CN114555777A - 经修饰的丝状真菌宿主细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分泌目的多肽的磷脂酶D灭活的丝状真菌细胞，和在所述细胞中产生分泌的目的多肽的方法，以及产生所述细胞的方法。

Description

经修饰的丝状真菌宿主细胞

序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及经修饰的分泌目的多肽的磷脂酶D灭活的丝状真菌细胞，和在所述细胞中产生分泌的目的多肽的方法，以及产生所述细胞的方法。

背景技术

丝状真菌宿主细胞中的重组基因表达是生产目的多肽(如酶和其他有价值的蛋白质)的常用方法。为了工业和商业目的，丝状真菌宿主菌株的生产力和产物产量是生产成本的重要因素。

在丝状真菌细胞中增加异源蛋白质的生产力或产量的方法总是具有商业利益的。

发明内容

本发明涉及遗传修饰的丝状真菌宿主细胞，其中天然磷脂酶已被灭活。磷脂酶的灭活可以通过本领域已知的任何适合的基因灭活方法完成。消除或减少磷脂酶产生的方便方法的实例是基于磷脂酶编码基因的基因替代或基因中断技术。

曲霉属丝状真菌宿主细胞中编码磷脂酶的spo14基因的灭活导致细胞中表达的几种异源分泌的目的多肽、葡糖淀粉酶(AGU)和葡聚糖酶的产量增加。

因此，在第一方面，本发明涉及丝状真菌宿主细胞，这些丝状真菌宿主细胞包含编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸并且包含灭活的spo14基因或其同源物，其中所述spo14基因或其同源物编码具有以下氨基酸序列的磷脂酶D，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:3具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

本发明还提供了用于通过在有利于表达目的多肽的条件下培养本发明的丝状真菌宿主细胞并任选地回收目的多肽来产生异源分泌的目的多肽的方法。

因此，在第二方面，本发明涉及产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在有利于表达该分泌的目的多肽的条件下培养丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞包含编码该分泌的目的多肽的异源多核苷酸并且包含灭活的spo14基因或其同源物，其中所述spo14基因或其同源物编码具有以下氨基酸序列的磷脂酶D，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性；以及，任选地

b)回收该分泌的目的多肽。

在最后一个方面，本发明涉及产生丝状真菌宿主细胞的方法，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的异源目的多肽的改善的产量，所述方法无具体顺序地包括以下步骤：

a)用编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸转化丝状真菌宿主细胞；以及

b)在该丝状真菌宿主细胞中灭活spo14基因或其同源物，其中所述spo14基因或其同源物编码具有以下氨基酸序列的磷脂酶D，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

定义

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。

成熟多肽：术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(诸如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后其最终形式的多肽。本领域已知宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)中的两种的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(EMBOSS的BLOSUM62版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,同上)(优选地5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

具体实施方式

宿主细胞

本发明涉及重组宿主细胞，该宿主细胞包含与一种或多种控制序列可操作地连接的本发明的多核苷酸，该控制序列指导异源目的多肽的产生和分泌。

将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥])。

本发明的真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉胞菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。

在一个方面，本发明涉及产生丝状真菌宿主细胞的方法，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的异源目的多肽的改善的产量，所述方法无具体顺序地包括以下步骤：

a)用编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸转化丝状真菌宿主细胞；以及

b)在该丝状真菌宿主细胞中灭活spo14基因或其同源物，其中所述spo14基因或其同源物编码具有以下氨基酸序列的磷脂酶D，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

在另一方面，本发明涉及所得丝状真菌宿主细胞，这些丝状真菌宿主细胞包含编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸并且包含灭活的spo14基因或其同源物，其中所述spo14基因或其同源物编码具有以下氨基酸序列的磷脂酶D，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:3具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

在本发明的方面的优选的实施例中，丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。

优选地，该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶；最优选地该分泌的目的多肽是葡糖淀粉酶。

在本发明的优选实施例中，该磷脂酶D包含以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:3具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

优选地，该spo14基因或其同源物包含以下基因组核苷酸序列或由其组成，该基因组核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:1具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。可替代地，该spo14基因或其同源物包含以下基因组核苷酸序列或由其组成，其cDNA序列与SEQ ID NO:2具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:2具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可用许多方式操作该多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延伸因子。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。

控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-末端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的N-末端。

还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

去除或减少磷脂酶D活性

本发明还涉及用于产生亲本细胞突变体的方法，该方法包括灭活、破坏或缺失编码本发明的磷脂酶D多肽的多核苷酸或其一部分，这些方法导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变细胞产生更少的磷脂酶D多肽。

可以使用本领域熟知的方法通过降低或消除该spo14多核苷酸或其同源物的表达来构建突变体细胞，例如插入、破坏、替换、或缺失。在一个优选的方面，该多核苷酸是灭活的。例如，待修饰或灭活的多核苷酸可以是活性必需的编码区或其一部分，或编码区的表达所需的调节元件。这种调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该多核苷酸的表达的部分。可修饰的其他控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子、和转录激活因子。

该多核苷酸的修饰或灭活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该多核苷酸的表达被降低或消除的突变体细胞来进行。该诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适合的物理或化学诱变剂、通过使用适合的寡核苷酸、或通过对DNA序列进行PCR产生的诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任何组合来进行。

适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，诱变一般是在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞来进行的。

该spo14多核苷酸或其同源物的修饰或灭活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调控元件中插入、取代、或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可插入或去除核苷酸从而导致终止密码子的引入、起始密码子的去除、或可读框的变化。此类修饰或灭活可根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。尽管原则上，修饰可以在体内进行，即直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但是优选的是如下所示例地在体外进行修饰。

以下描述了用于缺失或破坏靶标基因的方法，例如：Miller等人(1985.Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5:1714-1721)；WO 90/00192；May,G.(1992.Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi.[丝状真菌的应用分子遗传学]J.R.Kinghorn和G.Turner,编著,Blackie Academic and Professional[布莱基学术和专业],第1-25页)；以及Turner,G.(1994.Vectors for Genetic Manipulation.[用于基因操作的载体]S.D.Martinelli和J.R.Kinghorn,编著,Elsevier[爱思唯尔],第641-665页)。

消除或降低多核苷酸的表达的便利的方法的实例是基于基因替代、基因缺失、或基因破坏技术的。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷的核酸序列替代内源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸还编码可用于选择其中该多核苷酸已经被修饰或破坏的转化体的标记。在一个方面，用选择性标记，如本文描述的那些来破坏该多核苷酸。

本发明还涉及抑制具有磷脂酶D活性的多肽在细胞中表达的方法，该方法包括对细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或者在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包含spo14多核苷酸或其同源物的子序列。在一个优选的方面，dsRNA长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。

该dsRNA优选地是小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在一个优选的方面，该dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选方面，该dsRNA是用于抑制翻译的微小RNA。

本发明还涉及此类双链RNA(dsRNA)分子，包含用于抑制该多肽在细胞中的表达的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的部分。虽然本发明不局限于任何具体的作用机制，但是该dsRNA可以进入细胞并且导致相似的或一致的序列的单链RNA(ssRNA)(包括内源mRNA)的降解。当细胞被暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地被叫做RNA干扰(RNAi)的过程所降解；参见例如美国专利号5,190,931。

本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一方面，本发明提供了使用本发明的dsRNAi来选择性地降解RNA的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一个方面，可以使用这些dsRNA分子来在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。用于制备并使用dsRNA分子选择性降解RNA的方法在本领域中是熟知的；参见例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824和6,515,109。

这些磷脂酶D多肽缺陷型突变体细胞作为用于异源分泌的多肽的表达的宿主细胞尤其有用。

用于培养和纯化目的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。

产生方法

宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一方面，回收包含多肽的发酵液。

可以通过本领域已知的多种程序纯化该多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。

在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。

本发明的一个方面涉及产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在有利于表达该分泌的目的多肽的条件下培养丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞包含编码该分泌的目的多肽的异源多核苷酸并且包含灭活的spo14基因或其同源物，其中所述spo14基因或其同源物编码具有以下氨基酸序列的磷脂酶D，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性；以及，任选地

b)回收该分泌的目的多肽。

在优选的实施例中，丝状真菌宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。

优选地，该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶；最优选地该分泌的目的多肽是葡糖淀粉酶。

在本发明的优选实施例中，该磷脂酶D包含以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:3具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

优选地，该spo14基因或其同源物包含以下基因组核苷酸序列或由其组成，该基因组核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:1具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。可替代地，该spo14基因或其同源物包含以下基因组核苷酸序列或由其组成，其cDNA序列与SEQ ID NO:2具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:2具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

实例

材料与方法

分子克隆技术描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1989)Molecularcloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册](第2版)Cold Spring HarborLaboratory[冷泉港实验室],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约。

酶

用于DNA操作的酶(例如限制性内切核酸酶，连接酶等)可获得自新英格兰生物实验室公司)，并且根据制造商的说明书使用。

培养基和溶液

AMG痕量金属溶液由以下构成：0.3g柠檬酸、0.68g ZnCl₂、0.25gCuSO₄·5H₂O、0.024g NiCl₂·6H₂O、1.39g FeSO₄·7H₂O、1.356g MnSO₄·5H₂O、以及去离子水补足至1升。

COVE-N-glyX板由以下构成：218g木糖醇、10g甘油、2.02g KNO₃、50ml COVE盐溶液、25g纯净琼脂、以及去离子水补足至1升。

COVE培养基由以下构成：342.3g蔗糖、20ml 50X COVE盐溶液、10ml1M乙酰胺、10ml1.5M CsCl2、25g纯净琼脂、以及去离子水补足至1升。

COVE2培养基由以下构成：30g蔗糖、20ml 50X COVE盐溶液、10ml1M乙酰胺、25g纯净琼脂、以及去离子水补足至1升。

COVE-N板由以下构成：342.3g蔗糖、20ml COVE盐溶液、3g NaNO₃、30g纯净琼脂组成、以及去离子水补足至1升。

COVE-N顶层琼脂糖由以下构成：342.3g蔗糖、20ml COVE盐溶液、3g NaNO₃、10g低熔点琼脂糖、以及去离子水补足至1升。

COVE-N JP板由以下构成：30g蔗糖、20ml COVE盐溶液、3g NaNO₃、30g纯净琼脂、以及去离子水补足至1升。

COVE盐溶液由以下构成：26g的KCl、26g的MgSO₄·7H₂O、76g的KH₂PO₄、50ml的COVE痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。

COVE痕量金属由以下构成：0.04g Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g CuSO₄·5H₂O、1.2gFeSO₄·7H₂O、1.0g MnSO₄·5H₂O、0.8g Na₂MoO₄·2H₂O、10gZnSO₄·7H₂O、以及去离子水补足至1升。

LB培养基由以下构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的氯化钠、以及去离子水补足至1升。

LB加氨比西林板由以下构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的氯化钠、15g的细菌培养用琼脂、以100μg/ml的氨比西林、以及去离子水补足至1升。

MSS培养基由以下构成：70g蔗糖、100g豆粉、三滴普鲁尼克(pluronic)消泡剂、以及去离子水补足至1升；将pH调节至6.0。

不含尿素的MU-1培养基由以下构成：260g麦芽糊精、3g MgSO₄·7H₂O、6g K₂SO₄、5gKH₂PO₄、0.5ml AMG痕量金属溶液、几滴消泡剂、以及去离子水补足至1升；将pH调节至4.5。

