JP4638418B2 - アスペルギラス・ニガーの酵素−欠失変異体における生物学的物質の生成方法 - Google Patents
アスペルギラス・ニガーの酵素−欠失変異体における生物学的物質の生成方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、酵素−欠失アスペルギラス・ニガー変異体株における異種の生物学的物質の生成方法、酵素−欠失アスペルギラス・ニガー変異体株の入手方法、及び酵素−欠失アスペルギラス・ニガー変異体株に関する。
アスペルギラス・ニガーは、多量のグルコアミラーゼを分泌する。しかしながら、高められたタンパク質発現及び分泌の所望する形質を有するアスペルギラス・ニガー宿主は、好結果をもたらす発酵の最も所望する特徴を必ずしも有する必要はない。発酵は、興味ある生物学的物質の回収及び精製の間、除去を必要とする複数の酵素の分泌のために、最適ではなく、又は酵素は生物学的物質と同時精製することができる。
Pedersen など., 2000, Metabolic Engineering 2: 34-41, 及び WO 00/50576号は、アスペルギラス・ニガーのグルコアミラーゼ−生成株におけるオキサロ酢酸ヒドロラーゼ(EC 3.7.1.1)コードのオキサロ酢酸ヒドロラーゼ(oah)遺伝子の破壊を開示し、ここで得られる株シュウ酸を生成することができなかった。
興味ある生物学的物質の回収及び下流のプロセッシングを複雑化することができる酵素の生成を欠くと共に、商業的量の生物学的物質の発現のための能力を有する。改良されたアスペルギラス・ニガー宿主を提供することが本発明の目的である。
本発明は、異種の生物学的物質の生成方法に関し、ここで前記方法は、
(a)前記異種の生物学的物質の生成のために適切な培地において親アスペルギラス・ニガー株の変異体を培養し、ここで(i)前記変異体株は、前記異種の生物学的物質をコードする第1のヌクレオチド配列、並びにglaA、及びasa, amyA, amyB, prtT及びoahから成る群から選択された少なくとも1つの遺伝子の修飾を含んで成る1又は複数の第2のヌクレオチド配列を含んで成り、そして(ii)前記変異体株は、同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、並びに酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA及び中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼから成る群から選択された少なくとも1つの酵素の生成を欠いており;そして
(b)前記培養培地から前記異種の生物学的物質を回収することを含んで成る。
本発明はまた、酵素−欠失性アスペルギラス・ニガー変異体株、及びその生成方法にも関する。
本発明は、異種の生物学的物質の生成方法に関し、ここで前記方法は、(a)前記異種の生物学的物質の生成のために適切な培地において親アスペルギラス・ニガー株の変異体を培養し、ここで(i)前記変異体株は、前記異種の生物学的物質をコードする第1のヌクレオチド配列、並びにglaA、及びasa, amyA, amyB, prtT及びoahから成る群から選択された少なくとも1つの遺伝子の修飾を含んで成る1又は複数の第2のヌクレオチド配列を含んで成り、そして(ii)前記変異体株は、同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、並びに酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA及び中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼから成る群から選択された少なくとも1つの酵素の生成を欠いており;そして(b)前記培養培地から前記異種の生物学的物質を回収することを含んで成る。
用語“酸安定性α−アミラーゼ活性”とは、酸性pH範囲において最適な活性を有するα−アミラーゼ活性として本明細書において定義される。本発明に関しては、酸安定性α―アミラーゼ活性は、pH4.0でSigma Chemical Co.キット477を用いて、基質として4,6−エチリデン(G7)−p−ニトロフェニル(G1)−α−D−ニトロフェニル(G1)−α−D−マルトヘプタシドを用いて決定される。
もう1つの好ましい観点においては、変異体は、glaA, amyB及びoahの修飾を包含する。もう1つの好ましい観点においては変異体は、glaA, prtT及びoahの修飾を包含する。
もう1つの好ましい観点においては、変異体は、glaA, asa, amyA, amyB, prtT及びoahを包含する。
