JP2015522288A - ＡｇｓＥ欠損株 - Google Patents

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Abstract

本発明は、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ＡｇｓＥタンパク質の産生又はその相同体の産生が欠損している変異微生物宿主細胞に関する。意外にも、本発明に係る変異微生物宿主細胞を、目的の化合物、例えば酵素の作製方法において使用すると、修飾されていない親宿主細胞が使用される方法と比較した場合に、同じ条件下で計測したとき、前記化合物の収率の向上が達成されることが分かった。

Description

発明の詳細な説明
［発明の分野］
本発明は、ポリペプチドの産生の欠損をもたらすように好ましくはそのゲノムが修飾されている変異微生物宿主細胞、その変異微生物宿主細胞の作製方法及び前記変異微生物宿主細胞を使用した目的の化合物の作製方法に関する。
［発明の背景］
異なる工業目的には異なる宿主細胞型が用いられ得る。例えば：哺乳類細胞系は抗体産生に用いられ；真菌細胞はポリペプチド及び二次代謝産物の産生に好ましい生物であり；細菌細胞は小型代謝産物及び抗生物質産生に好ましく；及び植物細胞は呈味及び風味化合物に好ましい。
かかる宿主細胞の生産性及び／又はそれが使用されるプロセスを最適化するため、組換え技術が広く用いられている。これには複数の選択肢が含まれ得る。
一部の技術は、宿主細胞において目的の化合物をコードする目的の遺伝子の過剰発現を目標とし得る。遺伝子発現はいくつかの方法で調整することができる。
例えば、目的の遺伝子を宿主細胞において前記細胞に好適な強力なプロモーターの発現制御下に置いてもよい。これは、プラスミド又はベクター介在性の形質転換によって、宿主細胞に発現カセットを導入することにより起こり得る。次に、発現カセットに含まれるプロモーターが適切に機能するのに必要な誘導条件下で形質転換宿主細胞を培養することにより、目的の化合物の作製を達成し得る。例えば米国特許第５７２２８５４７号明細書は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の形質転換によりそこでのポリペプチドの発現を得るために使用されるＤＮＡコンストラクトの使用について記載しており、このＤＮＡコンストラクトは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）における転写を促進する、且つ前記ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された誘導性プロモーターＤＮＡを含む。
転写活性化因子は、ＲＮＡポリメラーゼと目的の遺伝子の発現を制御するプロモーターとの結合を促進する調節タンパク質であることが知られている。遺伝子発現は、例えば、特異的な転写活性化因子を高量で産生する変異宿主細胞を使用して調整することができ、前記転写活性化因子により活性化されるプロモーターの制御下にある目的の遺伝子の発現増加がもたらされる。かかる手法は、例えば、ＰｒｔＴ転写活性化因子及びその使用に関する国際公開第２００６／０４０３１２号パンフレットに記載されている。
さらに代替的な手法では、その遺伝子の発現に使用される宿主細胞における目的の遺伝子のコピー数を増加させることにより、遺伝子発現を改善することができる。しかしながら、発現させる遺伝子のコピーを多く含む組換え宿主細胞は不安定になり得るため、宿主細胞中に存在する遺伝子コピーの数は制限因子である。この問題の解決法が国際公開第９８４６７７２号パンフレットに提供され、これは複数の実質的に相同なＤＮＡドメインを含む安定な糸状菌類について記載しており、ここでは前記ドメインの少なくとも２つに、目的の化合物をコードする組換えＤＮＡ分子の組み込まれたコピーが存在する。
宿主細胞による目的の化合物の生産性の向上を目標とするさらに他の手法には、競合する経路の欠失又は不活性化、酵素の区画化の変更、タンパク質又は代謝産物分泌の増加、細胞小器官内容物の増加などが含まれる。
宿主細胞における目的の化合物の発現について理解が進んでいるにも関わらず、依然として商業的又は工業的規模で重要な目的の化合物の産生を増加させる方法が求められている。意外にも、本発明者らは、目的の化合物、例えば目的の酵素を発現する微生物宿主細胞、例えば糸状菌宿主細胞におけるａｇｓＥ遺伝子の下方制御が、前記宿主細胞による前記酵素の産生増加をもたらしたことを見出した。
［発明の概要］
本発明は、
修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、
ａ．配列番号３に記載のポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一のポリペプチド、好ましくは、それと少なくとも７０％同一の、配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一のポリペプチド、好ましくは、それと少なくとも７０％同一の、配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
ｃ．配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるか又は配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドが、配列番号１又は２によりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有する、ポリペプチド；
ｄ．配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２の相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２によりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有するポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドの産生の欠損をもたらすように好ましくはそのゲノムが修飾されている変異微生物宿主細胞に関する。
本発明はさらに、
ａ．親微生物宿主細胞を提供するステップ；
ｂ．親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、
（ｉ）配列番号３に記載のポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一のポリペプチド、好ましくは、それと少なくとも７０％同一の、配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一のポリペプチド、好ましくは、それと少なくとも７０％同一の、配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるか又は配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドが、配列番号１又は２によりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有する、ポリペプチド；
（ｉｖ）配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２の相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２によりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有するポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドの産生が欠損している変異微生物宿主細胞を生じるように親微生物宿主細胞を修飾するステップ、好ましくは親微生物宿主細胞のゲノムを修飾するステップ：
を含む、本発明に係る変異微生物宿主細胞の作製方法に関する。
本発明はまた、
ａ．本発明に係るか、又は本発明に係る変異微生物宿主細胞の作製方法により作製された、目的の化合物の発現能を有する変異微生物宿主細胞を提供するステップ、
ｂ．目的の化合物の発現を促す条件下で前記微生物宿主細胞を培養するステップ、
ｃ．任意選択で、培養培地から目的の化合物を単離するステップ
を含む、微生物発酵による目的の化合物の作製方法にも関する。
ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）グルコースオキシダーゼ酵素遺伝子の発現に使用されるｐＧＢＴＯＰ−１２ベースのプラスミド、ｐＧＢＴＯＰＧＯＸ−３を、グルコアミラーゼプロモーターにより駆動される発現及び適応ＢａｍＨＩアンプリコンにおける標的組込みのレイアウトを含めて示す。 Ｌ０１リパーゼ酵素（国際公開第２００９／１０６５７５号パンフレットに記載されるとおり）の発現に使用されるｐＧＢＴＯＰ−１２ベースのプラスミド、ｐＧＢＴＯＰＬＩＰ−２を、そこにクローニングされるＬ０１遺伝子並びにグルコアミラーゼプロモーターにより駆動される発現及び適応ＢａｍＨＩアンプリコンにおける標的組込みのレイアウトを含めて示す。 ブタホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）酵素の発現に使用されるｐＧＢＴＯＰ−１２ベースのプラスミド、ｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２を、そこにクローニングされるＧＬＡ−ＰＬＡ２コード遺伝子並びにグルコアミラーゼプロモーターにより駆動される発現及び適応ＢａｍＨＩアンプリコンにおける標的組込みのレイアウトを含めて示す。 アミラーゼをコードするａｇｄＢ遺伝子の欠失に使用されるプラスミドｐＧＢＤＥＬ−ＡＭＹ１を、他の欠失コンストラクト（即ちｐＧＢＤＥＬ−ＡＭＹ２、及びｐＧＢＤＥＬ−ＡＭＹ４）を代表するレイアウトと共に示す。 種々の株の培養上清中で計測したときの、相対グルコースオキシダーゼ活性を示す。４日目におけるＰＧＯＸ−２基準株の活性を１００％レベルに設定した。 種々の変異株のオンプレートでのグルコースオキシダーゼ活性を示す。１％マルトース上で成長させ、４日間成長させた後にｏ−アニシジン染色を行った。 示すとおりの種々の株を４日目に培養上清中で測定したときの相対リパーゼ活性を示す。２つのＬＩＰ２基準株のうち一方の活性を１００％レベルに設定した。 示すとおりの株を５日間発酵させた後に培養上清中で測定したときの相対ＰＬＡ２活性を示す。ＰＬＡ２基準株の活性を１００％レベルに設定した。
［配列表の説明］
配列番号１は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のａｇｓＥ遺伝子のゲノム配列を、２ｋｂ上流及び下流のフランキング領域を含めて示す。このゲノム配列は、配列番号２に記載のｃＤＮＡ配列を含む。
配列番号２は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｇｓＥ遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号３は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のＡｇｓＥタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、配列番号３のアミノ酸２０〜２４２６に対応する成熟ＡｇｓＥタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のａｇｄＢ遺伝子のゲノム配列を、２ｋｂ上流及び下流のフランキング領域を含めて示す。このゲノム配列は、配列番号６に記載のｃＤＮＡ配列を含む。
配列番号６は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｇｄＢ遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号７は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のＡｇｄＢタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のａｇｄＡ遺伝子のゲノム配列を、２ｋｂ上流及び下流のフランキング領域を含めて示す。このゲノム配列は、配列番号９に記載のｃＤＮＡ配列を含む。
配列番号９は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｇｄＡ遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号１０は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のＡｇｄＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）由来のグルコースオキシダーゼのコドンペア最適化ｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号１２は、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）由来のグルコースオキシダーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＣアミラーゼ遺伝子のゲノム配列を、２ｋｂ上流及び下流のフランキング領域を含めて示す。このゲノム配列は、配列番号２に記載のｃＤＮＡ配列を含む。
配列番号１４は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＣアミラーゼ遺伝子（短い配列）のｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号１５は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＣアミラーゼタンパク質（短い配列）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、配列番号１５のアミノ酸１７〜４９３に対応するＡｍｙＣ成熟アミラーゼタンパク質（短い配列）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＣアミラーゼ遺伝子（長い配列）のｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号１８は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＣアミラーゼタンパク質（長い配列）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、配列番号１８のアミノ酸１７〜５２４に対応するＡｍｙＣ成熟アミラーゼタンパク質（長い配列）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、融合したプロＰＬＡ２（ブタホスホリパーゼＡ２）と融合したＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の天然グルコアミラーゼＡ遺伝子を含む融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
全てのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）遺伝子ヌクレオチド配列及びタンパク質配列並びにそれらのゲノムコンテクストは、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のＮＣＢＩ又はＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／）から入手可能な公開データベースから得ることができる。例えば、ＥＭＢＬにおいてＣＢＳ ５１３．８８のゲノム配列は、受託番号がＡＭ２６９９４８〜ＡＭ２７０４１５である。
［発明の詳細な説明］
本発明は、
修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、
ａ．配列番号３に記載のポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一の、且つ好ましくは配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一の、且つ好ましくは配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
ｃ．配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるか又は配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドが、配列番号１又は２によりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有する、ポリペプチド；
ｄ．配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２の相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２によりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有するポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドの産生の欠損をもたらすように好ましくはそのゲノムが修飾されている変異微生物宿主細胞に関する。
意外にも、本発明に係る、且つ目的の化合物の発現能を有する変異微生物宿主細胞を、目的の化合物、例えば酵素の作製方法において使用すると、親宿主細胞が使用される方法と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、前記化合物の収率の向上が達成されることが分かった。
加えて、本発明に係る、且つ目的の化合物の発現能を有する変異微生物宿主細胞を、目的の化合物の作製方法において使用すると、変異微生物宿主細胞を含む発酵ブロスが著しく低い粘度を示すことが見出された。この特性は、それにより本発明の変異微生物宿主細胞が使用される発酵プロセスを少ないエネルギーを用いて実施する又はより集約的に実施することが可能になるため、工業規模のプロセスに特に適している。
本発明の文脈の中で「同じ条件下で測定した」又は「同じ条件下で分析した」とは、変異型微生物宿主細胞と親微生物宿主細胞とが同じ条件下で培養されること、及び親微生物宿主細胞と比較した場合に変異宿主細胞が欠損しているポリペプチドの量及び／又は活性が、それぞれ微生物宿主細胞及び親宿主細胞において、同じ条件を使用して、好ましくは同じアッセイ及び／又は方法を用いることによって、より好ましくは同じ実験の範囲内で測定されることを意味する。
「変異微生物宿主細胞」は、親宿主細胞から誘導される微生物宿主細胞であって、その由来の親宿主細胞と比較した場合に異なる遺伝子型及び／又は異なる表現型を獲得するように、親宿主細胞と比較した場合に好ましくはそのゲノムが修飾されている微生物宿主細胞として本明細書によって定義される。
修飾はいずれも以下により生じさせることができる
ａ）親微生物宿主細胞を組換え遺伝子操作技法に供すること；及び／又は
ｂ）親微生物宿主細胞を（古典的）突然変異誘発に供すること；及び／又は
ｃ）親微生物宿主細胞を化合物又は組成物の阻害に供すること。
例えば配列番号３に記載のポリペプチドなどの産物の「産物の産生の欠損がもたらされるように好ましくはそのゲノムが修飾されている変異微生物宿主細胞」は、本明細書では、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較して、同じ条件下で分析したとき、細胞が：ａ）より少ない産物を産生するか又は実質的に全く産生しない、及び／又はｂ）活性が低下した若しくは比活性が低下した産物又は活性を有しない若しくは比活性を有しない産物を産生する、及びこれらの可能性の１つ以上の組み合わせである表現型特徴がもたらされるように好ましくはそのゲノムが修飾されている変異微生物宿主細胞として定義される。
本発明の文脈において、本発明に係る変異微生物宿主細胞はポリペプチドの産生が欠損している。前記ポリペプチドは好ましくは、好ましくはグリコシドヒドロラーゼ活性である酵素活性、より好ましくは、α−アミラーゼ活性［ＥＣ３．２．１．１］、イソアミラーゼ活性、イヌリナーゼ活性、インベルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２６］、マルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２０］、イソマルターゼ活性、プルラナーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、シクロデキストリナーゼ活性、キトサナーゼ活性、デキストラナーゼ活性、スクラーゼ−イソマルターゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、グリコーゲン脱分枝酵素活性からなる群から選択される酵素活性を有する。
別の実施形態において、前記ポリペプチドは好ましくは、α−グルコノトランスフェラーゼ活性である酵素活性、グリコシドトランスフェラーゼ又はグリコシドシンターゼ活性である酵素活性、より好ましくは、グリコーゲン分枝酵素活性、α−１，３−グルカンシンターゼ酵素活性［ＥＣ２．４．１．１８３］、α−１，４−グルカンシンターゼ活性、α−１，６−グルカンシンターゼ活性、β−１，３−グルカンシンターゼ活性、β−１，４−グルカンシンターゼ活性、β−１，６−グルカンシンターゼ活性、グルコアミラーゼ活性、マルトペンタオース形成アミラーゼ活性、マルトヘキサオース形成アミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、α−グルコシダーゼＩＩ活性、α−キシロシダーゼ活性からなる群から選択される酵素活性を有する。
このポリペプチドは、
ａ．配列番号３に記載のポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一の、且つ好ましくは配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一の、好ましくは配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
ｃ．配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるか又は配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドが、配列番号１又は２によりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有する、ポリペプチド；
ｄ．配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２の相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２によりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有するポリペプチド；
からなる群から選択される。
配列番号３に記載のポリペプチドは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来の推定α−１，３−Ｄ−グルカンシンターゼａｇｓＥに対応する（Ｙｕａｎ Ｘ．−Ｌ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｋａａｉｊ Ｒ．Ｍ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．，Ｐｕｎｔ Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａｒｅｌ Ｍ．Ｊ．Ｅ．Ｃ．，Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ Ｌ．，Ｒａｍ Ａ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００８）２７９：５４５−５６１）。配列番号３に記載のポリペプチドは、ａｇｓＥ遺伝子（配列番号１に示すとおりのゲノムＤＮＡ、配列番号２に示すとおりのｃＤＮＡ）によりコードされる。
本発明の文脈において、配列番号３と少なくとも７０％同一のポリペプチドは、配列番号３のポリペプチドと比較した場合に１つ以上のアミノ酸の１つ以上の置換、欠失、及び／又は挿入を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるポリペプチドであって、好ましくは配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの酵素活性を有するポリペプチドである。従って配列番号３に記載のポリペプチド及びそれと少なくとも７０％同一のポリペプチドは、好ましくは少なくとも１つの酵素活性を共通して有する。前記少なくとも１つの酵素活性は、好ましくはグリコシドヒドロラーゼ活性であり、より好ましくは、α−アミラーゼ活性［ＥＣ３．２．１．１］、イソアミラーゼ活性、イヌリナーゼ活性、インベルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２６］、マルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２０］、イソマルターゼ活性、プルラナーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、シクロデキストリナーゼ活性、キトサナーゼ活性、デキストラナーゼ活性、スクラーゼ−イソマルターゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、グリコーゲン脱分枝酵素活性からなる群から選択される酵素活性である。
別の実施形態において、前記酵素活性は：α−グルコノトランスフェラーゼ活性であり、酵素活性は好ましくはグリコシドトランスフェラーゼ又はグリコシドシンターゼ活性、より好ましくは、グリコーゲン分枝酵素活性、α−１，３−グルカンシンターゼ酵素活性［ＥＣ２．４．１．１８３］、α−１，４−グルカンシンターゼ活性、α−１，６−グルカンシンターゼ活性、β−１，３−グルカンシンターゼ活性、β−１，４−グルカンシンターゼ活性、β−１，６−グルカンシンターゼ活性、グルコアミラーゼ活性、マルトペンタオース形成アミラーゼ活性、マルトヘキサオース形成アミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、α−グルコシダーゼＩＩ活性、α−キシロシダーゼ活性からなる群から選択される酵素活性である。
配列番号３と少なくとも７０％同一の、且つ配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの（酵素）活性を有するポリペプチドは、配列番号３に記載のポリペプチドと比べて高い又は低い前記少なくとも１つの活性を有し得る。配列番号３と少なくとも７０％同一のポリペプチドは、例えば、配列番号３の天然変異体、オルソログ又は例えば古典的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ＤＮＡシャフリング及びインシリコ設計などの当該技術分野において周知の方法を用いて得られたインビトロ生成変異体であってもよい。本発明の文脈において、配列番号３と少なくとも７０％同一のポリペプチドは、配列番号３と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、配列番号３に記載のポリペプチドの好ましくは２０％〜４００％の酵素活性を有し、より好ましくは４０〜３５０％の活性、さらにより好ましくは５０〜３００％の活性、７０〜２５０％の活性、８０〜２００％の活性、最も好ましくは約１００％の活性を有する。活性とは、本明細書によって、上述のとおりの酵素活性が意図される。配列番号３に記載のポリペプチド及びそれと少なくとも７０％同一の、且つ配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの酵素活性を有するポリペプチドにおける少なくとも１つの酵素活性の測定には、前記比活性を測定するための当該技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。ただ一つの要件は、配列番号３に記載のポリペプチド及びそれと少なくとも７０％同一のポリペプチドにおける前記活性の測定が、同じ方法及び／又はアッセイ且つ同じ条件下で、好ましくは同じ実験の範囲内で実施されることである。α−アミラーゼ活性は、好ましくは、実験セッションに記載されるα−アミラーゼ活性を決定するための十分に確立されたセラルファ（Ｃｅｒａｌｐｈａ）法により測定され得る。α−１，３−グルカンシンターゼ活性は、「Ｔｓｕｍｏｒｉ Ｈ．，Ｓｈｉｍａｍｕｒａ Ａ．，Ｍｕｋａｓａ Ｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８５）１３１：５５３−５５９」に記載される方法により測定され得る。好ましくはポリペプチドは配列番号３と少なくとも８０％同一であり、より好ましくは配列番号３と少なくとも８５％同一であり、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは配列番号３と少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、９３％、９４％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、９７％、９８％、少なくとも９９％同一である。好ましくはポリペプチドは、配列番号３に記載のポリペプチドである。好ましくは配列同一性は、ポリペプチド配列の全長にわたり測定される。
