CN105308171A - Agse缺陷菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及突变微生物宿主细胞，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞在AgsE蛋白质产生或其同源物产生上缺陷。已意外地发现，如果与使用未被修饰的亲本宿主细胞的方法相比，在相同条件下测量时，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞用于生成目标化合物例如酶的方法中时获得产率提高的所述化合物。

Description

AGSE缺陷菌株

技术领域

本发明涉及优选在其基因组中被修饰以导致多肽生成缺陷的突变微生物宿主细胞，涉及生成所述突变微生物宿主细胞的方法和使用所述突变微生物宿主细胞生成目标化合物的方法。

背景技术

不同的宿主细胞类型可用于不同的工业用途。例如：哺乳动物细胞系用于抗体生产；真菌细胞是用于生产多肽和次级代谢产物的优选生物；细菌细胞优选用于小代谢产物和抗生素生产；而植物细胞优选用于口感和风味化合物。

重组技术广泛用于优化这种宿主细胞的生产率和/或使用这种宿主细胞的工艺。这可涉及许多选择。

一些技术将针对编码目标化合物的目标基因在宿主细胞中的过表达。可按几种方式调节基因表达。

例如可将目标基因置于宿主细胞中，受适合所述细胞的强启动子的表达控制。后者可通过质粒或载体介导的转化将表达盒引入宿主细胞中进行。然后可通过在表达盒中所含启动子正常作用所必需的诱导条件下，培养转化的宿主细胞实现目标化合物的生成。例如，US57228547描述了DNA构建体用于转化曲霉菌(Aspergillus)以在其中获得多肽表达的用途，其中DNA构建体包含用于在曲霉菌中促进转录并且与编码所述多肽的DNA可操作地连接的诱导型启动子DNA。

已知转录激活子是促进RNA聚合酶与控制目标基因表达的启动子结合的调节蛋白。可以通过例如以下来调节基因表达：使用生成更高量的特异性转录激活子的突变宿主细胞，导致在受所述转录激活子激活的启动子控制下的目标基因表达增加。在例如WO2006/040312中描述了这种方法，提到了PrtT转录激活子及其用途。

在另一替代性方法中，可通过增加用于表达基因的宿主细胞中目标基因的拷贝数来提高基因表达。然而，宿主细胞中存在的基因拷贝数是限制因素，因为包含大量待表达基因拷贝的重组宿主细胞可能变得不稳定。在WO9846772中给出了这个问题的解决方案，其描述了包含多个基本同源的DNA结构域的稳定丝状真菌，其中在所述结构域的至少2个中，存在编码目标化合物的重组DNA分子的整合的拷贝。

还有其他旨在提高宿主细胞对目标化合物的生产率的方法可涉及缺失或灭活竞争途径、改变酶的区室化(compartmentalization)、增加蛋白质或代谢产物分泌、增加细胞器含量(organellecontent)等。

尽管在对宿主细胞中目标化合物的表达的理解上有进展，但是仍然需要在商业或工业规模上，增加重要目标化合物的生成的方法。令人惊讶的是，我们已经发现下调微生物宿主细胞、例如表达目标化合物(例如目标酶)的丝状真菌宿主细胞中的agsE基因导致所述宿主细胞对所述酶的生成增加。

发明概述

本发明涉及一种突变微生物宿主细胞，其优选在其基因组中被修饰，从而如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时导致选自以下的多肽的生成缺陷：

a.根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；

b.SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；

c.根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性；

d.能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性。

本发明进一步涉及一种生成根据本发明所述的突变微生物宿主细胞的方法，其包括以下步骤：

a.提供亲本微生物宿主细胞；

b.修饰所述亲本微生物宿主细胞，优选修饰所述亲本微生物宿主细胞的基因组，从而产生如果与亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时选自以下的多肽的生成上缺陷的突变微生物宿主细胞：

(i)根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；

(ii)SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；

(iii)根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性；

(iv)能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性。

本发明也涉及通过微生物发酵生成目标化合物的方法，其包括：

a.提供能够表达所述目标化合物的根据本发明所述的或根据生成本发明所述的突变微生物宿主细胞的方法生成的突变微生物宿主细胞，

b.在有益于表达所述目标化合物的条件下培养所述微生物宿主细胞，

c.任选地从培养基中分离所述目标化合物。

附图说明

图1描绘了pGBTOPGOX-3，其为用于表达产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)葡萄糖氧化酶基因的基于pGBTOP-12的质粒，具有受葡糖淀粉酶启动子驱动的表达与在经改造BamHI扩增子中靶向整合的布局。

图2描绘了pGBTOPLIP-2，其为用于表达L01脂肪酶(如WO2009/106575所述)的基于pGBTOP-12的质粒，具有克隆在其中的L01基因和受葡糖淀粉酶启动子驱动的表达与在经改造BamHI扩增子中靶向整合的布局。

图3描绘了pGBTOPPLA-2，其为用于表达猪磷脂酶A2(PLA2)的基于pGBTOP-12的质粒，具有克隆在其中的GLA-PLA2编码基因和受葡糖淀粉酶启动子驱动的表达与在经改造BamHI扩增子中靶向整合的布局。

图4描绘了pGBDEL-AMY1，其为用于缺失编码淀粉酶的agdB基因的质粒，具有其他缺失构建体(即pGBDEL-AMY2和pGBDEL-AMY4)的代表布局。

图5描绘了在不同菌株的培养上清液中测量的相对葡萄糖氧化酶活性。第4天PGOX-2参考菌株的活性被设为100％水平。

图6描绘了不同突变菌株板上的葡萄糖氧化酶活性。在1％麦芽糖上生长并且在生长4天后，用邻茴香胺染色。

图7描绘了第4天在所示不同菌株的培养上清液中测量的相对脂肪酶活性。将两个LIP2参考菌株之一的活性设为100％水平。

图8描绘了在发酵所示菌株5天后，在培养上清液中测量的相对PLA2活性。将PLA2参考菌株的活性设为100％水平。

序列表描述

SEQIDNO:1列出了来自黑曲霉(Aspergillusniger)的agsE基因的基因组序列，包括2kb上游和下游侧翼区。所述基因组序列包含根据SEQIDNO:2的cDNA序列。

SEQIDNO:2列出了来自黑曲霉的agsE基因的cDNA序列。

SEQIDNO:3列出了来自黑曲霉的AgsE蛋白质的氨基酸序列。

SEQIDNO:4列出了与SEQIDNO:3的第20-2426位氨基酸相对应的成熟AgsE蛋白质的氨基酸序列。

SEQIDNO:5列出了来自黑曲霉的agdB基因的基因组序列，包括2kb上游和下游侧翼区。所述基因组序列包含根据SEQIDNO:6的cDNA序列。

SEQIDNO:6列出了来自黑曲霉的agdB基因的cDNA序列。

SEQIDNO:7列出了来自黑曲霉的AgdB蛋白质的氨基酸序列。

SEQIDNO:8列出了来自黑曲霉的agdA基因的基因组序列，包括2kb上游和下游侧翼区。所述基因组序列包含根据SEQIDNO:9的cDNA序列。

SEQIDNO:9列出了来自黑曲霉的agdA基因的cDNA序列。

SEQIDNO:10列出了来自黑曲霉的AgdA蛋白质的氨基酸序列。

SEQIDNO:11列出了来自产黄青霉的葡萄糖氧化酶的密码子对优化cDNA序列。

SEQIDNO:12列出了来自产黄青霉的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列。

SEQIDNO:13列出了来自黑曲霉的amyC淀粉酶基因的基因组序列，包括2kb上游和下游侧翼区。所述基因组序列包含根据SEQIDNO:2的cDNA序列。

SEQIDNO:14列出了来自黑曲霉的amyC淀粉酶基因的cDNA序列(短序列)。

SEQIDNO:15列出了来自黑曲霉的amyC淀粉酶蛋白质的氨基酸序列(短序列)。

SEQIDNO:16列出了与SEQIDNO:15的第17-493位氨基酸相对应的AmyC成熟淀粉酶蛋白的氨基酸序列(短序列)。

SEQIDNO:17列出了来自黑曲霉的amyC淀粉酶基因的cDNA序列(长序列)。

SEQIDNO:18列出了来自黑曲霉的amyC淀粉酶蛋白质的氨基酸序列(长序列)。

SEQIDNO:19列出了与SEQIDNO:18的第17-524位氨基酸相对应的AmyC成熟淀粉酶蛋白的氨基酸序列(长序列)。

SEQIDNO:20列出了包含与融合的proPLA2(猪磷脂酶A2)融合的黑曲霉天然葡糖淀粉酶A基因的融合蛋白的氨基酸序列。

可从例如从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的NCBI或EMBL(http://www.ebi.ac.uk/embl/)可得到的公用数据库得到黑曲霉基因的所有核苷酸序列和蛋白质序列及其基因组环境(genomiccontext)。例如，EMBL上CBS513.88的基因组序列的登记号为no.AM269948-AM270415。

发明详述

本发明涉及一种突变微生物宿主细胞，其已优选在其基因组中被修饰，从而如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时导致选自以下的多肽的生成缺陷：

a.根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同并且优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的多肽；

b.SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同并且优选具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽；

c.根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性；

d.能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性。

已意外地发现，如果与使用亲本宿主细胞的方法相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述并且能够表达目标化合物的突变微生物宿主细胞用于生成目标化合物例如酶的方法中时获得产率提高的所述化合物。

另外，已经发现当根据本发明所述并且能够表达目标化合物的突变微生物宿主细胞用于生成目标化合物的方法中时，包含突变微生物宿主细胞的发酵液展示出相当低的粘度。这种性质与工业规模工艺尤其相关，因为其允许使用本发明突变微生物宿主细胞的发酵工艺使用更少能量进行或更强烈地(intensively)进行。

在本发明的上下文中，“在相同条件下测量”或“在相同条件下分析”意味着在相同条件下培养突变微生物宿主细胞和亲本微生物宿主细胞并且使用相同条件、优选使用相同测定法和/或方法、更优选在同一实验中分别在微生物宿主细胞和亲本宿主细胞中测量如果与亲本微生物宿主细胞相比在突变宿主细胞中缺陷的多肽的量和/或活性。

本文将“突变微生物宿主细胞”定义为源自亲本宿主细胞并且如果与亲本宿主细胞相比，已优选在其基因组中被修饰以获得如果与其来源的亲本宿主细胞相比不同的基因型和/或不同的表型的微生物宿主细胞。

所述修饰可通过以下任一种实现：

a)使亲本微生物宿主细胞经受重组基因操作技术；和/或

b)使亲本微生物宿主细胞经受(传统)诱变；和/或

c)使亲本微生物宿主细胞经受抑制性化合物或组合物。

本文将“已优选在其基因组中被修饰以导致产物生成缺陷的突变微生物宿主细胞”定义为已优选在其基因组中被修饰以导致以下表型特征的突变微生物宿主细胞，其中与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比，在相同条件下分析时，所述细胞：a)生成更少的产物或基本不生成产物和/或b)生成活性降低或比活性降低的产物或没有活性或没有比活性的产物或这些可能性中一种或更多种的组合，其中所述产物例如根据SEQIDNO:3的多肽产物。

在本发明的上下文中，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞在多肽生成上缺陷。所述多肽优选具有酶活性，优选为糖苷水解酶活性，更优选为选自以下的酶活性：α-淀粉酶活性[EC3.2.1.1]、异淀粉酶活性、菊粉酶活性、转化酶活性[EC3.2.1.26]、麦芽糖酶活性[EC3.2.1.20]、异麦芽糖酶活性、支链淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、环糊精酶活性、壳聚糖酶活性、葡聚糖酶活性、蔗糖酶-异麦芽糖酶活性、α-葡糖苷酶活性、糖原脱支酶活性。

在另一实施方式中，所述多肽优选具有为α-葡糖基转移酶(α-gluconotransferase)活性的酶活性，优选为糖苷转移酶或糖苷合酶活性的酶活性，更优选为选自以下的酶活性：糖原分支酶活性、α-1,3-葡聚糖合酶活性[EC2.4.1.183]、α-1,4-葡聚糖合酶活性、α-1,6-葡聚糖合酶活性、β-1,3-葡聚糖合酶活性、β-1,4-葡聚糖合酶活性、β-1,6-葡聚糖合酶活性、葡糖淀粉酶活性、形成麦芽五糖的淀粉酶活性、形成麦芽六糖的淀粉酶活性、α-葡糖苷酶活性、α-葡糖苷酶II活性、α-木糖苷酶活性。

这种多肽选自：

a.根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同并且优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的多肽；

b.SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同并且优选具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽；

c.根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或1的多核苷酸编码的所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性；

d.能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽优选具有SEQIDNO:1或2编码的多肽的至少一种活性。

根据SEQIDNO:3的多肽与来自黑曲霉的推定α-1,3-D-葡聚糖合酶agsE相对应(YuanX.-L.,vanderKaaijR.M.,vandenHondelC.A.M.J.J.,PuntP.J.,vanderMarelM.J.E.C.,DijkhuizenL.,RamA.F.J.Mol.Genet.Genomics(2008)279:545-561)。根据SEQIDNO:3的多肽由agsE基因(如SEQIDNO:1所示的基因组DNA，如SEQIDNO:2所示的cDNA)编码。

在本发明的上下文中，与SEQIDNO:3至少70％相同的多肽是特征如下的多肽：如果与SEQIDNO:3的多肽相比氨基酸序列包含一个或更多个氨基酸的一个或更多个替换、缺失和/或插入并且优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种酶活性。因此，根据SEQIDNO:3的多肽和与其至少70％相同的多肽优选具有至少一种共同的酶活性。所述至少一种酶活性优选为糖苷水解酶活性，更优选为选自以下的酶活性：α-淀粉酶活性[EC3.2.1.1]、异淀粉酶活性、菊粉酶活性、转化酶活性[EC3.2.1.26]、麦芽糖酶活性[EC3.2.1.20]、异麦芽糖酶活性、支链淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、环糊精酶活性、壳聚糖酶活性、葡聚糖酶活性、蔗糖酶-异麦芽糖酶活性、α-葡糖苷酶活性、糖原脱支酶活性。

在另一实施方式中，所述酶活性为：α-葡糖基转移酶活性，酶活性优选为糖苷转移酶或糖苷合酶活性，更优选为选自以下的酶活性：糖原分支酶活性、α-1,3-葡聚糖合酶活性[EC2.4.1.183]、α-1,4-葡聚糖合酶活性、α-1,6-葡聚糖合酶活性、β-1,3-葡聚糖合酶活性、β-1,4-葡聚糖合酶活性、β-1,6-葡聚糖合酶活性、葡糖淀粉酶活性、形成麦芽五糖的淀粉酶活性、形成麦芽六糖的淀粉酶活性、α-葡糖苷酶活性、α-葡糖苷酶II活性、α-木糖苷酶活性。

与SEQIDNO:3至少70％相同并且具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种(酶)活性的多肽可具有比根据SEQIDNO:3的多肽多或少的所述至少一种活性。与SEQIDNO:3至少70％相同的多肽可为例如SEQIDNO:3的天然变体、直系同源物或使用本领域中众所周知的方法，例如传统诱变、定点诱变、DNA改组和计算机设计获得的体外生成的变体。在本发明的上下文中，如果与SEQIDNO:3相比并且在相同条件下测量，与SEQIDNO:3至少70％相同的多肽优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的20％-400％酶活性，更优选40％-350％活性，甚至更优选50-300％活性、70-250％活性、80-200％活性，最优选约100％活性。此处用活性指以上提及的酶活性。为了测量在根据SEQIDNO:3的多肽中以及在与其至少70％相同并且具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种酶活性的多肽中的所述至少一种酶活性，可使用本领域中已知的用于测量所述比活性的任何方法。唯一的要求是根据SEQIDNO:3的多肽和与其至少70％相同的多肽中所述活性的测量使用相同方法和/或测定法在相同条件下、优选在同一实验中进行。可优选根据实验部分中描述的用于测定α-淀粉酶活性的已良好建立的Ceralpha方法测量α-淀粉酶活性。可根据“TsumoriH.,ShimamuraA.,MukasaH.JournalofGeneralMicrobiology(1985)131:553-559”中描述的方法测量α-1,3-葡聚糖合酶活性。优选地，所述多肽与SEQIDNO:3至少80％相同，更优选与SEQIDNO:3至少85％相同，甚至更优选与SEQIDNO:3至少90％相同，最优选与SEQIDNO:3至少91％，例如至少92％、93％、94％、至少95％相同，至少96％、97％、98％、至少99％相同。优选地，所述多肽为根据SEQIDNO:3的多肽。优选地，在整个多肽序列长度上测量序列同一性。

