JP2000505302A

JP2000505302A - ガラクタナーゼ活性を有する酵素

Info

Publication number: JP2000505302A
Application number: JP9530528A
Authority: JP
Inventors: ヴェンケコフデ，レーン; サカリカピネン，マーカス; ノンボエアンデルセン，レン; グロスクラウセン，イブ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 2000-05-09
Also published as: WO1997032013A1; US6329185B1; AU713323B2; CN1212012A; AU1871897A; CA2246728A1; EP0896616A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ガラクタナーゼ活性を有する酵素、ガラクタナーゼ活性を有する酵素をコードするDNA構築物、上記酵素の製法、ガラクタナーゼ活性を有する上記酵素を含む酵素製剤、上記ガラクタナーゼを含む界面活性剤製剤、及び多くの産業用途のための上記酵素及び酵素製剤の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ガラクタナーゼ活性を有する酵素発明の分野本発明は、ガラクタナーゼ活性を有する酵素、上記ガラクタナーゼ活性を有する酵素をコードするDNA構築物、上記酵素の製法、上記ガラクタナーゼ活性を有する酵素を含む酵素製剤、並びに多くの産業用途のための上記酵素及び酵素製剤の使用に関する。本発明の背景ガラクタン(Galactans)及びアラビノガラクタン（arabinogalactans）は、ペクチン毛状領域（pectic hairy regions）の成分としてほとんどの植物内に存在する。それらは、通常、その毛状領域のラムノガラクツロナン（rhamnogalactur onan）骨格内のラムノース（rhamnose）残基のＯ−４に付着されている。その側鎖の分布及び組成は、異なる細胞型及び生理学的状態の間でかなり変化するが、一般に、ラムノガラクツロナン領域内のラムノジル(rhamnosyl)単位の約半分は、付着された側鎖をもつ。ガラクタン側鎖は、ほとんどの植物において、１型ガラクタンであり、これは、いくつかの分枝点及び60までの糖単位(Saccharide un its(DP60))の長さをもつβ−１，４−結合ガラクトピラノースから成る。アラビノフラノース残基又は短いアラビナン・オリゴマーは、そのガラクトジル単位のＯ−３においてガラクタン鎖に付着されることができ、これ故、アラビノガラクタンと命名されている。ガラクタン（又はアラビノガラクタン）は、１次細胞壁において重要な機能をもち、ここでは、それらは、その細胞壁の他の構造成分、例えば、キシログルカン、又はアラビノキシランと相互作用する。従って、それらは、たぶん、細胞壁中のペクチン・マトリックスをつなぎ留めるのに役立っている。さらに、それらは、水和及び水結合能力を増加させ、そして多孔度と受動拡散の調節にとって重要であると考えられるペクチン・ポリマー間の鎖間会合を減少させる。(Carpita & Gibeaut，1993，Plant J.，3，1-30；O'Neill et al.，1990，Methods in Plan t Biochemistry，415-441；Selvendran，1993，The Chemistry of Plant Cell Walls．Dietary Fibers；Hwang et al.，Food Hydrocolloids，7，39-53；Fry， 1988，The growing Plant Cell Wall：Chemical and Metabolic Analysis)。ｂ−１，４−ガラクタナーゼ（E.C.3.2.1.89）は、ガラクタン（及びアラビノガラクタン）を分解し、そしてさまざまな微生物源から精製されている（Nakano et al.，1985，Agric．Biol．Chem.，49，3445-3454；Emi & Yamamoto，1972， Agric．Biol．Chem.，36,1945-1954；Araujo & Word，1990，J．Ind．Microbiol .，6，171-178；Van De Vis et al.，1991，Carbohydr．Polym.，16，167-187）。多くのｂ−１，４−ガラクタナーゼが精製されているけれども、１のみがクローン化され、そしてDNAが配列決定されている。 WO 92／13945は、真菌ｂ−１，４−ガラクタナーゼ（アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus)）のクローニング及びDNA配列決定について記載している。本発明の要約本発明に従えば、本発明者らは、今般、最初に、ガラクタナーゼ活性を示す酵素をコードする、、担子菌(Basidiomycota)からの、DNA配列を単離し、そして特徴付けることに成功し、これにより、単成分ガラクタナーゼ製剤を製造することを可能にした。従って、第１の側面においては、本発明は、ガラクタナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含むDNA構築物であって、そのDNA配列が、（ａ）エシェリキア・コリ(Escherichia coli)DSM 10355内に存在するプラスミドpYES 2.0内にクローン化されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分；（ｂ）配列番号：１内の１〜1026位又はより好ましくは55〜1026位に示される DNA配列又はその相補鎖；（ｃ）上記DNA配列と少なくとも70％の相同性をもつ（ａ）又は（ｂ）内に定められたDNA配列のアナログ；（ｄ）低ストリンジェンシーにおいて配列番号：１内の１〜1026位に示される DNA配列とハイブリダイズするDNA配列；（ｅ）遺伝子コードの縮重のために、（ｂ）又は（ｄ）の配列とハイブリダイズしないが、上記DNA配列の中のいずれかによりコードされたポリペプチドと同じアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするDNA配列；又は（ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）又は（ｅ）に特定するDNA配列の対立形態（allelic form）又は断片であるDNA配列、を含む、前記DNA構築物に関する。ガラクタナーゼをコードする全長DNA配列は、糸状菌メリピラス・ギガンテウス(Meripilus giganteus)の株から誘導されており、そしてEscherichia coli株D SM No．10355内に存在するプラスミドpYES 2.0内にクローン化されている。 Escherichia coli DSM 10355内に宿されたDNA配列をコードする上記ガラクタナーゼは、配列番号：１内に提示されたものと同じ配列をもつと信じられる。従って、DSM 10355内に存在するプラスミドpYES 2.0内にクローン化されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分に言及するとき、その言及は、配列番号：１内に提示されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分を含むことも意図される。従って、用語“DSM 10355内に存在するプラスミドpYES 2.0内にクローン化されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分”と“配列番号：１内に提示されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分”は、互換使用されることができる。さらなる側面においては、本発明は、本発明に係るDNA構築物を宿す発現ベクター、上記DNA構築物又は上記発現ベクターを含む細胞、並びにガラクタナーゼ活性を示す酵素の製法であって、その酵素の製造を許容する条件下で上記細胞を培養し、そしてその培養物から上記酵素を回収することを含む方法を提供する。さらなる側面においては、本発明は、以下の：（ａ）Escherichia coli DSM 10355内に存在するプラスミドpYES 2.0内にクローン化されたDNA配列のガラクタナーゼ酵素コーディング部分によりコードされたポリペプチド；（ｂ）配列番号：２の19〜342位に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）上記ポリペプチドと少なくとも70％の相同性をもつ（ａ）又は（ｂ）に定義されたポリペプチドのアナログ；そして（ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）の対立形態又は断片、から成る群から選ばれたガラクタナーゼ活性を示す単離酵素を提供する。さらなる側面においては、本発明は、さまざまな産業用途のための本発明に係る酵素又は酵素製剤の使用に関する。最後に、本発明は、糸状菌メリピラス・ギガンテウス(Meripilus giganteus)の株由来のガラクタナーゼ・コーディング配列（Escherichia coli DSM 10355内に存在するプラスミドpYES 2.0内にクローン化されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分）を宿すEscherichia colin DSM No．10355、又は上記ガラクタナーゼ・コーディング能力を保持している上記E．coli株のいずれかの突然変異体の単離された実質的に純粋な生物学的培養物に；並びに配列番号：１として提示されたDNA配列が由来するところの糸状菌メリピラス・ギガンテウスCBS No．521.95の単離された実質的に純粋な生物学的培養物に関する。定義さらに詳細に本発明について討議する前に、まず、以下の用語を定義する。 “DNA 構築物”：用語“DNA構築物”とは、DNAのセグメントをその天然の位置からそれが再生産されるであろう異なる部位に配置し直すために遺伝子操作において使用される標準的なクローニング手順に従ってクローン化されたDNA配列をいう。このクローニング方法は、所望のDNAセグメントの切除及び単離、そのベクター分子内へのDNA片の挿入、及びDNAセグメントの多コピー又はクローンが複製されるであろうところの細胞内への組換えベクターの取り込みを含む。本発明に係る“DNA構築物”は、他に、“クローン化されたDNA配列”又は“単離されたDNA配列”ともいわれる。 “〜から得られた”：本発明の目的のためには、特定の微生物源に関して本明細書中に使用するとき、用語“〜から得られた”とは、酵素が、特定の源により、又はその源からの遺伝子がその中に挿入されている細胞により生産されることを意味する。 “単離されたポリペプチド”：本明細書中に定義するとき、本発明のガラクタナーゼについて使用するとき、用語“単離されたポリペプチド”又は“単離されたガラクタナーゼ”とは、SDS−PAGEにより測定されるとき、少なくとも約20％純度の、好ましくは少なくとも約40％純度の、より好ましくは約60 ％純度の、さらにより好ましくは約80％純度の、最も好ましくは約90％純度の、そしてさらに最も好ましくは約95％純度のガラクタナーゼ又はガラクタナーゼ部分をいう。用語“単離されたポリペプチド”は、他に“精製されたポリペプチド ”ともいわれる。 “相同不純物(Homologous impurities)”：本明細書中に使用するとき、用語 “相同不純物”は、本発明に係る酵素が元来そこから得られるところの相同（異体同形）細胞に起源をもついずれかの不純物（例えば、本発明に係る酵素以外のポリペプチド）を意味する。本発明においては、上記異体同形細胞は、例えば、メリピラス・ギガンテウスの株であることができる。 “ガラクタナーゼ・コーディング部分”：本明細書中に使用するとき、DNA配列に関して使用される用語“ガラクタナーゼ・コーディング部分”は、ポリペプチド配列に翻訳される領域に対応するDNA配列の領域を意味する。配列番号：１内に示すDNA配列内では、それは、最初の“ATG”開始コドン（mRNAにおいては“ AUG”コドン）と以下の終止コドン（“TAA”，“TAG”又は“TGA”）の間の領域である。換言すれば、これは、翻訳されたポリペプチドである。翻訳されたポリペプチドは、ガラクタナーゼ活性を示す成熟配列に加えて、Ｎ −末端シグナル配列を含む。このシグナル配列は、一般に、そのポリペプチドの分泌を導く。さらなる情報については、（Stryer，L.，“Biochemistry”W．H. ，Freeman and Company/NewYork，ISBN 0-7167-1920-7）を参照のこと。本文脈においては、用語“ガラクタナーゼ・コーディング部分” は、翻訳さたポリペプチド及びその成熟部分をカバーすることを意図される。 “ガラクタナーゼ”：本文脈においては、ガラクタナーゼは、EC−番号：3.2. 1.89をもつものとして、酵素分類（EC）に従って定義される。公式名：ARABINOGALACTAN ENDO-1，4-BETA-GALACTOSIDASE 別名：ENDO-1,4-BETA-GALACTANASE GALACTANASE ARABINO GALACTANASE 触媒される反応：アラビノガラクタン内の１，４−ベータ−Ｄ−ガラクトシド結合の分子内加水分解本発明の詳細な説明 DNA 構築物本発明は、ガラクタナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含むDNA構築物であって、そのDNA配列が、（ａ）エシェリキア・コリ(Escherichia coli)DSM 10355内に存在するプラスミドpYES 2.0内にクローン化されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分；（ｂ）配列番号：１内の１〜1026位又はより好ましくは55〜1026位に示される DNA配列又はその相補鎖；（ｃ）上記DNA配列と少なくとも70％の相同性をもつ（ａ）又は（ｂ）内に定められたDNA配列のアナログ；（ｄ）低ストリンジェンシーにおいて配列番号：１内の１〜1026位に示される DNA配列とハイブリダイズするDNA配列；（ｅ）遺伝子コードの縮重のために、（ｂ）又は（ｄ）の配列とハイブリダイズしないが、上記DNA配列の中のいずれかによりコードされたポリペプチドと同じアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするDNA 配列；又は（ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）又は（ｅ）に特定するDNA配列の対立形態（allelic form）又は断片であるDNA配列、を含む、前記DNA構築物を提供する。 DSM 10355内に存在するプラスミドpYES 2.0内にクローン化されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分は、配列番号：１に提示されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分と同一であると、今日、信じられている。従って、用語“DSM 10355内に存在するプラスミドpYES 2.0内にクローン化されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分”と“配列番号：１に提示されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分”は、互換使用されることができる。 DNA配列は、ゲノム、cDNA、又は合成起源又はそれらのいずれかの組合せ物から成ることができる。本発明は、遺伝子コードの縮重のためにそのDNA配列が配列番号：１と相違する、配列番号：２の成熟部分（すなわち、19−342位）として示すアミノ酸配列をもつガラクタナーゼ活性を示す酵素をコードするクローン化されたDNA配列をも包含する。配列番号：１に示すDNA配列及び／又は本発明のアナログDNA配列は、微生物、例えばバクテリア、酵母又は糸状菌から得られることができる。好ましくは、それは糸状菌から得られ、そして好適なものの例を、“微生物源(Microbiolsource s)”の章（以下参照）中に与える。あるいは、類似配列は、配列番号：１のガラクタナーゼ・コーディング部分として提示されたDNA配列に基づき構築されることができ、例えば、そのサブ配列であり、そして／又はそのDNA配列によりコードされたガラクタナーゼの他のアミノ酸配列を生じないが、その酵素の生産を意図された宿主生物のコドンの用い方に一致するヌクレオチド置換の挿入、又は異なるアミノ酸配列を生じさせることができるヌクレオチド置換の導入により構築されることができる。ヌクレオチド置換が行われるとき、アミノ酸の変更は、好ましくは、僅かな性質を有するもの、すなわち、そのタンパク質の折り畳み又は活性に有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換、典型的には１〜約30アミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の伸長、例えば、アミノ−末端メチオニン残基、約20〜25残基までの小さなリンカー・ペプチド、又は精製を容易にする小さな伸長、例えば、ポリ−ヒスチジン特性、抗原性エピトープ又は結合性ドメインである。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えば、グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）及び小さなアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）の群内のものである。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、例えば、Ford et al.，(1991)，Protein Expression an d Purification 2，95-107を参照のこと。このような置換がその分子の機能に決定的な領域の外側で行われることができ、そして未だ活性なポリペプチドをもたらすことは、当業者にとって明らかであろう。本発明に係るDNA構築物によりコードされポリペプチドの活性に不可欠なアミノ酸であって、そしてそれ故置換に供されないものは、本分野において知られた手順、例えば、部位指定突然変異誘発又はアラニン・スキャニング突然変異誘発（例えば、Cunningham and Wells，(1989)，Science 244，1081-1085参照）に従って、同定されることができる。後者の技術においては、突然変異誘発は、その分子内の残基のそれぞれにおいて導入され、そして得られた突然変異分子は、その分子の活性に決定的なアミノ酸残基を同定するために生物学的（すなわち、ガラクタナーゼ）活性についてテストされる。基質−酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学又はフォトアフィニティー・ラベリングの如き技術（例えば、de Vos et al.，(19 92)，Science 255，306-312；Smith et al.，(1992)，J．Mol．Biol．224，899- 904；Wlodaver et al.，(1992)，FEBS Lett．309，59-64参照）により測定されるような結晶構造の分析により測定されることもできる。上記（ｃ）に言及したDNA配列のホモロジーは、第１の配列の、第２の配列からの逸脱を示す、２つの配列間の同一性の程度として測定される。ホモロジーは、好適には、本分野に知られたコンピューター・プログラム、例えば、GCGプログラム・パッケージにおいて提供されるGAP(Program Manual for the Wiscon $i n Package,Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science D rive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S．B．and Wunsch，C．D. ，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)により、測定されることができる。DNA配列比較のための以下の設定：5.0のGAP創出ペナルティー及び0 .3のGAP伸長ペナルティーを用いたGAPを使用することにより、先に言及した類似 DNA配列のコーディング領域は、配列番号：１に示すDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分と、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80 ％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも97％の同一性の程度を示す。少なくとも低ストリンジェンシー条件下であるが、好ましくは、中又は高ストリンジェンシー条件において、配列番号：１に示すDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分、すなわち、ヌクレオチド1〜1026にハイブリダイズする上記（ｄ）に定めたような類似DNA配列を定めるための先に言及されたハイブリダイゼーション条件は、以下詳細に説明するようなものである。ヌクレオチド・プローブと相同的DNA又はRNA配列との間の低、中、又は高ストリンジェンシーにおけるハイブリダイゼーションを測定するために好適な実験条件は、10分間５×SSC(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Sambrook et al． 1989)中でハイブリダイズさせるためのDNA断片又はRNAを含有するフィルターの事前含浸、及び５×SSCの溶液、５×Denhardt's溶液（Sambrook et al．1989）、0.5％SDS及び100μｇ／mlの変性音波処理サケ精子DNA（Sambrook et al．1989 ）中での上記フィルターの事前ハイブリダイゼーション、その後の、約45℃における12時間の、ランダム−プライムされ(Feinberg，A．P．and Vogelstein，B．（1983）Anal．Biochem．132：6-13)、³²Ｐ−dCTP−ラベルされた（比活性＞１ ×10⁹cpm／μg）プローブの10ng／mlの濃度を含む同一溶液中でのハイブリダイゼーションを含む。次にこのフィルターを、２×SSC、０.5％SDS中で30分間、２回、少なくとも55℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも60℃ （中ストリンジェンシー）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（中／高ストリンジェンシー）、さらにより好ましくは少なくとも70℃（高ストリンジェンシー）、そしてさらにより好ましくは少なくとも75℃（極高ストリンジェンシー）で洗浄する。上記条件下でそのオリゴヌクレオチド・プローブがそれにハイブリダイズするところの分子は、Ｘ線フィルムを使用して検出される。本発明に係るポリペプチドの先に言及したポリペプチドのホモロジー(特性(c) )は、第１の配列の、第２の配列からの逸脱を示す２つの配列間の同一性の程度として測定される。ホモロジーは、好適には、本分野に知られたコンピューター・プログラム、例えば、GCGプログラム・パッケージにおいて提供されるGAP（Pr ogram Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin,USA 53711)(Needle man，S．B．and Wunsch，C．D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48， 443-453）により、測定されることができる。ポリペプチド配列比較のための以下の設定：3.0のGAP創出ペナルティー及び0.1のGAP伸長ペナルティーを用いたGA Pを使用することにより、本発明に係る類似DNA配列によりコードされるポリペプチドの成熟部分は、配列番号：２に示すアミノ酸配列の成熟部分、すなわち配列番号２内の19〜342位と、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、特に少なくとも97％の同一性の程度を示す。本発明は、配列番号：２に示すアミノ酸配列の成熟部分から、３以下のアミノ酸、好ましくは２以下のアミノ酸、そしてより好ましくは１以下のアミノ酸程、相違するアミノ酸配列をもつガラクタナーゼ変異体にも関する。本発明のガラクタナーゼをコードするDNA配列は、例えば、Sambrook et al.， (1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab．；Cold Spring Harbor，NYにより記載されるような標準的な方法を使用してエシェリキア・コリ(Escherichia coli)DS M No．10355株から単離されることができる。本発明に係るガラクタナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列は、 −着目のガラクタナーゼを生産すると予想されるいずれかの生物からのcDNAライブラリーを、好適なベクター内で、クローニングし、 −上記ベクターで好適な酵母宿主細胞を形質転換し、 −好適な条件下で上記宿主細胞を培養して、cDNAライブラリー中のクローンによりコードされたいずれかの着目の酵素を発現させ、 −このようなクローンにより生産された酵素のいずれかのガラクタナーゼ活性を測定することにより、陽性クローンにいてスクリーニングし、そして −このようなクローンから上記酵素をコードするDNAを単離する、ことを含むいずれかの一般的な方法により、単離されることもできる。一般的な単離方法は、WO 93／11249又はWO 94／14953(それらの内容をここに引用により取り込む）中に開示されている。上記スクリーニング方法のより詳細な説明を、以下の実施例１に与える。あるいは、本発明に係るガラクタナーゼをコードするDNAは、周知の手順に従って、便利には、本明細書中に開示するDNA配列に基づき調製された合成オリゴヌクレオチド・プローブの使用により、好適な源、例えば下記生物のいずれかから、単離されることができる。例えば、好適なオリゴヌクレオチド・プローブは、配列番号：１として提示されたヌクレオチド配列のガラクタナーゼ・コーディング部分又はそのいずれかの好適なサブ配列に基づき、又はアミノ酸配列、配列番号：２に基づき、調製されることができる。微生物源好ましい態様においては、ガラクタナーゼをコードするDNA配列は、サルノコシカケ（Polyporaceae）科に属する株から得られる。これは、entrez browser N CBI分類学バージョン３，３（アップデート12.13.95）に従えば、アフィロフォラレ(Aphyllophorales)目内の科であって、担子菌類(Basidiomycota)の下帽菌類 (Hymenomycetes)綱に属するものである。現在、本発明の酵素に相同な酵素をコードするDNA配列、すなわち類似のDNA配列は、他の微生物から得られることができるということが企図されている。例えば、DNA配列は、他の微生物、特に真菌、例えば、アスペルギルス(Aspergillus) 種、特にアスペルギルス・アクレアタス（A．aculeatus）又はアスペルギルス・ニガー（A．niger）の株、フィトフトーラ（Phytophthora）種の株、特に、フィトフトーラ・インフェスタンス（P．infestans）、フィトフトーラ・メガスパーマ(P．megasperma)、フィトフトーラ・カクトラム(P．cactorum)の株、又はタラロミセス(Talaromyces)種の株、特にタラロミセス・ビソクラミドイデス(T．bys sochlamydoides)、タラロミセス・エマーソニ（T．emersonii）の株、サーモアスカス(Thermoascus)種の株、特にサーモアスカス・アウランティアカス（T．au rantiacus）の株、スポロトリチャム（Sporotrichum）種の株、特にスポロトリチャム・セルフィラム（S．celluphilum）の株又はペニシリウム(Penicillium) 種の株、特に、ペニシリウム・シトリナム(P．citrinum)、ペニシリウム・カメンバーチ(P．camembertii)又はペニシリウム・ロクエフォーチ(P．roquefortii) の株のcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることにより得られることができる。本発明に係るガラクタナーゼがそこから得られるところのメリピラス・ギガンテウス（Meripilus giganteus）の株の単離は、Centraalbureau voor Schimmelc ultures，P．0．Box 273，3740 AG Baarn，The Netherlands，(CBS)に特許手続の目的をもって微生物の国際的承認に関するブダペスト条約に従って本発明者により寄託されている。寄託日：04.07.95 寄託者番号：NN 006040 CBS名：メリピラス・ギガンテウス(Meripilus giganteus) CBSNo．521.95 さらに、本発明に係るガラクタナーゼをコードする全体長DNA配列を含む発現プラスミドpYES 2.0は、Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultu ren GmbH.，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Federal Republic of Germany，（DSM）に特許手続の目的をもって微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って本発明者により寄託されたエシェリキア・コリ（Esch erichia coli）の株に形質転換されている。寄託日：06.12.95 寄託者番号：NN 049142 DSM名：エシェリキア・コリ（Escherichiacoli）DSM No. 10355 発現ベクター他の側面においては、本発明は、本発明に係るDNA構築物を含む組換え発現ベクターを提供する。本発明に係る発現ベクターは、便利には組換えDNA手順に供されるいずれかの発現ベクターであることができ、そしてベクターの選定は、その中にそれが導入されるであろう宿主細胞にしばしば依存するであろう。従って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の存在物として存在するベクターであって、その複製が染色体の複製から独立しているもの、例えば、プラスミドであることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入されるとき、その宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、そしてその中にそれが組み込まれるところの染色体と一緒に複製されるものであることができる。発現ベクター内では、ガラクタナーゼをコードするDNA配列は、好適なプロモーター及びターミネーター配列に作用可能な状態で接続されなければならない。プロモーターは、選ばれた宿主細胞内で転写活性を示すいずれかのDNA配列であることができ、そして宿主細胞に対し同種又は異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子から得られることができる。