CN113301812A - 用于食物产品的重组组分和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了用于产生包含重组组分的食物产品的方法，以及用于这样的方法的组合物和通过这样的方法产生的食物产品。

Description

用于食物产品的重组组分和组合物
相关申请
本申请要求于2018年10月17日提交的美国临时申请系列号：62/746,918的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及动物源性食物产品的替代品。特别地，本发明涉及用于食物产品的重组组分和组合物，用于产生这些组分和组合物的方法，以及用于产生包含这些组分和组合物的食物产品的方法。
背景技术
动物源性食物产品(例如肉、奶、蛋)是常见的营养来源。它们包含优质蛋白质、必需矿物质(例如钙、磷、锌、镁)和维生素(例如核黄素、维生素A、维生素B12)。另外，许多这样的食物产品具有允许产生广泛多样的衍生食物产品(例如酸奶、奶酪、奶油、冰淇淋、黄油、蛋黄酱)的有利的功能特性。
然而，动物源性食物产品包含可能在人中引起不健康反应的组分(例如乳糖、过敏原、饱和脂肪、胆固醇)。此外，这些食物产品的产生涉及畜牧业，这对动物福利和环境产生了重大影响，并且具有被病原体、农药残留、重金属和黄曲霉毒素M1污染的可能性。
这些担忧推动了动物源性食物产品的替代品的发展。一些这样的替代品包括植物来源的组分(例如蛋白质、脂质、维生素)。然而，越来越多地，动物源性食物产品的替代品是从重组产生(例如使用微生物宿主细胞)的组分(例如蛋白质、脂质)产生的。
在食物产品中重组组分的使用带来了新的问题。一个这样的问题是这样的事实，即由重组组分产生的食物产品经常含有大量的这样的重组组分(比以前利用重组组分的产品中的典型更多)，并且大量重组组分的使用可能受到由从其获得重组组分的微生物宿主细胞同时产生的其他(有时是非期望的)组分的影响。
一种这样的其他组分是酯酶活性。酯酶可以水解甘油二酯、甘油三酯、磷脂和/或脂蛋白中的酯键以释放游离脂肪酸。包含甘油二酯、甘油三酯、磷脂和/或脂蛋白的组合物用于其中可以使用重组组分的多种食物产品中。在一些这样的食物产品中，酯酶催化的游离脂肪酸的释放可能对诸如质地、乳化、香气、味道和营养含量的性质具有有害影响。在其他这样的食物产品中，酯酶催化的游离脂肪酸的释放可能对诸如风味特征(例如，成熟奶酪的风味特征)的性质具有有益的影响。
因此，在重组组分的产生、加工和使用中必须克服挑战，特别是在酯酶活性方面，以用于产生动物源性食物产品的替代品。
因此，需要一种方法，通过该方法可以从重组组分产生动物源性食物产品的替代品，以及需要用于这样的方法的组合物和从这样的方法获得的组合物。
附图说明
将通过使用附图，以附加的特性和细节来描述和说明示例性实施方案，其中：
图1是显示重组β-乳球蛋白制剂的游离脂肪酸(FFA)测定的结果的图表，所述重组β-乳球蛋白制剂是根据本发明的各种代表性实施方案通过基于电荷(即离子络合)和热失稳性/热稳定性纯化以分离酯酶活性而获得的，其中“最终材料”是在缓冲液交换以去除高盐并浓缩重组β-乳球蛋白的制剂；
图2显示了重组β-乳球蛋白制剂的染色的天然PAGE凝胶，所述重组β-乳球蛋白制剂是根据本发明的各种代表性实施方案通过基于电荷(即离子络合)和热失稳性/热稳定性纯化以分离酯酶活性而获得的，其中“最终材料”是在缓冲液交换以去除高盐并浓缩重组β-乳球蛋白的制剂；
图3是显示重组β-乳球蛋白制剂的FFA测定结果的图表，所述重组β-乳球蛋白制剂是根据本发明的各种代表性实施方案通过基于电荷(即离子络合)和疏水性纯化以分离酯酶活性而获得的，其中“最终材料”是在缓冲液交换以去除高盐并浓缩重组β-乳球蛋白的制剂；
图4显示了重组β-乳球蛋白制剂的染色的天然PAGE凝胶，所述重组β-乳球蛋白制剂是根据本发明的各种代表性实施方案通过基于电荷(即离子络合)和疏水性纯化以分离酯酶活性而获得的，其中“最终材料”是在缓冲液交换以去除高盐并浓缩重组β-乳球蛋白的制剂；
图5是显示根据本发明的各种代表性实施方案从包含指示的消泡剂的培养物中获得的澄清的发酵液的pNPL测定(使用Tukey-Kramer分析)的结果的图；
图6是根据本发明的代表性实施方案的用于产生包含消除的角质酶活性的重组宿主细胞的靶向载体的图；
图7是显示了重组β-乳球蛋白制剂的FFA测定的结果的图，所述重组β-乳球蛋白制剂是根据本发明的各种代表性实施方案从与从相应的重组宿主细胞获得的重组β-乳球蛋白制剂相比包含消除的角质酶活性的重组宿主细胞获得的；
图8显示了重组β-乳球蛋白制剂的染色的天然PAGE凝胶，所述重组β-乳球蛋白制剂是根据本发明的各种代表性实施方案从与从相应的重组宿主细胞获得的重组β-乳球蛋白制剂相比包含消除的角质酶活性的重组宿主细胞获得的；和
图9A-9F显示了根据本发明的各种代表性实施方案的在存在或不存在酯酶活性的情况下的包含重组或天然牛β-乳球蛋白的冷冻甜食的凝胶组合物的照片。
发明内容
在一个方面，本文提供了一种用于产生食物产品的方法，所述食物产品包含由能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞产生的重组组分，其中所述方法包括其中酯酶的活性被基本上消除或调节的至少一个步骤。
在另一方面，本文提供了一种制剂，其包含重组组分和与相应制剂中所包含的酯酶活性相比被基本上消除或调节的酯酶活性。
在另一方面，本文提供了一种重组微生物宿主细胞，其能够产生重组组分，并且包含与相应重组微生物宿主细胞中所包含的酯酶活性相比被基本上消除或调节的酯酶活性。
在另一方面，本文提供了一种食物产品，其包含由重组微生物宿主细胞产生的重组组分，其中所述食物产品还包含与相应的食物产品中的酯酶活性相比被基本上消除或调节的酯酶活性。
发明详述
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
定义
除非在此另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文所用的术语“一个”、“一种”和“该”以及类似的参考词指单数和复数。
如本文所用，术语“约”是指对于如本领域普通技术人员所确定的特定值而言处于可接受的误差范围内，该误差范围可以部分取决于如何测量或确定该值，或者取决于测量系统的限制。
如本文所用，术语“和/或”是指彼此组合或互斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”或“x或y或z”。
如本文所用，术语“相应制剂”是指与被用于与该“相应制剂”进行比较的制剂相同的制剂，所不同的是“相应制剂”中包含的酯酶活性没有如本文所提供的被基本上消除或调节(例如，由于该制剂不是来源于包含基本上消除或调节的酯酶活性的重组微生物宿主细胞，和/或不来源于在适合于基本上消除或调节酯酶活性的条件下培养的重组微生物宿主细胞；和/或不来源于包含酯酶抑制剂的发酵液；或由于重组组分未经纯化以与酯酶活性分离)。
如本文所用，术语“相应的食物产品”是指通过与用于产生该“相应的食物产品”进行比较的食物产品的方法相同的方法产生的食物产品，所不同的是产生“相应的食物产品”的方法不包括其中酯酶活性如本文提供的方法所提供的那样被基本上消除或调节的至少一个步骤。
术语“相应的重组微生物宿主细胞”是指与用于与“相应的重组微生物宿主细胞”进行比较的重组微生物宿主细胞相同的重组微生物宿主细胞，所不同的是“相应的重组微生物宿主细胞”的酯酶活性没有如本文提供的重组微生物宿主细胞中所提供的那样被基本上消除或调节。
如本文所用，术语“基本上不含”和“基本上消除”是指所指示的组分不能通过常规分析方法在所指示的组合物中被检测到，或者所指示的组分以不发挥功能的痕量存在。在本文中使用的术语“功能”是指不促成包含痕量的所指示的组分的组合物的性能，或在包含痕量的所指示的组分的所指示的组合物中不具有活性(例如酶活性)，或消耗包含痕量的所指示的组分的组合物后不具有对健康不利的影响。
如本文所用，术语“酯酶活性”或“酯酶的活性”是指可水解酯键的酶(即，作用于酯键的水解酶)的活性。酯酶用酶委员会编号(EC编号)3.1指定。这些术语在本文可互换使用。
如本文所用，术语“发酵液”是指包含能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞的培养物。
如本文所用，术语“丝状真菌细胞”是指来自真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人,In,Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义的)亚门的任何丝状形式的细胞。丝状真菌细胞通过其在营养生长过程中的菌丝伸长而与酵母区分开。
如本文所用，术语“真菌”是指子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及Chythridiomycota、卵菌门和球囊菌门(Glomeromycota)的生物。但是，可以理解的是，真菌分类法正在不断发展，因此将来可能会调整真菌界的这一特定定义。
如本文所用，术语“异源的”是指在描述其的背景中通常不存在。换句话说，这样表征的实体在描述其的背景中是外来的。当用于指由丝状真菌细胞产生的蛋白质时，该术语暗示该蛋白质不是由丝状真菌细胞天然产生的。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指已将重组核酸引入其中的细胞。应当理解，这样的术语不仅旨在指特定的对象细胞，而且还指这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以这样的后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文在多核苷酸或多肽序列的上下文中使用的，术语“相同的/同一的”是指在两个序列中的参考窗口内的残基在为了最大对应性而比对时是相同的。有许多本领域已知的不同算法可用于测量核苷酸序列或蛋白质序列同一性。例如，可以使用FASTA(例如，如在Wisconsin Genetics软件包版本10.0，Genetics Computer Group,Madison,WI中提供的)、GAP(例如，如在Wisconsin Genetics软件包版本10.0，Genetics Computer Group,Madison,WI中提供的)、BESTFIT(例如，如在Wisconsin Genetics软件包版本10.0，Genetics Computer Group,Madison,WI中提供的)、ClustalW(例如，使用版本1.83的默认参数)或BLAST(例如，使用倒数BLAST，PSI-BLAST，BLASTP，BLASTN；例如，如通过NationalCenter for Biotechnology Information提供的)来比较序列(参见，例如，Pearson.1990.Methods Enzymol.183:63；Altschul等人,1990.J.Mol.Biol.215:403)。为了通过这些方法进行比对，可以使用默认参数(例如，对于BLASTN，默认参数为空位开放罚分＝5和空位延伸罚分＝2，和对于BLASTP，默认参数为空位开放罚分＝11和空位延伸罚分＝1)。参考窗口的范围可以从2个序列的整个长度到2个序列各自的仅一个区域(例如长度至少为50个核苷酸或至少10个氨基酸的区域)。
如本文所用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“携带”或其变体旨在以类似于术语“包含”的方式是包含性的。
如本文所用，术语“微生物(microbe)”是微生物(microorganism)的缩写，并且是指单细胞生物。如本文所用，该术语包括所有细菌、古细菌、单细胞原生生物、单细胞动物、单细胞植物、单细胞真菌、单细胞藻类、原生动物和假菌界(chromista)。
如本文所用，与酯酶活性有关的术语“调节”是指酯酶的活性的任何改变(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)，包括酯酶的活性的增加或减少。这样的调节的酯酶活性通常是由于酯酶的浓度的增加或减少，或者是由于酯酶的酶活性的增加或减少引起的。
如本文所用，术语“天然的”是指自然界中发现的。
如本文所用，术语“任选的”或“任选地”是指特征或结构存在或不存在，或者事件或情况发生或不发生。该描述包括其中存在特定特征或结构的实例以及其中不存在该特征或结构的实例，或者其中事件或情况发生的实例以及其中事件或情况没有发生的实例。
如本文所公开的术语“多核苷酸”是指RNA、cDNA、基因组DNA以及上述的合成形式和混合聚合物的有义链和反义链。多核苷酸可被化学或生物化学修饰，或可包含非天然或衍生的核苷酸碱基。这样的修饰包括例如标记，甲基化，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如不带电荷的键联(例如，甲基膦酸酯，磷酸三酯，磷酰胺，氨基甲酸酯)，带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯)，悬垂部分(例如，多肽)，嵌入剂(例如，吖啶，补骨脂素)，螯合剂，烷基化剂和修饰的键联(例如，α异头核酸)。修饰的核苷酸的实例是本领域已知的(参见，例如，Malyshev等人,2014.Nature 509:385；Li等人,2014.J.Am.Chem.Soc.136:826)。还包括了合成的分子，其在其通过氢键合和其他化学相互作用与指定序列结合的能力的方面模拟多核苷酸。这样的分子是本领域已知的，并且包括例如其中肽键联替代分子主链中的磷酸键联的分子。其他修饰可以包括例如其中核糖环包含桥接部分或其他结构(例如在“锁”多核苷酸中发现的修饰)的类似物。
如本文所用，术语“制剂”是指在将重组组分与发酵液的一种或多种其他组分分离后获得的制剂。
如本文所用，术语“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码和非编码的氨基酸，天然存在和非天然存在的氨基酸，化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰的肽主链的多肽。
如本文所用，术语“纯化”是指重组蛋白基本上与重组微生物宿主细胞的细胞组分(例如，膜脂质，染色体，蛋白质)分离。该术语不需要(尽管允许)将重组蛋白与所有其他化学物质分开。
如本文所用，术语“重组微生物宿主细胞”是指包含重组多核苷酸的微生物细胞。应当理解，这样的术语旨在不仅指特定的对象细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“重组微生物宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“重组多核苷酸”是指已经从其天然存在的环境中移出的多核苷酸，不与全部或部分当在自然界中发现多核苷酸时与该多核苷酸邻接或邻近的多核苷酸相关联的该多核苷酸，不与其在自然界中未连接至的多核苷酸可操作地连接的多核苷酸，或在自然界中不存在的多核苷酸。该术语可用于例如描述克隆的DNA分离物或包含化学合成的核苷酸类似物的多核苷酸。如果多核苷酸包含任何非天然存在的遗传修饰，则其也被视为“重组的”。例如，如果内源多核苷酸包含例如通过人为干预人工引入的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代，则将其视为“重组多核苷酸”。这样的修饰可以将点突变、取代突变、缺失突变、插入突变、错义突变、移码突变、重复突变、扩增突变、易位突变或倒位突变引入多核苷酸。该术语包括宿主细胞染色体中的多核苷酸，以及不在宿主细胞染色体中的多核苷酸(例如，附加体中包含的多核苷酸)。
如本文所用，术语“重组蛋白”是指与在自然界中产生该蛋白质的细胞的物种或类型相比，在不同物种或类型的细胞中产生的蛋白质，或以在自然界不产生的水平在细胞中产生的蛋白质。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其通常是指环状双链DNA环(可以在其中连接其他DNA区段)，但也包括线性双链分子，例如通过聚合酶链反应(PCR)扩增或用限制性酶处理环状质粒得到的分子。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中(在下文中更详细地讨论)。某些载体能够在将它们引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体可以在引入到宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。
如本文所用，术语“酵母”是指酵母目的生物，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽/起泡而发生，并且碳分解代谢可能是发酵性的。
用于产生包含重组组分的食物产品的方法
在一个方面，本文提供了一种用于产生食物产品的方法，所述食物产品包含由能够产生重组组分(例如，本文提供的任何重组微生物宿主细胞)的重组微生物宿主细胞产生的重组组分(例如，本文公开的任何重组组分)，其中所述方法包括其中酯酶的活性(即，酯酶活性；例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)被基本上消除或调节的至少一个步骤。
在一些实施方案中，基于产生重组组分的重组微生物宿主细胞通常还产生酯酶活性的发现，本发明提供了用于产生包含重组组分(例如，本文公开的任何重组组分)的食物产品的一种或多种方法。这样的酯酶活性可以与重组组分共纯化。当重组组分随后用于产生食物产品时，酯酶活性可以水解食物产品中所含的甘油二酯、甘油三酯、磷脂和/或脂蛋白中的酯键，从而催化食物产品中游离脂肪酸的产生。
如上文所提及的，在食物产品中产生游离脂肪酸可能通过例如产生腐臭的香气和/或味道、干扰乳剂的形成、对质地具有不期望的影响、与必需营养物质(例如维生素)相互作用和从而减少营养含量以及减少保质期而具有有害作用。食物产品中游离脂肪酸的产生还可以通过例如产生期望的风味特征(例如，成熟奶酪的风味特征)或制备用于加工奶酪中的酶改性奶酪而具有有益的作用。
在一些实施方案中，基于由重组宿主细胞产生的酯酶活性与哺乳动物产生的奶中所含的酯酶活性不同的发现，本发明提供了用于产生包含重组组分(例如，本文公开的任何重组组分)的食物产品的一种或多种方法。
因此，本发明的各种实施方案包括用于基本上消除或调节由重组微生物宿主细胞产生的酯酶活性的特定方法。通过基本上消除或调节包含在重组微生物宿主细胞中产生的重组组分的食物产品中的酯酶活性，本发明提供了用于在食物产品中防止或延迟腐臭的香气和味道的产生、形成乳剂、增加营养含量、调节质地、延长保质期和/或更快速地产生期望的风味特征的方法。
在一些实施方案中，本文提供的用于产生食物产品的方法包括至少一个步骤，其中基本上消除酯酶活性。
在一些实施方案中，本文提供的用于产生食物产品的方法包括至少一个步骤，其中酯酶活性降低。在一些这样的实施方案中，酯酶活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
在一些实施方案中，本文提供的用于产生食物产品的方法包括至少一个步骤，其中酯酶活性增加。在一些这样的实施方案中，酯酶活性增加至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％或至少1000％。
在一些实施方案中，本文提供的用于产生食物产品的方法包括至少一个步骤，其中基本上消除第一酯酶活性并且降低第二酯酶活性。在一些实施方案中，本文提供的用于产生食物产品的方法包括至少一个步骤，其中基本上消除第一酯酶活性并且增加第二酯酶活性。在一些实施方案中，本文提供的用于产生食物产品的方法包括至少一个步骤，其中第一酯酶活性增加而第二酯酶活性降低。
在一些实施方案中，本文提供的用于产生食物产品的方法包括一个步骤，其中酯酶的活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)被基本上消除或调节。
在一些实施方案中，本文提供的用于产生食物产品的方法包括两个或更多个步骤(例如2个步骤、3个步骤、4个步骤、5个步骤)，其中酯酶的活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)被基本上消除或调节(例如，选自本文公开的提供基本上消除或调节的酯酶活性(例如任何本文公开的一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)的步骤的两个或更多个步骤)。
基本上消除或调节酯酶活性
在本文提供的用于产生食物产品的方法中的其中基本上消除或调节酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)的至少一个步骤可以包括提供基本上消除或调节的酯酶活性的任何步骤。
在一些实施方案中，在本文提供的用于产生食物产品的方法中的其中基本上消除或调节酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)的至少一个步骤包括以下步骤：在适于基本上消除或调节酯酶活性的条件下，培养能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞。
因此，在一些这样的实施方案中，本文提供的方法包括以下步骤：a)获得能够产生重组组分(例如，本文公开的任何重组组分)的重组微生物宿主细胞；b)在适合于基本上消除或调节酯酶活性以及适于产生和/或分泌重组组分的条件下在培养基中培养重组微生物宿主细胞以获得包含重组组分和基本上消除或调节的酯酶活性的发酵液；c)任选地从发酵液中纯化重组组分以获得包含重组组分和基本上消除或调节的酯酶活性的制剂；和d)从包含重组组分和基本上消除或调节的酯酶活性的发酵液或制剂制备食物产品。
用于在适合于基本上消除或调节酯酶活性的条件下在培养基中培养重组微生物宿主细胞的合适条件是例如重组微生物宿主细胞基本上消除或调节其酯酶活性的产生的条件。这样的条件的非限制性实例包括合适的pH，合适的温度，合适的进料速率，合适的压力，合适的营养含量(例如，合适的碳含量，合适的氮含量，合适的磷含量)，合适的补充物含量，合适的痕量金属含量和/或合适的氧合水平。在一些实施方案中，重组微生物宿主细胞基本上消除或调节其酯酶活性的产生的合适pH是2至7.5、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3或2.5；2.5至7.5、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5或3；3至7.5、6.5、6、5.5、5、4.5、4或3.5；3.5至7.5、6.5、6、5.5、5、4.5、4；4至7.5、6.5、6、5.5、5、4.5；4.5至7.5、6.5、6、5.5、5；5至7.5、6.5、6、5.5；5.5至7.5、6.5、6；6至7.5、6.5；6.5至7.5或7；或7至7.5的pH。在一些实施方案中，在其中重组微生物宿主细胞基本上消除或调节其酯酶活性的产生的培养基中的合适补充物含量是消泡剂。合适的消泡剂的非限制性实例包括Struktol J 673A(Schill&SeilacherGmbH，Hamburg,Germany)，Industrol DF204(BASF Canada，Inc.，Mississauga,Canada)，聚乙二醇P-2000(Dow，Midland，MI)，Hodag K-60K(Hodag Chemical Corp.,Chicago,IL)和Erol DF6000K(PMC Ouvrie,Carvin,France)，ACP 1500(Dow Chemical Company,Midland,MI)，消泡剂204(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)，SAG 471(Momentive PerformanceMaterials Inc.,Waterford,NY)，SAG5693(Momentive Performance Materials Inc.,Waterford,NY)，SAG710(Momentive Performance Materials Inc.,Waterford,NY)，SAG730(Momentive Performance Materials Inc.,Waterford,NY)，硅酮消泡剂，StruktolJ647(Schill&Seilacher,Hamburg,Germany)和向日葵油。
在一些实施方案中，在本文提供的用于产生食物产品的方法中的其中基本上消除或调节酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)的至少一个步骤包括基本上消除或调节从能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞的培养物获得的发酵液或制剂中的酯酶活性的步骤。
因此，在一些这样的实施方案中，本文提供的方法包括以下步骤：a)获得能够产生重组组分(例如，本文公开的任何重组组分)的重组微生物宿主细胞；b)在适于产生和/或分泌重组组分的条件下在培养基中培养重组微生物宿主细胞以获得包含重组组分的发酵液；c)任选地从发酵液中纯化重组组分以获得包含重组组分的制剂；d)基本上消除或调节发酵液或制剂中的酯酶活性以获得包含重组组分和基本上消除或调节的酯酶活性的发酵液或制剂；和e)从包含重组组分和基本上消除或调节的酯酶活性的发酵液或制剂制备食物产品。