根据本发明所述的突变微生物宿主细胞在其生成上缺陷的多肽可为SEQIDNO:3中包含的成熟多肽。本文将成熟多肽定义为翻译、翻译后修饰，例如N端加工、C端加工、糖基化、磷酸化、分泌和任选地通过(蛋白水解)切割去除前导序列后呈其最终形式的多肽。信号肽、肽原(propeptide)和前肽原(prepropeptide)在本领域中有时称为“前导序列”。本文将术语“肽原”定义为与具有生物活性的多肽的N端框内融合的肽。所生成的多肽称为多肽原，其缺乏多肽生物活性并且可通过肽原从多肽原的催化或自身催化切割转化为成熟、生物活性多肽。本文将信号肽和肽原一起称为“前肽原”。本文将“信号序列”定义为与肽原N端框内融合并且肽原与具有生物活性的多肽的N端框内融合的肽。在一些情况下，缺乏肽原并且信号序列与多肽N端框内融合。信号序列的功能是指引多肽进入细胞分泌途径。

因此，SEQIDNO:3可为由mRNA翻译并且在翻译后修饰之前的序列。如果与其中包含的成熟多肽相比，SEQIDNO:3可在C端和/或N端包含附加氨基酸。例如，SEQIDNO:3可包含与其信号肽、肽原和/或前肽原框内连接的成熟多肽。在一个优选实施方式中，SEQIDNO:3中包含的成熟多肽与SEQIDNO:3的第20-2426位氨基酸相对应并且在SEQIDNO:4中列出。因此在一个实施方式中，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞中作为根据SEQIDNO:4的成熟多肽的多肽缺陷。

在本发明的上下文中，突变微生物细胞在其生成上缺陷的多肽可为与本文所定义的成熟多肽至少70％相同并且优选具有所述成熟多肽如本文所定义的至少一种活性的多肽。因此，如本文所定义的SEQIDNO:3中包含的成熟多肽，优选根据SEQIDNO:4的成熟多肽和与其至少70％相同的多肽优选具有至少一种共同的酶活性。所述至少一种酶活性优选为糖苷水解酶活性，更优选为选自以下的酶活性：α-淀粉酶活性[EC3.2.1.1]、异淀粉酶活性、菊粉酶活性、转化酶活性[EC3.2.1.26]、麦芽糖酶活性[EC3.2.1.20]、异麦芽糖酶活性、支链淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、环糊精酶活性、壳聚糖酶活性、葡聚糖酶活性、蔗糖酶-异麦芽糖酶活性、α-葡糖苷酶活性、糖原脱支酶活性。

在另一实施方式中，所述酶活性为：α-葡糖基转移酶活性，酶活性优选为糖苷转移酶或糖苷合酶活性，更优选为选自以下的酶活性：糖原分支酶活性、α-1,3-葡聚糖合酶活性[EC2.4.1.183]、α-1,4-葡聚糖合酶活性、α-1,6-葡聚糖合酶活性、β-1,3-葡聚糖合酶活性、β-1,4-葡聚糖合酶活性、β-1,6-葡聚糖合酶活性、葡糖淀粉酶活性、形成麦芽五糖的淀粉酶活性、形成麦芽六糖的淀粉酶活性、α-葡糖苷酶活性、α-葡糖苷酶II活性、α-木糖苷酶活性。

优选地，所述多肽与本文所述的成熟多肽至少80％相同，更优选与本文所述的成熟多肽至少85％相同，甚至更优选与本文所述的成熟多肽至少90％相同，最优选与本文所述的成熟多肽至少91％，例如至少92％、93％、94％、至少95％相同，至少96％、97％、98％、至少99％相同。优选地，所述多肽为根据SEQIDNO:4的成熟多肽。优选地，在整个多肽序列长度上测量序列同一性。

在本发明的上下文中，根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸是编码如以上所定义的根据SEQIDNO:3的多肽、SEQIDNO:3中包含的成熟多肽、根据SEQIDNO:4的多肽或与SEQIDNO:3具有至少70％同一性的多肽、与SEQIDNO:3中包含的成熟多肽具有至少70％同一性的多肽、与根据SEQIDNO:4的多肽具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸。在本发明的上下文中，与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸是特征如下的多核苷酸：如果与SEQIDNO:1或2的多核苷酸相比，核苷酸序列包含一个或更多个核苷酸的一个或更多个替换、缺失和/或插入。优选地，所述多核苷酸与SEQIDNO:1或2至少80％相同，更优选与SEQIDNO:1或2至少85％相同，甚至更优选与SEQIDNO:1或2至少90％相同，最优选与SEQIDNO:1或2至少91％、92％、93％、94％、至少95％相同，至少96％、97％、98％、至少99％相同。优选地，所述多核苷酸为根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸。优选地，与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽具有SEQIDNO:1或2编码的多肽如本文所定义的至少一种酶活性。因此，SEQIDNO:1或2编码的多肽和与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽具有至少一种共同的酶活性。所述至少一种酶活性优选为糖苷水解酶活性，更优选为选自以下的酶活性：α-淀粉酶活性[EC3.2.1.1]、异淀粉酶活性、菊粉酶活性、转化酶活性[EC3.2.1.26]、麦芽糖酶活性[EC3.2.1.20]、异麦芽糖酶活性、支链淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、环糊精酶活性、壳聚糖酶活性、葡聚糖酶活性、蔗糖酶-异麦芽糖酶活性、α-葡糖苷酶活性、糖原脱支酶活性。

在另一实施方式中，所述酶活性为：α-葡糖基转移酶活性，酶活性优选为糖苷转移酶或糖苷合酶活性，更优选为选自以下的酶活性：糖原分支酶活性、α-1,3-葡聚糖合酶活性[EC2.4.1.183]、α-1,4-葡聚糖合酶活性、α-1,6-葡聚糖合酶活性、β-1,3-葡聚糖合酶活性、β-1,4-葡聚糖合酶活性、β-1,6-葡聚糖合酶活性、葡糖淀粉酶活性、形成麦芽五糖的淀粉酶活性、形成麦芽六糖的淀粉酶活性、α-葡糖苷酶活性、α-葡糖苷酶II活性、α-木糖苷酶活性。

为了本发明的目的，此处明确为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同一性百分比，为最佳比较目的而比对所述序列。为了优化两个序列之间的比对，在比较的两个序列的任一个中引入空位。可在比较序列的整个长度上进行这种比对。或者，可在较短长度，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在报告比对区域上相同匹配的百分比。

两个序列之间序列的比较和序列同一性百分比的测定可使用数学算法完成。技术人员将意识到可用几种不同的计算机程序比对两个序列并测定两个序列之间的同一性的事实(Kruskal,J.B.(1983)AnoverviewofsequencecomparisonD.Sankoff和J.B.Kruskal,(编辑),Timewarps,stringeditsandmacromolecules:thetheoryandpracticeofsequencecomparison，第1-44页，AddisonWesley)。可使用Needleman和Wunsch算法比对两个序列，测定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比。(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。可用所述算法比对氨基酸序列和核苷酸序列二者。Needleman-Wunsch算法已经在计算机程序NEEDLE中执行。为了本发明的目的，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序(2.8.0版本或更高，EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(2000)Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.TrendsinGenetics16,(6)第276—277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，将EBLOSUM62用于替代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。使用的可选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将认识到，所有这些不同的参数将产生略有不同的结果，但是使用不同算法时两个序列的总体同一性百分比未显著改变。

用如上所述的程序NEEDLE比对后，查询序列和本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：两个序列在比对中显示出相同氨基酸或相同核苷酸的相应位置的数量除以在减去比对中空位总数后的比对总长度。可使用NOBRIEF选项由NEEDLE获得如本文所定义的同一性并且在程序输出中标记为“最长同一性”。

本发明的核酸和蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以对公用数据库进行搜索，例如鉴定其他家族成员或相关序列。这种搜索可使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403—10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)进行。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得空位比对用于比较目的，如Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所述，利用空位BLAST。利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上国家生物技术信息中心的主页。

在本发明的上下文中，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞缺乏其生成的多肽可为能够与SEQIDNO:1或2杂交或能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，优选其能够在低严格性条件下与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸的互补链杂交，更优选其能够在中等严格性条件下杂交，甚至更优选其能够在高严格性条件下杂交。优选地，能够与SEQIDNO:1或2杂交或能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:1或2编码的多肽具有至少一种共同的酶活性。所述至少一种酶活性优选为糖苷水解酶活性，更优选为选自以下的酶活性：α-淀粉酶活性[EC3.2.1.1]、异淀粉酶活性、菊粉酶活性、转化酶活性[EC3.2.1.26]、麦芽糖酶活性[EC3.2.1.20]、异麦芽糖酶活性、支链淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、环糊精酶活性、壳聚糖酶活性、葡聚糖酶活性、蔗糖酶-异麦芽糖酶活性、α-葡糖苷酶活性、糖原脱支酶活性。

在另一实施方式中，所述酶活性为：α-葡糖基转移酶活性，酶活性优选为糖苷转移酶或糖苷合酶活性，更优选为选自以下的酶活性：糖原分支酶活性、α-1,3-葡聚糖合酶活性[EC2.4.1.183]、α-1,4-葡聚糖合酶活性、α-1,6-葡聚糖合酶活性、β-1,3-葡聚糖合酶活性、β-1,4-葡聚糖合酶活性、β-1,6-葡聚糖合酶活性、葡糖淀粉酶活性、形成麦芽五糖的淀粉酶活性、形成麦芽六糖的淀粉酶活性、α-葡糖苷酶活性、α-葡糖苷酶II活性、α-木糖苷酶活性。

如本文所使用，术语“杂交”旨在描述相互至少约60％、65％、80％、85％、90％，优选至少93％，更优选至少95％和最优选至少98％相同的多核苷酸序列通常保持与彼此的互补体杂交的杂交和洗涤条件。如本文所使用，术语“杂交”意为寡聚化合物基本互补的链的配对。一种配对机制涉及寡聚化合物链的互补核苷酸碱基(核苷酸)之间的氢键结合，其可为Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补核酸。可在不同环境下发生杂交。“严格性杂交”或“在低严格性、中等严格性、高严格性或极高严格性条件下杂交”在本文中用于描述杂交和洗涤条件，更特别地为寡聚化合物将与其靶序列杂交但与最少量的其他序列杂交的条件。所以，寡聚化合物将与靶序列杂交的程度比与其他序列的可检测到的更高。在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6:3.6中可找到进行杂交反应的指导。

技术人员将知道哪些条件适于低、中等和高严格性杂交条件。关于这种条件的其他指导在本领域中易于得到，例如在Sambrook等，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.；和Ausubel等人(编辑),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。

严格性条件依赖序列并且在不同环境下将会不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。通常，将严格性条件选为在规定离子强度和pH下，比寡聚化合物的热熔点(T_m)低约5℃。T_m为50％寡聚化合物与完美匹配探针杂交的温度(在规定离子强度和pH下)。也可添加去稳定剂例如甲酰胺获得严格性条件。

特异性杂交条件的实例如下：1)低严格性杂交条件，在约45℃的6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，接着在至少50℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严格性条件，洗涤温度可增加到55℃)；2)中等严格性杂交条件，在约45℃的6×SSC中，接着在60℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或更多次；3)高严格性杂交条件，在约45℃的6×SSC中，接着在65℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或更多次；和4)极高严格性杂交条件为65℃的0.5M磷酸钠、7％SDS，接着在65℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或更多次。

在本发明的上下文中，当在相同条件下分析时宿主细胞优选在其基因组中包含如与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比导致如本文所定义的多肽生成减少或不生成的修饰和/或在相同条件下分析时包含如与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比生成(酶)活性降低或没有活性(本文已经定义了所述活性)的源自如本文所述的多肽的多肽的修饰时，突变微生物宿主细胞在如本文所定义的多肽的生成上缺陷。因此如本文所定义的突变微生物宿主细胞在以下情况下在如本文所述的多肽的生成上缺陷：

a)如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，生成较少如本文所定义的多肽或其不生成如本文所定义的多肽时；和/或

b)在相同条件下分析时，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比，生成活性降低或没有活性的源自如本文所定义的多肽的多肽时。

在一个实施方式中，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞生成少1％的如本文所定义的多肽，至少少5％、至少少10％、至少少20％、至少少30％、至少少40％、至少少50％、至少少60％、至少少70％、至少少80％、至少少90％、至少少91％、至少少92％、至少少93％、至少少94％、至少少95％、至少少96％、至少少97％、至少少98％、至少少99％或至少少99.9％。优选地，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞基本不生成如本文所定义的多肽。

在一个实施方式中，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞生成如本文所定义的(酶)活性低1％，活性至少低5％、活性至少低10％、活性至少低20％、活性至少低30％、活性至少低40％、活性至少低50％、活性至少低60％、活性至少低70％、活性至少低80％、活性至少低90％、活性至少低91％、活性至少低92％、活性至少低93％、活性至少低94％、活性至少低95％、活性至少低96％、活性至少低97％、活性至少低98％、活性至少低99％或活性至少低99.9％的源自如本文所定义的多肽的多肽。优选地，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下分析，所述突变微生物宿主细胞生成基本没有活性的源自如本文所定义的多肽的多肽。

所述酶活性优选为糖苷水解酶活性，更优选为选自以下的酶活性：α-淀粉酶活性[EC3.2.1.1]、异淀粉酶活性、菊粉酶活性、转化酶活性[EC3.2.1.26]、麦芽糖酶活性[EC3.2.1.20]、异麦芽糖酶活性、支链淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、环糊精酶活性、壳聚糖酶活性、葡聚糖酶活性、蔗糖酶-异麦芽糖酶活性、α-葡糖苷酶活性、糖原脱支酶活性。

在另一实施方式中，所述酶活性为：α-葡糖基转移酶活性，酶活性优选为糖苷转移酶或糖苷合酶活性，更优选为选自以下的酶活性：糖原分支酶活性、α-1,3-葡聚糖合酶活性[EC2.4.1.183]、α-1,4-葡聚糖合酶活性、α-1,6-葡聚糖合酶活性、β-1,3-葡聚糖合酶活性、β-1,4-葡聚糖合酶活性、β-1,6-葡聚糖合酶活性、葡糖淀粉酶活性、形成麦芽五糖的淀粉酶活性、形成麦芽六糖的淀粉酶活性、α-葡糖苷酶活性、α-葡糖苷酶II活性、α-木糖苷酶活性。

可通过以下测量根据本发明所述的突变微生物宿主细胞在如本文所定义的多肽生成上的缺陷：测定如果与未被修饰的亲本宿主细胞相比在其基因组中被修饰的微生物宿主细胞生成的具有如本文所定义的酶活性的多肽的量和/或(比)活性，和/或测定由编码本文所述多肽的多核苷酸转录的mRNA的量，和/或基因或基因组测序。

可通过比较突变微生物宿主细胞的DNA序列与亲本(未被修饰)微生物宿主细胞的序列来测定基因组中的修饰。可使用本领域中技术人员已知的标准方法，例如使用Sanger测序技术和/或新一代测序技术例如IlluminaGA2,Roche454等，进行DNA测序和基因组测序，如ElaineR.Mardis(2008),Next-GenerationDNASequencingMethods,AnnualReviewofGenomicsandHumanGenetics,9:387-402.(doi:10.1146/annurev.genom.9.081307.164359)中所综述的。

