JP2004526440A - 真菌における分泌タンパク質の産生のための改良法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、改良されたタンパク質産生のためのプロモーターおよび真菌宿主に関する。本発明では、分泌ストレスの下で分泌タンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与する機構に対する応答に関してプロモーターを改変した。また、本発明は、真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法に関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌における分泌タンパク質の産生のための最適化された方法に関する。特に、本発明は、本方法で使用されるＤＮＡ配列、プロモーターおよび真菌宿主に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の真菌、特にトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）およびアスペルギルス・ニガーは、タンパク質生産のためにバイオテクノロジー産業で広く使用されている。通常、組換えタンパク質は、それが異種タンパク質であれ同種タンパク質であれ、真菌において分泌タンパク質をコードし大量に発現している遺伝子のプロモーター、例えばトリコデルマ・リーセイのプロモーターであるｃｂｈ１およびアスペルギルス・ニガーのプロモーターであるｇｌａなどの制御の下で産生される。トリコデルマ・リーセイおよびアスペルギルス・ニガーは、同種加水分解酵素を培地中に極めて効率的に産生するが、生産される異種タンパク質の収量は、同種タンパク質の収量に比べて通常かなり低い。特に、遠い種、例えば哺乳動物を起源とするタンパク質の産生は極めて低レベルである（ＡｒｃｈｅｒおよびＰｅｂｅｒｄｙ、１９９７、Ｐｅｎｔｔｉｌａ、１９９８）。低収率の理由としては、ポリペプチドの翻訳および分泌経路への移行が非効率なこと、タンパク質のフォールディングおよび輸送の妨害、ならびにｍＲＮＡが不安定で異種遺伝子の転写レベルが低いことなどが示唆されている（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ他１９９３、Ｇｏｕｋａ他１９９７）。
【０００３】
タンパク質フォールディングと輸送の障害は、異種タンパク質の産生中に起こりやすく、細胞中でストレス反応を誘導することが知られている。近年、細胞がタンパク質フォールディングおよびプロセシングのために特化された環境であるＥＲの内腔の状態を感知して正常の機能の動揺に対応することができる２つのフィードバック機構が報告されている。これらの機構はアンフォールドタンパク質応答（Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＵＰＲ）を構成し、この応答は、１つはＥＲの内腔におけるアンフォールドタンパク質の存在に反応してシャペロンおよびフォールディング触媒をコードする遺伝子の転写活性（Ｓｈａｍｕ他、１９９４）の増加であり、もう１つは真核生物の開始因子２αのリン酸化の増加でこれは細胞において翻訳活性をダウンレギュレートする（Ｈａｒｄｉｎｇ他、１９９９）。酵母および哺乳類細胞の小胞体におけるアンフォールドタンパク質に対する細胞応答が最近Ｍｏｒｉによって概説されている（２０００）。
【０００４】
しかしながら、これらのストレス条件において内因性分泌タンパク質をコードする遺伝子の転写制御についてはほとんど知られていない。特に、細胞のタンパク質をフォールディングし輸送する能力の限界に応じた分泌タンパク質をコードする遺伝子のフィードバック制御に関するデータは一切報告されていない。場合によっては、異種遺伝子が同時に発現された場合、内因性細胞外タンパク質をコードする遺伝子の転写物レベルは対照菌株における発現に比べて低いことが観察されている（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ他１９９６）。遺伝子の効率的な発現に必要な転写／制御因子の量が異種遺伝子の複数のコピーの発現中に不足するからではないかと説明されている。
【０００５】
分泌タンパク質をコードする遺伝子の様々な炭素源および窒素源における制御については糸状菌で詳細に検討されており、トリコデルマ・リーセイにおけるセルラーゼおよびヘミセルラーゼの発現がその好例である。トリコデルマ・リーセイでは、セルラーゼおよびヘミセルラーゼの発現は、環境要件および栄養素の利用可能性によく適応している。複雑な植物材料を含む培地では、（ヘミ）セルラーゼ遺伝子群は協調的に誘導されるが、特異的誘導機構も知られている（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ他１９９７）。セルロースおよびラクトースまたはソホロースなどのある種のオリゴ糖は、遺伝子の効率的インデューサーであることが知られている。グルコースの存在下では、セルラーゼおよびヘミセルラーゼの発現は異化代謝産物抑制（カタボライト・リプレッション）機構によって厳重に抑制されている。セルラーゼ遺伝子発現の制御に関与するいくつかの制御因子が単離されており、これにはグルコース・リプレッサー遺伝子ｃｒｅ１およびセルラーゼ遺伝子活性化因子として機能すると仮定されてきた遺伝子（ａｃｅ１およびａｃｅ２）が含まれる（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ他２０００）。
【０００６】
具体的に、ソホロースによって誘導されグルコースの存在によって抑制されない、タンパク質コード領域の上流にあるトリコデルマ・リーセイｃｂｈ１プロモーターのヌクレオチド配列からなる改変トリコデルマ・プロモーターが米国特許第６，００１，５９５号に記載されている。この公報は、−１８４から−１、−１６１から−１、−１４０から−１および−１６１から−１３３の領域について述べている。この公報は端を切り落としたｃｂｈ１の領域について記載しているが、それらをストレス条件下での分泌タンパク質の産生に使用することは提案していない。このプロモーターは、グルコースまたはソホロースの存在下でタンパク質を産生するように設計されている。国際特許出願ＷＯ９８／２３６４２はセルラーゼ制御因子ａｃｅ１およびａｃｅ２について記載し、タンパク質産生の活性化因子として使用することについて記載し、因子の過剰発現によるヘミ（セルラーゼ）発現の改良を示唆している。グルコース抑制解除をもたらす改変体は、ＷＯ９４／０４６７３に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、糸状菌における分泌タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが、タンパク質合成、フォールディングまたは輸送が障害されると低下するという新規知見に基づいている。この制御機構は、タンパク質合成、フォールディングまたは輸送を妨害する化学薬品（それぞれＤＴＴ、Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７、ブレフェルジンＡ）で処理した培養中、または機能的に不完全なタンパク質フォールディング系を有する菌株（遺伝子ｐｄｉＡに対してアンチセンス転写物を発現する菌株）中で働いていることが立証されている。さらに、ｔＰＡ（組織プラスミノゲン活性化因子）などの異種タンパク質を産生する菌株では、ＵＰＲが活性化されかつ分泌タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現レベルが低くなることが示された。発明者は、糸状菌における分泌タンパク質の産生中にこのタイプのフィードバック制御が起きることを初めて見いだした。
【０００８】
分泌タンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーションまたはフィードバック制御と呼ばれるこの現象が、分泌タンパク質をコードする遺伝子またはそれらのプロモーターを選択的に制御し選ばれたタンパク質の産生を増強するために、本発明で利用される。このことは、分泌タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター配列を遺伝子改変し、転写ダウンレギュレーションに対する反応性を変化させることによって達成される。あるいは、ダウンレギュレーションに関与する制御因子、または対応するシグナル伝達経路における因子をコードする遺伝子を、ダウンレギュレーションをなくすかあるいは増強するように改変することができる。通常は分泌ストレス下でダウンレギュレーションを受けるプロモーターの制御下で対象タンパク質の産生が行われる場合には、ダウンレギュレーション機構の不活性化が有益である。例えば、対象タンパク質の発現がダウンレギュレーションを受けないプロモーターの下で行われる場合には、ダウンレギュレーションの増強を利用して他のタンパク質の産生を抑制することができる。
【０００９】
本発明では、分泌可能なタンパク質のプロモーター中に位置する特異的な制御領域すなわちＤＮＡ配列が転写のダウンレギュレーションに関与することを見いだした。
より具体的には、真菌において分泌可能なタンパク質のプロモーター中に位置するＤＮＡ配列の特徴は主に、請求項１の特徴部分に記載されている。
【００１０】
分泌ストレス下で分泌タンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与するプロモーター中のＤＮＡ配列を変異、不活性化または除去して、遺伝子のダウンレギュレーションをなくすか低下させることができる、あるいはプロモーター配列の改変により、例えばダウンレギュレーションを受ける反応性プロモーター要素を増幅することにより遺伝子のダウンレギュレーションを増強することができる。
より具体的には、分泌可能なタンパク質のプロモーターの特徴は主に、請求項６の特徴部分に記載されている。
【００１１】
真菌宿主における改良されたタンパク質産生のためのプロモーターを作製する方法は、請求項１０の特徴部分に記載されている。
本発明を用い、タンパク質産生に用いられるプロモーターの効率を向上することおよび／または分泌タンパク質の制御システムを操作することによりタンパク質産生に優れた菌株を設計することができる。
より具体的には、最適化されたタンパク質産生のための真菌宿主菌株は主に、請求項１２の特徴部分に記載されている。
【００１２】
改良されたタンパク質産生のための真菌宿主を産生する方法は主に、請求項２６および２７の特徴部分に記載されている。
本発明は、遺伝子の発現が非改変プロモーターの場合と同じようにはダウンレギュレーションを受けないように、同種であれ異種であれ、あるタンパク質の産生に使用される同種または異種プロモーターを改変するのに用いることができる。特に、本発明は、異種タンパク質を産生するのに有用であるが、同種タンパク質の産生にも応用することができる。
【００１３】
さらに、本発明は、プロモーターのダウンレギュレーションに関与する制御因子の不活性化または活性もしくは発現を低下させるのに使用して、そのプロモーター、プロモーターに結合する制御因子あるいは反応に関与する制御因子の下でのタンパク質産生を改良することができる。
真菌において分泌可能なタンパク質の生産を最適化する方法の特徴は主に、請求項２８および３０の特徴部分に記載されている。
【００１４】
本発明を用いる１つの可能性は、ダウンレギュレーションを受けないプロモーターの下で同種または異種タンパク質を発現させているときに他の同種分泌タンパク質の産生を低下させるために制御因子を過剰発現させることである。このような場合、異種タンパク質は、例えばトリコデルマｇｐｄなどのプロモーターの下で発現かつ分泌され、ストレス条件において影響を受けない。同種分泌タンパク質は、ダウンレギュレートされたプロモーターの下で発現される。ダウンレギュレーションに関与するタンパク質をコードする遺伝子は過剰発現される。
【００１５】
また真菌における最適化された分泌可能なタンパク質の生産方法の特徴は主に、請求項３１の特徴部分に記載されている。
本発明に従って調製されたＤＮＡ配列、プロモーターまたは真菌宿主の使用法の特徴は、請求項３１に記載されている。
本発明の他の特徴、態様および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかになるはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書では、用語「内因性タンパク質」は、微生物宿主の本体の産物であるタンパク質を意味する。
本明細書では、「組換えタンパク質」は、微生物の本来の産物ではないタンパク質を意味する。所望の同種または異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切な方法によって宿主に伝達することができる。「同種タンパク質」は、同一微生物種によって産生されるタンパク質を意味する。「異種タンパク質」は、別の微生物種によって産生されるタンパク質を意味する。
【００１７】
本明細書では、「分泌可能なタンパク質」または「分泌タンパク質」は、宿主細胞の外側、培地中に分泌されるタンパク質を意味する。
「改良されたタンパク質産生」は、タンパク質の産生が、ダウンレギュレーションを変えるための遺伝子組換えしていない真菌宿主菌株を用いた場合に比べ、少なくとも３％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも３０％多いことを意味する。
【００１８】
本明細書では、「分泌ストレス」または「分泌ストレス条件」は宿主の分泌能力が抑制されている、あるいは分泌経路に負担がかかり過ぎていることを意味する。この抑制は、例えば異種タンパク質の産生または同種タンパク質量の増加によって引き起こされる。あるいはタンパク質の合成やフォールディング、輸送等を妨害する毒素（例えば、イオノフォア、ＤＴＴまたはブレフェルジンＡ（＝ＢＦＡ））によることもある。また、この抑制は、遺伝的手段によりフォールディングまたは分泌経路を変更すること、例えばタンパク質のフォールディングまたは輸送に必要な成分の活性を増強または不活性化することによって引き起こされることもある。しかしながら、ＵＰＲと同様に、この分泌タンパク質遺伝子の転写ダウンレギュレーションの機構は、生物体が分泌タンパク質の合成とフォールディングおよび分泌能力のバランスをとるための自然の機構と考えられ、分泌同種タンパク質の合成が誘導された場合などの多くのタンパク質産生条件でも（部分的に）起こることがある。
【００１９】
本明細書では、「ダウンレギュレーション」、「転写ダウンレギュレーション」または「フィードバック制御」とは、タンパク質に対応するｍＲＮＡレベルが前述の細胞性応答が原因で低下することを意味する。このダウンレギュレーション効果は、分泌タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルの遺伝子を測定することによって示された。
【００２０】
本発明によれば、分泌タンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列は、分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター中に見いだすことができる。このことは、制御因子などの細胞機構の作用に対する応答の１つとして、遺伝子産物をダウンレギュレートすることができる領域をプロモーターが含んでいることを意味する。
【００２１】
前述のように、分泌ストレスの下で遺伝子のダウンレギュレーションを分析するには様々な条件を用いることができる。それらの条件には、例えば、分泌タンパク質（異種または内因性タンパク質）を過剰生産させる、ＤＴＴ、ＢＦＡもしくはＣａイノフォアのような毒素を用いる、または遺伝的手段によりフォールディングまたは分泌経路を改変する（例えばタンパク質のフォールディングまたは輸送に必要な成分の活性を増強または不活性化する）ことなどがある。本発明では、培養をＤＴＴ、ＣａイオノフォアＡ２３１８７、ＢＦＡなどで処理すること、異種分泌タンパク質（組織プラスミノゲン活性化因子）を発現させること、あるいは遺伝子操作（アンチセンス技法）によってフォールディング機構を低下させることによって分泌ストレスを模倣した。
【００２２】
本発明の目的上、あるプロモーターを含む宿主を（前述のような）分泌ストレス条件の下で培養した場合、そのプロモーターの支配下にあるｍＲＮＡ量が宿主を非分泌ストレス条件で培養した場合に得られるｍＲＮＡ量に比べ少なければ、そのプロモーターは転写ダウンレギュレーション（すなわちダウンレギュレーション）に関与するＤＮＡ配列を含んでいると規定される。
【００２３】
同様に、本発明の目的上、ある宿主を(前述のような)分泌ストレス条件で培養した場合に得られる１つまたは複数の分泌タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子のｍＲＮＡ量が、その宿主を非分泌ストレス条件の下で培養した場合に少なくなれば、その宿主は転写ダウンレギュレーションすなわちダウンレギュレーションに関与する制御因子などの機構を備えていると規定される。
【００２４】
このダウンレギュレーション効果は、前述のように分泌ストレスの下で遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定することによって判明する。本発明の目的上、１つまたは複数の分泌タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルに測定可能な変化を示すことができれば、転写ダウンレギュレーションに関与する機構に対する応答についてプロモーターまたは宿主を遺伝子改変する。言い換えれば、選択された分泌可能なタンパク質の発現（ｍＲＮＡ量）を増加または低下させる。この変化は、非改変プロモーターまたは非改変宿主に比べ、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらにより好ましくは３０％以上、最も好ましくは５０％以上の増加または減少である。
【００２５】
本発明の目的上、「リポーター・タンパク質」は、その発現または量を分析することができるすべての遺伝子またはタンパク質である。前述のように転写ダウンレギュレーションに関与するプロモーターまたは宿主の能力を試験する場合には、リポーター・タンパク質のｍＲＮＡレベルを分析することができる。
【００２６】
分泌タンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列または領域は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、ハイドロフォビン、プロテアーゼ、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、スウォレニン（ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ）、およびペクチナーゼなどのタンパク質をコードする様々な遺伝子のプロモーター中に位置する。
ＤＮＡ配列は、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ｓｗｏ、ｇｌａ、ａｍｙ、およびｐｅｐＡのプロモーターを含む群から選択されるプロモーター中に位置していることが好ましい。
【００２７】
本発明は、トリコデルマおよびアスペルギルスにより分泌されるタンパク質をコードする多くの遺伝子が転写ダウンレギュレーション機構に支配されることを示している。本発明による分泌可能なタンパク質のプロモーターは、トリコデルマ属の効率的に分泌される加水分解酵素のプロモーターであることが好ましい。プロモーターは、トリコデルマのセルラーゼまたはヘミセルラーゼのプロモーターであることがより好ましい。プロモーターは、トリコデルマのｃｂｈ１であることが最も好ましい。また、分泌可能なタンパク質のプロモーターは、アスペルギルス属の効率的に分泌される加水分解酵素のプロモーターであってもよい。プロモーターは、アスペルギルスのプロテアーゼまたはデンプン分解酵素遺伝子のプロモーターであることが好ましい。プロモーターは、ｇｌａ、ａｍｙまたはｐｅｐＡであることがより好ましい。
【００２８】
本発明に例示するように、分泌可能なタンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列は、トリコデルマｃｂｈ１プロモーターの−１６２位の上流（配列番号５）に見いだすことができる。あるいは、−１８８位の上流（配列番号２）、−２１１位の上流（配列番号３）、−３４１位の上流（配列番号４）、−３９１位の上流（配列番号１）、−５０１位の上流（配列番号８）、−７４１位の上流（配列番号９）、−８８１位の上流（配列番号１０）に見いだすことができる。しかしながら、それらは−１０３１位の下流（配列番号１１）、−１２０１位の下流（配列番号７）、または−１２８１位の下流（配列番号６）に位置しているようである。したがって、ｃｂｈ１プロモーター中の分泌可能なタンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列は、ヌクレオチド−１０３１と−１６２の間に位置しているようである。最も重要な領域はヌクレオチド−２１１と−３４１の間および−５０１と−１０３１の間である。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、分泌可能なタンパク質のプロモーターは、ダウンレギュレートされないように、またはダウンレギュレーションが軽減されるように遺伝子改変される。
【００３０】
本発明に従って改変されたプロモーターでは、分泌タンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡの効果は様々な変異方法によって減少し、または配列が不活性化もしくは除去されることがある。例えば、分泌可能なタンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列が除去されたプロモーターは、トリコデルマｃｂｈ１プロモーターの−５０１の上流、−１８８の上流、−２１１の上流、−３４１の上流、−３９１の上流、−１６２の上流、−８８１の上流および−７４１の上流のヌクレオチドを欠くプロモーターで、それぞれ（配列番号１６）（配列番号１７）（配列番号１８）（配列番号１１９）（配列番号２０）（配列番号２１）（配列番号２２）（配列番号２３）にあたる。
【００３１】
本発明に従って改変された別のプロモーターでは、標準的な分子生物学の方法を用い、ダウンレギュレーションに関与することを担う配列を増幅することによって分泌タンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡの効果を増すことができる。
分泌可能なタンパク質の最適化された産生のため、分泌タンパク質をコードする遺伝子の分泌ストレスの下での転写をダウンレギュレートする機構を遺伝子改変した真菌宿主菌株を構築することができる。
【００３２】
本発明の一実施形態によれば、本発明の真菌宿主菌株は、分泌タンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡの効果が減少もしくは除去されたプロモーター、または分泌タンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡの効果が増加したプロモーターを有することができる。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、真菌宿主中での転写ダウンレギュレーションに関与する制御因子の発現を遺伝子改変することができる。所望ならば、制御因子の発現を軽減もしくはなくすこともできるし、制御因子の発現を増加させることもできる。
【００３４】
本発明は、細胞外分泌タンパク質をコードする多くの遺伝子が、この制御機構を明らかにするために用いられた条件下では、転写的にダウンレギュレートされていること、分泌タンパク質をコードする遺伝子は、ほとんど全部ではないとしても多くがこの転写ダウンレギュレーションの下にあることを示している。制御機構の下にある遺伝子、プロモーターおよびタンパク質は、セルラーゼ（セロビオース加水分解酵素、エンドグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼなど）、ヘミセルラーゼ（キシラナーゼ、マンナーゼ）、β−キシロシダーゼなど、およびアラビノシダーゼ、グルクロニダーゼ、アセチル・キシラン・エステラーゼなどの側鎖切断酵素）、デンプン分解酵素（α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、シクロデキストリナーゼなど）ハイドロフォビン、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、アスペルギロペプシン）、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、様々なペクチナーゼ（エンドおよびエキソポリガラクツロナーゼ、ペクチン・エステラーゼ、ペクチンリアーゼおよびペクチン酸性リアーゼ）およびリグニナーゼ（リグニン・ペルオキシダーゼ、Ｍｎペルオキシダーゼ、ラッカーゼなど）を含む群から選択することができる。
【００３５】
制御機構は、遺伝子ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ｓｗｏ、ｇｌａ、ａｍｙ、およびｐｅｐＡによってコードされるタンパク質を含む群から選択されるタンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与している。
例えば制御因子はａｃｅ１遺伝子によってコードされているものであるが、ａｃｅ１以外の因子もこのダウンレギュレーションに関与している。このことは、実施例の、ａｃｅ１がすべての培養条件で制御（の主要部）を担ってはいないという事実によって示される。
【００３６】