不含尿素的MU-1glu培养基由以下构成：260g葡萄糖、3gMgSO₄·7H₂O、6g K₂SO₄、5gKH₂PO₄、0.5ml AMG痕量金属溶液、几滴消泡剂、以及去离子水补足至1升；将pH调节至4.5。

50％尿素由以下构成：500g尿素、以及去离子水补足至1升。

YPG培养基由以下构成：10g的酵母提取物、20g的细菌培养用蛋白胨、20g的葡萄糖、以及去离子水补足至1升。

STC由0.8M山梨醇、25mM或50mM Tris pH 8、和25mM或50mM CaCl₂组成。

SPTC由STC缓冲液中的40％聚乙二醇4000(PEG4000)组成。

SOC培养基由以下构成：20g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、0.5g的NaCl、10ml的250mM KCl、以及去离子水补足至1升。

TAE缓冲液由以下构成：4.84g的Tris碱、1.14ml的冰乙酸、2ml的0.5M EDTApH8.0、以及去离子水补足至1升。

购买的材料(大肠杆菌、质粒和试剂盒)

将大肠杆菌DH5-α(东洋公司(Toyobo))用于质粒构建和PCR扩增。将商购的质粒pBluescript II SK-(斯图特基因公司(Stratagene)#212206)用于PCR片段的克隆。使用凯杰质粒试剂盒(Qiagen Plasmid Kit)(凯杰公司(Qiagen))来回收扩增的质粒。使用DNA连接试剂盒(宝生物公司(Takara))或T4 DNA连接酶(宝灵曼公司(Boehringer Mannheim))来进行连接。使用扩展(Expand)TM PCR系统(宝灵曼公司)来进行聚合酶链式反应(PCR)。QIAquickTM凝胶提取试剂盒(凯杰公司)被用于纯化PCR片段并从琼脂糖凝胶中提取DNA片段。

菌株

表达宿主菌株黑曲霉O73TYS和O73P66由诺维信公司(Novozymes)分离并为从土壤分离的黑曲霉NN049184的衍生物。基因修饰O73TYS和O73P66以破坏淀粉葡糖苷酶活性和α-淀粉酶活性的表达，然后引入黑曲霉胞嘧啶脱氨酶基因(fcy1)。

质粒

质粒pHUda801描述于WO 2012160093中的实例4中。用于酶基因的表达的载体的质粒pRika147描述于WO 2012160093的实例9中。

黑曲霉的转化

亲本黑曲霉宿主细胞的转化是使用已知用于丝状真菌转化的通用方法，如描述于Yelton等人,“Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid[通过使用trpC质粒的黑曲霉的转化]”,Proc Natl Acad Sci U S A[美国科学院院刊].1984年3月；81(5):1470-4中，并如下来实现的：

如果宿主菌株是pyrG缺陷型突变体，则将黑曲霉宿主菌株接种至100ml补充有10mM尿苷的YPG培养基上，并且在32℃下在80rpm下孵育16小时。将球粒进行收集并且用0.6M KCl洗涤，并且将其重悬浮于含有商业β-葡聚糖酶产品(GLUCANEX^TM，诺维信公司，鲍斯韦，丹麦)的20ml 0.6M KCl(终浓度为20mg/ml)中。将悬浮液在32℃下在80rpm下孵育直到形成原生质体，并且然后用STC缓冲液洗涤两次。将这些原生质体用血红蛋白计计数，并且在8:2:0.1的STC:STPC:DMSO溶液中重新悬浮并调节至终浓度为2.5x10⁷个原生质体/ml。将大约4μg的质粒DNA添加至100μl的原生质体悬浮液中，轻轻混合，并且冰上孵育30分钟。添加1ml的SPTC，并且将该原生质体悬浮液在37℃孵育20分钟。在添加10ml 50℃ COVE-N顶层琼脂糖后，将混合物倾倒于基本培养基上，并且将这些板在30℃下孵育5天。

PCR扩增

PCR条件

用于报告酶生产的摇瓶培养

将选择的转化体的孢子接种进100ml的MSS培养基，并且在30C下培养3天。将10％的种子培养物转移到摇瓶中的MU-1MU-1glu培养基中并在32C下培养6天。通过离心获得上清液。使用离心后的培养物上清液用于酶测定。

用于葡糖淀粉酶生产的实验室规模罐培养

按补料分批发酵来进行发酵(H.Pedersen 2000)。将所选择菌株在液体培养基中预培养，然后将生长的菌丝体转移到罐中用于酶产生的进一步培养。在pH 4.75在34C下培养8天，用葡萄糖和铵进行补料而不过度给予(其阻止酶生产)。使用全培养液进行酶测定。

DNA杂交

将所选择的转化体的菌丝体从在3ml YPG培养基中的过夜培养物中收获，用蒸馏水冲洗。遵循制造商的说明书，将研磨的菌丝体经受使用土壤用FastDNA SPIN试剂盒(MP生物医疗)的基因组DNA制备。遵循制造商的说明书，使用PCR DIG探针合成试剂盒(罗氏应用科学公司(Roche Applied Science)，印第安纳波利斯(Indianapolis)，印第安纳州(IN))合成非放射性探针。遵循制造商的说明书，使用QIAquick TM凝胶提取试剂盒(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加利福尼亚州)将DIG标记的探针进行凝胶纯化。

将5微克的基因组DNA用适当的限制性内切酶完全消化16小时(40μl总体积、4U酶/μl DNA)并且在0.8％琼脂糖凝胶上运行。将该DNA在凝胶中通过用0.2M HCl处理进行片段化、变性(0.5M NaOH，1.5M NaCl)并且进行中和(1M Tris，pH7.5；1.5M NaCl)用于随后在20X SSC中转移至海邦(Hybond)N+膜(安玛西亚公司(Amersham))上。将该DNA进行UV交联到该膜上并且在42℃下在20ml DIG Easy Hyb(罗氏诊断产品有限公司(Roche DiagnosticsCorporation)，曼海姆，德国)中预杂交1小时。将变性的探针直接添加至DIG Easy Hyb缓冲液中并且在42℃下进行过夜杂交。在杂交后洗涤(在2X SSC中、室温、5分钟洗涤两次；并且在0.1X SSC中、68℃洗涤两次，各15min)，遵循制造商的方案，使用DIG检测系统和CPD-Star(罗氏公司)进行化学发光检测。将DIG-标记的DNA分子量标记II(罗氏公司)用于标准标记。

布拉德福德测定(全部蛋白测定)

布拉德福德(Bradford)测定、比色蛋白测定是基于染料考马斯亮蓝G-250的吸光度偏移，其中在酸性条件下，红色形式的染料转化成其蓝色形式，以结合正在测定的蛋白质。染料与蛋白质的结合稳定化了蓝色阴离子形式。在595nm处的吸光度的增加与结合的染料的量成比例，并且因此与样品中存在的蛋白质的量(浓度)成比例。遵循制造商的说明书，将酶样品用蒸馏水适当地稀释，并且通过使用Quick Start^TM布拉德福德(Bradford)蛋白测定(伯乐公司(Bio-Rad inc.))来测量它们的蛋白质量。

葡糖淀粉酶活性

葡糖淀粉酶活性以淀粉葡糖苷酶单位(AGU)测量。AGU被定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。可使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-D-葡萄糖特异性地反应，形成NADH，使用光度计在340nm下测定该NADH作为原始葡萄糖浓度的量度。

淀粉葡糖苷酶孵育：

显色反应：

实例1：用于黑曲霉spo14基因的靶标基因破坏的质粒pHUda2368(载体)的构建

构建质粒pHUda2368以包含黑曲霉磷脂酶D(spo14)基因的5’和3’侧翼区，这两个侧翼区通过与其终止子重复一起的作为选择性标记的构巢曲霉乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)，和人单纯疱疹病毒1(HSV-1)胸苷激酶基因分开。HSV-1胸苷激酶基因位于spo14基因的3’侧翼区的3’端，允许没有正确地靶向spo14基因座的黑曲霉转化体的反向选择。以如下所述的若干个步骤构建质粒。

使用以下引物产生包含黑曲霉spo14的5’侧翼区的PCR产物：

引物spo14-1(正义)：

5’-CGGTGGCGGCCGCATTCAACAACCGAGTGA-3’(SEQ ID NO:4)

引物spo14-2(反义)：

5’-CGCTCCGACTAGTTAGATACTAGACTAGATA-3’(SEQ ID NO:5)

通过反应中的PCR来扩增所希望的片段，该反应由约100ng黑曲霉O73TYS的基因组DNA、1μl扩展高保真聚合酶(罗氏公司)、100μM引物spo14-1、100μM引物spo14-2、5x PCR缓冲液(包含MgCl2)、20μl 2.5mM dNTP混合物(总体积；100μl)组成。将反应在编程为如下的Bio-

C1000Touch^TM热循环仪中孵育：1个循环，在94℃持续2分钟；30个循环，每个在94℃持续30秒，在55℃持续30秒，并且在72℃持续2分钟；1个循环，在72℃持续7分钟；并且保持在4℃。将生成的2,554bp PCR片段通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从该凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。将纯化的2,554bpPCR片段用NotI和SpeI进行消化。

将质粒pHUda801(WO 2012160093 A1中的实例4)用Not I和SpeI进行消化，并且通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，将其中的9,558bp片段从该凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。在反应中将9,558bp片段连接至2,554bp PCR片段，该反应由1μl9,558bp片段、3μl 2,554bp片段、1μl 5X连接酶缓冲液、5μl2X连接酶缓冲液、以及1μl连接酶(罗氏公司快速DNA连接试剂盒)组成。将该连接反应在室温下孵育10分钟。将5μl的连接混合物转化到DH5α化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化体涂布在LB加氨比西林板上，并且在37℃孵育过夜。使用QIA小量制备试剂盒，将质粒DNA从若干个转化体中纯化。通过使用适当的限制性酶，随后通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳，筛选适当连接的质粒DNA。将一种质粒命名为pHUda801-5’spo14。

使用以下引物产生包含黑曲霉spo14的3’侧翼区的PCR产物：

引物spo14-3(正义)：

5’-GTTTAAACCACTGGCAGCCAGGAGAAGCCC-3’(SEQ ID NO:6)

引物spo14-4(反义)：

5’-TTAATTAAAATGAAGGAAGAGATGGAAGGA-3’(SEQ ID NO:7)

通过反应中的PCR来扩增所希望的片段，该反应由约100ng黑曲霉O73TYS的基因组DNA、1μl扩展高保真聚合酶(罗氏公司)、100μM引物spo14-3、100μM引物spo14-4、5x PCR缓冲液(包含MgCl2)、20μl 2.5mM dNTP混合物(总体积；100μl)组成。将反应在编程为如下的Bio-

C1000Touch^TM热循环仪中孵育：1个循环，在94℃持续2分钟；30个循环，每个在94℃持续30秒，在55℃持续30秒，并且在72℃持续2分钟；1个循环，在72℃持续7分钟；并且保持在4℃。将生成的2,980bp PCR片段通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从该凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。将纯化的2,980bpPCR片段用PmeI和PacI进行消化。