可使用技术人员可用的适合测量如本文所定义的多肽酶活性的任何测定法，转录谱分析、Northern印迹RT-PCR、Q-PCR和Western印迹法来测量在如本文所述多肽生成上的缺陷。特别地，例如可通过northern印迹法实现量化细胞中存在的mRNA的量(在MolecularCloning:ALaboratoryManual中，Sambrook等，NewYork:ColdSpringHarbourPress,1989)。例如可通过western印迹法实现量化细胞中存在的如本文所述的多肽的量。还可通过DNA阵列分析量化mRNA量上的差异(Eisen,M.B.和Brown，P.O.DNAarraysforanalysisofgeneexpression.MethodsEnzymol.1999,303:179-205)。

优选在基因组中的修饰被理解为一种或更多种修饰。

优选在基因组中的修饰可通过以下任一种实现：

a)使亲本微生物宿主细胞经受重组基因操作技术；和/或

b)使亲本微生物宿主细胞经受(传统)诱变；和/或

c)使亲本微生物宿主细胞经受抑制性化合物或组合物。

本文将(突变)微生物宿主细胞基因组的修饰定义为导致细胞基因组中多核苷酸序列变化的任何事件。在一个优选实施方式中，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞优选在其基因组中具有修饰，其包括：

a)在相同条件下分析时，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比导致如本文所定义的多肽生成减少或不生成的修饰，和/或

b)在相同条件下分析时，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比生成(酶)活性降低或没有(酶)活性的源自如本文所定义的多肽的多肽的修饰。

可通过传统菌株改良、随机诱变然后选择引入修饰。也可通过定点诱变引入修饰。

修饰可通过引入(插入)、替换(置换)或去除(缺失)多核苷酸序列中的一个或更多个核苷酸完成。可实现编码如本文所定义的多肽的多核苷酸的完全或部分缺失。在替代方案中，编码如本文所定义的多肽的多核苷酸可用不编码如本文所定义的多肽或编码如本文所定义多肽的部分或完全失活形式的多核苷酸序列部分或完全置换。在另一替代方案中，可将一个或更多个核苷酸插入编码如本文所定义的多肽的多核苷酸中，从而导致所述多核苷酸破坏并且由破坏多核苷酸编码的如本文所定义的多肽随之而来的部分或完全失活。

在一个实施方式中，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞在其基因组中包含选自以下的修饰：

a)如本文所定义的多核苷酸完全或部分缺失；

b)如本文所定义的多核苷酸被不编码如本文所定义的多肽或编码本文所定义多肽的部分或完全失活形式的多核苷酸置换；

c)通过在多核苷酸序列中插入一个或更多个核苷酸以及由经破坏多核苷酸编码的如本文所定义的多肽随之而来的部分或完全失活来破坏本文所定义的多核苷酸。

这种修饰可例如在编码序列或转录或翻译如上所述多核苷酸所需的调控元件中。例如，可插入或去除核苷酸，以便导致终止密码子引入、起始密码子去除或编码序列的开放阅读框变化或移码。编码序列或其调控元件的修饰可通过定点或随机诱变、DNA改组法、DNA重新组装法、基因合成(见例如Young和Dong，(2004),NucleicAcidsResearch32,(7)electronicaccesshttp://nar.oupjournals.org/cgi/reprint/32/7/e59或Gupta等(1968),Proc.Natl.Acad.SciUSA,60:1338-1344；Scarpulla等(1982),Anal.Biochem.121:356-365；Stemmer等(1995),Gene164:49-53)或PCR产生的诱变根据本领域中已知的方法实现。随机诱变程序的实例在本领域中众所周知，例如化学(例如NTG)诱变或物理(例如UV)诱变。定点诱变程序的实例为QuickChange^TM定点诱变试剂盒(StratageneCloningSystems,LaJolla,CA)、‘TheAlteredII体外诱变系统’(PromegaCorporation)或通过使用如Gene.1989年4月15日；77(1):51-9.(HoSN,HuntHD,HortonRM,PullenJK,PeaseLR“Site-directedmutagenesisbyoverlapextensionusingthepolymerasechainreaction”)描述的PCR或使用如MolecularBiology:CurrentInnovationsandFutureTrends.(编者A.M.Griffin和H.G.Griffin.ISBN1-898486-01-8；1995,POBox1,Wymondham,Norfolk,U.K.)描述的PCR的重叠延伸。

优选的修饰方法基于重组遗传操作技术例如部分或完全基因置换或部分或完全基因缺失。

例如，在置换多核苷酸、核酸构建体或表达盒的情况下，可在要置换的靶基因座引入适当DNA序列。适当DNA序列优选存在于克隆载体上。优选的整合性克隆载体包含与多核苷酸同源和/或与要置换的基因座侧翼的多核苷酸有同源性以用于向这个预定基因座靶向整合克隆载体的DNA片段。为了促进靶向整合，优选在转化细胞之前，使克隆载体线性化。优选地，进行线性化以使克隆载体的至少一端，但是优选两端侧翼为与要置换的DNA序列(或侧翼序列)同源的序列。这个过程称为同源重组并且这种技术也可用于实现(部分)基因缺失。

例如，与内源性多核苷酸对应的多核苷酸可由缺陷多核苷酸置换，所述缺陷多核苷酸是不能生成(全功能性)多肽的多核苷酸。通过同源重组，缺陷多核苷酸置换了内源性多核苷酸。可期望的是，缺陷多核苷酸也编码可用于选择其中核酸序列已经被修饰的转化体的标记。

替代性的或与提到的其他技术相结合，可使用基于粘粒在大肠杆菌(E.coli)中体内重组的技术，如ArapidmethodforefficientgenereplacementinthefilamentousfungusAspergillusnidulans(2000)Chaveroche,M-K.,Ghico,J-M.和d’EnfertC；NucleicacidsResearch,第28卷，no.22中所述。

可替代地，可通过已建立的反义技术，使用与多核苷酸的核酸序列互补的核苷酸序列进行修饰，其中所述宿主细胞生成较少或不生成蛋白质，例如本文所定义的和由本文所述多核苷酸编码的多肽。更特别地，可通过引入与多核苷酸的核酸序列互补、可在细胞中转录并且能够与细胞中生成的mRNA杂交的核苷酸序列来减少或消除宿主细胞中多核苷酸的表达。在允许互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译的蛋白质的量由此被减少或消除。在Appl.Environ.Microbiol.2000年2月；66(2):775-82中示出了表达反义RNA的实例。(Characterizationofafoldase,proteindisulfideisomeraseA,intheproteinsecretorypathwayofAspergillusniger.NgiamC,JeenesDJ,PuntPJ,VanDenHondelCA,ArcherDB)或(ZrennerR,WillmitzerL,SonnewaldU.Analysisoftheexpressionofpotatouridinediphosphate-glucosepyrophosphorylaseanditsinhibitionbyantisenseRNA.Planta.(1993)；190(2):247-52.)。

在一个实施方式中，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞是这样的突变微生物宿主细胞，其中如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量导致如本文所定义的多肽生成减少或不生成的修饰是由于编码所述多肽的mRNA生成减少。

可经由RNA干扰(RNAi)技术(FEMSMicrob.Lett.237(2004):317-324)获得导致由编码本文所述多肽的多核苷酸转录的mRNA量减少的修饰。在这种方法中，表达将受影响的核苷酸序列的相同有义和反义部分克隆在对方后面且之间有核苷酸间隔物，并且被插入表达载体中。这种分子经转录后，小核苷酸片段的形成将导致将受到影响mRNA的靶向降解。特定mRNA的消除可达到不同程度。WO2008/053019、WO2005/05672A1、WO2005/026356A1，Oliveira等，“EfficientcloningsystemforconstructionofgenesilencingvectorsinAspergillusniger”(2008)Appl.Microbiol.和Biotechnol.80(5):917-924和/或Barnes等人，“siRNAasamoleculartoolforuseinAspergillusniger”(2008)BiotechnologyLetters30(5):885-890中描述的RNA干扰技术可用于这一目的。

可通过不同方法，例如用针对这种多肽的抗体或化学抑制剂或蛋白抑制剂或物理抑制剂(TourO.等人，(2003)Nat.Biotech:Geneticallytargetedchromophore-assistedlightinactivation.第21卷no.12:1505-1508)或肽抑制剂或反义分子或RNAi分子(R.S.Kamath_等人，(2003)Nature:SystematicfunctionalanalysisoftheCaenorhabditiselegansgenomeusingRNAi.第421卷，231-237)获得产生如本文所定义的酶活性降低或没有酶活性的多肽的修饰。

除了以上提到的技术或作为替代方案，也可借助于替代性信号序列(RamondeLucas,J.、MartinezO、PerezP.、IsabelLopez,M.、Valenciano,S.和Laborda,F.TheAspergillusnidulanscarnitinecarrierencodedbytheacuHgeneisexclusivelylocatedinthemitochondria.FEMSMicrobiolLett.2001年6月24日；201(2):193-8.)或滞留信号(Derkx,P.M.和Madrid,S.M.ThefoldaseCYPBisacomponentofthesecretorypathwayofAspergillusnigerandcontainstheendoplasmicreticulumretentionsignalHEELMol.Genet.Genomics.2001年12月；266(4):537-545.)，或通过使多肽靶向能够与参与细胞分泌途径的细胞的膜结构融合的过氧化物酶体从而导致多肽分泌到细胞外(例如WO2006/040340中所述)来抑制如本文所定义的多肽的活性，或使如本文所定义的多肽重新定位。

可替代地或与以上提到的技术相结合，也可例如通过紫外或化学诱变(Mattern,I.E.、vanNoortJ.M.、vandenBerg,P.、Archer,D.B.、Roberts,I.N.和vandenHondel,C.A.，IsolationandcharacterizationofmutantsofAspergillusnigerdeficientinextracellularproteases.MolGenGenet.1992年8月；234(2):332-6.)或通过使用抑制本文所述多肽的酶活性的抑制剂(例如野尻霉素，其起到β-葡糖苷酶抑制剂的作用(CarrelF.L.Y.和CanevasciniG.CanadianJournalofMicrobiology(1991)37(6):459-464；ReeseE.T.、ParrishF.W.和EttlingerM.CarbohydrateResearch(1971)381-388))获得对如本文所定义的多肽酶活性的抑制。

在根据本发明所述的一个实施方式中，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞基因组中的修饰是在如以上所定义的编码如以上所定义的多肽的多核苷酸的至少一个位置中的修饰。

在本发明的上下文中，“亲本微生物宿主细胞”和“突变微生物宿主细胞”可为任何类型的宿主细胞。下文描述了突变微生物宿主细胞的一个具体实施方式。对于本领域的技术人员而言明显的是，除非另外说明，可适用于突变微生物宿主细胞的实施方式也可适用于亲本微生物宿主细胞。

根据本发明所述的突变微生物宿主细胞可为原核细胞。优选地，原核细胞为细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物。适合的细菌可选自例如埃希氏菌(Escherichia)、鱼腥藻(Anabaena)、柄杆菌(Caulobactert)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、红杆菌(Rhodobacter)、假单胞菌(Pseudomonas)、副球菌(Paracoccus)、芽孢杆菌(Bacillus)、短杆菌(Brevibacterium)、棒状杆菌(Corynebacterium)、根瘤菌(Rhizobium)(中华根瘤菌(Sinorhizobium))、产黄菌(Flavobacterium)、克雷白杆菌(Klebsiella)、肠杆菌(Enterobacter)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、甲基杆菌(Methylobacterium)、葡萄球菌(Staphylococcus)或链霉菌(Streptomyces)。优选地，所述细菌细胞选自：枯草杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣型芽胞杆菌(B.licheniformis)、B.puntis、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽胞杆菌(B.pumilus)、氧化葡糖杆菌(G.oxydans)、新月柄杆菌CB15(CaulobactertcrescentusCB15)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummelioti)和放射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)。

根据一个实施方式，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞为真核细胞。优选地，真核细胞为哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类细胞。优选的哺乳动物细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、293细胞、PerC6细胞和杂交瘤。优选的昆虫细胞包括例如Sf9和Sf21细胞及其衍生物。更优选地，真核细胞为真菌细胞，即酵母细胞，例如念珠菌(Candida)、汉森酵母(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母(Yarrowia)菌株。更优选地，来自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或丝状真菌细胞。最优选地，真核细胞为丝状真菌细胞。

丝状真菌包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人，在AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi，1995年第8版，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义)。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖构成的菌丝体壁。通过菌丝伸长而营养生长并且碳分解代谢专性好氧。丝状真菌菌株包括但不限于支顶孢菌(Acremonium)、伞菌(Agaricus)、曲霉菌(Aspergillus)、短梗霉菌(Aureobasidium)、金孢菌(Chrysosporium)、鬼伞菌(Coprinus)、隐球菌(Cryptococcus)、线黑粉酵母(Filibasidium)、镰孢菌(Fusarium)、腐质霉(Humicola)、稻瘟菌(Magnaporthe)、毛霉菌(Mucor)、毁丝霉菌(Myceliophthora)、新美鞭菌(Neocallimastix)、脉孢菌(Neurospora)、拟青霉菌(Paecilomyces)、青霉菌(Penicillium)、梨囊鞭菌(Piromyces)、原毛平革菌(Panerochaete)、侧耳菌(Pleurotus)、裂褶菌(Schizophyllum)、篮状菌(Talaromyces)、Rasamsonia、嗜热子囊菌(Thermoascus)、梭孢壳菌(Thielavia)、弯颈霉菌(Tolypocladium)和木霉菌(Trichoderma)菌株。

优选的丝状真菌细胞属于支顶孢菌属、曲霉菌属、金孢菌属、毁丝霉菌属、青霉菌属、篮状菌属、Rasamsonia属、梭孢壳菌属、镰孢菌属或木霉菌属的物种，并且最优选黑曲霉、阿拉巴门支顶孢菌(Acremoniumalabamense)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)、Rasamsoniaemersonii、米曲霉(Aspergillusoryzae)、勒克瑙金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)、里氏木霉(Trichodermareesei)、土生梭孢壳菌(Thielaviaterrestris)或产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)的物种。更优选的宿主细胞属于曲霉菌属，更优选的宿主细胞属于黑曲霉物种。当根据本发明所述的宿主细胞为黑曲霉宿主细胞时，宿主细胞优选为CBS513.88、CBS124.903或其衍生物。

在许多培养物保藏机构，例如美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSM)、荷兰微生物菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)、美国农业研究专利菌种保藏北区研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter，NRRL)和俄罗斯莫斯科的俄罗斯科学院全俄微生物菌种保藏中心(All-RussianCollectionofMicroorganismsofRussianAcademyofSciences，俄语缩写VKM，英语缩写RCM)，几种丝状真菌菌株易于为公众所用。本发明上下文中的可用菌株可为黑曲霉CBS513.88、CBS124.903、米曲霉ATCC20423、IFO4177、ATCC1011、CBS205.89、ATCC9576、ATCC14488-14491、ATCC11601、ATCC12892、产黄青霉CBS455.95、产黄青霉Wisconsin54-1255(ATCC28089)、橘青霉(Penicilliumcitrinum)ATCC38065、产黄青霉P2、土生梭孢壳菌NRRL8126、埃默森篮状菌CBS124.902、产黄头孢霉(Acremoniumchrysogenum)ATCC36225或ATCC48272、里氏木霉ATCC26921或ATCC56765或ATCC26921、酱油曲霉ATCC11906、嗜热毁丝菌C1、Garg27K、VKM-F3500D、勒克瑙金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)C1、Garg27K、VKM-F3500D、ATCC44006及其衍生物。

根据本发明的一个实施方式，当根据本发明所述的突变微生物宿主细胞为丝状真菌宿主细胞时，突变微生物宿主细胞可进一步在其基因组中包含一个或更多个修饰，从而使得如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，突变微生物宿主细胞在选自以下的至少一种产物的生成上缺陷：葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素(优选赭曲霉素(ochratoxin)和/或伏马菌素(fumonisin))、蛋白酶转录调节子prtT、PepA、基因hdfA和/或hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE。