制御機構は、トリコデルマ属の加水分解酵素を制御するものであることが好ましい。トリコデルマのセルラーゼまたはヘミセルラーゼを制御していることがより好ましい。制御因子は、アスペルギルス属の加水分解酵素を制御するものでもよい。アスペルギルスのプロテアーゼまたはデンプン分解酵素を制御していることが好ましい。
【００３７】
本明細書では、「真菌産生宿主」は、所望の産物を効率的に産生するために選択または遺伝子改変されたいかなる真菌宿主菌株も意味し、例えば分析的、医学的または工業的用途のタンパク質産生に有用である。宿主菌株は、目的産物を効率的に産生するために遺伝子工学的手段によって改変された組換え菌株であることが好ましい。
【００３８】
本発明はここではトリコデルマおよびアスペルギルスの２つの真菌で例示し、転写のダウンレギュレーション機構の一般的性質を示す。他の真菌でもこの機構の改変はタンパク質産生の改良に有用なはずである。
【００３９】
本発明の真菌宿主菌株は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フザリウム属、ペニシリウム属、フミコラ属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア属、ハンゼヌラ属、カンジダ属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、スキゾサッカロミセス属およびサッカロミセス属を含む群から選択することができる。宿主は、トリコデルマまたはアスペルギルス属、例えばトリコデルマ・ハルジアナム(T. harziamun)、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（T. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ビリデ（T. ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギー(T. koningii)、アスペルギルス・ニデュランス(A. nidulance)、アスペルギルス・テレウス(A. terreus)、アスペルギルス・フィクム（T. ｆｉｃｕｍ）、アスペルギルス・オリザエ(A. oryze)およびアスペルギルス・アワモリ(A. awamori)に属していることが好ましい。宿主は、トリコデルマ・リーセイ（ヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina））またはアスペルギルス・ニガーに属していることが最も好ましい。
【００４０】
真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法は、
−分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子を選択する工程、
−分泌ストレスの下で分泌タンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与する機構に応じて遺伝子のプロモーターを遺伝子改変する工程、
−真菌宿主においてプロモーターの制御の下で所望の分泌可能なタンパク質を産生する工程、および
−宿主の培地からタンパク質産物を回収する工程を含む。
【００４１】
本発明によれば、真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法は、
−適切な培地中で上記で定義した真菌宿主を培養する工程、および
−培地からタンパク質産物を回収する工程を含む。
【００４２】
タンパク質産物は、細菌または高等もしくは下等真核生物に由来するいかなる産物であってもよく、タンパク質産物は、真菌または哺乳類起源に由来してもよい。タンパク質産物は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、ハイドロフォビン、プロテアーゼ、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、ペクチナーゼなどの加水分解酵素であってもよく、または免疫グロブリンまたはｔＰＡなどのいかなる哺乳類タンパク質であってもよい。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、タンパク質産物を転写ダウンレギュレーションを受けにくいプロモーターから発現させ、その他の望ましくないタンパク質は、ダウンレギュレーションによって制御されるプロモーターから発現させることができる。ダウンレギュレーションを増強することにより、生産を転写ダウンレギュレーションを受けにくいプロモーターから発現されるタンパク質産物にふりむけることができる。このようなプロモーターはｇｐｄなどの構成性プロモーターであってもよい。
【００４４】
真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法は、
−分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子を選択する工程、
−転写ダウンレギュレーションの機構によって制御不可能なプロモーター中に、選択された分泌可能なタンパク質のコード領域を動作可能に連結する工程、
−適切な培養条件の下で真菌宿主を培養し、真菌宿主においてダウンレギュレーションに関与するタンパク質を過剰産生する工程、および
−宿主の培地から選択された分泌可能なタンパク質を回収する工程を含む。
【００４５】
選択された分泌可能なタンパク質は異種タンパク質で、望ましくない分泌可能なタンパク質は同種タンパク質であることができる。
本明細書では、「プロモーターを遺伝子改変してダウンレギュレーションによって制御可能または制御不可能にすること」とは、当技術分野でよく知られている適切な従来型または分子生物学の方法、すなわち部位特異的突然変異誘発または欠失などのＤＮＡ技法やは化学薬品もしくは放射線を用いる従来の突然変異誘発などによりプロモーターを改変し、非改変プロモーターと違ってダウンレギュレーションによって制御される、または制御されないようにし、続いて転写ダウンレギュレーション機構が改変された細胞をスクリーニングまたは選択することを意味する。本発明では、トリコデルマｃｂｈ１プロモーターの部分を欠失させることによってダウンレギュレーションによって制御されないようにする遺伝子組換えを例示した。
【００４６】
本明細書では、「分泌ストレス下でのダウンレギュレーションに関与するタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子改変すること」とは、遺伝子を当技術分野でよく知られている適切な従来型または分子生物学の方法により改変して、遺伝子の過剰発現または不活性化、あるいは発現の活性を変化させることを意味する。改変は、部位特異的突然変異誘発または欠失などの組換えＤＮＡ技法により行われることが好ましいが、望ましい特性を持つ細胞との交雑または融合などの遺伝子改変のその他の方法を使用することも可能であり、または化学薬品もしくは放射線を用いる従来の突然変異誘発によりおこない、続いて転写ダウンレギュレーション機構が組み換えられた細胞をスクリーニングまたは選択する。
【００４７】
我々は、糸状菌に分泌ストレスに反応して分泌タンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーション機構が存在することを立証した。真菌のトリコデルマ・リーセイおよびアスペルギルス・ニガーでの例を示す。タンパク質合成、フォールディングまたは輸送を妨害する化学薬品で処理した真菌培養を分析することにより、またはフォルダーゼ・レベルの低下を示す真菌株を分析することにより、新規な制御機構の証拠が得られた（実施例１、２、３、４および５を参照）。さらに、異種タンパク質を産生する菌株では、内因性分泌タンパク質をコードする遺伝子はそれらの親菌株に比べて低レベルで発現される（実施例６を参照）。真核生物系では、近年、ＥＲの内腔の状態を感知し、分泌ストレスに応答して攪乱を軽減できる２つのフィードバック機構が報告されている。それらはＵＰＲ経路（Ｓｈａｍｕ他、１９９４）および翻訳開始の減衰(アテニュエーション)（Ｈａｒｄｉｎｇ他、１９９９）である。我々の新規な知見には、分泌ストレスの下で機能する３番目のタイプのフィードバック制御機構が含まれ、それが特定の遺伝子のプロモーター配列によって仲介されることがｃｂｈ１プロモーター配列の下でのｌａｃＺ発現からなるリポーター遺伝子系を用いて示される（実施例７および８）。
【００４８】
得られた結果に基づき、トリコデルマにおいて分泌タンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーションに関与するプロモーター領域の性質を明らかにすることができる。関与するプロモーター領域は、例えば様々な程度の欠失のあるｃｂｈ１プロモーターの下で細胞外タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルがダウンレギュレートされる条件、例えばＤＴＴによる処理を用い、ｌａｃＺリポーター遺伝子発現を検討することによって見つけだすことができる。この分析に基づき選択されたプロモーター領域を、ストレス下および非ストレス下（例えば、ＤＴＴ処理および非処理）にある培養からの細胞抽出物と一緒に用いてゲル・シフト法を行い、さらに詳細に特異的領域を特定し、制御因子にとって可能な結合部位の特徴を明らかにすることができる。プロモーター配列を比較することにより、ストレス条件に影響を受ける他のプロモーター中でダウンレギュレーションに関与している配列を特定することができる。本明細書に記載の方法または当技術分野で知られている方法を用い、どのような生物体、どのようなプロモーターでも、分泌タンパク質をコードする遺伝子からこの転写ダウンレギュレーションに応答する領域を特定することが可能である。
【００４９】
フィードバック制御に関与しプロモーター配列に結合する制御タンパク質のクローニングおよび性質解明は、ｃｂｈ１プロモーター中（およびダウンレギュレーションを示す他の関連遺伝子中）で特徴の明らかになったプロモーター要素を利用し、例えば酵母ワンハイブリッド（ｙｅａｓｔ−ｏｎｅ ｈｙｂｒｉｄ）系を用いて行うことができる。ＤＮＡ結合タンパク質のクローニングに適用できるシステムは市販されている（例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＭａｔｃｈｍａｋｅｒ（商標））ものや報告されている（例えば、Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ他２０００）ものがある。
【００５０】
遺伝子のダウンレギュレーションに関与していることが判明したプロモーター配列は、ストレス条件におけるダウンレギュレーションが消滅または軽減されるように改変することができる。これらの手段により、そうでなければダウンレギュレートされると思われる条件下で遺伝子の産生レベルを増加させることが可能であり、改変プロモーター（ダウンレギュレートする配列が改変された）の下での同種あるいは異種遺伝子産物の産生を改良することができる。さらに、ダウンレギュレーションに関与する制御因子を完全または部分的に不活性化し、タンパク質産生を改良することができる。分泌タンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーションを有することが知られているいかなる生物体、例えば他の種類の真菌、好ましくは他の種類の糸状菌について同様の手法を利用することができる。
【００５１】
異種タンパク質の産生は、例えば、化学薬品ＤＴＴ、ＢＦＡまたはＡ２３１８７による処理と類似したタイプのストレス反応を引き起こすことがある。例えば、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子を産生するトリコデルマ・リーセイはｔＰＡの産生中には培養の内因性セルラーゼ転写物のレベルが低いことが観察され（実施例６）、ｅｇｌ１およびｃｂｈ１をコードする遺伝子のダウンレギュレーションを示す。内因性細胞外タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターが、ストレス反応を惹き起こす異種産物の発現または同種産物の過剰発現のために使用される場合には、その内因性細胞外タンパク質の発現は、産生中に転写ダウンレギュレーションに関与するフィードバック制御の対象になることがある。プロモーターエレメント、またはプロモーターに結合するか制御シグナルに関与する制御因子を改変することは、ダウンレギュレーション・プロセスを消滅させることによってタンパク質産生を増加させるための手段である。
【００５２】
場合によっては、分泌ストレス中にダウンレギュレーションを増強して一部の内因性タンパク質の産生を減少させたり、分泌ストレス中にダウンレギュレートしないプロモーターの下で対象タンパク質を産生することが有益なことがある。このことは、ダウンレギュレーションに関与する制御因子を過剰発現させることおよび／または抑制性制御因子の結合を増すためにプロモーターを改変すること、例えば因子の結合部位数を増やすことによって達成することができる。本発明は、分泌タンパク質遺伝子の発現がダウンレギュレートされるときに、プロモーターがダウンレギュレートされない遺伝子を特定することができる一方法について、トリコデルマ・リーセイｇｐｄプロモーターを例にあげて記載している。
【００５３】
これらの手段により、分泌タンパク質をコードする遺伝子を選択的に制御し、産生プロモーターのダウンレギュレーションを減少または不活性化することにより選択されたタンパク質の産生を増強し、またはダウンレギュレーションを増強して他の分泌タンパク質の発現を選択的に抑制することが可能である。本発明はタンパク質生産に利用できるばかりでなく、本明細書に記載の転写ダウンレギュレーションの機構は他の目的で真菌株を改変して宿主において特定の望ましくないまたは望ましいタンパク質の発現を選択的に制御するための手段を提供することを言っておく必要がある。
【実施例１】
【００５４】
トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０培養におけるＣａ２＋イオノフォアＡ２３１８７、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の効果
＜ＲＮＡおよびタンパク質のサンプリング、代謝標識および分析に使用するトリコデルマ菌株、培養条件および方法＞
トリコデルマ菌株および培養条件は基本的に別の場所に記載されている（Ｐａｋｕｌａ他２０００；Ｉｌｍｅｎ他１９９６）。トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０株（Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ ＆ Ｅｖｅｌｅｉｇｈ、１９７９）は、炭素源としてラクトース２０ｇｌ−１を含有する最少培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４７．６ｇｌ−１、ＫＨ２ＰＯ４１５．０ｇｌ−１、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇｌ−１、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ０．２ｇｌ−１、ＣｏＣｌ２３．７ｍｇｌ−１、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ５ｍｇｌ−１、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１．４ｍｇｌ−１、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１．６ｍｇｌ−１、ＫＯＨでｐＨを５．２に調整）で培養した。２×１０７個の胞子を含む胞子懸濁液（２０％グリセロール中−８０℃で保存）を培地２００ｍｌに接種し、２１０ｒｐｍで振盪しながら２８℃において振盪フラスコ中で培養した。４日間の培養後、培養を新鮮な培地で１０倍希釈し、さらに２４時間培養し、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０μｇ／ｍｌブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）または５μＭ Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７で処理した。無処理対照培養には保存原液の溶媒を同じ量だけ加えた（Ａ２３１８７およびＢＦＡ処理についてはそれぞれ対照培養に０．２％および０．５％ＤＭＳＯ、およびＤＴＴ処理については対照に２回(２段)蒸留水を使用）。様々な時点でタンパク質の代謝標識およびＲＮＡ単離のために培養を分割した。
【００５５】
（Ｐａｋｕｌａ他２０００）に記載の方法を用い、３５Ｓ−メチオニンでタンパク質を代謝標識した。サンプルの調製および標識タンパク質の分析は、基本的に（Ｐａｋｕｌａ他２０００）にあるように行った。標識実験は、ＤＴＴまたはＡ２３１８７の添加後１０分、またはＢＦＡ添加後１５分に開始した。［３５Ｓ］−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＳＪ１０１５、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞標識等級、１０００Ｃｉｍｍｏｌ−１、１０μＣｉμｌ−１）１ｍＣｉを、培養を５０ｍｌ取り分けたものに加えた。無処理培養は並行して同様に標識した。経時的にサンプル２ｍｌを採取した。細胞抽出物および培養上清中の総標識タンパク質は、サンプル中のＴＣＡ不溶物のシンチレーション計数によって測定し、標識された特定のタンパク質（例えば、ＣＢＨＩ）は、２Ｄゲル電気泳動を用いて分析し、タンパク質をＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量した。タンパク質合成および分泌の速度、ならびに平均合成時間および最小分泌時間は、Ｐａｋｕｌａ他２０００に記載のように決定した。
【００５６】
ノーザン分析については、ＤＴＴ、ＢＦＡまたはＡ２３１８７で処理した培養および無処理対照培養から処理後０、１５、３０、６０、９０、１２０、２４０および３６０分に菌糸体サンプルを採取した。一番目のサンプル（時点０）は、ＤＴＴ、ＢＦＡまたはＡ２３１８７の添加直後に採取した。菌糸体を濾過し、等容積の０．７％ＮａＣｌで洗浄し、液体窒素中で直ちに凍結し、−８０℃で保存した。総ＲＮＡは、基本的に製造者の使用説明書に従いＴｒｉｚｏｌ（商標）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて単離した。ノーザン・ブロッティングおよびハイブリッド形成は、標準的手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他）に従って行った。プローブとして遺伝子の完全長ｃＤＮＡを用いた。
【００５７】
＜トリコデルマ・リーセイにおけるタンパク質合成および輸送に対するＡ２３１８７、ＤＴＴおよびＢＦＡの効果＞
分泌タンパク質をコードする遺伝子のフィードバック制御を、他の生物体においてタンパク質合成、フォールディングまたは輸送を妨害することが知られている薬剤で処理した培養で検討した。Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７は、哺乳類細胞においてタンパク質合成を低下させるばかりでなく、ＥＲのＣａ２＋貯蔵を空にすることによってタンパク質のフォールディングおよび輸送を阻害することが報告されている（Ｂｒｏｎｓｔｒｏｍ他１９８９、ＬｏｄｉｓｈおよびＫｏｎｇ、１９９０、Ｌｏｄｉｓｈ他１９９２）。ジチオスレイトールは、酵母および哺乳類においてジスルフィド架橋の形成およびタンパク質のフォールディングを阻害する還元剤である（Ｊａｍｓａ他１９９４、Ａｌｂｅｒｉｎｉ他１９９０、Ｂｒａａｋｍａｎ他１９９２）。ＢＦＡによる細胞の処理は、例えば哺乳類ではゴルジ構造を崩壊し、ＥＲからゴルジへのタンパク質の輸送を阻害することが知られているが、その作用は、生物体および特定の細胞タイプによって異なる（Ｐｅｌｈａｍ、１９９１、ＳｈａｈおよびＫｌａｕｓｎｅｒ、１９９３）。
【００５８】
タンパク質の代謝標識を用い、トリコデルマ・リーセイ培養におけるタンパク質合成および分泌に対するＡ２３１８７、ＤＴＴおよびＢＦＡの効果について特徴を明らかにした（用いた方法についてはＰａｋｕｌａ他２０００を参照）。
標識メチオニンの添加前に、５μＭ Ａ２３１８７もしくは１０ｍＭ ＤＴＴで１０分間または５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで１５分間、培養を処理した。標識総タンパク質ならびに標識された特定のタンパク質を、標識実験の様々な時点で細胞抽出物および培養上清で分析した。
【００５９】
総タンパク質合成の速度および総タンパク質分泌の速度は、細胞抽出物および培養上清において時間単位当たりにＴＣＡ不溶物中に取り込まれた放射能の量として測定した（図１、ＴＣＡ不溶物中の放射能はバイオマス乾燥重量１ｍｇ当たりで示し、時点０分は、標識メチオニンの添加に当たる）。速度は、処理の初めの１５〜４５分間に測定された値から推定した。ＤＴＴまたはＢＦＡの存在下では、総タンパク質合成の速度は影響を受けなかったが、イオノフォアによる処理は、対照細胞の速度の５１％までタンパク質合成速度を低下させた。細胞外標識タンパク質の産生は、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養中でかなり効率的に阻害された。これらの培養では、総標識タンパク質の培地中への分泌速度は、対照細胞の速度の５％に過ぎなかった。さらに、ＢＦＡ処理培養では、細胞外タンパク質の産生は、対照培養に比べて顕著に遅くなった。イオノフォアＡ２３１８７で処理した培養では、標識タンパク質の培地への産生速度は、無処理培養における速度の２３％まで低下した。タンパク質合成および分泌の速度を表１に要約して示す（表１では、速度の値は、無処理対照培養における値のパーセントとして示す）。この結果は、ＤＴＴおよびＢＦＡはタンパク質合成を妨害しないが細胞からのタンパク質輸送を遮断し、一方Ａ２３１８７はタンパク質合成に対する阻害効果も有していることを示唆している。
【００６０】
細胞外タンパク質の合成、具体的にはタンパク質の輸送に対する処理の効果を、モデルタンパク質として真菌類によって産生される主要なセルラーゼであるセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）を用いて検討した。タンパク質の合成および分泌ならびに輸送中のタンパク質のｐＩパターン変化は、２Ｄゲル電気泳動を用いてモニターした（Ｐａｋｕｌａ他２０００に記載のように；図２は、各パネルの左から右へ約３．５〜４．５のｐＨ範囲において２Ｄゲルで分析した標識実験の様々な時点における標識ＣＢＨＩを示す）。ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養から調製した細胞抽出物では、まさに最初の新生ｐＩ型のみが検出でき、タンパク質が生合成経路内では完全には翻訳後修飾されないことを示している。ＤＴＴ処理培養では、培地中への標識ＣＢＨＩの産生は一切検出されず、ＢＦＡ処理培養では、標識実験の末期に微量のＣＢＨＩが分泌されたに過ぎなかった（産生速度は、対照培養で測定された速度の４％であった）。この結果は、これらの条件では、不均一なｐＩをもたらす修飾が行われるコンパートメントにタンパク質が到達する前に、タンパク質の輸送が遮断されることを示唆している。しかしながら、ＢＦＡ処理培養の培地中で検出された微量のＣＢＨＩは完全なｐＩパターンを獲得しており、タンパク質のごく一部は修飾され輸送されるが、完全に処理された形のタンパク質の量があまりに少ないために細胞抽出物中に検出されないことを示している。タンパク質輸送に対するイオノフォアＡ２３１８７による処理の効果は明確ではなかった。ＣＢＨＩのｐＩ型の全パターンの形成は、対照細胞に比べて１５〜２０分遅くなり、ｐＩ型パターンが全部揃ったＣＢＨＩは培地中に分泌されたが遅延していた。
【００６１】
標識実験の様々な時点における細胞抽出物および培養上清のサンプルからの標識ＣＢＨＩを２Ｄゲル中で分析し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量した。ＣＢＨＩの合成および分泌速度（時間単位当たりに産生した標識タンパク質の量）ならびにＣＢＨＩの平均合成時間および最小分泌時間などのパラメータを決定した（方法についてはＰａｋｕｌａ他２０００を参照）。図３には標識実験中の標識ＣＢＨＩの定量結果を示し、これらの条件におけるＣＢＨＩの合成および分泌をあらわす推定パラメータを表１に要約して示す。ＤＴＴおよびＢＦＡ処理培養では完全長ＣＢＨＩの平均合成時間は影響を受けず、これはこれらの処理によって総タンパク質合成が影響を受けないという結果（上記参照）と合致している。ＢＦＡ処理培養で測定された分子の最小分泌時間は１１分から６９分に増加し、ＤＴＴ処理培養ではこの条件下で産生された細胞外タンパク質は極めて少量であるためにパラメータを決定できなかった。イオノフォアＡ２３１８７で処理した培養では、ＣＢＨＩ合成ならびにタンパク質の輸送が影響を受けた。対照培養に比べＡ２３１８７で処理した培養中でのＣＢＨＩの最小分泌時間は１０分増加し、ＣＢＨＩの合成時間は対照培養中よりも３〜４分長かった。
【００６２】
驚いたことに、ＤＴＴまたはＢＦＡによる処理は、総タンパク質合成の速度を低下させるかＣＢＨＩ分子の合成に必要な時間を延ばすことはなかったが、ＤＴＴまたはＢＦＡ処理培養中ではＣＢＨＩ合成の速度（時間単位当たりに合成された標識ＣＢＨＩの量）が低下することが見いだされた（表１では、速度は、対照培養で測定された値のパーセントとして示す）。ＣＢＨＩ合成速度は、ＤＴＴ処理培養では対照培養中で測定された速度の４〜２４％であり、ＢＦＡ処理培養中では５２％であった。合成されたＣＢＨＩの大部分は細胞内に残る。培地中へのＣＢＨＩ産生の速度はＤＴＴ処理培養中では測定できず、ＢＦＡ処理培養では対照培養中で測定された速度の４％であった。イオノフォアＡ２３１８７で処理した培養では、ＣＢＨＩ合成の速度は、総タンパク質合成速度より大きな影響を受けた。ＣＢＨＩ合成の速度は、対照細胞中で測定された速度の２６％であり、総タンパク質合成速度は５１％であった。培地中へのタンパク質分泌速度は、ＣＢＨＩの合成速度と同程度に低下した（対照培養中で測定された速度の２７％）。
