KR20210119375A - 식품에서 사용하기 위한 재조합 성분 및 조성물 - Google Patents

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티모시 게이스트링거
헤더 젠슨
라비라즈신 잘라
헨드릭 미어먼
발라크리쉬난 라메쉬
타이 웨거너
티모시 스콧 존슨
빈센트 웨이-시앙 우
프란체스카 마네아
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퍼펙트 데이, 인크.
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Abstract

재조합 성분을 포함하는 식품을 생산하는 방법, 및 이러한 방법에서 사용되는 조성물, 및 이러한 방법에 의해 생산된 식품이 제공된다.

Description

식품에서 사용하기 위한 재조합 성분 및 조성물
관련 출원
본 출원은 2018년 10월 17일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/746,918을 우선권 주장하고, 이는 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 동물-유래 식품의 대안물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 식품에서 사용하기 위한 재조합 성분 및 조성물, 이러한 성분 및 조성물을 생산하는 방법, 및 이러한 성분 및 조성물을 포함하는 식품을 생산하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
동물-유래 식품 (예를 들어, 육류, 우유, 난)은 대중적인 영양 공급원이다. 이는 고품질 단백질, 필수 미네랄 (예를 들어, 칼슘, 인, 아연, 마그네슘), 및 비타민 (예를 들어, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 B12)을 포함한다. 추가적으로, 다수의 이러한 식품은 광범위한 파생 식품 (예를 들어, 요거트, 치즈, 크림, 아이스크림, 버터, 마요네즈)의 생산을 허용하는 유리한 기능적 특성을 보유한다.
그러나, 동물-유래 식품은 인간에서 건강에 좋지 않은 반응을 야기할 수 있는 성분 (예를 들어, 락토스, 알레르겐, 포화 지방, 콜레스테롤)을 포함한다. 또한, 이러한 식품의 생산은 축산을 수반하고, 이는 동물 복지 및 환경에 상당한 영향을 미치고, 병원체, 살충제 잔류물, 중금속 및 아플라톡신 M1으로 오염될 가능성이 있다.
이러한 우려는 동물-유래 식품에 대한 대안물의 개발을 촉진하였다. 일부 이러한 대안물은 식물-유래 성분 (예를 들어, 단백질, 지질, 비타민)을 포함한다. 그러나, 점차적으로, 동물-유래 식품에 대한 대안물은 재조합으로 (예를 들어, 미생물 숙주 세포를 사용하여) 생산된 성분 (예를 들어, 단백질, 지질)로부터 생산된다.
식품에서 재조합 성분을 사용하는 것은 새로운 문제를 제기한다. 한 이러한 문제는 재조합 성분으로부터 생산된 식품이 종종 상당량의 이러한 재조합 성분을 함유하고 (재조합 성분이 이용된 이전 제품에서 전형적인 것보다 더 많음), 다량의 재조합 성분의 사용이 재조합 성분이 수득되는 미생물 숙주 세포에 의해 동시에 생산되는 다른, 때때로 바람직하지 않는 성분에 영향을 받을 수 있다는 사실이다.
한 이러한 다른 성분은 에스테라제 활성이다. 에스테라제는 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 및/또는 지질단백질 내의 에스테르 결합을 가수분해하여 유리 지방산을 방출할 수 있다. 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 및/또는 지질단백질을 포함하는 조성물은 재조합 성분이 사용될 수 있는 다양한 식품에서 사용된다. 일부 이러한 식품에서, 유리 지방산의 에스테라제-촉매 방출이, 예를 들어, 질감, 에멀션화, 향, 맛 및 영양 함량과 같은 성질에 해로운 효과를 가질 수 있다. 다른 이러한 식품에서, 유리 지방산의 에스테라제-촉매 방출은, 예를 들어, 풍미 프로파일 (예를 들어, 숙성 치즈의 풍미 프로파일)과 같은 성질에 이로운 효과를 가질 수 있다.
그 결과, 특히 에스테라제 활성과 관련하여, 동물-유래 식품에 대한 대안물의 생산을 위한 재조합 성분의 생산, 프로세싱 및 사용에서, 난제가 극복되어야 한다.
따라서, 동물-유래 식품에 대한 대안물이 재조합 성분으로부터 생산될 수 있는 방법, 뿐만 아니라 이러한 방법에서 사용되고 이러한 방법으로부터 수득되는 조성물이 요구된다.
도면의 간단한 설명
예시적인 실시양태가 하기 내용의 첨부된 도면의 사용을 통해 추가적으로 구체적이고 상세하게 기술되고 설명될 것이다:
도 1은 본 발명의 다양한 대표적인 실시양태에 따른, 전하 (즉, 이온성 복합체 형성) 및 열불안정성/열안정성을 기초로 에스테라제 활성을 정제하는 것으로부터 수득된 재조합 β-락토글로불린 제제의 유리 지방산 (FFA) 검정법의 결과를 나타내는 차트이고, 여기서 "최종 물질"은 높은 염을 제거하고 재조합 β-락토글로불린을 농축하기 위한 완충제 교환 후의 제제이다;
도 2는 본 발명의 다양한 대표적인 실시양태에 따른, 전하 (즉, 이온성 복합체 형성) 및 열불안정성/열안정성을 기초로 에스테라제 활성을 정제하는 것으로부터 수득된 재조합 β-락토글로불린 제제의 염색된 천연 PAGE 겔을 나타내고, 여기서 "최종 물질"은 높은 염을 제거하고 재조합 β-락토글로불린을 농축하기 위한 완충제 교환 후의 제제이다;
도 3은 본 발명의 다양한 대표적인 실시양태에 따른, 전하 (즉, 이온성 복합체 형성) 및 소수성을 기초로 에스테라제 활성을 정제하는 것으로부터 수득된 재조합 β-락토글로불린 제제의 FFA 검정법의 결과를 나타내는 차트이고, 여기서 "최종 물질"은 높은 염을 제거하고 재조합 β-락토글로불린을 농축하기 위한 완충제 교환 후의 제제이다;
도 4는 본 발명의 다양한 대표적인 실시양태에 따른, 전하 (즉, 이온성 복합체 형성) 및 소수성을 기초로 에스테라제 활성을 정제하는 것으로부터 수득된 재조합 β-락토글로불린 제제의 염색된 천연 PAGE 겔을 나타내고, 여기서 "최종 물질"은 높은 염을 제거하고 재조합 β-락토글로불린을 농축하기 위한 완충제 교환 후의 제제이다;
도 5는 본 발명의 다양한 대표적인 실시양태에 따른, 투키-크레이머(Tukey-Kramer) 분석으로 지시된 소포제를 포함하는 배양물로부터 수득된 정화된 발효 브로스의 pNPL 검정법의 결과를 나타내는 다이어그램이다;
도 6은 본 발명의 다양한 대표적인 실시양태에 따른, 제거된 큐티나제 활성을 포함하는 재조합 숙주 세포의 생산에 사용된 표적화 벡터의 지도이다;
도 7은 본 발명의 다양한 대표적인 실시양태에 따른, 상응하는 재조합 숙주 세포로부터 수득된 재조합 β-락토글로불린 제제에 비교하여 제거된 큐티나제 활성을 포함하는 재조합 숙주 세포로부터 수득된 재조합 β-락토글로불린 제제에 대한 FFA 검정법의 결과를 나타내는 차트이다;
도 8은 본 발명의 다양한 대표적인 실시양태에 따른, 상응하는 재조합 숙주 세포로부터 수득된 재조합 β-락토글로불린 제제에 비교하여 제거된 큐티나제 활성을 포함하는 재조합 숙주 세포로부터 수득된 재조합 β-락토글로불린 제제의 염색된 천연 PAGE 겔을 나타내는 차트이다;
도 9a-9f는 본 발명의 다양한 대표적인 실시양태에 따른, 에스테라제 활성의 존재 또는 부재 하의 재조합 또는 천연 소 β-락토글로불린을 포함하는 빙과의 겔 조성물의 사진을 나타낸다.
발명의 개요
한 측면에서, 재조합 성분을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 성분을 포함하는 식품을 생산하는 방법이며, 여기서 방법이 에스테라제의 활성이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 재조합 성분 및 상응하는 제제 내에 포함된 에스테라제 활성에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 제제가 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 재조합 성분을 생산할 수 있고, 상응하는 재조합 미생물 숙주 세포 내에 포함된 에스테라제 활성 또는 발현에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 재조합 미생물 숙주 세포가 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 성분을 포함하는 식품이고, 여기서 식품이 상응하는 식품에서의 에스테라제의 활성에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제의 활성을 추가로 포함하는 식품이 본원에서 제공된다.
발명의 상세한 설명
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 추가로, 문맥적으로 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다.
정의
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "하나" 및 유사한 언급은 본원에서 달리 지시되거나 또는 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 단수 및 복수 둘 다를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내에 있는 것을 지칭하고, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 또는 측정 시스템의 한계에 부분적으로 좌우될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 조합되거나 또는 서로 배타적인 다중 성분을 지칭한다. 예를 들어, "x, y, 및/또는 z"는 "x" 단독, "y" 단독, "z" 단독, "x, y, 및 z", "(x 및 y) 또는 z", 또는 "x 또는 y 또는 z"를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "상응하는 제제"는 (예를 들어, 제제가 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 재조합 미생물 숙주 세포로부터, 및/또는 에스테라제 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 데 적절한 조건 하에 배양된 재조합 미생물 숙주 세포로부터, 및/또는 에스테라제 억제제를 포함한 발효 브로스로부터 유래되지 않은 것에 의해; 또는 재조합 성분이 에스테라제 활성으로부터 정제되지 않은 것에 의해) "상응하는 제제" 내에 포함된 에스테라제 활성이 본원에서 제공된 바와 같이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되지 않는다는 것을 제외하고는 "상응하는 제제"에 비교되는 제제와 동일한 제제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "상응하는 식품"은 "상응하는 식품"이 생산되는 방법이 본원에서 제공된 방법에서 제공되는 바와 같은 에스테라제 활성이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계를 포함하지 않는다는 것을 제외하고는 "상응하는 식품"에 비교되는 식품을 생산하는 데 사용된 방법과 동일한 방법에 의해 생산된 식품을 지칭한다.
용어 "상응하는 재조합 미생물 숙주 세포"는 "상응하는 재조합 미생물 숙주 세포"의 에스테라제 활성이 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포에서 제공되는 바와 같이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되지 않는다는 것을 제외하고는 "상응하는 재조합 미생물 숙주 세포"에 비교되는 재조합 미생물 숙주 세포와 동일한 재조합 미생물 숙주 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "본질적으로 없는" 및 "본질적으로 제거된"은 지시된 성분이 통상적인 분석 방법에 의해 지시된 조성물에서 검출가능하지 않거나 또는 지시된 성분이 기능적이지 않도록 미량으로 존재하는 것을 지칭한다. 이러한 문맥에서 사용된 바와 같은 용어 "기능적"은 미량의 지시된 성분을 포함하는 조성물의 성질에 기여하지 않거나, 또는 미량의 지시된 성분을 포함하는 지시된 조성물에서 활성 (예를 들어, 효소 활성)을 갖지 않거나, 또는 미량의 지시된 성분을 포함하는 조성물의 소비 시 건강에 유해한 효과를 갖지 않는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "에스테라제 활성" 또는 "에스테라제의 활성"은 에스테르 결합을 가수분해할 수 있는 효소 (즉, 에스테르 결합 상에 작용하는 히드롤라제)의 활성을 지칭한다. 에스테라제는 효소 위원회 번호 (EC 번호) 3.1로 지정된다. 이러한 용어들은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "발효 브로스"는 재조합 성분을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 포함하는 배양물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "사상 진균 세포"는 유미코타(Eumycota) 및 오오미코타(Oomycota) 아문으로부터의 임의의 사상 형태의 세포를 지칭한다 (문헌 [Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK]에 정의된 바와 같음). 사상 진균 세포는 무성생식 성장 동안의 그의 균사 신장에 의해 효모와 구별된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "진균"은 아스코미코타(Ascomycota), 바시디오미코타(Basidiomycota), 자이고미코타(Zygomycota), 및 키트리디오미코타(Chythridiomycota), 오오미코타(Oomycota), 및 글로메로미코타(Glomeromycota) 문의 생물을 지칭한다. 그러나, 진균 분류가 계속 진화 중이고, 따라서 진균계의 이러한 특정한 정의는 미래에 조정될 수 있다는 것이 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이종성"은 이것이 기술되는 맥락에서 정상적으로 존재하지 않는 것을 지칭한다. 달리 말하면, 이렇게 특성화된 존재는 이것이 기술되는 맥락에서 외래이다. 사상 진균 세포에 의해 생산되는 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 이러한 용어는 단백질이 사상 진균 세포에 의해 천연적으로 생산되지 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 재조합 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 지칭하도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "동일한"은 최대 상응에 대해 정렬되었을 때 동일한 2개의 서열 내의 기준 창 내의 잔기를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 다수의 상이한 알고리즘이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, FASTA (예를 들어, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group) (위스컨신주 매디슨)의 위스컨신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 버전 10.0에서 제공된 바와 같음), GAP (예를 들어, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (위스컨신주 매디슨)의 위스컨신 제네틱스 소프트웨어 패키지 10.0에서 제공된 바와 같음), BESTFIT (예를 들어, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (위스컨신주 매디슨))의 위스컨신 제네틱스 소프트웨어 패키지 10.0에서 제공된 바와 같음), ClustalW (예를 들어, 버전 1.83의 디폴트 파라미터를 사용함), 또는 BLAST (예를 들어, 상호 BLAST, PSI-BLAST, BLASTP, BLASTN을 사용함; 예를 들어, 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 제공된 바와 같음)를 사용하여 서열을 비교할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Pearson. 1990. Methods Enzymol. 183:63]; [Altschul et al. 1990. J. Mol. Biol. 215:403]을 참조한다). 이러한 방법에 의한 정렬을 위해, 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다 (예를 들어, BLASTN의 경우, 디폴트 파라미터는 갭(Gap) 개방 페널티=5 및 갭 확장 페널티=2이고, BLASTP의 경우, 디폴트 파라미터는 갭 개방 페널티=11 및 갭 확장 페널티=1이다). 기준 창은 2개의 서열의 전체 길이부터 2개 서열 각각의 영역 (예를 들어, 적어도 50개의 뉴클레오티드 또는 적어도 10개의 아미노산 길이인 영역)만까지의 범위일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "포함하는", "포함하다", "갖는", "갖는다", "갖는/있는", 또는 그의 변형은 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 포괄적이도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "미생물(microbe)"은 미생물(microorganism)의 약어이고, 단세포 생물을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이러한 용어는 모든 박테리아, 원시세균, 단세포 원생생물, 단세포 동물, 단세포 식물, 단세포 진균, 단세포 조류, 원생동물, 및 크로미스타(chromista)를 포함한다.
에스테라제 활성과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "조정된"은 에스테라제의 활성의 증가 또는 감소를 포함하여, 에스테라제의 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)의 임의의 변경을 지칭한다. 이러한 조정된 에스테라제 활성은 전형적으로 에스테라제의 농도의 증가 또는 감소 또는 에스테라제의 효소 활성의 증가 또는 감소에 기인한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "천연"은 자연에서 발견되는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "임의적인" 또는 "임의적으로"는 특색 또는 구조가 존재하거나 또는 그렇지 않은 것, 또는 이벤트 또는 상황이 발생하거나 또는 그렇지 않은 것을 지칭한다. 이러한 기술은 특정한 특색 또는 구조가 존재하는 경우 및 특색 및 구조가 부재하는 경우, 또는 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우 및 이벤트 또는 상황이 발생하지 않는 경우를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"는 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 상기의 것들의 합성 형태 및 혼합 중합체의 센스 및 안티센스 가닥 둘 다를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 표지, 메틸화, 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형 예컨대 하전되지 않은 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트), 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트), 펜던트 모이어티 (예를 들어, 폴리펩티드), 인터칼레이터 (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌), 킬레이터, 알킬화제, 및 변형 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 예가 관련 기술 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Malyshev et al. 2014. Nature 509:385]; [Li et al. 2014. J. Am. Chem. Soc. 136:826]을 참조한다). 수소 결합 혈성 및 다른 화학적 상호작용을 통해 지정된 서열에 결합하는 능력 면에서 폴리뉴클레오티드를 모방하는 합성 분자가 또한 포함된다. 이러한 분자는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 펩티드 연결이 분자의 백본 내의 포스페이트 연결을 치환하는 분자를 포함한다. 다른 변형은, 예를 들어, 리보스 고리가 가교 모이어티 또는 다른 구조 예컨대 "잠금" 폴리뉴클레오티드에서 발견되는 변형을 함유하는 유사체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "제제"는 발효 브로스의 하나 이상의 다른 성분으로부터의 재조합 성분의 분리 시에 수득된 제제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭하고, 이는 코딩 및 비-코딩 아미노산, 천연에서 발생하는 아미노산 및 천연에서 발생하지 않는 것, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "정제함"은 재조합 단백질이 재조합 미생물 숙주 세포의 세포 성분 (예를 들어, 막 지질, 염색체, 단백질)으로부터 실질적으로 분리되는 것을 지칭한다. 이러한 용어는 재조합 단백질이 모든 다른 화학물질로부터 분리되는 것을 (허용하지만) 요구하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 미생물 숙주 세포"는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 지칭하도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 미생물 숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 그의 천연 발생 환경으로부터 제거된 폴리뉴클레오티드, 천연에서 발견될 때 폴리뉴클레오티드에 인접 또는 근접하는 폴리뉴클레오티드 전체 또는 일부분과 회합되지 않은 폴리뉴클레오티드, 천연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드, 또는 천연에서 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 용어는, 예를 들어, 클로닝된 DNA 단리물, 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 기술하는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 천연적으로 발생하지 않는 임의의 유전자 변형을 함유하는 경우에 또한 "재조합"으로 간주된다. 예를 들어, 내인성 폴리뉴클레오티드가 인공적으로, 예를 들어, 인간의 개입에 의해 도입된 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 함유하면 이는 "재조합 폴리뉴클레오티드"로 간주된다. 이러한 변형은 폴리뉴클레오티드 내로 점 돌연변이, 치환 돌연변이, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 프레임 이동 돌연변이, 중복 돌연변이, 증폭 돌연변이, 전위 돌연변이, 또는 역전 돌연변이를 도입할 수 있다. 이러한 용어는 숙주 세포의 염색체 내의 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 숙주 세포의 염색체 내에 있지 않은 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 에피솜 내에 포함된 폴리뉴클레오티드)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 단백질"은 천연에서 단백질을 생산하는 세포의 종 또는 유형에 비교하여 상이한 종 또는 유형의 세포에서 생산되거나, 또는 천연에서 생산되지 않는 수준으로 세포에서 생산되는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 자신이 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한가지 유형은 "플라스미드"이고, 이는 추가적인 DNA 분절이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 일반적으로 지칭하지만, 선형 이중-가닥 분자 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의한 증폭으로부터 또는 원형 플라스미드의 제한 효소 처리로부터 초래된 것을 또한 포함한다. 다른 벡터는 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 및 효모 인공 염색체 (YAC)를 포함한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가적인 DNA 분절은 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다 (하기에서 더욱 상세하게 논의됨). 특정 벡터는 자신이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제될 수 있다 (예를 들어, 숙주 세포에서 기능하는 복제 기원을 갖는 벡터). 다른 벡터는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "효모"는 사카로미세탈레스(Saccharomycetales) 목의 생물, 예컨대 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 지칭한다. 효모의 무성생식 성장은 단세포 탈러스(thallus)의 발아/출포에 의해 발생하고, 탄소 이화대사는 발효성일 수 있다.
재조합 성분을 포함하는 식품을 생산하는 방법
한 측면에서, 재조합 성분을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포 (예를 들어, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포 중 임의의 것)에 의해 생산된 재조합 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분 중 임의의 것)을 포함하는 식품을 생산하는 방법이며, 여기서 방법이 에스테라제의 활성 (즉, 에스테라제 활성; 예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 재조합 성분을 생산하는 재조합 미생물 숙주 세포가 또한 전형적으로 에스테라제 활성을 생산한다는 발견을 기초로 재조합 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분 중 임의의 것)을 포함하는 식품을 생산하는 하나 이상의 방법을 제공한다. 이러한 에스테라제 활성은 재조합 성분과 공동으로 정제될 수 있다. 그 후 재조합 성분이 식품을 생산하는 데 사용되는 경우, 에스테라제 활성은 식품 내에 함유된 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 및/또는 지질단백질 내의 에스테르 결합을 가수분해할 수 있고, 따라서 식품에서 유리 지방산의 생산을 촉매할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 식품에서의 유리 지방산 생산은, 예를 들어, 산패된 향 및/또는 맛을 생산하고, 에멀션 형성을 방해하고, 질감에 대한 바람직하지 않은 효과를 갖고, 필수 영양소 (예를 들어, 비타민)와 상호작용함으로써 영양 함량을 소시키며, 저장 수명을 감소시키는 것에 의해, 해로운 효과를 가질 수 있다. 식품에서의 유리 지방산 생산은, 예를 들어, 원하는 풍미 프로파일 (예를 들어, 숙성 치즈의 풍미 프로파일)을 생산하거나, 또는 가공 치즈에서 사용하기 위한 효소-변형 치즈를 제조하는 것에 의해, 이로운 효과를 가질 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 에스테라제 활성이 포유동물-생산 우유에 함유된 에스테라제 활성과 상이하다는 발견을 기초로 재조합 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분 중 임의의 것)을 포함하는 식품을 생산하는 하나 이상의 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 다양한 실시양태는 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 에스테라제 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 특정한 방법을 포함한다. 재조합 미생물 숙주 세포에서 생산된 재조합 성분을 포함하는 식품에서 에스테라제 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 것에 의해, 본 발명은 식품에서 산패된 향 및 맛의 생산을 방지하거나 지연시키고/거나, 에멀션을 형성시키고/거나, 영양 함량을 증가시키고/거나, 질감을 조정하고/거나, 저장 수명을 연장시키고/거나, 원하는 풍미 프로파일을 더욱 신속하게 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법은 에스테라제 활성이 본질적으로 제거되는 적어도 1개의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법은 에스테라제 활성이 감소되는 적어도 1개의 단계를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 에스테라제 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법은 에스테라제 활성이 증가되는 적어도 1개의 단계를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 에스테라제 활성은 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%만큼 증가된다.
일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법은 제1 에스테라제 활성이 본질적으로 제거되고 제2 에스테라제 활성이 감소되는 적어도 1개의 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법은 제1 에스테라제 활성이 본질적으로 제거되고 제2 에스테라제 활성이 증가되는 적어도 1개의 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법은 제1 에스테라제 활성이 증가되고 제2 에스테라제 활성이 감소되는 적어도 1개의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법은 에스테라제의 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 1개의 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법은 에스테라제의 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 2개 이상의 단계 (예를 들어, 2개의 단계, 3개의 단계, 4개의 단계, 5개의 단계) (예를 들어, 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성, 예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성을 제공하는 본원에 개시된 단계로부터 선택된 2개 이상의 단계)를 포함한다.
에스테라제 활성의 본질적인 제거 또는 조정
식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법에서의 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계는 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 제공하는 임의의 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법에서의 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계는 에스테라제 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 데 적절한 조건 하에 재조합 성분을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
따라서, 일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 a) 재조합 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분 중 임의의 것)을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 수득하는 단계; b) 재조합 미생물 숙주 세포를 에스테라제 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 데, 그리고 재조합 성분의 생산 및/또는 분비에 적절한 조건 하에 배양 배지에서 배양하여, 재조합 성분 및 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 발효 브로스를 수득하는 단계; c) 임의적으로, 발효 브로스로부터 재조합 성분을 정제하여, 재조합 성분 및 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 제제를 수득하는 단계; 및 d) 재조합 성분 및 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 발효 브로스 또는 제제로부터 식품을 제조하는 단계를 포함한다.
에스테라제 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 데 적절한 조건 하에 배양 배지에서 재조합 미생물 숙주 세포를 배양하기 위한 적절한 조건은, 예를 들어, 재조합 미생물 숙주 세포가 그의 에스테라제 활성 생산을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 조건이다. 이러한 조건의 비제한적인 예는 적절한 pH, 적절한 온도, 적절한 공급 속도, 적절한 압력, 적절한 영양 함량 (예를 들어, 적절한 탄소 함량, 적절한 질소 함량, 적절한 인 함량), 적절한 보충물 함량, 적절한 미량 금속 함량, 및/또는 적절한 산소화 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 미생물 숙주 세포가 그의 에스테라제 활성 생산을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 적절한 pH는 2 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 또는 2.5; 2.5 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5, 4.5, 4, 3.5, 또는 3; 3 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5, 4.5, 4, 또는 3.5; 3.5 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5, 4.5, 4; 4 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5, 4.5; 4.5 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5; 5 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5; 5.5 내지 7.5, 6.5, 6; 6 내지 7.5, 6.5; 6.5 내지 7.5, 또는 7; 또는 7 내지 7.5의 pH이다. 일부 실시양태에서, 재조합 미생물 숙주 세포가 그의 에스테라제 활성 생산을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 배양 배지 내의 적절한 보충물 함량은 소포제이다. 적절한 소포제의 비제한적인 예는 스트룩톨(Struktol) J 673 A (쉴&사일라커 게엠베하(Schill&Seilacher GmbH), 독일 함부르크), 인더스트롤(Industrol) DF204 (BASF 캐나다 인크(BASF Canada, Inc.), 캐나다 미시소거), 폴리글리콜(Polyglycol) P-2000 (다우(Dow), 미시건주 미들랜드), 호닥(Hodag) K-60K (호닥 케미컬 코포레이션(Hodag Chemical Corp.), 일리노이주 시카고), 및 에롤(Erol) DF6000K (PMC 우브리(PMC Ouvrie), 프랑스 꺄흐방), ACP 1500 (다우 케미컬 컴퍼니(Dow Chemical Company), 미시건주 미들랜드), 안티폼(Antifoam) 204 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스), SAG 471 (모멘티브 퍼포먼스 매터리얼스 인크(Momentive Performance Materials Inc.), 뉴욕주 워터포드), SAG 5693 (모멘티브 퍼포먼스 매터리얼스 인크, 뉴욕주 워터포드), SAG 710 (모멘티브 퍼포먼스 매터리얼스 인크, 뉴욕주 워터포드), SAG 730 (모멘티브 퍼포먼스 매터리얼스 인크, 뉴욕주 워터포드), 실리콘 안티폼, 스트룩톨 J647 (쉴&사일라커, 독일 함부르크), 및 해바라기 오일을 포함한다.
