FI120310B - Parannettu menetelmä erittyvien proteiinien tuottamiseksi sienissä - Google Patents

Description

PARANNETTU MENETELMÄ ERITTYVIEN PROTEIINIEN TUOTTAMISEKSI SIENISSÄ Tämä keksintö koskee menetelmää promoottorin valmistamiseksi parantunutta proteiinin 5 tuotantoa varten sieni-isännässä, menetelmää sieni-isännän valmistamiseksi parannettua proteiinin tuotantoa varten, menetelmää sieni-isäntäkannan valmistamiseksi proteiinin tuotantoa varten, menetelmää homologisten erittyvien proteiinien ylituottamiseksi tai hetero-logisten erittyvien proteiinien tuottamiseksi sienissä, menetelmää homologisten erittyvien proteiinien vähäisemmäksi tuottamiseksi sienissä, menetelmää erittyvien proteiinien opti-10 moiduksi tuottamiseksi sienissä sekä DNA-sekvenssiä.

KEKSINNÖN TAUSTA

Tiettyjä sienilajeja, etenkin Trichoderma reesei ja Aspergillus niger, käytetään yleisesti 15 bioteknologisessa teollisuudessa proteiinin tuotantoon. Rekombinanttiproteiinit, joko hete-rologiset tai homologiset, tuotetaan tyypillisesti sienissä erittyviä proteiineja koodaavien runsaasti ilmentyvien geenien promoottoreiden, esim. T. reesein cbhl.n promoottorin ja A. nigerin g/a-promoottorin säätelyn alaisina. T. reesei ja A. niger tuottavat homologisia hyd-rolaaseja hyvin tehokkaasti viljelyalustaan, mutta tuotettujen heterologisten proteiinien 20 saannot ovat tyypillisesti paljon pienempiä homologisten proteiinien saantoihin verrattuna. Erityisesti kaukaisista lajeista peräisin olevia proteiineja, esim. nisäkäsproteiineja, tuotetaan hyvin alhaisella tasolla (Archer ja Peberdy, 1997, Penttilä, 1998). Syiksi alhaisiin saantoihin on ehdotettu polypeptidin tehotonta translaatiota ja translokaatiota eritysreittiin, esteitä proteiinin laskostumisessa ja kuljetuksessa, ja mRNA:n epästabiilisudesta johtuvia 25 heterologisen geenin alhaisia transkriptitasoja (MacKenzie et ai. 1993, Gouka et ai. 1997).

Proteiinin laskostumisen ja myöhemmän kuljetuksen heikentymisen, jonka tapahtuminen on todennäköistä heterologisen proteiinin tuottamisen aikana, tiedetään indusoivan stressi-vasteita solussa. Viime vuosina on raportoitu kaksi palautemekanismia, jotka sallivat solun 30 havaita ER:n ontelon tilan ja reagoida tämän erikoistuneen proteiinilaskostus- ja muokkaus ympäristön normaalin toiminnan häiriöihin. Näitä mekanismeja ovat laskostumatto-man proteiinin vaste (Unfolded Protein Response (UPR)), joka lisää chaperoneja ja laskos-tuskatalysaattoreita koodaavien geenien transkriptioaktiivisuutta vasteena laskostumatto-mien proteiinien läsnäoloon ER:n ontelossa (Shamu et ai., 1994) ja eukaryoottisen initi-35 aatiofaktori 2 a:n fosforylaatio, joka säätää translaatioaktiivisuutta soluissa alaspäin 2 (Harding et ai., 1999). Mori (2000) on äskettäin julkaissut katsauksen, joka koskee solujen vastetta laskostumattomiin proteiineihin hiiva- ja nisäkässolujen endoplasmisessa retikkelissä.

5 Hyvin vähän tiedetään kuitenkin näissä stressiolosuhteissa tapahtuvasta endogeenisiä erittyviä proteiineja koodaavien geenien transkriptionaalisesta säätelystä. Erityisesti ei ole saatavilla mitään tietoja erittyviä proteiineja koodaavien geenien palautesäätelystä vasteena solun kapasiteetin rajoituksiin laskostaa ja kuljettaa proteiineja. Joissakin tapauksissa on havaittu, että heterologisten geenien ilmentymisen kanssa samanaikaisesti endogeenisiä 10 ekstrasellulaarisia proteiineja koodaavien geenien transkriptiotasot ovat alempia verrattuna kontrollikannoissa tapahtuvaan ilmentymiseen (Margolles-Clark et ai. 1996). Annettu selitys on ollut se, että geenien tehokkaalle ilmentymiselle tarvittavien transkriptio/säätely-tekijöiden määrä voisi olla rajoittava heterologisen geenin monien kopioiden ilmentymisen aikana.

15

Erittyviä proteiineja koodaavien geenien säätelyä eri hiilen ja typen lähteillä on tutkittu yksityiskohtaisesti rihmasienissä, sellulaasin ja hemisellulaasin ilmentymisen T. reeseissa ollessa hyvä esimerkki tästä. T. reeseissa sellulaasin ja hemisellulaasin ilmentyminen sopeutuu helposti ympäristön vaatimuksiin ja ravinteiden saatavuuteen. Kasvimateriaalia 20 sisältävässä kompleksialustassa (hemi)sellulaasigeenit indusoituvat koordinoidusti, mutta myös spesifisiä induktiomekanismeja tunnetaan (Margolles-Clark et ai. 1997). Selluloosan ja eräiden oligosakkaridien, kuten laktoosin ja soforoosin, tiedetään olevan tehokkaita geenien indusoijia. Glukoosin läsnä ollessa sellulaasin ja hemisellulaasin ilmentyminen on tiukasti hiilikataboliittirepressiomekanismin vaimentamaa. Useita sellulaasigeeni-ilmenty-25 misen säätelyä välittäviä säätelytekijöitä on eristetty, mukaan luettuna glukoosirepressori-geeni crel ja myös geenit, joiden on väitetty toimivan sellulaasigeeniaktivaattoreina (acel ja ace2) (Saloheimo et ai. 2000).

Spesifisesti, muunnetut Trichoderma-pvomoottorit, jotka ovat soforoosilla indusoituvia 30 eivätkä repressoidu glukoosin läsnäolon vaikutuksesta ja jotka sisältävät nukleotidi-sekvenssin Trichoderma reesei cbhl -promoottorista ylävirtaan proteiinia koodaavasta alueesta, kuvataan US-patentissa nro. 6 001, 595. Julkaisu mainitsee alueet -184 - -1, -161 —1, -140--1 ja -161 --133. Vaikka julkaisu kuvaa tiettyjä lyhennettyjä cbhl:n alueita, se ei ehdota niiden käyttämistä erittyvien proteiinien tuottamisessa stressiolosuh-35 teissä. Promoottorit on suunniteltu proteiinin tuottamiseen glukoosin tai soforoosin läsnä 3 ollessa. Sellulaasisäätelijät acel ja ace2 on kuvattu kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 98/23642, joka kuvaa niiden käytön proteiinin tuotannon aktivaattoreina ja ehdottaa parantunutta hemi(sellulaasin) ilmentymistä tekijöiden yli-ilmentämisellä. Modifikaatiota, jotka johtavat glukoosin derepressioon, kuvataan julkaisussa WO 94/04673.

5

KEKSINNÖN YHTEENVETO

Tämä keksintö perustuu siihen uuteen havaintoon, että erittyviä proteiineja koodaavien geenien ilmentymistaso rihmasienissä laskee olosuhteissa, joissa proteiinien synteesi, 10 laskostuminen tai kuljetus on heikentynyttä. Tämän säätelymekanismin on osoitettu toimivan viljelmissä, jotka on käsitelty kemiallisilla aineilla, jotka häiritsevät proteiinien synteesiä, laskostumista tai kuljetusta (DTT, Ca2+-ionofori A23187, BrefeldinA, vastaavassa järjestyksessä), tai kannoissa, joissa on funktionaalisesti epätäydellinen proteiinin laskostusjärjestelmä (kannat, jotka ilmentävät anti-sense-transkriptiä geenille 15 pdiA). Lisäksi kantojen, jotka tuottavat heterologisia proteiineja, kuten tPA (kudoksen plasminogeeniaktivaattori), on osoitettu osoittavan aktivoitua UPR:aa sekä erittyviä proteiineja koodaavien endogeenisten geenien alempia ilmentymistasoja. Me olemme ensimmäisinä osoittaneet, että tämän tyyppinen palautesäätely tapahtuu erittyvien proteiinien tuotossa rihmasienissä.

20 Tätä erittyvien proteiinien alaspäinsäätelyksi tai palautesäätelyksi kutsuttua ilmiötä käytetään tässä keksinnössä hyödyksi selektiivisesti säätelemään erittyviä proteiineja koodaa-via geenejä tai niiden promoottoreita, ja lisäämään valittujen proteiinien tuottoa. Tämä saadaan aikaan muuttamalla erittyvää proteiinia koodaavan geenin promoottorisekvenssiä 25 geneettisesti sen reagoivuuden transkriptionaaliseen alaspäinsäätelyyn muuttamiseksi. Vaihtoehtoisesti voidaan geenejä, jotka koodaavat alaspäinsäätelyä välittäviä säätely-tekijöitä, tai tekijöitä vastaavassa signalointireitissä, muuntaa sillä tavalla, että alaspäin-säätely joko katoaa tai tehostuu. Alaspäinsäätelyn mekanismin inaktivointi on edullista, kun kiinnostavan proteiinin tuotto tapahtuu sellaisen promoottorin säätelyn alaisena, joka 30 on normaalisti alaspäinsäätelyn alainen eritysstressin aikana. Alaspäinsäätelyn tehostamista voidaan käyttää hyödyksi muiden proteiinien tuotannon vaimentamiseksi, kun kiinnostavan proteiinin ilmentyminen tapahtuu esimerkiksi sellaisen promoottorin alaisuudessa, joka ei ole alaspäinsäätelyn alainen.

4 Tässä keksinnössä on havaittu, että erittyvän proteiinin promoottorissa sijaitseva spesifinen säätelyalue tai DNA-sekvenssi kykenee välittämään transkriptionaalista alaspäinsäätelyä. DNA-sekvenssille on tunnusomaista se, mitä määritellään patenttivaatimuksessa 23.

5

Erittyvien proteiinien transkriptionaalista alaspäinsäätelyä eritysstressissä välittävässä promoottorissa olevia DNA-sekvenssejä voidaan mutatoida, inaktivoida tai poistaa geenin alaspäinsäätelyn poistamiseksi tai vähentämiseksi tai vaihtoehtoisesti geenin alaspäinsäätelyä voidaan tehostaa muuntamalla promoottorisekvenssejä, esim. monistamalla respon-10 siivinen, alaspäinsäätelyn alainen promoottorielementti.

Keksintöä voidaan käyttää parempien kantojen konstruoimiseen proteiinituottoa varten proteiinin tuottoon käytettävien promoottorien tehokkuutta lisäämällä ja/tai manipuloimalla erittyvien proteiinien säätelyjärjestelmää. Menetelmälle promoottorin valmistamiseksi 15 parantunutta proteiinin tuotantoa varten sieni-isännässä on tunnusomaista se, mitä sanotaan patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Menetelmälle sieni-isännän valmistamiseksi parannettua proteiinin tuotantoa varten on tunnusomaista se, mitä sanotaan patenttivaatimuksen 2 tunnusmerkkiosassa, menetelmälle 20 sieni-isäntäkannan valmistamiseksi proteiinin tuotantoa varten on tunnusomaista se, mitä sanotaan patenttivaatimuksen 7 tunnusmerkkiosassa ja menetelmille erittyvien proteiinien optimoiduksi tuottamiseksi sienissä, on tunnusomaista se, mitä sanotaan patenttivaatimusten 19 ja 20 tunnusmerkkiosissa.

25 Esillä olevaa keksintöä voidaan käyttää muuntamaan homologista tai heterologista promoottoria, jota käytetään proteiinin tuottamiseen, joko homologisen tai heterologisen, sillä tavalla, että ilmentyminen ei ole samalla tavalla alaspäinsäätelyn alainen kuin muuntama-ton promoottori. Keksintö on erityisen hyödyllinen heterologisten proteiinien tuotantoa varten, mutta sitä voidaan myös käyttää homologisten proteiinien tuottamiseen. Lisäksi 30 keksintöä voidaan käyttää promoottorin alaspäinsäätelyä välittävän säätelytekijän (-tekijöiden), joko promoottoriin sitoutuvan tekijän (tekijöiden) tai vastetta välittävien säätelytekijöiden, inaktivoimiseen tai aktiivisuuden tai ilmentymisen vähentämiseen promoottorin alaisen proteiinituoton parantamiseksi.

5

Eräs mahdollisuus käyttää keksintöä on säätelytekijän yli-ilmentäminen homologisten erittyvien proteiinien tuotannon vähentämiseksi homologisten tai heterologisten proteiinien ilmentymisen aikana sellaisen promoottorin alaisuudessa, joka ei ole alaspäin-säätelyn alainen. Tällaisessa tapauksessa heterologinen proteiini ilmentyy ja erittyy esim. 5 promoottorin, kuten Trichoderma gpd, alaisena, johon stressiolosuhteet eivät vaikuta. Homologiset erittyvät proteiinit ilmentyvät promoottorin alaisena, joka on alaspäin-säädelty. Alaspäinsäätelyä välittäviä proteiineja koodaavat geenit ovat yli-ilmentyviä.

Menetelmälle homologisten erittyvien proteiinien ylituottamiseksi tai heterologisten erit-10 tyvien proteiinien tuottamiseksi sienissä, on tunnusomaista se, mitä sanotaan patenttivaatimuksen 16 tunnusmerkkiosassa. Menetelmälle homologisten erittyvien proteiinien vähäisemmäksi tuottamiseksi sienissä, on tunnusomaista se, mitä sanotaan patenttivaatimuksen 17 tunnusmerkkiosassa. Menetelmälle erittyvien proteiinien optimoitua proteiinituottoa varten on pääasiassa luonteenomaista se, mitä määritellään patenttivaatimusten 20 ja 22 15 tunnusmerkkiosissa.

Esillä olevan keksinnön muut piirteet, aspektit ja edut tulevat ilmeisiksi seuraavasta kuvauksesta ja mukaan liitetyistä patenttivaatimuksista.

20 KUVIOT

Kuvio 1. Kokonaisproteiinisynteesi ja erittyminen viljelmissä, jotka on käsitelty A23187:11a, DTTilla ja BFA:lla.

A) TCA:han liukenemattomaan materiaaliin inkorporoituneen radioaktiivisuuden määrä 25 solu-uutteissa, jotka oli valmistettu viljelmistä, jotka oli käsitelty 5 uM A23187:lla (avoimet vinoneliöt, O), ja käsittelemättömistä kontrolliviljelmistä (mustat vinoneliöt, ♦).

B) TCA:han liukenemattomaan materiaaliin inkorporoituneen radioaktiivisuuden määrä viljelysupematantissa viljelmissä, jotka oli käsitelty 5 uM A23187:11a (avoimet vinoneliöt, O), ja käsittelemättömistä kontrolliviljelmistä (mustat vinoneliöt, ♦).

30 C) TCA:han liukenemattomaan materiaaliin inkorporoituneen radioaktiivisuuden määrä solu-uutteissa, jotka oli valmistettu viljelmistä, jotka oli käsitelty 10 mM DTT:lla (avoimet vinoneliöt, O), ja käsittelemättömistä kontrolliviljelmistä (mustat vinoneliöt, ♦).

6 D) TCAihan liukenemattomaan materiaaliin inkorporoituneen radioaktiivisuuden määrä viljelysupematantissa viljelmissä, jotka oli käsitelty 10 mM DTTilla (avoimet vinoneliöt, <>), ja käsittelemättömistä kontrolliviljelmistä (mustat vinoneliöt, ♦).

E) TCAihan liukenemattomaan materiaaliin inkorporoituneen radioaktiivisuuden määrä 5 solu-uutteissa, jotka oli valmistettu viljelmistä, jotka oli käsitelty 50 pg/ml BFAilla (avoimet vinoneliöt, O), ja käsittelemättömistä kontrolliviljelmistä (mustat vinoneliöt, ♦).