【００６３】
この結果は、ＢＦＡまたはＤＴＴによる処理はトリコデルマにおけるタンパク質輸送を明らかに妨害し恐らくＥＲからのタンパク質輸送を妨げるが、Ａ２３１８７による処理はタンパク質輸送にわずかな遅れを引き起こすに過ぎないことを示している。ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養では、総タンパク質合成活性は影響を受けないが、分泌モデルタンパク質のＣＢＨＩの合成速度は、タンパク質輸送の障害と同時に特異的に低下した。Ａ２３１８７処理培養では、総タンパク質合成速度の明らかな低下が測定されたが、ＣＢＨＩの合成速度は、総タンパク質合成に対する効果に比べてより大きな影響を受けた。
【００６４】
【表１】
【００６５】
＜Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理したトリコデルマ・リーセイにおけるＵＰＲ反応に関与するフォルダーゼＰＤＩＩ、シャペロンＢＩＰＩ、および転写因子ＨＡＣＩをコードする遺伝子の転写物レベル＞
Ａ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡによる処理中に採取したサンプルのノーザン分析を行い、転写レベルにおける処理の効果について検討した。また、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養中のタンパク質輸送およびフォールディングにおける妨害は、ｐｄｉ１およびｂｉｐ１遺伝子の誘導（図４、ｐｄｉ１についての結果はすでに報告されている；Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ他１９９９）および、活発に翻訳されてＵＰＲ反応に関与する短形のｈａｃ１転写物の発現（図５は、各時点における全ｈａｃ１シグナルで正規化した短形および長形の転写物のシグナルを示す）が示すように、アンフォールド反応（ＵＰＲ）経路の活性化として現れた。Ａ２３１８７処理培養では、タンパク質輸送はわずかに影響を受けたに過ぎず、合成されたタンパク質の総量は減少した。これらの条件では、ｐｄｉ１およびｂｉｐ１の誘導は観察されなかった（図４）。しかしながら、短形のｈａｃ１ｍＲＮＡの一過性かつ弱い発現がＡ２３１８７処理細胞で観察され、ＵＰＲ経路に対する若干の効果を示している（図５）。
【００６６】
Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理したトリコデルマ・リーセイ培養における内因性分泌タンパク質をコードする遺伝子の転写物レベル
ＤＴＴまたはＢＦＡ処理培養では、無処理対照細胞に比べてＣＢＨＩ合成速度は低下したが、これらの条件下では総タンパク質合成は影響を受けなかった。Ａ２３１８７処理培養では、ＣＢＨＩの合成は、処理培養中の総タンパク質合成に比べて大きく妨げられた。薬物で処理した培養から調製したサンプルのノーザン分析は、ｃｂｈ１のｍＲＮＡレベルが処理中に顕著に低下したことを示した（図６、処理の様々な時点でｇｐｄのシグナルで正規化したｃｂｈ１シグナル）。ｍＲＮＡレベルの低下は、標識実験におけるタンパク質の合成速度の低下を少なくとも部分的には説明するように見える。ＤＴＴおよびＡ２３１８７処理培養では、遺伝子のｍＲＮＡレベルの低下の動態はＲＮＡの測定半減期に対応した。ＢＦＡ処理培養では、低下は若干少なめであった。同様の低下は、処理中のｅｇｌ１ｍＲＮＡレベルで観察された（図６、処理の様々な時点でｇｐｄのシグナルで規格化したシグナル）。さらに、ＤＴＴ処理培養のサンプルについて、より広範囲な遺伝子についてノーザン分析を行った。細胞外タンパク質をコードする様々な他の遺伝子、例えばｘｙｎ１およびｈｆｂ２の転写物レベルが低下し（図７）、細胞外タンパク質をコードする多くの遺伝子が、タンパク質の合成、フォールディング、または輸送に制限がある時にはフィードバック制御の下にあることを示している。
【００６７】
また、ダウンレギュレーションは、真菌類によって発現されるすべての遺伝子に影響を及ぼすわけではないが、細胞外タンパク質をコードする遺伝子の群には共通していることは明らかである。ＵＰＲの制御下にアップレギュレートされる遺伝子に加え、ダウンレギュレートされない遺伝子がいくつか見いだされた（図８）。興味深いことに、細胞内β−グルコシダーゼをコードするｂｇｌ１は真菌類が利用できる炭素源に応じてセルラーゼと同様な制御を受けるにもかかわらず、これらの条件下ではｂｇｌ２のｍＲＮＡレベルは低下しない。小胞輸送で機能するタンパク質をコードする遺伝子、例えばｓａｒ１（Ｖｅｌｄｈｕｉｓｅｎ他１９９７）およびｙｐｔ１の発現レベルは、ＤＴＴによる処理によって影響を受けなかった（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ他投稿中）。その発現がＤＴＴ処理によって明らかには影響を受けないその他の遺伝子は、例えばｃＤＮＡ１およびｇｐｄ（グリセルアルデヒド−６−Ｐ−デヒドロゲナーゼ）である。このｇｐｄシグナルをノーザン分析でのシグナルの正規化に用いた。
【実施例２】
【００６８】
ＤＴＴで処理したアスペルギルス・ニガーの培養における内因性分泌タンパク質をコードする遺伝子の転写物レベル
＜アスペルギルス・ニガー菌株、培養条件およびＲＮＡのサンプリングおよび分析に使用する方法＞
実験で使用するアスペルギルス・ニガー菌株は、ＡＢ４．１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ他、１９８７）およびＡＳ１．１（Ｎｇｉａｍ他、２０００）とした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）に再懸濁した胞子を、最終密度が培地１ｍｌ当たり１×１０５個となるよう液体培地に接種した。菌株はポテト・デキストロース寒天斜面（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）上で維持した。アスペルギルス・ニガーＡＢ４．１の場合には、１０ｍＭウリジンを培地に追加した。胞子を形成するまで３０℃で斜面培養し、実験毎に更新した。液体培養に関するすべての実験にはＡＣＭＳ／Ｎ／Ｐ培地（Ａｒｃｈｅｒ他、１９９０）を使用した。アスペルギルス・ニガーＡＢ４．１培養にはやはり１０ｍＭウリジンを追加した。培養は、５０ｍｌ三角フラスコ中の培地１００ｍｌ中、２５℃、１５０ｒｐｍで培養した。ＤＴＴストレス実験では、ＡＢ４．１培養を４４時間培養してから２ＭのＤＴＴ１ｍｌを加え、最終濃度２０ｍＭとした。対照ＡＢ４．１培養には等容積の水を加えた。培地交換実験では、培養はＡＣＭＳ／Ｎ／Ｐ中で２５℃および１５０ｒｐｍ４４時間行った。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）により菌糸体を収集し、２５℃に温めておいた炭素源を含まない培地１００ｍｌで２回洗浄した。次いで、あらかじめ温めておいた、必要に応じて添加物を加えたＡＣＭＸ／Ｎ／Ｐ１００ｍｌを入れたフラスコに菌糸体を移し、前と同じ条件でインキュベーションを続けた。ＡＣＭＸ／Ｎ／Ｐは、１リットル当たり可溶性デンプン１０ｇの代わりに１リットル当たりキシロース１０ｇを含有するという点でＡＣＭＳ／Ｎ／Ｐとは異なる。
【００６９】
２層のＭｉｒａｃｌｏｔｈにより菌糸体を収集し、液体窒素中で瞬間冷凍した。次いで、液体窒素中で菌糸体を粉砕して細かい粉末とし、Ｅｄｗａｒｄｓ Ｍｏｄｕｌｙｏ凍結乾燥器中で２日間凍結乾燥した。凍結乾燥器中で乾燥すること２日後、次いでさらに１日後に菌糸体の重量を測定して乾燥重量を決定した。この期間に重量の減少が一切観察されない場合には、培養物は完全に乾燥していると見なした。
【００７０】
総ＲＮＡは、製造者の使用説明書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）を用い、凍結乾燥し粉砕した菌糸体１００ｍｇから抽出した。Ｕｖｉｋｏｎ ８５０分光光度計（Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）で２３０、２６０および２８０ｎｍにおける吸光度を読み取ることによってＲＮＡを定量した。２６０ｎｍ：２８０ｎｍの読み取り値の比が２．０を超えれば良質のＲＮＡを示していると見なした。また、７％ホルムアルデヒド・ゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）上でサンプルを泳動することによってＲＮＡの品質を評価した。ノーザン・ブロッティングの場合には、１レーン当たりＲＮＡ１０μｇを７％ホルムアルデヒド・ゲル上で電気泳動した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｈｏｒｉｚｏｎ １１−１４サブマリン・ゲル電気泳動タンク、２５Ｖ、６時間、ＭＯＰＳ泳動バッファー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９））。サンプルは、Ｓｉｇｍａ ＲＮＡローディング・ダイ（Ｃａｔ．＃ Ｒ４２６８）を用いて調製した。電気泳動後、ＤＥＰＣ処理水（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）で２０分間づつ５回、ゲルを洗浄し、次いで５０ｍＭ ＮａＯＨ中に１０分間浸漬した。Ｈｙｂｏｎｄ ＸＬナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｌ．ＵＫ）への転写は、製造者の使用説明書に従って転写用バッファーとして１０×ＳＳＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）を用い、Ａｐｐｌｉｇｅｎｅバキューム・ブロッターを用いて行った。転写時間は２．５時間とした。転写後、ブロットを５０ｍＭ ＮａＯＨ中に５分間浸漬し、次いで２×ＳＳＣ中で３０秒間洗浄してから一夜空気乾燥した。
【００７１】
ノーザン・ブロットのためのプローブは、製造者の使用説明書に従ってＭｅｇａｐｒｉｍｅ標識キットおよびα−３２Ｐ ｄＡＴＰ（どちらもＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｌ．、ＵＫ）を用いて標識した。ｇｌａＡプローブは、アスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ遺伝子（Ｂｏｅｌ他、１９８４）の配列中の座標＋１０５９から＋１６９６に対応する６３７ｂｐ断片とした。アクチン・プローブは、アスペルギルス・ニデュランスのγ−アクチン遺伝子（Ｆｉｄｅｌ他、１９８８）中の座標＋８８９から＋１６５４に対応する７６５ｂｐ断片とした。ｐｄｉＡプローブは、アスペルギルス・ニガーのｐｄｉＡ遺伝子（Ｎｇｉａｍ他、１９９７）の配列中の座標＋６３から＋３６５に対応する３０３ｂｐ断片とした。ｐｅｐＡプローブは、アスペルギルス・アワモリのアスペルギロペプシン遺伝子（Ｂｅｒｋａ他、１９９０）中の座標＋１１８６から＋１６３１に対応する４４５ｂｐフラグメントとした。ｂｉｐＡプローブは、アスペルギルス・ニガーのｂｉｐＡ遺伝子（ｖａｎ Ｇｅｍｅｒｅｎ他、１９９７）の座標＋７１２から＋１１５６に対応する４４５ｂｐフラグメントとした。すべてのプローブは、アスペルギルス・ニガーのゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）を用いてアガロース−ＴＡＥゲルから精製した。
【００７２】
プローブＤＮＡを加える前に、Ｈｙｂ９ハイブリダイゼーション溶液（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ、ＵＳＡ）中３０分間、６５℃においてブロットを予備交雑した。次いで、６５℃において一夜、ハイブリダイゼーションを行った。ブロットは、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中（６５℃，１５分間）２回、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中（６５℃，３０分間）で１回洗浄した。ブロットを可視化し、ＦｕｊｉＦｉｌｍ ＢＡＳ１５００バイオイメージングアナライザー(phosphorimaging system)を用いてバンド強度を定量した。ＲＮＡ負荷量は、γ−アクチン・プローブを用いて正規化した。グラフに示す図は、標的ｍＲＮＡシグナルとγ−アクチンのシグナルとの比を表している。シグナルは、各リン光イメージ・プレート上のブロットに対する曝露時間に左右される。様々なグラフ上の値は転写物の絶対レベルを表していないため、直接比較することはできない。
【００７３】
＜アスペルギルス・ニガー培養における遺伝子ｇｌａＡ、ｐｅｐＡ、ｐｄｉＡおよびｂｉｐＡの転写物レベルに対するＤＴＴの効果＞
図９は、ＤＴＴの時間経過実験（ストレス試剤の添加から１０時間、３回測定の平均シグナル）から得られた結果を示している。パート（Ａ）は、この期間のｇｌａＡ遺伝子の定常状態ＲＮＡレベルに対する効果を示している。明らかに分かるように、ＤＴＴ処理培養では、ｍＲＮＡの量が経時的に着実に減少し、半減期は約７０分であった。このことは、ｇｌａＡ ｍＲＮＡ合成の非存在下でのｇｌａＡ ｍＲＮＡのＴ１／２が約７０分であることを示す本研究室で行った培地交換試験のデータとよく相関している（図１０）。したがって、図９Ａにおける結果は、ＤＴＴ処理がｇｌａＡの転写を阻害し、ｇｌａＡ ｍＲＮＡのレベルの減少は生体内の正常な分解によることを示唆している。図９Ｂは、別の分泌タンパク質アスペロギロペプシン（ｐｅｐＡ）に対するＤＴＴストレスの効果を示している。この遺伝子は、培地のｐＨが酸性に傾いた場合にのみ誘導されるため、時間経過の後期まで転写は起こらない。データは、対照培養中ではｐｅｐＡ ｍＲＮＡのレベルの増加が認められるが、ＤＴＴ処理培養では有意な増加が認められないことを示している。図９ＣおよびＤは、アンフォールドタンパク質反応に関与する遺伝子に対するＤＴＴの効果を示している。示したｐｄｉＡおよびｂｉｐＡのどちらの遺伝子も、ストレス試剤の添加に迅速な反応を示す。この反応は一過性のようには見えず、逆にいうと長続きするようである。このことがＤＴＴ添加後の長時間にわたるメッセンジャーＲＮＡの産生によるものか当該ｍＲＮＡの長い半減期によるものかは不明である。
【実施例３】
【００７４】
グルコアミラーゼ・プロモーターの制御下にｐｄｉＡアンチセンス転写物を発現するアスペルギルス・ニガーの培養における遺伝子ｇｌａＡおよびｐｅｐＡの転写物レベル
ｐｄｉＡアンチセンス構築体を発現するアスペルギルス・ニガー菌株およびその親菌株におけるｇｌａＡおよびｐｅｐＡの発現を比較した。菌株の培養およびＲＮＡ分析の方法は実施例２に記載した。
【００７５】
図１１は、グルコアミラーゼ・プロモーターの制御下にｐｄｉＡアンチセンス配列の複数のコピーを含むアスペルギルス・ニガーＡＳ１．１と、親菌株のアスペルギルス・ニガーＡＢ４．１を比較し、炭素源としてデンプンを含有する培地上で培養した場合に得られたデータを示している。パネル（ａ）は、ｇｌａＡ遺伝子のｍＲＮＡレベルに対する効果を示している。最初の時点（２４時間目）からＡＳ１．１菌株におけるｇｌａＡ ｍＲＮＡのレベルは漸減を示すが、ＡＢ４．１では増加することが分かる。このことおよび図１におけるパネル（ａ）から分かるように、親菌株（ＡＢ４．１）におけるｇｌａＡ ｍＲＮＡのレベルは、正規化に用いたγ−アクチンのレベルに対しても実際に増加している。これは一部にはｇｌａＡ ｍＲＮＡの長い半減期に起因している可能性がある。すなわちｍＲＮＡの分解の速度が、合成の速度よりも有意に低くその結果このｍＲＮＡの集団が増えつづけるのであろう。パネル（ｂ）にはｐｅｐＡ遺伝子の転写に対する効果を示す。やはり、ＡＳ１．１におけるｍＲＮＡのレベルは親のＡＢ４．１に比べて著しく低かった。パネル（ｃ）は、この実験における乾燥重量測定値を示しており、アンチセンス構築物が発現した場合に真菌の生育に対する有意な効果はないことを示している。
【実施例４】
【００７６】
ｇｐｄＡプロモーターの制御下にｐｄｉＡアンチセンス転写物を構成的に発現するアスペルギルス・ニガーの培養における遺伝子ｇｌａＡの転写物レベルおよび分泌グルコアミラーゼのレベル
ｇｐｄＡプロモーターの制御下にｐｄｉＡアンチセンスｃＤＮＡを構成的に発現するアスペルギルス・ニガー菌株（ＡＳＧ６７株）およびその親菌株におけるｇｌａＡの発現を比較した。菌株の培養およびＲＮＡ分析の方法は実施例２に記載した。分泌されたグルコアミラーゼ・タンパク質レベルの分析については、各フラスコから培養濾液のサンプル７ｍｌを採取し、必要となるまで−２０℃で保存した。グルコアミラーゼの測定に用いた方法は、ＭａｃＫｅｎｚｉｅ他（１９９４）の方法とした。
【００７７】
図１２は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ・プロモーターの制御下にｐｄｉＡアンチセンス配列の複数のコピーを含むアスペルギルス・ニガーＡＳＧ６７と親菌株のＡＢ４．１を、炭素源としてデンプンを含有する培地上で培養し比較して得られたデータを示している。パネル（ａ）は、分泌グルコアミラーゼのレベルに対する効果を示している。これから分かるように、分泌グルコアミラーゼのレベルは経時的に両菌株中で増加するものの、アンチセンス菌株でのレベルは、特に真菌の生育後期には親菌株（ＡＢ４．１）でのレベルよりも低い。パネル（ｂ）では、ｇｌａＡ遺伝子の転写物レベルに対する効果を見ることができる。３６時間目で同一の転写物レベルに達した後、親菌株（ＡＢ４．１）では転写物レベルが漸増しているが、ｐｄｉＡアンチセンス菌株（ＡＳＧ６７）ではそうではない。パネル（ｃ）は、実験における乾燥重量測定値を示しており、アンチセンス構築体が発現した場合も真菌の生育に対して有意な効果は認められないことを示している。
【実施例５】
【００７８】
ｐｄｉＡアンチセンス転写物を構成的に発現するアスペルギルス・ニガーにおけるｈａｃＡ転写物のスプライシング
ｐｄｉＡアンチセンス配列を構成的に発現するアスペルギルス・ニガー菌株およびその親菌株において、アンフォールドタンパク質反応に対してプラスに作用する制御因子をコードするｈａｃＡ転写物のスプライシングを分析した。菌株の培養およびＲＮＡ分析の方法は実施例２に記載した。実験で使用するｈａｃＡプローブは、ＶＴＴにおいて単離されたｈａｃＡ ｃＤＮＡとした。同じ培養物が、実施例４におけるデータが得らるのに使用された。
【００７９】
図１３は、経時的なｈａｃＡのノーザン・ブロットを示している。アンフォールドタンパク質反応（ＵＰＲ）の誘導があった場合には、ゲル上にあるｍＲＮＡよりもわずかに低い第二のｍＲＮＡ分子種が現れるであろう。存在するｍＲＮＡはスプライシングされていないｈａｃＡと正確に同じサイズである。これらのデータは、ＵＰＲの誘導が存在しないことを示唆し、転写ダウンレギュレーション機構はＵＰＲとは区別され、異なったやり方で制御されていることを意味している。
【実施例６】
【００８０】
異種タンパク質を産生するトリコデルマ・リーセイ菌株における内因性分泌タンパク質をコードする遺伝子の発現レベル
＜培養物の分析に使用する菌株、培養条件および方法＞
ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ、Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ他、１９８６）を産生するトリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０株は、Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、１９８７に記載の方法を用い、図１４Ａに示す発現カセットで親菌株を形質転換することによって構築した。
【００８１】
ｔＰＡ産生菌株および親菌株Ｒｕｔ−Ｃ３０は、並行してバイオリアクター中で培養した。使用する培地は、ＶＴＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにおいて用いられるラクトースをベースにした緩衝化培地（ラクトース４０ｇ／ｌ、ペプトン４ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４２．８ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０．６ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ０．８ｇ／ｌ、微量元素を追加）とした。バイオマスの乾燥重量は、実施例７に記載のように測定した。培地中のラクトース濃度は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入したキットを用いて決定し、培地中の総タンパク質は、ＢｉｏＲａｄから購入したＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて測定し、ＨＥＣ活性は、（ＢａｉｌｅｙおよびＮｅｖａｌａｉｎｅｎ、１９８１；ＩＵＰＡＣ、１９８７）に記載のように測定し、ｔＰＡ濃度は、ＴＮＯ（オランダ）より提供されたＥＩＡキットを用いて測定した。ＲＮＡ単離およびノーザン分析は、実施例１、７、８、および９に記載のように行った。
【００８２】
＜ｔＰＡ産生菌株およびその親菌株における内因性細胞外タンパク質の発現＞
トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ（ヒト組織プラスミノゲン活性化因子）を産生する形質転換体で、内因性分泌タンパク質の産生および対応する遺伝子の発現について検討した。ｔＰＡは、真菌によって極めて少量産生され、宿主における様々なストレス反応を誘導することが期待される異種タンパク質の一例である。この形質転換体は、約５個の発現カセットのコピーを持つと推定され、ｃｂｈ１プロモーターの下でＣＢＨＩ融合タンパク質としてｔＰＡが産生される。
【００８３】
２つの菌株においてタンパク質産生および対応する遺伝子の発現を比較するため、バイオリアクター中で並行培養を行った。バイオマスの生成および炭素源ラクトースの消費を培養中に測定し、生育をモニターした（図１４Ｂ）。培地中に産生した総タンパク質およびセルラーゼ活性（基質ＨＥＣに対する活性で主にエンドグルカナーゼ活性を測定する）を培養の始めから終わりまで測定した（図１４Ｃ）。ノーザン分析を行い、培養物におけるｅｇｌ１（図１４Ｄ）、ｃｂｈ１（図１４Ｅ）およびｂｉｐ１（図１４Ｆ）の発現を分析した。ノーザンにおけるシグナルの正規化にはアクチンのシグナルを用いた。
【００８４】
２つの菌株は、培養中にどちらかと言えば同様に生育したが、ｔＰＡ産生菌株が培地中に産生した総タンパク質およびセルラーゼ活性は、親菌株に比べてかなり低かったことは明らかである。形質転換体によって産生されたｔＰＡは、産生された総タンパク質のわずかな部分に過ぎず、得られた最高収量は２５ｍｇ／ｌであった。ｔＰＡ産生培養菌における低いタンパク質産生と合致するように、細胞外エンドグルカナーゼＩをコードするｅｇｌ１およびセロビオヒドロラーゼＩをコードするｃｂｈ１の発現レベルも、ｔＰＡを産生する培養菌の方が低かった。ｔＰＡ産生培養中でシャペロン遺伝子ｂｉｐ１の発現が誘導され、異種タンパク質の産生によるＵＰＲなどのストレス反応の活性化を示している。このように、形質転換体における分泌タンパク質をコードする内因性遺伝子の低い発現レベルは、分泌ストレス中に働くダウンレギュレーション機構のためと考えられる。
【実施例７】
【００８５】
トリコデルマ・リーセイのＤＴＴ処理培養における完全長ｃｂｈ１プロモーターおよび最小ｃｂｈ１プロモーターの下でのリポーター遺伝子ｌａｃＺの発現−ダウンレギュレーションにおけるプロモーター配列の役割
＜ＲＮＡサンプルの分析に使用する培養条件、および方法＞
ＱＭ９４１４株（Ｍａｎｄｅｌｓ他、１９７１）ならびにそれに由来しｃｂｈ１プロモーターの下で大腸菌ｌａｃＺを発現するｐＭＩ３４およびｐＭＬＯ１６（Ｉｌｍｅｎ他、１９９６）を、０．０５％プロテオース・ペプトンおよび２０ｇ／ｌソルビトールまたはグリセロールを含有する最小培地上で培養した。８×１０７個の胞子を生育培地２００ｍｌに接種し、三角フラスコ中で２１０ｒｐｍで振盪しながら２８℃で培養した。培養開始２３時間後および３２時間後にα−ソホロース（１ｍＭ）を加え、ソルビトール培地上でセルラーゼ遺伝子発現を誘導した。培養開始４０時間後に１０ｍＭ ＤＴＴによる培養物の処理を開始した。ＲＮＡ単離のため菌糸体サンプルを採取し、実施例１に記載のようにノーザン分析にかけた。ソホロース誘導およびＤＴＴの処理の前後には、菌糸体サンプルを濾過し恒量になるまで１０５℃において乾燥する（２４時間）ことにより、培養物の乾燥重量を測定した。培養物の乾燥重量は、ＤＴＴによる処理の開始時には１．１〜１．４ｇ／ｌであった。
【００８６】
＜ＤＴＴ処理中のｃｂｈ１プロモーターの下でのリポーター遺伝子活性＞
ｍＲＮＡレベルのフィードバック制御が、その遺伝子のプロモーター配列によって仲介されるか否かを検討するため、リポーター遺伝子系を用いた。リポーター遺伝子発現カセットの概略図を図１５Ａに示す。大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を、トリコデルマ・リーセイ菌株のｃｂｈ１プロモーター、すなわち２．２ｋｂの完全長ｃｂｈ１プロモーターあるいは１６１ｂｐの最小プロモーターの下で発現させ、菌株をＤＴＴ処理している間の発現レベルを検討した。ｇｐｄ１のシグナルで正規化したｌａｃＺシグナルの定量を図１５Ｂに示す。ｌａｃＺ転写物レベルは、完全長ｃｂｈ１プロモーターの下で発現する場合にのみＤＴＴ処理中にダウンレギュレートされた。しかしながら、推定上のＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位を含む最小のｃｂｈ１プロモーターをｌａｃＺ発現に用いた場合には、その短いプロモーターは機能しかつソホロースによる誘導もできるにもかかわらず、ダウンレギュレーションは観察されなかった。ダウンレギュレーション機構がこれらの条件下でこれらの菌株で機能することを確認するために、ｅｇｌ１の転写物レベルを両菌株で分析した。この結果は、ｃｂｈ１プロモーター中の配列エレメントがダウンレギュレーションには必要であり、ｍＲＮＡの不安定性以外の機構がこのプロセスに関与していることを示している。