本発明に係る変異微生物宿主細胞に産生が欠損しているポリペプチドは、配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドであってもよい。成熟ポリペプチドは、本明細書では、翻訳、翻訳後修飾、例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化、リン酸化、分泌及び（タンパク質分解性の）切断によるリーダー配列の任意選択の除去を経たその最終形態のポリペプチドとして定義される。シグナルペプチド、プロペプチド及びプレプロペプチドが、当該技術分野では時に「リーダー配列」と称されることもある。用語「プロペプチド」は、本明細書では、生物学的活性を有するポリペプチドのＮ末端にインフレームで融合したペプチドとして定義される。得られるポリペプチドは、ポリペプチドの生物学的活性を欠いているプロポリペプチドとして知られ、プロポリペプチドからプロペプチドが触媒的又は自己触媒的に切断されることにより、成熟した生物学的に活性なポリペプチドに変換され得る。本明細書では、シグナルペプチド及びプロペプチドは、合わせて「プレプロペプチド」と称される。「シグナル配列」は、本明細書では、プロペプチドのＮ末端にインフレームで融合しているペプチドであって、そのプロペプチドが、生物学的活性を有するポリペプチドのＮ末端にインフレームで融合しているペプチドとして定義される。ある場合にはプロペプチドがなく、シグナル配列がポリペプチドのＮ末端にインフレームで融合している。シグナル配列の機能は、ポリペプチドを細胞分泌経路に向かわせることである。
従って配列番号３は、ｍＲＮＡから翻訳された、且つ翻訳後修飾前の配列であってもよい。配列番号３は、そこに含まれる成熟ポリペプチドと比較した場合に、Ｃ末端及び／又はＮ末端のいずれかにさらなるアミノ酸を含み得る。配列番号３は、例えば、そのシグナルペプチド、プロペプチド及び／又はプレプロペプチドにインフレームで連結された成熟ポリペプチドを含み得る。好ましい実施形態において、配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸２０〜２４２６に対応し、配列番号４に示される。従って、一実施形態において本発明に係る変異微生物宿主細胞は、配列番号４に記載の成熟ポリペプチドであるポリペプチドを欠損している。
本発明の文脈において、変異微生物細胞に産生が欠損しているポリペプチドは、本明細書に定義するとおりの成熟ポリペプチドと少なくとも７０％同一の、且つ前記成熟ポリペプチドの本明細書に定義するとおりの少なくとも１つの活性を好ましくは有するポリペプチドであり得る。従って本明細書に定義するとおりの配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド、好ましくは配列番号４に記載の成熟ポリペプチド及びそれと少なくとも７０％同一のポリペプチドは、好ましくは少なくとも１つの酵素活性を共通して有する。前記少なくとも１つの酵素活性は、好ましくはグリコシドヒドロラーゼ活性であり、より好ましくは、α−アミラーゼ活性［ＥＣ３．２．１．１］、イソアミラーゼ活性、イヌリナーゼ活性、インベルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２６］、マルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２０］、イソマルターゼ活性、プルラナーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、シクロデキストリナーゼ活性、キトサナーゼ活性、デキストラナーゼ活性、スクラーゼ−イソマルターゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、グリコーゲン脱分枝酵素活性からなる群から選択される酵素活性である。
別の実施形態において、前記酵素活性は：α−グルコノトランスフェラーゼ活性であり、酵素活性は、好ましくはグリコシドトランスフェラーゼ又はグリコシドシンターゼ活性、より好ましくは、グリコーゲン分枝酵素活性、α−１，３−グルカンシンターゼ酵素活性［ＥＣ２．４．１．１８３］、α−１，４−グルカンシンターゼ活性、α−１，６−グルカンシンターゼ活性、β−１，３−グルカンシンターゼ活性、β−１，４−グルカンシンターゼ活性、β−１，６−グルカンシンターゼ活性、グルコアミラーゼ活性、マルトペンタオース形成アミラーゼ活性、マルトヘキサオース形成アミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、α−グルコシダーゼＩＩ活性、α−キシロシダーゼ活性からなる群から選択される酵素活性である。
好ましくはポリペプチドは、本明細書に定義するとおりの成熟ポリペプチドと少なくとも８０％同一であり、より好ましくは本明細書に定義するとおりの成熟ポリペプチドと少なくとも８５％同一であり、さらにより好ましくは本明細書に定義するとおりの成熟ポリペプチドと少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは本明細書に定義するとおりの成熟ポリペプチドと少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、９３％、９４％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、９７％、９８％、少なくとも９９％同一である。好ましくはポリペプチドは、配列番号４に記載の成熟ポリペプチドである。好ましくは配列同一性は、ポリペプチド配列の全長にわたり測定される。
本発明の文脈において、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチド又は配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドは、上記に定義するとおりの配列番号３に記載のポリペプチド、配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド、配列番号４に記載のポリペプチド又は配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチド、配列番号４に記載のポリペプチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明の文脈において、配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドは、配列番号１又は２のポリヌクレオチドと比較した場合に１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の置換、欠失、及び／又は挿入を含むヌクレオチド配列によって特徴付けられるポリヌクレオチドである。好ましくはポリヌクレオチドは、配列番号１又は２と少なくとも８０％同一であり、より好ましくは配列番号１又は２と少なくとも８５％同一であり、さらにより好ましくは配列番号１又は２と少なくとも９０％同一であり、最も好ましくは配列番号１又は２と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、９７％、９８％、少なくとも９９％同一である。好ましくはポリヌクレオチドは、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドである。好ましくは配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、配列番号１又は２によりコードされるポリペプチドの本明細書に定義するとおりの少なくとも１つの酵素活性を有する。従って配列番号１又は２によりコードされるポリペプチド及び配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、少なくとも１つの酵素活性を共通して有する。前記少なくとも１つの酵素活性は、好ましくはグリコシドヒドロラーゼ活性であり、より好ましくは、α−アミラーゼ活性［ＥＣ３．２．１．１］、イソアミラーゼ活性、イヌリナーゼ活性、インベルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２６］、マルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２０］、イソマルターゼ活性、プルラナーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、シクロデキストリナーゼ活性、キトサナーゼ活性、デキストラナーゼ活性、スクラーゼ−イソマルターゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、グリコーゲン脱分枝酵素活性からなる群から選択される酵素活性である。
別の実施形態において、前記酵素活性は：α−グルコノトランスフェラーゼ活性であり、酵素活性は好ましくは、グリコシドトランスフェラーゼ又はグリコシドシンターゼ活性、より好ましくは、グリコーゲン分枝酵素活性、α−１，３−グルカンシンターゼ酵素活性［ＥＣ２．４．１．１８３］、α−１，４−グルカンシンターゼ活性、α−１，６−グルカンシンターゼ活性、β−１，３−グルカンシンターゼ活性、β−１，４−グルカンシンターゼ活性、β−１，６−グルカンシンターゼ活性、グルコアミラーゼ活性、マルトペンタオース形成アミラーゼ活性、マルトヘキサオース形成アミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、α−グルコシダーゼＩＩ活性、α−キシロシダーゼ活性からなる群から選択される酵素活性である。
本発明の目的上、ここで、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列同一性パーセントの決定のため、最適比較を目的として配列がアラインメントされることを定義する。２つの配列間のアラインメントを最適化するため、比較される２つの配列の任意の配列にギャップが導入され得る。かかるアラインメントは、比較される配列の全長にわたり実行してもよい。或いは、アラインメントは、それより短い長さにわたり、例えば約２０、約５０、約１００個又はそれ以上の核酸／塩基又はアミノ酸にわたり実行してもよい。配列同一性は、報告されるアラインメント領域にわたる２つの配列間における同一マッチのパーセンテージである。
２つの配列間における配列比較及び配列同一性パーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。当業者は、２つの配列のアラインメント及び２つの配列間の同一性の決定に利用可能ないくつかの種々のコンピュータプログラムを利用可能であるということを承知しているであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）「配列比較の概観（Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）」，Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ及びＪ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（編）、「タイムワープ、ストリングエディット及び巨大分子：配列比較の理論と実践（Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）」，ｐｐ．１−４４，Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間における配列同一性のパーセンテージは、２つの配列のアラインメント用のニードルマン−ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを使用して決定し得る（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の両方を、このアルゴリズムによってアラインメントすることができる。ニードルマン−ブンシュアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明のためには、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮＥＥＤＬＥプログラムが用いられた（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，ｌ．及びＢｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列には、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換行列に使用される。ヌクレオチド配列には、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意選択のパラメータは、ギャップ開始ペナルティ１０及びギャップ伸長ペナルティ０．５である。当業者は、これらの種々のパラメータがいずれも僅かに異なる結果を生み出し得るが、２つの配列の全体的な同一性パーセンテージは別のアルゴリズムを使用しても大きくは変わらないことを理解するであろう。
上記に記載したとおりのプログラムＮＥＥＤＬＥによるアラインメント後、問い合わせ配列と本発明の配列との間の配列同一性のパーセンテージが以下のとおり計算される：アラインメントにおいて両配列で同一のアミノ酸又は同一のヌクレオチドを示す対応する位置の数を、アラインメントの全長からアラインメントにおけるギャップの総数を減じた差で除す。本明細書のとおり定義される同一性は、ＮＥＥＤＬＥから、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することにより求めることができ、プログラムの出力では「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ−ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と表示される。
本発明の核酸及びタンパク質配列はさらに、例えば他のファミリーメンバー又は関連する配列を同定するため、公開データベースの検索を実行するための「問い合わせ配列」として使用することができる。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行すると、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を求めることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行すると、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を求めることができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを求めるには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるとおりのギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する際には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／にあるホームページを参照のこと。
本発明の文脈において、本発明に係る変異微生物宿主細胞に産生が欠損していることがあり得るポリペプチドは、配列番号１又は２とのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドの相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであってもよく、好ましくはそのポリヌクレオチドは、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドの相補鎖との低いストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーション能を有し、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーション能を有し、さらにより好ましくは高いストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーション能を有する。好ましくは、配列番号１又は２とのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドの相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、配列番号１又は２によりコードされるポリペプチドと共通して少なくとも１つの酵素活性を有する。前記少なくとも１つの酵素活性は、好ましくはグリコシドヒドロラーゼ活性であり、より好ましくは、α−アミラーゼ活性［ＥＣ３．２．１．１］、イソアミラーゼ活性、イヌリナーゼ活性、インベルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２６］、マルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２０］、イソマルターゼ活性、プルラナーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、シクロデキストリナーゼ活性、キトサナーゼ活性、デキストラナーゼ活性、スクラーゼ−イソマルターゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、グリコーゲン脱分枝酵素活性からなる群から選択される酵素活性である。
別の実施形態において、前記酵素活性は：α−グルコノトランスフェラーゼ活性であり、酵素活性は、好ましくはグリコシドトランスフェラーゼ又はグリコシドシンターゼ活性、より好ましくは、グリコーゲン分枝酵素活性、α−１，３−グルカンシンターゼ酵素活性［ＥＣ２．４．１．１８３］、α−１，４−グルカンシンターゼ活性、α−１，６−グルカンシンターゼ活性、β−１，３−グルカンシンターゼ活性、β−１，４−グルカンシンターゼ活性、β−１，６−グルカンシンターゼ活性、グルコアミラーゼ活性、マルトペンタオース形成アミラーゼ活性、マルトヘキサオース形成アミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、α−グルコシダーゼＩＩ活性、α−キシロシダーゼ活性からなる群から選択される酵素活性である。
本明細書で使用されるとき、用語「ハイブリダイズする」は、少なくとも約６０％、６５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９５％及び最も好ましくは少なくとも９８％互いに同一のポリヌクレオチド配列が典型的に互いの相補体とハイブリダイズしたまま留まるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記載することが意図される。本明細書で使用されるとき、用語「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の実質的に相補的な鎖の対形成を意味する。一つの対形成機構には、オリゴマー化合物鎖の相補的なヌクレオチド塩基（ヌクレオチド）の間における水素結合（これはワトソン・クリック型、フーグスティーン型又は逆フーグスティーン型水素結合であってよい）が関わる。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成によって対になる相補核酸である。ハイブリダイゼーションは様々な環境下で起こり得る。「ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」又は「低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高いストリンジェンシー、又は極めて高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、本明細書では、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件、より具体的には、オリゴマー化合物がその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とは最小限の数しかハイブリダイズしない条件を記載するために使用される。従って、オリゴマー化合物は、他の配列よりも検出し得る程度に高度に標的配列とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション反応の実施に関する手引きは、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６：３．６を参照することができる。
当業者は、どの条件が低い、中程度の及び高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件に該当するかを分かっているであろう。かかる条件に関するさらなる手引きは、当該技術分野では、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編），１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）において容易に利用可能である。
ストリンジェンシー条件は配列に依存し、環境の違いによって異なり得る。長い配列ほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェンシー条件は、規定のイオン強度及びｐＨにおけるオリゴマー化合物の熱的融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、完全に一致するプローブに対してオリゴマー化合物の５０％がハイブリダイズする（規定のイオン強度及びｐＨ下における）温度である。ストリンジェンシー条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても実現し得る。
特異的ハイブリダイゼーション条件の例は、以下のとおりである：１）低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中約４５℃、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中少なくとも５０℃で２回洗浄（低いストリンジェンシー条件では、洗浄温度は５５℃まで増加させることができる）；２）中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、６×ＳＳＣ中約４５℃、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６０℃で１回以上の洗浄；３）高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、６×ＳＳＣ中約４５℃、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で１回以上洗浄；及び４）極めて高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中６５℃、続いて０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中６５℃で１回以上洗浄である。
本発明の文脈の中で、変異微生物宿主細胞は、その宿主細胞が好ましくはそのゲノムに修飾を含み、その修飾が、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、本明細書に定義するとおりのポリペプチドの産生の低下をもたらし又はその産生をなくすものである場合、及び／又は修飾を含み、その修飾が、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、（酵素）活性（この活性は本明細書に定義されている）が低下しているか又はそれを有しない本明細書に記載されるとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドをもたらすものである場合、本明細書に定義するとおりのポリペプチドの産生は欠損している。従って本明細書に定義するとおりの変異微生物宿主細胞は、以下の場合に本明細書に記載されるとおりのポリペプチドの産生が欠損している
ａ）それが、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した任意選択で少ない本明細書に定義するとおりのポリペプチドを産生するか、又はそれが本明細書に定義するとおりのポリペプチドを産生しない場合；及び／又は
ｂ）それが、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、活性が低下した又は活性を有しない本明細書に定義するとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドを産生する場合。
一実施形態において変異微生物宿主細胞は、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、１％少ない、少なくとも５％少ない、少なくとも１０％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、少なくとも９１％少ない、少なくとも９２％少ない、少なくとも９３％少ない、少なくとも９４％少ない、少なくとも９５％少ない、少なくとも９６％少ない、少なくとも９７％少ない、少なくとも９８％少ない、少なくとも９９％少ない、又は少なくとも９９．９％少ない本明細書に定義するとおりのポリペプチドを産生する。好ましくは変異微生物宿主細胞は、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、本明細書に記載されるとおりのポリペプチドを実質的に産生しない。
一実施形態において変異微生物宿主細胞は、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、１％低い本明細書に定義するとおりの（酵素）活性、少なくとも５％低い活性、少なくとも１０％低い活性、少なくとも２０％低い活性、少なくとも３０％低い活性、少なくとも４０％低い活性、少なくとも５０％低い活性、少なくとも６０％低い活性、少なくとも７０％低い活性、少なくとも８０％低い活性、少なくとも９０％低い活性、少なくとも９１％低い活性、少なくとも９２％低い活性、少なくとも９３％低い活性、少なくとも９４％低い活性、少なくとも９５％低い活性、少なくとも９６％低い活性、少なくとも９７％低い活性、少なくとも９８％低い活性、少なくとも９９％低い活性、又は少なくとも９９．９％低い活性を有する、本明細書に定義するとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドを産生する。好ましくは変異微生物宿主細胞は、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で分析した場合に、実質的に活性を有しない本明細書に記載されるとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドを産生する。
前記酵素活性は好ましくはグリコシドヒドロラーゼ活性であり、より好ましくは、α−アミラーゼ活性［ＥＣ３．２．１．１］、イソアミラーゼ活性、イヌリナーゼ活性、インベルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２６］、マルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２０］、イソマルターゼ活性、プルラナーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、シクロデキストリナーゼ活性、キトサナーゼ活性、デキストラナーゼ活性、スクラーゼ−イソマルターゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、グリコーゲン脱分枝酵素活性からなる群から選択される酵素活性である。
別の実施形態において前記酵素活性は：α−グルコノトランスフェラーゼ活性であり、酵素活性は好ましくは、グリコシドトランスフェラーゼ又はグリコシドシンターゼ活性、より好ましくは、グリコーゲン分枝酵素活性、α−１，３−グルカンシンターゼ酵素活性［ＥＣ２．４．１．１８３］、α−１，４−グルカンシンターゼ活性、α−１，６−グルカンシンターゼ活性、β−１，３−グルカンシンターゼ活性、β−１，４−グルカンシンターゼ活性、β−１，６−グルカンシンターゼ活性、グルコアミラーゼ活性、マルトペンタオース形成アミラーゼ活性、マルトヘキサオース形成アミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、α−グルコシダーゼＩＩ活性、α−キシロシダーゼ活性からなる群から選択される酵素活性である。
本発明に係る変異微生物宿主細胞における本明細書に定義するとおりのポリペプチドの産生の欠損は、そのゲノムが修飾された微生物宿主細胞によって産生される本明細書に定義するとおりの酵素活性を有するポリペプチドの量及び／又は（比）活性を決定することにより測定してもよく、及び／又はそれは、本明細書に記載されるとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡの量を決定することにより測定してもよく、及び／又はそれは、修飾されていない親宿主細胞と比較した場合の遺伝子又はゲノムシーケンシングにより測定してもよい。
ゲノムの修飾は、変異微生物宿主細胞のＤＮＡ配列を親の（非修飾）微生物宿主細胞の配列と比較することにより決定し得る。ＤＮＡのシーケンシング及びゲノムシーケンシングは、当業者に公知の標準的な方法を用いて、例えばサンガーシーケンシング技術及び／又は次世代シーケンシング技術、例えばＥｌａｉｎｅ Ｒ．Ｍａｒｄｉｓ（２００８），「次世代ＤＮＡシーケンシング方法（Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：３８７−４０２．（ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｇｅｎｏｍ．９．０８１３０７．１６４３５９）にレビューされるとおりのＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ２、Ｒｏｃｈｅ ４５４等を使用して行うことができる。