发酵液或制剂中的酯酶活性可以被基本上消除或调节，例如，通过向发酵液或制剂中添加酯酶抑制剂。合适的酯酶抑制剂的非限制性实例包括合成抑制剂(例如膦酸酯，硼酸，脂质类似物)和天然抑制剂(例如β-内酯(例如缬氨内酯，厄贝内酯A和B，和韧革菌素(vibralactone))，甘露寡糖，乙酰胆碱酯酶抑制剂，胆碱酯酶抑制剂，多酚，皂角苷，panclicins，橙皮苷，caulerpenyne，原花青素，奥利司他(Xenical)，鼠尾草酸，七叶皂苷，西红花素，西红花酸，绿原酸，新绿原酸，阿魏酰奎尼酸，e-聚赖氨酸，壳聚糖，几丁质)，分离自例如来源诸如欧洲刺柏(Juniperus communis)，八角茴香(Illicium religiosum)，竹节参(Panax japonicus rhizome)，人参(Panax ginseng)，西洋参(Panax quinquefolius)，刺五加(Acanthopanax senticosus)，中华山茶(Camellia sinensis var.sinensis)，普洱茶(Camellia sinensis var.assamica)，地肤(Kochia scoparia)，桔梗(Platycodiradix)，网状五层龙(Salacia reticulate)，荷花(Nelumbo nucifera)，旱柳(Salixmatsudana)，野黍(Eriochloa villosa)，网状五层龙(Salacia reticulate)，华北蓝盆花(Scabiosa tschiliensis Grun)和短梗五加(Acanthopanax sessili■orous)。在一些这样的实施方案中，酯酶抑制剂需要针对活性添加pH和/或离子强度调节剂。
发酵液或制剂中的酯酶活性还可以例如通过从发酵液或制剂中去除和/或向发酵液或制剂中添加酯酶的活性所需的辅助因子和/或酯酶抑制剂的活性所需的辅助因子来基本上消除或调节。这样的辅助因子的非限制性实例包括金属(例如，二价阳离子，例如钙)。在一些实施方案中，通过将二价阳离子与螯合剂结合来去除二价阳离子(例如钙)。合适的螯合剂的非限制性实例是乙二胺四乙酸(EDTA)。
发酵液或制剂中的酯酶活性还可以例如通过热处理或非热处理来基本上消除或调节。热处理的非限制性实例包括巴氏灭菌(pasteurizing)和消毒(sterilizing)。非热处理的非限制性实例包括高压巴氏灭菌(即，高压处理，HPP)、超声处理、脉冲电场处理和辐照。在一些实施方案中，发酵液或制剂中的酯酶活性通过在高温下将发酵液或制剂温育相对短的时间段(例如，在85℃至90℃的温度持续5至10分钟)来基本上消除或降低。
在一些实施方案中，在本文提供的用于产生食物产品的方法中的其中基本上消除或调节酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)的至少一个步骤包括获得能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞的步骤，其中所述重组微生物宿主细胞包含基本上消除或调节的酯酶活性。
因此，在一些这样的实施方案中，本文提供的方法包括以下步骤：a)获得能够产生重组组分(例如，本文公开的任何重组组分)的重组微生物宿主细胞，其中与相应的重组微生物宿主细胞中所包含的酯酶活性相比，所述重组微生物宿主包含基本上消除或调节的酯酶活性；b)在适合于产生和/或分泌重组组分的条件下在培养基中培养重组微生物宿主细胞以获得包含重组组分和基本上消除或调节的酯酶活性的发酵液；c)任选地从发酵液中纯化重组组分以获得包含重组组分的制剂；和d)从包含重组组分和基本上消除或调节的酯酶活性的发酵液或制剂制备食物产品。
通过基本上消除或调节酯酶(例如，例如，本文公开的任何一种酯酶或本文公开的至少两种酯酶的任何组合)的表达(即，活性蛋白的产生)或通过基本上消除或调节酯酶的活性，可以基本上消除或调节重组微生物宿主细胞中的酯酶活性。基本上消除或调节重组微生物宿主细胞中酯酶的表达可以通过例如在重组微生物宿主细胞中遗传修饰驱动酯酶的表达的控制序列(例如启动子序列，增强子序列，信号肽，转录终止子，或控制基因表达(即转录和/或翻译)的任何其他序列)或其功能部分(即足以用于控制序列的功能的部分)以使得酯酶的表达被基本上消除或调节来实现。
基本上消除或调节重组微生物宿主细胞中酯酶的表达还可以通过例如在重组微生物宿主细胞中遗传修饰驱动酯酶表达所需的蛋白质(例如，转录因子(例如，包含与选自UniProt序列G0RX49、G0RHG1、A0A2T4B416、A0A2T4BJU6、A2R2J1、A2R903、G2Q2Z5和G2Q8I6的序列至少50％相同(例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的氨基酸序列的蛋白质)，产生活性形式的酯酶所需的翻译后修饰酶)的表达的控制序列或其功能部分或通过遗传修饰编码酯酶的表达所需的蛋白质的编码序列或其功能部分(例如，转录因子的DNA结合结构域，翻译后修饰酶的催化结构域)来实现，使得基本上消除或调节酯酶的表达。
基本上消除或调节重组微生物宿主细胞中酯酶的表达也可以通过例如将重组多核苷酸引入重组微生物宿主细胞中来实现，该重组多核苷酸包含与编码酯酶的编码序列互补的核苷酸序列，或编码对酯酶特异的RNAi构建体。
基本上消除或调节重组微生物宿主细胞中酯酶的表达或活性也可以通过例如在重组微生物宿主细胞中遗传修饰编码酯酶或其功能部分(例如催化结构域)的编码序列进行来实现。
基本上消除或调节重组微生物宿主细胞中酯酶的活性也可以通过例如在重组微生物宿主细胞中遗传修饰驱动酯酶的内源性抑制剂的表达的控制序列和/或遗传修饰编码酯酶的内源性抑制剂的编码序列以使内源性抑制剂的表达和/或活性在重组微生物宿主细胞中被基本上消除或调节或者通过在重组微生物宿主细胞中引入编码酯酶的异源抑制剂的重组多核苷酸来实现。
遗传修饰可通过例如引入、取代或去除核苷酸序列中的一个或多个核苷酸而发生。例如，可以插入或去除一个或多个核苷酸以引入终止密码子；删除起始密码子；插入开放阅读框的移码；或创建点突变，错义突变，取代突变，缺失突变，移码突变，插入突变，重复突变，扩增突变，易位突变或倒位突变。
用于遗传修饰微生物宿主细胞的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于随机诱变和筛选，定点诱变，PCR诱变，插入诱变，化学诱变(使用例如羟胺，N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，N-甲基-N'-亚硝基胍(NTG)，O-甲基羟胺，亚硝酸，甲烷磺酸乙酯(EMS)，亚硫酸氢钠，甲酸，核苷酸类似物)，辐射(例如紫外线(UV)辐射)，编码或非编码核苷酸序列的缺失，同源重组，FLP/FRT重组，基因破坏，CRISPR基因编辑和基因转换。
在一些实施方案中，在本文提供的用于产生食物产品的方法中的其中基本上消除或调节酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)的至少一个步骤包括纯化重组组分以与重组微生物宿主细胞产生的酯酶活性分离的步骤。
因此，在一些这样的实施方案中，本文提供的方法包括以下步骤：a)获得能够产生重组组分(例如，本文公开的任何重组组分)的重组微生物宿主细胞；b)在适于产生和/或分泌重组组分的条件下在培养基中培养重组微生物宿主细胞以获得包含重组组分的发酵液；c)从发酵液中纯化重组组分以获得包含重组组分的制剂，使得该制剂具有基本上消除或调节的酯酶活性；和d)从包含重组组分和基本上消除或调节的酯酶活性的制剂制备食物产品。
从发酵液中纯化重组组分可以基于将重组组分与酯酶区分开或在重组组分与酯酶之间共有的任何一种性质或性质组合来完成。这样的性质的非限制性实例包括大小，分子量，通过特定蛋白酶或蛋白酶组合的降解，等电点(pI)，电荷，热失稳性/热稳定性，对特定分子的亲和力，溶解度，pH稳定性，疏水性和亲水性。
在一些实施方案中，基于热失稳性/热稳定性纯化重组组分。在一些这样的实施方案中，将包含重组组分的发酵液(例如，澄清的发酵液(即，从其除去细胞和细胞碎片的发酵液))或制剂加热至酯酶变性并从溶液中沉淀但重组组分在结构上保持结构完整和可溶的温度。随后可以通过任何合适的方法将沉淀的酯酶与可溶性重组组分分离，所述方法包括1-g沉降、通过离心加速沉降和/或多种过滤技术，包括但不限于深度过滤或切向流过滤、使用滤垫、片材或膜。
在一些实施方案中，基于疏水性纯化重组组分。在一些这样的实施方案中，将合适的色谱支持物添加到包含重组组分的发酵液(例如，澄清的发酵液)或制剂中，并且调节发酵液或制剂的pH和/或离子强度，使得酯酶或者重组组分(但不是两者)结合到色谱支持物上(例如，基于疏水相互作用)，分别在未结合的部分中留下可溶性重组组分或酯酶。合适的色谱支持物的非限制性实例包括苯基琼脂糖，丁基琼脂糖和辛基琼脂糖。随后可以通过本领域已知的任何合适的方法，包括但不限于1-g沉降、离心或过滤，分别将具有结合的酯酶或重组组分的色谱支持物与可溶性重组组分或酯酶分离。可替代地，色谱支持物可以是固定支持物(例如，柱中的吸附剂)，使包含重组组分的发酵液或制剂通过该固定支持物，并在未结合的部分中获得重组组分，而酯酶结合至色谱支持物，或重组组分结合到色谱支持物上，而酯酶保留在未结合的部分中，随后通过例如调节pH和/或离子强度，将结合的重组组分从色谱支持物上释放出来。
在一些实施方案中，基于电荷纯化重组组分。在一些这样的实施方案中，将抗衡离子或离子交换树脂或酸钠盐添加至包含重组组分的发酵液(例如，澄清的发酵液)或制剂，并调节发酵液或制剂的pH和/或离子强度，使得抗衡离子或离子交换树脂或酸钠盐与重组组分或酯酶形成复合物，分别留下可溶性酯酶或重组组分。随后可以通过本领域已知的任何合适方法分离复合物，包括1-g沉降，通过离心加速沉降，和/或使用滤垫、片材或膜的多种过滤技术，包括但不限于深度过滤或切向流过滤。在其中重组组分与抗衡离子或离子交换树脂或酸钠盐复合的实施方案中，可以通过调节pH和/或离子强度从复合物提取重组组分以使得重组组分和抗衡离子或离子交换树脂或酸钠盐互相排斥。
在一些实施方案中，基于pH稳定性纯化重组组分。在一些这样的实施方案中，调节包含重组组分的发酵液(例如，澄清的发酵液)或制剂的pH，使得酯酶变性并从溶液中沉淀出来，留下可溶的重组组分。随后可以通过任何合适的方法将沉淀的酯酶与可溶性重组组分分离，所述方法包括但不限于1-g沉降，通过离心加速沉降，和/或使用滤垫、片材或膜的多种过滤技术，包括但不限于深度过滤或切向流过滤。
在一些实施方案中，基于电荷、热失稳性/热稳定性、疏水性、大小、分子量、pH稳定性、等电点(pI)、对特定分子的亲和力和溶解度中的两种或更多种来纯化重组组分，其中用于分离的各种策略是连续(例如，基于电荷的分离随后基于疏水性的分离，基于疏水性的分离随后基于pH稳定性的分离)或并行(例如，基于pH稳定性和热失稳性/热稳定性的分离，基于pH稳定性和对特定分子的亲和力的分离，基于溶解度和pH稳定性和/或热失稳性/热稳定性和/或pI的分离)进行的。
酯酶活性
本文提供的基本上消除或调节的酯酶活性(例如包含在包含重组组分的发酵液或制剂中或包含在本文提供的能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞中的基本上消除或调节的酯酶活性)可以是任何一种酯酶或至少两种(例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或更多种)酯酶的任何组合的基本上消除或调节的活性。
这样的酯酶的非限制性实例包括羧酸酯水解酶(EC编号3.1.1)、磷酸二酯水解酶(EC编号3.1.4)、外切核糖核酸酶(EC编号3.1.13)、羧酸酯酶(EC编号3.1.1.1)、芳基酯酶(EC编号3.1.1.2)、三酰基甘油脂酶(EC编号3.1.1.3)、磷脂酶A2(EC编号3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC编号3.1.1.5)、乙酰酯酶(EC编号3.1.1.6)、乙酰胆碱酯酶(EC编号3.1.1.7)、磷脂酶C(EC编号3.1.4.3)、磷脂酶D(EC编号3.1.4.4)、磷酸肌醇磷脂酶C(3.1.4.11)、果胶酯酶(EC编号3.1.1.11)、葡萄糖酸内酯酶(EC编号3.1.1.17)、酰基甘油脂酶(EC编号3.1.1.23)、3-氧代己二酸酯烯醇-内酯酶(EC编号3.1.1.24)、1,4-内酯酶(EC编号3.1.1.25)、半乳糖脂酶(EC编号3.1.1.26)、磷脂酶A1(EC编号3.1.1.32)、脂蛋白脂酶(EC编号3.1.1.34)、头孢菌素C脱乙酰基酶(EC编号3.1.1.41)、羧甲烯丁烯羟酸内酯酶(carboxymethylenebutenolidase)(EC编号3.1.1.45)、2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶(EC编号3.1.1.57)、阿魏酸酯酶(EC编号3.1.1.73)、角质酶(EC编号3.1.1.74)和激素敏感性脂酶(EC编号3.1.1.79)。
合适的羧酸酯水解酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码羧酸酯水解酶的任何序列的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的同一性的氨基酸序列。
表1–示例性酯酶(UniProt序列ID)
Figure GDA0003164359190000191
Figure GDA0003164359190000201
Figure GDA0003164359190000211
在一些实施方案中，羧酸酯水解酶包含与选自UniProt序列G0RIU1、A2R1N7、G0RBM4、A0A2T4BBP9、G2Q379、A0A2T4AZ21、A2R8Z3、G0R9X3、A2QPC2、G0RCG3、A0A2T4BCL7、A0A2T4B416和A0A2T4BNI9的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
合适的磷酸二酯水解酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码磷酸二酯水解酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的外切核糖核酸酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码外切核糖核酸酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的羧酸酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码羧酸酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的芳基酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码芳基酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的三酰基甘油脂酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码三酰基甘油脂酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，三酰基甘油脂酶包含与选自UniProt序列A2QM14和A2R709的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
合适的磷脂酶A2的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码磷脂酶A2的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的溶血磷脂酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码溶血磷脂酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，溶血磷脂酶包含与选自UniProt序列G0RX90、G2Q0K1、A0A2T4B235、A2QC75和A2QF42的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
合适的乙酰酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码乙酰酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，乙酰酯酶包含与选自UniProt序列G0RHJ4、A0A2T4BJD9和G2QL32的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
合适的乙酰胆碱酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码乙酰胆碱酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的磷脂酶C的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码磷脂酶C的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，磷脂酶C包含与选自UniProt序列G0REM9、A0A2T4BFY3和A2QAD7的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
合适的磷脂酶D的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码磷脂酶D的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的磷酸肌醇磷脂酶C的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码磷酸肌醇磷脂酶C的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的果胶酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码果胶酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的葡萄糖酸内酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码葡萄糖酸内酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的酰基甘油脂酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码酰基甘油脂酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的3-氧代己二酸酯烯醇-内酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码3-氧代己二酸酯烯醇-内酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的1,4-内酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码1,4-内酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的半乳糖脂酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码半乳糖脂酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的磷脂酶A1的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码磷脂酶A1的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的脂蛋白脂酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码脂蛋白脂酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的头孢菌素C脱乙酰基酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码头孢菌素C脱乙酰基酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的羧甲烯丁烯羟酸内酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码羧甲烯丁烯羟酸内酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的阿魏酸酯酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码阿魏酸酯酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
合适的角质酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码角质酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，角质酶包含与选自UniProt序列G0RH85、A2QBP1、A0A2T4BJB5、A5ABE6、A2R2W3和G2QH51的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
合适的激素敏感性脂酶的非限制性实例包括酯酶，其包含与选自表1中所列的编码激素敏感性脂酶的任何序列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列。
其他合适的酯酶的非限制性实例包括包含与表1中所列的序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列的酯酶，以及包含与表2中所列的InterPro结构域中的任一个至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列的酯酶。
表2：示例性酯酶催化结构域的InterPro编号
Figure GDA0003164359190000281
Figure GDA0003164359190000291
本文公开的酯酶包括作为本文公开的酯酶的保守修饰的变体的酯酶。如本文所用，术语“保守修饰的变体”是指编码的氨基酸序列的个别取代、缺失或添加，其导致氨基酸被化学相似的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。本文公开的酯酶还包括本文公开的酯酶的多态性变体、种间同系物和等位基因。
在其中基本上消除或调节的酯酶活性(例如，在本文提供的包含重组组分的发酵液或制剂中或在本文提供的能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞中包含的基本上消除或调节的酯酶活性)包含至少两种酯酶的基本上消除或调节的活性的实施方案中，这样的至少两种酯酶可以包含一种或多种(例如，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，六种或更多种，七种或更多种，八种或更多种，九种或更多种，十种或更多种，十一种或更多种，十二种或更多种等)任何酯酶(例如，本文提供的任何酯酶)。
这样的酯酶的非限制性实例包括羧酸酯水解酶(EC编号3.1.1)、磷酸二酯水解酶(EC编号3.1.4)、外切核糖核酸酶(EC编号3.1.13)、羧酸酯酶(EC编号3.1.1.1)、芳基酯酶(EC编号3.1.1.2)、三酰基甘油脂酶(EC编号3.1.1.3)、磷脂酶A2(EC编号3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC编号3.1.1.5)、乙酰酯酶(EC编号3.1.1.6)、乙酰胆碱酯酶(EC编号3.1.1.7)、磷脂酶C(EC编号3.1.4.3)、磷脂酶D(EC编号3.1.4.4)、磷酸肌醇磷脂酶C(3.1.4.11)、果胶酯酶(EC编号3.1.1.11)、葡萄糖酸内酯酶(EC编号3.1.1.17)、酰基甘油脂酶(EC编号3.1.1.23)、3-氧代己二酸酯烯醇-内酯酶(EC编号3.1.1.24)、1,4-内酯酶(EC编号3.1.1.25)、半乳糖脂酶(EC编号3.1.1.26)、磷脂酶A1(EC编号3.1.1.32)、脂蛋白脂酶(EC编号3.1.1.34)、头孢菌素C脱乙酰基酶(EC编号3.1.1.41)、羧甲烯丁烯羟酸内酯酶(EC编号3.1.1.45)、2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶(EC编号3.1.1.57)、阿魏酸酯酶(EC编号3.1.1.73)、角质酶(EC编号3.1.1.74)和激素敏感性脂酶(EC编号3.1.1.79)及其组合。