【実施例８】
【００８７】
トリコデルマ・リーセイのＤＴＴ処理培養における切り詰めｃｂｈ１プロモーターの下でのリポーター遺伝子ｌａｃＺの発現−分泌ストレス条件下にプロモーターのダウンレギュレーションに関与するプロモーター領域の同定方法
切り詰めｃｂｈ１プロモーターの下に大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を持つトリコデルマ・リーセイ菌株を培養し、実施例７に記載のようにＤＴＴで処理し、ｌａｃＺ遺伝子の発現を分析した（実施例７と同様）。図１６Ａは、様々な菌株におけるｌａｃＺ発現に使用したｃｂｈ１プロモーター構築物の概略図を示している。ＤＴＴで処理した培養および無処理培養におけるｌａｃＺ、ｅｇｌ１およびｇｐｄ１ ｍＲＮＡレベルのノーザン分析を図１６Ｂ、ＣおよびＤに示す。分泌ストレス条件（例えば、ＤＴＴ処理培養）の下でダウンレギュレーションを受けやすい内因性遺伝子の例としてｅｇｌ１のｍＲＮＡレベルを分析し、サンプル負荷の対照としてｇｐｄ１のシグナルを用いた。ｌａｃＺおよびｅｇ１ｌ ｍＲＮＡのシグナルを定量しｇｐｄ１のシグナルで正規化し、処理の様々な時点におけるＤＴＴ処理サンプルのシグナルと対照サンプル中のシグナルの比をグラフとして示す。ｃｂｈ１プロモーターの長さが１０２９ｂｐ以上である構築物を持つ菌株では（図１６Ｂに示す）、ＤＴＴによる処理中に２．２ｋｂの完全長ｃｂｈ１プロモーターの下で遺伝子を発現する菌株と同じ程度にｌａｃＺの発現が減少した。長さが３３９ｂｐから４９９ｂｐのｃｂｈ１プロモーターの下でｌａｃＺ遺伝子を発現する菌株では（図１６Ｃに示す）、ＤＴＴによる処理中にｌａｃＺ ｍＲＮＡのレベルが明らかに減少したが、完全長ｃｂｈ１プロモーターの下での発現とは同程度ではなく、この菌株におけるダウンレギュレーションの内部対照として用いたｅｇｌ１のｍＲＮＡレベルと同程度でもなかった。長さが１６１ｂｐから２０９ｂｐの切り詰めプロモーターの下でｌａｃＺ遺伝子を発現する菌株では（図１６Ｄに示す）、ＤＴＴによる処理中にｌａｃＺの強い発現（無処理培養中のシグナルに比較して）が検出された。これらの結果は、ｃｂｈ１プロモーターの場合には、ＤＴＴ処理中の発現レベルの減少に関与する領域は、翻訳開始コドンの上流１０２９ｂｐ領域内に位置し、開始コドンの上流の領域５００〜１０２９ｂｐおよび２０９〜３３９ｂｐに最も重要な領域が位置していることを示唆している。
【実施例９】
【００８８】
トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４および遺伝子ａｃｅ１に欠失を有するその誘導体のＤＴＴ処理培養におけるｃｂｈ１の発現
分泌ストレス条件下のセルラーゼプロモーターのダウンレギュレーションにおけるセルラーゼ制御因子ａｃｅ１が果たしている役割を検討するため、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４および遺伝子ａｃｅ１が欠失しているその誘導体（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ他、２０００）をＤＴＴで処理し、セルラーゼ発現について分析した。菌株をソルビトール含有培地上で培養し、ソホロースで誘導し、実施例７に記載したように１０ｍＭ ＤＴＴで処理した。ＲＮＡ分析のための菌糸体のサンプリングならびにノーザン分析は、実施例１および７に記載した通りである。処理中にｃｂｈ１の転写物レベルを定量し、シグナルはｇｐｄ１のシグナルで正規化した（図１７）。
【００８９】
トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０株の場合と同様（実施例１）、ＱＭ９４１４の培養物をＤＴＴ処理するとｃｂｈ１はダウンレギュレーションを受ける。しかしながら、ソルビトール含有培地で培養したａｃｅ１が欠失したＱＭ９４１４株の培養では、ＤＴＴによる処理中もｃｂｈ１が構成的に発現される。これらの特異的条件では、ｃｂｈ１プロモーターのダウンレギュレーションにとってａｃｅ１活性が必要であるように見える。しかしながら、発明者他は、他の培養条件（例えば、グリセロール含有培地上）では、ａｃｅ１活性が必要でないという証拠をつかんでおり、この制御機構にはまだ知られていない他の要因が関与していることを示した。
【実施例１０】
【００９０】
分泌ストレス条件下で遺伝子の転写ダウンレギュレーションの機構を欠く真菌変異株の単離
完全長ｃｂｈ１プロモーターの下で大腸菌ｌａｃＺリポーター遺伝子を発現するトリコデルマ・リーセイｐＭＬＯ１６株にＵＶ照射を用いて突然変異を起こさせ、ＢＦＡの存在という分泌ストレス条件下でｌａｃＺを発現することができる突然変異体を呈色反応に基づいてスクリーニングした。
【００９１】
１ｍｌ当たり１０７個の胞子を含有する胞子懸濁液に対し、胞子生存率が１５〜４６％となるようＵＶ照射を行った。変異処理した胞子は、マイクロタイター・プレート上、ウェル当たりおよそ３個の胞子を用い、炭素源としてソルビトールを含有する最小培地で培養した（実施例７と同じだが、ただしこの場合にはｐＨ７．０とした）。７日間培養した後、ソホロースおよびブレフェルジンＡを加えてｌａｃＺ発現を誘導すると同時に分泌ストレス条件を作り出した。ＢＦＡ存在下のｌａｃＺ産生の誘導は、培養中にＸ−ｇａｌを添加することによる呈色反応によって検出した。ｌａｃＺを発現する培養物をＰＤプレート上で純化し、ＢＦＡ存在下にｃｂｈ１プロモーターを誘導する（ｌａｃＺ発現を制御する）突然変異体の能力を確認した。図１８Ａは、ダウンレギュレーションを受ける完全長ｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺを発現するｐＭＬＯ１６の対照培養、ｃｂｈ１の最小プロモーター（分泌条件においてダウンレギュレートされない、実施例８も参照）の下でｌａｃＺを発現するｐＭＩ３３株、およびｌａｃＺ陰性菌株ＱＭ９４１４、それぞれにおけるｌａｃＺ活性を示している。呈色反応によって示されるように、ソホロース添加後、ＢＦＡの存在下ではｌａｃＺ産生が認められないか、ＢＦＡの非存在下ではｌａｃＺが産生される。図１８Ｂは、マイクロタイター・プレート培養における突然変異体のスクリーニングの一例を示している。分泌ストレス条件下でｌａｃＺを発現する突然変異体を呈色反応に基づいて単離することができる。対照として、ｐＭＬＯ１６の非突然変異誘発胞子をＢＦＡの存在下および非存在下にプレート上で培養した（四角で囲んだウェルを参照；ＢＦＡの非存在下のｌａｃＺ産生を示す陽性呈色反応、およびＢＦＡの存在下で陰性呈色反応）。
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【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】Ａ２３１８７、ＤＴＴおよびＢＦＡで処理した培養における総タンパク質合成および分泌。 Ａ）５μＭ Ａ２３１８７で処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）から調製した細胞抽出液中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。 Ｂ）５μＭ Ａ２３１８７で処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の培養上清中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。 Ｃ）１０ｍＭ ＤＴＴで処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）から調製した細胞抽出液中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。 Ｄ）１０ｍＭ ＤＴＴで処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の培養上清中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。 Ｅ）５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）から調製した細胞抽出液中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。 Ｆ）５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の培養上清中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。
【図２】時間を変えて５μＭ Ａ２３１８７、５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡあるいは１０ｍＭ ＤＴＴで処理し３５Ｓ−メチオニンで標識した培養からのＣＢＨＩの２Ｄ(２次元)ゲル分析。 Ａ）無処理対照培養、およびＡ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養から標識実験中の様々な時点で調製された細胞抽出液中の標識ＣＢＨＩ（時点は、標識メチオニン添加後の時間（分）として各パネル上に示す）。 Ｂ）Ａ２３１８７またはＢＦＡで処理した培養および無処理培養の標識１８０分後の培養上清からの標識ＣＢＨＩ。
【図３】ＣＢＨＩの合成および分泌。 Ａ）５μＭ Ａ２３１８７で処理した培養（白丸、○）中、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の、標識実験の様々な時点における細胞抽出液中の標識ＣＢＨＩの量 Ｂ）５μＭ Ａ２３１８７で処理した培養（白丸、○）中、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の、標識実験の様々な時点における培養上清中の標識ＣＢＨＩの量 Ｃ）１０ｍＭ ＤＴＴで処理した培養（白丸、○）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の標識実験の様々な時点における細胞抽出液中の標識ＣＢＨＩの量 Ｄ）１０ｍＭ ＤＴＴで処理した培養（白丸、○）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の標識実験の様々な時点における培養上清中の標識ＣＢＨＩの量 Ｅ）５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで処理した培養（白丸、○）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の、標識実験の様々な時点における細胞抽出液中の標識ＣＢＨＩの量 Ｆ）５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで処理した培養物（白丸、○）中、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の、標識実験の様々な時点における培養上清中の標識ＣＢＨＩの量
【図４】Ａ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養におけるｐｄｉ１およびｂｉｐ１発現のノーザン分析。 Ａ）様々な時点におけるＡ２３１８７による処理培養、および無処理対照培養中のｂｉｐ１およびｐｄｉ１の定常状態ｍＲＮＡレベル（ｇｐｄのシグナルで規格化したシグナル）(処理培養は黒い棒、対照培養は白い棒)。 Ｂ）様々な時点におけるＤＴＴによる処理培養、および無処理対照培養中のｂｉｐ１およびｐｄｉ１の定常状態ｍＲＮＡレベル（ｇｐｄのシグナルで規格化したシグナル）(処理培養は黒い棒、対照培養は白い棒)。 Ｃ）様々な時点における、ＢＦＡによる処理培養および無処理対照培養中のｂｉｐ１およびｐｄｉ１の定常状態ｍＲＮＡレベル（ｇｐｄのシグナルで規格化したシグナル）(処理培養は黒い棒、対照培養は白い棒)。
【図５】ＢＦＡおよびＡ２３１８７で処理した培養（黒い棒）および無処理対照培養（白い棒）中のｈａｃ１ ｍＲＮＡのノーザン分析。
【図６】様々な時間Ａ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養（黒い棒）中および無処理対照培養（白い棒）中のｃｂｈ１およびｅｇｌ１のノーザン分析。
【図７】ＤＴＴ処理中の、トリコデルマ・リーセイにおけるｘｙｎ１およびｈｆｂ２タンパク質のノーザン分析（ｇｐｄのシグナルで規格化したシグナル）。
【図８】ＤＴＴによる処理中にダウンレギュレートされない転写物のノーザン分析：分泌経路の成分をコードするｙｐｔ１およびｓａｒ１、未知の機能のｃＤＮＡ１、および細胞内β−グルコシダーゼをコードするｂｇｌ２のシグナル（シグナルは、ｇｐｄのシグナルで規格化した）。
【図９Ａ】アスペルギルス・ニガーからの遺伝子の転写に対するＤＴＴの効果：グルコアミラーゼ遺伝子、ｇｌａＡ（３回測定の平均シグナル）（実線はＤＴＴ処理培養を示し、破線は水処理対照を示す）
【図９Ｂ】アスペルギルス・ニガーからの遺伝子の転写に対するＤＴＴの効果：酸性プロテアーゼであるアスペルギロペプシン遺伝子（ｐｅｐＡ）（３回測定の平均シグナル）（実線はＤＴＴ処理培養を示し、破線は水処理対照を示す）
【図９Ｃ】アスペルギルス・ニガーからの遺伝子の転写に対するＤＴＴの効果：ＥＲ中の常在フォルダーゼ（ｆｏｌｄａｓｅ）であるタンパク質ジスルフィド異性化酵素（ｐｄｉＡ）（３回測定の平均シグナル）（実線はＤＴＴ処理培養を示し、破線は水処理対照を示す）
【図９Ｄ】アスペルギルス・ニガーからの遺伝子の転写に対するＤＴＴの効果：ＥＲ−常在シャペロンであるｂｉｐＡ（３回測定の平均シグナル）（実線はＤＴＴ処理培養を示し、破線は水処理対照を示す）
【図１０】炭素源としてデンプンを含有する培地を炭素源としてキシロースを含有する培地に交換することがアスペルギルス・ニガーＡＢ４．１におけるｇｌａＡの転写に与える効果（交換はＴ＝０で行い、結果は２回の測定の平均を示す）
【図１１Ａ】グルコアミラーゼ遺伝子の転写に対するアンチセンスｐｄｉＡの効果（ｇｌａＡ、２つの異なる実験からの６個のフラスコの平均シグナル）（菌株ＡＢ４．１は実線で示し、菌株ＡＳ１．１は破線で示す。）
【図１１Ｂ】アスペルギロペプシン遺伝子の転写に対するアンチセンスｐｄｉＡの効果（ｐｅｐＡ、２つの異なる実験からの６個のフラスコの平均シグナル）（菌株ＡＢ４．１は実線で示し、菌株ＡＳ１．１は破線で示す。）
【図１１Ｃ】培養の乾燥重量測定（２つの異なる実験からの６個のフラスコの平均シグナル）
【図１２Ａ】ｇｐｄＡプロモーターの制御下にアンチセンスｐｄｉＡを発現するアスペルギルス・ニガーの分泌グルコアミラーゼ・タンパク質のレベル。（データは各時点の３回測定の平均であり、菌株ＡＢ４．１は黒い棒で示し、菌株ＡＳＧ６７は灰色の棒で示す）。
【図１２Ｂ】ｇｐｄＡプロモーターの制御下にアンチセンスｐｄｉＡを発現するアスペルギルス・ニガーにおけるｇｌａＡ ｍＲＮＡの定常状態レベル。（菌株ＡＢ４．１は実線で示し、菌株ＡＳＧ６７は破線で示す）。
【図１２Ｃ】培養の乾燥重量測定（菌株ＡＢ４．１は実線で示し、菌株ＡＳＧ６７は破線で示す）。
【図１３】ｈａｃＡをプローブとした、アスペルギルス・ニガーＡＢ４．１およびＡＳＧ６７のノーザン・ブロット分析。レーン１〜７は、２４、３６、４８、６０、７２、８４および９６時間におけるアスペルギルス・ニガーＡＢ４．１のサンプルを示し、レーン８〜１４は、同じ時点におけるアスペルギルス・ニガーＡＳＧ６７（アンチセンスｐｄｉＡ菌株）について示す。
【図１４Ａ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０においてｔＰＡを産生するための発現カセット
【図１４Ｂ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：増殖をモニターするため培養中に測定されたバイオマス乾燥重量およびラクトース濃度。
【図１４Ｃ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：培地中で産生される総タンパク質およびＨＥＣ活性（セルラーゼ、特にエンドグルカナーゼ、活性を測定する）。
【図１４Ｄ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：分泌タンパク質をコードする遺伝子の例として分析されたｅｇｌ１の転写物レベル（アクチン遺伝子のシグナルで規格化）。
【図１４Ｅ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：ｃｂｈ１およびｃｂｈ１−ｔＰＡ融合物の転写物レベル（アクチン遺伝子のシグナルで規格化）
【図１４Ｆ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：培養中のｂｉｐ１の転写物レベル（アクチン遺伝子のシグナルで規格化）
【図１５】ｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺリポーター遺伝子の発現 Ａ）１０ｍＭ ＤＴＴ存在下の発現試験に用いたｌａｃＺ発現カセットの概略図：菌株ｐＭＬＯ１６中では完全長ｃｂｈ１プロモーターの下で、菌株ｐＭＩ３４中では切り詰めプロモーターの下でのｌａｃＺ発現。 Ｂ）菌株ｐＭＬＯ１６中（左のグラフ）および菌株ｐＭＩ３４中（右のグラフ）において１０ｍＭ ＤＴＴ処理培養（黒い棒）および無処理対照培養（白い棒）中のｌａｃＺおよびｅｇｌ１のｍＲＮＡレベル（ｇｐｄシグナルで規格化）。
【図１６Ａ】様々な程度に欠失させたｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺリポーター遺伝子の発現：分泌ストレス条件の下でプロモーターの活性を検討するためトリコデルマ・リーセイにおける大腸菌ｌａｃＺ発現のために使用したｃｂｈ１プロモーターの欠失シリーズの略図
【図１６Ｂ】様々な程度に欠失させたｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺリポーター遺伝子の発現：菌株ｐＭＬＯ１６、ｐＭＬＯ１６Ｓ、ｄｅｌ１（１）Ｓおよびｄｅｌ０（２）ＳのＤＴＴ処理培養および同一菌株の無処理培養におけるｌａｃＺ、ｅｇｌ１およびｇｐｄ１の発現のノーザン分析。処理の時点は、処理の開始からの時間（分）として各レーンの上部に示す。各時点におけるＤＴＴ処理培養中の相対ｍＲＮＡレベル（無処理対照培養中のｍＲＮＡレベルを１と設定した）は、右のグラフに示す（ｌａｃＺシグナル、白丸；ｅｇｌ１シグナル、黒い菱形）
【図１６Ｃ】様々な程度に欠失させたｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺリポーター遺伝子の発現：Ｂ）と同様な、菌株ｄｅｌ２３、ｄｅｌ５（１１）Ｓ、ｄｅｌ５（１１）およびｄｅｌ６（１４）のノーザン分析
【図１６Ｄ】様々な程度に欠失させたｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺリポーター遺伝子の発現：Ｂ）と同様な、菌株ｄｅｌ７（５）Ｓ、ｐＭＩ３３およびｐＭＩ３４のノーザン分析
【図１７】トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４およびａｃｅ１遺伝子が欠失したＱＭ９４１４の培養におけるＤＴＴ処理中のｃｂｈ１ ｍＲＮＡレベル
【図１８Ａ】分泌ストレス条件の下で遺伝子のダウンレギュレーションの機構を欠いた真菌変異体のスクリーニング：菌株ｐＭＬＯ１６、ｐＭＩ３３およびＱＭ９４１４のマイクロタイター平板培養をＢＦＡおよびソホロースの存在下および非存在下でｌａｃＺ産生を試験した。ｌａｃＺ産生は暗色反応として検出した
【図１８Ｂ】分泌ストレス条件の下で遺伝子のダウンレギュレーションの機構を欠いた真菌変異体のスクリーニング：マイクロタイター平板培養における、ＢＦＡ存在下でのソホロース誘導後のｌａｃＺの発現についての変異体のスクリーニング。ｌａｃＺ産生変異体は、Ｘ−ｇａｌ基質の添加後に暗色反応に基づいて検出した。変異誘発されていないｐＭＬＯ１６の培養は、ＢＦＡの存在下および非存在下ソホロース誘導後にｌａｃＺ産生についてアッセイした（四角で囲んだウェル）
【０００１】
本発明は、真菌における分泌タンパク質の産生のための最適化された方法に関する。特に、本発明は、本方法で使用されるＤＮＡ配列、プロモーターおよび真菌宿主に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の真菌、特にトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）およびアスペルギルス・ニガーは、タンパク質生産のためにバイオテクノロジー産業で広く使用されている。通常、組換えタンパク質は、それが異種タンパク質であれ同種タンパク質であれ、真菌において分泌タンパク質をコードし大量に発現している遺伝子のプロモーター、例えばトリコデルマ・リーセイのプロモーターであるｃｂｈ１およびアスペルギルス・ニガーのプロモーターであるｇｌａなどの制御の下で産生される。トリコデルマ・リーセイおよびアスペルギルス・ニガーは、同種加水分解酵素を培地中に極めて効率的に産生するが、生産される異種タンパク質の収量は、同種タンパク質の収量に比べて通常かなり低い。特に、遠い種、例えば哺乳動物を起源とするタンパク質の産生は極めて低レベルである（ＡｒｃｈｅｒおよびＰｅｂｅｒｄｙ、１９９７、Ｐｅｎｔｔｉｌａ、１９９８）。低収率の理由としては、ポリペプチドの翻訳および分泌経路への移行が非効率なこと、タンパク質のフォールディングおよび輸送の妨害、ならびにｍＲＮＡが不安定で異種遺伝子の転写レベルが低いことなどが示唆されている（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ他１９９３、Ｇｏｕｋａ他１９９７）。
【０００３】
タンパク質フォールディングと輸送の障害は、異種タンパク質の産生中に起こりやすく、細胞中でストレス反応を誘導することが知られている。近年、細胞がタンパク質フォールディングおよびプロセシングのために特化された環境であるＥＲの内腔の状態を感知して正常の機能の動揺に対応することができる２つのフィードバック機構が報告されている。これらの機構はアンフォールドタンパク質応答（Ｕｎｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＵＰＲ）を構成し、この応答は、１つはＥＲの内腔におけるアンフォールドタンパク質の存在に反応してシャペロンおよびフォールディング触媒をコードする遺伝子の転写活性（Ｓｈａｍｕ他、１９９４）の増加であり、もう１つは真核生物の開始因子２αのリン酸化の増加でこれは細胞において翻訳活性をダウンレギュレートする（Ｈａｒｄｉｎｇ他、１９９９）。酵母および哺乳類細胞の小胞体におけるアンフォールドタンパク質に対する細胞応答が最近Ｍｏｒｉによって概説されている（２０００）。
【０００４】
しかしながら、これらのストレス条件において内因性分泌タンパク質をコードする遺伝子の転写制御についてはほとんど知られていない。特に、細胞のタンパク質をフォールディングし輸送する能力の限界に応じた分泌タンパク質をコードする遺伝子のフィードバック制御に関するデータは一切報告されていない。場合によっては、異種遺伝子が同時に発現された場合、内因性細胞外タンパク質をコードする遺伝子の転写物レベルは対照菌株における発現に比べて低いことが観察されている（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ他１９９６）。遺伝子の効率的な発現に必要な転写／制御因子の量が異種遺伝子の複数のコピーの発現中に不足するからではないかと説明されている。
【０００５】
分泌タンパク質をコードする遺伝子の様々な炭素源および窒素源における制御については糸状菌で詳細に検討されており、トリコデルマ・リーセイにおけるセルラーゼおよびヘミセルラーゼの発現がその好例である。トリコデルマ・リーセイでは、セルラーゼおよびヘミセルラーゼの発現は、環境要件および栄養素の利用可能性によく適応している。複雑な植物材料を含む培地では、（ヘミ）セルラーゼ遺伝子群は協調的に誘導されるが、特異的誘導機構も知られている（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ他１９９７）。セルロースおよびラクトースまたはソホロースなどのある種のオリゴ糖は、遺伝子の効率的インデューサーであることが知られている。グルコースの存在下では、セルラーゼおよびヘミセルラーゼの発現は異化代謝産物抑制（カタボライト・リプレッション）機構によって厳重に抑制されている。セルラーゼ遺伝子発現の制御に関与するいくつかの制御因子が単離されており、これにはグルコース・リプレッサー遺伝子ｃｒｅ１およびセルラーゼ遺伝子活性化因子として機能すると仮定されてきた遺伝子（ａｃｅ１およびａｃｅ２）が含まれる（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ他２０００）。
【０００６】