選択のアスペルギラス・ニガー株においてその対応する遺伝子を修飾するための酵素を生成する他の微生物源からの興味ある酵素の生成に関与する本明細書に記載されるヌクレオチド配列に対して相同か又は相補的なヌクレオチド配列が、使用され得る。
好ましい観点においては、アスペルギラス・ニガー変異体株における酵素の生成に関与する遺伝子の修飾は、選択マーカーにより標識されていない。
本発明のさらなる観点においては、アスペルギラス・ニガー株の変異体は、特定の生物学的物質の生成、回収又は適用に対して有害な物質をコードする他の酵素の修飾、例えば欠失又は破壊を含むことができる。
もう1つの好ましい観点においては、生物ポリマーは、ポリサッカリドである。ポリサッカリドは、いずれかのポリサッカリド、例えばムコポリサッカリド(例えば、ヘパリン及びヒアルロン酸)及び窒素含有ポリサッカリド(例えば、キチン)であり得るが、但しそれらだけには限定されない。より好ましい態様においては、ポリサッカリドはヒアルロン酸である。“ヒアルロン酸”は、β−1,4及びβ−1,3グリコシド結合を変えることによって一緒に結合される、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)及びグルクロン酸(GlcUA)の反復二糖単位から構成される、硫酸化されていないグリコサミノグリカンとして、本明細書においては定義される。ヒアルロン酸はまた、ヒアルロナン、ヒアルロネート又はHAとして知られている。もう1つの好ましい観点においては、ポリサッカリドは、キチンである。もう1つの好ましい観点においては、ポリサッカリドは、ヘパリンである。
二次代謝物は、アルカロイド、クマリン、フラボノイド、ポリケチド、キニン、ステロイド、ペプチド又はテルペンであり得るが、但しそれらだけには限定されない。好ましい態様においては、二次代謝物は、抗生物質、摂食阻害剤、誘引剤、殺菌剤、抗菌剤、ホルモン、殺昆虫剤又は殺鼠薬である。
制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち、アスペルギラス・ニガー株による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、異種生物学的物質をコードするヌクレオチド配列の5’側末端に作用可能に連結される。アスペルギラス・ニガー株において機能的であるいずれかのリーダー配列が、本発明に使用され得る。
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわちヌクレオチド配列の3’末端に作用可能に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとしてアスペルギラス・ニガー株により認識される配列であり得る。アスペルギラス・ニガー株において機能するいずれかのポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。
好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミアーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼをコードする遺伝子から得られる。
上記の種々の核酸及び制御配列は、1又は複数の便利な制限部位で異種生物学的物質をコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、異種生物学的物質をコードするヌクレオチド配列は、前記配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現及びたぶん分泌のための適切な制御配列により作用可能に連結される。
“導入”とは、核酸配列を含んで成るベクターをアスペルギラス・ニガー株中に導入することを意味し、その結果、前記ベクターは染色体組み込み体として、又は自己複製染色体ベクターとして維持される。組み込みは一般的に、ヌクレオチド配列が株中に安定して維持される場合、好都合であると思われる。染色体中へのベクターの組み込みは、相同組換え、非相同組換え又はトランスポジションにより起こる。
本発明はさらに、次の例により記載されるが、それらは本発明の範囲を制限するものではない。
DNA配列決定は、ABI 3700 Sequencing (Applied Biosystems,Inc., Foster City, CA)により行われた。
株:
すべての株は、アスペルギラス・ニガーBo−1(DSM 12665)に由来する。アスペルギラス・ニガーBo−1は、α−1,6−トランスグルコシダーゼ活性をもたらさないα−1,6−トランスグルコシダーゼ遺伝子の突然変異を含んで成る。
最少培地は、1L当たり6 g のNaNO3, 0.52 gの KCI, 1.52 g のKH2PO4, 20 g のNoble寒天, 10 gのグルコース, 0.5g のMgSO4・7H2O, 及び 1 mlのCove 微量元素から構成された。