草酸水解酶(oahA)是许多宿主细胞中草酸合成途径的组分。oahA缺陷的宿主细胞将草酸缺陷。草酸在许多应用例如食品应用中是不需要的副产物。此外，草酸降低了生成这种组分的宿主细胞的培养基培养的pH，导致产率降低；即草酸缺陷的宿主细胞产率升高。因此，如果根据本发明所述的微生物宿主细胞oahA缺陷是有利的。oahA缺陷宿主细胞和产生所述宿主细胞的优选方法在WO2000/50576和WO2004/070022中有大量描述。产生oahA缺陷宿主细胞的一个优选方法为WO2000/50576中描述的破坏重组方法。优选地，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞oahA缺陷。优选地，oahA为真菌oahA。更优选地，oahA为来自曲霉菌的oahA。甚至更优选，oahA为来自黑曲霉的oahA。甚至更优选，oahA为来自黑曲霉CBS513.88的oahA。最优选地，oahA包含An10g00820的序列。

prtT为真核细胞中蛋白酶的转录激活子。最近在WO00/20596、WO01/68864、WO2006/040312和WO2007/062936中已经描述了蛋白酶的几种真菌转录激活子。这些转录激活子分离自黑曲霉(A.niger)、烟曲霉(A.fumigatus)、产黄青霉(P.chrysogenum)和米曲霉(A.oryzae)。蛋白酶基因的这些转录激活子可用于改进在真菌细胞中生成多肽的方法，其中所述多肽对蛋白酶降解敏感。当根据本发明所述的微生物宿主细胞prtT缺陷时，宿主细胞将产生较少受prtT转录控制的蛋白酶。因此当根据本发明所述的宿主细胞prtT缺陷时有利。prtT缺陷宿主和产生这些宿主的优选方法在WO01/68864、WO2006/040312中有大量描述。WO01/68864和WO2006/040312描述了破坏prtT编码序列的重组和传统方法。WO2007/062936描述了蛋白酶启动子中prtT结合位点的破坏。结合位点的破坏阻碍了prtT与结合位点的结合。因此，蛋白酶的转录未经prtT激活并且生成较少蛋白酶。

优选地，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞包含编码prtT的多核苷酸，所述多核苷酸包含修饰，其中当在可比较条件下培养时，与来源的亲本细胞相比，所述宿主细胞在prtT的生成上缺陷。优选地，prtT为真菌prtT。更优选地，prtT为来自曲霉菌的prtT。甚至更优选，prtT为来自黑曲霉的prtT。甚至更优选，prtT为来自黑曲霉CBS513.88的prtT。最优选地，prtT包含An04g06940的序列。

术语“葡糖淀粉酶”(glaA)与术语“淀粉葡萄糖苷酶”相同并且在本文中定义为具有糊精6-α-D-葡聚糖水解酶活性的酶，其催化在1,4-连接的α-D-葡萄糖残基和末端1,4-连接的α-D-葡萄糖残基链中分支点处1,6-α-D-葡糖苷键的内水解。可通过测定对硝基苯酚(paranitrofenol)从底物对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷的释放(Sigma)，按AGIU/ml测量葡糖淀粉酶活性。这样产生黄色，可使用分光光度计在405nm下测量其吸光度。1AGIU是在pH4.3和60℃下，每分钟由可溶性淀粉底物生成1μmol葡萄糖的酶量。在WO98/46772中可找到所述测定法的更多详情。

优选地，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞包含编码glaA的多核苷酸，所述多核苷酸包含修饰，其中当在可比较条件下培养时，与来源的亲本细胞相比，所述宿主细胞在glaA的生成上缺陷。优选地，glaA为真菌glaA。更优选地，glaA为来自曲霉菌的glaA。甚至更优选，glaA为来自黑曲霉的glaA。甚至更优选，glaA为来自黑曲霉CBS513.88的glaA。最优选地，glaA包含An03g06550的序列。

本文将术语“α-淀粉酶”定义为在水的存在下，催化具有三个或更多个α-1,4-连接的葡萄糖单元的多糖内水解为麦芽-寡糖的1,4-α-D-葡聚糖的葡聚糖水解酶活性。为测定(中性)α-淀粉酶活性，根据供应商的方法使用Megazyme谷类α-淀粉酶试剂盒(Megazyme,CERALPHAα淀粉酶测定试剂盒，目录参考号K-CERA，2000-2001年)。测量的活性基于在过量葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的存在下，在pH为7.0时，非还原封端对硝基苯麦芽庚糖苷的水解。形成的对硝基苯酚的量是对样品中存在的α-淀粉酶活性的度量。

本文将术语“酸稳定性α-淀粉酶”(amyA)定义为具有α-淀粉酶活性，在酸性pH范围内活性最佳的酶。为测定酸稳定性α-淀粉酶活性，也根据供应商的方法但是在酸性pH下使用Megazyme谷类α-淀粉酶试剂盒(Megazyme,CERALPHAα淀粉酶测定试剂盒，目录参考号K-CERA，2000-2001年)。测量的活性基于在过量葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的存在下，在4.5的pH下，非还原封端对硝基苯麦芽庚糖苷的水解。形成的对硝基苯酚的量是对样品中存在的酸稳定性α-淀粉酶活性的度量。

优选地，根据本发明所述的宿主细胞包含编码AmyA的多核苷酸，所述多核苷酸包含修饰，其中当在可比较条件下培养时，与来源的亲本细胞相比，所述宿主细胞amyA缺陷。优选地，amyA为真菌amyA。更优选地，amyA为来自曲霉菌的amyA。甚至更优选，amyA为来自黑曲霉的amyA。甚至更优选，amyA为来自黑曲霉CBS513.88的amyA。最优选地，amyA包含An11g03340的序列。

本文将术语“中性α-淀粉酶活性”(amy)定义为具有α-淀粉酶活性，在中性pH范围内活性最佳的酶。

优选地，根据本发明所述的宿主细胞包含编码AmyB的多核苷酸，所述多核苷酸包含修饰，其中当在可比较条件下培养时，与来源的亲本细胞相比，所述宿主细胞amyBI和/或amyBII缺陷。更优选地，根据本发明所述的微生物宿主细胞amyBI和amyBII缺陷。优选地，amyB为真菌amyB。更优选地，amyB为来自曲霉菌的amyB。甚至更优选，amyB为来自黑曲霉的amyBI。甚至更优选，amyB为来自黑曲霉CBS513.88的amyBI。最优选地，amyBI包含An12g06930的序列。甚至更优选，amyB为来自黑曲霉的amyBII。甚至更优选，amyB为来自黑曲霉CBS513.88的amyBII。最优选地，amyBII包含An05g02100的序列。

本文将术语毒素相关多核苷酸定义为编码负责至少一种毒素或毒素中间化合物的生物合成或分泌的化合物或生化途径的基因簇、多个基因、基因或其部分。所述化合物可例如为可以是酶的多肽。

在目标多肽的生成中用作宿主细胞的许多宿主细胞，尤其是真菌，具有编码多种毒素生物合成所涉及的酶的基因。例如，环匹阿尼酸、曲酸、3-硝基丙酸和黄曲霉毒素是在例如黄曲霉(Aspergillusflavus)中形成的已知毒素。类似地，在许多真菌中，例如在镰孢属(例如镶片镰孢霉(Fusariumvenenatum))和木霉属中形成单端孢烯(trichothecene)并且赭曲霉素可由曲霉菌生成。最近，对工业黑曲霉宿主菌株基因组的测序揭示了伏马菌素基因簇(Pel等人，“GenomesequencingandanalysisoftheversatilecellfactoryAspergillusnigerCBS513.88”.NatBiotechnol.2007年2月；25(2):221-231)。目标化合物发酵期间这种毒素的形成非常不合需要，因为这些毒素可对操作人员、消费者和环境造成健康危害。因此，毒素缺陷的宿主细胞使得目标化合物的生成无毒。因为没有毒素必须从产物中去除，所以无毒化合物更易于生成。此外，对化合物的监管批准程序更简单。

优选地，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞包含编码化合物(其可为例如可以是酶的多肽)或生化途径的毒素相关多核苷酸，所述毒素相关多核苷酸包含修饰，其中当在可比较条件下培养时，与来源的亲本细胞相比，所述宿主细胞在所述毒素或毒素中间化合物的生成上缺陷。优选地，毒素或毒素中间化合物为真菌毒素或毒素中间化合物。更优选地，毒素或毒素中间化合物为来自曲霉菌的毒素或毒素中间化合物。甚至更优选，毒素或毒素中间化合物为来自黑曲霉的毒素或毒素中间化合物。甚至更优选，毒素或毒素中间化合物为来自黑曲霉CBS513.88的毒素或毒素中间化合物。甚至更优选，毒素或毒素中间化合物为伏马菌素或伏马菌素中间化合物。甚至更优选，毒素或毒素中间化合物为赭曲霉素或赭曲霉素中间化合物。最优选地，毒素或毒素中间化合物为赭曲霉素或伏马菌素或赭曲霉素或伏马菌素中间化合物。

优选地，毒素相关多核苷酸编码真菌毒素或毒素中间化合物的生成中所涉及的化合物(例如其可为可以是酶的多肽)或生化途径。更优选地，毒素或毒素中间化合物来自曲霉菌。甚至更优选地，毒素或毒素中间化合物来自黑曲霉。甚至更优选地，毒素或毒素中间化合物来自黑曲霉CBS513.88。甚至更优选，伏马菌素或伏马菌素中间化合物。甚至更优选，伏马菌素B或伏马菌素B中间化合物。甚至更优选，伏马菌素B2或伏马菌素B2中间化合物。甚至更优选地，毒素相关多核苷酸包含来自An01g06820至An01g06930的伏马菌素簇的序列。最优选地，毒素相关多核苷酸包含An01g06930的序列。

在另一优选实施方式中，毒素相关多核苷酸编码赭曲霉素或赭曲霉素中间化合物中所涉及的化合物(例如其可为可以是酶的多肽)或生化途径。更优选，赭曲霉素A或赭曲霉素A中间化合物。更优选地，毒素相关多核苷酸包含来自An15g07880至An15g07930的簇的序列。最优选地，毒素相关多核苷酸包含An15g07910的序列和/或An15g07920的序列。

优选地，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞包含至少一种编码化合物(例如其可为可以是酶的多肽)或生化途径的毒素相关多核苷酸，所述毒素相关多核苷酸包含至少一个修饰，其中当在可比较条件下培养时，与来源的亲本细胞相比，所述宿主细胞在毒素或毒素中间化合物的生成上缺陷。

更优选地，根据本发明所述的宿主细胞包含两种毒素相关多核苷酸，所述两种毒素相关多核苷酸各包含至少一个修饰，其中当在可比较条件下培养时，与来源的亲本细胞相比，所述宿主细胞优选在伏马菌素和赭曲霉素的生成上缺陷。

甚至更优选，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞包含三种或更多种毒素相关多核苷酸，所述三种或更多种毒素相关多核苷酸各包含至少一个修饰，其中当在可比较条件下培养时，与来源的亲本细胞相比，所述宿主细胞优选在伏马菌素、赭曲霉素和至少一种另外的毒素或毒素中间化合物的生成上缺陷。

因此，当根据本发明所述的突变微生物宿主细胞为丝状真菌宿主细胞时，所述宿主细胞可以在其基因组中包含一个或更多个修饰，以导致主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA生成上的缺陷。例如，根据本发明所述的宿主细胞可进一步包含编码主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因的破坏。更优选地，pepA为来自曲霉菌的pepA。甚至更优选，pepA为来自黑曲霉的pepA。甚至更优选，pepA为来自黑曲霉CBS513.88的pepA。最优选，pepA包含An14g04710的序列。

优选地，通过使细胞在NHR(非同源重组)组分上缺陷来提高多核苷酸靶向整合到根据本发明所述的突变微生物宿主细胞基因组中预定位点的效率。优选地，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞包含编码含修饰的NHR组分的多核苷酸，其中当在相同条件下培养时，与来源的亲本细胞相比，所述宿主细胞在所述NHR组分的生成上缺陷。

待修饰的NHR组分可为本领域中技术人员已知的任何NHR组分。优选的待修饰NHR组分选自酵母KU70、KU80、MRE11、RAD50、RAD51、RAD52、XRS2、SIR4、LIG4的丝状真菌同源物的组。更优选的待修饰NHR组分为酵母KU70和KU80的丝状真菌同源物，优选hdfA(酵母KU70的同源物)或其同源物和hdfB(酵母KU80的同源物)或其同源物。最优选的待修饰NHR组分为KU70或hdfA或其同源物。另一优选的待修饰NHR组分为KU80或hdfB或其同源物。获得这种缺陷NHR中所涉组分的宿主细胞的方法为技术人员已知并且在WO2005/095624中有大量描述。优选地，hdfA基因为来自黑曲霉的hdfA基因，更优选为来自黑曲霉的根据WO2005/095624的SEQIDNO:1的hdfA。在另一优选实施方式中，hdfB基因为来自黑曲霉的hdfB基因，更优选为来自黑曲霉的根据WO2005/095624的SEQIDNO:4的hdfB。

因此当根据本发明所述的突变微生物宿主细胞为丝状真菌宿主细胞时，根据本发明所述的宿主细胞可另外在其基因组中包含一个或更多个修饰，以导致hdfA基因(如WO2005/095624的SEQIDNO:3所示)和/或hdfB基因(如WO2005/095624的SEQIDNO:6所示)编码的产物生成上的缺陷。例如，根据本发明所述的宿主细胞可进一步包含hdfA和/或hdfB基因的破坏。在WO2005/095624中已经描述了缺陷hdfA和/或hdfB基因编码的产物的丝状真菌宿主细胞。

当根据本发明所述的突变微生物宿主细胞为丝状真菌宿主细胞时，根据本发明所述的宿主细胞可另外在其基因组中包含导致非核糖体肽合酶npsE生成缺陷的修饰。在WO2012/001169中已经描述了非核糖体肽合酶npsE生成缺陷的这种宿主细胞(npsE具有WO2012/001169的SEQIDNO:35中所示的基因组序列，SEQIDNO:36中所示的编码序列，SEQIDNO:37中所示的mRNA和SEQIDNO:38中所示的nrps蛋白质)。

根据本发明所述的突变微生物宿主细胞可在其基因组中另外包含导致在α-淀粉酶amyC生成上缺陷的修饰。在2013年7月19日提交的，标题为“淀粉酶缺陷菌株”的共同待决的国际专利申请中描述了在α-淀粉酶amyC生成上缺陷的这种宿主细胞，并且所述申请要求全部于2012年7月19日提交的EP12177173.7、US61/673589、EP12177171.1和US61/673607的优先权。amyC具有如在该共同待决的国际专利申请的SEQIDNO:1或5中所示的基因组序列和SEQIDNO:2或6所示的编码序列及如SEQIDNO:3或7中所示的AmyC蛋白质，SEQIDNO:4和8中示出了成熟AmyC蛋白质。共同待决的申请的SEQIDNO:1和5与本文的SEQIDNO:13相对应。共同待决的申请的SEQIDNO:2和6分别与本文的SEQIDNO:14和17相对应。共同待决的申请的SEQIDNO:3和7分别与本文的SEQIDNO:15和18相对应。共同待决的申请的SEQIDNO:4和8分别与本文的SEQIDNO:16和19相对应。