具体的に、ソホロースによって誘導されグルコースの存在によって抑制されない、タンパク質コード領域の上流にあるトリコデルマ・リーセイｃｂｈ１プロモーターのヌクレオチド配列からなる改変トリコデルマ・プロモーターが米国特許第６，００１，５９５号に記載されている。この公報は、−１８４から−１、−１６１から−１、−１４０から−１および−１６１から−１３３の領域について述べている。この公報は端を切り落としたｃｂｈ１の領域について記載しているが、それらをストレス条件下での分泌タンパク質の産生に使用することは提案していない。このプロモーターは、グルコースまたはソホロースの存在下でタンパク質を産生するように設計されている。国際特許出願ＷＯ９８／２３６４２はセルラーゼ制御因子ａｃｅ１およびａｃｅ２について記載し、タンパク質産生の活性化因子として使用することについて記載し、因子の過剰発現によるヘミ（セルラーゼ）発現の改良を示唆している。グルコース抑制解除をもたらす改変体は、ＷＯ９４／０４６７３に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、糸状菌における分泌タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが、タンパク質合成、フォールディングまたは輸送が障害されると低下するという新規知見に基づいている。この制御機構は、タンパク質合成、フォールディングまたは輸送を妨害する化学薬品（それぞれＤＴＴ、Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７、ブレフェルジンＡ）で処理した培養中、または機能的に不完全なタンパク質フォールディング系を有する菌株（遺伝子ｐｄｉＡに対してアンチセンス転写物を発現する菌株）中で働いていることが立証されている。さらに、ｔＰＡ（組織プラスミノゲン活性化因子）などの異種タンパク質を産生する菌株では、ＵＰＲが活性化されかつ分泌タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現レベルが低くなることが示された。発明者は、糸状菌における分泌タンパク質の産生中にこのタイプのフィードバック制御が起きることを初めて見いだした。
【０００８】
分泌タンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーションまたはフィードバック制御と呼ばれるこの現象が、分泌タンパク質をコードする遺伝子またはそれらのプロモーターを選択的に制御し選ばれたタンパク質の産生を増強するために、本発明で利用される。このことは、分泌タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター配列を遺伝子改変し、転写ダウンレギュレーションに対する反応性を変化させることによって達成される。あるいは、ダウンレギュレーションに関与する制御因子、または対応するシグナル伝達経路における因子をコードする遺伝子を、ダウンレギュレーションをなくすかあるいは増強するように改変することができる。通常は分泌ストレス下でダウンレギュレーションを受けるプロモーターの制御下で対象タンパク質の産生が行われる場合には、ダウンレギュレーション機構の不活性化が有益である。例えば、対象タンパク質の発現がダウンレギュレーションを受けないプロモーターの下で行われる場合には、ダウンレギュレーションの増強を利用して他のタンパク質の産生を抑制することができる。
【０００９】
本発明では、分泌可能なタンパク質のプロモーター中に位置する特異的な制御領域すなわちＤＮＡ配列が転写のダウンレギュレーションに関与することを見いだした。
より具体的には、真菌において分泌可能なタンパク質のプロモーター中に位置するＤＮＡ配列の特徴は主に、請求項１の特徴部分に記載されている。
【００１０】
分泌ストレス下で分泌タンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与するプロモーター中のＤＮＡ配列を変異、不活性化または除去して、遺伝子のダウンレギュレーションをなくすか低下させることができる、あるいはプロモーター配列の改変により、例えばダウンレギュレーションを受ける反応性プロモーター要素を増幅することにより遺伝子のダウンレギュレーションを増強することができる。
より具体的には、分泌可能なタンパク質のプロモーターの特徴は主に、請求項６の特徴部分に記載されている。
【００１１】
真菌宿主における改良されたタンパク質産生のためのプロモーターを作製する方法は、請求項１０の特徴部分に記載されている。
本発明を用い、タンパク質産生に用いられるプロモーターの効率を向上することおよび／または分泌タンパク質の制御システムを操作することによりタンパク質産生に優れた菌株を設計することができる。
より具体的には、最適化されたタンパク質産生のための真菌宿主菌株は主に、請求項１２の特徴部分に記載されている。
【００１２】
改良されたタンパク質産生のための真菌宿主を産生する方法は主に、請求項２６および２７の特徴部分に記載されている。
本発明は、遺伝子の発現が非改変プロモーターの場合と同じようにはダウンレギュレーションを受けないように、同種であれ異種であれ、あるタンパク質の産生に使用される同種または異種プロモーターを改変するのに用いることができる。特に、本発明は、異種タンパク質を産生するのに有用であるが、同種タンパク質の産生にも応用することができる。
【００１３】
さらに、本発明は、プロモーターのダウンレギュレーションに関与する制御因子の不活性化または活性もしくは発現を低下させるのに使用して、そのプロモーター、プロモーターに結合する制御因子あるいは反応に関与する制御因子の下でのタンパク質産生を改良することができる。
真菌において分泌可能なタンパク質の生産を最適化する方法の特徴は主に、請求項２８および３０の特徴部分に記載されている。
【００１４】
本発明を用いる１つの可能性は、ダウンレギュレーションを受けないプロモーターの下で同種または異種タンパク質を発現させているときに他の同種分泌タンパク質の産生を低下させるために制御因子を過剰発現させることである。このような場合、異種タンパク質は、例えばトリコデルマｇｐｄなどのプロモーターの下で発現かつ分泌され、ストレス条件において影響を受けない。同種分泌タンパク質は、ダウンレギュレートされたプロモーターの下で発現される。ダウンレギュレーションに関与するタンパク質をコードする遺伝子は過剰発現される。
【００１５】
また真菌における最適化された分泌可能なタンパク質の生産方法の特徴は主に、請求項３１の特徴部分に記載されている。
本発明に従って調製されたＤＮＡ配列、プロモーターまたは真菌宿主の使用法の特徴は、請求項３１に記載されている。
本発明の他の特徴、態様および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかになるはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書では、用語「内因性タンパク質」は、微生物宿主の本体の産物であるタンパク質を意味する。
本明細書では、「組換えタンパク質」は、微生物の本来の産物ではないタンパク質を意味する。所望の同種または異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切な方法によって宿主に伝達することができる。「同種タンパク質」は、同一微生物種によって産生されるタンパク質を意味する。「異種タンパク質」は、別の微生物種によって産生されるタンパク質を意味する。
【００１７】
本明細書では、「分泌可能なタンパク質」または「分泌タンパク質」は、宿主細胞の外側、培地中に分泌されるタンパク質を意味する。
「改良されたタンパク質産生」は、タンパク質の産生が、ダウンレギュレーションを変えるための遺伝子組換えしていない真菌宿主菌株を用いた場合に比べ、少なくとも３％、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも３０％多いことを意味する。
【００１８】
本明細書では、「分泌ストレス」または「分泌ストレス条件」は宿主の分泌能力が抑制されている、あるいは分泌経路に負担がかかり過ぎていることを意味する。この抑制は、例えば異種タンパク質の産生または同種タンパク質量の増加によって引き起こされる。あるいはタンパク質の合成やフォールディング、輸送等を妨害する毒素（例えば、イオノフォア、ＤＴＴまたはブレフェルジンＡ（＝ＢＦＡ））によることもある。また、この抑制は、遺伝的手段によりフォールディングまたは分泌経路を変更すること、例えばタンパク質のフォールディングまたは輸送に必要な成分の活性を増強または不活性化することによって引き起こされることもある。しかしながら、ＵＰＲと同様に、この分泌タンパク質遺伝子の転写ダウンレギュレーションの機構は、生物体が分泌タンパク質の合成とフォールディングおよび分泌能力のバランスをとるための自然の機構と考えられ、分泌同種タンパク質の合成が誘導された場合などの多くのタンパク質産生条件でも（部分的に）起こることがある。
【００１９】
本明細書では、「ダウンレギュレーション」、「転写ダウンレギュレーション」または「フィードバック制御」とは、タンパク質に対応するｍＲＮＡレベルが前述の細胞性応答が原因で低下することを意味する。このダウンレギュレーション効果は、分泌タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルの遺伝子を測定することによって示された。
【００２０】
本発明によれば、分泌タンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列は、分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター中に見いだすことができる。このことは、制御因子などの細胞機構の作用に対する応答の１つとして、遺伝子産物をダウンレギュレートすることができる領域をプロモーターが含んでいることを意味する。
【００２１】
前述のように、分泌ストレスの下で遺伝子のダウンレギュレーションを分析するには様々な条件を用いることができる。それらの条件には、例えば、分泌タンパク質（異種または内因性タンパク質）を過剰生産させる、ＤＴＴ、ＢＦＡもしくはＣａイノフォアのような毒素を用いる、または遺伝的手段によりフォールディングまたは分泌経路を改変する（例えばタンパク質のフォールディングまたは輸送に必要な成分の活性を増強または不活性化する）ことなどがある。本発明では、培養をＤＴＴ、ＣａイオノフォアＡ２３１８７、ＢＦＡなどで処理すること、異種分泌タンパク質（組織プラスミノゲン活性化因子）を発現させること、あるいは遺伝子操作（アンチセンス技法）によってフォールディング機構を低下させることによって分泌ストレスを模倣した。
【００２２】
本発明の目的上、あるプロモーターを含む宿主を（前述のような）分泌ストレス条件の下で培養した場合、そのプロモーターの支配下にあるｍＲＮＡ量が宿主を非分泌ストレス条件で培養した場合に得られるｍＲＮＡ量に比べ少なければ、そのプロモーターは転写ダウンレギュレーション（すなわちダウンレギュレーション）に関与するＤＮＡ配列を含んでいると規定される。
【００２３】
同様に、本発明の目的上、ある宿主を(前述のような)分泌ストレス条件で培養した場合に得られる１つまたは複数の分泌タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子のｍＲＮＡ量が、その宿主を非分泌ストレス条件の下で培養した場合に少なくなれば、その宿主は転写ダウンレギュレーションすなわちダウンレギュレーションに関与する制御因子などの機構を備えていると規定される。
【００２４】
このダウンレギュレーション効果は、前述のように分泌ストレスの下で遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定することによって判明する。本発明の目的上、１つまたは複数の分泌タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルに測定可能な変化を示すことができれば、転写ダウンレギュレーションに関与する機構に対する応答についてプロモーターまたは宿主を遺伝子改変する。言い換えれば、選択された分泌可能なタンパク質の発現（ｍＲＮＡ量）を増加または低下させる。この変化は、非改変プロモーターまたは非改変宿主に比べ、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらにより好ましくは３０％以上、最も好ましくは５０％以上の増加または減少である。
【００２５】
本発明の目的上、「リポーター・タンパク質」は、その発現または量を分析することができるすべての遺伝子またはタンパク質である。前述のように転写ダウンレギュレーションに関与するプロモーターまたは宿主の能力を試験する場合には、リポーター・タンパク質のｍＲＮＡレベルを分析することができる。
【００２６】
分泌タンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列または領域は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、ハイドロフォビン、プロテアーゼ、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、スウォレニン（ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ）、およびペクチナーゼなどのタンパク質をコードする様々な遺伝子のプロモーター中に位置する。
ＤＮＡ配列は、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ｓｗｏ、ｇｌａ、ａｍｙ、およびｐｅｐＡのプロモーターを含む群から選択されるプロモーター中に位置していることが好ましい。
【００２７】
本発明は、トリコデルマおよびアスペルギルスにより分泌されるタンパク質をコードする多くの遺伝子が転写ダウンレギュレーション機構に支配されることを示している。本発明による分泌可能なタンパク質のプロモーターは、トリコデルマ属の効率的に分泌される加水分解酵素のプロモーターであることが好ましい。プロモーターは、トリコデルマのセルラーゼまたはヘミセルラーゼのプロモーターであることがより好ましい。プロモーターは、トリコデルマのｃｂｈ１であることが最も好ましい。また、分泌可能なタンパク質のプロモーターは、アスペルギルス属の効率的に分泌される加水分解酵素のプロモーターであってもよい。プロモーターは、アスペルギルスのプロテアーゼまたはデンプン分解酵素遺伝子のプロモーターであることが好ましい。プロモーターは、ｇｌａ、ａｍｙまたはｐｅｐＡであることがより好ましい。
【００２８】
本発明に例示するように、分泌可能なタンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列は、トリコデルマｃｂｈ１プロモーターの−１６２位の上流（配列番号５）に見いだすことができる。あるいは、−１８８位の上流（配列番号２）、−２１１位の上流（配列番号３）、−３４１位の上流（配列番号４）、−３９１位の上流（配列番号１）、−５０１位の上流（配列番号８）、−７４１位の上流（配列番号９）、−８８１位の上流（配列番号１０）に見いだすことができる。しかしながら、それらは−１０３１位の下流（配列番号１１）、−１２０１位の下流（配列番号７）、または−１２８１位の下流（配列番号６）に位置しているようである。したがって、ｃｂｈ１プロモーター中の分泌可能なタンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列は、ヌクレオチド−１０３１と−１６２の間に位置しているようである。最も重要な領域はヌクレオチド−２１１と−３４１の間および−５０１と−１０３１の間である。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、分泌可能なタンパク質のプロモーターは、ダウンレギュレートされないように、またはダウンレギュレーションが軽減されるように遺伝子改変される。
【００３０】
本発明に従って改変されたプロモーターでは、分泌タンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡの効果は様々な変異方法によって減少し、または配列が不活性化もしくは除去されることがある。例えば、分泌可能なタンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列が除去されたプロモーターは、トリコデルマｃｂｈ１プロモーターの−５０１の上流、−１８８の上流、−２１１の上流、−３４１の上流、−３９１の上流、−１６２の上流、−８８１の上流および−７４１の上流のヌクレオチドを欠くプロモーターで、それぞれ（配列番号１６）（配列番号１７）（配列番号１８）（配列番号１１９）（配列番号２０）（配列番号２１）（配列番号２２）（配列番号２３）にあたる。
【００３１】
本発明に従って改変された別のプロモーターでは、標準的な分子生物学の方法を用い、ダウンレギュレーションに関与することを担う配列を増幅することによって分泌タンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡの効果を増すことができる。
分泌可能なタンパク質の最適化された産生のため、分泌タンパク質をコードする遺伝子の分泌ストレスの下での転写をダウンレギュレートする機構を遺伝子改変した真菌宿主菌株を構築することができる。
【００３２】
本発明の一実施形態によれば、本発明の真菌宿主菌株は、分泌タンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡの効果が減少もしくは除去されたプロモーター、または分泌タンパク質のダウンレギュレーションに関与するＤＮＡの効果が増加したプロモーターを有することができる。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、真菌宿主中での転写ダウンレギュレーションに関与する制御因子の発現を遺伝子改変することができる。所望ならば、制御因子の発現を軽減もしくはなくすこともできるし、制御因子の発現を増加させることもできる。
【００３４】
本発明は、細胞外分泌タンパク質をコードする多くの遺伝子が、この制御機構を明らかにするために用いられた条件下では、転写的にダウンレギュレートされていること、分泌タンパク質をコードする遺伝子は、ほとんど全部ではないとしても多くがこの転写ダウンレギュレーションの下にあることを示している。制御機構の下にある遺伝子、プロモーターおよびタンパク質は、セルラーゼ（セロビオース加水分解酵素、エンドグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼなど）、ヘミセルラーゼ（キシラナーゼ、マンナーゼ）、β−キシロシダーゼなど、およびアラビノシダーゼ、グルクロニダーゼ、アセチル・キシラン・エステラーゼなどの側鎖切断酵素）、デンプン分解酵素（α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、シクロデキストリナーゼなど）ハイドロフォビン、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、アスペルギロペプシン）、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、様々なペクチナーゼ（エンドおよびエキソポリガラクツロナーゼ、ペクチン・エステラーゼ、ペクチンリアーゼおよびペクチン酸性リアーゼ）およびリグニナーゼ（リグニン・ペルオキシダーゼ、Ｍｎペルオキシダーゼ、ラッカーゼなど）を含む群から選択することができる。
【００３５】
制御機構は、遺伝子ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ｓｗｏ、ｇｌａ、ａｍｙ、およびｐｅｐＡによってコードされるタンパク質を含む群から選択されるタンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与している。
例えば制御因子はａｃｅ１遺伝子によってコードされているものであるが、ａｃｅ１以外の因子もこのダウンレギュレーションに関与している。このことは、実施例の、ａｃｅ１がすべての培養条件で制御（の主要部）を担ってはいないという事実によって示される。
【００３６】
制御機構は、トリコデルマ属の加水分解酵素を制御するものであることが好ましい。トリコデルマのセルラーゼまたはヘミセルラーゼを制御していることがより好ましい。制御因子は、アスペルギルス属の加水分解酵素を制御するものでもよい。アスペルギルスのプロテアーゼまたはデンプン分解酵素を制御していることが好ましい。
【００３７】
本明細書では、「真菌産生宿主」は、所望の産物を効率的に産生するために選択または遺伝子改変されたいかなる真菌宿主菌株も意味し、例えば分析的、医学的または工業的用途のタンパク質産生に有用である。宿主菌株は、目的産物を効率的に産生するために遺伝子工学的手段によって改変された組換え菌株であることが好ましい。
【００３８】
本発明はここではトリコデルマおよびアスペルギルスの２つの真菌で例示し、転写のダウンレギュレーション機構の一般的性質を示す。他の真菌でもこの機構の改変はタンパク質産生の改良に有用なはずである。
【００３９】
本発明の真菌宿主菌株は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フザリウム属、ペニシリウム属、フミコラ属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア属、ハンゼヌラ属、カンジダ属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、スキゾサッカロミセス属およびサッカロミセス属を含む群から選択することができる。宿主は、トリコデルマまたはアスペルギルス属、例えばトリコデルマ・ハルジアナム(T. harziamun)、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（T. ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ビリデ（T. ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギー(T. koningii)、アスペルギルス・ニデュランス(A. nidulance)、アスペルギルス・テレウス(A. terreus)、アスペルギルス・フィクム（T. ｆｉｃｕｍ）、アスペルギルス・オリザエ(A. oryze)およびアスペルギルス・アワモリ(A. awamori)に属していることが好ましい。宿主は、トリコデルマ・リーセイ（ヒポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina））またはアスペルギルス・ニガーに属していることが最も好ましい。
【００４０】
真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法は、
−分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子を選択する工程、
−分泌ストレスの下で分泌タンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与する機構に応じて遺伝子のプロモーターを遺伝子改変する工程、
−真菌宿主においてプロモーターの制御の下で所望の分泌可能なタンパク質を産生する工程、および
−宿主の培地からタンパク質産物を回収する工程を含む。
【００４１】
本発明によれば、真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法は、
−適切な培地中で上記で定義した真菌宿主を培養する工程、および
−培地からタンパク質産物を回収する工程を含む。
【００４２】
タンパク質産物は、細菌または高等もしくは下等真核生物に由来するいかなる産物であってもよく、タンパク質産物は、真菌または哺乳類起源に由来してもよい。タンパク質産物は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、ハイドロフォビン、プロテアーゼ、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、ペクチナーゼなどの加水分解酵素であってもよく、または免疫グロブリンまたはｔＰＡなどのいかなる哺乳類タンパク質であってもよい。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、タンパク質産物を転写ダウンレギュレーションを受けにくいプロモーターから発現させ、その他の望ましくないタンパク質は、ダウンレギュレーションによって制御されるプロモーターから発現させることができる。ダウンレギュレーションを増強することにより、生産を転写ダウンレギュレーションを受けにくいプロモーターから発現されるタンパク質産物にふりむけることができる。このようなプロモーターはｇｐｄなどの構成性プロモーターであってもよい。
【００４４】
真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法は、
−分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子を選択する工程、
−転写ダウンレギュレーションの機構によって制御不可能なプロモーター中に、選択された分泌可能なタンパク質のコード領域を動作可能に連結する工程、
−適切な培養条件の下で真菌宿主を培養し、真菌宿主においてダウンレギュレーションに関与するタンパク質を過剰産生する工程、および
−宿主の培地から選択された分泌可能なタンパク質を回収する工程を含む。
【００４５】
選択された分泌可能なタンパク質は異種タンパク質で、望ましくない分泌可能なタンパク質は同種タンパク質であることができる。
本明細書では、「プロモーターを遺伝子改変してダウンレギュレーションによって制御可能または制御不可能にすること」とは、当技術分野でよく知られている適切な従来型または分子生物学の方法、すなわち部位特異的突然変異誘発または欠失などのＤＮＡ技法やは化学薬品もしくは放射線を用いる従来の突然変異誘発などによりプロモーターを改変し、非改変プロモーターと違ってダウンレギュレーションによって制御される、または制御されないようにし、続いて転写ダウンレギュレーション機構が改変された細胞をスクリーニングまたは選択することを意味する。本発明では、トリコデルマｃｂｈ１プロモーターの部分を欠失させることによってダウンレギュレーションによって制御されないようにする遺伝子組換えを例示した。
【００４６】
