * 1989-12-15 1999-12-27 吉富製薬株式会社 異種蛋白質の製造方法
FI103206B1 (fi) * 1990-01-29 1999-05-14 Novartis Ag Uusi ilmentämisjärjestelmä sieniä varten
NL9001388A (nl) * 1990-06-19 1992-01-16 Unilever Nv Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
NZ239083A (en) * 1990-07-24 1993-08-26 Gist Brocades Nv Endo-xylanase-containing silage composition

Also Published As

Publication number Publication date
EP0672149B1 (en) 2001-08-08
CA2123416A1 (en) 1993-06-24
CA2123416C (en) 2003-05-20
ZA929539B (en) 1994-06-09
EP0672149A1 (en) 1995-09-20
WO1993012237A1 (en) 1993-06-24
JPH07501453A (ja) 1995-02-16
JP2866739B2 (ja) 1999-03-08
US5705358A (en) 1998-01-06
ATE204022T1 (de) 2001-08-15
AU3158393A (en) 1993-07-19
DE69231995T2 (de) 2002-04-04
FI942691A (fi) 1994-06-08
DK0672149T3 (da) 2001-11-05
AU664223B2 (en) 1995-11-09
DE69231995D1 (de) 2001-09-13
ES2159519T3 (es) 2001-10-16
FI942691A0 (fi) 1994-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI111958B (fi) Menetelmä tuottaa/erittää proteiinia transformoidun homeen avulla käyttämällä Aspergilluksen endoksylanaasi II-geenistä saatuja ekspressioita/erittämistä sääteleviä alueita
EP0305216B1 (en) Recombinant Humicola lipase and process for the production of recombinant humicola lipases
AU567031B2 (en) Glucoamylase cdna
US5965384A (en) Methods for producing Humicola lipases in aspergillus
AU718990B2 (en) Lysophospholipase produced from Aspergillus by recombinant methods
JPH08507695A (ja) Ｅｇ ▲ｉｉｉ▼セルラーゼの精製及び分子クローニング
JPH08500733A (ja) グルコースの存在下で活性的な真菌プロモーター
Fellinger et al. Expression of the α‐galactosidase from Cyamopsis tetragonoloba (guar) by Hansenula polymorpha
WO1986007091A1 (en) Yeast expressing glucoamylase
AU635054B2 (en) Dna encoding a lipase and a lipase modulator
Ruttkowski et al. Characterization of a polygalacturonase gene of Aspergillus niger RH5344
US5834191A (en) Production of heterologous peptides
JPH02283287A (ja) アスペルギルス・ニゲルからのデオキシリボ核酸、組換え宿主微生物の製造法および機能的デオキシリボ核酸配列
JP3343567B2 (ja) 糸状菌のエンハンサーｄｎａ塩基配列およびその用途
US5770371A (en) Modification of cryptic splice sites in heterologous genes expressed in fungi
WO2000050567A1 (en) Fungal cells with inactivated dna mismatch repair system
Kashiwagi et al. The nucleotide sequence of the β-glucosidase gene from Cellvibrio gilvus
JP2000513588A (ja) Ｄｎａ配列、これらのｄｎａの発現、該ｄｎａによってコードされる好熱性ラッカーゼならびにその使用
JPH09505989A (ja) 菌類からのα‐１，４‐グルカンリアーゼ、その精製、遺伝子クローニングおよび微生物での発現
EP0912748B1 (en) Modification of cryptic splice sites in heterologous genes expressed in fungi
CA1316472C (en) Yeast expressing glucoamylase
JP2000245465A (ja) 高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片
JP2007050006A (ja) アスペルギルス属の新規プロモーター
JP2007075120A (ja) アスペルギルス属の新規プロモーター
JP2007050005A (ja) アスペルギルス属の新規プロモーター

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired