FI120835B

FI120835B - Uusia esteraaseja ja niiden käyttö

Info

Publication number: FI120835B
Application number: FI20075532A
Authority: FI
Inventors: Johanna Buchert; Marjaana Raettoe; Tiina Nakari-Setaelae; Pasi Halonen; Hanna Kontkanen; Ann Westerholm-Parvinen
Original assignee: Valtion Teknillinen
Priority date: 2007-07-10
Filing date: 2007-07-10
Publication date: 2010-03-31
Also published as: AU2008274161A1; AU2008274161B2; CN101784657A; ZA201000436B; US8546115B2; BRPI0814694A2; EP2171050A4; JP2010532984A; US20100209985A1; WO2009007510A1; JP5496883B2; FI20075532A0; FI20075532L; CA2692605A1; EP2171050A1; EP2171050B1

Description

Uusia esteraaseja ja niiden käyttö

Keksinnön ala

Keksintö liittyy uusiin esteraaseihin ja erityisesti polyesteraasiprote-iineihin, joilla on kutinaasi- ja/tai suberinaasiaktiivisuutta. Mainittuja entsyymejä 5 voidaan saada Coprinus tai Trichoderma -suvun sienistä. Keksintö liittyy myös eristettyihin polynukleotideihin, jotka koodaavat mainittuja proteiineja, ja poly-nukleotideja käsittäviin vektoreihin ja geneettisesti modifioituihin mikro-organis-meihin sekä menetelmiin proteiinien tuottamiseksi. Keksintö liittyy myös ent-syymivalmisteeseen, joka käsittää polyesteraasiproteiinin ja proteiinin tai valio misteen käyttöön. Keksinnön kohteena on myös menetelmä kutiinin ja/tai sub-eriinin tai muiden polyesteraaseja käyttävien polyestereiden hydrolysoimiseksi.

Tekniikan taso

Kutinaasit ja suberinaasit ovat polyesteraaseja, jotka kykenevät hajottamaan tai osittain depolymerisoimaan kasvien polyesterivahoja eli kutiinia 15 ja suberiinia. Merkittäviä määriä kutiinia/suberiinia on läsnä maa-ja metsätalouden erilaisissa raaka-aineissa ja sivutuotteissa, kuten koivuntuohessa ja korkissa, marjoissa, viljoissa, vihanneksissa ja niiden prosessoinnin sivutuotteissa. Näiden vahojen läsnäolo kasvien raaka-aineissa voi haitata kasvimateriaalien teollista käsittelyä niiden hydrofobisen luonteen ja heikosti hajoavan 20 rakenteen vuoksi.

Polyesterien modifiointi parantaisi useiden luonnonmateriaalien prosessointia ja hyödyntämistä ja vähentäisi prosessin sivutuotteiden ja jätteiden käsittelyä. Näitä jätefraktioita voitaisiin käyttää hyväksi arvokkaampien koostumusten lähteenä, esimerkiksi suberiinipohjaiset oligoesterit voisivat olla mah-25 dollisia raaka-aineita voitelu- ja sidosaineissa. Polyesteraasien käyttö parantaa useiden kasvimateriaalien, kuten viljojen, hedelmien, vihannesten ja marjojen, prosessointia ja hyväksikäyttöä ja myös arvokkaiden bioaktiivisten ja funktionaalisten komponenttien vapautumista ja talteenottoa näistä raaka-aineista.

Luonnonresurssien kestävä käyttö ja jätehuolto vähentävät osaltaan 30 jätteen tuotantoa. Entsyymien käyttö yhdessä kemiallisten ja fysikaalisten prosessien kanssa on ympäristöystävällinen tapa tuottaa lisäarvoa jätesivutuotteil-le. Kutinaaseja/suberinaaseja voidaan myös käyttää esim. pyykinpesu- ja as-tianpesusovelluksiin rasvojen poistamiseksi sekä puuvillan biopesuun ja ihmisen valmistamien polyesterikuitujen pinnan muokkaamiseen.

2

Vaikka lipidejä ja vahoja on runsaasti erilaisten teollisten tuotteiden ja lignoselluloosajätteiden ainesosina, ainoastaan rajoitettu joukko lipidejä muuntelevia muita entsyymejä kuin tavanomaisia lipaaseja on kaupallisesti saatavilla. Kutinaaseja ja suberinaaseja pidetään potentiaalisina ensyymeinä 5 muokattaessa luonnollisia lipidejä ja vahoja, joita ei voida hydrolysoida tavanomaisilla lipaaseilla.

Tähän mennessä tutkituin on kasvi-/ihmispatogeenisestä sienestä Fusarium solani sp. pisi peräisin oleva kutinaasi (Carvalho et ai., 1999), mutta kutinaaseja on löydetty myös sellaisista mikro-organismeista kuin Alternaria 10 brassicicola (Trail ja Köller, 1993), Botrytis cinerea (Gindro ja Pezet 1999), Venturia inaequalis (Köller ja Parker, 1989), Aspergillus oryzae (Maeda et ai., 2005) ja tietyistä Streptomyces-lajeista (Fett et ai., 1992). Kaikki biokemialli-sesti hyvin karakterisoidut kutinaasit ovat seriiniesteraaseja, jotka sisältävät klassisen Ser-His-Asp-triadin, joka on yleinen seriiniproteaaseissa ja useissa 15 lipaaseissa. Karakterisoiduilla kutinaaseilla on optimaalinen pH, joka vaihtelee neutraalista emäksiseen.

Kutinaaseille on esitetty monia käyttötarkoituksia, joista vain muutamia mainitaan tässä. Esimerkiksi julkaisussa W02004/029193 esitetään kutinaaseja sisältävien lipaasien käyttö fermentaatioprosessissa, erityisesti pro-20 sesseissa, joissa tuotetaan etanolia. Julkaisu US 6,255,451 liittyy biohajoavien polymeerien hajottamiseen lipaasilla ja kutinaasilla. Mahdollisesti lipolyyttisiä entsyymejä tuottavia organismeja on luetteloitu suuria määriä, näiden joukossa mm. Coprinus cinerus ja Trichoderma reesei. Ei ole kuitenkaan mitään esitystä näistä organismeista peräisin olevista lipaaseista. Garcia-Lepe et ai., 1997, 25 seuloivat lipaasiaktiivisuutta 51 eri suvun ja kannan sienestä autolyysiviljelmis-sä. Parhaiksi lipaasiaktiivisuuden tuottajiksi osoittautuivat Fusarium-suvun sienet, joissa myös ilmeni matalaa kutiini- ja suberiiniaktiivisuutta. Myös Aspergillus osoitti jonkin verran aktiivisuutta, kun taas Penicillium-lajissa aktiivisuus oli hyvin matala. Suvun Trichoderma lahkon Mucorales ja luokan Basidiomycetes 30 muissa lajeissa ja kannoissa ei ilmennyt lipaasiaktiivisuutta.

Kutinaaseja tuottavat usein fytopatogeeniset sienet, koska ne osallistuvat korkeampien kasvien rakenteellisen kutiinipolymeerin hajottamiseen. Kutinaasit ovat eritettyjä proteiineja, joiden avulla patogeeniset sienet pääsevät tunkeutumaan kutikulaarisen esteen läpi isäntäkasviin sieni-infektion alkuvai-35 heessa. Fytopatogeeniset sienet ovat kuitenkin ei-toivottuja teollisten entsyymien lähteitä, koska käyttäjillä on niistä negatiivinen käsitys. Itse asiassa tällä 3 hetkellä ei ole kaupallisesti saatavilla elintarvikelaatua olevia polyesteraaseja ja suberiinia prosessoivia entsyymejä. Edelleen siis tarvitaan uusia ja tehokkaampia polyesteraaseja. Tämä keksintö täyttää kyseisen tarpeen.

Keksinnön lyhyt selostus 5 Keksinnön yhtenä tavoitteena on polyesteraasiproteiini, joka sisältää aminohapposekvenssin, jolla on ainakin 50-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 2, 6,11 tai 13 kanssa, tai sen variantin tai fragmentin, jolla on polyeste-raasiaktiivisuutta.

Keksinnön eräänä toisena tavoitteena on eristetty polynukleotidi, jo-10 ka valitaan ryhmästä, joka koostuu: a) polynukleotidista, joka sisältää sekvenssin nro 1, 3, 5, 10 tai 12 mukaisen nukleotidisekvenssin, tai nukleotidisekvenssin, joka koodaa patenttivaatimuksen 1 mukaista proteiinia, b) kohdan a) komplementaarisesta säikeestä, ja 15 c) sekvenssistä, joka degeneroitunut geneettisen koodin suhteen jonkin kohdan a) tai b) mukaiselle sekvenssistä.

Keksinnön tavoitteena on myös vektori, joka sisältää mainitun poly-nukleotidin, ja geneettisesti modifioitu mikro-organismi, joka on transformoitu tällä vektorilla.

20 Keksinnön kohteena on myös menetelmä mainitun polyesteraasi- proteiinin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa transformoidaan mikro-organismi vektorilla, joka sisältää mainitun polynukleotidin, viljellään transformoitu mikro-organismi olosuhteissa, jotka sallivat mainitun polynukleotidin ekspression, ja otetaan talteen ekpressoitu proteiini.

25 Keksintö kattaa myös entsyymivalmisteen, joka sisältää mainitun polyesteraasiproteiinin.

Lisäksi keksintö kattaa menetelmän kutiinin, suberiinin tai muun polyesterin hydrolysoimiseksi, joka menetelmä sisältää vaiheet, joissa kutiinia, suberiinia tai muuta polyesteriä sisältävää materiaalia käsitellään polyesteraa-30 siproteiinilla olosuhteissa, jotka sallivat mainitun polyesterin osittaisen hydro-lyysin tai kokonaishydrolyysin.

Edelleen keksintö kattaa mainitun polyesteraasiproteiinin tai entsyymivalmisteen käytön elintarviketeollisuudessa, massa- ja paperiteollisuudessa, tekstiiliteollisuudessa, tai pyykki- ja astianpesusovelluksissa tai kemial-35 lisessa synteesissä. Keksinnön erityisiä suoritusmuotoja on esitetty epäitsenäisissä vaatimuksissa. Keksinnön muita tavoitteita, yksityiskohtia ja etuja tulee 4 esiin seuraavista piirustuksista, yksityiskohtaisesta kuvauksesta ja esimerkeistä.

Kuvioiden lyhyt selostus

Kuvio 1 esittää Coprinus cinereus -sienen kutinaasityyppisten prote-5 iinien aminohapposekvenssit.

Kuvio 2 esittää solunulkoista Coprinus cinereus -kutinaasin 09668 (CcCUT) tuotantoa 20 l:n bioreaktoriviljelyssä.

Kuvio 3 esittää solunulkoista Trichoderma reesei -kutinaasin (TrCUT) ja -suberinaasin (TrSUB) tuotantoa 20 l:n bioreaktoriviljelyssä.

10 Kuvio 4 esittää rasvahappoketjun pituuden vaikutuksia Coprinus ci nereus -kutinaasin 09668 (CcCUT) ja Trichoderma reesei -kutinaasin (TrCUT) esterolyyttiseen aktiivisuuteen mitattuna pH-arvolla 7 ja 40 °C:ssa.