일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법에서의 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계는 재조합 성분을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포의 배양물로부터 수득된 발효 브로스 또는 제제에서 에스테라제 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 단계를 포함한다.
따라서, 일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 a) 재조합 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분 중 임의의 것)을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 수득하는 단계; b) 재조합 미생물 숙주 세포를 재조합 성분의 생산 및/또는 분비에 적절한 조건 하에 배양 배지에서 배양하여, 재조합 성분을 포함하는 발효 브로스를 수득하는 단계; c) 임의적으로, 발효 브로스로부터 재조합 성분을 정제하여, 재조합 성분을 포함하는 제제를 수득하는 단계; d) 발효 브로스 또는 제제에서 에스테라제 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하여, 재조합 성분 및 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 발효 브로스 또는 제제를 수득하는 단계; 및 e) 재조합 성분 및 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 발효 브로스 또는 제제로부터 식품을 제조하는 단계를 포함한다.
발효 브로스 또는 제제 내의 에스테라제 활성은, 예를 들어, 발효 브로스 또는 제제에 에스테라제 억제제를 첨가하는 것에 의해 본질적으로 제거되거나 또는 조정될 수 있다. 적절한 에스테라제 억제제의 비제한적인 예는 합성 억제제 (예를 들어, 포스포네이트, 보론산, 지질 유사체), 및 예를 들어, 주니페루스 콤무니스(Juniperus communis), 일리시움 렐리지오숨(Illicium religiosum), 파낙스 자포니쿠스(Panax japonicus) 근경, 파낙스 진셍(Panax ginseng), 파낙스 퀸퀘폴리우스(Panax quinquefolius), 아칸토파낙스 센티코수스(Acanthopanax senticosus), 카멜리아 시넨시스 변종 시넨시스(Camellia sinensis var. sinensis), 카멜리아 시넨시스 변종 아사미카(Camellia sinensis var. assamica), 코키아 스코파리아(Kochia scoparia), 플라티코디 라딕스(Platycodi radix), 살라시아 레티쿨레이트(Salacia reticulate), 넬룸보 누시페라(Nelumbo nucifera), 살릭스 마츠다나(Salix matsudana), 에리오클로아 빌로사(Eriochloa villosa), 살라시아 레티쿨레이트(Salacia reticulate), 스카비오사 츠칠리엔시스 그룬(Scabiosa tschiliensis Grun), 및 아칸토파낙스 세실리풀로루스(Acanthopanax sessiliflorous)와 같은 공급원으로부터 단리된 천연 억제제 (예를 들어, β-락톤 (예컨대 발리락톤, 에베락톤 A & B, 및 비브라락톤), 만노-올리고사카라이드, 아세틸콜린 에스테라제 억제제, 콜린에스테라제 억제제, 폴리페놀, 사포닌, 판클리신, 헤스페리딘, 콜러페닌, 프로안토시아니딘, 오를리스탯(Orlistat)　(제니칼(Xenical)), 카르노스산, 에스신, 크로신, 크로세틴, 클로로겐산, 네오클로로겐산, 페룰로이퀸산, e-폴리라이신, 키토산, 키틴)를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 에스테라제 억제제는 활성을 위해 pH 및/또는 이온 강도 조정제의 첨가를 필요로 한다.
발효 브로스 또는 제제 내의 에스테라제 활성은, 예를 들어, 에스테라제의 활성에 요구되는 보조인자 및/또는 에스테라제 억제제의 활성에 요구되는 보조인자를 발효 브로스 또는 제제로부터 제거하고/거나 이에 첨가하는 것에 의해 또한 본질적으로 제거되거나 또는 조정될 수 있다. 이러한 보조인자의 비제한적인 예는 금속 (예를 들어, 2가 양이온, 예컨대 칼슘)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2가 양이온을 킬레이팅제에 결합시키는 것에 의해 2가 양이온 (예를 들어, 칼슘)이 제거된다. 적절한 킬레이팅제의 비제한적인 예는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)이다.
발효 브로스 또는 제제 내의 에스테라제 활성은, 예를 들어, 열 또는 비-열 프로세싱에 의해 또한 본질적으로 제거되거나 또는 조정될 수 있다. 열 프로세싱의 비제한적인 예는 저온살균 및 살균을 포함한다. 비-열 프로세싱의 비제한적인 예는 고압 저온살균 (즉, 고압 프로세싱, HPP), 초음파처리, 펄스 전기장 프로세싱, 및 조사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발효 브로스 또는 제제 내의 에스테라제 활성은 발효 브로스 또는 제제를 고온에서 비교적 짧은 기간 동안 (예를 들어, 85℃ 내지 90℃의 온도에서 5 내지 10분 동안) 인큐베이션하는 것에 의해 본질적으로 제거되거나 또는 감소된다.
일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법에서의 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계는 재조합 성분을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 수득하고, 여기서 재조합 미생물 숙주 세포가 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 단계를 포함한다.
따라서, 일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 a) 재조합 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분 중 임의의 것)을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 수득하고, 여기서 재조합 미생물 숙주 세포가 상응하는 재조합 미생물 숙주 세포 내에 포함된 에스테라제 활성에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 단계; b) 재조합 미생물 숙주 세포를 재조합 성분의 생산 및/또는 분비에 적절한 조건 하에 배양 배지에서 배양하여, 재조합 성분 및 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 발효 브로스를 수득하는 단계; c) 임의적으로, 발효 브로스로부터 재조합 성분을 정제하여, 재조합 성분을 포함하는 제제를 수득하는 단계; 및 d) 재조합 성분 및 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 발효 브로스 또는 제제로부터 식품을 제조하는 단계를 포함한다.
에스테라제 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합)의 발현 (즉, 활성 단백질의 생산)을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 것에 의해 또는 에스테라제의 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 것에 의해 에스테라제 활성이 재조합 미생물 숙주 세포에서 본질적으로 제거되거나 또는 조정될 수 있다. 재조합 미생물 숙주 세포에서 에스테라제의 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 것은, 예를 들어, 에스테라제의 발현이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되도록, 에스테라제의 발현을 구동시키는 제어 서열 (예를 들어, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 신호 펩티드, 전사 종결인자, 또는 유전자의 발현 (즉, 전사 및/또는 번역)을 제어하는 임의의 다른 서열) 또는 그의 기능적 부분 (즉, 제어 서열의 기능에 충분한 부분)을 재조합 미생물 숙주 세포에서 유전자 변형시키는 것에 의해 달성될 수 있다.
재조합 미생물 숙주 세포에서 에스테라제의 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 것은, 예를 들어, 에스테라제의 발현이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되도록, 에스테라제의 발현에 요구되는 단백질 (예를 들어, 전사 인자 (예를 들어, 유니프롯(UniProt) 서열 G0RX49, G0RHG1, A0A2T4B416, A0A2T4BJU6, A2R2J1, A2R903, G2Q2Z5, 및 G2Q8I6으로부터 선택된 서열에 적어도 50% (예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질), 활성 형태의 에스테라제의 생산에 요구되는 번역후 변형 효소)의 발현을 구동시키는 제어 서열 또는 그의 기능적 부분을 재조합 미생물 숙주 세포에서 유전자 변형시키는 것에 의해, 또는 에스테라제의 발현에 요구되는 단백질 또는 그의 기능적 부분 (예를 들어, 전사 인자의 DNA 결합 도메인, 번역후 변형 효소의 촉매 도메인)을 코딩하는 코딩 서열을 유전자 변형시키는 것에 의해 또한 달성될 수 있다.
재조합 미생물 숙주 세포에서 에스테라제의 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 것은, 예를 들어, 에스테라제를 코딩하는 코딩 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 에스테라제에 대해 특이적인 RNAi 구축물을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 재조합 미생물 숙주 세포 내로 도입하는 것에 의해 또한 달성될 수 있다.
재조합 미생물 숙주 세포에서 에스테라제의 발현 또는 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 것은, 예를 들어, 에스테라제 또는 그의 기능적 부분 (예를 들어, 촉매 도메인)을 코딩하는 코딩 서열을 재조합 미생물 숙주 세포에서 유전자 변형시키는 것에 의해 또한 달성될 수 있다.
재조합 미생물 숙주 세포에서 에스테라제의 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 것은, 예를 들어, 내인성 억제제의 발현 및/또는 활성이 재조합 미생물 숙주 세포에서 본질적으로 제거되거나 또는 조정되도록 에스테라제의 내인성 억제제의 발현을 구동시키는 제어 서열을 재조합 미생물 숙주 세포에서 유전자 변형시키고/거나 에스테라제의 내인성 억제제를 코딩하는 코딩 서열을 유전자 변형시키는 것에 의해, 또는 에스테라제의 이종성 억제제를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 재조합 미생물 숙주 세포에 도입하는 것에 의해 또한 달성될 수 있다.
유전자 변형시키는 것은, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입하거나, 치환하거나 또는 제거하는 것에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, 정지 코돈을 도입하거나, 시작 코돈을 제거하거나, 오픈 리딩 프레임의 프레임 이동을 삽입하거나, 또는 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 치환 돌연변이, 결실 돌연변이, 프레임 이동 돌연변이, 삽입 돌연변이, 중복 돌연변이, 증폭 돌연변이, 전위 돌연변이, 또는 역전 돌연변이를 생성시키기 위해 하나 이상의 뉴클레오티드가 삽입 또는 제거될 수 있다.
미생물 숙주 세포를 유전자 변형시키는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 비제한적으로, 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝, 부위-지정 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 삽입 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발 (예를 들어, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), N-메틸-N'-니트로소구아니딘 (NTG), O-메틸 히드록실아민, 아질산, 에틸 메탄 술포네이트 (EMS), 중아황산나트륨, 포름산, 뉴클레오티드 유사체를 사용함), 조사 (예를 들어, 자외선 (UV) 조사), 코딩 또는 비-코딩 뉴클레오티드 서열의 결실, 상동 재조합, FLP/FRT 재조합, 유전자 파괴, CRISPR 유전자 편집, 및 유전자 전환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법에서의 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계는 재조합 성분을 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 에스테라제 활성으로부터 정제하는 단계를 포함한다.
따라서, 일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 a) 재조합 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분 중 임의의 것)을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 수득하는 단계; b) 재조합 미생물 숙주 세포를 재조합 성분의 생산 및/또는 분비에 적절한 조건 하에 배양 배지에서 배양하여, 재조합 성분을 포함하는 발효 브로스를 수득하는 단계; c) 제제가 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하도록, 발효 브로스로부터 재조합 성분을 정제하여 재조합 성분을 포함하는 제제를 수득하는 단계; 및 d) 재조합 성분 및 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 발효 브로스 또는 제제로부터 식품을 제조하는 단계를 포함한다.
발효 브로스로부터 재조합 성분을 정제하는 것은 재조합 성분을 에스테라제로부터 구별하거나 또는 재조합 성분과 에스테라제 사이에 공유되는 임의의 한가지 성질 또는 성질 조합을 기초로 달성될 수 있다. 이러한 성질의 비제한적인 예는 크기, 분자량, 특정 프로테아제 또는 프로테아제 조합에 의한 분해, 등전점 (pI), 전하, 열불안정성/열안정성, 특정 분자에 대한 친화력, 용해도, pH 안정성, 소수성, 및 친수성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 성분은 열불안정성/열안정성을 기초로 정제된다. 일부 이러한 실시양태에서, 재조합 성분을 포함하는 발효 브로스 (예를 들어, 정화된 발효 브로스 (즉, 세포 및 세포 잔해물이 제거된 발효 브로스)) 또는 제제가 에스테라제는 변성되고 용액으로부터 침전되지만 재조합 성분은 구조적으로 무손상이고 가용성으로 유지되는 온도로 가열된다. 후속적으로, 침전된 에스테라제를 1-g 침강, 원심분리를 통한 가속 침강, 및/또는 필터 패드, 시트 또는 막을 사용하는, 심층 여과 또는 접선 유동 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 여과 기술을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 가용성 재조합 성분으로부터 분리할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 성분은 소수성을 기초로 정제된다. 일부 이러한 실시양태에서, 적절한 크로마토그래프 지지체가 재조합 성분을 포함하는 발효 브로스 (예를 들어, 정화된 발효 브로스) 또는 제제에 첨가되고, 에스테라제 또는 재조합 성분 (둘 다는 아님)이 (예를 들어, 소수성 상호작용을 기초로) 크로마토그래프 지지체에 결합하도록 발효 브로스 또는 제제의 pH 및/또는 이온 강도가 조정되어, 가용성 재조합 성분 또는 에스테라제를 각각 미결합 부분에 남긴다. 적절한 크로마토그래프 지지체의 비제한적인 예는 페닐 세파로스, 부틸 세파로스, 및 옥틸 세파로스를 포함한다. 후속적으로, 에스테라제 또는 재조합 성분이 결합되어 있는 크로마토그래프 지지체가 1-g 침강, 원심분리, 또는 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 적절한 방법에 의해 가용성 재조합 성분 또는 에스테라제로부터 각각 분리될 수 있다. 대안적으로, 크로마토그래프 지지체는 재조합 성분을 포함하는 발효 브로스 또는 제제가 이를 통과하여 이동하도록 만들어지는 고정 지지체 (예를 들어, 칼럼 내의 흡착제)일 수 있고, 재조합 성분은 미결합 부분에서 수득되는 반면 에스테라제는 크로마토그래프 지지체에 결합하거나, 또는 재조합 성분은 크로마토그래프 지지체에 결합하는 반면 에스테라제는 미결합 부분에 남고, 후속적으로, 결합된 재조합 성분이 예를 들어 pH 및/또는 이온 강도를 조정하는 것에 의해 크로마토그래프 지지체로부터 방출된다.
일부 실시양태에서, 재조합 성분은 전하를 기초로 정제된다. 일부 이러한 실시양태에서, 반대 이온 또는 이온-교환 수지 또는 나트륨 산 염이 재조합 성분을 포함하는 발효 브로스 (예를 들어, 정화된 발효 브로스) 또는 제제에 첨가되고, 반대 이온 또는 이온-교환 수지 또는 나트륨 산 염이 재조합 성분 또는 에스테라제와 복합체를 형성하도록 발효 브로스 또는 제제의 pH 및/또는 이온 강도가 조정되어, 가용성 에스테라제 또는 재조합 성분을 각각 남긴다. 후속적으로, 복합체를 1-g 침강, 원심분리를 통한 가속 침강, 및/또는 필터 패드, 시트 또는 막을 사용하는, 심층 여과 또는 접선 유동 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 여과 기술을 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 단리될 수 있다. 재조합 성분이 반대 이온 또는 이온-교환 수지 또는 나트륨 산 염과 복합체를 형성하는 실시양태에서, 재조합 성분과 반대 이온 또는 이온-교환 수지 또는 나트륨 산 염이 서로 반발하도록 pH 및/또는 이온 강도를 조정하는 것에 의해 재조합 성분이 복합체로부터 추출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 성분은 pH 안정성을 기초로 정제된다. 일부 이러한 실시양태에서, 재조합 성분을 포함하는 발효 브로스 (예를 들어, 정화된 발효 브로스) 또는 제제의 pH가 에스테라제가 변성되고 용액으로부터 침전되도록 조정되어, 가용성 재조합 성분을 남긴다. 후속적으로, 침전된 에스테라제를 1-g 침강, 원심분리를 통한 가속 침강, 및/또는 필터 패드, 시트 또는 막을 사용하는, 심층 여과 또는 접선 유동 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 여과 기술을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 가용성 재조합 성분으로부터 분리할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 성분은 전하, 열불안정성/열안정성, 소수성, 크기, 분자량, pH 안정성, 등전점 (pI), 특정 분자에 대한 친화력, 및 용해도 중 2가지 이상을 기초로 정제되고, 여기서 분리를 위한 다양한 전략은 연속적으로 수행되거나 (예를 들어, 전하를 기초로 하는 분리 후의 소수성을 기초로 하는 분리, 소수성을 기초로 하는 분리 후의 pH 안정성을 기초로 하는 분리), 또는 병행으로 수행된다 (예를 들어, pH 안정성 및 열불안정성/열안정성을 기초로 하는 분리, pH 안정성 및 특정 분자에 대한 친화력을 기초로 하는 분리, 용해도 및 pH 안정성 및/또는 열불안정성/열안정성 및/또는 pI를 기초로 하는 분리).
에스테라제 활성
본원에서 제공된 바와 같은 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성 (예를 들어, 재조합 성분을 포함하는 발효 브로스 또는 제제 내에 포함되거나, 또는 재조합 성분을 생산할 수 있는 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포 내에 포함된 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성)은 임의의 1개의 에스테라제 또는 적어도 2개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개 이상)의 에스테라제의 임의의 조합의 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 활성일 수 있다.
이같은 에스테라제의 비제한적인 예는 카르복실산 에스테르 히드롤라제 (EC 번호 3.1.1), 인산 디에스테르 히드롤라제 (EC 번호 3.1.4), 엑소리보뉴클레아제 (EC 번호 3.1.13), 카르복실에스테라제 (EC 번호 3.1.1.1), 아릴에스테라제 (EC 번호 3.1.1.2), 트리아실글리세롤 리파제 (EC 번호 3.1.1.3), 포스포리파제 A2 (EC 번호 3.1.1.4), 라이소포스포리파제 (EC 번호 3.1.1.5), 아세틸에스테라제 (EC 번호 3.1.1.6), 아세틸콜린에스테라제 (EC 번호 3.1.1.7), 포스포리파제 C (EC 번호 3.1.4.3), 포스포리파제 D (EC 번호 3.1.4.4), 포스포이노시티드 포스포리파제 C (3.1.4.11), 펙틴에스테라제 (EC 번호 3.1.1.11), 글루코노락토나제 (EC 번호 3.1.1.17), 아실글리세롤 리파제 (EC 번호 3.1.1.23), 3-옥소아디페이트 에놀-락토나제 (EC 번호 3.1.1.24), 1,4-락토나제 (EC 번호 3.1.1.25), 갈락토리파제 (EC 번호 3.1.1.26), 포스포리파제 A1 (EC 번호 3.1.1.32), 지질단백질 리파제 (EC 번호 3.1.1.34), 세팔로스포린-C 데아세틸라제 (EC 번호 3.1.1.41), 카르복시메틸렌부테놀리다제 (EC 번호 3.1.1.45), 2-피론-4,6-디카르복실레이트 락토나제 (EC 번호 3.1.1.57), 페룰로일 에스테라제 (EC 번호 3.1.1.73), 큐티나제 (EC 번호 3.1.1.74), 및 호르몬-민감성 리파제 (EC 번호 3.1.1.79)를 포함한다.
적절한 카르복실산 에스테르 히드롤라제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 카르복실산 에스테르 히드롤라제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 도일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
표 1 - 예시적인 에스테라제 (유니프롯 서열 ID)
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일부 실시양태에서, 카르복실산 에스테르 히드롤라제는 유니프롯 서열 G0RIU1, A2R1N7, G0RBM4, A0A2T4BBP9, G2Q379, A0A2T4AZ21, A2R8Z3, G0R9X3, A2QPC2, G0RCG3, A0A2T4BCL7, A0A2T4B416, 및 A0A2T4BNI9로부터 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
적절한 인산 디에스테르 히드롤라제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 인산 디에스테르 히드롤라제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 엑소리보뉴클레아제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 엑소리보뉴클레아제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 카르복실에스테라제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 카르복실에스테라제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 아릴에스테라제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 아릴에스테라제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 트리아실글리세롤 리파제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 트리아실글리세롤 리파제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트리아실글리세롤 리파제는 유니프롯 서열 A2QM14 및 A2R709로부터 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
적절한 포스포리파제 A2의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 포스포리파제 A2를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 라이소포스포리파제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 라이소포스포리파제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이소포스포리파제는 유니프롯 서열 G0RX90, G2Q0K1, A0A2T4B235, A2QC75, 및 A2QF42로부터 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
적절한 아세틸에스테라제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 아세틸에스테라제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아세틸에스테라제는 유니프롯 서열 G0RHJ4, A0A2T4BJD9, 및 G2QL32로부터 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
적절한 아세틸콜린에스테라제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 아세틸콜린에스테라제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 포스포리파제 C의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 포스포리파제 C를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포스포리파제 C는 유니프롯 서열 G0REM9, A0A2T4BFY3, 및 A2QAD7로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
적절한 포스포리파제 D의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 포스포리파제 D를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 포스포이노시티드 포스포리파제 C의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 포스포이노시티드 포스포리파제 C를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 펙틴에스테라제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 펙틴에스테라제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 글루코노락토나제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 글루코노락토나제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 아실글리세롤 리파제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 아실글리세롤 리파제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 3-옥소아디페이트 에놀-락토나제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 3-옥소아디페이트 에놀-락토나제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 1,4-락토나제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 1,4-락토나제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 갈락토리파제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 갈락토리파제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 포스포리파제 A1의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 포스포리파제 A1을 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 지질단백질 리파제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 지질단백질 리파제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 세팔로스포린-C 데아세틸라제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 세팔로스포린-C 데아세틸라제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 카르복시메틸렌부테놀리다제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 카르복시메틸렌부테놀리다제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 2-피론-4,6-디카르복실레이트 락토나제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 2-피론-4,6-디카르복실레이트 락토나제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 페룰로일 에스테라제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 페룰로일 에스테라제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
적절한 큐티나제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 큐티나제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 큐티나제는 유니프롯 서열 G0RH85, A2QBP1, A0A2T4BJB5, A5ABE6, A2R2W3, 및 G2QH51로부터 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
적절한 호르몬-민감성 리파제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 호르몬-민감성 리파제를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
추가적인 적절한 에스테라제의 비제한적인 예는 표 1에 열거된 서열에 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제, 및 표 2에 열거된 인터프로(InterPro) 도메인 중 어느 하나에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 에스테라제를 포함한다.
표 2: 예시적인 에스테라제 촉매 도메인의 인터프로 번호
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본원에 개시된 에스테라제는 본원에 개시된 에스테라제의 보존적으로 변형된 변이체인 에스테라제를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환되는 것을 초래하는 코딩된 아미노산 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가를 지칭한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 본원에 개시된 에스테라제는 본원에 개시된 에스테라제의 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자를 추가로 포함한다.
본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성 (예를 들어, 재조합 성분을 포함하는 본원에서 제공된 발효 브로스 또는 제제 내에, 또는 재조합 성분을 생산할 수 있는 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포 내에 포함된 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성)이 적어도 2개의 에스테라제의 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 활성을 포함하는 실시양태에서, 이러한 적어도 2개의 에스테라제는 1개 이상 (예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상 등)의 임의의 에스테라제 (예를 들어, 본원에서 제공된 에스테라제)를 포함할 수 있다.
이같은 에스테라제의 비제한적인 예는 카르복실산 에스테르 히드롤라제 (EC 번호 3.1.1), 인산 디에스테르 히드롤라제 (EC 번호 3.1.4), 엑소리보뉴클레아제 (EC 번호 3.1.13), 카르복실에스테라제 (EC 번호 3.1.1.1), 아릴에스테라제 (EC 번호 3.1.1.2), 트리아실글리세롤 리파제 (EC 번호 3.1.1.3), 포스포리파제 A2 (EC 번호 3.1.1.4), 라이소포스포리파제 (EC 번호 3.1.1.5), 아세틸에스테라제 (EC 번호 3.1.1.6), 아세틸콜린에스테라제 (EC 번호 3.1.1.7), 포스포리파제 C (EC 번호 3.1.4.3), 포스포리파제 D (EC 번호 3.1.4.4), 포스포이노시티드 포스포리파제 C (3.1.4.11), 펙틴에스테라제 (EC 번호 3.1.1.11), 글루코노락토나제 (EC 번호 3.1.1.17), 아실글리세롤 리파제 (EC 번호 3.1.1.23), 3-옥소아디페이트 에놀-락토나제 (EC 번호 3.1.1.24), 1,4-락토나제 (EC 번호 3.1.1.25), 갈락토리파제 (EC 번호 3.1.1.26), 포스포리파제 A1 (EC 번호 3.1.1.32), 지질단백질 리파제 (EC 번호 3.1.1.34), 세팔로스포린-C 데아세틸라제 (EC 번호 3.1.1.41), 카르복시메틸렌부테놀리다제 (EC 번호 3.1.1.45), 2-피론-4,6-디카르복실레이트 락토나제 (EC 번호 3.1.1.57), 페룰로일 에스테라제 (EC 번호 3.1.1.73), 큐티나제 (EC 번호 3.1.1.74), 호르몬-민감성 리파제 (EC 번호 3.1.1.79), 및 그의 조합을 포함한다.