ガラクタナーゼをコードするDN A配列、プロモーターとターミネーターをそれぞれライゲートし、そしてそれらを好適なベクター内に挿入するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Sambrook et al.，(1989)，Molecular Cloning．A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor，NY参照）。糸状菌宿主細胞内での使用のために好適なプロモーターの例は、例えば、ADH3 プロモーター(McKnight et al.，The EMBO J．4(1985)，2093-2099)又はtpi Aプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、TAKAアミラーゼ、リゾムコー・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillusn iger)中性ａ−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定性ａ−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori) グルコアミラーゼ(glu A)、リゾムコー・ミエヘイ・リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ・アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ・トリオース・ホスフェート・イソメラーゼ又はアスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼをコードする遺伝子から得られるものである。宿主細胞さらに他の態様においては、本発明は、本発明に係るDNA構築物及び／又は本発明に係る組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明の宿主細胞は、真核細胞、特に真菌細胞、例えば酵母又は糸状菌細胞である。特に、細胞は、トリコダーマ(Trichoderma)、好ましくはトリコダーマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)又はトリコダーマ・レーセイ(Trichoderma reeseiの種、又はアスペルギルス(Aspergillus)の種、最も好ましくはアスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)又はアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、又はフザリウム(Fusarium)の種、最も好ましくは、P CT／US／95／07743中にさらに記載されたようなフザリウムATCC 20334の同定特徴をもつフザリウム種に属することができる。真菌細胞は、それ自体知られたやり方で、プロトプラスト形成及びそのプロトプラストの形質転換、その後の細胞壁の再生を含む方法により形質転換されることができる。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用は、EP 238 023(Novo No rdisk A/S)(この内容を引用によりここに取り込む)中に記載されている。宿主細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス(Saccharomyces)の株、特にサツカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）又はサッカロミセス・ウバラム（Saccharomyces uvarum）、シゾサッカロミセス(S chizosaccharomyces)種の株、例えば、シゾサッカロミセス・ポンブ(Schizosaccharomyces pombe)、ハンセヌラ(Hans enula)種の株、ピチア（Pichia）種の株、ヤローウィア（Yarrowia）種の株、例えばヤローウィア・リポリティカ(Yarrowia lypolytica)、クルイベロミセス(Kl uyveromyces)種の株、例えばクルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces la ctis）であることもできる。ガラクタナーゼの製法本発明は、本発明に係る単離酵素の製法であって、その酵素をコードするDNA 配列により形質転換されている好適な宿主細胞を、その酵素の産生を許容する条件下で培養し、そして得られた酵素をその培養物から回収する、前記製法を提供する。上記酵素をコードするDNA配列を含む発現ベクターが異種宿主細胞内に形質転換されるとき、本発明に係る酵素の異種組換え体製造を可能にすることができる。それにより、異体同種（相同）不純物を有しないことを特徴とする、高精製ガラクタナーゼ製剤を作ることができる。本発明においては、相同宿主細胞は、メリピラス・ギガンテウス（（Meripilu s giganteus）の株であることができる。形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、着目の宿主細胞を培養するために好適ないずれかの慣用培地であることができる。発現されたガラクタナーゼは、便利にはその培養基上に分泌されることができ、そして遠心分離又は濾過によりその培地から細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムにより培地のタンパク質成分を沈殿させ、その後クロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィーその他を含む周知の手順によりそれから回収されることができる。酵素製剤さらなる側面においては、本発明は、植物細胞壁成分の分解のために有用な酵素製剤であって、上記のようなガラクタナーゼ活性を示す酵素に富む製剤に関する。このやり方で、酵素製：剤の細胞壁分解能力の強化（boosting）が得られることができる。本発明に係る酵素に富む酵素製剤は、例えば多酵素活性を含む酵 lluclast又はCelluzyme(全てNovo Nordisk A/Sから入手可能なもの）を含むものであることができる。本文脈において、用語“富む(enriched)”とは、便利には、上記方法により調製された本発明に係る酵素の添加により、例えば、1.1の濃縮率をもって、酵素製剤のガラクタナーゼ活性が高められていることを意図している。本発明に係る酵素製剤は、本発明に係るガラクタナーゼに加えて、１以上の他の酵素、例えば、キシラン分解(xylanolytic)、又はペクチン分解（pectinolyti c）活性をもつもの、例えば、ａ−アラビノシダーゼ、ａ−グルクロンシダーゼ、フィターゼ(phytase)、キシラン・アセチル・エステラーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ(rhamnogalacturonase)、ペクチン・アセチルエステラーゼ、ガラクタナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチン・リアーゼ、ペクテート・リアーゼ、グルカナーゼ、ペクチン・メチルエステラーゼ、ラッカーゼ、又はオキシドレダクターゼを含むことができる。追加の酵素は、アスペルギルス属、好ましくはアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アクレアタス、アスペルギルス・アワモリ又はアスペルギルス・オリザエ、又はトリコダーマ、又はフミコーラ・インソレンスに属する微生物により産生されることができる。あるいは、ガラクタナーゼ活性を示す酵素に富む酵素製剤は、主要な酵素成分として本発明に係る酵素を含むもの、例えば、１成分酵素製剤であることができる。酵素成分は、本分野において知られた方法に従って調製され、そして液体又は乾燥組成物の形態にあることができる。例えば、酵素製剤は、粒状物又は微粒状物の形態にあることができる。本製剤中に含まれるであろう酵素は、本分野において知られた方法に従って安定化されることができる。本発明に係る酵素製剤の好ましい使用の例を、以下に与える。本発明に係る酵素製剤の投与量及び本製剤が使用されるところの他の条件は、本分野において知られた方法に基づいて決定されることができる。本発明に係る酵素製剤は、以下の目的の中の少なくとも１のために有用であることができる。植物材料の分解又は修飾本発明に係る酵素製剤は、好ましくは、本発明に係るガラクタナーゼの高い植物細胞壁分解活性のために、植物細胞壁又は植物細胞壁から生じるいずれかのガラクタン含有材料の分解又は修飾のための剤として、使用される。本発明に係るガラクタナーゼは、ガラクタン内のｂ−１，４細胞を加水分解する。ガラクタンは、ｂ−１，４結合ガラクトースから成る骨格をもつ多糖類である。この骨格は、側分枝（sidebranches）、例えば、アラビノースをもつことができる。側分枝の組成及び数は、そのガラクタンの源に従って変化する。（Step hen，A．M.，1983，ch．3 in The Polysaccharides，Vol．2，Ed．Aspinall，G. O.）。ガラクタナーゼによるガラクタンの分解は、その側分枝の全体的又は部分的除去により容易化される。アラビノース側基は、温やかな酸処理により又はアルファ−アラビノシダーゼにより除去されることができる。上述のように本ガラクタナーゼにより又はガラクタナーゼと側分枝加水分解性酵素との組合せにより解放されるオリゴマーは、ベータ−ガラクトシダーゼによりさらに遊離のガラクトースに分解されることができる。本発明に係るガラクタナーゼは、オリゴ糖類の製造のためにガラクタンを分解するために、他のペクチン分解又はヘミセルロース分解酵素を伴わずに、又は限定された活性の他のペクチン分解又はヘミセルロース分解酵素を伴って、使用されることができる。上記オリゴ糖類は、大豆細胞壁材料から放出された又は植物材料からのいくぶん精製されたアラビノガラクタンのアラビノガラクタン・オリゴ糖類のような、バルキング剤として使用されることができる。本発明に係るガラクタナーゼは、ガラクタンをガラクトース及び他の単糖類に分解するために他のペクチン分解又はヘミセルロース分解酵素と共に使用されることができる。本発明に係るガラクタナーゼは、単独で、又は油に富む植物材料からの油、例えば、大豆からの大豆油、オリーブからのオリーブ油又はナタネからのナタネ油又はヒマワリからのヒマワリ油の抽出を改善するために、グルカナーゼ、ペクチナーゼ及び／又はヘミセルラーゼのような他の酵素と共に使用されることができる。本発明のガラクタナーゼは、植物細胞材料の成分の分離のために使用されることができる。