本明細書では、「分泌ストレス下でのダウンレギュレーションに関与するタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子改変すること」とは、遺伝子を当技術分野でよく知られている適切な従来型または分子生物学の方法により改変して、遺伝子の過剰発現または不活性化、あるいは発現の活性を変化させることを意味する。改変は、部位特異的突然変異誘発または欠失などの組換えＤＮＡ技法により行われることが好ましいが、望ましい特性を持つ細胞との交雑または融合などの遺伝子改変のその他の方法を使用することも可能であり、または化学薬品もしくは放射線を用いる従来の突然変異誘発によりおこない、続いて転写ダウンレギュレーション機構が組み換えられた細胞をスクリーニングまたは選択する。
【００４７】
我々は、糸状菌に分泌ストレスに反応して分泌タンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーション機構が存在することを立証した。真菌のトリコデルマ・リーセイおよびアスペルギルス・ニガーでの例を示す。タンパク質合成、フォールディングまたは輸送を妨害する化学薬品で処理した真菌培養を分析することにより、またはフォルダーゼ・レベルの低下を示す真菌株を分析することにより、新規な制御機構の証拠が得られた（実施例１、２、３、４および５を参照）。さらに、異種タンパク質を産生する菌株では、内因性分泌タンパク質をコードする遺伝子はそれらの親菌株に比べて低レベルで発現される（実施例６を参照）。真核生物系では、近年、ＥＲの内腔の状態を感知し、分泌ストレスに応答して攪乱を軽減できる２つのフィードバック機構が報告されている。それらはＵＰＲ経路（Ｓｈａｍｕ他、１９９４）および翻訳開始の減衰(アテニュエーション)（Ｈａｒｄｉｎｇ他、１９９９）である。我々の新規な知見には、分泌ストレスの下で機能する３番目のタイプのフィードバック制御機構が含まれ、それが特定の遺伝子のプロモーター配列によって仲介されることがｃｂｈ１プロモーター配列の下でのｌａｃＺ発現からなるリポーター遺伝子系を用いて示される（実施例７および８）。
【００４８】
得られた結果に基づき、トリコデルマにおいて分泌タンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーションに関与するプロモーター領域の性質を明らかにすることができる。関与するプロモーター領域は、例えば様々な程度の欠失のあるｃｂｈ１プロモーターの下で細胞外タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルがダウンレギュレートされる条件、例えばＤＴＴによる処理を用い、ｌａｃＺリポーター遺伝子発現を検討することによって見つけだすことができる。この分析に基づき選択されたプロモーター領域を、ストレス下および非ストレス下（例えば、ＤＴＴ処理および非処理）にある培養からの細胞抽出物と一緒に用いてゲル・シフト法を行い、さらに詳細に特異的領域を特定し、制御因子にとって可能な結合部位の特徴を明らかにすることができる。プロモーター配列を比較することにより、ストレス条件に影響を受ける他のプロモーター中でダウンレギュレーションに関与している配列を特定することができる。本明細書に記載の方法または当技術分野で知られている方法を用い、どのような生物体、どのようなプロモーターでも、分泌タンパク質をコードする遺伝子からこの転写ダウンレギュレーションに応答する領域を特定することが可能である。
【００４９】
フィードバック制御に関与しプロモーター配列に結合する制御タンパク質のクローニングおよび性質解明は、ｃｂｈ１プロモーター中（およびダウンレギュレーションを示す他の関連遺伝子中）で特徴の明らかになったプロモーター要素を利用し、例えば酵母ワンハイブリッド（ｙｅａｓｔ−ｏｎｅ ｈｙｂｒｉｄ）系を用いて行うことができる。ＤＮＡ結合タンパク質のクローニングに適用できるシステムは市販されている（例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＭａｔｃｈｍａｋｅｒ（商標））ものや報告されている（例えば、Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ他２０００）ものがある。
【００５０】
遺伝子のダウンレギュレーションに関与していることが判明したプロモーター配列は、ストレス条件におけるダウンレギュレーションが消滅または軽減されるように改変することができる。これらの手段により、そうでなければダウンレギュレートされると思われる条件下で遺伝子の産生レベルを増加させることが可能であり、改変プロモーター（ダウンレギュレートする配列が改変された）の下での同種あるいは異種遺伝子産物の産生を改良することができる。さらに、ダウンレギュレーションに関与する制御因子を完全または部分的に不活性化し、タンパク質産生を改良することができる。分泌タンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーションを有することが知られているいかなる生物体、例えば他の種類の真菌、好ましくは他の種類の糸状菌について同様の手法を利用することができる。
【００５１】
異種タンパク質の産生は、例えば、化学薬品ＤＴＴ、ＢＦＡまたはＡ２３１８７による処理と類似したタイプのストレス反応を引き起こすことがある。例えば、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子を産生するトリコデルマ・リーセイはｔＰＡの産生中には培養の内因性セルラーゼ転写物のレベルが低いことが観察され（実施例６）、ｅｇｌ１およびｃｂｈ１をコードする遺伝子のダウンレギュレーションを示す。内因性細胞外タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターが、ストレス反応を惹き起こす異種産物の発現または同種産物の過剰発現のために使用される場合には、その内因性細胞外タンパク質の発現は、産生中に転写ダウンレギュレーションに関与するフィードバック制御の対象になることがある。プロモーターエレメント、またはプロモーターに結合するか制御シグナルに関与する制御因子を改変することは、ダウンレギュレーション・プロセスを消滅させることによってタンパク質産生を増加させるための手段である。
【００５２】
場合によっては、分泌ストレス中にダウンレギュレーションを増強して一部の内因性タンパク質の産生を減少させたり、分泌ストレス中にダウンレギュレートしないプロモーターの下で対象タンパク質を産生することが有益なことがある。このことは、ダウンレギュレーションに関与する制御因子を過剰発現させることおよび／または抑制性制御因子の結合を増すためにプロモーターを改変すること、例えば因子の結合部位数を増やすことによって達成することができる。本発明は、分泌タンパク質遺伝子の発現がダウンレギュレートされるときに、プロモーターがダウンレギュレートされない遺伝子を特定することができる一方法について、トリコデルマ・リーセイｇｐｄプロモーターを例にあげて記載している。
【００５３】
これらの手段により、分泌タンパク質をコードする遺伝子を選択的に制御し、産生プロモーターのダウンレギュレーションを減少または不活性化することにより選択されたタンパク質の産生を増強し、またはダウンレギュレーションを増強して他の分泌タンパク質の発現を選択的に抑制することが可能である。本発明はタンパク質生産に利用できるばかりでなく、本明細書に記載の転写ダウンレギュレーションの機構は他の目的で真菌株を改変して宿主において特定の望ましくないまたは望ましいタンパク質の発現を選択的に制御するための手段を提供することを言っておく必要がある。
【実施例１】
【００５４】
トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０培養におけるＣａ２＋イオノフォアＡ２３１８７、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の効果
＜ＲＮＡおよびタンパク質のサンプリング、代謝標識および分析に使用するトリコデルマ菌株、培養条件および方法＞
トリコデルマ菌株および培養条件は基本的に別の場所に記載されている（Ｐａｋｕｌａ他２０００；Ｉｌｍｅｎ他１９９６）。トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０株（Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ ＆ Ｅｖｅｌｅｉｇｈ、１９７９）は、炭素源としてラクトース２０ｇｌ−１を含有する最少培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４７．６ｇｌ−１、ＫＨ２ＰＯ４１５．０ｇｌ−１、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇｌ−１、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ０．２ｇｌ−１、ＣｏＣｌ２３．７ｍｇｌ−１、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ５ｍｇｌ−１、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１．４ｍｇｌ−１、ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１．６ｍｇｌ−１、ＫＯＨでｐＨを５．２に調整）で培養した。２×１０７個の胞子を含む胞子懸濁液（２０％グリセロール中−８０℃で保存）を培地２００ｍｌに接種し、２１０ｒｐｍで振盪しながら２８℃において振盪フラスコ中で培養した。４日間の培養後、培養を新鮮な培地で１０倍希釈し、さらに２４時間培養し、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０μｇ／ｍｌブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）または５μＭ Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７で処理した。無処理対照培養には保存原液の溶媒を同じ量だけ加えた（Ａ２３１８７およびＢＦＡ処理についてはそれぞれ対照培養に０．２％および０．５％ＤＭＳＯ、およびＤＴＴ処理については対照に２回(２段)蒸留水を使用）。様々な時点でタンパク質の代謝標識およびＲＮＡ単離のために培養を分割した。
【００５５】
（Ｐａｋｕｌａ他２０００）に記載の方法を用い、３５Ｓ−メチオニンでタンパク質を代謝標識した。サンプルの調製および標識タンパク質の分析は、基本的に（Ｐａｋｕｌａ他２０００）にあるように行った。標識実験は、ＤＴＴまたはＡ２３１８７の添加後１０分、またはＢＦＡ添加後１５分に開始した。［３５Ｓ］−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＳＪ１０１５、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞標識等級、１０００Ｃｉｍｍｏｌ−１、１０μＣｉμｌ−１）１ｍＣｉを、培養を５０ｍｌ取り分けたものに加えた。無処理培養は並行して同様に標識した。経時的にサンプル２ｍｌを採取した。細胞抽出物および培養上清中の総標識タンパク質は、サンプル中のＴＣＡ不溶物のシンチレーション計数によって測定し、標識された特定のタンパク質（例えば、ＣＢＨＩ）は、２Ｄゲル電気泳動を用いて分析し、タンパク質をＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量した。タンパク質合成および分泌の速度、ならびに平均合成時間および最小分泌時間は、Ｐａｋｕｌａ他２０００に記載のように決定した。
【００５６】
ノーザン分析については、ＤＴＴ、ＢＦＡまたはＡ２３１８７で処理した培養および無処理対照培養から処理後０、１５、３０、６０、９０、１２０、２４０および３６０分に菌糸体サンプルを採取した。一番目のサンプル（時点０）は、ＤＴＴ、ＢＦＡまたはＡ２３１８７の添加直後に採取した。菌糸体を濾過し、等容積の０．７％ＮａＣｌで洗浄し、液体窒素中で直ちに凍結し、−８０℃で保存した。総ＲＮＡは、基本的に製造者の使用説明書に従いＴｒｉｚｏｌ（商標）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて単離した。ノーザン・ブロッティングおよびハイブリッド形成は、標準的手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他）に従って行った。プローブとして遺伝子の完全長ｃＤＮＡを用いた。
【００５７】
＜トリコデルマ・リーセイにおけるタンパク質合成および輸送に対するＡ２３１８７、ＤＴＴおよびＢＦＡの効果＞
分泌タンパク質をコードする遺伝子のフィードバック制御を、他の生物体においてタンパク質合成、フォールディングまたは輸送を妨害することが知られている薬剤で処理した培養で検討した。Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７は、哺乳類細胞においてタンパク質合成を低下させるばかりでなく、ＥＲのＣａ２＋貯蔵を空にすることによってタンパク質のフォールディングおよび輸送を阻害することが報告されている（Ｂｒｏｎｓｔｒｏｍ他１９８９、ＬｏｄｉｓｈおよびＫｏｎｇ、１９９０、Ｌｏｄｉｓｈ他１９９２）。ジチオスレイトールは、酵母および哺乳類においてジスルフィド架橋の形成およびタンパク質のフォールディングを阻害する還元剤である（Ｊａｍｓａ他１９９４、Ａｌｂｅｒｉｎｉ他１９９０、Ｂｒａａｋｍａｎ他１９９２）。ＢＦＡによる細胞の処理は、例えば哺乳類ではゴルジ構造を崩壊し、ＥＲからゴルジへのタンパク質の輸送を阻害することが知られているが、その作用は、生物体および特定の細胞タイプによって異なる（Ｐｅｌｈａｍ、１９９１、ＳｈａｈおよびＫｌａｕｓｎｅｒ、１９９３）。
【００５８】
タンパク質の代謝標識を用い、トリコデルマ・リーセイ培養におけるタンパク質合成および分泌に対するＡ２３１８７、ＤＴＴおよびＢＦＡの効果について特徴を明らかにした（用いた方法についてはＰａｋｕｌａ他２０００を参照）。
標識メチオニンの添加前に、５μＭ Ａ２３１８７もしくは１０ｍＭ ＤＴＴで１０分間または５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで１５分間、培養を処理した。標識総タンパク質ならびに標識された特定のタンパク質を、標識実験の様々な時点で細胞抽出物および培養上清で分析した。
【００５９】
総タンパク質合成の速度および総タンパク質分泌の速度は、細胞抽出物および培養上清において時間単位当たりにＴＣＡ不溶物中に取り込まれた放射能の量として測定した（図１、ＴＣＡ不溶物中の放射能はバイオマス乾燥重量１ｍｇ当たりで示し、時点０分は、標識メチオニンの添加に当たる）。速度は、処理の初めの１５〜４５分間に測定された値から推定した。ＤＴＴまたはＢＦＡの存在下では、総タンパク質合成の速度は影響を受けなかったが、イオノフォアによる処理は、対照細胞の速度の５１％までタンパク質合成速度を低下させた。細胞外標識タンパク質の産生は、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養中でかなり効率的に阻害された。これらの培養では、総標識タンパク質の培地中への分泌速度は、対照細胞の速度の５％に過ぎなかった。さらに、ＢＦＡ処理培養では、細胞外タンパク質の産生は、対照培養に比べて顕著に遅くなった。イオノフォアＡ２３１８７で処理した培養では、標識タンパク質の培地への産生速度は、無処理培養における速度の２３％まで低下した。タンパク質合成および分泌の速度を表１に要約して示す（表１では、速度の値は、無処理対照培養における値のパーセントとして示す）。この結果は、ＤＴＴおよびＢＦＡはタンパク質合成を妨害しないが細胞からのタンパク質輸送を遮断し、一方Ａ２３１８７はタンパク質合成に対する阻害効果も有していることを示唆している。
【００６０】
細胞外タンパク質の合成、具体的にはタンパク質の輸送に対する処理の効果を、モデルタンパク質として真菌類によって産生される主要なセルラーゼであるセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）を用いて検討した。タンパク質の合成および分泌ならびに輸送中のタンパク質のｐＩパターン変化は、２Ｄゲル電気泳動を用いてモニターした（Ｐａｋｕｌａ他２０００に記載のように；図２は、各パネルの左から右へ約３．５〜４．５のｐＨ範囲において２Ｄゲルで分析した標識実験の様々な時点における標識ＣＢＨＩを示す）。ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養から調製した細胞抽出物では、まさに最初の新生ｐＩ型のみが検出でき、タンパク質が生合成経路内では完全には翻訳後修飾されないことを示している。ＤＴＴ処理培養では、培地中への標識ＣＢＨＩの産生は一切検出されず、ＢＦＡ処理培養では、標識実験の末期に微量のＣＢＨＩが分泌されたに過ぎなかった（産生速度は、対照培養で測定された速度の４％であった）。この結果は、これらの条件では、不均一なｐＩをもたらす修飾が行われるコンパートメントにタンパク質が到達する前に、タンパク質の輸送が遮断されることを示唆している。しかしながら、ＢＦＡ処理培養の培地中で検出された微量のＣＢＨＩは完全なｐＩパターンを獲得しており、タンパク質のごく一部は修飾され輸送されるが、完全に処理された形のタンパク質の量があまりに少ないために細胞抽出物中に検出されないことを示している。タンパク質輸送に対するイオノフォアＡ２３１８７による処理の効果は明確ではなかった。ＣＢＨＩのｐＩ型の全パターンの形成は、対照細胞に比べて１５〜２０分遅くなり、ｐＩ型パターンが全部揃ったＣＢＨＩは培地中に分泌されたが遅延していた。
【００６１】
標識実験の様々な時点における細胞抽出物および培養上清のサンプルからの標識ＣＢＨＩを２Ｄゲル中で分析し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量した。ＣＢＨＩの合成および分泌速度（時間単位当たりに産生した標識タンパク質の量）ならびにＣＢＨＩの平均合成時間および最小分泌時間などのパラメータを決定した（方法についてはＰａｋｕｌａ他２０００を参照）。図３には標識実験中の標識ＣＢＨＩの定量結果を示し、これらの条件におけるＣＢＨＩの合成および分泌をあらわす推定パラメータを表１に要約して示す。ＤＴＴおよびＢＦＡ処理培養では完全長ＣＢＨＩの平均合成時間は影響を受けず、これはこれらの処理によって総タンパク質合成が影響を受けないという結果（上記参照）と合致している。ＢＦＡ処理培養で測定された分子の最小分泌時間は１１分から６９分に増加し、ＤＴＴ処理培養ではこの条件下で産生された細胞外タンパク質は極めて少量であるためにパラメータを決定できなかった。イオノフォアＡ２３１８７で処理した培養では、ＣＢＨＩ合成ならびにタンパク質の輸送が影響を受けた。対照培養に比べＡ２３１８７で処理した培養中でのＣＢＨＩの最小分泌時間は１０分増加し、ＣＢＨＩの合成時間は対照培養中よりも３〜４分長かった。
【００６２】
驚いたことに、ＤＴＴまたはＢＦＡによる処理は、総タンパク質合成の速度を低下させるかＣＢＨＩ分子の合成に必要な時間を延ばすことはなかったが、ＤＴＴまたはＢＦＡ処理培養中ではＣＢＨＩ合成の速度（時間単位当たりに合成された標識ＣＢＨＩの量）が低下することが見いだされた（表１では、速度は、対照培養で測定された値のパーセントとして示す）。ＣＢＨＩ合成速度は、ＤＴＴ処理培養では対照培養中で測定された速度の４〜２４％であり、ＢＦＡ処理培養中では５２％であった。合成されたＣＢＨＩの大部分は細胞内に残る。培地中へのＣＢＨＩ産生の速度はＤＴＴ処理培養中では測定できず、ＢＦＡ処理培養では対照培養中で測定された速度の４％であった。イオノフォアＡ２３１８７で処理した培養では、ＣＢＨＩ合成の速度は、総タンパク質合成速度より大きな影響を受けた。ＣＢＨＩ合成の速度は、対照細胞中で測定された速度の２６％であり、総タンパク質合成速度は５１％であった。培地中へのタンパク質分泌速度は、ＣＢＨＩの合成速度と同程度に低下した（対照培養中で測定された速度の２７％）。
【００６３】
この結果は、ＢＦＡまたはＤＴＴによる処理はトリコデルマにおけるタンパク質輸送を明らかに妨害し恐らくＥＲからのタンパク質輸送を妨げるが、Ａ２３１８７による処理はタンパク質輸送にわずかな遅れを引き起こすに過ぎないことを示している。ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養では、総タンパク質合成活性は影響を受けないが、分泌モデルタンパク質のＣＢＨＩの合成速度は、タンパク質輸送の障害と同時に特異的に低下した。Ａ２３１８７処理培養では、総タンパク質合成速度の明らかな低下が測定されたが、ＣＢＨＩの合成速度は、総タンパク質合成に対する効果に比べてより大きな影響を受けた。
【００６４】
【表１】
＜Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理したトリコデルマ・リーセイにおけるＵＰＲ反応に関与するフォルダーゼＰＤＩＩ、シャペロンＢＩＰＩ、および転写因子ＨＡＣＩをコードする遺伝子の転写物レベル＞
Ａ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡによる処理中に採取したサンプルのノーザン分析を行い、転写レベルにおける処理の効果について検討した。また、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養中のタンパク質輸送およびフォールディングにおける妨害は、ｐｄｉ１およびｂｉｐ１遺伝子の誘導（図４、ｐｄｉ１についての結果はすでに報告されている；Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ他１９９９）および、活発に翻訳されてＵＰＲ反応に関与する短形のｈａｃ１転写物の発現（図５は、各時点における全ｈａｃ１シグナルで正規化した短形および長形の転写物のシグナルを示す）が示すように、アンフォールド反応（ＵＰＲ）経路の活性化として現れた。Ａ２３１８７処理培養では、タンパク質輸送はわずかに影響を受けたに過ぎず、合成されたタンパク質の総量は減少した。これらの条件では、ｐｄｉ１およびｂｉｐ１の誘導は観察されなかった（図４）。しかしながら、短形のｈａｃ１ｍＲＮＡの一過性かつ弱い発現がＡ２３１８７処理細胞で観察され、ＵＰＲ経路に対する若干の効果を示している（図５）。
【００６６】
Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理したトリコデルマ・リーセイ培養における内因性分泌タンパク質をコードする遺伝子の転写物レベル
ＤＴＴまたはＢＦＡ処理培養では、無処理対照細胞に比べてＣＢＨＩ合成速度は低下したが、これらの条件下では総タンパク質合成は影響を受けなかった。Ａ２３１８７処理培養では、ＣＢＨＩの合成は、処理培養中の総タンパク質合成に比べて大きく妨げられた。薬物で処理した培養から調製したサンプルのノーザン分析は、ｃｂｈ１のｍＲＮＡレベルが処理中に顕著に低下したことを示した（図６、処理の様々な時点でｇｐｄのシグナルで正規化したｃｂｈ１シグナル）。ｍＲＮＡレベルの低下は、標識実験におけるタンパク質の合成速度の低下を少なくとも部分的には説明するように見える。ＤＴＴおよびＡ２３１８７処理培養では、遺伝子のｍＲＮＡレベルの低下の動態はＲＮＡの測定半減期に対応した。ＢＦＡ処理培養では、低下は若干少なめであった。同様の低下は、処理中のｅｇｌ１ｍＲＮＡレベルで観察された（図６、処理の様々な時点でｇｐｄのシグナルで規格化したシグナル）。さらに、ＤＴＴ処理培養のサンプルについて、より広範囲な遺伝子についてノーザン分析を行った。細胞外タンパク質をコードする様々な他の遺伝子、例えばｘｙｎ１およびｈｆｂ２の転写物レベルが低下し（図７）、細胞外タンパク質をコードする多くの遺伝子が、タンパク質の合成、フォールディング、または輸送に制限がある時にはフィードバック制御の下にあることを示している。
【００６７】
また、ダウンレギュレーションは、真菌類によって発現されるすべての遺伝子に影響を及ぼすわけではないが、細胞外タンパク質をコードする遺伝子の群には共通していることは明らかである。ＵＰＲの制御下にアップレギュレートされる遺伝子に加え、ダウンレギュレートされない遺伝子がいくつか見いだされた（図８）。興味深いことに、細胞内β−グルコシダーゼをコードするｂｇｌ１は真菌類が利用できる炭素源に応じてセルラーゼと同様な制御を受けるにもかかわらず、これらの条件下ではｂｇｌ２のｍＲＮＡレベルは低下しない。小胞輸送で機能するタンパク質をコードする遺伝子、例えばｓａｒ１（Ｖｅｌｄｈｕｉｓｅｎ他１９９７）およびｙｐｔ１の発現レベルは、ＤＴＴによる処理によって影響を受けなかった（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ他投稿中）。その発現がＤＴＴ処理によって明らかには影響を受けないその他の遺伝子は、例えばｃＤＮＡ１およびｇｐｄ（グリセルアルデヒド−６−Ｐ−デヒドロゲナーゼ）である。このｇｐｄシグナルをノーザン分析でのシグナルの正規化に用いた。
【実施例２】
【００６８】
ＤＴＴで処理したアスペルギルス・ニガーの培養における内因性分泌タンパク質をコードする遺伝子の転写物レベル
＜アスペルギルス・ニガー菌株、培養条件およびＲＮＡのサンプリングおよび分析に使用する方法＞