이같은 조합의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 GDSL 리파제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 라이소포스포리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 C; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 C; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 C; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 포스포리파제 C; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 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하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 GDSL 리파제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 GDSL 리파제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 GDSL 리파제, 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 GDSL 리파제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 포스포리파제 C 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 GDSL 리파제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 GDSL 리파제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 GDSL 리파제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 GDSL 리파제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자 및 하나 이상의 다른 카르복실산 에스테르 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 C; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 라이소포스포리파제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 포스포리파제 C; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 포스포리파제 C; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 A2 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 C 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 포스포리파제 C 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 아세틸자일란에스테라제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 세포외 리파제-유사 단백질 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 GDSL 리파제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 GDSL 리파제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제; 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 GDSL 리파제 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 및 하나 이상의 큐티나제 및 하나 이상의 알파/베타 히드롤라제 폴드 도메인-함유 단백질 및 에스테라제의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자.
식품을 생산하기 위한 본원에서 제공된 방법의 적어도 1개의 단계에서, 또는 재조합 성분을 포함하는 본원에서 제공된 발효 브로스 또는 제제에서, 또는 재조합 성분을 생산할 수 있는 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포에서 활성이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되어야 하는 에스테라제의 적절한 수 및/또는 조합을 관련 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 에스테라제를 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 친화력 크로마토그래피, 자이모그램 검정법, 겔 전기영동을 사용하여) 단리하고, 어떤 것이 또는 적어도 2개의 에스테라제의 어떤 조합이 특정한 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 또는 지질단백질의 실질적인 양의 분해를 제공하는지를 결정하도록 시험관 내에서 테스트할 수 있다. 또한, 임의의 1개의 에스테라제 또는 적어도 2개의 에스테라제의 임의의 조합에서 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 활성을 포함하는, 재조합 성분 (예를 들어, 임의의 본원에 개시된 재조합 성분)을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 수득할 수 있고, 각각의 이러한 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 성분을 포함하는 식품의 지질 분해의 감소 또는 제거의 정도를 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 성분을 포함하는 본원에서 제공된 발효 브로스 또는 제제, 또는 재조합 성분을 생산할 수 있는 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 특정 식품의 생산에 유용한 에스테라제 활성의 특정한 프로파일을 제공하는 에스테라제 활성의 조합 및/또는 수준 (즉, 에스테라제 활성 프로파일)을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 식품의 원하는 풍미, 향, 질감, 에멀션화, 영양 함량 및/또는 저장 수명을 제공하도록 에스테라제 활성 프로파일이 최적화된다.
효소 검정법을 사용하여 에스테라제 활성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 비색 반응 생성물 또는 예를 들어 PAGE 겔, 분광광도계, 영상화, UV/Vis, 빛, 및 HPLC를 사용하여 검출될 수 있는 생성물 (예를 들어, 트리글리세리드의 에스테라제-촉매 가수분해로부터 생산된 유리 지방산 및/또는 글리세롤)의 생산에 의해 효소 활성을 결정할 수 있다.
재조합 성분을 생산하고 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 재조합 미생물 숙주 세포
또 다른 측면에서, 재조합 성분을 생산할 수 있고, 상응하는 재조합 미생물 숙주 세포 내에 포함된 에스테라제 활성에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)을 포함하는 재조합 미생물 숙주 세포가 본원에서 제공된다.
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포 내에 포함된 에스테라제 활성은 임의의 수단에 의해 본질적으로 제거되거나 또는 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 에스테라제의 발현 (즉, 활성 단백질의 생산)을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 것에 의해, 또는 에스테라제의 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 것에 의해 에스테라제 활성이 본질적으로 제거되거나 또는 조정된다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 a) 에스테라제의 발현을 구동시키는 제어 서열 또는 그의 기능적 부분 (즉, 제어 서열의 기능에 충분한 부분) (예를 들어, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 신호 펩티드, 전사 종결인자, 또는 유전자의 발현 (즉, 전사 및/또는 번역)을 제어하는 임의의 다른 서열)에서의 유전자 변형으로, 여기서 유전자 변형이 에스테라제의 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 변형시키는 유전자 변형; b) 에스테라제 또는 그의 기능적 부분 (예를 들어, 촉매 도메인)을 코딩하는 코딩 서열에서의 유전자 변형으로, 여기서 유전자 변형이 에스테라제의 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 변형시키는 유전자 변형; c) 에스테라제의 발현에 요구되는 단백질 (예를 들어, 전사 인자, 활성 형태의 에스테라제의 생산에 요구되는 번역후 변형 효소)의 발현을 구동시키는 제어 서열 또는 그의 기능적 부분 (즉, 제어 서열의 기능에 충분한 부분)에서의 유전자 변형으로, 여기서 유전자 변형이 에스테라제의 발현에 요구되는 단백질의 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하고, 이에 의해 에스테라제의 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 유전자 변형; d) 에스테라제의 발현에 요구되는 단백질 또는 그의 기능적 부분 (예를 들어, 전사 인자의 DNA 결합 도메인, 번역후 변형 효소의 촉매 도메인)을 코딩하는 코딩 서열에서의 유전자 변형으로, 여기서 유전자 변형이 에스테라제의 발현에 요구되는 단백질의 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하고, 이에 의해 에스테라제의 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 유전자 변형; e) 에스테라제의 내인성 억제제의 발현을 구동시키는 제어 서열 또는 그의 기능적 부분 (즉, 제어 서열의 기능에 충분한 부분)에서의 유전자 변형으로, 여기서 유전자 변형이 내인성 억제제의 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하고, 이에 의해 에스테라제의 발현을 제거하거나 또는 조정하는 유전자 변형; f) 에스테라제의 내인성 억제제를 코딩하는 코딩 서열에서의 유전자 변형으로, 여기서 유전자 변형이 내인성 억제제의 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하고, 이에 의해 에스테라제의 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 유전자 변형; 및/또는 g) 에스테라제의 이종성 (즉, 비-천연) 억제제를 코딩하는 코딩 서열을 도입하는 유전자 변형으로, 여기서 유전자 변형이 이종성 억제제의 생산을 제공하고, 이에 의해 에스테라제의 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 유전자 변형을 포함한다.
유전자 변형은, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열 내의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 또는 결실로 이루어질 수 있다. 유전자 변형은, 예를 들어, 정지 코돈을 도입하거나, 시작 코돈을 제거하거나, 오픈 리딩 프레임의 프레임 이동을 삽입하거나, 또는 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 치환 돌연변이, 결실 돌연변이, 프레임 이동 돌연변이, 삽입 돌연변이, 중복 돌연변이, 증폭 돌연변이, 전위 돌연변이, 또는 역전 돌연변이를 생성시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 에스테라제 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합)를 코딩하는 코딩 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 에스테라제에 대해 특이적인 RNAi 구축물을 코딩하거나, 또는 에스테라제 활성의 이종성 억제제를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포가 에스테라제의 발현에 요구되는 단백질의 발현 또는 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 유전자 변형을 포함하는 일부 실시양태에서, 에스테라제의 발현에 요구되는 이러한 단백질은 에스테라제의 발현을 조절하는 전사 인자이다. 일부 이러한 실시양태에서, 에스테라제의 발현을 조절하는 전사 인자는 표 1에 열거된 에스테라제의 발현을 조절하는 전사 인자를 코딩하는 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 에스테라제의 발현을 조절하는 전사 인자는 유니프롯 서열 G0RX49, G0RHG1, A0A2T4B416, A0A2T4BJU6, A2R2J1, A2R903, G2Q2Z5, 및 G2Q8I6으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 하나 이상의 에스테라제의 발현을 조절하는 적어도 2개의 전사 인자의 조합의 발현 또는 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 재조합 성분을 생산할 수 있고, 상응하는 재조합 미생물 숙주 세포 내에 포함된 에스테라제 활성에 비교하여 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%만큼 감소된 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 본질적으로 제거된 에스테라제 활성을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 재조합 성분을 생산할 수 있고, 상응하는 재조합 미생물 숙주 세포 내에 포함된 에스테라제 활성에 비교하여 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%만큼 증가된 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)을 포함한다.
미생물 숙주 세포
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 임의의 미생물 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 재조합 박테리아 숙주 세포이다. 재조합 박테리아 숙주 세포는 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 박테리아 균주로부터 유래될 수 있다. 박테리아 균주의 비제한적인 예는 피르미쿠테스(firmicutes), 시아노박테리아(cyanobacteria) (청록 조류), 오실라토리오프시데아에(oscillatoriophcideae), 바실라레스(bacillales), 락토바실라레스(lactobacillales), 오실라토리알레스(oscillatoriales), 바실라세아에(bacillaceae), 락토바실라세아에(lactobacillaceae), 아세토박터 서브옥시단스(Acetobacter suboxydans), 아세토박터 자일리눔(Acetobacter xylinum), 악티노플라네 미수리엔시스(Actinoplane missouriensis), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실루스 서브틸루스(Bacillus subtilus), 바실루스 세루스(Bacillus cerus), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코쿠스 락티스 랜스필드 그룹 N(Lactococcus lactis Lancefield Group N), 락토바실루스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 류코노스톡 시트로보룸(Leuconostoc citrovorum), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 균주 NRRL B-512(F), 마이크로코쿠스 리소데익티쿠스(Micrococcus lysodeikticus), 스피룰리나(Spirulina), 스트렙토코쿠스 크레모리스(Streptococcus cremoris), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 스트렙토코쿠스 락티스 아종 디아세틸락티스(Streptococcus lactis subspecies diacetylactis), 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토마이세스 카타노오겐시스(Streptomyces chattanoogensis), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 나탈렌시스(Streptomyces natalensis), 스트렙토마이세스 올리바세우스(Streptomyces olivaceus), 스트렙토마이세스 올리보크로모게네스(Streptomyces olivochromogenes), 스트렙토마이세스 루비기노수스(Streptomyces rubiginosus), 테트라히메나 써모파일(Tetrahymena thermophile), 테트라히메나 헤게위치(Tetrahymena hegewischi), 테트라히메나 하이퍼안굴라리스(Tetrahymena hyperangularis), 테트라히메나 말라센시스(Tetrahymena malaccensis), 테트라히메나 피그멘토사(Tetrahymena pigmentosa), 테트라히메나 피리포르미스(Tetrahymena pyriformis), 및 테트라히메나 보락스(Tetrahymena vorax), 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 및 그의 파생종 및 교배종을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 재조합 효모 숙주 세포이다. 재조합 효모 숙주 세포는 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 효모 균주로부터 유래될 수 있다. 효모 균주의 비제한적인 예는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 엣첼시이(Candida etchellsii), 칸디다 구일리에르몬디이(Candida guilliermondii), 칸디다 후밀리스(Candida humilis), 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica), 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis), 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 칸디다 베르사틸리스(Candida versatilis), 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii), 에레모테시움 아쉬비이이(Eremothecium ashbyii), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 종, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 피키아(Pichia) 종, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에(Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타(Pichia minuta) (오가타에에 미누타(Ogataea minuta), 피키아 린드네리(Pichia lindneri)), 피키아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피키아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피키아 구에르쿠움(Pichia guercuum), 피키아 피즈페리(Pichia pijperi), 피키아 스팁티스(Pichia stiptis), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 로도토룰라(Rhodotorula) 종, 사카로마이세스(Saccharomyces) 종, 사카로마이세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 베티쿠스(Saccharomyces beticus), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 케발리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 엘립소디데우스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 엑시구우스(Saccharomyces exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스(Saccharomyces florentinus), 사카로마이세스 프라길리스(Saccharomyces fragilis), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe), 사카로마이세스 사케(Saccharomyces sake), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 스포로볼로마이세스 로세우스(Sporobolomyces roseus), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 지고사카로마이세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii), 및 그의 파생종 및 교배종을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 재조합 사상 진균 숙주 세포이다. 재조합 사상 진균 숙주 세포는 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 사상 진균 균주로부터 유래될 수 있고, 그의 임의의 홀로모프(holomorphic), 텔레모프(teleomorphic), 또는 아나모프(anamorphic) 형태를 포함한다. 사상 진균 균주의 비제한적인 예는 아크레모니움(Acremonium), 아스페르길루스(Aspergillus), 오레오바시디움(Aureobasidium), 카나리오마이세스(Canariomyces), 카에토니움(Chaetonium), 카에토미디움(Chaetomidium), 코리니스쿠스(Corynascus), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 크리소스포리움(Chrysosporium), 쿠네메리아(Coonemeria), 닥틸로마이세스(Dactylomyces), 에메리셀라(Emericella), 필리바시디움(Filibasidium), 푸사리움(Fusarium), 깁베렐라(Gibberella), 후미콜라(Humicola), 렌티눌라(Lentinula), 마그나포르테(Magnaporthe), 말브란키움(Malbranchium), 멜라노카르푸스(Melanocarpus), 무코르(Mucor), 미셀리오프토라(Myceliophthora), 미로테시움(Myrothecium), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 페네로카에테(Phenerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 리조푸스(Rhizopus), 스키조필룸(Schizophyllum), 스키탈리디움(Scytalidium), 스포로트리쿰(Sporotrichum), 스테레움(Stereum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 써모마이세스(Thermomyces), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 트리코데르마(Trichoderma) 균주를 포함한다.
아크레모니움 균주의 비제한적인 예는 아크레모니움 알라바멘세(Acremonium alabamense)를 포함한다. 아스페르길루스 균주의 비제한적인 예는 아스페르길루스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 니게르 변종 아와모리(Aspergillus niger var. awamori), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae), 및 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 뿐만 아니라 에메리셀라(Emericella), 네오사르토리아 (Neosartorya),　및 페트로마이세스(Petromyces) 종을 포함한다. 크리소스포리움 균주의 비제한적인 예는 크리소스포리움 보트리오이데스(Chrysosporium botryoides), 크리소스포리움 카르미카엘리(Chrysosporium carmichaeli), 크리소스포리움 크라시투니카툼(Chrysosporium crassitunicatum), 크리소스포리움 유로파에(Chrysosporium europae), 크리소스포리움 에볼세아누이(Chrysosporium evolceannui), 크리소스포리움 파리니콜라(Chrysosporium farinicola), 크리소스포리움 파스티디움(Chrysosporium fastidium), 크리소스포리움 필리포르메(Chrysosporium filiforme), 크리소스포리움 게오르기아에(Chrysosporium georgiae), 크리소스포리움 글로비페룸(Chrysosporium globiferum), 크리소스포리움 글로비페룸 변종 아르티쿨라툼(Chrysosporium globiferum var. articulatum), 크리소스포리움 글로비페룸 변종 니베움(Chrysosporium globiferum var. niveum), 크리소스포리움 히룬도(Chrysosporium hirundo), 크리소스포리움 히스파니쿰(Chrysosporium hispanicum), 크리소스포리움 홀미이(Chrysosporium holmii), 크리소스포리움 인디쿰(Chrysosporium indicum), 크리소스포리움 이옵스(Chrysosporium iops), 크리소스포리움 케라티노필룸(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 크레이셀리이(Chrysosporium kreiselii), 크리소스포리움 쿠주로비아눔(Chrysosporium kuzurovianum), 크리소스포리움 리그노룸(Chrysosporium lignorum), 크리소스포리움 오바툼(Chrysosporium obatum), 크리소스포리움 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 루크노웬세 Garg 27K, 크리소스포리움 메디움(Chrysosporium medium), 크리소스포리움 메디움 변종 스피세센스(Chrysosporium medium var. spissescens), 크리소스포리움 메피티쿰(Chrysosporium mephiticum), 크리소스포리움 메르다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 메르다리움 변종 로제움(Chrysosporium merdarium var. roseum), 크리소스포리움 미노르(Chrysosporium minor), 크리소스포리움 파니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 파르붐(Chrysosporium parvum), 크리소스포리움 파르붐 변종 크레센스(Chrysosporium parvum var. crescens), 크리소스포리움 필로숨(Chrysosporium pilosum), 크리소스포리움 슈도메르다리움(Chrysosporium pseudomerdarium), 크리소스포리움 피리포르미스(Chrysosporium pyriformis), 크리소스포리움 퀸스란디쿰(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 시글레리(Chrysosporium sigleri), 크리소스포리움 술푸레움(Chrysosporium sulfureum), 크리소스포리움 신크로눔(Chrysosporium synchronum), 크리소스포리움 트로피쿰(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 운둘라툼(Chrysosporium undulatum), 크리소스포리움 발레나렌세(Chrysosporium vallenarense), 크리소스포리움 베스페르틸룸(Chrysosporium vespertilium), 및 크리소스포리움 조나툼(Chrysosporium zonatum)을 포함한다.
푸사리움 균주의 비제한적인 예는 푸사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 프로리페라툼(Fusarium proliferatum), 푸사리움 베르티시올리오이데스(Fusarium verticiollioides), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 크루크웰렌세(Fusarium crookwellense), 푸사리움 포아에(Fusarium poae), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambuccinum), 및 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 뿐만 아니라 연관된 그의 기베렐라(Gibberella) 텔레모프 형태를 포함한다. 미셀리오프토라 균주의 비제한적인 예는 미셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila)를 포함한다. 무코르 균주의 비제한적인 예는 무코르 미에헤이 쿠니 엣 에머슨(Mucor miehei Cooney et Emerson) (리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) (쿠니 & 알. 에머슨(Cooney & R. Emerson))) 스키퍼(Schipper), 및 무코르 푸실루스 린드트(Mucor pusillus Lindt)를 포함한다. 뉴로스포라 균주의 비제한적인 예는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)를 포함한다.
페니실리움 균주의 비제한적인 예는 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum) 및 페니실리움 로퀘포르티이(Penicillium roquefortii)를 포함한다. 리조푸스 균주의 비제한적인 예는 리조푸스 니베우스(Rhizopus niveus)를 포함한다. 스포로트리쿰 균주의 비제한적인 예는 스포로트리쿰 셀룰로필룸(Sporotrichum cellulophilum)을 포함한다. 티엘라비아 균주의 비제한적인 예는 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris)를 포함한다. 트리코데르마 균주의 비제한적인 예는 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌기이(Trichoderma koningii), 트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 리이세이(Trichoderma reesei), 트리코데르마 아트로비리다에(Trichoderma atroviride), 트리코데르마 비렌스(Trichoderma virens), 트리코데르마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride), 및 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 뿐만 아니라 그의 대안적인 생식/텔레모프 형태 (즉, 하이포크레아(Hypocrea) 종)를 포함한다.
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 포자형성-수용성 또는 포자형성-결핍성일 수 있다.
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 야생형 미생물 세포로부터 또는 그의 유전자 변이체 (예를 들어, 돌연변이체)로부터 유래될 수 있다.
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 (GRAS) 산업용 균주로부터 유래될 수 있다.
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 높은 외인성 분비 단백질/바이오매스 비를 가질 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 이러한 비는 약 1:1 초과, 약 2:1 초과, 약 3:1 초과, 약 4:1 초과, 약 5:1 초과, 약 6:1 초과, 약 7:1 초과, 또는 약 8:1 초과이다.
일부 실시양태에서, 에스테라제 또는 적어도 2개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개 이상)의 에스테라제의 조합의 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 활성을 포함하는 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 에스테라제 또는 적어도 2개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개 이상)의 에스테라제의 조합의 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 활성을 포함하는 재조합 트리코데르마 리이세이 숙주 세포 (즉, 트리코데르마 리이세이 균주로부터 유래된 재조합 숙주 세포), 에스테라제 또는 적어도 2개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개 이상)의 에스테라제의 조합의 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 활성을 포함하는 재조합 아스페르길루스 니게르 숙주 세포 (즉, 아스페르길루스 니게르 균주로부터 유래된 재조합 숙주 세포), 에스테라제 또는 적어도 2개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개 이상)의 에스테라제의 조합의 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 활성을 포함하는 재조합 트리코데르마 시트리노비리데 숙주 세포 (즉, 트리코데르마 시트리노비리데 균주로부터 유래된 재조합 숙주 세포), 및 에스테라제 또는 적어도 2개 (예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개 이상)의 에스테라제의 조합의 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 활성을 포함하는 재조합 미셀리오프토라 써모필라 숙주 세포 (즉, 미셀리오프토라 써모필라 균주로부터 유래된 재조합 숙주 세포)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
재조합 성분
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 재조합 성분을 생산할 수 있다. 재조합 성분의 비제한적인 예는 단백질, 지질, 탄수화물, 소형 분자, 식품 첨가물, 식품 보충물 (예를 들어, 비타민), 뉴트라슈티컬(neutraceutical), 및 프로바이오틱(probiotic)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 성분은 재조합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 재조합 단백질은 재조합 식물 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "식물 단백질"은 식물에서 천연적으로 발견되는 단백질 (즉, 식물 세포에 천연적인 단백질) 내의 아미노산의 서열에 적어도 80% 동일한 (예를 들어, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 99% 동일한, 100% 동일한) 적어도 20개의 아미노산 (예를 들어, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 또는 적어도 150개이고, 일반적으로 250개 이하인 아미노산)의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 식물 단백질의 비제한적인 예는 소철, 은행나무, 구과식물, 사이프러스, 향나무, 측백나무, 시더우드, 소나무, 안젤리카, 캐러웨이, 고수, 쿠민, 펜넬, 파슬리, 딜, 민들레, 헬리크리섬, 매리골드, 쑥, 홍화, 캐모마일, 양상추, 웜우드, 카렌듈라, 시트로넬라, 세이지, 타임, 치아 씨드, 겨자, 올리브, 커피, 고추, 가지, 파프리카, 크랜베리, 키위, 채소 식물 (예를 들어, 당근, 셀러리), 만수국, 쑥국화, 타라곤, 해바라기, 윈터그린, 바질, 히솝, 라벤더, 레몬 버베나, 마조람, 멜리사, 패출리, 페니로얄, 페퍼민트, 로즈마리, 참깨, 스피아민트, 프림로즈, 사마라, 후추, 피망, 감자, 고구마, 토마토, 블루베리, 까마중, 페튜니아, 모닝 글로리, 라일락, 자스민, 인동, 금어초, 차전자, 구충초, 메밀, 아마란스, 근대, 퀴노아, 시금치, 대황, 호호바, 하위수과, 클로렐라, 마룰라, 헤이즐넛, 카놀라, 케일, 청경채, 순무, 유향나무, 미르, 엘레미, 대마, 호박, 스쿼시, 표주박, 마니옥, 달버지아, 콩과 식물 (예를 들어, 알팔파, 렌틸, 콩류, 클로버, 완두콩, 파바 코세이라, 프리홀 볼라 로카, 프리홀 네그로, 싸리속, 감초, 루핀, 메스키트, 캐롭, 대두, 땅콩, 타마린드, 등나무, 카시아, 병아리콩, 호로파, 푸른 완두콩, 노란 완두콩, 깍지 완두콩, 리마콩, 잠두), 제라늄, 아마, 석류, 목화, 오크라, 님, 무화과, 오디, 클로브, 유칼립투스, 티트리, 니아울리, 과일 식물 (예를 들어, 사과, 살구, 복숭아, 서양자두, 배, 승도복숭아), 딸기, 블랙베리, 라즈베리, 체리, 자두, 장미, 탠저린, 감귤류 (예를 들어, 그레이프프루트, 레몬, 라임, 오렌지, 광귤, 만다린, 탠저린), 망고, 시트러스 베르가못, 부쿠, 포도, 브로콜리, 싹양배추, 카멜리나, 콜리플라워, 평지, 평지씨 (카놀라), 순무, 양배추, 오이, 수박, 허니듀 멜론, 주키니, 자작나무, 호두, 카사바, 바오밥, 올스파이스, 아몬드, 빵나무, 샌달우드, 마카다미아, 타로, 튜베로즈, 알로에 베라, 마늘, 양파, 샬롯, 바닐라, 유카, 베티베르, 갈랑갈, 보리, 콘, 쿠르쿠마 아로마티카(curcuma aromatica), 생강, 레몬 그라스, 귀리, 야자, 파인애플, 쌀, 호밀, 수수, 라이밀, 강황, 얌, 대나무, 보리, 카유풋, 칸나, 카다몬, 옥수수, 귀리, 밀, 계피, 사사프라스, 린데라 벤조인(lindera benzoin), 월계수, 아보카도, 일랑-일랑, 메이스, 넛멕, 모링가, 쇠뜨기, 오레가노, 실란트로, 처빌, 차이브, 집합과, 곡물 식물, 허브 식물, 잎채소, 비-곡물 콩류 식물, 견과류 식물, 다즙 식물, 육생 식물, 수생 식물, 델버지아, 기장, 핵과, 분리과, 현화 식물, 비-현화 식물, 재배 식물, 야생 식물, 나무, 관목, 꽃, 풀, 초본 식물, 잎나무, 덩굴 식물, 선인장, 열대 식물, 아열대 식물, 온대 식물, 및 그의 파생종 및 교배종으로부터 유래된 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 식물 단백질은 완두콩 단백질 (예를 들어, 레구민, 비실린, 코비실린)이다. 다른 실시양태에서, 식물 단백질은 감자 단백질 (예를 들어, 투베린, 프로테아제 억제제 노테이트(notate) II)이다.
일부 실시양태에서, 재조합 단백질은 재조합 동물 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "동물 단백질"은 동물에서 천연적으로 발견되는 단백질 (즉, 동물 세포에 천연적인 단백질) 내의 아미노산의 서열에 적어도 80% 동일한 (예를 들어, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 99% 동일한, 100% 동일한) 적어도 20개의 아미노산 (예를 들어, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 또는 적어도 150개이고, 일반적으로 250개 이하인 아미노산)의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 동물 단백질의 비제한적인 예는 곤충 (예를 들어, 파리), 포유동물 (예를 들어, 소, 양, 염소, 토끼, 돼지, 인간) 또는 새 (예를 들어, 닭)로부터 유래되는 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동물 단백질은 구조 단백질 (예를 들어, 콜라겐, 트로포엘라스틴, 엘라스틴)이다. 다른 실시양태에서, 동물 단백질은 난 단백질 (예를 들어, 오브알부민)이다.