如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，选自葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素(优选赭曲霉素和/或伏马菌素)、蛋白酶转录调节子prtT、PepA、基因hdfA和/或hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE、淀粉酶amyC的至少一种产物生成上的缺陷可以已经在根据本发明所述的突变微生物宿主细胞所来源的亲本宿主细胞中存在。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素(优选赭曲霉素和/或伏马菌素)、蛋白酶转录调节子prtT、PepA、基因hdfA和/或hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE、淀粉酶amyC。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA、PepA和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素(优选赭曲霉素和/或伏马菌素)、蛋白酶转录调节子prtT、基因hdfA和/或hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE、淀粉酶amyC。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA、PepA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素(优选赭曲霉素和/或伏马菌素)、蛋白酶转录调节子prtT、基因hdfA和/或hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE、淀粉酶amyC。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA、PepA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：中性α-淀粉酶amyBII、草酸水解酶(oahA)、毒素(优选赭曲霉素和/或伏马菌素)、蛋白酶转录调节子prtT、基因hdfA和/或hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE、淀粉酶amyC。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA、PepA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：草酸水解酶(oahA)、毒素(优选赭曲霉素和/或伏马菌素)、蛋白酶转录调节子prtT、基因hdfA和/或hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE、淀粉酶amyC。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA、PepA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII、基因hdfA编码的产物和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：草酸水解酶(oahA)、毒素(优选赭曲霉素和/或伏马菌素)、蛋白酶转录调节子prtT、基因hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE、淀粉酶amyC。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA、PepA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII、基因hdfA编码的产物、草酸水解酶(oahA)和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：毒素(优选赭曲霉素和/或伏马菌素)、蛋白酶转录调节子prtT、基因hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE、淀粉酶amyC。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA、PepA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII、基因hdfA编码的产物、草酸水解酶(oahA)、赭曲霉素、伏马菌素和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：蛋白酶转录调节子prtT、基因hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE、淀粉酶amyC。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA、PepA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII、基因hdfA编码的产物、草酸水解酶(oahA)、赭曲霉素、伏马菌素、蛋白酶转录调节子prtT和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：基因hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE、淀粉酶amyC。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA、PepA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII、基因hdfA编码的产物、草酸水解酶(oahA)、赭曲霉素、伏马菌素、蛋白酶转录调节子prtT、非核糖体肽合酶npsE和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：基因hdfB编码的产物、淀粉酶amyC。

在一个实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步包含glaA、PepA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII、基因hdfA编码的产物、草酸水解酶(oahA)、赭曲霉素、伏马菌素、蛋白酶转录调节子prtT、淀粉酶amyC和任选至少另一种选自以下的产物生成上的缺陷：基因hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE。

在一个更加优选的实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步具有更低的淀粉酶背景并且包含glaA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII生成上的缺陷。这种突变微生物细胞可以还包含KU70或KU80的丝状真菌同源物生成上的缺陷。这种突变微生物细胞可以还包含毒素生成上的缺陷。这种突变微生物细胞可以还包含KU70或KU80的丝状真菌同源物生成上的缺陷和毒素生成上的缺陷。

在一个甚至更加优选的实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞具有更低的淀粉酶背景并且进一步包含glaA、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI、amyBII和amyC生成上的缺陷。这种突变微生物细胞也可包含KU70或KU80的丝状真菌同源物。这种突变微生物细胞还可包含毒素生成上的缺陷。这种突变微生物细胞可以还包含KU70或KU80的丝状真菌同源物生成上的缺陷和毒素生成上的缺陷。

在一个最优选的实施方式中，如果与亲本宿主细胞相比并且在相同条件下测量，根据本发明所述的突变微生物细胞进一步具有更低的α-淀粉酶背景并且包含酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII和任选amyC生成上的缺陷。这种突变微生物细胞也可以包含KU70或KU80的丝状真菌同源物。这种突变微生物细胞可以还包含毒素生成上的缺陷。这种突变微生物细胞可还包含KU70或KU80的丝状真菌同源物生成上的缺陷和毒素生成上的缺陷。

当根据本发明所述的突变微生物宿主细胞为丝状真菌宿主细胞时，所述宿主细胞可以另外包含至少两个基本同源的DNA结构域，其适于整合编码目标化合物的多核苷酸的一个或更多个拷贝，其中改造所述至少两个基本同源DNA结构域中的至少一个以与其来源的基本同源DNA结构域相比，对编码目标化合物的多核苷酸具有更强的整合偏好，并且其中改造的基本同源DNA结构域所来源的基本同源DNA结构域的基因转换频率比所述至少两个基本同源DNA结构域中的另一个高至少10％。在WO2011/009700中已经描述了这些细胞。下文也将含有这些基本同源DNA结构域的两个或更多个拷贝的菌株称为含两个或更多个扩增子的菌株。例如，在vanDijck等，2003,RegulatoryToxicologyandPharmacology28；27-35:OnthesafetyofanewgenerationofDSMAspergillusnigerenzymeproductionstrains中描述了包含这种扩增子的宿主细胞的实例。在vanDijck等中，描述了包含7个扩增葡糖淀粉酶基因座，即7个扩增子的黑曲霉菌株。该上下文中优选的宿主细胞为丝状真菌宿主细胞，优选黑曲霉宿主细胞，其包含两个或更多个扩增子，优选两个或更多个ΔglaA扩增子(优选包含3、4、5、6、7个ΔglaA扩增子)，其中已经改造具有最高基因转换频率的扩增子以与其来源的扩增子相比，对编码目标化合物的多核苷酸具有更高的整合偏好。扩增子的改造可根据WO2011/009700(其以引用的方式全部并入此处)中描述的任一种方法进行。WO2011/009700中描述的这些宿主细胞的实例为包含3个ΔglaA扩增子——BamHI截短扩增子、SalI截短扩增子和BglII截短扩增子——的宿主细胞并且其中已经改造BamHI扩增子以与其来源的BamHI扩增子相比，对编码目标化合物的多核苷酸具有更高的整合偏好。下文将包含两个或更多个扩增子并且其中已经改造一个扩增子以与其来源的扩增子相比对编码目标化合物的多核苷酸具有更高的整合偏好的宿主细胞称为包含经改造扩增子的宿主细胞。

当根据本发明所述的突变微生物宿主细胞为丝状真菌宿主细胞时，根据本发明所述的宿主细胞可另外包含Sec61的修饰。优选的SEC61修饰是产生SEC61单向突变体的修饰，即其中从头合成的蛋白质可经由SEC61进入ER，但是蛋白质不能经由SEC61离开ER的突变体。这种修饰在WO2005/123763中有大量描述。在一个优选实施方式中，突变微生物宿主细胞包含如WO2005/123763的SEQIDNO:3中所示的Sec61中的修饰。最优选地，SEC61修饰是其中在WO2005/123763的SEQIDNO:3中，丝氨酸376经色氨酸置换的S376W突变。

在一个优选实施方式中，根据本发明所述的突变微生物宿主细胞包含编码目标化合物的至少一个多核苷酸或编码在细胞生成目标化合物中所涉及的化合物的至少一个多核苷酸。

目标化合物可为任何生物化合物。生物化合物可为生物质或生物聚合物或代谢产物。生物化合物可由构成生物合成或代谢途径的单个多核苷酸或一系列多核苷酸编码或可为单个多核苷酸的产物或一系列多核苷酸的产物的直接结果。生物化合物可以对宿主细胞是天然的或异源的。

本文将术语“异源生物化合物”定义为对细胞并非天然的生物化合物；或其中已经进行结构修饰以改变天然生物化合物的天然生物化合物。

本文将术语“生物聚合物”定义为相同、相似或不相似的亚基(单体)的链(或聚合物)。生物聚合物可为任何生物聚合物。生物聚合物可例如但不限于核酸、聚胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖。

生物聚合物可为多肽。所述多肽可为具有目标生物活性的任何多肽。术语“多肽”在本文中并非意在指特定长度的编码产物，因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。多肽进一步包括以上提到的多肽的自然存在的等位和工程化变异及杂合多肽。所述多肽对宿主细胞可为天然的或异源的。多肽可为胶原或明胶，或其变体或杂合物。多肽可为抗体或其部分、抗原、凝集因子、酶、激素或激素变体、受体或其部分、调节蛋白、结构蛋白、报告子或转运蛋白、分泌过程中涉及的蛋白质、折叠过程中涉及的蛋白质、伴侣蛋白、肽氨基酸转运体、糖基化因子、转录因子、合成肽或寡肽、细胞内蛋白。细胞内蛋白可为酶，例如蛋白酶、神经酰胺酶、环氧化物水解酶、氨基肽酶、酰基转移酶、醛缩酶、羟化酶、氨基肽酶、脂肪酶。多肽也可为细胞外分泌的酶。这种酶可以属于以下的组，氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶。所述酶可为碳水化合物酶，例如纤维素酶(例如葡聚糖内切酶、β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶)、半纤维素酶或果胶分解酶(例如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、多聚半乳糖醛酸内切酶、多聚半乳糖醛酸外切酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿糖基木聚糖水解酶、半乳醣醛酸酶、裂解酶或淀粉水解酶)；水解酶、异构酶或连接酶、磷酸酶(例如植酸酶)、酯酶(例如脂肪酶)、蛋白水解酶、氧化还原酶(例如氧化酶)、转移酶或异构酶。所述酶可为植酸酶。所述酶可为氨基肽酶、天冬酰胺酶、淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、内切蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、蛋白质脱氨酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、半乳糖脂酶、叶绿素酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶或葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、单加氧酶。

优选地，目标化合物为异源产物。优选地，目标化合物为葡萄糖氧化酶。更优选地，目标化合物为异源葡萄糖氧化酶。在另一优选实施方式中，目标化合物为解脂酶，例如具有选自：脂肪酶(三酰基甘油脂肪酶)、磷脂酶(例如磷脂酶A1和/或磷脂酶A2和/或磷脂酶B和/或磷脂酶C)、半乳糖脂酶的一种或更多种活性的解脂酶。

根据本发明，多肽或酶也可为如WO2010/102982中描述的产物。根据本发明，多肽也可为与另一多肽融合或杂合的多肽，另一多肽在所述多肽或其片段的N端或C端融合。通过使编码一个多肽的核酸序列(或其一部分)与编码另一多肽的核酸序列(或其一部分)融合生成融合多肽。

生成融合多肽的技术在本领域中已知，并且包括连接编码多肽的编码序列，以致其在框内并且融合多肽的表达受相同启动子和终止子的控制。杂合多肽可包含从至少两个不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中一个或更多个所述多肽可以与宿主细胞异源。在例如WO2010/121933中描述了融合多肽和信号序列融合的实例。

生物聚合物可为多糖。多糖可为任何多糖，包括但不限于粘多糖(例如，肝素和透明质酸)和含氮多糖(例如，几丁质)。在一个更优选的选项中，多糖为透明质酸。

编码目标化合物或编码根据本发明所述目标化合物的生成中所涉及的化合物的多核苷酸可编码在初级或次级代谢产物，例如有机酸、类胡萝卜素、(β-内酰胺)抗生素和维生素的合成中所涉及的酶。这种代谢产物可视为根据本发明所述的生物化合物。

术语“代谢产物”涵盖初级和次级代谢产物；代谢产物可为任何代谢产物。优选的代谢产物为柠檬酸、葡糖酸、己二酸、富马酸、衣康酸和琥珀酸。

代谢产物可由例如在生物合成或代谢途径中的一个或更多个基因编码。初级代谢产物是与能量代谢、生长和结构相关的、细胞初级或一般代谢的产物。次级代谢产物是次级代谢的产物(见，例如，R.B.Herbert,TheBiosynthesisofSecondaryMetabolites，Chapman和Hall，NewYork,1981)。

初级代谢产物可为但不限于氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酯或维生素。

次级代谢产物可为但不限于生物碱、香豆素、类黄酮、聚酮、奎宁、类固醇、肽或萜。次级代谢产物可为抗生素、拒食素、引诱剂、杀菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂或杀鼠剂。优选的抗生素为头孢菌素和β-内酰胺。其他优选代谢产物为外代谢产物。外代谢产物的实例为AurasperoneB、Funalenone、Kotanin、Nigragillin、Orlandin、其他萘并-γ-吡喃酮、吡喃黑杆菌素A(PyranonigrinA)、TensidolB、伏马菌素B2和赭曲霉素A。

生物化合物也可为选择标记的产物。选择标记为目标多核苷酸的产物，所述产物提供了杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原营养等。选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、ble(腐草霉素抗性蛋白)、hyg(潮霉素)、NAT或NTC(诺尔丝菌素)及其等效物。

根据本发明，目标化合物优选为目标化合物列表中描述的多肽。

优选地，多肽为目标化合物列表中描述的酶。优选葡萄糖氧化酶。在另一实施方式中，酶为解脂酶。

根据本发明的另一实施方式，目标化合物优选为代谢产物。

突变微生物细胞可以已经能够生成目标化合物。也可为突变微生物细胞提供编码多肽的同源或异源核酸构建体，其中多肽可为目标化合物或在目标化合物的生成中所涉及的多肽。本领域的技术人员知道如何修饰微生物宿主细胞以致其能够生成目标化合物。

术语“核酸构建体”在本文中也称为核酸分子，其为单链或双链的，分离自自然存在的基因或已被修饰为含有以在自然界中不存在的方式组合和并置的核酸区段。当核酸构建体含有编码序列表达所需的所有控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义，其中所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。

本文将术语“可操作地连接”定义为以下构型，其中控制序列相对于DNA序列的编码序列置于合适位置，以便控制序列指导RNA或mRNA和任选由所述(m)RNA翻译的多肽生成。

本文将术语“控制序列”定义为包括在体外或宿主细胞内，mRNA和/或多肽表达所必需或有利的所有组件。每个控制序列可对编码多肽的核酸序列天然或外来的。这种控制序列包括但不限于前导序列、Shine-Delgarno序列、最佳翻译起始序列(如Kozak,1991,J.Biol.Chem.266:19867-19870所述)、多聚腺苷酸化序列、肽原序列、前肽原序列、启动子、信号序列和转录终止子。在最低限度上，控制序列包括启动子及转录和翻译终止信号。控制序列可经优化用于其特定目的。用于本发明的优选的最优化控制序列是以引用的方式并入本文的WO2006/077258中描述的控制序列。

为了引入促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接的特异性限制位点，可以为控制序列提供接头。

控制序列可为适当启动子序列(启动子)。

控制序列也可为适合转录终止子(终止子)序列，为丝状真菌细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3'-末端可操作地连接。在细胞中为功能性的任何终止子均可用于本发明。本领域中的技术人员知道哪些类型的终止子可用于如本文所述的微生物宿主细胞中。

用于丝状真菌细胞的优选终止子序列从丝状真菌基因的任何终止子序列得到，更优选从曲霉菌基因得到，甚至更优选从米曲霉TAKA淀粉酶基因、编码黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、构巢曲霉(A.nidulans)邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、trpC和/或尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶的基因得到。

控制序列也可为最佳翻译起始序列(如Kozak,1991,J.Biol.Chem.266:19867-19870中所述)或5'-非翻译序列、mRNA的非翻译区，其对于由突变微生物宿主细胞翻译很重要。翻译起始序列或5’-非翻译序列与编码多肽的编码序列的5'-末端可操作地连接。每个控制序列可对编码多肽的核酸序列为天然或外来的。控制序列可经优化用于其特定目的。

适合的5'-非翻译序列可为在真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因、米曲霉TAKA淀粉酶和曲霉菌磷酸丙糖异构酶基因和黑曲霉葡糖淀粉酶glaA、α-淀粉酶、木聚糖酶和植酸酶编码基因之前的那些多核苷酸。

控制序列也可为对于突变微生物宿主细胞的翻译很重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的5'-末端可操作地连接。在细胞中为功能性的任何前导序列均可用于本发明。

前导序列可为源自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(例如来自曲霉菌的glaA的18和24氨基酸两种形式)、α-因子基因(酵母，例如酵母菌属和克鲁维酵母)或α-淀粉酶(amyE、amyQ和amyL)及碱性蛋白酶aprE和天然蛋白酶基因(芽胞杆菌(Bacillus))的前导序列或如WO2010/121933中描述的信号序列。

用于丝状真菌细胞的优选前导序列从在米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉(A.nidulans)磷酸丙糖异构酶及黑曲霉glaA和植酸酶之前的多核苷酸得到。

可从青霉菌(Penicillium)IPNS基因或pcbC基因、β微管蛋白基因分离另一些控制序列。WO01/21779中引述的所有控制序列由此以引用的方式并入。

控制序列也可为多聚腺苷酸化序列，其为与核酸序列的3'-末端可操作地连接并且在转录时由微生物宿主细胞(突变或亲本)识别为信号以向转录mRNA添加多聚腺苷酸残基的序列。在细胞中为功能性的任何多聚腺苷酸化序列均可用于本发明。

用于丝状真菌细胞的优选多聚腺苷酸化序列从编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的多核苷酸得到。

在一个优选实施方式中，在根据本发明所述的突变微生物宿主细胞中，编码目标化合物的至少一个多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的至少一个多核苷酸与启动子、优选与诱导型启动子可操作地连接。

