BR112021007367A2 - componentes e composições recombinantes para uso em produtos alimentares - Google Patents

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Abstract

COMPONENTES E COMPOSIÇÕES RECOMBINANTES PARA USO EM PRODUTOS ALIMENTARES. São fornecidos métodos para produzir produtos alimentares compreendendo componentes e composições recombinantes usados em produtos alimentares produzidos por tais métodos.

Description

“COMPONENTES E COMPOSIÇÕES RECOMBINANTES PARA O USO EM PRODUTOS ALIMENTARES” PEDIDOS RELACIONADOS
[001]Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos Estados Unidos nº de série: 62/746.918, depositado em 17 de outubro de 2018, que é incorporado neste documento por referência, em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002]A presente invenção se refere geralmente a alternativas para produtos alimentares de origem animal. Em particular, a presente invenção se refere a componentes e composições recombinantes para uso em produtos alimentares, métodos para produzir esses componentes e composições e métodos para produzir produtos alimentares compreendendo esses componentes e composições.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003]Os produtos alimentares derivados de animais (por exemplo, carne, leite, ovo) são fontes populares de nutrição. Eles compreendem proteínas de alta qualidade, minerais essenciais (por exemplo, cálcio, fósforo, zinco, magnésio) e vitaminas (por exemplo, riboflavina, vitamina A, vitamina B12). Além disso, muitos desses produtos alimentares possuem características funcionais vantajosas que permitem a produção de uma ampla variedade de produtos alimentares derivados (por exemplo, iogurte, queijo, creme, sorvete, manteiga, maionese).
[004]Entretanto, os produtos alimentares de origem animal compreendem componentes (por exemplo, lactose, alérgenos, gorduras saturadas, colesterol) que podem causar reações prejudiciais em humanos. Além disso, a produção desses alimentos envolve a pecuária, que tem impacto significativo no bem-estar animal e no meio ambiente e apresenta potencial de contaminação por patógenos, resíduos de pesticidas, metais pesados e aflatoxina M1.
[005]Estas preocupações têm alimentado o desenvolvimento de alternativas para produtos alimentares derivados de animais. Algumas dessas alternativas compreendem componentes derivados de plantas (por exemplo, proteínas, lipídeos, vitaminas). Cada vez mais, no entanto, alternativas para produtos alimentares de origem animal são produzidas a partir de componentes (por exemplo, proteínas, lipídeos) que são produzidos de forma recombinante (por exemplo, usando células hospedeiras microbianas).
[006]O uso de componentes recombinantes em produtos alimentares apresenta novos problemas. Um desses problemas é o fato de que produtos alimentares produzidos a partir de componentes recombinantes frequentemente contêm uma quantidade significativa de tais componentes recombinantes (mais do que era típico em produtos anteriores nos quais os componentes recombinantes foram usados), e que o uso de grandes quantidades de componentes recombinantes pode ser impactado por outros componentes, às vezes indesejados, que são produzidos simultaneamente pelas células hospedeiras microbianas a partir das quais os componentes recombinantes são obtidos.
[007]Um desses outros componentes é a atividade da esterase. As esterases podem hidrolisar ligações éster em diglicerídeos, triglicerídeos, fosfolipídeos e/ou lipoproteínas para liberar ácidos graxos livres. As composições compreendendo diglicerídeos, triglicerídeos, fosfolipídeos e/ou lipoproteínas são utilizadas numa variedade de produtos alimentares nos quais podem ser usados componentes recombinantes. Em alguns desses produtos alimentares, a liberação catalisada por esterase de ácidos graxos livres pode ter efeitos prejudiciais nas propriedades, como, por exemplo, textura, emulsificação, aroma, sabor e teor nutricional. Em outros produtos alimentares, a liberação de ácidos graxos livres catalisada por esterase pode ter efeitos benéficos nas propriedades, como, por exemplo, perfis de sabor (por exemplo, perfis de sabor de queijo envelhecido.
[008]Como resultado, desafios devem ser superados, particularmente no que diz respeito à atividade esterase, na produção, processamento e uso de componentes recombinantes para a produção de alternativas a produtos alimentares de origem animal.
[009]Portanto, existe uma necessidade de métodos pelos quais alternativas para produtos alimentares derivados de animais possam ser produzidas a partir de componentes recombinantes, bem como para composições usadas em e obtidas a partir de tais métodos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[010]Modalidades de exemplo serão descritas e explicadas com especificidade e detalhes adicionais por meio do uso dos desenhos anexos, nos quais:
[011]A Figura 1 é um gráfico que mostra resultados de um ensaio de ácido graxo livre (FFA) de preparações de β-lactoglobulina recombinante obtidas a partir da purificação de uma atividade de esterase com base na carga (isto é, complexação iônica) e termolabilidade/termoestabilidade, em que o “material final” é uma preparação depois de trocas de tampão para remover alto teor de sal e para concentrar a β-lactoglobulina recombinante, de acordo com várias modalidades representativas da presente invenção;
[012]A Figura 2 mostra géis PAGE nativos corados de preparações de β- lactoglobulina recombinante obtidas a partir da purificação de uma atividade de esterase com base na carga (isto é, complexação iônica) e termolabilidade/termoestabilidade, em que o “material final” é uma preparação depois de trocas de tampão para remover alto teor de sal e para concentrar a β-lactoglobulina recombinante, de acordo com várias modalidades representativas da presente invenção;
[013]A Figura 3 é um gráfico que mostra resultados de um ensaio de FFA de preparações de β-lactoglobulina recombinante obtidas a partir da purificação de uma atividade de esterase com base na carga (isto é, complexação iônica) e hidrofobicidade, em que o “material final” é uma preparação depois de trocas de tampão para remover alto teor de sal e para concentrar a β-lactoglobulina recombinante, de acordo com várias modalidades representativas da presente invenção;
[014]A Figura 4 mostra géis PAGE nativos corados de preparações de β- lactoglobulina recombinante obtidas a partir da purificação de uma atividade de esterase com base na carga (isto é, complexação iônica) e hidrofobicidade, em que o “material final” é uma preparação depois de trocas de tampão para remover alto teor de sal e para concentrar a β-lactoglobulina recombinante, de acordo com várias modalidades representativas da presente invenção;
[015]A Figura 5 é um diagrama que mostra resultados de um ensaio de pNPL de caldos de fermentação clarificados obtidos de culturas compreendendo os agentes anti-espuma indicados, com análise de Tukey-Kramer, de acordo com várias modalidades representativas da presente invenção;
[016]A Figura 6 é um mapa de um vetor alvo usado para produção de uma célula hospedeira recombinante compreendendo uma atividade de cutinase eliminada, de acordo com uma modalidade representativa da presente invenção;
[017]A Figura 7 é um gráfico que mostra resultados de um ensaio de FFA para preparações de β-lactoglobulina recombinante obtidas de células hospedeiras recombinantes compreendendo uma atividade de cutinase eliminada em comparação com uma preparação de β-lactoglobulina recombinante obtida de uma célula hospedeira recombinante correspondente, de acordo com várias modalidades representativas da presente invenção;
[018]A Figura 8 mostra géis PAGE nativos corados de preparações de β- lactoglobulina recombinante obtidas de células hospedeiras recombinantes compreendendo uma atividade de cutinase eliminada em comparação com uma preparação de β-lactoglobulina recombinante obtida de uma célula hospedeira recombinante correspondente, de acordo com várias modalidades representativas da presente invenção; e
[019]As Figuras 9A a 9F mostram fotografias de composição de gel de confeitos congelados compreendendo β-lactoglobulina bovina nativa ou recombinante na presença ou ausência de atividade de esterase de acordo com várias modalidades representativas da presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[020]Em um aspecto, é fornecido neste documento um método para produzir um produto alimentar compreendendo um componente recombinante produzido por uma célula hospedeira microbiana recombinante capaz de produzir o componente recombinante, em que o método compreende pelo menos uma etapa em que uma atividade de uma esterase é essencialmente eliminada ou modulada.
[021]Em um outro aspecto, é fornecido neste documento uma preparação que compreende um componente recombinante e uma atividade de esterase que é essencialmente eliminada ou modulada em comparação com a atividade de esterase compreendida em uma preparação correspondente.
[022]Em um outro aspecto, é fornecido neste documento uma célula hospedeira microbiana recombinante que é capaz de produzir um componente recombinante e que compreende uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase em comparação com a atividade de esterase compreendida em uma célula hospedeira microbiana recombinante correspondente.
[023]Em um outro aspecto, é fornecido neste documento um produto alimentar que compreende um componente recombinante produzido por uma célula hospedeira microbiana recombinante, em que o produto alimentar compreende ainda uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de uma esterase em comparação com a atividade da esterase em um produto alimentar correspondente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[024]A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta divulgação se refere. Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo contexto, os termos singulares incluirão o plural e os termos plurais incluirão o singular. Definições
[025]Os termos “um” e “uma”, “o e a” e referências semelhantes, conforme usados neste documento, referem-se ao singular e ao plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto.
[026]O termo “cerca de”, conforme usado neste documento, refere-se a estar dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular, conforme determinado por alguém versado na técnica, que pode depender em parte de como o valor é medido ou determinado, ou sobre as limitações do sistema de medição.
[027]O termo “e/ou”, conforme usado neste documento, refere-se a vários componentes em combinação ou exclusivos um do outro. Por exemplo, “x, y e/ou z” pode se referir a “x” sozinho, “y” sozinho, “z” sozinho, “x, y e z”, “(x e y) ou z”, ou “x ou y ou z”.
[028]O termo “preparação correspondente”, tal como usado neste documento, refere-se a uma preparação que é idêntica à preparação que é comparada com a “preparação correspondente”, exceto que a atividade esterase compreendida na “preparação correspondente” não é essencialmente eliminada ou modulada como fornecido neste documento (por exemplo, em virtude da preparação não ser derivada de uma célula hospedeira microbiana recombinante compreendendo uma atividade esterase essencialmente eliminada ou modulada e/ou de uma célula hospedeira microbiana recombinante que foi cultivada em condições adequadas para essencialmente eliminar ou modular uma esterase atividade e/ou de um caldo de fermentação que compreendia um inibidor de esterase; ou em virtude do componente recombinante não ser purificado da atividade de esterase).
[029]O termo “produto alimentar correspondente”, tal como aqui usado, refere- se a um produto alimentar que é produzido por um método que é idêntico ao método usado para produzir o produto alimentar que é comparado com o “produto alimentar correspondente”, exceto que o método pelo qual o “produto alimentar correspondente” é produzido não compreende pelo menos uma etapa na qual uma atividade esterase é essencialmente eliminada ou modulada, conforme previsto no método fornecido neste documento.
[030]O termo “célula hospedeira microbiana recombinante correspondente” refere-se a uma célula hospedeira microbiana recombinante que é idêntica à célula hospedeira microbiana recombinante que é comparada à “célula hospedeira microbiana recombinante correspondente”, exceto que a atividade esterase do “recombinante correspondente célula hospedeira microbiana “não é essencialmente eliminada ou modulada conforme fornecido na célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento.
[031]Os termos “essencialmente livre de” e “essencialmente eliminado”, tal como usados neste documento, referem-se ao componente indicado sendo não detectável na composição indicada por métodos analíticos comuns, ou ao componente indicado estando presente em tais quantidades vestigiais de modo a não ser funcional. O termo “funcional”, conforme usado neste contexto, refere-se a não contribuir para as propriedades da composição que compreende as quantidades vestigiais do componente indicado, ou a não ter atividade (por exemplo, atividade enzimática) na composição indicada compreendendo as quantidades vestigiais do componente indicado componente, ou não ter efeitos adversos à saúde após o consumo da composição que compreende as quantidades vestigiais do componente indicado.
[032]Os termos “atividade esterase” ou “atividade de uma esterase”, tal como aqui usados, referem-se à atividade de uma enzima que pode hidrolisar uma ligação éster (isto é, hidrolase atuando em uma ligação éster). As esterases são designadas com o número de comissão da enzima (número CE) 3.1. Os termos são usados indistintamente neste documento.
[033]O termo “caldo de fermentação”, tal como usado neste documento, refere-se a uma cultura que compreende uma célula hospedeira microbiana recombinante capaz de produzir um componente recombinante.
[034]O termo “célula fúngica filamentosa”, tal como usado neste documento refere-se a uma célula de qualquer forma filamentosa da subdivisão Eumycota e Oomycota (conforme definido por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). Uma célula fúngica filamentosa se distingue da levedura por seu alongamento de hifas durante o crescimento vegetativo.
[035]O termo “fungo”, tal como usado neste documento, refere-se a organismos dos filos Ascomycotas, Basidiomycota, Zygomycota e Chythridiomycota, Oomycota e Glomeromycota. Entende-se, no entanto, que a taxonomia dos fungos está em constante evolução e, portanto, essa definição específica do reino dos fungos pode ser ajustada no futuro.
[036]O termo “heterólogo”, tal como usado neste documento, refere-se a não estar normalmente presente no contexto em que é descrito. Em outras palavras, uma entidade assim caracterizada é estrangeira no contexto em que é descrita. Quando usado em referência a uma proteína produzida por uma célula fúngica filamentosa, o termo implica que a proteína não é produzida nativamente pela célula fúngica filamentosa.
[037]O termo “célula hospedeira”, tal como usado neste documento, refere-se a uma célula na qual um ácido nucleico recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos se destinam a referir-se não apenas à célula em questão em particular, mas à progênie de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo “célula hospedeira”, conforme usado neste documento.
[038]O termo “idêntico”, conforme usado neste documento, no contexto de sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas, refere-se aos resíduos dentro de uma janela de referência em duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima. Existem vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a sequência de nucleotídeos ou identidade de sequência de proteína. Por exemplo, as sequências podem ser comparadas usando FASTA (por exemplo, conforme fornecido no Wisconsin Genetics Software Package Versão 10.0, Genetics Computer Group, Madison, WI), GAP (por exemplo, conforme fornecido no Wisconsin Genetics Software Package Versão 10.0, Genetics Computer Group, Madison, WI), BESTFIT (por exemplo, conforme fornecido no Wisconsin Genetics Software Package Versão 10.0, Genetics Computer Group, Madison, WI), ClustalW (por exemplo, usando parâmetros padrão da versão 1.83), ou BLAST (por exemplo, usando BLAST recíproco, PSI-BLAST, BLASTP, BLASTN; por exemplo, como fornecido através do National Center for Biotechnology Information) (ver, por exemplo, Pearson. 1990. Methods Enzymol. 183: 63; Altschul et al. 1990. J. Mol. Biol.
215: 403). Para o alinhamento por esses métodos, os parâmetros padrão podem ser usados (por exemplo, para BLASTN, os parâmetros padrão são Penalidade de abertura de intervalo = 5 e penalidade de extensão de intervalo = 2, e para BLASTP, os parâmetros padrão são penalidade de abertura de intervalo = 11 e penalidade de extensão de intervalo = 1). A janela de referência pode variar de todos os comprimentos das 2 sequências a apenas uma região de cada uma das 2 sequências
(por exemplo, uma região que tem pelo menos 50 nucleotídeos ou pelo menos 10 aminoácidos de comprimento).
[039]Os termos “incluindo”, “inclui”, “tendo”, “tem”, “com” ou variantes dos mesmos, conforme usados neste documento, pretendem ser inclusivos de uma maneira semelhante ao termo “compreendendo”.
[040]O termo “micróbio”, conforme usado neste documento, é uma abreviatura de microrganismo e refere-se a um organismo unicelular. Tal como aqui usado, o termo inclui todas as bactérias, arqueas, protistas unicelulares, animais unicelulares, plantas unicelulares, fungos unicelulares, algas unicelulares, protozoários e cromistas.
[041]O termo “modulado”, conforme usado neste documento em conexão com uma atividade de esterase, refere-se a qualquer alteração de uma atividade de uma esterase (por exemplo, atividade de qualquer esterase divulgada neste documento ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas neste documento), incluindo um aumento ou diminuição de uma atividade de uma esterase. Tal atividade de esterase modulada é normalmente devida a um aumento ou diminuição de uma concentração de uma esterase ou a um aumento ou diminuição de uma atividade enzimática de uma esterase.
[042]O termo “nativo”, conforme usado neste documento, refere-se ao que é encontrado na natureza.
[043]Os termos “opcional” ou “opcionalmente”, conforme usados neste documento, referem-se a um recurso ou estrutura presente ou não, ou a um evento ou circunstância ocorrendo ou não. A descrição inclui casos em que um determinado recurso ou estrutura está presente e casos em que o recurso ou estrutura está ausente, ou casos em que o evento ou circunstância ocorre e casos em que o evento ou circunstância não ocorre.
[044]O termo “polinucleotídeo”, conforme divulgado neste documento, refere- se a filamentos sentido e antissentido de RNA, cDNA, DNA genômico e formas sintéticas e polímeros mistos dos anteriores. Um polinucleotídeo pode ser modificado química ou bioquimicamente ou pode conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivatizadas. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações internucleotídicas, tais como ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos), ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos), porções pendentes (por exemplo, polipeptídeos), intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno), quelantes, alquiladores e ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos).
Exemplos de nucleotídeos modificados são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Malyshev et al. 2014. Nature 509: 385; Li et al. 2014. J. Am. Chem. Soc. 136: 826).
Também estão incluídas moléculas sintéticas que imitam polinucleotídeos em sua capacidade de se ligarem a uma sequência designada por meio de ligações de hidrogênio e outras interações químicas. Tais moléculas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, moléculas nas quais as ligações peptídicas substituem as ligações fosfato na estrutura da molécula. Outras modificações podem incluir, por exemplo, análogos em que o anel de ribose contém uma fração de ponte ou outra estrutura, como as modificações encontradas em polinucleotídeos “bloqueados”.
[045]O termo “preparação”, tal como usado neste documento, refere-se a uma preparação obtida após a separação de um componente recombinante de um ou mais outros componentes de um caldo de fermentação.
[046]O termo “proteína”, tal como usado neste documento, refere-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos que ocorrem na natureza e aqueles que não ocorrem na natureza, quimicamente ou aminoácidos bioquimicamente modificados ou derivatizados e polipeptídeos possuindo estruturas peptídicas modificadas.
[047]O termo “purificação”, tal como usado neste documento, refere-se a uma proteína recombinante sendo substancialmente separada dos componentes celulares (por exemplo, lipídeos de membrana, cromossomos, proteínas) da célula hospedeira microbiana recombinante. O termo não requer (embora permita) que a proteína recombinante seja separada de todos os outros produtos químicos.
[048]O termo “célula hospedeira microbiana recombinante”, tal como aqui usado, refere-se a uma célula microbiana que compreende um polinucleotídeo recombinante. Deve ser entendido que tal termo se destina a referir-se não apenas à célula em questão em particular, mas também à progênie de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutação ou influências ambientais, tal progênie pode não ser idêntica à célula-mãe, mas ainda está incluída no escopo do termo “célula hospedeira microbiana recombinante”, conforme usado neste documento.
[049]O termo “polinucleotídeo recombinante”, tal como usado neste documento, refere-se a um polinucleotídeo que foi removido de seu ambiente de ocorrência natural, um polinucleotídeo que não está associado com a totalidade ou uma porção de um polinucleotídeo adjacente ou próximo ao polinucleotídeo quando é encontrado na natureza, um polinucleotídeo que está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza, ou um polinucleotídeo que não ocorre na natureza. O termo pode ser usado, por exemplo, para descrever isolados de DNA clonado, ou um polinucleotídeo compreendendo um análogo de nucleotídeo sintetizado quimicamente. Um polinucleotídeo também é considerado “recombinante” se contiver qualquer modificação genética que não ocorre naturalmente. Por exemplo, um polinucleotídeo endógeno é considerado um “polinucleotídeo recombinante” se contiver uma inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos que são introduzidos artificialmente, por exemplo, por intervenção humana. Tal modificação pode introduzir no polinucleotídeo uma mutação pontual, mutação de substituição,
mutação de deleção, mutação de inserção, mutação missense, mutação de frameshift, mutação de duplicação, mutação de amplificação, mutação de translocação ou mutação de inversão. O termo inclui um polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira, bem como um polinucleotídeo que não está no cromossomo de uma célula hospedeira (por exemplo, um polinucleotídeo que está compreendido em um epissoma).
[050]O termo “proteína recombinante”, tal como usado neste documento, refere-se a uma proteína que é produzida em uma célula de uma espécie ou tipo diferente em comparação com a espécie ou tipo de célula que produz a proteína na natureza, ou que é produzida em um célula em um nível em que não é produzida na natureza.
[051]O termo “vetor”, tal como usado neste documento, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que geralmente se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados, mas também inclui moléculas de fita dupla lineares, como aquelas resultantes da amplificação pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ou do tratamento de um plasmídeo circular com uma enzima de restrição. Outros vetores incluem cosmídeos, cromossomos artificiais bacterianos (BAC) e cromossomos artificiais de levedura (YAC). Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral (discutido em mais detalhes abaixo). Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores tendo uma origem de replicação que funciona na célula hospedeira). Outros vetores podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, portanto, são replicados junto com o genoma hospedeiro.
[052]O termo “levedura”, tal usado neste documento, refere-se a organismos da ordem Saccharomycetales, como Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. O crescimento vegetativo da levedura ocorre por brotamento/bolha de um talo unicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo. Método para Produzir Produto Alimentar Compreendendo Componente Recombinante
[053]Em um aspecto, é fornecido neste documento um método para produzir um produto alimentar que compreende um componente recombinante (por exemplo, qualquer um dos componentes recombinantes divulgados aqui) produzido por uma célula hospedeira microbiana recombinante capaz de produzir o componente recombinante (por exemplo, qualquer uma das células hospedeiras microbianas recombinantes fornecidas aqui), em que o método compreende pelo menos uma etapa em que uma atividade de uma esterase (isto é, atividade de esterase; por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) é essencialmente eliminada ou modulada.
[054]Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um ou mais métodos para produzir um produto alimentar que compreende um componente recombinante (por exemplo, qualquer um dos componentes recombinantes divulgados aqui) com base na descoberta que uma célula hospedeira microbiana recombinante que produz um componente recombinante também normalmente produz uma atividade de esterase. Tal atividade de esterase pode co-purificar com o componente recombinante. Quando o componente recombinante é então usado para produzir um produto alimentar, a atividade de esterase pode hidrolizar ligações de éster em diglicerídeos, triglicerídeos, fosfolipídeos, e/ou lipoproteínas contidas no produto alimentar e, assim, catalisar a produção de ácidos graxos livres no produto alimentar.
[055]Como observado acima, a produção de ácidos graxos livres em um produto alimentar pode ter efeitos prejudiciais, por exemplo, pela produção de aroma e/ou sabor rançosos, interferindo na formação de emulsões, tendo efeitos indesejáveis na textura, interagindo com nutrientes essenciais (por exemplo, vitaminas) e, portanto, diminuindo o teor nutricional e reduzindo o prazo de validade. A produção de ácidos graxos livres em um produto alimentar também pode ter efeitos benéficos, por exemplo, produzindo perfis de sabor desejados (por exemplo, perfis de sabor de queijo envelhecido) ou fazendo queijo modificado por enzima para uso em queijo processado.
[056]Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um ou mais métodos para produzir um produto alimentar que compreende um componente recombinante (por exemplo, qualquer um dos componentes recombinantes divulgados aqui) com base na descoberta que a atividade de esterase produzida por uma célula hospedeira recombinante difere da atividade de esterase contida em leite produzido por mamífero.
[057]Várias modalidades da presente invenção, portanto, incluem métodos específicos para essencialmente eliminar ou modular a atividade de esterase produzida por uma célula hospedeira microbiana recombinante. Ao essencialmente eliminar ou modular uma atividade de esterase em um produto alimentar compreendendo um componente recombinante produzido em uma célula hospedeira microbiana recombinante, a presente invenção fornece um método para prevenir ou atrasar a produção de aroma e sabor rançosos, formando emulsões, aumentando teor nutricional, modulando a textura, estendendo a vida útil e/ou produzindo mais rapidamente um perfil de sabor desejado em um produto alimentar.
[058]Em algumas modalidades, o método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase é essencialmente eliminada.
[059]Em algumas modalidades, o método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase é diminuída. Em algumas de tais modalidades, a atividade de esterase é diminuída por pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %.
[060]Em algumas modalidades, o método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase é aumentada. Em algumas de tais modalidades, a atividade de esterase é aumentada por pelo menos 25 %, pelo menos 50 %, pelo menos 75 %, pelo menos 100 %, pelo menos 150 %, pelo menos 200 %, pelo menos 300 %, pelo menos 400 %, pelo menos 500 %, pelo menos 600 %, pelo menos 700 %, pelo menos 800 %, pelo menos 900 % ou pelo menos 1,000 %.
[061]Em algumas modalidades, o método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende pelo menos uma etapa em que uma primeira atividade de esterase é essencialmente eliminada e uma segunda atividade de esterase é diminuída. Em algumas modalidades, o método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende pelo menos uma etapa em que uma primeira atividade de esterase é essencialmente eliminada e uma segunda atividade de esterase é aumentada. Em algumas modalidades, o método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende pelo menos uma etapa em que uma primeira atividade de esterase é aumentada e uma segunda atividade de esterase é diminuída.
[062]Em algumas modalidades, o método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende uma etapa em que uma atividade de uma esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) é essencialmente eliminada ou modulada.
[063]Em algumas modalidades, o método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende duas ou mais etapas (por exemplo, 2 etapas, 3 etapas, 4 etapas, 5 etapas) em que uma atividade de uma esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) é essencialmente eliminada ou modulada (por exemplo, duas ou mais etapas selecionadas a partir das etapas divulgadas aqui que fornecem uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase, por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui). Essencialmente Eliminar ou modular a Atividade de Esterase
[064]A pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) é essencialmente eliminada ou modulada no método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar pode compreender qualquer etapa que fornece uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase.
[065]Em algumas modalidades, a pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) é essencialmente eliminada ou modulada no método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende a etapa de culturar uma célula hospedeira microbiana recombinante capaz de produzir um componente recombinante sob condições adequadas para essencialmente eliminar ou modular a atividade de esterase.