또 다른 실시양태에서, 재조합 단백질은 재조합 우유 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "우유 단백질"은 포유동물-생산 우유에서 천연적으로 발견되는 단백질 (즉, 포유동물-생산 우유에 천연적인 단백질) 내의 아미노산의 서열에 적어도 80% 동일한 (예를 들어, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 99% 동일한, 100% 동일한) 적어도 20개의 아미노산 (예를 들어, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 또는 적어도 150개이고, 일반적으로 250개 이하인 아미노산)의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
재조합 우유 단백질은 재조합 유청 단백질 또는 재조합 카세인일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "유청 단백질" 또는 "카세인"은 각각 천연 유청 단백질 또는 카세인 내의 아미노산의 서열에 적어도 80% 동일한 (예를 들어, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 99% 동일한, 100% 동일한) 적어도 20개의 아미노산 (예를 들어, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 또는 적어도 150개이고, 일반적으로 250개 이하인 아미노산)의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 유청 단백질의 비제한적인 예는 α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토페린, 트랜스페린, 혈청 알부민, 락토페록시다제, 및 글리코마크로펩티드를 포함한다. 카세인의 비제한적인 예는 β-카세인, γ-카세인, κ-카세인, α-S1-카세인, 및 α-S2-카세인을 포함한다. 유청 단백질 및 카세인을 코딩하는 핵산 서열의 비제한적인 예가 2015년 8월 21일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2015/046428, 및 2017년 8월 25일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2017/48730에 개시되어 있고, 이들은 이에 의해 전문이 본원에 포함된다.
재조합 우유 단백질은 소, 인간, 양, 염소, 버팔로, 낙타, 말, 당나귀, 여우 원숭이, 판다, 기니피그, 다람쥐, 곰, 마카크, 고릴라, 침팬지, 산양, 원숭이, 유인원, 고양이, 개, 왈라비, 래트, 마우스, 코끼리, 주머니쥐, 토끼, 고래, 비비, 긴팔원숭이, 오랑우탄, 만드릴, 돼지, 늑대, 여우, 사자, 호랑이, 및 바늘두더지를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 포유동물 종으로부터 유래될 수 있다.
재조합 우유 단백질은 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 에피토프가 결여될 수 있다. 이러한 재조합 우유 단백질은 식품에서 사용하기에 특히 적절하다.
재조합 우유 단백질은 번역후 변형을 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "번역후 변형" 또는 그의 두문자어 "PTM"은 단백질 생합성 후에 단백질에 화학기가 공유결합으로 부착되는 것을 지칭한다. PTM은 단백질의 아미노산 측쇄 상에서 또는 그의 C- 또는 N-말단에서 발생할 수 있다. PTM의 비제한적인 예는 글리코실화 (즉, 글리칸 기 (즉, 단당류, 이당류, 다당류, 선형 글리칸, 분지형 글리칸, galf 잔기를 갖는 글리칸, 술페이트 및/또는 포스페이트 잔기를 갖는 글리칸, D-글루코스, D-갈락토스, D-만노스, L-푸코스, N-아세틸-D-갈락토스 아민, N-아세틸-D-글루코스 아민, N-아세틸-D-뉴라민산, 갈락토푸라노스, 포스포디에스테르, N-아세틸글루코스아민, N-아세틸갈락토스아민, 시알산 및 그의 조합; 예를 들어, 문헌 [Deshpande et al. 2008. Glycobiology 18(8):626]을 참조한다)가 C-연결, N-연결, 또는 O-연결을 통해, 또는 글리피에이션(glypiation) (즉, 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커의 부가) 또는 포스포글리코실화 (즉, 포스포-세린의 포스페이트를 통해 연결됨)을 통해 단백질에 공유결합으로 부착되는 것), 인산화 (즉, 포스페이트 기가 단백질에 공유결합으로 부착되는 것), 알킬화 (즉, 알칸 기 (예를 들어, 메틸화에서의 메탄 기)가 단백질에 공유결합으로 부착되는 것), 및 지질화 (즉, 지질 기 (예를 들어, 프레닐화 및 이소프레닐화에서의 이소프레노이드 기 (예를 들어, 파르네실화에서의 파르네솔 기, 제라닐화에서의 제라니올 기, 제라닐제라닐화에서의 제라닐제라니올 기), 지방산 아실화에서의 지방산 기 (예를 들어, 미리스토일화에서의 미리스트산, 팔미트화에서의 팔미트산), 글리피에이션에서의 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커)가 공유결합으로 부착되는 것), 히드록실화 (즉, 히드록시드 기가 공유결합으로 부착되는 것), SUMO화 (즉, 소형 유비퀴틴-유사 변형제 (또는 SUMO) 단백질이 단백질에 부착되는 것), 니트로실화 (즉, NO 기가 단백질에 부착되는 것), 및 타이로신 니트로화 (즉, 니트레이트 기가 단백질의 타이로신 잔기에 부착되는 것)를 포함한다. 재조합 우유 단백질의 PTM은 천연 PTM, 비-천연 PTM, 또는 적어도 1개의 천연 PTM과 적어도 1개의 비-천연 PTM의 혼합물일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비-천연 PTM"은 천연 단백질 (즉, "천연 PTM"을 갖는 단백질)에 비교하여, 단백질 내의 하나 이상의 PTM (예를 들어, 글리코실화, 인산화)의 하나 이상의 위치(들)의 차이, 및/또는 단백질 내의 하나 이상의 위치(들)에서의 하나 이상의 PTM의 유형의 차이를 지칭한다.
재조합 우유 단백질은 우유 단백질 반복물일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "우유 단백질 반복물"은 포유동물-생산 우유에서 발견되는 단백질 (예를 들어, 유청 단백질, 카세인) 내의 아미노산 서열에 적어도 80% 동일하고 (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일하고, 적어도 99% 동일하고), 재조합 우유 단백질에서 1회 초과 (예를 들어, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 10회, 적어도 15회, 적어도 20회, 적어도 30회, 적어도 40회, 적어도 50회, 적어도 75회, 적어도 100회, 적어도 150회, 또는 적어도 200회)로 존재하는 아미노산 서열을 지칭한다. 우유 단백질 반복물은 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 75개, 적어도 100개, 또는 적어도 150개이고, 일반적으로 200개 이하인 아미노산을 포함할 수 있다. 재조합 우유 단백질 내의 우유 단백질 반복물은 연속적일 수 있거나 (즉, 개재 아미노산 서열이 없음), 또는 비-연속적일 수 있다 (즉, 개재 아미노산 서열이 있음). 비-연속적으로 존재하는 경우, 개재 아미노산 서열은 바람직하지 않은 성질을 도입하지 않으면서 분자량을 제공하는 데 소극적인 역할을 할 수 있거나, 또는 특정 성질 (예를 들어, 용해도, 생물분해성, 다른 분자에 대한 결합)을 제공하는 데 적극적인 역할을 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 단백질은 재조합 조류 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "조류 단백질"은 조류에서 천연적으로 발견되는 단백질 (즉, 조류 세포에 천연적인 단백질) 내의 아미노산의 서열에 적어도 80% 동일한 (예를 들어, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 99% 동일한, 100% 동일한) 적어도 20개의 아미노산 (예를 들어, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 또는 적어도 150개이고, 일반적으로 250개 이하인 아미노산)의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 재조합 단백질은 재조합 진균 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "진균 단백질"은 진균에서 천연적으로 발견되는 단백질 (즉, 진균 세포에 천연적인 단백질) 내의 아미노산의 서열에 적어도 80% 동일한 (예를 들어, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 99% 동일한, 100% 동일한) 적어도 20개의 아미노산 (예를 들어, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 또는 적어도 150개이고, 일반적으로 250개 이하인 아미노산)의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 재조합 단백질은 재조합 미생물 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "미생물 단백질"은 미생물에서 천연적으로 발견되는 단백질 (즉, 미생물 세포에 천연적인 단백질) 내의 아미노산의 서열에 적어도 80% 동일한 (예를 들어, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 99% 동일한, 100% 동일한) 적어도 20개의 아미노산 (예를 들어, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 또는 적어도 150개이고, 일반적으로 250개 이하인 아미노산)의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
일반적인 방법
재조합 성분을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 재조합 미생물 숙주 세포는 재조합 성분을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 재조합 벡터)를 전형적으로 포함한다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 직접적인 화학적 합성 및 클로닝을 비제한적으로 포함하는, 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 적절한 방법에 의해 제조될 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 하나 이상의 발현 카세트를 포함하고, 여기서 각각의 발현 카세트는 프로모터 (예를 들어, 진균 프로모터), 임의적인 신호 서열 (즉, 펩티드에 부착된 신생 단백질을 신생 단백질이 합성되는 세포의 외부로 전달하는 것을 매개하는 펩티드를 코딩하는 서열), 재조합 단백질을 코딩하는 서열, 및 종결 서열 (또는 다중 종결 서열)을 포함하고, 여기서 프로모터는 임의적인 신호 서열에 센스 배향으로 작동가능하게 연결되고 (즉, 프로모터 및 임의적인 신호 서열 및 단백질을 코딩하는 후속 서열은 프로모터가 임의적인 신호 서열 및 단백질을 코딩하는 서열의 전사를 조절하는 데 효과적이도록 위치하고), 임의적인 신호 서열은 재조합 단백질을 코딩하는 서열에 센스 배향으로 작동가능하게 연결되고 (즉, 신호 서열 및 재조합 단백질을 코딩하는 서열은 전사 및 번역으로 기능적인 신호 서열을 포함하는 재조합 단백질이 생산되도록 위치하고), 종결 서열은 재조합 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된다 (즉, 재조합 단백질을 코딩하는 서열 및 종결 서열은 종결인자가 임의적인 신호 서열 및 재조합 단백질을 코딩하는 서열의 전사를 종결시키는 데 효과적이도록 위치한다).
프로모터는 재조합 미생물 숙주 세포에서 기능적인 임의의 적절한 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터 또는 억제성 프로모터 (예를 들어, 글루코스, 갈락토스, 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 소포로스, 겐티오비오스, 소르보스, 셀룰라제 프로모터를 유도하는 이당류, 전분, 트립토판, 또는 포스페이트의 존재 하에 유도되거나 또는 억제되는 프로모터)이다. 재조합 사상 진균 숙주 세포에서 사용하기 위한 적절한 프로모터의 비제한적인 예는 하기 단백질 중 임의의 것을 코딩하는 유전자의 프로모터 및 그의 기능적 부분을 포함한다: 글루코아밀라제 (예를 들어, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 투빈겐시스(Aspergillus tubingensis), 아스페르길루스 포에티두스, 또는 아스페르길루스 카르보나리우스(Aspegillus carbonarius)의 glaA), 아밀라제 (예를 들어, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라제, 아스페르길루스 니게르 중성 알파-아밀라제, 아스페르길루스 니게르 산 안정적 알파-아밀라제, 진균 α-아밀라제 (amy), 박테리아 알파-아밀라제), 프로테아제 (예를 들어, 리조무코르 미에헤이 아스파르트산 프로테아제, 아스페르길루스 오리자에 알칼리성 프로테아제, 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제, 트리코데르마 리이세이 프로테아제), 리파제 (예를 들어, 리조무코르 미에헤이 리파제), 아이소머라제 (예를 들어, 아스페르길루스 오리자에 트리오스 포스페이트 아이소머라제, 진균 트리오스 포스페이트 아이소머라제 (tpi), 효모 트리오스포스페이트 아이소머라제), 아세트아미다제 (예를 들어, 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리자에 또는 기타 진균 아세트아미다제 (amdS)), 데히드로게나제 (예를 들어, 진균 알콜 데히드로게나제 (adhA), 진균 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (gpd), 효모 알콜 데히드로게나제), 자일라나제 (예를 들어, 진균 자일라나제 (xlnA), 트리코데르마 자일라나제 (xyn1, xyn2, bxl1)), 키나제 (예를 들어, 효모 3-포스포글리세레이트 키나제), 히드롤라제 (예를 들어, 진균 셀로비오히드롤라제 I (cbh1), 트리코데르마 히드롤라제 (cbh2, egl1, egl2)), 포스파타제 (예를 들어, 푸사리움 산 포스파타제), 및 기타 진균 단백질 (예를 들어, 진균 엔도 α-L-아라비나제 (abnA), 진균 α-L-아라비노푸라노시다제 A (abfA), 진균 α-L-아라비노푸라노시다제 B (abfB), 진균 피타제, 진균 ATP-신쎄타제, 진균 서브유닛 9 (oliC), 진균 포자형성-특이적 단백질 (Spo2), 진균 SSO, 효모 알콜 옥시다제, 효모 락타제, 뉴로스포라 크라사 CPC1, 아스페르길루스 니둘란스 trpC, 진균 키틴분해 효소 (예를 들어, 엔도- & 엑소-키티나제, 베타-글루카나제), 진균 VAMP-연관 단백질 (VAP), 진균 번역 신장 인자 (TEF1), 진균 DNA 손상-반응성 단백질 (DDRP), 진균 (예를 들어, 푸사리움 또는 뉴로스포라 크라사) 육방 퍼옥시솜 (Hex1), 진균 (예를 들어, 뉴로스포라 크라사) 카탈라제), 및 재조합 사상 진균 숙주 세포에서 높은 수준으로 생산되는 임의의 기타 단백질.
재조합 박테리아 또는 효모 숙주 세포에서 사용하기 위한 적절한 프로모터의 비제한적인 예는 하기 단백질 중 임의의 것을 코딩하는 유전자의 프로모터 및 그의 기능적 부분을 포함한다: LAC4, T7 폴리머라제, TAC, GAL1, λPL, λPR, 베타-락타마제, spa, CYC1, TDH3, GPD, TEF1, ENO2, PGL1, GAP, SUC2, ADH1, ADH2, HXT7, PHO5, CLB1, AOX1, 셀룰라제, 아밀라제, 프로테아제, 자일라나제, 및 재조합 사상 진균 숙주 세포에서 높은 수준으로 생산되는 임의의 기타 단백질.
일부 실시양태에서, 프로모터는 스트레스 (예를 들어, 열 충격) 반응 유전자 (예를 들어, hac1, BIP)의 프로모터이다.
신호 서열은 재조합 미생물 숙주 세포에서 기능적인 임의의 적절한 신호 서열일 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 전형적으로 코딩되는 재조합 단백질은 재조합 우유 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 우유 단백질 중 임의의 것 (예를 들어, 재조합 b-락토글로불린, 재조합 a-락트알부민, 재조합 k-카세인, 재조합 b-카세인), 재조합 난 단백질 (예를 들어, 오보트랜스페린 (콘알부민), 오보뮤신, 오브알부민, 오보트랜스페린, 라이소자임), 비타민 생산에 요구되는 재조합 단백질, 지질 생산에 요구되는 재조합 단백질, 풍미를 생성시키는 소형 분자, 질감 및 에멀션을 생성시키는 중합체, 및 그의 조합을 포함하는 임의의 재조합 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분)일 수 있다.
종결 서열은 재조합 미생물 숙주 세포에서 기능적인 임의의 적절한 종결 서열일 수 있다. 재조합 사상 진균 숙주 세포에서 사용하기 위한 적절한 종결 서열의 비제한적인 예는 아스페르길루스 오리자에 (예를 들어, TAKA 아밀라제 유전자의종결 서열), 아스페르길루스 니게르 (예를 들어, glaA, gpdA, aamA, trpC, pdc1, adh1, amdS, 또는 tef1 유전자의 종결 서열), 푸사리움 옥시스포룸 (예를 들어, 세린 프로테아제 (트립신) 유전자의 종결 서열), 트리코데르마 리이세이 (예를 들어, cbh1, pdc1, TEF1, gpd1, xyn1, 또는 adh1 유전자의 종결 서열), 피키아 파스토리스 (예를 들어, aox1, gap1, adh1, tef1, tps1, 또는 pgk1 유전자의 종결 서열), 사카로마이세스 세레비시아에 (예를 들어, adh1, cyc1, gal1, tef1, pdc1, pgk1, 또는 tps1 유전자의 종결 서열)의 종결 서열, 합성 종결 서열, 및 상기 열거된 서열의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 재조합 효모 숙주 세포에서 사용하기 위한 적절한 종결 서열의 비제한적인 예는 PGK1 및 TPS1 종결 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
재조합 폴리뉴클레오티드는 추가적인 요소를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 요소의 비제한적인 예는 인핸서 서열, 반응 요소, 단백질 인식 부위, 유도성 요소, 단백질 결합 서열, 5' 및 3' 비번역 영역, 폴리아데닐화 서열, 인트론, 복제 기원, 오퍼레이터 (즉, 억제인자 단백질이 결합할 수 있는 단백질-결합 도메인을 포함하고 프로모터의 활성을 감소시키거나 제거하는, 프로모터에 인접한 핵산의 서열), 및 선별 마커 (즉, 사상 진균 세포의 영양요구성을 완성시키거나, 항생제 저항성을 제공하거나, 또는 색 변화를 초래할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자)를 포함한다. 이러한 요소는 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 복제 기원의 비제한적인 예는 AMA1 및 ANSI를 포함한다. 적절한 선별 마커의 비제한적인 예는 amdS (아세트아미다제), argB (오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제), bar (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제), hph (히그로마이신 포스포트랜스퍼라제), niaD (니트레이트 리덕타제), pyrG/pyr4 (오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제), sC (술페이트 아데닐트랜스퍼라제), 및 trpC (안트라닐레이트 신타제), 및 그의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선별 마커는 선별 마커의 생산을 감소시키고, 따라서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 사상 진균 세포가 선별 하에 생존하도록 허용하는 데 필요한 카피의 수를 증가시키는 변경을 포함한다.
재조합 폴리뉴클레오티드가 2개 이상의 발현 카세트를 포함하는 실시양태에서, 작동가능하게 연결된 프로모터, 임의적인 신호 서열, 폴리펩티드 종결 서열을 코딩하는 서열, 및 임의적인 추가적인 요소는 2개 이상의 발현 카세트 사이에서 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드를 미생물 세포 내로 도입하여 재조합 미생물 숙주 세포를 수득하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예는 인산칼슘 형질감염, 덴드리머 형질감염, 리포솜 형질감염 (예를 들어, 양이온성 리포솜 형질감염), 양이온성 중합체 형질감염, 세포 압착, 초음파 천공, 광학적 형질감염, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 수력학적 전달, 유전자 총, 마그네토펙션(magnetofection), 바이러스 형질도입, 전기천공 및 화학적 형질전환 (예를 들어, PEG를 사용함)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 재조합 미생물 숙주 세포에서 발현 벡터 (즉, 숙주 세포에 형질도입되거나, 이를 형질전환시키거나 또는 감염시키고, 숙주 세포가 숙주 세포에 천연인 것 이외의 핵산 및/또는 단백질을 발현하도록 또는 숙주 세포에 천연이지 않은 방식으로 핵산 및/또는 단백질을 발현하도록 야기하는 핵산) 상에서 염색체외에서 유지된다. 다른 실시양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 재조합 미생물 숙주 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체) 내로 안정적으로 통합된다. 게놈 내의 통합을 위해, 재조합 폴리뉴클레오티드는 상동 또는 비-상동 재조합에 의해 게놈 내로 통합되기 위한 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 서열은 정확한 위치에서의 숙주 게놈 내로의 통합을 가능하게 한다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 상동 재조합의 가능성을 강화하도록 재조합 미생물 숙주 세포의 게놈 내의 표적 서열과 고도로 상동성인 적어도 100개, 적어도 250개, 적어도 500개, 적어도 750개, 적어도 1,000개, 또는 적어도 10,000개의 염기쌍을 포함할 수 있다. 이러한 고도로 상동성인 서열은 비-코딩 또는 코딩일 수 있다. 재조합 단백질의 생산을 증가시키기 위해 재조합 폴리뉴클레오티드의 1개를 초과하는 카피가 재조합 미생물 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다.
재조합 미생물 숙주 세포는 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 적절한 발효 용기 (예를 들어, 배양 플레이트, 진탕 플라스크, 발효기 (예를 들어, 교반 탱크 발효기, 공수 발효기, 기포 칼럼 발효기, 고정층 생물반응기, 실험실 발효기, 산업용 발효기, 또는 그의 임의의 조합))에서 임의의 규모 (예를 들어, 소규모, 대규모) 및 관련 기술 분야에 공지되어 있는 공정 (예를 들어, 연속, 뱃치(batch), 페드-뱃치(fed-batch), 또는 고체 상태)으로 배양될 수 있다.
적절한 배양 배지는 재조합 미생물 숙주 세포가 성장하고/거나 생육성으로 유지될 수 있는 임의의 배양 배지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 탄소, 질소 (예를 들어, 무수 암모니아, 황산암모늄, 질산암모늄, 인산이암모늄, 인산일암모늄, 폴리인산암모늄, 질산나트륨, 요소, 펩톤, 단백질 가수분해물, 효모 추출물), 및 포스페이트 공급원을 포함하는 수성 배지이다. 배양 배지는 무기 염, 미네랄, 금속, 전이 금속, 비타민, 유화 오일, 계면활성제, 및 임의의 기타 영양소를 추가로 포함할 수 있다. 적절한 탄소 공급원의 비제한적인 예는 단당류, 이당류, 다당류, 아세테이트, 에탄올, 메탄올, 글리세롤, 메탄, 및 그의 조합을 포함한다. 단당류의 비제한적인 예는 덱스트로스 (글루코스), 프룩토스, 갈락토스, 자일로스, 아라비노스, 및 그의 조합을 포함한다. 이당류의 비제한적인 예는 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 및 그의 조합을 포함한다. 다당류의 비제한적인 예는 전분, 글리코겐, 셀룰로스, 아밀로스, 헤미셀룰로스, 말토덱스트린, 및 그의 조합을 포함한다. 적절한 배양 배지가 상업적 공급업체에서 입수가능하거나, 또는 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection)의 카탈로그의) 공개된 조성물에 따라 제조될 수 있다.
재조합 성분의 생산을 위한 적절한 조건은 재조합 미생물 숙주 세포가 성장하고/거나 생육성으로 유지될 수 있는 것이다. 이러한 조건의 비제한적인 예는 적절한 pH, 적절한 온도, 적절한 공급 속도, 적절한 압력, 적절한 영양 함량 (예를 들어, 적절한 탄소 함량, 적절한 질소 함량, 적절한 인 함량), 적절한 보충물 함량, 적절한 미량 금속 함량, 및 적절한 산소화 수준을 포함한다.
일부 실시양태에서, 배양 배지는 재조합 단백질의 분해를 방지할 수 있는 프로테아제 (예를 들어, 식물-기반 프로테아제), 재조합 단백질을 분해할 수 있는 프로테아제의 활성을 감소시키는 프로테아제 억제제, 및/또는 프로테아제 활성을 유용할 수 있는 희생 단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 생산된 재조합 단백질 내에 혼입하기 위한 비-천연 아미노산을 추가로 포함한다.
기타 유전자 변형
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 재조합 성분의 생산을 개선하는 유전자 변형을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 유전자 변형의 비제한적인 예는 변경된 프로모터, 변경된 키나제 활성, 변경된 포스파타제 활성, 변경된 단백질 폴딩 활성, 변경된 단백질 분비 활성, 및 변경된 유전자 발현 유도 경로를 포함한다.
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 재조합 단백질의 분해를 최소화하도록 프로테아제의 감소되거나 또는 또는 본질적으로 제거된 활성을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들어, PCT 출원 WO 96/29391을 참조한다). 관련 기술 분야에 공지된 방법에 따라 돌연변이체의 스크리닝에 의해 또는 특이적인 유전자 변형에 의해 프로테아제의 활성이 감소되거나 또는 본질적으로 제거된 사상 진균 세포를 수득할 수 있다.
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 천연 또는 이종 글리코실트랜스퍼라제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 내인성 또는 이종 글리코실트랜스퍼라제의 비제한적인 예는 푸코실트랜스퍼라제, 갈라톡실트랜스퍼라제, 글루코실트랜스퍼라제, 자일로실트랜스퍼라제, 아세틸라제, 글루코닐트랜스퍼라제, 글루코로닐에피머라제, 시알릴트랜스퍼라제, 만노실트랜스퍼라제, 술포트랜스퍼라제, β-아세틸갈라토스아미닐트랜스퍼라제, 및 N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제를 포함한다.
본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포는 천연 또는 이종성 키나제 또는 포스파타제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 천연 또는 이종성 키나제 또는 포스파타제의 비제한적인 예는 단백질 키나제 A, 단백질 키나제 B, 단백질 키나제 C, 크레아틴 키나제 B, 단백질 키나제 C 베타, 단백질 키나제 G, TmkA, Fam20 키나제 (예를 들어, Fam20C), ATM, CaM-II, cdc2, cdk5, CK1, CKII, DNAPK, EGFR, GSK3, INSR, p38MAPK, RSK, SRC, 포스포트랜스퍼라제, 알칼리성 포스파타제 (예를 들어, 유니프롯KB - O77578), 산 포스파타제 등을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kabir & Kazi. 2011. Genet Mol Biol. 34(4):587]을 참조한다).