本文将术语“启动子”定义为结合RNA聚合酶并指示聚合酶到编码生物化合物的核酸序列的正确下游转录起始位点以引发转录的DNA序列。RNA聚合酶有效催化与编码区适当DNA链互补的信使RNA的组装。还将术语“启动子”理解为包括在转录成mRNA后用于翻译的5'-非编码区(介于启动子和翻译起点之间)、顺式作用转录控制元件(例如增强子)和能够与转录因子相互作用的其他核苷酸序列。启动子可为适合真核或原核宿主细胞的显示出转录活性的任何适当启动子序列，包括突变、截短和杂合启动子，并且可从编码与细胞同源(天然)或异源(外来)的细胞外或细胞内多肽的多核苷酸获得。启动子可为组成型或诱导型启动子。

优选地，启动子为诱导型启动子。更优选地，启动子为碳水化合物诱导型启动子。优选使用的碳水化合物诱导型启动子选自淀粉诱导型启动子(即可由淀粉、其单体、二聚体、寡聚体诱导的启动子，例如麦芽糖诱导型启动子、异麦芽糖诱导型启动子)、纤维素诱导型启动子(即可由纤维素、其单体、二聚体和/或寡聚体诱导的启动子，例如纤维二糖诱导型启动子、槐糖诱导型启动子)、半纤维素诱导型启动子(即可由半纤维素、其单体、二聚体和/或寡聚体诱导的启动子，例如木聚糖诱导型启动子、阿拉伯糖诱导型启动子、木糖诱导型启动子)、果胶诱导型启动子(即可由果胶、其单体、二聚体和/或寡聚体诱导的启动子，例如半乳糖醛酸诱导型启动子、鼠李糖诱导型启动子)、阿拉伯聚糖诱导型启动子(即可由阿拉伯聚糖、其单体、二聚体和/或寡聚体诱导的启动子，例如阿拉伯糖诱导型启动子)、葡萄糖诱导型启动子、乳糖诱导型启动子、半乳糖诱导型启动子。另一些诱导型启动子为铜、油酸诱导型启动子。

在丝状真菌中适合的启动子为可以选自下组的启动子，所述组包括但不限于从编码以下的多核苷酸获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、曲霉菌gpdA启动子、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、黑曲霉或泡盛曲霉木聚糖内切酶(xlnA)或β-木糖苷酶(xlnD)、里氏木霉纤维二糖水解酶I(CBHI)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢霉(Fusariumvenenatum)淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢霉Dania(WO00/56900)、镶片镰孢霉Quinn(WO00/56900)、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶III、里氏木霉葡聚糖内切酶IV、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶以及NA2-tpi启动子(来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的杂合启动子)及其突变、截短和杂合启动子。启动子的另一些实例为WO2006/092396和WO2005/100573中描述的启动子，其以引用的方式并入本文。在WO2008/098933中描述了启动子用途的另一实例。可用于丝状真菌中的优选碳水化合物诱导型启动子为如以上所定义的米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、黑曲霉或泡盛曲霉木聚糖内切酶(xlnA)或β-木糖苷酶(xlnD)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶III、里氏木霉葡聚糖内切酶IV、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶以及NA2-tpi启动子(来自编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的杂合启动子)。

来自革兰氏阳性微生物的这种启动子的实例包括但不限于gnt(葡萄糖酸操纵子启动子)；来自地衣型芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)的penP；glnA(谷氨酰胺合成酶)；xylAB(木糖操纵子)；araABD(L-阿拉伯糖操纵子)和Pspac启动子、杂合SPO1/lac启动子，其可受诱导剂例如异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷[IPTG]控制((YansuraD.G.,HennerD.J.ProcNatlAcadSciUSA.198481(2):439-443)。活化子也为诱导启动子活性的序列特异性DNA结合蛋白。来自革兰氏阳性微生物的这种启动子的实例包括但不限于双组分系统(PhoP-PhoR、DegU-DegS、Spo0A-Phosphorelay)、LevR、Mry和GltC。(ii)次级σ因子的生成可为造成由特异性启动子转录的主要原因。来自革兰氏阳性微生物的实例包括但不限于孢子形成特异性σ因子：σF、σE、σG和σK及一般应力σ因子σB激活的启动子。通过能量限制和环境应力诱导σB介导的应答(HeckerM,U.MolMicrobiol.1998；29(5):1129-1136.)。(iii)减弱抗终止作用也调节转录。来自革兰氏阳性微生物的实例包括但不限于trp操纵子和sacB基因。(iv)表达载体中的另一些调节启动子基于赋予蔗糖可诱导性的sacR调节系统(KlierAF,RapoportG.AnnuRevMicrobiol.1988；42:65-95)。

用于细菌、例如杆菌(Bacilli)中的适合诱导型启动子包括：来自革兰氏阳性微生物的启动子，例如但不限于SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶启动子)和amyE。来自革兰氏阴性微生物的启动子的实例包括但不限于tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR和λ-PL。

用于细菌细胞、例如杆菌中的启动子另外的实例包括α-淀粉酶和SPo2启动子以及来自细胞外蛋白酶基因的启动子。

适合启动子的其他实例为从大肠杆菌lac操纵子获得的启动子。另一实例为天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂酶基因(dagA)的启动子。另一实例为迟缓芽胞杆菌(Bacilluslentus)碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子。另一实例为地衣型芽胞杆菌碱性蛋白酶基因(枯草溶菌素Carlsberg基因)的启动子。另一实例为枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的启动子。另一实例为枯草杆菌α淀粉酶基因(amyF)的启动子。另一实例为地衣型芽胞杆菌α淀粉酶基因(amyL)的启动子。另一实例为嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子。另一实例为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子。另一实例为对于“-35”区域具有序列TTGACA而对于“-10”区域具有TATAAT的“共有”启动子。另一实例为地衣型芽胞杆菌青霉素酶基因(penP)的启动子。另一实例为枯草杆菌xylA和xylB基因的启动子。

优选地，启动子序列来自高表达基因。可从中选择启动子和/或包含在优选预定靶基因座中以整合表达构建体的优选高表达基因的实例包括但不限于编码糖酵解酶例如磷酸丙糖异构酶(TPI)、甘油醛-磷酸脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK或PKI)、醇脱氢酶(ADH)的基因，以及编码淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖体蛋白的基因。适合的高表达基因的特定实例包括例如来自克鲁维酵母属的LAC4基因，分别来自汉森酵母和毕赤酵母的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)，来自黑曲霉和泡盛曲霉的葡糖淀粉酶(glaA)基因，米曲霉TAKA-淀粉酶基因、构巢曲霉gpdA基因和里氏木霉纤维二糖水解酶基因。

可用于酵母中的启动子包括例如来自糖酵解基因的启动子，例如来自酵母或丝状真菌的磷酸果糖激酶(PFK)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子；在(WO93/03159)中可找到关于来自酵母的这种启动子的更多详情。另一些有用的启动子为核糖体蛋白编码基因启动子、乳糖酶基因启动子(LAC4)、醇脱氢酶启动子(ADH1、ADH4等)和烯醇酶启动子(ENO)。组成型和诱导型的另一些启动子和增强子或上游激活序列将为本领域的技术人员已知。若期望，用于本发明宿主细胞中的启动子可被修饰以影响其控制特征。该上下文中的适合启动子包括为本领域中技术人员众所周知的组成型和诱导型天然启动子以及工程化启动子。真核宿主细胞中的适合启动子可为GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO1、TPI1和AOX1。其他适合启动子包括PDC1、GPD1、PGK1、TEF1和TDH3。可使用的碳水化合物诱导型启动子的实例为GAL启动子，例如GAL1或GAL10启动子。

以上提到的所有启动子在本领域中易于得到。

在一个优选实施方式中，在根据本发明所述的突变微生物细胞中，编码目标化合物的至少一个多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的至少一个多核苷酸可操作地连接到碳水化合物诱导型启动子，优选淀粉诱导型启动子，更优选选自葡糖淀粉酶启动子、酸稳定性淀粉酶启动子、α淀粉酶启动子和TAKA淀粉酶启动子的启动子。

为了促进表达，编码作为目标化合物的多肽或在目标化合物的生成中所涉及的多肽的多核苷酸可为合成多核苷酸。合成多核苷酸在密码子使用上可优选根据WO2006/077258和/或PCT/EP2007/055943(作为WO2008/000632公开)中描述的方法优化，其以引用的方式并入本文。PCT/EP2007/055943解决了密码子对优化。密码子对优化是这样的方法，其中已对其密码子使用、尤其是使用的密码子对修饰了编码多肽的核苷酸序列，以获得编码多肽的核苷酸序列的更高表达和/或编码的多肽更多生成。将密码子对定义为编码序列中两个随后的三联体(密码子)的组。

为了促进表达和/或翻译，编码作为目标化合物的多肽或编码在目标化合物的生成中所涉及的多肽的多核苷酸可包含在表达载体中，以致编码多肽产物的基因与适当控制序列可操作地连接，以在体外或突变微生物宿主细胞内表达和/或翻译。

表达载体可为任何载体(例如，质粒或病毒)，其可方便地进行重组DNA程序并且可引起编码多肽的多核苷酸表达。载体的选择通常将取决于载体与要向其中引入载体的细胞的相容性。载体可为线性或闭环质粒。载体可为自主复制载体，即作为染色体外实体存在的其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。自主维持的克隆载体可包含AMA1-序列(见例如Aleksenko和Clutterbuck(1997),FungalGenet.Biol.21:373-397)。

或者，载体可为引入宿主细胞时整合到基因组中并且与已经将其整合的染色体一起复制的载体。整合性克隆载体可随机整合或整合在宿主细胞染色体内预定的靶基因座处。在本发明的一个优选实施方式中，整合性克隆载体包含与宿主细胞基因组中预定靶基因座的DNA序列同源的DNA片段，以向该预定基因座靶向整合克隆载体。为了促进靶向整合，优选在转化细胞之前，使克隆载体线性化。优选进行线性化，以致克隆载体的至少一端但是优选两端的侧翼为与靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选为至少30bp，优选至少50bp，优选至少0.1kb，甚至优选至少0.2kb，更优选至少0.5kb，甚至更优选至少1kb，最优选至少2kb。优选地，向宿主细胞基因组中靶向整合、即在预定靶基因座中整合的效率随宿主细胞的同源重组能力的增强而提高。

优选地，克隆载体中与靶基因座同源的同源侧翼DNA序列源自高表达基因座，意味着其源自能够在宿主细胞中高水平表达的基因。本文将能够高水平表达的基因、即高表达基因定义为，在例如诱导条件下其mRNA可构成细胞总mRNA的至少0.5％(w/w)的基因，或者，其基因产物可构成细胞总蛋白质的至少1％(w/w)的基因，或在分泌基因产物的情况下，可分泌到至少0.1g/l的水平的基因(如EP357127B1所述)。

通过举例给出了许多优选的高表达真菌基因：来自曲霉、金孢菌或木霉的淀粉酶、葡糖淀粉酶、醇脱氢酶、木聚糖酶、甘油醛-磷酸脱氢酶或纤维二糖水解酶(cbh)基因。用于这些目的最优选的高表达基因为葡糖淀粉酶基因，优选黑曲霉葡糖淀粉酶基因、米曲霉TAKA-淀粉酶基因、构巢曲霉gpdA基因、里氏木霉cbh基因(优选cbh1)、勒克瑙金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)cbh基因或来自产黄青霉的cbh基因。

可将多于一个拷贝的核酸序列插入突变微生物宿主细胞中以增加所述序列编码的产物的生成(过度表达)。这可优选通过将DNA序列的拷贝整合到其基因组，更优选通过在前一段中定义的一个高表达基因座处靶向整合DNA序列进行。或者，这可通过包括与所述核酸序列一起的可扩增选择标记基因进行，其中可通过在适当选择剂的存在下培养细胞来选择含有选择标记基因的扩增拷贝并从而含有所述核酸序列的附加拷贝的细胞。为了使待过度表达的DNA序列的拷贝数量增加更多，可使用如WO98/46772中描述的基因转换技术。

载体系统可为单个载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA，或转座子。

载体优选含有一个或更多个允许容易地选择转化细胞的选择标记。选择标记是其产物提供了杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原营养等的基因。选择标记可作为表达盒的表达载体上引入细胞或可在单独表达载体上引入。

用于丝状真菌细胞的选择标记可选自下组，所述组包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、bleA(腐草霉素结合)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、NAT或NTC(诺尔丝菌素)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)及其来自其他物种的等效物。优选用于曲霉菌和青霉菌细胞的是amdS(见例如EP635574B1、EP0758020A2、EP1799821A2、WO97/06261A2)和构巢曲霉或米曲霉的pyrG基因或吸湿链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。更优选地，使用amdS基因，甚至更优选来自构巢曲霉或黑曲霉的amdS基因。最优选的选择标记基因为与构巢曲霉gpdA启动子融合的构巢曲霉amdS编码序列(见EP635574B1)。另一些优选的AmdS标记为WO2006/040358中描述的标记。也可使用来自其他丝状真菌的AmdS基因(WO97/06261)。

可用于细菌中的标记包括ATP合成酶、亚基9(oliC)、乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶(pvrA)、细菌G418抗性基因(这也可用于酵母中，但不可用于丝状真菌中)、氨苄青霉素抗性基因(大肠杆菌)、新霉素、卡那霉素、四环素、壮观霉素、红霉素、氯霉素、腐草霉素的抗性基因(芽孢杆菌)和编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的大肠杆菌uidA基因。例如，载体可在体外用于生成RNA或用于转染或转化宿主细胞。

可用于转化大多数丝状真菌和酵母的通用标记基因例如乙酰胺酶基因或cDNA(来自构巢曲霉、米曲霉或黑曲霉的amdS、niaD、facA基因或cDNA)或提供对抗生素如G418的抗性、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、腐草霉素或苯菌灵抗性(benA)的基因。或者，可使用特异性选择标记，例如需要相应突变宿主菌株的营养缺陷型标记：例如D-丙氨酸消旋酶(来自芽孢杆菌)、URA3(来自酿酒酵母或来自其他酵母的类似基因)、pyrG或pyrA(来自构巢曲霉或黑曲霉)、argB(来自构巢曲霉或黑曲霉)或trpC。在一个优选实施方式中，在引入表达构建体后从转化的宿主细胞中缺失选择标记，以便获得无选择标记基因的能够生成多肽的转化宿主细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序为本领域中的技术人员众所周知(见，例如Sambrook和Russell，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第3版，CSHLPress,ColdSpringHarbor,NY,2001；和Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyInterScience,NY,1995)。

此外，标准分子克隆技术例如DNA分离、凝胶电泳、核酸的酶促限制修饰、Southern分析、细胞转化等为技术人员已知并且例如由Sambrook等人(1989)"MolecularCloning:alaboratorymanual",ColdSpringHarborLaboratories,ColdSpringHarbor,NewYork和Innis等(1990)"PCRprotocols,aguidetomethodsandapplications"AcademicPress,SanDiego描述。

可使用cDNA、mRNA或使用基因组DNA作为模板和使用适当寡聚核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术扩增核酸。可将这样扩增的核酸克隆到适当载体中并且通过DNA序列分析表征。

优选地，修饰突变微生物宿主细胞以提高多核苷酸的表达，以增强作为目标化合物的多肽或目标化合物的生成中所涉及的多肽的生成。

优选地，向宿主细胞基因组中靶向整合、即在预定靶基因座中整合的效率随宿主细胞的同源重组能力增强而提高。细胞的这种表型优选涉及如WO2005/095624中描述的缺陷型hdfA或hdfB。WO2005/095624公开了获得包含更高效率的靶向整合的丝状真菌细胞的优选方法。

任选地，宿主细胞已被修饰为包含更高未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse，UPR)，以增强目标多肽的生成能力。可通过US2004/0186070A1和/或US2001/0034045A1和/或WO01/72783A2和/或WO2005/123763中描述的技术增加UPR。更特别地，HAC1和/或IRE1和/或PTC2的蛋白质水平可被调节，和/或SEC61蛋白可被工程化以便获得具有更高UPR的宿主细胞。