特に重要なのは、（サトウ・ダイコン（sugar beet）からのスクロース又はポテトからのデンプンの如き）商業的にかなり重要な成分及び（パルプ又は穀皮（hull）画分の如き）あまり重要でない成分への、糖又はデンプンに富む植物材料の分離である。また、特に重要なのは、タンパク質に富む又は油に富む農作物の、貴重なタンパク質及び油並びにあまり重要でない穀皮画分への分離である。この分離方法は、本分解に知られた方法の使用により行われることができる。本発明のガラクタナーゼは、収率を増加させるためのフルーツ又は野菜ジュースの製造において、そして例えば、ワイン又はジュース製造からの、各種植物細胞壁から得られた材料又は廃材料、又は農業残物、例えば植物外皮、穀皮、サトウ・ダイコン・パルプ、オリーブ・パルプ、ポテト・パルプ、その他の酵素的加水分解において、使用されることもできる。植物材料は、異なる種の加工を改善するために、かんきつ類からのペクチンの精製の如きガラクタン以外の成分の精製又は抽出を容易にするために、飼料価（ feed value）を改善するために、水結合能を減少させるために、廃水プラント内での分解性を改善するために、エンシレージ（ensilage）への植物材料の変換を改善するために、その他のために、分解されることができる。本発明に係る酵素調製物によって、加工されたフルーツ又は野菜のコンシステンシー及び外観を調節することができる。コンシステンシーと外観は、加工のために使用される酵素の実際の組合せの結果、すなわち、本発明に係るガラクタナーゼがそれと組合せられるところの酵素の特異性であることが示されている。例は、例えば、リンゴ、ナシ又はイチゴからの清澄ジュース；例えば、リンゴ、ナシ、イチゴ、かんきつ類又はトマトからの濁った安定性のジュース；及び例えば、ニンジンとトマトからのピューレの製造を含む。本発明に係るガラクタナーゼは、植物細胞壁から得られた材料の粘度の修飾において使用されることができる。例えば、ガラクタナーゼは、ガラクタンを含む飼料の粘度を減少させるために、そして粘性ガラクタン含有材料の加工を促進するために使用されることができる。この粘度の減少は、ガラクタン含有材料の全体的又は部分的分解のために好適な条件下で本発明に係る酵素調製物によりガラクタン含有植物材料を処理することにより得られることができる。ガラクタナーゼは、例えば、植物繊維からペクチン物質の除去のために、他の酵素と共に、使用されることができる。この除去は、例えば、織物繊維（textil e fibres）又は他のセルロース性材料の製造において不可欠である。この目的のために、植物繊維材料は、その植物繊維材料と会合するペクチン物質の全体的又は部分的分解のために好適な条件下で本発明に係るガラクタナーゼの好適な量で処理される。動物飼料添加物本発明に係るガラクタナーゼは、動物飼料の修飾のために使用されることができ、そして（その飼料の成分を修飾することにより）インビトロにおいて又はインビボにおいてそれらの効果を発揮することができる。ガラクタナーゼは、多量のアラビノガラクタン又はガラクタンを含有する動物飼料組成物、例えば、大豆、ナタネ、ルピナスの種子からの植物材料を含有する飼料への添加のために特に好適である。上記飼料に添加されるとき、本ガラクタナーゼは、植物細胞壁材料のインビボ分解をかなり改善し、これにより、動物による植物栄養のよりよい利用が達成される。これにより、その動物の成長速度及び／又は飼料変換比（すなわち、体重増加分に対する摂取された飼料の重量）が改善される。例えば、摂取可能なガラクタンは、例えば、動物により消化されることができるガラクトース又はガラクトオリゴマーに、例えばβ−ガラクトシダーゼと共に、ガラクタナーゼにより分解され、そしてこれ故、飼料の利用可能なエネルギーに貢献する。また、ガラクタンの分解により、ガラクタナーゼは、非炭水化物飼料構成成分、例えば、タンパク質、脂肪及びミネラルの消化能力及び取り込みを改善することができる。さらなる説明のために、PCT／DK96／00443及び本明細書中の実施例を参照することができる。ワインとジュースの加工本発明に係る酵素調製物は、野菜又はフルーツ・ジュース、特にリンゴ又はナシ・ジュースにおける脱ペクチン化及び粘度減少のために使用されることができる。これは、上記フルーツ又は野菜ジュース中に含まれるペクチン含有材料を分解するために有効な量において本発明に係る酵素調製物により上記フルーツ又は野菜ジュースを処理することにより達成されることができる。本酵素調製物は、マッシュ（mash）の抽出性又は分解性を改善するために、フルーツ及び野菜からのマッシュの処理において使用されることができる。例えば、本酵素調製物は、ジュース製造のためのリンゴ及びナシからのマッシュの処理において、そしてワイン製造のためのグレープのマッシュ処理において使用されることができる。１成分ガラクタナーゼの利点以上から、本発明に係るガラクタナーゼが、商業的に入手可能なガラクタナーゼ含有ペクチン分解、ヘミセルロース分解又はセルロース分解酵素調製物中に通常存在することが判明しているペクチン・メチルエステラーゼ及び他のペクチン分解酵素の如き他の酵素活性を本質的に含まない１成分酵素調製物として製造されることができる。この理由のために、本発明に係るガラクタナーゼの使用は、このような他の酵素活性の作用が不所望であるような目的のために特に有利である。例は、濁って安定なジュースの製造及びピューレの製造を含む。これらの製造においては、例えば、慣用のペクチン分解酵素調製物中の副活性として通常見い出されるペクチン・メチル・エステラーゼの存在が、濁って安定なジュース中の濁りの減少された安定性をもたらし、又はピューレ中の離液(syneresis)を引き起こす。さらに、その実質的な純度のために、本発明に係るガラクタナーゼは、ガラクタンを含有するペクチンの一部だけが分解されるであろうような方法で、ペクチンを修飾するために使用されることができる。慣用のペクチン分解活性が存在したとしたならば、ペクチンのより広範な分解が、そのペクチンの粘度増加又はゲル化能力における得られた減少により得られることができるであろう。最後に、実質的に純粋なガラクタナーゼは、飼料のために使用される植物材料からガラクトース及びガラクトオリゴマーを選択的に解放するために使用されることができる。ガラクトースは、動物により容易に消化される。ガラクタナーゼに加えてガラクタナーゼ活性をもつ慣用のペクチン分解又はヘミセルロース分解酵素製剤は、例えば、飼料中不所望であるキシロース及びガラクツロン酸を産生するエンド−とエクソ−酵素の混合物を含む。本発明を、以下の実施例においてさらに詳細に記載する。これらは、請求されるものとして本発明の範囲をいかなる方法においても限定しないと意図される。材料と方法寄託された生物：メリピラス・ギガンテウス（（Meripilusgiganteus）CBS No．521.95は、本発明に係るガラクタナーゼ・コーディングDNA配列を含む。シャトル・ベクターpYES 2.0内に、本発明に係るガラクタナーゼをコードする、全体長DNA配列を含むプラスミドを含むエシェリキア・コリ（Esc herichia coli）DSM 10355。他の株：酵母株：使用されたサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）株は、W3124(MATa；ura 3-52；leu 2-3，112；ｈis 3-D200；pep 4-1137；prc l::HIS3；prb1::LEU2；Cir+)。 E．coli株：DH5a（Life Technologies A/S，Roskilde，Denmark) プラスミド：アスペルギルス発現ベクターpHD414は、（EP 238 023中に記載された）プラスミドp775の誘導体である。pHD414の構築は、WO 93／11249中にさらに記載されている。 pYES 2.0（Invitrogen） pAZG55（実施例１参照）一般的分子生物学的方法：特にことわらない限り、DNA操作と形質転換を、分子生物学の標準的な方法を使用して行った(Sambrook et al．(1989)Molecular cloning：A laboratory man ual，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F．M．et al．（eds.）“Current protocols in Molecular Biology”．John Wiley and S ons，1995；Harwood，C．R.，andCutting，S．M．（eds.）“Molecular Biologi cal Methods for Bacillus”．John Wiley and Sons，1990)。 DNA操作のための酵素を、供給者の取扱説明書に従って使用した。 DNA操作のための酵素特にことわらない限り、DNA操作のための全ての酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ等は、New England Biolabs，Incから得られる。 mRNA単離のためのメリピラス・ギガンテウスCBSNo．521.95の発酵手順：メリピラス・ギガンテウスCBS No．521.95を、外成長菌糸を含むプレートから、100mlセルロース含有培地PD液体ブロス(24gポテト・デキストロース・ブロス、Difco 0549，1000mlまでの脱イオン水；オートクレーブ(15〜20分間121℃))を含む振とうフラスコ内に、接種した。この培養物を５日間26℃において発酵させた。得られた培養ブロスをミラクロスを通して濾過し、そしてその菌糸を液体窒素中で凍結させた。 mRNAを(H．Dalboege et al Mol．Gen．Genet（1994）243：253-260．；WO 93 ／11249；WO 94／14953)中に記載されたように上記カルチャーからの菌糸を単離した。全RNAの抽出を、チオシアン酸グアニジンを用いて、その後の５.7Ｍ CsClクッションを通しての超遠心分離により行い、そしてポリ（A）⁺RNAの単離を、WO 94 ／14953中に記載された手順を使用したオリゴ（dT）−セルロース・アフィニティー・クロマトグラフィーにより行う。 cDNA合成：２本鎖cDNAを、RNase H法（Gubler and Hoffman（1983）Gene 25： 263-269，Sambrook et al．（1989）Molecular cloning：A laboratory manual ，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY）により５mgポリ(A)⁺RNA から合成する。