将质粒pHUda801-5’spo14用PmeI和PacI进行消化，并且通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，将其中的10,091bp片段从该凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。在反应中将10,091bp片段连接至2,980bp PCR片段，该反应由1μl 10,091bp片段、3μl 2,980bp片段、1μl 5X连接酶缓冲液、5μl 2X连接酶缓冲液、以及1μl连接酶(罗氏公司快速DNA连接试剂盒)组成。将该连接反应在室温下孵育10分钟。将5μl的连接混合物转化到DH5α化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化体涂布在LB加氨比西林板上，并且在37℃孵育过夜。使用QIA小量制备试剂盒，将质粒DNA从若干个转化体中纯化。通过使用适当的限制性酶，随后通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳，筛选适当连接的质粒DNA。将一种质粒命名为pHUda2368。

实例2：O73P66中黑曲霉spo14基因破坏

通过在32℃下持续16小时，伴随80rpm的轻轻搅拌，在补充有10mM尿苷的100ml的YPG培养基中培养菌株，来制备黑曲霉菌株O73P66的原生质体。将球粒进行收集并且用0.6MKCl洗涤，并且将其重悬浮于含有商业β-葡聚糖酶产品(GLUCANEX^TM，诺维信公司，鲍斯韦，丹麦)的20ml0.6M KCl(终浓度为20mg/ml)中。将该悬浮液在32℃下以80rpm孵育直到形成原生质体。将原生质体通过衬有

的漏斗，过滤到50ml无菌塑料离心管中，并且用0.6M KCl进行洗涤以提取受陷的原生质体。通过在2,000rpm离心15分钟收集合并的滤液和上清液。弃去上清液，并且用10-25ml的STC洗涤该球粒，并且在2,000rpm再次离心10分钟，并且然后用STC缓冲液洗涤两次。将这些原生质体用血红蛋白计计数，并且在8:2:0.1的STC:STPC:DMSO溶液中重新悬浮并调节至终浓度为2.5x10⁷个原生质体/ml。

将约10μg的pHUda2368添加至0.3ml的原生质体悬浮液中，轻轻混合，并且在冰上孵育30分钟。添加3ml SPTC，并且将该原生质体悬浮液在37℃下孵育20分钟。在添加12ml50℃ COVE-N顶层琼脂糖之后，将该混合物倾倒于COVE-N板上，并且将这些板在30℃下孵育7天。用无菌牙签将这些生长转化体转移到补充有1.5μM 5-氟-2-脱氧尿苷(FdU)(杀死表达包含在pHUda2368中的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)的细胞的药剂)的Cove-N JP板上。将单孢子分离物转移至COVE-N-glyX板上。

通过DNA分析筛选包含用来破坏spo14基因的pHUda2368的黑曲霉菌株O73P66的可能的转化体。将每个孢子纯化的转化体在3ml的YPG培养基中进行培养，并且在30℃以200rpm摇动孵育2天。使用衬有

的漏斗来收集生物质。遵循制造商的说明书，将研磨的菌丝体经受使用土壤用FastDNA SPIN试剂盒(MP生物医疗)的基因组DNA制备。

进行DNA印迹分析，以确认spo14基因座的破坏。用SpeI和SphI来消化来自每个转化体的5μg的基因组DNA。基因组DNA消化反应由以下构成：5μg基因组DNA、1μl SpeI、1μlSphI、2μl 10X NE缓冲液4组成、以及水补足至20μl。在37℃，将基因组DNA消化物孵育大约16小时。遵循制造商的建议，使用TAE缓冲液，使这些消化物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并且使用

印迹至hybond N+(GE医疗集团生命科学部(GE HealthcareLife Sciences)，曼彻斯特，新罕布什尔州，美国)持续大约1小时。将膜与500bp地高辛标记的黑曲霉spo14探针杂交，其中使用如下所示的引物spo14-5(正义)和spo14-6(反义)，通过PCR，通过掺入地高辛-11-dUTP合成该探针。

正向引物(spo14-5)：

5’-CACTGGCAGCCAGGAGAAGC-3’(SEQ ID NO:8)

反向引物(spo14-6)：

5'-GGAGTGCTCGGTCGGAGTGC-3’(SEQ ID NO:9)

扩增反应(100μl)由以下组成：200μM PCR DIG标记的混合物(vial 2)(罗氏应用科学公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)、0.5μM引物，

高保真酶混合物(vial 1)(罗氏应用科学公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)、以及作为模板的1μl(100pg/μl)的pHUda2368，最终体积为100μl。将扩增反应在编程为如下的Bio-

C1000Touch^TM热循环仪中孵育：1个循环，在94℃持续2分钟；30个循环，每个在94℃持续30秒，在55℃持续30秒，并且在72℃持续30秒；且保持在4℃。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将0.5kb片段从该凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。将变性的探针直接添加至DIG Easy Hyb缓冲液中并且在42℃下进行过夜杂交。在杂交后洗涤(在2X SSC中、室温、5分钟洗涤两次；并且在0.1X SSC中、68℃洗涤两次，各15min)，遵循制造商的方案，使用DIG检测系统和CPD-Star(罗氏公司)进行化学发光检测。将DIG-标记的DNA分子量标记II(罗氏公司)用于标准标记。选择在spo14基因座(杂交带从3.3kb移至4.5kb)正确整合的菌株O74UVH用于后续实验。

实例3：O73TYS中黑曲霉spo14基因破坏

通过在32℃下持续16小时，伴随80rpm的轻轻搅拌，在补充有10mM尿苷的100ml的YPG培养基中培养菌株，来制备黑曲霉菌株O73TYS的原生质体。将球粒进行收集并且用0.6MKCl洗涤，并且将其重悬浮于含有商业β-葡聚糖酶产品(GLUCANEX^TM，诺维信公司，鲍斯韦，丹麦)的20ml0.6M KCl(终浓度为20mg/ml)中。将该悬浮液在32℃下以80rpm孵育直到形成原生质体。将原生质体通过衬有

的漏斗，过滤到50ml无菌塑料离心管中，并且用0.6M KCl进行洗涤以提取受陷的原生质体。通过在2,000rpm离心15分钟收集合并的滤液和上清液。弃去上清液，并且用10-25ml的STC洗涤该球粒，并且在2,000rpm再次离心10分钟，并且然后用STC缓冲液洗涤两次。将这些原生质体用血红蛋白计计数，并且在8:2:0.1的STC:STPC:DMSO溶液中重新悬浮并调节至终浓度为2.5x10⁷个原生质体/ml。

将约10μg的pHUda2368添加至0.3ml的原生质体悬浮液中，轻轻混合，并且在冰上孵育30分钟。添加3ml SPTC，并且将该原生质体悬浮液在37℃下孵育20分钟。在添加12ml50℃ COVE-N顶层琼脂糖之后，将该混合物倾倒于COVE-N板上，并且将这些板在30℃下孵育7天。用无菌牙签将这些生长转化体转移到补充有1.5μM 5-氟-2-脱氧尿苷(FdU)(杀死表达包含在pHUda2368中的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)的细胞的药剂)的Cove-N JP板上。将单孢子分离物转移至COVE-N-glyX板上。

通过DNA分析筛选包含用来破坏spo14基因的pHUda2368的黑曲霉菌株O73TYS的可能的转化体。将每个孢子纯化的转化体在3ml的YPG培养基中进行培养，并且在30℃以200rpm摇动孵育2天。使用衬有

的漏斗来收集生物质。遵循制造商的说明书，将研磨的菌丝体经受使用土壤用FastDNA SPIN试剂盒(MP生物医疗)的基因组DNA制备。

进行DNA印迹分析，以确认spo14基因座的破坏。用SpeI和SphI来消化来自每个转化体的5μg的基因组DNA。基因组DNA消化反应由以下构成：5μg基因组DNA、1μl SpeI、1μlSphI、2μl 10X NE缓冲液4组成、以及水补足至20μl。在37℃，将基因组DNA消化物孵育大约16小时。遵循制造商的建议，使用TAE缓冲液，使这些消化物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并且使用

印迹至hybond N+(GE医疗集团生命科学部(GE HealthcareLife Sciences)，曼彻斯特，新罕布什尔州，美国)持续大约1小时。将膜与500bp地高辛标记的黑曲霉spo14探针杂交，其中使用如上所示的引物spo14-5(正义)和spo14-6(反义)，通过PCR，通过掺入地高辛-11-dUTP合成该探针。

将变性的探针直接添加至DIG Easy Hyb缓冲液中并且在42℃下进行过夜杂交。在杂交后洗涤(在2X SSC中、室温、5分钟洗涤两次；并且在0.1XSSC中、68℃洗涤两次，各15min)，遵循制造商的方案，使用DIG检测系统和CPD-Star(罗氏公司)进行化学发光检测。将DIG-标记的DNA分子量标记II(罗氏公司)用于标准标记。选择在spo14基因座(杂交带从3.5kb移至4.5kb)正确整合的菌株O835NC、O835ND和O835NE用于后续实验。

实例4：来自O73TYS的spo14灭活菌株在摇瓶培养中的表达评估

将黑曲霉O835NC、O835ND和O835NE及其亲本菌株O73TYS在COVE-N-glyX板上在30℃下培养数周。使用无菌移液管将来自每个板的一块小塞子打洞，将其各自接种到在500ml烧瓶中的100ml的MSS培养基中。将这些烧瓶在30℃下以200rpm孵育3天。然后，将10ml的培养液转移至在500ml烧瓶中的100ml的MU1培养基中。将这些烧瓶在32℃下以200rpm孵育6天。将每个培养物在10ml试管中以5,000rpm离心10分钟，并且回收培养物上清液，用于确定葡糖淀粉酶(AGU)生产力。按照上述方法测量它们的酶活性(AGU活性)；结果示于下表中。通过从产生的标准曲线外推，并且与设置在100％的黑曲霉菌株O73TYS相比来确定酶(AGU)生产力。

在摇瓶中，spo14基因破坏菌株的AGU生产力比参考菌株黑曲霉菌株O73TYS高18％-25％(表1)。

表1：摇瓶培养物中的AGU生产力。

实例5：来自O73TYS的spo14灭活菌株在实验室规模罐培养中的表达评估

将黑曲霉O835NC、O835ND和O835NE及其亲本菌株O73TYS在实验室规模的罐中按照材料与方法中所述的发酵方法进行培养。收集每个培养物样品以确定葡糖淀粉酶(AGU)生产力。按照上述方法测量它们的酶活性(AGU活性)；结果示于下表中。通过从产生的标准曲线外推，并且与设置在100％的黑曲霉菌株O73TYS相比来确定每剂量葡萄糖的酶(AGU)生产力。

在实验室规模的罐中，spo14基因破坏菌株的每剂量葡萄糖的AGU生产力比参考菌株黑曲霉菌株O73TYS高5％-7％(表2)。

表2：摇瓶培养物中的AGU生产力。

实例6：淡紫紫孢菌葡聚糖酶基因(pldex)表达载体pHUda2370的构建

将质粒pHUda2370构建为含有由黑曲霉中性淀粉酶启动子II(Pna2)和葡糖淀粉酶终止子(Tamg)驱动的淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)葡聚糖酶基因(pldex)、作为选择性标记的构巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)、以及由黑曲霉酸性稳定性淀粉酶启动子(PasaA)和米曲霉硝酸还原酶终止子(Tniad)驱动的酵母酿酒酵母FLP重组基因(flp)。