Coveプレートは、1L当たり342. 3 g のスクロース, 20 mlのCove塩(50X), 10 mM のアセトアミド, 15 mM のCsCl, 及び25 g のNoble 寒天から構成された。
50×COVE塩溶液は、1L当たり、26gのKCl、26gのMgSO4・7H2O, 76gのKH2PO4及び50mlのCove微量元素から構成された。
AMG微量元素溶液は、1L当たり、14.3 g のZnS04・7H20, 2.5 g の CuSO4・5H2O, 0.5 g のNiC12・6H20, 13.8 gのFeS04・7H20, 8.5 g のMnSO4 ・H20,及び3 g のクエン酸から成った。
STCは、0.8Mのソルビトール、50mMのトリス(pH8)、25mMのCaCl2から構成された。
SPTCは、40%のPEG4000、0.8Mのソルビトール、50mMのトリス(pH8)、50mMのCaCl2から構成された。
SPCは、1L当たり40%PEG 4000、0.8Mのソルビトール及び50mMのCaCl2(pH4.5)から構成された。
スターチアズールプレートは、1L当たり0.1 gのグルコース, 1 gのKH2PO4, 0.5 g のMgS04, 0.5 g の KCI, 3 gの NaNO3, 0.1 gの酵母抽出物, 1 ml of Cove微量元素, 5 g の スターチアズール, 15 g のNoble寒天, 及び100 mMのグリシンpH 2.9から構成された。
次の例に記載される個々の破壊カセット20μgを、制限酵素により消化し、そして破壊のために使用されるべきフラグメントを切除し、そしてQIAEXII Gel Extraction Kit(QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)を用いて、1%アガロース−50mMのトリス塩基−50mMのボレート−0.1mMの二ナトリウムEDTA緩衝液(TBE)ゲルから精製した。合計体積を、無菌ガラス蒸留された水において20μlにし、そして4種の形質転換の間に流した。
アスペルギラス・ニガー菌糸体を、5%のグルコース(及び適用できる場合、10mMのウリジン)により補充されたYP培地5mlを含む15mmプレートから収穫し、濾過し、そしてサイドアームフラスコ及び磁器を用いて、10mMのトリス(pH7.4)−0.1mMのEDTA(pH8)(TE)によりすすぎ、そして最後に、微小遠心分離管に入れ、高速バキューム下で1時間、乾燥した。
アスペルギラス・ニガーBo−1 DNAをWahleithner など., 1996, Current Genetics. 29: 395-403の方法に従って、グアニジン塩酸塩における溶解により単離し、続いてQiagen Maxiprep 過ラム(QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA)上でその製造業者による記載のようにして精製した。アスペルギラス・ニガーBo−1のゲノムライブラリーを、EMBL4(Clonetech, Palo Alto, CA)において、その製造業者の説明書に従って創造した。アスペルギラス・ニガーBo−1ゲノムDNAを、Sau3Aにより部分的に消化した。消化の後、DNAを、分離用低融点アガロースゲル上で電気泳動し、そして8〜23kbのDNAを含む領域をゲルからスライスした。
EMBL4に含まれるアスペルギラス・ニガーBo−1のゲノムライブラリーからの約26,500個のプラークを、ナイロンフィルター上にレプリカプレートし、そしてアスペルギラス・ニジュランスのpyrG遺伝子からの1.4kbのフラグメントによりプローブした。いくつかの陽性クローンを、製造業者により記載の通りにして、精製し、そして増殖した。陽性クローンからのファージDNAを、Qiagen lambda Mini Prep Kit (QIAGEN,Inc., Chatsworth, CA)を用いて単離した。ファージDNAを、いくつかの制限酵素により消化し、続いて、pyrG遺伝子を含むフラグメントを同定するためにサザン分析した。クローン7bと命名された1つのクローンは、3.5kbのXbaIフラグメント上のプロモーター及びターミネーター配列の両者を包含する、アスペルギラス・ニガーpyrG遺伝(配列番号1(DNA配列)及び2(推定されるアミノ酸配列))を含んだ。
プライマー1:5’−GGGACTAGTGGATCGAAGTTCTGATGGTTA−3’(配列番号3)
プライマー2:5’−ATACCGCGGGTTTCAAGGATGGAGATAGGA−3’(配列番号4)
582bpのPCR生成物を、SpeI及びKspIにより消化し、そして下記のようにして直接使用した。