[066]Consequentemente, em algumas de tais modalidades, o método fornecido neste documento compreende as etapas de: a) obter uma célula hospedeira microbiana recombinante que é capaz de produzir um componente recombinante (por exemplo, qualquer um dos componentes recombinantes divulgados aqui); b) culturar a célula hospedeira microbiana recombinante em um meio de cultura sob condições adequadas para essencialmente eliminar ou modular uma atividade de esterase e para produção e/ou secreção do componente recombinante para obter um caldo de fermentação compreendendo o componente recombinante e uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase; c) opcionalmente purificar o componente recombinante a partir do caldo de fermentação para obter uma preparação compreendendo o componente recombinante e uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase; e d) preparar um produto alimentar a partir do caldo de fermentação ou preparação compreendendo o componente recombinante e a atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase.
[067]As condições adequadas para culturar uma célula hospedeira microbiana recombinante em um meio de cultura sob condições adequadas para essencialmente eliminar ou modular uma atividade de esterase são, por exemplo, aquelas sob as quais a célula hospedeira microbiana recombinante essencialmente elimina ou modula sua produção da atividade de esterase. Exemplos não limitativos de tais condições incluem um pH adequado, uma temperatura adequada, uma razão de alimentação adequada, uma pressão adequada, um teor de nutriente adequado (por exemplo, um teor de carbono adequado, um teor de nitrogênio adequado, um teor de fósforo adequado), um teor de suplemento adequado, um teor de metal residual adequado,
e/ou um nível adequado de oxigenação. Em algumas modalidades, um pH adequado no qual uma célula hospedeira microbiana recombinante essencialmente elimina ou modula sua produção de uma atividade de esterase é um pH entre 2 e 7,5, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, ou 2,5; entre 2,5 e 7,5, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, ou 3; entre 3 e 7,5, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, ou 3,5; entre 3,5 e 7,5, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4; entre 4 e 7,5, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5; entre 4,5 e 7,5, 6,5, 6, 5,5, 5; entre 5 e 7,5, 6,5, 6, 5,5; entre 5,5 e 7,5, 6,5, 6; entre 6 e 7,5, 6,5; entre 6,5 e 7,5, ou 7; ou entre 7 e 7,5. Em algumas modalidades, um teor de suplemento adequado em um meio de cultura em que uma célula hospedeira microbiana recombinante essencialmente elimina ou modula sua produção de uma atividade de esterase é um agente anti-espuma. Exemplos não limitativos de agentes anti-espuma adequados incluem Struktol J 673 A (Schill & Seilacher GmbH, Hamburgo, Alemanha), Industrol DF204 (BASF Canadá, Inc., Mississauga, Canadá), Poliglicol P-2000 (Dow, Midland, MI), Hodag K-60K (Hodag Chemical Corp., Chicago, IL) e Erol DF6000K (PMC Ouvrie, Carvin, França), ACP 1500 (Dow Chemical Company, Midland, MI), Antifoam 204 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO ), SAG 471 (Momentive Performance Materials Inc., Waterford, NY), SAG 5693 (Momentive Performance Materials Inc., Waterford, NY), SAG 710 (Momentive Performance Materials Inc., Waterford, NY), SAG 730 (Momentive Performance Materials Inc., Waterford, NY), antiespumantes de silicone, Struktol J647 (Schill & Seilacher, Hamburgo, Alemanha) e óleo de girassol.
[068]Em algumas modalidades, a pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) é essencialmente eliminada ou modulada no método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende a etapa de essencialmente eliminar ou modular uma atividade de esterase em um caldo de fermentação ou preparação obtido de uma cultura de uma célula hospedeira microbiana recombinante capaz de produzir o componente recombinante.
[069]Consequentemente, em algumas de tais modalidades, o método fornecido neste documento compreende as etapas de: a) obter uma célula hospedeira microbiana recombinante que é capaz de produzir um componente recombinante (por exemplo, qualquer um dos componentes recombinantes divulgados aqui); b) culturar a célula hospedeira microbiana recombinante em um meio de cultura sob condições adequadas para produção e/ou secreção do componente recombinante para obter um caldo de fermentação compreendendo o componente recombinante; c) opcionalmente purificar o componente recombinante a partir do caldo de fermentação para obter uma preparação compreendendo o componente recombinante; d) essencialmente eliminar ou modular uma atividade de esterase em the caldo de fermentação ou a preparação para obter um caldo de fermentação ou preparação compreendendo o componente recombinante e uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase; e) preparar um produto alimentar a partir do caldo de fermentação ou preparação compreendendo o componente recombinante e a atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase.
[070]Uma atividade de esterase em um caldo de fermentação ou preparação pode ser essencialmente eliminada ou modulada, por exemplo, adicionando ao caldo de fermentação ou preparação um inibidor de esterase. Exemplos não limitativos de inibidores de esterase adequados incluem inibidores sintéticos (por exemplo, fosfonatos, ácido borônico, análogos de lipídeos) e inibidores naturais (por exemplo, β-lactonas (como valilactona, ebelactona A & B e vibralactona), manno- oligossacarídeos, inibidores de acetilcolina esterase, inibidores de colinesterase, polifenóis, saponinas, panclicinas, hesperidina, caulerpenino, proantocianidina, Orlistat (Xenical), ácido carnósico, escina, crocina, crocetina, ácido clorogênico, ácido neoclorogênico, ácido feruloquínico, e-polilisina, quitosana, quitina), isolado, por exemplo, de fontes como Juniperus communis, Illicium religiosum, Panax rizomas japonicus, Panax ginseng, Panax quinquefolius, Acanthopanax senticosus, Camellia sinensis var. sinensis, Camellia sinensis var. assamica, Kochia scoparia, Platycodi radix, Salacia reticulate, Nelumbo nucifera, Salix matsudana, Eriochloa villosa, Salacia reticulate, Scabiosa tschiliensis Grun e Acanthopanax sessili florous. Em algumas de tais modalidades, o inibidor de esterase requer a adição de um agente de ajuste de pH e/ou força iônica para atividade.
[071]Uma atividade de esterase em um caldo de fermentação ou preparação também pode ser essencialmente eliminada ou modulada, por exemplo, removendo do e/ou adicionando ao caldo de fermentação ou preparação um cofator necessário para atividade de uma esterase e/ou um cofator necessário para atividade de um inibidor de esterase. Exemplos não limitativos de tais cofatores incluem metais (por exemplo, cátions divalentes, tais como cálcio). Em algumas modalidades, um cátion divalente (por exemplo, cálcio) é removido ligando o cátion divalente a um agente quelante. Um não limitante exemplo de agentes quelantes adequados é ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
[072]Uma atividade de esterase em um caldo de fermentação ou preparação também pode ser essencialmente eliminada ou modulada, por exemplo, por processamento térmico ou não térmico. Exemplos não limitativos de processamento térmico incluem pasteurização e esterilização. Exemplos não limitativos de processamento não térmico incluem pasteurização de alta pressão (isto é, processamento de alta pressão, HPP), ultrassom, processamento de campo elétrico de pulso e irradiação. Em algumas modalidades, uma atividade esterase em um caldo de fermentação ou preparação é essencialmente eliminada ou reduzida incubando o caldo de fermentação ou preparação em alta temperatura por um período de tempo relativamente curto (por exemplo, a uma temperatura entre 85 °C e 90 °C por entre 5 e 10 min).
[073]Em algumas modalidades, a pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) é essencialmente eliminada ou modulada no método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende a etapa de obter uma célula hospedeira microbiana recombinante capaz de produzir um componente recombinante, em que a célula hospedeira microbiana recombinante compreende uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase.
[074]Consequentemente, em algumas de tais modalidades, o método fornecido neste documento compreende as etapas de: a) obter uma célula hospedeira microbiana recombinante capaz de produzir um componente recombinante (por exemplo, qualquer um dos componentes recombinantes divulgados aqui), em que a célula hospedeira microbiana recombinante compreende uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase em comparação com a atividade de esterase compreendida em uma célula hospedeira microbiana recombinante correspondente; b) culturar a célula hospedeira microbiana recombinante em um meio de cultura sob condições adequadas para produção e/ou secreção do componente recombinante para obter um caldo de fermentação compreendendo o componente recombinante e a atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase; c) opcionalmente purificar o componente recombinante a partir do caldo de fermentação para obter uma preparação compreendendo o componente recombinante; e d) preparar um produto alimentar a partir do caldo de fermentação ou preparação compreendendo o componente recombinante e a atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase.
[075]Uma atividade de esterase pode ser essencialmente eliminada ou modulada em uma célula hospedeira microbiana recombinante por essencialmente eliminar ou modular a expressão (isto é, produção de uma proteína alvo) de uma esterase (por exemplo, qualquer uma esterase divulgada aqui ou qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui), ou por essencialmente eliminar ou modular a atividade de uma esterase. Essencialmente eliminar ou modular a expressão de uma esterase em uma célula hospedeira microbiana recombinante pode ser realizada, por exemplo, modificando geneticamente na célula hospedeira microbiana recombinante uma sequência de controle (por exemplo, uma sequência promotora, uma sequência potenciadora, um peptídeo sinal, um terminador de transcrição ou qualquer outra sequência que controle a expressão (isto é, transcrição e/ou tradução de um gene), ou uma parte funcional deste (isto é, uma parte que é suficiente para a função da sequência de controle), que conduz a expressão de uma esterase de modo que a expressão da esterase seja essencialmente eliminada ou modulada.
[076]Essencialmente eliminar ou modular a expressão de uma esterase em uma célula hospedeira microbiana recombinante também pode ser realizada, por exemplo, modificando geneticamente na célula hospedeira microbiana recombinante uma sequência de controle, ou parte funcional da mesma, que conduz a expressão de uma proteína necessária para expressão de uma esterase (por exemplo, um fator de transcrição (por exemplo, uma proteína que compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 % idêntica (por exemplo, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % ou mais) a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RX49, G0RHG1, A0A2T4B416, A0A2T4BJU6, A2R2J1, A2R903, G2Q2Z5 e G2Q8I6), uma enzima de modificação pós-tradução necessária para produção de uma forma ativa de uma esterase), ou modificando geneticamente uma sequência de codificação que codifica uma proteína necessária para expressão de uma esterase, ou uma parte funcional da mesma (por exemplo, um domínio de ligação ao DNA de um fator de transcrição, um domínio catalítico de uma enzima de modificação pós-
tradução), de modo que a expressão da esterase seja essencialmente eliminada ou modulada.
[077]Essencialmente eliminar ou modular a expressão de uma esterase em uma célula hospedeira microbiana recombinante também pode ser realizada, por exemplo, introduzindo na célula hospedeira microbiana recombinante um polinucleotídeo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de codificação que codifica uma esterase, ou que codifica uma construção de RNAi que é específica para uma esterase.
[078]Essencialmente eliminar ou modular a expressão ou atividade de uma esterase em uma célula hospedeira microbiana recombinante também pode ser realizada, por exemplo, modificando geneticamente na célula hospedeira microbiana recombinante uma sequência de codificação que codifica uma esterase ou uma parte funcional da mesma (por exemplo, um domínio catalítico).
[079]Essencialmente eliminar ou modular a atividade de uma esterase em uma célula hospedeira microbiana recombinante também pode ser realizada, por exemplo, modificando geneticamente na célula hospedeira microbiana recombinante uma sequência de controle que conduz a expressão de um inibidor endógeno de uma esterase e/ou modificando geneticamente uma sequência de codificação que codifica um inibidor endógeno de uma esterase de modo que a expressão e/ou atividade do inibidor endógeno seja essencialmente eliminada ou modulada na célula hospedeira microbiana recombinante, ou introduzindo na célula hospedeira microbiana recombinante um polinucleotídeo recombinante que codifica um inibidor heterólogo de uma esterase.
[080]A modificação genética pode ocorrer, por exemplo, introduzindo, substituindo ou removendo um ou mais nucleotídeos em uma sequência de nucleotídeos. Por exemplo, um ou mais nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos para introduzir um códon de parada; remover um códon de início; inserir uma mudança de quadro do quadro de leitura aberto; ou criar uma mutação pontual, mutação missense, mutação de substituição, mutação de deleção, mutação de frameshift, mutação de inserção, mutação de duplicação, mutação de amplificação, mutação de translocação ou mutação de inversão.
[081]Os métodos para modificar geneticamente uma célula hospedeira microbiana são bem conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, mutagênese aleatória e triagem, mutagênese dirigida ao local, mutagênese por PCR, mutagênese por inserção, mutagênese química (usando, por exemplo, hidroxilamina, N-metil-N’- nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), N-metil-N’-nitrosogaunidina (NTG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico, nucleotídeo análogos), irradiação (por exemplo, irradiação ultravioleta (UV)), deleção de sequências de nucleotídeos codificantes ou não, recombinação homóloga, recombinação FLP/FRT, interrupção do gene, edição do gene CRISPR e conversão do gene.
[082]Em algumas modalidades, a pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) é essencialmente eliminada ou modulada no método fornecido neste documento para produzir um produto alimentar compreende a etapa de purificar um componente recombinante de uma atividade de esterase produzida por uma célula hospedeira microbiana recombinante.
[083]Consequentemente, em algumas de tais modalidades, o método fornecido neste documento compreende as etapas de: a) obter uma célula hospedeira microbiana recombinante capaz de produzir um componente recombinante (por exemplo, qualquer um dos componentes recombinantes divulgados aqui); b) culturar a célula hospedeira microbiana recombinante em um meio de cultura sob condições adequadas para produção e/ou secreção do componente recombinante para obter um caldo de fermentação compreendendo o componente recombinante; c) purificar o componente recombinante a partir do caldo de fermentação para obter uma preparação compreendendo o componente recombinante tal que a preparação compreende uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase; e d) preparar um produto alimentar a partir da preparação compreendendo o componente recombinante e a atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase.
[084]A purificação de um componente recombinante de um caldo de fermentação pode ser realizada com base em qualquer propriedade ou combinação de propriedades que diferencia o componente recombinante de uma esterase ou que é compartilhado entre o componente recombinante e uma esterase. Exemplos não limitativos de tais propriedades incluem tamanho, peso molecular, degradação por uma protease específica ou combinação de proteases, ponto isoelétrico (pI), carga, termolabilidade/termoestabilidade, afinidade por uma molécula específica, solubilidade, estabilidade de pH, hidrofobicidade e hidrofilicidade.
[085]Em algumas modalidades, o componente recombinante é purificado com base na termolabilidade/termoestabilidade. Em algumas dessas modalidades, um caldo de fermentação (por exemplo, um caldo de fermentação clarificado (isto é, um caldo de fermentação do qual as células e os resíduos celulares foram removidos)) ou preparação compreendendo o componente recombinante é aquecido a uma temperatura na qual uma esterase é desnaturada e precipita fora da solução, mas no qual o componente recombinante permanece estruturalmente intacto e solúvel. A esterase precipitada pode ser subsequentemente separada do componente recombinante solúvel por qualquer método adequado, incluindo sedimentação de 1 g, sedimentação acelerada por centrifugação e/ou uma variedade de técnicas de filtração, incluindo, mas não se limitando a, filtração profunda ou filtração de fluxo tangencial, usando almofadas de filtro, folhas ou membranas.
[086]Em algumas modalidades, o componente recombinante é purificado com base na hidrofobicidade. Em algumas de tais modalidades, um suporte cromatográfico adequado é adicionado a um caldo de fermentação (por exemplo, um caldo de fermentação clarificado) ou preparação compreendendo o componente recombinante, e o pH e/ou força iônica do caldo de fermentação ou preparação é ajustado de modo que a esterase ou o componente recombinante (mas não ambos) se liga ao suporte cromatográfico (por exemplo, com base na interação hidrofóbica), deixando para trás o componente recombinante solúvel ou esterase em uma porção não ligada, respectivamente. Exemplos não limitativos de suportes cromatográficos adequados incluem fenil sefarose, butil sefarose e octil sefarose. O suporte cromatográfico com esterase ligada ou componente recombinante pode ser subsequentemente separado do componente recombinante solúvel ou esterase, respectivamente, por qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a 1 g de sedimentação, centrifugação ou filtração. Alternativamente, o suporte cromatográfico pode ser um suporte estacionário (por exemplo, adsorvente em uma coluna) através do qual o caldo de fermentação ou preparação compreendendo o componente recombinante é feito para viajar, e o componente recombinante é obtido na porção não ligada enquanto a esterase se liga ao suporte cromatográfico, ou o componente recombinante é ligado ao suporte cromatográfico, enquanto a esterase permanece na porção não ligada, e o componente recombinante ligado é subsequentemente liberado do suporte cromatográfico, por exemplo, ajustando o pH e/ou força iônica.
[087]Em algumas modalidades, o componente recombinante é purificado com base na carga. Em algumas de tais modalidades, um contra-íon ou resina de troca iônica ou sal de ácido de sódio é adicionado a um caldo de fermentação (por exemplo, um caldo de fermentação clarificado) ou preparação compreendendo o componente recombinante e o pH e/ou força iônica do caldo de fermentação ou a preparação é ajustada de modo que o contra-íon ou resina de troca iônica ou sal de ácido de sódio forme um complexo com o componente recombinante ou a esterase, deixando para trás uma esterase solúvel ou componente recombinante, respectivamente. O complexo pode ser subsequentemente isolado por qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo sedimentação de 1 g, sedimentação acelerada por centrifugação e/ou uma variedade de técnicas de filtração, incluindo, mas não se limitando a, filtração de profundidade ou filtração de fluxo tangencial, usando filtro almofadas, folhas ou membranas. Em modalidades em que o componente recombinante é complexado ao contra-íon ou resina de troca iônica ou sal de ácido de sódio, o componente recombinante pode ser extraído do complexo ajustando o pH e/ou força iônica de modo que o componente recombinante e o contra-íon ou resina de troca iônica ou sal de ácido de sódio se repelem.
[088]Em algumas modalidades, o componente recombinante é purificado com base na estabilidade do pH. Em algumas dessas modalidades, o pH de um caldo de fermentação (por exemplo, um caldo de fermentação clarificado) ou preparação compreendendo o componente recombinante é ajustado de modo que uma esterase seja desnaturada e precipite da solução, deixando para trás o componente recombinante solúvel. A esterase precipitada pode ser subsequentemente separada do componente recombinante solúvel por qualquer método adequado, incluindo, mas não se limitando a sedimentação de 1 g, sedimentação acelerada por centrifugação e/ou uma variedade de técnicas de filtração, incluindo, mas não se limitando a, filtração em profundidade ou tangencial filtração de fluxo, usando almofadas de filtro, folhas ou membranas.
[089]Em algumas modalidades, o componente recombinante é purificado com base em duas ou mais de cargas, termolabilidade/termoestabilidade, hidrofobicidade, tamanho, peso molecular, estabilidade de pH, ponto isoelétrico (pI), afinidade para uma molécula específica e solubilidade, em que as várias estratégias de separação são realizadas em sucessão (por exemplo, separação com base na carga seguida de separação com base na hidrofobicidade, separação com base na hidrofobicidade seguida pela separação com base na estabilidade do pH) ou em paralelo (por exemplo, separação com base na estabilidade do pH e termolabilidade/termoestabilidade, separação baseada na estabilidade do pH e afinidade a uma molécula específica, separação baseada na solubilidade e estabilidade do pH e/ou termolabilidade/termoestabilidade e/ou pI)). Atividade de Esterase
[090]Uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase como fornecida aqui (por exemplo, uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase compreendida em um caldo de fermentação ou preparação compreendendo um componente recombinante, ou compreendida em uma célula hospedeira microbiana recombinante fornecida aqui capaz de produzir um componente recombinante) pode ser uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de qualquer uma esterase ou de qualquer combinação de pelo menos duas esterases (por exemplo, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou mais).
[091]Exemplos não limitativos de tais esterases incluem hidrolases de éster carboxílico (EC número 3.1.1), diéster fosfórico hidrolases (EC número 3.1.4), exoribonucleases (EC número 3.1.13), carboxilesterases (EC número 3.1.1.1), arilesterases (EC número 3.1.1.2), lipases de triacilglicerol (EC número 3.1.1.3), fosfolipases A2 (EC número 3.1.1.4), lisofosfolipases (EC número 3.1.1.5), acetilesterases (EC número 3.1.1.6), acetilcolinesterases (EC número 3.1.1.7), fosfolipases C (EC número 3.1.4.3), fosfolipases D (EC número 3.1.4.4), fosfoinositídeo fosfolipases C (3.1.4.11), pectinesterases (EC número 3.1.1.11), gluconolactonases (EC número 3.1.1.17), acilglicerol lipases (EC número 3.1.1.23), 3- oxoadipato enol-lactonases (EC número 3.1.1.24), 1,4-lactonases (EC número
3.1.1.25), galactolipases (EC número 3.1.1.26), fosfolipases A1 (EC número 3.1.1.32), lipoproteína lipases (EC número 3.1.1.34), cefalosporina-C deacetilases (EC número
3.1.1.41), carboximetilenobutenolidases (EC número 3.1.1.45), 2-pirona-4,6- dicarboxilato lactonases (EC número 3.1.1.57), feruloil esterases (EC número
3.1.1.73), cutinases (EC número 3.1.1.74), e lipase sensíveis ao hormônio (EC número 3.1.1.79).
[092]Exemplos não limitativos de éster carboxílico hidrolase adequado incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codifica um éster carboxílico hidrolase listado na Tabela 1. Tabela 1 - Esterases Exemplificativas (IDs de sequência UniProt) G0RX49 G0RWS1 G0RKL4 A2QLA0 G0RBZ6 G0RIU1 G0RHG1 A2QT90 G0RJ76 A2QZX4 G0RJC6 A2R6L8 A2R2J1 A2QF42 A2QFE9 A2R2I5 G0RQN5 G0RX90 A2R903 A2R350 A2QZN6 A2QI32 G0RGQ7 G0RLB7 A0A2T4B416 A2QKQ5 A2QG33 A2QIR3 A2QEJ2 G0RLB0 G2Q2Z5 A2R7J0 A5ABE5 A2QH76 A2QRK1 A2QNF0 G2Q8I6 E2PT14 A2Q8F7 A2R5R5 G0REM9 G0RBM4 A0A2T4BJU6 A2QCM0 A2QF54 E2PT22 G0RAQ0 A0A2T4AZ21 G0RWC3 A2QII0 A2QBG8 A2R502 G0RTR6 A0A2T4BBP9 G0RMN0 A2QUA5 A2R2M3 A2R496 G0RLF5 G2Q379 G0R9X3 A2R088 A2QZ72 A5ABH9 G0RDK5 G0RMI7 G0RVK4 G0RRK3 A2RAP4 A2R1N7 G0RBJ0 A2R689 G0RCG3 G0RGR3 A2QS46 A2QS22 G0RMI3 A2QMI7 G0RVN2 A2QT70 A2QCT1 A2QUC1 G0R707 A2QT47
G0R6X2 A2QPJ6 A2R032 A2R273 G0RBB4 A2QS21 G0R8N5 A2QSJ9 A2R9C0 A2QBH3 G0RJY0 A2QZE3 A2QW83 A2QST4 A5ABC3 A2QH22 G0RT28 A2R8R3 A2Q9L0 A2R6I6 A2R8Z3 A5ABE8 A2QE05 A2R1R5 A2QRP8 A2QSX2 A2QE77 A2QHE2 A2QPY4 A2QUQ1 A2R0H9 A2QS66 A5ABK1 A2QK90 A2R8R4 A2QVF5 A2R7H4 A2QZY6 A2QX56 A2QMK5 A2R234 A2R4Z2 A2QUD7 A2R5V7 A2QYS7 A2QZ17 A0A2T4BJD9 A2QNW9 A2R780 A2QF64 A2R835 A2Q8R7 A0A2T4BFY3 A2R1P3 E2PSR0 A2QM14 A2QT75 A2QZW3 G2QL32 A2QYC0 A5ABE6 A2QGD9 A2QBH5 A2QAH7 A0A2T4BNI9 A2QYK5 A2R2W3 A2QN29 A2QS33 A2QIA0 A2QPC2 A2QZB7 A2QBP1 A2QTI0 A2R274 A2QUE3 A0A2T4BCL7 A2QK82 G0RH85 A2R199 A2QEW9 A2QIE4 A2QY19 A2QHB7 G2QH51 A2QTZ0 A5ABC0 A2QN56 A2QAD7 A2QZR0 A0A2T4BJB5 A2R775 A2QW25 A2Q818 A2QVJ4 A2QC75 A2QSY5 A2QHE9 A2QS56 A2QV39 A2R256 G2Q0K1 A2R0Z6 A2R1X8 A2QRK3 A2QV40 A2R5R4 A0A2T4B235 A2QYU7 A2R709 A2QG70 A2R6H5 A2RBF9 G0RHJ4 A2QZI3 A2QTI9 A2QZK9 A2QBC9 A2QXD2 A2QEH4 A2QT66 A2QL90 A2QV44 A2QV27 A2R098 A2R845 A2QYF0 A5ABZ1 A2QZB2 A2QT57 A2QL89 A2QAC4 A2QX92 A2QKZ8 A2QBK3 A2QBH8 A2R8M8 A2R6I8 A2QK84 A2R8C2 A2R0P4 A2Q8U6 A2QZX0
[093] Em algumas modalidades, o éster carboxílico hidrolase compreende uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de aminoácido de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95
%, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RIU1, A2R1N7, G0RBM4, A0A2T4BBP9, G2Q379, A0A2T4AZ21, A2R8Z3, G0R9X3, A2QPC2, G0RCG3, A0A2T4BCL7, A0A2T4B416 e A0A2T4BNI9.
[094]Exemplos não limitativos de diéster fosfórico hidrolase adequado incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam um diéster fosfórico hidrólase listado na Tabela 1.
[095]Exemplos não limitativos de exoribonucleases adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma exoribonuclease listada na Tabela 1.
[096]Exemplos não limitativos de carboxilesterases adequados incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100
% idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam um carboxilesterase listado na Tabela 1.