本明細書に記載されるとおりのポリペプチドの産生の欠損は、当業者に利用可能な本明細書に定義するとおりのポリペプチド酵素活性を測定するのに好適な任意のアッセイ、転写プロファイリング、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｑ−ＰＣＲ及びウエスタンブロッティングを用いて測定することができる。詳細には、細胞中に存在するｍＲＮＡ量の定量化は、例えばノーザンブロッティングにより実現してもよい（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９にある）。細胞中に存在する本明細書に記載されるとおりのポリペプチドの量の定量化は、例えばウエスタンブロッティングにより実現してもよい。また、ｍＲＮＡ量の差をＤＮＡアレイ解析によって定量化してもよい（Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．及びＢｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．「遺伝子発現解析用ＤＮＡアレイ（ＤＮＡ ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９，３０３：１７９−２０５）。
修飾、好ましくはゲノムの修飾は、１つ以上の修飾と解釈される。
修飾、好ましくはゲノムの修飾は、いずれも以下によって生じさせることができる
ａ）親微生物宿主細胞を組換え遺伝子操作技法に供すること；及び／又は
ｂ）親微生物宿主細胞を（古典的）突然変異誘発に供すること；及び／又は
ｃ）親微生物宿主細胞を化合物又は組成物の阻害に供すること。
（変異）微生物宿主細胞のゲノムの修飾は、本明細書では、細胞のゲノムにおいてポリヌクレオチド配列の変化をもたらす任意のイベントとして定義される。好ましい実施形態において、本発明に係る変異微生物宿主細胞は、以下を含む修飾、好ましくはそのゲノムにおける修飾を有する：
ａ）修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、本明細書に定義するとおりのポリペプチドの産生の低下をもたらし又はその産生をなくす修飾、及び／又は
ｂ）修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、本明細書に定義するとおりの（酵素）活性が低下しているか又はそれを有しない本明細書に定義するとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドをもたらす修飾。
修飾は、古典的な株改良、ランダム突然変異誘発と、続く選択により導入することができる。修飾はまた、部位特異的突然変異誘発によっても導入することができる。
修飾は、ポリヌクレオチド配列における１つ以上のヌクレオチドの導入（挿入）、代替（置換）又は除去（欠失）により達成し得る。本明細書に定義するとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの完全又は部分欠失を実現してもよい。代替例では、本明細書に定義するとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本明細書に定義するとおりのポリペプチドをコードしないか又は部分的若しくは完全に不活性型の本明細書に定義するとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列で部分的に又は完全に置き換えてもよい。さらに別の代替例では、本明細書に定義するとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、前記ポリヌクレオチドの破壊と、その結果としての、破壊されたポリヌクレオチドによりコードされる本明細書に定義するとおりのポリペプチドの部分的又は完全な不活性化をもたらす１つ以上のヌクレオチドを挿入することができる。
一実施形態において、本発明に係る変異微生物宿主細胞は、そのゲノムに以下から選択される修飾を含む
ａ）本明細書に定義するとおりのポリヌクレオチドの完全又は部分欠失、
ｂ）本明細書に定義するとおりのポリペプチドをコードしないか又は部分的若しくは完全に不活性型の本明細書に定義するとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列による、本明細書に定義するとおりのポリヌクレオチドの完全又は部分置換
ｃ）ポリヌクレオチド配列における１つ以上のヌクレオチドの挿入による本明細書に定義するとおりのポリヌクレオチドの破壊と、その結果としての、破壊されたポリヌクレオチドによりコードされる本明細書に定義するとおりのポリペプチドの部分的又は完全な不活性化。
この修飾は、例えば、コード配列にあっても、又は上記に記載したとおりのポリヌクレオチドの転写若しくは翻訳に必要な調節エレメントにあってもよい。例えば、終止コドンの導入、開始コドンの除去又はコード配列のオープンリーディングフレームの変化若しくはフレームシフトがもたらされるようにヌクレオチドを挿入又は除去し得る。コード配列又はその調節エレメントの修飾は、部位特異的又はランダム突然変異誘発、ＤＮＡシャフリング法、ＤＮＡ再構築法、遺伝子合成（例えば、Ｙｏｕｎｇ及びＤｏｎｇ，（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，（７） 電子アクセスｈｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｕｐｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｒｅｐｒｉｎｔ／３２／７／ｅ５９又はＧｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．（１９６８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，６０：１３３８−１３４４；Ｓｃａｒｐｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８２），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：３５６−３６５；Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３を参照）、又は当該技術分野において公知の方法におけるＰＣＲ生成突然変異誘発によって達成され得る。ランダム突然変異誘発手法の例は、例えば化学的（例えばＮＴＧ）突然変異誘発又は物理的（例えば紫外線）突然変異誘発など、当該技術分野において周知されている。部位特異的突然変異誘発手法の例は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、「Ｔｈｅ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ＩＩインビトロ突然変異誘発システム」（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、又はＧｅｎｅ．１９８９ Ａｐｒ １５；７７（１）：５１−９（Ｈｏ ＳＮ，Ｈｕｎｔ ＨＤ，Ｈｏｒｔｏｎ ＲＭ，Ｐｕｌｌｅｎ ＪＫ，Ｐｅａｓｅ ＬＲ「ポリメラーゼ連鎖反応を使用したオーバーラップ伸長による部位特異的突然変異誘発」）に記載されるとおりのＰＣＲを使用するか若しくはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ．（編者Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ及びＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ．ＩＳＢＮ １−８９８４８６−０１−８；１９９５，ＰＯ Ｂｏｘ １，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，Ｕ．Ｋ．）に記載されるとおりのＰＣＲを使用するオーバーラップ伸長によるものである。
好ましい修飾方法は、部分的若しくは完全な遺伝子置換又は部分的若しくは完全な遺伝子欠失などの組換え遺伝子操作技法に基づく。
例えば、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクト又は発現カセットの置換の場合、置換しようとする標的遺伝子座に適切なＤＮＡ配列を導入してもよい。適切なＤＮＡ配列は、好ましくはクローニングベクター上に存在する。好ましい組込みクローニングベクターはＤＮＡ断片を含み、これはポリヌクレオチドと相同であり、及び／又は置換しようとするポリヌクレオチドに隣接する遺伝子座と相同性を有することにより、クローニングベクターの組込みをこの所定の遺伝子座に標的化する。標的組込みを促進するため、クローニングベクターは、好ましくは細胞の形質転換前に線状化される。好ましくは、線状化は、クローニングベクターの少なくとも一端、しかし好ましくは両端に、置換しようとするＤＮＡ配列と相同な配列（又はフランキング配列）が隣接するように実施される。このプロセスは相同組換えと称され、この技法もまた、（部分的）遺伝子欠失を実現するために用いられ得る。
例えば、内因性ポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチドを、（完全に機能する）ポリペプチドを産生することができないポリヌクレオチドである欠陥ポリヌクレオチドに置き換えてもよい。相同組換えにより、欠陥ポリヌクレオチドが内因性ポリヌクレオチドに代わって置かれる。欠陥ポリヌクレオチドがマーカーもコードすることが望ましいこともあり、マーカーは、核酸配列が修飾されている形質転換体の選択に用いられ得る。
代わりに、又は記載した他の技法と組み合わせて、「糸状菌アスペルギルス・ニデュランスにおける高速の効率的遺伝子置換方法（Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）」（２０００）Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ，Ｍ−Ｋ．，Ｇｈｉｃｏ，Ｊ−Ｍ．及びｄ’Ｅｎｆｅｒｔ Ｃ；Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ ２８，ｎｏ ２２に記載されるとおり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコスミドのインビボ組換えに基づく技法を使用することができる。
或いは、前記宿主細胞が、本明細書に定義するとおりの、及び本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドなどのタンパク質をそれほど多く産生しないか又は全く産生しない修飾は、ポリヌクレオチドの核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を使用する確立されたアンチセンス技法によって実施され得る。より具体的には、ポリヌクレオチドの核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を導入することにより、それが細胞において転写され得るとともに、細胞で産生されるｍＲＮＡとのハイブリダイズ能を有することで、宿主細胞によるポリヌクレオチドの発現が低下又は消失し得る。従って、相補アンチセンスヌクレオチド配列とｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを可能にする条件下では、翻訳されるタンパク質の量が低下又は消失する。アンチセンス−ＲＮＡの発現の例が、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００ Ｆｅｂ；６６（２）：７７５−８２．（アスペルギルス・ニガーのタンパク質分泌経路におけるフォールダーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｏｌｄａｓｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ａ，ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、Ｎｇｉａｍ Ｃ，Ｊｅｅｎｅｓ ＤＪ，Ｐｕｎｔ ＰＪ，Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ ＣＡ，Ａｒｃｈｅｒ ＤＢ）又は（Ｚｒｅｎｎｅｒ Ｒ，Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ Ｌ，Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ Ｕ．、ジャガイモウリジン二リン酸グルコースピロホスホリラーゼの発現及びアンチセンスＲＮＡによるその阻害の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）．Ｐｌａｎｔａ．（１９９３）；１９０（２）：２４７−５２．）に示される。
一実施形態において、本発明に係る変異微生物宿主細胞は、本明細書に定義するとおりのポリペプチドの産生の低下をもたらし又はその産生をなくす修飾が、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、前記ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生が低下することに起因する変異微生物宿主細胞である。
本明細書に記載されるとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡの量の減少をもたらす修飾は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技法によって達成することができる（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｌｅｔｔ．２３７（２００４）：３１７−３２４）。この方法では、その発現が影響を受けることになるヌクレオチド配列の同じセンス及びアンチセンス部分が互いの後ろに、ヌクレオチドスペーサーを間に含んでクローニングされ、発現ベクターに挿入される。かかる分子が転写された後、小さいヌクレオチド断片の形成により、作用を受けようとするｍＲＮＡの標的分解が起こり得る。特定のｍＲＮＡの除去は様々な程度であり得る。国際公開第２００８／０５３０１９号パンフレット、国際公開第２００５／０５６７２Ａ１号パンフレット、国際公開第２００５／０２６３５６Ａ１号パンフレット、Ｏｌｉｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，「アスペルギルス・ニガーにおける遺伝子サイレンシングベクター構築のための効率的なクローニングシステム（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）」（２００８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８０（５）：９１７−９２４及び／又はＢａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，「アスペルギルス・ニガーで使用される分子ツールとしてのｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）」（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０（５）：８８５−８９０に記載されるＲＮＡ干渉技法を、この目的に使用することができる。
本明細書に定義するとおりの酵素活性が低下した又はそれを有しないポリペプチドをもたらす修飾は、種々の方法によって、例えばかかるポリペプチドに対する抗体によるか、或いは化学的阻害薬又はタンパク質阻害薬又は物理的阻害薬（Ｔｏｕｒ Ｏ．ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ：「遺伝子標的化発色団支援光不活性化（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌｉｇｈｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」．Ｖｏｌ．２１．ｎｏ．１２：１５０５−１５０８））或いはペプチド阻害薬又はアンチセンス分子又はＲＮＡｉ分子（Ｒ．Ｓ．Ｋａｍａｔｈ＿ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ：「ＲＮＡｉを使用したカエノラブディティス・エレガンスゲノムの系統的機能分析（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｇｅｎｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ＲＮＡｉ）」、ｖｏｌ．４２１，２３１−２３７）により得ることができる。
上述の技法に加えて、又は代替例として、本明細書に定義するとおりのポリペプチドの活性を阻害すること、又は本明細書に定義するとおりのポリペプチドを再局在化させることが、代替的なシグナル配列（Ｒａｍｏｎ ｄｅ Ｌｕｃａｓ，Ｊ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｏ，Ｐｅｒｅｚ Ｐ．，Ｉｓａｂｅｌ Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，Ｖａｌｅｎｃｉａｎｏ，Ｓ．及びＬａｂｏｒｄａ，Ｆ．「ａｃｕＨ遺伝子によりコードされるアスペルギルス・ニデュランスカルニチン担体はミトコンドリアにのみ局在する（Ｔｈｅ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｃｕＨ ｇｅｎｅ ｉｓ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．２００１ Ｊｕｌ ２４；２０１（２）：１９３−８）若しくは保留シグナル（Ｄｅｒｋｘ，Ｐ．Ｍ．及びＭａｄｒｉｄ，Ｓ．Ｍ．「フォールダーゼＣＹＰＢはアスペルギルス・ニガーの分泌経路の構成要素であり、小胞体保留シグナルを含む（Ｔｈｅ ｆｏｌｄａｓｅ ＣＹＰＢ ｉｓ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｎｄ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）」 ＨＥＥＬ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００１ Ｄｅｃ；２６６（４）：５３７−５４５）を用いることによるか、又は細胞の分泌経路に関与する細胞の膜構造との融合能を有するペルオキシソームをポリペプチドの標的とすることで、ポリペプチドの細胞外への分泌を生じさせる（例えば国際公開第２００６／０４０３４０号パンフレットに記載されるとおり）ことによってもまた可能である。
それに代えて、又は上述の技法と組み合わせて、本明細書に定義するとおりのポリペプチド酵素活性の阻害はまた、例えば、紫外線又は化学的突然変異誘発（Ｍａｔｔｅｒｎ，Ｉ．Ｅ．，ｖａｎ Ｎｏｏｒｔ Ｊ．Ｍ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ａｒｃｈｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｉ．Ｎ．及びｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．，「細胞外プロテアーゼを欠損したアスペルギルス・ニガーの突然変異体の単離及び特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）」．Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９２ Ａｕｇ；２３４（２）：３３２−６）によるか、又は本明細書に記載されるとおりのポリペプチドの酵素活性を阻害する阻害薬（例えばノジリマイシン、これはβ−グルコシダーゼの阻害薬として機能する（Ｃａｒｒｅｌ Ｆ．Ｌ．Ｙ．及びＣａｎｅｖａｓｃｉｎｉ Ｇ．Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）３７（６）：４５９−４６４；Ｒｅｅｓｅ Ｅ．Ｔ．，Ｐａｒｒｉｓｈ Ｆ．Ｗ．及びＥｔｔｌｉｎｇｅｒ Ｍ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９７１）３８１−３８８））の使用により達成することもできる。
本発明に係る実施形態において、本発明に係る変異微生物宿主細胞のゲノムの修飾は、上記に定義するとおりの、ポリペプチドをコードする上記に定義するとおりのポリヌクレオチドの少なくとも１つの位置における修飾である。
本発明の文脈において「親微生物宿主細胞」及び「変異微生物宿主細胞」は、任意の種類の宿主細胞であってよい。変異微生物宿主細胞の具体的な実施形態は、以下に記載する。当業者には、特に指示されない限り、変異微生物宿主細胞に適用し得る実施形態を同様に親微生物宿主細胞にも適用し得ることは明らかであろう。
本発明に係る変異微生物宿主細胞は原核細胞であってよい。好ましくは、原核生物宿主細胞は細菌細胞である。用語「細菌細胞」には、グラム陰性及びグラム陽性の両方の微生物が含まれる。好適な細菌は、例えば、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、カウロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｔ）、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）（シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ））、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）又はストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から選択され得る。好ましくは、細菌細胞は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．プンチス（Ｂ．ｐｕｎｔｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｇ．オキシダンス（Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｔ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）ＣＢ １５、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス・カルノスス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｏｔｉ）及びリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される。
ある実施形態によれば、本発明に係る変異微生物宿主細胞は真核生物宿主細胞である。好ましくは、真核細胞は、哺乳類、昆虫、植物、真菌、又は藻類細胞である。好ましい哺乳類細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、及びハイブリドーマが含まれる。好ましい昆虫細胞には、例えばＳｆ９及びＳｆ２１細胞並びにそれらの誘導体が含まれる。より好ましくは、真核細胞は真菌細胞、即ち酵母細胞、例えば、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の株などである。より好ましくは、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、又は糸状菌細胞由来である。最も好ましくは、真核細胞は糸状菌細胞である。
糸状菌類には、あらゆる糸状形態の真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，第８版，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ケンブリッジ，英国により定義されるとおり）が含まれる。糸状菌類は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類で構成される菌糸体の壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸伸長によるもので、炭素異化は偏性好気性である。糸状菌株としては、限定はされないが、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ファネロカエテ属（Ｐａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、プレウロタス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラサムソニア属（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の株が挙げられる。
好ましい糸状菌細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラサムソニア属（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アクレモニウム・アラバメンセ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）又はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の種に属する。より好ましい宿主細胞はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に属し、より好ましくは宿主細胞はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）種に属する。本発明に係る宿主細胞がアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）宿主細胞である場合、宿主細胞は好ましくは、ＣＢＳ ５１３．８８、ＣＢＳ１２４．９０３又はその誘導体である。
いくつかの糸状菌株が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）、及びロシア科学アカデミーのＡｌｌ−Ｒｕｓｓｉａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ロシア語略称ＶＫＭ、英語略称ＲＣＭ）、モスクワ、ロシアなど、いくつかのカルチャーコレクションにおいて一般に容易に利用可能である。本発明の文脈において有用な株は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８、ＣＢＳ１２４．９０３、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ ４１７７、ＡＴＣＣ１０１１、ＣＢＳ２０５．８９、ＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ１４４８８〜１４４９１、ＡＴＣＣ１１６０１、ＡＴＣＣ１２８９２、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ ４５５．９５、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）５４−１２５５（ＡＴＣＣ２８０８９）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＮＲＲＬ８１２６、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＳ １２４．９０２、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５又はＡＴＣＣ４８２７２、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ２６９２１又はＡＴＣＣ５６７６５又はＡＴＣＣ２６９２１、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ１１９０６、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）Ｃ１、Ｇａｒｇ ２７Ｋ、ＶＫＭ−Ｆ ３５００ Ｄ、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）Ｃ１、Ｇａｒｇ ２７Ｋ、ＶＫＭ−Ｆ ３５００ Ｄ、ＡＴＣＣ４４００６及びその誘導体であり得る。
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る変異微生物宿主細胞が糸状菌宿主細胞であるとき、変異微生物宿主細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、中性α−アミラーゼ（ａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩ）、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）、毒素、好ましくはオクラトキシン及び／又はフモニシン、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴ、ＰｅｐＡ、遺伝子ｈｄｆＡ及び／又はｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥから選択される少なくとも１つの産物の産生が変異微生物宿主細胞において欠損するような１つ以上の修飾を、そのゲノムにさらに含み得る。
シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）は、多くの宿主細胞におけるシュウ酸合成経路の一成分である。ｏａｈＡが欠損している宿主細胞は、シュウ酸が欠損することになる。シュウ酸は、食品用途など多くの用途で望ましくない副産物である。さらにシュウ酸は、この成分を産生する宿主細胞の培地培養のｐＨを低下させ、収率の低下をもたらす；即ちシュウ酸欠損宿主細胞では、収率が増加する。従って、本発明に係る微生物宿主細胞がｏａｈＡを欠損している場合、有利である。ｏａｈＡ欠損宿主細胞及び前記宿主細胞の好ましい作製方法が、国際公開第２０００／５０５７６号パンフレット及び国際公開第２００４／０７００２２号パンフレットに広範に記載されている。ｏａｈＡ欠損宿主細胞の好ましい作製方法は、国際公開第２０００／５０５７６号パンフレットに記載される組換えによる破壊方法である。好ましくは、本発明に係る変異微生物宿主細胞はｏａｈＡを欠損している。好ましくは、ｏａｈＡは真菌ｏａｈＡである。より好ましくは、ｏａｈＡは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のｏａｈＡである。さらにより好ましくはｏａｈＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のｏａｈＡである。さらにより好ましくはｏａｈＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８由来のｏａｈＡである。最も好ましくは、ｏａｈＡはＡｎ１０ｇ００８２０の配列を含む。
ｐｒｔＴは、真核細胞におけるプロテアーゼの転写活性化因子である。プロテアーゼのいくつかの真菌転写活性化因子が、最近になって、国際公開第００／２０５９６号パンフレット、国際公開第０１／６８８６４号パンフレット、国際公開第２００６／０４０３１２号パンフレット及び国際公開第２００７／０６２９３６号パンフレットに記載されている。これらの転写活性化因子は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ））から単離された。プロテアーゼ遺伝子のこれらの転写活性化因子を使用して、真菌細胞におけるポリペプチドの産生方法を改善することができ、ここでポリペプチドはプロテアーゼ分解に対して感受性を有する。本発明に係る微生物宿主細胞がｐｒｔＴを欠損しているとき、宿主細胞はｐｒｔＴの転写制御下にあるプロテアーゼをそれほど多く産生しないことになる。従って、本発明に係る宿主細胞がｐｒｔＴを欠損しているとき、有利である。ｐｒｔＴ欠損宿主及びそれらの宿主の好ましい作製方法は、国際公開第０１／６８８６４号パンフレット、国際公開第２００６／０４０３１２号パンフレットに広範に記載されている。国際公開第０１／６８８６４号パンフレット及び国際公開第２００６／０４０３１２号パンフレットは、ｐｒｔＴコード配列を破壊するための組換え方法及び古典的方法を記載している。国際公開第２００７／０６２９３６号パンフレットは、プロテアーゼプロモーターにおけるｐｒｔＴ結合部位の破壊を記載している。結合部位の破壊は、ｐｒｔＴがその結合部位に結合することを妨げる。結果的に、ｐｒｔＴによりプロテアーゼの転写が活性化されず、プロテアーゼの産生が少なくなる。
好ましくは、本発明に係る変異微生物宿主細胞は、ｐｒｔＴをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは修飾を含むものであり、ここで宿主細胞は、その元となる親細胞と比較して、同等の条件下で培養したとき、ｐｒｔＴの産生が欠損している。好ましくは、ｐｒｔＴは真菌ｐｒｔＴである。より好ましくは、ｐｒｔＴは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のｐｒｔＴである。さらにより好ましくはｐｒｔＴは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のｐｒｔＴである。さらにより好ましくはｐｒｔＴは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８由来のｐｒｔＴである。最も好ましくは、ｐｒｔＴはＡｎ０４ｇ０６９４０の配列を含む。
用語「グルコアミラーゼ」（ｇｌａＡ）は、用語「アミログルコシダーゼ」と同じであり、本明細書では、１，４−連結α−Ｄ−グルコース残基及び末端１，４−連結α−Ｄ−グルコース残基の鎖の分枝点における１，６−α−Ｄ−グルコシド連結の内部加水分解を触媒するデキストリン６−α−Ｄ−グルカノヒドロラーゼ活性を有する酵素として定義される。グルコアミラーゼ活性は、基質ｐ−ニトロフェニル−ａ−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ）からのパラニトロフェノールの遊離を測定することにより、ＡＧＩＵ／ｍｌとして計測することができる。これによって黄色が生じ、その吸光度を分光光度計を使用して４０５ｎｍで計測することができる。１ＡＧＩＵが、可溶性デンプン基質からｐＨ４．３及び６０℃で毎分１μモルのグルコースを産生する酵素の量である。国際公開第９８／４６７７２号パンフレットにおいて、アッセイのさらなる詳細を参照することができる。
好ましくは、本発明に係る変異微生物宿主細胞は、ｇｌａＡをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは修飾を含むものであり、ここで宿主細胞は、その元となる親細胞と比較して、同等の条件下で培養したとき、ｇｌａＡの産生が欠損している。好ましくは、ｇｌａＡは真菌ｇｌａＡである。より好ましくは、ｇｌａＡは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のｇｌａＡである。さらにより好ましくはｇｌａＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のｇｌａＡである。さらにより好ましくはｇｌａＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８由来のｇｌａＡである。最も好ましくは、ｇｌａＡはＡｎ０３ｇ０６５５０の配列を含む。
用語「α−アミラーゼ」は、本明細書では、水の存在下における３つ以上のα−１，４−連結グルコース単位を含む多糖類からマルトオリゴ糖類への内部加水分解を触媒する１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ活性として定義される。（中性）α−アミラーゼ活性の測定には、Ｍｅｇａｚｙｍｅ穀物α−アミラーゼキットが、供給業者のプロトコルに従い使用される（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、ＣＥＲＡＬＰＨＡ αアミラーゼアッセイキット、カタログ品番Ｋ−ＣＥＲＡ、２０００〜２００１年）。計測される活性は、ｐＨ７．０の過剰なグルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼの存在下における非還元末端ブロックドｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシドの加水分解に基づく。形成されたｐ−ニトロフェノールの量が、試料中に存在するα−アミラーゼ活性の尺度である。
用語「酸安定性α−アミラーゼ」（ａｍｙＡ）は、本明細書では、酸性ｐＨ範囲で最適活性となるα−アミラーゼ活性を有する酵素として定義される。酸安定性α−アミラーゼ活性の測定にもまた、Ｍｅｇａｚｙｍｅ穀物α−アミラーゼキットが、供給業者のプロトコルに従い、但し酸性ｐＨで使用される（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、ＣＥＲＡＬＰＨＡ αアミラーゼアッセイキット、カタログ品番Ｋ−ＣＥＲＡ、２０００〜２００１年）。計測される活性は、ｐＨ４．５の過剰なグルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼの存在下における非還元末端ブロックドｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシドの加水分解に基づく。形成されたｐ−ニトロフェノールの量が、試料中に存在する酸安定性α−アミラーゼ活性の尺度である。
好ましくは、本発明に係る宿主細胞は、ＡｍｙＡをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは修飾を含むものであり、ここで宿主細胞は、その元となる親細胞と比較して、同等の条件下で培養したとき、ａｍｙＡが欠損している。好ましくは、ａｍｙＡは真菌ａｍｙＡである。より好ましくは、ａｍｙＡは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のａｍｙＡである。さらにより好ましくはａｍｙＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＡである。さらにより好ましくはａｍｙＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８由来のａｍｙＡである。最も好ましくは、ａｍｙＡはＡｎ１１ｇ０３３４０の配列を含む。
用語「中性α−アミラーゼ活性」（ａｍｙ）は、本明細書では、中性ｐＨ範囲で最適活性となるα−アミラーゼ活性を有する酵素として定義される。
好ましくは、本発明に係る宿主細胞は、ＡｍｙＢをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは修飾を含むものであり、ここで宿主細胞は、その元となる親細胞と比較して、同等の条件下で培養したとき、ａｍｙＢＩ及び／又はａｍｙＢＩＩが欠損している。より好ましくは、本発明に係る微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｏｌ）宿主細胞は、ａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩが欠損している。好ましくは、ａｍｙＢは真菌ａｍｙＢである。より好ましくは、ａｍｙＢは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のａｍｙＢである。さらにより好ましくはａｍｙＢは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＢＩである。さらにより好ましくはａｍｙＢは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８由来のａｍｙＢＩである。最も好ましくは、ａｍｙＢＩはＡｎ１２ｇ０６９３０の配列を含む。さらにより好ましくはａｍｙＢは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｙＢＩＩである。さらにより好ましくはａｍｙＢは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８由来のａｍｙＢＩＩである。最も好ましくは、ａｍｙＢＩＩはＡｎ０５ｇ０２１００の配列を含む。
ポリヌクレオチドに関連する用語の毒素は、本明細書では、少なくとも１つの毒素又は毒素中間化合物の生合成又は分泌に関与する化合物又は生化学的経路をコードする遺伝子クラスター、多数の遺伝子、遺伝子又はその一部として定義される。前記化合物は、例えば、酵素であってもよいポリペプチドであり得る。
目的のポリペプチドの産生において宿主細胞として使用されるいくつかの宿主細胞、特に真菌類は、様々な毒素の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を有する。例えば、シクロピアゾン酸、コウジ酸、３−ニトロプロピオン酸及びアフラトキシンは公知の毒素であり、これらは、例えば黄色コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）で形成される。同様に、トリコテセンは、いくつかの真菌類、例えば、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）などのフザリウム・エスピー（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）で形成され、オクラトキシンはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）によって産生され得る。最近になって、工業用アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）宿主株のゲノムのシーケンシングにより、フモニシン遺伝子クラスターが明らかになった（Ｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，「万能細胞工場アスペルギルス・ニガーＣＢＳ ５１３．８８のゲノムシーケンシング及び解析（Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ ５１３．８８）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｆｅｂ；２５（２）：２２１−２３１）。目的の化合物の発酵中におけるかかる毒素の形成は、それらの毒素が操作者、顧客及び環境に健康被害をもたらし得るため、極めて望ましくない。結果的に、毒素欠損宿主細胞が、目的の化合物を毒素なしに生産することを可能にする。毒素不含の化合物の生産は、生成物から毒素を除去する必要がないため、より容易である。さらに、化合物に関する規制当局の承認手順が簡略化される。
好ましくは、本発明に係る変異微生物宿主細胞は、化合物（これは例えば、酵素であってもよいポリペプチドであり得る）又は生化学的経路をコードする毒素関連ポリヌクレオチドを含み、前記毒素関連ポリヌクレオチドは修飾を含むものであり、ここで宿主細胞は、その元となる親細胞と比較して、同等の条件下で培養したとき、前記毒素又は毒素中間化合物の産生が欠損している。好ましくは、毒素又は毒素中間化合物は真菌毒素又は毒素中間化合物である。より好ましくは、毒素又は毒素中間化合物は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来の毒素又は毒素中間化合物である。さらにより好ましくは毒素又は毒素中間化合物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来の毒素又は毒素中間化合物である。さらにより好ましくは毒素又は毒素中間化合物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８由来の毒素又は毒素中間化合物である。さらにより好ましくは、毒素又は毒素中間化合物はフモニシン又はフモニシン中間化合物である。さらにより好ましくは、毒素又は毒素中間化合物はオクラトキシン又はオクラトキシン中間化合物である。最も好ましくは、毒素又は毒素中間化合物は、オクラトキシン若しくはフモニシン又はオクラトキシン若しくはフモニシン中間化合物である。
好ましくは、毒素関連ポリヌクレオチドは、真菌毒素又は毒素中間化合物の産生に関与する化合物（これは例えば、酵素であってもよいポリペプチドであり得る）又は生化学的経路をコードする。より好ましくは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来の毒素又は毒素中間化合物。さらにより好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来の毒素又は毒素中間化合物。さらにより好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８由来の毒素又は毒素中間化合物。さらにより好ましくは、フモニシン又はフモニシン中間化合物。さらにより好ましくは、フモニシン−Ｂ又はフモニシン−Ｂ中間化合物。さらにより好ましくは、フモニシン−Ｂ２又はフモニシン−Ｂ２中間化合物。さらにより好ましくは、毒素関連ポリヌクレオチドは、Ａｎ０１ｇ０６８２０からＡｎ０１ｇ０６９３０までのフモニシンクラスターの配列を含む。最も好ましくは、毒素関連ポリヌクレオチドはＡｎ０１ｇ０６９３０の配列を含む。
別の好ましい実施形態において、毒素関連ポリヌクレオチドは、オクラトキシン又はオクラトキシン中間化合物に関与する化合物（これは例えば、酵素であってもよいポリペプチドであり得る）又は生化学的経路をコードする。より好ましくは、オクラトキシンＡ又はオクラトキシンＡ中間化合物。より好ましくは、毒素関連ポリヌクレオチドは、Ａｎ１５ｇ０７８８０からＡｎ１５ｇ０７９３０までのクラスターの配列を含む。最も好ましくは、毒素関連ポリヌクレオチドは、Ａｎ１５ｇ０７９１０の配列及び／又はＡｎ１５ｇ０７９２０の配列を含む。
好ましくは、本発明に係る変異微生物宿主細胞は、化合物（これは例えば、酵素であってもよいポリペプチドであり得る）又は生化学的経路をコードする少なくとも１つの毒素関連ポリヌクレオチドを含み、前記毒素関連ポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含むものであり、ここで宿主細胞は、その元となる親細胞と比較して、同等の条件下で培養したとき、毒素、又は毒素中間化合物の産生が欠損している。
より好ましくは、本発明に係る宿主細胞は２つの毒素関連ポリヌクレオチドを含み、前記２つの毒素関連ポリヌクレオチドは、各々、少なくとも１つの修飾を含むものであり、ここで宿主細胞は好ましくは、その元となる親細胞と比較して、同等の条件下で培養したとき、フモニシン及びオクラトキシンの産生が欠損している。
さらにより好ましくは、本発明に係る変異微生物宿主細胞は３つ以上の毒素関連ポリヌクレオチドを含み、前記３つ以上の毒素関連ポリヌクレオチドは、各々、少なくとも１つの修飾を含むものであり、ここで宿主細胞は好ましくは、その元となる親細胞と比較して、同等の条件下で培養したとき、フモニシン、オクラトキシン及び少なくとも１つのさらなる毒素又は毒素中間化合物の産生が欠損している。
従って、本発明に係る変異微生物宿主細胞が糸状菌宿主細胞であるとき、宿主細胞は、そのゲノムに、主要細胞外アスパラギン酸プロテアーゼＰｅｐＡの産生の欠損をもたらす１つ以上の修飾を含み得る。例えば本発明に係る宿主細胞は、主要細胞外アスパラギン酸プロテアーゼＰｅｐＡをコードするｐｅｐＡ遺伝子の破壊をさらに含み得る。より好ましくは、ｐｅｐＡは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のｐｅｐＡである。さらにより好ましくはｐｅｐＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のｐｅｐＡである。さらにより好ましくはｐｅｐＡは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ ５１３．８８由来のｐｅｐＡである。最も好ましくは、ｐｅｐＡはＡｎ１４ｇ０４７１０の配列を含む。
好ましくは、本発明に係る変異微生物宿主細胞のゲノム中への所定の部位に対するポリヌクレオチドの標的組込み効率は、細胞をＮＨＲ（非相同組換え）における構成要素が欠損したものにすると増加する。好ましくは、本発明に係る変異微生物宿主細胞は、修飾を含むＮＨＲ構成要素をコードするポリヌクレオチドを含み、ここで前記宿主細胞は、その元となる親細胞と比較して、同じ条件下で培養したとき、前記ＮＨＲ構成要素の産生が欠損している。
修飾されるＮＨＲ構成要素は、当業者に公知の任意のＮＨＲ構成要素であり得る。修飾される好ましいＮＨＲ構成要素は、酵母ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＸＲＳ２、ＳＩＲ４、ＬＩＧ４の糸状菌相同体の群から選択される。修飾されるより好ましいＮＨＲ構成要素は、酵母ＫＵ７０及びＫＵ８０の糸状菌相同体、好ましくはｈｄｆＡ（酵母ＫＵ７０の相同体）又はその相同体及びｈｄｆＢ（酵母ＫＵ８０の相同体）又はその相同体である。修飾される最も好ましいＮＨＲ構成要素は、ＫＵ７０又はｈｄｆＡ、又はそれらの相同体である。修飾される別の好ましいＮＨＲ構成要素は、ＫＵ８０又はｈｄｆＢ、又はそれらの相同体である。ＮＨＲに関与する構成要素が欠損したかかる宿主細胞を得る方法は、当業者に公知であり、国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットに広範に記載されている。好ましくはｈｄｆＡ遺伝子は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のｈｄｆＡ遺伝子、より好ましくは国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットの配列番号１に記載のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のｈｄｆＡである。別の好ましい実施形態においてｈｄｆＢ遺伝子は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のｈｄｆＢ遺伝子であり、より好ましくは国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットの配列番号４に記載のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のｈｄｆＢである。
従って、本発明に係る変異微生物宿主細胞が糸状菌宿主細胞であるとき、本発明に係る宿主細胞は、そのゲノムに、ｈｄｆ Ａ遺伝子（国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットの配列番号３に示されるとおり）及び／又はｈｄｆＢ遺伝子（国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットの配列番号６に示されるとおり）によりコードされる産物の産生の欠損をもたらす１つ以上の修飾をさらに含み得る。例えば本発明に係る宿主細胞は、ｈｄｆＡ及び／又はｈｄｆＢ遺伝子の破壊をさらに含み得る。ｈｄｆＡ及び／又はｈｄｆＢ遺伝子によりコードされる産物が欠損している糸状菌宿主細胞については、国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットに記載されている。
本発明に係る変異微生物宿主細胞が糸状菌宿主細胞であるとき、本発明に係る宿主細胞は、そのゲノムに、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥの産生の欠損をもたらす修飾をさらに含み得る。非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥの産生が欠損したかかる宿主細胞については、国際公開第２０１２／００１１６９号パンフレットに記載されている（ｎｐｓＥは、国際公開第２０１２／００１１６９号パンフレットの配列番号３５に示されるとおりのゲノム配列、配列番号３６に示されるコード配列、配列番号３７に示されるｍＲＮＡ及び配列番号３８に示されるｎｒｐｓタンパク質を有する）。
本発明に係る変異微生物宿主細胞は、そのゲノムに、α−アミラーゼａｍｙＣの産生の欠損をもたらす修飾をさらに含み得る。α−アミラーゼａｍｙＣの産生が欠損したかかる宿主細胞については、「アミラーゼ欠損株（Ａｍｙｌａｓｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｔｒａｉｎ）」と題される２０１３年７月１９日に出願された同時係属中の国際特許出願に記載されており、この特許出願は、２０１２年７月１９日に全て出願された欧州特許第１２１７７１７３．７号明細書、米国仮特許出願第６１／６７３５８９号明細書、欧州特許第１２１７７１７１．１号明細書及び米国仮特許出願第６１／６７３６０７号明細書からの優先権を主張するものである。ａｍｙＣは、この同時係属中の国際特許出願の配列番号１又は５に示されるとおりのゲノム配列及び配列番号２又は６に示されるコード配列及び配列番号３又は７に示されるとおりのＡｍｙＣタンパク質であって、配列番号４及び８に示される成熟ＡｍｙＣタンパク質を含むものを有する）。この同時係属出願の配列番号１及び５が、本明細書の配列番号１３に対応する。この同時係属出願の配列番号２及び６が、本明細書のそれぞれ配列番号１４及び１７に対応する。この同時係属出願の配列番号３及び７が、明細書のそれぞれ本配列番号１５及び１８に対応する。この同時係属出願の配列番号４及び８が、本明細書のそれぞれ配列番号１６及び１９に対応する。
親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、中性α−アミラーゼ（ａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩ）、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）、毒素、好ましくはオクラトキシン及び／又はフモニシン、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴ、ＰｅｐＡ、遺伝子ｈｄｆＡ及び／又はｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥ、アミラーゼａｍｙＣから選択される少なくとも１つの産物の産生の欠損が、本発明に係る変異微生物宿主細胞が由来する親宿主細胞に既に存在し得る。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、任意選択で、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、中性α−アミラーゼ（ａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩ）、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）、毒素、好ましくはオクラトキシン及び／又はフモニシン、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴ、ＰｅｐＡ、遺伝子ｈｄｆＡ及び／又はｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥ、アミラーゼａｍｙＣからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、ＰｅｐＡと、任意選択で、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、中性α−アミラーゼ（ａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩ）、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）、毒素、好ましくはオクラトキシン及び／又はフモニシン、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴ、遺伝子ｈｄｆＡ及び／又はｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥ、アミラーゼａｍｙＣからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、ＰｅｐＡと、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）と、任意選択で、中性α−アミラーゼ（ａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩ）、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）、毒素、好ましくはオクラトキシン及び／又はフモニシン、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴ、遺伝子ｈｄｆＡ及び／又はｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥ、アミラーゼａｍｙＣからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、ＰｅｐＡと、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）と、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩと、任意選択で、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩＩ、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）、毒素、好ましくはオクラトキシン及び／又はフモニシン、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴ、遺伝子ｈｄｆＡ及び／又はｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥ、アミラーゼａｍｙＣからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、ＰｅｐＡと、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）と、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩと、任意選択で、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）、毒素、好ましくはオクラトキシン及び／又はフモニシン、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴ、遺伝子ｈｄｆＡ及び／又はｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥ、アミラーゼａｍｙＣからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、ＰｅｐＡと、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）と、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩと、遺伝子ｈｄｆＡによりコードされる産物と、任意選択で、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）、毒素、好ましくはオクラトキシン及び／又はフモニシン、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴ、遺伝子ｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥ、アミラーゼａｍｙＣからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、ＰｅｐＡと、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）と、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩと、遺伝子ｈｄｆＡによりコードされる産物と、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）と、任意選択で、毒素、好ましくはオクラトキシン及び／又はフモニシン、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴ、遺伝子ｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥ、アミラーゼａｍｙＣからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、ＰｅｐＡと、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）と、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩと、遺伝子ｈｄｆＡによりコードされる産物と、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）と、オクラトキシンと、フモニシンと、任意選択で、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴ、遺伝子ｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥ、アミラーゼａｍｙＣからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、ＰｅｐＡと、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）と、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩと、遺伝子ｈｄｆＡによりコードされる産物と、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）と、オクラトキシンと、フモニシンと、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴと、任意選択で、遺伝子ｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥ、アミラーゼａｍｙＣからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、ＰｅｐＡと、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）と、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩと、遺伝子ｈｄｆＡによりコードされる産物と、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）と、オクラトキシンと、フモニシンと、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴと、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥと、任意選択で、遺伝子ｈｄｆＢによりコードされる産物、アミラーゼａｍｙＣからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