次の例に記載される遺伝子破壊は、選択マーカーとしてアスペルギラス・ニガーpyrG遺伝子を用いた。pyrG遺伝子は、ウリジンを添加しないでウリジン栄養要求株の増殖を可能にするオロトジン−5’−ホスフェートデカルボキシラーゼをコードする。pyrGの反復使用を、例4に記載されるようにマーカーの末端への反復配列の付加により可能にした。pyrGの切除は、5−FOA上での選択に基づいて直線的な反復体間での相同組換えにより生じた(d’Enfert, 1996, Current Genetics 30: 76-82)。
アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ(gla)遺伝子(配列番号5:DNA配列、及び6:推定されるアミノ酸配列)を、8kbのフラグメントとして、例3に記載されるゲノムλ−ライブラリーから単離し、そしてPUC118(Roche Diagnostics Corporation, Mannheim, Germany)中にサブクローン化し、pJRoy13を生成した。アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子及び1.8kbのフランギングDNAを含むpJRoy13からの4kbのSpeIフラグメントを、pBluescriptSK+ (Stratagene, La Jolla, CA)中に挿入し、pJRoy17(図3)を生成した。
プライマー3:5’− ACTAGTGGCCCTGTACCCAGA−3’(配列番号7)
プライマー4:5’− GCATGCATTGCTGAGGTGTAATGATG−3’(配列番号8)
グルコアミラーゼ遺伝子プロモータープローブを、例2に記載のようにして単離し、そしてラベルした。
アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子ターミネーターを、3’末端でSpeI部位にハイブリダイズするプライマー5、及び5’末端にSphI部位を付加するプライマー6により、800bpのフラグメントとしてpJRoy17から増幅した。
プライマー5:5’− GAGGTCGACGGTATCGATAAG−3’(配列番号9)
プライマー6:5’− GCATGCAGATCTCGAGAATACACCGTTCCTCAG−3’(配列番号10)
グルコアミラーゼ遺伝子ターミネーターを含む800bpのフラグメントを、精製し、そして下記のようにして直接使用した。
プローブを、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ及びpyrG遺伝子に対して生成した。上記プライマー3及び5を用いて、pJRoy17からのgla遺伝子(プロモーター及びターミネーターを包含する)をPCR増幅し、そしてプライマー1及び2(例4を参照のこと)を用いて、例4に記載される同じ方法を用いて、pJRoy10からpyrGターミネーター配列を増幅した。プローブを、例2に記載のようにして単離し、そしてラベルした。
アスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ遺伝子(asa)の一部を単離し、そしてアメリカ特許第5,252,726号に記載のようにして、pUC19(Roche Diagnostics Corporation, Mannheim, Germany)中にクローン化した。前記酸安定性α−アミラーゼ遺伝子の一部の開始コドンの上流の346bpを、酸安定性アミラーゼ遺伝子の一部を含むpUC19から、HpaIによる消化により切除し、そしてpMBin01(図6)を創造した。pMBin04+の二重消化を、SmaI及びSpeIにより行い、そして4237bpのSmaI/SpeIフラグメントを、1%アガロース−TBEゲル上での電気泳動に続いて、QIAEX11 Gel Extraction Kitを用いて単離した。その4237bpのSmaI/SpeIフラグメントは、酸安定性α−アミラーゼ遺伝子の5’末端、pyrGターミネーター、全pyrG遺伝子(ターミネーターを包含する)、及び酸安定性α−アミラーゼ遺伝子の3’末端から成った。
プライマー7:5’− CTCATTGGCCGAAACTCCGAT−3’(配列番号11)
プライマー8:5’− AGCAGACGATGTCCTGAGCTG−3’(配列番号12)
522bpのプローブを、例2に記載のようにして単離し、そしてラベルした。