这样的组合的非限制性实例包括：一种或多种角质酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种细胞外脂酶样蛋白和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种GDSL脂酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种调节酯酶的表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种GDSL脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种三酰基甘油脂酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种磷脂酶A2；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种磷脂酶C；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种GDSL脂酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种磷脂酶A2；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种磷脂酶C；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种GDSL脂酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种磷脂酶C；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种GDSL脂酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种α/β水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种磷脂酶C和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种磷脂酶C和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种GDSL脂酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种α/β水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种GDSL脂酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种GDSL脂酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种GDSL脂酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种GDSL脂酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种α/β水解酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种GDSL脂酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种磷脂酶A2以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种磷脂酶C以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种乙酰酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种GDSL脂酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种磷脂酶A2以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种磷脂酶C以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种乙酰酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种GDSL脂酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种α/β水解酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种磷脂酶C以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种乙酰木聚糖酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种细胞外脂酶样蛋白以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种乙酰酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种GDSL脂酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种α/β水解酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种调节酯酶表达的转录因子以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种乙酰木聚糖酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种磷脂酶C和一种或多种乙酰酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种GDSL脂酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种α/β水解酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种调节酯酶表达的转录因子以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种乙酰酯酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种GDSL脂酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种α/β水解酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种GDSL脂酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种α/β水解酶以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种GDSL脂酶和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种GDSL脂酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种α/β水解酶和一种或多种调节酯酶表达的转录因子以及一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶以及一种或多种三酰基甘油脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶以及一种或多种磷脂酶A2；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶以及一种或多种磷脂酶C；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶以及一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶以及一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶以及一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶以及一种或多种GDSL脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶以及一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶以及一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂酶以及一种或多种磷脂酶A2；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂酶以及一种或多种磷脂酶C；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂酶以及一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂酶以及一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂酶以及一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂酶以及一种或多种GDSL脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂酶以及一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂酶以及一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2以及一种或多种磷脂酶C；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2以及一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2以及一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2以及一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2以及一种或多种GDSL脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2以及一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2以及一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C以及一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C以及一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C以及一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C以及一种或多种GDSL脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C以及一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C以及一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶以及一种或多种细胞外脂酶样蛋白；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶以及一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶以及一种或多种GDSL脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶以及一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶以及一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白以及一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白以及一种或多种GDSL脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白以及一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种细胞外脂酶样蛋白以及一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰酯酶以及一种或多种GDSL脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰酯酶以及一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰酯酶以及一种或多种调节酯酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种GDSL脂酶以及一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种GDSL脂酶以及一种或多种调节酯酶表达的转录因子；以及一种或多种角质酶和一种或多种含α/β水解酶折叠结构域的蛋白质以及一种或多种调节酯酶表达的转录因子。
在本文提供的用于产生食物产品的方法的至少一个步骤中或在本文提供的包含重组体的发酵液或制剂中或在本文提供的能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞中其活性必须被基本上消除或调节的酯酶的合适数量和/或组合可以通过本领域中已知的方法鉴定。例如，可以通过本领域已知的方法(例如，采用亲和色谱，酶谱测定，凝胶电泳)分离酯酶，并在体外进行测试，以确定哪一种酯酶或至少两种酯酶的哪种组合提供对特定的甘油二酯、甘油三酯、磷脂或脂蛋白的实质量降解。此外，可以获得能够产生重组组分(例如，本文公开的任何重组组分)的重组微生物宿主细胞，其包含在至少两种酯酶中的任何一种或任何组合中基本上消除或调节的活性，并且可以通过本领域已知的方法来测量包含由每个这样的重组微生物宿主细胞产生的重组组分的食物产品的脂质降解的减少或消除的程度。
在一些实施方案中，本文提供的包含重组组分的发酵液或制剂或本文提供的能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞包含提供可用于产生特定食物产品的酯酶活性的特定特征谱(即酯酶活性谱)的酯酶活性的组合和/或水平。在一些这样的实施方案中，酯酶活性谱被优化以提供食物产品的期望的风味、香气、质地、乳化、营养含量和/或保质期。
酯酶活性可以使用酶测定法测量。例如，可以使用例如PAGE凝胶、分光光度计、成像、UV/Vis、光和HPLC，通过比色反应产物或可以被检测的产物(例如，由酯酶催化的甘油三酯水解产生的游离脂肪酸和/或甘油)的产生来确定酶活性。
产生重组组分并包含基本上消除或调节的酯酶活性的重组微生物宿主细胞
在另一方面，本文提供了一种重组微生物宿主细胞，其能够产生重组组分并且包含与相应重组微生物宿主细胞中包含的酯酶活性相比基本上消除或调节的酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)。
可以通过任何方式基本上消除或调节包含在本文提供的重组微生物宿主细胞中的酯酶活性。在一些实施方案中，通过基本上消除或调节酯酶的表达(即活性蛋白的产生)或通过基本上消除或调节酯酶的活性来基本上消除或调节酯酶活性。因此，在各种实施方案中，本文提供的重组微生物宿主细胞包含：a)驱动酯酶的表达的控制序列(例如启动子序列，增强子序列，信号肽，转录终止子或控制基因表达(即转录和/或翻译)的任何其他序列)或其功能部分(即，足以用于控制序列的功能的部分)中的遗传修饰，其中遗传修饰基本上消除或调节酯酶的表达；b)编码酯酶或其功能部分(例如催化结构域)的编码序列中的遗传修饰，其中该遗传修饰基本上消除或调节该酯酶的活性；c)驱动表达酯酶所需的蛋白质(例如转录因子，产生酯酶活性形式所需的翻译后修饰酶)的表达的控制序列或其功能部分(即足以用于控制序列的功能的部分)中的遗传修饰，其中遗传修饰基本上消除或调节表达酯酶所需的蛋白质的表达，从而基本上消除或调节酯酶的表达；d)编码表达酯酶所需的蛋白质或其功能部分(例如，转录因子的DNA结合结构域，翻译后修饰酶的催化结构域)的编码序列中的遗传修饰，其中遗传修饰基本上消除或调节表达酯酶所需的蛋白质的活性，从而基本上消除或调节酯酶的表达；e)驱动酯酶的内源性抑制剂的表达的控制序列或其功能部分(即足以用于控制序列的功能的部分)中的遗传修饰，其中该遗传修饰基本上消除或调节内源性抑制剂的表达，从而基本上消除或调节酯酶的表达；f)编码酯酶的内源性抑制剂的编码序列中的遗传修饰，其中该遗传修饰基本上消除或调节内源性抑制剂的活性，从而基本上消除或调节酯酶的表达；和/或g)引入编码酯酶的异源(即非天然)抑制剂的编码序列的遗传修饰，其中该遗传修饰提供了异源抑制剂的产生，从而基本上消除或调节酯酶的表达。
遗传修饰可以由例如多核苷酸序列中一个或多个核苷酸的插入、取代或缺失组成。遗传修饰可以例如引入终止密码子；删除起始密码子；插入开放阅读框的移码；或创建点突变，错义突变，取代突变，缺失突变，移码突变，插入突变，重复突变，扩增突变，易位突变或倒位突变。
在一些实施方案中，本文提供的重组微生物宿主细胞包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含与编码酯酶(例如，本文公开的任何一种酯酶或本文公开的至少两种酯酶的任何组合)的编码序列互补、编码对酯酶特异的RNAi构建体或编码酯酶活性的异源抑制剂的核苷酸序列。
在其中本文提供的重组微生物宿主细胞包含基本上消除或调节酯酶表达所需的蛋白质的表达或活性的遗传修饰的一些实施方案中，酯酶表达所需的这样的蛋白质是调节酯酶的表达的转录因子。在一些这样的实施方案中，调节酯酶表达的转录因子包含与选自表1中所列的编码调节酯酶表达的转录因子的任何序列的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些这样的实施方案中，调节酯酶表达的转录因子包含与选自UniProt序列G0RX49、G0RHG1、A0A2T4B416、A0A2T4BJU6、A2R2J1、A2R903、G2Q2Z5和G2Q8I6的序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些这样的实施方案中，本文提供的重组微生物宿主细胞包含一种或多种遗传修饰，其基本上消除或调节调节一种或多种酯酶的表达的至少两种转录因子的组合的表达或活性。
在一些实施方案中，本文提供的重组微生物宿主细胞能够产生重组组分，并包含与相应重组微生物宿主细胞中所包含的酯酶活性相比减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)。在一些这样的实施方案中，本文提供的重组微生物宿主细胞包含基本上消除的酯酶活性。在其他实施方案中，本文提供的重组微生物宿主细胞能够产生重组组分，并且包含与相应的重组微生物宿主细胞中所包含的酯酶活性相比增至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％或至少1000％的酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)。
微生物宿主细胞
本文提供的重组微生物宿主细胞可以来源于任何微生物细胞。在一些实施方案中，本文提供的重组微生物宿主细胞是重组细菌宿主细胞。重组细菌宿主细胞可以来源于本领域已知的任何细菌菌株。细菌菌株的非限制性实例包括厚壁菌门(firmicutes)、蓝细菌(cyanobacteria)(蓝绿藻)、颤藻亚目(oscillatoriophcideae)、芽孢杆菌目(bacillales)、乳杆菌目(lactobacillales)、颤藻目(oscillatoriales)、芽胞杆菌科(bacillaceae)、乳杆菌科(lactobacillaceae)、弱氧化醋酸杆菌(Acetobactersuboxydans)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、米苏里游动放线菌(Actinoplanemissouriensis)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、极大节旋藻(Arthrospiramaxima)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cerus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸乳球菌Lancefield血清群N(Lactococcus lactis Lancefield Group N)、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)、噬柠檬酸明串珠菌(Leuconostoc citrovorum)、葡聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranicum)、肠系膜明串珠菌菌株NRRL B-512(F)(Leuconostoc mesenteroides strain NRRL B-512(F))、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、螺旋藻(Spirulina)、乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、乳酸链球菌双醋酸亚种(Streptococcus lactis subspeciesdiacetylactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、纳塔尔链霉菌(Streptomyces natalensis)、橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)、橄榄产色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)、锈赤链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophile)、Tetrahymena hegewischi、Tetrahymenahyperangularis、Tetrahymena malaccensis、Tetrahymena pigmentosa、梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)和Tetrahymena vorax、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)及其衍生物和杂交种。
在一些实施方案中，本文提供的重组微生物宿主细胞是重组酵母宿主细胞。重组酵母宿主细胞可以来源于本领域已知的任何酵母菌株。酵母菌株的非限制性实例包括白色念珠菌(Candida albicans)、Candida etchellsii、高里假丝酵母(Candidaguilliermondii)、扁平云假丝酵母(Candida humilis)、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)、伪热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、皱状假丝酵母(Candida versatilis)、汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyceshansenii)、阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母的种(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、毕赤酵母属的种(Pichia sp.)、巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichialindneri)、Pichia opuntiae、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、Pichiasalictaria、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、红酵母属的种(Rhodotorulasp.)、酵母属的种(Saccharomyces sp.)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、Saccharomyces beticus、酿酒酵母、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、少孢酵母(Saccharomyces exiguus)、Saccharomyces florentinus、脆壁酵母(Saccharomycesfragilis)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)、裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、清酒酵母(Saccharomyces sake)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)及其衍生物和杂交种。
在一些实施方案中，本文提供的重组微生物宿主细胞是重组丝状真菌宿主细胞。重组丝状真菌宿主细胞可以来源于本领域已知的任何丝状真菌菌株，包括其任何全纯(holomorphic)型、有性(teleomorphic)型或无性(anamorphic)型形式。丝状真菌菌株的非限制性实例包括支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Canariomyces、毛壳属(Chaetonium)、Chaetomidium、棒囊壳属(Corynascus)、隐球菌属(Cryptococcus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Coonemeria、Dactylomyces、裸孢壳属(Emericella)、Filibasidium、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、香菇属(Lentinula)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、Malbranchium、Melanocarpus、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Phenerochaete、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢霉属(Scytalidium)、侧孢霉属(Sporotrichum)、韧革菌属(Stereum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热真菌属(Thermomyces)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)和木霉属(Trichoderma)菌株。