一実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、ｇｌａＡと、ＰｅｐＡと、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）と、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩと、遺伝子ｈｄｆＡによりコードされる産物と、シュウ酸ヒドロラーゼ（ｏａｈＡ）と、オクラトキシンと、フモニシンと、プロテアーゼ転写調節因子ｐｒｔＴと、アミラーゼａｍｙＣと、任意選択で、遺伝子ｈｄｆＢによりコードされる産物、非リボソームペプチドシンターゼｎｐｓＥからなる群から選択される少なくとももう一つの産物との産生の欠損をさらに含む。
より好ましい実施形態において本発明に係る変異微生物細胞はさらに、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、低下したアミラーゼバックグラウンドを有し、ｇｌａＡ、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩの産生の欠損を含む。かかる微生物変異細胞はまた、ＫＵ７０又はＫＵ８０の糸状菌相同体の産生の欠損も含み得る。かかる微生物変異細胞はまた、毒素の産生の欠損も含み得る。かかる微生物変異細胞はまた、ＫＵ７０又はＫＵ８０の糸状菌相同体の産生の欠損及び毒素の産生の欠損も含み得る。
さらにより好ましい実施形態において本発明に係る変異微生物細胞は、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、低下したアミラーゼバックグラウンドを有し、ｇｌａＡ、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩ、ａｍｙＢＩＩ及びａｍｙＣの産生の欠損をさらに含む。かかる微生物変異細胞はまた、ＫＵ７０又はＫＵ８０の糸状菌相同体も含み得る。かかる微生物変異細胞はまた、毒素の産生の欠損も含み得る。かかる微生物変異細胞はまた、ＫＵ７０又はＫＵ８０の糸状菌相同体の産生の欠損及び毒素の産生の欠損も含み得る。
最も好ましい実施形態において本発明に係る変異微生物細胞はさらに、親宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、低下したα−アミラーゼバックグラウンドを有し、酸安定性α−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、中性α−アミラーゼａｍｙＢＩ及びａｍｙＢＩＩ、及び任意選択でａｍｙＣの産生の欠損を含む。かかる微生物変異細胞はまた、ＫＵ７０又はＫＵ８０の糸状菌相同体も含み得る。かかる微生物変異細胞はまた、毒素の産生の欠損も含み得る。かかる微生物変異細胞はまた、ＫＵ７０又はＫＵ８０の糸状菌相同体の産生の欠損及び毒素の産生の欠損も含み得る。
本発明に係る変異微生物宿主細胞が糸状菌宿主細胞であるとき、宿主細胞は、目的の化合物をコードするポリヌクレオチドの１つ以上のコピーの組込みに好適な少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインをさらに含むことができ、ここで少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインのうち少なくとも１つは、その元となる実質的に相同なＤＮＡドメインと比較して目的の化合物をコードするポリヌクレオチドに対して高い組込み選択性を有するように適応され、且つ適応された実質的に相同なＤＮＡドメインの元となる実質的に相同なＤＮＡドメインは、少なくとも２つの実質的に相同なＤＮＡドメインの他方の１つより少なくとも１０％高い遺伝子変換頻度を有する。これらの細胞については、国際公開第２０１１／００９７００号パンフレットに記載されている。これらの実質的に相同なＤＮＡドメインの２つ以上のコピーを含む株はまた、以下では、２つ以上のアンプリコンを含む株とも称される。かかるアンプリコンを含む宿主細胞の例は、例えば、ｖａｎ Ｄｉｊｃｋ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２８；２７−３５：「新世代のＤＳＭアスペルギルス・ニガー酵素産生株の安全性に関して（Ｏｎ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＳＭ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓ）」に記載されている。ｖａｎ Ｄｉｊｃｋ ｅｔ ａｌでは、７つの増幅されたグルコアミラーゼ遺伝子座、即ち７つのアンプリコンを含むアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）株が記載されている。この文脈内で好ましい宿主細胞は、２つ以上のアンプリコン、好ましくは２つ以上のΔｇｌａＡアンプリコンを含む（好ましくは３、４、５、６、７つのΔｇｌａＡアンプリコンを含む）糸状菌宿主細胞、好ましくはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）宿主細胞であり、ここで最も高い遺伝子変換頻度のアンプリコンは、その元となるアンプリコンと比較して目的の化合物をコードするポリヌクレオチドに対して高い組込み選択性を有するように適応されている。アンプリコンの適応は、国際公開第２０１１／００９７００号パンフレット（全体が参照によって本明細書に援用される）に記載される方法の任意の一つにより実施することができる。国際公開第２０１１／００９７００号パンフレットに記載されるこれらの宿主細胞の例は、ＢａｍＨＩトランケート型アンプリコン、ＳａｌＩトランケート型アンプリコン及びＢｇｌＩＩトランケート型アンプリコンである３つのΔｇｌａＡアンプリコンを含む宿主細胞であり、ＢａｍＨＩアンプリコンは、その元となるＢａｍＨＩアンプリコンと比較して目的の化合物をコードするポリヌクレオチドに対して高い組込み選択性を有するように適応されている。２つ以上のアンプリコンを含む宿主細胞であって、一方のアンプリコンが、その元となるアンプリコンと比較して目的の化合物をコードするポリヌクレオチドに対して高い組込み選択性を有するように適応されている宿主細胞は、以下では適応アンプリコンを含む宿主細胞と称される。
本発明に係る変異微生物宿主細胞が糸状菌宿主細胞であるとき、本発明に係る宿主細胞は、Ｓｅｃ６１の修飾をさらに含み得る。好ましいＳＥＣ６１修飾は、ＳＥＣ６１の一方向性の突然変異体；即ち、デノボ合成されたタンパク質はＳＥＣ６１を介して小胞体（ＥＲ）に侵入できるが、そのタンパク質がＳＥＣ６１を介してＥＲを離れることはできない突然変異体をもたらす修飾である。かかる修飾は、国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットに広範に記載されている。好ましい実施形態において変異微生物宿主細胞は、国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットの配列番号３に示すとおりのＳｅｃ６１に修飾を含む。最も好ましくは、ＳＥＣ６１修飾は、国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットの配列番号３においてセリン３７６がトリプトファンに置換されるＳ３７６Ｗ突然変異である。
好ましい実施形態において、本発明に係る変異微生物宿主細胞は、目的の化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又は細胞による目的の化合物の産生に関与する化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
目的の化合物は、任意の生物学的化合物であってよい。生物学的化合物は、バイオマス又は生体高分子若しくは代謝産物であり得る。生物学的化合物は、生合成経路又は代謝経路を構成する単一のポリヌクレオチド若しくは一連のポリヌクレオチドによりコードされてもよく、又は単一のポリヌクレオチドの産物若しくは一連のポリヌクレオチドの産物の直接的な結果であってもよい。生物学的化合物は宿主細胞にとって天然であっても、又は異種であってもよい。
用語「異種の生物学的化合物」は、本明細書では、細胞にとって天然でない生物学的化合物；又は天然の生物学的化合物を改変する構造的な修飾が行われている天然の生物学的化合物として定義される。
用語「生体高分子」は、本明細書では、同一の、類似した、又は異なるサブユニット（単量体）の鎖（又は重合体）として定義される。生体高分子は任意の生体高分子であってよい。生体高分子は、例えば、限定はされないが、核酸、ポリアミン、ポリオール、ポリペプチド（又はポリアミド）、又は多糖であってもよい。
生体高分子はポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、目的の生物学的活性を有する任意のポリペプチドであってよい。用語「ポリペプチド」は、本明細書では、コードされる産物の特定の長さを指すようには意図されず、従って、ペプチド、オリゴペプチド、及びタンパク質が包含される。ポリペプチドにはさらに、上述のポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異型及び操作された変異型並びにハイブリッドポリペプチドが含まれる。ポリペプチドは宿主細胞にとって天然であっても、又は異種であってもよい。ポリペプチドはコラーゲン又はゼラチン、又はその変異体若しくはハイブリッドであってもよい。ポリペプチドは、抗体又はその一部、抗原、凝固因子、酵素、ホルモン又はホルモン変異体、受容体又はその一部、調節タンパク質、構造タンパク質、レポーター、又は輸送タンパク質、分泌過程に関与するタンパク質、折り畳み過程に関与するタンパク質、シャペロン、ペプチドアミノ酸トランスポーター、グリコシル化因子、転写因子、合成ペプチド又はオリゴペプチド、細胞内タンパク質であってもよい。細胞内タンパク質は、酵素、例えば、プロテアーゼ、セラミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、アミノペプチダーゼ、アシラーゼ、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、リパーゼであってもよい。ポリペプチドはまた、細胞外に分泌される酵素であってもよい。かかる酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼの群に属し得る。酵素はカルボヒドラーゼ、例えばセルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ又はβ−グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ又はペクチン分解酵素、例えばキシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、エキソポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノキシランヒドロラーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼ、又はデンプン分解酵素；ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼ、ホスファターゼ、例えばフィターゼ、エステラーゼ、例えばリパーゼ、タンパク質分解酵素、オキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼ、トランスフェラーゼ、又はイソメラーゼであってもよい。酵素はフィターゼであってもよい。酵素は、アミノペプチダーゼ、アスパラギナーゼ、アミラーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、セリン−プロテアーゼカタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、タンパク質デアミナーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ガラクトリパーゼ、クロロフィラーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はグルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼであってもよい。
好ましくは、目的の化合物は異種産物である。好ましくは目的の化合物はグルコースオキシダーゼである。より好ましくは目的の化合物は異種グルコースオキシダーゼである。別の好ましい実施形態において目的の化合物は脂肪分解酵素であり、例えば、リパーゼ（トリアシルグリセロールリパーゼ）、ホスホリパーゼ（例えばホスホリパーゼＡ１及び／又はホスホリパーゼＡ２及び／又はホスホリパーゼＢ及び／又はホスホリパーゼＣ）、ガラクトリパーゼからなる群から選択される活性の１つ以上を有する脂肪分解酵素である。
本発明によれば、ポリペプチド又は酵素はまた、国際公開第２０１０／１０２９８２号パンフレットに記載されるとおりの産物であってもよい。本発明によれば、ポリペプチドはまた、別のポリペプチドがポリペプチド又はその断片のＮ末端又はＣ末端に融合した融合又はハイブリッドポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは、あるポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を、別のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）と融合させることにより作製される。
融合ポリペプチドの作製技法は当該技術分野において公知であり、ポリペプチドをコードするコード配列を、それがインフレームになり、且つ融合されるポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるようにライゲートすることが含まれる。ハイブリッドポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる部分的又は完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んでもよく、ここで１つ以上が宿主細胞にとって異種であってよい。融合ポリペプチド及びシグナル配列融合の例は、例えば国際公開第２０１０／１２１９３３号パンフレットに記載されるとおりである。
生体高分子は多糖であってもよい。多糖は、限定はされないが、ムコ多糖（例えば、ヘパリン及びヒアルロン酸）及び窒素含有多糖（例えば、キチン）を含めた任意の多糖であってよい。より好ましい任意選択例では、多糖はヒアルロン酸である。
目的の化合物をコードするか又は本発明に係る目的の化合物の産生に関与する化合物をコードするポリヌクレオチドは、一次又は二次代謝産物、例えば、有機酸、カロテノイド、（β−ラクタム）抗生物質、及びビタミンなどの合成に関与する酵素をコードし得る。かかる代謝産物は、本発明に係る生物学的化合物と見なされる。
用語「代謝産物」には、一次及び二次代謝産物の両方が包含される；代謝産物は任意の代謝産物であってよい。好ましい代謝産物は、クエン酸、グルコン酸、アジピン酸、フマル酸、イタコン酸及びコハク酸である。
代謝産物は、生合成又は代謝経路などにおける１つ以上の遺伝子によりコードされ得る。一次代謝産物は、細胞の一次代謝又は一般的な代謝の産物であり、これらはエネルギー代謝、成長、及び構造に関係する。二次代謝産物は二次代謝の産物である（例えば、Ｒ．Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，Ｃｈａｐｍａｎ及びＨａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１を参照）。
一次代謝産物は、限定はされないが、アミノ酸、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、トリグリセリド、又はビタミンであってもよい。
二次代謝産物は、限定はされないが、アルカロイド、クマリン、フラボノイド、ポリケチド、キニーネ、ステロイド、ペプチド、又はテルペンであってもよい。二次代謝産物は、抗生物質、摂食阻害剤、誘引剤、殺細菌剤、殺真菌剤、ホルモン、殺虫剤、又は殺鼠剤であってもよい。好ましい抗生物質はセファロスポリン及びβ−ラクタムである。他の好ましい代謝産物は細胞外代謝産物である。細胞外代謝産物の例は、アウラスペロンＢ、フナレノン、コタニン、ニグラジリン（Ｎｉｇｒａｇｉｌｌｉｎ）、オルランジン、他のナフト−γ−ピロン、ピラノニグリンＡ、テンシドールＢ、フモニシンＢ２及びオクラトキシンＡである。
生物学的化合物はまた、選択可能マーカーの産物であってもよい。選択可能マーカーは、目的のポリヌクレオチドの産物であり、この産物は、殺生物剤又はウイルス耐性、耐重金属性、原栄養性から栄養要求性などを提供する。選択可能マーカーとしては、限定はされないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ｂｌｅ（フレオマイシン耐性タンパク質）、ｈｙｇ（ハイグロマイシン）、ＮＡＴ又はＮＴＣ（ノールセオスリシン）並びにこれらの等価物が挙げられる。
本発明によれば、目的の化合物は好ましくは、目的の化合物のリストに記載されるとおりのポリペプチドである。
好ましくは、ポリペプチドは、目的の化合物のリストに記載されるとおりの酵素である。好ましくはグルコースオキシダーゼ。別の実施形態において酵素は脂肪分解酵素である。
本発明の別の実施形態によれば、目的の化合物は好ましくは代謝産物である。
変異微生物細胞は、既に目的の化合物の産生能を有していてもよい。変異微生物宿主細胞にはまた、目的の化合物であるか又は目的の化合物の産生に関与するポリペプチドであり得るポリペプチドをコードする相同又は異種核酸コンストラクトが提供されてもよい。当業者は、微生物宿主細胞をどのように修飾すればそれが目的の化合物の産生能を有するようになるかを分かっている。
用語「核酸コンストラクト」は、本明細書では、一本鎖或いは二本鎖の、核酸分子と称され、これは天然に存在する遺伝子から単離されるか、又は本来天然には存在しない形で組み合わされて並ぶ核酸セグメントを含むように修飾されている。用語の核酸コンストラクトは、核酸コンストラクトがコード配列の発現に必要な全ての制御配列を含む場合には用語「発現カセット」と同義語であり、ここで前記制御配列は前記コード配列に作動可能に連結される。
用語「作動可能に連結された」は、本明細書では、制御配列がＤＮＡ配列のコード配列に対して、ＲＮＡ又はｍＲＮＡ及び任意選択で前記（ｍ）ＲＮＡから翻訳されるポリペプチドの産生が制御配列により誘導されるような位置に適切に置かれている構成として定義される。
用語「制御配列」は、本明細書では、インビトロ或いは宿主細胞内でのｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドの発現に必須の又は有利な全ての構成要素を含むものと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然であっても又は外来性であってもよい。かかる制御配列としては、限定はされないが、リーダー、シャイン・ダルガノ配列、最適翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０に記載されるとおり）、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プレプロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。最低でも、制御配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳終結シグナルを含む。制御配列は、その特定の目的に合わせて最適化され得る。本発明で使用される好ましい最適化制御配列は、国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるものである。
制御配列には、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを促進する特異的な制限部位を導入することを目的に、リンカーが提供され得る。
制御配列は適切なプロモーター配列（プロモーター）であってよい。
制御配列はまた、好適な転写ターミネーター（ターミネーター）配列、即ち糸状菌細胞によって認識されることにより転写を終結させる配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。細胞において機能する任意のターミネーターを本発明に使用し得る。当業者は、本明細書に記載されるとおりの微生物宿主細胞においてどのタイプのターミネーターを使用し得るかを分かっている。
糸状菌細胞に好ましいターミネーター配列は、糸状菌遺伝子、より好ましくはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）遺伝子由来、さらにより好ましくはＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ遺伝子由来の、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ及び／又はフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼをコードするこれらの遺伝子の任意のターミネーター配列から得られる。
制御配列はまた、最適翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０に記載されるとおり）、又は５’−非翻訳配列、変異型微生物宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。翻訳開始配列又は５’−非翻訳配列は、ポリペプチドをコードするコード配列の５’末端に作動可能に連結される。各制御配列はポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然であっても、又は外来性であってもよい。制御配列は、その特定の目的に合わせて最適化され得る。
好適な５’−非翻訳配列は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子並びにＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼｇｌａＡ、α−アミラーゼ、キシラナーゼ及びフィターゼコード遺伝子の前にあるポリヌクレオチドであってもよい。
制御配列はまた、変異型微生物宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。細胞において機能する任意のリーダー配列を本発明に使用し得る。
リーダー配列は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来の１８及び２４アミノ酸の両方のバージョン）、α因子遺伝子（酵母、例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ））又はα−アミラーゼ（ａｍｙＥ、ａｍｙＱ及びａｍｙＬ）並びにアルカリプロテアーゼａｐｒＥ及び天然プロテアーゼ遺伝子（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））に由来するもの、又は国際公開第２０１０／１２１９３３号パンフレットに記載されるとおりのシグナル配列であってもよい。
糸状菌細胞に好ましいリーダーは、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ及びＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｌａＡ及びフィターゼの前にあるポリヌクレオチドから得られる。
他の制御配列は、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）ＩＰＮＳ遺伝子、又はｐｃｂＣ遺伝子、βチューブリン遺伝子から単離されてもよい。国際公開第０１／２１７７９号パンフレットに引用される全ての制御配列が、本明細書によって参照により援用される。
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、即ち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結される配列であって、転写されると微生物宿主細胞（変異型又は親）によってシグナルとして認識されることにより、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加する配列であってもよい。細胞において機能する任意のポリアデニル化配列を本発明に使用し得る。
糸状菌細胞に好ましいポリアデニル化配列は、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチドから得られる。
好ましい実施形態において、本発明に係る変異微生物宿主細胞では、目的の化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又は目的の化合物の産生に関与する化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、プロモーター、好ましくは誘導性プロモーターに作動可能に連結される。
用語「プロモーター」は、本明細書では、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、生物学的化合物をコードする核酸配列の正しい下流転写開始部位にポリメラーゼを導き転写を開始させるＤＮＡ配列として定義される。ＲＮＡポリメラーゼはコード領域の適切なＤＮＡ鎖と相補的なメッセンジャーＲＮＡの構築を効果的に触媒する。用語「プロモーター」にはまた、ｍＲＮＡへの転写後の翻訳のための５’−非コード領域（プロモーターと翻訳開始との間）、エンハンサーなどのシス作用転写制御エレメント、及び転写因子と相互作用する能力を有する他のヌクレオチド配列も含まれるものと理解され得る。プロモーターは、変異型、トランケート型、及びハイブリッド型プロモーターを含め、真核生物又は原核生物宿主細胞に好適な、転写活性を示す任意の適切なプロモーター配列であってよく、細胞にとって相同な（天然）、或いは異種の（外来性）細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得られ得る。プロモーターは構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであり得る。