アスペルギラス・ニガーparT遺伝子(配列番号13:DNA配列、及び14:推定されるアミノ酸配列)を、WO00/20596号に記載される2種のオーバーラッピングするクローン、NcE1.4及びCIE1.8を用いて構成した(pMBin09、図7)。NcE, CIE1.8及びpZeRO-2(Invitrogen, Carlsbad, CA)を、PstIにより消化し、それぞれクローンの5’及び3’末端でPstI部位を生成し、そして複数のクローニング部位でpZeRO-2を洗浄化した。両prtTクローンの共有される領域におけるSspI部位を用いて、三元連結を、PstI部位でpZeRO-2中にPstI/SspIクローンフラグメントを連結することにより行い、pMBin09をもたらした。
プライマー9:5’− TGTGATTGAGGTGATTGGCG−3’(配列番号15)
プライマー10:5’− TCAGCCACACCTGCAAAGGC−3’(配列番号16)
プローブを、例2に記載のようにして単離し、そしてラベルし、そしてそのプローブは破壊の下流に232bpのprtTコード配列を含んだ。
アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ遺伝子amyA及びamyBを、アメリカ特許第5,252, 726号 (NA1=amyA及びNA2=amyB)に開示されるようにしてクローン化した。
プライマー11:5’−GGCAGCAGGATATGTAAGTCG−3’(配列番号19)
プライマー12:5’−CACTGTAATCGACTGAGCTAC−3’(配列番号20)
アスペルギラス・ニガーamyA遺伝子配列はその3’末端を除いて、amyBと実質的に同一であるので(Korman など, 1990, Current Genetics 17: 203-212)、例10に使用される破壊構造体及びプロトコールが適用された。アスペルギラス・ニガーMBin117を、amyA遺伝子(配列番号21:DNA配列、及び22:推定されるアミノ酸配列)を破壊するために、pMBin03からのEcoRI/AvrIIフラグメントにより、例1に記載されるプロトコールに従って形質転換した。
ゲノムDNAを、4個の形質転換体、及び対照としてのアスペルギラス・ニガーMBin117から単離し、そして例2に記載される方法を用いて、サザン分析にゆだねた。ゲノムDNAを、EcoRI及びBspLU11Iにより消化し、そして例10に記載のようにしてプローブした。amyB遺伝子に対応する2.7kbのバンド、及びamyA遺伝子を表わす、わずかに大きなバンドが野生型アスペルギラス・ニガーBo−1株に存在した。
アスペルギラス・ニガーシュウ酸ヒドロラーゼ(oah)遺伝子(配列番号23:DNA配列、及び24:推定されるアミノ酸配列)を、WO00/50576号に記載される方法に従ってクローン化した。プラスミドpHP1を、WO00/50576号に記載のようにして構成した。
プライマー13:5’−CTACGACATGAAGACCAACGC−3’(配列番号25)
プライマー14:5’−GCACCGTTCTCCACCATGTTG−3’(配列番号26)
グルコアミラーゼ、酸安定性のα−アミラーゼ、中性α−アミラーゼ、及びプロテアーゼを生成する一般宿主アスペルギラス・ニガー株の能力を、振盪フラスコ及び/又は発酵器において株を培養することにより評価した。アスペルギラス・ニガーBo-1を、対照として用いた。
約104/mlの密度でのアスペルギラス・ニガー株の分生子を、5%グルコースにより補充されたYP培地20mlを含む125mlの振盪フラスコ中に接種した。振盪フラスコを、37℃及び200rpmで3〜6日間インキュベートした。振盪フラスコ培養物のサンプルを、3〜6日目に除き、そして遠心分離し、酵素アッセイについての上清液を生成した。
酸安定性及び中性α−アミラーゼ活性を、Sigmaα−アミラーゼ基質(Sigma Kit # 577, Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO)を用いて30℃で、それぞれpH4.5及び7.0で測定した。検出は405nmであった。FungamylTMを、標準として使用し、そして活性をFAU/mlで報告した。
アスペルギラス・ニガーMBin114におけるprtT遺伝子の欠失により、合計のプロテアーゼ活性は、アスペルギラス・ニガーBo-1の約20%に低下した。MBin114の6日目の発酵サンプルは、692のプロテアーゼ活性を有し、そしてBo-1は3953蛍光単位/mlであった。
カンジダ・アンタルクチカリパーゼB遺伝子(配列番号27:DNA配列、及び28:推定されるアミノ酸配列)を、アメリカ特許第6,020,180号に記載のようにしてクローン化した。リパーゼB遺伝子を含むプラスミドpMT1335を、Hoegh など., in Can. J. Bot. 73 (Suppl. 1) :S869-S875 (1995)による記載のようにして構成した。アスペルギラス・ニジュランスamdS遺伝子を含むプラスミドpTOC90を、WO91/17243号に記載のようにして構成した。プラスミドpMT1335及びpTOC90を、例1に記載されるプロトコールに従って、アスペルギラス・ニガーMBin114中に同時形質転換し、そして形質転換体をアセトアミド上で選択した。