本领域的技术人员知道如何用所述一个或更多个表达盒和选择标记转化细胞。例如，技术人员可使用一个或更多个表达载体，其中所述一个或更多个克隆载体包含表达盒和选择标记。

突变微生物宿主细胞的转化可通过任何适合的已知方法进行，包括例如电穿孔法、粒子轰击或微粒轰击、原生质体法和土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化(AMT)。优选地，使用原生质体法。J.R.S.Fincham,Transformationinfungi.1989,Microbiologicalreviews.53,148-170描述了转化的程序。

通过向细胞中引入多核苷酸、表达载体或核酸构建体转化突变微生物宿主细胞优选通过本领域众所周知的技术进行(见Sambrook和Russell；Ausubel，同上)。转化可以牵涉由原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生以本身已知的方式组成的过程。在EP238023和Yelton等人，1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述了转化曲霉菌细胞的适合程序。例如在DeGroot等，Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationoffilamentousfungi.NatBiotechnol.1998,16:839-842.Erratumin:NatBiotechnol199816:1074中描述了使用根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转化曲霉菌和其他丝状真菌宿主细胞的适合程序。由Malardier等人，1989,Gene78:147156或在WO96/00787中描述了转化镰刀菌物种的适合方法。可应用其他方法，例如使用在：Christiansen等人，Biolistictransformationoftheobligateplantpathogenicfungus,Erysiphegraminisf.sp.hordei.1995,CurrGenet.29:100-102中描述的基因枪转化(biolistictransformation)的方法。可使用Becker和Guarente，Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology，第194卷，第182-187页，AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；和Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920描述的程序转化酵母。

为了增加突变微生物宿主细胞内编码目标化合物或编码由细胞生成目标化合物(基因)所涉及的化合物的多核苷酸的拷贝量，可以需要多次转化宿主细胞。这样，宿主细胞生成的不同酶的比例可以受影响。同样，表达载体可包含多个表达盒以增加待转化多核苷酸的拷贝量。

另一种方式可为不同多核苷酸选择不同控制序列，根据选择，这可引起所期望多肽更高产或更低产。

可基于选择标记的存在选择经选择标记转化的细胞。在转化(曲霉菌)细胞的情况下，通常同时用所有核酸物质转化细胞时，当存在选择标记时编码所期望多肽的多核苷酸也存在。

本发明还提供了一种生成根据本发明所述的突变微生物宿主细胞的方法，包括以下步骤：

a.提供如本文所述的亲本微生物宿主细胞；

b.修饰所述亲本微生物宿主细胞，优选修饰所述亲本微生物宿主细胞的基因组，以产生如果与亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时，在如本文所述的选自以下的多肽的生成上缺陷的如本文所述的突变微生物宿主细胞：

(i)根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；

(ii)SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同的多肽，优选与其至少70％相同并且具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽；

(iii)根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的所述多肽优选具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性；

(iv)能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽优选具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性。

在该上下文中，将对于本领域的技术人员明确的是，适用于根据本发明所述的突变微生物宿主细胞的特定实施方式也可以适用于本发明的其他方面。

本发明进一步提供了一种通过微生物发酵生成目标化合物的方法，包括：

a.提供根据本发明所述的能够表达目标化合物的突变微生物宿主细胞，

b.在有益于表达目标化合物的条件下培养所述突变微生物宿主细胞，

c.任选地从培养基中分离目标化合物。

步骤a中，突变微生物宿主细胞可为本文所述的突变宿主细胞。

步骤b中，在有益于表达本文所述的目标化合物的条件下培养步骤a的突变微生物宿主细胞。在适于生成目标化合物的营养培养基中，使用本领域已知的方法培养突变微生物细胞。例如，可通过在适合培养基中并且在允许生成和/或分离目标化合物的条件下，在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料或固态发酵)培养细胞。培养在包含碳源和氮源和无机盐的适合营养培养基中，使用本领域已知的程序进行(见，例如，Bennett,J.W.和LaSure,L.编辑，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA,1991)。合适培养基可从商业供应商处得到或可使用公开的组分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果目标化合物分泌到营养培养基中，则可从培养基中直接分离化合物。如果未分泌目标化合物，则可从细胞裂解物分离。

步骤c中，可任选分离目标化合物。可通过本领域中已知的方法分离如本文所述的目标化合物。例如，可通过常规程序，包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基中分离目标化合物。然后可通过本领域中已知的多种程序，包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解(例如，硫酸铵沉淀)或萃取(见例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden编辑，VCHPublishers,NewYork,1989)，进一步纯化分离的目标化合物。在一些应用中，可使用目标化合物而无需从培养液中实质上分离；将培养基与生物质分开可以已足够。

在根据本发明所述的生成目标化合物的方法的一个优选实施方式中，如果与使用未被修饰的亲本微生物宿主细胞来生成目标化合物的方法的产率相比且在相同条件下测量，目标化合物的产率增加。优选地，其增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。更优选地，至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％。甚至更优选，至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、270％、至少280％、至少290％或至少300％。

如本文所定义的突变微生物宿主细胞可用于如本文所述的生成目标化合物的方法中。

在通过微生物发酵生成目标化合物的方法中生成的目标化合物可为本文所述的任何化合物。

本发明的一些优选实施方式

1.一种突变微生物宿主细胞，其已被修饰，优选在其基因组中被修饰，以导致如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时，在选自以下的多肽的生成上缺陷：

a.根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同并且优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的多肽；

b.SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同并且优选具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽；

c.根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中所述根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的所述多肽优选具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性；

d.能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽优选具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性。

2.根据实施方式1所述的突变微生物宿主细胞，其中SEQIDNO:3中包含的所述成熟多肽为根据SEQIDNO:4的成熟多肽。

3.根据实施方式1或2中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中根据实施方式1a.-1d.所述的多肽具有为糖苷水解酶活性的酶活性，更优选为选自以下的酶活性：α-淀粉酶活性[EC3.2.1.1]、异淀粉酶活性、菊粉酶活性、转化酶活性[EC3.2.1.26]、麦芽糖酶活性[EC3.2.1.20]、异麦芽糖酶活性、支链淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、环糊精酶活性、壳聚糖酶活性、葡聚糖酶活性、蔗糖酶-异麦芽糖酶活性、α-葡糖苷酶活性、糖原脱支酶活性。

4.根据实施方式1-2中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中根据实施方式1a.-1d.所述的多肽具有为α-葡糖基转移酶活性的酶活性，所述酶活性优选为糖苷转移酶或糖苷合酶活性，更优选为选自以下的酶活性：糖原分支酶活性、α-1,3-葡聚糖合酶活性[EC2.4.1.183]、α-1,4-葡聚糖合酶活性、α-1,6-葡聚糖合酶活性、β-1,3-葡聚糖合酶活性、β-1,4-葡聚糖合酶活性、β-1,6-葡聚糖合酶活性、葡糖淀粉酶活性、形成麦芽五糖的淀粉酶活性、形成麦芽六糖的淀粉酶活性、α-葡糖苷酶活性、α-葡糖苷酶II活性、α-木糖苷酶活性。

5.根据实施方式1-5中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中所述修饰包括：

a)如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比，在相同条件下分析时，导致实施方式1a.-1d.中定义的多肽生成减少或不生成的修饰，和/或

b)如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比，在相同条件下分析时，生成活性降低或没有活性的源自实施方式1a.-1d.所定义多肽的多肽的修饰。

6.根据实施方式1-5中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中所述突变微生物宿主细胞

a.如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，生成较少实施方式1a.-1d.中定义的多肽或其不生成实施方式1a.-1d.中定义的多肽；和/或

b.如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比，在相同条件下分析时，生成活性降低或没有活性的源自实施方式1a.-1d.所定义多肽的多肽。

7.根据实施方式1-6中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞生成少1％的实施方式1a.-1d.中定义的多肽，至少少5％、至少少10％、至少少20％、至少少30％、至少少40％、至少少50％、至少少60％、至少少70％、至少少80％、至少少90％、至少少91％、至少少92％、至少少93％、至少少94％、至少少95％、至少少96％、至少少97％、至少少98％、至少少99％或至少少99.9％，优选地，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞基本不生成权利要求1a.-1d.中定义的多肽。

8.根据实施方式1-7中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞生成(酶)活性低1％的源自实施方式1a.-1d.中所定义多肽的多肽，活性至少低5％、活性至少低10％、活性至少低20％、活性至少低30％、活性至少低40％、活性至少低50％、活性至少低60％、活性至少低70％、活性至少低80％、活性至少低90％、活性至少低91％、活性至少低92％、活性至少低93％、活性至少低94％、活性至少低95％、活性至少低96％、活性至少低97％、活性至少低98％、活性至少低99％或活性至少低99.9％，优选地，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下分析，所述突变微生物宿主细胞生成基本没有活性的源自权利要求1a.-1d.中所定义多肽的多肽。

9.根据实施方式1-8中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中其基因组中的所述修饰选自：

a)完全或部分缺失实施方式1c.或1d.中定义的多核苷酸；

b)用不编码实施方式1a.-1d.中定义的多肽或编码实施方式1a.-1d.中所定义多肽的部分或完全失活形式的多核苷酸序列完全或部分置换实施方式1c.或1d.中定义的多核苷酸；

c)通过在多核苷酸序列中插入一个或更多个核苷酸来破坏实施方式1c.或1d.中所定义的多核苷酸，从而部分或完全失活实施方式1a.至1d.中所定义的多肽。

10.根据实施方式1-9中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中导致实施方式1a.-1d.中定义的多肽生成减少或不生成的所述修饰是由于编码所述多肽的mRNA生成减少。

11.根据实施方式1-10中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其包含编码目标化合物的至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的至少一种多核苷酸。

12.根据实施方式11所述的突变微生物宿主细胞，其中编码目标化合物的所述至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的所述至少一种多核苷酸与启动子、优选与诱导型启动子可操作地连接。

13.根据实施方式1-12中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中所述启动子为碳水化合物诱导型启动子，优选为选自淀粉诱导型启动子的启动子，更优选为葡糖淀粉酶启动子、酸稳定性淀粉酶启动子、α-淀粉酶启动子和TAKA淀粉酶启动子。

14.根据实施方式1-13中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其为真核细胞，更优选为真菌细胞，甚至更优选地所述突变微生物宿主细胞为丝状真菌。

15.根据实施方式14所述的突变微生物宿主细胞，其为选自曲霉菌(Aspergillus)、支顶孢菌(Acremonium)、毁丝霉菌(Myceliophthora)、梭孢壳菌(Thielavia)、金孢菌(Chrysosporium)、青霉菌(Penicillium)、篮状菌(Talaromyces)、Rasamsonia、镰刀菌(Fusarium)或木霉菌(Trichoderma)的丝状真菌，优选黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、阿拉巴门支顶孢菌(Acremoniumalabamense)、嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)、土生梭孢壳菌(Thielaviaterrestris)、勒克瑙金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、Rasamsoniaemersonii、埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)、里氏木霉(Trichodermareesei)或产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)的物种。

16.一种生成突变微生物宿主细胞的方法，其包括以下步骤：

a.提供亲本微生物宿主细胞；

b.修饰所述亲本微生物宿主细胞，优选修饰所述亲本微生物宿主细胞的基因组，以产生如果与亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，在选自以下的多肽的生成上缺陷的突变微生物宿主细胞：

(i)根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；

(ii)SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同的多肽，优选与其至少70％相同并且具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽；

(iii)根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或1的多核苷酸编码的所述多肽优选具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性；

(iv)能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽优选具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性。

17.根据实施方式16所述的方法，其中所述突变微生物宿主细胞为根据实施方式1-15中任一项所述的突变微生物宿主细胞。

18.一种通过微生物发酵生成目标化合物的方法，其包括：

a.提供根据实施方式1-15中任一项所述的或通过根据实施方式16或17的方法生成的能够表达所述目标化合物的突变微生物宿主细胞，

b.在有益于表达所述目标化合物的条件下培养所述突变微生物宿主细胞，

c.任选地从培养基中分离所述目标化合物。

19.根据实施方式18所述的方法，其中所述目标化合物为选自生物质、生物聚合物、代谢产物的生物化合物，优选地所述目标化合物选自生物聚合物或代谢产物。

20.根据实施方式19所述的方法，其中所述生物聚合物选自核酸、聚胺、多元醇、多肽(例如蛋白质，优选酶)或聚酰胺或多糖，或代谢产物选自初级或次级代谢产物。

21.根据实施方式20所述的方法，其中所述目标化合物为酶，优选为葡萄糖氧化酶。

22.根据实施方式18-21中任一项所述的方法，其中如果与使用未被修饰的亲本微生物宿主细胞来生成目标化合物的方法的产率相比，在相同条件下测量时，所述目标化合物的产率增加，优选其中所述产率增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％，更优选至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％，甚至更优选至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％或至少300％。

下文将通过实施例说明本发明，然而不得将实施例解释为限制本发明的范围。

实施例

菌株

WT1：这种黑曲霉菌株用作野生型菌株。该菌株存放在CBS研究所，保藏编号为CBS513.88。

GBA306：在WO2011/009700中已经详细描述了用WT1作为出发菌株构建GBA306。该GBA306菌株具有下列基因型：ΔglaA、ΔpepA、ΔhdfA、经改造BamHI扩增子、ΔamyBII、ΔamyBI和ΔamyA。

PGOX-2：该黑曲霉菌株为表达产黄青霉葡萄糖氧化酶的GBA306菌株。使用pGBTOPGOX-3表达载体构建PGOX-2菌株(见图1-其中克隆有密码子对优化的产黄青霉葡萄糖氧化酶(WO2012/001169的如SEQIDNO:29中所示并且具有如SEQIDNO:30中所示的蛋白质序列)编码序列的pGBTOP12表达载体(WO2011/009700))，所述表达载体通过使用WO2011/009700和WO2012/001169中描述的方法，用含amdS选择标记基因的载体pGBAAS-3共转化引入。转化和反选(在WO98/46772和WO99/32617中也有描述)然后选择具有多个拷贝的菌株后，选择1个产多拷贝酶的菌株并命名为PGOX-2。该菌株在后续实验中用作葡萄糖氧化酶产生菌株。

PLA-2和LIP-2：选择猪磷脂酶A2(PLA2)蛋白和L01解脂酶(如WO2009/106575中所述，具有根据SEQIDNO:2的氨基酸序列并且由SEQIDNO:1的多核苷酸序列编码)作为酶在黑曲霉GBA306中表达的模型蛋白。两种酶也在不同黑曲霉背景下表达，但是表达盒和编码序列基本上与WO2012001169实施例1中所描述的相似。

选择猪磷脂酶A2(PLA2)蛋白(RobertsI.N.,JeenesD.J.,MacKenzieD.A.,WilkinsonA.P.,SumnerI.G.和ArcherD.B.(1992)“HeterologousgeneexpressioninAspergillusniger:aglucoamylase-porcinepancreaticphospholipaseA₂fusionproteinissecretedandprocessedtoyieldmatureenzyme”Gene122:155-161)作为酶在黑曲霉菌株中表达的模型蛋白。原则上如Roberts等(1992)和WO2012001169所述，制备proPLA2与黑曲霉的天然葡糖淀粉酶A基因的融合物作为过度表达PLA2的片段。去除GLA和porPLA2之间的kex2切割位点(KR)，以致编码的GLA-proPLA2融合蛋白与SEQIDNO:20中列出的相同。

使用如WO98/46772和WO99/32617所述的相同技术，将这种编码以上提到的蛋白质的glaA-pla2融合基因克隆到黑曲霉pGBTOP-12表达载体中，生成pGBTOPPLA-2(图3)。使用如WO98/46772和WO99/32617所述的技术，将编码解脂酶L01的基因克隆到黑曲霉pGBTOP-12表达载体中，其在基本上如WO2012001169中所述的葡糖淀粉酶启动子的控制下，产生pGBTOPLIP-2(图2)。