Keksinnön yksityiskohtainen selostus

Keksintö antaa käyttöön uusia entsyymiproteiineja, jotka kykenevät 15 hydrolysoimaan esterisidoksia luonnollisissa ja keinotekoisissa polyestereissä. Ainakin joillakin niistä on merkittävää aktiivisuutta myös happamalla pH-ar-volla, mikä on edullista tietyissä sovelluksissa. Proteiinit ovat ’’esteraaseja”, jotka kattavat luokan (EC 3.1.1.) entsyymit ja joita kutsutaan myös karboksyylies-terihydrolaaseiksi. Keksinnön mukaiset proteiinit ovat erityisesti ’’polyesteraa-20 seja”, mikä tarkoittaa, että niillä on merkittävää aktiivisuutta monilla eri polyestereillä, kuten kasvipolyesterivahoilla eli kutiini-, suberiini- tai keinotekoisilla polyestereillä. Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan proteiinilla on kutinaasiaktiivisuutta. ’’Kutinaasi” on luokan (EC 3.1.1.74) entsyymi. Kutinaasi on seriiniesteraasi, joka sisältää klassisen Ser, His, Asp -seriinihydrolaasien 25 triadin. Keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaan proteiinilla on sube-rinaasiaktiivisuutta. ’’Suberinaasi” on entsyymi, joka kykenee hajottamaan sube-riinia. Proteiineissa voi olla enemmän kuin yksi mainituista entsyymin aktiivisuuksista mitattuna mallisubstraateilla tai substraattina käytetyllä eristetyllä ku-tiinilla tai suberiinilla. Polymeraasiaktiivisuus saattaa siis olla ainakin kutinaasi-30 aktiivisuutta tai suberinaasiaktiivisuutta tai molempia. Lisäksi proteiineissa voi olla muuta entsyymiaktiivisuutta, kuten lipaasiaktiivisuutta, joka kuuluu myös luokkaan EC 3.1.1.

Polyesteraasit sisältävät aminohapposekvenssin, jolla on ainakin 50-prosenttinen tai edullisesti ainakin 60-, 70-, 80-, 90- , 95- tai 98-prosenttinen 35 identtisyys sekvenssin nro 2, 6, 11 tai 13 kanssa, tai sen variantin tai fragmen- 5 tin, jolla on polyesteraasiaktiivisuutta. Erään edullisen suoritusmuodon mukaan polyesteraasi sisältää aminohapposekvenssin, jolla on ainakin 50-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 2 kanssa, tai sen variantin tai fragmentin, jolla on kutinaasiaktiivisuutta. Tällaisia ovat esimerkiksi polyesterit, jotka sisältävät sek-5 venssin nro 4, 7, 8 tai 9 mukaisen aminohapposekvenssin, tai sen entsymaattisesti aktiivisen variantin. Tällaisella proteiinilla voi olla 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 95- tai 98-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 4 kanssa.

Termillä ’’identtisyys” tarkoitetaan tässä kahden aminohapposekvenssin välistä sekvenssi-identiteettiä toisiinsa verrattuna. Sekvenssien identiteetti 10 määritetään tässä käyttämällä ClustalW-monirinnastusohjelmaa, joka on saatavilla Euroopan molekyylibiologian laboratorion - Euroopan bioinformatiikan instituutin internet-sivuilta (European Molecular Biology Laboratory - European Bioinformatics Institute EMBL-EBI; http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) käyttämällä oletusasetuksia ja Blosum62:ta substituutiomatriisina (Thompson et ai., 1994). 15 Tiedetään hyvin, että yhden tai muutaman aminohapon poistami nen, lisääminen tai substituutio ei välttämättä muuta entsyymiproteiinin katalyyttisiä ominaisuuksia. Tämän vuoksi keksintö kattaa myös variantteja ja fragmentteja tietyistä aminohapposekvensseistä, joilla on polyesteraasiaktiviteettia. Termillä ’’variantti” viitataan tässä sekvenssiin, jonka aminohapposekvenssissä 20 on vähäisiä muutoksia tiettyyn sekvenssiin verrattuna. Tällainen variantti voi ilmetä luonnollisesti esim. alleelisena varianttina samassa kannassa, lajissa tai suvussa, tai se voidaan saada aikaan mutageneesillä tai jollain muulla geeni-muuntelulla. Se voi sisältää aminohappojen substituutioita, poistoja tai lisäyksiä, mutta silti se toimii olennaisesti samalla tavalla kuin annetut entsyymit, ja 25 erityisesti se säilyttää katalyyttisen toimintansa polymeraasina.

Tietyn proteiinisekvenssin ’’fragmentti” tarkoittaa kyseisen sekvenssin osaa eli sekvenssiä, joka on katkaistu N- ja/tai C-terminaalisessa päässä. Se voi olla esimerkiksi signaalisekvenssin sisältävä proteiinin kypsä osa, tai se voi olla vain kypsän proteiinin entsymaattisesti aktiivinen fragmentti.

30 Keksintö kohdistuu myös eristettyihin polynukleotideihin, jotka koo- daavat esitettyjä polyesteraaseja, mukaan lukien komplementaarisia kantoja ja degeneroituneita kantoja. Polynukleotidi, joka on ’’geneettisen koodin seurauksena degeneroitunut” tietystä sekvenssistä, tarkoittaa, että se sisältää yhden tai useamman erilaisen kodonin, mutta koodaa samoja aminohappoja. Termillä 35 ’’polynukleotidi” tarkoitetaan tässä joko yksi- tai kaksijuosteista polynukleiini-happoa. Termi kattaa genomisen DNA:n, cDNA:n ja RNA:n.

6

Eri organismeista peräisin olevilla geeneillä, jotka koodaavat entsyymejä, joilla on sama katalyyttinen aktiivisuus, on usein sekvenssin samankaltaisuuksia. Näitä samankaltaisuuksia voidaan käyttää hyväksi kloonattaessa muita geenejä muista organismeista, joilla on samanlainen tai samankaltainen 5 katalyyttinen aktiivisuus.

Uusia esteraaseja koodaavia polynukleotideja voidaan identifioida esim. in silico vertaamalla nukleotidisekvenssejä. Jos tällaisia sekvenssejä ei ole saatavilla, voidaan nukleotidi- tai aminohapposekvenssin konservoitunut alue identifioida ja kloonata geenifragmentti PCR-menetelmillä. Kloonaus tar-10 koittaa mielenkiinnon kohteena olevan DNA-fragmentin siirtoa organismista it-sekopioituvaan geneettiseen elementtiin ja edelleen mahdollisesti vieraaseen isäntäsoluun. Kokonainen geeni voidaan saada fragmentin sekvensoinnin jälkeen esim. käyttämällä cDNA-kirjastoa tunnetulla tavalla. Toinen tapa identifioida polyesteraasiageeni on käyttää perinteistä nukleiinihappohybridisaatiota.