支顶孢属菌株的非限制性实例包括亚拉巴马支顶孢(Acremonium alabamense)。曲霉属菌株的非限制性实例包括刺曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、黑曲霉泡盛变种(Aspergillus niger var.awamori)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)和土曲霉(Aspergillus terreus)以及裸孢壳属、新萨托菌属(Neosartorya)和石座菌属(Petromyces)物种。金孢子菌属菌株的非限制性实例包括Chrysosporium botryoides、Chrysosporium carmichaeli、Chrysosporiumcrassitunicatum、Chrysosporium europae、Chrysosporium evolceannui、Chrysosporiumfarinicola、Chrysosporium fastidium、Chrysosporium filiforme、Chrysosporiumgeorgiae、Chrysosporium globiferum、Chrysosporium globiferum var.articulatum、Chrysosporium globiferum var.niveum、Chrysosporium hirundo、Chrysosporiumhispanicum、Chrysosporium holmii、Chrysosporium indicum、Chrysosporium iops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium kreiselii、Chrysosporium kuzurovianum、Chrysosporium lignorum、Chrysosporium obatum、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium lucknowense Garg 27K、Chrysosporiummedium、Chrysosporiummedium var.spissescens、Chrysosporium mephiticum、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporium merdarium var.roseum、微小金孢子菌(Chrysosporium minor)、Chrysosporium pannicola、短小金孢子菌(Chrysosporiumparvum)、短小金孢子菌新月变种(Chrysosporium parvum var.crescens)、Chrysosporiumpilosum、Chrysosporium pseudomerdarium、梨形金孢菌(Chrysosporium pyriformis)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium sigleri、硫磺金孢子菌(Chrysosporiumsulfureum)、Chrysosporium synchronum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium undulatum、Chrysosporium vallenarense、Chrysosporium vespertilium和Chrysosporium zonatum。
镰刀菌属菌株的非限制性实例包括串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、层生镰孢菌(Fusarium proliferatum)、轮枝镰刀菌(Fusariumverticiollioides)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、克地镰刀菌(Fusariumcrookwellense)、梨孢镰刀菌(Fusarium poae)、拟枝孢镰刀菌(Fusariumsporotrichioides)、Fusarium sambuccinum和Fusarium torulosum，以及其相关的赤霉属有性型形式。毁丝霉属菌株的非限制性实例包括嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)。毛霉菌属菌株的非限制性实例包括Mucor miehei Cooney et Emerson(米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)(Cooney&R.Emerson))Schipper和Mucor pusillus Lindt。脉孢菌属菌株的非限制性实例包括粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。
青霉属菌株的非限制性实例包括产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)和娄地青霉(Penicillium roquefortii)。根霉属菌株的非限制性实例包括雪白根霉(Rhizopusniveus)。侧孢霉属菌株的非限制性实例包括Sporotrichum cellulophilum。梭孢壳属菌株的非限制性实例包括Thielavia terrestris。木霉属菌株的非限制性实例包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长柄木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、深绿木霉(Trichodermaatroviride)、绿木霉(Trichoderma virens)、桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)和绿色木霉(Trichoderma viride)以及其替代的两性/有性形式(即Hypocrea物种)。
本文提供的重组微生物宿主细胞可以是有孢子形成能力的或是孢子形成缺陷的。
本文提供的重组微生物宿主细胞可以来源于野生型微生物细胞或其遗传变异体(例如，突变体)。
本文提供的重组微生物宿主细胞可以来源于通常认可为安全(GRAS)工业菌株。
本文提供的重组微生物宿主细胞可以具有高的外源分泌蛋白/生物质比率。在一些这样的实施方案中，该比率大于约1:1、大于约2:1、大于约3:1、大于约4:1、大于约5:1、大于约6:1、大于约7:1或大于约8:1。
在一些实施方案中，本文提供的包含基本上消除或调节的酯酶或至少两种(例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或更多种)酯酶的组合的活性的重组微生物宿主细胞选自包含基本上消除或调节的酯酶或至少两种(例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或更多种)酯酶的组合的活性的重组里氏木霉宿主细胞(即来源于里氏木霉菌株的重组宿主细胞)，包含基本上消除或调节的酯酶或至少两种(例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或更多种)酯酶的组合的活性的重组黑曲霉宿主细胞(即来源于黑曲霉菌株的重组宿主细胞)，包含基本上消除或调节的酯酶或至少两种(例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或更多种)酯酶的组合的活性的重组桔绿木霉宿主细胞(即来源于桔绿木霉菌株的重组宿主细胞)，和包含基本上消除或调节的酯酶或至少两种(例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种或更多种)酯酶的组合的活性的重组嗜热毁丝霉宿主细胞(即来源于嗜热毁丝霉菌株的重组宿主细胞)
重组组分
本文提供的重组微生物宿主细胞能够产生重组组分。重组组分的非限制性实例包括蛋白质、脂质、碳水化合物、小分子、食品添加剂、食品补充剂(例如维生素)、营养保健品和益生菌。
在一些实施方案中，重组组分是重组蛋白。在一些实施方案中，重组蛋白是重组植物蛋白。如本文所用，术语“植物蛋白”是指包含与天然存在于植物中的蛋白质(即由植物细胞天然产生的蛋白质)中的氨基酸序列至少80％相同(例如至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同、100％相同)的至少20个氨基酸(例如至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少150和通常不超过250个氨基酸)的序列的多肽。植物蛋白的非限制性实例包括来源于以下的蛋白质：苏铁、银杏、针叶树、柏树、杜松、金钟柏、雪松、松树、当归、葛缕子、芫荽、小茴香、茴香、欧芹、莳萝、蒲公英、蜡菊、金盏花、艾蒿、红花、甘菊、生菜、苦艾、金盏花、香茅、鼠尾草、百里香、奇亚籽、芥末、橄榄、咖啡、辣椒、茄子、红辣椒、蔓越莓、猕猴桃、蔬菜植物(例如胡萝卜、芹菜)、万寿菊、艾菊、龙蒿、向日葵、冬青树、罗勒、牛膝草、熏衣草、柠檬马鞭草、马郁兰、蜜蜂花、广霍香、薄荷油、薄荷、迷迭香、芝麻、留兰香、报春花、翅果、胡椒、甘椒树、马铃薯、甘薯、番茄、蓝莓、茄科植物、矮牵牛花、牵牛花、丁香、茉莉、金银花、金鱼草、欧车前、土荆芥、荞麦、苋菜、莙荙菜、藜麦、菠菜、大黄、荷荷巴油、cypselea、小球藻、马鲁拉树、榛子、卡诺拉油菜籽、羽衣甘蓝、白菜、芜菁甘蓝、乳香、没药、榄香脂、大麻、南瓜、西葫芦、葫芦(curcurbit)、树薯、黄檀、豆类植物(例如苜蓿、扁豆、黄豆、三叶草、豌豆、蚕豆(fava coceira)、frijole bolaroja、frijole negro、胡枝子、甘草、羽扇豆、牧豆树、角豆树、大豆、花生、罗望子树、紫藤、决明子、鸡心豆/鹰嘴豆、胡卢巴、绿豌豆、黄豌豆、糖荚豌豆、利马豆、蚕豆)、天竺葵、亚麻、石榴、棉花、秋葵、印度楝、无花果、桑树、丁香、桉树、茶树、绿花白千层(niaouli)、结果类植物(例如苹果、杏、桃、李、梨、油桃)、草莓、黑莓、覆盆子、樱桃、洋李、玫瑰、橘、柑橘类(例如葡萄柚、柠檬、酸橙、橙子、苦橙、柑橘(mandarin)、柑桔(tangerine))、芒果、佛手柑、布枯、葡萄、西兰花、抱子甘蓝、亚麻荠(camelina)、花椰菜、油菜、油菜籽(卡诺拉油菜籽)、萝卜、卷心菜、黄瓜、西瓜、蜜瓜、绿皮西葫芦、桦木、胡桃、木薯、猴面包树、多香果、杏仁、面包果、檀香木、澳洲坚果、芋头、晚香玉、芦荟、大蒜、洋葱、葱、香草、丝兰、香根草、高良姜、大麦、玉米、郁金、生姜、柠檬草、燕麦、棕榈、菠萝、大米、黑麦、高粱、小黑麦、姜黄、山药、竹子、大麦、白千层、美人蕉、小豆蔻、玉米、燕麦、小麦、肉桂、黄樟、桂皮钓樟(lindera benzoin)、月桂树、鳄梨、依兰、肉豆蔻干皮(mace)、肉豆蔻、辣木、马尾、牛至、香菜、山萝卜、细香葱、聚合果、谷物植物、草药植物、叶类蔬菜、非谷物豆类植物、坚果植物、肉质植物、陆生植物、水生植物、delbergia、小米、核果、裂果、开花植物、非开花植物、栽培植物、野生植物、树木、灌木、花卉、草、草本植物、灌木丛、藤本植物、仙人掌、热带植物、亚热带植物、温带植物以及其衍生物和杂交种。
在一些实施方案中，植物蛋白是豌豆蛋白(例如豆球蛋白、蚕豆球蛋白(vicillin)、covicillin)。在其他实施方案中，植物蛋白是马铃薯蛋白(例如结节蛋白(tuberin)、蛋白酶抑制剂标记II)。
在一些实施方案中，重组蛋白是重组动物蛋白。如本文所用，术语“动物蛋白”是指包含与天然存在于动物中的蛋白质(即由动物细胞天然产生的蛋白质)中的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同、100％相同)的至少20个氨基酸(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少150和通常不超过250个氨基酸)的序列的多肽。动物蛋白的非限制性实例包括来源于昆虫(例如苍蝇)、哺乳动物(例如牛、绵羊、山羊、兔子、猪、人)或鸟类(例如鸡)的蛋白质。在一些实施方案中，动物蛋白是结构蛋白(例如胶原蛋白、原弹性蛋白、弹性蛋白)。在其他实施方案中，动物蛋白是卵蛋白(例如卵清蛋白)。
在其他实施方案中，重组蛋白是重组乳蛋白。如本文所用，术语“乳蛋白”是指包含与天然存在于哺乳动物产生的乳中的蛋白质(即对于哺乳动物产生的乳而言是天然的蛋白质)中的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同、100％相同)的至少20个氨基酸(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少150和通常不超过250个氨基酸)的序列的多肽。
重组乳蛋白可以是重组乳清蛋白或重组酪蛋白。如本文所用，术语“乳清蛋白”或“酪蛋白”是指分别包含与天然乳清蛋白或酪蛋白中的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同、100％相同)的至少20个氨基酸(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少150和通常不超过250个氨基酸)的序列的多肽。乳清蛋白的非限制性实例包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、转铁蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶和糖巨肽。酪蛋白的非限制性实例包括β-酪蛋白、γ-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白和α-S2-酪蛋白。编码乳清蛋白和酪蛋白的核酸序列的非限制性实例公开在2015年8月21日提交的PCT申请PCT/US2015/046428和2017年8月25日提交的PCT申请PCT/US2017/48730中，其通过引用整体并入本文。
重组乳蛋白可来源于任何哺乳动物物种，包括但不限于牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、山羊、猴子、猿、猫、狗、小袋鼠、大鼠、老鼠、大象、负鼠、兔子、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎和针鼹鼠。
重组乳蛋白可缺少能在人或动物中引发免疫反应的表位。这样的重组乳蛋白特别适合用于食物产品中。
重组乳蛋白可具有翻译后修饰。如本文所用，术语“翻译后修饰”或其首字母缩略词“PTM”是指蛋白质生物合成后化学基团与蛋白质的共价附接。PTM可以出现在蛋白质的氨基酸侧链或其C或N末端。PTM的非限制性实例包括糖基化(即聚糖基团(即单糖、二糖、多糖、线性聚糖、支链聚糖、带有呋喃半乳糖(galf)残基的聚糖、带有硫酸酯和/或磷酸酯残基的聚糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-神经氨酸、呋喃半乳糖、磷酸二酯、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸及其组合；参见，例如，Deshpande等人,2008.Glycobiology18(8):626)通过C-键联、N-键联或O-键联或通过糖基磷脂酰肌醇化(即添加糖基磷脂酰肌醇锚)或磷酸糖基化(即通过磷酸丝氨酸的磷酸盐连接)、磷酸化(即磷酸基团与蛋白质共价附接)、烷基化(即烷烃基团(例如甲基化中的甲烷基团)与蛋白质共价附接))和脂化(即脂质基团的共价附接(例如，异戊烯基化和异戊二烯化中的异戊二烯基团(例如，法尼基化中的法尼醇基团、牻牛儿基化中的香叶醇基团、香叶酰香叶酰化中的香叶基香叶醇基团)，脂肪酰化中的脂肪酸基团(例如，肉豆蔻酰化中的肉豆蔻酸、棕榈酰化中的棕榈酸)，糖基磷脂酰肌醇化中的糖基磷脂酰肌醇锚))、羟基化(即羟基的共价附接)、SUMO化(即小泛素样修饰剂(或SUMO)蛋白与蛋白质的附接)、亚硝基化(即NO基团与蛋白质的附接)和酪氨酸硝化(即，硝酸酯基团与蛋白质的酪氨酸残基的附接)共价附接于蛋白质)。重组乳蛋白的PTM可以是天然PTM、非天然PTM或至少一种天然PTM和至少一种非天然PTM的混合物。如本文所用，术语“非天然PTM”是指与天然蛋白质(即具有“天然PTM”的蛋白质)相比，蛋白质中一种或多种PTM(例如糖基化、磷酸化)的一个或多个位置的差异和/或蛋白质中一个或多个位置的一种或多种PTM的类型的差异。
重组乳蛋白可具有乳蛋白重复序列。如本文所用，术语“乳蛋白重复序列”是指与哺乳动物产生的乳中存在的蛋白质(例如乳清蛋白、酪蛋白)中的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少85％、至少90％、至少95％相同、至少99％相同)并且在重组乳蛋白中存在多于一次(例如，至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少10次、至少15次、至少20次、至少30次、至少40次、至少50次、至少75次、至少100次、至少150次或至少200次)的氨基酸序列。乳蛋白重复序列可以包含至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少75个、至少100个或至少150个并且通常不超过200个氨基酸。重组乳蛋白中的乳蛋白重复序列可以是连续的(即，没有插入的氨基酸序列)或不连续的(即，具有插入的氨基酸序列)。当非连续地存在时，插入的氨基酸序列可以在提供分子量时发挥被动作用而不会引入不希望的特性，或者可以在提供特定的特性(例如溶解性、生物降解性、与其他分子的结合)时发挥主动作用。
在一些实施方案中，重组蛋白是重组藻类蛋白。如本文所用，术语“藻类蛋白”是指包含与藻类中天然存在的蛋白质(即藻类细胞天然产生的蛋白质)中的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％相同、至少85％相同、至少有90％相同、至少95％相同、至少99％相同、100％相同)的至少20个氨基酸(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少150，通常不超过250个氨基酸)的序列的多肽。
在一些实施方案中，重组蛋白是重组真菌蛋白。如本文所用，术语“真菌蛋白”是指包含与真菌中天然存在的蛋白质(即真菌细胞天然产生的蛋白质)中的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％相同、至少85％相同、至少有90％相同、至少95％相同、至少99％相同、100％相同)的至少20个氨基酸(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少150，通常不超过250个氨基酸)的序列的多肽。
在一些实施方案中，重组蛋白是重组微生物蛋白。如本文所用，术语“微生物蛋白”是指包含与微生物中天然存在的蛋白质(即微生物细胞天然产生的蛋白质)中的氨基酸序列至少80％相同(例如，至少80％相同、至少85％相同、至少有90％相同、至少95％相同、至少99％相同、100％相同)的至少20个氨基酸(例如，至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少150，通常不超过250个氨基酸)的序列的多肽。
一般方法
能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞可以使用本领域已知的方法获得。重组微生物宿主细胞通常包含编码重组组分的重组多核苷酸(例如重组载体)。重组多核苷酸可以通过本领域已知的任何合适方法来制备，包括但不限于直接化学合成和克隆。
重组多核苷酸通常包含一个或多个表达盒，其中每个表达盒包含：启动子(例如，真菌启动子)，任选的信号序列(即，编码肽的序列，所述肽介导递送附接至所述肽的新生蛋白至在其中合成新生蛋白的细胞的外部)，编码重组蛋白的序列以及终止序列(或多个终止序列)，其中启动子在有义方向上可操作地连接至任选的信号序列(即，启动子和任选的信号序列以及随后的编码蛋白质的序列被定位为使得启动子有效用于调节任选的信号序列和编码蛋白质的序列的转录)，任选的信号序列以有义方向可操作地连接至编码重组蛋白的序列(即信号序列和编码重组蛋白的序列被定位为使得转录和翻译产生包含功能性信号序列的重组蛋白)，并且将终止序列可操作地连接至编码重组蛋白的序列(即，编码重组蛋白的序列和终止序列被定位为使得终止子有效用于终止任选的信号序列和编码重组蛋白的序列的转录)。
启动子可以是在重组微生物宿主细胞中有功能的任何合适的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。在其他实施方案中，启动子是诱导型启动子或抑制型启动子(例如，在葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、纤维素、槐糖、龙胆二糖、山梨糖、诱导纤维素酶启动子的二糖、淀粉、色氨酸或磷酸盐的存在下被诱导或抑制的启动子)。用于重组丝状真菌宿主细胞的合适启动子的非限制性实例包括编码以下任何蛋白质的基因的启动子及其功能部分：葡糖淀粉酶(例如黑曲霉、泡盛曲霉、日本曲霉、塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)、臭曲霉或碳黑曲霉(Aspegillus carbonarius)的glaA)，淀粉酶(例如米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定α-淀粉酶，真菌α-淀粉酶(amy)，细菌α-淀粉酶)，蛋白酶(例如，米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶，米曲霉碱性蛋白酶，尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶，里氏木霉蛋白酶)，脂酶(例如米黑根毛霉脂酶)，异构酶(例如米曲霉磷酸丙糖异构酶，真菌磷酸丙糖异构酶(tpi)，酵母磷酸丙糖异构酶)，乙酰胺酶(例如构巢曲霉或米曲霉或其他真菌乙酰胺酶(amdS))，脱氢酶(例如，真菌乙醇脱氢酶(adhA)，真菌3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)，酵母乙醇脱氢酶)，木聚糖酶(例如，真菌木聚糖酶(xlnA)，木霉木聚糖酶(xyn1、xyn2、bxl1))，激酶(例如，酵母3-磷酸甘油酸激酶)，水解酶(例如真菌纤维二糖水解酶I(cbh1)，木霉水解酶(cbh2、egl1、egl2))，磷酸酶(例如镰刀菌酸性磷酸酶)和其他真菌蛋白(例如真菌内切α-L-阿拉伯糖酶(abnA)，真菌α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶A(abfA)，真菌α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶B(abfB)，真菌植酸酶，真菌ATP合成酶，真菌亚基9(oliC)，真菌孢子形成特异性蛋白(Spo2)，真菌SSO，酵母醇氧化酶，酵母乳糖酶，粗糙脉孢菌CPC1，构巢曲霉trpC，真菌几丁质分解酶(例如内切和外切几丁质酶，β-葡聚糖酶)，真菌VAMP相关蛋白(VAP)，真菌翻译延伸因子(TEF1)真菌DNA损伤反应蛋白(DDRP)，真菌(例如镰刀菌或粗糙脉孢菌)六角形过氧化物酶体(Hex1)，真菌(例如粗糙脉孢菌)过氧化氢酶)，以及重组丝状真菌宿主细胞中高水平产生的任何其他蛋白质。
用于重组细菌或酵母宿主细胞中的合适启动子的非限制性实例包括编码以下任何蛋白质的基因的启动子及其功能部分：LAC4、T7聚合酶、TAC、GAL1、λPL、λPR、β-内酰胺酶、spa、CYC1、TDH3、GPD、TEF1、ENO2、PGL1、GAP、SUC2、ADH1、ADH2、HXT7、PHO5、CLB1、AOX1、纤维素酶，淀粉酶，蛋白酶，木聚糖酶以及重组丝状真菌宿主细胞中高水平产生的任何其他蛋白质。
在一些实施方案中，启动子是应激(例如，热激)反应基因(例如，hac1、BIP)的启动子。
信号序列可以是在重组微生物宿主细胞中起作用的任何合适的信号序列。
通常由重组多核苷酸编码的重组蛋白可以是任何重组蛋白(例如，本文公开的重组组分)，包括重组乳蛋白(例如，本文公开的任何重组乳蛋白(例如，重组b-乳球蛋白，重组a-乳清蛋白，重组k-酪蛋白，重组b-酪蛋白)，重组卵蛋白(例如卵转铁蛋白(伴清蛋白)，卵粘蛋白，卵清蛋白，卵转铁蛋白，溶菌酶)，产生维生素所需的重组蛋白，产生脂质所需的重组蛋白，产生风味的小分子，产生质地和乳化的聚合物及其组合。
终止序列可以是在重组微生物宿主细胞中起作用的任何合适的终止序列。用于重组丝状真菌宿主细胞的合适终止序列的非限制性实例包括但不限于米曲霉(例如，TAKA淀粉酶基因的终止序列)、黑曲霉(例如，glaA、gpdA、aamA、trpC、pdc1、adh1、amdS或tef1基因的终止序列)、尖孢镰刀菌(例如丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶)基因的终止序列)、里氏木霉(例如cbh1、pdc1、TEF1、gpd1、xyn1或adh1基因的终止序列)、巴斯德毕赤酵母(例如aox1、gap1、adh1、tef1、tps1或pgk1基因的终止序列)、酿酒酵母(例如adh1、cyc1、gal1、tef1、ptc1、pdc1、pgk1或tps1基因的终止序列)的终止序列，合成的终止序列以及以上列出的序列的任意组合。用于重组酵母宿主细胞的合适终止序列的非限制性实例包括但不限于PGK1和TPS1终止序列。