対照としてのアスペルギラス・ニガーMBin114及びアスペルギラス・ニガーBo-1を、例13に記載のようにして、2Lの発酵器において培養した。
一般的なプロテアーゼ活性を、例9に記載のようにして測定した。
シタリジウム・サーモフィラス(Scytalidium thermophilum)カタラーゼ遺伝子(配列番号29:DNA配列、及び30:推定されるアミノ酸配列)を、アメリカ特許第5,646,025号に記載のようにしてクローン化した。カタラーゼ遺伝子を含むプラスミドpDM153を、アメリカ特許第5,646,025号に記載のようにして構成した。プラスミドpDM153を用いて、例1に記載されるプロトコールに従って、アスペルギラス・ニガー株MBin114, MBin118及びMBin120を形質転換した。
図15は、アスペルギラス・ニガー一般宿主株MBin114, MBin118及びMBin120におけるシタリジウム・サーモフィラムカタラーゼ生成の比較を示す。酵素生成における明白な変化は、試験されるいずれの株にも観察されなかった。
種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書に組み込まれている。
Claims (15)
- 異種のポリペプチドの生成方法であって、
(a)前記異種の生物学的物質の生成のために適切な培地において親アスペルギラス・ニガー(Aspergilus niger)株の変異体を培養し、ここで(i)前記変異体株は、前記異種のポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列、並びにglaA、asa、amyA、amyB、prtT及びoahの修飾を含んで成る第2のヌクレオチド配列を含んで成り、そして(ii)前記変異体株は、同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA及び中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼの生成を欠いており,ここで前記修飾は、(1)遺伝子又は制御要素中の1又は複数のヌクレイチドの導入、置換又は除去、(2)遺伝子破壊、(3)遺伝子転換、(4)遺伝子欠失、或いは(5)ランダム又は特異的変異誘発として定義され;そして
(b)前記培養培地から前記異種の生物学的物質を回収する;
ことを含んで成る方法。 - 前記変異体株が、同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA及び中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼを少なくとも25%少なく生成する、請求項1に記載の方法。
- 前記変異体株が、同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA及び中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼを完全に欠く、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記変異体株がさらに、タンパク質分解活性をコードする1又は複数の遺伝子の修飾を含んで成り、ここで前記修飾は、(1)遺伝子又は制御要素中の1又は複数のヌクレイチドの導入、置換又は除去、(2)遺伝子破壊、(3)遺伝子転換、(4)遺伝子欠失、或いは(5)ランダム又は特異的変異誘発として定義される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記変異体株が、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、α−1,6−トランスグルコシダーゼ、トランスグルタミナーゼ及びキシラナーゼから成る群から選択される酵素をコードする1又は複数の遺伝子の修飾をさらに含んで成り、ここで前記修飾は、(1)遺伝子又は制御要素中の1又は複数のヌクレイチドの導入、置換又は除去、(2)遺伝子破壊、(3)遺伝子転換、(4)遺伝子欠失、或いは(5)ランダム又は特異的変異誘発として定義される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 異種のポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列、並びにglaA、asa,amyA,amyB,prtT及びoahの修飾を含んで成る第2のヌクレオチド配列を含んで成る、親アスペルギラス・ニガー株の変異体であって、同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA,中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼを欠いていることを特徴とする変異体株。