15 Kloonaukseen voidaan valmistaa erityisiä koettimia esimerkiksi vas taavasta mRNA:sta, tai koetin voidaan valmistaa, jos osa geenin koodaaman proteiinin aminohapposekvenssistä tunnetaan. Kun ehdokkaina olevat DNA-sekvenssit on määritelty, voidaan algoritmisilla menetelmillä tehokkaasti etsiä kohteena olevasta genomista vastaavuuksia. BLAST (Basic Local Alignment 20 Search Tool) on laajalti käytössä oleva järjestelmä, joka on suunniteltu tätä tarkoitusta varten.

Keksinnön mukaiset proteiinit tai polynukleotidit voidaan saada mistä tahansa sopivasta organismista, mukaan lukien niitä sisältävät bakteeri-, sieni- , hiiva-, kasvi- tai nisäkkäistä peräisin olevat solut. Edullisesti entsyymi 25 saadaan sienestä ja erityisesti rihmasienestä, kuten Coprinus tai Trichoderma -suvun sienestä, erityisesti lajista C. cinereus tai T. reesei (Hypocrea jecorina).

Tietystä organismista ’’saadut” proteiinit tai polynukleotidit kattavat mainitusta organismista eristetyt tuotteet sekä niiden muunnokset. Tietystä or-ganismista johdettu proteiini voi olla rekombinantisti tuotettu tuote, joka on 30 identtinen luonnollisesti esiintyvän proteiinin kanssa tai muunnos siitä. Proteiinia voidaan myös muunnella esim. glykosylaatiolla, fosforylaatiolla tai muulla kemiallisella muuntelulla. Muunteluun voi myös kuulua sopivan peptidin tai pro-teiinifuusiokumppanin liittäminen mielenkiinnon kohteena olevaan proteiiniin. Fuusiokumppanilla voi olla hyödyllinen tehtävä eli se voi vahvistaa mielenkiin-35 non kohteena olevan proteiinin hydrolyysiä tai prosessointitehokkuutta. Esimerkkejä tällaisista fuusiokumppaneista ovat mm. hydrofobiinisienet. Tietystä 7 organismista saatuihin tuotteisiin kuuluu myös tuotteiden mutantteja ja luonnollisia variantteja, joista poistetaan, lisätään ja/tai korvataan yksi tai useampi nukleiinihappo ja/tai aminohappo.

Kuten edellä on esitetty, proteiini voidaan eristää organismista, jos-5 sa se esiintyy luonnollisesti, tai se voidaan valmistaa rekombinantisti isän-täsolussa tai tuottaa synteettisesti esim. peptidisynteesillä. Proteiini on edullisesti rekombinantti proteiini. Se voidaan valmistaa eristämällä ensin proteiinia koodaavaa polynukleotidia sisältävä fragmentti monistamalla PCR-reaktiossa (Coen, 2001) tai joillain muilla rekombinantti-DNA-menetelmillä (Sambrook et 10 ai., 1989). Eristetty polynukleotidi viedään sitten vektoriin, esim. plasmidivekto-riin, erityisesti ekspressiovektoriin, joka sisältää seuraavat toiminnallisesti liitetyt elementit: transkriptiopromoottorin, polyesteraasia koodaavan segmentin ja transkriptioterminaattorin. Promoottori on edullisesti vahva promoottori, joka mahdollistaa proteiinin yliekspression. Yksi sopiva promoottori on T. reesein 15 sellobiohydrolaasin I (cbh1) promoottori. Promoottori valitaan siten, että se kykenee toteuttamaan mielenkiinnon kohteena olevan geenin ekspression valitussa tuotantoisännässä. Vektori voi olla integroitu kromosomiin tai se voi olla automaattisesti monistuva.

Seuraavaksi vektori transformoidaan heterologiseen tai homologi-20 seen isäntäsoluun, jotta saadaan luotua ’’geneettisesti muunneltu mikro-organismi”, jota viljellään olosuhteissa, joissa proteiinin ekspressio on mahdollinen. Menetelmiä eri isäntäjärjestelmässä tapahtuvaan proteiinin tuotantoon rekom-binanttitekniikoilla tunnetaan alalla hyvin (Gellissen, 2005). Vaihtoehtoisesti ainoastaan vahva promoottori on liitetty polyesteraasigeeniin isännän kromo-25 somissa, jolloin mainitun geenin ekspressio on yliekspressoitu. Isäntäsolu voi olla mikä tahansa sopiva eukaryoottinen tai prokaryoottinen solu. Edullisesti se on sieni, kuten rihmasieni tai hiiva, ja edullisimmin se kuuluu sukuun Tricho-derma, erityisesti se on T. reesei. Se voi myös olla Saccharomyces- tai Pichia -kantaa, kuten S. cerevisiae ja P. stipitis, vastaavasti. Edelleen se voi olla As-30 pergillus -kantaa, kuten A. nidulans, A. niger tai A. oryzae tai jopa bakteeri-isäntä.

Polyesteraasiproteiini tuoteaan edullisesti solun ulkopuolella, jolloin eritetty proteiini voidaan saada kasvualustasta. Vaihtoehtoisesti solut voidaan rikkoa entsyymin vapauttamiseksi, ja entsyymi voidaan sitten ottaa superna-35 tantista solujätteiden poiston jälkeen. Entsyymiä voidaan puhdistaa edelleen useilla erilaisilla proteiininpuhdistusmenetelmillä, jos halutaan. Tällainen puh- 8 distaminen voi sisältää esim. konsentraation, saostamisen, kromatografian, immunopuhdistuksen, faasierottelun jne. muiden proteiinien ja erityisesti muiden entsyymien poistamiseksi.