重组多核苷酸可以进一步包含另外的元件。这样的另外的元件的非限制性实例包括增强子序列，应答元件，蛋白质识别位点，可诱导元件，蛋白质结合序列，5’和3’非翻译区，聚腺苷酸化序列，内含子，复制起点，操纵子(即与启动子相邻的核酸序列，其包含其中阻遏蛋白可以结合并减少或消除启动子的活性的蛋白结合结构域)，以及选择标记(即编码可以补充丝状真菌细胞营养缺陷型、提供抗生素抗性或导致颜色变化的蛋白质的基因)。这样的元件在本领域中是已知的。复制起点的非限制性实例包括AMA1和ANSI。合适的选择标记的非限制性实例包括amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG/pyr4(乳清苷5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酸转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)及其衍生物。在一些实施方案中，选择标记包括降低选择标记的产生从而增加允许包含多核苷酸的丝状真菌细胞在选择下存活所需的拷贝数的改变。
在其中重组多核苷酸包含两个或更多个表达盒的实施方案中，可操作地连接的启动子、任选的信号序列、编码多肽终止序列的序列和任选的另外的元件在两个或更多个表达盒之间可以相同或不同。
用于将重组多核苷酸引入微生物细胞以获得重组微生物宿主细胞的方法是本领域众所周知的。这样的方法的非限制性实例包括磷酸钙转染、树状大分子转染、脂质体转染(例如阳离子脂质体转染)、阳离子聚合物转染、细胞挤压、声孔效应、光学转染、原生质体融合、刺穿转染(impalefection)、热力学递送、基因枪、磁转染、病毒转导，电穿孔和化学转化(例如，使用PEG)。
在一些实施方案中，重组多核苷酸在重组微生物宿主细胞中染色体外地保持在表达载体上(即，转导、转化或感染宿主细胞并使其表达对宿主细胞非天然的核酸和/或蛋白质或以对宿主细胞非天然的方式表达核酸和/或蛋白质的核酸)。在其他实施方案中，重组多核苷酸稳定地整合在重组微生物宿主细胞的基因组(例如染色体)内。为了整合到基因组中，重组多核苷酸可以包含用于通过同源或非同源重组整合到基因组中的序列。在一些实施方案中，这样的序列使得能够在精确的位置整合到宿主基因组中。重组多核苷酸可包含与重组微生物宿主细胞的基因组中的靶序列高度同源的至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000或至少10000个碱基对以增加同源重组的概率。这样的高度同源的序列可以是非编码或编码的。可以将多于一个拷贝的重组多核苷酸插入重组微生物宿主细胞中以增加重组蛋白的产生。
重组微生物宿主细胞可以在本领域已知的任何合适的发酵容器中(例如，培养板，摇瓶，发酵器(例如，搅拌罐发酵器，空运发酵器，泡罩塔发酵器，固定床生物反应器，实验室发酵器，工业发酵器，或其任何组合))和以本领域已知的任何规模(例如，小规模，大规模)和工艺(例如，连续，分批，补料分批或固态)培养。
合适的培养基包括其中重组微生物宿主细胞可以生长和/或保持活力的任何培养基。在一些实施方案中，培养基是包含碳、氮(例如无水氨、硫酸铵、硝酸铵、磷酸二铵、磷酸一铵、多磷酸铵、硝酸钠、尿素、蛋白胨、蛋白质水解物、酵母提取物)和磷酸盐来源的液体培养基。培养基可以进一步包含无机盐、矿物质、金属、过渡金属、维生素、乳化油、表面活性剂和任何其他营养物。合适的碳源的非限制性实例包括单糖、二糖、多糖、乙酸盐、乙醇、甲醇、甘油、甲烷及其组合。单糖的非限制性实例包括右旋糖(葡萄糖)、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及其组合。二糖的非限制性实例包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。多糖的非限制性实例包括淀粉、糖原、纤维素、直链淀粉、半纤维素、麦芽糖糊精及其组合。合适的培养基可以从商业供应商那里获得，或者可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)进行制备。
用于产生重组组分的合适条件是重组微生物宿主细胞可以在其中生长和/或保持活力的条件。这样的条件的非限制性实例包括合适的pH、合适的温度、合适的进料速率、合适的压力、合适的营养含量(例如合适的碳含量、合适的氮含量、合适的磷含量)、合适的补充物含量、合适的痕量金属含量和合适的氧合水平。
在一些实施方案中，培养基还包含可防止重组蛋白降解的蛋白酶(例如，基于植物的蛋白酶)，降低可降解重组蛋白的蛋白酶的活性的蛋白酶抑制剂，和/或可以抽取蛋白酶活性的牺牲蛋白。在一些实施方案中，培养基还包含用于掺入所产生的重组蛋白中的非天然氨基酸。
其他遗传修饰
本文提供的重组微生物宿主细胞可以进一步包含改善重组组分的产生的遗传修饰。这样的遗传修饰的非限制性实例包括改变的启动子、改变的激酶活性、改变的磷酸酶活性、改变的蛋白质折叠活性、改变的蛋白质分泌活性和改变的基因表达诱导途径。
本文提供的重组微生物宿主细胞可进一步具有降低或基本上消除的蛋白酶活性以使重组蛋白的降解最小化(参见，例如，PCT申请WO 96/29391)。具有蛋白酶的降低或基本上消除的活性的丝状真菌细胞可以按照本领域已知的方法通过筛选突变体或通过特定的遗传修饰来获得。
本文提供的重组微生物宿主细胞可进一步包含天然或异源糖基转移酶。这样的内源性或异源糖基转移酶的非限制性实例包括岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、葡糖基转移酶、木糖基转移酶、乙酰基转移酶、葡糖醛酸基转移酶、葡糖醛酸差向异构酶(glucoronylepimerases)、唾液酸转移酶、甘露糖基转移酶、磺基转移酶、β-乙酰半乳糖胺基转移酶和N-乙酰葡糖胺基转移酶。
本文提供的重组微生物宿主细胞可以进一步包含天然或异源激酶或磷酸酶。这样的天然或异源激酶或磷酸酶的非限制性实例包括蛋白激酶A、蛋白激酶B、蛋白激酶C、肌酸激酶B、蛋白激酶Cβ、蛋白激酶G、TmkA、Fam20激酶(例如Fam20C)、ATM、CaM-II、cdc2、cdk5、CK1、CKII、DNAPK、EGFR、GSK3、INSR、p38MAPK、RSK、SRC、磷酸转移酶、碱性磷酸酶(例如UniProtKB-O77578)、酸性磷酸酶等(参见例如Kabir&Kazi.2011.Genet Mol Biol.34(4):587)。
包含重组组分和基本上消除或调节的酯酶活性的制剂
在另一方面，本文提供了包含重组组分(例如，本文公开的任何重组组分)和与相应制剂中包含的酯酶活性相比基本上消除或调节的酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)的制剂。
在一些实施方案中，本文提供的制剂包含重组组分和基本上消除或调节的酯酶活性，该活性与相应制剂中包含的酯酶活性相比降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些这样的实施方案中，本文提供的制剂包含重组组分和基本上消除的酯酶活性。在其他实施方案中，本文提供的制剂包含重组组分和与相应制剂中包含的酯酶活性相比增加至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％或至少1000％的酯酶活性。
本文提供的制剂可通过从包含本文提供的重组微生物宿主细胞的发酵液中纯化由该重组微生物宿主细胞产生的重组组分来获得。
用于从发酵液中纯化重组组分的方法是本领域众所周知的(参见，例如，ProteinPurification,JC Janson and L Ryden,Eds.,VCH Publishers,New York,1989；ProteinPurification Methods:APractical Approach,ELV Harris and S Angel,Eds.,IRLPress,Oxford,England,1989)。
重组组分可以基于其分子量，通过例如尺寸排阻/交换色谱、通过膜的超滤、凝胶渗透色谱(例如，制备性盘状凝胶电泳)或密度离心来纯化。
重组组分还可以基于其表面电荷或疏水性/亲水性，通过例如等电沉淀、阴离子/阳离子交换色谱、等电聚焦(IEF)或反相色谱法来纯化。
重组组分也可以基于其溶解度，通过例如硫酸铵沉淀、等电沉淀、表面活性剂、去污剂或溶剂萃取来纯化。
重组组分还可以基于其对另一分子的亲和力，通过例如亲和色谱、活性染料或羟基磷灰石来纯化。亲和色谱可包括使用对重组组分具有特异性结合亲和力的抗体，或针对His标记的重组蛋白的镍NTA，或使用凝集素以结合重组蛋白上的糖部分或特异性结合重组组分的任何其他分子。在一些实施方案中，重组组分携带有利于纯化的标签。这样的标签的非限制性实例包括表位标签和蛋白质标签。表位标签的非限制性实例包括c-myc、血凝素(HA)、多组氨酸(6x-HIS)、GLU-GLU和DYKDDDDK(FLAG)表位标签。蛋白质标签的非限制性实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、绿色荧光蛋白(GFP)和麦芽糖结合蛋白(MBP)。分离重组组分后(例如，通过蛋白酶切割)，可以去除表位或蛋白质标签。
在其中重组组分由重组微生物宿主细胞分泌的实施方案中，可以直接从发酵液中纯化重组组分。在其他实施方案中，重组组分可以从细胞裂解物中纯化。
重组组分的身份可以通过高效液相色谱(HPLC)、Western印迹分析、Eastern印迹分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、酶产物的形成、酶底物的消失和二维质谱(2D-MS/MS)序列鉴定来确认和/或定量。
在一些实施方案中，相对于发酵液中包含的其它组分，重组组分被纯化至大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％或大于99％的纯度。在一些实施方案中，与其在发酵液中相比，重组组分被纯化为相对于制剂中的其他组分的丰度多至少两倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，重组组分被纯化至按重量计大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％或大于99％的纯度。
在一些实施方案中，制剂是液体。在其他实施方案中，制剂是固体。在一些这样的实施方案中，制剂是粉末。在一些这样的实施方案中，粉末包含按重量计小于10％、小于7％、小于5％、小于3％或小于1％的水分含量。粉末可以例如通过喷雾干燥或通过蒸发浓缩而获得。
在一些实施方案中，制剂包含处理后的重组组分。重组组分的后处理可包括片段化(例如，通过化学手段或通过暴露于蛋白酶(例如，胰蛋白酶、胃蛋白酶、calmapepsin))、去除反应性位点(例如，通过氧化去除甲硫氨酸和/或色氨酸残基的反应性位点)、调节(例如，通过化学、光化学和/或酶促策略)、环化、生物素化(即，附着生物素)以及缀合至其他元件(例如，聚乙二醇、抗体、脂质体、磷脂、DNA、RNA、核酸、糖、二糖、多糖、淀粉、纤维素、去污剂、细胞壁)。
后处理可以以随机方式或以位点特异性方式发生(例如，在半胱氨酸残基的巯基(例如，用于氨基乙基化，碘乙酰胺的形成，马来酰亚胺的形成，Dha的形成，经由二硫键的共价附接，以及脱硫)；赖氨酸残基的伯胺基(例如，用于附接活化的酯、磺酰氯、异硫氰酸酯、不饱和醛酯以及醛)；酪氨酸残基的酚羟基；去除可以引发人类的免疫反应的特定的表位(例如，聚糖基)；偶氮电环化)。
后处理可改变重组组分的某些化学和/或物理性质，包括但不限于大小、电荷、疏水性、亲水性、溶剂化、蛋白质折叠和化学反应性。
包含重组组分的食物产品
在另一方面，本文提供一种食物产品，其包含由本文提供的重组微生物宿主细胞产生的重组组分(例如，本文公开的任何重组组分)，并且与相应食物产品中的酯酶活性相比包括基本上消除或调节的酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)。如本文所用，术语“食物产品”是指可以被人或动物(包括驯养的动物(例如，狗、猫)、农场动物(例如，牛、猪、马)和野生动物(例如，非驯养的掠食性动物)摄取的产品。该术语包括可以与一种或多种其他成分组合或添加至一种或多种其他成分以制成可以被人或动物摄取的食物产品的产品。在各种实施方案中，本文提供的食物产品符合美国食品和药物管理局(FDA)、美国农业部、欧洲食品安全局和/或其他国家或地区食品监管机构要求的食品安全标准。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品包含按重量计至少0.000075％、至少0.0001％、0.00025％、至少0.0005％、至少0.00075％、至少0.001％、至少0.0025％、至少0.005％、至少0.0075％、至少0.01％、至少0.025％、至少0.05％、至少0.075％、至少0.1％、至少0.25％、至少0.5％、至少0.75％、至少1％、至少2.5％、至少5％、至少7.5％、至少10％、至少12.5％、至少15％、至少17.5％、至少20％、至少22.5％、至少25％、至少27.5％、至少30％、至少32.5％、至少35％、至少37.5.％、至少40％、至少42.5％、至少45％、至少47.5％、至少50％、至少52.5％、至少55％、至少57.5％、至少60％、至少62.5％、至少65％、至少67.5％、至少70％、至少72.5％、至少75％、至少77.5％、至少80％、至少82.5％、至少85％、至少87.5％、至少90％、至少92.5％、至少95％、至少97.5％或100％的由本文提供的一种或多种重组微生物宿主细胞产生的一种或多种重组组分(例如本文公开的任何重组组分)。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品基本上没有酯酶活性(例如，本文公开的任何一种酯酶的活性或本文公开的至少两种酯酶的任何组合的活性)。
在一些实施方案中，食物产品主要或完全由来源于非动物来源的组分组成。在替代实施方案中，食物产品包含部分来源于动物来源的组分，但补充有来源于非动物来源的组分。在一些这样的实施方案中，食物产品包含按重量计5％至100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％；10％至100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％；20％至100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％；30％至100％、90％、80％、70％、60％、50％或40％；40％至100％、90％、80％、70％、60％或50％；50％至100％、90％、80％、70％或60％；60％至100％、90％、80％或70％；70％至100％、90％或80％；80％至100％或90％；或90％至100％的来源于非动物来源的组分。
在各种实施方案中，食物产品是选自由国家健康和营养检查调查定义的任何食物产品类别的食物产品，或类似于这样的食物产品(即，是食物产品替代品)。
这样的食物产品类别的非限制性实例(以及这样的食物产品的非限制性实例)包括零食和口香糖(例如零食棒，饼干，来自谷物制品的咸味零食，咀嚼口香糖)；面包，谷物和面食(例如燕麦面包和面包卷，玉米面包，玉米松饼，玉米饼，面粉和干混合物，小点心，多谷物面包和面包卷，全麦面包和面包卷，意大利面，黑麦面包和面包卷，碎小麦面包和面包卷，白面包和面包卷)；饮料(例如啤酒和麦芽酒，浓缩饮料，能量饮料，运动饮料，液体替代品，软饮料，碳酸饮料，果汁，葡萄酒，鸡尾酒，营养饮料，营养粉)；甜品和甜点(例如蛋糕，糖果，薯片，曲奇，酒味冷饮，糕点，冰或冰棍，松饼，馅饼，糖替代物或替代品，糖浆，蜂蜜，果冻，果酱，罐头，沙拉，薄饼，丹麦酥，早餐糕点，甜甜圈)；早餐食物(例如粮谷，谷物，大米，法式吐司，煎饼，华夫饼，咖啡蛋糕)；鸡蛋(例如，蛋盘，蛋汤，用蛋清制成的混合物，鸡蛋替代品，用鸡蛋替代品制成的混合物)；乳制品；色拉调味料，油，酱汁，调味品(例如食用油脂，植物油，色拉调味料，番茄酱，肉汁)；土豆(例如土豆沙拉，土豆汤，薯片和薯条，炸土豆，土豆泥，酿土豆，泡芙)；和汤(例如蔬菜汤，蔬菜肉汤)，餐食，主菜，蛋白质(例如肉类替代品)和海鲜。
在一些这样的实施方案中，本文提供的食物产品是乳制品或类似于乳制品(即，是乳制品替代品)。本文所用的术语“乳制品”是指奶(例如，全脂奶(至少3.25％乳脂)，部分脱脂的奶(1％至2％乳脂)，脱脂奶(小于0.2％乳脂)，烹调奶，炼乳，调味奶，山羊奶，绵羊奶，奶粉，淡奶，泡沫奶)，以及来源于奶的产品，包括但不限于酸奶(例如，全脂酸奶(每170克至少6克脂肪)，低脂酸奶(每170克2至5克脂肪)，脱脂酸奶(每170克0.5克或更少的脂肪)，希腊酸奶(除去乳清的滤过酸奶)，搅打过的酸奶，山羊奶酸奶，浓缩酸奶(Labneh)(labne)，绵羊奶酸奶，酸奶饮料(例如全脂奶Kefir，低脂奶Kefir)，Lassi)，奶酪(例如乳清奶酪(例如意大利乳清奶酪)，帕斯塔菲拉塔奶酪(例如马苏里拉奶酪)，半软奶酪，例如Havarti和Muenster；中硬奶酪，例如Swiss和Jarlsberg；硬奶酪，例如Cheddar和Parmesan；洗过的凝乳奶酪，例如Colby和Monterey Jack；软熟奶酪，例如Brie和Camembert；新鲜奶酪，例如白软奶酪，菲达奶酪，奶油奶酪和凝乳；加工奶酪；加工奶酪食品；加工奶酪产品；加工涂抹奶酪；酶调节奶酪；冷包装奶酪)，基于乳制品的调味料(例如新鲜的，冷冻的，冷藏的或货架稳定的)，乳制品涂抹酱(例如低脂涂抹酱，低脂黄油)，奶油(例如干奶油，浓奶油，淡奶油，鲜奶油，稀奶油(half-and-half)，咖啡增白剂，咖啡奶精，酸奶油，法式焦糖奶油)，冷冻甜食(例如冰淇淋，冰沙，奶昔，冷冻酸奶，圣代冰淇淋，冰淇淋，蛋奶冻)，乳制品甜点(例如，新鲜、冷藏或冷冻)，黄油(例如，搅打过的黄油，培养的黄油)，奶粉(例如，全脂奶粉，脱脂奶粉，填充脂肪的奶粉(即，包含植物脂肪以取代所有或一些动物脂肪的奶粉)，婴儿配方食品，浓缩乳蛋白(即按重量计至少80％的蛋白质含量)，乳蛋白分离物(即按重量计至少90％的蛋白质含量)，乳清蛋白浓缩物，乳清蛋白分离物，脱盐乳清蛋白浓缩物，脱盐乳清蛋白浓缩物，β-乳球蛋白浓缩物，β-乳球蛋白分离物，α-乳白蛋白浓缩物，α-乳白蛋白分离物，糖巨肽浓缩物，糖巨肽分离物，酪蛋白浓缩物，酪蛋白分离物，营养补充品，质地混合物(texturizing blend)，调味混合物，着色混合物)，即饮或即混产品(例如，新鲜、冷藏或货架稳定的乳蛋白饮料，减肥饮料，营养饮料，运动恢复饮料和能量饮料)，布丁，凝胶，咀嚼片，炸土豆片和薯条。
如本文所用，术语“食物产品替代品”(例如，“乳制品替代品”)是指类似于常规食物产品的食物产品(例如，可以代替常规食物产品使用)。这样的相似性可以归因于任何物理、化学或功能属性。在一些实施方案中，本文提供的食物产品与常规食物产品的相似之处归因于物理属性。物理属性的非限制性实例包括颜色，形状，机械特性(例如硬度，G'储能模量值，形状保持性，内聚力，质地(即与感官知觉相关的机械特性(例如口感，多脂肪，乳脂状，均化，丰满，平滑，厚度)，粘度以及结晶度。在一些实施方案中，本文提供的食物产品和常规食物产品的相似之处归因于化学/生物学属性，化学特性的非限制性实例包括营养含量(例如氨基酸的类型和/或数量(例如PDCAAS评分)，脂质的类型和/或数量，碳水化合物的类型和/或数量，矿物质的类型和/或数量，维生素的类型和/或数量)，pH，消化性，保质期，饥饿和/或饱腹调节，味觉，以及香气。在一些实施方案中，本文提供的食物产品与常规食物产品的相似之处归因于功能属性。功能属性的非限制性实例包括响应于物理和/或化学条件(例如，搅拌，温度，pH，离子强度，蛋白质浓度，糖浓度，离子强度)的最大强度的胶凝/凝集行为(例如，胶凝能力(即形成凝胶所需的时间(即，具有通过氢键连接至蛋白质分子的溶剂填充的空间的蛋白质网络))，凝集能力(即响应于物理和/或化学条件形成沉淀的能力(即基于蛋白质分子之间的强相互作用和溶剂的排斥的紧密的蛋白质网络))，凝胶强度(即形成的凝胶的强度，以力/单位面积(例如，帕斯卡(Pa))测量)，胶凝时的持水能力，胶凝时的脱水收缩作用(即随时间流水)，起泡行为(例如起泡能力(即响应于物理和/或化学条件而保留的空气量))，泡沫稳定性(即响应于物理和/或化学条件而形成的泡沫的半衰期)，泡沫渗出)，增稠能力，使用多功能性(即以各种方式使用食物产品和/或从食物产品获得多种其他组分的能力；例如，产生类似于奶衍生物产品(例如酸奶，奶酪，奶油和黄油)的食物产品的能力)，以及形成蛋白质二聚体的能力。
在各种实施方案中，本文提供的食物产品是奶替代品(即，类似于奶)，酸奶替代品(即，类似于酸奶)，奶酪替代品(即，类似于奶酪)，冷冻甜点替代品(即，类似于冷冻甜点(例如冰淇淋))或任何其他乳制品替代品(即类似于乳制品(例如本文公开的任何乳制品))
乳蛋白组分
在一些实施方案中，食物产品(例如，乳制品、蛋制品)包含乳蛋白组分，其中所述乳蛋白组分包含重组乳蛋白和与不是根据本文提供的方法产生的乳蛋白组分(即，不是通过包括其中酯酶的活性被基本上消除或调节的至少一个步骤的方法产生的)的酯酶活性相比基本上消除或调节的酯酶活性。如本文所用，术语“乳蛋白组分”是指由乳清蛋白的一个子集或酪蛋白的一个子集或乳清蛋白的一个子集与酪蛋白的一个子集的混合物组成的组分(即，仅来自乳清蛋白浓缩物或胶束酪蛋白浓缩物或酪蛋白酸钠或酸性酪蛋白或乳蛋白浓缩物或乳蛋白分离物中存在的一些但不是全部蛋白质)。该术语还暗示乳蛋白组分中的乳蛋白是食物产品中包含的仅有的乳蛋白(即，除了乳蛋白组分所组成的乳蛋白之外，所述食物产品不包含其他乳蛋白)。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品包含按重量计0.1％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％或0.2％；0.2％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％或0.3％；0.3％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％或0.4％；0.4％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％；0.5％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％或0.6％；0.6％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％或0.7％；0.7％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％或0.8％；0.8％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.9％；0.9％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％；1％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％；2％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％；3％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或4％；4％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％或5％；5％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％或6％；6％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％或7％；7％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％或8％；8％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％或9％；9％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％或10％；10％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％或11％；11％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％或12％；12％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％或13％；13％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或14％；14％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％；15％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％；20％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或25％；25％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％；30％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％或35％；35％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％或40％；40％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％或45％；45％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％；50％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％或55％；55％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％；60％至100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或65％；65％至100％、95％、90％、85％、80％、75％或70％；70％至100％、95％、90％、85％、80％或75％；75％至100％、95％、90％、85％或80％；80％至100％、95％、90％或85％；或85％至100％、95％、90％；90％至100％或95％或95％至100％的乳蛋白组分。