実験で使用するアスペルギルス・ニガー菌株は、ＡＢ４．１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ他、１９８７）およびＡＳ１．１（Ｎｇｉａｍ他、２０００）とした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）に再懸濁した胞子を、最終密度が培地１ｍｌ当たり１×１０５個となるよう液体培地に接種した。菌株はポテト・デキストロース寒天斜面（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）上で維持した。アスペルギルス・ニガーＡＢ４．１の場合には、１０ｍＭウリジンを培地に追加した。胞子を形成するまで３０℃で斜面培養し、実験毎に更新した。液体培養に関するすべての実験にはＡＣＭＳ／Ｎ／Ｐ培地（Ａｒｃｈｅｒ他、１９９０）を使用した。アスペルギルス・ニガーＡＢ４．１培養にはやはり１０ｍＭウリジンを追加した。培養は、５０ｍｌ三角フラスコ中の培地１００ｍｌ中、２５℃、１５０ｒｐｍで培養した。ＤＴＴストレス実験では、ＡＢ４．１培養を４４時間培養してから２ＭのＤＴＴ１ｍｌを加え、最終濃度２０ｍＭとした。対照ＡＢ４．１培養には等容積の水を加えた。培地交換実験では、培養はＡＣＭＳ／Ｎ／Ｐ中で２５℃および１５０ｒｐｍ４４時間行った。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、ＵＳＡ）により菌糸体を収集し、２５℃に温めておいた炭素源を含まない培地１００ｍｌで２回洗浄した。次いで、あらかじめ温めておいた、必要に応じて添加物を加えたＡＣＭＸ／Ｎ／Ｐ１００ｍｌを入れたフラスコに菌糸体を移し、前と同じ条件でインキュベーションを続けた。ＡＣＭＸ／Ｎ／Ｐは、１リットル当たり可溶性デンプン１０ｇの代わりに１リットル当たりキシロース１０ｇを含有するという点でＡＣＭＳ／Ｎ／Ｐとは異なる。
【００６９】
２層のＭｉｒａｃｌｏｔｈにより菌糸体を収集し、液体窒素中で瞬間冷凍した。次いで、液体窒素中で菌糸体を粉砕して細かい粉末とし、Ｅｄｗａｒｄｓ Ｍｏｄｕｌｙｏ凍結乾燥器中で２日間凍結乾燥した。凍結乾燥器中で乾燥すること２日後、次いでさらに１日後に菌糸体の重量を測定して乾燥重量を決定した。この期間に重量の減少が一切観察されない場合には、培養物は完全に乾燥していると見なした。
【００７０】
総ＲＮＡは、製造者の使用説明書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）を用い、凍結乾燥し粉砕した菌糸体１００ｍｇから抽出した。Ｕｖｉｋｏｎ ８５０分光光度計（Ｋｏｎｔｒｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）で２３０、２６０および２８０ｎｍにおける吸光度を読み取ることによってＲＮＡを定量した。２６０ｎｍ：２８０ｎｍの読み取り値の比が２．０を超えれば良質のＲＮＡを示していると見なした。また、７％ホルムアルデヒド・ゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）上でサンプルを泳動することによってＲＮＡの品質を評価した。ノーザン・ブロッティングの場合には、１レーン当たりＲＮＡ１０μｇを７％ホルムアルデヒド・ゲル上で電気泳動した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｈｏｒｉｚｏｎ １１−１４サブマリン・ゲル電気泳動タンク、２５Ｖ、６時間、ＭＯＰＳ泳動バッファー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９））。サンプルは、Ｓｉｇｍａ ＲＮＡローディング・ダイ（Ｃａｔ．＃ Ｒ４２６８）を用いて調製した。電気泳動後、ＤＥＰＣ処理水（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）で２０分間づつ５回、ゲルを洗浄し、次いで５０ｍＭ ＮａＯＨ中に１０分間浸漬した。Ｈｙｂｏｎｄ ＸＬナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｌ．ＵＫ）への転写は、製造者の使用説明書に従って転写用バッファーとして１０×ＳＳＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）を用い、Ａｐｐｌｉｇｅｎｅバキューム・ブロッターを用いて行った。転写時間は２．５時間とした。転写後、ブロットを５０ｍＭ ＮａＯＨ中に５分間浸漬し、次いで２×ＳＳＣ中で３０秒間洗浄してから一夜空気乾燥した。
【００７１】
ノーザン・ブロットのためのプローブは、製造者の使用説明書に従ってＭｅｇａｐｒｉｍｅ標識キットおよびα−３２Ｐ ｄＡＴＰ（どちらもＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｌ．、ＵＫ）を用いて標識した。ｇｌａＡプローブは、アスペルギルス・ニガー・グルコアミラーゼ遺伝子（Ｂｏｅｌ他、１９８４）の配列中の座標＋１０５９から＋１６９６に対応する６３７ｂｐ断片とした。アクチン・プローブは、アスペルギルス・ニデュランスのγ−アクチン遺伝子（Ｆｉｄｅｌ他、１９８８）中の座標＋８８９から＋１６５４に対応する７６５ｂｐ断片とした。ｐｄｉＡプローブは、アスペルギルス・ニガーのｐｄｉＡ遺伝子（Ｎｇｉａｍ他、１９９７）の配列中の座標＋６３から＋３６５に対応する３０３ｂｐ断片とした。ｐｅｐＡプローブは、アスペルギルス・アワモリのアスペルギロペプシン遺伝子（Ｂｅｒｋａ他、１９９０）中の座標＋１１８６から＋１６３１に対応する４４５ｂｐフラグメントとした。ｂｉｐＡプローブは、アスペルギルス・ニガーのｂｉｐＡ遺伝子（ｖａｎ Ｇｅｍｅｒｅｎ他、１９９７）の座標＋７１２から＋１１５６に対応する４４５ｂｐフラグメントとした。すべてのプローブは、アスペルギルス・ニガーのゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）を用いてアガロース−ＴＡＥゲルから精製した。
【００７２】
プローブＤＮＡを加える前に、Ｈｙｂ９ハイブリダイゼーション溶液（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ、ＵＳＡ）中３０分間、６５℃においてブロットを予備交雑した。次いで、６５℃において一夜、ハイブリダイゼーションを行った。ブロットは、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中（６５℃，１５分間）２回、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中（６５℃，３０分間）で１回洗浄した。ブロットを可視化し、ＦｕｊｉＦｉｌｍ ＢＡＳ１５００バイオイメージングアナライザー(phosphorimaging system)を用いてバンド強度を定量した。ＲＮＡ負荷量は、γ−アクチン・プローブを用いて正規化した。グラフに示す図は、標的ｍＲＮＡシグナルとγ−アクチンのシグナルとの比を表している。シグナルは、各リン光イメージ・プレート上のブロットに対する曝露時間に左右される。様々なグラフ上の値は転写物の絶対レベルを表していないため、直接比較することはできない。
【００７３】
＜アスペルギルス・ニガー培養における遺伝子ｇｌａＡ、ｐｅｐＡ、ｐｄｉＡおよびｂｉｐＡの転写物レベルに対するＤＴＴの効果＞
図９は、ＤＴＴの時間経過実験（ストレス試剤の添加から１０時間、３回測定の平均シグナル）から得られた結果を示している。パート（Ａ）は、この期間のｇｌａＡ遺伝子の定常状態ＲＮＡレベルに対する効果を示している。明らかに分かるように、ＤＴＴ処理培養では、ｍＲＮＡの量が経時的に着実に減少し、半減期は約７０分であった。このことは、ｇｌａＡ ｍＲＮＡ合成の非存在下でのｇｌａＡ ｍＲＮＡのＴ１／２が約７０分であることを示す本研究室で行った培地交換試験のデータとよく相関している（図１０）。したがって、図９Ａにおける結果は、ＤＴＴ処理がｇｌａＡの転写を阻害し、ｇｌａＡ ｍＲＮＡのレベルの減少は生体内の正常な分解によることを示唆している。図９Ｂは、別の分泌タンパク質アスペロギロペプシン（ｐｅｐＡ）に対するＤＴＴストレスの効果を示している。この遺伝子は、培地のｐＨが酸性に傾いた場合にのみ誘導されるため、時間経過の後期まで転写は起こらない。データは、対照培養中ではｐｅｐＡ ｍＲＮＡのレベルの増加が認められるが、ＤＴＴ処理培養では有意な増加が認められないことを示している。図９ＣおよびＤは、アンフォールドタンパク質反応に関与する遺伝子に対するＤＴＴの効果を示している。示したｐｄｉＡおよびｂｉｐＡのどちらの遺伝子も、ストレス試剤の添加に迅速な反応を示す。この反応は一過性のようには見えず、逆にいうと長続きするようである。このことがＤＴＴ添加後の長時間にわたるメッセンジャーＲＮＡの産生によるものか当該ｍＲＮＡの長い半減期によるものかは不明である。
【実施例３】
【００７４】
グルコアミラーゼ・プロモーターの制御下にｐｄｉＡアンチセンス転写物を発現するアスペルギルス・ニガーの培養における遺伝子ｇｌａＡおよびｐｅｐＡの転写物レベル
ｐｄｉＡアンチセンス構築体を発現するアスペルギルス・ニガー菌株およびその親菌株におけるｇｌａＡおよびｐｅｐＡの発現を比較した。菌株の培養およびＲＮＡ分析の方法は実施例２に記載した。
【００７５】
図１１は、グルコアミラーゼ・プロモーターの制御下にｐｄｉＡアンチセンス配列の複数のコピーを含むアスペルギルス・ニガーＡＳ１．１と、親菌株のアスペルギルス・ニガーＡＢ４．１を比較し、炭素源としてデンプンを含有する培地上で培養した場合に得られたデータを示している。パネル（ａ）は、ｇｌａＡ遺伝子のｍＲＮＡレベルに対する効果を示している。最初の時点（２４時間目）からＡＳ１．１菌株におけるｇｌａＡ ｍＲＮＡのレベルは漸減を示すが、ＡＢ４．１では増加することが分かる。このことおよび図１におけるパネル（ａ）から分かるように、親菌株（ＡＢ４．１）におけるｇｌａＡ ｍＲＮＡのレベルは、正規化に用いたγ−アクチンのレベルに対しても実際に増加している。これは一部にはｇｌａＡ ｍＲＮＡの長い半減期に起因している可能性がある。すなわちｍＲＮＡの分解の速度が、合成の速度よりも有意に低くその結果このｍＲＮＡの集団が増えつづけるのであろう。パネル（ｂ）にはｐｅｐＡ遺伝子の転写に対する効果を示す。やはり、ＡＳ１．１におけるｍＲＮＡのレベルは親のＡＢ４．１に比べて著しく低かった。パネル（ｃ）は、この実験における乾燥重量測定値を示しており、アンチセンス構築物が発現した場合に真菌の生育に対する有意な効果はないことを示している。
【実施例４】
【００７６】
ｇｐｄＡプロモーターの制御下にｐｄｉＡアンチセンス転写物を構成的に発現するアスペルギルス・ニガーの培養における遺伝子ｇｌａＡの転写物レベルおよび分泌グルコアミラーゼのレベル
ｇｐｄＡプロモーターの制御下にｐｄｉＡアンチセンスｃＤＮＡを構成的に発現するアスペルギルス・ニガー菌株（ＡＳＧ６７株）およびその親菌株におけるｇｌａＡの発現を比較した。菌株の培養およびＲＮＡ分析の方法は実施例２に記載した。分泌されたグルコアミラーゼ・タンパク質レベルの分析については、各フラスコから培養濾液のサンプル７ｍｌを採取し、必要となるまで−２０℃で保存した。グルコアミラーゼの測定に用いた方法は、ＭａｃＫｅｎｚｉｅ他（１９９４）の方法とした。
【００７７】
図１２は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ・プロモーターの制御下にｐｄｉＡアンチセンス配列の複数のコピーを含むアスペルギルス・ニガーＡＳＧ６７と親菌株のＡＢ４．１を、炭素源としてデンプンを含有する培地上で培養し比較して得られたデータを示している。パネル（ａ）は、分泌グルコアミラーゼのレベルに対する効果を示している。これから分かるように、分泌グルコアミラーゼのレベルは経時的に両菌株中で増加するものの、アンチセンス菌株でのレベルは、特に真菌の生育後期には親菌株（ＡＢ４．１）でのレベルよりも低い。パネル（ｂ）では、ｇｌａＡ遺伝子の転写物レベルに対する効果を見ることができる。３６時間目で同一の転写物レベルに達した後、親菌株（ＡＢ４．１）では転写物レベルが漸増しているが、ｐｄｉＡアンチセンス菌株（ＡＳＧ６７）ではそうではない。パネル（ｃ）は、実験における乾燥重量測定値を示しており、アンチセンス構築体が発現した場合も真菌の生育に対して有意な効果は認められないことを示している。
【実施例５】
【００７８】
ｐｄｉＡアンチセンス転写物を構成的に発現するアスペルギルス・ニガーにおけるｈａｃＡ転写物のスプライシング
ｐｄｉＡアンチセンス配列を構成的に発現するアスペルギルス・ニガー菌株およびその親菌株において、アンフォールドタンパク質反応に対してプラスに作用する制御因子をコードするｈａｃＡ転写物のスプライシングを分析した。菌株の培養およびＲＮＡ分析の方法は実施例２に記載した。実験で使用するｈａｃＡプローブは、ＶＴＴにおいて単離されたｈａｃＡ ｃＤＮＡとした。同じ培養物が、実施例４におけるデータが得らるのに使用された。
【００７９】
図１３は、経時的なｈａｃＡのノーザン・ブロットを示している。アンフォールドタンパク質反応（ＵＰＲ）の誘導があった場合には、ゲル上にあるｍＲＮＡよりもわずかに低い第二のｍＲＮＡ分子種が現れるであろう。存在するｍＲＮＡはスプライシングされていないｈａｃＡと正確に同じサイズである。これらのデータは、ＵＰＲの誘導が存在しないことを示唆し、転写ダウンレギュレーション機構はＵＰＲとは区別され、異なったやり方で制御されていることを意味している。
【実施例６】
【００８０】
異種タンパク質を産生するトリコデルマ・リーセイ菌株における内因性分泌タンパク質をコードする遺伝子の発現レベル
＜培養物の分析に使用する菌株、培養条件および方法＞
ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ、Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ他、１９８６）を産生するトリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０株は、Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、１９８７に記載の方法を用い、図１４Ａに示す発現カセットで親菌株を形質転換することによって構築した。
【００８１】
ｔＰＡ産生菌株および親菌株Ｒｕｔ−Ｃ３０は、並行してバイオリアクター中で培養した。使用する培地は、ＶＴＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにおいて用いられるラクトースをベースにした緩衝化培地（ラクトース４０ｇ／ｌ、ペプトン４ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４２．８ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ０．６ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ０．８ｇ／ｌ、微量元素を追加）とした。バイオマスの乾燥重量は、実施例７に記載のように測定した。培地中のラクトース濃度は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入したキットを用いて決定し、培地中の総タンパク質は、ＢｉｏＲａｄから購入したＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて測定し、ＨＥＣ活性は、（ＢａｉｌｅｙおよびＮｅｖａｌａｉｎｅｎ、１９８１；ＩＵＰＡＣ、１９８７）に記載のように測定し、ｔＰＡ濃度は、ＴＮＯ（オランダ）より提供されたＥＩＡキットを用いて測定した。ＲＮＡ単離およびノーザン分析は、実施例１、７、８、および９に記載のように行った。
【００８２】
＜ｔＰＡ産生菌株およびその親菌株における内因性細胞外タンパク質の発現＞
トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ（ヒト組織プラスミノゲン活性化因子）を産生する形質転換体で、内因性分泌タンパク質の産生および対応する遺伝子の発現について検討した。ｔＰＡは、真菌によって極めて少量産生され、宿主における様々なストレス反応を誘導することが期待される異種タンパク質の一例である。この形質転換体は、約５個の発現カセットのコピーを持つと推定され、ｃｂｈ１プロモーターの下でＣＢＨＩ融合タンパク質としてｔＰＡが産生される。
【００８３】
２つの菌株においてタンパク質産生および対応する遺伝子の発現を比較するため、バイオリアクター中で並行培養を行った。バイオマスの生成および炭素源ラクトースの消費を培養中に測定し、生育をモニターした（図１４Ｂ）。培地中に産生した総タンパク質およびセルラーゼ活性（基質ＨＥＣに対する活性で主にエンドグルカナーゼ活性を測定する）を培養の始めから終わりまで測定した（図１４Ｃ）。ノーザン分析を行い、培養物におけるｅｇｌ１（図１４Ｄ）、ｃｂｈ１（図１４Ｅ）およびｂｉｐ１（図１４Ｆ）の発現を分析した。ノーザンにおけるシグナルの正規化にはアクチンのシグナルを用いた。
【００８４】
２つの菌株は、培養中にどちらかと言えば同様に生育したが、ｔＰＡ産生菌株が培地中に産生した総タンパク質およびセルラーゼ活性は、親菌株に比べてかなり低かったことは明らかである。形質転換体によって産生されたｔＰＡは、産生された総タンパク質のわずかな部分に過ぎず、得られた最高収量は２５ｍｇ／ｌであった。ｔＰＡ産生培養菌における低いタンパク質産生と合致するように、細胞外エンドグルカナーゼＩをコードするｅｇｌ１およびセロビオヒドロラーゼＩをコードするｃｂｈ１の発現レベルも、ｔＰＡを産生する培養菌の方が低かった。ｔＰＡ産生培養中でシャペロン遺伝子ｂｉｐ１の発現が誘導され、異種タンパク質の産生によるＵＰＲなどのストレス反応の活性化を示している。このように、形質転換体における分泌タンパク質をコードする内因性遺伝子の低い発現レベルは、分泌ストレス中に働くダウンレギュレーション機構のためと考えられる。
【実施例７】
【００８５】
トリコデルマ・リーセイのＤＴＴ処理培養における完全長ｃｂｈ１プロモーターおよび最小ｃｂｈ１プロモーターの下でのリポーター遺伝子ｌａｃＺの発現−ダウンレギュレーションにおけるプロモーター配列の役割
＜ＲＮＡサンプルの分析に使用する培養条件、および方法＞
ＱＭ９４１４株（Ｍａｎｄｅｌｓ他、１９７１）ならびにそれに由来しｃｂｈ１プロモーターの下で大腸菌ｌａｃＺを発現するｐＭＩ３４およびｐＭＬＯ１６（Ｉｌｍｅｎ他、１９９６）を、０．０５％プロテオース・ペプトンおよび２０ｇ／ｌソルビトールまたはグリセロールを含有する最小培地上で培養した。８×１０７個の胞子を生育培地２００ｍｌに接種し、三角フラスコ中で２１０ｒｐｍで振盪しながら２８℃で培養した。培養開始２３時間後および３２時間後にα−ソホロース（１ｍＭ）を加え、ソルビトール培地上でセルラーゼ遺伝子発現を誘導した。培養開始４０時間後に１０ｍＭ ＤＴＴによる培養物の処理を開始した。ＲＮＡ単離のため菌糸体サンプルを採取し、実施例１に記載のようにノーザン分析にかけた。ソホロース誘導およびＤＴＴの処理の前後には、菌糸体サンプルを濾過し恒量になるまで１０５℃において乾燥する（２４時間）ことにより、培養物の乾燥重量を測定した。培養物の乾燥重量は、ＤＴＴによる処理の開始時には１．１〜１．４ｇ／ｌであった。
【００８６】
＜ＤＴＴ処理中のｃｂｈ１プロモーターの下でのリポーター遺伝子活性＞
ｍＲＮＡレベルのフィードバック制御が、その遺伝子のプロモーター配列によって仲介されるか否かを検討するため、リポーター遺伝子系を用いた。リポーター遺伝子発現カセットの概略図を図１５Ａに示す。大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を、トリコデルマ・リーセイ菌株のｃｂｈ１プロモーター、すなわち２．２ｋｂの完全長ｃｂｈ１プロモーターあるいは１６１ｂｐの最小プロモーターの下で発現させ、菌株をＤＴＴ処理している間の発現レベルを検討した。ｇｐｄ１のシグナルで正規化したｌａｃＺシグナルの定量を図１５Ｂに示す。ｌａｃＺ転写物レベルは、完全長ｃｂｈ１プロモーターの下で発現する場合にのみＤＴＴ処理中にダウンレギュレートされた。しかしながら、推定上のＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位を含む最小のｃｂｈ１プロモーターをｌａｃＺ発現に用いた場合には、その短いプロモーターは機能しかつソホロースによる誘導もできるにもかかわらず、ダウンレギュレーションは観察されなかった。ダウンレギュレーション機構がこれらの条件下でこれらの菌株で機能することを確認するために、ｅｇｌ１の転写物レベルを両菌株で分析した。この結果は、ｃｂｈ１プロモーター中の配列エレメントがダウンレギュレーションには必要であり、ｍＲＮＡの不安定性以外の機構がこのプロセスに関与していることを示している。
【実施例８】
【００８７】
トリコデルマ・リーセイのＤＴＴ処理培養における切り詰めｃｂｈ１プロモーターの下でのリポーター遺伝子ｌａｃＺの発現−分泌ストレス条件下にプロモーターのダウンレギュレーションに関与するプロモーター領域の同定方法
切り詰めｃｂｈ１プロモーターの下に大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を持つトリコデルマ・リーセイ菌株を培養し、実施例７に記載のようにＤＴＴで処理し、ｌａｃＺ遺伝子の発現を分析した（実施例７と同様）。図１６Ａは、様々な菌株におけるｌａｃＺ発現に使用したｃｂｈ１プロモーター構築物の概略図を示している。ＤＴＴで処理した培養および無処理培養におけるｌａｃＺ、ｅｇｌ１およびｇｐｄ１ ｍＲＮＡレベルのノーザン分析を図１６Ｂ、ＣおよびＤに示す。分泌ストレス条件（例えば、ＤＴＴ処理培養）の下でダウンレギュレーションを受けやすい内因性遺伝子の例としてｅｇｌ１のｍＲＮＡレベルを分析し、サンプル負荷の対照としてｇｐｄ１のシグナルを用いた。ｌａｃＺおよびｅｇ１ｌ ｍＲＮＡのシグナルを定量しｇｐｄ１のシグナルで正規化し、処理の様々な時点におけるＤＴＴ処理サンプルのシグナルと対照サンプル中のシグナルの比をグラフとして示す。ｃｂｈ１プロモーターの長さが１０２９ｂｐ以上である構築物を持つ菌株では（図１６Ｂに示す）、ＤＴＴによる処理中に２．２ｋｂの完全長ｃｂｈ１プロモーターの下で遺伝子を発現する菌株と同じ程度にｌａｃＺの発現が減少した。長さが３３９ｂｐから４９９ｂｐのｃｂｈ１プロモーターの下でｌａｃＺ遺伝子を発現する菌株では（図１６Ｃに示す）、ＤＴＴによる処理中にｌａｃＺ ｍＲＮＡのレベルが明らかに減少したが、完全長ｃｂｈ１プロモーターの下での発現とは同程度ではなく、この菌株におけるダウンレギュレーションの内部対照として用いたｅｇｌ１のｍＲＮＡレベルと同程度でもなかった。長さが１６１ｂｐから２０９ｂｐの切り詰めプロモーターの下でｌａｃＺ遺伝子を発現する菌株では（図１６Ｄに示す）、ＤＴＴによる処理中にｌａｃＺの強い発現（無処理培養中のシグナルに比較して）が検出された。これらの結果は、ｃｂｈ１プロモーターの場合には、ＤＴＴ処理中の発現レベルの減少に関与する領域は、翻訳開始コドンの上流１０２９ｂｐ領域内に位置し、開始コドンの上流の領域５００〜１０２９ｂｐおよび２０９〜３３９ｂｐに最も重要な領域が位置していることを示唆している。
【実施例９】
【００８８】
トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４および遺伝子ａｃｅ１に欠失を有するその誘導体のＤＴＴ処理培養におけるｃｂｈ１の発現
分泌ストレス条件下のセルラーゼプロモーターのダウンレギュレーションにおけるセルラーゼ制御因子ａｃｅ１が果たしている役割を検討するため、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４および遺伝子ａｃｅ１が欠失しているその誘導体（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ他、２０００）をＤＴＴで処理し、セルラーゼ発現について分析した。菌株をソルビトール含有培地上で培養し、ソホロースで誘導し、実施例７に記載したように１０ｍＭ ＤＴＴで処理した。ＲＮＡ分析のための菌糸体のサンプリングならびにノーザン分析は、実施例１および７に記載した通りである。処理中にｃｂｈ１の転写物レベルを定量し、シグナルはｇｐｄ１のシグナルで正規化した（図１７）。
【００８９】
トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０株の場合と同様（実施例１）、ＱＭ９４１４の培養物をＤＴＴ処理するとｃｂｈ１はダウンレギュレーションを受ける。しかしながら、ソルビトール含有培地で培養したａｃｅ１が欠失したＱＭ９４１４株の培養では、ＤＴＴによる処理中もｃｂｈ１が構成的に発現される。これらの特異的条件では、ｃｂｈ１プロモーターのダウンレギュレーションにとってａｃｅ１活性が必要であるように見える。しかしながら、発明者他は、他の培養条件（例えば、グリセロール含有培地上）では、ａｃｅ１活性が必要でないという証拠をつかんでおり、この制御機構にはまだ知られていない他の要因が関与していることを示した。
【実施例１０】
【００９０】
分泌ストレス条件下で遺伝子の転写ダウンレギュレーションの機構を欠く真菌変異株の単離
完全長ｃｂｈ１プロモーターの下で大腸菌ｌａｃＺリポーター遺伝子を発現するトリコデルマ・リーセイｐＭＬＯ１６株にＵＶ照射を用いて突然変異を起こさせ、ＢＦＡの存在という分泌ストレス条件下でｌａｃＺを発現することができる突然変異体を呈色反応に基づいてスクリーニングした。
【００９１】
１ｍｌ当たり１０７個の胞子を含有する胞子懸濁液に対し、胞子生存率が１５〜４６％となるようＵＶ照射を行った。変異処理した胞子は、マイクロタイター・プレート上、ウェル当たりおよそ３個の胞子を用い、炭素源としてソルビトールを含有する最小培地で培養した（実施例７と同じだが、ただしこの場合にはｐＨ７．０とした）。７日間培養した後、ソホロースおよびブレフェルジンＡを加えてｌａｃＺ発現を誘導すると同時に分泌ストレス条件を作り出した。ＢＦＡ存在下のｌａｃＺ産生の誘導は、培養中にＸ−ｇａｌを添加することによる呈色反応によって検出した。ｌａｃＺを発現する培養物をＰＤプレート上で純化し、ＢＦＡ存在下にｃｂｈ１プロモーターを誘導する（ｌａｃＺ発現を制御する）突然変異体の能力を確認した。図１８Ａは、ダウンレギュレーションを受ける完全長ｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺを発現するｐＭＬＯ１６の対照培養、ｃｂｈ１の最小プロモーター（分泌条件においてダウンレギュレートされない、実施例８も参照）の下でｌａｃＺを発現するｐＭＩ３３株、およびｌａｃＺ陰性菌株ＱＭ９４１４、それぞれにおけるｌａｃＺ活性を示している。呈色反応によって示されるように、ソホロース添加後、ＢＦＡの存在下ではｌａｃＺ産生が認められないか、ＢＦＡの非存在下ではｌａｃＺが産生される。図１８Ｂは、マイクロタイター・プレート培養における突然変異体のスクリーニングの一例を示している。分泌ストレス条件下でｌａｃＺを発現する突然変異体を呈色反応に基づいて単離することができる。対照として、ｐＭＬＯ１６の非突然変異誘発胞子をＢＦＡの存在下および非存在下にプレート上で培養した（四角で囲んだウェルを参照；ＢＦＡの非存在下のｌａｃＺ産生を示す陽性呈色反応、およびＢＦＡの存在下で陰性呈色反応）。