Tässä yhteydessä ’’entsyymivalmiste” voi olla mikä tahansa koos-5 tumus, joka sisältää ainakin yhden keksinnön mukaisista polyesteraaseista. Se voi myös sisältää yhden tai useampia entsyymejä. Se voi olla raakamuodossa, esim. käytetyn viljelmän tai solun supernatantin muodossa, tai se voi sisältää polyesteraasin puhdistetussa tai olennaisesti puhdistetussa muodossa.

Polyesteraasit ovat hyödyllisiä kutiinia, suberiinia tai muuta polyes-10 teriä sisältävän materiaalin hydrolyysille. Kutiinia ja/tai suberiinia sisältävä materiaali on yleensä kasviperäistä, kun taas muu polyesteriä sisältävä materiaali voi olla kasvista saatua tai ihmisen tekemää. Käsiteltävään materiaaliin lisätään entsyymiä määrä, joka on tehokas halutun reaktion katalysoimiseksi, hyd-rolyysin sallivissa olosuhteissa. Polyesteraaseja voidaan esim. käyttää kasvi-15 polyesterivahojen, eli kutiinin ja suberiinin, hajottamiseksi tai niiden depolyme-roinniksi osittain. Näin ollen polyesteraaseja voidaan käyttää esim. maatalous-tai elintarviketuotteiden tai vihanneksista, hedelmistä, maljoista ja viljoista saatavien sivutuotteiden käsittelyyn. Niitä voidaan myös soveltaa muissa kuin elin-tarvikeprosesseissa, kuten menetelmissä, jotka käsittävät puuraaka-aineiden, 20 massa- ja paperituotteiden tai prosessin jätteiden tai vesien tai sivutuotteiden käsittelyä, tai synteettisten tai muiden ihmisen tekemien polyesterikuitujen tai -tekstiilien muokkausta tai tahrojen tai rasvan poistamista pyykistä ja tiskeistä.

Sopivissa olosuhteissa polyesteraaseja voidaan käyttää myös katalysoimaan käänteinen reaktio eli esterifikaatio, jossa muodostetaan esterisidok-25 siä esim. rasvahappojen ja alkoholien välille.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä, jotka eivät ole rajoittavia. Tulisi kuitenkin ymmärtää, että edellä olevassa kuvauksessa ja esimerkeissä esitetyt suoritusmuodot on tarkoitettu ainoastaan havainnollistaviksi ja että useat erilaiset muutokset ja muunnelmat ovat mahdollisia patenttivaati-30 musten puitteissa.

Esimerkki 1. Polyesteraasiaktiivisuuksien mittaaminen Menetelmiä suberiinin hajottamisen mallintamiseksi

Suberiinin alifaattisen kerroksen hajoamista jäljitettiin mallisubstraa-teilla eli naftolijohdannaisilla, joissa oli eroja sekä kromoforin (1-naftyyli, 2- naf-35 tyyli, Naftooli AS, Naftooli AS-D) irtotilavuuden että esterisidoksen sisältävän 9 hiiliketjun suhteen. Naftolijohdannaisten substraattiliuoksia (0,5 -1 mM) valmistettiin 1-prosenttisessa asetonissa ja 1-prosenttisessa Triton X-100:ssa 50 mM:ssa Na-sitraattia (pH 5) tai 50 mM:ssa NaP:ta (pH 8). Reaktioseos, joka sisälsi 170 pl substraattiliuosta ja 10 μΙ entsyyminäytettä inkuboitiin 40 °C:ssa 5 20 minuuttia. Inkubaation jälkeen lisättiin 20 μΙ 1-prosenttista Fast Blue BB - suolaväriä ja absorbanssi (1NA substraatit - 450 nm, 2NA substraatit - 510 nm, NAS substraatit - 595 nm, NASD substraatit - 595 nm) mitattiin 10 minuutin li-säinkubaation jälkeen. Entsyymien aktiviteetit määriteltiin vertaamalla standar-dikäyrään, joka tehtiin useille eri 1NA:n, 2NA:n, NAS:n tai NASD:n määrille 10 (värjäytyneet reaktiotuotteet).

Aromaattisia aineita sisältävien suberiinikerrosten hajoamista valvottiin mallisubstraatilla 4-metylumbelliferyyli 4-metyyliferuulihappoesteri (MUFE), joka sisälsi p-kumaronihappojohdannaisia (havaitaan luonnollisessa suberii-nissa), jotka oli esteröity fluoresoivalla molekyylillä (4-metyyliumbelliferoni, 15 4MU). MUFE-testi tehtiin inkuboimalla 190 μΙ 0,1 mM substraattiliuosta ja 10 μΙ entsyymiliuosta 40 °C:ssa. Fluoresenssi mitattiin (Aex = 355 nm; Aem = 465 nm) 20 min inkubaation jälkeen käyttämällä 4- metyyliumbelliferonia (4MU) standardina.

Suberiinin hajoamista mitattiin myös käyttämällä radioaktiivisesti lei-20 mattua suberiinia substraattina. Koivun pinnan tuohesta eristettyä suberiinia leimattiin yhdisteellä [3H]NaBH4. Reaktioseos sisälsi 10 mg suberiinia (5x105 -106 dpm/mg), 1,9 ml puskuria (0,1 % Triton X-100:aa 50 mM:ssa Na-sitraattipuskuria, pH 5, tai 50 mM:ssa Na-fosfaattipuskuria, pH 7) ja 0,1 ml entsyymiliuosta. Re-aktioseosta inkuboitiin 37 °C:ssa, ja 0,1 ml:n reaktionäytteitä otettiin 48 tuntia 25 kestäneen inkubaation aikana. Entsymaattisen toiminnan vapauttamat hydro-lyysituotteet (3H-leimatut monomeerit) uutettiin reaktionäytteistä etyyliasetaatilla, ja näin syntynyt radioaktiivisuus mitattiin nestetuikelaskimella. Entsymaattisen hajoamisasteen (%) määrä todettiin mittaamalla radioaktiivisuus, joka vapautui, kun emäs oli kokonaan hydrolysoinut suberiinin.