재조합 성분 및 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함하는 제제
또 다른 측면에서, 재조합 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분 중 임의의 것) 및 상응하는 제제 내에 포함된 에스테라제 활성에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)을 포함하는 제제가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 재조합 성분, 및 상응하는 제제 내에 포함된 에스테라제 활성에 비교하여 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%만큼 감소된 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 재조합 성분 및 본질적으로 제거된 에스테라제 활성을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 재조합 성분 및 상응하는 제제 내에 포함된 에스테라제 활성에 비교하여 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%만큼 증가된 에스테라제 활성을 포함한다.
본원에서 제공된 제제는 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 성분을 재조합 미생물 숙주 세포를 포함하는 발효 브로스로부터 정제하는 것에 의해 수득될 수 있다.
발효 브로스로부터 재조합 성분을 정제하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Protein Purification, JC Janson and L Ryden, Eds., VCH Publishers, New York, 1989]; [Protein Purification Methods: A Practical Approach, ELV Harris and S Angel, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989]을 참조한다).
재조합 성분을 그의 분자량을 기초로, 예를 들어, 크기 배제/교환 크로마토그래피, 막을 통한 초여과, 겔 투과 크로마토그래피 (예를 들어, 분취용 디스크-겔 전기영동), 또는 밀도 원심분리에 의해 정제할 수 있다.
또한 재조합 성분을 그의 표면 전하 또는 또는 소수성/친수성을 기초로, 예를 들어, 등전 침전, 음이온/양이온 교환 크로마토그래피, 등전 포커싱 (IEF), 또는 역상 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
또한 재조합 성분을 그의 용해도를 기초로, 예를 들어, 황산암모늄 침전, 등전 침전, 계면활성제, 세제, 또는 용매 추출에 의해 정제할 수 있다.
또한 재조합 성분을 또 다른 분자에 대한 그의 친화력을 기초로, 예를 들어, 친화력 크로마토그래피, 반응성 염료, 또는 히드록시아파타이트에 의해 정제할 수 있다. 친화력 크로마토그래피는 재조합 성분에 대한 특이적인 결합 친화력을 갖는 항체, 또는 His-태그부착된 재조합 단백질에 대한 니켈 NTA, 또는 재조합 단백질 상의 당 모이어티에 결합하는 렉틴, 또는 재조합 성분에 특이적으로 결합하는 임의의 기타 분자의 사용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 성분은 정제를 용이하게 하는 태그를 보유한다. 이러한 태그의 비제한적인 예는 에피토프 태그 및 단백질 태그를 포함한다. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 c-myc, 헤마글루티닌 (HA), 폴리히스티딘 (6x-HIS), GLU-GLU, 및 DYKDDDDK (FLAG) 에피토프 태그를 포함한다. 단백질 태그의 비제한적인 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 녹색 형광 단백질 (GFP), 및 말토스 결합 단백질 (MBP)을 포함한다. 에피토프 또는 단백질 태그는 재조합 성분의 단리 후에 (예를 들어, 프로테아제 절단을 통해) 제거될 수 있다.
재조합 성분이 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 분비되는 실시양태에서, 재조합 성분은 발효 브로스로부터 직접 정제될 수 있다. 다른 실시양태에서, 재조합 성분은 세포 용해물로부터 정제될 수 있다.
재조합 성분의 신원을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 웨스턴 블롯 분석, 이스턴 블롯 분석, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 효소 생성물의 형성, 효소 기질의 소멸, 및 2차원 질량 분광법 (2D-MS/MS) 서열 확인에 의해 확인 및/또는 정량할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재조합 성분은 발효 브로스 내에 포함된 다른 성분에 비교하여 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 97% 초과, 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 일부 실시양태에서, 재조합 성분은 발효 브로스 내에 있었을 때보다 제제 내의 다른 성분에 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배 더 풍부하도록 정제된다. 일부 실시양태에서, 재조합 성분은 중량 기준으로 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 97% 초과, 또는 99% 초과의 순도로 정제된다.
일부 실시양태에서, 제제는 액체이다. 다른 실시양태에서, 제제는 고체이다. 일부 이러한 실시양태에서, 제제는 분말이다. 일부 이러한 실시양태에서, 분말은 중량 기준으로 10% 미만, 7% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 또는 1% 미만의 수분 함량을 포함한다. 예를 들어, 분무 건조 또는 증발을 통한 농축에 의해 분말을 수득할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제제는 프로세싱 후의 재조합 성분을 포함한다. 재조합 성분의 후-프로세싱은 단편화 (예를 들어, 화학적 수단 또는 프로테아제 효소 (예를 들어, 트립신, 펩신, 칼마펩신)에 대한 노출에 의함), 반응성 부위의 제거 (예를 들어, 산화에 의해 메티오닌 및/또는 트립토판 잔기의 반응성 부위를 제거함), 조정 (예를 들어, 화학적, 광화학적, 및/또는 효소 전략을 통함), 고리화, 비오틴화 (즉, 비오틴 부착), 및 다른 요소 (예를 들어, 폴리-에틸렌-글리콜, 항체, 리포솜, 인지질, DNA, RNA, 핵산, 당, 이당류, 다당류, 전분, 셀룰로스, 세제, 세포벽)에 대한 접합을 포함할 수 있다.
후-프로세싱은 무작위 방식으로 또는 부위-특이적 방식으로 (예를 들어, 시스테인 잔기의 술프히드릴 기 (예를 들어, 아미노에틸화, 아이오도아세트아미드 형성, 말레이미드 형성, Dha 형성, 디술피드 결합을 통한 공유결합 부착, 및 탈황을 위해); 라이신 잔기의 1차 아민 기 (예를 들어, 활성화된 에스테르, 술포닐 클로라이드, 이소티오시아네이트, 불포화 알데히드 에스테르, 및 알데히드의 부착을 위해); 타이로신 잔기의 페놀성 히드록실 기; 인간에서 면역 반응을 유발할 수 있는 특정 에피토프 (예를 들어, 글리칸 기)의 제거; 아조-전기고리화) 발생할 수 있다.
후-프로세싱은 크기, 전하, 소수성, 친수성, 용매화, 단백질 폴딩 및 화학적 반응성을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 재조합 성분의 특정한 화학적 및/또는 물리적 성질을 변경시킬 수 있다.
재조합 성분을 포함하는 식품
또 다른 측면에서, 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분 중 임의의 것)을 포함하고, 상응하는 식품 내의 에스테라제 활성에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)을 포함하는 식품이 본원에서 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "식품"은 인간, 또는 가축 동물 (예를 들어, 개, 고양이), 농장 동물 (예를 들어, 소, 돼지, 말), 및 야생 동물 (예를 들어, 비-가축 식육 동물)을 포함하는 동물이 섭취할 수 있는 제품을 지칭한다. 이러한 용어는 인간 또는 동물이 섭취할 수 있는 식품을 제조하기 위해 하나 이상의 다른 성분과 조합되거나 이에 첨가될 수 있는 제품을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 미국 식품의약청 (FDA), 미국 농무부, 유럽 식품 안정청, 및/또는 기타 주립 또는 지역 식품 규제 기관에서 요구하는 식품 안전 표준을 충족시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 중량 기준으로 적어도 0.000075%, 적어도 0.0001%, 0.00025%, 적어도 0.0005%, 적어도 0.00075%, 적어도 0.001%, 적어도 0.0025%, 적어도 0.005%, 적어도 0.0075%, 적어도 0.01%, 적어도 0.025%, 적어도 0.05%, 적어도 0.075%, 적어도 0.1%, 적어도 0.25%, 적어도 0.5%, 적어도 0.75%, 적어도 1%, 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 7.5%, 적어도 10%, 적어도 12.5%, 적어도 15%, 적어도 17.5%, 적어도 20%, 적어도 22.5%, 적어도 25%, 적어도 27.5%, 적어도 30%, 적어도 32.5%, 적어도 35%, 적어도 37.5.%, 적어도 40%, 적어도 42.5%, 적어도 45%, 적어도 47.5%, 적어도 50%, 적어도 52.5%, 적어도 55%, 적어도 57.5%, 적어도 60%, 적어도 62.5%, 적어도 65%, 적어도 67.5%, 적어도 70%, 적어도 72.5%, 적어도 75%, 적어도 77.5%, 적어도 80%, 적어도 82.5%, 적어도 85%, 적어도 87.5%, 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 97.5%, 또는 100%의 하나 이상의 본원에서 제공된 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 하나 이상의 재조합 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 성분 중 임의의 것)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 에스테라제 활성 (예를 들어, 임의의 1개의 본원에 개시된 에스테라제의 활성 또는 적어도 2개의 본원에 개시된 에스테라제의 임의의 조합의 활성)이 본질적으로 없다.
일부 실시양태에서, 식품은 비-동물 공급원으로부터 유래된 성분으로 주로 또는 전적으로 구성된다. 대안적 실시양태에서, 식품은 동물 공급원으로부터 부분적으로 유래된 성분으로 구성되지만, 비-동물 공급원으로부터 유래된 성분이 보충된다. 일부 이러한 실시양태에서, 식품은 중량 기준으로 5% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10%; 10% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 또는 20%; 20% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 또는 30%; 30% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 또는 40%; 40% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 또는 50%; 50% 내지 100%, 90%, 80%, 70%, 또는 60%; 60% 내지 100%, 90%, 80%, 또는 70%; 70% 내지 100%, 90%, 또는 80%; 80% 내지 100%, 또는 90%; 또는 90% 내지 100%의 비-동물 공급원으로부터 유래된 성분을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 식품은 국립 건강 및 영양 조사(National Health and Nutrition Examination Survey)에 의해 정의된 식품 카테고리 중 임의의 것으로부터 선택된 식품이거나, 또는 이러한 식품과 유사하다 (즉, 식품 대용물이다).
이같은 식품 카테고리의 비제한적인 예 (및 이러한 식품의 비제한적인 예)는 스낵 식품 및 검 (예를 들어, 스낵바, 크래커, 곡물 제품으로부터의 짭짤한 스낵, 츄잉 검); 빵, 곡물 및 파스타 (예를 들어, 귀리 빵 및 롤, 옥수수 빵, 옥수수 머핀, 토르티야, 밀가루 및 건조 믹스, 비스킷, 혼합곡 빵 및 롤, 통밀 빵 및 롤, 파스타, 호밀 빵 및 롤, 크랙(cracked) 밀 빵 및 롤, 흰 빵 및 롤); 음료 (예를 들어, 맥주 및 에일, 음료 농축물, 음료, 에너지 음료, 스포츠 음료, 체액 보충물, 청량 음료, 탄산 음료, 주스, 와인, 칵테일, 영양 음료, 영양 분말); 과자 및 디저트 (예를 들어, 케이크, 사탕, 칩, 쿠키, 코블러, 페이스트리, 빙과 또는 아이스 캔디, 머핀, 파이, 설탕 대체물 또는 대용물, 시럽, 꿀, 젤리, 잼, 보존물, 샐러드, 크레이프, 데니시, 아침 식사용 페이스트리, 도넛); 아침 식사 식품 (예를 들어, 시리얼 곡물, 시리얼, 쌀, 프렌치 토스트, 팬케이크, 와플, 커피 케이크); 계란 (예를 들어, 계란 요리, 계란 수프, 계란 흰자로 만든 혼합물, 계란 대용물, 계란 대용물로 만든 혼합물); 유제품; 샐러드 드레싱, 오일, 소스, 양념 (예를 들어, 요리용 지방, 식물성 오일, 샐러드 드레싱, 토마토 소스, 그레이비); 감자 (예를 들어, 감자 샐러드, 감자 수프, 칩 및 스틱, 튀긴 감자, 으깬 감자, 스터프(stuffed) 감자, 퍼프); 및 수프 (예를 들어, 야채 수프, 야채 브로스), 식사, 메인 요리, 단백질 (예를 들어, 육류 대용물), 및 해산물을 포함한다.
일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 유제품이거나 또는 유제품과 유사하다 (즉, 유제품 대용물이다). 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "유제품"은 우유 (예를 들어, 전유 (적어도 3.25%의 유지방), 부분적 탈지유 (1% 내지 2% 유지방), 탈지유 (0.2% 미만의 유지방), 조리용 우유, 가당 연유, 풍미 우유, 염소 우유, 양 우유, 건조 우유, 무가당 연유, 우유 폼), 및 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 우유로부터 유래된 제품을 지칭한다: 요거트 (예를 들어, 전유 요거트 (170 g 당 적어도 6 그램의 지방), 저지방 요거트 (170 g 당 2 내지 및 5 그램의 지방), 무지방 요거트 (170 g 당 0.5 그램 이하), 그릭 요거트 (유청이 제거된 변형 요거트), 휩 요거트, 염소 우유 요거트, 라브네(Labneh), 양 우유 요거트, 요거트 음료 (예를 들어, 전유 케퍼(Kefir), 저지방유 케퍼), 라시(Lassi)), 치즈 (예를 들어, 유청 치즈 예컨대 리코타; 파스타 필라타 치즈 예컨대 모짜렐라; 반-연성 치즈 예컨대 하바티(Havarti) 및 뮌스터(Muenster); 중간-경성 치즈 예컨대 스위스(Swiss) 및 얄스베르그(Jarlsberg); 경성 치즈 예컨대 체다(Cheddar) 및 파마산(Parmesan); 워시드 커드 치즈 예컨대 콜비(Colby) 및 몬테레이 잭(Monterey Jack); 연성 숙성 치즈 예컨대 브리(Brie) 및 까망베르(Camembert); 생치즈 예컨대 코티지 치즈, 페타 치즈, 크림 치즈, 및 커드; 가공 치즈; 가공 치즈 식품; 가공 치즈 제품; 가공 치즈 스프레드; 효소-조정 치즈; 콜드-팩 치즈), 유제품-기반 소스 (예를 들어, 신선, 냉동, 냉장, 또는 상온 안정적), 유제품 스프레드 (예를 들어, 저지방 스프레드, 저지방 버터), 크림 (예를 들어, 드라이 크림, 헤비 크림, 라이트 크림, 휘핑 크림, 하프-앤-하프, 커피 화이트너, 커피 크리머, 사우어 크림, 크렘 프레쉬), 빙과 (예를 들어, 아이스크림, 스무디, 밀크 쉐이크, 프로즌 요거트, 선데이, 젤라토, 커스타드), 유제품 디저트 (예를 들어, 신선, 냉장, 또는 냉동), 버터 (예를 들어, 휩 버터, 발효 버터), 유제품 분말 (예를 들어, 전유 분말, 탈지 분유, 지방 충전 분유 (즉, 동물 지방 전체 또는 일부를 대신하여 식물 지방을 포함하는 분유), 유아용 조제 분유, 우유 단백질 농축물 (즉, 적어도 80 중량%의 단백질 함량), 우유 단백질 단리물 (즉, 적어도 90 중량%의 단백질 함량), 유청 단백질 농축물, 유청 단백질 단리물, 미네랄이 제거된 유청 단백질 농축물, 미네랄이 제거된 유청 단백질 농축물, β-락토글로불린 농축물, β-락토글로불린 단리물, α-락트알부민 농축물, α-락트알부민 단리물, 글리코마크로펩티드 농축물, 글리코마크로펩티드 단리물, 카세인 농축물, 카세인 단리물, 영양 보충물, 질감화 블렌드, 풍미 블렌드, 착색 블렌드), 즉석 음용 또는 즉석 혼합 제품 (예를 들어, 신선하거나, 냉장되거나, 또는 상온 안정적인 유제품 단백질 음료, 체중 감소 음료, 영양 음료, 스포츠 회복 음료, 및 에너지 음료), 푸딩, 겔, 츄어블, 칩, 및 바.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "식품 대용물" (예를 들어, "유제품 대용물")은 통상적인 식품과 유사한 (예를 들어, 통상적인 식품 대신 사용될 수 있는) 식품을 지칭한다. 이러한 유사성은 임의의 물리적, 화학적, 또는 기능적 속성에 기인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품과 통상적인 식품의 유사성은 물리적 속성에 기인한다. 물리적 속성의 비제한적인 예는 색상, 형상, 기계적 특성 (예를 들어, 경도, G' 저장 모듈러스 값, 형상 유지, 응집, 질감 (즉, 감각 지각 (예를 들어, 입맛, 기름기, 크림성, 균질화, 풍부함, 매끄러움, 두께)과 연관된 기계적 특성, 점도, 및 결정도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품과 통상적인 식품의 유사성은 화학적/생물학적 속성에 기인한다. 화학적 속성의 비제한적인 예는 영양 함량 (예를 들어, 아미노산의 유형 및/또는 양 (예를 들어, PDCAAS 점수), 지질의 유형 및/또는 양, 탄수화물의 유형 및/또는 양, 미네랄의 유형 및/또는 양, 비타민의 유형 및/또는 양), pH, 소화성, 저장 수명, 배고픔 및/또는 포만감 조절, 맛, 및 향을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품과 통상적인 식품의 유사성은 기능적 속성에 기인한다. 기능적 속성의 비제한적인 예는 겔화/응집 거동 (예를 들어, 겔화 능력 (즉, 물리적 및/또는 화학적 조건 (예를 들어, 교반, 온도, pH, 이온 강도, 단백질 농도, 당 농도, 이온 강도)에 반응하여 최대 강도의 겔 (즉, 수소 결합에 의해 단백질 분자에 연결된 용매로 공간이 채워진 단백질 네트워크)을 형성하는 데 요구되는 시간), 응집 능력 (즉, 물리적 및/또는 화학적 조건에 반응하여 침전물 (즉, 단백질 분자와 용매 배제 사이의 강한 상호작용을 기초로 하는 촘촘한 단백질 네트워크)을 형성하는 능력), 겔 강도 (즉, 힘/단위 면적 (예를 들어, 파스칼 (Pa))으로 측정된, 형성된 겔의 강도), 겔화 시의 물 유지 능력, 겔화 시의 이액 (즉, 경시적인 누수)), 거품 형성 거동 (예를 들어, 거품 형성 능력 (즉, 물리적 및/또는 화학적 조건에 반응하여 유지되는 공기의 양), 거품 안정성 (즉, 물리적 및/또는 화학적 조건에 반응하여 형성된 거품의 반감기), 거품 누설), 증점 용량, 용도 다능성 (즉, 식품을 다양한 방식으로 및/또는 다양한 다른 조성물이 식품으로부터 유래되도록 사용하는 능력; 예를 들어, 우유 파생 제품 예컨대 요거트, 치즈, 크림 및 버터와 유사한 식품을 생산하는 능력), 및 단백질 이량체를 형성하는 능력을 포함한다.
다양한 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 우유 대용물 (즉, 우유와 유사함), 요거트 대용물 (즉, 요거트와 유사함), 치즈 대용물 (즉, 치즈와 유사함), 냉동 디저트 대용물 (즉, 냉동 디저트 (예를 들어, 아이스크림)와 유사함), 또는 임의의 기타 유제품 대용물 (즉, 유제품 (예를 들어, 임의의 본원에 개시된 유제품)과 유사함)이다.
우유 단백질 성분
일부 실시양태에서, 식품 (예를 들어, 유제품, 난 제품)은 우유 단백질 성분을 포함하고, 여기서 우유 단백질 성분은 재조합 우유 단백질, 및 본원에서 제공된 방법에 따라 생산되지 않은 (즉, 에스테라제의 활성이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되지 않은) 우유 단백질 성분의 에스테라제 활성에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제의 활성을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "우유 단백질 성분"은 유청 단백질의 서브세트, 또는 카세인의 서브세트, 또는 유청 단백질의 서브세트 및 카세인의 서브세트의 혼합물로 이루어진 성분을 지칭한다 (즉, 유청 단백질 농축물 또는 마이셀 카세인 농축물, 또는 카세인산나트륨, 또는 산 카세인, 또는 우유 단백질 농축물 또는 우유 단백질 단리물 내에 존재하는 전체가 아니라 일부인 단백질로부터의 것). 추가로 이러한 용어는 우유 단백질 성분 내의 우유 단백질이 식품 내에 포함된 유일한 우유 단백질이라는 것을 의미한다 (즉, 식품이 우유 단백질 성분을 이루는 우유 단백질 이외의 다른 우유 단백질을 포함하지 않는다).
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 중량 기준으로 0.1% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 또는 0.2%; 0.2% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 또는 0.3%; 0.3% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 또는 0.4%; 0.4% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 또는 0.5%; 0.5% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 또는 0.6%; 0.6% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 또는 0.7%; 0.7% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 또는 0.8%; 0.8% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0.9%; 0.9% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%; 1% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 또는 2%; 2% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 또는 3%; 3% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 또는 4%; 4% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 또는 5%; 5% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 또는 6%; 6% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 또는 7%; 7% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 또는 8%; 8% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 또는 9%; 9% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 또는 10%; 10% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 또는 11%; 11% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 또는 12%; 12% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 또는 13%; 13% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 또는 14%; 14% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 또는 15%; 15% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20%; 20% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 또는 25%; 25% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 또는 30%; 30% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 또는 35%; 35% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 또는 40%; 40% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 또는 45%; 45% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50%; 50% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 또는 55%; 55% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 또는 60%; 60% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 또는 65%; 65% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 또는 70%; 70% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75%; 75% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 또는 80%; 80% 내지 100%, 95%, 90%, 또는 85%; 또는 85% 내지 100%, 95%, 90%; 90% 내지 100% 또는 95%, 또는 95% 내지 100%의 우유 단백질 성분을 포함한다.
본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)의 우유 단백질 (예를 들어, 하나 이상의 유청 단백질, 하나 이상의 카세인, 또는 하나 이상의 유청 단백질 및 하나 이상의 카세인의 혼합물)로 이루어질 수 있고, 여기서 우유 단백질 중 적어도 1개는 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 우유 단백질 (예를 들어, 본원에 개시된 재조합 우유 단백질 중 임의의 것)이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 유청 단백질 (예를 들어, β-락토글로불린, α-락트알부민, β-락토글로불린 및 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 번역후 변형 (PTM)을 갖는 2개 이상의 β-락토글로불린의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 β-락토글로불린 및 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 α-락트알부민 및 β-락토글로불린의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 β-락토글로불린 및 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 α-락트알부민의 혼합물의 혼합물); 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 카세인 (예를 들어, κ-카세인, β-카세인, γ-카세인, κ-카세인 및 β-카세인의 혼합물, κ-카세인 및 γ-카세인의 혼합물, β-카세인 및 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 κ-카세인 및 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 κ-카세인 및 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 β-카세인 및 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 β-카세인 및 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 γ-카세인 및 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 γ-카세인 및 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 κ-카세인 및/또는 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 β-카세인 및/또는 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 γ-카세인의 혼합물); 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진다.
적어도 1개의 재조합 우유 단백질은 단일 재조합 우유 단백질일 수 있다. 단일 재조합 우유 단백질은 단일 재조합 유청 단백질 (예를 들어, 재조합 β-락토글로불린 또는 재조합 α-락트알부민) 또는 단일 재조합 카세인 (예를 들어, 재조합 κ-카세인 또는 재조합 β-카세인 또는 재조합 γ-카세인)일 수 있다. 대안적으로 적어도 1개의 재조합 우유 단백질은 2개 이상의 재조합 우유 단백질일 수 있다. 2개 이상의 재조합 우유 단백질은 2개 이상의 재조합 유청 단백질 (예를 들어, 재조합 β-락토글로불린 및 재조합 α-락트알부민), 2개 이상의 재조합 카세인 (예를 들어, 재조합 κ-카세인 및 재조합 β-카세인, 재조합 κ-카세인 및 재조합 γ-카세인, 재조합 κ-카세인 및 재조합 β-카세인 및 재조합 γ-카세인), 또는 적어도 1개의 재조합 유청 단백질 및 적어도 1개의 재조합 카세인의 혼합물 (예를 들어, 재조합 κ-카세인 및 재조합 β-카세인 및 재조합 γ-카세인 중 1개 또는 2개 또는 모두와 조합된 재조합 β-락토글로불린 및 재조합 α-락트알부민 중 하나 또는 둘 다)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 1개의 재조합 우유 단백질은 적어도 1개의, PTM을 갖는 재조합 우유 단백질을 포함한다. 다양한 이러한 실시양태에서, PTM은 천연 PTM, 비-천연 PTM, 또는 그의 혼합물일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 우유 단백질의 PTM의 유형 및/또는 수는 본원에서 제공된 식품에 바람직한 속성을 부여한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 재조합 유청 단백질 (예를 들어, 재조합 β-락토글로불린, 재조합 α-락트알부민, 재조합 β-락토글로불린 및 재조합 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-락토글로불린의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-락토글로불린 및 재조합 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 α-락트알부민 및 β-락토글로불린의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-락토글로불린 및 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 α-락트알부민의 혼합물의 혼합물); 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 재조합 카세인 (예를 들어, 재조합 κ-카세인, 재조합 β-카세인, 재조합 γ-카세인, 재조합 κ-카세인 및 재조합 β-카세인의 혼합물, 재조합 κ-카세인 및 재조합 γ-카세인의 혼합물, 재조합 β-카세인 및 재조합 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 κ-카세인 및 재조합 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 κ-카세인 및 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-카세인 및 재조합 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-카세인 및 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 γ-카세인 및 재조합 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 γ-카세인 및 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 κ-카세인 및/또는 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-카세인 및/또는 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 γ-카세인의 혼합물); 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 재조합 유청 단백질 (예를 들어, 재조합 β-락토글로불린, 재조합 α-락트알부민, 재조합 β-락토글로불린 및 재조합 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-락토글로불린의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-락토글로불린 및 재조합 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 α-락트알부민 및 β-락토글로불린의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-락토글로불린 및 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 α-락트알부민의 혼합물의 혼합물); 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 재조합 카세인 (예를 들어, 재조합 κ-카세인, 재조합 β-카세인, 재조합 γ-카세인, 재조합 κ-카세인 및 재조합 β-카세인의 혼합물, 재조합 κ-카세인 및 재조합 γ-카세인의 혼합물, 재조합 β-카세인 및 재조합 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 κ-카세인 및 재조합 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 κ-카세인 및 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-카세인 및 재조합 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-카세인 및 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 γ-카세인 및 재조합 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 γ-카세인 및 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 κ-카세인 및/또는 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 β-카세인 및/또는 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 재조합 γ-카세인의 혼합물); 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진다.