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【００９２】
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【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】Ａ２３１８７、ＤＴＴおよびＢＦＡで処理した培養における総タンパク質合成および分泌。 Ａ）５μＭ Ａ２３１８７で処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）から調製した細胞抽出液中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。 Ｂ）５μＭ Ａ２３１８７で処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の培養上清中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。 Ｃ）１０ｍＭ ＤＴＴで処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）から調製した細胞抽出液中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。 Ｄ）１０ｍＭ ＤＴＴで処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の培養上清中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。 Ｅ）５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）から調製した細胞抽出液中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。 Ｆ）５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで処理した培養（菱形、◇）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の培養上清中のＴＣＡ不溶画分に取り込まれた放射能の量。
【図２】時間を変えて５μＭ Ａ２３１８７、５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡあるいは１０ｍＭ ＤＴＴで処理し３５Ｓ−メチオニンで標識した培養からのＣＢＨＩの２Ｄ(２次元)ゲル分析。 Ａ）無処理対照培養、およびＡ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養から標識実験中の様々な時点で調製された細胞抽出液中の標識ＣＢＨＩ（時点は、標識メチオニン添加後の時間（分）として各パネル上に示す）。 Ｂ）Ａ２３１８７またはＢＦＡで処理した培養および無処理培養の標識１８０分後の培養上清からの標識ＣＢＨＩ。
【図３】ＣＢＨＩの合成および分泌。 Ａ）５μＭ Ａ２３１８７で処理した培養（白丸、○）中、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の、標識実験の様々な時点における細胞抽出液中の標識ＣＢＨＩの量 Ｂ）５μＭ Ａ２３１８７で処理した培養（白丸、○）中、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の、標識実験の様々な時点における培養上清中の標識ＣＢＨＩの量 Ｃ）１０ｍＭ ＤＴＴで処理した培養（白丸、○）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の標識実験の様々な時点における細胞抽出液中の標識ＣＢＨＩの量 Ｄ）１０ｍＭ ＤＴＴで処理した培養（白丸、○）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の標識実験の様々な時点における培養上清中の標識ＣＢＨＩの量 Ｅ）５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで処理した培養（白丸、○）、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の、標識実験の様々な時点における細胞抽出液中の標識ＣＢＨＩの量 Ｆ）５０μｇ／ｍｌ ＢＦＡで処理した培養物（白丸、○）中、および無処理対照培養（黒い菱形、◆）の、標識実験の様々な時点における培養上清中の標識ＣＢＨＩの量
【図４】Ａ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養におけるｐｄｉ１およびｂｉｐ１発現のノーザン分析。 Ａ）様々な時点におけるＡ２３１８７による処理培養、および無処理対照培養中のｂｉｐ１およびｐｄｉ１の定常状態ｍＲＮＡレベル（ｇｐｄのシグナルで規格化したシグナル）(処理培養は黒い棒、対照培養は白い棒)。 Ｂ）様々な時点におけるＤＴＴによる処理培養、および無処理対照培養中のｂｉｐ１およびｐｄｉ１の定常状態ｍＲＮＡレベル（ｇｐｄのシグナルで規格化したシグナル）(処理培養は黒い棒、対照培養は白い棒)。 Ｃ）様々な時点における、ＢＦＡによる処理培養および無処理対照培養中のｂｉｐ１およびｐｄｉ１の定常状態ｍＲＮＡレベル（ｇｐｄのシグナルで規格化したシグナル）(処理培養は黒い棒、対照培養は白い棒)。
【図５】ＢＦＡおよびＡ２３１８７で処理した培養（黒い棒）および無処理対照培養（白い棒）中のｈａｃ１ ｍＲＮＡのノーザン分析。
【図６】様々な時間Ａ２３１８７、ＤＴＴまたはＢＦＡで処理した培養（黒い棒）中および無処理対照培養（白い棒）中のｃｂｈ１およびｅｇｌ１のノーザン分析。
【図７】ＤＴＴ処理中の、トリコデルマ・リーセイにおけるｘｙｎ１およびｈｆｂ２タンパク質のノーザン分析（ｇｐｄのシグナルで規格化したシグナル）。
【図８】ＤＴＴによる処理中にダウンレギュレートされない転写物のノーザン分析：分泌経路の成分をコードするｙｐｔ１およびｓａｒ１、未知の機能のｃＤＮＡ１、および細胞内β−グルコシダーゼをコードするｂｇｌ２のシグナル（シグナルは、ｇｐｄのシグナルで規格化した）。
【図９Ａ】アスペルギルス・ニガーからの遺伝子の転写に対するＤＴＴの効果：グルコアミラーゼ遺伝子、ｇｌａＡ（３回測定の平均シグナル）（実線はＤＴＴ処理培養を示し、破線は水処理対照を示す）
【図９Ｂ】アスペルギルス・ニガーからの遺伝子の転写に対するＤＴＴの効果：酸性プロテアーゼであるアスペルギロペプシン遺伝子（ｐｅｐＡ）（３回測定の平均シグナル）（実線はＤＴＴ処理培養を示し、破線は水処理対照を示す）
【図９Ｃ】アスペルギルス・ニガーからの遺伝子の転写に対するＤＴＴの効果：ＥＲ中の常在フォルダーゼ（ｆｏｌｄａｓｅ）であるタンパク質ジスルフィド異性化酵素（ｐｄｉＡ）（３回測定の平均シグナル）（実線はＤＴＴ処理培養を示し、破線は水処理対照を示す）
【図９Ｄ】アスペルギルス・ニガーからの遺伝子の転写に対するＤＴＴの効果：ＥＲ−常在シャペロンであるｂｉｐＡ（３回測定の平均シグナル）（実線はＤＴＴ処理培養を示し、破線は水処理対照を示す）
【図１０】炭素源としてデンプンを含有する培地を炭素源としてキシロースを含有する培地に交換することがアスペルギルス・ニガーＡＢ４．１におけるｇｌａＡの転写に与える効果（交換はＴ＝０で行い、結果は２回の測定の平均を示す）
【図１１Ａ】グルコアミラーゼ遺伝子の転写に対するアンチセンスｐｄｉＡの効果（ｇｌａＡ、２つの異なる実験からの６個のフラスコの平均シグナル）（菌株ＡＢ４．１は実線で示し、菌株ＡＳ１．１は破線で示す。）
【図１１Ｂ】アスペルギロペプシン遺伝子の転写に対するアンチセンスｐｄｉＡの効果（ｐｅｐＡ、２つの異なる実験からの６個のフラスコの平均シグナル）（菌株ＡＢ４．１は実線で示し、菌株ＡＳ１．１は破線で示す。）
【図１１Ｃ】培養の乾燥重量測定（２つの異なる実験からの６個のフラスコの平均シグナル）
【図１２Ａ】ｇｐｄＡプロモーターの制御下にアンチセンスｐｄｉＡを発現するアスペルギルス・ニガーの分泌グルコアミラーゼ・タンパク質のレベル。（データは各時点の３回測定の平均であり、菌株ＡＢ４．１は黒い棒で示し、菌株ＡＳＧ６７は灰色の棒で示す）。
【図１２Ｂ】ｇｐｄＡプロモーターの制御下にアンチセンスｐｄｉＡを発現するアスペルギルス・ニガーにおけるｇｌａＡ ｍＲＮＡの定常状態レベル。（菌株ＡＢ４．１は実線で示し、菌株ＡＳＧ６７は破線で示す）。
【図１２Ｃ】培養の乾燥重量測定（菌株ＡＢ４．１は実線で示し、菌株ＡＳＧ６７は破線で示す）。
【図１３】ｈａｃＡをプローブとした、アスペルギルス・ニガーＡＢ４．１およびＡＳＧ６７のノーザン・ブロット分析。レーン１〜７は、２４、３６、４８、６０、７２、８４および９６時間におけるアスペルギルス・ニガーＡＢ４．１のサンプルを示し、レーン８〜１４は、同じ時点におけるアスペルギルス・ニガーＡＳＧ６７（アンチセンスｐｄｉＡ菌株）について示す。
【図１４Ａ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０においてｔＰＡを産生するための発現カセット
【図１４Ｂ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：増殖をモニターするため培養中に測定されたバイオマス乾燥重量およびラクトース濃度。
【図１４Ｃ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：培地中で産生される総タンパク質およびＨＥＣ活性（セルラーゼ、特にエンドグルカナーゼ、活性を測定する）。
【図１４Ｄ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：分泌タンパク質をコードする遺伝子の例として分析されたｅｇｌ１の転写物レベル（アクチン遺伝子のシグナルで規格化）。
【図１４Ｅ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：ｃｂｈ１およびｃｂｈ１−ｔＰＡ融合物の転写物レベル（アクチン遺伝子のシグナルで規格化）
【図１４Ｆ】トリコデルマ・リーセイＲｕｔ−Ｃ３０およびｔＰＡ産生形質転換体３０６／３６のバイオリアクター培養：培養中のｂｉｐ１の転写物レベル（アクチン遺伝子のシグナルで規格化）
【図１５】ｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺリポーター遺伝子の発現 Ａ）１０ｍＭ ＤＴＴ存在下の発現試験に用いたｌａｃＺ発現カセットの概略図：菌株ｐＭＬＯ１６中では完全長ｃｂｈ１プロモーターの下で、菌株ｐＭＩ３４中では切り詰めプロモーターの下でのｌａｃＺ発現。 Ｂ）菌株ｐＭＬＯ１６中（左のグラフ）および菌株ｐＭＩ３４中（右のグラフ）において１０ｍＭ ＤＴＴ処理培養（黒い棒）および無処理対照培養（白い棒）中のｌａｃＺおよびｅｇｌ１のｍＲＮＡレベル（ｇｐｄシグナルで規格化）。
【図１６Ａ】様々な程度に欠失させたｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺリポーター遺伝子の発現：分泌ストレス条件の下でプロモーターの活性を検討するためトリコデルマ・リーセイにおける大腸菌ｌａｃＺ発現のために使用したｃｂｈ１プロモーターの欠失シリーズの略図
【図１６Ｂ】様々な程度に欠失させたｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺリポーター遺伝子の発現：菌株ｐＭＬＯ１６、ｐＭＬＯ１６Ｓ、ｄｅｌ１（１）Ｓおよびｄｅｌ０（２）ＳのＤＴＴ処理培養および同一菌株の無処理培養におけるｌａｃＺ、ｅｇｌ１およびｇｐｄ１の発現のノーザン分析。処理の時点は、処理の開始からの時間（分）として各レーンの上部に示す。各時点におけるＤＴＴ処理培養中の相対ｍＲＮＡレベル（無処理対照培養中のｍＲＮＡレベルを１と設定した）は、右のグラフに示す（ｌａｃＺシグナル、白丸；ｅｇｌ１シグナル、黒い菱形）
【図１６Ｃ】様々な程度に欠失させたｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺリポーター遺伝子の発現：Ｂ）と同様な、菌株ｄｅｌ２３、ｄｅｌ５（１１）Ｓ、ｄｅｌ５（１１）およびｄｅｌ６（１４）のノーザン分析
【図１６Ｄ】様々な程度に欠失させたｃｂｈ１プロモーターの下でのｌａｃＺリポーター遺伝子の発現：Ｂ）と同様な、菌株ｄｅｌ７（５）Ｓ、ｐＭＩ３３およびｐＭＩ３４のノーザン分析
【図１７】トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４およびａｃｅ１遺伝子が欠失したＱＭ９４１４の培養におけるＤＴＴ処理中のｃｂｈ１ ｍＲＮＡレベル
【図１８Ａ】分泌ストレス条件の下で遺伝子のダウンレギュレーションの機構を欠いた真菌変異体のスクリーニング：菌株ｐＭＬＯ１６、ｐＭＩ３３およびＱＭ９４１４のマイクロタイター平板培養をＢＦＡおよびソホロースの存在下および非存在下でｌａｃＺ産生を試験した。ｌａｃＺ産生は暗色反応として検出した
【図１８Ｂ】分泌ストレス条件の下で遺伝子のダウンレギュレーションの機構を欠いた真菌変異体のスクリーニング：マイクロタイター平板培養における、ＢＦＡ存在下でのソホロース誘導後のｌａｃＺの発現についての変異体のスクリーニング。ｌａｃＺ産生変異体は、Ｘ−ｇａｌ基質の添加後に暗色反応に基づいて検出した。変異誘発されていないｐＭＬＯ１６の培養は、ＢＦＡの存在下および非存在下ソホロース誘導後にｌａｃＺ産生についてアッセイした（四角で囲んだウェル）
Claims (33)
- 分泌可能なタンパク質のプロモーター中に位置し、分泌ストレスの下で分泌タンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与することを特徴とするＤＮＡ配列。
- 前記ＤＮＡ配列が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、ハイドロフォビン、プロテアーゼ、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、スウォレニン、リグニン分解酵素およびペクチナーゼのプロモーターからなる群から選択されるプロモーター中に位置することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ配列。
- プロモーターが、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ｓｗｏ、ｇｌａ、ａｍｙ、およびｐｅｐＡプロモーターを含む群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
- 分泌可能なタンパク質のプロモーター中に位置するＤＮＡ配列が、ストレス条件下で測定した場合に非ストレス条件に比べて低下した分泌可能なタンパク質のｍＲＮＡレベルの原因であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
- ＤＮＡ配列がトリコデルマｃｂｈ１プロモーターの−１６２位上流に位置することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列。
- 分泌ストレスの下での分泌タンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与する機構に対する応答が改変されていることを特徴とする、改良されたタンパク質産生のための、分泌可能なタンパク質のプロモーター。
- 転写ダウンレギュレーションに関与するＤＮＡ配列が変異、不活性化、除去または増幅されていることを特徴とする請求項６に記載のプロモーター。
- 請求項１乃至４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列が変異、不活性化、除去または増幅されていることを特徴とする請求項６または７に記載のプロモーター。
- 請求項６乃至８のいずれか１項に記載のプロモーターであって、遺伝子改変の結果として、分泌可能なタンパク質が分泌ストレス条件において改変プロモーターの下で発現される場合に、請求項６乃至８のいずれか１項に記載のプロモーターの改変されていないものの下での分泌可能なタンパク質の発現に比べて分泌可能なタンパク質の発現が増加または減少することを特徴とするプロモーター。
- 真菌宿主における改良されたタンパク質産生のためのプロモーターを製造する方法であって、
−分泌可能なタンパク質のプロモーターを選択する工程、
−プロモーターを遺伝子改変する工程、
−プロモーターをリポーター・タンパク質のコード領域に動作可能に連結する工程、
−分泌ストレスにある適切な培養条件下に真菌宿主の改変プロモーターの制御下で選択されたリポーター・タンパク質を発現する工程、
−非改変プロモーターで得られる発現に比べ、選択されたリポーター・タンパク質のタンパク質発現の増加または減少を示す細胞をスクリーニングまたは選択する工程、を含むことを特徴とする方法。 - 選択されたリポーター・タンパク質のコード領域が分泌可能なタンパク質のコード領域であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
- 分泌ストレスの下で分泌タンパク質をコードする遺伝子の転写をダウンレギュレートする宿主機構が複数、遺伝子改変されていることを特徴とする真菌宿主菌株。
- 宿主が、請求項６乃至９のいずれか１項に記載のプロモーターを備えていることを特徴とする、請求項１２に記載の真菌宿主菌株。
- 真菌宿主が遺伝子改変されたプロモーターを備え、改変の結果、タンパク質が分泌ストレス条件において改変プロモーターの下で発現される場合に、非改変プロモーターの下でのタンパク質の発現に比べてタンパク質の発現が増加または減少することを特徴とする請求項１２または１３に記載の真菌宿主菌株。
- 転写ダウンレギュレーションに関与する制御因子の発現または活性が宿主中で遺伝子改変されていることを特徴とする、請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株。
- 制御因子の発現または活性が低下または消滅していることを特徴とする請求項１２乃至１５のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株。
- 制御因子の発現または活性が増幅または増加していることを特徴とする請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株。
- 請求項１２乃至１７のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株であって、転写ダウンレギュレーションに関与する制御因子の発現または活性が真菌宿主中で遺伝子改変され、その結果として、分泌可能なタンパク質が分泌ストレス条件において真菌宿主で発現される場合に、非改変宿主における分泌可能なタンパク質の発現に比べて、分泌可能なタンパク質の発現が増加または減少することを特徴とする真菌宿主菌株。
- 請求項１２乃至１８のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株であって、前記複数の制御機構が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、ハイドロフォビン、スウォレニン、プロテアーゼ、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、リグニン分解酵素およびペクチナーゼを含む群から選択されるタンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与していることを特徴とする真菌宿主菌株。
- 請求項１２乃至１９のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株であって、前記複数の制御機構が、遺伝子ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ｓｗｏ、ｇｌａ、ａｍｙ、およびｐｅｐＡによってコードされるタンパク質を含む群から選択されるタンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与していることを特徴とする真菌宿主菌株。
- 請求項１２乃至２０のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株であって、制御因子がａｃｅ１遺伝子によってコードされていることを特徴とする真菌宿主菌株。
- 請求項１２乃至２１のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株であって、タンパク質産物が、転写ダウンレギュレーションを受けないプロモーターから発現されることを特徴とする真菌宿主菌株。
- 請求項１２乃至２２のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株であって、菌株が、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フザリウム属、ペニシリウム属、フミコラ属、トリポクラジウム・ジオデス（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ ｇｅｏｄｅｓ）、クルイベロマイセス属、ピキア属、ハンゼヌラ属、カンジダ属、ヤロウィア属、スキゾサッカロミセス属、サッカロミセス属を含む群から選択されることを特徴とする真菌宿主菌株。
- 菌株がアスペルギルス属またはトリコデルマ属に属していることを特徴とする請求項１２乃至２３のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株。
- 菌株がアスペルギルス・ニガーまたはトリコデルマ・リーセイに属していることを特徴とする請求項１２乃至２４のいずれか１項に記載の真菌宿主菌株。
- 改良されたタンパク質産生のための真菌宿主を製造する方法であって、
−分泌可能なタンパク質のプロモーターを選択する工程、
−プロモーターを遺伝子改変する工程、
−プロモーターを選択された分泌可能なタンパク質のコード領域に動作可能に連結する工程、
−分泌ストレスにある適切な培養条件下に真菌宿主の改変プロモーターの制御下で選択された分泌可能なタンパク質を発現する工程、
−非改変プロモーターの下での分泌可能なタンパク質の発現に比べ、選択された分泌可能なタンパク質のタンパク質発現の増加または減少を示す細胞をスクリーニングまたは選択する工程、および
−転写ダウンレギュレーション機構が改変されたプロモーターを備える真菌宿主を回収する工程を含むことを特徴とする方法。 - 改良されたタンパク質産生のための真菌宿主を製造する方法であって、
−真菌宿主において転写ダウンレギュレーションに関与する制御因子の発現または活性を遺伝子改変する工程、
−分泌ストレス条件において改変真菌宿主で選択された分泌可能なタンパク質を発現する工程、
−非改変宿主における分泌可能なタンパク質の発現に比べ、選択された分泌可能なタンパク質のタンパク質発現の増加または減少を示す細胞をスクリーニングまたは選択する工程、および
−真菌細胞を回収する工程を含むことを特徴とする方法。 - 真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法であって、
−適切な培地において請求項１１乃至２５のいずれか１項に記載の宿主または請求項２６または２７に記載の方法によって得られる宿主を培養する工程、および
−培地からタンパク質産物を回収する工程を含むことを特徴とする方法。 - 請求項２８に記載の方法であって、タンパク質産物が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、ハイドロフォビン、プロテアーゼ、インベルターゼ、フィターゼ、ホスファターゼ、リグニン分解酵素、ペクチナーゼ、免疫グロブリンまたはｔＰＡなどの細菌または下等もしくは高等真核生物または真菌もしくは哺乳類に由来するタンパク質を含む群から選択されるものである ことを特徴とする方法。
- 真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法であって、
−分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子を選択する工程、
−分泌ストレスの下で分泌タンパク質の転写ダウンレギュレーションに関与する機構にに対する応答に関して遺伝子のプロモーターを遺伝子改変する工程、
−真菌宿主においてプロモーターの制御下に所望の分泌可能なタンパク質を産生する工程、および
−宿主の培地からタンパク質産物を回収する工程を含むことを特徴とする方法。 - 真菌における分泌可能なタンパク質の最適化されたタンパク質産生のための方法であって、
−分泌可能なタンパク質の遺伝子を選択する工程、
−転写ダウンレギュレーションによって制御されないプロモーター中に、選択された分泌可能なタンパク質のコード領域を動作可能に連結する工程、
−適切な培養条件の下で真菌宿主を培養し、真菌宿主においてダウンレギュレーションに関与するタンパク質を過剰産生する工程、および
−宿主の培地から選択された分泌可能なタンパク質を回収する工程を含むことを特徴とする方法。 - 請求項３１に記載の方法であって、選択された分泌可能なタンパク質が異種タンパク質であることを特徴とする方法。
- タンパク質産生を最適化するための請求項１乃至５のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列、または請求項６乃至１１のいずれか１項に記載のプロモーター、または請求項１２乃至２５のいずれか１項に記載の真菌宿主、または請求項２６または２７に記載の方法によって得られる真菌宿主の使用。
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