30 Menetelmiä kutiinin hajoamisen mallintamiseksi

Kutinaasiaktiivisuutta mallintavaa esteraasiaktiivisuutta mitattiin spekt-rofotometrisellä testillä (hieman muunneltu Davies et ai., 2000), jossa substraattina oli 2,1 mM p-nitrofenyylibutyraattia (p-NPB). Reaktio toteutettiin 0,1 M:ssa natriumfosfaattipuskuria (pH 7,0) 40 °C:ssa 10 minuutin ajan ja vapau-35 tuneen p-nitrofenolin määrä mitattiin 340 nm:ssä käyttämällä standardina kau- 10 pallista p-nitrofenolia. Tällä menetelmällä saatiin sopiva ja nopea testi epäspe-sifille esteraasiaktiivisuudelle.

Myös kutinaasiaktiivisuutta mitattiin käyttämällä 3H-leimattua omena-kutiinia substraattina ja soveltamalla metodologiaa, jonka ovat esittäneet Köller 5 et ai. (1982) ja Davies et ai. (2000). Reaktioseos sisälsi 8 mg kutiinia (5x106 dpm/mg), 1,9 ml reaktioseosta (joka sisälsi 0,025 % Triton X-100:aa 50 mM:ssa Na-fosfaattipuskuria, pH 7,0) ja 0,1 ml entsyymiliuosta. Reaktioseosta inkuboitiin 37 °C:ssa, ja reaktiota seurattiin 24 h. Kutinaasin toiminnan seurauksena vapautuneet hydrolyysituotteet (3H-leimatut monomeerit) uutettiin 0,1 10 ml:n reaktionäytteestä etyyliasetaatilla, ja näin syntynyt radioaktiivisuus mitattiin nestetuikelaskimella. Entsymaattisen hajoamisasteen (%) määrä voidaan todeta mittaamalla radioaktiivisuus, joka vapautuu, kun emäs on kokonaan hydrolysoinut kutiinin.

Esimerkki 2. Polyesterolyyttisten aktiivisuuksien seulonta 15 Kaikkiaan 55 mikro-organismia, joista suurin osa rihmasieniä, seu lottiin, jotta saatiin selville niiden kyky tuottaa suberiinia muuntelevia entsyymejä suberiini-indesoiduissa olosuhteissa. Seulonta perustui viljelysupernatantilla tehtyihin entsymaattisiin kokeisiin (naftoolisubstraattien hydrolyysi ja fluoresoi-vasti leimattu aromaattinen yhdiste ja radioleimattu suberiini, kuten Esimerkis-20 sä 1 on esitetty) ja eroteltujen kiinteiden aineiden GC/MS-analyysiin, jolloin pitkien rasvahappojen, kuten hydroksirasvahappojen ja diolien, lisääntyneet määrät vahvistivat, että mikro-organismi kykeni hajoittamaan suberiinia kasvunsa aikana. Coprinus cinereuksen ja Trichoderma reesein havaittiin olevan potentiaalisia kutiinia/suberiinia hajoittavien entsyymien tuottajia.

25 Esimerkki 3. Polyesteraasia koodavien geenien genomianalyysi Coprinus cinereuksesta

Coprinus cinereuksen todettiin kykenevän tuottamaan polyesteraa-seja, joilla on aktiivisuutta luonnollisissa polyestereissä, kuten kutiinissa ja sub-eriinissa (Esimerkki 2). Coprinus cinereuksen julkaistua genomia 30 (http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/coprinus cinereus/Home.html) käytettiin tunnettujen polyesteraasien (kutinaasien ja suberinaasien) perusteella tehtyihin samankaltaisuushakuihin, ja kuusi erilaista kutinaasi-tyyppistä geeniä löydettiin. Proteiinien samankaltaisuutta analysoitiin ClustalW-monirin-nastusohjelmalla. Geeneistä viisi (CC1G_09668.1, CC1G_03922.1, 35 CC1G_11503.1, CC1G_07482.1 ja CC1G_09365.1) osoitti korkeaa sekvens- 11 sihomologiaa kutinaaseille ja yhdellä (CCIG_05430.1) oli korkeampi homologia asetyyli-ksylaaniesteraasien (AXE) kanssa siten, että esim. sekvenssi-identtisyys Trichoderma reesei AXE1 :n kanssa oli 30%. Tulokset on esitetty kuviossa 1, jossa on osoitettu kutinaasien seriini-aktiivinen kohta ja aspartaatti- ja histi-5 diini-aktiiviset kohdat. Mainituista geeneistä ja vastaavista entsyymeistä käytetään tästä eteenpäin yksinkertaisesti merkintöjä 09668, 03922, 11503, 07482, 09365 ja 05430, vastaavasti.

ClustalW-monirinnastusohjelmalla analysoitujen Coprinus cinereus -kutinaasien väliset sekvenssi-identiteetit on esitetty taulukossa 1. Geeneissä 10 09668, 03922 ja 11503 oli 199 aminohappoa, 07482:ssa oli 200 aminohappoa, 09365:ssa oli 216 ja 05430:ssa oli 229 aminohappoa.

Taulukko 1. Coprinus cinereus -kutinaasien väliset sekvenssi-identiteetit __09668 03922 11503 07482 09365 05430 09668__100______ 03922__88__100_____ 11503__75__76__100____ 07482__60__59__57__100___ 09365__53__53__49__53__100__ 05430 29 | 30 | 25 I 25 24 100

Esimerkki 4. Polyesteraasia koodaavien geenien genomianalyysi Tricho-15 derma reeseistä

Trichoderma reeseillä havaittiin olevan aktiivisuutta kutiinin ja sub-eriinin suhteen (esimerkki 2). T. reesein julkaistua genomia (http://qenome.iqi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html) käytettiin tunnettuihin kutinaaseihin perustuvien hakujen tekemiseen, ja yksi kutinaasi (tyyppinen) geeni (v1.2: tre17732, 20 v2.0: tre60489, teline 7) löydettiin.