F) TCAihan liukenemattomaan materiaaliin inkorporoituneen radioaktiivisuuden määrä viljelysupematantissa viljelmissä, jotka oli käsitelty 50 μι*/ιη1 BFAilla (avoimet vinoneliöt, O), ja käsittelemättömistä kontrolliviljelmistä (mustat vinoneliöt, ♦).

10

Kuvio 2. CBHIin 2D-geelianalyysi viljelmistä, jotka oli käsitelty joko 5 μΜ A23187:11a, 50 μ$*/ιη1 BFAilla tai 10 mM DTTilla ja leimattu 35S-metinoniinilla eripituisten ajanjaksojen ajan.

A) Leimattu CBHI solu-uutteista, jotka oli valmistettu käsittelemättömästä viljelmästä ja 15 viljelmistä, jotka oli käsitelty A23187:11a, DTTilla tai BFAilla eri ajankohtina leimauskokeen aikana (ajankohta osoitetaan kunkin kuvion yläpuolella minuutteina leimatun metioniinin lisäämisen jälkeen).

B) Leimattu CBHI viljelysupematantista 180 minuutin kuluttua A23187:11a tai BFAilla käsiteltyjen viljelmien ja käsittelemättömien viljelmien leimaamisesta.

20

Kuvio 3. CBHIin synteesi ja eritys.

A) Leimatun CBHIin määrä solu-uutteessa leimauskokeen eri ajankohtina viljelmissä, jotka oli käsitelty 5 μΜ A23187:11a (avoimet ympyrät, o) ja käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä (mustat vinoneliöt, ♦) 25 B) Leimatun CBHIin määrä viljelysupematantissa leimauskokeen eri ajankohtina viljelmissä, jotka oli käsitelty 5 μΜ A23187:11a (avoimet ympyrät, o) ja käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä (mustat vinoneliöt, ♦) C) Leimatun CBHIin määrä solu-uutteessa leimauskokeen eri ajankohtina viljelmissä, jotka oli käsitelty 10 mM DTTilla (avoimet ympyrät, o) ja käsittelemättömissä 30 kontrolliviljelmissä (mustat vinoneliöt, ♦) D) Leimatun CBHIin määrä viljelysupematantissa leimauskokeen eri ajankohtina viljelmissä, jotka oli käsitelty 10 mM DTTilla (avoimet ympyrät, o) ja käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä (mustat vinoneliöt, ♦) 7 E) Leimatun CBHI:n määrä solu-uutteessa leimauskokeen eri ajankohtina viljelmissä, jotka oli käsitelty 50 μ§/πι1 BFAilla (avoimet ympyrät, o) ja käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä (mustat vinoneliöt, ♦) F) Leimatun CBHI:n määrä viljelysupematantissa leimauskokeen eri ajankohtina 5 viljelmissä, jotka oli käsitelty 50 μ§/ηι1 BFA:lla (avoimet ympyrät, o) ja käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä (mustat vinoneliöt, ♦)

Kuvio 4. pdi- ja /»/»/-ilmentymisen Northem-analyysi viljelmissä, jotka oli käsitelty A23187:11a, DTT:lla tai BFA:lla.

10 A) bipl:n japdihn steady-state mRNA-taso (signaalit normalisoitu gp</-signaalien kanssa) A23187-käsittelyn eri ajankohtina (mustat pylväät) ja käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä (valkoiset pylväät) B) bip 1 :n ja pdil:n steady-state mRNA-taso (signaalit normalisoitu gp</-signaalien kanssa) DTT-käsittelyn eri ajankohtina (mustat pylväät) ja käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä 15 (valkoiset pylväät) C) bipl: n ja pdihn steady-state mRNA-taso (signaalit normalisoitu g/?</-signaalien kanssa) BFA-käsittelyn eri ajankohtina (mustat pylväät) ja käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä (valkoiset pylväät) 20 Kuvio 5. Aac/-mRNAn Northem-analyysi viljelmissä, jotka oli käsitelty BFA:lla ja A23187:11a (mustat pylväät) ja käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä (valkoiset pylväät).

Kuvio 6. cbhhn ja egll :n Northem-analyysi viljelmissä, jotka oli käsitelty A23187:11a, DTT:lla tai BFA:lla eripituisten ajanjaksojen ajan (mustat pylväät) ja kontrolliviljelmissä 25 (valkoiset pylväät).

Kuvio 7. xynl- ja /z/Z>2-proteiinien Northem-analyysi T. reeseissa DTT-käsittelyn aikana (signaalit normalisoitu gpd-signaalin kanssa) 30 Kuvio 8. Northem-analyysi transkripteista, joita ei säädellä alaspäin DTT-käsittelyn aikana: ypth.n ja sarh.n, jotka koodaavat eritysreitin komponentteja, funktioltaan tuntemattoman cDNAh.n, ja intrasellulaarista β-glukosidaasia koodaavan bgl2:n signaalit (signaalit normalisoitiin gpJ-signaalin kanssa) 8

Kuvio 9. DTT:n vaikutukset A. nigeristä olevien geenien transkriptioon: A) glukoamylaasigeeni, glaA (kolmen määrityksen keskiarvosignaali) B) hapan proteaasi aspergillopepsiinin geeni (pepÄ) (kolmen määrityksen keskiarvosignaali) 5 C) proteiinin disulfidi-isomeraasi (pdiA), ER:ssa sijaitseva foldaasi, (kolmen määrityksen keskiarvosignaali) D) bipA, ER:ssa sijaitseva chaperoni, (kolmen määrityksen keskiarvosignaali) (yhtenäinen viiva edustaa DTT-käsiteltyjä viljelmiä ja pisteviiva edustaa vedellä käsiteltyjä kontrolleja) 10

Kuvio 10. Tärkkelystä hiilen lähteenä sisältävän alustan ksyloosia hiilen lähteenä sisältävään alustaan vaihtamisen vaikutus glaA:n transkriptioon A. niger AB4.1 :ssa (Vaihto suoritettiin ajankohtana T=0, ja tulokset edustavat kahden määrityksen keskiarvoa) 15 Kuvioll.

A) Antisense pdiA:n vaikutus glukoamylaasigeenin transkriptioon (glaA, kuuden pullon keskimääräinen signaali kahdesta eri kokeesta) (Kantaa AB4.1 edustaa yhtenäinen viiva, ja kantaa AS 1.1 pisteviiva.) B) Antisense pdiA:n vaikutus aspergillopepsiinigeenin transkriptioon (pepA, kuuden pullon 20 keskimääräinen signaali kahdesta eri kokeesta) (Kantaa AB4.1 edustaa yhtenäinen viiva, ja kantaa AS 1.1 pisteviiva.) C) Kuivapainon määritys viljelmille (kuuden pullon keskimääräinen signaali kahdesta eri kokeesta) 25 Kuvio 12. T. Reesein Rut-C30:n ja tPA:ta tuottavan transformantin 306/36 viljely bioreaktorissa A) Ilmentämiskasetti tPA:n tuottoa varten T. reesei Rut-C30:ssa B) Biomassan kuivapaino ja laktoosipitoisuus mitattuna viljelyn aikana kasvun 30 seuraamiseksi.

C) Viljelyalustassa tuotettu kokonaisproteiini ja HEC-aktiivisuus (sellulaasi-, etenkin endoglukanaasiaktiivisuutta mittaamalla).

D) egll:n transkriptitaso (normalisoitu aktiinigeenin signaalin kanssa) analysoituna esimerkkinä erittyvää proteiinia koodaavasta geenistä.

35 E) cbhi:n ja cbhl-tPA-fuusion transkriptitaso (normalisoitu aktiinigeenin signaalin kanssa) 9 F) bipl\n transkriptitaso (normalisoitu aktiinigeenin signaalin kanssa) viljelyn aikana

Kuvio 13. /acZ-reportterigeenin ilmentyminen cöA-promoottorin alaisena A) 10 mM DTT:n läsnä ollessa tehtyihin ilmentämistutkimuksiin käytetyn lacZ-5 ilmentämiskasetin kaavakuva: lacZ\n ilmentyminen täyspitkän cbh 1 -promoottorin alaisena kannassa pML016, ja lyhennetyn promoottorin alaisuudessa kannassa pMI34. (normalisoitu gp<Asignaalin kanssa) 10 mM DTT:lla käsittelyn aikana (mustat pylväät) ja käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä (valkoiset pylväät) kannoissa pMLOlö (käyrät vasemmalla) ja pMI34 (käyrät oikealla).

10

Kuvio 14. cM/-mRNA-taso DTT-käsittelyn aikana T. reesei QM9414:n ja QM9414:n, jossa acel-geeni oli poistettu, viljelmissä.

A) Sorbitolilla kasvatettujen ja soforoosilla indusoitujen viljelmien DTT-käsittely B) Glyserolilla kasvatettujen ja soforoosilla indusoitujen viljelmien DTT-käsittely 15

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

Termillä “endogeeniset proteiinit” tarkoitetaan tässä proteiineja, jotka ovat mikrobi-20 isännän luonnollisia tuotteita.

“Rekombinanttiproteiineilla” tarkoitetaan tässä proteiineja, jotka eivät ole mikrobin luonnollisia tuotteita. Haluttuja homologisia tai heterologisia proteiineja koodaavia DNA-sekvenssejä voidaan siirtää sopivalla menetelmällä isäntään. "Homologisella proteiinilla" 25 tarkoitetaan saman mikrobilajin tuottamaa proteiinia. "Heterologisella proteiinilla" tarkoitetaan toisen mikrobilajin tuottamaa proteiinia.

“Erittyvällä proteiinilla” tai "eritetyllä proteiinilla" tarkoitetaan tässä proteiinia, joka eritetään isäntäsolun ulkopuolelle viljelyalustaan.

30 “Parannetulla proteiinintuotolla” tarkoitetaan proteiinin tuottoa, joka on vähintään 3 %, edullisesti vähintään 5 %, edullisemmin vähintään 10 %, vieläkin edullisemmin vähintään 20 %, edullisimmin vähintään 30 % parempi kuin proteiinintuotto käyttämällä sieni-isäntäkantaa, jota ei ole geneettisesti muunnettu niiden alaspäinsäätelyn muuttamiseksi.

35 10 “Eritysstressillä” tai "eritysstressiolosuhteilla" tarkoitamme tässä sitä, että isännän erityskapasiteetti on rajoitettu tai eritysreitti ylikuormitettu. Rajoituksen voivat aiheuttaa esimerkiksi hererologisten proteiinien tuottaminen tai homologisten proteiinien kasvaneet määrät, tai se saattaa johtua proteiinin synteesiä, laskostumista tai kuljetusta estävästä 5 toksiinista. Tässä keksinnössä eritysstressiä simuloitiin käyttämällä kemikaaleja tai toksiineja kuten ionoforia, DTT:ta tai brefeldin A:ta (=BFA). Rajoitus voidaan aikaansaada myös muuntamalla laskostumista tai eritysreittiä geneettisin keinoin, esim. proteiinin laskostumiseen tai kuljetukseen vaadittavien komponenttien aktiivisuutta tehostamalla tai inaktivoimalla. Kuten UPR:aa, voidaan tätä erittyvien proteiinien geenien 10 transkriptionaalista alaspäinsäätelyä kuitenkin pitää organismille luonnollisena mekanismina erittyvien proteiinien synteesin ja laskostus- ja erityskapasiteetin tasapainottamiseksi, ja se voi (osittain) tapahtua monissa proteiinintuoton olosuhteissa, kuten silloin, kun erittyvien homologisten proteiinien synteesi indusoituu.

15 “Alaspäinsäätelyllä” tai "palautesäätelyllä” tarkoitamme tässä sitä, että proteiinin ilmentymistasot ovat alempia näistä edellä mainituista soluvasteista johtuen. Tämä alaspäinsäätelyvaikutus on osoitettu mittaamalla erittyviä proteiineja koodaavien geenien mRNA-taso. Alaspäinsäätely toimii näin ollen transkriptiotasolla.

20 Tämän keksinnön mukaisesti voidaan erittyviä proteiineja koodaavien geenien transkriptionaalista alaspäinsäätelyä välittävät DNA-sekvenssit löytää eritettäviä proteiineja koodaavien geenien promoottoreista. Tämä tarkoittaa sitä, että promoottorit sisältävät alueita, jotka kykenevät säätelemään geenituotteen tuottoa alaspäin, vasteena säätelytekijöiden toiminnalle.

25

Erittyvien proteiinien alaspäinsäätelyä välittävät DNA-sekvenssit tai alueet sijaitsevat erilaisten, sellaisia proteiineja kuten sellulaaseja, hemisellulaaseja, amylolyyttisiä entsyymejä, hydrofobiineja, proteaaseja, invertaaseja, fytaaseja, fosfataaseja, swolleniineja, ja pektinaaseja koodaavien geenien promoottoreissa.

DNA-sekvenssit sijaitsevat edullisesti promoottoreissa, jotka valitaan ryhmästä, johon sisältyvät cbhl-, cbh2-, egll-,egl2-, hfbl-, hfb2-, xynl-, swo-, gla-, amy-, ja pepA-promoottorit.

30 11 Tämä keksintö osoittaa, että monet Trichoderman ja Aspergillusin erittyviä proteiineja koodaavat geenit ovat transkriptionaalisen alaspäinsäätelymekanismin alaisia. Tämän keksinnön mukainen erittyvän proteiinin promoottori on edullisesti Trichoderma-suvun tehokkaasti erittyvän hydrolaasin promoottori. Edullisemmin promoottori on Trichoderman 5 sellulaasi- tai hemisellulaasipromoottori. Edullisimmin promoottori on Trichoderman cbhl. Eritettävän proteiinin promoottori voi myös olla Aspergillus-svtvun tehokkaasti erittyvän hydrolaasin promoottori. Promoottori on edullisesti proteaasi tai Aspergillusin amylolyyttisen entsyymin geenin promoottori. Edullisemmin promoottori on gla, amy tai pepA.

10

Kuten tässä keksinnössä valaistaan esimerkein, voidaan eritettävien proteiinien alaspäinsäätelyä välittävät DNA-sekvenssit löytää Trichoderman cbhl-promottorissa ylävirtaan - 162:sta. Ne voidaan vaihtoehtoisesti löytää ylävirtaan -188:sta, -211:sta, -341:sta, -391:sta, -501:sta, -741:sta, -881 :sta, -1031 :sta, -1201 :sta tai -1281 :sta.

15 Tämän keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti eritettävän proteiinin promoottori muunnetaan geneettisesti siten, että se ei ole alaspäinsäädeltävä tai alaspäinsäätelyltään alentunut.

20 Muunnetussa promoottorissa tämän keksinnön mukaisesti erittyvien proteiinien alaspäinsäätelyä välittävien DNA-sekvenssien vaikutusta vähennetään erilaisin mutaatiomenetelmin, tai sekvenssit voidaan inaktivoida tai poistaa.

Toisessa muunnetussa promoottorissa tämän keksinnön mukaisesti erittyvien proteiinien 25 alaspäinsäätelyä välittävien DNA-sekvenssien vaikutusta voidaan lisätä monistamalla alaspäinsäätelyn välittämisestä vastuussa oleva sekvenssi molekyylibiologian perusmenetelmiä käyttämällä.

Eritettävien proteiinien optimoitua tuottoa varten voidaan konstruoida sieni-isäntäkantoja, 30 joissa erittyviä proteiineja koodaavien geenien transkriptiota eritysstressin aikana alaspäinsäätelevät mekanismit on geneettisesti muunnettu.

Tämän keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti tämän keksinnön mukainen sieni-isäntäkanta voi sisältää promoottorin, jossa erittyvien proteiinien alaspäinsäätelyä 12 välittävien DNA-sekvenssien vaikutus on vähentynyt tai poistettu tai erittyvien proteiinien alaspäinsäätelyä välittävien DNA-sekvenssien vaikutus on kasvanut.

Tämän keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaisesti transkriptionaalista 5 alaspäinsäätelyä välittävien säätelytekijöiden ilmentymistä voidaan geneettisesti muuntaa sieni-isännässä. Haluttaessa voidaan säätelytekijöiden ilmentymistä vähentää tai se voidaan poistaa, tai säätelytekijöiden ilmentymistä voidaan lisätä.