[097]Exemplos não limitativos de arilesterases adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma arilesterase listada na Tabela 1.
[098]Exemplos não limitativos de lipases de triacilglicerol adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma lipase de triacilglicerol listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, a lipase de triacilglicerol compreende uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de aminoácido de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt A2QM14 e A2R709.
[099]Exemplos não limitativos de fosfolipases A2 adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de aminoácido de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma fosfolipase A2 listado na Tabela 1.
[0100]Exemplos não limitativos de lisofosfolipases adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma lisofosfolipase listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, a lisofosfolipase compreende uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de aminoácido de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RX90, G2Q0K1, A0A2T4B235, A2QC75 e A2QF42.
[0101]Exemplos não limitativos de acetilesterases adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96
%, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma acetilesterase listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, a acetilesterase compreende uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de aminoácido de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RHJ4, A0A2T4BJD9 e G2QL32.
[0102]Exemplos não limitativos de acetilcolinesterases adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma acetilcolinesterase listada na Tabela 1.
[0103]Exemplos não limitativos de fosfolipases C adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma fosfolipase C listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, a fosfolipase C compreende uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de aminoácido de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0REM9, A0A2T4BFY3 e A2QAD7.
[0104]Exemplos não limitativos de fosfolipases D adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma fosfolipase D listada na Tabela 1.
[0105]Exemplos não limitativos de fosfoinositídeo fosfolipase C adequado incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam um fosfoinositídeo fosfolipase C listado na Tabela
1.
[0106]Exemplos não limitativos de pectinesterases adequados incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam um pectinesterase listado na Tabela 1.
[0107]Exemplos não limitativos de gluconolactonases adequados incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam um gluconolactonase listado na Tabela 1.
[0108]Exemplos não limitativos de acilglicerol lipase adequado incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam um acilglicerol lipase listado na Tabela 1.
[0109]Exemplos não limitativos de 3-oxoadipato enol-lactonase adequados incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam um 3-oxoadipato enol-lactonase listado na Tabela
1.
[0110]Exemplos não limitativos de 1,4-lactonases adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma 1,4-lactonase listada na Tabela 1.
[0111]Exemplos não limitativos de galactolipases adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma galactolipase listada na Tabela 1.
[0112]Exemplos não limitativos de fosfolipases A1 adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma fosfolipase A1 listada na Tabela 1.
[0113]Exemplos não limitativos de lipoproteína lipase adequada incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma lipoproteína lipase listada na Tabela 1.
[0114]Exemplos não limitativos de cefalosporina-C deacetilase adequada incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam um cefalosporina-C deacetilase listado na Tabela
1.
[0115]Exemplos não limitativos de carboximetilenobutenolidases adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma carboximetilenobutenolidase listada na Tabela 1.
[0116]Exemplos não limitativos de 2-pirona-4,6-dicarboxilato lactonase adequada incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma 2-pirona-4,6-dicarboxilato lactonase listada na Tabela 1.
[0117]Exemplos não limitativos de feruloil esterase adequado incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam um feruloil esterase listado na Tabela 1.
[0118]Exemplos não limitativos de cutinases adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma cutinase listada na Tabela 1. Em algumas modalidades, a cutinase compreende uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de aminoácido de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65
%, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RH85, A2QBP1, A0A2T4BJB5, A5ABE6, A2R2W3 e G2QH51.
[0119]Exemplos não limitativos de lipases sensíveis ao hormônio adequadas incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam uma lipase sensível ao hormônio listada na Tabela
1.
[0120]Exemplos não limitativos de esterases adequadas adicionais incluem esterases que compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % idêntica a uma sequência listada na Tabela 1, e esterases que compreendem uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de aminoácido de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % para qualquer um dos domínios InterPro listados na Tabela
2. Tabela 2: Números InterPro de Domínios Catalíticos de Esterase Exemplificativos IPR002168 IPR017915 IPR003187 IPR038885 IPR008265 IPR033140 IPR001087 IPR004961 IPR039097 IPR033112 IPR000675 IPR001531 IPR007000 IPR039180 IPR033113 IPR002641 IPR003633 IPR007942 IPR008947 IPR001423 IPR002642 IPR007751 IPR009613 IPR036541 IPR009535 IPR002921 IPR008475 IPR010711 IPR033560 IPR026605 IPR001711 IPR010468 IPR011402 IPR033562 IPR028382 IPR001736 IPR013818 IPR012354 IPR033902 IPR028407 IPR000909 IPR014815 IPR016272 IPR034315 IPR032075 IPR005592 IPR015359 IPR016338 IPR037737 IPR032588 IPR006693 IPR016090 IPR016445 IPR038875 IPR033556 IPR025202 IPR017913 IPR016674 IPR001211 IPR033903 IPR003140 IPR017914 IPR017186 IPR001981 IPR033906 IPR011150 IPR024632 IPR017766 IPR002330 IPR035547 IPR015679 IPR025920 IPR017767 IPR002331 IPR035669 IPR016555 IPR029002 IPR017769 IPR002333 IPR000734 IPR021771 IPR032093 IPR020009 IPR002334 IPR001028 IPR001192 IPR032341 IPR025483 IPR036444 IPR036691 IPR024884 IPR016035 IPR002918 IPR005152 IPR015141
[0121]As esterases aqui divulgadas incluem esterases que são variantes modificadas de forma conservadora das esterases aqui divulgadas. O termo “variantes modificadas de forma conservativa”, tal como usado neste documento, refere-se a uma substituição, deleção ou adição individual a uma sequência de aminoácidos codificada que resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica. As esterases aqui divulgadas incluem ainda variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos das esterases aqui divulgadas.
[0122]Em modalidades em que a atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase (por exemplo, a atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase compreendida em um caldo de fermentação ou preparação fornecido aqui compreendendo um componente recombinante, ou em uma célula hospedeira microbiana recombinante fornecida aqui capaz de produzir um componente recombinante) compreende uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de pelo menos duas esterases, tal pelo menos duas esterases pode compreender uma ou mais (por exemplo, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais, doze ou mais, etc.) de qualquer esterase (por exemplo, qualquer esterase fornecida aqui).
[0123]Exemplos não limitativos de tais esterases incluem hidrolases de éster carboxílico (EC número 3.1.1), diéster fosfórico hidrolases (EC número 3.1.4), exoribonucleases (EC número 3.1.13), carboxilesterases (EC número 3.1.1.1), arilesterases (EC número 3.1.1.2), lipases de triacilglicerol (EC número 3.1.1.3), fosfolipases A2 (EC número 3.1.1.4), lisofosfolipases (EC número 3.1.1.5), acetilesterases (EC número 3.1.1.6), acetilcolinesterases (EC número 3.1.1.7), fosfolipases C (EC número 3.1.4.3), fosfolipases D (EC número 3.1.4.4), fosfoinositídeo fosfolipases C (3.1.4.11), pectinesterases (EC número 3.1.1.11), gluconolactonases (EC número 3.1.1.17), acilglicerol lipases (EC número 3.1.1.23), 3- oxoadipato enol-lactonases (EC número 3.1.1.24), 1,4-lactonases (EC número
3.1.1.25), galactolipases (EC número 3.1.1.26), fosfolipases A1 (EC número 3.1.1.32), lipoproteína lipases (EC número 3.1.1.34), cefalosporina-C deacetilases (EC número
3.1.1.41), carboximetilenobutenolidases (EC número 3.1.1.45), 2-pirona-4,6- dicarboxilato lactonases (EC número 3.1.1.57), feruloil esterases (EC número
3.1.1.73), cutinases (EC número 3.1.1.74), lipases sensíveis ao hormônio (EC número
3.1.1.79), e combinações dos mesmos.
[0124]Exemplos não limitativos de tais combinações dos mesmos incluem: uma ou mais cutinases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais acetilesterases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de GDSL e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais hidrolases alfa/beta e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de triacilglicerol; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases A2; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases C; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilxilanesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais cutinases e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais cutinases e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais lipases de triacilglicerol; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais fosfolipases A2; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais fosfolipases C; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais acetilxilanesterases; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais lipases de GDSL;
uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais lisofosfolipases e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais fosfolipases A2; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais fosfolipases C; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais acetilxilanesterases; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais lipases de triacilglicerol e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais fosfolipases C; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais acetilxilanesterases; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais fosfolipases A2 e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais acetilxilanesterases; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais fosfolipases C e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais acetilxilanesterase e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais acetilesterases e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais acetilesterases e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais acetilesterases e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais lipases de GDSL e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais lipases de GDSL e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais hidrolases alfa/beta e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilxilanesterases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilesterases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de GDSL e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e uma ou mais hidrolases alfa/beta e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais acetilxilanesterases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais acetilesterases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais lipases de GDSL e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais hidrolases alfa/beta e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lisofosfolipases e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais acetilxilanesterases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais acetilesterases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais lipases de GDSL e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais hidrolases alfa/beta e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de triacilglicerol e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais acetilesterases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais lipases de GDSL, e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais hidrolases alfa/beta e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico;
uma ou mais fosfolipases A2 e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais acetilesterases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais lipases de GDSL e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais hidrolases alfa/beta e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais fosfolipases C e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais acetilesterases e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais lipases de GDSL e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais acetilxilanesterase e uma ou mais hidrolases alfa/beta e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais acetilxilanesterase e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais acetilesterases e uma ou mais lipases de GDSL e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais acetilesterases e uma ou mais hidrolases alfa/beta e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais acetilesterases e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de GDSL e uma ou mais hidrolases alfa/beta e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais lipases de GDSL e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais hidrolases alfa/beta e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase e uma ou mais outras hidrolases de éster carboxílico; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais lipases de triacilglicerol; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais fosfolipases A2; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais fosfolipases C; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais acetilxilanesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais cutinases e uma ou mais lisofosfolipases e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais fosfolipases A2; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais fosfolipases C; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais acetilxilanesterases;
uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de triacilglicerol e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de triacilglicerol e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais fosfolipases C; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais acetilxilanesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases A2 e uma ou mais hidrolases alfa/beta;
uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases A2 e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais acetilxilanesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases C e uma ou mais hidrolases alfa/beta;
uma ou mais cutinases e uma ou mais fosfolipases C e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilxilanesterases e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilxilanesterases e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilxilanesterases e uma ou mais lipases de
GDSL; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilxilanesterases e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilxilanesterases e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais cutinases e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular e uma ou mais acetilesterases; uma ou mais cutinases e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais cutinases e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais cutinases e uma ou mais proteínas tipo lipase extracelular e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilesterases e uma ou mais lipases de GDSL; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilesterases e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais cutinases e uma ou mais acetilesterases e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de GDSL e uma ou mais hidrolases alfa/beta; uma ou mais cutinases e uma ou mais lipases de GDSL e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase; e uma ou mais cutinases e um ou mais alpha/beta hidrólase fold domínio-contendo proteínas e um ou mais fatores de transcrição que regulam a expressão de uma esterase.
[0125]Um número adequado e/ou combinação de esterases cuja atividade deve ser essencialmente eliminada ou modulada em pelo menos uma etapa do método fornecido neste documento para a produção de um produto alimentar, ou no caldo de fermentação ou preparação fornecida neste documento compreendendo um recombinante componente, ou na célula hospedeira microbiana recombinante aqui fornecida capaz de produzir um componente recombinante, pode ser identificado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as esterases podem ser isoladas por métodos conhecidos na técnica (por exemplo, empregando cromatografia de afinidade, ensaios de zimograma, eletroforese em gel) e testadas in vitro para determinar qual ou qual combinação de pelo menos duas esterases fornece uma quantidade substancial de degradação de diglicerídeos, triglicerídeos, fosfolipídeos ou lipoproteínas específicos. Além disso, as células hospedeiras microbianas recombinantes capazes de produzir um componente recombinante (por exemplo, qualquer componente recombinante divulgado neste documento) podem ser obtidas que compreendem uma atividade essencialmente eliminada ou modulada em qualquer uma ou qualquer combinação de pelo menos duas esterases e grau de redução ou eliminação de degradação lipídica de um produto alimentar compreendendo o componente recombinante produzido por cada uma dessas células hospedeiras microbianas recombinantes pode ser medida por métodos conhecidos na técnica.
[0126]Em algumas modalidades, o caldo de fermentação ou preparação fornecido neste documento compreendendo um componente recombinante, ou a célula hospedeira microbiana recombinante fornecida aqui capaz de produzir um componente recombinante, compreende uma combinação e/ou nível de atividade de esterases que fornecem um perfil específico de atividade de esterases (isto é, perfil de atividade de esterase) que é útil para produção de um produto alimentar específico. Em algumas de tais modalidades, o perfil de atividade de esterase é otimizado para fornecer um sabor, aroma, textura, emulsificação, teor nutricional, e/ou vida útil desejados do produto alimentar.
[0127]A atividade da esterase pode ser medida usando um ensaio enzimático. Por exemplo, a atividade da enzima pode ser determinada pela produção de um produto de reação colorimétrica ou um produto que pode ser detectado (por exemplo, ácidos graxos livres e/ou glicerol produzidos a partir de uma hidrólise catalisada por esterase de um triglicerídeo), usando, por exemplo, gel PAGE, espectrofotômetro, imagem, UV/Vis, luz e HPLC. Célula Hospedeira Microbiana Recombinante Produzindo Componente Recombinante e Compreendendo Atividade Essencialmente Eliminada ou Modulada de Esterase
[0128]Em um outro aspecto, é fornecido neste documento uma célula hospedeira microbiana recombinante que é capaz de produzir um componente recombinante e que compreende uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) em comparação com a atividade de esterase compreendida em uma célula hospedeira microbiana recombinante correspondente.
[0129]Uma atividade de esterase compreendida em uma célula hospedeira microbiana recombinante fornecida aqui pode ser essencialmente eliminada ou modulada por qualquer meio. Em algumas modalidades, a atividade de esterase é essencialmente eliminada ou modulada por essencialmente eliminar ou modular a expressão (isto é, produção de uma proteína alvo) da esterase, ou por essencialmente eliminar ou modular a atividade da esterase.
Consequentemente, em várias modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante fornecida aqui compreende a) uma modificação genética em uma sequência de controle, ou uma parte funcional da mesma (isto é, uma parte que é suficiente para a função da sequência de controle), que conduz expressão de uma esterase (por exemplo, uma sequência promotora, uma sequência potenciadora, um peptídeo sinal, um terminador de transcrição, ou qualquer outra sequência que controle a expressão (isto é, transcrição e/ou tradução) de um gene), em que a modificação genética essencialmente elimina ou modula a expressão de a esterase; b) uma modificação genética em uma sequência de codificação que codifica uma esterase, ou uma parte funcional desta (por exemplo, um domínio catalítico), em que a modificação genética essencialmente elimina ou modula a atividade da esterase; c) uma modificação genética em uma sequência de controle, ou uma parte funcional da mesma (isto é,
uma parte que é suficiente para a função da sequência de controle), que conduz a expressão de uma proteína necessária para expressão de uma esterase (por exemplo, um fator de transcrição, uma enzima de modificação pós-tradução necessária para produção de um forma ativa de uma esterase), em que a modificação genética essencialmente elimina ou modula a expressão da proteína necessária para expressão da esterase e desse modo essencialmente elimina ou modula a expressão da esterase; d) uma modificação genética em uma sequência de codificação que codifica uma proteína necessária para expressão de uma esterase, ou uma parte funcional da mesma (por exemplo, um domínio de ligação ao DNA de um fator de transcrição, um domínio catalítico de uma enzima de modificação pós-tradução), em que a modificação genética essencialmente elimina ou modula atividade de a proteína necessária para expressão da esterase e, desse modo, essencialmente elimina ou modula expressão da esterase; e) uma modificação genética em uma sequência de controle, ou uma parte funcional da mesma (isto é, uma parte que é suficiente para a função da sequência de controle), que conduz a expressão de um inibidor endógeno de uma esterase, em que a modificação genética essencialmente elimina ou modula a expressão do inibidor endógeno e, desse modo, essencialmente elimina ou modula a expressão da esterase; f) uma modificação genética em uma sequência de codificação que codifica um inibidor endógeno de uma esterase, em que a modificação genética essencialmente elimina ou modula a atividade do inibidor endógeno e desse modo essencialmente elimina ou modula a expressão da esterase; e/ou g) uma modificação genética que introduz uma sequência de codificação que codifica um inibidor heterólogo (isto é, não nativo) de uma esterase, em que a modificação genética fornece para produção do inibidor heterólogo e, desse modo, essencialmente elimina ou modula a expressão da esterase.
[0130]Uma modificação genética pode consistir em, por exemplo, uma inserção, uma substituição ou uma deleção de um ou mais nucleotídeos em uma sequência polinucleotídica. Uma modificação genética pode, por exemplo, introduzir um códon de parada; remover um códon de início; inserir uma mudança de quadro do quadro de leitura aberto; ou criar uma mutação pontual, mutação missense, mutação de substituição, mutação de deleção, mutação de frameshift, mutação de inserção, mutação de duplicação, mutação de amplificação, mutação de translocação ou mutação de inversão.
[0131]Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento compreende um polinucleotídeo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de codificação que codifica uma esterase (por exemplo, qualquer uma esterase divulgada aqui ou qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui), que codifica uma construção de RNAi que é específica para a esterase, ou que codifica um inibidor heterólogo da atividade de esterase.
[0132]Em algumas modalidades em que a célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento compreende uma modificação genética que essencialmente elimina ou modula a expressão ou atividade de uma proteína necessária para expressão de uma esterase, tal proteína necessária para expressão de uma esterase é um fator de transcrição que regula a expressão de uma esterase.
Em algumas de tais modalidades, o fator de transcrição que regula a expressão de uma esterase compreende uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de aminoácido de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %,
pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos
85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98
%, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das sequências que codificam um fator de transcrição que regula a expressão de uma esterase listada na Tabela 1. Em algumas de tais modalidades, o fator de transcrição que regula a expressão de uma esterase compreende uma sequência de aminoácido com uma identidade de sequência de aminoácido de pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, pelo menos 99,5 % ou 100 % a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RX49, G0RHG1, A0A2T4B416, A0A2T4BJU6, A2R2J1, A2R903, G2Q2Z5 e G2Q8I6. Em algumas de tais modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante fornecida aqui compreende uma ou mais modificações genéticas que essencialmente eliminam ou modulam a expressão ou atividade de uma combinação de pelo menos dois fatores de transcrição que regulam a expressão de uma ou mais esterases.
[0133]Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante é fornecida neste documento capaz de produzir um componente recombinante e compreende uma atividade de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) que é reduzida por pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % em comparação com a atividade de esterase compreendida em uma célula hospedeira microbiana recombinante correspondente. Em algumas de tais modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante fornecida aqui compreende uma atividade essencialmente eliminada de esterase. Em outras modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante é fornecida neste documento capaz de produzir um componente recombinante e compreende uma atividade de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) que é aumentada por pelo menos 25 %, pelo menos 50 %, pelo menos 75 %, pelo menos 100 %, pelo menos 150 %, pelo menos 200 %, pelo menos 300 %, pelo menos 400 %, pelo menos 500 %, pelo menos 600 %, pelo menos 700 %, pelo menos 800 %, pelo menos 900 % ou pelo menos 1,000 % em comparação com a atividade de esterase compreendida em uma célula hospedeira microbiana recombinante correspondente. Célula Hospedeira Microbiana
[0134]A célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento pode ser derivada de qualquer célula microbiana. Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante é fornecida neste documento uma célula hospedeira bacteriana recombinante. A célula hospedeira bacteriana recombinante pode ser derivada de qualquer cepa bacteriana conhecida na técnica. Exemplos não limitativos de cepas bacterianas incluem firmicutes, cianobactérias (algas azuis-verdes), oscillatoriophcideae, bacillales, lactobacillales, oscillatoriales, bacillaceae, lactobacillaceae, Acetobacter suboxidans, Acetobacter xylinum, Actinoplane missouriensis, Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus subtilus, Bacillus cerus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Lactobacilo acidophilus, Lactobacilo bulgaricus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis Lancefield Grupo N, Lactobacilo reuteri, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc dextranicum, cepa Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512(F), Micrococcus lysodeikticus, Spirulina, Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus lactis subspecies diacetylactis, Streptococcus thermophilus, Streptomyces chattanoogensis, Streptomyces griseus, Streptomyces natalensis, Streptomyces olivaceus, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces rubiginosus, Tetrahymena thermophile, Tetrahymena hegewischi, Tetrahymena hyperangularis, Tetrahymena malaccensis, Tetrahymena pigmentosa, Tetrahymena pyriformis, e Tetrahymena vorax, Xanthomonas campestris, e derivados e cruzamentos dos mesmos.
[0135]Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante é fornecida neste documento uma célula hospedeira de levedura recombinante. A célula hospedeira de levedura recombinante pode ser derivada de qualquer cepa de levedura conhecido na técnica. Exemplos não limitativos de cepas de levedura incluem Candida albicans, Candida etchellsii, Candida guilliermondii, Candida humilis, Candida lipolitica, Candida pseudotropicalis, Candida utilis, Candida versatilis, Debaryomyces hansenii, Eremothecium ashbyii, Hansenula polimorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces thermotolerans, Pichia sp., Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia metanolica, Rhodotorula sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces bayanus, Saccharomyces beticus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pombe, Saccharomyces sake, Saccharomyces uvarum, Sporobolomyces roseus, Yarrowia lipolitica, Zygosaccharomyces rouxii, e derivados e cruzamentos dos mesmos.
[0136]Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante é fornecida neste documento, uma célula hospedeira fúngica filamentosa recombinante. A célula hospedeira fúngica filamentosa recombinante pode ser derivada de qualquer cepa fúngica filamentosa conhecida na técnica, incluindo qualquer forma holomórfica, teleomórfica, ou anamórfica da mesma. Exemplos não limitativos de cepas fúngica filamentosas incluem cepas Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Canariomyces, Chaetonium, Chaetomidium, Corynascus, Cryptococcus, Chrysosporium, Coonemeria, Dactylomyces, Emericella, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola, Lentinula, Magnaporthe, Malbranchium, Melanocarpus, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phenerochaete, Phlebia, Piromyces, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Stereum, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, e Trichoderma.
[0137]Exemplos não limitativos de cepas Acremonium incluem Acremonium alabamense. Exemplos não limitativos de cepas Aspergillus incluem Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, e Aspergillus terreus, bem como espécie Emericella, Neosartorya, e Petromyces. Exemplos não limitativos de cepas Chrysosporium incluem Chrysosporium botryoides, Chrysosporium carmichaeli, Chrysosporium crassitunicatum, Chrysosporium europae, Chrysosporium evolceannui, Chrysosporium farinicola, Chrysosporium fastidium, Chrysosporium filiforme, Chrysosporium georgiae, Chrysosporium globiferum, Chrysosporium globiferum var. articulatum, Chrysosporium globiferum var. niveum, Chrysosporium hirundo, Chrysosporium hispanicum, Chrysosporium holmii, Chrysosporium indicum, Chrysosporium iops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium kreiselii, Chrysosporium kuzurovianum, Chrysosporium lignorum, Chrysosporium obatum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium lucknowense Garg 27K, Chrysosporium medium, Chrysosporium medium var. spissescens, Chrysosporium mephiticum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium merdarium var. roseum, Chrysosporium minor, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium parvum, Chrysosporium parvum var. crescens, Chrysosporium pilosum, Chrysosporium pseudomerdarium, Chrysosporium pyriformis, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium sigleri, Chrysosporium sulfureum, Chrysosporium synchronum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium undulatum, Chrysosporium vallenarense, Chrysosporium vespertilium, e Chrysosporium zonatum.
[0138]Exemplos não limitativos de cepas Fusarium incluem Fusarium moniliforme, Fusarium venenatum, Fusarium oxisporum, Fusarium graminearum, Fusarium proliferatum, Fusarium verticiollioides, Fusarium culmorum, Fusarium crookwellense, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sambuccinum, e Fusarium torulosum, bem como formas teleomórficas Gibberella associadas das mesmas. Exemplos não limitativos de cepas Myceliophthora incluem Myceliophthora thermophila. Exemplos não limitativos de cepas Mucor incluem Mucor miehei Cooney et Emerson (Rhizomucor miehei (Cooney & R. Emerson)) Schipper, e Mucor pusillus Lindt. Exemplos não limitativos de cepas Neurospora incluem Neurospora crassa.
[0139]Exemplos não limitativos de cepas Penicillium incluem Penicillium chrysogenum e Penicillium roquefortii. Exemplos não limitativos de cepas Rhizopus incluem Rhizopus niveus. Exemplos não limitativos de cepas Sporotrichum incluem Sporotrichum cellulophilum. Exemplos não limitativos de cepas Thielavia incluem Thielavia terrestris. Exemplos não limitativos de cepas Trichoderma incluem Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma atroviride, Trichoderma virens, Trichoderma citrinoviride, e Trichoderma viride, bem como formas sexuais/teleomórficas alternativas das mesmas (isto é, espécies de Hypocrea).
[0140]A célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento pode ser competente para esporulação ou deficiente para esporulação.
[0141]A célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento pode ser derivada de uma célula microbiana do tipo selvagem ou de uma variante genética (por exemplo, mutante) da mesma.
[0142]A célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento pode ser derivada de uma geralmente reconhecida como corante industrial seguro (GRAS).
[0143]A célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento pode ter uma alta proporção de proteína exógena secretada/biomassa.
Em algumas de tais modalidades, a proporção é maior do que cerca de 1:1, maior do que cerca de 2:1, maior do que cerca de 3:1, maior do que cerca de 4:1, maior do que cerca de 5:1, maior do que cerca de 6:1, maior do que cerca de 7:1 ou maior do que cerca de 8:1.