ポリ(A)^- RNA（5mlのDEPC−処理水中５mg）を事前にシリコーン処理したRNase不含エッペンドルフ管内で８分間70℃で加熱し、氷上でクエンチし、そして1mM dATP，dGTP及びdTTP、及び0.5mM５−メチル−dCTP(Pharmacia)、40単位のヒト胎盤リボヌクレアーゼ・インヒビター(RNas in，Promega)、1.45mgのオリゴ(dT)₁₈−NotIプライマー(Pharmacia)及び1000単位のSuper Script II RNase H逆転写酵素（Bethesda Research Laboratories）を含む逆転写酵素バッファー(50mM Tris−Cl、pH8.3、75mM KCI、3mM MgCl₂、10 mM DTT,，Bethesda Research Laboratories)と、50mlの最終容量において併合した。第１ストランドcDNAを、45℃において１時間上記反応混合物をインキュベートすることにより合成する。合成後、mRNA:cDNAハイブリッド混合物を、製造者の取扱説明書に従って、MicroSpin S−400HR(Pharmacia)スピン・カラムを通してゲル濾過する。ゲル濾過後、ハイブリッドを、20OmMの各dNTP、60単位のE．coli DNAポリメラーゼI（Pharmacia）、5.25単位のRNase H（Promega）及び15単位のE．coli DNA リガーゼ(Boehringer Mannheim)を含む250mlの第２ストランド・バッファー(20m M Tris−Cl、pH7.4、90mM KC1、4.6mM MgCl₂、10mM（NH₄）₂SO₄、0.16mM bNAD+) 中で希釈する。第２ストランドcDNA合成を、16℃で２時間、そして25℃でさらに 15分間、上記反応管をインキュベートすることにより行う。この反応を、20mMの最終濃度までのEDTAの添加、その後のフェノール及びクロロホルム抽出により停止させた。ヤエナリ(Mung bean)ヌクレアーゼ処理：２本鎖cDNAを、２容量の96％EtOH、0 .2容量の10Ｍ NH₄Acの添加により−20℃において12時間沈殿させ、遠心分離により回収し、70％EtOH中で洗浄し、乾燥させ、そして25単位のMung beanヌクレアーゼ(Pharmacia)を含む30ml Mung beanヌクレアーゼ・バッファー(30mM NaAc、p H4.6、300mM NaCl、1mM ZnSO、0.35mM DTT、２％グリセロール）中に再懸濁させる。上記１本鎖ヘアーピンDNAを、30℃で30分間上記反応物をインキュベートすることにより刈り込み(clipped)、その後、70mlの10mM Tris−Cl、pH7.5、１mM EDTAの添加、フェノール抽出、そして氷上30分間、２容量の96％EtOH及び0.1容量の３ＭNaAcによる沈殿を行う。 T4 DNAポリメラーゼによるブラント末端化：２本鎖cDNAを、遠心分離により回収し、そして16℃で１時間その反応混合物をインキュベートすることにより、0. 5mMの各dNTP及び５単位のT4 DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を含む30ml T4 DNAポリメラーゼ・バッファー(20mM Tris−アセテート、pH7.9、10mM MgAc 、50mM KAc、１mM DTT)中でブラント末端化する。この反応を、20mMの最終濃度までのEDTAの添加により停止させ、その後、フェノール及びクロロホルム抽出、及び２容量の96％Et0H及び0.1容量の３Ｍ NaAc pH5.2の添加により−20℃における12時間の沈殿を行う。アダプター・ライゲーション、NotI消化及びサイズ選択：フィル−イン反応後、cDNAを遠心分離により回収し、70％EtOH中で洗浄し、そして乾燥させる。cDNAペレットを、2.5mg非パリンドローム性BstXIアダプター（ Invitrogen）と30単位のT4リガーゼ(Promega)を含む25mlのライゲーション・バッファー(30mM Tris−Cl、pH7.8、10mM MgCl₂、10mM DTT、0.5mM ATP)中に再懸濁させ、そして16℃で12時間インキュベートした。この反応を、65℃で20分間加熱することにより停止させ、そして次に氷上で５分間冷却する。アダプトされた cDNAを、20mlの水、５mlの10×NotI制限酵素バッファー(New England Biolabs) 及び50単位のNotI(New England Biolabs)の添加により、NotI制限酵素で消化し、その後37℃で2.5時間インキュベートする。この反応を、65℃で10分間加熱することにより停止させる。このcDNAを、ライゲートされていないアダプターと小さなcDNAとを分離するために、１×TBE中、0.8％ Sea Plaque GTG低融点アガロース・ゲル(FMC)上でゲル電気泳動によりサイズ分画する。このcDNAを、0.7kbにおけるカット−オフを用いてサイズ選択し、そして製造者の取扱説明書に従ってｂ−アガラーゼ(New England Biolabs)の使用によりそのゲルから奪還(rescued)し、そして２容量の96％EtOHと0.1容量の３Ｍ N aAc、pH 5.2を添加することにより−20℃で12時間沈殿させる。ライブラリーの構築：指向性のサイズ選択されたcDNAを、遠心分離により回収し、70％EtOH中で洗浄し、乾燥させ、そして30mlの10mM Tris−Cl、pH7.5、１mM EDTA中に再懸濁させる。このcDNAを、製造者の取扱説明書に従ってMicro Spin S−300 HR(Pharmacia)スピン・カラムを通してのゲル濾過により脱塩する。３つのテスト・ライゲーションを、５ml ２本鎖cDNA（反応管＃１と＃２）、15単位のＴ４リガーゼ(Promega)及び30ng（管＃１）、40ng（管＃２）と40ng（管＃３、ベクター・バックグラウンド対照）のBstXI−NotI解裂pYES 2.0ベクターを含む10mlライゲーション・バッファー(30mM Tris−CI、pH7.8、10mM MgCl₂、10mM DTT、0.5mM ATP)中で行う。このライゲーション反応を、16℃、12時間でのインキュベーション、70℃、20分間での加熱、及び各管への10mlの水の添加により行う。１mlの各ライゲーション混合物を、記載されたように40mlの電気コンピテントなE．coli DH10B細胞（Bethesda research Laboratories）中にエレクトロポレーションする(Sambrook et al．（1989）Molecular cloning：A laboratory m anual，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY)。最適な条件を使用して、プールを構成するE．coli内で樹立する。各プールを、37℃で24時間のインキュベーション後、15.000〜30.000コロニー／プレートを与えるLB＋アンピシリン寒天プレート上に形質転換されたE．coliを広げることにより行う。20ml LB＋アンピシリンを上記プレートに添加し、そして上記細胞をその中に懸濁させる。細胞懸濁液を、37℃で１時間50mlの管内で振とうする。プラスミドDNAを、QIAGENプラスミド・キットを使用して製造者の取扱説明書に従い上記細胞から単離し、そして−20℃で保存する。個々のプールからの精製プラスミドDNAの１mlアリコートを、エレクトロポレーション(Becker and Guarante（1991）Methods Enzymol．194：182-187)により S．cerevisiae W 3124内に形質転換させ、そしてその形質転換体を、２％グルコースを含むSC寒天上にプレートし、そして30℃でインキュベートする。陽性クローンの同定：上記形質転換体を、0.1％AZCLガラクタン(Megazyme，Australia)及び２％ガラクトースを含むSC寒天上にプレートし、そして30℃で３〜５日間インキュベートする。ガラクタナーゼ陽性コロニーを、青色ハロー(blue halo)により囲まれたコロニーとして同定する。アスペルギルス内での発現のためのcDNA遺伝子の単離：ガラクタナーゼ産生酵母コロニーを、50mlガラス試験管内の20mlYPDブロス中に接種する。この管を２日間30℃で振とうする。これらの細胞を、3000rpmで10 分間の遠心分離により収穫する。 DNAをWO 94／14953に従って単離し、そして50ml水中に溶解させる。DNAを、標準的な手順によりE．coliに形質転換させる。プラスミドDNAを、標準的な手順を使用してE．coliから単離し、そして制限酵素分析により分析する。cDNA挿入物を、適当な制限酵素を使用して切除し、そしてアスペルギルス発現ベクター内にライゲートする。アスペルギルス・オリザエ又はアスペルギルス・ニガーの形質転換プロトプラストを、WO 95／02043，p.16，line21〜page17，１ine 12中に記載されたように調製することができる（これを引用によりここに取り込む）。 100μｌのプロトプラスト懸濁液を、10μｌのSTC（1.2Ｍソルビトール、10mM Tris−HCl、pH＝7.5、10mM CaCl₂）中の適当なDNAの５〜25μｇと混合する。プロトプラストを、着目のアスペルギルス発現ベクターと混合する。この混合物を 25分間室温で放置し、0.2mlの60％PEG 4000(BDH 29576)、10mM CaCl₂及び10mM T ris−HCl、pH7.5を添加し、そして注意して（２回）混合し、そして最後に0.85m lの同一溶液を添加し、そして注意して混合する。この混合物を、25分間室温で放置し、2500ｇで15分間回転させ、そしてそのペレットを、２mlの1.2Mソルビトール中に再懸濁させる。もう１回沈殿させた後、そのプロトプラストを、1.0Mスクロース、pH7.0、窒素源としての10mMアセトアミド、及びバックグラウンド成長を阻害するための20mMのCsClを含む最小プレート（Cove，Biochem．Biophys． Acta 113（1966）51-56）上に広げる。37℃で４〜７日間インキュベートした後、胞子を拾い上げ、そして単一コロニーについて広げる。この手順を繰り返し、そして２番目の再単離の後の単一コロニーの胞子を、定められた形質転換体として保存する。Ａ．oryzae形質転換体のテスト各形質転換体を、10mlのYPM(以下、参照)中に接種し、そして増殖させる。30 ℃で２〜５日間インキュベートした後、その上清を取の穴に10μｌの上清を使用することにより同定する。次にガラクタナーゼ活性を、青色ハローとして同定する。フェッド・バッチ発酵：フェッド・バッチ発酵を、炭素源としてマルトデキストリン、窒素源としてウレア、及び酵母エキスを含む培地中で行った。