Tämä keksintö osoittaa, että monet ekstrasellulaarisesti erittyviä proteiineja koodaavat 10 geenit ovat transkriptionaalisesti alaspäinsäädeltyjä näiden säätelymekanismien osoittamiseen käytetyissä olosuhteissa ja monien, ellei useimpien tai kaikkien erittyviä proteiineja koodaavien geenien odotetaan olevan tämän transkriptionaalisen alaspäinsäätelyn alaisia. Säätelymekanismin alaiset geenit, promoottorit ja proteiinit voidaan valita ryhmästä, joka sisältää sellulaasit (kuten sellobiohydrolaasit, 15 endoglukanaasit ja β-glukosidaasit), hemisellulaasit (kuten ksylanaasit, mannaasit, β-ksylosidaasit, ja sivuketjua pilkkovat entsyymit kuten arabinosidaasit, glukuronidaasit, asetyyliksylaaniesteraasit), amylolyyttiset entsyymit (kuten α-amylaasit, glukoamylaasit, pullulanaasit, syklodekstrinaasit), hydrofobiinit, proteaasit (happamat, emäksiset, aspergillopepsiini), invertaasit, fytaasit, fosfataasit, erilaiset pektinaasit (kuten endo- ja 20 eksopolygalakturonaasit, pektiiniesteraasit, pektiinilyaasi ja pektiinihappolyaasi) ja ligninaasit (kuten ligniiniperoksidaasit, Mn-peroksidaasit, lakkaasit).

Säätelymekanismit välittävät proteiinien, jotka valitaan ryhmästä, joka sisältää geenien cbhl, cbh2, egll,egl2, hfbl, hfb2, xynl, swo, gla, amy, ja pepA koodaamat proteiinit, 25 transkriptionaalista alaspäinsäätelyä.

Esimerkkinä säätelytekijää koodaa acel-geeni. Muutkin tekijät kuin acel ovat osallisina tässä alaspäinsäätelyssä, minkä osoittaa esimerkeissä se tosiseikka, että acel ei ole vastuussa (suurimmasta osasta) säätelyä kaikissa viljelyolosuhteissa.

30 Säätelymekanismit säätelevät edullisesti suvun Trichoderma hydrolaaseja. Edullisemmin ne säätelevät Trichoderman sellulaaseja tai hemisellulaaseja. Säätelytekijät voivat säädellä suvun Aspergillus hydrolaaseja. Edullisesti ne säätelevät Aspergillusin proteaaseja tai amylolyyttisiä entsyymejä.

13 "Tuottoisäntäsieni" merkitsee tässä mitä tahansa sienikantaa, joka on valittu tai geneettisesti muunnettu tuottamaan haluttua tuotetta tehokkaasti ja on käyttökelpoinen proteiinintuottoon esim. analyyttistä, lääketieteellistä tai teollista käyttöä varten. 5 Isäntäkanta on edullisesti rekombinanttikanta, joka on muunnettu geeniteknologisin keinoin tuottamaan kiinnostuksen kohteena olevaa tuotetta tehokkaasti.

Keksintöä valaistaan tässä esimerkein kahden sienilajin, Trichoderma ja Aspergillus, avulla, mikä osoittaa transkriptionaalisen alaspäinsäätelymekanismin yleisluonteen. Tämä 10 mekanismin muuntaminen muissa sienissä tulee olemaan hyödyllistä paremman proteiinintuoton kannalta.

Tämän keksinnön mukaiset sieni-isäntäkannat voidaan valita ryhmästä, johon sisältyvät Aspergillus spp., Trichoderma spp., Neurospora spp., Fusarium spp., Penicillium spp., 15 Humicola spp., Tolypocladium geodes, Schwanniomyces spp., Arxula, spp., Trichosporon spp., Kluyveromyces spp., Pichia spp., Hansenula spp., Candida spp., Yarrowia spp, Schizosaccharomyces ssp. ja Saccharomyces spp. Isäntä kuuluu edullisesti Trichoderma-tai Aspergi//us-lajeihin, esim. T.harzianum, T.longibrachiatum, T.viride, T.koningii, A.nidulans, A.terreus, A.ficum, A.oryzae ja A.awamori. Edullisimmin se kuuluu lajiin T. 20 reesei (Hypocrea jecorina) tai A. niger.

Menetelmä erittyvien proteiinien optimoiduksi proteiinin tuottamiseksi sienissä sisältää seuraavat vaiheet: - erittyvää proteiinia koodaavan geenin valinta; 25 - geenin promoottorin geneettinen muuntaminen erittyvien proteiinien transkriptionaalista alaspäinsäätelyä eritysstressin alaisena välittäviin mekanismiin kohdistuvan vasteensa osalta; - halutun erittyvän proteiinin tuottaminen promoottorin säätelyn alaisena sieni-isännässä Ja - proteiinituotteen talteen ottaminen isännän viljelyalustasta.

30 Tämän keksinnön mukaisesti menetelmä erittyvien proteiinien optimoiduksi proteiinin tuottamiseksi sienissä voi sisältää seuraavat vaiheet: - edellä mainitun sieni-isännän viljeleminen sopivassa viljelyalustassa; ja - proteiinituotteen talteen ottaminen alustasta.

14

Proteiinituote voi olla mikä tahansa tuote, joka on peräisin bakteereista tai korkeammista tai alemmista eukaryooteista, proteiinituote voi olla sieni- tai nisäkäsalkuperää. Proteiinituote voi olla hydrolaasi, kuten sellulaasi, hemisellulaasi, amylolyyttinen 5 entsyymi, hydrofobiini, proteaasi, invertaasi, fytaasi, fosfataasi, pektinaasi tai se voi olla mikä tahansa nisäkäsproteiini kuten immunoglobuliini tai tPA.

Tämän keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti proteiinituote voidaan ilmentää promoottorista, joka ei ole transkriptionaalisen alaspäinsäätelyn alainen. Muita, ei-haluttuja 10 proteiineja voidaan ilmentää promoottorista, jota alaspäinsäätely säätelee. Lisäämällä alaspäinsäätelyä on mahdollista ohjata sellaisesta promoottorista ilmentyvän proteiinituotteen tuottoa, joka ei ole transkriptionaalisen alaspäinsäätelyn alainen. Tällainen promoottori voi olla konstitutiivinen promoottori, kuten gpd.

15 Menetelmä erittyvien proteiinien optimoiduksi proteiinin tuottamiseksi sienissä sisältää seuraavat vaiheet: - erittyvää proteiinia koodaavan geenin valinta; - valitun erittyvän proteiinin koodausalueen liittäminen operoitavasti promoottoriin, joka ei ole säädeltävissä transkriptionaalisen alaspäinsäätelyn mekanismilla; 20 - epätoivottuja proteiineja koodaavien geenien liittäminen operoitavasti promoottoriin, joka on säädeltävissä transkriptionaalisen alaspäinsäätelyn mekanismilla eritysstressissä; - sieni-isännän viljeleminen sopivissa viljelyolosuhteissa ja alaspäinsäätelyä sieni-isännässä välittävien proteiinien ylituottaminen; ja - valitun erittyvän proteiinin talteen ottaminen isännän viljelyalustasta.

25

Valittu erittyvä proteiini voi olla heterologinen proteiini ja epätoivotut erittyvät proteiinit voivat olla homologisia proteiineja.

’’Promoottorin geneettinen muuntaminen siten, että se ei ole säädeltävissä 30 alaspäinsäätelyllä” tarkoittaa tässä sitä, että promoottori on muunnettu millä tahansa sopivalla tavanomaisella alalla tunnetulla molekyylibiologian menetelmällä siten, että se ei ole säädeltävissä alaspäinsäätelyllä samalla tavalla kuin muuntamaton promoottori on, DNA-tekniikoilla, kuten kohdennetulla mutageneesillä tai deleetiolla. Tässä keksinnössä 15 geneettisen muuntamisen esimerkkinä toimii Trichoderman cbhl-promoottorin, jonka ei ole tarkoitus olla alaspäinsäätelyn säätelemä, osien poistaminen.

“Alaspäinsäätelyä eritysstressissä välittäviä proteiineja koodaavien geenien geneettinen 5 muuntaminen" tarkoittaa tässä sitä, että geenit on muunnettu millä tahansa sopivalla tavanomaisella alalla tunnetulla molekyylibiologian menetelmällä siten, että niitä ylituotetaan tai inaktivoidaan tai niiden aktiivisuus tai ilmentyminen on muuttunut. Muuntaminen tehdään edullisesti rekombinantti-DNA-tekniikoilla, kuten kohdennetulla mutageneesillä tai deleetiolla mutta myös mitä tahansa muuta geneettisen muuntamisen 10 menetelmää kuten halutuilla ominaisuuksilla varustettujen solujen risteyttämistä tai yhdistämistä voidaan käyttää, tai tavanomaista mutageneesiä kemiallisia aineita tai säteilyä käyttäen, mitä seuraa transkriptionaalisen alaspäinsäätelyn mekanismin osalta muuntuneiden solujen seulonta tai selektio.

15 Olemme osoittaneet erittyviä proteiineja koodaavien geenien alaspäinsäätelyn mekanismin olemassaolon rihmasienissä vasteena eritysstressiin. Esimerkkejä esitetään sienilajeista T. reesei ja A. niger. Todisteita uudesta säätelymekanismista on saatu analysoimalla joko proteiinisynteesiä, -laskostumista tai -kuljetusta estävillä kemiallisilla aineilla käsiteltyjä sieniviljelmiä, tai analysoimalla foldaasitasoiltaan alentuneita sienikantoja (katso esimerkit 20 1, 2 ja 3). Lisäksi kannoissa, jotka tuottavat heterologisia proteiineja, endogeenisia erittyviä proteiineja koodaavat geenit ilmentyvät alemmilla tasoilla emokantaansa verrattuna (katso esimerkki 4). Eukaryoottisissa järjestelmissä on viime vuosina raportoitu kaksi palautemekanismia, jotka sallivat solun aistia ER:n ontelon tilan ja reagoida eritysstressiin häiriöiden vähentämiseksi. Näihin sisältyvät UPR-reitti (Shamu et ai., 1994) 25 ja translaation initiaation vaimentaminen (Harding et ai., 1999). Uusi havaintomme käsittää eritysstressin aikana toimivan palautesäätelymekanismin kolmannen tyypin, jonka osoitetaan olevan tietyn geenin promoottorisekvenssin välittämä käyttäen reportterigeenijärjestelmää, joka koostuu IacZ: n ilmentymisestä cbhl-promoottorisekvenssien alaisena (esimerkki 4) 30

Saatujen tulosten perusteella on mahdollista jatkaa Trichodermassa erittyviä proteiineja koodaavien geenien alaspäinsäätelyyn osallistuvien promoottorialueiden karakterisointia. Osallisena olevat promoottorialueet voidaan paikallistaa tutkimalla esimerkiksi lacZ-reportteringeenin ilmentymistä eriasteisesti deletoidun cbh 1-promoottorin alaisena ja 16 käyttämällä olosuhteita, joissa ekstrasellulaarisia proteiineja koodaavien geenien mRNA-taso on alaspäinsäädelty, esim. käsittely DTTilla. Tämän analyysin perusteella voidaan valikoituja promoottorialueita käyttää geelisiirtymämäärityksissä stressatuista ja stressaantumattomista viljelmistä (esim. DTT-käsitelty ja käsittelemätön) olevien solu-5 uutteiden kanssa spesifisten alueiden tunnistamiseksi yksityiskohtaisemmin, ja säätelytekij öiden mahdollisten sitoutumiskohtien karakterisoimiseksi.

Promoottorisekvenssien vertailua voidaan käyttää alaspäinsäätelyä välittävien sekvenssien tunnistamiseen muissa promoottoreissa, joihin stressiolosuhteet vaikuttavat. Tässä kuvattuja tai alalla tunnettuja menetelmiä käyttäen on mahdollista tunnistaa missä tahansa 10 eliössä ja missä tahansa erittyvää proteiinia koodaavan geenin promoottorissa alueita, jotka reagoivat tähän transkriptionaaliseen alaspäinsäätelyyn.

Palautesäätelyyn ja promoottorisekvensseihin sitoutumiseen osallistuvien säätelyproteiinien kloonaaminen ja karakterisointi voidaan suorittaa käyttämällä esim. 15 yeast-one -hybridijäqestelmää käyttäen hyväksi karakterisoituja promoottorielementtejä cbh 1 -promoottorissa (ja muissa alaspäinsäätelyä osoittavissa relevanteissa geeneissä). Kloonausjäqestelmiä DNA:ta sitoville proteiineille, joita voidaan käyttää, on kaupallisesti saatavana (esim. Clontech’n MatchmakerTM) tai niitä on raportoitu (esim. Saloheimo et ai. 2000).

20

Promoottorisekvenssi, jonka on havaittu välittävän geenin alaspäinsäätelyä, voidaan muuntaa siten, että alaspäinsäätely stressiolosuhteissa poistuu tai vähenee. Näillä keinoin on mahdollista lisätä geenin tuottotasoa olosuhteissa, joissa se muuten olisi alaspäinsäädelty, ja joko homologisen tai heterologisen geenituotteen tuottoa muunnetun 25 promoottorin alaisena (josta alaspäinsäätelevät sekvenssit on muunnettu) voidaan parantaa. Lisäksi alaspäinsäätelyyn osallistuvat säätelytekijät voidaan täydellisesti tai osittain inaktivoida proteiinintuoton parantamiseksi. Samanlaista lähestymistapaa voidaan käyttää minkä tahansa organismin kanssa, jolla tiedetään olevan erittyviä proteiineja koodaavien geenien alaspäinsäätelyä, esim. muiden sienilajien, erityisesti muiden rihmasienilajien 30 kanssa.

Heterologisten proteiinien tuottaminen voi aiheuttaa samantyyppisen stressivasteen kuin esim. käsittely kemiallisilla aineilla DTT, BFA tai A23187. Endogeenisen sellulaasin transkriptien alempia tasoja on havaittu ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattoria 17 tuottavissa T. reesei -viljelmissä, mikä osoittaa esim. egll:aja cbhl:a koodaavien geenien alaspäinsäätelyn tPA:n tuottamisen aikana (esimerkki 3). Jos endogeenisiä ekstrasellulaarisia proteiineja koodaavien geenien promoottoreita käytetään heterologisen tuotteen ilmentämiseen tai homologisen tuotteen yli-ilmentämiseen stressivasteita 5 indusoiden, saattaa ilmentyminen tulla tuottamisen aikana transkriptionaalista alaspäinsäätelyä välittävän palautesäätelyn alaiseksi. Joko promoottorielementtien tai promoottoriin sitoutuvien tai säätelysignaalia välittävien säätelytekijöiden muuntaminen ovat keinoja lisätä proteiinintuottoa alaspäinsäätelyprosessi poistamalla.

10 Joissakin tapauksissa saattaa olla edullista tehostaa alaspäinsäätelyä eritysstressin aikana endogeenisistä proteiineista joidenkin tuotannon vähentämiseksi, ja kiinnostuksen kohteena olevan proteiinin tuottamiseksi promoottorin alaisena, jota ei alaspäinsäädellä eritysstressin aikana. Tämä voidaan saada aikaan yli-ilmentämällä alaspäinsäätelyä välittäviä säätelytekijöitä ja/tai muuntamalla promoottoreita repressoivien säätelytekijöiden 15 sitoutumisen lisäämiseksi, esim. tekijöille tarjolla olevia sitoutumiskohtia lisäten. Tämä keksintö kuvaa yhden menetelmän, jolla voidaan tunnistaa ne geenit, joiden promoottorit eivät ole alaspäinsäädeltyjä silloin kuin erittyvän proteiinin geenien ilmentyminen on, esimerkin ollessa T.reesein gpd-promoottori.

20 Näillä keinoin on mahdollista selektiivisesti säädellä erittyviä proteiineja koodaavia geenejä valittujen proteiinien tuotannon lisäämiseksi, joko tuottopromoottorin alaspäinsäätelyä vähentämällä tai inaktivoimalla tai tehostamalla alaspäinsäätelyä muiden erittyvien proteiinien ilmentymisen vaimentamiseksi selektiivisesti. Tulee panna merkille, että keksinnön käyttäminen hyödyksi ei rajoitu proteiinituotantoon, vaan että tässä kuvatut 25 transkriptionaalisen alaspäinsäätelyn mekanismit taijoavat keinoja muuntaa sienikantoja myös muihin tarkoituksiin ja selektiivisesti säädellä tiettyjen haluttujen ja ei-haluttujen proteiinien ilmentymistä isännässä..