使用以下引物来产生含有pldex基因的PCR产物：

引物pldex-1(正义)：

5’-ggatttagtcttgatcggatccaccatgcgttggcctggt-3’(SEQ ID NO:10)

引物pldex-2(反义)：

5’-gaaatggattgattgtcacgtgTTAttcaatgctccagtc-3’(SEQ ID NO:11)

通过反应中的PCR来扩增所希望的片段，该反应由约100ng携带pldex基因的质粒DNA、1μl扩展高保真聚合酶(罗氏公司)、100μM引物pldex-1、100μM引物pldex-2、5x PCR缓冲液(包含MgCl2)、20μl 2.5mM dNTP混合物(总体积；100μl)组成。将反应在编程为如下的Bio-

C1000 Touch^TM热循环仪中孵育：1个循环，在94℃持续2分钟；30个循环，每个在94℃持续30秒，在55℃持续30秒，并且在72℃持续2分钟；1个循环，在72℃持续7分钟；并且保持在4℃。将生成的1,824bp PCR片段通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，从该凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。

将质粒pRika147(WO 2012160093中实例9所述的)用BamHI和PmlI进行消化，并且通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行纯化，将其中的10,512bp片段从该凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。在反应中将纯化的1,824bp PCR片段与10,512bp片段融合，该反应由1μl 10,512bp片段、3μl 1,824bp片段和1μl的5X In-Fusion HD酶预混物(In-

HD克隆试剂盒/克泰科公司(Clonetech))组成。将连接反应在50℃下孵育10分钟。将3μl混合物转化到DH5α化学感受态大肠杆菌细胞中。将转化体涂布在LB加氨比西林板上，并且在37℃孵育过夜。使用QIA小量制备试剂盒，将质粒DNA从若干个转化体中纯化。通过使用适当的限制性酶，随后通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳，筛选适当连接的质粒DNA。将一种质粒命名为pHUda2370。

实例7：淡紫紫孢菌葡聚糖酶基因(pldex)表达载体pHUda2370在黑曲霉菌株O73P66和O74UVH菌株中的引入

通过flp重组酶在四个预先指定的基因座处引入pldex表达质粒，这些基因座是甘露糖基转移酶(alg2)、葡萄糖激酶(gukA)、酸稳定性淀粉酶(asaA)和多铜氧化酶(mcoH)。

通过在32℃下持续16小时，以80rpm轻微搅动，在100ml的YPG培养基中培养菌株，来制备黑曲霉菌株O73P66和O74UVH的原生质体。将球粒进行收集并且用0.6M KCl洗涤，并且将其重悬浮于含有商业β-葡聚糖酶产品(GLUCANEX^TM，诺维信公司，鲍斯韦，丹麦)的20ml0.6M KCl(终浓度为20mg/ml)中。将该悬浮液在32℃下以80rpm孵育直到形成原生质体。将原生质体通过衬有

的漏斗，过滤到50ml无菌塑料离心管中，并且用0.6MKCl进行洗涤以提取受陷的原生质体。通过在2,000rpm离心15分钟收集合并的滤液和上清液。弃去上清液，并且用10-25ml的STC洗涤该球粒，并且在2,000rpm再次离心10分钟，并且然后用STC缓冲液洗涤两次。将这些原生质体用血红蛋白计计数，并且在8:2:0.1的STC:STPC:DMSO溶液中重新悬浮并调节至终浓度为2.5x10⁷个原生质体/ml。

将约10μg的pHUda2370添加至0.3ml的原生质体悬浮液中，轻轻混合，并且在冰上孵育30分钟。添加3ml SPTC，并且将该原生质体悬浮液在37℃下孵育20分钟。在添加12ml补充有50μg/ml的5’氟胞嘧啶(5FC)(即杀死表达带有O73P66和O74UVH的黑曲霉胞嘧啶脱氨酶(fcy1)基因的细胞的药剂)的50℃ COVE顶层琼脂糖后，将混合物倾倒在COVE板上，并且将这些板在30℃下孵育10天。将这些生长转化体用无菌牙签转移至补充有10μg/ml 5’氟胞嘧啶(5FC)的Cove-2板上。将单孢子分离物转移至COVE-N-glyX板上。

通过DNA分析筛选含有pHUda2370以引入pldex基因的黑曲霉菌株O73P66和O74UVH的可能转化体。将每个孢子纯化的转化体在3ml的YPG培养基中进行培养，并且在30℃以200rpm摇动孵育2天。使用衬有

的漏斗来收集生物质。遵循制造商的说明书，将研磨的菌丝体经受使用土壤用FastDNA SPIN试剂盒(MP生物医疗)的基因组DNA制备。

进行DNA印迹分析以确认四个预指定的基因座(alg2、gukA、asaA、mcoH)处的pldex基因的引入。用SacII来消化来自每个转化体的5μg的基因组DNA。基因组DNA消化反应是由5μg基因组DNA、0.5μl SacIII、2μl10X NE缓冲液4、以及水补足至20μl。在37℃，将基因组DNA消化物孵育大约16小时。遵循制造商的建议，使用TAE缓冲液，使这些消化物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并且使用

印迹至hybond N+(GE医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences)，曼彻斯特，新罕布什尔州，美国)持续大约1小时。将膜与500bp地高辛标记的pldex探针杂交，其中使用如下所示的引物pldex-3(正义)和pldex-4(反义)，通过PCR，通过掺入地高辛-11-dUTP合成该探针。

正向引物(pldexC-3)：

5’-atgcgttggcctggtaattt-3’(SEQ ID NO:12)

反向引物(pldexC-4)：

5'-gatggtctcgtagacaaacg-3’(SEQ ID NO:13)

扩增反应(100μl)由以下组成：200μM PCR DIG标记的混合物(vial 2)(罗氏应用科学公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)、0.5μM引物，

高保真酶混合物(vial 1)(罗氏应用科学公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)、以及作为模板的1μl(100pg/μl)的pHUda2370，最终体积为100μl。将扩增反应在编程为如下的Bio-

C1000Touch^TM热循环仪中孵育：1个循环，在94℃持续2分钟；30个循环，每个在94℃持续30秒，在55℃持续30秒，并且在72℃持续30秒；且保持在4℃。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，其中将0.3kb片段从该凝胶切离，并且使用

凝胶提取试剂盒进行提取。将变性的探针直接添加至DIG Easy Hyb缓冲液中并且在42℃进行过夜杂交。在杂交后洗涤(在2X SSC中、室温、5分钟洗涤两次；并且在0.1X SSC中、68℃洗涤两次，各15min)，遵循制造商的方案，使用DIG检测系统和CPD-Star(罗氏公司)进行化学发光检测。将DIG-标记的DNA分子量标记II(罗氏公司)用于标准标记。选择分别从O73P66和O74UVH产生的正确整合的菌株C5559-2370-1、8、9和C5559-2368-2370-1、3、6用于随后的实验。

实例8：在摇瓶培养中的PLDEX表达评估

将黑曲霉菌株C5559-2370-1、8、9，C5559-2368-2370-1、3、6，和O73P66以及O74UVH在COVE-N-glyX板上在30℃下培养约几周。使用无菌移液管将来自每个板的一块小塞子打洞，将其各自接种到在500ml烧瓶中的100ml的MSS培养基中。将这些烧瓶在30℃下以200rpm孵育3天。然后，将10ml的培养液转移至在500ml烧瓶中的100ml的MU1 glu培养基中。将这些烧瓶在30℃下以200rpm孵育5天。将每个培养物在10ml试管中以5,000rpm离心10分钟，并且回收培养物上清液，用于确定葡聚糖酶生产力。使用Quick Start^TM布拉德福德(Bradford)蛋白测定试剂盒(伯乐公司)进行葡聚糖酶生产力测定。将培养物上清液在蒸馏水中适当稀释。使用几个步骤在蒸馏水中稀释牛血清白蛋白(WAKO目录号519-83921)，起始于0.5mg/ml浓度并且结束于0.1mg/ml浓度。将包括标准品的每个稀释的5μl转移至96孔平底板中。将250μl 1x的染料试剂溶液添加至每个孔中，然后在室温下孵育5分钟。在595nm下测量反应的终点。通过从生成的标准曲线外推来确定全部蛋白生产力。

来自菌株O74UVH的spo14基因破坏菌株的平均葡聚糖酶生产力比来自O73P66的菌株的高60％-65％。(表3)

表3：摇瓶培养物中的葡聚糖酶生产力(一式三份)。将C5559-2370-1在摇瓶中的生产力设为100％。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> 经修饰的丝状真菌宿主细胞

<130> 15091-WO-PCT

<160> 13

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 3870

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<220>

<221> 外显子

<222> (1)..(201)

<220>

<221> 内含子

<222> (202)..(270)

<220>

<221> 外显子

<222> (271)..(637)

<220>

<221> 内含子

<222> (638)..(694)

<220>

<221> 外显子

<222> (695)..(838)

<220>

<221> 内含子

<222> (839)..(889)

<220>

<221> 外显子

<222> (890)..(3138)

<220>

<221> 内含子

<222> (3139)..(3186)

<220>

<221> 外显子

<222> (3187)..(3870)

<400> 1

atg acc cgc ccc gag gac gac ctg gcc tat ggc cag tac tac cag gac 48

Met Thr Arg Pro Glu Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Gln Tyr Tyr Gln Asp