[0144]Em algumas modalidades, uma célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento compreendendo uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de uma esterase ou de uma combinação de pelo menos duas esterases (por exemplo, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou mais) é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula hospedeira de Trichoderma reesei recombinante (isto é, uma célula hospedeira recombinante derivada de uma cepa Trichoderma reesei) compreendendo uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de uma esterase ou de uma combinação de pelo menos duas esterases (por exemplo, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7,
pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou mais), uma célula hospedeira de Aspergillus niger recombinante (isto é, uma célula hospedeira recombinante derivada de uma cepa Aspergillus niger) compreendendo uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de uma esterase ou de uma combinação de pelo menos duas esterases (por exemplo, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou mais), uma célula hospedeira de Trichoderma citrinoviride recombinante (isto é, uma célula hospedeira recombinante derivada de uma cepa Trichoderma citrinoviride) compreendendo uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de uma esterase ou de uma combinação de pelo menos duas esterases (por exemplo, pelo menos 2, pelo menos
3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou mais), e uma célula hospedeira de Myceliophthora thermophila recombinante (isto é, uma célula hospedeira recombinante derivada de uma cepa Myceliophthora thermophila) compreendendo uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de uma esterase ou de uma combinação de pelo menos duas esterases (por exemplo, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, ou mais). Componente Recombinante
[0145]A célula hospedeira microbiana recombinante é fornecida neste documento capaz de produzir um componente recombinante. Exemplos não limitativos de componentes recombinantes incluem proteínas, lipídeos, carboidratos, moléculas pequenas, aditivos alimentares, suplementos alimentares (por exemplo, vitaminas), neutracêuticos e probióticos.
[0146]Em algumas modalidades, o componente recombinante é uma proteína recombinante. Em algumas modalidades, a proteína recombinante é uma proteína vegetal recombinante. O termo “proteína vegetal” conforme usado neste documento refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de pelo menos 20 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, ou pelo menos 150, e geralmente não mais do que 250 aminoácidos) que é pelo menos 80 % idêntica (por exemplo, pelo menos 80 % idêntica, pelo menos 85 % idêntica, pelo menos 90 % idêntica, pelo menos 95 % idêntica, pelo menos 99 % idêntica, 100 % idêntica) a uma sequência de aminoácidos em uma proteína nativamente encontrada em uma planta (isto é, uma proteína que é nativa a uma célula vegetal). Exemplos não limitativos de proteínas vegetais incluem proteínas derivadas de cicadáceas, ginkgo biloba, coníferas, cipreste, zimbros, thuja, cedro, pinheiros, angelica, cominho, coentro, cominho, erva-doce, salsa, endro, dente de leão, helichrysum, calêndula, artemísia, cártamo, camomila, alface, absinto, calêndula, citronela, sálvia, tomilho, semente de chia, mostarda, azeitona, café, pimentão, berinjela, páprica, amora, kiwi, vegetais (por exemplo, cenoura, aipo), tagetes, atanásia, estragão, girassol, gaultéria, manjericão, hissopo, lavanda, verbena limão, manjerona, melissa, patchouli, poejo, hortelã-pimenta, alecrim, gergelim, hortelã,
prímula, sâmara, pimenta, pimentão, batata, batata doce, tomate, mirtilo, solanácea,
petúnia, ipomeia, lilás, jasmim, madressilva, snapdragon, psílio, minhoca, trigo sarraceno, amaranto, acelga, quinua, espinafre, ruibarbo, jojoba, cypselea, chlorella, marula, avelã, canola, couve, chicória, rutabaga, incenso, mirashrh, elemi, cânhamo,
abóbora, abóbora, curcurbit, mandioca, dalbergia, plantas leguminosas (por exemplo, alfafa, lentilhas, feijão, trevos, ervilhas, fava coceira, frijole bola roja, frijole negro, lespedeza, alcaçuz, tremoço, algaroba, alfarroba, soja, amendoim, tamarindo, glicínia, cássia, grão de bico/garbanzo, feno-grego, ervilha verde, ervilha amarela, ervilha,
feijão, feijão fava), gerânio, linho, romã, algodão, quiabo, nim, figo, amora, cravo,
eucalipto, árvore do chá, niaouli, plantas frutíferas (por exemplo, maçã, damasco, pêssego, ameixa, pêra, nectarina), morango, amora, framboesa, cereja, ameixa, rosa,
tangerina, frutas cítricas (por exemplo, toranja, limão, lima, laranja, laranja amarga, tangerina, tangerina), manga, bergamota cítrica, buchu, uva, brócolis, couve de bruxelas, camelina, couve-flor, couve nabiça, colza (canola), nabo, repolho, pepino, melancia, melão, abobrinha, vidoeiro, noz, mandioca, baobá, pimenta da Jamaica,
amêndoa, fruta-pão, sândalo, macadâmia, taro, tuberosa, aloe vera, alho, cebola,
chalota, baunilha, iúca, vetiver, galanga, cevada, milho, curcuma aromatica, gengibre, capim-limão, aveia, palma, abacaxi, arroz, centeio, sorgo, triticale, cúrcuma, inhame,
bambu, cevada, cajuput, canna, cardamomo, milho, aveia, trigo, canela, sassafrás, benjoim de lindera, louro, abacate, ylang-ylang, maça, noz-moscada, moringa, rabo de cavalo, orégano, coentro, cerefólio, cebolinha, frutas agregadas, grãos, plantas herbáceas, vegetais folhosos, leguminosas não-grãos, plantas de nozes, plantas suculentas, plantas terrestres, plantas aquáticas, delbergia, painço, drupas,
esquizocarpos, plantas com flores, plantas sem flores, plantas cultivadas, plantas selvagens, árvores, arbustos, flores, gramíneas, plantas herbáceas, escovas, lianas,
cactos, plantas tropicais, plantas subtropicais, plantas temperadas, e derivados e cruzamentos dos mesmos.
[0147]Em algumas modalidades, a proteína vegetal é uma proteína de ervilha (por exemplo, legumina, vicilina, covicilina). Em outras modalidades, a proteína vegetal é uma proteína da batata (por exemplo, tuberina, notato de inibidor de protease II).
[0148]Em algumas modalidades, a proteína recombinante é uma proteína animal recombinante. O termo “animal proteína” conforme usado neste documento refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de pelo menos 20 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, ou pelo menos 150, e geralmente não mais do que 250 aminoácidos) que é pelo menos 80 % idêntica (por exemplo, pelo menos 80 % idêntica, pelo menos 85 % idêntica, pelo menos 90 % idêntica, pelo menos 95 % idêntica, pelo menos 99 % idêntica, 100 % idêntica) a uma sequência de aminoácidos em uma proteína nativamente encontrada em um animal (isto é, uma proteína que é nativa de uma célula animal). Exemplos não limitativos de proteínas animais incluem proteínas derivadas de insetos (por exemplo, mosca), mamíferos (por exemplo, vaca, ovelha, cabra, coelho, porco, ser humano), ou pássaros (por exemplo, galinha). Em algumas modalidades, a proteína animal é uma proteína estrutural (por exemplo, colágeno, tropoelastina, elastina). Em outras modalidades, a proteína animal é uma proteína do ovo (por exemplo, ovalbumina).
[0149]Em ainda outras modalidades, a proteína recombinante é uma proteína recombinante do leite. O termo “proteína do leite” conforme usado neste documento refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de pelo menos 20 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, ou pelo menos 150, e geralmente não mais do que 250 aminoácidos) que é pelo menos 80 % idêntica (por exemplo, pelo menos 80 % idêntica, pelo menos 85 %
idêntica, pelo menos 90 % idêntica, pelo menos 95 % idêntica, pelo menos 99 % idêntica, 100 % idêntica) a uma sequência de aminoácidos em uma proteína nativamente encontrada em um leite produzido por mamífero (isto é, uma proteína que é nativa do leite produzido por mamífero).
[0150]A proteína recombinante do leite pode ser uma proteína recombinante do soro de leite ou uma caseína recombinante. O termo “proteína do soro do leite” ou “caseína” conforme usado neste documento refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de pelo menos 20 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, ou pelo menos 150, e geralmente não mais do que 250 aminoácidos) que é pelo menos 80 % idêntica (por exemplo, pelo menos 80 % idêntica, pelo menos 85 % idêntica, pelo menos 90 % idêntica, pelo menos 95 % idêntica, pelo menos 99 % idêntica, 100 % idêntica) a uma sequência de aminoácidos em uma proteína do soro do leite ou caseína nativa, respectivamente. Exemplos não limitativos de proteínas do soro do leite incluem α-lactalbumina, β- lactoglobulina, lactoferrina, transferrina, albumina sérica, lactoperoxidase, e glicomacropeptídeo. Exemplos não limitativos de caseínas incluem β-caseína, γ- caseína, κ-caseína, α-S1-caseína, e α-S2-caseína. Exemplos não limitativos de sequências de ácido nucleico que codificam proteínas do soro do leite e caseínas são divulgadas em pedido PCT PCT/US2015/046428 depositado em 21 de agosto de 2015 e pedido PCT PCT/US2017/48730 depositado em 25 de agosto de 2017, que são aqui incorporados em sua totalidade.
[0151]A proteína recombinante do leite pode ser derivada de qualquer espécie de mamífero, incluindo, mas não se limitando a vaca, ser humano, ovelha, cabra, búfalo, camelo, cavalo, burro, lêmure, panda, porquinho-da-índia, esquilo, urso, macaco, gorila, chimpanzé, cabra montesa, macaco, macaco, gato, cachorro, canguru pequeno, rato, camundongo, elefante, gambá, coelho, baleia, babuíno, gibão, orangotango, mandril, porco, lobo, raposa, leão, tigre e equidna.
[0152]A proteína recombinante do leite pode carecer de epítopos que podem desencadear respostas imunes em um ser humano ou animal. Essas proteínas recombinantes do leite são particularmente adequadas para uso em produtos alimentares.
[0153]A proteína recombinante do leite pode ter uma modificação pós- tradução. O termo “modificação pós-tradução”, ou seu acrônimo “PTM”, conforme usado neste documento refere-se à ligação covalente de um grupo químico a uma proteína após a biossíntese de proteínas. PTM pode ocorrer na cadeia lateral de aminoácidos da proteína ou em seus terminais C ou N. Exemplos não limitativos de PTMs incluem glicosilação (isto é, ligação covalente a proteínas de grupos de glicano (isto é, monossacarídeos, dissacarídeos, polissacarídeos, glicanos lineares, glicanos ramificados, glicanos com resíduos galf, glicanos com sulfato e/ou resíduos de fosfato, D-glicose, D-galactose, D-manose, L-fucose, N-acetil-D-galactose amina, N-acetil-D- glicose amina, ácido N-acetil-D-neuramínico, galactofuranose, fosfodiésteres, N- acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina, ácido siálico e combinações dos mesmos; ver, por exemplo, Deshpande et al. 2008. Glycobiology 18 (8): 626) via ligação C, ligação N ou ligação O, ou via glipiação (isto é, adição de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol) ou fosfoglicosilação (isto é, ligada através do fosfato de uma fosfo-serina)), fosforilação (isto é, ligação covalente a proteínas de grupos fosfato), alquilação (isto é, ligação covalente a proteínas de grupos alcano (por exemplo, grupo metano em metilação)) e lipidação (isto é, atta covalente fragmento de um grupo lipídico (por exemplo, grupo isoprenóide em prenilação e isoprenilação (por exemplo, grupo farnesol em farnesilação, grupo geraniol em geranilação, grupo geranilgeraniol em geranilgeranilação), grupo de ácido graxo em acilação graxo (por exemplo, ácido mirístico em miristoilação, ácido palmítico em palmitoilação), âncora de glicosilfosfatidilinositol na glipiação)), hidroxilação (isto é, ligação covalente de um grupo hidróxido), sumoilação (isto é, ligação a proteínas de proteína modificadora semelhante à ubiquitina pequena (ou SUMO)), nitrosilação (isto é, ligação a proteínas de um grupo NO) e nitração de tirosina (isto é, ligação a resíduos de tirosina de proteínas de grupos de nitrato). A PTM da proteína do leite recombinante pode ser uma PTM nativa, uma PTM não nativa ou uma mistura de pelo menos uma PTM nativa e pelo menos uma PTM não nativa. O termo “PTM não nativa”, tal como aqui usado, refere-se a uma diferença em um ou mais locais de uma ou mais PTMs (por exemplo, glicosilação, fosforilação) em uma proteína e/ou uma diferença no tipo de uma ou mais PTMs em um ou mais locais em uma proteína em comparação com a proteína nativa (isto é, a proteína tendo “PTMs nativas”).
[0154]A proteína recombinante do leite pode ter uma repetição da proteína do leite. O termo “repetição da proteína do leite” conforme usado neste documento refere- se a uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica (por exemplo, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % idêntica, pelo menos 99 % idêntica) a uma sequência de aminoácido em uma proteína encontrada em um leite produzido por mamífero (por exemplo, uma proteína do soro do leite, uma caseína) e que está presente mais de uma vez (por exemplo, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, ou pelo menos 200 vezes) na proteína recombinante do leite. Um repetição da proteína do leite pode compreender pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, ou pelo menos 150, e geralmente não mais do que 200 aminoácidos. Uma repetição da proteína do leite em uma proteína recombinante do leite pode ser consecutiva (isto é, não ter sequências de aminoácidos intervenientes) ou não consecutiva (isto é, ter sequências de aminoácidos intervenientes). Quando presente não consecutivamente, a sequência de aminoácidos interveniente pode desempenhar um papel passivo no fornecimento de peso molecular sem introdução de propriedades indesejáveis, ou pode desempenhar um papel ativo no fornecimento de propriedades particulares (por exemplo, solubilidade, biodegradabilidade, ligação a outras moléculas).
[0155]Em algumas modalidades, a proteína recombinante é uma proteína de algas recombinante. O termo “proteína de algas” conforme usado neste documento refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de pelo menos 20 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, ou pelo menos 150, e geralmente não mais do que 250 aminoácidos) que é pelo menos 80 % idêntica (por exemplo, pelo menos 80 % idêntica, pelo menos 85 % idêntica, pelo menos 90 % idêntica, pelo menos 95 % idêntica, pelo menos 99 % idêntica, 100 % idêntica) a uma sequência de aminoácidos em uma proteína nativamente encontrada em uma alga (isto é, uma proteína que é nativa de uma célula de alga).
[0156]Em algumas modalidades, a proteína recombinante é uma proteína fúngica recombinante. O termo “fúngico proteína” conforme usado neste documento refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de pelo menos 20 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, ou pelo menos 150, e geralmente não mais do que 250 aminoácidos) que é pelo menos 80 % idêntica (por exemplo, pelo menos 80 % idêntica, pelo menos 85 % idêntica, pelo menos 90 % idêntica, pelo menos 95 % idêntica, pelo menos 99 % idêntica, 100 % idêntica) a uma sequência de aminoácidos em uma proteína nativamente encontrada em um fungo (isto é, uma proteína que é nativa de uma célula fúngica).
[0157]Em algumas modalidades, a proteína recombinante é uma proteína microbiana recombinante. O termo “proteína microbiana” conforme usado neste documento refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de pelo menos 20 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, ou pelo menos 150, e geralmente não mais do que 250 aminoácidos) que é pelo menos 80 % idêntica (por exemplo, pelo menos 80 % idêntica, pelo menos 85 % idêntica, pelo menos 90 % idêntica, pelo menos 95 % idêntica, pelo menos 99 % idêntica, 100 % idêntica) a uma sequência de aminoácidos em uma proteína nativamente encontrada em um micróbio (isto é, uma proteína que é nativa de uma célula microbiana). Métodos Gerais
[0158]Uma célula hospedeira microbiana recombinante que é capaz de produzir um componente recombinante pode ser obtido usando métodos conhecidos na técnica. A célula hospedeira microbiana recombinante normalmente compreende um polinucleotídeo recombinante (por exemplo, um vetor recombinante) que codifica o componente recombinante. O polinucleotídeo recombinante pode ser preparado por qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, síntese química direta e clonagem.
[0159]O polinucleotídeo recombinante normalmente compreende um ou mais cassetes de expressão, em que cada cassete de expressão compreende: um promotor (por exemplo, um promotor fúngico), uma sequência de sinal opcional (isto é, uma sequência que codifica um peptídeo que medeia a entrega de uma proteína nascente ligada ao peptídeo ao exterior da célula em que a proteína nascente é sintetizada), uma sequência que codifica uma proteína recombinante e uma sequência de terminação (ou múltiplas sequências de terminação), em que o promotor está operacionalmente ligado na orientação de sentido à sequência de sinal opcional (isto é, o promotor e a sequência de sinal opcional e a sequência subsequente que codifica a proteína são posicionados de modo que o promotor seja eficaz para regular a transcrição da sequência de sinal opcional e a sequência que codifica a proteína), a sequência de sinal opcional está operacionalmente ligada na orientação de sentido à sequência que codifica uma proteína recombinante (isto é, a sequência de sinal e a sequência que codifica uma proteína recombinante é posicionada de modo que a transcrição e tradução produzam uma proteína recombinante compreendendo uma sequência de sinal funcional), e a sequência de terminação está operacionalmente ligada à sequência que codifica uma proteína recombinante (isto é, a sequência que codifica uma proteína recombinante e a sequência de terminação são posicionadas de tal que o terminador é eficaz para terminar a transcrição da sequência de sinal opcional e da sequência que codifica uma proteína recombinante)).
[0160]O promotor pode ser qualquer promotor adequado que seja funcional na célula hospedeira microbiana recombinante. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em outras modalidades, o promotor é um promotor indutível ou um promotor reprimível (por exemplo, um promotor que é induzido ou reprimido na presença de glicose, galactose, lactose, sacarose, celulose, soforose, gentiobiose, sorbose, dissacarídeos que induzem os promotores de celulase, amido, triptofano ou fosfato). Exemplos não limitativos de promotores adequados para uso em células hospedeiras de fungos filamentosos recombinantes incluem promotores e partes funcionais dos mesmos, de genes que codificam qualquer uma das seguintes proteínas: glucoamilase (por exemplo, glaA de Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus japonicus, Aspergillus tubingensis, Aspergillus foetidus, ou Aspegillus carbonarius), amilase (por exemplo, Aspergillus oryzae TAKA amilase, alfa-amilase neutra Aspergillus niger, ácido estável de alfa-amilase Aspergillus niger, fúngico α- amilase (ami), alfa-amilase bacteriana), protease (por exemplo, Protease aspártica de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, protease tipo tripsina
Fusarium oxisporum, Trichoderma reesei protease), lipase (por exemplo, Rhizomucor miehei lipase), isomerase (por exemplo, Aspergillus oryzae triose fosfato isomerase, triose fosfato isomerase fúngica (tpi), triosefosfato isomerase de levedura), acetamidase (por exemplo, Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae ou outra acetamidase fúngica (amdS)), desidrogenase (por exemplo, álcool desidrogenase fúngico (adhA), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase fúngico (gpd), levedura de álcool desidrogenase), xilanase (por exemplo, fúngico xilanase (xlnA), Trichoderma xylanases (xyn1, xyn2, bxl1)), cinase (por exemplo, levedura 3-fosfoglicerato cinase), hidrólase (por exemplo, celobiohidrolase I fúngica (cbh1), Trichoderma hidrolases (cbh2, egl1, egl2)), fosfatase (por exemplo, fosfatase ácida de Fusarium) e outras proteínas fúngicas (por exemplo, endo α-L-arabinase fúngica (abnA), α-L- fúngica arabinofuranosidase A (abfA), α-L-arabinofuranosidase B fúngica (abfB), fitase fúngica, ATP-sintetase fúngica, subunidade 9 fúngica (oliC), proteína específica de esporulação fúngica (Spo2), SSO fúngica, álcool oxidase de levedura, lactase de levedura, Neurospora crassa CPC1, Aspergillus nidulans trpC, enzimas quitinolíticas fúngicas (por exemplo, endo- e exo-quitinase, beta-glucanase), proteínas fúngicas associadas ao VAMP (VAPs), fator de alongamento da tradução fúngica (TEF1), proteína fúngica responsiva a danos no DNA ( DDRP), fúngica (por exemplo, Fusarium ou Neurospora crassa) peroxissomo hexagonal (Hex1), fúngica (por exemplo, Neurospora crassa) catalase) e qualquer outra proteína produzida em alto nível na célula hospedeira fúngica filamentosa recombinante.
[0161]Exemplos não limitativos de promotores adequados para o uso em células hospedeiras de levedura ou bactérias recombinantes incluem promotores e partes funcionais dos mesmos, de genes que codificam qualquer uma das seguintes proteínas: polimerase LAC4, T7, TAC, GAL1, λPL, λPR, beta-lactamase, spa, CYC1, TDH3, GPD, TEF1, ENO2, PGL1, GAP, SUC2, ADH1, ADH2, HXT7, PHO5, CLB1,
AOX1, celulase, amilase, protease, xilanase, e qualquer outra proteína produzida em alto nível na célula hospedeira fúngica filamentosa recombinante.
[0162]Em algumas modalidades, os promotores são promotores ao estresse (por exemplo, choque térmico) (por exemplo, hac1, BIP).
[0163]A sequência de sinal pode ser qualquer sequência de sinal adequada que seja funcional na célula hospedeira microbiana recombinante.
[0164]A proteína recombinante que é normalmente codificada pelo polinucleotídeo recombinante pode ser qualquer proteína recombinante (por exemplo, um componente recombinante divulgado neste documento), incluindo uma proteína do leite recombinante (por exemplo, qualquer uma das proteínas do leite recombinantes divulgadas neste documento (por exemplo, b-lactoglobulina recombinante, a-lactalbumina recombinante, k-caseína recombinante, b-caseína recombinante), proteína de ovo recombinante (por exemplo, ovotransferrina (conalbumina), ovomucina, ovalbumina, ovotransferrina, lisozima), proteínas recombinantes necessárias para a produção de vitaminas, proteínas recombinantes necessárias para a produção de lipídeos, moléculas pequenas que criam sabor, polímeros que criam texturas e emulsões, e combinações dos mesmos.
[0165]A sequência de terminação pode ser qualquer sequência de terminação adequada que seja funcional na célula hospedeira microbiana recombinante. Exemplos não limitativos de sequências de terminação adequadas para uso em células hospedeiras de fungos filamentosos recombinantes incluem, mas não estão limitados a sequências de terminação de Aspergillus oryzae (por exemplo, sequência de terminação de gene TAKA amilase), Aspergillus niger (por exemplo, sequência de terminação de gene glaA, gpdA, aamA, trpC, pdc1, adh1, amdS, ou tef1), Fusarium oxisporum (por exemplo, sequência de terminação de gene de serina protease (tripsina)), Trichoderma reesei (por exemplo, sequência de terminação de gene cbh1, pdc1, TEF1, gpd1, xyn1, ou adh1), Pichia pastoris (por exemplo, sequência de terminação de gene aox1, gap1, adh1, tef1, tps1, ou pgk1), Saccharomyces cerevisiae (por exemplo, sequência de terminação de gene adh1, cyc1, gal1, tef1, pdc1, pgk1, ou tps1), sequências de terminação sintéticas e qualquer combinação das sequências listadas acima. Exemplos não limitativos de sequências de terminação adequadas para uso em células hospedeiras de levedura recombinantes incluem, mas não estão limitados às sequências de terminação PGK1 e TPS1.
[0166]O polinucleotídeo recombinante pode incluir ainda elementos adicionais. Exemplos não limitativos de tais elementos adicionais incluem sequências potenciadoras, elementos de resposta, locais de reconhecimento de proteínas, elementos indutíveis, sequências de ligação de proteínas, regiões 5’ e 3’ não traduzidas, sequências de poliadenilação, íntrons, origens de replicação, operadores (isto é, sequências de nucleicos ácidos adjacentes a um promotor que compreende um domínio de ligação de proteína onde uma proteína repressora pode se ligar e reduzir ou eliminar a atividade do promotor) e marcadores de seleção (isto é, genes que codificam proteínas que podem complementar a auxotrofia da célula fúngica filamentosa, fornecem resistência a antibióticos, ou resultar em uma mudança de cor).
Esses elementos são conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos de origens de replicação incluem AMA1 e ANSI. Exemplos não limitativos de marcadores de seleção adequados incluem amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pirG/pir4 (orotidina 5’-fosfato) sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase) e derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, o marcador de seleção compreende uma alteração que diminui a produção do marcador seletivo, aumentando assim o número de cópias necessárias para permitir que uma célula fúngica filamentosa compreendendo o polinucleotídeo sobreviva sob seleção.
[0167]Em modalidades em que o polinucleotídeo recombinante compreende dois ou mais cassetes de expressão, os promotores operacionalmente ligados,
sequências de sinal opcionais, sequências que codificam sequências de terminação de polipeptídeo e elementos adicionais opcionais podem ser idênticos ou diferentes entre os dois ou mais cassetes de expressão.
[0168]Os métodos para a introdução de um polinucleotídeo recombinante em uma célula microbiana para obter uma célula hospedeira microbiana recombinante são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos de tais métodos incluem transfecção de fosfato de cálcio, transfecção de dendrímero, transfecção de lipossoma (por exemplo, transfecção de lipossoma catiônico), transfecção de polímero catiônico, compressão de células, sonoporação, transfecção óptica, fusão de protoplastos, impalefecção, entrega hidrodinâmica, arma de gene, magnetofecção, transdução viral, eletroporação e transformação química (por exemplo, usando PEG).