ESIMERKIT

Esimerkki 1. Ca2+-ionofori A23187:n, ditiotreitolin (DTT) ja Brefeldin A:n (BFA) vaikutukset T. reesei Rut-C30 -viljelmissä 30 18 RNAn ja proteiinien näytteenottoon, metaboliseen leimaamiseen ja analyysiin käytetyt Trichoderma-kannat, viljelyolosuhteet ja menetelmät.

Trichoderma-kaxmaX ja viljelyolosuhteet on olennaisesti kuvattu muualla (Pakula et ai. 2000; Ilmen et ai 1996). T. reesei -kanta Rut-C30 (Montenecourt & Eveleigh, 1979) 5 viljeltiin minimaalialustassa ((NH^SCXj 7,6 g Γ1, KH2P04 15,0 g Γ1, MgS047H20 0,5 g Γ1, CaCl2 H20 0,2 g Γ1, CoCl2 3,7 mg Γ1, FeS047H20 5 mg Γ1, ZnS047H20 1.4 mg l'1, MnS04 7H20 1,6 mg Γ1, pH säädetty arvoon 5,2 KOHrlla) joka sisälsi laktoosia 20 g Γ1 hiilen lähteenä. Itiösuspensio, jossa oli 2x107 itiötä (säilytetty -80 °C:ssa 20 % glyserolissa) siirrostettiin 200 ml:aan alustaa, kasvatettiin ravistelupulloissa 28 °C:ssa 10 ravistellen nopeudella 210 rpm. 4 päivää kestäneen kasvatuksen jälkeen viljelmät laimennettiin 1/10 tuoreeseen alustaan, kasvatettiin vielä 24 h, ja käsiteltiin joko 10 mM ditiotreitolilla (DTT), 50 pg/ml:lla brefeldin A:ta (BFA) tai 5 μΜ Ca2+-ionoforilla A23187. Vastaava tilavuus kantaliuoksen liuotinta lisättiin käsittelemättömiin kontrolli viljelmiin (0,2 % ja 0,5 % DMSO kontrolliviljelmille A23187- ja BFA-käsittelylle, vastaavassa 15 jäijestyksessä, ja kaksoistislattua vettä kontrolliksi DTT-käsittelylle). Viljelmät jaettiin eriin proteiinien metabolista leimausta ja eri ajankohtina tapahtuvaa RNAn eristämistä varten.

Proteiinit leimattiin metabolisesti 35S-metioniinilla käyttäen viitteessä (Pakula et ai. 2000) 20 kuvattuja menetelmiä. Näytteiden valmistus ja leimattujen proteiinien analyysi suoritettiin olennaisesti kuten viitteessä (Pakula et ai. 2000). Leimauskoe aloitettiin 10 min jälkeen DTT:n tai A23187:n lisäämisestä tai 15 min jälkeen BFA:n lisäämisestä. 1 mCi of [35S]-metioniinia (Amersham SJ 1015, in vivo soluleimauslaatu, 1000 Ci mmol'', 10 pCi μΓ1) lisättiin 50 ml:n osaan viljelmästä. Käsittelemättömät viljelmät leimattiin rinnalla ja 25 samalla tavalla. 2 ml:n näytteitä kerättiin ajanjakson aikana. Leimautunut kokonaisproteiini solu-uutteissa ja viljelysupematantissa mitattiin käyttämällä näytteissä olevan TCAihan liukenemattoman materiaalin nestetuikelaskentaa, ja leimatut spesifiset proteiinit (esim. CBHI) analysoitiin käyttäen 2D-geelielektroforeesia, ja proteiinit kvantitoitiin käyttäen fosforimageria (Molecular Dynamics). Proteiinisynteesin ja erityksen nopeudet ja 30 keskimääräinen synteesiaika ja pienin eritysaika määritettiin kuten viitteessä Pakula et ai. 2000 kuvataan.

Northem-analyysiä varten kerättiin myseelinäytteitä DTT:11a, BFA:lla tai A23187:11a käsitellyistä viljelmistä ja käsittelemättömistä kontrolliviljelmistä 0, 15, 30, 60, 90, 120, 19 240 ja 360 minuutin jälkeen käsittelystä. Ensimmäinen näyte (ajan hetki 0 min) otettiin juuri ennen DTT:n, BFA:n tai A23187:n lisäämistä. Myseeli suodatettiin, pestiin samalla määrällä 0,7 % NaCl, pakastettiin välittömästi nestetyppeen, ja säilytettiin -80 °C:ssa. Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol™ Reagent’ia (Gibco BRL) olennaisesti 5 valmistajan ohjeiden mukaisesti. Northern blotting ja hybridisaatio suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti (Sambrook et ai). Geenien täyspitkää cDNAta käytettiin koettimina.

10 A23187:n, DTT:n ja BFA:n vaikutus proteiinisynteesiin ja -kuljetukseen T. reeseissa

Erittyviä proteiineja koodaavien geenien palautesäätelyä tutkittiin viljelmissä, jotka oli käsitelty reagensseilla, joiden tiedetään häiritsevän joko proteiinisynteesiä, -laskostumista tai -kuljetusta muissa organismeissa. Ca2+-ionofori A23187:n on raportoitu vähentävän proteiinisynteesiä sekä estävän proteiinien laskostumista ja kuljetusta tyhjentämällä ER:n 15 Ca2+-varastot nisäkässoluissa (Broström et ai. 1989, Lodish ja Kong, 1990, Lodish et ai.

1992) . Ditiotreitoli on pelkistin, joka estää disulfidisiltojen muodostumista ja proteiinien laskostumista hiivassa ja nisäkkäissä (Jämsä et ai. 1994, Alberini et ai. 1990, Braakman et ai. 1992). Solujen käsittelyn BFA:lla tiedetään hajottavan Golgi-rakenteen ja estävän proteiinien kuljetusta ER:sta Golgiin esim. nisäkäsjäijestelmissä, mutta vaikutus on 20 organismista ja spesifisestä solutyypistä riippuvaista (Pelham, 1991, Shah ja Klausner, 1993) .

Proteiinien metabolista leimausta käytettiin A23187:n, DTT:n ja BFA:n vaikutusten karakterisoimiseksi proteiinisynteesiin ja eritykseen T. reesei -viljelmissä (käytettyjen 25 menetelmien osalta katso Pakula et ai. 2000).

Viljelmiä käsiteltiin 10 minuuttia 5 μΜ A23187:lla tai 10 mM DTTilla tai 15 minuuttia 50 μg/ml BFA:lla ennen leimatun metioniinin lisäämistä. Leimautunut kokonaisproteiini sekä leimautuneet spesifiset proteiinit analysoitiin solu-uutteessa ja viljelysupematantissa leimauskokeen eri ajankohtina.

30

Kokonaisproteiinisynteesin nopeus ja kokonaisproteiinierityksen nopeus mitattiin TCAihan liukenemattomaan materiaaliin inkorporoituneen radioaktiivisuuden määränä aikayksikköä kohden solu-uutteissa ja viljelysupematantissa (kuvio 1., radioaktiivisuus TCA:han liukenemattomassa materiaalissa esitetään biomassan kuivapainon mg:aa kohden, ja ajan 20 hetki 0 minuuttia vastaa leimatun metioniinin lisäämistä). Nopeudet pääteltiin käsittelyn ensimmäisten 15-45 minuutin aikana mitatuista arvoista. DTT:n tai BFA:n läsnä ollessa kokonaisproteiinisynteesin nopeus ei muuttunut, kun taas käsittely ionoforilla laski proteiinisynteesin nopeuden 51 %:iin kontrollisoluissa havaitusta. Ekstrasellulaaristen 5 leimattujen proteiinien tuotto estyi melko tehokkaasti viljelmissä, jotka oli käsitelty DTT:lla tai BFAdla. Näissä viljelmissä kaikkien leimattujen proteiinien erittymisnopeus viljelyalustaan oli vain 5 % kontrollisoluissa havaitusta. BFAdla käsitellyissä viljelmissä ekstrasellulaaristen proteiinien tuotto oli lisäksi merkittävästi viivästynyt kontrolliviljelmiin verrattuna. Viljelmissä, jotka oli käsitelty ionofori A23187:11a 10 leimattujen proteiinien tuottonopeus viljelyalustaan oli laskenut 23 %:iin käsittelemättömissä viljelmistä havaitusta. Proteiinisynteesin ja -erityksen nopeudet esitetään yhteenvetona taulukossa 1 (taulukossa 1 nopeuksien arvot esitetään arvojen prosenttiosuutena käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä). Tulos osoittaa, että DTT ja BFA eivät estä proteiinisynteesiä, mutta estävät proteiinin kuljetuksen soluista, kun taas 15 A23187:11a on myös estävä vaikutus proteiinisynteesiin.

Käsittelyjen vaikutus ekstrasellulaaristen proteiinien synteesiin spesifisesti ja niiden kuljetukseen tutkittiin käyttämällä malliproteiinina sienen tuottamaa tärkeää sellulaasia, sellobiohydrolaasi I:a (CBHI). Proteiinin synteesiä ja erittymistä sekä muutoksia proteiinin 20 pl-kuviossa kuljetuksen aikana seurattiin 2D-geelielektroforeesilla (kuten kuvattu viitteessä Pakula et ai. 2000; kuvio 2 esittää leimattua CBHI:a leimauskokeen eri ajankohtina 2D-geeleissä analysoituna, pH-väli on noin 3,5-4,5 vasemmalta oikealle kussakin kuvassa). Solu-uutteissa, jotka oli valmistettu joko DTTdla tai BFAdla käsitellyistä viljelmistä, voidaan havaita vain aivan ensimmäiset pl-muodot, mikä osoittaa, 25 että proteiinia ei täysin modifioida posttranslationaalisesti biosynteettisessä reitissä. DTTdla käsitellyissä viljelmissä ei havaittu mitään leimatun CBHI:n tuottoa viljelyalustaan, ja BFAdla käsitellyissä viljelmissä vain hyvin pieni määrä CBHI:a erittyi leimauskokeen myöhäisvaiheissa (tuottonopeus oli 4 % kontrolliviljelmissä mitatusta). Tulos viittaa siihen, että näissä olosuhteissa proteiinin kuljetus estyy ennen kuin proteiini 30 saavuttaa osaston, jossa pl:n heterogenian aiheuttavat modifikaatiot tapahtuvat. BFAdla käsiteltyjen viljelmien viljelyalustassa havaittu hyvin pieni määrä CBHI:a oli kuitenkin saanut täyden pl-kuvion, mikä osoittaa, että pieni osa proteiinista modifioidaan ja kuljetetaan, mutta proteiinin täysin prosessoitujen muotojen määrä on liian pieni havaittavaksi solu-uutteissa. Ionofori A23187:11a tehdyn käsittelyn vaikutus proteiinin 21 kuljetukseen oli vähemmän selvä. CBHI:n täyden pl-kuvion muodostuminen oli viivästynyt 15-20 minuutilla kontrollisoluihin verrattuna, ja CBHI:a, jolla oli täysi pl-muotojen kuvio, erittyi kasvualustaan joskin viiveellä.

5 Leimattu CBHI solu-uutteen ja viljelysupematantin näytteistä leimauskokeen eri ajankohtina analysoitiin 2D-geeleissä ja kvantitoitiin fosforimageria käyttäen (Molecular Dynamics). Parametrit, kuten CBHI:n synteesi ja eritysnopeus (aikayksikköä kohden tuotetun leimatun proteiinin määrä) sekä CBHI:n keskimääräinen synteesiaika ja pienin erittymisaika, määritettiin (menetelmän osalta katso Pakula et ai. 2000). Leimatun CBHI:n 10 kvantitointi leimauskokeen aikana esitetään kuviossa 3, ja päätellyistä CBHIrn synteesiä ja eritystä kuvaavista parametreista näissä olosuhteissa esitetään yhteenveto taulukossa 1. Täyspitkän CBHI:n keskimääräinen synteesiaika oli muuttumaton DTT:lla ja BFA:lla käsitellyissä viljelmissä, mikä on sopusoinnussa sen tuloksen kanssa, jonka mukaan nämä käsittelyt eivät vaikuta kokonaisproteiinisynteesiin (katso edellä). BFA:lla käsitellyissä 15 viljelmissä mitattu molekyylin pienin erittymisaika kasvoi 11 minuutista 69 minuuttiin, ja DTT:11a käsitellyissä viljelmissä parametriä ei voitu määrittää, johtuen näissä olosuhteissa tuotetun ekstrasellulaarisen proteiinin hyvin pienestä määrästä. Viljelmien käsittelyllä ionofori A23187:11a oli vaikutus CBHI:n synteesiin sekä proteiinin kuljetukseen. CBHI:n pienin erittymisaika kasvoi 10 minuutilla A23187:11a käsitellyissä viljelmissä 20 kontrolliviljelmiin verrattuna, ja CBHP.n synteesiaika oli 3-4 minuuttia pidempi kuin kontrolliviljelmissä.

Yllättäen, vaikka käsittely DTT:11a tai BFA:lla ei alentanut kokonaisproteiinisynteesin nopeutta tai pidentänyt CBHI-molekyylien synteesiin vaadittavaa aikaa, huomattiin, että 25 CBHI:n synteesinopeus (aikayksikköä kohden syntetisoidun leimatun CBHI:n määrä) oli alempi viljelmissä, jotka oli käsitelty DTT:lla tai BFA.lla. (Taulukossa 1. nopeudet esitetään prosenttiosuutena kontrolliviljelmissä mitatuista arvoista.). DTT:lla käsitellyissä viljelmissä CBHI:n synteesinopeus oli 4-24 % kontrolliviljelmissä mitatusta ja BFA:lla käsitellyissä viljelmissä 52 %. Suurin osa syntetisoidusta CBHLsta jää solunsisäiseksi. 30 CBHI:n tuoton nopeutta viljelyalastaan ei voitu mitata DTT:lla käsitellyissä viljelmissä, ja BFA:lla käsitellyissä viljelmissä se oli 4 % kontrolliviljelmissä mitatusta. Ionofori A23187:11a käsitellyissä viljelmissä CBHI.n synteesinopeuteen vaikutettiin enemmän kuin kokonaisproteiinisynteesin nopeuteen. CBHI:n synteesin nopeus oli 26 % kontrollisoluissa mitatusta, ja kokonaisproteiinisynteesin nopeus 51 %. Proteiinierityksen nopeus 22 viljelyalustaan oli alentunut samassa määrin kuin CBHI:n synteesinopeus (27 % kontrolli vilj elmissä mitatusta).

Tulokset osoittavat, että käsittely DTT:lla tai BFA:lla selvästi esti proteiinin kuljetusta 5 Trichodermassa, mahdollisesti estäen proteiinin kuljettamisen eteenpäin ER:sta, kun taas käsittely A23187:11a aiheutti vain lievän viivästymisen proteiinin kuljetuksessa. Kokonaisproteiinisynteesiaktiivisuus oli muuttumaton viljelmissä, jotka oli käsitelty joko DTT.lla tai BFA.lla, kun taas erittyvän malliproteiini CBHI:n synteesinopeus aleni spesifisesti samanaikaisesti proteiinikuljetuksen heikentymisen kanssa. A23187:11a 10 käsitellyissä viljelmissä mitattiin selkeä kokonaisproteiinisynteesin nopeuden aleneminen, mutta CBHI:n synteesinopeuteen vaikutus oli suurempi kokonaisproteiinisynteesiin verrattuna.

Taulukko 1. A23187-, DTT- tai BFA-käsittelyn vaikutus proteiinisynteesiin ja -15 eritykseen T. reeseissa.

(n.d. = ei havaittu)

Kokonais- Kokonais- CBHI CBHI

proteiini- proteiini- synteesi- synteesi- synteesi- synteesi- nopeus nopeus _nopeus_nopeus_ Käsittelemät- 100% 100% 100% 100% tömät solut A23187 51% 23% 26% 27% BFA 100% 5% 52% 4% DTT 105% 5% 4-24% n.d.