好ましくは、プロモーターは誘導性プロモーターである。より好ましくはプロモーターは炭水化物誘導性プロモーターである。好ましく使用される炭水化物誘導性プロモーターは、デンプン誘導性プロモーター（即ち、デンプン、その単量体、二量体、オリゴマーにより誘導可能なプロモーター、例えばマルトース誘導性プロモーター、イソマルトース誘導性プロモーターなど）、セルロース誘導性プロモーター（即ち、セルロース、その単量体、二量体及び／又はオリゴマーにより誘導可能なプロモーター、例えばセロビオース誘導性プロモーター、ソホロース誘導性プロモーターなど）、ヘミセルロース誘導性プロモーター（即ち、ヘミセルロース、その単量体、二量体、及び／又はオリゴマーにより誘導可能なプロモーター、例えばキシラン誘導性プロモーター、アラビノース（ａｒａｂｉｏｎｏｓｅ）誘導性プロモーター、キシロース誘導性プロモーターなど）、ペクチン誘導性プロモーター（即ち、ペクチン、その単量体、二量体及び／又はオリゴマーにより誘導可能なプロモーター、例えばガラクツロン酸誘導性プロモーター、ラムノース誘導性プロモーターなど）、アラビナン誘導性プロモーター（即ち、アラビナン、その単量体、二量体、及び／又はオリゴマーにより誘導可能なプロモーター、例えばアラビノース誘導性プロモーターなど）、グルコース誘導性プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、ガラクトース誘導性プロモーターから選択される。他の誘導性プロモーターは、銅誘導性、オレイン酸誘導性プロモーターである。
糸状菌類において好適なプロモーターは、限定はされないが、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｇｐｄＡプロモーター、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）エンドキシラナーゼ（ｘｌｎＡ）又はβ−キシロシダーゼ（ｘｌｎＤ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）、Ｒ．ミエヘイ（Ｒ．ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム・ダニア（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｄａｎｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム・クイン（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼをコードするポリヌクレオチドから得られるプロモーター、並びにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ及びＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼをコードするポリヌクレオチド由来のプロモーターのハイブリッド）、並びにこれらの変異型、トランケート型、及びハイブリッド型プロモーターが含まれる群から選択され得るプロモーターである。プロモーターの他の例は、国際公開第２００６／０９２３９６号パンフレット及び国際公開第２００５／１００５７３号パンフレット（これらは参照により本明細書に援用される）に記載されるプロモーターである。さらに他のプロモーター使用例が、国際公開第２００８／０９８９３３号パンフレットに記載される。糸状菌類で使用することのできる好ましい炭水化物誘導性プロモーターは、上記に定義するとおり、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）エンドキシラナーゼ（ｘｌｎＡ）又はβ−キシロシダーゼ（ｘｌｎＤ）、Ｔ．、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、並びにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ及びＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼをコードするポリヌクレオチド由来のプロモーターのハイブリッド）である。
グラム陽性微生物由来のかかるプロモーターの例としては、限定はされないが、ｇｎｔ（グルコン酸オペロンプロモーター）；バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｐｅｎＰ；ｇｌｎＡ（グルタミンシンテターゼ）；ｘｙｌＡＢ（キシロースオペロン）；ａｒａＡＢＤ（Ｌ−アラビノースオペロン）及びＰｓｐａｃプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド［ＩＰＴＧ］などの誘導因子により制御することのできるハイブリッドＳＰＯ１／ｌａｃプロモーター（（Ｙａｎｓｕｒａ Ｄ．Ｇ．，Ｈｅｎｎｅｒ Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８４ ８１（２）：４３９−４４３）が挙げられる。活性化因子もまた、プロモーター活性を誘導する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質である。グラム陽性微生物由来のかかるプロモーターの例としては、限定はされないが、二成分系（ＰｈｏＰ−ＰｈｏＲ、ＤｅｇＵ−ＤｅｇＳ、Ｓｐｏ０Ａ−ホスホリレー）、ＬｅｖＲ、Ｍｒｙ及びＧｌｔＣが挙げられる。（ｉｉ）二次シグマ因子の産生は、主として特異的プロモーターからの転写に関与し得る。グラム陽性微生物由来の例としては、限定はされないが、胞子形成特異的シグマ因子：σＦ、σＥ、σＧ及びσＫ、並びに一般的なストレスシグマ因子σＢにより活性化されるプロモーターが挙げられる。σＢ媒介性応答は、エネルギー制限及び環境ストレスによって誘導される（Ｈｅｃｋｅｒ Ｍ，Ｖｏｅｌｋｅｒ Ｕ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８；２９（５）：１１２９−１１３６）。（ｉｉｉ）アテニュエーション及びアンチターミネーションもまた転写を制御する。グラム陽性微生物由来の例としては、限定はされないが、ｔｒｐオペロン及びｓａｃＢ遺伝子が挙げられる。（ｉｖ）発現ベクターにおける他の調節性のプロモーターは、スクロース誘導能を付与するｓａｃＲ制御系ベースである（Ｋｌｉｅｒ ＡＦ，Ｒａｐｏｐｏｒｔ Ｇ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８；４２：６５−９５）。
バチルス類（Ｂａｃｉｌｌｉ）などの細菌において有用な好適な誘導性プロモーターとしては、グラム陽性微生物由来のプロモーター、限定はされないが、ＳＰ０１−２６、ＳＰ０１−１５、ｖｅｇ、ｐｙｃ（ピルビン酸カルボキシラーゼプロモーター）、及びａｍｙＥが挙げられる。グラム陰性微生物由来のプロモーターの例としては、限定はされないが、ｔａｃ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃｌｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６，λ−ＰＲ、及びλ−ＰＬが挙げられる。
バチルス類（Ｂａｃｉｌｌｉ）などの細菌細胞において有用なプロモーターのさらなる例としては、α−アミラーゼ及びＳＰｏ２プロモーター並びに細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
好適なプロモーターの他の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロンから得られるプロモーターである。別の例は、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）のプロモーターである。別の例は、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＨ）のプロモーターである。別の例は、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルカリプロテアーゼ遺伝子（スブチリシンカールスベルグ遺伝子）のプロモーターである。別の例は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）のプロモーターである。別の例は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＦ）のプロモーターである。別の例は、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーターである。別の例は、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーターである。別の例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーターである。別の例は、「−３５」領域に配列ＴＴＧＡＣＡを有し、且つ「−１０」領域にＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターである。別の例は、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）のプロモーターである。別の例は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターである。
好ましくは、プロモーター配列は高発現遺伝子由来である。プロモーターをそこから選択し得る及び／又は発現コンストラクトの組込みに好ましい所定の標的遺伝子座に含まれる好ましい高発現遺伝子の例としては、限定はされないが、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ又はＰＫＩ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）などの解糖酵素をコードする遺伝子、並びにアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルコール（メタノール）オキシダーゼ、伸長因子及びリボソームタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。好適な高発現遺伝子の具体的な例としては、例えばクルイベロミセス・エスピー（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）由来のＬＡＣ４遺伝子、それぞれハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）由来のメタノールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ及びＭＯＸ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）及びＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）由来のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ遺伝子、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼ遺伝子が挙げられる。
酵母で使用することのできるプロモーターとしては、例えば、解糖系遺伝子由来のプロモーター、例えば、酵母又は糸状菌由来のホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＴＤＨ３又はＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる；酵母由来のかかるプロモーターに関するさらなる詳細は、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）を参照し得る。他の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質コード遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨＩ、ＡＤＨ４など）、及びエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。他のプロモーター（構成的及び誘導性のいずれも）、及びエンハンサー又は上流活性化配列は、当業者に公知である。本発明の宿主細胞で使用されるプロモーターは、必要であれば、その調節特性に影響を与えるように修飾されてもよい。この文脈で好適なプロモーターには、構成的及び誘導性の両方の天然プロモーター並びに改変プロモーターが含まれ、それらは当業者に周知されている。真核生物宿主細胞において好適なプロモーターは、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、又はＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ１、ＴＰＩ１、及びＡＯＸ１であり得る。他の好適なプロモーターには、ＰＤＣ１、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ１、及びＴＤＨ３が含まれる。用いられ得る炭水化物誘導性プロモーターの例は、ＧＡＬ１又はＧＡＬ１０プロモーターなどのＧＡＬプロモーターである。
上述のプロモーターは全て、当該技術分野において容易に利用可能である。
好ましい実施形態において、本発明に係る変異微生物細胞では、目的の化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又は目的の化合物の産生に関与する化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドは、炭水化物誘導性プロモーター、好ましくはデンプン誘導性プロモーター、より好ましくは、グルコアミラーゼプロモーター、酸安定性アミラーゼプロモーター、α−アミラーゼプロモーター及びタカアミラーゼプロモーターから選択されるプロモーターに作動可能に連結される。
発現を促進するため、目的の化合物であるポリペプチド又は目的の化合物の産生に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドであってもよい。合成ポリヌクレオチドは、好ましくは、参照により本明細書に援用される国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレット及び／又はＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５９４３号明細書（国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットとして公開された）に記載される方法により、コドン使用が最適化され得る。ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５９４３号明細書は、コドンペア最適化を取り上げている。コドンペア最適化は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がそのコドン使用頻度、詳細には使用されるコドンペアに関して修飾されていて、それによりポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現の向上及び／又はコードされるポリペプチドの産生の向上が得られる方法である。コドンペアは、コード配列中における２つの続きのトリプレット（コドン）の組として定義される。
発現及び／又は翻訳を促進するため、目的の化合物であるポリペプチドをコードするか又は目的の化合物の産生に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチド産物をコードする遺伝子がインビトロ又は変異微生物宿主細胞内での発現及び／又は翻訳に適切な制御配列に作動可能に連結するようにして、発現ベクター中に含められ得る。
発現ベクターは任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってよく、ベクターは好都合には、組換えＤＮＡ手順に供することができ、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる。ベクターの選択は、典型的にはベクターとベクターを導入する細胞との適合性に依存し得る。ベクターは線状又は閉環状プラスミドであってよい。ベクターは自己複製ベクター、即ち、染色体外の実体として存在する、その複製が染色体複製と無関係であるベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体であってもよい。自律的に維持されるクローニングベクターは、ＡＭＡ１配列を含み得る（例えば、Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ及びＣｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ（１９９７），Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７を参照）。
或いは、ベクターは、宿主細胞に導入するとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。組込みクローニングベクターはランダムに組み込まれてもよく、又は宿主細胞の染色体における所定の標的遺伝子座に組み込まれてもよい。本発明の好ましい実施形態において、組込みクローニングベクターは、宿主細胞のゲノムにおける所定の標的遺伝子座のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ断片を含み、クローニングベクターの組込みを所定の遺伝子座に標的化する。標的組込みを促進するため、クローニングベクターは、好ましくは細胞の形質転換前に線状化される。線状化は、好ましくは、クローニングベクターの少なくとも一端、しかし好ましくは両端に標的遺伝子座と相同な配列が隣接するように実施される。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは少なくとも３０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも０．１ｋｂ、さらに好ましくは少なくとも０．２ｋｂ、より好ましくは少なくとも０．５ｋｂ、さらにより好ましくは少なくとも１ｋｂ、最も好ましくは少なくとも２ｋｂである。好ましくは、宿主細胞のゲノムへの標的組込み効率、即ち所定の標的遺伝子座における組込み効率は、宿主細胞の相同組換え能力の増強により増加する。
好ましくは、標的遺伝子座と相同な、クローニングベクターにおける相同フランキングＤＮＡ配列は、高発現遺伝子座に由来し、これは即ち、宿主細胞において高い発現レベルの能力を有する遺伝子に由来することを意味する。高い発現レベルの能力を有する遺伝子、即ち高発現遺伝子は、本明細書では、ｍＲＮＡが例えば誘導条件下で全細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）を構成し得る遺伝子か、或いは遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも１％（ｗ／ｗ）を構成し得るか、又は分泌遺伝子産物の場合に、少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルまで分泌され得る遺伝子として定義される（欧州特許第３５７ １２７ Ｂ１号明細書に記載される）。
いくつかの好ましい高発現真菌遺伝子を例として提供する：アスペルギルス類（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ｃｂｈ）遺伝子。これらの目的に最も好ましい高発現遺伝子は、グルコアミラーゼ遺伝子、好ましくはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）タカアミラーゼ遺伝子、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ遺伝子、好ましくはｃｂｈ１、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ｃｂｈ遺伝子又はＰ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）由来のｃｂｈ遺伝子である。
変異型微生物宿主細胞に２つ以上の核酸配列コピーを挿入して、前記配列によりコードされる産物の産生を増加（過剰発現）させてもよい。これは、好ましくはそのゲノムにＤＮＡ配列のコピーを組み込むことにより、より好ましくはＤＮＡ配列の組込みを前段落で定義した高発現遺伝子座の１つに標的化することにより行うことができる。或いはこれは、増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を核酸配列と共に含めることにより行うことができ、ここでは適切な選択可能薬剤の存在下で細胞を培養することにより、選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って核酸配列のさらなるコピーを含む細胞を選択することができる。過剰発現させるＤＮＡ配列のコピー数をさらに一層増やすには、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載されるとおりの遺伝子変換技法を用い得る。
ベクター系は、単一のベクター若しくはプラスミドであっても、又は宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡ、又はトランスポゾンを一体になって含む２つ以上のベクター若しくはプラスミドであってもよい。
ベクターは、好ましくは１つ以上の選択可能マーカーを含み、それにより形質転換細胞を容易に選択することが可能となる。選択可能マーカーは、産物が殺生物剤又はウイルス耐性、耐重金属性、原栄養性から栄養要求性などを提供する遺伝子である。選択可能マーカーは発現ベクター上の細胞に発現カセットとして導入されてもよく、又は別個の発現ベクター上に導入されてもよい。
糸状菌細胞で使用される選択可能マーカーは、限定はされないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｂｌｅＡ（フレオマイシン結合）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ＮＡＴ又はＮＴＣ（ノールセオスリシン）及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、並びに他の種由来の等価物を含む群から選択され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）細胞における使用に好ましいのは、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ（例えば欧州特許第６３５５７４ Ｂ１号明細書、欧州特許出願公開第０７５８０２０Ａ２号明細書、欧州特許出願公開第１７９９８２１Ａ２号明細書、国際公開第９７／０６２６１Ａ２号パンフレットを参照）及びｐｙｒＧ遺伝子並びにストレプトミセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子である。より好ましくはａｍｄＳ遺伝子が使用され、さらにより好ましくはＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｄＳ遺伝子が使用される。最も好ましい選択可能マーカー遺伝子は、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡプロモーターと融合したＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳコード配列である（欧州特許第６３５５７４ Ｂ１号明細書を参照）。他の好ましいＡｍｄＳマーカーは、国際公開第２００６／０４０３５８号パンフレットに記載されるものである。他の糸状菌類由来のＡｍｄＳ遺伝子もまた用いられ得る（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。
細菌で使用することのできるマーカーとしては、ＡＴＰシンテターゼ、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ｐｖｒＡ）、細菌Ｇ４１８耐性遺伝子（これは酵母でも使用することができるが、糸状菌では使用できない）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、フレオマイシン耐性遺伝子（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））及びβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子が挙げられる。ベクターは、例えばＲＮＡの産生のためインビトロで使用されてもよく、又は宿主細胞のトランスフェクション若しくは形質転換に使用されてもよい。
多くの糸状菌及び酵母の形質転換に使用することができる万能マーカー遺伝子、例えばアセトアミダーゼ遺伝子又はｃＤＮＡ（Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）又はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のａｍｄＳ、ｎｉａＤ、ｆａｃＡ遺伝子又はｃＤＮＡ）、又はＧ４１８、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、メトトレキサート、フレオマイシン又はベノミル耐性（ｂｅｎＡ）などの抗生物質耐性を提供する遺伝子。或いは、対応する変異宿主株を必要とする栄養要求マーカーなどの、特異的な選択マーカー：例えばＤ−アラニンラセマーゼ（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来）、ＵＲＡ３（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来又は他の酵母由来の類似遺伝子）、ｐｙｒＧ又はｐｙｒＡ（Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来）、ａｒｇＢ（Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来）又はｔｒｐＣを使用することができる。好ましい実施形態において選択マーカーは、選択マーカー遺伝子を含まないポリペプチドの産生能を有する形質転換宿主細胞を得るため、発現コンストラクトの導入後に形質転換宿主細胞から欠失される。
本発明の組換え発現ベクターを構築するために上記に記載されるエレメントのライゲーションに使用される手順は、当業者に周知されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９５を参照）。
さらに、ＤＮＡ単離、ゲル電気泳動、核酸の酵素制限修飾、サザン解析、細胞の形質転換等の標準的な分子クローニング技術が当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）「ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏにより記載されている。
核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法に従いｃＤＮＡ、ｍＲＮＡか、或いはゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、且つ適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し得る。そのように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けることができる。
好ましくは、変異微生物宿主細胞は、ポリヌクレオチドの発現が向上し、それにより目的の化合物であるポリペプチド又は目的の化合物の産生に関与するポリペプチドの産生が増進するように修飾される。
好ましくは、宿主細胞のゲノムへの標的組込み効率、即ち所定の標的遺伝子座における組込み効率は、宿主細胞の相同組換え能力の増強により増加する。細胞のかかる表現型には、好ましくは国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットに記載されるとおりの欠損したｈｄｆＡ又はｈｄｆＢが関わる。国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットは、標的組込み効率の上昇を含む糸状菌細胞を得るための好ましい方法を開示している。
任意選択で、宿主細胞は、高い小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を含むことで目的のポリペプチドの産生能が増進するように修飾されている。ＵＰＲは、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７０Ａ１号明細書及び／又は米国特許出願公開第２００１／００３４０４５Ａ１号明細書及び／又は国際公開第０１／７２７８３Ａ２号パンフレット及び／又は国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットに記載される技法により増加させ得る。より具体的には、高いＵＰＲを有する宿主細胞を得るには、ＨＡＣ１及び／又はＩＲＥ１及び／又はＰＴＣ２のタンパク質レベルを調整し得るか、及び／又はＳＥＣ６１タンパク質を操作し得る。
当業者は、１つ以上の発現カセット及び選択可能マーカーによる細胞の形質転換方法を理解している。例えば、当業者は１つ以上の発現ベクターを使用することができ、この１つ以上のクローニングベクターは発現カセット及び選択可能マーカーを含む。
変異微生物宿主細胞の形質転換は、例えば電気穿孔法、パーティクルボンバードメント又はマイクロプロジェクタイルボンバードメント、プロトプラスト法及びアグロバクテリウム媒介形質転換（ＡＭＴ）を含めた、任意の好適な公知の方法により実施し得る。好ましくはプロトプラスト法が用いられる。形質転換手順は、Ｊ．Ｒ．Ｓ．Ｆｉｎｃｈａｍ，「真菌における形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｕｎｇｉ）」．１９８９，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ．５３，１４８−１７０により記載されている。