[0169]Em algumas modalidades, o polinucleotídeo recombinante é mantido extracromossômico na célula hospedeira microbiana recombinante em vetores de expressão (isto é, um ácido nucleico que transduz, transforma ou infecta uma célula hospedeira e faz com que ela expresse ácidos nucleicos e/ou proteínas diferentes daquelas nativas da célula hospedeira, ou de uma maneira não nativa da célula hospedeira). Em outras modalidades, o polinucleotídeo recombinante é integrado de forma estável no genoma (por exemplo, um cromossomo) da célula hospedeira microbiana recombinante. Para integração no genoma, o polinucleotídeo recombinante pode compreender sequências para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Em algumas modalidades, tais sequências permitem a integração no genoma hospedeiro em um local preciso. O polinucleotídeo recombinante pode compreender pelo menos 100, pelo menos 250, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1.000 ou pelo menos 10.000 pares de bases que são altamente homólogos com uma sequência alvo no genoma da célula hospedeira microbiana recombinante para aumentar a probabilidade de recombinação homóloga. Essa sequência altamente homóloga pode ser não codificadora ou codificadora. Mais de uma cópia do polinucleotídeo recombinante pode ser inserida na célula hospedeira microbiana recombinante para aumentar a produção da proteína recombinante.
[0170]Uma célula hospedeira microbiana recombinante pode ser cultivada em qualquer recipiente de fermentação adequado conhecido na técnica (por exemplo, placa de cultura, frasco de agitação, fermentador (por exemplo, fermentador de tanque agitado, fermentador de airlift, fermentador de coluna de bolha, biorreator de leito fixo, fermentador de laboratório, fermentador industrial, ou qualquer combinação dos mesmos)) e em qualquer escala (por exemplo, em pequena escala, grande escala) e processo (por exemplo, contínuo, lote, lote alimentado ou estado sólido) conhecido na técnica.
[0171]Os meios de cultura adequados incluem qualquer meio de cultura no qual a célula hospedeira microbiana recombinante pode crescer e/ou permanecer viável. Em algumas modalidades, o meio de cultura é um meio aquoso que compreende um carbono, um nitrogênio (por exemplo, amônia anidra, sulfato de amônio, nitrato de amônio, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, polifosfato de amônio, nitrato de sódio, ureia, peptona, hidrolisados de proteína, extrato de levedura) e uma fonte de fosfato. O meio de cultura pode compreender ainda um sal inorgânico, um mineral, um metal, um metal de transição, uma vitamina, um óleo emulsificante, um tensoativo e qualquer outro nutriente. Exemplos não limitativos de fontes de carbono adequadas incluem monossacarídeos, dissacarídeos, polissacarídeos, acetato, etanol, metanol, glicerol, metano e combinações dos mesmos. Exemplos não limitativos de monossacarídeos incluem dextrose (glicose), frutose, galactose, xilose, arabinose e combinações dos mesmos. Exemplos não limitativos de dissacarídeos incluem sacarose, lactose, maltose, trealose, celobiose e combinações dos mesmos. Exemplos não limitativos de polissacarídeos incluem amido, glicogênio, celulose, amilose, hemicelulose, maltodextrina e combinações dos mesmos. Os meios de cultura adequados estão disponíveis em fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection).
[0172]As condições adequadas para a produção do componente recombinante são aquelas em que a célula hospedeira microbiana recombinante pode crescer e/ou permanecer viável. Exemplos não limitativos de tais condições incluem um pH adequado, uma temperatura adequada, uma taxa de alimentação adequada, uma pressão adequada, um teor de nutrientes adequado (por exemplo, um teor de carbono adequado, um teor de nitrogênio adequado, um teor de fósforo adequado), um teor adequado teor de suplemento, um teor de metal residual adequado e um nível adequado de oxigenação.
[0173]Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende ainda uma protease (por exemplo, uma protease à base de planta) que pode prevenir a degradação de uma proteína recombinante, um inibidor de protease que reduz a atividade de uma protease que pode degradar a proteína recombinante, e/ou uma proteína sacrificial que pode desviar a atividade da protease. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende ainda um aminoácido não natural para incorporação na proteína recombinante produzida. Outras Modificações Genéticas
[0174]A célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento pode compreender ainda uma modificação genética que melhora a produção do componente recombinante. Exemplos não limitativos de tais modificações genéticas incluem promotores alterados, atividades de quinase alteradas, atividades de fosfatase alteradas, atividades de dobramento de proteínas alteradas, atividades de secreção de proteínas alteradas e vias de indução de expressão gênica alterada.
[0175]A célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento pode ainda ter atividade reduzida ou essencialmente eliminada de uma protease de modo a minimizar a degradação da proteína recombinante (ver, por exemplo, o pedido PCT WO96/29391). As células fúngicas filamentosas com atividade reduzida ou essencialmente eliminada de uma protease podem ser obtidas por triagem de mutantes ou por modificação genética específica de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0176]A célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento pode compreender ainda uma glicosiltransferase nativa ou heteróloga. Os exemplos não limitativos de tais glicosiltransferases endógenas ou heterólogas incluem fucosiltransferases, galactosiltransferases, glucosiltransferases, xilosiltransferases, acetilases, glucoroniltransferases, glucoronilpimerases, sialiltransferases, galactosiltransferases, glucosiltransferases, xilosiltransferases, acetilases, glucoroniltransferases, glucoronilpimerases, sialiltransferases, nialyltransferases, manosiltransferases-acetiltransferases, manosiltransferases, N- acetiltransferases e N-acetiltransferases.
[0177]A célula hospedeira microbiana recombinante fornecida neste documento pode compreender ainda uma quinase ou fosfatase nativa ou heteróloga.
Exemplos não limitativos de tais quinases ou fosfatases nativas ou heterólogas incluem proteína quinase A, proteína quinase B, proteína quinase C, creatina quinase B, proteína quinase C beta, proteína quinase G, TmkA, Fam20 quinases (por exemplo, Fam20C), ATM, CaM-II, cdc2, cdk5, CK1, CKII, DNAPK, EGFR, GSK3, INSR, p38MAPK, RSK, SRC, fosfotransferases, fosfatase alcalina (por exemplo, UniProtKB - O77578), fosfatase ácida e outros (ver, por exemplo, Kabiratase & Kazi. 2011. Genet Mol Biol. 34 (4): 587).
Preparação Compreendendo Componente Recombinante e Atividade de Esterase Essencialmente Eliminada ou Modulada
[0178]Em um outro aspecto, é fornecido neste documento uma preparação que compreende um componente recombinante (por exemplo, qualquer um dos componentes recombinantes divulgados aqui) e uma atividade de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) que é essencialmente eliminada ou modulada em comparação com a atividade de esterase compreendida em uma preparação correspondente.
[0179]Em algumas modalidades, a preparação fornecida aqui compreende um componente recombinante e uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase que é reduzida por pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % em comparação com a atividade de esterase compreendida em uma preparação correspondente. Em algumas de tais modalidades, a preparação fornecida aqui compreende um componente recombinante e uma atividade essencialmente eliminada de esterase. Em outras modalidades, a preparação fornecida neste documento compreende um componente recombinante e uma atividade de esterase que é aumentada por pelo menos 25 %, pelo menos 50 %, pelo menos 75 %, pelo menos 100 %, pelo menos 150 %, pelo menos 200 %, pelo menos 300 %, pelo menos 400 %, pelo menos 500 %, pelo menos 600 %, pelo menos 700 %, pelo menos 800 %, pelo menos 900 % ou pelo menos 1,000 % em comparação com a atividade de esterase compreendida em uma preparação correspondente.
[0180]A preparação fornecida neste documento pode ser obtida purificando um componente recombinante produzido por uma célula hospedeira microbiana recombinante fornecida aqui de um caldo de fermentação compreendendo a célula hospedeira microbiana recombinante.
[0181]Os métodos para purificar um componente recombinante a partir de um caldo de fermentação são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Protein Purification, JC Janson e L Ryden, Eds., VCH Publishers, Nova Iorque, 1989; Protein Purification Methods: A Practical Approach, ELV Harris e S Angel, Eds., IRL Press, Oxford, Inglaterra, 1989).
[0182]Um componente recombinante pode ser purificado com base em seu peso molecular, por exemplo, por exclusão de tamanho/cromatografia de troca, ultrafiltração através de membranas, cromatografia de permeação em gel (por exemplo, eletroforese de disco-gel preparativa) ou centrifugação de densidade.
[0183]Um componente recombinante também pode ser purificado com base em sua carga superficial ou hidrofobicidade/hidrofilicidade, por exemplo, precipitação isoelétrica, cromatografia de troca aniônica/catiônica, focagem isoelétrica (IEF) ou cromatografia de fase reversa.
[0184]Um componente recombinante também pode ser purificado com base em sua solubilidade, por exemplo, precipitação com sulfato de amônio, precipitação isoelétrica, tensoativos, detergentes ou extração com solvente.
[0185]Um componente recombinante também pode ser purificado com base em sua afinidade para outra molécula, por exemplo, por cromatografia de afinidade, corantes reativos ou hidroxiapatita. A cromatografia de afinidade pode incluir o uso de um anticorpo com uma afinidade de ligação específica para o componente recombinante, ou NTA de níquel para uma proteína recombinante marcada com His, ou uma lectina para se ligar a uma fração de açúcar em uma proteína recombinante, ou qualquer outra molécula que especificamente se liga o componente recombinante.
Em algumas modalidades, o componente recombinante carrega um marcador que facilita a purificação. Exemplos não limitativos de tais marcadores incluem marcadores de epítopo e marcadores de proteína. Exemplos não limitativos de marcadores de epítopo incluem marcadores de epítopo c-myc, hemaglutinina (HA), poli-histidina (6x- HIS), GLU-GLU e DYKDDDDK (FLAG). Exemplos não limitativos de marcadores de proteína incluem glutationa-S-transferase (GST), proteína fluorescente verde (GFP) e proteína de ligação à maltose (MBP). Um epítopo ou marcador de proteína pode ser removido após o isolamento do componente recombinante (por exemplo, via clivagem por protease).
[0186]Em modalidades em que o componente recombinante é secretado pela célula hospedeira microbiana recombinante, o componente recombinante pode ser purificado diretamente a partir do caldo de fermentação. Em outras modalidades, o componente recombinante pode ser purificado de um lisado celular.
[0187]A identidade do componente recombinante pode ser confirmada e/ou quantificada por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), análise de Western blot, análise de Eastern blot, eletroforese em gel de poliacrilamida, eletroforese capilar, formação de um produto enzimático, desaparecimento de uma enzima substrato e identificação de sequência de espectroscopia de massa bidimensional (2D-MS/MS).
[0188]Em algumas modalidades, o componente recombinante é purificado até uma pureza maior que 30 %, maior que 35 %, maior que 40 %, maior que 45 %, maior que 50 %, maior que 55 %, maior que 60 %, maior que 65 %, maior que 70 %, maior que 75 %, maior que 80 %, maior que 85 %, maior que 90 %, maior que 95 %, maior que 97 % ou maior que 99 % em relação a outros componentes compreendidos no caldo de fermentação. Em algumas modalidades, o componente recombinante é purificado para ser pelo menos duas vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes mais abundante em relação a outros componentes na preparação que era no caldo de fermentação. Em algumas modalidades, o componente recombinante é purificado até uma pureza maior que 30 %, maior que 35 %, maior que 40 %, maior que 45 %, maior que 50 %, maior que 55 %, maior que 60 %, maior que 65 %, maior que 70 %, maior que 75 %, maior que 80 %, maior que 85 %, maior que 90 %, maior que 95 %, maior que 97 % ou maior que 99 % em peso.
[0189]Em algumas modalidades, a preparação é um líquido. Em outras modalidades, a preparação é um sólido. Em algumas de tais modalidades, a preparação é um pó. Em algumas de tais modalidades, o pó compreende uma teor de umidade menor que 10 %, menor que 7 %, menor que 5 %, menor que 3 % ou menor que 1 % em peso. Um pó pode ser obtido, por exemplo, por secagem por pulverização ou concentração por evaporação.
[0190]Em algumas modalidades, a preparação compreende um componente recombinante que é pós-processado. O pós-processamento de um componente recombinante pode compreender a fragmentação (por exemplo, por meios químicos ou por exposição a enzimas protease (por exemplo, tripsina, pepsina, calmapepsina)), remoção de locais reativos (por exemplo, remoção de locais reativos de resíduos de metionina e/ou triptofano por oxidação), modulação (por exemplo, via estratégias químicas, fotoquímicas e/ou enzimáticas), ciclização, biotinilação (isto é, anexar biotina) e conjugação a outros elementos (por exemplo, polietilenoglicol, anticorpos, lipossomas, fosfolipídeos, DNA, RNA, ácidos nucléicos, açúcares, dissacarídeos, polissacarídeos, amidos, celulose, detergentes, paredes celulares).
[0191]O pós-processamento pode ocorrer de uma maneira aleatória ou de uma maneira específica do local (por exemplo, em grupos sufidrila de resíduos de cisteína (por exemplo, para aminoetilação, formação de iodoacetamidas, formação de maleimidas, formação de Dha, fixação covalente via ligações de dissulfeto e dessulfuração); grupos de amina primária de resíduos de lisina (por exemplo, para ligação de ésteres ativados, cloretos de sulfonil, isotiocianatos, ésteres de aldeído insaturados e aldeídos); grupos hidroxil fenólicos de resíduos de tirosina; remoção de epítopos específicos (por exemplo, grupos de glicano) que pode desencadear respostas imunes em seres humanos; azo-eletrociclização).
[0192]O pós-processamento pode alterar certas propriedades químicas e/ou físicas do componente recombinante, incluindo, mas não se limitando a tamanho, carga, hidrofobicidade, hidrofilicidade, solvatação, dobramento de proteína e reatividade química. Produto Alimentar Compreendendo Componente Recombinante
[0193]Em um outro aspecto, é fornecido neste documento um produto alimentar que compreende um componente recombinante (por exemplo, qualquer um dos componentes recombinantes divulgados aqui) produzido por uma célula hospedeira microbiana recombinante fornecida aqui, e que compreende uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui) em comparação com a atividade de esterase em um produto alimentar correspondente. O termo “produto alimentar” conforme usado aqui refere-se a um produto que pode ser ingerido por um ser humano ou um animal, incluindo um animal domesticado (por exemplo, cão, gato), animal de fazenda (por exemplo, vaca, porco, cavalo) e selvagem animal (por exemplo, animal predador não domesticado). O termo inclui produtos que podem ser combinados ou adicionados a um ou mais ingredientes para fazer um produto alimentar que pode ser ingerido por um ser humano ou um animal. Em várias modalidades, o produto alimentar aqui fornecido atende aos padrões de segurança alimentar exigidos pela Adiminstração de Alimento e Fármaco (FDA) dos EUA, pelo Departamento de Agricultura dos EUA, pela Autoridade Europeia de Segurança Alimentar e/ou outras agências reguladoras estaduais ou regionais de alimentos.
[0194]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento compreende pelo menos 0,000075 %, pelo menos 0,0001 %, 0,00025 %, pelo menos 0,0005 %, pelo menos 0,00075 %, pelo menos 0,001 %, pelo menos 0,0025 %, pelo menos 0,005 %, pelo menos 0,0075 %, pelo menos 0,01 %, pelo menos 0,025 %, pelo menos 0,05 %, pelo menos 0,075 %, pelo menos 0,1 %, pelo menos 0,25 %, pelo menos 0,5 %, pelo menos 0,75 %, pelo menos 1 %, pelo menos 2,5 %, pelo menos 5 %, pelo menos 7,5 %, pelo menos 10 %, pelo menos 12,5 %, pelo menos 15 %, pelo menos 17,5 %, pelo menos 20 %, pelo menos 22,5 %, pelo menos 25 %, pelo menos 27,5 %, pelo menos 30 %, pelo menos 32,5 %, pelo menos 35 %, pelo menos 37,5. %, pelo menos 40 %, pelo menos 42,5 %, pelo menos 45 %, pelo menos 47,5 %, pelo menos 50 %, pelo menos 52,5 %, pelo menos 55 %, pelo menos 57,5 %, pelo menos 60 %, pelo menos 62,5 %, pelo menos 65 %, pelo menos 67,5 %, pelo menos 70 %, pelo menos 72,5 %, pelo menos 75 %, pelo menos 77,5 %, pelo menos 80 %, pelo menos 82,5 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87,5 %, pelo menos 90 %, pelo menos 92,5 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97,5 % ou 100 % em peso de um ou mais componentes recombinantes (por exemplo, qualquer um dos componentes recombinantes divulgados aqui) produzidos por uma ou mais células hospedeiras microbianas recombinantes fornecidas aqui.
[0195]Em algumas modalidades, o produto alimentar é fornecido neste documento essencialmente livre de uma atividade de esterase (por exemplo, atividade de qualquer uma esterase divulgada aqui ou atividades de qualquer combinação de pelo menos duas esterases divulgadas aqui).
[0196]Em algumas modalidades, o produto alimentar é principalmente ou totalmente composto de componentes derivados de fontes não aninais. Em modalidades alternativas, o produto alimentar é composto de componentes parcialmente derivados de fontes animais, mas suplementados com componentes derivados de fontes não animais. Em algumas de tais modalidades, o produto alimentar compreende entre 5 % e 100 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % ou 10 %; entre 10 % e 100 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 % ou 20 %; entre 20 % e 100 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 % ou 30 %; entre 30 % e 100 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 % ou 40 %; entre 40 % e 100 %, 90 %, 80 %, 70 %, 60 % ou 50 %; entre 50 % e 100 %, 90 %, 80 %, 70 % ou 60 %; entre 60 % e 100 %, 90 %, 80 % ou 70 %; entre 70 % e 100 %, 90 % ou 80 %; entre 80 % e 100 % ou 90 %; ou entre 90 % e 100 % em peso de componentes derivados de fontes não aninais.
[0197]Em várias modalidades, o produto alimentar é um produto alimentar selecionado de qualquer uma das categorias de produtos alimentares definidas pelo Pesquisa Nacional de Exame de Saúde e Nutrição, ou se assemelha a esse produto alimentar (isto é, é um produto alimentar substituto).
[0198]Exemplos não limitativos de tais categorias de produtos alimentares (e exemplos não limitativos de tais produtos alimentares) incluem petiscos e gomas (por exemplo, petiscos em barra, bolachas, petiscos salgados de produtos de cereais, gomas de mascar); pães, grãos e massas (por exemplo, pães e pãezinhos de aveia, broa de milho, muffins de milho, tortilhas, farinha e misturas secas, biscoitos, pães e pãezinhos de grãos múltiplos, pães e pães de trigo integral, massas, pães de centeio e pãezinhos, trigo rachado pães e pãezinhos, pães brancos e pãezinhos); bebidas (por exemplo, cervejas e cervejas, concentrados de bebidas, bebidas, bebidas energéticas, bebidas esportivas, substitutos de fluidos, refrigerantes, bebidas carbonatadas, sucos, vinhos, coquetéis, bebidas nutricionais, pós nutricionais); doces e sobremesas (por exemplo, bolos, doces, batatas fritas, biscoitos, sapateiros, pastéis, gelados ou picolés, muffins, tortas, substitutos ou substitutos do açúcar, xaropes, mel, geleias, compotas, conservas, saladas, crepes, dinamarquês, doces de café da manhã, donuts); alimentos de pequeno-almoço (por exemplo, grãos de cereais, cereais, arroz, rabanada, panquecas, waffles, bolo de café); ovos (por exemplo, pratos de ovos, sopas de ovo, misturas feitas com claras de ovo, substitutos de ovo, misturas feitas com substitutos de ovo); lacticínios; molhos para salada, óleos, molhos, condimentos (por exemplo, gorduras para cozinhar, óleos vegetais, molhos para salada, molhos de tomate, molhos); batatas (por exemplo, salada de batata, sopas de batata, batatas fritas e palitos, batatas fritas, purê de batatas, batatas recheadas, folhados); e sopas (por exemplo, sopas de vegetais, caldos de vegetais), refeições, pratos principais, proteínas (por exemplo, substitutos de carne) e frutos do mar.
[0199]Em algumas de tais modalidades, o produto alimentar é fornecido neste documento um produto lácteo ou se assemelha a um produto lácteo (isto é, é um substituto do produto lácteo). O termo “produto lácteo”, tal como aqui usado, refere-se a leite (por exemplo, leite integral (pelo menos 3,25 % de gordura do leite), leite parcialmente desnatado (de 1 % a 2 % de gordura do leite), leite desnatado (menos de 0,2 % de gordura do leite), leite para cozinhar, leite condensado, leite aromatizado, leite de cabra, leite de ovelha, leite em pó, leite evaporado, espuma de leite) e produtos derivados do leite, incluindo, mas não se limitando a iogurte (por exemplo, iogurte de leite integral (pelo menos 6 gramas de gordura por 170 g), iogurte desnatado (entre 2 e 5 gramas de gordura por 170 g), iogurte desnatado (0,5 gramas ou menos de gordura por 170 g), iogurte grego (iogurte coado com o soro removido), iogurte batido, iogurte de leite de cabra, Labneh (labne), iogurte de leite de ovelha, bebidas à base de iogurte (por exemplo, Kefir de leite integral, Kefir de leite desnatado), Lassi), queijo (por exemplo, soro de leite, como ricota; queijo de pasta filata, como mussarela; semi - queijo macio, como Havarti e Muenster; queijo médio-duro, como Swiss e Jarlsberg; queijo duro, como Cheddar e Parmesão; queijo coalhado lavado, como Colby e Monterey Jack; amadurecimento macio queijo fresco, como Brie e Camembert; queijo fresco, como queijo cottage, queijo feta, queijo cremoso e requeijão; Queijo processado; alimentos com queijo processado; produto de queijo processado; pasta de queijo processado; queijo modulado por enzimas; queijo embalado a frio), molhos à base de leite (por exemplo, fresco, congelado, refrigerado ou estável), produtos para barrar lácteos (por exemplo, pasta com baixo teor de gordura, manteiga com baixo teor de gordura), nata (por exemplo, creme seco, creme light, chantilly, meio a meio, branqueador de café, creme de café, creme de leite, creme fraiche), confeitos congelados (por exemplo, sorvete, smoothie, milk shake, iogurte congelado, sundae, gelato, creme), sobremesas lácteas (por exemplo, fresco, refrigerado ou congelado), manteiga (por exemplo, manteiga batida, manteiga de cultura), laticínios em pó (por exemplo, leite em pó integral, leite em pó desnatado, leite em pó com gordura (isto é, leite em pó compreendendo gordura vegetal no local de toda ou alguma gordura animal), fórmula infantil, concentrado de proteína do leite (isto é, teor de proteína de pelo menos 80 % em peso), isolado de proteína de leite (isto é, teor de proteína de pelo menos 90 % em peso), concentrado de proteína de soro de leite, soro de leite isolado de proteína, concentrado de proteína de soro de leite desmineralizado, concentrado de proteína de soro de leite desmineralizado, concentrado de β- lactoglobulina, isolado de β-lactoglobulina, concentrado de α-lactalbumina, isolado de α-lactalbumina, concentrado de glicomacropeptídeo, isolado de glicomacropeptídeo, concentrado de caseína, isolado de caseína, suplementos nutricionais, misturas de texturização, misturas de aromatizantes, misturas de corantes), produtos prontos para beber ou prontos para misturar (por exemplo, produtos frescos, bebidas de proteína láctea refrigeradas ou estáveis em prateleira, bebidas para perder peso, bebidas nutricionais, bebidas de recuperação esportiva e bebidas energéticas), pudins, géis, mastigáveis, batatas fritas e barras.
[0200]O termo “substituto do produto alimentar” (por exemplo, “substituto do produto lácteo”) conforme usado neste documento refere-se a um produto alimentar que se assemelha a um produto alimentar convencional (por exemplo, pode ser usado no lugar do produto alimentar convencional). Essa semelhança pode ser devida a qualquer atributo físico, químico ou funcional. Em algumas modalidades, a semelhança do produto alimentar aqui fornecido com um produto alimentar convencional é devido a um atributo físico.
Exemplos não limitativos de atributos físicos incluem cor, forma, características mecânicas (por exemplo, dureza, valor do módulo de armazenamento G’, retenção de forma, coesão, textura (isto é,
características mecânicas que estão correlacionadas com percepções sensoriais (por exemplo, sensação na boca, gordura, cremosidade, homogeneização, riqueza, suavidade, espessura), viscosidade e cristalinidade.
Em algumas modalidades, a semelhança do produto alimentar aqui fornecido e de um produto alimentar convencional é devido a um atributo químico/biológico.
Exemplos não limitativos de atributos químicos incluem teor dos nutrientes (por exemplo, tipo e/ou quantidade de aminoácidos (por exemplo, pontuação PDCAAS), tipo e/ou quantidade de lipídeos,
tipo e/ou quantidade de carboidratos, tipo e/ou quantidade de minerais, tipo e/ou quantidade de vitaminas, pH, digestibilidade, vida útil, regulação da fome e/ou saciedade, sabor e aroma.
Em algumas modalidades, a semelhança do produto alimentar aqui fornecido com um produto alimentar convencional é devido a um atributo funcional.
Exemplos não limitativos de atributos funcionais incluem comportamento de gelificação/aglutinação (por exemplo, capacidade de gelificação (isto é, o tempo necessário para formar um gel isto é, uma rede de proteínas com espaços preenchidos com solvente ligado por ligações de hidrogênio às moléculas de proteína) de força máxima em resposta a uma condição física e/ou química (por exemplo, agitação, temperatura, pH, força iônica, concentração de proteína,
concentração de açúcar, força iônica)), capacidade de aglutinação (isto é, capacidade de formar um precipitado (isto é, uma rede protéica rígida baseada em fortes interações entre moléculas de proteína e exclusão de solvente) em resposta a uma condição física e/ou química), força do gel (isto é, força do gel formado, medida em força/unidade de área (por exemplo, pascal (Pa))), capacidade de retenção da água após gelificação, sinérese após gelificação (isto é, água escorrendo ao longo do tempo)), comportamento de formação de espuma (por exemplo, capacidade de formação de espuma (isto é, quantidade de ar retido em resposta a uma condição física e/ou química), estabilidade da espuma (isto é, meia-vida da espuma formada em resposta a uma condição física e/ou química), infiltração de espuma), capacidade de espessamento, versatilidade de uso (isto é, capacidade de usar o produto alimentar em uma variedade de maneiras e/ou derivar uma diversidade de outras composições do produto alimentar; por exemplo, capacidade de produzir produtos alimentares que se assemelham a produtos derivados do leite, como iogurte, queijo, creme e manteiga) e capacidade de formar dímeros de proteína.