フェッド・バッチ発酵を、3.5％の炭素源及び0.5％の窒素源を含む培地中に着目のA．oryzae宿主細胞の振とうフラスコ培養物を接種することにより行った。pH7.0と34℃における24時間の培養の後に、追加の炭素及び窒素源の連続供給を開始させた。この炭素源を限定要因として維持し、そして酸素が過剰に存在することを保証した。このフェッド・バッチ発酵を、４日間続けた。配列番号：１に示すDNA配列の単離本発明のガラクタナーゼをコードする配列番号：１に示すDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分を、本分野において知られた方法（Sambrook et al．（1989）Molecular cloning：A laboratory manual，Cold Spring Harbor lab. ，Cold Spring Harbor，NY）によるプラスミドDNAの抽出により、寄託生物Esche richia coli DSM 10355から得ることができる。培地 YPD：10ｇの酵母エキス、20ｇのペプトン、900mlまでのH₂O、オートクレーブにかけ、100mlの20％グルコース（滅菌濾過されたもの）を添加したもの。 YPM：10gの酵母エキス、20ｇのペプトン、900mlまでのH₂O、オートクレーブにかけ、100mlの20％マルトデキストリン（滅菌濾過されたもの）を添加したもの。 10×Basal塩：75gの酵母ナイトロジェン・ベース、113gのコハク酸、68gのNaO 、1000mlまでのH₂O、滅菌濾過したもの。 SC−URA：100mlの10×Basal塩、28mlの20％カザミノ酸（ビタミン不含）、10m lの１％トリプトファン、900mlまでのH₂O、オートクレーブにかけ、3.6mlの５％トレオニンと100mlの20％グルコース又は20％ガラクトースを添加したもの。 SC−寒天：SC−URA、20ｇ／ｌの寒天を添加したもの。 SC−改変寒天：20ｇの寒天、20mlの10×Basal塩、900mlまでのH₂O、オートクレーブにかけたもの。 AZCLガラクタン（Megazyme，Australia） PET 4000（ポリエチレン・グリコール、分子量=4,000）(BDH，Egland) 実施例実施例１メリピラス・ギガンテウスCBS No．521.95からのガラクタナーゼのクローニングと発現 mRNAを、十分な通気を保証するために撹拌しながらセルロース含有発酵培地中で培養されたメリピラス・ギガンテウス、CBS No．521.95から単離した。菌糸を３〜５日間の培養後に収穫し、液体窒素中で直ちに凍結させ、そして−80℃で保存した。約９×10⁵の個々のクローンから成る、メリピラス・ギガンテウス、CBS No．521.95からのライブラリーを、１％のベクター・バックグラウンドをもつと記載されているようなE．coli内で構築した。上記プールのいくつかからのプラスミドDNAを酵母内に形質転換させ、そして250〜400の酵母コロニーを含む50 〜100のプレートを、各プールから得た。ガラクタナーゼ陽性コロニーを、上記AZCLガラクタン・アッセイによりSC寒天プレート上で同定し、そして単離した。cDNA挿入物を、上記酵母コロニーから直接増幅し、そして先の“材料及び方法”のセクション中に記載したように特徴付けた。上記ガラクタナーゼをコードするcDNAのDNA配列を、配列番号：１に示し、そしてその対応のアミノ酸配列を、配列番号：２に示す。 cDNAを、DSM 10355内のプラスミドから得ることができる。前記DNAを酵母コロニーから単離し、そしてプラスミドDNAを先に記載したようなE．coliの形質転換により奪還した。アスペルギルスにおいてガラクタナーゼを発現させるために、上記DNAを、適当な制限酵素で消化し、ゲル上でサイズ分画し、そしてそのガラクタナーゼ遺伝子に対応する断片を精製した。この遺伝子を、その後、pHD414にライゲートし、適当な制限酵素で消化し、プラスミドpA2G 55を得た。 E．coli内で上記DNAを増幅させた後、上記プラスミドを先に記載したようにアスペルギルス・オリザエ内に形質転換させた。 A．oryzae形質転換体のテスト上記形質転換体のそれぞれを、先に記載したように酵素活性についてテストした。上記形質転換体のいくつかは、上記のアスペルギルス・オリザエのバックグラウンドよりもかなり大きなガラクタナーゼ活性を有していた。これは、アスペルギルス・オリザエにおける上記ガラクタナーゼの効率的な発現を示すものである。実施例２ヌクレオチドとタンパク質のデータベースに対する本発明に係るガラクタナーゼによるホモロジー検索を行った。このホモロジー検索は、最も関係の深いガラクタナーゼがアスペルギルス・アクレアタスからのベータ−１，４−ガラクタナーゼであることを示していた。 “本発明の詳細な説明”中に記載された方法に従って、ほとんどの従来技術のガラクタナーゼに対する本発明に係るガラクタナーゼのDNAホモロジーは、コンピューター・プログラムGAPを使用して測定される。本発明に係るガラクタナーゼは、アスペルギルス・アクレアタスからのベータ−１，４−ガラクタナーゼに対しほんの56％のDNAホモロジーを有している(WO 92／13945)。これは、本発明に係るガラクタナーゼが、実際に、知られたガラクタナーゼのいずれのものとも異なっているということを示している。実施例３ M．giganteusからの組換えガラクタナーゼの精製組換え酵素を発現するアスペルギルス・オリザエの発酵からの培養上清を、遠心分離し、そして0.2μｍフィルターを通して濾過して菌糸を除去し、３kDa膜を備えたFiltronカセット(Minisette)内で限外濾過し、そして同時に、そのバッファーを50mM H₃BO₃、５mM DMG、１mM CaCl₂、pH7.0に変えた。得られたサンプルを、50mMH₂BO₃、５mM DMG、１mM CaCl₂、pH7.0中で平衡化した50ml Pharmacia Q Sepharose HPアニオン交換カラム上にロードした。サンプルを適用した後、このカラムを50mM H₃BO₃、５mM DMG、１mM CaCl₂、pH7.0中で洗浄し、そして結合されたタンパク質を、50mM H₃BO₃、５mM DMG、１mM CaCl₂、pH7.0中０から0.5M NaClまでの線形増加NaClグラジエントを用いて溶出させた。これらの画分を、AZ CL性ガラクタンに対するガラクタナーゼ活性についてテストし、そしてその活性を含む画分をプールした。ガラクタナーゼ活性の全ては、上記洗浄画分中に在った。Ｑ−セファロース・カラムからの洗浄画分中のpHを、酢酸を用いてpH4.5に調整し、そして10mM CH₃COOH／NaOH中で平衡化した50mI Pharmacia S Sepharose H Pカラムに適用した。上記カラムを洗浄した後、結合されたタンパク質を、10mM CH₃COOH／NaOH、pH4.5中0から250mM NaClまでの線形増加NaClグラジエントを用いて溶出させた。ガラクタナーゼ活性の全ては、単一ピーク内に存在し、そして電気泳動において純粋な形態で溶出された。タンパク質濃度を、製造者(Bio-Rad Laboratories GmbH)の推奨に従って“Bio -Radタンパク質アッセイ”の使用により測定する。実施例４： M．giganteusからの組換えガラクタナーゼの特徴付け上記酵素の分子量及び等電点をWO 94／21785中に記載したように測定した。この酵素の活性を、ルピナス(lupin)ガラクタン(Megazyme，Australia)からの還元糖の放出により又はAZCL−ポテト−ガラクタン(Megazyme，Australia)からの青色の放出により計測した。 0.5mlの0.4％AZCL−ポテト−ガラクタンを、最適pHの0.5mlの0.1Ｍシトレート／ホスフェート・バッファーと混合し、そして10μｌの好適に希釈された酵素溶液を添加した。インキュベーションを、95℃で20分間上記酵素の熱失活前（特にことわらない場合)30℃において15分間Eppendorf Thermomixers内で行った。酵素のインキュベーションを３連で行い、そして酵素が添加されたが直ちに失活されたブランクを作った。遠心分離の後、上清の吸光度を620nmにおいてマイクロタイター・プレート内で計測し、そして上記ブランクの値を差し引いた。ルピナス・ガラクタンの0.5％溶液を、（特にことわらない限り）最適pHの0.1 Ｍシトレート／ホスフェート中で調製し、10μｌの好適に希釈した酵素溶液を１ mlの基質に添加し、そしてインキュベーションを、20分間95℃における熱失活前に15分間30℃で行った。還元糖を、マイクロタイター・プレート内で、0.15ｇのパラ・ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド(Sigma H−9882)、0.50gの酒石酸カリウム −ナトリウム（Merck 8087）及び10.0mlまでの２％NaOH溶液を含むPHBAH試薬との反応により測定した。ブランクの結果を差し引いた。ガラクトースを標準として使用した。最適pH及び温度をAZCL−ガラクタン上で計測した。pH(2.5，3.0,3.5，4.0，4. 5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0,9.5，10.0)の0.1Ｍシトレート／ホスフェート・バッファーを最適pHの測定のために使用した。最適温度を測定するために、最適pHにおける0.1Ｍシトレート／ホスフェート・バッファーを、15分間の異なる温度での反応のために使用した。 Kmと比活性を、0.025〜1.0％の範囲にわたるルピナス・ガラクタン濃度（Ｓ）におけるインキュベーションし、そして生成された還元糖を計測し、次にその反応速度（Ｖ）を計算し、Ｓの関数としてＳ／Ｖを描き、線形回帰分析を行い、勾配（＝１／Vmax）と切片（Km／Vmax）を求め、そしてKmと比活性（＝Vmax／Ｅ） (ここで、Ｅは添加された酵素の量である）を計算することにより求めた。酵素 M．giganteus Mw 35kDa pI 5.9 最適pH 5.5 最適温度 40℃ Km（％ガラクタン） 0.4〜0.8 比活性（μmol／分／mg) 5000〜7000 アミノ末端配列アミノ末端分析を、製造者により記載されたように行ったApplied Biosystem 装置（ABI 473Aタンパク質シーケンサー、Applied Biosystem，USA）を用いたエドマン分解法を使用することにより測定した。Ｎ−末端配列：配列番号：２に示すアミノ酸配列をもつ本発明に係るガラクタナーゼに関しては、そのＮ−末端配列は：Ｎ−末端 Leu-Thr-Tyr-Lys-Gly-Ala− である。Ｎ−末端アミノ酸Leuは、配列番号：２中の19位にある。