ポリヌクレオチド、発現ベクター又は核酸コンストラクトの細胞への導入による変異微生物宿主細胞の形質転換は、好ましくは当該技術分野において周知の技法により実施される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ；Ａｕｓｕｂｅｌ，前掲を参照）。形質転換には、それ自体公知の方法におけるプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生からなる過程が関わり得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞の形質転換に好適な手順は、欧州特許第２３８ ０２３号明細書及びＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８４，米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ） ８１：１４７０−１４７４に記載される。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を使用したアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及び他の糸状菌宿主細胞の形質転換に好適な手順が、例えば、Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，「糸状菌類のアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）」．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８，１６：８３９−８４２．正誤表：Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８ １６：１０７４に記載される。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種の好適な形質転換方法が、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７１５６により、又は国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載される。他の方法、例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，「偏性植物病原性真菌エリシフェ・グラミニスｆ・エスピー・ホルデイの遺伝子銃形質転換（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｂｌｉｇａｔｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ，Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ）」．１９９５，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．２９：１００−１０２に記載されるとおりの遺伝子銃形質転換を使用する方法を適用してもよい。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ及びＧｕａｒｅｎｔｅ，編者Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．及びＳｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，「酵母遺伝学及び分子生物学の手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１９４巻，ｐｐ１８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ，１９８３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５３：１６３；及びＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ，１９７８，米国科学アカデミー紀要 ７５：１９２０により記載される手順を用いて形質転換し得る。
変異型微生物宿主細胞における目的の化合物（遺伝子）をコードするか又は細胞による目的の化合物の産生に関与する化合物をコードするポリヌクレオチドのコピーの量を増大させるためには、宿主細胞の複数の形質転換が必要となり得る。このようにして、宿主細胞により産生される種々の酵素の比に影響を及ぼし得る。また、形質転換しようとするポリヌクレオチドのコピーの量を増加させるため、発現ベクターが複数の発現カセットを含んでもよい。
別の方法は、ポリヌクレオチド毎に異なる制御配列を選択することであってよく、制御配列によって（選択に応じて）、所望のポリペプチドの産生が上昇又は低下し得る。
選択可能マーカーで形質転換される細胞は、選択可能マーカーの存在に基づき選択することができる。（アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））細胞の形質転換の場合、通常、細胞が全ての核酸物質で同時に形質転換されるとき、選択可能マーカーが存在すると、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた存在する。
本発明はまた、本発明に係る変異微生物宿主細胞の作製方法であって：
ａ．本明細書に記載されるとおりの親微生物宿主細胞を提供するステップ；
ｂ．親微生物宿主細胞を修飾するステップ、好ましくは親微生物宿主細胞のゲノムを修飾するステップであって、それにより、親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に：
（ｉ）配列番号３に記載のポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一のポリペプチド、好ましくは、それと少なくとも７０％同一の、配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一のポリペプチド、好ましくは、それと少なくとも７０％同一の、且つ配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるか又は配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドが、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有する、ポリペプチド；
（ｉｖ）配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２の相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有するポリペプチド；
からなる群から選択される本明細書に記載されるとおりのポリペプチドの産生が欠損している本明細書に記載されるとおりの変異微生物宿主細胞を生じさせるステップ
を含む方法も提供する。
この文脈内で、当業者には、本発明に係る変異微生物宿主細胞に適用可能な具体的な実施形態が、本発明の他の態様にもまた適用可能であり得ることは明らかであろう。
本発明はさらに、微生物発酵による目的の化合物の作製方法であって、
ａ．目的の化合物の発現能を有する本発明に係る変異微生物宿主細胞を提供するステップ、
ｂ．目的の化合物の発現を促す条件下で前記微生物宿主細胞を培養するステップ、
ｃ．任意選択で、培養培地から目的の化合物を単離するステップ
を含む方法を提供する。
ステップａ．では、変異微生物宿主細胞は、本明細書に記載されるとおりの変異宿主細胞であり得る。
ステップｂ．では、ステップａ．の変異微生物宿主細胞が、本明細書に記載されるとおりの目的の化合物の発現を促す条件下で培養される。変異微生物細胞は、当該技術分野で公知の方法を用いて、目的の化合物の産生に好適な栄養培地で培養される。例えば、細胞は振盪フラスコ培養、実験室用又は工業用発酵槽での小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、フェドバッチ、又は固形発酵を含む）により、好適な培地において且つ目的の化合物の産生及び／又は単離を可能にする条件下で実施して培養され得る。培養は、炭素源及び窒素源並びに無機塩類を含む好適な栄養培地で、当該技術分野において公知の手順を使用して行われる（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．及びＬａＳｕｒｅ，Ｌ．編，Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＣＡ，１９９１を参照）。好適な培地は供給業者から入手可能であるか、又は公開されている組成（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログにある）を使用して調製してもよい。目的の化合物が栄養培地中に分泌される場合、化合物は培地から直接単離することができる。目的の化合物が分泌されない場合、それは細胞溶解物から単離することができる。
ステップｃ．では、目的の化合物が任意選択で単離され得る。本明細書に記載されるとおりの目的の化合物は、当該技術分野において公知の方法により単離され得る。例えば、目的の化合物は、限定はされないが、遠心、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿を含む従来手法によって栄養培地から単離され得る。単離された目的の化合物は、次に、限定はされないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手法（例えば、分取等電点電気泳動）、溶解度差（例えば、硫安塩析）、又は抽出を含めた、当該技術分野において公知の様々な手法によりさらに精製され得る（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ及びＬａｒｓ Ｒｙｄｅｎ編，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）。用途によっては、目的の化合物は培養ブロスからの実質的な単離なしに使用され得る；バイオマスからの培養培地の分離で十分であり得る。
本発明に係る目的の化合物の作製方法の好ましい実施形態において、修飾されていない親微生物宿主細胞が使用される場合の目的の化合物の作製方法の収率と比較し、同じ条件下で測定した場合に、目的の化合物の収率は増加する。好ましくは、収率は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％増加する。より好ましくは、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％又は少なくとも２００％。さらにより好ましくは少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％又は少なくとも３００％。
本明細書に定義するとおりの変異微生物宿主細胞は、本明細書に記載されるとおりの目的の化合物の作製方法において使用され得る。
微生物発酵による目的の化合物の作製方法において作製される目的の化合物は、本明細書に記載されるとおりの任意の目的の化合物であり得る。
［本発明の好ましい実施形態］
１．修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、
ａ．配列番号３に記載のポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一の、且つ好ましくは配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一の、且つ好ましくは配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
ｃ．配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるか又は配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドが、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有する、ポリペプチド；
ｄ．配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２の相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有するポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドの産生の欠損をもたらすように好ましくはそのゲノムが修飾されている変異微生物宿主細胞。
２．配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドが、配列番号４に記載の成熟ポリペプチドである、実施形態１に記載の変異微生物宿主細胞。
３．実施形態１ａ．〜１．ｄに記載のポリペプチドが、グリコシドヒドロラーゼ活性である酵素活性、より好ましくは、α−アミラーゼ活性［ＥＣ３．２．１．１］、イソアミラーゼ活性、イヌリナーゼ活性、インベルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２６］、マルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２０］、イソマルターゼ活性、プルラナーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、シクロデキストリナーゼ活性、キトサナーゼ活性、デキストラナーゼ活性、スクラーゼ−イソマルターゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、グリコーゲン脱分枝酵素活性からなる群から選択される酵素活性を有する、実施形態１又は２に記載の変異微生物宿主細胞。
４．実施形態１ａ．〜１．ｄに記載のポリペプチドが、α−グルコノトランスフェラーゼ活性である酵素活性を有し、前記酵素活性が、好ましくはグリコシドトランスフェラーゼ又はグリコシドシンターゼ活性であり、より好ましくは、グリコーゲン分枝酵素活性、α−１，３−グルカンシンターゼ酵素活性［ＥＣ２．４．１．１８３］、α−１，４−グルカンシンターゼ活性、α−１，６−グルカンシンターゼ活性、β−１，３−グルカンシンターゼ活性、β−１，４−グルカンシンターゼ活性、β−１，６−グルカンシンターゼ活性、グルコアミラーゼ活性、マルトペンタオース形成アミラーゼ活性、マルトヘキサオース形成アミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、α−グルコシダーゼＩＩ活性、α−キシロシダーゼ活性からなる群から選択される酵素活性である、実施形態１又は２に記載の変異微生物宿主細胞。
５．修飾が、
ａ）修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、実施形態１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドの産生の低下をもたらし又はその産生をなくす修飾、及び／又は
ｂ）修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、活性が低下した又は活性を有しない実施形態１ａ．〜１．ｄに定義されるとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドをもたらす修飾
を含む、実施形態１〜５のいずれか一つに記載の変異微生物宿主細胞。
６．変異微生物宿主細胞が、
ａ．修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、実施形態１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドをより少なく産生するか、又は実施形態１ａ．〜１ｄに定義されるとおりのポリペプチドを産生しない；及び／又は
ｂ．修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、活性が低下した又は活性を有しない実施形態１ａ．〜１ｄに定義されるとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドを産生する、
実施形態１〜５のいずれか一つに記載の変異微生物宿主細胞。
７．変異微生物宿主細胞が、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、１％少ない、少なくとも５％少ない、少なくとも１０％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、少なくとも９１％少ない、少なくとも９２％少ない、少なくとも９３％少ない、少なくとも９４％少ない、少なくとも９５％少ない、少なくとも９６％少ない、少なくとも９７％少ない、少なくとも９８％少ない、少なくとも９９％少ない、又は少なくとも９９．９％少ない実施形態１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドを産生し、好ましくは変異微生物宿主細胞が、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドを実質的に産生しない、実施形態１〜６のいずれか一つに記載の変異微生物宿主細胞。
８．変異微生物宿主細胞が、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、１％低い（酵素）活性、少なくとも５％低い活性、少なくとも１０％低い活性、少なくとも２０％低い活性、少なくとも３０％低い活性、少なくとも４０％低い活性、少なくとも５０％低い活性、少なくとも６０％低い活性、少なくとも７０％低い活性、少なくとも８０％低い活性、少なくとも９０％低い活性、少なくとも９１％低い活性、少なくとも９２％低い活性、少なくとも９３％低い活性、少なくとも９４％低い活性、少なくとも９５％低い活性、少なくとも９６％低い活性、少なくとも９７％低い活性、少なくとも９８％低い活性、少なくとも９９％低い活性、又は少なくとも９９．９％低い活性を有する実施形態１ａ．〜１ｄに定義されるとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドを産生し、好ましくは変異微生物宿主細胞は、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で分析した場合に、実質的に活性を有しない請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドを産生する、実施形態１〜７のいずれか一つに記載の変異微生物宿主細胞。
９．そのゲノムにおける修飾が、
ａ）実施形態１ｃ．又は１ｄ．に定義されるとおりのポリヌクレオチドの完全又は部分欠失；
ｂ）実施形態１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドをコードしないか、又は部分的又は完全に不活性型の実施形態１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列による、実施形態１ｃ．又は１ｄ．に定義されるとおりのポリヌクレオチドの完全又は部分置換；
ｃ）ポリヌクレオチド配列における１つ以上のヌクレオチドの挿入と、その結果としての、実施形態１ａ．〜１ｄに定義されるとおりのポリペプチドの部分的又は完全な不活性化による、実施形態１ｃ．又は１ｄ．に定義されるとおりのポリヌクレオチドの破壊
から選択される、実施形態１〜８のいずれか一つに記載の変異微生物宿主細胞。
１０．実施形態１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドの産生の低下をもたらし又はその産生をなくす修飾が、前記ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生低下に起因する、実施形態１〜９のいずれか一つに記載の変異微生物宿主細胞。
１１．目的の化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又は目的の化合物の産生に関与する化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の変異微生物宿主細胞。
１２．目的の化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又は目的の化合物の産生に関与する化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、プロモーター、好ましくは誘導性プロモーターに作動可能に連結される、実施形態１１に記載の変異微生物宿主細胞。
１３．プロモーターが、炭水化物誘導性プロモーターであり、好ましくは、デンプン誘導性プロモーター、より好ましくはグルコアミラーゼプロモーター、酸安定性アミラーゼプロモーター、α−アミラーゼプロモーター及びタカアミラーゼプロモーターから選択されるプロモーターである、実施形態１〜１２のいずれか一つに記載の変異微生物宿主細胞。
１４．真核細胞、より好ましくは真菌細胞である、実施形態１〜１３のいずれか一つに記載の変異微生物宿主細胞であって、さらにより好ましくは糸状菌である変異微生物宿主細胞。
１５．アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ） クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラサムソニア属（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）から選択される糸状菌、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アクレモニウム・アラバメンセ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の種である、実施形態１４に記載の変異微生物宿主細胞。
１６．変異微生物宿主細胞の作製方法であって：
ａ．親微生物宿主細胞を提供するステップ；
ｂ．親微生物宿主細胞を修飾するステップ、好ましくは親微生物宿主細胞のゲノムを修飾するステップであって、それにより、親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に：
（ｉ）配列番号３に記載のポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一のポリペプチド、好ましくは、それと少なくとも７０％同一の、配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一のポリペプチド、好ましくは、それと少なくとも７０％同一の、且つ配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるか又は配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドが、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有する、ポリペプチド；
（ｉｖ）配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２の相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有するポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドの産生が欠損している変異微生物宿主細胞を生じさせるステップ
を含む方法。
１７．変異微生物宿主細胞が、実施形態１〜１５のいずれか一つに記載の変異微生物宿主細胞である、実施形態１６に記載の方法。
１８．微生物発酵による目的の化合物の作製方法であって：
ａ．実施形態１〜１５のいずれか一つに記載の又は実施形態１６又は１７に記載の方法により産生される、目的の化合物の発現能を有する変異微生物宿主細胞を提供するステップ
ｂ．目的の化合物の発現を促す条件下で前記変異微生物宿主細胞を培養するステップ、
ｃ．任意選択で、培養培地から目的の化合物を単離するステップ
を含む方法。
１９．目的の化合物が、バイオマス、生体高分子、代謝産物からなる群から選択される生物学的化合物であり、好ましくは目的の化合物が生体高分子又は代謝産物から選択される、実施形態１８に記載の方法。
２０．生体高分子が、核酸、ポリアミン、ポリオール、ポリペプチド（タンパク質、好ましくは酵素など）若しくはポリアミド、又は多糖から選択され、又は代謝産物が、一次若しくは二次代謝産物から選択される、実施形態１９に記載の方法。
２１．目的の化合物が酵素、好ましくはグルコースオキシダーゼである、実施形態２０に記載の方法。
２２．修飾されていない親微生物宿主細胞が使用される場合の目的の化合物の作製方法の収率と比較し、同じ条件下で測定した場合に、目的の化合物の収率が増加し、好ましくは収率が、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％又は少なくとも２００％、さらにより好ましくは少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％又は少なくとも３００％増加する、実施形態１８〜２１のいずれか一つに記載の方法。
以下に本発明を例によって説明するが、それらの例が本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
［実施例］
［株］
ＷＴ １：このアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）株を野生型株として使用する。この株はＣＢＳ機関に寄託番号ＣＢＳ５１３．８８として寄託されている。
ＧＢＡ ３０６：ＷＴ１を出発株として使用したＧＢＡ ３０６の構築は、国際公開第２０１１／００９７００号パンフレットに詳細に記載されている。このＧＢＡ ３０６株は以下の遺伝子型を有する：ΔｇｌａＡ、ΔｐｅｐＡ、ΔｈｄｆＡ、適応ＢａｍＨＩアンプリコン、ΔａｍｙＢＩＩ、ΔａｍｙＢＩ、及びΔａｍｙＡ。
ＰＧＯＸ−２：このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株は、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）グルコースオキシダーゼ酵素を発現するＧＢＡ３０６株である。ＰＧＯＸ−２株は、ｐＧＢＴＯＰＧＯＸ−３発現ベクター（図１を参照のこと−コドンペア最適化ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）グルコースオキシダーゼ（国際公開第２０１２／００１１６９号パンフレットの配列番号２９に示されるとおり、及びタンパク質配列は配列番号３０に示されるとおり）コード配列がクローニングされているｐＧＢＴＯＰ１２発現ベクター（国際公開第２０１１／００９７００号パンフレット））を使用して構築し、これは、国際公開第２０１１／００９７００号パンフレット及び国際公開第２０１２／００１１６９号パンフレットに記載されるとおりの方法を用いて、ａｍｄＳ選択可能マーカー遺伝子を含むベクターｐＧＢＡＡＳ−３との同時形質転換によって導入された。形質転換及び対抗選択（同様に国際公開第９８／４６７７２号パンフレット及び国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されるとおり）の後、続いて複数のコピーを含む株を選択し、１つの多コピー酵素産生株を選択してＰＧＯＸ−２と命名した。この株を、続く実験においてグルコースオキシダーゼ酵素産生株として使用する。
ＰＬＡ−２及びＬＩＰ−２：ブタホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）タンパク質及び脂肪分解性Ｌ０１酵素（国際公開第２００９／１０６５７５号パンフレットに記載されるとおりの配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、且つ配列番号１のポリヌクレオチド配列によりコードされる）を、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＧＢＡ ３０６における酵素発現のモデルタンパク質として選択した。両方の酵素とも、異なるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）バックグラウンドでも発現したが、発現カセット及びコード配列は、国際公開第２０１２００１１６９号パンフレットの実施例１の記載と本質的に同様であった。
ブタホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）タンパク質（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｉ．Ｎ．，Ｊｅｅｎｅｓ Ｄ．Ｊ．，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ａ．Ｐ．，Ｓｕｍｎｅｒ Ｉ．Ｇ．及びＡｒｃｈｅｒ Ｄ．Ｂ．（１９９２）「アスペルギルス・ニガーにおける異種遺伝子発現。グルコアミラーゼ−ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２融合タンパク質の分泌及びプロセシングにより成熟酵素が産生される（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ．ａ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ−ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｔｏ ｙｉｅｌｄ ｍａｔｕｒｅ ｅｎｚｙｍｅ）」Ｇｅｎｅ １２２：１５５−１６１）を、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株における酵素発現のモデルタンパク質として選択した。ＰＬＡ２の過剰発現用断片を、プロＰＬＡ２とＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の天然グルコアミラーゼＡ遺伝子の融合として作製し、原則的に、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）及び国際公開第２０１２００１１６９号パンフレットにより記載されるとおり調製した。ＧＬＡとｐｏｒＰＬＡ２との間のｋｅｘ２切断部位（ＫＲ）は除去され、従ってコードされるＧＬＡ−プロＰＬＡ２融合タンパク質は、配列番号２０に示すとおりである。