[0201]Em várias modalidades, o produto alimentar é fornecido neste documento um substituto do leite (isto é, se assemelha ao leite), substituto do iogurte (isto é, se assemelha ao iogurte), substituto do queijo (isto é, se assemelha ao queijo), substituto da sobremesa congelada (isto é, se assemelha a uma sobremesa congelada (por exemplo, sorvete)), ou qualquer outro substituto de produtos lácteos (isto é, se assemelha a um produto lácteo (por exemplo, qualquer produto lácteo divulgado aqui)). Componente de Proteína do Leite
[0202]Em algumas modalidades, o produto alimentar (por exemplo, produto lácteo, produto do ovo) compreende um componente de proteína do leite, em que o componente de proteína do leite compreende uma proteína recombinante do leite e uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de uma esterase em comparação com a atividade de esterase de um componente de proteína do leite que não é produzido de acordo com um método fornecido neste documento (isto é, não é produzido por um método que compreende pelo menos uma etapa em que atividade de uma esterase é essencialmente eliminada ou modulada). O termo “componente de proteína do leite” conforme usado neste documento refere-se a um componente que consiste em um subconjunto de proteínas do soro do leite ou um subconjunto de caseínas ou uma mistura de um subconjunto de proteínas do soro do leite e um subconjunto de caseínas (isto é, de apenas algumas, mas não todas as proteínas presentes em um concentrado de proteína de soro de leite ou um concentrado de caseína micelar, ou um caseinato de sódio, ou uma caseína ácida, ou um concentrado de proteína do leite ou isolado de proteína do leite). O termo implica, além disso, que as proteínas do leite no componente de proteína do leite são as únicas proteínas do leite compreendidas no produto alimentar (isto é, o produto alimentar não compreende outras proteínas do leite além das proteínas do leite de que consiste o componente da proteína do leite).
[0203]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento compreende entre 0,1 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 % ou 0,2 %; entre 0,2 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 % ou 0,3 %; entre 0,3 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 % ou 0,4 %; entre 0,4 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 % ou 0,5 %; entre 0,5 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 % ou 0,6 %; entre 0,6 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %,
8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 % ou 0,7 %; entre 0,7 % e 100 %,
95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 % ou 0,8 %; entre 0,8 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %,
70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % ou 0,9 %; entre 0,9 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %,
6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % ou 1 %; entre 1 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %,
70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 % ou 2 %; entre 2 % e 100 %,
95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %
ou 3 %; entre 3 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9
%, 8 %, 7 %, 6 %, 5 % ou 4 %; entre 4 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70
%, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 % ou 5 %; entre 5 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %,
80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 % ou 6 %; entre 6 % e 100 %, 95 %,
90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25
%, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 % ou 7 %; entre 7 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30
%, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 % ou 8 %; entre 8 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %,
30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 % ou 9 %; entre 9 % e 100 %,
95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30
%, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 % ou 10 %; entre 10 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 % ou 11 %; entre 11 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 %, 13 % ou 12 %; entre 12 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 14 % ou 13 %; entre 13 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 % ou 14 %; entre 14 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 % ou 15 %; entre 15 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 % ou 20 %; entre 20 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 % ou 25 %; entre 25 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 % ou 30 %; entre 30 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 % ou 35 %; entre 35 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 % ou 40 %; entre 40 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 % ou 45 %; entre 45 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 % ou 50 %; entre 50 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 % ou 55 %; entre 55 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 % ou 60 %; entre 60 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 % ou 65 %; entre 65 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % ou 70 %; entre 70 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 % ou 75 %; entre 75 % e 100 %, 95 %, 90 %, 85 % ou 80 %; entre 80 % e 100 %, 95 %, 90 % ou 85 %; ou entre 85 % e 100 %, 95 %, 90 %; entre 90 % e 100 % ou 95 % ou entre 95 % e 100 % em peso do componente de proteína do leite.
[0204]O componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido neste documento pode consistir em uma ou mais proteínas do leite (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou mais) (por exemplo, uma ou mais proteínas do soro do leite, uma ou mais caseínas, ou uma mistura de uma ou mais proteínas do soro do leite e uma ou mais caseínas), em que pelo menos uma das proteínas do leite é uma proteína recombinante do leite (por exemplo, qualquer um da proteínas recombinantes do leite divulgado aqui) produzida por uma célula hospedeira microbiana recombinante.
[0205]Em algumas modalidades, o componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido neste documento consiste em uma ou mais proteínas do soro do leite (por exemplo, duas, três, quatro, ou mais) (por exemplo, uma β-lactoglobulina, uma α-lactalbumina, uma mistura de uma β- lactoglobulina e uma α-lactalbumina, uma mistura de duas ou mais β-lactoglobulina tendo diferente modificação pós-tradução (PTMs), uma mistura de duas ou mais α- lactalbumina tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais β-lactoglobulina tendo diferentes PTMs e uma α-lactalbumina, uma mistura de duas ou mais α- lactalbumina tendo diferentes PTMs e uma β-lactoglobulina, uma mistura de duas ou mais β-lactoglobulina tendo diferentes PTMs e uma mistura de duas ou mais α- lactalbumina tendo diferentes PTMs); uma ou mais caseínas (por exemplo, duas, três, quatro, ou mais) (por exemplo, uma κ-caseína, uma β-caseína, uma γ-caseína, uma mistura de uma κ-caseína e uma β-caseína, uma mistura de uma κ-caseína e uma γ- caseína, uma mistura de uma β-caseína e uma γ-caseína, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais β-caseínas tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais γ-caseínas tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas tendo diferentes PTMs e uma β- caseína, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas tendo diferentes PTMs e uma γ- caseína, uma mistura de duas ou mais β-caseínas tendo diferentes PTMs e uma κ- caseína, uma mistura de duas ou mais β-caseínas tendo diferentes PTMs e uma γ- caseína, uma mistura de duas ou mais γ-caseínas tendo diferentes PTMs e uma κ-
caseína, uma mistura de duas ou mais γ-caseínas tendo diferentes PTMs e uma β- caseína, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas tendo diferentes PTMs e/ou duas ou mais β-caseínas tendo diferentes PTMs e/ou duas ou mais γ-caseínas tendo diferentes PTMs); ou qualquer combinação das mesmas.
[0206]A pelo menos uma proteína recombinante do leite pode ser uma proteína recombinante do leite única. A proteína recombinante do leite única pode ser uma única proteína recombinante do soro de leite (por exemplo, uma β-lactoglobulina recombinante ou uma α-lactalbumina recombinante) ou uma única caseína recombinante (por exemplo, uma κ-caseína recombinante ou uma β-caseína recombinante ou uma γ-caseína recombinante). Alternativamente, a pelo menos uma proteína recombinante do leite pode ser duas ou mais proteínas recombinantes do leite. As duas ou mais proteínas recombinantes do leite podem ser duas ou mais proteína recombinante do soro de leites (por exemplo, uma β-lactoglobulina recombinante e uma α-lactalbumina recombinante), duas ou mais recombinante caseínas (por exemplo, uma κ-caseína recombinante e uma β-caseína recombinante, uma κ-caseína recombinante e uma γ-caseína recombinante, uma κ-caseína recombinante e uma β-caseína recombinante e uma γ-caseína recombinante), ou uma mistura de pelo menos uma proteína recombinante do soro de leite e pelo menos uma caseína recombinante (por exemplo, uma ou ambas de uma β-lactoglobulina recombinante e uma α-lactalbumina recombinante em combinação com uma ou duas ou todas de uma κ-caseína recombinante e uma β-caseína recombinante e uma γ- caseína recombinante).
[0207]Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína recombinante do leite compreende pelo menos uma proteína recombinante do leite que tem uma PTM. Em várias tais modalidades, a PTM pode ser uma PTM nativa, uma PTM não nativa, ou uma mistura dos mesmos. Em algumas modalidades, o tipo e/ou número de PTMs da proteína recombinante do leite conferem um atributo desejável no produto alimentar fornecido neste documento.
[0208]Em algumas modalidades, o componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido neste documento compreende uma ou mais proteínas recombinantes do soro de leite (por exemplo, duas, três, quatro, ou mais) (por exemplo, uma β-lactoglobulina recombinante, uma α-lactalbumina recombinante, uma mistura de uma β-lactoglobulina recombinante e uma α- lactalbumina recombinante, uma mistura de duas ou mais β-lactoglobulinas recombinantes tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais α-lactalbuminas recombinantes tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais β-lactoglobulinas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma α-lactalbumina recombinante, uma mistura de duas ou mais α-lactalbuminas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma β-lactoglobulina, uma mistura de duas ou mais β-lactoglobulinas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma mistura de duas ou mais α-lactalbuminas recombinantes tendo diferentes PTMs); uma ou mais caseínas recombinantes (por exemplo, duas, três, quatro, ou mais) (por exemplo, uma κ-caseína recombinante, uma β-caseína recombinante, uma γ-caseína recombinante, uma mistura de uma κ-caseína recombinante e uma β-caseína recombinante, uma mistura de uma κ-caseína recombinante e uma γ-caseína recombinante, uma mistura de uma β-caseína recombinante e uma γ-caseína recombinante, uma mistura de duas ou mais κ- caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais β- caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais γ- caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais κ- caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma β-caseína recombinante, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma γ- caseína, uma mistura de duas ou mais β-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma κ-caseína recombinante, uma mistura de duas ou mais β-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma γ-caseína, uma mistura de duas ou mais γ-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma κ-caseína recombinante, uma mistura de duas ou mais γ-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma β-caseína, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e/ou duas ou mais β-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e/ou duas ou mais γ-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs); ou qualquer combinação das mesmas.
[0209]Em algumas modalidades, o componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido neste documento consiste em uma ou mais proteínas recombinantes do soro de leite (por exemplo, duas, três, quatro, ou mais) (por exemplo, uma β-lactoglobulina recombinante, uma α-lactalbumina recombinante, uma mistura de uma β-lactoglobulina recombinante e uma α- lactalbumina recombinante, uma mistura de duas ou mais β-lactoglobulinas recombinantes tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais α-lactalbuminas recombinantes tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais β-lactoglobulinas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma α-lactalbumina recombinante, uma mistura de duas ou mais α-lactalbuminas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma β-lactoglobulina, uma mistura de duas ou mais β-lactoglobulinas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma mistura de duas ou mais α-lactalbuminas recombinantes tendo diferentes PTMs); uma ou mais caseínas recombinantes (por exemplo, duas, três, quatro, ou mais) (por exemplo, uma κ-caseína recombinante, uma β-caseína recombinante, uma γ-caseína recombinante, uma mistura de uma κ-caseína recombinante e uma β-caseína recombinante, uma mistura de uma κ-caseína recombinante e uma γ-caseína recombinante, uma mistura de uma β-caseína recombinante e uma γ-caseína recombinante, uma mistura de duas ou mais κ- caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais β- caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais γ-
caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais κ- caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma β-caseína recombinante, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma γ- caseína, uma mistura de duas ou mais β-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma κ-caseína recombinante, uma mistura de duas ou mais β-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma γ-caseína, uma mistura de duas ou mais γ-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma κ-caseína recombinante, uma mistura de duas ou mais γ-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e uma β-caseína, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e/ou duas ou mais β-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs e/ou duas ou mais γ-caseínas recombinantes tendo diferentes PTMs); ou qualquer combinação das mesmas.
[0210]O componente de proteína do leite pode ainda compreender uma ou mais proteínas do leite nativas. Em algumas modalidades, o componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido aqui compreende uma ou mais proteínas do soro do leite nativas (por exemplo, duas, três, quatro, ou mais) (por exemplo, uma β-lactoglobulina nativa, uma α-lactalbumina nativa, uma mistura de uma β-lactoglobulina nativa e uma α-lactalbumina nativa, uma mistura de duas ou mais β- lactoglobulina nativa tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais α- lactalbumina nativa tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais β- lactoglobulina nativa tendo diferentes PTMs e uma α-lactalbumina nativa, uma mistura de duas ou mais α-lactalbumina nativa tendo diferentes PTMs e uma β-lactoglobulina nativa, uma mistura de duas ou mais β-lactoglobulina nativa tendo diferentes PTMs e uma mistura de duas ou mais α-lactalbumina nativa tendo diferentes PTMs); uma ou mais caseínas nativas (por exemplo, duas, três, quatro, ou mais) (por exemplo, uma κ-caseína nativa, uma β-caseína nativa, uma γ-caseína nativa, uma mistura de uma κ-caseína nativa e uma β-caseína nativa, uma mistura de uma κ-caseína nativa e uma γ-caseína nativa, uma mistura de uma β-caseína nativa e uma γ-caseína nativa, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas nativa tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais β-caseínas nativa tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais γ-caseínas nativa tendo diferentes PTMs, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas nativa tendo diferentes PTMs e uma β-caseína nativa, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas nativa tendo diferentes PTMs e uma γ-caseína nativa, uma mistura de duas ou mais β-caseínas nativa tendo diferentes PTMs e uma κ-caseína nativa, uma mistura de duas ou mais β-caseínas nativa tendo diferentes PTMs e uma γ-caseína nativa, uma mistura de duas ou mais γ-caseínas nativa tendo diferentes PTMs e uma κ-caseína nativa, uma mistura de duas ou mais γ-caseínas nativa tendo diferentes PTMs e uma β-caseína nativa, uma mistura de duas ou mais κ-caseínas nativa tendo diferentes PTMs e/ou duas ou mais β-caseínas nativa tendo diferentes PTMs e/ou duas ou mais γ-caseínas nativa tendo diferentes PTMs); de qualquer combinação das mesmas.
[0211]Em algumas de tais modalidades, o componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido neste documento consiste em proteína do soro do leite e caseína em uma proporção em peso entre cerca de 10 a cerca de 1 e cerca de 1 a cerca de 10 (por exemplo, cerca de 10 a 1, cerca de 9 a 1, cerca de 8 a 1, cerca de 7 a 1, cerca de 6 a 1, cerca de 5 a 1, cerca de 4 a 1, cerca de 3 a 1, cerca de 2 a 1, cerca de 1 a 1, cerca de 1 a 2, cerca de 1 a 3, cerca de 1 a 4, cerca de 1 a 5, cerca de 1 a 6, cerca de 1 a 7, cerca de 1 a 8, cerca de 1 a 9, ou cerca de 1 a 10).
[0212]Em algumas de tais modalidades, o componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido neste documento consiste em proteína recombinante do soro de leite e proteína do soro do leite nativa em uma proporção em peso entre cerca de 10 a cerca de 1 e cerca de 1 a cerca de 10 (por exemplo, cerca de 10 a 1, cerca de 9 a 1, cerca de 8 a 1, cerca de 7 a 1, cerca de 6 a 1, cerca de 5 a
1, cerca de 4 a 1, cerca de 3 a 1, cerca de 2 a 1, cerca de 1 a 1, cerca de 1 a 2, cerca de 1 a 3, cerca de 1 a 4, cerca de 1 a 5, cerca de 1 a 6, cerca de 1 a 7, cerca de 1 a 8, cerca de 1 a 9, ou cerca de 1 a 10).
[0213]Em algumas de tais modalidades, o componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido neste documento consiste em caseína recombinante e caseína nativa em uma proporção em peso entre cerca de 10 a cerca de 1 e cerca de 1 a cerca de 10 (por exemplo, cerca de 10 a 1, cerca de 9 a 1, cerca de 8 a 1, cerca de 7 a 1, cerca de 6 a 1, cerca de 5 a 1, cerca de 4 a 1, cerca de 3 a 1, cerca de 2 a 1, cerca de 1 a 1, cerca de 1 a 2, cerca de 1 a 3, cerca de 1 a 4, cerca de 1 a 5, cerca de 1 a 6, cerca de 1 a 7, cerca de 1 a 8, cerca de 1 a 9, ou cerca de 1 a 10).
[0214]Em algumas de tais modalidades, o componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido neste documento consiste em proteína recombinante do soro de leite e caseína recombinante em uma proporção em peso entre cerca de 10 a cerca de 1 e cerca de 1 a cerca de 10 (por exemplo, cerca de 10 a 1, cerca de 9 a 1, cerca de 8 a 1, cerca de 7 a 1, cerca de 6 a 1, cerca de 5 a 1, cerca de 4 a 1, cerca de 3 a 1, cerca de 2 a 1, cerca de 1 a 1, cerca de 1 a 2, cerca de 1 a 3, cerca de 1 a 4, cerca de 1 a 5, cerca de 1 a 6, cerca de 1 a 7, cerca de 1 a 8, cerca de 1 a 9, ou cerca de 1 a 10).
[0215]Em algumas de tais modalidades, o componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido neste documento consiste em proteína do soro do leite nativa e caseína nativa em uma proporção em peso entre cerca de 10 a cerca de 1 e cerca de 1 a cerca de 10 (por exemplo, cerca de 10 a 1, cerca de 9 a 1, cerca de 8 a 1, cerca de 7 a 1, cerca de 6 a 1, cerca de 5 a 1, cerca de 4 a 1, cerca de 3 a 1, cerca de 2 a 1, cerca de 1 a 1, cerca de 1 a 2, cerca de 1 a 3, cerca de 1 a 4, cerca de 1 a 5, cerca de 1 a 6, cerca de 1 a 7, cerca de 1 a 8, cerca de 1 a 9, ou cerca de 1 a 10).
[0216]Em algumas de tais modalidades, o componente de proteína do leite compreendido no produto alimentar fornecido neste documento consiste em proteína recombinante do leite e nativa proteína do leite em uma proporção em peso entre cerca de 10 a cerca de 1 e cerca de 1 a cerca de 10 (por exemplo, cerca de 10 a 1, cerca de 9 a 1, cerca de 8 a 1, cerca de 7 a 1, cerca de 6 a 1, cerca de 5 a 1, cerca de 4 a 1, cerca de 3 a 1, cerca de 2 a 1, cerca de 1 a 1, cerca de 1 a 2, cerca de 1 a 3, cerca de 1 a 4, cerca de 1 a 5, cerca de 1 a 6, cerca de 1 a 7, cerca de 1 a 8, cerca de 1 a 9, ou cerca de 1 a 10).
[0217]Em todas as modalidades, o componente de proteína do leite consiste em um único subconjunto de proteínas do soro do leite, ou de um subconjunto de caseínas, ou de uma mistura de um subconjunto de proteínas do soro do leite e um subconjunto de caseínas. Em algumas modalidades, o subconjunto de proteínas do soro do leite consiste em uma β-lactoglobulina e/ou uma α-lactalbumina. Em algumas modalidades, o subconjunto de caseínas consiste em uma κ-caseína e/ou uma β- caseína e/ou uma γ-caseína. Em várias modalidades, a mistura de um subconjunto de proteínas do soro do leite e um subconjunto de caseínas consiste em uma β- lactoglobulina e/ou uma α-lactalbumina em combinação com uma κ-caseína e/ou uma β-caseína e/ou uma γ-caseína. Em algumas de tais modalidades, a mistura consiste em uma β-lactoglobulina e uma κ-caseína. Em outras tais modalidades, a mistura consiste em uma α-lactalbumina e uma κ-caseína. Em ainda outras tais modalidades, a mistura consiste em uma β-lactoglobulina e uma α-lactalbumina e uma κ-caseína. Componente de Proteína não Láctea
[0218]Em algumas modalidades, o produto alimentar (por exemplo, produto lácteo, produto do ovo) compreende um componente de proteína não láctea, em que o componente de proteína não láctea compreende uma proteína não láctea recombinante e uma atividade essencialmente eliminada ou modulada de uma esterase em comparação com a atividade de esterase de um componente de proteína não láctea que não é produzido de acordo com um método fornecido neste documento (isto é, não é produzido por um método que compreende pelo menos uma etapa em que a atividade de uma esterase é essencialmente eliminada ou modulada).
[0219]O componente de proteína não láctea compreendido no produto alimentar fornecido neste documento pode compreender proteínas não lácteas derivadas de qualquer fonte, bem como misturas de proteínas não lácteas derivadas de várias fontes. Exemplos não limitativos de tais fontes incluem animais, plantas, algas, fungos, e micróbios.
[0220]Exemplos não limitativos de animais incluem insetos (por exemplo, mosca), mamíferos (por exemplo, vaca, ovelha, cabra, coelho, porco, ser humano), e pássaros (por exemplo, galinha).
[0221]Exemplos não limitativos de plantas incluem cicadáceas, ginkgo biloba, coníferas, cipreste, zimbros, thuja, cedro, pinheiros, angelica, cominho, coentro, cominho, erva-doce, salsa, endro, dente de leão, helichrysum, calêndula, artemísia, cártamo, camomila, alface, absinto, calêndula, citronela, sálvia, tomilho, semente de chia, mostarda, azeitona, café, pimentão, berinjela, páprica, amora, kiwi, vegetais (por exemplo, cenoura, aipo), tagetes, atanásia, estragão, girassol, gaultéria, manjericão, hissopo, lavanda, verbena limão, manjerona, melissa, patchouli, poejo, hortelã- pimenta, alecrim, gergelim, hortelã, prímula, sâmara, pimenta, pimentão, batata, batata doce, tomate, mirtilo, solanácea, petúnia, ipomeia, lilás, jasmim, madressilva, snapdragon, psílio, minhoca, trigo sarraceno, amaranto, acelga, quinua, espinafre, ruibarbo, jojoba, cypselea, chlorella, marula, avelã, canola, couve, chicória, rutabaga, incenso, mirashrh, elemi, cânhamo, abóbora, abóbora, curcurbit, mandioca, dalbergia, plantas leguminaosas (por exemplo, alfafa, lentilhas, feijão, trevos, ervilhas, fava coceira, frijole bola roja, frijole negro, lespedeza, alcaçuz, tremoço, algaroba, alfarroba, soja, amendoim, tamarindo, glicínia, cássia, grão de bico/garbanzo, feno- grego, ervilha verde, ervilha amarela, ervilha, feijão, feijão fava), gerânio, linho, romã,
algodão, quiabo, nim, figo, amora, cravo, eucalipto, árvore do chá, niaouli, plantas frutíferas (por exemplo, maçã, damasco, pêssego, ameixa, pêra, nectarina), morango, amora, framboesa, cereja, ameixa, rosa, tangerina, frutas cítricas (por exemplo, toranja, limão, lima, laranja, laranja amarga, tangerina), manga, bergamota cítrica, buchu, uva, brócolis, bruxelas, couve, camelina, couve-flor, couve nabiça, colza (canola), nabo, repolho, pepino, melancia, melão, abobrinha, vidoeiro, noz, mandioca, baobá, pimenta da Jamaica, amêndoa, fruta-pão, sândalo, macadâmia, taro, tuberosa, aloe vera, alho, cebola, chalota, baunilha, iúca, vetiver, galanga, cevada, milho, curcuma aromatica, gengibre, capim-limão, aveia, palma, abacaxi, arroz, centeio, sorgo, triticale, cúrcuma, inhame, bambu, cevada, cajuput, canna, cardamomo, milho, aveia, trigo, canela, sassafrás, benjoim de lindera,, louro, abacate, ylang-ylang, maça, noz-moscada, moringa, rabo de cavalo, orégano, coentro, cerefólio, cebolinha, frutas agregadas, grãos, plantas herbáceas, vegetais folhosos, leguminaosas não-grãos, plantas de nozes, plantas suculentas, plantas terrestres, plantas aquáticas, delbergia, painço, drupas, esquizocarpos, plantas com flores, plantas sem flores, plantas cultivadas, plantas selvagens, árvores, arbustos, flores, gramíneas, plantas herbáceas, escovas, lianas, cactos, plantas tropicais, plantas subtropicais, plantas temperadas, e derivados e cruzamentos dos mesmos.
[0222]Exemplos não limitativos de algas incluem algas verdes (por exemplo, Chlorella vulgaris, Chlorealla pyrenoidosa), algas marrons (por exemplo, Alaria marginata, Analipus japonicus, Ascophyllum nodosum, Ecklonia sp, Eisenia bicyclis, Hizikia fusiforme, Kjellmaniella gyrata, Laminaria angustata, Laminaria longirruris, Laminaria Longissima, Laminaria ochotensis, Laminaria claustonia, Laminaria saccharina, Laminaria digitata, Laminaria japonica, Macrocystis pyrifera, Petalonia fascia, Scytosiphon lome), alga vermelha (por exemplo, Chondrus crispus, Chondrus ocellatus, Eucheuma cottonii, Eucheuma spinosum, Furcellaria fastigiata, Gracilaria bursa-pastoris, Gracilaria lichenoides, Gloiopeltis furcata, Gigartina acicularis,
Gigartina bursa-pastoris, Gigartina pistillata, Gigartina radula, Gigartina skottsbergii, Gigartina stellata, Palmaria palmata, Porphyra columbina, Porphyra crispata, Porhyra deutata, Porhyra perforata, Porhyra suborbiculata, Porphyra tenera, Porphyridium cruentum, Porphyridium purpureum, Porphyridium aerugineum, Rhodella maculate, Rhodella reticulata, Rhodella violacea, Rhodymenia palmata), e derivados e cruzamentos dos mesmos.
[0223]Exemplos não limitativos de fungos incluem Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus oryzae, Candida albicans, Candida etchellsii, Candida guilliermondii, Candida humilis, Candida lipolitica, Candida pseudotropicalis, Candida utilis, Candida versatilis, Chrysosporium lucknowense, Debaryomyces hansenii, Endothia parasitica, Eremothecium ashbyii, Fusarium gramineum, Fusarium moniliforme, Fusarium venenatum, Hansenula polimorpha, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Kluyveromyces thermotolerans, Morteirella vinaceae var. raffinoseutilizer, Mucor miehei, Mucor miehei var. Cooney et Emerson, Mucor pusillus Lindt, Myceliophthora thermophile, Neurospora crassa, Penicillium roquefortii, Physcomitrella patens, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta, Ogataea minuta, Pichia lindneri, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia metanolica, Rhizopus niveus, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces beticus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces pombe, Saccharomyces sake, Saccharomyces uvarum, Sporidiobolus johnsonii, Sporidiobolus salmonicolor, Sporobolomyces roseus, Trichoderma reesei, Xanthophyllomyces dendrorhous, Yarrowia lipolitica, Zygosaccharomyces rouxii, e derivados e cruzamentos dos mesmos.