1 5 10 15

tcc gcc cgg gga gcc tct tcc gga gac tcc tcc agg ggt ctg agc gac 96

Ser Ala Arg Gly Ala Ser Ser Gly Asp Ser Ser Arg Gly Leu Ser Asp

20 25 30

act ttt aag aag ctg aag cag act tac aag tcc cac cag tcg caa cag 144

Thr Phe Lys Lys Leu Lys Gln Thr Tyr Lys Ser His Gln Ser Gln Gln

35 40 45

ggc tct tcc cag caa tct cag cag tcg cag caa tcc cag tcc gcc agc 192

Gly Ser Ser Gln Gln Ser Gln Gln Ser Gln Gln Ser Gln Ser Ala Ser

50 55 60

tac tac aat gtaagttgtt gcctgtacct ggtcacctcc ccgatccccg 241

Tyr Tyr Asn

65

gtactaaccg acccgttcca aactcccag act tcg aac cag acc tac cag tcc 294

Thr Ser Asn Gln Thr Tyr Gln Ser

70 75

caa ggt ccc tcg cag tcc cag caa tac cat cct cag cag caa caa caa 342

Gln Gly Pro Ser Gln Ser Gln Gln Tyr His Pro Gln Gln Gln Gln Gln

80 85 90

caa cag cag caa caa ccc cat ccg tcg aaa ccg cag aag cag gac aaa 390

Gln Gln Gln Gln Gln Pro His Pro Ser Lys Pro Gln Lys Gln Asp Lys

95 100 105

ttt tcc ggc ttg ttt ggc aag ctg gaa gaa ctc ggc aat gag gtg gca 438

Phe Ser Gly Leu Phe Gly Lys Leu Glu Glu Leu Gly Asn Glu Val Ala

110 115 120

cag aaa ctg ggt acc gcg ctc gac ccc cag gcg tat gcc gag tat ggc 486

Gln Lys Leu Gly Thr Ala Leu Asp Pro Gln Ala Tyr Ala Glu Tyr Gly

125 130 135

gct cca aag ccg cag acc gag aac cgc ttc ggg agc ttt gcg gcc ccg 534

Ala Pro Lys Pro Gln Thr Glu Asn Arg Phe Gly Ser Phe Ala Ala Pro

140 145 150 155

cgt cag ggt aac gag gtc aag tgg cac gtg gat ggt tgc gcc tac ttt 582

Arg Gln Gly Asn Glu Val Lys Trp His Val Asp Gly Cys Ala Tyr Phe

160 165 170

tat gct gtg tcc aag gca ttg gag agt gcc aag gat tat att tgg att 630

Tyr Ala Val Ser Lys Ala Leu Glu Ser Ala Lys Asp Tyr Ile Trp Ile

175 180 185

ctg gac t gtaggtaccc aggggactgc tgtgttggag gggcatgaga ctgactatgc 687

Leu Asp

attttag gg tgg ctc tct ccg gaa ctt tac ctg aga cga ccc ccc gca 735

Trp Trp Leu Ser Pro Glu Leu Tyr Leu Arg Arg Pro Pro Ala

190 195 200

aag cac gaa cag tac cgg ctg gat cgg atg ctg ttg gct gcg gcg cag 783

Lys His Glu Gln Tyr Arg Leu Asp Arg Met Leu Leu Ala Ala Ala Gln

205 210 215

cgc gga gtc cgg gtg aac atc att gtg tac aag gag gtg acg cag gca 831

Arg Gly Val Arg Val Asn Ile Ile Val Tyr Lys Glu Val Thr Gln Ala

220 225 230 235

ctg acc c gtatgttttg tgcgtctgtt gcgtgaaccg tcaaactgac cctactggca 888

Leu Thr

g tc tcc tca cac cac acc aag cac cat ctg gaa gac ctc cat gaa aac 936

Leu Ser Ser His His Thr Lys His His Leu Glu Asp Leu His Glu Asn

240 245 250

att gca gta ttc cgt cac ccc gat cac ctg ccc gac cgt cag gaa ctc 984

Ile Ala Val Phe Arg His Pro Asp His Leu Pro Asp Arg Gln Glu Leu

255 260 265

gag gcg tcc atc cat acg tct ctc cag aac ttg tcc ctc gat gcc ggc 1032

Glu Ala Ser Ile His Thr Ser Leu Gln Asn Leu Ser Leu Asp Ala Gly

270 275 280 285

aac ctt gcc aag atg tcc gaa gac gcc atc aag ggc atc tac ggc atg 1080

Asn Leu Ala Lys Met Ser Glu Asp Ala Ile Lys Gly Ile Tyr Gly Met

290 295 300

cac gag gat gtg att ctg tac tgg gct cac cac gag aag ctt tgc ctc 1128

His Glu Asp Val Ile Leu Tyr Trp Ala His His Glu Lys Leu Cys Leu

305 310 315

att gat ggc cgc att gcg ttc atg ggt ggt ctg gat atg tgc ttt ggc 1176

Ile Asp Gly Arg Ile Ala Phe Met Gly Gly Leu Asp Met Cys Phe Gly

320 325 330

cgc tgg gac acc aac cag cat gaa ctg gcc gat gtt cac ggt cag gac 1224

Arg Trp Asp Thr Asn Gln His Glu Leu Ala Asp Val His Gly Gln Asp

335 340 345

ctg aac aag att gtc ttc ccc ggt cag gac tac aac aac gcc cga gtg 1272

Leu Asn Lys Ile Val Phe Pro Gly Gln Asp Tyr Asn Asn Ala Arg Val

350 355 360 365

agt gat ttc cac gac gtt gcc cac tgg gag cag aac cag ctg gac cgc 1320

Ser Asp Phe His Asp Val Ala His Trp Glu Gln Asn Gln Leu Asp Arg

370 375 380

aag gac act tct cgc atg ggc tgg tcc gat att tcg gtc agt ttg cac 1368

Lys Asp Thr Ser Arg Met Gly Trp Ser Asp Ile Ser Val Ser Leu His

385 390 395

ggc ccg gtc gtc gag gat ctg agg aag cac ttt gtt cag cgg tgg aac 1416

Gly Pro Val Val Glu Asp Leu Arg Lys His Phe Val Gln Arg Trp Asn

400 405 410

ttc atc tat gac tcc aag tac cag tcg cgc aac aac tcg aga tac gcc 1464

Phe Ile Tyr Asp Ser Lys Tyr Gln Ser Arg Asn Asn Ser Arg Tyr Ala

415 420 425

aga ttg gcc ctg tac ggc cgg ccg acc tca ggc ccc cag cag cag caa 1512

Arg Leu Ala Leu Tyr Gly Arg Pro Thr Ser Gly Pro Gln Gln Gln Gln

430 435 440 445

ggg ccc caa cag ggt ggt cag gcc cag aaa ccg ccc gcg tcg cct cag 1560

Gly Pro Gln Gln Gly Gly Gln Ala Gln Lys Pro Pro Ala Ser Pro Gln

450 455 460

cct ggt gcc act ggg cct ccc cca ccg agc tgg caa cag cag gca gcg 1608

Pro Gly Ala Thr Gly Pro Pro Pro Pro Ser Trp Gln Gln Gln Ala Ala

465 470 475

tct ccc cag cct ggg gca aat cct ggt cct cct gct cct agc tgg cag 1656

Ser Pro Gln Pro Gly Ala Asn Pro Gly Pro Pro Ala Pro Ser Trp Gln

480 485 490

caa cag gca gct ccg tcg cag cct agc gcc cag gca cct agt tcc agc 1704

Gln Gln Ala Ala Pro Ser Gln Pro Ser Ala Gln Ala Pro Ser Ser Ser

495 500 505

agc tct tct acc cca agc tgg cag cag cag cag acc gga gtt gcc agc 1752

Ser Ser Ser Thr Pro Ser Trp Gln Gln Gln Gln Thr Gly Val Ala Ser

510 515 520 525

aac act cag cct tcc agc act gcc aac ccc gcg aca cct acc tgg cag 1800

Asn Thr Gln Pro Ser Ser Thr Ala Asn Pro Ala Thr Pro Thr Trp Gln

530 535 540

cag cag gca ccg aca cct caa cag gga ggc tac gca gcc agt cct tcc 1848

Gln Gln Ala Pro Thr Pro Gln Gln Gly Gly Tyr Ala Ala Ser Pro Ser

545 550 555

ccc aac ccg agc agc cag gag aag ccc agc tgg caa cag cag cct gcg 1896

Pro Asn Pro Ser Ser Gln Glu Lys Pro Ser Trp Gln Gln Gln Pro Ala

560 565 570

cag ccc agc ggt tac caa ccc cag gca caa acc act ggc agc cag gag 1944

Gln Pro Ser Gly Tyr Gln Pro Gln Ala Gln Thr Thr Gly Ser Gln Glu

575 580 585

aag ccc agc tgg caa cag cag agc tct gag cct cct gcg tac tcg gcc 1992

Lys Pro Ser Trp Gln Gln Gln Ser Ser Glu Pro Pro Ala Tyr Ser Ala

590 595 600 605

cac cca cag cag cac tac act tac agt ggt gac tcg ttc ccc cca ccc 2040

His Pro Gln Gln His Tyr Thr Tyr Ser Gly Asp Ser Phe Pro Pro Pro

610 615 620

cct cct ggt cct ccg cca gcc cag aac tct gtg cag gcg tct tac cag 2088

Pro Pro Gly Pro Pro Pro Ala Gln Asn Ser Val Gln Ala Ser Tyr Gln

625 630 635

gcg tac aac ccc cag cag ccg tcg cct cag aac cag aca ccc acc caa 2136

Ala Tyr Asn Pro Gln Gln Pro Ser Pro Gln Asn Gln Thr Pro Thr Gln

640 645 650

ggc cag agt cag act cct tac tat ccg cct ccc ccg aac cag gaa gtc 2184

Gly Gln Ser Gln Thr Pro Tyr Tyr Pro Pro Pro Pro Asn Gln Glu Val

655 660 665

cac cac tcg caa aca cgc ggt att cac gac gcg cac cag agc gga tat 2232

His His Ser Gln Thr Arg Gly Ile His Asp Ala His Gln Ser Gly Tyr

670 675 680 685

ggc gac tct gag agg ggc ttc aac ccc cgc cgt ctg cgt gag aac ttc 2280

Gly Asp Ser Glu Arg Gly Phe Asn Pro Arg Arg Leu Arg Glu Asn Phe

690 695 700

atg gac tac ggc aac gtc ctg cgt ggc gag ttg gca ggc cag atc cat 2328

Met Asp Tyr Gly Asn Val Leu Arg Gly Glu Leu Ala Gly Gln Ile His

705 710 715

cag tac cag gat cgg ttc tcc act cat ggc cgt cag gtt aac cag ccc 2376

Gln Tyr Gln Asp Arg Phe Ser Thr His Gly Arg Gln Val Asn Gln Pro

720 725 730

cgt ggt aac atg acc tgc cag atc gtg cgc agc tgc tcg aag tgg agt 2424

Arg Gly Asn Met Thr Cys Gln Ile Val Arg Ser Cys Ser Lys Trp Ser

735 740 745

aac ggc act ccg acc gag cac tcc att cag gat gcg tat gct gcg gtc 2472

Asn Gly Thr Pro Thr Glu His Ser Ile Gln Asp Ala Tyr Ala Ala Val

750 755 760 765

att cgc aac agt cag cac ttt atc tac att gag aac cag ttc ttc atc 2520

Ile Arg Asn Ser Gln His Phe Ile Tyr Ile Glu Asn Gln Phe Phe Ile

770 775 780

aca gcg acc ggt gac gcg cag aag ccg gtg gag aac aag atc ggt gtt 2568

Thr Ala Thr Gly Asp Ala Gln Lys Pro Val Glu Asn Lys Ile Gly Val

785 790 795

gcg att gtg gag cgc att ctg cgc gct gcc cgt gct ggt gag aag ttc 2616

Ala Ile Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Ala Arg Ala Gly Glu Lys Phe

800 805 810

aag atc atc gtc gtg att ccc tcc gtc ccc tgc ttt gcc gga gat ttg 2664

Lys Ile Ile Val Val Ile Pro Ser Val Pro Cys Phe Ala Gly Asp Leu

815 820 825

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Ser Asp Glu Ser Thr Leu Gly Thr Arg Ala Ile Met Glu Phe Gln Tyr