Laajojen blast-hakujen tuloksena löydettiin suberinaasi-tyyppinen geeni (v1.2: tre40871, v2.0: tre31227, teline 37). Steptomyces scabiesin sub-erinaasin proteiinisekvenssiä käytettiin ensin haussa, joka tehtiin BLAST-ohjel-malla (blastp) National Center for Biotechnology Information -keskuksessa, 25 NCBI, käyttämällä oletusparametrejä (matriisi: Blosum62, gap costs: olemassaolo 11, laajennus 1). Tämän jälkeen tehtiin oletusparametrejä käyttäen BLAST-haku Trichoderma reesei -genomille fungaalisilla sekvensseillä, joissa 12 oli samankaltaisuutta S. scabies -suberinaasin (joka sisälsi SEST-tyyppisiä alueita) kanssa.

Tämän SEST-alueen sisältävät entsyymit toimivat esteraaseina ja lipaaseina, mutta niiden sekvenssihomologia todellisten lipaasien kanssa on 5 pieni. Näiden entsyymien tertiaarirakenne on olennaisesti erilainen kuin alfa-/beetahydrolaasiperheessä ja ainutkertainen kaikkien tunnettujen hydrolaasien joukossa. Tämän tyyppistä esteraasialuetta sisältäviä proteiineja on löydetty useista erilaisista hydrolaaseista. Rakennetietoa sisältäviin kuuluu Streptomy-ces scabiesista saatava esteraasi (SEST), joka on perunaruven aiheuttaja ja 10 hydrolysoi tietyn esterisidoksen suberiinissa. Joillakin hypoteettisilla tai putatii-visilla proteiineilla on myös havaittu olevan samankaltaisuutta S. scabies -este-raasin kanssa.

Esimerkki 5. Uusien polyesteraasien kloonaus Coprinus cinereuksesta

Kolme erityyppistä polyesteraasia (09668, 07482, 05430), joiden vä-15 linen homologia oli matalin, valittiin esimerkistä 3 yliekspressioon Trichoderma reeseissä. Valituissa kutinaaseissa oli optimaalinen kodonin käyttö ja sopivia natiivisignaalisekvenssejä ekspressioisännälle.

Kromosomi-DNA:n eristämiseksi kasvatettiin Coprinus cinereus -kantaa VTT-D-041011 sienirihmastona nesteviljelyissä, jotka aloitettiin itiöistä. 20 Itiöitä inokuloitiin 50 ml:ssa YP-kasvualustaa ja kasvatettiin kaksi vuorokautta 24 °C:ssa ravistellen. Sienirihmastosta korjattiin sato suodattamalla, ja geno-minen DNA eristettiin Raederin ja Brodan, 1985, menetelmällä. Genomista DNA:ta käytettiin templaattina kahden kutinaasigeenin (CC1G_09668.1, CC1G_07482.1) ja AXE-tyyppisen geenin (CC1G_05430.1) PCR-monistuksiin 25 alukkeilla, jotka oli suunniteltu siten, että ne luovat C-terminaalisen HiS6-tagin, ja joilla oli lambdafaagi-pohjaisia paikkakohtaisia rekombinaatiosekvenssejä. Geenien natiivisignaalisekvenssejä käytettiin. Käytetyt alukkeet olivat: CC1G_09668.1 eteenpäinsuuntaava: sekvenssin nro: 14, CC1GJJ9668.1 käänteissuuntaava: sekvenssin nro: 15, CC1G_07482.1 eteenpäinsuuntaava: 30 sekvenssin nro: 16, CC1G_07482.1 käänteissuuntaava: sekvenssin nro: 17, CC1G_05430.1 eteenpäinsuuntaava: sekvenssin nro: 18, CC1G_05430.1 käänteissuuntaava: sekvenssin nro: 19. PCR-reaktiot toteutettiin lämmönkes-tävällä Phusion-polymeraasilla (Finnzymes, Suomi) valmistajan suosittelemassa reaktioseoksessa. PCR-ohjelmassa oli 30 sekunnin alkudenaturaatiovaihe 35 98 °C:ssa, jonka jälkeen seurasi 25 10 sekunnin jaksoa 98 °C:ssa, 30 sekun nin jaksoa 64 °C:ssa ja 30 sekunnin jaksoa 72 °C:ssa, jossa lämpökäsittely- 13 lämpötilaa laskettiin 1 °C:lla jaksoa kohti, kunnes saavutettiin 50 °C:een lämpötila. Tämän jälkeen seurasi 10 minuutin loppupidennysvaihe 72 °C:ssa. Monistetut PCR-tuotteet rekombinoitiin Gateway donori-vektoriin pDONR221 (In-vitrogen) Gateway Recombination -pakkauksella ja sekvensoitiin. Saadut sek-5 venssit on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2. Kloonatut Coprinus cinereus -kutinaasisekvenssit

Geeni Kloonattu nukleotidi- Johdettu aminohappo- __sekvenssi__sekvenssi_ C. cinereus 09668 sekvenssin nro: 1 sekvenssin nro: 2 klooni 3.1___ C. cinereus 07482 sekvenssin nro: 3 sekvenssin nro: 4 klooni 4.2___ C. cinereus 05430 sekvenssin nro: 5 sekvenssin nro: 6 klooni 5.1 __

Kaksi 09668:n kloonia, 3.1 ja 3.5, sekvensoitiin. Kloonin 3.5 nukleotidisekvens-sien ja genomisekvenssin välillä oli muutamia eroja, mutta kaikki kolme nukleo-tidisekvenssiä koodaavat samaa aminohapposekvenssiä (sekvenssin nro: 2). 10 Julkaistu genomisekvenssl on saatu haploidigenomista, ja se perustuu automaattiseen genomiannotaatioon. Näin ollen kloonattujen geenien sekvenssit voivat erota julkaistujen geenien sekvensseistä. Eroja on voinut syntyä myös PCR:n aikana.