本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分可以由一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种)乳蛋白(例如一种或多种乳清蛋白，一种或多种酪蛋白，或一种或多种乳清蛋白与一种或多种酪蛋白的混合物)组成，其中至少一种乳蛋白是由重组微生物宿主细胞产生的重组乳蛋白(例如，本文公开的任何重组乳蛋白)。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分由一种或多种(例如，两种，三种，四种或更多种)乳清蛋白(例如，β-乳球蛋白，α-乳白蛋白，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同翻译后修饰(PTM)的β-乳球蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的β-乳球蛋白的混合物以及两种或更多种具有不同PTM的α-乳白蛋白的混合物)；一种或多种(例如，两种，三种，四种或更多种)酪蛋白(例如，κ-酪蛋白，β-酪蛋白，γ-酪蛋白，κ-酪蛋白和β-酪蛋白的混合物，κ-酪蛋白和γ-酪蛋白的混合物，β-酪蛋白和γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的κ-酪蛋白和β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的κ-酪蛋白和γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的β-酪蛋白和κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的β-酪蛋白和γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的γ-酪蛋白和κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的γ-酪蛋白和β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的κ-酪蛋白和/或两种或更多种具有不同PTM的β-酪蛋白和/或两种或更多种具有不同PTM的γ-酪蛋白的混合物)；或其任何组合组成。
至少一种重组乳蛋白可以是单一的重组乳蛋白。单一的重组乳蛋白可以是单一的重组乳清蛋白(例如，重组β-乳球蛋白或重组α-乳白蛋白)或单一的重组酪蛋白(例如，重组κ-酪蛋白或重组β-酪蛋白或重组γ-酪蛋白)。可替代地，至少一种重组乳蛋白可以是两种或更多种重组乳蛋白。两种或更多种重组乳蛋白可以是两种或更多种重组乳清蛋白(例如，重组β-乳球蛋白和重组α-乳白蛋白)，两种或更多种重组酪蛋白(例如，重组κ-酪蛋白和重组β-酪蛋白，重组κ-酪蛋白和重组γ-酪蛋白，重组κ-酪蛋白和重组β-酪蛋白和重组γ-酪蛋白)，或至少一种重组乳清蛋白和至少一种重组酪蛋白的混合物(例如重组β-乳球蛋白和重组α-乳白蛋白中的一种或两种与重组κ-酪蛋白和重组β-酪蛋白和重组γ-酪蛋白中的一种或两种或全部的组合)。
在一些实施方案中，至少一种重组乳蛋白包括具有PTM的至少一种重组乳蛋白。在各种这样的实施方案中，PTM可以是天然PTM，非天然PTM或其混合物。在一些实施方案中，重组乳蛋白的PTM的类型和/或数目赋予本文提供的食物产品所需的属性。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分包含一种或多种(例如，两种，三种，四种或更多种)重组乳清蛋白(例如，重组β-乳球蛋白，重组α-乳白蛋白，重组β-乳球蛋白和重组α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-乳球蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-乳球蛋白和重组α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-乳球蛋白的混合物和两种或更多种具有不同PTM的重组α-乳白蛋白的混合物)；一种或多种(例如，两种，三种，四种或更多种)重组酪蛋白(例如，重组κ-酪蛋白，重组β-酪蛋白，重组γ-酪蛋白，重组κ-酪蛋白和重组β-酪蛋白的混合物，重组κ-酪蛋白和重组γ-酪蛋白的混合物，重组β-酪蛋白和重组γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组κ-酪蛋白和重组β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组κ-酪蛋白和γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-酪蛋白和重组κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-酪蛋白和γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组γ-酪蛋白和重组κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组γ-酪蛋白和β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组κ-酪蛋白和/或两种或更多种具有不同PTM的重组β-酪蛋白和/或两种或更多种具有不同PTM的重组γ-酪蛋白的混合物)；或其任何组合。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分由一种或多种(例如，两种，三种，四种或更多种)重组乳清蛋白(例如，重组β-乳球蛋白，重组α-乳白蛋白，重组β-乳球蛋白和重组α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-乳球蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-乳球蛋白和重组α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-乳球蛋白的混合物和两种或更多种具有不同PTM的重组α-乳白蛋白的混合物)；一种或多种(例如，两种，三种，四种或更多种)重组酪蛋白(例如，重组κ-酪蛋白，重组β-酪蛋白，重组γ-酪蛋白，重组κ-酪蛋白和重组β-酪蛋白的混合物，重组κ-酪蛋白和重组γ-酪蛋白的混合物，重组β-酪蛋白和重组γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组κ-酪蛋白和重组β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组κ-酪蛋白和γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-酪蛋白和重组κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组β-酪蛋白和γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组γ-酪蛋白和重组κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组γ-酪蛋白和β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的重组κ-酪蛋白和/或两种或更多种具有不同PTM的重组β-酪蛋白和/或两种或更多种具有不同PTM的重组γ-酪蛋白的混合物)；或其任何组合组成。
乳蛋白组分可以进一步包含一种或多种天然乳蛋白。在一些实施方案中，本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分包含一种或多种(例如，两种，三种，四种或更多种)天然乳清蛋白(例如，天然β-乳球蛋白，天然α-乳白蛋白，天然β-乳球蛋白和天然α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然β-乳球蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然β-乳白蛋白和天然α-乳白蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然α-乳白蛋白和天然β-乳球蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然β-乳球蛋白的混合物以及两种或更多种具有不同PTM的天然α-乳白蛋白混合物)；一种或多种(例如，两种，三种，四种或更多种)天然酪蛋白(例如，天然κ-酪蛋白，天然β-酪蛋白，天然γ-酪蛋白，天然κ-酪蛋白和天然β-酪蛋白的混合物，天然κ-酪蛋白和天然γ-酪蛋白的混合物，天然β-酪蛋白和天然γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然κ-酪蛋白和天然β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然κ-酪蛋白和天然γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然β-酪蛋白和天然κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然β-酪蛋白和天然γ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然γ-酪蛋白和天然κ-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然γ-酪蛋白和天然β-酪蛋白的混合物，两种或更多种具有不同PTM的天然κ-酪蛋白和/或两种或更多种具有不同PTM的天然β-酪蛋白和/或两种或更多种具有不同PTM的天然γ-酪蛋白的混合物)；其任何组合。
在一些这样的实施方案中，本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分由乳清蛋白和酪蛋白组成，其重量比为约10比约1至约1比约10(例如，约10比1、约9比1、约8比1、约7比1、约6比1、约5比1、约4比1、约3比1、约2比1、约1比1、约1比2、约1比3、约1比4、约1比5、约1比6、约1比7、约1比8、约1比9或约1比10)。
在一些这样的实施方案中，本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分由重组乳清蛋白和天然乳清蛋白组成，其重量比为约10比约1至约1比约10(例如，约10比1、约9比1、约8比1、约7比1、约6比1、约5比1、约4比1、约3比1、约2比1、约1比1、约1比2、约1比3、约1比4、约1比5、约1比6、约1比7、约1比8、约1比9或约1比10)。
在一些这样的实施方案中，本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分由重组酪蛋白和天然酪蛋白组成，其重量比为约10比约1至约1比约10(例如，约10比1、约9比1、约8比1、约7比1、约6比1、约5比1、约4比1、约3比1、约2比1、约1比1、约1比2、约1比3、约1比4、约1比5、约1比6、约1比7、约1比8、约1比9或约1比10)。
在一些这样的实施方案中，本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分由重组乳清蛋白和重组酪蛋白组成，其重量比为约10比约1至约1比约10(例如，约10比1、约9比1、约8比1、约7比1、约6比1、约5比1、约4比1、约3比1、约2比1、约1比1、约1比2、约1比3、约1比4、约1比5、约1比6、约1比7、约1比8、约1比9或约1比10)。
在一些这样的实施方案中，本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分由天然乳清蛋白和天然酪蛋白组成，其重量比为约10比约1至约1比约10(例如，约10比1、约9比1、约8比1、约7比1、约6比1、约5比1、约4比1、约3比1、约2比1、约1比1、约1比2、约1比3、约1比4、约1比5、约1比6、约1比7、约1比8、约1比9或约1比10)。
在一些这样的实施方案中，本文提供的食物产品中包含的乳蛋白组分由重组乳蛋白和天然乳蛋白组成，其重量比为约10比约1至约1比约10(例如，约10比1、约9比1、约8比1、约7比1、约6比1、约5比1、约4比1、约3比1、约2比1、约1比1、约1比2、约1比3、约1比4、约1比5、约1比6、约1比7、约1比8、约1比9或约1比10)。
在所有实施方案中，乳蛋白组分仅由乳清蛋白的子集或酪蛋白的子集或乳清蛋白的子集与酪蛋白的子集的混合物组成。在一些实施方案中，乳清蛋白的子集由β-乳球蛋白和/或α-乳白蛋白组成。在一些实施方案中，酪蛋白的子集由κ-酪蛋白和/或β-酪蛋白和/或γ-酪蛋白组成。在各个实施方案中，乳清蛋白的子集和酪蛋白的子集的混合物由与κ-酪蛋白和/或β-酪蛋白和/或γ-酪蛋白组合β-乳球蛋白和/或α-乳白蛋白组成。在一些这样的实施方案中，混合物由β-乳球蛋白和κ-酪蛋白组成。在其他这样的实施方案中，混合物由α-乳白蛋白和κ-酪蛋白组成。在其他这样的实施方案中，混合物由β-乳球蛋白和α-乳白蛋白和κ-酪蛋白组成。
非乳蛋白组分
在一些实施方案中，食物产品(例如，乳制品、蛋制品)包含非乳蛋白组分，其中所述非乳蛋白组分包含重组的非乳蛋白和与未根据本文提供的方法产生的(即，不是通过包含其中基本上消除或调节酯酶活性的至少一个步骤的方法产生的)非乳蛋白组分的酯酶活性相比基本上消除或调节的酯酶活性。
本文提供的食物产品中包含的非乳蛋白组分可包含来源于任何来源的非乳蛋白，以及来源于各种来源的非乳蛋白的混合物。这样的来源的非限制性实例包括动物、植物、藻类、真菌和微生物。
动物的非限制性实例包括昆虫(例如，苍蝇)、哺乳动物(例如，牛、绵羊、山羊、兔子、猪、人)和鸟类(例如，鸡)。
植物的非限制性实例包括苏铁、银杏、针叶树、柏树、杜松、金钟柏、雪松、松树、当归、葛缕子、芫荽、小茴香、茴香、欧芹、莳萝、蒲公英、蜡菊、金盏花、艾蒿、红花、甘菊、生菜、苦艾、金盏花、香茅、鼠尾草、百里香、野鼠尾草籽、芥末、橄榄、咖啡、辣椒、茄子、红辣椒、蔓越莓、猕猴桃、蔬菜植物(例如胡萝卜、芹菜)、万寿菊、艾菊、龙蒿、向日葵、冬青树、罗勒、牛膝草、熏衣草、柠檬马鞭草、马郁兰、蜜蜂花、广霍香、薄荷油、薄荷、迷迭香、芝麻、留兰香、报春花、翅果、胡椒、甘椒树、马铃薯、甘薯、番茄、蓝莓、茄科植物、矮牵牛花、牵牛花、丁香、茉莉、金银花、金鱼草、欧车前、土荆芥属植物、荞麦、苋菜、莙荙菜、藜麦、菠菜、大黄、荷荷巴油、cypselea、小球藻、马鲁拉树、榛子、卡诺拉油菜籽、羽衣甘蓝、白菜、芜菁甘蓝、乳香、没药、榄香脂、大麻、南瓜、西葫芦、葫芦、树薯、黄檀、豆类植物(例如苜蓿、扁豆、黄豆、三叶草、豌豆、蚕豆、frijole bola roja、frijole negro、胡枝子、甘草、羽扇豆、牧豆树、角豆树、大豆、花生、罗望子树、紫藤、决明子、鸡心豆/鹰嘴豆、胡卢巴、绿豌豆、黄豌豆、糖荚豌豆、利马豆、蚕豆)、天竺葵、亚麻、石榴、棉花、秋葵、印度楝、无花果、桑树、丁香、桉树、茶树、绿花白千层、结果类植物(例如苹果、杏、桃、李、梨、油桃)、草莓、黑莓、覆盆子、樱桃、洋李、玫瑰、橘、柑橘类(例如葡萄柚、柠檬、酸橙、橙子、苦橙、柑橘、柑桔)、芒果、佛手柑、布枯、葡萄、西兰花、抱子甘蓝、亚麻荠、花椰菜、油菜、油菜籽(卡诺拉油菜籽)、萝卜、卷心菜、黄瓜、西瓜、蜜瓜、绿皮西葫芦、桦木、胡桃、木薯、猴面包树、多香果、杏仁、面包果、檀香木、澳洲坚果、芋头、晚香玉、芦荟、大蒜、洋葱、葱、香草、丝兰、香根草、高良姜、大麦、玉米、郁金、生姜、柠檬草、燕麦、棕榈、菠萝、大米、黑麦、高粱、小黑麦、姜黄、山药、竹子、大麦、白千层、美人蕉、小豆蔻、玉米、燕麦、小麦、肉桂、黄樟、桂皮钓樟、月桂树、鳄梨、依兰、肉豆蔻干皮、肉豆蔻、辣木、马尾、牛至、香菜、山萝卜、细香葱、聚合果、谷物植物、草药植物、叶类蔬菜、非谷物豆类植物、坚果植物、肉质植物、陆生植物、水生植物、黄檀、小米、核果、裂果、开花植物、非开花植物、栽培植物、野生植物、树木、灌木、花卉、草、草本植物、灌木丛、藤本植物、仙人掌、热带植物、亚热带植物、温带植物以及其衍生物和杂交种。
藻类的非限制性实例包括绿藻(例如小球藻(Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻(Chlorealla pyrenoidosa))、褐藻(例如Alaria marginata、Analipus japonicus、泡叶藻(Ascophyllum nodosum)、昆布属的种(Ecklonia sp)、爱森藻(Eisenia bicyclis)、羊栖菜(Hizikia fusiforme)、环形解氏藻(Kjellmaniella gyrata)、狭叶海带(Laminariaangustata)、Laminaria longirruris、Laminaria Longissima、Laminaria ochotensis、Laminaria claustonia、阔叶巨藻(Laminaria saccharina)、掌状海带(Laminariadigitata)、Laminaria japonica、巨型海带(Macrocystis pyrifera)、Petalonia fascia、Scytosiphon lome)、红藻(例如皱波角叉菜(Chondrus crispus)、Chondrus ocellatus、耳突麒麟菜(Eucheuma cottonii)、刺麒麟菜(Eucheuma spinosum)、红藻胶(Furcellariafastigiata)、脆江蓠(Gracilaria bursa-pastoris)、菊花心江蓠(Gracilarialichenoides)、海萝藻(Gloiopeltis furcata)、Gigartina acicularis、Gigartinabursa-pastoris、Gigartina pistillata、Gigartina radula、Gigartina skottsbergii、星芒杉藻(Gigartina stellata)、红海藻(Palmaria palmata)、Porphyra columbina、皱紫菜(Porphyra crispata)、Porhyra deutata、Porhyra perforata、Porhyrasuborbiculata、甘紫菜(Porphyra tenera)、紫球藻(Porphyridium cruentum)、淡色紫球藻(Porphyridium purpureum)、铜绿紫球藻(Porphyridium aerugineum)、Rhodellamaculate、蔷薇藻(Rhodella reticulata)、Rhodella violacea、掌状红皮藻(Rhodymeniapalmata))及其衍生物和杂交种。
真菌的非限制性实例包括构巢曲霉、黑曲霉、黑曲霉泡盛变种、米曲霉、白色念珠菌、Candida etchellsii、高里假丝酵母、扁平云假丝酵母、解脂假丝酵母、伪热带假丝酵母、产朊假丝酵母、皱状假丝酵母、Chrysosporium lucknowense、汉氏德巴利氏酵母、寄生内座壳(Endothia parasitica)、阿氏假囊酵母、禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、镰孢霉、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母乳酸变种(Kluyveromycesmarxianus var.lactis)、耐热克鲁维酵母、Morteirella vinaceaevar.raffinoseutilizer、米黑毛霉(Mucor miehei)、Mucor miehei var.Cooney etEmerson、Mucor pusillus Lindt、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、娄地青霉、小立碗藓(Physcomitrella patens)、巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、Pichia trehalophila、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母、微小毕赤酵母、Ogataea minuta、Pichia lindneri、Pichia opuntiae、耐热毕赤酵母、Pichia salictaria、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤酵母、树干毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、雪白根霉、贝酵母、Saccharomyces beticus、酿酒酵母、薛瓦酵母、糖化酵母、葡萄酒酵母、少孢酵母、Saccharomyces florentinus、脆壁酵母、巴氏酵母、裂殖酵母、清酒酵母、葡萄汁酵母、约翰荪锁孢酵母(Sporidiobolus johnsonii)、Sporidiobolus salmonicolor、掷孢酵母、里氏木霉、红法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)、解脂耶氏酵母、鲁氏酵母及其衍生物和杂交种。
微生物的非限制性实例包括厚壁菌门、蓝细菌(蓝绿藻)、颤藻亚目、芽孢杆菌目、乳杆菌目、颤藻目、芽胞杆菌科、乳杆菌科、弱氧化醋酸杆菌、木醋杆菌、米苏里游动放线菌、钝顶节旋藻、极大节旋藻、蜡样芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌Lancefield血清群N、罗伊氏乳酸杆菌、噬柠檬酸明串珠菌、葡聚糖明串珠菌、肠系膜明串珠菌、溶壁微球菌、螺旋藻、乳脂链球菌、乳酸链球菌、乳酸链球菌双醋酸亚种、嗜热链球菌、恰塔努加链霉菌、灰色链霉菌、纳塔尔链霉菌、橄榄链霉菌、橄榄产色链霉菌、锈赤链霉菌、嗜热四膜虫、Tetrahymena hegewischi、Tetrahymena hyperangularis、Tetrahymena malaccensis、Tetrahymena pigmentosa、梨形四膜虫、Tetrahymena vorax、野油菜黄单胞菌及其衍生物和杂交种。
在一些实施方案中，非乳蛋白是动物蛋白。这样的蛋白质的非限制性实例包括胶原蛋白。
在一些实施方案中，非乳蛋白是植物蛋白。这样的非乳植物蛋白的非限制性实例包括豌豆蛋白和马铃薯蛋白。
在一些实施方案中，非乳蛋白是真菌蛋白。这样的蛋白质的非限制性实例包括葡糖淀粉酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡聚糖酶、SUN家族成员(Sim1p、Uth1p、Nca3p、Sun4p)、延伸因子1-α、线粒体亮氨酰-tRNA合成酶、α-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、纤维素酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切-1,4-β-木糖苷酶、葡糖淀粉酶、肽酶、曲霉胃蛋白酶-1(aspergillopepsin-1)、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶A、α-半乳糖苷酶A、α-半乳糖苷酶B、α-半乳糖苷酶D、α-葡糖醛酸酶A、β-半乳糖苷酶C、葡聚糖1,3-β-葡糖苷酶A、疏水蛋白和葡聚糖内切-1,3-β-葡糖苷酶eglC。
在一些实施方案中，非乳蛋白来源于宿主细胞(例如，本文公开的任何动物、植物、藻类、真菌或微生物天然或重组宿主细胞)分泌的非乳蛋白。合适的分泌的非乳蛋白可以例如通过获得分泌蛋白组(即，通过例如在液体培养物中培养动物、植物、藻类、真菌或微生物细胞、从细胞培养物移出细胞(例如，通过离心)并任选地浓缩剩余的培养基；或通过对基因组进行测序并在计算机上鉴定分泌的蛋白质(参见，例如，Mattanovich等人,2009.Microbial Cell Factories 8:29)而获得的分泌的蛋白，全细胞提取物，或分级分离的全细胞提取物；任选地部分消化、糖基化、磷酸化或以其他方式酶促处理蛋白质；然后将它们在测定(例如高通量测定)中例如针对与乳蛋白质相比具有相似、相同或不同特性的蛋白质进行筛选)来鉴定。合适的分泌的非乳蛋白也可以通过将大豆蛋白的富含钙的级分例如针对与乳蛋白相比具有相似、相同或不同特性的蛋白质进行筛选来鉴定。在2017年8月25日提交的PCT申请PCT/US2017/48730中提供了合适的分泌的非乳蛋白的非限制性实例。在一些实施方案中，非乳蛋白是一种分泌的真菌蛋白(即由真菌(例如，本文公开的任何真菌)分泌的蛋白质)。
在一些实施方案中，非乳蛋白组分包含重组非乳蛋白。在一些这样的实施方案中，重组非乳蛋白具有非天然的PTM和/或缺乏可以在人或动物中引发免疫应答的表位。
其他组分
本文提供的食物产品可以进一步包含一种或多种其他组分。例如，在一些实施方案中，本文提供的食物产品进一步包含脂质。脂质的非限制性实例包括选自脂肪、油、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂和游离脂肪酸的脂质。