Keskimäärä!- CBHI:n minimieritys- CBHI:n synteesi aika _aika___ Käsittelemättö- 5.7 min 11 min mät solut A23187 9 min 21 min BFA 4.6 min 69 min DTT 4.3 min n.d.

23 UPR-vastetta välittäviä foldaasia PDII, chaperonia BIPI, ja transkriptiotekijää HACI koodaavien geenien transkriptiotasot joko Ca2+-ionofori A23187:lla, DTT:lla tai BFAilia käsitellyissä T. reesei -viljelmissä 5 A23187:11a, DTT:lla tai BFA:lla käsittelyn aikana kerättyjen näytteiden Northem-analyysi suoritettiin käsittelyjen vaikutuksen tutkimiseksi transkriptiotasolla. Proteiinikuljetuksen ja -laskostumisen este DTT:lla tai BFA:lla käsitellyissä viljelmissä ilmeni myös laskostumattoman vasteen (UPR) reitin aktivoitumisena, mitä osoittaa pdil- ja bipl-10 geenien induktio (kuvio 4, tulos on raportoitu aiemmin pdil:n osalta; Saloheimo et ai. 1999), sekä UPR-vastetta välittävän Aaci-transkriptin lyhennetyn, aktiivisesti transloidun muodon ilmentymisenä (kuvio 5 esittää transkriptin lyhyen ja pidempien muotojen signaalit normalisoituna had:n kokonaissignaalin suhteen kunakin ajankohtana). A23187:11a käsitellyissä viljelmissä proteiinin kuljetukseen oli vain lievästi muuttunut ja 15 syntetisoidun proteiinin kokonaismäärä oli pienempi. Näissä olosuhteissa ei havaittu mitään pdil:n ja bipl:n induktiota (kuvio 4). had mRNAn lyhyen muodon lyhytaikainen ja melko heikko ilmentyminen havaittiin myös A23187:11a käsitellyissä soluissa, mikä osoittaa jonkin verran vaikutusta myös UPR-reittiin (kuvio 5).

20 Endogeenisiä erittyviä proteiineja koodaavien geenien transkriptitasot joko Ca2+-ionofori A23187:lla, DTTilla tai BFAilia käsitellyissä T. reesei -viljelmissä

Joko DTTdla tai BFAdla käsitellyissä viljelmissä CBHI:a syntetisoitiin alemmalla nopeudella verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin, kun taas 25 kokonaisproteiinisynteesi oli muuttumaton näissä olosuhteissa. A23187:lla käsitellyissä viljelmissä CBHI:n synteesi oli suuremmassa määrin hidastunutta verrattuna kokonaisproteiinisynteesiin käsitellyissä viljelmissä. Kemikaaleilla käsitellyistä viljelmistä valmistettujen näytteiden Northem-analyysi osoitti, että cbhl:n mRNA-taso aleni merkittävästi käsittelyn aikana (kuvio 6, cbhl-signaalit normalisoitu gpd-signaalien 30 suhteen käsittelyn eri ajankohtina). Alentunut mRNA-taso näyttää selittävän ainakin osittain proteiinin alemman synteesitason leimauskokeessa. DTTdla ja A23187:11a käsitellyissä viljelmissä geenin mRNA-tason aleneminen tapahtui kinetiikalla, joka vastasi mRNAn mitattua puoliintumisaikaa. BFAdla käsitellyissä viljelmissä aleneminen oli jonkin verran hitaampaa. Samanlainen aleneminen havaittiin egll:n mRNAtasossa 24 käsittelyjen aikana (kuvio 6, signaalit normalisoitu gpJ-signaalien suhteen käsittelyn eri ajankohtina). Lisäksi suoritettiin laajemman geenisarjan Northem-analyysi DTT:lla käsiteltyjen viljelmien näytteistä. Monien muiden ekstrasellulaarisia proteiineja koodaavien geenien, esim. xynl and hfb2, transkriptitaso oli alentunut (kuvio 7), mikä 5 osoittaa, että monet ekstrasellulaarisia proteiineja koodaavat geenit ovat palautekontrollin alaisia olosuhteissa, joissa on proteiinisynteesin, -laskostumisen tai -kuljetuksen rajoituksia.

On myös ilmeistä, että alaspäinsäätely ei vaikuta kaikkiin sienen ilmentämiin geeneihin, 10 vaan on yhteinen ekstrasellulaarisia proteiineja koodaavien geenien ryhmälle. UPR:n kontrollin alaisena olevien ylöspäinsäädeltyjen geenien lisäksi löydettiin useita esimerkkejä geeneistä, joita ei säädelty alaspäin (kuvio 8). Kiinnostavaa on, että näissä olosuhteissa intrasellulaarista β-glukosidaasia koodaavan bgl2:n mRNAn taso ei alentunut, vaikka geeniä säädellään samalla tavalla kuin sellulaaseja suhteessa sienelle saatavilla 15 olevaan hiilen lähteeseen. Vesikkelikuljetuksessa toimivien proteiinien geenien, esim. sarl (Veldhuisen et ai. 1997) jayptl, ilmentymistaso ei muuttunut DTT-käsittelyllä (Saloheimo et ai. lähetetty julkaistavaksi). Muita geenejä, joiden ilmentymiseen DTT-käsittely ei nähtävästi vaikuta, ovat esim. cDNAl ja gpd (glyseraldehydi-6-P-dehydrogenaasi). Gpd-signaalia käytettiin signaalien normalisointiin Northem-analyyseissä.

20

Esimerkki 2. Endogeenisiä erittyviä proteiineja koodaavien geenien transkriptitasot joko DTTrlla käsitellyissä A Niger -viljelmissä A. niger -kannat, viljelyolosuhteet ja RNAn näytteenottoon ja analyysiin käytetyt 25 menetelmät

Kokeissa käytetyt Aspergillus niger -kannat olivat AB4.1 (van Hartingsveldt et ah, 1987) ja AS 1.1 (Ngiam et ai., 2000). Itiöitä, jotka oli resuspendoitu 0,1 % Tween 20:een (Sigma, UK) käytettiin nesteviljelmien siirrostamiseksi lopulliseen tiheyteen lxlO5 itiötä per ml 30 alustaa. Kannat ylläpidettiin peruna-dekstroosiagarvinopinnoilla (Difco, USA) lisäten 10 mM uridiinia A. niger AB4.1:lle. Vinopinnat kasvatettiin 30 °C:ssa, kunnes ne olivat itiöineet ja nuorennettiin kutakin koetta varten. ACMS/N/P-alustaa (Archer et ai., 1990) käytettiin kaikkiin kokeisiin, joihin sisältyi nesteviljely. A. niger AB4.1:n viljelmät täydennettiin jälleen 10 mM uridiinilla. Viljelmät kasvatettiin 100 ml:n erissä alustaa 250 f 25 ml:n kartiopulloissa 25 °C:ssa ja 150 rpm:ssa. DTT-stressikokeissa AB4.1-viljelmiä kasvatettiin 44 tuntia ennen 1 ml:n 2 M DTT-liuosta lisäämistä loppupitoisuuden 20 mM saamiseksi. AB4.1 :n kontrolliviljelmiin lisättiin vastaava määrä vettä. Alustanvaihtokoetta varten viljelmiä kasvatettiin 44 tuntia 25 °C:ssa ja 150 rpmrssa ACMS/N/P:ssa. Myseeli 5 kerättiin talteen Miraclothrn läpi (CalBiochem, USA) ja pestiin kahdella 100 ml:n erällä 25 °C:een esilämmitettyä alustaa ilman hiilenlähdettä. Sitten myseeli siirrettiin esilämmitettyihin pulloihin, jotka sisälsivät 100 ml ACMX/N/P:ta tarvittaessa täydennettynä ja inkubointia jatkettiin käyttäen samoja olosuhteita kuin edellä. ACMX/N/P eroaa ACMS/N/P:sta sen osalta, että se sisältää 10 g ksyloosia litraa kohden 10 g:n sijasta 10 liukoista tärkkelystä litraa kohden.

Myseelit kerättiin talteen kahden Miracloth-kerroksen läpi ja pikapakastettiin nestetypessä. Sitten myseelit jauhettiin nestetypen alla hienoksi jauheeksi, joka pakastekuivattiin Edwards Modulyo -pakastekuivaimessa kaksi päivää. Kuivapainot määritettiin 15 punnitsemalla myseelit kahden pakastekuivuripäivän jälkeen ja kuivaamalla sitten vielä päivän. Ellei mitään painon alenemista havaittu tämän ajanjakson aikana, katsottuiin viljelmän olevan täysin kuiva.

Kokonais-RNA uutettiin 100 mg:sta pakastekuivattuja, jauhettuja myseeleitä käyttäen 20 RNeasy Plant Mini Kit’iä (Qiagen, UK) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA

kvantitoitiin lukemalla absorbanssit 230, 260 ja 280 nm:n kohdalla Uvikon 850 spektrofotometrissä (Kontron Instruments, UK). Suhteet, jotka ylittivät arvon 2,0 260nm:280nm-lukemille, hyväksyttiin hyvälaatuista RNAta osoittaviksi. RNAn laatu määritettiin myös ajamalla näytteitä 7 % formaldehydigeeleissä (Sambrook et ai, 1989). 25 Northem-blottausta varten 10 μg RNAta näytekaistaa kohden ajettiin 7 % formaldehydigeelissä MOPS-ajopuskurissa (Sambrook et ai, 1989) 16 tuntia 25 V:ssa Life Technologies Horizon 11-14 geelielektroforeesiuppotankissa. Näytteet valmistettiin käyttäen Sigman RNA-latausväriä (Cat.# R4268). Elektroforeesin jälkeen geeli pestiin 5 vaihdolla DEPC-käsiteltyä vettä (Sambrook et ai, 1989), kukin pesu 20 minuuttia, ja 30 liotettiin sitten 50 mM NaOH:ssa 10 minuuttia. Siirto Hybond XL -nailonkalvolle (Amersham Intl., UK) suoritettiin käyttämällä Appligene-vakuumiblotteria valmistajan ohjeiden mukaisesti lOxSSC (Sambrook et ai, 1989) siirtopuskurina. Siirtoaika oli 2,5 tuntia. Siirron jälkeen blottia liotettiin 50 mM NaOH:ssa 5 minuuttia ja huuhdeltiin sitten 2xSSC:ssa 30 sekuntia ennen kuin sen annettiin kuivua ilmassa yli yön.

26 I Koettimet northem-blotteja varten leimattiin käyttäen Megaprime- leimausvarustepakkausta ja · - P dATP:ta (kumpikin Amersham Inti., UK) valmistajan ohjeiden mukaisesti. GlaA-koetin oli 637 bp:n fragmentti vastaten koordinaatteja +1059 -5 +1696 A. nigerin glukoamylaasigeenin sekvenssissä (Boel et ai., 1984), Aktiinikoetin oli 765 bp:n fragmentti vastaten koordinaatteja +889 - +1654 A. nidulansin γ-aktiinigeenissä (Fidel et ai., 1988). PdiA-koQtm oli 303 bp:n fragmentti vastaten koordinaatteja +63 - +365 A. nigerin pdiA-geemn sekvenssissä (Ngiam et ai., 1997). PepA-koetin oli 445 bp:n fragmentti vastaten koordinaatteja +1186 -+1631 A. awamorin aspergillopepsiinigeenissä 10 (Berka et ai., 1990). BipA-koetin oli 445 bp:n fragmentti vastaten A. nigerin bipA-geznin j koordinaatteja +712-+1156 (van Gemeren et ai., 1997) Kaikki koettimet monistettiin PCR:lla A. nigerin genomin DNAsta ja puhdistettiin agaroosi-TAE -geeleistä käyttäen | Qiaquick geeliuuttovarustesaijaa (Qiagen, UK).

15 Blotit esihybridisoitiin 65 °C:ssa Hyb9-hybridisaatioliuoksessa (Puregene, USA) 30 minuuttia ennen koetin-DNAn lisäämistä. Hybridisaatio suoritettiin sitten yli yön 65 °C:ssa. Blotit pestiin kahdesti 2xSSC, 0,1 % SDSrssa 15 minuuttia 65 °C:ssa ja sitten kerran 0,lxSSC, 0,1 % SDS:ssa 30 minuuttia 65 °C:ssa. Blotit visualisoitiin ja juovien voimakkuudet kvantitoitiin käyttäen FujiFilm BAS1500 fosforimaging-järjestelmää. RNA-20 lataukset normalisoitiin γ-aktiinikoetinta käyttämällä. Piirroksissa esitetyt luvut edustavat kohde-mRNA-signaalin ja γ-aktiinisignaalin suhdetta. Tämä on riippuvainen valotusajasta Moteille kullakin fosforimage-levyllä. Koska eri piirroksissa olevat arvot eivät edusta transkriptien absoluuttisia tasoja, ne eivät ole suoraan vertailukelpoisia.

25 DTT:n vaikutus geenien glaA, pepA, pdiA ja bipA trasnkriptitasoihin A. niger-viljelmissä I Kuvio 9 esittää tulokset yli 10 tuntia kestäneestä DTT-aikakokeesta (stressitekijän lisäämisestä, kolmen määrityksen keskiarvosignaalit). Osa (A) esittää vaikutusta steady-state-RNA-tasoihin glaA-geenille tänä aikana. On selvästi nähtävissä, että DTTrlla 30 käsitellyissä viljelmissä mRNAn määrä putoaa tasaisesti ajan mittaan, puoliintumisajan ollessa noin 70 minuuttia. Tämä korreloi hyvin tässä laboratoriossa suoritetusta alustanvaihtokokeesta saatujen tulosten kanssa (kuvio 10.), jotka osoittavat että glaA:n mRNAn TlA on n. 70 minuuttia glaA:n mRNA-synteesin puuttuessa. Kuviossa 9A oleva tulos viittaa siksi siihen, että DTT-käsittely estää glaA:n transkription ja että glaA:n 27 mRNAn tason aleneminen johtuu sen normaalista hajoamisesta organismin sisällä. Kuvio 9B osoittaa DTT-stressin vaikutuksen toiseen erittyvään proteiiniin, aspergillopepsiiniin (pepA). Tämä geeni indusoituu vain kun alustan pH tulee happamammaksi ja näin ollen transkriptio ei tapahdu ennen kuin myöhään ajan kuluessa. Tulokset osoittavat, että vaikka 5 kontrolli viljelmissä esiintyy pepA: n mRNAn nousu, ei DTT.lla käsitellyissä viljelmissä ole merkittävää nousua. Kuvio 9C ja D osoittavat DTT:n vaikutukset geenihin, jotka osallistuvat laskostumattoman proteiinin vasteeseen. Esitetyistä geeneistä molemmat, pdiA ja bipA, osoittavat nopean vasteen stressitekijän lisäämiselle. Tämä vaste ei näytä olevan ohimenevä vaan on päinvastoin pitkäikäinen. Ei tiedetä, johtuuko tämä lähetti-RNAn 10 tuotosta pidemmän ajanjakson ajan DTT:n lisäämisen jälkeen vai johtuuko se osallisena olevien mRNAiden pitkistä puoliintumisaj öistä.

ESIMERKKI 3. Geenien glaA ja pepA transkriptitasot pi/74-antisensetranskriptiä ilmentävissä A. niger -viljelmissä 15 glaA:n ja pepA:n ilmentymistä on vertailtu A. mger-kannassa, joka ilmentää pdiA-antisensekonstruktia, ja sen emokannassa. Kantojen viljely- ja RNAn analyysimenetelmät on kuvattu esimerkissä 2.

Kuvio 11 esittää tuloksia, jotka on saatu A. niger ASl.l:n, joka sisältää useita kopioita 20 pdiA-antisensesekvenssistä glukoamylaasipromoottorin kontrollin alaisena, vertailusta emokantaan A. niger AB4.1 kasvatettuna alustalla, joka sisältää tärkkelystä hiilen lähteenä. Kuva (a) esittää vaikutuksen mRNA-tasoihin g7a4-geenille. Voidaan havaita, että ensimmäisestä aikapisteestä 24 tunnin kohdalla glaA:n mRNA-tasot AS 1.1-kannassa osoittavat asteittaista alenemista, kun taas AB4.1:n tasot nousevat. Tästä ja kuvasta (a) 25 kuviossa 1 voidaan havaita, että glaA:n mRNA-tasot emokannassa (AB4.1) itse asiassa nousevat suhteessa γ-aktiinin tasoon, jota käytetään normalisointiin. Tämä saattaa johtua osaksi glaA:n mRNAn pitkästä puoliintumisajasta, mikä tarkoittaisi sitä, että mRNAn hajoamisnopeus on merkittävästi hitaampaa kuin sen tuottonopeus, synnyttäen tämän mRNAn jatkuvasti kasvavan populaation. Kuvassa (b) esitetään vaikutukset pepA-geenin 30 transkriptioon. Kannassa AS 1.1 on jälleen merkitsevästi alemmat mRNA-tasot kuin emokannassa AB4.1. Kuva (c) esittää kokeiden kuivapainomääritykset, jotka osoittavat ettei sienen kasvuun ole merkittävää vaikutusta antisense-konstruktin ilmentyessä.