우유 단백질 성분은 하나 이상의 천연 우유 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 천연 유청 단백질 (예를 들어, 천연 β-락토글로불린, 천연 α-락트알부민, 천연 β-락토글로불린 및 천연 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 β-락토글로불린의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 β-락토글로불린 및 천연 α-락트알부민의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 α-락트알부민 및 천연 β-락토글로불린의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 β-락토글로불린 및 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 α-락트알부민의 혼합물의 혼합물); 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 천연 카세인 (예를 들어, 천연 κ-카세인, 천연 β-카세인, 천연 γ-카세인, 천연 κ-카세인 및 천연 β-카세인의 혼합물, 천연 κ-카세인 및 천연 γ-카세인의 혼합물, 천연 β-카세인 및 천연 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 κ-카세인 및 천연 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 κ-카세인 및 천연 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 β-카세인 및 천연 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 β-카세인 및 천연 γ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 γ-카세인 및 천연 κ-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 γ-카세인 및 천연 β-카세인의 혼합물, 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 κ-카세인 및/또는 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 β-카세인 및/또는 상이한 PTM을 갖는 2개 이상의 천연 γ-카세인의 혼합물); 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 약 10 대 약 1 내지 약 1 대 약 10 (예를 들어, 약 10 대 1, 약 9 대 1, 약 8 대 1, 약 7 대 1, 약 6 대 1, 약 5 대 1, 약 4 대 1, 약 3 대 1, 약 2 대 1, 약 1 대 1, 약 1 대 2, 약 1 대 3, 약 1 대 4, 약 1 대 5, 약 1 대 6, 약 1 대 7, 약 1 대 8, 약 1 대 9, 또는 약 1 대 10)의 중량비의 유청 단백질 및 카세인으로 이루어진다.
일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 약 10 대 약 1 내지 약 1 대 약 10 (예를 들어, 약 10 대 1, 약 9 대 1, 약 8 대 1, 약 7 대 1, 약 6 대 1, 약 5 대 1, 약 4 대 1, 약 3 대 1, 약 2 대 1, 약 1 대 1, 약 1 대 2, 약 1 대 3, 약 1 대 4, 약 1 대 5, 약 1 대 6, 약 1 대 7, 약 1 대 8, 약 1 대 9, 또는 약 1 대 10)의 중량비의 재조합 유청 단백질 및 천연 유청 단백질로 이루어진다.
일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 약 10 대 약 1 내지 약 1 대 약 10 (예를 들어, 약 10 대 1, 약 9 대 1, 약 8 대 1, 약 7 대 1, 약 6 대 1, 약 5 대 1, 약 4 대 1, 약 3 대 1, 약 2 대 1, 약 1 대 1, 약 1 대 2, 약 1 대 3, 약 1 대 4, 약 1 대 5, 약 1 대 6, 약 1 대 7, 약 1 대 8, 약 1 대 9, 또는 약 1 대 10)의 중량비의 재조합 카세인 및 천연 카세인으로 이루어진다.
일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 약 10 대 약 1 내지 약 1 대 약 10 (예를 들어, 약 10 대 1, 약 9 대 1, 약 8 대 1, 약 7 대 1, 약 6 대 1, 약 5 대 1, 약 4 대 1, 약 3 대 1, 약 2 대 1, 약 1 대 1, 약 1 대 2, 약 1 대 3, 약 1 대 4, 약 1 대 5, 약 1 대 6, 약 1 대 7, 약 1 대 8, 약 1 대 9, 또는 약 1 대 10)의 중량비의 재조합 유청 단백질 및 재조합 카세인으로 이루어진다.
일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 약 10 대 약 1 내지 약 1 대 약 10 (예를 들어, 약 10 대 1, 약 9 대 1, 약 8 대 1, 약 7 대 1, 약 6 대 1, 약 5 대 1, 약 4 대 1, 약 3 대 1, 약 2 대 1, 약 1 대 1, 약 1 대 2, 약 1 대 3, 약 1 대 4, 약 1 대 5, 약 1 대 6, 약 1 대 7, 약 1 대 8, 약 1 대 9, 또는 약 1 대 10)의 중량비의 천연 유청 단백질 및 천연 카세인으로 이루어진다.
일부 이러한 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품 내에 포함된 우유 단백질 성분은 약 10 대 약 1 내지 약 1 대 약 10 (예를 들어, 약 10 대 1, 약 9 대 1, 약 8 대 1, 약 7 대 1, 약 6 대 1, 약 5 대 1, 약 4 대 1, 약 3 대 1, 약 2 대 1, 약 1 대 1, 약 1 대 2, 약 1 대 3, 약 1 대 4, 약 1 대 5, 약 1 대 6, 약 1 대 7, 약 1 대 8, 약 1 대 9, 또는 약 1 대 10)의 중량비의 재조합 우유 단백질 및 천연 우유 단백질로 이루어진다.
모든 실시양태에서, 우유 단백질 성분은 유청 단백질의 서브세트, 또는 카세인의 서브세트, 또는 유청 단백질의 서브세트 및 카세인의 서브세트의 혼합물로만 이루어진다. 일부 실시양태에서, 유청 단백질의 서브세트는 β-락토글로불린 및/또는 α-락트알부민으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 카세인의 서브세트는 κ-카세인 및/또는 β-카세인 및/또는 γ-카세인으로 이루어진다. 다양한 실시양태에서, 유청 단백질의 서브세트 및 카세인의 서브세트의 혼합물은 κ-카세인 및/또는 β-카세인 및/또는 γ-카세인과 조합된 β-락토글로불린 및/또는 α-락트알부민으로 이루어진다. 일부 이러한 실시양태에서, 혼합물은 β-락토글로불린 및 κ-카세인으로 이루어진다. 다른 이러한 실시양태에서, 혼합물은 α-락트알부민 및 κ-카세인으로 이루어진다. 또 다른 이러한 실시양태에서, 혼합물은 β-락토글로불린 및 α-락트알부민 및 κ-카세인으로 이루어진다.
비-우유 단백질 성분
일부 실시양태에서, 식품 (예를 들어, 유제품, 난 제품)은 비-우유 단백질 성분을 포함하고, 여기서 비-우유 단백질 성분은 재조합 비-우유 단백질, 및 본원에서 제공된 방법에 따라 생산되지 않은 (즉, 에스테라제의 활성이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되지 않은) 비-우유 단백질 성분의 에스테라제 활성에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제의 활성을 포함한다.
본원에서 제공된 식품 내에 포함된 비-우유 단백질 성분은 임의의 공급원으로부터 유래된 비-우유 단백질, 뿐만 아니라 다양한 공급원으로부터 유래된 비-우유 단백질의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 공급원의 비제한적인 예는 동물, 식물, 조류, 진균 및 미생물을 포함한다.
동물의 비제한적인 예는 곤충 (예를 들어, 파리), 포유동물 (예를 들어, 소, 양, 염소, 토끼, 돼지, 인간), 및 새 (예를 들어, 닭)을 포함한다.
식물의 비제한적인 예는 소철, 은행나무, 구과식물, 사이프러스, 향나무, 측백나무, 시더우드, 소나무, 안젤리카, 캐러웨이, 고수, 쿠민, 회향풀, 파슬리, 딜, 민들레, 헬리크리섬, 매리골드, 쑥, 홍화, 캐모마일, 양상추, 웜우드, 카렌듈라, 시트로넬라, 세이지, 타임, 치아 씨드, 겨자, 올리브, 커피, 고추, 가지, 파프리카, 크랜베리, 키위, 채소 식물 (예를 들어, 당근, 셀러리), 만수국, 쑥국화, 타라곤, 해바라기, 윈터그린, 바질, 히솝, 라벤더, 레몬 버베나, 마조람, 멜리사, 패출리, 페니로얄, 페퍼민트, 로즈마리, 참깨, 스피아민트, 프림로즈, 사마라, 후추, 피망, 감자, 고구마, 토마토, 블루베리, 까마중, 페튜니아, 모닝 글로리, 라일락, 자스민, 인동, 금어초, 차전자, 구충초, 메밀, 아마란스, 근대, 퀴노아, 시금치, 대황, 호호바, 하위수과, 클로렐라, 마룰라, 헤이즐넛, 카놀라, 케일, 청경채, 순무, 유향나무, 미르, 엘레미, 대마, 호박, 스쿼시, 표주박, 마니옥, 달버지아, 콩과 식물 (예를 들어, 알팔파, 렌틸, 콩류, 클로버, 완두콩, 파바 코세이라, 프리홀 볼라 로카, 프리홀 네그로, 싸리속, 감초, 루핀, 메스키트, 캐롭, 대두, 땅콩, 타마린드, 등나무, 카시아, 병아리콩, 호로파, 푸른 완두콩, 노란 완두콩, 깍지 완두콩, 리마콩, 잠두), 제라늄, 아마, 석류, 목화, 오크라, 님, 무화과, 오디, 클로브, 유칼립투스, 티트리, 니아울리, 과일 식물 (예를 들어, 사과, 살구, 복숭아, 서양자두, 배, 승도복숭아), 딸기, 블랙베리, 라즈베리, 체리, 자두, 장미, 탠저린, 감귤류 (예를 들어, 그레이프프루트, 레몬, 라임, 오렌지, 광귤, 만다린), 망고, 시트러스 베르가못, 부쿠, 포도, 브로콜리, 싹양배추, 카멜리나, 콜리플라워, 평지, 평지씨 (카놀라), 순무, 양배추, 오이, 수박, 허니듀 멜론, 주키니, 자작나무, 호두, 카사바, 바오밥, 올스파이스, 아몬드, 빵나무, 샌달우드, 마카다미아, 타로, 튜베로즈, 알로에 베라, 마늘, 양파, 샬롯, 바닐라, 유카, 베티베르, 갈랑갈, 보리, 콘, 쿠르쿠마 아로마티카, 생강, 레몬 그라스, 귀리, 야자, 파인애플, 쌀, 호밀, 수수, 라이밀, 강황, 얌, 대나무, 보리, 카유풋, 칸나, 카다몬, 옥수수, 귀리, 밀, 계피, 사사프라스, 린데라 벤조인, 월계수, 아보카도, 일랑-일랑, 메이스, 넛멕, 모링가, 쇠뜨기, 오레가노, 실란트로, 처빌, 차이브, 집합과, 곡물 식물, 허브 식물, 잎채소, 비-곡물 콩류 식물, 견과류 식물, 다즙 식물, 육생 식물, 수생 식물, 델버지아, 기장, 핵과, 분리과, 현화 식물, 비-현화 식물, 재배 식물, 야생 식물, 나무, 관목, 꽃, 풀, 초본 식물, 잎나무, 덩굴 식물, 선인장, 열대 식물, 아열대 식물, 온대 식물, 및 그의 파생종 및 교배종을 포함한다.
조류의 비제한적인 예는 녹조류 (예를 들어, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 피레노이도사(Chlorealla pyrenoidosa)), 갈조류 (예를 들어, 알라리아 마르기나타(Alaria marginata), 아날리푸스 자포니쿠스(Analipus japonicus), 아스코필룸 노도숨(Ascophyllum nodosum), 엑크로니아(Ecklonia) 종, 에이세니아 비시클리스(Eisenia bicyclis), 히지키아 푸시포르메(Hizikia fusiforme), 크젤마니엘라 기라타(Kjellmaniella gyrata), 라미나리아 안구스타타(Laminaria angustata), 라미나리아 롱기루리스(Laminaria longirruris), 라미나리아 롱기시마(Laminaria Longissima), 라미나리아 오코텐시스(Laminaria ochotensis), 라미나리아 클라우스토니아(Laminaria claustonia), 라미나리아 사카리나(Laminaria saccharina), 라미나리아 디기타타(Laminaria digitata), 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica), 마크로시스티스 피리페라(Macrocystis pyrifera), 페탈로니아 파스시아(Petalonia fascia), 스키토시폰 로메(Scytosiphon lome)), 홍조류 (예를 들어, 콘드루스 크리스푸스(Chondrus crispus), 콘드루스 오셀라투스(Chondrus ocellatus), 에우케우마 코토니이(Eucheuma cottonii), 에우케우마 스피노숨(Eucheuma spinosum), 푸르셀라리아 파스티기아타(Furcellaria fastigiata), 그라실라리아 부르사-파스토리스(Gracilaria bursa-pastoris), 그라실라리아 리케노이데스(Gracilaria lichenoides), 글로이오펠티스 푸르카타(Gloiopeltis furcata), 기가르티나 아시쿨라리스(Gigartina acicularis), 기가르티나 부르사-파스토리스(Gigartina bursa-pastoris), 기가르티나 피스틸라타(Gigartina pistillata), 기가르티나 라둘라(Gigartina radula), 기가르티나 스코츠베르기이(Gigartina skottsbergii), 기가르티나 스텔라타(Gigartina stellata), 팔마리아 팔마타(Palmaria palmata), 포르피라 콜룸비나(Porphyra columbina), 포르피라 크리스파타(Porphyra crispata), 포르피라 데우타타(Porhyra deutata), 포르피라 페르포라타(Porhyra perforata), 포르피라 서브오르비쿨라타(Porhyra suborbiculata), 포르피라 테네라(Porphyra tenera), 포르피리디움 크루엔툼(Porphyridium cruentum), 포르피리디움 푸르푸레움(Porphyridium purpureum), 포르피리디움 아에루기네움(Porphyridium aerugineum), 로델라 마쿨라테(Rhodella maculate), 로델라 레티쿨라타(Rhodella reticulata), 로델라 비올라세아(Rhodella violacea), 로디메니아 팔마타(Rhodymenia palmata)), 및 그의 파생종 및 교배종을 포함한다.
진균의 비제한적인 예는 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 니게르 변종 아와모리, 아스페르길루스 오리자에, 칸디다 알비칸스, 칸디다 엣첼시이, 칸디다 구일리에르몬디이, 칸디다 후밀리스, 칸디다 리폴리티카, 칸디다 슈도트로피칼리스, 칸디다 유틸리스, 칸디다 베르사틸리스, 크리소스포리움 루크노웬세, 데바리오마이세스 한세니이, 엔도티아 파라시티카(Endothia parasitica), 에레모테시움 아쉬비이이, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 모닐리포르메, 푸사리움 베네나툼, 한세눌라 폴리모르파, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 클루이베로마이세스 마르시아누스 변종 락티스, 클루이베로마이세스 써모톨레란스, 모르테이렐라 비나세아에 변종 라피노스유틸라이저(Morteirella vinaceae var. raffinoseutilizer), 무코르 미에헤이, 무코르 미에헤이 변종 쿠니 엣 에머슨, 무코르 푸실루스 린드트, 미셀리오프토라 써모파일(Myceliophthora thermophile), 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 로퀘포르티이, 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens), 피키아 파스토리스, 피키아 핀란디카, 피키아 트레할로필라, 피키아 코클라마에, 피키아 멤브라나에파시엔스, 피키아 미누타, 오가타에에 미누타, 피키아 린드네리, 피키아 오푼티아에, 피키아 써모톨레란스, 피키아 살릭타리아, 피키아 구에르쿠움, 피키아 피즈페리, 피키아 스팁티스, 피키아 메타놀리카, 리조푸스 니베우스, 사카로마이세스 바야누스, 사카로마이세스 베티쿠스, 사카로마이세스 세레비시아에, 사카로마이세스 케발리에리, 사카로마이세스 디아스타티쿠스, 사카로마이세스 엘립소디데우스, 사카로마이세스 엑시구우스, 사카로마이세스 플로렌티누스, 사카로마이세스 프라길리스, 사카로마이세스 파스토리아누스, 사카로마이세스 폼베, 사카로마이세스 사케, 사카로마이세스 우바룸, 스포리디오볼루스 존소니이(Sporidiobolus johnsonii), 스포리디오볼루스 살모니콜로르(Sporidiobolus salmonicolor), 스포로볼로마이세스 로세우스, 트리코데르마 리이세이, 크산토필로마이세스 덴드로로우스(Xanthophyllomyces dendrorhous), 야로위아 리폴리티카, 지고사카로마이세스 로욱시이, 및 그의 파생종 및 교배종을 포함한다.
미생물의 비제한적인 예는 피르미쿠테스, 시아노박테리아 (청록 조류), 오실라토리오프시데아에, 바실라레스, 락토바실라레스, 오실라토리알레스, 바실라세아에, 락토바실라세아에, 아세토박터 서브옥시단스, 아세토박터 자일리눔, 악티노플라네 미수리엔시스, 아르트로스피라 플라텐시스, 아르트로스피라 막시마, 바실루스 세레우스, 바실루스 코아굴란스, 바실루스 서브틸루스, 바실루스 세루스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 스테아로써모필루스, 바실루스 서브틸리스, 에쉐리키아 콜라이, 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 불가리쿠스, 락토코쿠스 락티스, 락토코쿠스 락티스 랜스필드 그룹 N, 락토바실루스 레우테리, 류코노스톡 시트로보룸, 류코노스톡 덱스트라니쿰, 류코노스톡 메센테로이데스, 마이크로코쿠스 리소데익티쿠스, 스피룰리나, 스트렙토코쿠스 크레모리스, 스트렙토코쿠스 락티스, 스트렙토코쿠스 락티스 아종 디아세틸락티스, 스트렙토코쿠스 써모필루스, 스트렙토마이세스 카타노오겐시스, 스트렙토마이세스 그리세우스, 스트렙토마이세스 나탈렌시스, 스트렙토마이세스 올리바세우스, 스트렙토마이세스 올리보크로모게네스, 스트렙토마이세스 루비기노수스, 테트라히메나 써모파일, 테트라히메나 헤게위치, 테트라히메나 하이퍼안굴라리스, 테트라히메나 말라센시스, 테트라히메나 피그멘토사, 테트라히메나 피리포르미스, 테트라히메나 보락스, 잔토모나스 캄페스트리스, 및 그의 파생종 및 교배종을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-우유 단백질은 동물 단백질이다. 이러한 단백질의 비제한적인 예는 콜라겐을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-우유 단백질은 식물 단백질이다. 이러한 비-우유 식물 단백질의 비제한적인 예는 완두콩 단백질 및 감자 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-우유 단백질은 진균 단백질이다. 이러한 단백질의 비제한적인 예는 글루코아밀라제, 자일라나제, 아밀라제, 글루카나제, SUN 패밀리의 구성원 (Sim1p, Uth1p, Nca3p, Sun4p), 신장 인자 1-알파, 미토콘드리아 류실-tRNA 신쎄타제, 알파-아밀라제, 알파-갈락토시다제, 셀룰라제, 엔도-1,4-베타-자일라나제, 엔도글루카나제, 엑소-1,4-베타-자일로시다제, 글루코아밀라제, 펩티다제, 아스페르길로펩신-1, 1,4-베타-D-글루칸 셀로비오히드롤라제 A, 알파-갈락토시다제 A, 알파-갈락토시다제 B, 알파-갈락토시다제 D, 알파-글루쿠로니다제 A, 베타-갈락토시다제 C, 글루칸 1,3-베타-글루코시다제 A, 히드로포빈, 및 글루칸 엔도-1,3-베타-글루코시다제 eglC를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-우유 단백질은 숙주 세포 (예를 들어, 본원에 개시된 동물, 식물, 조류, 진균, 또는 미생물의 천연 또는 재조합 숙주 세포 중 임의의 것)에 의해 분비되는 비-우유 단백질로부터 유래된다. 적절한 분비된 비-우유 단백질을, 예를 들어, 시크리톰(secretome) (즉, 예를 들어, 동물, 식물, 조류, 진균 또는 미생물 세포를 액체 배양에서 배양하고, 세포 배양물로부터 (예를 들어, 원심분리를 통해) 세포를 제거하고, 임의적으로 나머지 배양 배지를 농축하거나; 또는 게놈을 시퀀싱하고, 분비된 단백질을 인-실리코(in silico)로 확인하는 것에 의해 수득된, 분비된 단백질) (예를 들어, 문헌 [Mattanovich et al. 2009. Microbial Cell Factories 8:29]을 참조한다), 전체 세포 추출물, 또는 분획화된 전체 세포 추출물을 수득하고; 임의적으로, 단백질을 부분적으로 소화시키거나, 글리코실화시키거나, 인산화시키거나, 또는 다른 방식으로 효소에 의해 처리한 후; 예를 들어, 우유 단백질에 비교하여 유사하거나, 동일하거나 또는 상이한 성질을 갖는 단백질에 대해, 검정법 (예를 들어, 고처리리량 검정법)에서 이를 스크리닝하는 것에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 우유 단백질에 비교하여 유사하거나, 동일하거나 또는 상이한 성질을 갖는 단백질에 대해, 대두 단백질의 칼슘-강화 분획을 스크리닝하는 것에 적절한 분비된 비-우유 단백질을 확인할 수도 있다. 적절한 분비된 비-우유 단백질의 비제한적인 예가 2017년 8월 25일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2017/48730에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 비-우유 단백질은 분비된 진균 단백질 (즉, 진균 (예를 들어, 본원에 개시된 진균 중 임의의 것)에 의해 분비되는 단백질)이다.
일부 실시양태에서, 비-우유 단백질 성분은 재조합 비-우유 단백질을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 재조합 비-우유 단백질은 비-천연 PTM을 갖고/거나, 인간 또는 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 에피토프가 결여된다.
기타 성분
본원에서 제공된 식품은 하나 이상의 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 지질을 추가로 포함한다. 지질의 비제한적인 예는 지방, 오일, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 및 유리 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택된 지질을 포함한다.
오일의 비제한적인 예는 식물 오일 (예를 들어, 해바라기 오일, 코코넛 오일, 겨자 오일, 땅콩 오일, 캐놀라 오일, 옥수수 오일, 목화씨 오일, 아마씨 오일, 올리브 오일, 야자 오일, 평지씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 대두 오일, 아몬드 오일, 비치 넛 오일, 브라질 넛 오일, 캐슈 오일, 헤이즐넛 오일, 마카다미아 넛 오일, 몽곤고 넛 오일, 피칸 오일, 잣 오일, 피스타치오 넛 오일, 호두 오일, 아보카도 오일, 포도씨 오일), 미생물-유래 오일, 조류-유래 오일, 진균-유래 오일, 해양 동물 오일 (예를 들어, 대서양 어류 오일, 태평양 어류 오일, 지중해 어류 오일, 경도 압착 어류 오일, 알칼리성 처리 어류 오일, 열 처리 어류 오일, 담갈색 및 진갈색 어류 오일, 가다랑어 오일, 정어리 오일, 참치 오일, 농어 오일, 넙치 오일, 돛새치 오일, 바라쿠다 오일, 대구 오일, 멘헤이든 오일, 정어리 오일, 앤초비 오일, 카펠린 오일, 대서양 대구 오일, 대서양 청어 오일, 대서양 고등어 오일, 대서양 멘헤이든 오일, 연어 오일, 및 상어 오일, 오징어 오일, 갑오징어 오일, 문어 오일, 크릴 오일, 바다표범 오일, 고래 오일), 비-필수 오일, 필수 오일, 천연 오일, 비-수소화 오일, 부분적 수소화 오일, 수소화 오일 (예를 들어, 수소화 코코넛 오일), 원유, 반-정련 (알칼리성 정련으로도 지칭됨) 오일, 에스테르교환 오일, 및 정련 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장쇄 오일 (예를 들어, 해바라기 오일, 옥수수 오일, 올리브 오일, 대두 오일, 땅콩 오일, 호두 오일, 아몬드 오일, 참깨 오일, 목화씨 오일, 캐놀라 오일, 홍화 오일, 아마씨 오일, 야자 오일, 야자핵 오일, 야자 열매 오일, 코코넛 오일, 바바수 오일, 시어 버터, 망고 버터, 코코아 버터, 밀 배아 오일, 쌀겨 오일, 올레산을 400%만큼 과발현하는 조작된 해바라기 오일)이 단쇄 트리글리세리드와 조합되어 에스테르전이 지방산 에스테르가 생성된다. 트리글리세리드 및 장쇄 오일의 다양한 조합이 다수의 상이한 풍미 프로파일을 생성시키기 위해 포함될 수 있다.