油的非限制性实例包括植物油(例如，向日葵油，椰子油，芥末油，花生油，芥花籽油，玉米油，棉籽油，亚麻籽油，橄榄油，棕榈油，油菜籽油，红花油，芝麻油，大豆油，杏仁油，山毛榉坚果油，巴西坚果油，腰果油，榛子油，澳洲坚果油，蒙刚果(mongongo)坚果油，山核桃油，松子油，开心果油，胡桃油，鳄梨油，葡萄油)，微生物来源的油，藻类来源的油，真菌来源的油，海洋动物油(例如，大西洋鱼油，太平洋鱼油，地中海鱼油，轻压鱼油，碱处理的鱼油，热处理的鱼油，浅和深棕色鱼油，鲣鱼油，青鳞鱼油，金枪鱼油，海鲈鱼油，大比目鱼油，旗鱼油，梭子鱼油，鳕鱼油，鲱鱼油，沙丁鱼油，凤尾鱼油，毛鳞鱼油，大西洋鳕鱼油，大西洋鲱鱼油，大西洋鲭鱼油，大西洋鲱鱼油，鲑鱼油和鲨鱼油，鱿鱼油，墨鱼油，章鱼油，磷虾油，海豹油，鲸油)，非精油，精油，天然油，非氢化油，部分氢化油，氢化油(例如，氢化椰子油)，原油，半精制(也称为碱性精制)油，互酯化油和精制油。在一些实施方案中，较长链的油(例如向日葵油，玉米油，橄榄油，大豆油，花生油，胡桃油，杏仁油，芝麻油，棉籽油，芥花籽油，红花油，亚麻籽油，棕榈油，棕榈仁油，棕榈果油，椰子油，巴巴树油，乳木果油，芒果油，可可油，小麦胚芽油，米糠油，过表达油酸达400％的工程化向日葵油)与短链甘油三酯组合以产生酯基转移的脂肪酸酯。可以结合甘油三酯和较长链的油的各种组合以产生许多不同的风味特征。
甘油单酯和甘油二酯的非限制性实例包括植物来源的甘油单酯和甘油二酯(例如，来源于以下的甘油单酯和甘油二酯：向日葵、椰子、花生、棉籽、橄榄、棕榈、油菜籽、红花、芝麻、大豆、杏仁、山毛榉坚果、巴西坚果、腰果、榛子、澳洲坚果、蒙刚果坚果、山核桃、松子、开心果、胡桃和鳄梨)。甘油单酯和甘油二酯可包括本文列出的任何游离脂肪酸的酰基链。甘油单酯和甘油二酯的其他实例是本领域已知的。
游离脂肪酸的非限制性实例包括丁酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山酸，二十四酸，蜡酸，肉豆蔻脑酸，十六碳烯酸(pamitoleic acid)，杉皮酸(sapienic acid)，油酸，反油酸，十八碳烯酸，亚油酸，反式亚油酸，α-亚麻酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，芥酸，二十二碳六烯酸，ω-脂肪酸(例如花生四烯酸，ω-3-脂肪酸，ω-6脂肪酸，ω-7脂肪酸，ω-9脂肪酸)，长度为4–16个碳的偶数碳的脂肪酸，单饱和酸(尤其是具有18个碳)，具有低界面张力的脂肪酸(例如，小于20、小于15、小于11、小于9、小于7、小于5、小于3、小于2、小于1或小于0.5达因/厘米、0.1至20、1至15、2至9、3至9、4至9、5至9、2至7、0.1至5、0.3至2或0.5至1达因/厘米，0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5或20.0)，在sn-3处被酯化的丁酸(4:0)或己酸(6:0)，在sn-1和sn-2处被酯化的中链脂肪酸(8:0–14:0)以及16:0，其中硬脂酸(18:0)位于位置sn-1的脂肪酸，其中油酸(18:1)位于位置sn-1和sn-3的脂肪酸，具有一定范围碳原子(例如8至40、10至38、12至36、14至34、16至32、18至30或20至28个碳原子)的脂肪酸，包含至少一个不饱和键(即碳-碳双键或三键；例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个碳-碳双键和/或三键)的脂肪酸，具有共轭不饱和键(即，至少一对碳-碳双键和/或三键键合在一起，而它们之间没有亚甲基(CH2)(例如4CH:CHi CH:CHi))的脂肪酸，以及上述脂肪酸的衍生物(例如，酯(例如甲酯和乙酯)，盐(例如钠盐和钾盐)，甘油三酯衍生物，甘油二酯衍生物，甘油单酯衍生物)。游离脂肪酸可以是饱和或不饱和的。在一些实施方案中，游离脂肪酸不是来源于哺乳动物或不是由哺乳动物产生。游离脂肪酸的其他实例是本领域已知的。
磷脂的非限制性实例包括卵磷脂磷脂(例如，大豆卵磷脂磷脂，向日葵卵磷脂磷脂，棉花卵磷脂磷脂，油菜籽卵磷脂磷脂，米糠卵磷脂磷脂，玉米卵磷脂磷脂，面粉卵磷脂磷脂)，心磷脂，神经酰胺磷酸胆碱，神经酰胺磷酸乙醇胺，甘油磷脂，磷脂酸，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，磷酸鞘脂和磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，磷脂不是来源于哺乳动物或不是由哺乳动物产生的。
甘油三酯的非限制性实例包括三丁酸甘油酯，短链甘油三酯，包含三个油酸的短链甘油三酯；包含己酸的短链甘油三酯；包含己酸和丁酸的短链甘油三酯；包含己酸和癸酸的短链甘油三酯；包含一个丁酸、一个己酸和一个辛酸的短链甘油三酯。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品具有按重量计小于0.3％、小于0.25％、小于0.2％、小于0.15％、小于0.1％、或小于0.05％；0.05％至3％、2.6％、2.2％、1.8％、1.4％、1.0％、0.6％、0.2％、或0.1％；0.1％至3％、2.6％、2.2％、1.8％、1.4％、1.0％、0.6％、或0.2％；0.2％至3％、2.6％、2.2％、1.8％、1.4％、1.0％、或0.6％；0.6％至3％、2.6％、2.2％、1.8％、1.4％、或1.0％；1.0％至3％、2.6％、2.2％、1.8％、或1.4％；1.4％至3％、2.6％、2.2％、或1.8％；1.8％至3％、2.6％、或2.2％；2.2％至3％、或2.6％；或2.6％至3％的游离脂质含量。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品具有在由人类感官专家小组确定的期望范围内的游离脂质含量(例如，具有由人类感官专家小组确定不是腐臭的香气和/或味道；具有由人类感官专家小组确定为期望的风味特征)。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品进一步包含碳水化合物。碳水化合物的非限制性实例包括淀粉、面粉和可食用纤维。淀粉的非限制性实例包括麦芽糊精、菊粉、低聚果糖、果胶、羧甲基纤维素、瓜耳胶、玉米淀粉、燕麦淀粉、马铃薯淀粉、大米淀粉、豌豆淀粉和小麦淀粉。面粉的非限制性实例包括但不限于苋菜面粉、燕麦面粉、藜麦面粉、大米面粉、黑麦面粉、高粱面粉、大豆面粉、小麦面粉和玉米面粉。可食用纤维的非限制性实例包括竹纤维、大麦麸、胡萝卜纤维、柑桔纤维、玉米麸、可溶性膳食纤维、不溶性膳食纤维、燕麦麸、豌豆纤维、米糠、头壳(head husk)、大豆纤维、大豆多糖、小麦麸和木浆纤维素。在一些实施方案中，至少一些碳水化合物来源于植物。在一些这样的实施方案中，至少一些碳水化合物来源于豌豆。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品还包含天然或人工甜味剂。甜味剂的非限制性实例包括甜菊糖、阿斯巴甜、甜蜜素、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜甙、brazzein、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽酮糖苷、乳糖醇(lacititol)、马槟榔、麦芽糖醇、甘露糖醇、神秘果蛋白、monatin、monelin、osladin、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、爱德万甜(Advantame)、阿力甜、阿斯巴甜-乙酰舒泛、环氨酸钠、甘精、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜、P-4000和不含碳水化合物的甜味剂。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品还包含矿物质。矿物质的非限制性实例包括脂溶性矿物质、水溶性矿物质、钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐、氯化物、磷酸盐、镁、钾、锌、铁、钼、锰和铜。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品还包含乳化剂。乳化剂的非限制性实例包括阴离子乳化剂、非离子乳化剂、阳离子乳化剂、两性乳化剂、生物乳化剂、立体乳化剂、Pickering乳化剂、糖脂类(例如海藻糖脂质、槐糖脂、鼠李糖脂、甘露糖赤藓糖醇脂(mannosylerythriol lipid))、寡肽(例如短杆菌肽S、多粘菌素)、脂肽(例如表面活性素)、磷脂、脂肪酸、中性脂质、聚合生物表面活性剂、两亲性多糖、脂多糖、蛋白质(例如豌豆蛋白、大豆蛋白、鸡心豆蛋白、藻类蛋白、酵母蛋白、马铃薯蛋白、扁豆蛋白)、甘露糖蛋白(mannoprotein)、磷酸钠、硬脂酰乳酸钙、甘油单酯的单和二乙酰酒石酸酯、磷脂、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、硬脂酸镁、脂肪酸的钠/钾/钙盐、硬脂酰二乳酸钙、聚甘油酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油单酯的乙酸酯、甘油单酯的乳酸酯、甘油单酯的柠檬酸酯、脂肪酸的聚甘油酯、聚甘油聚蓖麻油酸酯、脂肪酸的丙烷-1,2-二醇酯、糖酯、脂肪酸的蔗糖酯、甘油单酯、乙酰化甘油单酯、乳酸化甘油单酯、甘油二酯、磷酸甘油单酯、二乙酰酒石酸酯、硬脂酰基-2-乳酸钠/钙、磷酸铵、聚山梨酯、聚山梨酯80、羧甲基纤维素(CMC)、调节纤维素、柠檬酸酯、槐豆胶、瓜尔豆胶、liposan、emulsan、卵磷脂、表面活性剂(例如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯(Span 65)、脱水山梨醇倍半油酸酯(Arlacel 83)、单硬脂酸甘油酯、脱水山梨糖醇单油酸酯(Span 80)、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Span 60)、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(Span 40)、脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span 20)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯(Tween 65)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯(Tween 85)、聚乙二醇400单硬脂酸酯、聚山梨酸酯60(Tween 60)、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚山梨酸酯80(Tween 80)、聚山梨酸酯40(Tween 40)、聚山梨酸酯20(Tween 20)、PEG 20三硬脂酸酯、PEG 20三油酸酯、PEG 20单硬脂酸酯、PEG 20单油酸酯、PEG 20单棕榈酸酯和PEG 20单月桂酸酯脱水山梨糖醇)及其衍生物和混合物。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品进一步包含抗氧化剂。抗氧化剂的非限制性实例包括天然抗氧化剂(例如，α-生育酚(例如，牛乳中包含的生育酚)；低分子量硫醇(例如，牛乳中包含的低分子量硫醇)；视黄醇(例如，牛乳中包含的视黄醇)；TBHQ；类胡萝卜素(例如牛乳中包含的类胡萝卜素)；维生素E；印度楝提取物；核黄素；迷迭香提取物；迷迭香提取物中所含的酚二萜类(例如鼠尾草酚、鼠尾草酸)；鼠尾草提取物；抗坏血酸及其盐；乳酸及其盐；葡萄渣青贮物；葡萄渣青贮物中所含的酚类化合物(例如阿魏酸)；大豆(Glycine max)提取物；大豆提取物中所含的异黄酮或多酚化合物；大蒜(Allium sativum)提取物；大蒜提取物中所含的硫、酚、类黄酮或萜类化合物；茴香(Foeniculum vulgareMill.)提取物；洋甘菊(Matricaria recutita L.)提取物；褐藻(例如，泡叶藻，墨角藻(Fucus vesiculosus))；绿色粉红胡椒(GEO)的精油；成熟的粉红胡椒(MEO)的精油；绿茶提取物；丁基化羟基茴香醚(E320)；丁基化羟基甲苯(E321)；和儿茶素类(例如表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)，表儿茶素没食子酸酯(epicatechingallate)，表没食子儿茶素，C儿茶素，表儿茶素，绿茶提取物中包含的儿茶素)。在一些实施方案中，本文提供的食物产品包含按重量计小于2,000ppm的抗氧化剂。
食物产品特性
在一些实施方案中，本文提供的食物产品具有2至10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3或2.5；2.5至10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5或3；3至10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4或3.5；3.5至10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5或4；4至10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5或4.5；4.5至10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5或5；5至10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6或5.5；5.5至10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5或6；6至10、9.5、9、8.5、8、7.5、7或6.5；6.5至10、9.5、9、8.5、8、7.5或7；7至10、9.5、9、8.5、8或7.5；7.5至10、9.5、9、8.5或8；8至10、9.5、9或8.5；8.5至10、9.5或9；9至10或9.5；或9.5至10的pH，其中pH是在包含按重量计4％的蛋白质含量的去离子水的溶液中测量的。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品具有0.04至0.999、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1；0.1至0.999、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.2；0.2至0.999、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4或0.3；0.3至0.999、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5或0.4；0.4至0.999、0.9、0.8、0.7、0.6或0.5；0.5至0.999、0.9、0.8、0.7或0.6；0.6至0.999、0.9、0.8或0.7；0.7至0.999、0.9或0.8；0.8至0.999或0.9；或0.9至0.999的水活度。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品是均质的食物产品(即，已经历均化的食物产品)，并且包含平均粒径为0.11μm至15μm、12μm、10μm、8μm、6μm、4μm、2μm、1μm或0.5μm；0.5μm至15μm、12μm、10μm、8μm、6μm、4μm、2μm或1μm；1μm至15μm、12μm、10μm、8μm、6μm、4μm或2μm；2μm至15μm、12μm、10μm、8μm、6μm或4μm；4μm至15μm、12μm、10μm、8μm或6μm；6μm至15μm、12μm、10μm或8μm；8μm至15μm、12μm或10μm；10μm至15μm或12μm；或12μm至15μm的分散相液滴。
在一些实施方案中，本文提供的食物产品是粗悬浮食物产品(即，在不使用高压均化的情况下已经过乳化(例如，在胶体研磨机，超声波仪，转子定子单元中)的食物产品；例如，沙拉酱，蛋黄酱)和分散相液滴，其平均直径为1μm至10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm或2μm；2μm至10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm或3μm；3μm至10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm或4μm；4μm至10μm、9μm、8μm、7μm、6μm或5μm；5μm至10μm、9μm、8μm、7μm或6μm；6μm至10μm、9μm、8μm或7μm；7μm至10μm、9μm或8μm；8μm至10μm或9μm；或9μm至10μm。
食物产品制备
存在多种用于制备食物产品的配方，并且任何这样的配方可用于本文提供的方法中以产生本文提供的食物产品。包含重组组分的发酵液或制剂可以代替常规使用的食物成分或附加于常规使用的食物成分而在这样的配方中使用。
应该理解，尽管已经结合本发明的某些特定实施方案描述了本发明，但是前述描述旨在举例说明而不是限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面，优点和修改对于本发明所属领域的技术人员将是明显的。
实施例
包括以下实施例以举例说明本发明的具体实施方案。实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术；然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的特定实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。因此，实施例中阐述或示出的所有内容均应被解释为举例说明性的，而不是限制性的。
实施例1：通过纯化去除酯酶活性
通过用被靶向用于基因组整合并在诱导型启动子的控制下编码β-乳球蛋白的多核苷酸转化里氏木霉菌株的原生质体来产生能够产生重组β-乳球蛋白的重组里氏木霉宿主细胞。在包含选择重组多核苷酸的整合的标记物的培养基上选择转化体。
将重组宿主细胞在适合于重组宿主细胞生长以及适于产生和分泌重组β-乳球蛋白的培养基中发酵。
收集发酵液，并通过离心除去生物质和细胞碎片以获得澄清的发酵液。基于电荷(即离子络合)、热失稳性/热稳定性和/或疏水性从澄清的发酵液分离重组β-乳球蛋白。
例如，通过基于电荷的分离(即，在特定pH和/或离子强度下与携带与重组β-乳球蛋白相反的电荷的颗粒(例如，酸钠盐)的离子络合，然后分离复合物，并通过pH和/或离子强度调节从分离的复合物中洗脱重组β-乳球蛋白)，然后基于亲水性的分离(即将重组β-乳球蛋白制剂在合适的pH和/或离子强度(例如0.8M Na2SO4)下加载到苯基琼脂糖凝胶柱上以允许酯酶与苯基琼脂糖凝胶结合，并在流通物中收集可溶性β-乳球蛋白)来分离重组β-乳球蛋白。任选地喷雾干燥β-乳球蛋白制剂以获得β-乳球蛋白粉制剂。
在另一个实例中，通过基于电荷的分离(即，在特定pH和/或离子强度下与携带与重组β-乳球蛋白相反的电荷的颗粒(例如，酸钠盐)的离子络合，然后分离复合物，并通过pH和/或离子强度调节从分离的复合物中洗脱重组β-乳球蛋白)，然后基于热失稳性/热稳定性的分离(即在适当的pH和/或离子强度(例如pH3和电导率<2mS/cm，例如通过渗滤获得)下加热(例如80-85℃持续20-60分钟)以沉淀出酯酶活性，然后通过离心去除沉淀以获得可溶性β-乳球蛋白)来分离重组β-乳球蛋白。任选地喷雾干燥β-乳球蛋白制剂以获得β-乳球蛋白粉制剂。
通过将β-乳球蛋白粉末制剂(3％w/w)添加至椰子油和/或向日葵油，并在200bar下均质化以形成乳化液，来确定β-乳球蛋白制剂中包含的酯酶活性。使用FFA试剂盒(产品号KA1667；Abnova(中国台湾省台北市))来测定混合物中游离脂肪酸的存在。
如图1-4所示，通过纯化获得的β-乳球蛋白制剂包含基本上消除的酯酶活性。
实施例2：通过培养去除酯酶活性
通过用被靶向用于基因组整合并在诱导型启动子的控制下编码β-乳球蛋白的多核苷酸转化里氏木霉菌株的原生质体来产生能够产生重组β-乳球蛋白的重组里氏木霉宿主细胞。在包含选择重组多核苷酸的整合的标记物的培养基上选择转化体。
将重组宿主细胞在包含适合于重组宿主细胞生长以及适于产生和分泌重组β-乳球蛋白的培养基的三种培养物中发酵。三种培养物彼此的区别仅在于培养基中包含的消泡剂的类型，所述消泡剂选自Industrol DF204、聚乙二醇P-2000和Erol DF6000K。
从每种培养物中收集发酵液，并通过离心除去生物质和细胞碎片，以获得澄清的发酵液。澄清的发酵液中所含的酯酶活性通过使用pNPL(产品编号61716；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和4MUo测定(产品编号75164；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)基本上根据制造商的方案来测定。对于4Muo测定，在白色96孔板中将20uL澄清的发酵液与20uL 0.1M乙酸钠缓冲液pH4.3和40uL 0.1mM 4MU-o组合，将混合物在43℃温育60分钟，然后用80uL 0.1M硼砂溶液pH9.22淬灭，并通过在365nm处的激发和在450nm处的发射读数来读取荧光。对于pNPL测定，在96孔PCR板中将40uL的pH4.3的澄清发酵液与40uL的1mM pNPL溶液组合，将混合物在43℃温育60分钟，然后用等体积的0.1M硼砂溶液pH9.22淬灭，并通过在400nm处的发射读数来读取荧光。
如图5所示，Tukey-Kramer分析表明，从利用Industrol DF204或聚乙二醇P-2000作为消泡剂的培养物中获得的澄清发酵液产生比从利用Erol DF6000K作为消泡剂的培养物中获得的澄清发酵液显著更低的酯酶活性。
实施例3：通过遗传修饰去除酯酶活性
通过用经过工程改造以通过同源重组在角质酶基因座处整合并用选择标记物代替角质酶开放阅读框的多核苷酸(靶向载体)转化能够产生重组β-乳球蛋白的里氏木霉菌株的原生质体(“相应的重组宿主细胞”)来产生能够产生重组β-乳球蛋白并包含基本上消除的角质酶(例如cut1(UniProt#G0RH85))活性的重组里氏木霉宿主细胞(“角质酶敲除重组宿主细胞”)。
靶向载体的一般结构显示在图6中。靶向载体包含选择标记物(pyr4基因，其使得能够在没有尿嘧啶补充的情况下生长)，其侧翼为与里氏木霉基因组中的侧接角质酶开放阅读框的上游和下游多核苷酸序列同源的多核苷酸序列。上游序列和下游序列的序列在本文中分别提供为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
在基本培养基上选择转化体，然后通过PCR筛选以鉴定角质酶敲除重组宿主细胞。将角质酶敲除重组宿主细胞和相应的重组宿主细胞在适合于重组宿主细胞的生长以及重组β-乳球蛋白的产生和分泌的培养基中发酵。收集发酵液，并通过离心除去生物质和细胞碎片以获得澄清的发酵液。基于电荷(即，静电相互作用)从澄清的发酵液中分离重组β-乳球蛋白。
使用FFA测定法测定从角质酶敲除菌株和亲本菌株获得的β-乳球蛋白制剂中的角质酶活性。
如图7所示，在FFA测定中，从相应的重组宿主细胞获得的β-乳球蛋白制剂随时间产生游离脂肪酸，这表明在β-乳球蛋白制剂中存在脂酶活性。这样的游离脂肪酸的产生(即酯酶活性)在从角质酶敲除重组宿主细胞获得的β-乳球蛋白制剂中被基本上消除。
实施例■4：■包含在丝状真菌细胞中产生的重组■β-乳球蛋白并进一步包含降 低的酯酶活性的冰淇淋组合物。
制备以下样品，并在4℃下温育16小时：
Figure GDA0003164359190000861
Figure GDA0003164359190000871
如图9A所示，使用由丝状真菌细胞产生的重组β-乳球蛋白导致形成不期望的凝胶组合物。此外，该制剂产生了腐臭的香气和味道。
如图9B所示，重组β-乳球蛋白的热处理防止了胶凝(并减少了腐臭的香气和味道的产生)。
如图9C所示，三酰基甘油脂酶的添加消除重组β-乳球蛋白的热处理的效果，因为该制剂再次形成了凝胶组合物(具有腐臭的香气和味道)。
如图9D所示，使用从乳清纯化的牛β-乳球蛋白不提供非期望的凝胶组合物。它也没有产生腐臭的香气和味道。
如图9E所示，向牛β-乳球蛋白添加三酰基甘油脂酶导致凝胶形成(以及腐臭的香气和味道产生)。
如图9F所示，包含基本上消除的酯酶活性的重组β-乳球蛋白制剂的使用提供了具有期望的香气和味道的期望的冰淇淋质地。
综上所述，数据表明由丝状真菌细胞产生的重组β-乳球蛋白的制剂可包含对食物组合物的质地、香气和味道具有有害作用的酯酶活性。
实施例5：提供期望的感官特征的酯酶活性的鉴定
能够产生重组组分(例如，重组乳蛋白)的另外的重组宿主细胞(例如，另外的重组里氏木霉宿主细胞，另外的重组黑曲霉宿主细胞，另外的重组桔绿木霉宿主细胞，另外的重组嗜热毁丝霉宿主细胞)如实施例3中所述通过靶向其他酯酶(例如，羧酸酯水解酶(例如，UniProt#G0RBM4，G0RIU1)，磷脂酶C(例如，UniProt#G0REM9)，乙酰酯酶(例如，UniProt#G0RHJ4)和调节酯酶(例如，UniProt#G0RX49)的表达的转录因子，以及本文公开的任何其他酯酶，两种或更多种这样的其他酯酶的组合，以及一种或多种这样的其他酯酶与角质酶(例如UniProt#G0RH85)的组合)来产生，其中使用与实施例3中公开的靶向载体相似的靶向载体，但包含对靶向的酯酶基因座特异的上游和下游靶向序列，或使用其他诱变方案以将突变(例如，一个或多个核苷酸的变化、缺失或插入)引入调节酯酶表达的核苷酸序列中，或引入编码酯酶的开放阅读框中，以产生包含调节(即，更高或更低)的或基本上消除的酯酶活性的重组宿主细胞。根据本文描述的方法，从这样的重组宿主细胞获得重组组分制剂，并将其用于制备食物产品。测试食物产品的期望感官特性(例如，期望的气味，期望的味道，期望的质地，期望的乳化)，以鉴定为所述食物产品提供期望的感官特征的合适的酯酶活性或酯酶活性的组合。为特定食物产品提供期望的感官特征的合适的酯酶活性或酯酶活性的组合可以取决于食物产品的具体组成(例如，食物产品的具体脂质特性)。