28 ESIMERKKI 4. Endogeenisiä erittyviä proteiineja koodaavien geenien ilmentymistaso heterologisia proteiineja tuottavissa T. reesei -kannoissa

Kannat, viljelyolosuhteet ja viljelmien analyysiin käytetyt menetelmät.

5 Ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattoria (tPA, Verheijen et ai. 1986) tuottava T. reesei Rut-C30 -kanta rakennettiin transformoimalla emokanta kuviossa 12A esitetyllä ilmentämiskasetilla käyttämällä viitteessä Penttilä et ai. 1987 kuvattuja menetelmiä.

TPA:ta tuottava kanta ja emokanta Rut-C30 viljeltiin bioreaktoreissa rinnakkain. 10 Käytettävä viljelyalusta oli VTT Biotekniikassa käytettävä laktoosipohjainen puskuroitu alusta (laktoosi 40 g/1, peptoni 4 g/1, hiivauute 1 g/1, KH2PO4 4 g/1, (NH4)2S04 2,8 g/1, MgS04x7H20 0,6 g/1, CaCl2x2H20 0,8 g/1, täydennettynä hivenaineilla). Biomassan kuivapaino mitattiin kuten esimerkissä 5 kuvattiin. Laktoosipitoisuus viljelyalustassa määritettiin Boehringer Mannheim’ilta hankitulla välinepakkauksella, kokonaisproteiini 15 viljelyalustassa määritettiin BioRad’ilta hankitulla Protein Assay’lla, HEC-aktiivisuus mitattiin kuvatulla tavalla (viitteessä Bailey ja Nevalainen, 1981; IUPAC, 1987) ja tPA-pitoisuus mitattiin käyttäen TNO:n (Alankomaat) toimittamaa EIA-sarjaa. RNAn eristäminen ja Northem-analyysi suoritettiin esimerkeissä 1, 5 ja 6 kuvatulla tavalla.

20 Ekstrasellulaaristen endogeenisten proteiinien ilmentyminen tPA:ta tuottavassa kannassa ja tämän emokanassa

Endogeenisten erittyvien proteiinien tuottoa ja vastaavien geenien ilmentymistä tutkittiin T. reesei Rut-C30:ssa ja transformantissa, joka tuotti tPA:ta (ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattori), joka on esimerkki heteroloogisesta proteiinista, jota sieni 25 tuottaa hyvin huonosti, ja jonka odotetaan indusoivan monia stressivasteita isännässään. Transformantissa on arvioitu olevan noin viisi kopiota ilmentämiskasetista, josta tPA tuotetaan CBHI-fuusioproteiinina cbh\-promoottorin alaisena.

Proteiini tuoton ja vastaavien geenien ilmentymisen vertailemiseksi näissä kahdessa 30 kannassa suoritettiin rinnakkaisia viljelyjä bioreaktoreissa. Biomassan muodostus ja hiilenlähde laktoosin kulutus mitattiin viljelyn aikana kasvun seuraamiseksi (kuvio 12B). Kokonaisproteiini ja viljelyalustaan tuotettu sellulaasiaktiivisuus (aktiivisuus substraattia HEC vastaan, joka mittaa pääasiassa endoglukanaasiaktiivisuutta) mitattiin koko viljelyn ajan (kuvio 12C). Northem-analyysi suoritettiin egll:n (kuvio 12D), cbhl:n (kuvio 12E) ja 29 bipl:n (kuvio 12F) ilmentymisen analysoimiseksi viljelmissä. Aktiinin signaalia käytettiin signaalien normalisointiin Northemeissa.

Vaikkakin nämä kaksi kantaa kasvoivat melko samalla tavalla viljelyn aikana, oli ilmeistä, 5 että tPA:ta tuottava kanta tuotti paljon vähemmän kokonaisproteiinia ja sellulaasiaktiivisuutta viljelyalustaan emokantaan verrattuna. Transformantin tuottama tPA oli vain pieni osa tuotetusta kokonaisproteiinista, korkein saatu saanto on 25 mg/1. Sopusoinnussa alhaisen proteiinituoton kanssa tPA:ta tuottavassa viljelmässä olivat egll:n, joka koodaa ekstrasellulaarista endoglukanaasi I:a, ja cbhl: n, joka koodaa 10 sellobiohydrolaasi I:a, ilmentymistasot alempia tPArta tuottavassa viljelmässä.

Chaperonigeenin bipl ilmentyminen indusoitui tPA:ta tuottavassa viljelmässä, mikä osoittaa stressivasteiden, kuten UPR:n aktivoitumisen, heterologisen proteiinin tuottamisen toimesta. Näin ollen transformantissa erittyviä proteiineja koodaavien endogeenisten geenien alhaiset ilmentymistasot voisivat johtua eritysstressin aikana aktiivisesta 15 alaspäinsäätelymekanismista.

ESIMERKKI 5. Reportterigeenin IacZ ilmentyminen täyspituisen cää/-promoottorin ja lyhennetyn minimaalisen cbh/-promoottorin alaisena DTT:lla käsitellyissä T. reesein viljelmissä - promoottorisekvenssin rooli alaspäinsäätelyssä 20

Viljelyolosuhteet ja RNA-näytteiden analyysiin käytetyt menetelmät

Kanta QM9414 (Mandels et ai. 1971) ja sen johdannaiset pMI34 ja pML016, jotka ilmentävät Escherichia colin lacZ:aa cbhl -promoottorin alaisena (Ilmen et ai 1996), kasvatettiin minimaalialustalla, joka sisälsi 0,05% proteoosipeptonia ja 20 g/1 sorbitolia tai 25 glyserolia. 8x10 itiötä surrostettiin 200 ml:aa kohden kasvatusalustaa ja viljelmät kasvatettiin kartiopulloissa 28 °C:ssa ravistelussa 210 rpmdla. α-Soforoosia (1 mM) lisättiin 23 h:n ja 32 h:n kasvatuksen jälkeen sellulaasigeeni-ilmentymisen indusoimiseksi sorbitolialustalla. Viljelmien käsittely 10 mM DTTdla aloitettiin 40 h:n kasvatuksen jälkeen. Myseelinäytteitä RNAn eristämistä varten kerättiin ja niille tehtiin Northem-30 analyysi esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Viljelmien kuivapaino mitattiin ennen ja jälkeen soforoosi-induktion ja DTT-käsittelyn suodattamalla ja kuivaamalla myseelinäytteet 105 °C:ssa vakiopainoon (24 h). Viljelmien kuivapaino oli 1,1-1,4 g/1 DTT-käsittelyn alussa.

30

Reportterigeenin aktiivisuus cbhl-promoottorin alaisuudessa DTT-käsittelyn aikana

Reportterigeenijäijestelmää käytettiin sen tutkimiseksi, oliko mRNA-tason palautesäätely osallisena olevan geenin promoottorisekvenssin välittämä. Reportterigeeni-ilmentämiskasettien kaavakuva esitetään kuviossa 13A. E. colin IacZ-geeni ilmennettiin 5 cbhl -promoottorin alaisena T. reesei -kannassa, joko täyspituisen 2,2 kb:n cbhl- promoottorin alaisena tai 161 bp:n minimaalisen promoottorin alaisena, ja ilmentymistasot tutkittiin kantojen DTT-käsittelyn aikana. /anZ-signaalin kvantitointi gpdl:n signaalin kanssa normalisoituna esitetään kuviossa 13B. IacZ:n transkriptitaso on alaspäinsäädelty DTT-käsittelyn aikana vain ilmennettäessä täyspituisen cbhl-promoottorin alaisena. 10 Mitään alaspäinsäätelyä ei kuitenkaan havaittu, jos otaksutun TATA-elementin ja transkription aloituskohdat sisältävää minimaalista cbh 1-promoottoria käytettiin lacZ-ilmentämiseen, vaikka lyhyt promoottori on funktionaalinen ja jopa indusoitavissa soforoosilla. egll:n transkriptitaso analysoitiin molemmissa näistä kannoista sen kontrolloimiseksi, että alaspäinsäätelymekanismi on funktionaalinen näissä kannoissa 15 näissä olosuhteissa. Tulos osoittaa, että alaspäinsäätely edellyttää sekvenssielementtejä cbh 1 -promoottorissa, ja muu mekanismi kuin mRNAn pysymättömyys on osallisena prosessissa.

ESIMERKKI 6. cbhhn ilmentyminen T. reesei QM9414:n ja sen johdannaisen, jossa 20 on deleetio geenissä acel, viljelmissä

Sellulaasisäätelijän acel mahdollisen roolin tutkimiseksi sellulaasipromoottorien alaspäinsäätelyssä eritysstressin olosuhteissa T. reesei QM9414:n ja kannan johdannaisen, jossa oli deleetio geenissä acel (Saloheimo et ai. 2000), viljelmiä käsiteltiin DTT:lla ja 25 analysoitiin sellulaasin ilmentymisen osalta. Kannat kasvatettiin sorbitolia sisältävässä alustassa, indusoitiin soforoosilla, ja käsiteltiin 10 mM DTTrlla esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Myseelinäytteenotto RNA-analyysiä varten sekä Northem-analyysit on kuvattu myös esimerkeissä 1 ja 5. cbhl·.n transkriptitaso kvantitoitiin käsittelyn aikana ja signaalit normalisoitiin gpdl: signaalien kanssa (kuvio 14).

30 cbhl on alaspäinsäätelyn alainen DTT-käsittelyn aikana QM9414:n viljelmissä samalla tavalla kuin on osoitettu kannalle T. reesei Rut-C30 (esimerkki 1). Kuitenkin kannan QM9414, jossa on deleetio acel·.ssa, kasvatettuna sorbitolipitoisissa viljelmissä cbhl ilmentyy konstitutiivisesti myös DTT-käsittelyn aikana. Näissä spesifisissä olosuhteissa 31 näyttää acel-aktiivisuutta vaadittavan cbh 1 -promoottorin alaspäinsäätelemiseksi. Meillä on kuitenkin todisteita siitä, että muissa viljelyolosuhteissa (esim. glyserolia sisältävällä alustalla) acel-aktiivisuutta ei vaadita, mikä osoittaa että muut vielä tuntemattomat tekijät ovat osallisina tässä säätelymekanismissa.

5

Viitteet

Alberini, C. M., Bet, P., Milstein, C. & Sitia, R. (1990). Secretion of immunoglobulin M assembly intermediates in the presence of reducing agents. Nature 347, 485-487.

10 Archer, D.B, Jeenes, DJ, MacKenzie, D.A., Brightwell, G., Lambert, N., Lowe, G., Radford, S.E. and Dobson, C.M. 1990. Hen egg white lysozyme expressed in, and secreted from, Aspergillus niger is correctly processed and folded. Bio/Technology 8: 741 - 745. Archer, D. B. & Peberdy, J. F. (1997). The molecular biology of secreted enzyme production by fungi. Cri. Rev Biotechnol 17, 273-306 15 Bailey, M.J. and Nevalainen, K.M.H. (1981) Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing cellulase. Enzyme Microb. Technol. 3, 153-157.

Braakman, I, Helenius, J. & Helenius, A. (1992). Manipulating disulphide bond formation and protein folding in the endoplasmic reticulum,. EMBOJ11, 1717-1722.

20 Boel, E., Hansen, M.T., Hjort, I., Hoegh, I. and Fill, N.P. 1984. Two different types of intervening sequences in the glucoamylase gene from Aspergillus niger. EMBO Journal 3: 1581 - 1585.

Broström, C. 0., Chin, K. V., Wong, W. L., Cade, C. and Broström, M. A. (1989) Inhibition of translational initiation in eucaryotic cells by calcium ionophore. J. Biol. 25 Chem. 264, 1644-1649.

Fidel, S., Doonan, J.H. and Morris, N.R. 1988. Aspergillus nidulans contains a single actin gene that has unique intron locations and encodes gamma actin. Gene 70: 283 - 293. van Gemeren, I.A., Punt, P.J., Drint-Kuyvenhoven, A., Broekhuijsen, M.P., van’t Hoog, A., Beijersbergen, A., Verrips, C.T. and van den Hondel, C.A.M.J.J. 1997. The ER 30 chaperone encoding bipA of black Aspergilli is induced by heat shock and unfolded proteins. Gene 198: 43 — 52.

Gouka, R. J., Punt, P. J. & van den Hondel, C. A. M. J. J. (1997). Efficient production of secreted proteins by Aspergillus: progress, limitations and prospects. Appi Microbiol Biotechnol 47, 1 -11.

32

Harding, H.P., Zhang, Y.H. and Ron, D. 1999. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic reticulum-resident kinase. Nature 397: 271 - 274. van Hartingsveldt, W., Mattem, I.E., van Zeijl, C.M., Pouwels, P.H. and van den Hondel, C.A.M.J.J. 1987. Development of a homologous transformation system for Aspergillus 5 niger based on thepyrG gene. Molecular and General Genetics 206: 71 - 75.

Ilmen, M., Onnela, M.- L., Klemsdal, S., Keränen, S. & Penttilä, M. (1996). Functional analysis of the cellobiohydrolase I promoter of the filamentous fungus Trichoderma reesei. Mol Gen Genet 253, 303-314.

IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) (1987) Measurement of 10 cellulase activities. Pure and Appi. Chem. 59, 257-268.

Jämsä, E., Simonen, M. & Makarow, M. (1994). Selective retention of secretory proteins in the yeast endoplasmic reticulum by treatment of cells with a reducing agent. Yeast 10, 355-370.

Mori, K. 2000. Tripartite management of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum. 15 Cell 101:451 -454.

Lodish, H. F. and Kong, N. (1990). Perturbation of cellular calcium blocks exit of secretory proteins from the rough endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 265, 10893-10899.

Lodish, H. F., Kong, N., and Wikström, L. (1992) Calcium is required for folding of newly 20 made subunits of the asialoglycoprotein receptor within the endoplasmic reticulum. J. Biol. Chem. 267, 12753-12760.

MacKenzie, D. A., Jeenes, D. J., Belshaw, N. J., and Archer, D. B. (1993) Regulation of secreted protein production by fdamentous fungi: recent development and perspectives. J. Gen. Microbiol. 139, 2295-2307.

25 Mandels, M., Weber, J., and Parizek, R. (1971) Enhanced cellulase production by a mutant of Trichoderma viride. Appi. Microbiol. 21, 152-154.

Margolles-Clark, E., Hayes, C.K., Harman, G. And Penttilä, M. (1996) Improved production of Trichoderma harzianum endochitinase by expression in Trichoderma reesei. Appi. Env. Microbiol. 62, 2145-2151.

30 Margolles-Clark, E., Ιΐηιέη, M. and Penttilä, M. (1997) Expression patterns of ten hemicellulase genes of the filamentous fungus Trichoderma reesei on various carbon sources. J Biotechnol. 57, 167-179.

Montenecourt, B. S. & Eveleigh, D. E. (1979). Selective screening methods for the isolation of high yielding cellulase mutants of Trichoderma reesei. Adv Chem Ser 181, 289-301.

33

Ngiam, C., Jeenes, D.J. and Archer, D.B. 1997. Isolation and characterisation of a gene 5 encoding protein disulphide isomerase, pdiA, from Aspergillus niger. Current Genetics 31: 133 - 138.

Ngiam, C., Jeenes, D.J., Punt, P.J., van den Hondel, C.A.M.J.J. and Archer, D.B. 2000. Characterisation of a foldase, PDIA, in the secretory pathway of Aspergillus niger. Applied and Environmental Microbiology 66:775-782.