- 前記変異体株が、同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA、中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼを少なくとも25%少なく生成する、請求項6に記載の変異体株。
- 前記変異体株が、同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA、中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼを完全に欠く、請求項6又は7に記載の変異体株。
- 前記変異体株がさらに、タンパク質分解活性をコードする1又は複数の遺伝子の修飾を含んで成り、ここで前記修飾は、(1)遺伝子又は制御要素中の1又は複数のヌクレイチドの導入、置換又は除去、(2)遺伝子破壊、(3)遺伝子転換、(4)遺伝子欠失、或いは(5)ランダム又は特異的変異誘発として定義される、請求項6〜8のいずれか1項に記載の変異体株。
- 前記変異体株が、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、α−1,6−トランスグルコシダーゼ、トランスグルタミナーゼ及びキシラナーゼから成る群から選択される酵素をコードする1又は複数の遺伝子の修飾をさらに含んで成り、ここで前記修飾は、(1)遺伝子又は制御要素中の1又は複数のヌクレイチドの導入、置換又は除去、(2)遺伝子破壊、(3)遺伝子転換、(4)遺伝子欠失、或いは(5)ランダム又は特異的変異誘発として定義される、請求項6〜9のいずれか1項に記載の変異体株。
- 親アスペルギラス・ニガー株の変異体の入手方法であって、
(a)前記親アスペルギラス・ニガー株中に、異種のポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列、並びにglaA、asa、amyA、amyB、prtT及びoahの修飾を含んで成る第2のヌクレオチド配列を導入し;そして
(b)同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA、中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼの生成を欠いている、修飾されたヌクレオチド配列を含んで成り、ここで前記修飾は、(1)遺伝子又は制御要素中の1又は複数のヌクレイチドの導入、置換又は除去、(2)遺伝子破壊、(3)遺伝子転換、(4)遺伝子欠失、或いは(5)ランダム又は特異的変異誘発として定義される、段階(a)からの変異体株を同定することを含んで成る方法。 - 前記変異体株が、同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA、中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼを少なくとも25%少なく生成する、請求項11に記載の方法。
- 前記変異体株が、同一の条件下で培養される場合、親アスペルギラス・ニガーに比較して、グルコアミラーゼ、酸安定性α−アミラーゼ、中性α−アミラーゼA、中性α−アミラーゼB、プロテアーゼ及びシュウ酸ヒドロラーゼを完全に欠く、請求項11に記載の方法。
- 前記変異体株がさらに、タンパク質分解活性をコードする1又は複数の遺伝子の修飾を含んで成り、ここで前記修飾は、(1)遺伝子又は制御要素中の1又は複数のヌクレイチドの導入、置換又は除去、(2)遺伝子破壊、(3)遺伝子転換、(4)遺伝子欠失、或いは(5)ランダム又は特異的変異誘発として定義される、請求項11〜13のいずれか1項にに記載の方法。
- 前記変異体株が、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、α−1,6−トランスグルコシダーゼ、トランスグルタミナーゼ及びキシラナーゼから成る群から選択される酵素をコードする1又は複数の遺伝子の修飾をさらに含んで成り、ここで前記修飾は、(1)遺伝子又は制御要素中の1又は複数のヌクレイチドの導入、置換又は除去、(2)遺伝子破壊、(3)遺伝子転換、(4)遺伝子欠失、或いは(5)ランダム又は特異的変異誘発として定義される、請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法。
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