830 835 840 845

aac tgc atc aac cgc gga ggc agc agc atc atg gag atg att gcc aag 2760

Asn Cys Ile Asn Arg Gly Gly Ser Ser Ile Met Glu Met Ile Ala Lys

850 855 860

gag gga ttc aac ccg atg gac tac atc cgg ttc tat aac ctg cgt aac 2808

Glu Gly Phe Asn Pro Met Asp Tyr Ile Arg Phe Tyr Asn Leu Arg Asn

865 870 875

tac gac cgc atc aat gtc agc ggc ccg ctg atg cag gct gag cag agc 2856

Tyr Asp Arg Ile Asn Val Ser Gly Pro Leu Met Gln Ala Glu Gln Ser

880 885 890

agc ggc gtc aat tac gag gat gcc cgc aaa cag cac gat gtg act acc 2904

Ser Gly Val Asn Tyr Glu Asp Ala Arg Lys Gln His Asp Val Thr Thr

895 900 905

ggc ggc cct ggt ggt tat ggt cct ggt gct ccg cgg gca gct ttc gac 2952

Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ala Ala Phe Asp

910 915 920 925

acc acc gcg cct tac cag cag tac cag caa gct gcc cag cag gtg ggc 3000

Thr Thr Ala Pro Tyr Gln Gln Tyr Gln Gln Ala Ala Gln Gln Val Gly

930 935 940

ggc aag tct ggc cag tgg gat agt gtg agc agc tgc tac atg ctc aat 3048

Gly Lys Ser Gly Gln Trp Asp Ser Val Ser Ser Cys Tyr Met Leu Asn

945 950 955

ggc cct gat att cgc aat gtg ccc tgg aac gga cct ccg gag gcc gag 3096

Gly Pro Asp Ile Arg Asn Val Pro Trp Asn Gly Pro Pro Glu Ala Glu

960 965 970

att gat gcg ttt gtc acc gag gaa ctc tat gtt cac tcc aag 3138

Ile Asp Ala Phe Val Thr Glu Glu Leu Tyr Val His Ser Lys

975 980 985

gtacgttagc cattcacatg gtataagtgc agaactaaca agatgcag gtg atg att 3195

Val Met Ile

990

gct gac gac cgt gtt gcc att gtc gga tcg gct aac ttg aac gac cgc 3243

Ala Asp Asp Arg Val Ala Ile Val Gly Ser Ala Asn Leu Asn Asp Arg

995 1000 1005

tct caa ctg gga act cac gac tcg gaa att gcc atc gtc att gag 3288

Ser Gln Leu Gly Thr His Asp Ser Glu Ile Ala Ile Val Ile Glu

1010 1015 1020

gac tac acc cct gtg cag tcc cgc atg aac ggc cag cct tgg act 3333

Asp Tyr Thr Pro Val Gln Ser Arg Met Asn Gly Gln Pro Trp Thr

1025 1030 1035

gcc agc cgg ttc gct acc tcc ctc cgt cgt cag ctg ttc cgc aag 3378

Ala Ser Arg Phe Ala Thr Ser Leu Arg Arg Gln Leu Phe Arg Lys

1040 1045 1050

cac ctg gga ctg ctg cca cca cag gac atg gag cgg ccg gac ggc 3423

His Leu Gly Leu Leu Pro Pro Gln Asp Met Glu Arg Pro Asp Gly

1055 1060 1065

aac ttc gag cca gtg ggc gtt ccc aac acc acc gac ttc gag tca 3468

Asn Phe Glu Pro Val Gly Val Pro Asn Thr Thr Asp Phe Glu Ser

1070 1075 1080

ccc gag agc cag att gtg gcc gat ccg ctg gcg gat acg ctg cac 3513

Pro Glu Ser Gln Ile Val Ala Asp Pro Leu Ala Asp Thr Leu His

1085 1090 1095

agt atg tgg aac acg cgg gct cgg acg aac acg gag gtg ttc cgc 3558

Ser Met Trp Asn Thr Arg Ala Arg Thr Asn Thr Glu Val Phe Arg

1100 1105 1110

aag gtc ttc cac tcg gtt ccg gac gac tcg gtg cgc aac tgg gct 3603

Lys Val Phe His Ser Val Pro Asp Asp Ser Val Arg Asn Trp Ala

1115 1120 1125

acg tac aag gag ttc tac gga tac tac ttc cac aac gcg gac aag 3648

Thr Tyr Lys Glu Phe Tyr Gly Tyr Tyr Phe His Asn Ala Asp Lys

1130 1135 1140

cag gcg tat ggc gag gac gag tcc aga cct gct cgc tac aag tat 3693

Gln Ala Tyr Gly Glu Asp Glu Ser Arg Pro Ala Arg Tyr Lys Tyr

1145 1150 1155

ggg cac gtg gtc cgc gac gac ttc cct ccg ggc ccg gag ggt gtc 3738

Gly His Val Val Arg Asp Asp Phe Pro Pro Gly Pro Glu Gly Val

1160 1165 1170

agg caa gtc aaa gaa ctg ctc agc cag gtc aag ggc acg ttg gtg 3783

Arg Gln Val Lys Glu Leu Leu Ser Gln Val Lys Gly Thr Leu Val

1175 1180 1185

gag atg cct ttg atg ttc ctg att gag gag gat gtg gcg aag gag 3828

Glu Met Pro Leu Met Phe Leu Ile Glu Glu Asp Val Ala Lys Glu

1190 1195 1200

ggg ttg acg ctg aat gag att acg gag cca atc tac act tga 3870

Gly Leu Thr Leu Asn Glu Ile Thr Glu Pro Ile Tyr Thr

1205 1210

<210> 2

<211> 3645

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(3642)

<223> 编码磷脂酶的cDNA

<400> 2

atg acc cgc ccc gag gac gac ctg gcc tat ggc cag tac tac cag gac 48

Met Thr Arg Pro Glu Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Gln Tyr Tyr Gln Asp

1 5 10 15

tcc gcc cgg gga gcc tct tcc gga gac tcc tcc agg ggt ctg agc gac 96

Ser Ala Arg Gly Ala Ser Ser Gly Asp Ser Ser Arg Gly Leu Ser Asp

20 25 30

act ttt aag aag ctg aag cag act tac aag tcc cac cag tcg caa cag 144

Thr Phe Lys Lys Leu Lys Gln Thr Tyr Lys Ser His Gln Ser Gln Gln

35 40 45

ggc tct tcc cag caa tct cag cag tcg cag caa tcc cag tcc gcc agc 192

Gly Ser Ser Gln Gln Ser Gln Gln Ser Gln Gln Ser Gln Ser Ala Ser

50 55 60

tac tac aat act tcg aac cag acc tac cag tcc caa ggt ccc tcg cag 240

Tyr Tyr Asn Thr Ser Asn Gln Thr Tyr Gln Ser Gln Gly Pro Ser Gln

65 70 75 80

tcc cag caa tac cat cct cag cag caa caa caa caa cag cag caa caa 288

Ser Gln Gln Tyr His Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

85 90 95

ccc cat ccg tcg aaa ccg cag aag cag gac aaa ttt tcc ggc ttg ttt 336

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100 105 110

ggc aag ctg gaa gaa ctc ggc aat gag gtg gca cag aaa ctg ggt acc 384

Gly Lys Leu Glu Glu Leu Gly Asn Glu Val Ala Gln Lys Leu Gly Thr

115 120 125

gcg ctc gac ccc cag gcg tat gcc gag tat ggc gct cca aag ccg cag 432

Ala Leu Asp Pro Gln Ala Tyr Ala Glu Tyr Gly Ala Pro Lys Pro Gln

130 135 140

acc gag aac cgc ttc ggg agc ttt gcg gcc ccg cgt cag ggt aac gag 480

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145 150 155 160

gtc aag tgg cac gtg gat ggt tgc gcc tac ttt tat gct gtg tcc aag 528

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165 170 175

gca ttg gag agt gcc aag gat tat att tgg att ctg gac tgg tgg ctc 576

Ala Leu Glu Ser Ala Lys Asp Tyr Ile Trp Ile Leu Asp Trp Trp Leu

180 185 190

tct ccg gaa ctt tac ctg aga cga ccc ccc gca aag cac gaa cag tac 624

Ser Pro Glu Leu Tyr Leu Arg Arg Pro Pro Ala Lys His Glu Gln Tyr

195 200 205

cgg ctg gat cgg atg ctg ttg gct gcg gcg cag cgc gga gtc cgg gtg 672

Arg Leu Asp Arg Met Leu Leu Ala Ala Ala Gln Arg Gly Val Arg Val

210 215 220

aac atc att gtg tac aag gag gtg acg cag gca ctg acc ctc tcc tca 720

Asn Ile Ile Val Tyr Lys Glu Val Thr Gln Ala Leu Thr Leu Ser Ser

225 230 235 240

cac cac acc aag cac cat ctg gaa gac ctc cat gaa aac att gca gta 768

His His Thr Lys His His Leu Glu Asp Leu His Glu Asn Ile Ala Val

245 250 255

ttc cgt cac ccc gat cac ctg ccc gac cgt cag gaa ctc gag gcg tcc 816

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260 265 270

atc cat acg tct ctc cag aac ttg tcc ctc gat gcc ggc aac ctt gcc 864

Ile His Thr Ser Leu Gln Asn Leu Ser Leu Asp Ala Gly Asn Leu Ala

275 280 285

aag atg tcc gaa gac gcc atc aag ggc atc tac ggc atg cac gag gat 912

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290 295 300

gtg att ctg tac tgg gct cac cac gag aag ctt tgc ctc att gat ggc 960

Val Ile Leu Tyr Trp Ala His His Glu Lys Leu Cys Leu Ile Asp Gly

305 310 315 320

cgc att gcg ttc atg ggt ggt ctg gat atg tgc ttt ggc cgc tgg gac 1008

Arg Ile Ala Phe Met Gly Gly Leu Asp Met Cys Phe Gly Arg Trp Asp

325 330 335

acc aac cag cat gaa ctg gcc gat gtt cac ggt cag gac ctg aac aag 1056

Thr Asn Gln His Glu Leu Ala Asp Val His Gly Gln Asp Leu Asn Lys

340 345 350

att gtc ttc ccc ggt cag gac tac aac aac gcc cga gtg agt gat ttc 1104

Ile Val Phe Pro Gly Gln Asp Tyr Asn Asn Ala Arg Val Ser Asp Phe

355 360 365

cac gac gtt gcc cac tgg gag cag aac cag ctg gac cgc aag gac act 1152

His Asp Val Ala His Trp Glu Gln Asn Gln Leu Asp Arg Lys Asp Thr

370 375 380

tct cgc atg ggc tgg tcc gat att tcg gtc agt ttg cac ggc ccg gtc 1200

Ser Arg Met Gly Trp Ser Asp Ile Ser Val Ser Leu His Gly Pro Val

385 390 395 400

gtc gag gat ctg agg aag cac ttt gtt cag cgg tgg aac ttc atc tat 1248

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405 410 415

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Asp Ser Lys Tyr Gln Ser Arg Asn Asn Ser Arg Tyr Ala Arg Leu Ala

420 425 430

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435 440 445

cag ggt ggt cag gcc cag aaa ccg ccc gcg tcg cct cag cct ggt gcc 1392

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450 455 460

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465 470 475 480

cct ggg gca aat cct ggt cct cct gct cct agc tgg cag caa cag gca 1488

Pro Gly Ala Asn Pro Gly Pro Pro Ala Pro Ser Trp Gln Gln Gln Ala

485 490 495

gct ccg tcg cag cct agc gcc cag gca cct agt tcc agc agc tct tct 1536

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500 505 510

acc cca agc tgg cag cag cag cag acc gga gtt gcc agc aac act cag 1584

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515 520 525

cct tcc agc act gcc aac ccc gcg aca cct acc tgg cag cag cag gca 1632

Pro Ser Ser Thr Ala Asn Pro Ala Thr Pro Thr Trp Gln Gln Gln Ala

530 535 540

ccg aca cct caa cag gga ggc tac gca gcc agt cct tcc ccc aac ccg 1680

Pro Thr Pro Gln Gln Gly Gly Tyr Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn Pro