모노글리세리드 및 디글리세리드의 비제한적인 예는 식물-유래 모노글리세리드 및 디글리세리드 (예를 들어, 해바라기, 코코넛, 땅콩, 목화씨, 올리브, 야자, 평지씨, 홍화, 참깨, 대두, 아몬드, 비치 넛, 브라질 넛, 캐슈, 헤이즐넛, 마카다미아 넛, 몽곤고 넛, 피칸, 잣, 피스타치오, 호두 및 아보카도로부터 유래된 모노글리세리드 및 디글리세리드)를 포함한다. 모노글리세리드 및 디글리세리드는 본원에 열거된 유리 지방산 중 임의의 것의 아실 쇄를 포함할 수 있다. 모노글리세리드 및 디글리세리드의 추가적인 예가 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
유리 지방산의 비제한적인 예는 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산, 세로트산, 미리스톨레산, 팔미톨레산, 사피엔산, 올레산, 엘라이드산, 바센산, 리놀레산, 리노엘라이드산, α-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 에루크산, 도코사헥사엔산, 오메가-지방산 (예를 들어, 아라키돈산, 오메가-3-지방산, 오메가-6-지방산, 오메가-7-지방산, 오메가-9-지방산), 탄소 4-16개 길이의 짝수의 탄소를 갖는 지방산, 단일불포화 산 (특히, 탄소 18개를 갖는 것), 계면 장력이 낮은 지방산 (예를 들어, 20 미만, 15 미만, 11 미만, 9 미만, 7 미만, 5 미만, 3 미만, 2 미만, 1 미만, 또는 0.5 미만의 다인/cm, 0.1 내지 20, 1 내지 15, 2 내지 9, 3 내지 9, 4 내지 9, 5 내지 9, 2 내지 7, 0.1 내지 5, 0.3 내지 2, 또는 0.5 내지 1 다인/cm, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5, 또는 20.0), sn-3에서 에스테르화된 부티르산 (4:0) 또는 카프로산 (6:0), 위치 sn-1 및 sn-2에서 에스테르화된 중쇄 지방산 (8:0-14:0)뿐만 아니라 16:0, 위치 sn-1에 스테아르산 (18:0)이 배치된 지방산, 위치 sn-1 및 sn-3에 올레산 (18:1)이 배치된 지방산, 일정 범위의 탄소 원자를 갖는 지방산 (예를 들어, 8 내지 40개, 10 내지 38개, 12 내지 36개, 14 내지 34개, 16 내지 32개, 18 내지 30개, 또는 20 내지 28개의 탄소 원자), 적어도 1개의 불포화 결합 (즉, 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합; 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 탄소-탄소 이중 결합 및/또는 삼중 결합)을 포함하는 지방산, 공액 불포화 결합 (즉, 적어도 1쌍의 탄소-탄소 이중 및/또는 삼중 결합이 메틸렌 (CH2) 기가 그들 사이에 없으면서 함께 결합됨 (예를 들어, 4CH:CHi CH:CHi))을 갖는 지방산, 및 상기 언급된 지방산의 유도체 (예를 들어, 에스테르 (예를 들어, 메틸 및 에틸 에스테르), 염 (예를 들어, 나트륨 및 칼륨 염), 트리글리세리드 유도체, 디글리세리드 유도체, 모노글리세리드 유도체)를 포함한다. 유리 지방산은 포화 또는 불포화일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유리 지방산은 포유동물로부터 유래되거나 또는 이에 의해 생산되지 않는다. 유리 지방산의 추가적인 예가 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
인지질의 비제한적인 예는 레시틴 인지질 (예를 들어, 대두 레시틴 인지질, 해바라기 레시틴 인지질, 목화 레시틴 인지질, 평지씨 레시틴 인지질, 쌀겨 레시틴 인지질, 옥수수 레시틴 인지질, 밀가루 레시틴 인지질), 카르디올리핀, 세라마이드 포스포콜린, 세라마이드 포스포에탄올아민, 글리세로인지질, 포스파티드산, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스포스핑고지질, 및 포스파티딜세린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 포유동물로부터 유래되거나 또는 이에 의해 생산되지 않는다.
트리글리세리드의 비제한적인 예는 트리부티린, 단쇄 트리글리세리드, 3개의 올레산을 포함하는 단쇄 트리글리세리드; 헥산산을 포함하는 단쇄 트리글리세리드; 헥산산 및 부티르산을 포함하는 단쇄 트리글리세리드; 헥산산 및 데칸산을 포함하는 단쇄 트리글리세리드; 및 1개의 부티르산, 1개의 헥산산 및 1개의 옥탄산을 포함하는 단쇄 트리글리세리드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 중량 기준으로 0.3% 미만, 0.25% 미만, 0.2% 미만, 0.15% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.05% 미만; 0.05% 내지 3%, 2.6%, 2.2%, 1.8%, 1.4%, 1.0%, 0.6%, 0.2%, 또는 0.1%; 0.1% 내지 3%, 2.6%, 2.2%, 1.8%, 1.4%, 1.0%, 0.6%, 또는 0.2%; 0.2% 내지 3%, 2.6%, 2.2%, 1.8%, 1.4%, 1.0%, 또는 0.6%; 0.6% 내지 3%, 2.6%, 2.2%, 1.8%, 1.4%, 또는 1.0%; 1.0% 내지 3%, 2.6%, 2.2%, 1.8%, 또는 1.4%; 1.4% 내지 3%, 2.6%, 2.2%, 또는 1.8%; 1.8% 내지 3%, 2.6%, 또는 2.2%; 2.2% 내지 3%, 또는 2.6%; 또는 2.6% 내지 3%이 유리 지질 함량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 전문가 인간 감각 패널에 의해 결정된 바와 같은 원하는 범위 내에 있는 유리 지질 함량을 갖는다 (예를 들어, 전문가 인간 감각 패널에 의해 산패되지 않은 것으로 결정된 향 및/또는 맛을 갖고; 전문가 인간 감각 패널에 의해 바람직한 것으로 결정된 풍미 프로파일을 갖는다).
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 탄수화물을 추가로 포함한다. 탄수화물의 비제한적인 예는 전분, 가루, 및 식용 섬유를 포함한다. 전분의 비제한적인 예는 말토덱스트린, 이눌린, 프룩토올리고사카라이드, 펙틴, 카르복시메틸 셀룰로스, 구아 검, 옥수수 전분, 귀리 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 완두콩 전분, 및 밀 전분을 포함한다. 가루의 비제한적인 예는 아마란스 가루, 귀리 가루, 퀴노아 가루, 쌀 가루, 호밀 가루, 수수 가루, 대두 가루, 밀 가루, 및 옥수수 가루를 포함한다. 식용 섬유의 비제한적인 예는 대나무 섬유, 보리 겨, 당근 섬유, 감귤 섬유, 옥수수 겨, 가용성 식이 섬유, 불용성 식이 섬유, 귀리 겨, 완두콩 섬유, 쌀 겨, 곡물 껍질, 대두 섬유, 대두 다당류, 밀 겨, 및 목재 펄프 셀룰로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄수화물 중 적어도 일부는 식물로부터 유래된다. 일부 이러한 실시양태에서, 탄수화물 중 적어도 일부는 완두콩으로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 천연 또는 인공 감미제를 추가로 포함한다. 감미제의 비제한적인 예는 스테비아, 아스파탐, 시클라메이트, 사카린, 수크랄로스, 모그로시드, 브라제인, 커큘린, 에리트리톨, 글리시리진, 이눌린, 이소몰트, 라시티톨, 마빈린, 말티톨, 만니톨, 미라큘린, 모나틴, 모넬린, 오슬라 딘, 펜타딘, 소르비톨, 타우마틴, 자일리톨, 아세술팜 포타슘, 아드반탐, 알리탐, 아스파탐-아세술팜, 소듐 시클라메이트, 둘신, 글루신, 네오헤스페리딘 디히드로칼콘, 네오탐, P-4000, 및 탄수화물을 포함하지 않는 감미제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 미네랄을 추가로 포함한다. 미네랄의 비제한적인 예는 지용성 미네랄, 수용성 미네랄, 칼슘, 인, 칼륨, 나트륨, 시트레이트, 클로라이드, 포스페이트, 마그네슘, 칼륨, 아연, 철, 몰리브네넘, 망가니즈, 및 구리를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 유화제를 추가로 포함한다. 유화제의 비제한적인 예는 음이온성 유화제, 비-이온성 유화제, 양이온성 유화제, 양쪽성 유화제, 생물유화제, 스테아르산 유화제, 피커링(Pickering) 유화제, 당지질 (예를 들어, 트레할로스 지질, 소포로리피드, 람노리피드, 만노실에리트리톨 지질), 올리고펩티드 (예를 들어, 그라미시딘 S, 폴리믹신), 지질펩티드 (예를 들어, 서팩틴), 인지질, 지방산, 중성 지질, 중합체성 생물계면활성제, 양친매성 다당류, 지질다당류, 단백질 (예를 들어, 완두콩 단백질, 대두 단백질, 병아리콩 단백질, 조류 단백질, 효모 단백질, 감자 단백질, 렌틸 단백질), 만노단백질, 인산나트륨, 칼슘 스테아로일 락틸레이트, 모노글리세리드의 모노- 및 디아세틸 타르타르산 에스테르, 인지질, 소르비탄 모노스테아레이트, 스테아르산마그네슘, 지방산의 나트륨/칼륨/칼슘 염, 칼슘 스테아로일 디락테이트, 폴리-글리세롤 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 모노글리세리드의 아세트산 에스테르, 모노글리세리드의 락트산 에스테르, 모노글리세리드의 시트르산 에스테르, 지방산의 폴리글리세롤 에스테르, 폴리글리세롤 폴리리시놀레에이트, 지방산의 프로판-1,2-디올 에스테르, 당 에스테르, 지방산의 수크로스 에스테르, 모노글리세리드, 아세틸화 모노글리세리드, 락틸화 모노글리세리드, 디글리세리드, 포스페이트 모노글리세리드, 디아세틸 타르타르산 에스테르, 소듐/칼슘 스테아로일-2-락틸레이트, 암모늄 포스파티드, 폴리소르베이트, 폴리소르베이트-80, 카르복시메틸셀룰로스 (CMC), 조정된 셀룰로스, 시트르산 에스테르, 로커스트 빈 검, 구아 검, 리포산, 에멀산, 레시틴, 계면활성제 (예를 들어, 소르비탄 트리올레에이트 (스팬(Span) 85), 소르비탄 트리스테아레이트 (스팬 65), 소르비탄 세스퀴올레에이트 (아를라셀(Arlacel) 83), 글리세릴 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트 (스팬 80), 소르비탄 모노스테아레이트 (스팬 60), 소르비탄 모노팔미테이트 (스팬 40), 소르비탄 모노라우레이트 (스팬 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트 (트윈(Tween) 65), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레에이트 (트윈 85), 폴리에틸렌 글리콜 400 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60 (트윈 60), 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 80 (트윈 80), 폴리소르베이트 40 (트윈 40), 폴리소르베이트 20 (트윈 20), PEG 20 트리스테아레이트, PEG 20 트리올레에이트, PEG 20 모노스테아레이트, PEG 20 모노올레에이트, PEG 20 모노팔미테이트, 및 PEG 20 모노라우레이트 소르비탄), 및 그의 유도체 및 혼합물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 항산화제를 추가로 포함한다. 항산화제의 비제한적인 예는 천연 항산화제 (예를 들어, α-토코페롤 (예를 들어, 우유에 포함된 토코페롤); 저분자량 티올 (예를 들어, 우유에 포함된 저분자량 티올); 레티놀 (예를 들어, 우유에 포함된 레티놀); TBHQ; 카르테노이드 (예를 들어, 우유에 포함된 카르테노이드); 비타민 E; 아자디라크타 인디카(Azadirachta indica) 추출물; 리보플라빈; 로즈마리 추출물; 로즈마리 추출물에 포함된 페놀계 디테르펜 (예를 들어, 카르노솔, 카르노스산); 세이지 추출물; 아스코르브산 및 그의 염; 락트산 및 그의 염; 포도 잔류물 사일리지; 포도 잔류물 사일리지에 포함된 페놀계 화합물 (예를 들어, 페룰산); 대두 (글리시네 맥스(Glycine max)) 추출물; 대두 추출물에 포함된 이소플라본 또는 폴리페놀계 화합물; 마늘 (알리움 사티붐(Allium sativum)) 추출물; 마늘 추출물에 포함된 황, 페놀계, 플라보노이드 또는 테르페노이드 화합물; 펜넬 (포에니쿨룸 불가리 밀(Foeniculum vulgare Mill.)) 추출물; 캐모마일 (마트리카리아 레쿠티타 엘(Matricaria recutita L.)) 추출물; 갈조류 (예를 들어, 아스코필룸 노도숨, 푸쿠스 베시쿨로수스(Fucus vesiculosus)); 녹색 핑크 페퍼(pink pepper) (GEO)의 필수 오일; 성숙 핑크 페퍼 (MEO)의 필수 오일; 녹차 추출물; 부틸화 히드록시아니솔 (E320); 부틸화 히드록시톨루엔 (E321); 및 카테킨 (예를 들어, 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, C 카테킨, 에피카테킨, 녹차 추출물에 포함된 카테킨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 중량 기준으로 2,000 ppm 미만의 항산화제를 포함한다.
식품 성질
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 pH가 2 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 또는 2.5; 2.5 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 또는 3; 3 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 또는 3.5; 3.5 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 또는 4; 4 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 또는 4.5; 4.5 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 또는 5; 5 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 또는 5.5; 5.5 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 6.5, 또는 6; 6 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 7, 또는 6.5; 6.5 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 7.5, 또는 7; 7 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 8, 또는 7.5; 7.5 내지 10, 9.5, 9, 8.5, 또는 8; 8 내지 10, 9.5, 9, 또는 8.5; 8.5 내지 10, 9.5, 또는 9; 9 내지 10, 또는 9.5; 또는 9.5 내지 10이고, 여기서 pH는 4 중량%의 단백질 함량을 포함하는 탈이온수의 용액에서 측정된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 0.04 내지 0.999, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1; 0.1 내지 0.999, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 또는 0.2; 0.2 내지 0.999, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 또는 0.3; 0.3 내지 0.999, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 또는 0.4; 0.4 내지 0.999, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 또는 0.5; 0.5 내지 0.999, 0.9, 0.8, 0.7, 또는 0.6; 0.6 내지 0.999, 0.9, 0.8, 또는 0.7; 0.7 내지 0.999, 0.9, 또는 0.8; 0.8 내지 0.999, 또는 0.9; 또는 0.9 내지 0.999의 수분 활성도를 갖는다
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 균질화된 식품 (즉, 균질화를 거친 식품)이고, 평균 직경이 0.11 ㎛ 내지 15 ㎛, 12 ㎛, 10 ㎛, 8 ㎛, 6 ㎛, 4 ㎛, 2 ㎛, 1 ㎛, 또는 0.5 ㎛; 0.5 ㎛ 내지 15 ㎛, 12 ㎛, 10 ㎛, 8 ㎛, 6 ㎛, 4 ㎛, 2 ㎛, 또는 1 ㎛; 1 ㎛ 내지 15 ㎛, 12 ㎛, 10 ㎛, 8 ㎛, 6 ㎛, 4 ㎛, 또는 2 ㎛; 2 ㎛ 내지 15 ㎛, 12 ㎛, 10 ㎛, 8 ㎛, 6 ㎛, 또는 4 ㎛; 4 ㎛ 내지 15 ㎛, 12 ㎛, 10 ㎛, 8 ㎛, 또는 6 ㎛; 6 ㎛ 내지 15 ㎛, 12 ㎛, 10 ㎛, 또는 8 ㎛; 8 ㎛ 내지 15 ㎛, 12 ㎛, 또는 10 ㎛; 10 ㎛ 내지 15 ㎛, 또는 12 ㎛; 또는 12 ㎛ 내지 15 ㎛인 분산된 상의 액적을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 식품은 조질 현탁액 식품 (즉, (예를 들어, 콜로이드 밀, 초음파처리기, 회전자 고정자 유닛에서) 고압 균질화를 사용하지 않고 유화된 식품; 예를 들어, 샐러드 드레싱, 마요네즈)이고, 평균 직경이 1 ㎛ 내지 10 ㎛, 9 ㎛, 8 ㎛, 7 ㎛, 6 ㎛, 5 ㎛, 4 ㎛, 3 ㎛, 또는 2 ㎛; 2 ㎛ 내지 10 ㎛, 9 ㎛, 8 ㎛, 7 ㎛, 6 ㎛, 5 ㎛, 4 ㎛, 또는 3 ㎛; 3 ㎛ 내지 10 ㎛, 9 ㎛, 8 ㎛, 7 ㎛, 6 ㎛, 5 ㎛, 또는 4 ㎛; 4 ㎛ 내지 10 ㎛, 9 ㎛, 8 ㎛, 7 ㎛, 6 ㎛, 또는 5 ㎛; 5 ㎛ 내지 10 ㎛, 9 ㎛, 8 ㎛, 7 ㎛, 또는 6 ㎛; 6 ㎛ 내지 10 ㎛, 9 ㎛, 8 ㎛, 또는 7 ㎛; 7 ㎛ 내지 10 ㎛, 9 ㎛, 또는 8 ㎛; 8 ㎛ 내지 10 ㎛, 또는 9 ㎛; 또는 9 ㎛ 내지 10 ㎛인 분산된 상의 액적을 포함한다.
식품 제조
식품을 제조하기 위해 다양한 요리법이 존재하고, 임의의 이러한 요리법이 본원에서 제공된 식품을 생산하기 위해 본원에서 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 재조합 성분을 포함하는 발효 브로스 또는 제제는 통상적으로 사용된 식품 성분 대신에 또는 이에 추가하여 이러한 요리법에서 사용될 수 있다.
본 발명이 그이 특정한 구체적 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 상기 설명은 본 발명의 범주를 예시하고, 제한하지 않도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 범주 내의 다른 측면, 장점, 및 변형이 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 구체적인 실시양태를 예시하도록 포함된다. 실시예에 개시된 기법은 본 발명의 실행에서 잘 기능하는 것으로 본 발명가들에 의해 발견된 기법을 나타낸다; 그러나, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 본 개시내용의 견지에서, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 개시된 구체적인 실시양태에서 다수의 변화가 이루어질 수 있고, 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 실시예에서 기재되거나 제시된 모든 내용은 예시적이고, 제한적이지 않은 의미로 해석되어야 한다.
실시예 1: 정제를 통한 에스테라제 활성의 제거
재조합 β-락토글로불린을 생산할 수 있는 재조합 트리코데르마 리이세이 숙주 세포가 트리코데르마 리이세이 균주의 원형질체를 게놈 통합용으로 표적화되고 유도성 프로모터의 제어 하의 β-락토글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시킴으로써 생성되었다. 재조합 폴리뉴클레오티드의 통합을 선별하는 마커를 포함한 배지에서 형질전환체가 선별되었다.　
재조합 숙주 세포를 재조합 숙주 세포의 성장 및 재조합 β-락토글로불린의 생산 및 분비에 적절한 배양 배지에서 발효시켰다.
발효 브로스를 수집하고, 바이오매스 및 세포 잔해물을 원심분리로 제거하여, 정화된 발효 브로스를 수득하였다. 정화된 발효 브로스로부터 전하 (즉, 이온성 복합체 형성), 열불안정성/열안정성, 및/또는 소수성을 기초로 재조합 β-락토글로불린을 단리하였다.
예를 들어, 전하를 기초로 하는 분리 (즉, 특정 pH 및/또는 이온 강도에서 재조합 β-락토글로불린과 반대되는 전하를 보유하는 입자 (예를 들어, 나트륨 산 염)와의 이온성 복합체 형성 후, 복합체를 단리하고, 단리된 복합체로부터 pH 및/또는 이온 강도 조정을 통해 재조합 β-락토글로불린이 용출됨)에 이어지는 친수성을 기초로 하는 분리 (즉, 재조합 β-락토글로불린 제제를 적절한 pH 및/또는 이온 강도 (예를 들어, 0.8 M Na2SO4)의 페닐 세파로스 칼럼에 로딩하여, 에스테라제가 페닐 세파로스에 결합하도록 허용하고, 가용성 β-락토글로불린을 관류물에서 수집함)에 의해 재조합 β-락토글로불린을 단리하였다. 임의적으로 β-락토글로불린 제제를 분무 건조하여, β-락토글로불린 분말 제제를 수득하였다.
또 다른 예에서, 전하를 기초로 하는 분리 (즉, 특정 pH 및/또는 이온 강도에서 재조합 β-락토글로불린과 반대되는 전하를 보유하는 입자 (예를 들어, 나트륨 산 염)와의 이온성 복합체 형성 후, 복합체를 단리하고, 단리된 복합체로부터 pH 및/또는 이온 강도 조정을 통해 재조합 β-락토글로불린이 용출됨)에 이어지는 열불안정성/열안정성을 기초로 하는 분리 (즉, 적절한 pH 및/또는 이온 강도 (예를 들어, pH 3 및 전도도 < 2 mS/cm (예를 들어, 투석여과에 의해 수득됨))에서 가열 (예를 들어, 20-60분 동안 80-85℃)하여 에스테라제 활성을 침전시킨 후, 침전물을 원심분리를 통해 제거하여, 가용성 β-락토글로불린을 수득함)에 의해 재조합 β-락토글로불린을 단리하였다. 임의적으로 β-락토글로불린 제제를 분무 건조하여, β-락토글로불린 분말 제제를 수득하였다.
β-락토글로불린 분말 제제 (3% w/w)를 코코넛 및/또는 해바라기 오일에 첨가하고, 200 바에서 균질화시켜 에멀션을 형성시킴으로써, β-락토글로불린 제제 내에 포함된 에스테라제 활성을 결정하였다. FFA 키트 (제품# KA1667; 앱노바(Abnova) (대만 타이페이시))를 사용하여 유리 지방산의 존재에 대해 혼합물을 검정하였다.
도 1-4에 나타난 바와 같이, 정제에 의해 수득된 β-락토글로불린 제제가 본질적으로 제거된 에스테라제 활성을 포함하였다.
실시예 2: 배양을 통한 에스테라제 활성의 제거
재조합 β-락토글로불린을 생산할 수 있는 재조합 트리코데르마 리이세이 숙주 세포가 트리코데르마 리이세이 균주의 원형질체를 게놈 통합용으로 표적화되고 유도성 프로모터의 제어 하의 β-락토글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시킴으로써 생성되었다. 재조합 폴리뉴클레오티드의 통합을 선별하는 마커를 포함한 배지에서 형질전환체가 선별되었다.　
재조합 숙주 세포를 재조합 숙주 세포의 성장 및 재조합 β-락토글로불린의 생산 및 분비에 적절한 배양 배지를 포함한 3개의 배양물에서 발효시켰다. 3개의 배양물은 인더스트롤 DF204, 폴리글리콜 P-2000, 및 에롤 DF6000K로 이루어진 목록으로부터 선택된, 배양 배지 내에 포함된 소포제의 유형에서만 서로 상이하였다.
각각의 배양물로부터 발효 브로스를 수집하고, 바이오매스 및 세포 잔해물을 원심분리로 제거하여, 정화된 발효 브로스를 수득하였다. 정화된 발효 브로스 내에 포함된 에스테라제 활성을 본질적으로 제조사의 프로토콜에 따라 pNPL (제품# 61716; 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스) 및 4MUo 검정법 (제품# 75164; 시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스)을 사용하여 결정하였다. 4Muo 검정법의 경우, 20 uL의 정화된 발효 브로스를 백색 96웰 플레이트에서 20 uL 0.1M 아세트산나트륨 완충제 pH 4.3, 및 40 uL 0.1 mM 4MU-o와 합치고, 혼합물을 43℃에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 80 uL 0.1 M 보락스(Borax) 용액 pH 9.22로 켄칭하고, 365 nm에서의 여기 및 450 nm에서의 방출 판독에 의해 형광을 판독하였다. pNPL 검정법의 경우, 40 uL의 pH 4.3의 정화된 발효 브로스를 96웰 PCR 플레이트에서 40 uL 1 mM pNPL 용액과 합치고, 혼합물을 43℃에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 동일한 부피의 0.1 M 보락스 용액 pH 9.22로 켄칭하고, 400 nm에서의 방출 판독에 의해 형광을 판독하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 투키-크레이머 분석은 인더스트롤 DF204 또는 폴리글리콜 P-2000을 소포제로서 이용한 배양물로부터 수득된 정화된 발효 브로스가 에롤 DF6000K를 소포제로서 이용한 배양물로부터 수득된 정화된 발효 브로스보다 유의하게 더 적은 에스테라제 활성을 생산하였음을 실연하였다.
실시예 3: 유전자 변형을 통한 에스테라제 활성의 제거
재조합 β-락토글로불린을 생산할 수 있고 본질적으로 제거된 큐티나제 (예를 들어, cut1 (유니프롯# G0RH85)) 활성을 포함하는 재조합 트리코데르마 리이세이 숙주 세포 ("큐티나제 녹아웃 재조합 숙주 세포")가 재조합 β-락토글로불린을 생산할 수 있는 트리코데르마 리이세이 균주 ("상응하는 재조합 숙주 세포")의 원형질체를 큐티나제 유전자좌에서 상동 재조합에 의해 통합되고 큐티나제 오픈 리딩 프레임을 선별 마커로 교체하도록 조작된 폴리뉴클레오티드 (표적화 벡터)로 형질전환시킴으로써 생성되었다.
표적화 벡터의 일반적인 구조가 도 6에서 제시된다. 표적화 벡터는 트리코데르마 리이세이 게놈 내의 큐티나제 오픈 리딩 프레임에 플랭킹된 상류 및 하류 폴리뉴클레오티드 서열에 상동성인 폴리뉴클레오티드 서열이 플랭킹된 선별 마커 (우라실 보충 없이 성장할 수 있게 하는 pyr4 유전자)를 포함하였다. 상류 및 하류 서열의 서열이 본원에서 각각 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 및 서열식별번호 2로 제공된다.
형질전환체를 최소 배지에서 선별한 후, PCR로 스크리닝하여, 큐티나제 녹아웃 재조합 숙주 세포를 확인하였다. 큐티나제 녹아웃 재조합 숙주 세포 및 상응하는 재조합 숙주 세포를 재조합 숙주 세포의 성장 및 재조합 β-락토글로불린의 생산 및 분비에 적절한 배양 배지에서 발효시켰다. 발효 브로스를 수집하고, 바이오매스 및 세포 잔해물을 원심분리로 제거하고, 정화된 발효 브로스를 수득하였다. 정화된 발효 브로스로부터 전하 (즉, 정전기적 상호작용)를 기초로 재조합 β-락토글로불린을 단리하였다.