本文所提及的所有出版物、专利、专利申请、序列、数据库条目和其他参考文献均以引用的方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、序列、数据库条目或其他参考文献均被明确并单独指出以通过引用并入。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。本文所使用的术语和描述仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围。
序列表
<110> 完美日股份有限公司
<120> 用于食物产品的重组组分和组合物
<130> 26579.23
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1510
<212> DNA
<213> 里氏木霉（Trichoderma reesei）
<400> 1
ctagccagaa ggacgcataa acggaagaaa ccccacgagg tcccatgact tctccagagg 60
ccgatctgcc ggcccgttac ccatctgggc atcaagcgga taatgccaat gcatcgtttt 120
tgacaggaaa agcggttggt ttgcggggta ttcgacagcc gagctggggg aagcagaaag 180
gaagcgcggg atggaagcga agaggagcgg ctttgttgct cttttcatgc gagctgtgcg 240
tcaactacag actacagcag gacaggtgcc acaatgacgc cgtacaactg tccggactcg 300
ggctcgagac tcttttccat cacataatat ctccatgagc tgaatcgtgg ctgaggagga 360
gagtttgacg cggcatgttt ctacgttccc cccggctagc ctgtacttac acacacacac 420
tcaaagcctg agggtgttca cggaccgcat atgccgtcta agcgcacaca ccttctcggc 480
ttcttccttg gcttcactct ggtctttttt ctttggcttg tgatgccgag aatctcgttt 540
gtcgttttga tttgagggcg atgagaggga gctgagtcgc gatgccctgc gataaatctt 600
ttgtattcga gtgtgcgagt ctataatgtt gtacgccggc caatcaacta tagcgagccg 660
cgtggcgatc atgacccttg tttgaagtgg acagaactag aagctggctg gcaaggggga 720
ttgtcgagat gtcgtcgctt cagaactgtc agtgctcgag cttgaagatt tgactcaata 780
ccaacgagtc agttcataca atcaggaacc aatgcggata cagagacaga atctgactat 840
catcgccact ttcatcgtcc cagagctcca gagccaacaa acagcatatg acagcggaac 900
tttccccccc tcaaccccag attaaatgct ccgttctgca tagtcagtca cacgcattgg 960
cctctgggcc cccgtcattg gcaccgtctc actggcggat cgccgaggcg ccgcatcgca 1020
aaggggagaa aagacggcac tccagtccgg atctggaagg ttgtttcttg tgatgcggag 1080
gaagcgtggc ccgagagggt gttgcaggat gagcgttgac tcgtcaattg ggccttgagg 1140
ggctgaggat ggagacaata ctagatctgt tgtctgctgc gggcctggtt gatatcgtgg 1200
ggaaagcgtg tgctgcgtaa aggaagcatt cgtcaggtca ggacaggtga ggagtatata 1260
aagagtctgg attgactccg agttctactt cctctcggcc attctctggt gtctcttgga 1320
gcaaaagcag cccttcagcc tctcagcatc ttcactcgca aaaaaaccca cttacaagat 1380
gcggtccttg gccattctca ccaccctcct cgcaggccat gcctttgcat accccaagcc 1440
agccccccag tcagtcaatc gcagggactg gccttcgatc aacgagttcc tctctgagtt 1500
ggccaaggtg 1510
<210> 2
<211> 1503
<212> DNA
<213> 里氏木霉
<400> 2
gtcttggaga gggttacgga agaggttgtg agagtcaaag tatggagaat gggcgaacat 60
aaaaaaaagg gatcaatgat tgtatatagc gaaagccact gaacatattg tatataagca 120
agcgttatga gatacatcaa tcatgttttg acatatttct ctgccaatag tgtacaatgt 180
gtagacttaa gcaaactcga atcaattcat cgctcatcta caagaaacat acaagattgt 240
ttctcatgtg tctttataaa gacagtgacc gtccacctct caagtccgat aacttatgca 300
tcatcaaagt ttcttacttg cggccgataa gctcaaggta gtgttcaaca acagagactg 360
tcatctcttc aaaagacttg aacttaaagc caaactcctt ctcagccttt gtcgaatcga 420
tatgcaccgg gatcgaaaca ggccggggaa cggactcgaa cttaaagatg ccgtcggcat 480
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catgcatctt tgcaacatcg tcgacgtgga cggcgacgcc gggaagagga tcacggggca 660
cgcccaggag agggtccatg atgatgccgt tggtgccctt ggagatgttg gcggggtcgg 720
tgacggtgtc gtcgcggccg atgacgaaga cggggaggat gttgacgacg gagaaggcgg 780
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aggcggcgat gctggaggca aaggggcctt ccgtgttgga ggcacgggtt tgttctgttg 900
acgagcggta agtcagaatt gacccctatt tctggaggca taacaggaag aggaaggagg 960
atttagctag ctgcatatgc tgggaagaaa gacataccgt tgaccttgac tcccgaggcc 1020
agggcctcga aagaggcaat ggaaaggaca gatgcggtga tgacaatctt ttcgatccca 1080
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tcagcctggc atgcctcatc accttcgacc gtcggggagg ctaggggtga agcaacgtga 1200
acgacatatt tgacgccctt gacagcttca tcgtaggcac ctggaacaat gatgttgggg 1260
acaatgatgc tctcgacttg tgagaggtaa ggcgcaagag gcttgaggct cgagatgcgt 1320
tcgaagccgg cctgggtacg gacggcggcg cggacattgt agccagcctt gacgagttcg 1380
acgagggtcc tgaagccaat catgccagtg gcaccagtga gctaaatagg ggacgtggtt 1440
gttagttggc gagggatcgg gtggagcatt tgtgtgtata tccgtgttgc tccggctcaa 1500
gac 1503

Claims (103)

1.一种用于产生食物产品的方法，所述食物产品包含由能够产生重组组分的重组微生物宿主细胞产生的重组组分，其中所述方法包括其中酯酶的活性被基本上消除或调节的至少一个步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶是单一酯酶。
3.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶包括至少2种酯酶。
4.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶包括羧酸酯水解酶。
5.权利要求4所述的方法，其中所述羧酸酯水解酶包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列G0RIU1、A2R1N7、G0RBM4、A0A2T4BBP9、G2Q379、A0A2T4AZ21、A2R8Z3、G0R9X3、A2QPC2、G0RCG3、A0A2T4BCL7、A0A2T4B416和A0A2T4BNI9。
6.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶包括三酰基甘油脂酶。
7.权利要求6所述的方法，其中所述三酰基甘油脂酶包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列A2QM14和A2R709。
8.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶包括磷脂酶A2。
9.权利要求8所述的方法，其中所述磷脂酶A2包含与UniProt序列A2QIF8至少80％相同的氨基酸序列。
10.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶包括溶血磷脂酶。
11.权利要求10所述的方法，其中所述溶血磷脂酶包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列G0RX90、G2Q0K1、A0A2T4B235、A2QC75和A2QF42。
12.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶包括乙酰酯酶。
13.权利要求12所述的方法，其中所述乙酰酯酶包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列G0RHJ4、A0A2T4BJD9和G2QL32。
14.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶包括磷脂酶C。
15.权利要求14所述的方法，其中磷脂酶C包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列G0REM9、A0A2T4BFY3和A2QAD7。
16.权利要求1所述的方法，其中所述酯酶包括角质酶。
17.权利要求16所述的方法，其中所述角质酶包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列G0RH85、A2QBP1、A0A2T4BJB5、A5ABE6、A2R2W3和G2QH51。
18.权利要求1所述的方法，其中酯酶的活性被基本上消除。
19.权利要求1所述的方法，其中酯酶的活性降低。
20.权利要求1所述的方法，其中酯酶的活性增加。
21.权利要求1所述的方法，其中酯酶的活性包括基本上消除的第一酯酶的活性和降低的第二酯酶的活性。
22.权利要求1所述的方法，其中酯酶的活性包括基本上消除的第一酯酶的活性和增加的第二酯酶的活性。
23.权利要求1所述的方法，其中酯酶的活性包括降低的第一酯酶的活性和增加的第二酯酶的活性。
24.权利要求1所述的方法，其中所述其中酯酶的活性被基本上消除或调节的至少一个步骤包括在适于基本上消除或调节酯酶活性的条件下培养所述重组微生物宿主细胞的步骤。
25.权利要求25所述的方法，其中合适的条件包括合适的消泡剂的存在。
26.权利要求26所述的方法，其中所述消泡剂选自ACP 1500、消泡剂204、ErolDF6000K、Hodag K-60K、IndustrolDF204、P-2000E、SAG 471、SAG 5693、SAG 710、SAG 730、硅酮消泡剂、StruktolJ647、StruktolJ673A和向日葵油。
27.权利要求1所述的方法，其中所述其中酯酶的活性被基本上消除或调节的至少一个步骤包括在重组微生物宿主细胞中产生重组组分的步骤，所述重组微生物宿主细胞包含与相应重组微生物宿主细胞中所包含的酯酶的活性相比基本上消除或调节酯酶的活性的遗传修饰。
28.权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物宿主细胞是重组丝状真菌宿主细胞。
29.权利要求29所述的方法，其中所述重组丝状真菌宿主细胞来源于重组黑曲霉(Aspergillus niger)宿主细胞、重组嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)宿主细胞、重组里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主细胞和重组桔绿木霉(Trichodermacitrinoviride)宿主细胞。
30.权利要求1所述的方法，其中所述其中酯酶的活性被基本上消除或调节的至少一个步骤包括纯化所述重组组分以与所述酯酶分开的步骤。
31.权利要求1所述的方法，其中所述重组组分是重组蛋白。
32.权利要求32所述的方法，其中所述重组蛋白选自重组植物蛋白、重组藻类蛋白、重组真菌蛋白、重组微生物蛋白和重组动物蛋白。
33.权利要求33所述的方法，其中所述重组动物蛋白是重组乳蛋白。
34.权利要求34所述的方法，其中所述重组乳蛋白是重组乳清蛋白。
35.权利要求35所述的方法，其中所述重组乳清蛋白选自α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、转铁蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶和糖巨肽。
36.权利要求34所述的方法，其中所述重组乳蛋白是重组酪蛋白。
37.权利要求37所述的方法，其中所述重组酪蛋白选自β-酪蛋白、γ-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白和α-S2-酪蛋白。
38.权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：纯化所述重组组分以获得包含所述重组组分和与相应的制剂相比基本上消除或调节的活性的酯酶的制剂。
39.权利要求39所述的方法，其中所述制剂包含被优化以在所述食物产品上提供选自期望的风味、期望的香气、期望的质地、期望的乳化、期望的营养含量和期望的保质期的一种或多种性质的酯酶活性谱。
40.权利要求39所述的方法，其中所述制剂是粉末。
41.一种重组微生物宿主细胞，所述重组微生物宿主细胞能够产生重组组分并且包含与相应重组微生物宿主细胞中所包含的酯酶的活性或表达相比基本上消除或调节的酯酶的活性或表达的遗传修饰。
42.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶是单一酯酶。
43.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶包括至少2种酯酶。
44.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶包括羧酸酯水解酶。
45.权利要求45所述的重组微生物宿主细胞，其中所述羧酸酯水解酶包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：G0RIU1、A2R1N7、G0RBM4、A0A2T4BBP9、G2Q379、A0A2T4AZ21、A2R8Z3、G0R9X3、A2QPC2、G0RCG3、A0A2T4BCL7、A0A2T4B416和A0A2T4BNI9。
46.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶包括三酰基甘油脂酶。
47.权利要求47所述的重组微生物宿主细胞，其中所述三酰基甘油脂酶包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列A2QM14和A2R709。
48.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶包括磷脂酶A2。
49.权利要求49所述的重组微生物宿主细胞，其中所述磷脂酶A2包含与UniProt序列A2QIF8至少80％相同的氨基酸序列。
50.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶包括溶血磷脂酶。
51.权利要求51所述的重组微生物宿主细胞，其中所述溶血磷脂酶包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列G0RX90、G2Q0K1、A0A2T4B235、A2QC75和A2QF42。
52.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶包括乙酰酯酶。
53.权利要求53所述的重组微生物宿主细胞，其中所述乙酰酯酶包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列G0RHJ4、A0A2T4BJD9和G2QL32。
54.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶包括磷脂酶C。
55.权利要求55所述的重组微生物宿主细胞，其中所述磷脂酶C包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列G0REM9、A0A2T4BFY3和A2QAD7。
56.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶包括角质酶。
57.权利要求57所述的重组微生物宿主细胞，其中所述角质酶包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列G0RH85、A2QBP1、A0A2T4BJB5、A5ABE6、A2R2W3和G2QH51。
58.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶的活性被基本上消除。
59.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶的活性降低。
60.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶的活性增加。
61.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶的活性包括基本上消除的第一酯酶的活性和降低的第二酯酶的活性。
62.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述酯酶的活性包括基本上消除的第一酯酶的活性和增加的第二酯酶的活性。
63.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中酯酶的活性包括降低的第一酯酶的活性和增加的第二酯酶的活性。
64.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述遗传修饰选自：驱动酯酶或表达酯酶所需的蛋白质的表达的控制序列或其功能部分中的遗传修饰、编码表达酯酶所需的蛋白质或其功能部分的编码序列中的遗传修饰、编码酯酶或其功能部分的编码序列中的遗传修饰、驱动酯酶的内源性抑制剂的表达的控制序列或其功能部分中的遗传修饰、编码酯酶的内源性抑制剂的编码序列中的遗传修饰以及引入编码酯酶的异源抑制剂的编码序列的遗传修饰。
65.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述遗传修饰是驱动调节酯酶的表达的转录因子的表达的控制序列或其功能部分中的遗传修饰或编码这样的转录因子或其功能部分的编码序列中的遗传修饰。
66.权利要求66所述的重组微生物宿主细胞，其中所述转录因子包含与选自以下的序列至少80％相同的氨基酸序列：UniProt序列G0RX49、G0RHG1、A0A2T4B416、A0A2T4BJU6、A2R2J1、A2R903、G2Q2Z5和G2Q8I6。
67.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述重组微生物宿主细胞是重组丝状真菌宿主细胞。
68.权利要求68所述的重组微生物宿主细胞，其中所述重组丝状真菌宿主细胞选自重组黑曲霉宿主细胞、重组嗜热毁丝霉宿主细胞、重组里氏木霉宿主细胞和重组桔绿木霉宿主细胞。
69.权利要求42所述的重组微生物宿主细胞，其中所述重组组分是重组蛋白。
70.权利要求70所述的重组微生物宿主细胞，其中所述重组蛋白选自重组植物蛋白、重组藻类蛋白、重组真菌蛋白、重组微生物蛋白和重组动物蛋白。
71.权利要求71所述的重组微生物宿主细胞，其中所述重组动物蛋白是重组乳蛋白。
72.权利要求72所述的重组微生物宿主细胞，其中所述重组乳蛋白是重组乳清蛋白。
73.权利要求73所述的重组微生物宿主细胞，其中所述重组乳清蛋白选自α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、转铁蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶和糖巨肽。
74.权利要求72所述的重组微生物宿主细胞，其中所述重组乳蛋白是重组酪蛋白。
75.权利要求75所述的重组微生物宿主细胞，其中所述重组酪蛋白选自β-酪蛋白、γ-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白和α-S2-酪蛋白。
76.一种食物产品，其包含由重组微生物宿主细胞产生的重组组分，其中所述食物产品还包含与相应食物产品中的酯酶活性相比基本上消除或调节的酯酶活性。
77.权利要求77所述的食物产品，其中所述酯酶是单一酯酶。
78.权利要求77所述的食物产品，其中所述酯酶包括至少2种酯酶。
79.权利要求77所述的食物产品，其中所述食物产品基本上没有酯酶活性。
80.权利要求77所述的食物产品，其中酯酶的活性降低。
81.权利要求77所述的食物产品，其中酯酶的活性增加。
82.权利要求77所述的食物产品，其中所述食物产品是乳制品替代品。
83.权利要求83所述的食物产品，其中所述乳制品替代品是选自以下的乳制品的替代品：牛奶、酸奶、奶酪、乳制品涂抹料、奶油、冷冻甜食、黄油和乳粉。
84.权利要求77所述的食物产品，其中所述食物产品包括乳蛋白组分。
85.权利要求85所述的食物产品，其中所述乳蛋白组分包含至少一种重组乳蛋白。
86.权利要求85所述的食物产品，其中所述至少一种重组乳蛋白是单一重组乳蛋白。
87.权利要求87所述的食物产品，其中所述单一重组乳蛋白是重组β-乳球蛋白。
88.权利要求87所述的食物产品，其中所述单一重组乳蛋白是重组α-乳白蛋白。
89.权利要求87所述的食物产品，其中所述单一重组乳蛋白是重组κ-酪蛋白。
90.权利要求87所述的食物产品，其中所述单一重组乳蛋白是重组β-酪蛋白。
91.权利要求87所述的食物产品，其中所述单一重组乳蛋白是重组γ-酪蛋白。
92.权利要求85所述的食物产品，其中所述至少一种重组乳蛋白是两种重组乳蛋白。
93.权利要求93所述的食物产品，其中所述两种重组乳蛋白是重组β-乳球蛋白和重组α-乳白蛋白。
94.权利要求93所述的食物产品，其中所述两种重组乳蛋白是重组κ-酪蛋白和重组β-酪蛋白。
95.权利要求93所述的食物产品，其中所述两种重组乳蛋白是重组κ-酪蛋白和重组γ-酪蛋白。
96.权利要求93所述的食物产品，其中所述两种重组乳蛋白是重组β-酪蛋白和重组γ-酪蛋白。
97.权利要求93所述的食物产品，其中所述两种重组乳蛋白是重组β-乳球蛋白和重组κ-酪蛋白。
98.权利要求93所述的食物产品，其中所述两种重组乳蛋白是重组κ-酪蛋白和重组α-乳白蛋白。
99.权利要求93所述的食物产品，其中所述两种重组乳蛋白是重组β-乳球蛋白和重组β-酪蛋白。
100.权利要求93所述的食物产品，其中所述两种重组乳蛋白是重组β-酪蛋白和重组α-乳白蛋白。
101.权利要求93所述的食物产品，其中所述两种重组乳蛋白是重组β-乳球蛋白和重组γ-酪蛋白。
102.权利要求93所述的食物产品，其中所述两种重组乳蛋白是重组γ-酪蛋白和重组α-乳白蛋白。
103.权利要求77所述的食物产品，其中所述食物产品包含在赋予所述食物产品期望的感官特征的期望范围内的游离脂质含量。
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