通过用含amdS选择标记基因的载体pGBAAS-3和pGBTOPLIP-2和pGBTOPPLA-2载体共转化GBA306菌株，随后选择转化体，构建解脂酶和葡糖淀粉酶-猪胰腺磷脂酶A₂融合蛋白的产酶菌株。转化和反选程序(如WO98/46772和WO99/32617所述)和随后的菌株选择产生生成脂肪酶的(多拷贝)菌株和生成葡糖淀粉酶-猪胰腺磷脂酶A₂融合蛋白的菌株。对于每种菌株背景而言，选择GBA306背景的1个高拷贝产酶菌株并命名为LIP-2和PLA-2。将这些菌株在后续实验中用作各产酶菌株。

分子生物学技术

在这些菌株中，使用技术人员已知的分子生物学技术(见：Sambrook和Russell，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第3版，CSHLPress,ColdSpringHarbor,NY,2001)，使几种基因过度表达而其他基因下调，如下所述。在WO199846772、WO199932617、WO2001121779、WO2005095624、WO2006040312、EP635574B、WO2005100573、WO2011009700和WO2012001169中可找到用于基因过度表达的表达载体和用于下调的破坏载体、转化、使用标记和选择性培养基的一般设计的实例。所有基因置换载体均包含各ORF序列约1-2kb的侧翼区，以靶向在预定基因座的同源重组。另外，其在直接重复之间含有用于转化的构巢曲霉双向amdS选择标记。在本文所有实施例中应用于基因缺失的方法使用通过双交换整合到基因组中侧翼序列的同源基因座的线性DNA，从而用amdS基因取代要缺失的基因。转化后，直接重复序列允许通过(第二)同源重组事件去除选择标记。amdS标记的去除可通过铺板到氟乙酰胺培养基上进行，导致对无标记基因菌株的选择。使用这种转化和后续反选的策略，即在EP0635574中也描述为“无标记基因(MARKER-GENEFREE)”方法，在菌株修饰程序中可无限地使用amdS标记。

黑曲霉摇瓶发酵

如WO2010/102982所述，预培养黑曲霉菌株并且在34℃和170rpm下培养。如WO2010/102982中更详细地描述的，在20mlCSL预培养基中预培养并且在生长过夜后，将10ml这种培养物转移到100ml发酵培养基(FM)中，培养时间如实施例中所示。

黑曲霉24孔微量滴定板发酵

为每孔装有4mlFM的24孔微量滴定板接种1×10⁵-5×10⁵个黑曲霉孢子。在34℃、550rpm和80％湿度下培养所述板120小时。

酶活性测量

如Witteveen等1990,“GlucoseoxidaseoverproducingandnegativemutantsofAspergillusniger”,ApplMicrobiolBiotechnol33:683-686所述，测量葡萄糖氧化酶(GOX)活性和GOX活性平板测定(使用邻茴香胺)。

为用分光光度法测定黑曲霉培养液中的磷脂酶PLA2活性(PLA2)，使用人工底物：1,2-二硫二辛酰磷脂酰胆碱(双C8，底物)。WO2006/040312中描述了该测定法的更多详情。

样品可含PLA2的(部分)非活性(未加工)形式＝PLA2原。应用胰蛋白酶从磷脂酶A2剪去前序列。用胰蛋白酶处理前PLA2导致上清液中存在的PLA2完全激活。胰蛋白酶处理后的酶活性用CPU(发色磷脂酶A2单位)或PLA2活性(相对CPU活性)表示。

可如WO2009/106575的“活性测量”部分下所述测量脂肪酶活性。

实施例1

含糖苷水解酶基因缺失的黑曲霉PGOX-2菌株的构建方法

为了能够破坏糖苷水解酶(GH)相关基因(也称基因编码：An01g10930、An04g06920和An09g03070，其编码GH31或GH13家族推定的α-葡聚糖合酶和/或(推定的)α-葡糖苷酶并且可参与淀粉降解或细胞壁α-葡聚糖合成)，为上述3种基因的每一种设计了基因置换载体。在表1中可找到淀粉酶编码基因的详细信息。

表1.构建的各GH破坏菌株的基因和菌株详细信息

载体pGBDEL-AMY1(图4)和其他pGBDEL变体(其包含用于同源重组的各淀粉酶编码ORF的约1kb侧翼区)用于转化黑曲霉PGOX-2。验证真实重组事件和菌株的正确性后，选择所产生的正确菌株PGOX-2、PGOX-2_AMY1、PGOX-2_AMY2、PGOX-2_AMY4-1和PGOX-2_AMY4-2作为在PGOX-2菌株背景下各GH基因(表1)灭活的代表性菌株。

对于黑曲霉LIP-2和PLA-2菌株，按照相同方法。这样分别产生在LIP-2和PLA-2菌株背景下各GH基因(表1)灭活的菌株LIP-2、LIP-2_AMY4-1、LIP-2_AMY4-2、PLA-2和PLA-2_AMY4。

实施例2

分析黑曲霉PGOX-2来源的菌株生成的葡萄糖氧化酶产物的量

为了能够评估GH基因破坏的影响，分析这些转化体在FM培养基中的摇瓶分析。接种后第4天和第6天，取培养基样品。分析培养上清液中的葡萄糖氧化酶水平。对于在葡糖淀粉酶启动子的控制下进行的葡萄糖氧化酶生成，令人惊讶的是，AgsE-An09g03070的破坏导致葡萄糖氧化酶生成增多(图5)，而另外两个agdA和agdB的破坏显示出葡萄糖氧化酶生成无明显影响。由培养上清液中的葡萄糖氧化酶活性鉴定的PGOX-2_AMY4-1和PGOX-2_AMY4-2菌株在两个取样日(第4天和第6天)均具有更高的活性。通过对如实施例1所述分离的随机转化体分析板上的GOX表达(图6)，确认了AgsE破坏后这种生成增加。这些实施例显示，根据本发明所述的丝状真菌细胞对含有作为碳源的麦芽糖的培养基中的目标蛋白质具有更高滴度，并且能够在AgsE破坏菌株背景下生成更多量的蛋白质产物。

实施例3

分析黑曲霉LIP-2来源的菌株生成的解脂酶L01产物的量

在LIP-2背景下，进一步测试了在PGOX-2背景下对葡萄糖氧化酶生成显示出积极影响的AgsE基因破坏。为了能够评估AgsE基因破坏对脂肪酶生成的影响，分析这些转化体在FM培养基中的摇瓶分析。接种后第3-6天，取培养基样品。分析培养上清液中的脂肪酶水平；比较不同菌株的最高生产率。对于在葡糖淀粉酶启动子的控制下进行的脂肪酶生成，令人惊讶的是，AgsE-An09g03070的破坏导致脂肪酶生成增多(图7)。由培养上清液中的脂肪酶活性鉴定的LIP-2_AMY4-1和LIP-2_AMY4-2菌株具有更高的活性。这些实施例显示，根据本发明所述的丝状真菌细胞对含有作为碳源的麦芽糖的培养基中的目标蛋白质具有更高滴度，并且能够在AgsE破坏菌株背景下生成更多量的蛋白质产物。

实施例4

分析黑曲霉PLA-2来源的菌株生成的磷脂酶A2产物的量

在PLA-2背景下，进一步测试了在PGOX-2背景下对葡萄糖氧化酶生成和在LIP-2背景下对脂肪酶生成显示出积极影响的AgsE基因破坏。为了能够评估AgsE基因破坏对磷脂酶A2生成的影响，分析这些转化体在FM培养基中的24孔微量滴定板发酵。接种120小时后，取培养基样品。分析培养上清液中的磷脂酶A2水平。对于在葡糖淀粉酶启动子的控制下进行的磷脂酶A2生成，令人惊讶的是，AgsE-An09g03070的破坏导致磷脂酶A2生成增多(图8)。这些实施例显示，根据本发明所述的丝状真菌细胞对含有作为碳源的麦芽糖的培养基中的目标蛋白质具有更高滴度，并且能够在AgsE破坏菌株背景下生成更多量的蛋白质产物。

申请人或代理人文件参考编号28995-WO-PCT

国际申请号：

与被保藏的微生物相关的说明

(PCTRule13bis)

PCT/RO/134表(1992年7月)

Claims (22)

1.一种突变微生物宿主细胞，其已被修饰，优选在其基因组中被修饰，以导致如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时，在选自以下的多肽的生成上缺陷：

a.根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同并且具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的多肽；

b.SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同并且具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽；

c.根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的所述多肽具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性；

d.能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性。

2.根据权利要求1所述的突变微生物宿主细胞，其中SEQIDNO:3中包含的所述成熟多肽为根据SEQIDNO:4的成熟多肽。

3.根据权利要求1或2所述的突变微生物宿主细胞，其中根据实施方案1a.-1d.所述的多肽具有为糖苷水解酶活性的酶活性，更优选为选自以下的酶活性：α-淀粉酶活性[EC3.2.1.1]、异淀粉酶活性、菊粉酶活性、转化酶活性[EC3.2.1.26]、麦芽糖酶活性[EC3.2.1.20]、异麦芽糖酶活性、支链淀粉酶活性、葡糖淀粉酶活性、环糊精酶活性、壳聚糖酶活性、葡聚糖酶活性、蔗糖酶-异麦芽糖酶活性、α-葡糖苷酶活性、糖原脱支酶活性。

4.根据权利要求1或2所述的突变微生物宿主细胞，其中根据权利要求1a.-1d.所述的多肽具有为α-葡糖基转移酶活性的酶活性，所述酶活性优选为糖苷转移酶或糖苷合酶活性，更优选为选自以下的酶活性：糖原分支酶活性、α-1,3-葡聚糖合酶酶活性[EC2.4.1.183]、α-1,4-葡聚糖合酶活性、α-1,6-葡聚糖合酶活性、β-1,3-葡聚糖合酶活性、β-1,4-葡聚糖合酶活性、β-1,6-葡聚糖合酶活性、葡糖淀粉酶活性、形成麦芽五糖的淀粉酶活性、形成麦芽六糖的淀粉酶活性、α-葡糖苷酶活性、α-葡糖苷酶II活性、α-木糖苷酶活性。

5.根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中所述修饰包括：

a)如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比，在相同条件下分析时，导致权利要求1a.-1d.中定义的多肽生成减少或不生成的修饰，和/或

b)如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比，在相同条件下分析时，生成活性降低或没有活性的源自权利要求1a.-1d.所定义多肽的多肽的修饰。

6.根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中所述突变微生物宿主细胞

a.如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，生成较少权利要求1a.-1d.中定义的多肽或其不生成权利要求1a.-1d.中定义的多肽；和/或

b.如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比，在相同条件下分析时，生成活性降低或没有活性的源自权利要求1a.-1d.所定义多肽的多肽。

7.根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞生成少1％的权利要求1a.-1d.中定义的多肽，至少少5％、至少少10％、至少少20％、至少少30％、至少少40％、至少少50％、至少少60％、至少少70％、至少少80％、至少少90％、至少少91％、至少少92％、至少少93％、至少少94％、至少少95％、至少少96％、至少少97％、至少少98％、至少少99％或至少少99.9％，优选地，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞基本不生成权利要求1a.-1d.中定义的多肽。

8.根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，所述突变微生物宿主细胞生成(酶)活性低1％的源自实施方案1a.-1d.中所定义多肽的多肽，活性至少低5％、活性至少低10％、活性至少低20％、活性至少低30％、活性至少低40％、活性至少低50％、活性至少低60％、活性至少低70％、活性至少低80％、活性至少低90％、活性至少低91％、活性至少低92％、活性至少低93％、活性至少低94％、活性至少低95％、活性至少低96％、活性至少低97％、活性至少低98％、活性至少低99％或活性至少低99.9％，优选地，如果与未被修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下分析，所述突变微生物宿主细胞生成基本没有活性的源自权利要求1a.-1d.中所定义多肽的多肽。

9.根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中其基因组中的所述修饰选自：

a)完全或部分缺失权利要求1c.或1d.中定义的多核苷酸；

b)用不编码权利要求1a.-1d.中定义的多肽或编码权利要求1a.-1d.中所定义多肽的部分或完全失活形式的多核苷酸序列完全或部分置换权利要求1c.或1d.中定义的多核苷酸；

c)通过在多核苷酸序列中插入一个或更多个核苷酸来破坏权利要求1c.或1d.中所定义的多核苷酸，从而部分或完全失活权利要求1a.至1d.中所定义的多肽。

10.根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中导致权利要求1a.-1d.中定义的多肽生成减少或不生成的所述修饰是由于编码所述多肽的mRNA生成减少。

11.根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其包含编码目标化合物的至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的至少一种多核苷酸。

12.根据权利要求11所述的突变微生物宿主细胞，其中编码目标化合物的所述至少一种多核苷酸或编码在目标化合物的生成中所涉及的化合物的所述至少一种多核苷酸与启动子、优选与诱导型启动子可操作地连接。

13.根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其中所述启动子为碳水化合物诱导型启动子，优选为选自淀粉诱导型启动子的启动子，更优选为葡糖淀粉酶启动子、酸稳定性淀粉酶启动子、α-淀粉酶启动子和TAKA淀粉酶启动子。

14.根据前述权利要求中任一项所述的突变微生物宿主细胞，其为真核细胞，更优选为真菌细胞，甚至更优选地所述突变微生物宿主细胞为丝状真菌。

15.根据权利要求14所述的突变微生物宿主细胞，其为选自曲霉菌(Aspergillus)、支顶孢菌(Acremonium)、毁丝霉菌(Myceliophthora)、梭孢壳菌(Thielavia)、金孢菌(Chrysosporium)、青霉菌(Penicillium)、篮状菌(Talaromyces)、Rasamsonia、镰刀菌(Fusarium)或木霉菌(Trichoderma)的丝状真菌，优选黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、阿拉巴门支顶孢菌(Acremoniumalabamense)、嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)、土生梭孢壳菌(Thielaviaterrestris)、勒克瑙金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、Rasamsoniaemersonii、埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)、里氏木霉(Trichodermareesei)或产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)的物种。

16.一种生成根据前述权利要求中任一项的突变微生物宿主细胞的方法，其包括以下步骤：

a.提供亲本微生物宿主细胞；

b.修饰所述亲本微生物宿主细胞，优选修饰所述亲本微生物宿主细胞的基因组，以产生如果与亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量，在选自以下的多肽的生成上缺陷的突变微生物宿主细胞：

(i)根据SEQIDNO:3的多肽或与其至少70％相同的多肽，优选具有根据SEQIDNO:3的多肽的至少一种活性的与其至少70％相同的多肽；

(ii)SEQIDNO:3中包含的成熟多肽或与其至少70％相同的多肽，优选与其至少70％相同并且具有SEQIDNO:3中包含的成熟多肽的至少一种活性的多肽；

(iii)根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的或与SEQIDNO:1或2至少70％相同的多核苷酸编码的多肽，其中根据SEQIDNO:1或1的多核苷酸编码的所述多肽优选具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性；

(iv)能够与根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交或能够与SEQIDNO:1或2的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽，其中所述多肽优选具有根据SEQIDNO:1或2的多核苷酸编码的多肽的至少一种活性。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述突变微生物宿主细胞为根据权利要求1-15中任一项所述的突变微生物宿主细胞。

18.一种通过微生物发酵生成目标化合物的方法，其包括：

a.提供能够表达所述目标化合物的根据权利要求1-15中任一项所述的或通过根据权利要求16或17的方法生成的突变微生物宿主细胞，

b.在有益于表达所述目标化合物的条件下培养所述突变微生物宿主细胞，

c.任选地从培养基中分离所述目标化合物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述目标化合物为选自生物质、生物聚合物、代谢产物的生物化合物，优选地所述目标化合物选自生物聚合物或代谢产物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述生物聚合物选自核酸、聚胺、多元醇、多肽(例如蛋白质，优选酶)或聚酰胺或多糖，或代谢产物选自初级或次级代谢产物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述目标化合物为酶，优选为葡萄糖氧化酶。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中如果与使用未被修饰的亲本微生物宿主细胞来生成目标化合物的方法的产率相比，在相同条件下测量时，所述目标化合物的产率增加，优选其中所述产率增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％，更优选至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少160％、至少170％、至少180％、至少190％或至少200％，甚至更优选至少210％、至少220％、至少230％、至少240％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％或至少300％。