큐티나제 녹아웃 균주 및 모체 균주로부터 수득된 β-락토글로불린 제제 내의 큐티나제 활성을 FFA 검정법을 사용하여 검정하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, FFA 검정법에서, 상응하는 재조합 숙주 세포로부터 수득된 β-락토글로불린 제제는 경시적으로 유리 지방산을 생산하였고, 이는 β-락토글로불린 제제 내의 리파제 활성의 존재를 지시한다. 큐티나제 녹아웃 재조합 숙주 세포로부터 수득된 β-락토글로불린 제제에서는 이러한 유리 지방산 생성 (즉, 에스테라제 활성)이 본질적으로 제거되었다.
실시예 4: 사상 진균 세포에서 생산된 재조합 β-락토글로불린을 포함하고 감소된 에스테라제 활성을 추가로 포함하는 아이스크림 조성물.
하기 샘플을 제조하고, 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다:
Figure pct00003
도 9a에 제시된 바와 같이, 사상 진균 세포에 의해 생산된 재조합 β-락토글로불린의 사용은 바람직하지 않은 겔 조성물의 형성에 이르렀다. 또한, 제제에서 산패된 향 및 맛이 발달되었다.
도 9b에 나타난 바와 같이, 재조합 β-락토글로불린의 열-처리가 겔화를 방지하였다 (그리고, 산패된 향 및 맛의 발달을 감소시켰다).
도 9c에 나타난 바와 같이, 제제가 (산패된 향 및 맛과 함께) 다시 겔 조성물을 형성하였다는 점에서 트리아실글리세롤 리파제의 첨가가 재조합 β-락토글로불린의 열-처리의 효과를 무효화하였다.
도 9d에 나타난 바와 같이, 유청으로부터 정제된 소 β-락토글로불린의 사용은 바람직하지 않은 겔 조성물을 제공하지 않았다. 이는 또한 산패된 향 및 맛을 생산하지 않았다.
도 9e에 나타난 바와 같이, 소 β-락토글로불린에 트리아실글리세롤 리파제를 첨가하면 겔 형성 (및 산패한 향 및 맛 생산)에 이르렀다
도 9f에 나타난 바와 같이, 본질적으로 제거된 에스테라제 활성을 포함하는 재조합 β-락토글로불린 제제의 사용은 바람직한 향 및 맛의 바람직한 아이스크림을 제공하였다.
총괄적으로, 데이터는 사상 진균 세포에 의해 생산된 재조합 β-락토글로불린의 제제가 식품 조성물의 질감, 향 및 맛에 해로운 효과를 미치는 에스테라제의 활성을 포함할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 5: 바람직한 감각 프로파일을 제공하는 에스테라제 활성의 확인
재조합 성분 (예를 들어, 재조합 우유 단백질)을 생산할 수 있는 추가적인 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 추가적인 재조합 트리코데르마 리이세이 숙주 세포, 추가적인 재조합 아스페르길루스 니게르 숙주 세포, 추가적인 재조합 트리코데르마 시트리노비리데 숙주 세포, 추가적인 재조합 미셀리오프토라 써모필라 숙주 세포)가 실시예 3에 개시된 것과 유사하지만 표적화된 에스테라제 유전자좌에 특이적인 상류 및 하류 표적화 서열을 포함하는 표적화 벡터를 사용하여, 또는 돌연변이 (예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화, 결실, 또는 삽입)를 에스테라제의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 서열 내로 또는 에스테라제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 내로 도입하여 조정된 (즉, 더 높은 또는 더 낮은) 또는 본질적으로 제거된 에스테라제 활성을 포함하는 재조합 숙주 세포를 생산하는 다른 돌연변이유발 체계를 사용하여, 다른 에스테라제 (예를 들어, 카르복실산 에스테르 히드롤라제 (예를 들어, 유니프롯# G0RBM4, G0RIU1), 포스포리파제 C (예를 들어, 유니프롯# G0REM9), 아세틸에스테라제 (예를 들어, 유니프롯# G0RHJ4), 및 에스테라제의 발현을 조절하는 전사 인자 (예를 들어, 유니프롯# G0RX49), 및 임의의 본원에 개시된 다른 에스테라제, 2개 이상의 이러한 다른 에스테라제의 조합, 및 1개 이상의 이러한 다른 에스테라제와 큐티나제 (예를 들어, 유니프롯# G0RH85)의 조합을 표적화하는 것에 의해 실시예 3에 기술된 바와 같이 생산된다. 본원에 기술된 방법에 따라 이러한 재조합 숙주 세포로부터 재조합 성분 제제가 수득되고, 식품을 제조하는 데 사용된다. 식품을 원하는 감각 성질 (예를 들어, 원하는 냄새, 원하는 맛, 원하는 질감, 원하는 에멀션화)에 대해 테스트하여, 이러한 식품에 바람직한 감각 프로파일을 제공하는 적절한 에스테라제 활성 또는 에스테라제 활성 조합을 확인한다. 특정 식품에 바람직한 감각 프로파일을 제공하는 적절한 에스레라제 활성 또는 에스테라제 활성 조합은 식품의 특정한 조성 (예를 들어, 식품의 특정한 지질 프로파일)에 좌우될 수 있다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 기타 참고문헌은 각각의 개별적인 간행물, 특허, 특허 출원, 서열, 데이터베이스 엔트리 또는 기타 참고문헌이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로, 그리고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선한다. 본원에서 사용된 용어법 및 설명은 특정 실시양태를 기술하기 위한 목적일 뿐이고, 본 발명의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Perfect Day, Inc. <120> RECOMBINANT COMPONENTS AND COMPOSITIONS FOR USE IN FOOD PRODUCTS <130> 26579.23 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1510 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 1 ctagccagaa ggacgcataa acggaagaaa ccccacgagg tcccatgact tctccagagg 60 ccgatctgcc ggcccgttac ccatctgggc atcaagcgga taatgccaat gcatcgtttt 120 tgacaggaaa agcggttggt ttgcggggta ttcgacagcc gagctggggg aagcagaaag 180 gaagcgcggg atggaagcga agaggagcgg ctttgttgct cttttcatgc gagctgtgcg 240 tcaactacag actacagcag gacaggtgcc acaatgacgc cgtacaactg tccggactcg 300 ggctcgagac tcttttccat cacataatat ctccatgagc tgaatcgtgg ctgaggagga 360 gagtttgacg cggcatgttt ctacgttccc cccggctagc ctgtacttac acacacacac 420 tcaaagcctg agggtgttca cggaccgcat atgccgtcta agcgcacaca ccttctcggc 480 ttcttccttg gcttcactct ggtctttttt ctttggcttg tgatgccgag aatctcgttt 540 gtcgttttga tttgagggcg atgagaggga gctgagtcgc gatgccctgc gataaatctt 600 ttgtattcga gtgtgcgagt ctataatgtt gtacgccggc caatcaacta tagcgagccg 660 cgtggcgatc atgacccttg tttgaagtgg acagaactag aagctggctg gcaaggggga 720 ttgtcgagat gtcgtcgctt cagaactgtc agtgctcgag cttgaagatt tgactcaata 780 ccaacgagtc agttcataca atcaggaacc aatgcggata cagagacaga atctgactat 840 catcgccact ttcatcgtcc cagagctcca gagccaacaa acagcatatg acagcggaac 900 tttccccccc tcaaccccag attaaatgct ccgttctgca tagtcagtca cacgcattgg 960 cctctgggcc cccgtcattg gcaccgtctc actggcggat cgccgaggcg ccgcatcgca 1020 aaggggagaa aagacggcac tccagtccgg atctggaagg ttgtttcttg tgatgcggag 1080 gaagcgtggc ccgagagggt gttgcaggat gagcgttgac tcgtcaattg ggccttgagg 1140 ggctgaggat ggagacaata ctagatctgt tgtctgctgc gggcctggtt gatatcgtgg 1200 ggaaagcgtg tgctgcgtaa aggaagcatt cgtcaggtca ggacaggtga ggagtatata 1260 aagagtctgg attgactccg agttctactt cctctcggcc attctctggt gtctcttgga 1320 gcaaaagcag cccttcagcc tctcagcatc ttcactcgca aaaaaaccca cttacaagat 1380 gcggtccttg gccattctca ccaccctcct cgcaggccat gcctttgcat accccaagcc 1440 agccccccag tcagtcaatc gcagggactg gccttcgatc aacgagttcc tctctgagtt 1500 ggccaaggtg 1510 <210> 2 <211> 1503 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 2 gtcttggaga gggttacgga agaggttgtg agagtcaaag tatggagaat gggcgaacat 60 aaaaaaaagg gatcaatgat tgtatatagc gaaagccact gaacatattg tatataagca 120 agcgttatga gatacatcaa tcatgttttg acatatttct ctgccaatag tgtacaatgt 180 gtagacttaa gcaaactcga atcaattcat cgctcatcta caagaaacat acaagattgt 240 ttctcatgtg tctttataaa gacagtgacc gtccacctct caagtccgat aacttatgca 300 tcatcaaagt ttcttacttg cggccgataa gctcaaggta gtgttcaaca acagagactg 360 tcatctcttc aaaagacttg aacttaaagc caaactcctt ctcagccttt gtcgaatcga 420 tatgcaccgg gatcgaaaca ggccggggaa cggactcgaa cttaaagatg ccgtcggcat 480 aagcctccgg gaagtgcctc ttcacaatct caaaagtctc agcccagtcg atggattcag 540 tgggatgagc acaagcgaga tagtcctggt tccccttgac gttcggcccc agggcaagga 600 catgcatctt tgcaacatcg tcgacgtgga cggcgacgcc gggaagagga tcacggggca 660 cgcccaggag agggtccatg atgatgccgt tggtgccctt ggagatgttg gcggggtcgg 720 tgacggtgtc gtcgcggccg atgacgaaga cggggaggat gttgacgacg gagaaggcgg 780 gcttcttctc ggcgatgaac ttttccgtgg cctggaaggc gagggctttg gaggcgacat 840 aggcggcgat gctggaggca aaggggcctt ccgtgttgga ggcacgggtt tgttctgttg 900 acgagcggta agtcagaatt gacccctatt tctggaggca taacaggaag aggaaggagg 960 atttagctag ctgcatatgc tgggaagaaa gacataccgt tgaccttgac tcccgaggcc 1020 agggcctcga aagaggcaat ggaaaggaca gatgcggtga tgacaatctt ttcgatccca 1080 gagaccttga ttgcagactc caggatgcca accgtgccct ggacggcggg ccggatgatc 1140 tcagcctggc atgcctcatc accttcgacc gtcggggagg ctaggggtga agcaacgtga 1200 acgacatatt tgacgccctt gacagcttca tcgtaggcac ctggaacaat gatgttgggg 1260 acaatgatgc tctcgacttg tgagaggtaa ggcgcaagag gcttgaggct cgagatgcgt 1320 tcgaagccgg cctgggtacg gacggcggcg cggacattgt agccagcctt gacgagttcg 1380 acgagggtcc tgaagccaat catgccagtg gcaccagtga gctaaatagg ggacgtggtt 1440 gttagttggc gagggatcgg gtggagcatt tgtgtgtata tccgtgttgc tccggctcaa 1500 gac 1503

Claims (104)

  1. 재조합 성분을 생산할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 성분을 포함하는 식품을 생산하는 방법이며, 에스테라제의 활성이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 에스테라제가 단일 에스테라제인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 에스테라제가 적어도 2개의 에스테라제를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 에스테라제가 카르복실산 에스테르 히드롤라제를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 카르복실산 에스테르 히드롤라제가 유니프롯(UniProt) 서열 G0RIU1, A2R1N7, G0RBM4, A0A2T4BBP9, G2Q379, A0A2T4AZ21, A2R8Z3, G0R9X3, A2QPC2, G0RCG3, A0A2T4BCL7, A0A2T4B416, 및 A0A2T4BNI9로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 에스테라제가 트리아실글리세롤 리파제를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 트리아실글리세롤 리파제가 유니프롯 서열 A2QM14 및 A2R709로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 에스테라제가 포스포리파제 A2를 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 포스포리파제 A2가 유니프롯 서열 A2QIF8에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 에스테라제가 라이소포스포리파제를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 라이소포스포리파제가 유니프롯 서열 G0RX90, G2Q0K1, A0A2T4B235, A2QC75, 및 A2QF42로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 에스테라제가 아세틸에스테라제를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 아세틸에스테라제가 유니프롯 서열 G0RHJ4, A0A2T4BJD9, 및 G2QL32로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 에스테라제가 포스포리파제 C를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 포스포리파제 C가 유니프롯 서열 G0REM9, A0A2T4BFY3, 및 A2QAD7로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 에스테라제가 큐티나제를 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 큐티나제가 유니프롯 서열 G0RH85, A2QBP1, A0A2T4BJB5, A5ABE6, A2R2W3, 및 G2QH51로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  18. 없음
  19. 제1항에 있어서, 에스테라제의 활성이 본질적으로 제거되는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 에스테라제의 활성이 감소되는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 에스테라제의 활성이 증가되는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 에스테라제의 활성이 본질적으로 제거되는 제1 에스테라제의 활성 및 감소되는 제2 에스테라제의 활성을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 에스테라제의 활성이 본질적으로 제거되는 제1 에스테라제의 활성 및 증가되는 제2 에스테라제의 활성을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 에스테라제의 활성이 감소되는 제1 에스테라제의 활성 및 증가되는 제2 에스테라제의 활성을 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 에스테라제 활성이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계가 재조합 미생물 숙주 세포를 에스테라제 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 데 적절한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 적절한 조건이 적절한 소포제의 존재를 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 소포제가 ACP 1500, 안티폼(Antifoam) 204, 에롤(Erol) DF6000K, 호닥(Hodag) K-60K, 인더스트롤(Industrol) DF204, P-2000E, SAG 471, SAG 5693, SAG 710, SAG 730, 실리콘 안티폼, 스트룩톨(Struktol) J647, 스트룩톨 J673A, 및 해바라기 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 에스테라제 활성이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계가 상응하는 재조합 미생물 숙주 세포 내에 포함된 에스테라제의 활성에 비교하여 에스테라제의 활성을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 유전자 변형을 포함하는 재조합 미생물 숙주 세포에서 재조합 성분을 생산하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 재조합 미생물 숙주 세포가 재조합 사상 진균 숙주 세포인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 재조합 사상 진균 숙주 세포가 재조합 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 숙주 세포, 재조합 미셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) 숙주 세포, 재조합 트리코데르마 리이세이(Trichoderma reesei) 숙주 세포, 및 재조합 트리코데르마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) 숙주 세포로 이루어진 군으로부터 유래되는 것인 방법.
  31. 제1항에 있어서, 에스테라제 활성이 본질적으로 제거되거나 또는 조정되는 적어도 1개의 단계가 에스테라제로부터 재조합 성분을 정제하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  32. 제1항에 있어서, 재조합 성분이 재조합 단백질인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 재조합 단백질이 재조합 식물 단백질, 재조합 조류 단백질, 재조합 진균 단백질, 재조합 미생물 단백질, 및 재조합 동물 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 재조합 동물 단백질이 재조합 우유 단백질인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 재조합 우유 단백질이 재조합 유청 단백질인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 재조합 유청 단백질이 α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토페린, 트랜스페린, 혈청 알부민, 락토페록시다제, 및 글리코마크로펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 재조합 우유 단백질이 재조합 카세인인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 재조합 카세인이 β-카세인, γ-카세인, κ-카세인, α-S1-카세인, 및 α-S2-카세인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  39. 제1항에 있어서, 재조합 성분 및 상응하는 제제에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제의 활성을 포함하는 제제를 수득하기 위해 재조합 성분을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 제제가 원하는 풍미, 원하는 향, 원하는 질감, 원하는 에멀션화, 원하는 영양 함량, 및 원하는 저장 수명으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성질을 식품에 제공하도록 최적화된 에스테라제 활성 프로파일을 포함하는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 제제가 분말인 방법.
  42. 재조합 성분을 생산할 수 있고, 상응하는 재조합 미생물 숙주 세포 내에 포함된 에스테라제의 활성 또는 발현에 비교하여 에스테라제의 활성 또는 발현을 본질적으로 제거하거나 또는 조정하는 유전자 변형을 포함하는 재조합 미생물 숙주 세포.
  43. 제42항에 있어서, 에스테라제가 단일 에스테라제인 재조합 미생물 숙주 세포.
  44. 제42항에 있어서, 에스테라제가 적어도 2개의 에스테라제를 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  45. 제42항에 있어서, 에스테라제가 카르복실산 에스테르 히드롤라제를 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  46. 제45항에 있어서, 카르복실산 에스테르 히드롤라제가 유니프롯 서열 G0RIU1, A2R1N7, G0RBM4, A0A2T4BBP9, G2Q379, A0A2T4AZ21, A2R8Z3, G0R9X3, A2QPC2, G0RCG3, A0A2T4BCL7, A0A2T4B416, 및 A0A2T4BNI9로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  47. 제42항에 있어서, 에스테라제가 트리아실글리세롤 리파제를 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  48. 제47항에 있어서, 트리아실글리세롤 리파제가 유니프롯 서열 A2QM14 및 A2R709로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  49. 제42항에 있어서, 에스테라제가 포스포리파제 A2를 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  50. 제49항에 있어서, 포스포리파제 A2가 유니프롯 서열 A2QIF8에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  51. 제42항에 있어서, 에스테라제가 라이소포스포리파제를 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  52. 제51항에 있어서, 라이소포스포리파제가 유니프롯 서열 G0RX90, G2Q0K1, A0A2T4B235, A2QC75, 및 A2QF42로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  53. 제42항에 있어서, 에스테라제가 아세틸에스테라제를 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  54. 제53항에 있어서, 아세틸에스테라제가 유니프롯 서열 G0RHJ4, A0A2T4BJD9, 및 G2QL32로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  55. 제42항에 있어서, 에스테라제가 포스포리파제 C를 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  56. 제55항에 있어서, 포스포리파제 C가 유니프롯 서열 G0REM9, A0A2T4BFY3, 및 A2QAD7로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  57. 제42항에 있어서, 에스테라제가 큐티나제를 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  58. 제57항에 있어서, 큐티나제가 유니프롯 서열 G0RH85, A2QBP1, A0A2T4BJB5, A5ABE6, A2R2W3, 및 G2QH51로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  59. 제42항에 있어서, 에스테라제의 활성이 본질적으로 제거되는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  60. 제42항에 있어서, 에스테라제의 활성이 감소되는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  61. 제42항에 있어서, 에스테라제의 활성이 증가되는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  62. 제42항에 있어서, 에스테라제의 활성이 본질적으로 제거되는 제1 에스테라제의 활성 및 감소되는 제2 에스테라제의 활성을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  63. 제42항에 있어서, 에스테라제의 활성이 본질적으로 제거되는 제1 에스테라제의 활성 및 증가되는 제2 에스테라제의 활성을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  64. 제42항에 있어서, 에스테라제의 활성이 감소되는 제1 에스테라제의 활성 및 증가되는 제2 에스테라제의 활성을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  65. 제42항에 있어서, 유전자 변형이 에스테라제 또는 에스테라제의 발현에 요구되는 단백질의 발현을 구동시키는 제어 서열 또는 그의 기능적 부분에서의 유전자 변형, 에스테라제의 발현에 요구되는 단백질 또는 그의 기능적 부분을 코딩하는 코딩 서열에서의 유전자 변형, 에스테라제 또는 그의 기능적 부분을 코딩하는 코딩 서열에서의 유전자 변형, 에스테라제의 내인성 억제제의 발현을 구동시키는 제어 서열 또는 그의 기능적 부분에서의 유전자 변형, 에스테라제의 내인성 억제제를 코딩하는 코딩 서열에서의 유전자 변형, 및 에스테라제의 이종성 억제제를 코딩하는 코딩 서열을 도입하는 유전자 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  66. 제42항에 있어서, 유전자 변형이 에스테라제의 발현을 조절하는 전사 인자의 발현을 구동시키는 제어 서열 또는 그의 기능적 부분, 또는 이러한 전사 인자 또는 그의 기능적 부분을 코딩하는 코딩 서열에서의 유전자 변형인 재조합 미생물 숙주 세포.
  67. 제66항에 있어서, 전사 인자가 유니프롯 서열 G0RX49, G0RHG1, A0A2T4B416, A0A2T4BJU6, A2R2J1, A2R903, G2Q2Z5, 및 G2Q8I6으로부터 선택된 서열에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  68. 제42항에 있어서, 재조합 미생물 숙주 세포가 재조합 사상 진균 숙주 세포인 재조합 미생물 숙주 세포.
  69. 제68항에 있어서, 재조합 사상 진균 숙주 세포가 재조합 아스페르길루스 니게르 숙주 세포, 재조합 미셀리오프토라 써모필라 숙주 세포, 재조합 트리코데르마 리이세이 숙주 세포, 및 재조합 트리코데르마 시트리노비리데 숙주 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  70. 제42항에 있어서, 재조합 성분이 재조합 단백질인 재조합 미생물 숙주 세포.
  71. 제70항에 있어서, 재조합 단백질이 재조합 식물 단백질, 재조합 조류 단백질, 재조합 진균 단백질, 재조합 미생물 단백질, 및 재조합 동물 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  72. 제71항에 있어서, 재조합 동물 단백질이 재조합 우유 단백질인 재조합 미생물 숙주 세포.
  73. 제72항에 있어서, 재조합 우유 단백질이 재조합 유청 단백질인 재조합 미생물 숙주 세포.
  74. 제73항에 있어서, 재조합 유청 단백질이 α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토페린, 트랜스페린, 혈청 알부민, 락토페록시다제, 및 글리코마크로펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  75. 제72항에 있어서, 재조합 우유 단백질이 재조합 카세인인 재조합 미생물 숙주 세포.
  76. 제75항에 있어서, 재조합 카세인이 β-카세인, γ-카세인, κ-카세인, α-S1-카세인, 및 α-S2-카세인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물 숙주 세포.
  77. 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 성분을 포함하는 식품이고, 상응하는 식품에서의 에스테라제의 활성에 비교하여 본질적으로 제거되거나 또는 조정된 에스테라제의 활성을 추가로 포함하는 식품.
  78. 제77항에 있어서, 에스테라제가 단일 에스테라제인 식품.
  79. 제77항에 있어서, 에스테라제가 적어도 2개의 에스테라제를 포함하는 것인 식품.
  80. 제77항에 있어서, 식품에 본질적으로 에스테라제의 활성이 없는 것인 식품.
  81. 제77항에 있어서, 에스테라제의 활성이 감소된 것인 식품.
  82. 제77항에 있어서, 에스테라제의 활성이 증가된 것인 식품.
  83. 제77항에 있어서, 식품이 유제품 대용물인 식품.
  84. 제83항에 있어서, 유제품 대용물이 우유, 요거트, 치즈, 유제품 스프레드, 크림, 빙과, 버터, 및 유제품 분말로 이루어진 군으로부터 선택된 유제품의 대용물인 식품.
  85. 제77항에 있어서, 식품이 우유 단백질 성분을 포함하는 것인 식품.
  86. 제85항에 있어서, 우유 단백질 성분이 적어도 1개의 재조합 우유 단백질을 포함하는 것인 식품.
  87. 제85항에 있어서, 적어도 1개의 재조합 우유 단백질이 단일 재조합 우유 단백질인 식품.
  88. 제87항에 있어서, 단일 재조합 우유 단백질이 재조합 β-락토글로불린인 식품.
  89. 제87항에 있어서, 단일 재조합 우유 단백질이 재조합 α-락트알부민인 식품.
  90. 제87항에 있어서, 단일 재조합 우유 단백질이 재조합 κ-카세인인 식품.
  91. 제87항에 있어서, 단일 재조합 우유 단백질이 재조합 β-카세인인 식품.
  92. 제87항에 있어서, 단일 재조합 우유 단백질이 재조합 γ-카세인인 식품.
  93. 제85항에 있어서, 적어도 1개의 재조합 우유 단백질이 2개의 재조합 우유 단백질인 식품.
  94. 제93항에 있어서, 2개의 재조합 우유 단백질이 재조합 β-락토글로불린 및 재조합 α-락트알부민인 식품.
  95. 제93항에 있어서, 2개의 재조합 우유 단백질이 재조합 κ-카세인 및 재조합 β-카세인인 식품.
  96. 제93항에 있어서, 2개의 재조합 우유 단백질이 재조합 κ-카세인 및 재조합 γ-카세인인 식품.
  97. 제93항에 있어서, 2개의 재조합 우유 단백질이 재조합 β-카세인 및 재조합 γ-카세인인 식품.
  98. 제93항에 있어서, 2개의 재조합 우유 단백질이 재조합 β-락토글로불린 및 재조합 κ-카세인인 식품.
  99. 제93항에 있어서, 2개의 재조합 우유 단백질이 재조합 κ-카세인 및 재조합 α-락트알부민인 식품.
  100. 제93항에 있어서, 2개의 재조합 우유 단백질이 재조합 β-락토글로불린 및 재조합 β-카세인인 식품.
  101. 제93항에 있어서, 2개의 재조합 우유 단백질이 재조합 β-카세인 및 재조합 α-락트알부민인 식품.
  102. 제93항에 있어서, 2개의 재조합 우유 단백질이 재조합 β-락토글로불린 및 재조합 γ-카세인인 식품.
  103. 제93항에 있어서, 2개의 재조합 우유 단백질이 재조합 γ-카세인 및 재조합 α-락트알부민인 식품.
  104. 제77항에 있어서, 바람직한 감각 프로파일을 식품에 부여하는 원하는 범위 내에 있는 유리 지질 함량을 포함하는 식품.
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