10 Pakula, T. M., Uusitalo, J., Saloheimo, M., Salonen, K., Aarts, J., and Penttilä, M. (2000) Monitoring the kinetics of glycoprotein synthesis and secretion in the filamentous fungus Trichoderma reesei: cellobiohydrolase I (CBHI) as a model protein. Microbiology 146, 223-232.

Pelham, H. R. B. (1991) Multiple targets for Brefeldin A. Cell 67, 449-451.

15 Penttilä, M., Nevalainen, H., Rättö, M., Salminen, E., and Knowles, J. K. C. (1987) Gene 61, 155-164.

Penttilä, M. (1998). Heterologous protein production in Trichoderma. In Trichoderma & Gliocladium, pp. 365-382. Edited by G. E. Harman & C. P. Kubicek. London: Taylor & Francis LTD.

20 Saloheimo; A., Aro, N., Ilmen, M. and Penttilä, M. (2000) Isolation of the acel gene encoding a Cys2-His2 transcription factor involved in regulation of activity of the cellulase promoter cbhl of Trichoderma reesei. J. Biol. Chem. 275, 5817-5825.

Saloheimo, M., Lund, M. & Penttilä, M. (1999) The protein disulphide isomerase gene of the fungus Trichoderma reesei is induced by endoplasmic reticulum stress and regulated 25 by the carbon source. Mol Gen Genet 262, 35-45.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press (New York).

Shah, N. and Klausner, R. D. (1993) Brefeldin A reversibly inhibits secretion in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 268, 5345-5348.

30 Shamu, C.E., Cox, J.S. and Walter, P. 1994. The unfolded protein response pathway in yeast. Trends in Cell Biology 4: 56 — 60.

Veldhuisen, G., Saloheimo, M., Fiers, M. A., Punt, P. J., Contreras, R., Penttilä, M. & van den Hondel, C. A. M. J. J. (1997). Isolation and analysis of functional homologues of the 34 secretion-related SARI gene of Saccharomyces cerevisiae from Aspergillus niger and Trichoderma. Mol Gen Genet 256, 446-455.

Verheijen, J.H., Caspers, Chang, G.T.G., de Munk, G.A.W., Pouwels, P.H., and

Enger-Valk, B.E. (1986) Involvement of finger domain and kringle 2 domain of tissue-type 5 plasminogen activator in fibrin binding and stimulation of activity by fibrin. EMBO J. 5, 3525-3530.

Organization Applicant

Street : Vuorimiehentie 5 City : ESPOO State : VTT Country : FINLAND PostalCode : 02044 PhoneNumber :

FaxNumber :

EmailAddress : <110> OrganizationName : Valtion teknillinen tutkimuskeskus Application Project <120> Title : Parannettu menetelmä erittyvien proteiinien tuottamiseksi <130> AppFileReference : VTT113 <140> CurrentAppNumber : FI 20010272 <141> CurrentFilingDate : 2001-02-13

Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggcactcatt cccgaaaaaa ctcggagatt 960 cctaagtagc gatggaaccg gaataatata ataggcaata cattgagttg cctcgacggt 1020 tgcaatgcag gggtactgag cttggacata actgttccgt accccacctc ttctcaacct 1080 ttggcgtttc cctgattcag cgtacccgta caagtcgtaa tcactattaa cccagactga 1140 ccggacgtgt tttgcccttc atttggagaa ataatgtcat tgcgatgtgt aatttgcctg 1200 2 cttgaccgac tggggctgtt cgaagcccga atgtaggatt gttatccgaa ctctgctcgt 1260 agaggcatgt tgtgaatctg tgtcgggcag gacacgcctc gaaggttcac ggcaagggaa 1320 accaccgata gcagtgtcta gtagcaacct gtaaagccgc aatgcagcat cactggaaaa 1380 tacaaaccaa tggctaaaag tacataagtt aatgcctaaa gaagtcatat accagcggct 1440 aataattgta caatcaagtg gctaaacgta ccgtaatttg ccaacggctt gtggggttgc 1500 agaagcaacg gcaaagcccc acttccccac gtttgtttct tcactcagtc caatctcagc 1560 tggtgatccc ccaattgggt cgcttgtttg ttccggtgaa gtgaaagaag acagaggtaa 1620 gaatgtctga ctcggagcgt tttgcataca accaagggca gtgatggaag acagtgaaat 1680 gttgacattc aaggagtatt tagccaggga tgcttgagtg tatcgtgtaa ggaggtttgt 1740 ctgccgatac gacgaatact gtatagtcac ttctgatgaa gtggtccata ttgaaatgta 1800 agtcggcact gaacaggcaa aaga 1824 <212> Type : DNA <211> Length : 1824

SequenceName : SEQIDNO:l SequenceDescription :

Custom Codon

Sequence Name : SEQIDNO:l Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 3 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggcactcatt cccgaaaaaa ctcggagatt 960 cctaagtagc gatggaaccg gaataatata ataggcaata cattgagttg cctcgacggt 1020 tgcaatgcag gggtactgag cttggacata actgttccgt accccacctc ttctcaacct 1080 ttggcgtttc cctgattcag cgtacccgta caagtcgtaa tcactattaa cccagactga 1140 ccggacgtgt tttgcccttc atttggagaa ataatgtcat tgcgatgtgt aatttgcctg 1200 cttgaccgac tggggctgtt cgaagcccga atgtaggatt gttatccgaa ctctgctcgt 1260 agaggcatgt tgtgaatctg tgtcgggcag gacacgcctc gaaggttcac ggcaagggaa 1320 accaccgata gcagtgtcta gtagcaacct gtaaagccgc aatgcagcat cactggaaaa 1380 tacaaaccaa tggctaaaag tacataagtt aatgcctaaa gaagtcatat accagcggct 1440 aataattgta caatcaagtg gctaaacgta ccgtaatttg ccaacggctt gtggggttgc 1500 agaagcaacg gcaaagcccc acttccccac gtttgtttct tcactcagtc caatctcagc 1560 tggtgatccc ccaattgggt cgcttgtttg ttccggtgaa gtgaaagaag acagaggtaa 1620 gaatgtctga ctcggagcgt tttgcataca accaagggca gtgatggaag acagtgaaat 1680 gttgacattc aaggagtatt tagccaggga tgcttgagtg tatcgtgtaa ggaggtttgt 1740 ctgccgatac gacgaatact gtatagtcac ttctgatgaa gtggtccata ttgaaatgta 1800 agtcggcact gaacaggcaa aagattgagt tgaaactgcc taagatctcg ggccctcggg 1860 ccttcggcct ttgggtgtac atgtttgtgc tccgggcaaa tgcaaagtgt ggtaggatcg 1920 aacacactgc tgcctttacc aagcagctga gggtatgtga taggcaaatg ttcaggggcc 1980 actgcatggt ttcgaataga aagagaagct tagccaagaa caatagc 2027 <212> Type : DNA <211> Length : 2027

SequenceName : SEQIDNO:2 SequenceDescription :

Custom Codon

Sequence Name : SEQIDNO:2 Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 4 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggcactcatt cccgaaaaaa ctcggagatt 960 cctaagtagc gatggaaccg gaataatata ataggcaata cattgagttg cctcgacggt 1020 tgcaatgcag gggtactgag cttggacata actgttccgt accccacctc ttctcaacct 1080 ttggegtttc cctgattcag cgtacccgta caagtcgtaa tcactattaa cccagactga 1140 ccggacgtgt tttgcccttc atttggagaa ataatgtcat tgcgatgtgt aatttgcctg 1200 cttgaccgac tggggctgtt cgaagcccga atgtaggatt gttatccgaa ctctgctcgt 1260 agaggcatgt tgtgaatctg tgtcgggcag gacacgcctc gaaggttcac ggcaagggaa 1320 accaccgata gcagtgtcta gtagcaacct gtaaagccgc aatgcagcat cactggaaaa 1380 tacaaaccaa tggctaaaag tacataagtt aatgcctaaa gaagtcatat accagcggct 1440 aataattgta caatcaagtg gctaaacgta ccgtaatttg ccaacggctt gtggggttgc 1500 agaagcaacg gcaaagcccc acttccccac gtttgtttct tcactcagtc caatctcagc 1560 tggtgatccc ccaattgggt cgcttgtttg ttccggtgaa gtgaaagaag acagaggtaa 1620 gaatgtctga ctcggagcgt tttgcataca accaagggca gtgatggaag acagtgaaat 1680 gttgacattc aaggagtatt tagccaggga tgcttgagtg tatcgtgtaa ggaggtttgt 1740 ctgccgatac gacgaatact gtatagtcac ttctgatgaa gtggtccata ttgaaatgta 1800 agtcggcact gaacaggcaa aagattgagt tgaaactgcc taagatctcg ggccctcggg 1860 ccttcggcct ttgggtgtac atgtttgtgc tccgggcaaa tgcaaagtgt ggtaggatcg 1920 aacacactgc tgcctttacc aagcagctga gggtatgtga taggcaaatg ttcaggggcc 1980 actgcatggt ttcgaataga aag 2003 <212 > Type : DNA <211> Length : 2003

SequenceName : SEQIDNO:3 SequenceDescription :

Custom Codon 5

Sequence Name : SEQIDN0:3 Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggcactcatt cccgaaaaaa ctcggagatt 960 cctaagtagc gatggaaccg gaataatata ataggcaata cattgagttg cctcgacggt 1020 tgcaatgcag gggtactgag cttggacata actgttccgt accccacctc ttctcaacct 1080 ttggcgtttc cctgattcag cgtacccgta caagtcgtaa tcactattaa cccagactga 1140 ccggacgtgt tttgcccttc atttggagaa ataatgtcat tgcgatgtgt aatttgcctg 1200 cttgaccgac tggggctgtt cgaagcccga atgtaggatt gttatccgaa ctctgctcgt 1260 agaggcatgt tgtgaatctg tgtcgggcag gacacgcctc gaaggttcac ggcaagggaa 1320 accaccgata gcagtgtcta gtagcaacct gtaaagccgc aatgcagcat cactggaaaa 1380 tacaaaccaa tggctaaaag tacataagtt aatgcctaaa gaagtcatat accagcggct 1440 aataattgta caatcaagtg gctaaacgta ccgtaatttg ccaacggctt gtggggttgc 1500 agaagcaacg gcaaagcccc acttccccac gtttgtttct tcactcagtc caatctcagc 1560 tggtgatccc ccaattgggt cgcttgtttg ttccggtgaa gtgaaagaag acagaggtaa 1620 gaatgtctga ctcggagcgt tttgcataca accaagggca gtgatggaag acagtgaaat 1680 6 gttgacattc aaggagtatt tagccaggga tgcttgagtg tatcgtgtaa ggaggtttgt 1740 ctgccgatac gacgaatact gtatagtcac ttctgatgaa gtggtccata ttgaaatgta 1800 agtcggcact gaacaggcaa aagattgagt tgaaactgcc taagatctcg ggccctcggg 1860 ccttcggcct ttgg 1874 <212> Type : DNA <211> Length : 1874

SequenceName : SEQIDNO:4 SequenceDescription :

Custom Codon

Sequence Name : SEQIDNO:4 Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggcactcatt cccgaaaaaa ctcggagatt 960 cctaagtagc gatggaaccg gaataatata ataggcaata cattgagttg cctcgacggt 1020 tgcaatgcag gggtactgag cttggacata actgttccgt accccacctc ttctcaacct 1080 ttggcgtttc cctgattcag cgtacccgta caagtcgtaa tcactattaa cccagactga 1140 ccggacgtgt tttgcccttc atttggagaa ataatgtcat tgcgatgtgt aatttgcctg 1200 cttgaccgac tggggctgtt cgaagcccga atgtaggatt gttatccgaa ctctgctcgt 1260 7 agaggcatgt tgtgaatctg tgtcgggcag gacacgcctc gaaggttcac ggcaagggaa 1320 accaccgata gcagtgtcta gtagcaacct gtaaagccgc aatgcagcat cactggaaaa 1380 tacaaaccaa tggctaaaag tacataagtt aatgcctaaa gaagtcatat accagcggct 1440 aataattgta caatcaagtg gctaaacgta ccgtaatttg ccaacggctt gtggggttgc 1500 agaagcaacg gcaaagcccc acttccccac gtttgtttct tcactcagtc caatctcagc 1560 tggtgatccc ccaattgggt cgcttgtttg ttccggtgaa gtgaaagaag acagaggtaa 1620 gaatgtctga ctcggagcgt tttgcataca accaagggca gtgatggaag acagtgaaat 1680 gttgacattc aaggagtatt tagccaggga tgcttgagtg tatcgtgtaa ggaggtttgt 1740 ctgccgatac gacgaatact gtatagtcac ttctgatgaa gtggtccata ttgaaatgta 1800 agtcggcact gaacaggcaa aagattgagt tgaaactgcc taagatctcg ggccctcggg 1860 ccttcggcct ttgggtgtac atgtttgtgc tccgggcaaa tgcaaagtgt ggtaggatcg 1920 aacacactgc tgcctttacc aagcagctga gggtatgtga taggcaaatg ttcaggggcc 1980 actgcatggt ttcgaataga aagagaagct tagccaagaa caatagccga taaagatagc 2040 ctcattaaac gga 2053 <212> Type : DNA <2ll> Length : 2053

SequenceName : SEQlDNO:5 SequenceDescription :

Custom Codon

Sequence Name : SEQIDNO:5 Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 8 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggca 934 <212> Type : DNA <211> Length : 934

SequenceName : SEQIDNO:6 SequenceDescription :

Custom Codon

Sequence Name : SEQIDNO:6 Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggcactcatt cccgaaaaaa ctcggagatt 960 cctaagtagc gatggaaccg gaataatata ataggcaata cattgagttg cctc 1014 <212> Type : DNA <211> Length : 1014

SequenceName : SEQIDNO:7 SequenceDescription :

Custom Codon 9

Sequence Name : SEQIDN0:7 Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggcactcatt cccgaaaaaa ctcggagatt 960 cctaagtagc gatggaaccg gaataatata ataggcaata cattgagttg cctcgacggt 1020 tgcaatgcag gggtactgag cttggacata actgttccgt accccacctc ttctcaacct 1080 ttggcgtttc cctgattcag cgtacccgta caagtcgtaa tcactattaa cccagactga 1140 ccggacgtgt tttgcccttc atttggagaa ataatgtcat tgcgatgtgt aatttgcctg 1200 cttgaccgac tggggctgtt cgaagcccga atgtaggatt gttatccgaa ctctgctcgt 1260 agaggcatgt tgtgaatctg tgtcgggcag gacacgcctc gaaggttcac ggcaagggaa 1320 accaccgata gcagtgtcta gtagcaacct gtaaagccgc aatgcagcat cactggaaaa 1380 tacaaaccaa tggctaaaag tacataagtt aatgcctaaa gaagtcatat accagcggct 1440 aataattgta caatcaagtg gctaaacgta ccgtaatttg ccaacggctt gtggggttgc 1500 agaagcaacg gcaaagcccc acttccccac gtttgtttct tcactcagtc caatctcagc 1560 tggtgatccc ccaattgggt cgcttgtttg ttccggtgaa gtgaaagaag acagaggtaa 1620 gaatgtctga ctcggagcgt tttgcataca accaagggca gtgatggaag acagtgaaat 1680 10 gttgacattc aaggagtatt tagccaggga tgct 1714 <212> Type : DNA <211> Length : 1714

SequenceName : SEQIDNO:8 SeguenceDescription :

Custom Codon

Sequence Name : SEQIDNO:8 Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggcactcatt cccgaaaaaa ctcggagatt 960 cctaagtagc gatggaaccg gaataatata ataggcaata cattgagttg cctcgacggt 1020 tgcaatgcag gggtactgag cttggacata actgttccgt accccacctc ttctcaacct 1080 ttggcgtttc cctgattcag cgtacccgta caagtcgtaa tcactattaa cccagactga 1140 ccggacgtgt tttgcccttc atttggagaa ataatgtcat tgcgatgtgt aatttgcctg 1200 cttgaccgac tggggctgtt cgaagcccga atgtaggatt gttatccgaa ctctgctcgt 1260 agaggcatgt tgtgaatctg tgtcgggcag gacacgcctc gaaggttcac ggcaagggaa 1320 accaccgata gcagtgtcta gtagcaacct gtaaagccgc aatgcagcat cactggaaaa 1380 tacaaaccaa tggctaaaag tacataagtt aatgcctaaa gaagtcatat accagcggct 1440 aataattgta caatcaagtg gctaaacgta ccgt 1474 11 <212> Type : DNA <211> Length : 1474