上述のタンパク質をコードするこのｇｌａＡ−ｐｌａ２融合遺伝子を、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット及び国際公開第９９／３２６１７号パンフレットの記載と同じ手法を使用してＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｐＧＢＴＯＰ−１２発現ベクターにクローニングし、ｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２（図３）を作成する。脂肪分解酵素Ｌ０１をコードする遺伝子を、本質的に国際公開第２０１２００１１６９号パンフレットに記載されるとおりグルコアミラーゼプロモーターの制御下で、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット及び国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されるとおりの手法を使用してＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｐＧＢＴＯＰ−１２発現ベクターにクローニングし、ｐＧＢＴＯＰＬＩＰ−２（図２）を得た。
ＧＢＡ ３０６株を、ａｍｄＳ選択可能マーカー遺伝子を含むベクターｐＧＢＡＡＳ−３と、それぞれｐＧＢＴＯＰＬＩＰ−２及びｐＧＢＴＯＰＰＬＡ−２ベクターとで同時形質転換し、続いて形質転換体を選択することにより、脂肪分解酵素及びグルコアミラーゼ−ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２融合タンパク質の酵素産生株を構築した。形質転換及び対抗選択手法（国際公開第９８／４６７７２号パンフレット及び国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されるとおり）と、続く株の選択により、リパーゼ及びグルコアミラーゼ−ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２融合タンパク質産生株を産生する（多コピー）株がもたらされた。各株バックグラウンドにつき１つの高コピー酵素産生株をＧＢＡ ３０６バックグラウンド用に選択し、ＬＩＰ−２及びＰＬＡ−２と命名した。これらの株を、続く実験におけるそれぞれの酵素産生株として使用した。
［分子生物学技法］
これらの株において、当業者に公知の分子生物学的技法を用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１を参照）、以下に記載するとおりいくつかの遺伝子を過剰発現させ、残りは下方制御した。遺伝子過剰発現用の発現ベクター及び下方制御用の破壊ベクターの一般的な設計、形質転換、マーカー及び選択培地の使用の例は、国際公開第１９９８４６７７２号パンフレット、国際公開第１９９９３２６１７号パンフレット、国際公開第２００１１２１７７９号パンフレット、国際公開第２００５０９５６２４号パンフレット、国際公開第２００６０４０３１２号パンフレット、欧州特許第６３５５７４Ｂ号明細書、国際公開第２００５１００５７３号パンフレット、国際公開第２０１１００９７００号パンフレット及び国際公開第２０１２００１１６９号パンフレットを参照することができる。全ての遺伝子置換ベクターが、それぞれのＯＲＦ配列の約１〜２ｋｂのフランキング領域を含み、相同組換えが所定のゲノム遺伝子座で起こるように標的化する。加えて、それらのベクターは、ダイレクトリピートの間に形質転換用のＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）双方向性ａｍｄＳ選択マーカーを含む。本明細書の全ての例において遺伝子欠失に適用される方法は線状ＤＮＡを使用し、これは二重乗換えによりフランキング配列の相同な遺伝子座でゲノムに組み込まれ、このようにして欠失させようとする遺伝子がａｍｄＳ遺伝子に置き換わる。形質転換後、ダイレクトリピートが、（第２の）相同組換イベントによる選択マーカーの除去を可能にする。ａｍｄＳマーカーの除去は、フルオロアセトアミド培地に播き、マーカー遺伝子を含まない株の選択をもたらすことにより行うことができる。形質転換及び続く対抗選択のこの戦略を使用して（これは欧州特許第０ ６３５ ５７４号明細書で「マーカー遺伝子フリー（ＭＡＲＫＥＲ−ＧＥＮＥ ＦＲＥＥ）」手法とも記載される）、ａｍｄＳマーカーを株修飾プログラムにおいて無限に使用することができる。
［Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）振盪フラスコ発酵］
国際公開第２０１０／１０２９８２号パンフレットに記載されるとおり、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株を前培養し、３４℃及び１７０ｒｐｍで培養した。国際公開第２０１０／１０２９８２号パンフレットにさらに詳細に記載されるとおり、例に指示されるとおりの培養時間として、前培養物は２０ｍｌのＣＳＬ前培養培地中にあり、一晩成長させた後、この培養物の１０ｍｌを１００ｍｌの発酵培地（ＦＭ）に移した。
［Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）２４ウェルマイクロタイタープレート発酵］
ウェル当たり４ｍｌのＦＭが入った２４ウェルマイクロタイタープレートに、１×１０５〜５×１０５のＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）胞子を接種した。このプレートを３４℃、５５０ｒｐｍ及び８０％湿度で１２０時間インキュベートした。
［酵素活性測定］
グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）活性及びＧＯＸ活性プレートアッセイ（ｏ−アニシジンを使用）を、Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９０，「グルコースオキシダーゼ過剰産生及びアスペルギルス・ニガーのネガティブ突然変異体（Ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）」，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３：６８３−６８６に記載されるとおり測定した。
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）培養ブロス中のホスホリパーゼＰＬＡ２活性（ＰＬＡ２）を分光光度法で測定するため、人工基質：１，２−ジチオジオクタノイルホファチジルコリン（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ｄｉＣ８、基質）を使用する。このアッセイのさらなる詳細は、国際公開第２００６／０４０３１２号パンフレットに記載される。
試料は、（部分的に）不活性な（処理されていない）形態のＰＬＡ２＝プロＰＬＡ２を含有し得る。トリプシンを加えると、ホスホリパーゼＡ２からプロ配列が切り取られる。プロＰＬＡ２をトリプシン処理することにより、上清中に存在するＰＬＡ２の完全な活性化がもたらされる。トリプシン処理後の酵素活性は、ＣＰＵ（発色ホスホリパーゼＡ２単位）又はＰＬＡ２活性（相対ＣＰＵ活性）で表される。
リパーゼ活性は、国際公開第２００９／１０６５７５号パンフレットの「活性測定（ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）」の節に記載されるとおり計測することができる。
［実施例１］
［グリコシドヒドロラーゼ遺伝子欠失を含むアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＰＧＯＸ−２株の構築手法］
グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）関連遺伝子（遺伝子コード：Ａｎ０１ｇ１０９３０、Ａｎ０４ｇ０６９２０、及びＡｎ０９ｇ０３０７０としても知られ、ＧＨ３１又はＧＨ１３ファミリーの推定α−グルカンシンターゼ及び／又は（推定）α−グルコシダーゼ酵素をコードし、任意選択でデンプン分解又は細胞壁α−グルカン合成に関与する）を破壊できるようにするため、上記に記載したとおりの３つの遺伝子の各々について遺伝子置換ベクターを設計した。アミラーゼコード遺伝子の詳細は、表１を参照し得る。
Figure 2015522288
ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＡＭＹ１（図４）及び他のｐＧＢＤＥＬ変異体（これらは相同組換えのためそれぞれのアミラーゼコードＯＲＦの約１ｋｂのフランキング領域を含む）を使用して、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＰＧＯＸ−２を形質転換した。組換え現象が本当に起こり、且つ株が正しいことを検証した後、得られた正しい株ＰＧＯＸ−２、ＰＧＯＸ−２＿ＡＭＹ１、ＰＧＯＸ−２＿ＡＭＹ２、ＰＧＯＸ−２＿ＡＭＹ４−１及びＰＧＯＸ−２＿ＡＭＹ４−２を、ＰＧＯＸ−２株バックグラウンドでそれぞれのＧＨ遺伝子（表１）が不活性化された代表株として選択した。
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＬＩＰ−２株及びＰＬＡ−２株についても同じ手法に従った。これにより、それぞれＬＩＰ−２株及びＰＬＡ−２株バックグラウンドでそれぞれのＧＨ遺伝子（表１）が不活性化された株ＬＩＰ−２、ＬＩＰ−２＿ＡＭＹ４−１、ＬＩＰ−２＿ＡＭＹ４−２、ＰＬＡ−２及びＰＬＡ−２＿ＡＭＹ４が得られた。
［実施例２］
［グルコースオキシダーゼ酵素産物の産生量に関するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＰＧＯＸ−２誘導株の分析］
ＧＨ遺伝子破壊の効果を評価できるようにするため、これらの形質転換体のＦＭ培地における振盪フラスコ分析を分析した。接種後４日目及び６日目、培地試料を採取した。培養上清中のグルコースオキシダーゼレベルを分析した。グルコアミラーゼプロモーターの制御下で行われるグルコースオキシダーゼ産生に関して、意外にも、ＡｇｓＥ−Ａｎ０９ｇ０３０７０の破壊がグルコースオキシダーゼ産生の増加をもたらし（図５）、一方、他の２つａｇｄＡ及びａｇｄＢの破壊は、グルコースオキシダーゼ産生の顕著な効果は示さなかった。ＰＧＯＸ−２＿ＡＭＹ４−１株及びＰＧＯＸ−２＿ＡＭＹ４−２株の両方とも、培養上清中のグルコースオキシダーゼ活性から特定されるとおり、いずれの試料採取日（４日目及び６日目）においても活性が増加した。ＡｇｓＥ破壊時のこの産生増加は、実施例１に記載されるとおり単離したランダム形質転換体についてプレート上のＧＯＸ発現を分析することにより確認された（図６）。これらの例から、本発明に係る糸状菌細胞が、マルトースを炭素源として含有する培地中で目的のタンパク質についてより高い力価を有し、ＡｇｓＥ破壊株バックグラウンドでタンパク質産物量の増加を生じさせる能力があることが分かる。
［実施例３］
［脂肪分解酵素Ｌ０１産物の産生量に関するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＬＩＰ−２誘導株の分析］
ＰＧＯＸ−２バックグラウンドにおけるグルコースオキシダーゼ産生に正の効果を示したＡｇｓＥ遺伝子破壊を、ＬＩＰ−２バックグラウンドでさらに試験した。ＡｇｓＥ遺伝子破壊がリパーゼ産生に及ぼす効果を評価できるようにするため、これらの形質転換体のＦＭ培地における振盪フラスコ分析を分析した。接種後３〜６日目、培地試料を採取した。培養上清中のリパーゼレベルを分析した；種々の株の最大生産性を比較した。グルコアミラーゼプロモーターの制御下で行われるリパーゼ産生に関して、意外にも、ＡｇｓＥ−Ａｎ０９ｇ０３０７０の破壊がリパーゼ産生の増加をもたらした（図７）。ＬＩＰ−２＿ＡＭＹ４−１株及びＬＩＰ−２＿ＡＭＹ４−２株の両方とも、培養上清中のリパーゼ活性から特定されるとおり、活性が増加した。これらの例から、本発明に係る糸状菌細胞が、マルトースを炭素源として含有する培地中で目的のタンパク質についてより高い力価を有し、ＡｇｓＥ破壊株バックグラウンドでタンパク質産物量の増加を生じさせる能力があることが分かる。
［実施例４］
［ホスホリパーゼＡ２酵素産物の産生量に関するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＰＬＡ−２誘導株の分析］
ＰＧＯＸ−２バックグラウンドにおけるグルコースオキシダーゼ産生及びＬＩＰ−２バックグラウンドにおけるリパーゼ産生に正の効果を示したＡｇｓＥ遺伝子破壊を、ＰＬＡ−２バックグラウンドでさらに試験した。ＡｇｓＥ遺伝子破壊がホスホリパーゼＡ２産生に及ぼす効果を評価できるようにするため、これらの形質転換体のＦＭ培地における２４ウェルマイクロタイタープレート発酵を分析した。接種後１２０時間目、培地試料を採取した。培養上清中のホスホリパーゼＡ２レベルを分析した。グルコアミラーゼプロモーターの制御下で行われるホスホリパーゼＡ２産生に関して、意外にも、ＡｇｓＥ−Ａｎ０９ｇ０３０７０の破壊がホスホリパーゼＡ２産生の増加をもたらした（図８）。これらの例から、本発明に係る糸状菌細胞が、マルトースを炭素源として含有する培地中で目的のタンパク質についてより高い力価を有し、ＡｇｓＥ破壊株バックグラウンドでタンパク質産物量の増加を生じさせる能力があることが分かる。

Claims (22)

  1. 修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、
    ａ．配列番号３に記載のポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一の、且つ前記配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
    ｂ．配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一の、且つ前記配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
    ｃ．配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるか又は配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドが、前記配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有する、ポリペプチド；
    ｄ．配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２の相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、前記配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
    からなる群から選択されるポリペプチドの産生の欠損をもたらすように好ましくはそのゲノムが修飾されている変異微生物宿主細胞。
  2. 前記配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドが、配列番号４に記載の成熟ポリペプチドである、請求項１に記載の変異微生物宿主細胞。
  3. 実施形態１ａ．〜１．ｄに記載の前記ポリペプチドが、グリコシドヒドロラーゼ活性である酵素活性、より好ましくは、α−アミラーゼ活性［ＥＣ３．２．１．１］、イソアミラーゼ活性、イヌリナーゼ活性、インベルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２６］、マルターゼ活性［ＥＣ３．２．１．２０］、イソマルターゼ活性、プルラナーゼ活性、グルコアミラーゼ活性、シクロデキストリナーゼ活性、キトサナーゼ活性、デキストラナーゼ活性、スクラーゼ−イソマルターゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、グリコーゲン脱分枝酵素活性からなる群から選択される酵素活性を有する、請求項１又は２に記載の変異微生物宿主細胞。
  4. 請求項１ａ．〜１．ｄに記載の前記ポリペプチドが、α−グルコノトランスフェラーゼ活性である酵素活性を有し、前記酵素活性が、好ましくはグリコシドトランスフェラーゼ又はグリコシドシンターゼ活性であり、より好ましくは、グリコーゲン分枝酵素活性、α−１，３−グルカンシンターゼ酵素活性［ＥＣ２．４．１．１８３］、α−１，４−グルカンシンターゼ活性、α−１，６−グルカンシンターゼ活性、β−１，３−グルカンシンターゼ活性、β−１，４−グルカンシンターゼ活性、β−１，６−グルカンシンターゼ活性、グルコアミラーゼ活性、マルトペンタオース形成アミラーゼ活性、マルトヘキサオース形成アミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、α−グルコシダーゼＩＩ活性、α−キシロシダーゼ活性からなる群から選択される酵素活性である、請求項１又は２に記載の変異微生物宿主細胞。
  5. 前記修飾が、
    ａ）修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドの産生の低下をもたらし又はその産生をなくす修飾、及び／又は
    ｂ）修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、活性が低下した又は活性を有しない請求項１ａ．〜１．ｄに定義されるとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドをもたらす修飾
    を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞。
  6. ａ．修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した任意選択で少ない請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドを産生するか又は請求項１ａ．〜１ｄに定義されるとおりのポリペプチドを産生しない；及び／又は
    ｂ．修飾されていない親微生物宿主細胞と比較した場合に、同じ条件下で分析したとき、活性が低下した又は活性を有しない請求項１ａ．〜１ｄに定義されるとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドを産生する、
    請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞。
  7. 前記変異微生物宿主細胞が、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、１％少ない、少なくとも５％少ない、少なくとも１０％少ない、少なくとも２０％少ない、少なくとも３０％少ない、少なくとも４０％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、少なくとも９０％少ない、少なくとも９１％少ない、少なくとも９２％少ない、少なくとも９３％少ない、少なくとも９４％少ない、少なくとも９５％少ない、少なくとも９６％少ない、少なくとも９７％少ない、少なくとも９８％少ない、少なくとも９９％少ない、又は少なくとも９９．９％少ない請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドを産生し、好ましくは前記変異微生物宿主細胞が、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドを実質的に産生しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞。
  8. 前記変異微生物宿主細胞が、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、１％低い（酵素）活性、少なくとも５％低い活性、少なくとも１０％低い活性、少なくとも２０％低い活性、少なくとも３０％低い活性、少なくとも４０％低い活性、少なくとも５０％低い活性、少なくとも６０％低い活性、少なくとも７０％低い活性、少なくとも８０％低い活性、少なくとも９０％低い活性、少なくとも９１％低い活性、少なくとも９２％低い活性、少なくとも９３％低い活性、少なくとも９４％低い活性、少なくとも９５％低い活性、少なくとも９６％低い活性、少なくとも９７％低い活性、少なくとも９８％低い活性、少なくとも９９％低い活性、又は少なくとも９９．９％低い活性を有する実施形態１ａ．〜１ｄに定義されるとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドを産生し、好ましくは前記変異微生物宿主細胞が、修飾されていない親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で分析した場合に、実質的に活性を有しない請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドから誘導されるポリペプチドを産生する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞。
  9. そのゲノムにおける前記修飾が、
    ａ）請求項１ｃ．又は１ｄ．に定義されるとおりのポリヌクレオチドの完全又は部分欠失；
    ｂ）請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドをコードしないか又は部分的又は完全に不活性型の請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列による、請求項１ｃ．又は１ｄ．に定義されるとおりのポリヌクレオチドの完全又は部分置換；
    ｃ）ポリヌクレオチド配列における１つ以上のヌクレオチドの挿入と、その結果としての、請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドの部分的又は完全な不活性化による、請求項１ｃ．又は１ｄ．に定義されるとおりのポリヌクレオチドの破壊
    から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞。
  10. 請求項１ａ．〜１ｄ．に定義されるとおりのポリペプチドの産生の低下をもたらし又はその産生をなくす前記修飾が、前記ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの産生低下に起因する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞。
  11. 目的の化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド又は目的の化合物の産生に関与する化合物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞。
  12. 前記目的の化合物をコードする前記少なくとも１つのポリヌクレオチド又は前記目的の化合物の産生に関与する化合物をコードする前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、プロモーター、好ましくは誘導性プロモーターに作動可能に連結される、請求項１１に記載の変異微生物宿主細胞。
  13. 前記プロモーターが、炭水化物誘導性プロモーターであり、好ましくは、デンプン誘導性プロモーター、より好ましくはグルコアミラーゼプロモーター、酸安定性アミラーゼプロモーター、α−アミラーゼプロモーター及びタカアミラーゼプロモーターから選択されるプロモーターである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞。
  14. 真核細胞、より好ましくは真菌細胞である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞であって、さらにより好ましくは糸状菌である変異微生物宿主細胞。
  15. アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ） クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラサムソニア属（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）から選択される糸状菌、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アクレモニウム・アラバメンセ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ラサムソニア・エメルソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、タラロミセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の種である、請求項１４に記載の変異微生物宿主細胞。
  16. ａ．親微生物宿主細胞を提供するステップ；
    ｂ．前記親微生物宿主細胞を修飾するステップ、好ましくは前記親微生物宿主細胞のゲノムを修飾するステップであって、それにより、前記親微生物宿主細胞と比較し、且つ同じ条件下で測定した場合に、
    （ｉ）配列番号３に記載のポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一のポリペプチド、好ましくは、それと少なくとも７０％同一の、前記配列番号３に記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
    （ｉｉ）配列番号３に含まれる成熟ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％同一のポリペプチド、好ましくは、それと少なくとも７０％同一の、且つ前記配列番号３に含まれる成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド；
    （ｉｉｉ）配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされるか又は配列番号１又は２と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１又は１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドが、前記配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有する、ポリペプチド；
    （ｉｖ）配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション能を有するか又は配列番号１又は２の相補鎖とのハイブリダイゼーション能を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、前記配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドの少なくとも１つの活性を好ましくは有するポリペプチド；
    からなる群から選択されるポリペプチドの産生が欠損している変異微生物宿主細胞を生じさせるステップ
    を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞の産生方法。
  17. 前記変異微生物宿主細胞が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の変異微生物宿主細胞である、請求項１６に記載の方法。
  18. 微生物発酵による目的の化合物の作製方法であって、
    ａ．請求項１〜１５のいずれか一項に記載の、又は請求項１６又は１７に記載の方法により産生される、前記目的の化合物の発現能を有する変異微生物宿主細胞を提供するステップ、
    ｂ．前記目的の化合物の発現を促す条件下で前記変異微生物宿主細胞を培養するステップ、
    ｃ．任意選択で、前記培養培地から前記目的の化合物を単離するステップ
    を含む方法。
  19. 前記目的の化合物が、バイオマス、生体高分子、代謝産物からなる群から選択される生物学的化合物であり、好ましくは前記目的の化合物が生体高分子又は代謝産物から選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記生体高分子が、核酸、ポリアミン、ポリオール、ポリペプチド（タンパク質、好ましくは酵素など）若しくはポリアミド、又は多糖から選択され、又は代謝産物が、一次若しくは二次代謝産物から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記目的の化合物が、酵素、好ましくはグルコースオキシダーゼである、請求項２０に記載の方法。
  22. 修飾されていない親微生物宿主細胞が使用される場合の目的の化合物の作製方法の収率と比較し、同じ条件下で測定した場合に、前記目的の化合物の収率が増加し、好ましくは前記収率が、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％、より好ましくは、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％又は少なくとも２００％、さらにより好ましくは少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％又は少なくとも３００％増加する、ｃ１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
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