[0224]Exemplos não limitativos de micróbios incluem firmicutes, cianobactérias (algas azuis-verdes), oscillatoriophcideae, bacillales, lactobacillales, oscillatoriales, bacillaceae, lactobacillaceae, Acetobacter suboxidans, Acetobacter xylinum, Actinoplane missouriensis, Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, Bacillus cereus, Bacillus coagulans, Bacillus subtilus, Bacillus cerus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Lactobacilo acidophilus, Lactobacilo bulgaricus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis Lancefield Grupo N, Lactobacilo reuteri, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc mesenteroides, Micrococcus lysodeikticus, Spirulina, Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus lactis subspecies diacetylactis, Streptococcus thermophilus, Streptomyces chattanoogensis, Streptomyces griseus, Streptomyces natalensis, Streptomyces olivaceus, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces rubiginosus, Tetrahymena thermophile, Tetrahymena hegewischi, Tetrahymena hyperangularis, Tetrahymena malaccensis, Tetrahymena pigmentosa, Tetrahymena pyriformis, Tetrahymena vorax, Xanthomonas campestris, e derivados e cruzamentos dos mesmos.
[0225]Em algumas modalidades, a proteína não láctea é uma proteína animal. Exemplos não limitativos de tais proteínas incluem colágeno.
[0226]Em algumas modalidades, a proteína não láctea é uma proteína vegetal. Exemplos não limitativos de tais proteínas não lácteas vegetais incluem proteínas de ervilha e proteínas da batata.
[0227]Em algumas modalidades, a proteína não láctea é uma proteína fúngica. Exemplos não limitativos de tais proteínas incluem glucoamilase, xilanase, amilase, glucanase, membro da família SUN (Sim1p, Uth1p, Nca3p, Sun4p), fator de alongamento 1-alfa, leucil-tRNA sintetase mitocondrial, alfa-amilase, alfa- galactosidase, celulase, endo-1,4-beta-xilanase, endoglucanase, exo-1,4-beta- xilosidase, glucoamilase, peptidase, aspergilopepsina-1, 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolase A, alfa-galactosidase A, alfa-galactosidase B, alfa-galactosidase D, alfa-glucuronidase A, beta-galactosidase C, glucano 1,3-beta-glucosidase A, hidrofobina e glucano endo-1,3-beta-glucosidase eglC.
[0228]Em algumas modalidades, a proteína não láctea é derivada de uma proteína não-láctea que é secretada por uma célula hospedeira (por exemplo, qualquer uma das células animais, vegetais, algas, fúngicas ou microbianas nativas ou recombinantes aqui divulgadas). Proteínas não lácteas segregadas adequadas podem ser identificadas, por exemplo, pela obtenção de um secretoma (isto é, proteínas segregadas, obtidas, por exemplo, por cultura de células animais, vegetais, algas, fúngicas ou microbianas em cultura líquida, removendo as células do cultura de células (por exemplo, por centrifugação) e, opcionalmente, concentrando o meio de cultura restante; ou por sequenciamento de genomas e identificação in silico de proteínas secretadas (ver, por exemplo, Mattanovich et al. 2009. Microbial Cell Factories 8:29), extratos de células inteiras ou extratos de células inteiras fracionados; opcionalmente digerir parcialmente, glicosilar, fosforilar ou de outra forma tratar enzimaticamente as proteínas; e, em seguida, rastreá-los em ensaios (por exemplo, ensaios de alto rendimento), por exemplo, para proteínas que têm propriedades semelhantes, idênticas ou diferentes em comparação com as proteínas do leite).
Proteínas não lácteas segregadas adequadas também podem ser identificadas por triagem de frações enriquecidas em cálcio de proteínas de soja, por exemplo, para proteínas que têm propriedades semelhantes, idênticas ou diferentes em comparação com proteínas do leite. Exemplos não limitativos de proteínas não lácteas segregadas adequadas são fornecidos no pedido PCT PCT/US2017/48730 depositado em 25 de agosto de 2017. Em algumas modalidades, a proteína não láctea é uma proteína fúngica secretada (ou seja, uma proteína que é secretada por um fungo (por exemplo, qualquer um dos fungos aqui divulgados)).
[0229]Em algumas modalidades, o componente de proteína não láctea compreende uma proteína não láctea recombinante. Em algumas dessas modalidades, a proteína recombinante não láctea tem uma PTM não nativa e/ou não tem um epítopo que pode desencadear uma resposta imune em um ser humano ou animal. Outros Componentes
[0230]O produto alimentar fornecido neste documento pode ainda compreender um ou mais outros componentes. Por exemplo, em algumas modalidades o produto alimentar fornecido aqui compreende ainda um lipídeo.
Exemplos não limitativos de lipídeos incluem lipídeos selecionado a partir do grupo que consiste em gorduras, óleos, monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos, fosfolipídeos, e ácidos graxos livres.
[0231]Exemplos não limitativos de óleos incluem óleos vegetais (por exemplo, óleo de girassol, óleo de coco, óleo de mostarda, óleo de amendoim, óleo de canola, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de linhaça, azeite, óleo de palma, óleo de colza, cártamo óleo, óleo de gergelim, óleo de soja, óleo de amêndoa, óleo de noz de faia, óleo de castanha do Brasil, óleo de caju, óleo de avelã, óleo de macadâmia, óleo de noz mongongo, óleo de noz-pecã, óleo de pinhão, óleo de pistache, óleo de noz, óleo de abacate, óleo de uva), óleos derivados de micróbios, óleos derivados de algas, óleos derivados de fungos, óleos de animais marinhos (por exemplo, óleo de peixe do Atlântico, óleo de peixe do Pacífico, óleo de peixe mediterrâneo, óleo de peixe prensado leve, óleo de peixe alcalino tratado, óleo de peixe tratado termicamente, óleo de peixe marrom leve e pesado, óleo de bonito, óleo de sardinha, óleo de atum, óleo de robalo, óleo de halibute, óleo de spearfish, óleo de barracuda, óleo de bacalhau, óleo de menhaden, óleo de sardinha, óleo de anchova, óleo de capelim, óleo de bacalhau do Atlântico, Óleo de arenque do Atlântico, óleo de cavala do Atlântico, óleo de menhaden do Atlântico, óleo de salmonídeo e óleo de tubarão, óleo de lula, óleo de choco, óleo de polvo, óleo de krill, óleo de foca, óleo de baleia), óleos não essenciais, óleos essenciais, óleos naturais, óleos não hidrogenados, óleos parcialmente hidrogenados, óleos hidrogenados (por exemplo, óleo de coco hidrogenado), óleos brutos, semi-refinados (também chamados de alcalinos óleos refinados), óleos interesterificados e óleos refinados. Em algumas modalidades, óleos de cadeia mais longa (por exemplo, óleo de girassol, óleo de milho, azeite de oliva, óleo de soja, óleo de amendoim, óleo de noz, óleo de amêndoa, óleo de gergelim, óleo de semente de algodão, óleo de canola, óleo de cártamo, óleo de linhaça, óleo de palma, óleo de palmiste, óleo de fruta de palma, óleo de coco, óleo de babaçu, manteiga de karité, manteiga de manga, manteiga de cacau, óleo de gérmen de trigo, óleo de farelo de arroz, óleo de girassol modificado que superexpressa ácido oleico em 400 %) são combinados com cadeia curta triglicerídeos para produzir ésteres de ácidos graxos transesterificados. Várias combinações de triglicerídeos e óleos de cadeia mais longa podem ser incorporadas para criar vários perfis de sabor diferentes.
[0232]Exemplos não limitativos de monoglicerídeos e diglicerídeos incluem monoglicerídeos e diglicerídeos derivados de plantas, (por exemplo, monoglicerídeos e diglicerídeos derivados de girassol, coco, amendoim, semente de algodão, azeitona, palma, colza, cártamo, semente de gergelim, soja, amêndoa, castanha de faia, castanha do Brasil, caju, avelã, noz de macadameia, noz mongongo, noz-pecã, pinhão, pistache, noz e abacate). Os monoglicerídeos e diglicerídeos podem incluir a cadeia acil de qualquer um dos ácidos graxos livres listados aqui. Exemplos adicionais de monoglicerídeos e diglicerídeos são conhecidos na técnica.
[0233]Exemplos não limitativos de ácidos graxos livres incluem ácido butírico, ácido capróico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido beênico, ácido lignocérico, ácido cerótico, ácido miristoléico, ácido pamitoleico, ácido sapiênico, ácido oleico, ácido elaídico, ácido vacênico, ácido linoléico, ácido linoelaídico, ácido α-linolênico, ácido araquidônico, ácido eicosapentaenóico, ácido erúcico, ácido docosahexaenóico, ácidos graxos ômega (por exemplo, ácido araquidônico, ácidos graxos ômega-3, ácidos graxos ômega-6, ácidos graxos ômega-7, ácidos graxos ômega-9), ácidos graxos com número par de carbonos de 4 a 16 carbonos de comprimento, ácidos monossaturados (particularmente com 18 carbonos), ácidos graxos com baixa tensão interfacial (por exemplo, menor que 20, menor que 15, menor que 11, menor que 9, menor que 7, menor que 5, menor que 3, menor que 2, menor que 1, ou menor que
0,5 dines/cm, de 0,1 a 20, de 1 a 15, de 2 a 9, de 3 a 9, de 4 a 9, de 5 a 9, de 2 a 7,
de 0,1 a 5, de 0,3 a 2, ou de 0,5 a 1 dines/cm, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0,
13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5 ou 20,0), ácido butírico (4: 0) ou ácido capróico (6: 0) que é esterificado em sn-3, ácidos graxos de cadeia média (8: 0 a 14: 0), bem como 16: 0 que são esterificados nas posições sn- 1 e sn-2, ácidos graxos nos quais o ácido esteárico (18: 0) é colocado na posição sn-1, ácidos graxos nos quais o ácido oleico (18: 1) é colocado nas posições sn-1 e sn-3, ácidos graxos que têm uma faixa de átomos de carbono (por exemplo, de 8 a 40, de 10 a 38, de 12 a 36, de 14 a 34, de 16 a 32, de 18 a 30 ou de 20 a 28 átomos de carbono), ácidos que compreendem pelo menos uma ligação insaturada (ou seja, uma ligação carbono dupla ou tripla; por exemplo, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 ou pelo menos 8 ligações duplas de carbono-carbono e/ou ligações triplas), ácidos graxos com ligações insaturadas conjugadas (ou seja, pelo menos um par de ligações duplas e/ou triplas de carbono-
carbono estão ligados, sem um grupo metileno (CH2) entre eles (por exemplo, 4CH:CHi CH:CHi)), e derivados dos ácidos graxos mencionados acima (por exemplo,
ésteres (por exemplo, ésteres metílicos e etílicos), sais (por exemplo, sais de sódio e potássio), derivados de triglicerídeos, derivados de diglicerídeos, derivados de monoglicerídeos). Os ácidos graxos livres podem ser saturados ou insaturados. Em algumas modalidades, os ácidos graxos livres não são derivados ou produzidos por um mamífero. Exemplos adicionais de ácidos graxos livres são conhecidos na técnica
[0234]Exemplos não limitativos de fosfolipídeos incluem fosfolipídeos de lecitina (por exemplo, fosfolipídeos de lecitina de soja, fosfolipídeos de lecitina de girassol, fosfolipídeos de lecitina de algodão, fosfolipídeos de lecitina de colza, bran de arroz, lecitina fosfolipídeos, fosfolipídeos de lecitina de milho, fosfolipídeos de lecitina de milho, fosfolipídeos de lecitina de milho), ceramida fosfoetanolaminas, glicerofosfolipídeos, ácido fosfatídico, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfospingolipídeos e fosfatidilserina. Em algumas modalidades, os fosfolipídeos não são derivados ou produzidos por um mamífero.
[0235]Exemplos não limitativos de triglicerídeos incluem tributirina, triglicerídeos de cadeia curta, triglicerídeos de cadeia curta compreendendo três ácidos oleicos; triglicerídeos de cadeia curta compreendendo ácido hexanóico; triglicerídeos de cadeia curta compreendendo ácido hexanóico e ácido butírico; triglicerídeos de cadeia curta compreendendo ácido hexanóico e ácido decanóico; e triglicerídeos de cadeia curta compreendendo um ácido butírico, um hexanóico e um ácido octanóico.
[0236]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento tem um teor de lipídeos livre menor que 0,3 %, menor que 0,25 %, menor que 0,2 %, menor que 0,15 %, menor que 0,1 % ou menor que 0,05 %; entre 0,05 % e 3 %, 2,6 %, 2,2 %, 1,8 %, 1,4 %, 1,0 %, 0,6 %, 0,2 % ou 0,1 %; entre 0,1 % e 3 %, 2,6 %, 2,2 %, 1,8 %, 1,4 %, 1,0 %, 0,6 % ou 0,2 %; entre 0,2 % e 3 %, 2,6 %, 2,2 %, 1,8 %, 1,4 %, 1,0 % ou 0,6 %; entre 0,6 % e 3 %, 2,6 %, 2,2 %, 1,8 %, 1,4 % ou 1,0 %; entre 1,0 % e 3 %, 2,6 %, 2,2 %, 1,8 % ou 1,4 %; entre 1,4 % e 3 %, 2,6 %, 2,2 % ou 1,8 %; entre 1,8 % e 3 %, 2,6 % ou 2,2 %; entre 2,2 % e 3 % ou 2,6 %; ou entre 2,6 % e 3 % em peso.
[0237]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento tem um teor de lipídeos livre que está dentro de uma faixa desejada conforme determinado por um painel sensorial humano especialista (por exemplo, tem um aroma e/ou sabor que é determinado por um painel sensorial humano especialista para não ser rançoso; tem um perfil de sabor que é determinado por um painel sensorial humano especialista como desejável).
[0238]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento compreende ainda um carboidrato. Exemplos não limitativos de carboidratos incluem amidos, farinhas e fibras comestíveis. Exemplos não limitativos de amidos incluem maltodextrina, inulina, frutooligossacarídeos, pectina, carboximetilcelulose, goma guar, amido de milho, amido de aveia, amido de batata, amido de arroz, amido de ervilha e amido de trigo. Exemplos não limitativos de farinhas incluem farinha de amaranto, farinha de aveia, farinha de quinua, farinha de arroz, farinha de centeio, farinha de sorgo, farinha de soja, farinha de trigo e farinha de milho. Exemplos não limitativos de fibras comestíveis incluem fibra de bambu, farelo de cevada, fibra de cenoura, fibra cítrica, farelo de milho, fibra dietética solúvel, fibra dietética insolúvel, farelo de aveia, fibra de ervilha, farelo de arroz, casca de cabeça, fibra de soja, polissacarídeo de soja, trigo farelo e celulose de polpa de madeira. Em algumas modalidades, pelo menos alguns dos carboidratos são derivados de plantas. Em algumas de tais modalidades, pelo menos parte do carboidrato é derivado de ervilha.
[0239]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento compreende ainda um agente adoçante natural ou artificial. Exemplos não limitativos de agentes adoçantes incluem estévia, aspartame, ciclamato, sacarina, sucralose, mogrosídeos, brazzeína, curculina, eritritol, glicirrizina, inulina, isomalte, lacititol, mabinlin, malititol, manitol, miraculina, monatina, miraculina, pentadinolina, os sorbitol, taumatina, xilitol, acessulfame de potássio, Advantame, alitame, aspartame-
acessulfame, ciclamato de sódio, dulcina, glucina, neoesperidina dihirdocalcona, neotame, P-4000 e agentes adoçantes que não compreendem carboidratos.
[0240]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento compreende ainda um mineral. Exemplos não limitativos de minerais incluem minerais solúveis em gordura, minerais solúveis em água, cálcio, fósforo, potássio, sódio, citrato, cloreto, fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro, molibdênio, manganês e cobre.
[0241]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento compreende ainda um emulsificante. Exemplos não limitantes de emulsificantes incluem emulsificantes aniônicos, emulsificantes não iônicos, emulsificantes catiônicos, emulsificantes anfotéricos, bioemulsificantes, emulsificantes estéricos, emulsificantes Pickering, glicolipídeos (por exemplo, trealose lipídeos, soforolipídeos, ramnolipídeos, manosileritriol lipídeos), oligopeptídeos (por exemplo, gramicina), polimixina), lipopeptídeos (por exemplo, surfactina), fosfolipídeos, ácidos graxos, lipídeos neutros, biostensoativos poliméricos, polissacarídeos anfipáticos, lipopolissacarídeos, proteínas (por exemplo, proteína de ervilha, proteína de soja, proteína de grão de bico, proteína de algas, proteína de levedura, proteína de batata, lentilha proteína), manoproteína, fosfatos de sódio, estearoil lactilato de cálcio, ésteres de ácido mono- e diacetil tartárico de monoglicerídeos, fosfolipídeos, monoestearato de sorbitano, estearato de magnésio, sais de sódio/potássio/cálcio de ácidos graxos, estearoil di-lactato de cálcio, ésteres de poliglicerol, ésteres de ácido graxo de sorbitano, ésteres de ácido acético de monoglicerídeos, ésteres de ácido lático de monoglicerídeos, ácido cítrico ésteres de monoglicerídeos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, poliricinoleato de poliglicerol, ésteres de propano-1,2-diol de ácidos graxos, ésteres de açúcar, ésteres de sacarose de ácidos graxos, monoglicerídeos, monoglicerídeos acetilados, monoglicerídeos lactilados, di-glicerídeos de ácido tartárico, monoglicerídeos de ácido tartárico ésteres, estearoil-2-lactilato de sódio/cálcio, fosfatídeo de amônio, polissorbatos, polissorbato-80, carboximetilcelulose (CMC), celulose modulada, ésteres de ácido cítrico, goma de alfarroba, goma guar, liposan, emulsão, lecitinas, tensoativos (por exemplo, sorbitano trioleato (Span 85), tristearato de sorbitano (Span 65), sesquioleato de sorbitano (Arlacel 83), monoestearato de gliceril, monooleato de sorbitano (Span 80), monoestearato de sorbitano (Span 60), monopalmitato de sorbitano (Span 40), monolaurato de sorbitano (Span 40), monolaurato de sorbitano, triestearato de polioxietileno sorbitano (Tween 65), trioleato de polioxietileno sorbitano (Tween 85), monoestearato de polietilenoglicol 400, polissorbato 60 (Tween 60), monoestearato de polioxietileno, poli sorbato 80 (Tween 80), polissorbato 40 (Tween 40), polissorbato 20 (Tween 20), PEG 20 tristearato, PEG 20 trioleato, PEG 20 monoestearato, PEG 20 monooleato, PEG 20 monopalmitato e PEG 20 monolaurato sorbitano) e derivados e misturas dos mesmos.
[0242]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento compreende ainda um antioxidante. Exemplos não limitativos de antioxidantes incluem antioxidantes naturais (por exemplo, α-tocoferol (por exemplo, tocoferol compreendido no leite bovino); tióis de baixo peso molecular (por exemplo, tióis de baixo peso molecular compreendidos no leite bovino); retinol (por exemplo, retinol compreendido no leite bovino); TBHQ; carotenóides (por exemplo, carotenóides compreendidos no leite de vaca); vitamina E; extrato de Azadirachta indica; riboflavina; extrato de alecrim; diterpenos fenólicos (por exemplo, carnosol, ácido carnósico) compreendidos no extrato de alecrim; extrato de sálvia; ácido ascórbico e seus sais; ácido láctico e seus sais; silagem de resíduo de uva; compostos fenólicos (por exemplo, ácido ferúlico) compreendidos na silagem de resíduo de uva; extrato de soja (Glycine max); isoflavonas ou compostos polifenólicos compreendidos no extrato de soja; extrato de alho (Allium sativum); enxofre, compostos fenólicos, flavonóides ou terpenóides compreendidos no extrato de alho; extrato de funcho (Foeniculum vulgare
Mill.); extrato de camomila (Matricaria recutita L.); algas marrons (por exemplo, Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus); óleos essenciais de pimenta rosa verde (GEO); óleos essenciais de pimenta rosa madura (MEO); extrato de chá verde; hidroxianisole butilado (E320); hidroxitolueno butilado (E321); e catequinas (por exemplo, galato de epigalocatequina, galato de epicatequina, epigalocatequina, catequina C, epicatequina, catequinas compreendidas no extrato de chá verde). Em algumas modalidades, o produto alimentar aqui fornecido compreende menos de
2.000 ppm em peso de um antioxidante. Propriedades do Produto Alimentar
[0243]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento tem um pH entre 2 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, 3, ou 2,5; entre 2,5 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, 3,5, ou 3; entre 3 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4, ou 3,5; entre 3,5 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, ou 4; entre 4 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, ou 4,5; entre 4,5 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, ou 5; entre 5 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, ou 5,5; entre 5,5 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, ou 6; entre 6 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, 7, ou 6,5; entre 6,5 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,5, ou 7; entre 7 e 10, 9,5, 9, 8,5, 8, ou 7,5; entre 7,5 e 10, 9,5, 9, 8,5, ou 8; entre 8 e 10, 9,5, 9, ou 8,5; entre 8,5 e 10, 9,5, ou 9; entre 9 e 10, ou 9,5; ou entre 9,5 e 10, em que pH é medido em solução de água desionizada compreendendo um teor de proteína de 4 % em peso.
[0244]Em algumas modalidades, o produto alimentar fornecido neste documento tem uma atividade de água entre 0,04 e 0,999, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ou 0,1; entre 0,1 e 0,999, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, ou 0,2; entre 0,2 e 0,999, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, ou 0,3; entre 0,3 e 0,999, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, ou 0,4; entre 0,4 e 0,999, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, ou 0,5; entre 0,5 e 0,999, 0,9, 0,8, 0,7, ou 0,6; entre 0,6 e 0,999, 0,9, 0,8, ou 0,7; entre 0,7 e 0,999, 0,9, ou 0,8; entre 0,8 e 0,999, ou 0,9; ou entre 0,9 e 0,999.
[0245]Em algumas modalidades, o produto alimentar é fornecido neste documento um produto alimentar homogeneizado (isto é, um produto alimentar que sofreu homogeneização) e compreende gotículas de fase dispersa com um diâmetro médio entre 0,11 μm e 15 μm, 12 μm, 10 μm, 8 μm, 6 μm, 4 μm, 2 μm, 1 μm, ou 0,5 μm; entre 0,5 μm e 15 μm, 12 μm, 10 μm, 8 μm, 6 μm, 4 μm, 2 μm, ou 1 μm; entre 1 μm e 15 μm, 12 μm, 10 μm, 8 μm, 6 μm, 4 μm, ou 2 μm; entre 2 μm e 15 μm, 12 μm, 10 μm, 8 μm, 6 μm, ou 4 μm;entre 4 μm e 15 μm, 12 μm, 10 μm, 8 μm, ou 6 μm; entre 6 μm e 15 μm, 12 μm, 10 μm, ou 8 μm; entre 8 μm e 15 μm, 12 μm, ou 10 μm; entre 10 μm e 15 μm, ou 12 μm; ou entre 12 μm e 15 μm.
[0246]Em algumas modalidades, o produto alimentar é fornecido neste documento um produto em suspensão grosseira (ou seja, um produto alimentar que foi emulsificado sem o uso de homogeneização de alta pressão (por exemplo, em um moinho coloidal, sonicador, unidade de estator do rotor); por exemplo, um molho para salada, uma maionese) e gotículas de fase dispersa com um diâmetro médio entre 1 μm e 10 μm, 9 μm, 8 μm, 7 μm, 6 μm, 5 μm, 4 μm, 3 μm, ou 2 μm; entre 2 μm e 10 μm, 9 μm, 8 μm, 7 μm, 6 μm, 5 μm, 4 μm, ou 3 μm; entre 3 μm e 10 μm, 9 μm, 8 μm, 7 μm, 6 μm, 5 μm, ou 4 μm; entre 4 μm e 10 μm, 9 μm, 8 μm, 7 μm, 6 μm, ou 5 μm; entre 5 μm e 10 μm, 9 μm, 8 μm, 7 μm, ou 6 μm; entre 6 μm e 10 μm, 9 μm, 8 μm, ou 7 μm; entre 7 μm e 10 μm, 9 μm, ou 8 μm; entre 8 μm e 10 μm, ou 9μm; ou entre 9 μm e 10 μm.
Preparação do Produto Alimentar
[0247]Existe uma variedade de receitas para a preparação de um produto alimentar e qualquer uma dessas receitas pode ser usada no método aqui fornecido para produzir um produto alimentar aqui fornecido. O caldo de fermentação ou preparação compreendendo o componente recombinante pode ser usado em tais receitas no lugar de ou além de ingredientes alimentares convencionalmente usados.
[0248]Deve ser entendido que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com certas modalidades específicas da mesma, a descrição anterior se destina a ilustrar e não limitar o escopo da invenção. Outros aspectos, vantagens e modificações dentro do escopo da invenção serão evidentes para aquelas pessoas versadas na técnica à qual a invenção pertence.
EXEMPLOS
[0249]Os seguintes exemplos são incluídos para ilustrar modalidades específicas da invenção. As técnicas divulgadas nos exemplos representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção; no entanto, aquelas pessoas versadas na técnica devem, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado semelhante ou semelhante sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Portanto, todas as questões apresentadas ou mostradas nos exemplos devem ser interpretadas como ilustrativas e não em um sentido limitante.
Exemplo 1: Remoção de Atividade de Esterase via Purificação
[0250]Uma célula hospedeira de Trichoderma reesei recombinante capaz de produzir uma β-lactoglobulina recombinante foi gerada pela transformação de protoplastos de uma cepa de Trichoderma reesei com um polinucleotídeo direcionado para integração genômica e que codifica β-lactoglobulina sob o controle de um promotor induzível. Os transformantes foram selecionados em um meio que compreendia um marcador selecionado para integração do polinucleotídeo recombinante.