これは、本発明に係る成熟ガラクタナーゼ酵素が配列番号：２中の19位から開始するということを示している。結論として、上記成熟配列は、配列番号：２中の19〜342である。実施例５：見掛け代謝エネルギー基礎食餌（basal diet）の栄養価に対する（実施例３に記載したように得られた）本発明に係るガラクタナーゼ酵素の効果を、古典的な見掛け代謝エネルギー (apparent metabolisable energy（AME）)を使用して評価して、鳥に利用可能な食餌エネルギーの量を推定した。AME試験を、ソールガム(sorghum)(64％)と大豆ミール（30％）を含む実験的基礎食餌を用いて行った。商業的なブロイラー・チキン（Ingham^TM IM98)を、制御された温度の家畜小屋内の床の囲い(floor pen)内の欝化から24日齢まで育てた。これらの鳥に21日間商業的なスターター飼料を与え、そして次に商業的なフィニッシャー（finisher ）飼料を与えた。ニワトリを５つの群内で計量し、そして同一の家畜小屋内の他の部屋内に置かれた48の代謝かごに移した。実験的食餌を７日間（１日目〜７日目の間）与えた。最初の３日間（１日目〜３日目）は、ニワトリを、上記かごと飼料に馴らすことを可能にした。飼料の摂取を上記期間に計測した。その後の４日間（４日目〜７日目）にわたり、飼料の摂取を計測し、そして排泄物を全て回収し、そして乾燥させた。５日目に集めた排泄物の水分含量を90℃において一夜乾燥させることにより測定した。各食餌を25羽の鳥に与えた。ソールガム、ペレットされた飼料、及び粉砕された飼料のサンプルの乾燥物（ DM）含量を、105℃で一夜乾燥させることにより測定した。排泄物と粉砕された飼料のグロス・エネルギー（GE）値を、Parr isoperibol爆発熱量計を用いて計測した。飼料を排泄物サンプルの窒素含量を、消化、蒸留及び滴定のKjeltec法により計測した。この実験においては、ガラクタナーゼは、6.7ml/kg飼料の投与量において含まれ、そしてラクターゼ(Sumilact^TM，Lot．No．40303−01，Shinihon，Japanから入手可能）は、3.3ml/kg飼料の投与量で含まれていた。供給された飼料のエネルギーと無効にされた排泄物のエネルギーの間の差異として測定された結果を、以下の表２に表す。表２．見掛け代謝エネルギー（AMEn）異なる下付き文字をもつ値は有意差がある（Ｐ＜0.05）。これは、本発明に係るガラクタナーゼが動物飼料産業において有用であることを示している。配列表配列番号：１は、寄託Escherichia coli DSM 10355内に形質転換されたDNA構築物内に含まれるガラクタナーゼ・コーディング配列のDNA配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者アンデルセン，レンノンボエデンマーク国，デーコー―2880 バグスバエルトノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ (72)発明者クラウセン，イブグロスデンマーク国，デーコー―2880 バグスバエルトノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．ガラクタナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含むDNA構築物であって、そのDNA配列が、（ａ）エシェリキア・コリ(Escherichia coli)DSM 10355内に存在するプラスミドpYES 2.0内にクローン化されたDNA配列のガラクタナーゼ・コーディング部分；（ｂ）配列番号：１内の１〜1026位又はより好ましくは55〜1026位に示される DNA配列又はその相補鎖；（ｃ）上記DNA配列と少なくとも70％の相同性をもつ（ａ）又は（ｂ）内に定められたDNA配列のアナログ；（ｄ）低ストリンジェンシーにおいて配列番号：１内の１〜1026位に示される DNA配列とハイブリダイズするDNA配列；（ｅ）遺伝子コードの縮重のために、（ｂ）又は（ｄ）の配列とハイブリダイズしないが、上記DNA配列の中のいずれかによりコードされたポリペプチドと同じアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするDNA配列；又は（ｆ）（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）又は（ｅ）に特定するDNA配列の対立形態（allelic form）又は断片であるDNA配列、を含む、前記DNA構築物。２．ガラクタナーゼ活性を示す酵素をコードする前記DNA配列が、微生物、好ましくは糸状菌、酵母、又はバクテリアから得られることができる、請求項１に記載のDNA構築物。３．前記DNA配列が、サルノコシカケ科、例えばメリピラス(Meripilus)、ブジャーカンデラ(Bjerkandera)、又はスポンジペリス(Spongipellis)属の株、特にメリピラス・ギガンテウス(Meripilus giganteus)の株から得られることができる、請求項２に記載の DNA構築物。４．前記DNA配列が、メリピラス・ギガンテウス(Meripilus giganteus)CBS No ．521.95株のDNAライブラリーから単離され、又はそれに基づき製造される、請求項３に記載のDNA構築物。５．前記DNA配列が、アスペルギルス(Aspergillus)種、特にアスペルギルス・アクレアタス（A．aculeatus）又はアスペルギルス・ニガー（A．niger）の株、フィトフトーラ（Phytophthora）種の株、特に、フィトフトーラ・インフェスタンス（P．infestans）、フィトフトーラ・メガスパーマ(P．megasperma)、フィトフトーラ・カクトラム(P．cactorum)の株、又はタラロミセス(Talaromyces)種の株、特にタラロミセス・ビソクラミドイデス(T．byssochlamydoides)、タラロミセス・エマーソニ（T．emersonii）の株、サーモアスカス(Thermoascus)種の株、特にサーモアスカス・アウランティアカス（T．aurantiacus）の株、スポロトリチャム（Sporotrichum）種の株、特にスポロトリチャム・セルフィラム（S ．celluphilum）の株又はペニシリウム(Penicillium)種の株、特に、ペニシリウム・シトリナム(P．citrinum)、ペニシリウム・カメンバーチ（P．camembertii ）又はペニシリウム・ロクエフォーチ（P．roquefortii）の株から得られることができる、請求項２に記載のDNA構築物。６．前記DNA配列は、エシェリキア・コリ（Escherichiacoli）DSM No．10355 から単離される、請求項１に記載のDNA構築物。７．請求項１〜６のいずれか１項に記載のDNA構築物を含む組換え発現ベクター。８．請求項１〜６のいずれか１項に記載のDNA構築物又は請求項７に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。９．真核細胞、特に真菌細胞、例えば酵母細胞又は糸状菌細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。 10．フザリウム又はアスペルギルス又はトリコデルマの株、特に、フザリウム ATCC 20334の同定特徴をもつフザリウム種、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、トリコデルマ・ハルジアナム又はトリコデルマ・レイセイである、請求項９に記載の宿主細胞。 11．サッカロミセスの株、特にサッカロミセス・セレビシエの株である、請求項９に記載の宿主細胞。 12．メリピラス種、特にメリピラス・ギガンテウス(Meripilus giganteus)である、請求項９に記載の宿主細胞。 13．メリピラス・ギガンテウスCBS No．521.95株である、請求項12に記載の宿主細胞。 14．ガラクタナーゼ活性を示す酵素の製法であって、その酵素の産生を許容する条件下、請求項8〜13のいずれか１項に記載の細胞を培養し、そしてその培養物からその酵素を回収することを含む、前記製法。 15．（ｉ）相同不純物を含まず、かつ、（ii）酵素が、請求項14に記載の方法により、そして請求項8〜11のいずれか１項に記載の宿主細胞を用いて製造されること、を特徴とする、ガラクタナーゼ活性を示す単離酵素。 16．以下の：（ａ）Escherichia coli DSM 10355内に存在するプラスミドpYES2.0内にクローン化されたDNA配列のガラクタナーゼ酵素コーディング部分によりコードされたポリペプチド；（ｂ）配列番号：２の19〜342位に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）上記ポリペプチドと少なくとも70％の相同性をもつ（ａ）又は（ｂ）に定義されたポリペプチドのアナログ；そして（ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）の対立形態又は断片、から成る群から選ばれたガラクタナーゼ活性を示す単離酵素。 17．請求項15又は16に記載の酵素を含む酵素製剤。 18．請求項15又は16に記載のガラクタナーゼ活性を示す酵素が濃縮されている、酵素製剤。 19．ａ−アラビノシダーゼ、キシラナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ａ−グルクロニシダーゼ(a-glucuronisidase)、ｂ−キシロシダーゼ、キシラン・アセチル・エステラーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチン・アセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチン・リアーゼ、ペクテート・リアーゼ、グルカナーゼ、ペクチン・メチルエステラーゼ、ラッカーゼ、又はフィターゼ(phytase)をさらに含む、請求項18に記載の製剤。 20．飼料又は食品の製造における請求項15又は16に記載の酵素、請求項17〜19 のいずれか１項に記載の酵素製剤の使用。 21．植物細胞壁由来材料の粘度を減少させるための、請求項15又は16に記載の酵素又は請求項17〜19のいずれか１項に記載の酵素製剤の使用。 22．ワイン又はジュースの製造における、請求項15又は16のいずれか１項に記載の酵素又は請求項17〜19のいずれか１項に記載の酵素製剤の使用。 23．寄託された株エシェリキア・コリ(Escherichia coli)DSM No．10355の単離された実質的に純粋な生物学的培養物。