SequenceName : SEQIDN0:9 SequenceDescription :

Custom Codon

Sequence Name : SEQIDN0:9 Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggcactcatt cccgaaaaaa ctcggagatt 960 cctaagtagc gatggaaccg gaataatata ataggcaata cattgagttg cctcgacggt 1020 tgcaatgcag gggtactgag cttggacata actgttccgt accccacctc ttctcaacct 1080 ttggcgtttc cctgattcag cgtacccgta caagtcgtaa tcactattaa cccagactga 1140 ccggacgtgt tttgcccttc atttggagaa ataatgtcat tgcgatgtgt aatttgcctg 1200 cttgaccgac tggggctgtt cgaagcccga atgtaggatt gttatccgaa ctctgctcgt 1260 agaggcatgt tgtgaatctg tgtcgggcag gacacgcctc gaaggttcac ggcaagggaa 1320 accaccgata gcagtgtcta gtag 1344 <212> Type : DNA <211> Length : 1344

SequenceName : SEQIDNO:10 SequenceDescription : 12

Custom Codon

Sequence Name : SEQIDNO:10 Sequence <213> OrganismName : Trichoderma reesei <400> PreSequenceString : gaattctcac ggtgaatgta ggccttttgt agggtaggaa ttgtcactca agcaccccca 60 acctccatta cgcctccccc atagagttcc caatcagtga gtcatggcac tgttctcaaa 120 tagattgggg agaagttgac ttccgcccag agctgaaggt cgcacaaccg catgatatag 180 ggtcggcaac ggcaaaaaag cacgtggctc accgaaaagc aagatgtttg cgatctaaca 240 tccaggaacc tggatacatc catcatcacg cacgaccact ttgatctgct ggtaaactcg 300 tattcgccct aaaccgaagt gcgtggtaaa tctacacgtg ggcccctttc ggtatactgc 360 gtgtgtcttc tctaggtggc attcttttcc cttcctctag tgttgaattg tttgtgttgg 420 agtccgagct gtaactacct ctgaatctct ggagaatggt ggactaacga ctaccgtgca 480 cctgcatcat gtatataata gtgatcctga gaaggggggt ttggagcaat gtgggacttt 540 gatggtcatc aaacaaagaa cgaagacgcc tcttttgcaa agttttgttt cggctacggt 600 gaagaactgg atacttgttg tgtcttctgt gtatttttgt ggcaacaaga ggccagagac 660 aatctattca aacaccaagc ttgctctttt gagctacaag aacctgtggg gtatatatct 720 agagttgtga agtcggtaat cccgctgtat agtaatacga gtcgcatcta aatactccga 780 agctgctgcg aacccggaga atcgagatgt gctggaaagc ttctagcgag cggctaaatt 840 agcatgaaag gctatgagaa attctggaga cggcttgttg aatcatggcg ttccattctt 900 cgacaagcaa agcgttccgt cgcagtagca ggcactcatt cccgaaaaaa ctcggagatt 960 cctaagtagc gatggaaccg gaataatata ataggcaata cattgagttg cctcgacggt 1020 tgcaatgcag gggtactgag cttggacata actgttccgt accccacctc ttctcaacct 1080 ttggcgtttc cctgattcag cgtacccgta caagtcgtaa tcactattaa cccagactga 1140 ccggacgtgt tttgcccttc atttggagaa ataatgtcat tgcg 1184 <212> Type : DNA <211> Length : 1184

SequenceName : SEQIDNO:ll SequenceDescription :

Custom Codon

Sequence Name : SEQIDNO:ll

Claims (26)

35

1. Menetelmä promoottorin valmistamiseksi parantunutta proteiinin tuotantoa varten sieni-isännässä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: 5. valitaan erittyvän proteiinin promoottori joukosta, joka käsittää cbhl:n, cbh2:n, egll:n, egl2:n, hft>l\n, hft>2\n, xynl:n, swo:n, gla:n, amy:n, japepA:n promoottorin; - modifioidaan promoottoria geneettisesti, joko muuttamalla promoottorissa olevia transkriptionaalista alaspäinsäätelyä välittäviä DNA-sekvenssejä siten, että promoottori ei ole säädelty alaspäin samalla tavoin kuin muuntamaton promoottori, 10 tai mutatoimalla ja sen jälkeen seulomalla muuntuneet promoottorit, jotka eivät ole alaspäin säädeltävissä samoin kuin muuntamaton promoottori; - liitetään promoottori toiminnallisesti reportteriproteiinin koodaavaan alueeseen; ilmennetään valittu reportteriproteiini modifioidun promoottorin säätelyn alaisuudessa sieni-isännässä kasvatusolosuhteissa, joissa isännän proteiinien eritys 15 on estetty tai heikennetty tai joissa isännän erityskapasiteetti on rajoittunut tai eritysreitti ylikuormittunut; - seulotaan tai valikoidaan soluja, joissa valittujen reportteriproteiinien ilmentyminen on lisääntynyt tai alentunut verrattuna ilmentymiseen, joka saadaan muuttamattomalla promoottorilla samoissa kasvatusolosuhteissa; 20. otetaan talteen sieni-isäntä, joka käsittää promoottorin, jonka transkriptionaalista alaspäinsäätelyä on modifioitu.

2. Menetelmä sieni-isännän valmistamiseksi parannettua proteiinin tuotantoa varten, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet 25. valitaan patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä saatu promoottori; - liitetään promoottori toiminnallisesti erittyvää proteiinia koodaavan geenin koodaavaan alueeseen; - ilmennetään valittu erittyvä proteiini modifioidun promoottorin säätelyn alaisuudessa sieni-isännässä sopivissa erittyvien proteiinien tuottoa indusoivissa kasvatusolosuhteissa, 30 joissa esiintyy eritysstressiä erityskapasiteetin rajoittavuuden tai eritysreitin ylikuormituksen vuoksi; - valitaan tai selektoidaan solut, joilla valittujen erittyvien proteiinien ilmentyminen on lisääntynyt tai vähentynyt verrattuna erittyvän proteiinin ilmentymiseen modifioimattoman promoottorin alaisuudessa samoissa olosuhteissa; ja 36 - otetaan talteen sieni-isäntä, joka käsittää promoottorin, jonka transkriptionaalista alaspäinsäätelyä on modifioitu.

3. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5 modifioitu alue sijaitsee ylävirtaan Trichoderma cbhl- promoottorin kohdasta -162.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että modifioitu alue sijaitsee Trichoderma cbhl- promoottorin nukleotidien -1031 ja -162 välissä. 10

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että modifioitu alue sijaitsee Trichoderma cbhl- promoottorin nukleotidien -1031 ja -501 välissä.

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että modifioitu alue sijaitsee Trichoderma cbhl- promoottorin nukleotidien -341 ja -211 välissä.

7. Menetelmä sieni-isäntäkannan valmistamiseksi proteiinin tuotantoa varten tunnettu 20 siitä, että - modifioidaan geneettisesti acel- säätelytekijää koodaavaa geeniä, joka sitoutuu erittyvää proteiinia koodaavan geenin promoottoriin tai joka välittää säätelysignaalin ilmennettäessä valittua erittyvää proteiinia tai acel-geenin ilmentymistä sieni-isännässä; - ilmennetään valittu erittyvä proteiini modifioidussa sieni-isännässä sopivissa erittyvien 25 proteiinien tuottoa indusoivissa kasvatusolosuhteissa, joissa esiintyy eritysstressiä erityskapasiteetin rajoittavuuden tai eritysreitin ylikuormituksen vuoksi; ja - valitaan tai selektoidaan solut, joilla valittujen erittyvien proteiinien ilmentyminen on lisääntynyt tai vähentynyt verrattuna erittyvän proteiinin ilmentymiseen modifioimattomassa isännässä samoissa olosuhteissa; ja 30. otetaan talteen sieni-isäntä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että säätelymekanismit välittävät proteiineja, jotka valitaan ryhmästä, joka sisältää sellulaasit, hemisellulaasit, amylolyytiset entsyymit, hydrofobiinit, swolleniinit, proteaasit, invertaasit, fytaasit, 37 fosfataasit, ligninolyyttiset entsyymit, ja pektinaasit, koodaavien geenien transkriptionaalista alaspäinsäätelyä.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5 säätelymekanismit välittävät proteiinien, jotka valitaan ryhmästä, joka sisältää geenien cbhl, cbh2, egll, egl2, hfbl, hfl>2, xynl, swo, gla, amy, ja pepA koodaamat proteiinit, transkriptionaalista alaspäinsäätelyä.

10. Jonkin patenttivaatimuksen 7-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sieni-10 isäntä on saatu jollakin patenttivaatimuksen 2-6 mukaisella menetelmällä.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 7-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että acel geenin ilmentymistä tai aktiivisuutta on alennettu tai se on poistettu.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 7-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että acel geenin ilmentymistä ja aktiivisuutta on vahvistettu tai lisätty.

13. Jonkin patenttivaatimuksen 7-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kanta valitaan ryhmästä, joka käsittää Aspergillus spp., Trichoderma spp., Neurospora spp.,

14. Jonkin patenttivaatimuksen 7-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kanta 25 kuuluu lajeihin Aspergillus spp. or Trichoderma spp.

15. Jonkin patenttivaatimuksen 7-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kanta kuuluu lajeihin A. niger tai T. reesei.

16. Menetelmä homologisten erittyvien proteiinien ylituottamiseksi tai heterologisten erittyvien proteiinien tuottamiseksi sienissä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: 38 - liitetään patenttivaatimuksen 1 tai jonkin patenttivaatimuksen 3-6 mukaisesti saatu promoottori toiminnallisesti valittua erittyvää proteiinia koodaavan geenin koodaavaan alueeseen, joka promoottori on valittu tai selektoitu lisääntyneen proteiinin ilmentymisen perusteella; ja 5. ilmennetään valittu erittyvä proteiini mainitun promoottorin säätelyn alaisuudessa sieni-isännässä sopivissa viljelyolosuhteissa; tai ilmennetään valittu erittyvä proteiini sieni-isännässä, joka on saatu jollakin patenttivaatimuksen 7-15 mukaisella menetelmällä, jolloin mainittu sieni-isäntä on valittuja selektoitu lisääntyneen proteiinin ilmentymisen perusteella; ja 10 - otetaan proteiinituote talteen isännän viljelyalue tästä.

17. Menetelmä homologisten erittyvien proteiinien vähäisemmäksi tuottamiseksi sienissä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: liitetään patenttivaatimuksen 1 tai jonkin patenttivaatimuksen 3-6 mukaisesti 15 saatu promoottori toiminnallisesti valittua erittyvää proteiinia koodaavan geenin koodaavaan alueeseen, joka promoottori on valittu tai selektoitu vähentyneen proteiinin ilmentymisen perusteella; ja - ilmennetään valittu erittyvä homologinen proteiini promoottorin säätelyn alaisuudessa sieni-isännässä sopivissa viljelyolosuhteissa; tai 20. ilmennetään valittu erittyvä homologinen proteiini sieni-isännässä, joka on saatu jollakin patenttivaatimuksen 7-15 mukaisella menetelmällä, jolloin mainittu sieni-isäntä on valittuja selektoitu vähentyneen proteiinin ilmentymisen perusteella.

18. Patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen menetelmä, t u n e 11 u siitä, että proteiinituote 25 valitaan ryhmästä, joka käsittää bakteereista tai alemmista tai korkeammista eukaryooteista peräisin olevat proteiinit, kuten sellulaasin, hemisellulaasin, amylolyyttisen entsyymin, hydrofobiinin, proteaasin, invertaasin, fytaasin, fosfataasin, ligninolyyttisen entsyymin, pektinaasin, immunoglobuliinin tai tPA:n.

19. Menetelmä erittyvien proteiinien optimoiduksi tuottamiseksi sienissä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: - valitaan erittyvää proteiinia koodaava geeni; 39 - liitetään valittua erittyvää proteiinia koodaavan geenin koodaava alue toiminnallisesti promoottoriin, jota ei säädellä eritysstressiolosuhteissa, kuten gpdl-, gpdA-, cDNAl-, yptl-, sarl-, bgl2- geenin promoottoriin; - tuotetaan valittua proteiinia sopivissa viljelyolosuhteissa sieni-isännässä, joka 5 ylituottaa proteiineja, jotka vastaavat proteiinien ekspression alaspäin säätelystä eritysstressiolosuhteissa isännän erityskapasiteetin ollessa rajoittunut tai eritysreitin ollessa ylikuormittunut, kuten ACE1, tai sieni-isännässä, joka tuottaa näitä säätelytekijöitä, jotka vastaavat proteiinien ekspression alaspäin säätelystä eritysstressiolosuhteissa isännän erityskapasiteetin ollessa rajoittunut tai eritysreitin 10 ollessa ylikuormittunut, lisääntyneellä aktiivisuudella; ja - otetaan talteen valittu erittyvä proteiini isännän viljelyalustasta.

20. Menetelmä erittyvien proteiinien optimoiduksi tuottamiseksi sienissä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet: 15. valitaan erittyvää proteiinia koodaava geeni; - liitetään valittua erittyvää proteiinia koodaavan geenin koodaava alue toiminnallisesti promoottoriin, joka on saatu patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tai jonkin patenttivaatimuksen 3-6 mukaisella menetelmällä; - tuotetaan valittua proteiinia sopivissa viljelyolosuhteissa sieni-isännässä, joka 20 ylituottaa proteiineja, jotka vastaavat proteiinien ekspression alaspäin säätelystä eritysstressiolosuhteissa isännän erityskapasiteetin ollessa rajoittunut tai eritysreitin ollessa ylikuormittunut, kuten ACE1, tai sieni-isännässä, joka tuottaa näitä säätelytekijöitä, jotka vastaavat proteiinien ekspression alaspäin säätelystä eritysstressiolosuhteissa isännän erityskapasiteetin ollessa rajoittunut tai eritysreitin 25 ollessa ylikuormittunut, lisääntyneellä aktiivisuudella; ja - otetaan talteen valittu erittyvä proteiini isännän viljelyalustasta.

20 Fusarium spp., Penicillium spp., Humicola spp., Tolypocladium geodes, Kluyveromyces spp., Pichia spp., Hansenula spp., Candida spp., Yarrowia spp, Schizosaccharomyces ssp, Saccharomyces spp.

21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että promoottori on gpd- promoottori. 30

22. Jonkin patenttivaatimuksen 19-21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini välittää ACEI:n alaspäinsäätelyä. 40

23. DNA-sekvenssi, joka sijaitsee nukleotidien -1031 ja -162 välissä Trichoderman cbhl-promoottorista ylävirtaan (nukleotidit 1186 - 2053 sekvenssissä SEQ ID NO:5), joka välittää erittyvien proteiinien alaspäinsäätelyä eritysstressin alaisuudessa.

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että DNA- sekvenssi sijaitsee nukleotidien -1031 ja -501 välissä Trichoderman cbh 1 -promoottorista ylävirtaan (nukleotidit 1186 - 1714 sekvenssissä SEQ ID NO:5).

25. Patenttivaatimuksen 23 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että DNA-10 sekvenssi sijaitsee nukleotidien -1031 ja -501 välissä Trichoderman cbhl- promoottorista ylävirtaan (nukleotidit 1186 - 2004 sekvenssissä SEQ ID NO:5)

26. Jonkin patenttivaatimuksen 23 - 25 mukaisen DNA-sekvenssin käyttö modifioidussa muodossa valitun proteiinin lisääntyneeksi tai vähentyneeksi tuottamiseksi sieni-isännässä 15 erittyvien proteiinien tuottoa indusoivissa kasvatusolosuhteissa, joissa esiintyy eritysstressiä erityskapasiteetin rajoittavuuden tai eritysreitin ylikuormituksen vuoksi, jolloin DNA-sekvenssiä on modifioitu siten, että promoottori, jossa DNA-sekvenssi sijaitsee, ei ole säädelty alaspäin samalla tavoin kuin muuntamaton promoottori. 41