[0251]A célula hospedeira recombinante foi fermentada em um meio de cultura adequado para o crescimento da célula hospedeira recombinante e para a produção e secreção da β-lactoglobulina recombinante.
[0252]O caldo de fermentação foi coletado e a biomassa e os resíduos celulares foram removidos por centrifugação para se obter um caldo de fermentação clarificado. A β-lactoglobulina recombinante foi isolada do caldo de fermentação clarificado com base na carga (isto é, complexação iônica), termolabilidade/termoestabilidade e/ou hidrofobicidade.
[0253]Por exemplo, a β-lactoglobulina recombinante foi isolada por separação com base na carga (isto é, complexação iônica com uma partícula que carrega uma carga oposta à da β-lactoglobulina recombinante em um determinado pH e/ou força iônica (por exemplo, a sal de ácido de sódio), seguido de isolamento do complexo e eluição da β-lactoglobulina recombinante do complexo isolado por meio de ajuste de pH e/ou força iônica) seguido de separação com base na hidrofilicidade (ou seja, carregando a preparação de β-lactoglobulina recombinante em um coluna de fenil sefarose em pH adequado e/ou força iônica (por exemplo, 0,8 M Na2SO4) para permitir a ligação da esterase à fenil sefarose e coleta de β-lactoglobulina solúvel no escoamento. A preparação de β-lactoglobulina foi opcionalmente seca por pulverização até obter uma preparação de pó de β-lactoglobulina.
[0254]Em um outro exemplo, a β-lactoglobulina recombinante foi isolada por separação com base na carga (isto é, complexação iônica com uma partícula que carrega uma carga oposta à da β-lactoglobulina recombinante em um determinado pH e/ou força iônica (por exemplo, um sal de ácido de sódio), seguido pelo isolamento do complexo e eluição da β-lactoglobulina recombinante do complexo isolado por meio de ajuste de pH e/ou força iônica) seguido por separação com base na termolabilidade/termoestabilidade (ou seja, aquecimento (por exemplo, 80 a 85 °C por 20 a 60 minutos) em pH adequado e/ou força iônica (por exemplo, pH3 e condutividade < 2mS/cm, obtido, por exemplo, por diafiltração) para precipitar a atividade esterase, seguida pela remoção do precipitado por centrifugação para obter β-lactoglobulina solúvel. A preparação de β-lactoglobulina foi opcionalmente seca por pulverização para obter uma preparação de pó de β-lactoglobulina.
[0255]As atividades de esterase compreendidas nas preparações de β- lactoglobulina foram determinadas adicionando a preparação de pó de β- lactoglobulina (a 3 % p/p) ao óleo de coco e/ou girassol e homogeneizando a 200 bar para formar uma emulsão. A mistura foi testada quanto à presença de ácidos graxos livres usando um kit FFA (Produto # KA1667; Abnova (Taipei City, Taiwan)).
[0256]Como mostrado nas Figuras 1 a 4, as preparações de β-lactoglobulina obtidas por purificação compreendem atividades de esterase essencialmente eliminadas. Exemplo 2: Remoção de Atividade de Esterase via Cultura
[0257]Uma célula hospedeira de Trichoderma reesei recombinante capaz de produzir uma β-lactoglobulina recombinante foi gerada pela transformação de protoplastos de uma cepa de Trichoderma reesei com um polinucleotídeo direcionado para integração genômica e que codifica uma β-lactoglobulina sob o controle de um promotor induzível. Os transformantes foram selecionados em um meio que compreendia um marcador selecionado para integração do polinucleotídeo recombinante.
[0258]A célula hospedeira recombinante foi fermentada em três culturas que compreendiam um meio de cultura que era adequado para o crescimento da célula hospedeira recombinante e para a produção e secreção da β-lactoglobulina recombinante. As três culturas diferiram entre si apenas no tipo de agente antiespuma contido no meio de cultura, que foi selecionado da lista que consistia em Industrol DF204, Poliglicol P-2000 e Erol DF6000K.
[0259]Os caldos de fermentação foram coletados de cada uma das culturas, e a biomassa e os detritos celulares foram removidos por centrifugação para obter caldos de fermentação clarificados. As atividades de esterase compreendidas nos caldos de fermentação clarificados foram determinadas usando o pNPL (produto # 61716; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e ensaios 4MU-o (produto # 75164; Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) essencialmente de acordo com o protocolo do fabricante. Para o ensaio 4MU-o, 20 µL de um caldo de fermentação clarificado foram combinados com 20 µL de tampão de acetato de sódio 0,1 M pH 4,3 e 40 µL de 4MU-o 0,1 mM em uma placa branca de 96 poços, a mistura foi incubada a 43 °C por 60 min antes de ser extinto com 80 µL de solução de Bórax 0,1 M pH 9,22, e a fluorescência foi lida por excitação a 365 nm e emissão de leitura a 450 nm. Para o ensaio de pNPL, 40 µL de um caldo de fermentação clarificado em pH4.3 foram combinados com 40 µL de solução de pNPL 1 mM em uma placa de PCR de 96 poços, a mistura foi incubada a 43 °C por 60 min antes de ser extinta com um volume de solução de Bórax 0,1 M pH 9,22 e fluorescência por emissão de leitura a 400 nm.
[0260]Como mostrado na Figura 5, uma análise de Tukey-Kramer demonstrou que os caldos de fermentação clarificados obtidos de culturas que utilizaram como agente anti-espuma Industrol DF204 ou Poliglicol P-2000 produziram significativamente menos atividade esterase do que os caldos de fermentação clarificados obtidos a partir do cultura que utilizou como agente anti-espuma Erol DF6000K.
Exemplo 3: Remoção da Atividade de Esterase via Modificação Genética
[0261]Uma célula hospedeira de Trichoderma reesei recombinante capaz de produzir uma β-lactoglobulina recombinante e compreendendo uma cutinase essencialmente eliminada (por exemplo, cut1 (UniProt # G0RH85)) atividade (“célula hospedeira recombinante de nocaute de cutinase”) foi gerada pela transformação de protoplastos de uma Cepa de Trichoderma reesei capaz de produzir uma β- lactoglobulina recombinante (“célula hospedeira recombinante correspondente”) com um polinucleotídeo (vetor alvo) projetado para integrar por recombinação homóloga no locus do gene da cutinase e para substituir o quadro de leitura aberto da cutinase por um marcador de seleção.
[0262]A estrutura geral do vetor alvo é mostrada na Figura 6. O vetor alvo compreendia um marcador seletivo (gene pyr4, que permite o crescimento sem suplementação de uracila) flanqueado por sequências polinucleotídicas que são homólogas às sequências polinucleotídicas a montante e a jusante que flanqueiam o quadro de leitura aberto da cutinase no genoma de Trichoderma reesei. A sequência das sequências a montante e a jusante são aqui fornecidas como SEQ ID No. 1 e SEQ ID No. 2, respectivamente.
[0263]Os transformantes foram selecionados em meio mínimo e, em seguida, rastreados por PCR para identificar uma célula hospedeira recombinante nocaute da cutinase. A célula hospedeira recombinante nocaute da cutinase e a célula hospedeira recombinante correspondente foram fermentadas em um meio de cultura adequado para o crescimento das células hospedeiras recombinantes e para a produção e secreção da β-lactoglobulina recombinante. Os caldos de fermentação foram recolhidos e a biomassa e os resíduos celulares foram removidos por centrifugação para obter caldos de fermentação clarificados. A β-lactoglobulina recombinante foi isolada dos caldos de fermentação clarificados com base na carga (isto é, interação eletrostática).
[0264]As atividades de cutinase nas preparações de β-lactoglobulina obtidas a partir da cepa nocaute da cutinase e da cepa parental foram testadas usando o ensaio FFA.
[0265]Como mostrado na Figura 7, no ensaio FFA, a preparação de β- lactoglobulina obtida da célula hospedeira recombinante correspondente produziu ácidos graxos livres ao longo do tempo, o que é indicativo da presença de uma atividade de lipase na preparação de β-lactoglobulina. Tal geração de ácidos graxos livres (isto é, atividade de esterase) foi essencialmente eliminada na preparação de β- lactoglobulina obtida a partir da célula hospedeira recombinante nocaute da cutinase. Exemplo 4: Composição de Sorvete compreendendo β-lactoglobulina Recombinante Produzida em Célula Fúngica Filamentosa e Compreendendo Ainda Atividade de Esterase Reduzida.
[0266]As seguintes amostras foram preparadas e incubadas a 4 ºC por 16 horas: Ingredientes & Amostra Processament A B C D E F o β- β- β- β- β- β- β- lactoglobulina lactoglob lactoglob lactoglob lactoglob lactoglob lactoglob (1,45 % p/p) ulina ulina ulina ulina ulina ulina recombin recombin recombin bovina bovina recombin ante (a) ante (a) ante (a) (b) (b) ante (d) Mistura de Sim Sim Sim Sim Sim Sim ingredientes de sorvete compreenden do 11,7 % de mono/di/triglic erídeos Tratamento Nenhum 90 ˚C, 10 90 ˚C, 10 Nenhum Nenhum Nenhum térmico de β- min min lactoglobulina 0,035 % de Nenhum Nenhum Sim Nenhum Sim Nenhum lipase (c) (a) Produzido por célula hospedeira de Trichoderma reseii compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica β-lactoglobulina bovina. (b) 95 % de proteína pura isolada de uma proteína de soro de leite disponível comercialmente isolada derivada de soro de leite doce. (c) Triacilglicerol lipase recombinante produzida por Candida cylindracea (Lipase AY 30SD-K, Amano Enzyme). (d) Compreendendo uma atividade de esterase essencialmente eliminada produzida por purificação como descrito no Exemplo 1, cultura como descrito no Exemplo 2, ou modificação genética como descrito no Exemplo 3.
[0267]Como mostrado na Figura 9A, o uso de β-lactoglobulina recombinante produzida por uma célula fúngica filamentosa levou à formação de uma composição de gel indesejada. Além disso, a preparação desenvolveu um aroma e sabor rançosos.
[0268]Como mostrado na Figura 9B, o tratamento térmico da β-lactoglobulina recombinante evitou a gelificação (e reduziu o desenvolvimento de aroma e sabor rançosos).
[0269]Como mostrado na Figura 9C, a adição de triacilglicerol lipase negou o efeito do tratamento térmico da β-lactoglobulina recombinante em que a preparação formou novamente uma composição de gel (com aroma e sabor rançosos).
[0270]Como mostrado na Figura 9D, o uso de β-lactoglobulina bovina purificada a partir de soro de leite não proporcionou a composição de gel indesejada.
Também não produziu o aroma e o sabor rançosos.
[0271]Como mostrado na Figura 9E, a adição de triacilglicerol lipase à β- lactoglobulina bovina leva à formação de gel (e produção de sabor e aroma rançosos).
[0272]Como mostrado na Figura 9F, o uso de uma preparação de β- lactoglobulina recombinante compreendendo uma atividade esterase essencialmente eliminada forneceu uma textura de sorvete desejável com aroma e sabor desejáveis.
[0273]Tomados em conjunto, os dados sugerem que uma preparação de β- lactoglobulina recombinante produzida por uma célula fúngica filamentosa pode compreender a atividade de uma esterase que tem um efeito prejudicial na textura, aroma e sabor de uma composição alimentar.
Exemplo 5: Identificação de Atividades de Esterase que Fornecem Perfis Sensoriais Desejáveis
[0274]Células hospedeiras recombinantes adicionais (por exemplo, células hospedeiras Trichoderma reesei recombinantes adicionais, células hospedeiras Aspergillus niger recombinantes adicionais, células hospedeiras Trichoderma citrinoviride recombinantes adicionais, células hospedeiras Myceliophthora thermophila recombinantes adicionais) capazes de produzir um componente recombinante (por exemplo, uma proteína recombinante do leite) são produzidas conforme descrito no Exemplo 3, visando outras esterases (por exemplo, hidrolase de éster carboxílico (por exemplo, UniProt # G0RBM4, G0RIU1), fosfolipase C (por exemplo, UniProt # G0REM9), acetilesterase (por exemplo, UniProt # G0RHJ4) e fator de transcrição que regula a expressão de uma esterase (por exemplo, UniProt# G0RX49), e qualquer outra esterase aqui divulgada, combinações de duas ou mais dessas esterases e combinações de uma ou mais dessas esterases com cutinase (por exemplo, UniProt # G0RH85), usando vetores alvo semelhantes aos divulgados no Exemplo 3, mas compreendendo sequências alvo a montante e a jusante específicas para os loci esterase alvo, ou usando outros esquemas de mutagênese para introduzir mutações (por exemplo, alterações, deleções ou inserções de um ou mais nucleotídeos) em sequências de nucleotídeos que regulam a expressão de esterases ou em quadros de leitura abertos que codificam esterases para produzir células hospedeiras recombinantes compreendendo atividades de esterase moduladas (isto é, superior ou inferior) ou essencialmente eliminadas. As preparações de componentes recombinantes são obtidas a partir de tais células hospedeiras recombinantes de acordo com os métodos aqui descritos e utilizadas para preparar produtos alimentares. Os produtos alimentares são testados para uma propriedade sensorial desejada (por exemplo, um odor desejado, um sabor desejado, uma textura desejada, uma emulsificação desejada) para identificar uma atividade esterase adequada ou combinação de atividades esterase que fornece um perfil sensorial desejável para esse produto alimentar. Uma atividade de esterase adequada ou combinação de atividades de esterase que fornece um perfil sensorial desejável para um determinado produto alimentar pode depender da composição específica do produto alimentar (por exemplo, o perfil lipídico específico do produto alimentar).
[0275]Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes, sequências, entradas de banco de dados e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na mesma medida como se cada publicação individual, patente, pedido de patente, sequência, entrada de banco de dados ou outra referência fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá.
A terminologia e a descrição utilizadas neste documento têm a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destinam a limitar o escopo da invenção.

Claims (96)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para produzir um produto alimentar compreendendo um componente recombinante produzido por uma célula hospedeira microbiana recombinante capaz de produzir o componente recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende pelo menos uma etapa em que uma atividade de uma esterase é essencialmente eliminada.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase é uma esterase única.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase compreende pelo menos 2 esterases.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase compreende uma hidrolase de éster carboxílico
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a hidrolase de éster carboxílico compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RIU1, A2R1N7, G0RBM4, A0A2T4BBP9, G2Q379, A0A2T4AZ21, A2R8Z3, G0R9X3, A2QPC2, G0RCG3, A0A2T4BCL7, A0A2T4B416 e A0A2T4BNI9.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase compreende uma lipase de triacilglicerol.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a lipase de triacilglicerol compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt A2QM14 e A2R709.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase compreende uma fosfolipase A2.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a fosfolipase A2 compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a sequência UniProt A2QIF8.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase compreende uma lisofosfolipase.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a lisofosfolipase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RX90, G2Q0K1, A0A2T4B235, A2QC75 e A2QF42.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase compreende uma acetilesterase.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a acetilesterase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RHJ4, A0A2T4BJD9 e G2QL32.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase compreende uma fosfolipase C.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a fosfolipase C compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0REM9, A0A2T4BFY3 e A2QAD7.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase compreende uma cutinase.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a cutinase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RH85, A2QBP1, A0A2T4BJB5, A5ABE6, A2R2W3 e G2QH51.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a atividade da esterase compreende uma atividade de uma primeira esterase que é essencialmente eliminada e uma atividade de uma segunda esterase que é diminuída.
19. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a atividade da esterase compreende uma atividade de uma primeira esterase que é essencialmente eliminada e uma atividade de uma segunda esterase que é aumentada.
20. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase é essencialmente eliminada compreende a etapa de culturar a célula hospedeira microbiana recombinante sob uma condição adequada for essencialmente eliminating a atividade de esterase.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a condição adequada compreende a presença de um agente anti-espuma adequado.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anti-espuma é selecionado a partir do grupo que consiste em ACP 1500, Anti-espumante 204, Erol DF6000K, Hodag K-60K, Industrol DF204, P-2000E, SAG 471, SAG 5693, SAG 710, SAG 730, Anti-espumante de silicone, Struktol J647, Struktol J673A, e óleo de girassol.
23. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase é essencialmente eliminada compreende a etapa de produzir o componente recombinante em uma célula hospedeira microbiana recombinante compreendendo uma modificação genética que essencialmente elimina a atividade da esterase em comparação com a atividade da esterase compreendida em uma célula hospedeira microbiana recombinante correspondente.
24. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira microbiana recombinante é uma célula hospedeira fúngica filamentosa recombinante.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa recombinante é derivada a partir do grupo que consiste em uma célula hospedeira de Aspergillus niger recombinante, uma célula hospedeira de Myceliophthora thermophila recombinante, uma célula hospedeira de Trichoderma reesei recombinante, e uma célula hospedeira de Trichoderma citrinoviride recombinante.
26. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma etapa em que uma atividade de esterase é essencialmente eliminada compreende a etapa de purificar o componente recombinante longe da esterase.
27. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o componente recombinante é uma proteína recombinante.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína vegetal recombinante, uma proteína de algas recombinante, uma proteína fúngica recombinante, uma proteína microbiana recombinante, e uma proteína animal recombinante.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína animal recombinante é uma proteína recombinante do leite.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína recombinante do leite é uma proteína recombinante do soro de leite.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína recombinante do soro de leite é selecionada a partir do grupo que consiste em α-lactalbumina β-lactoglobulina, lactoferrina, transferrina, albumina sérica, lactoperoxidase, e glicomacropeptídeo.
32. Método, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína recombinante do leite é uma caseína recombinante.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a caseína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em β- caseína, γ-caseína, κ-caseína, α-S1-caseína, e α-S2-caseína.
34. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende ainda a etapa de purificar o componente recombinante para obter uma preparação compreendendo o componente recombinante e um atividade essencialmente eliminada de uma esterase em comparação com uma preparação correspondente.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que a preparação compreende um perfil de atividade de esterase que é otimizado para fornecer sobre o produto alimentar uma ou mais propriedades selecionadas a partir do grupo que consiste em um sabor desejado, um aroma desejado, uma textura desejada, um emulsificação desejada, um conteúdo nutricional desejado, e um prazo de validade desejado.
36. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que a preparação é um pó.
37. Célula hospedeira microbiana recombinante que é capaz de produzir um componente recombinante e, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma modificação genética que essencialmente elimina uma atividade ou expressão de uma esterase em comparação com a atividade ou expressão da esterase compreendida em uma célula hospedeira microbiana recombinante correspondente.
38. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a esterase é uma esterase única.
39. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a esterase compreende pelo menos 2 esterases.
40. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37 CARACTERIZADA pelo fato de que a esterase compreende uma hidrolase de éster carboxílico.
41. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a hidrolase de éster carboxílico compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RIU1, A2R1N7, G0RBM4, A0A2T4BBP9, G2Q379, A0A2T4AZ21, A2R8Z3, G0R9X3, A2QPC2, G0RCG3, A0A2T4BCL7, A0A2T4B416 e A0A2T4BNI9.
42. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a esterase compreende uma lipase de triacilglicerol.
43. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que a lipase de triacilglicerol compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt A2QM14 e A2R709.
44. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a esterase compreende uma fosfolipase A2.
45. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADA pelo fato de que a fosfolipase A2 compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a sequência UniProt A2QIF8.
46. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a esterase compreende uma lisofosfolipase.
47. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADA pelo fato de que a lisofosfolipase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RX90, G2Q0K1, A0A2T4B235, A2QC75 e A2QF42.
48. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a esterase compreende uma acetilesterase.
49. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADA pelo fato de que a acetilesterase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RHJ4, A0A2T4BJD9 e G2QL32.
50. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que a esterase compreende uma fosfolipase C.
51. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADA pelo fato de que a fosfolipase C compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0REM9, A0A2T4BFY3 e A2QAD7.
52. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a esterase compreende uma cutinase.
53. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADA pelo fato de que a cutinase compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RH85, A2QBP1, A0A2T4BJB5, A5ABE6, A2R2W3 e G2QH51.
54. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade da esterase compreende uma atividade de uma primeira esterase que é essencialmente eliminada e uma atividade de uma segunda esterase que é diminuída.
55. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade da esterase compreende uma atividade de uma primeira esterase que é essencialmente eliminada e uma atividade de uma segunda esterase que é aumentada.
56. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a modificação genética é selecionada a partir do grupo que consiste em uma modificação genética em uma sequência de controle ou uma parte funcional desta que conduz a expressão da esterase ou de uma proteína necessária para expressão da esterase, uma modificação genética em uma sequência de codificação que codifica uma proteína ou uma parte funcional da mesma necessária para expressão da esterase, uma modificação genética em uma sequência de codificação que codifica a esterase ou uma parte funcional da mesma, uma modificação genética em uma sequência de controle ou uma parte funcional desta que conduz a expressão de um inibidor endógeno da esterase, uma modificação genética em uma sequência de codificação que codifica um inibidor endógeno da esterase, e uma modificação genética que introduz uma sequência de codificação que codifica um inibidor heterólogo da esterase.
57. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que a modificação genética é uma modificação genética em uma sequência de controle ou uma parte funcional desta que conduz a expressão de um fator de transcrição que regula a expressão da esterase ou em uma sequência de codificação que codifica tal fator de transcrição ou uma parte funcional da mesma.
58. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADA pelo fato de que o fator de transcrição compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 % idêntica a uma sequência selecionada a partir de sequências UniProt G0RX49, G0RHG1, A0A2T4B416, A0A2T4BJU6, A2R2J1, A2R903, G2Q2Z5 e G2Q8I6.
59. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira microbiana recombinante é uma célula hospedeira fúngica filamentosa recombinante.
60. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira fúngica filamentosa recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula hospedeira de Aspergillus niger recombinante, uma célula hospedeira de Myceliophthora thermophila recombinante, uma célula hospedeira de Trichoderma reesei recombinante, e uma célula hospedeira de Trichoderma citrinoviride recombinante.
61. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente recombinante é uma proteína recombinante.
62. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em uma proteína vegetal recombinante,
uma proteína de algas recombinante, uma proteína fúngica recombinante, uma proteína microbiana recombinante, e uma proteína animal recombinante.
63. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína animal recombinante é uma proteína recombinante do leite.
64. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína recombinante do leite é uma proteína recombinante do soro de leite.
65. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 64, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína recombinante do soro de leite é selecionada a partir do grupo que consiste em α-lactalbumina, β- lactoglobulina, lactoferrina, transferrina, albumina sérica, lactoperoxidase, e glicomacropeptídeo.
66. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína recombinante do leite é uma caseína recombinante.
67. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 66, CARACTERIZADA pelo fato de que a caseína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em β-caseína, γ-caseína, κ-caseína, α-S1- caseína, e α-S2-caseína.
68. Produto alimentar que compreende um componente recombinante produzido por uma célula hospedeira microbiana recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto alimentar compreende ainda um atividade essencialmente eliminada de uma esterase em comparação com a atividade da esterase em um produto alimentar correspondente.
69. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase é uma esterase única.
70. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de que a esterase compreende pelo menos 2 esterases.
71. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto alimentar é essencialmente livre da atividade da esterase.
72. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto alimentar é um substituto do produto lácteo.
73. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o substituto do produto lácteo é um substituto de um produto lácteo selecionado a partir do grupo que consiste em leite, iogurte, queijo, produtos para barrar lácteos, creme, confeitos congelados, manteiga, e laticínios em pó.
74. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto alimentar compreende um componente de proteína do leite.
75. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 74, CARACTERIZADO pelo fato de que o componente de proteína do leite compreende pelo menos uma proteína recombinante do leite.
76. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 74, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma proteína recombinante do leite é uma proteína recombinante do leite única.
77. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína recombinante do leite única é uma β-lactoglobulina recombinante.
78. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína recombinante do leite única é uma α-lactalbumina recombinante.
79. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína recombinante do leite única é uma κ-caseína recombinante.
80. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína recombinante do leite única é uma β-caseína recombinante.
81. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 76, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína recombinante do leite única é uma γ-caseína recombinante.
82. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 74, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma proteína recombinante do leite é duas proteínas recombinantes do leite.
83. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que as duas proteínas recombinantes do leite são uma β-lactoglobulina recombinante e uma α-lactalbumina recombinante.
84. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que as duas proteínas recombinantes do leite são uma κ-caseína recombinante e uma β-caseína recombinante.
85. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que as duas proteínas recombinantes do leite são uma κ-caseína recombinante e uma γ-caseína recombinante.
86. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que as duas proteínas recombinantes do leite são uma β-caseína recombinante e uma γ-caseína recombinante).
87. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que as duas proteínas recombinantes do leite são uma β-lactoglobulina recombinante e uma κ-caseína recombinante.
88. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que as duas proteínas recombinantes do leite são uma κ-caseína recombinante e uma α-lactalbumina recombinante.
89. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que as duas proteínas recombinantes do leite são uma β-lactoglobulina recombinante e uma β-caseína recombinante.
90. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que as duas proteínas recombinantes do leite são uma β-caseína recombinante e uma α-lactalbumina recombinante.
91. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que as duas proteínas recombinantes do leite são uma β-lactoglobulina recombinante e uma γ-caseína recombinante.
92. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que as duas proteínas recombinantes do leite são uma γ-caseína recombinante e uma α-lactalbumina recombinante.
93. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto alimentar compreende um teor de lipídios livre que está dentro de uma faixa desejada que confere um perfil sensorial desejado no produto alimentar.
94. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de que a atividade essencialmente eliminada da esterase diminui uma rancidez do produto alimentar.
95. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a atividade essencialmente eliminada da esterase diminui uma rancidez no produto alimentar.
96. Célula hospedeira microbiana recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que o uso do componente recombinante na produção de um produto alimentar não produz rancidez no produto alimentar.
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