545 550 555 560

agc agc cag gag aag ccc agc tgg caa cag cag cct gcg cag ccc agc 1728

Ser Ser Gln Glu Lys Pro Ser Trp Gln Gln Gln Pro Ala Gln Pro Ser

565 570 575

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580 585 590

tgg caa cag cag agc tct gag cct cct gcg tac tcg gcc cac cca cag 1824

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595 600 605

cag cac tac act tac agt ggt gac tcg ttc ccc cca ccc cct cct ggt 1872

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610 615 620

cct ccg cca gcc cag aac tct gtg cag gcg tct tac cag gcg tac aac 1920

Pro Pro Pro Ala Gln Asn Ser Val Gln Ala Ser Tyr Gln Ala Tyr Asn

625 630 635 640

ccc cag cag ccg tcg cct cag aac cag aca ccc acc caa ggc cag agt 1968

Pro Gln Gln Pro Ser Pro Gln Asn Gln Thr Pro Thr Gln Gly Gln Ser

645 650 655

cag act cct tac tat ccg cct ccc ccg aac cag gaa gtc cac cac tcg 2016

Gln Thr Pro Tyr Tyr Pro Pro Pro Pro Asn Gln Glu Val His His Ser

660 665 670

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Gln Thr Arg Gly Ile His Asp Ala His Gln Ser Gly Tyr Gly Asp Ser

675 680 685

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Glu Arg Gly Phe Asn Pro Arg Arg Leu Arg Glu Asn Phe Met Asp Tyr

690 695 700

ggc aac gtc ctg cgt ggc gag ttg gca ggc cag atc cat cag tac cag 2160

Gly Asn Val Leu Arg Gly Glu Leu Ala Gly Gln Ile His Gln Tyr Gln

705 710 715 720

gat cgg ttc tcc act cat ggc cgt cag gtt aac cag ccc cgt ggt aac 2208

Asp Arg Phe Ser Thr His Gly Arg Gln Val Asn Gln Pro Arg Gly Asn

725 730 735

atg acc tgc cag atc gtg cgc agc tgc tcg aag tgg agt aac ggc act 2256

Met Thr Cys Gln Ile Val Arg Ser Cys Ser Lys Trp Ser Asn Gly Thr

740 745 750

ccg acc gag cac tcc att cag gat gcg tat gct gcg gtc att cgc aac 2304

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755 760 765

agt cag cac ttt atc tac att gag aac cag ttc ttc atc aca gcg acc 2352

Ser Gln His Phe Ile Tyr Ile Glu Asn Gln Phe Phe Ile Thr Ala Thr

770 775 780

ggt gac gcg cag aag ccg gtg gag aac aag atc ggt gtt gcg att gtg 2400

Gly Asp Ala Gln Lys Pro Val Glu Asn Lys Ile Gly Val Ala Ile Val

785 790 795 800

gag cgc att ctg cgc gct gcc cgt gct ggt gag aag ttc aag atc atc 2448

Glu Arg Ile Leu Arg Ala Ala Arg Ala Gly Glu Lys Phe Lys Ile Ile

805 810 815

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820 825 830

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Ser Thr Leu Gly Thr Arg Ala Ile Met Glu Phe Gln Tyr Asn Cys Ile

835 840 845

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Asn Arg Gly Gly Ser Ser Ile Met Glu Met Ile Ala Lys Glu Gly Phe

850 855 860

aac ccg atg gac tac atc cgg ttc tat aac ctg cgt aac tac gac cgc 2640

Asn Pro Met Asp Tyr Ile Arg Phe Tyr Asn Leu Arg Asn Tyr Asp Arg

865 870 875 880

atc aat gtc agc ggc ccg ctg atg cag gct gag cag agc agc ggc gtc 2688

Ile Asn Val Ser Gly Pro Leu Met Gln Ala Glu Gln Ser Ser Gly Val

885 890 895

aat tac gag gat gcc cgc aaa cag cac gat gtg act acc ggc ggc cct 2736

Asn Tyr Glu Asp Ala Arg Lys Gln His Asp Val Thr Thr Gly Gly Pro

900 905 910

ggt ggt tat ggt cct ggt gct ccg cgg gca gct ttc gac acc acc gcg 2784

Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ala Ala Phe Asp Thr Thr Ala

915 920 925

cct tac cag cag tac cag caa gct gcc cag cag gtg ggc ggc aag tct 2832

Pro Tyr Gln Gln Tyr Gln Gln Ala Ala Gln Gln Val Gly Gly Lys Ser

930 935 940

ggc cag tgg gat agt gtg agc agc tgc tac atg ctc aat ggc cct gat 2880

Gly Gln Trp Asp Ser Val Ser Ser Cys Tyr Met Leu Asn Gly Pro Asp

945 950 955 960

att cgc aat gtg ccc tgg aac gga cct ccg gag gcc gag att gat gcg 2928

Ile Arg Asn Val Pro Trp Asn Gly Pro Pro Glu Ala Glu Ile Asp Ala

965 970 975

ttt gtc acc gag gaa ctc tat gtt cac tcc aag gtg atg att gct gac 2976

Phe Val Thr Glu Glu Leu Tyr Val His Ser Lys Val Met Ile Ala Asp

980 985 990

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Asp Arg Val Ala Ile Val Gly Ser Ala Asn Leu Asn Asp Arg Ser Gln

995 1000 1005

ctg gga act cac gac tcg gaa att gcc atc gtc att gag gac tac 3069

Leu Gly Thr His Asp Ser Glu Ile Ala Ile Val Ile Glu Asp Tyr

1010 1015 1020

acc cct gtg cag tcc cgc atg aac ggc cag cct tgg act gcc agc 3114

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1025 1030 1035

cgg ttc gct acc tcc ctc cgt cgt cag ctg ttc cgc aag cac ctg 3159

Arg Phe Ala Thr Ser Leu Arg Arg Gln Leu Phe Arg Lys His Leu

1040 1045 1050

gga ctg ctg cca cca cag gac atg gag cgg ccg gac ggc aac ttc 3204

Gly Leu Leu Pro Pro Gln Asp Met Glu Arg Pro Asp Gly Asn Phe

1055 1060 1065

gag cca gtg ggc gtt ccc aac acc acc gac ttc gag tca ccc gag 3249

Glu Pro Val Gly Val Pro Asn Thr Thr Asp Phe Glu Ser Pro Glu

1070 1075 1080

agc cag att gtg gcc gat ccg ctg gcg gat acg ctg cac agt atg 3294

Ser Gln Ile Val Ala Asp Pro Leu Ala Asp Thr Leu His Ser Met

1085 1090 1095

tgg aac acg cgg gct cgg acg aac acg gag gtg ttc cgc aag gtc 3339

Trp Asn Thr Arg Ala Arg Thr Asn Thr Glu Val Phe Arg Lys Val

1100 1105 1110

ttc cac tcg gtt ccg gac gac tcg gtg cgc aac tgg gct acg tac 3384

Phe His Ser Val Pro Asp Asp Ser Val Arg Asn Trp Ala Thr Tyr

1115 1120 1125

aag gag ttc tac gga tac tac ttc cac aac gcg gac aag cag gcg 3429

Lys Glu Phe Tyr Gly Tyr Tyr Phe His Asn Ala Asp Lys Gln Ala

1130 1135 1140

tat ggc gag gac gag tcc aga cct gct cgc tac aag tat ggg cac 3474

Tyr Gly Glu Asp Glu Ser Arg Pro Ala Arg Tyr Lys Tyr Gly His

1145 1150 1155

gtg gtc cgc gac gac ttc cct ccg ggc ccg gag ggt gtc agg caa 3519

Val Val Arg Asp Asp Phe Pro Pro Gly Pro Glu Gly Val Arg Gln

1160 1165 1170

gtc aaa gaa ctg ctc agc cag gtc aag ggc acg ttg gtg gag atg 3564

Val Lys Glu Leu Leu Ser Gln Val Lys Gly Thr Leu Val Glu Met

1175 1180 1185

cct ttg atg ttc ctg att gag gag gat gtg gcg aag gag ggg ttg 3609

Pro Leu Met Phe Leu Ile Glu Glu Asp Val Ala Lys Glu Gly Leu

1190 1195 1200

acg ctg aat gag att acg gag cca atc tac act tga 3645

Thr Leu Asn Glu Ile Thr Glu Pro Ile Tyr Thr

1205 1210

<210> 3

<211> 1214

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 3

Met Thr Arg Pro Glu Asp Asp Leu Ala Tyr Gly Gln Tyr Tyr Gln Asp

1 5 10 15

Ser Ala Arg Gly Ala Ser Ser Gly Asp Ser Ser Arg Gly Leu Ser Asp

20 25 30

Thr Phe Lys Lys Leu Lys Gln Thr Tyr Lys Ser His Gln Ser Gln Gln

35 40 45

Gly Ser Ser Gln Gln Ser Gln Gln Ser Gln Gln Ser Gln Ser Ala Ser

50 55 60

Tyr Tyr Asn Thr Ser Asn Gln Thr Tyr Gln Ser Gln Gly Pro Ser Gln

65 70 75 80

Ser Gln Gln Tyr His Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

85 90 95

Pro His Pro Ser Lys Pro Gln Lys Gln Asp Lys Phe Ser Gly Leu Phe

100 105 110

Gly Lys Leu Glu Glu Leu Gly Asn Glu Val Ala Gln Lys Leu Gly Thr

115 120 125

Ala Leu Asp Pro Gln Ala Tyr Ala Glu Tyr Gly Ala Pro Lys Pro Gln

130 135 140

Thr Glu Asn Arg Phe Gly Ser Phe Ala Ala Pro Arg Gln Gly Asn Glu

145 150 155 160

Val Lys Trp His Val Asp Gly Cys Ala Tyr Phe Tyr Ala Val Ser Lys

165 170 175

Ala Leu Glu Ser Ala Lys Asp Tyr Ile Trp Ile Leu Asp Trp Trp Leu

180 185 190

Ser Pro Glu Leu Tyr Leu Arg Arg Pro Pro Ala Lys His Glu Gln Tyr

195 200 205

Arg Leu Asp Arg Met Leu Leu Ala Ala Ala Gln Arg Gly Val Arg Val

210 215 220

Asn Ile Ile Val Tyr Lys Glu Val Thr Gln Ala Leu Thr Leu Ser Ser

225 230 235 240

His His Thr Lys His His Leu Glu Asp Leu His Glu Asn Ile Ala Val

245 250 255

Phe Arg His Pro Asp His Leu Pro Asp Arg Gln Glu Leu Glu Ala Ser

260 265 270

Ile His Thr Ser Leu Gln Asn Leu Ser Leu Asp Ala Gly Asn Leu Ala

275 280 285

Lys Met Ser Glu Asp Ala Ile Lys Gly Ile Tyr Gly Met His Glu Asp

290 295 300

Val Ile Leu Tyr Trp Ala His His Glu Lys Leu Cys Leu Ile Asp Gly

305 310 315 320

Arg Ile Ala Phe Met Gly Gly Leu Asp Met Cys Phe Gly Arg Trp Asp

325 330 335

Thr Asn Gln His Glu Leu Ala Asp Val His Gly Gln Asp Leu Asn Lys

340 345 350

Ile Val Phe Pro Gly Gln Asp Tyr Asn Asn Ala Arg Val Ser Asp Phe

355 360 365

His Asp Val Ala His Trp Glu Gln Asn Gln Leu Asp Arg Lys Asp Thr

370 375 380

Ser Arg Met Gly Trp Ser Asp Ile Ser Val Ser Leu His Gly Pro Val

385 390 395 400

Val Glu Asp Leu Arg Lys His Phe Val Gln Arg Trp Asn Phe Ile Tyr

405 410 415

Asp Ser Lys Tyr Gln Ser Arg Asn Asn Ser Arg Tyr Ala Arg Leu Ala

420 425 430

Leu Tyr Gly Arg Pro Thr Ser Gly Pro Gln Gln Gln Gln Gly Pro Gln

435 440 445

Gln Gly Gly Gln Ala Gln Lys Pro Pro Ala Ser Pro Gln Pro Gly Ala

450 455 460

Thr Gly Pro Pro Pro Pro Ser Trp Gln Gln Gln Ala Ala Ser Pro Gln

465 470 475 480

Pro Gly Ala Asn Pro Gly Pro Pro Ala Pro Ser Trp Gln Gln Gln Ala

485 490 495

Ala Pro Ser Gln Pro Ser Ala Gln Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser

500 505 510

Thr Pro Ser Trp Gln Gln Gln Gln Thr Gly Val Ala Ser Asn Thr Gln

515 520 525

Pro Ser Ser Thr Ala Asn Pro Ala Thr Pro Thr Trp Gln Gln Gln Ala

530 535 540

Pro Thr Pro Gln Gln Gly Gly Tyr Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn Pro

545 550 555 560

Ser Ser Gln Glu Lys Pro Ser Trp Gln Gln Gln Pro Ala Gln Pro Ser

565 570 575

Gly Tyr Gln Pro Gln Ala Gln Thr Thr Gly Ser Gln Glu Lys Pro Ser

580 585 590

Trp Gln Gln Gln Ser Ser Glu Pro Pro Ala Tyr Ser Ala His Pro Gln

595 600 605

Gln His Tyr Thr Tyr Ser Gly Asp Ser Phe Pro Pro Pro Pro Pro Gly

610 615 620

Pro Pro Pro Ala Gln Asn Ser Val Gln Ala Ser Tyr Gln Ala Tyr Asn

625 630 635 640

Pro Gln Gln Pro Ser Pro Gln Asn Gln Thr Pro Thr Gln Gly Gln Ser

645 650 655

Gln Thr Pro Tyr Tyr Pro Pro Pro Pro Asn Gln Glu Val His His Ser

660 665 670

Gln Thr Arg Gly Ile His Asp Ala His Gln Ser Gly Tyr Gly Asp Ser

675 680 685

Glu Arg Gly Phe Asn Pro Arg Arg Leu Arg Glu Asn Phe Met Asp Tyr

690 695 700

Gly Asn Val Leu Arg Gly Glu Leu Ala Gly Gln Ile His Gln Tyr Gln

705 710 715 720

Asp Arg Phe Ser Thr His Gly Arg Gln Val Asn Gln Pro Arg Gly Asn

725 730 735

Met Thr Cys Gln Ile Val Arg Ser Cys Ser Lys Trp Ser Asn Gly Thr

740 745 750

Pro Thr Glu His Ser Ile Gln Asp Ala Tyr Ala Ala Val Ile Arg Asn

755 760 765

Ser Gln His Phe Ile Tyr Ile Glu Asn Gln Phe Phe Ile Thr Ala Thr

770 775 780

Gly Asp Ala Gln Lys Pro Val Glu Asn Lys Ile Gly Val Ala Ile Val

785 790 795 800

Glu Arg Ile Leu Arg Ala Ala Arg Ala Gly Glu Lys Phe Lys Ile Ile

805 810 815

Val Val Ile Pro Ser Val Pro Cys Phe Ala Gly Asp Leu Ser Asp Glu

820 825 830

Ser Thr Leu Gly Thr Arg Ala Ile Met Glu Phe Gln Tyr Asn Cys Ile

835 840 845

Asn Arg Gly Gly Ser Ser Ile Met Glu Met Ile Ala Lys Glu Gly Phe

850 855 860

Asn Pro Met Asp Tyr Ile Arg Phe Tyr Asn Leu Arg Asn Tyr Asp Arg

865 870 875 880

Ile Asn Val Ser Gly Pro Leu Met Gln Ala Glu Gln Ser Ser Gly Val

885 890 895

Asn Tyr Glu Asp Ala Arg Lys Gln His Asp Val Thr Thr Gly Gly Pro

900 905 910

Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ala Ala Phe Asp Thr Thr Ala

915 920 925

Pro Tyr Gln Gln Tyr Gln Gln Ala Ala Gln Gln Val Gly Gly Lys Ser

930 935 940

Gly Gln Trp Asp Ser Val Ser Ser Cys Tyr Met Leu Asn Gly Pro Asp

945 950 955 960

Ile Arg Asn Val Pro Trp Asn Gly Pro Pro Glu Ala Glu Ile Asp Ala

965 970 975

Phe Val Thr Glu Glu Leu Tyr Val His Ser Lys Val Met Ile Ala Asp

980 985 990

Asp Arg Val Ala Ile Val Gly Ser Ala Asn Leu Asn Asp Arg Ser Gln

995 1000 1005

Leu Gly Thr His Asp Ser Glu Ile Ala Ile Val Ile Glu Asp Tyr

1010 1015 1020

Thr Pro Val Gln Ser Arg Met Asn Gly Gln Pro Trp Thr Ala Ser

1025 1030 1035

Arg Phe Ala Thr Ser Leu Arg Arg Gln Leu Phe Arg Lys His Leu

1040 1045 1050

Gly Leu Leu Pro Pro Gln Asp Met Glu Arg Pro Asp Gly Asn Phe

1055 1060 1065

Glu Pro Val Gly Val Pro Asn Thr Thr Asp Phe Glu Ser Pro Glu

1070 1075 1080

Ser Gln Ile Val Ala Asp Pro Leu Ala Asp Thr Leu His Ser Met

1085 1090 1095

Trp Asn Thr Arg Ala Arg Thr Asn Thr Glu Val Phe Arg Lys Val

1100 1105 1110

Phe His Ser Val Pro Asp Asp Ser Val Arg Asn Trp Ala Thr Tyr

1115 1120 1125

Lys Glu Phe Tyr Gly Tyr Tyr Phe His Asn Ala Asp Lys Gln Ala

1130 1135 1140

Tyr Gly Glu Asp Glu Ser Arg Pro Ala Arg Tyr Lys Tyr Gly His

1145 1150 1155

Val Val Arg Asp Asp Phe Pro Pro Gly Pro Glu Gly Val Arg Gln

1160 1165 1170

Val Lys Glu Leu Leu Ser Gln Val Lys Gly Thr Leu Val Glu Met

1175 1180 1185

Pro Leu Met Phe Leu Ile Glu Glu Asp Val Ala Lys Glu Gly Leu

1190 1195 1200

Thr Leu Asn Glu Ile Thr Glu Pro Ile Tyr Thr

1205 1210

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物spo14-1（正义）

<400> 4

cggtggcggc cgcattcaac aaccgagtga 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物spo14-2（反义）

<400> 5

cgctccgact agttagatac tagactagat a 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物spo14-3（正义）

<400> 6

gtttaaacca ctggcagcca ggagaagccc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物spo14-4（反义）

<400> 7

ttaattaaaa tgaaggaaga gatggaagga 30

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物（spo14-5）

<400> 8

cactggcagc caggagaagc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物（spo14-6）

<400> 9

ggagtgctcg gtcggagtgc 20

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pldex-1（正义）

<400> 10

ggatttagtc ttgatcggat ccaccatgcg ttggcctggt 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pldex-2（反义）

<400> 11

gaaatggatt gattgtcacg tgttattcaa tgctccagtc 40

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物（pldexC-3）

<400> 12

atgcgttggc ctggtaattt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物（pldexC-4）

<400> 13

gatggtctcg tagacaaacg 20

Claims (21)

1.一种丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞包含编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸并且包含灭活的spo14基因或其同源物，其中所述spo14基因或其同源物编码具有以下氨基酸序列的磷脂酶D，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性；与SEQ IDNO:3具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

2.如权利要求1所述的宿主细胞，该宿主细胞属于选自下组的属，该组由以下组成：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。

3.如权利要求2所述的宿主细胞，该宿主细胞是曲霉属细胞；优选地是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。

4.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

5.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该磷脂酶D包含以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:3具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

6.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该spo14基因或其同源物包含以下基因组核苷酸序列或由其组成，该基因组核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:1具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

7.如任一项前述权利要求所述的宿主细胞，其中该spo14基因或其同源物包含以下基因组核苷酸序列或由其组成，其cDNA序列与SEQ ID NO:2具有至少70％的同一性；与SEQ IDNO:2具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

8.一种产生分泌的目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在有利于表达该分泌的目的多肽的条件下培养丝状真菌宿主细胞，该丝状真菌宿主细胞包含编码该分泌的目的多肽的异源多核苷酸并且包含灭活的spo14基因或其同源物，其中所述spo14基因或其同源物编码具有以下氨基酸序列的磷脂酶D，该氨基酸序列与SEQID NO:3具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性；以及，任选地

b)回收该分泌的目的多肽。

9.如权利要求8所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞属于选自由以下组成的组的属：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉胞菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。

10.如权利要求9所述的方法细胞，其中该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。

11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中该磷脂酶D包含以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:3具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

13.如权利要求8-12中任一项所述的方法，其中该spo14基因或其同源物包含以下基因组核苷酸序列或由其组成，该基因组核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:1具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

14.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其中该spo14基因或其同源物包含以下基因组核苷酸序列或由其组成，其cDNA序列与SEQ ID NO:2具有至少70％的同一性；与SEQ IDNO:2具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

15.一种产生丝状真菌宿主细胞的方法，该丝状真菌宿主细胞具有分泌的异源目的多肽的改善的产量，所述方法无具体顺序地包括以下步骤：

a)用编码分泌的目的多肽的异源多核苷酸转化丝状真菌宿主细胞；以及

b)在该丝状真菌宿主细胞中灭活spo14基因或其同源物，其中所述spo14基因或其同源物编码具有以下氨基酸序列的磷脂酶D，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

16.如权利要求15所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞属于选自由以下组成的组的属：枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉胞菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。

17.如权利要求16所述的方法细胞，其中该丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞；优选地是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。

18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其中该分泌的目的多肽是酶；优选地，该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶；最优选地该分泌的目的多肽是葡糖淀粉酶。

19.如权利要求15-18中任一项所述的方法，其中该磷脂酶D包含以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:3具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:3具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

20.如权利要求15-19中任一项所述的方法，其中该spo14基因或其同源物包含以下基因组核苷酸序列或由其组成，该基因组核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO:1具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。

21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中该spo14基因或其同源物包含以下基因组核苷酸序列或由其组成，其cDNA序列与SEQ ID NO:2具有至少70％的同一性；与SEQ IDNO:2具有优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或最优选地至少99％的同一性。