Sekvenssi nro 4 ja sekvenssi nro 6, vastaavasti, eroavat genomista 15 johdetusta aminohapposekvenssistä yhden aminohapon verran. Tämä ero on osoitettu kuviossa 1, jossa kyseiset kaksi erilaista aminohappoa on varjostettu. Kolmen muun kutinaasi-tyyppisen proteiinin sekvenssit CC1G_03922, CC1G_11503, and CC1G_09365 sekvenssit ovat sekvenssilistauksessa, vastaavassa järjestyksessä, sekvenssin nro: 7, sekvenssin nro: 8 ja sekvenssin 20 nro: 9.

Geenit siirrettiin LR-rekombinaatioreaktioilla pDONR221 vektorista Trichoderma reesein expressiovektoriin pMS186, mikä sai aikaan plasmidit pAWP26 (CC1G_09668.1), pAWP27 (CC1G_07482) ja pAWP28 (CC1G 05430.1). Vektori pMS186 sisältää Gateway-lukukehyskasetin C 25 (RfC), joka on sijoitettu cbh1\n (sellobiohydrolaasi 1:n) promoottorin ja termi-naattorin väliin, ja hygromysiiniresitanssikasetin. LR-rekombinaatioreaktio suo- 14 ritettiin käyttämällä Gateway Recombination -pakkausta (Invitrogen) valmistajan ohjeita noudattaen.

Esimerkki 6. Uusien esteraasien kloonaus Trichoderma reeseistä

Trichoderma reeseistä eristettiin kutinaasi- (v1.2: tre17732, v2.0: 5 tre60489, teline 7) ja suberinaasi- (v1.2: tre40871, v2.0: tre31227, teline 37) cDNA RT-PCR:llä Trichoderma reesein cDNA-ekspressiokirjastosta RutC-30 (Margolles-Clark E., et ai., 1996) alukkeilla, jotka oli suunniteltu luomaan C-terminaalin HiS6-tagin ja joilla oli lambdafaagi-pohjaisia paikkakohtaisia rekom-binaatiosekvenssejä; kutinaasi eteenpäinsuuntaava: (sekvenssin nro: 20), 10 käänteissuuntaava kutinaasi: (sekvenssin nro: 21), suberinaasi eteenpäinsuuntaava (sekvenssin nro: 22), käänteissuuntaava suberinaasi: (sekvenssin nro: 23). Kutinaasin natiivisignaalisekvenssiä käytettiin, kun taas suberinaasikon-struktille käytettiin cbhhn signaalisekvenssiä. PCR-reaktiot toteutettiin lämmön-kestävällä Phusion-polymeraasilla (Finnzymes, Suomi) valmistajan suosittele-15 massa reaktioseoksessa. PCR-ohjelmassa oli 30 sekunnin alkudenaturaatio-vaihe 98 °C:ssa, jonka jälkeen seurasi 25 10 sekunnin jaksoa 98 °C:ssa, 30 sekunnin jaksoa 64 °C:ssa ja 30 sekunnin jaksoa 72 °C:ssa, jossa lämpökäsit-telylämpötilaa laskettiin 1 °C:lla jaksoa kohti, kunnes saavutettiin 50 °C:een lämpötila. Tämän jälkeen seurasi 10 minuutin loppupidennysvaihe 72 °C:ssa. 20 Vahvistetut PCR-tuotteet rekombinoitiin Gateway donori-vektoriin pDONR221 (Invitrogen) Gateway Recombination -pakkauksella ja sekvensoitiin. Saadut sekvenssit on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3. Kloonattuja Trichoderma reesei -kutinaasi- ja suberinaasi-sekvenssejä

Geeni Kloonattu nukleo- Johdettu amino- __tidisekvenssi__happosekvenssi T. reesei 17732 (kutinaasi)__sekvenssin nro: 10 sekvenssin nro: 11 T. reesei 40871 (suberinaasi) sekvenssin nro: 12 sekvenssin nro: 13 25

Kutinaasin kloonattu nukleotidisekvenssi ja sen johdettu aminohapposekvenssi olivat molemmat sekä 5 - että 3’-päässä pidempiä kuin T. reesein genomin laskenta-annotaation perusteella ennustettiin.

Kutinaasi- ja suberinaasigeenit siirrettiin LR-rekombinaatioreaktioilla 30 pDONR221 vektorista Trichoderma reesein expressiovektoriin pMS186, mikä sai aikaan plasmidit pAWP24 (kutinaasi) ja pAWP25 (suberinaasi). Vektori 15 pMS186 sisältää Gateway-lukukehyskasetin C (RfC), joka on sijoitettu cbh1:n (sellobiohydrolaasi 1 :n) promoottorin ja terminaattorin väliin, ja hygromysiini-resitanssikasetin. LR-rekombinaatioreaktio suoritettiin käyttämällä Gateway Recombination -pakkausta (Invitrogen) valmistajan ohjeita noudattaen.

5 Esimerkki 7. Uusien polyesteraasien ekspressio Trichoderma reeseissä

Polyesteraasigeenit ekspressoitiin T. reeseissä suuren sellulaasi-geenin cbh1 vahvasti indusoivan promootterin alaisena. Sirkulaarisia ekspres-siovektoreita (5 pg) transformoitiin T. reesein cbh1:n negatiiviseen kantaan VTT-D-04966 PEG-välitteisellä transformaatiolla, olennaisesti Penttilän M. et 10 ai., 1987, kuvaamalla tavalla, ja transformantit valittiin hydromysiiniresistans-siin maljoilla, jotka sisälsivät 125 pg/ml hygromysiiniä B. Kaksi peräkkäistä transformanttikierrosta siveltiin selektiiviselle kasvualustalle ja testattiin PCR:llä genomiin integroinnin osalta. Positiiviset transformantit puhdistettiin yksi-itiö viljelyillä ja niistä testattiin kutinaasiaktiivisuus nesteviljelyissä käyttämällä p-15 nitrofenyylibutyraattia (p-NPB) mallisubstraattina (esimerkki 1). 50 ml viljely-alustaa (TrMM + 4 % laktoosia, 2 % jäteviljaa, 100 mM PIPPS:ää, pH 5,5) in-okuloitiin 1x107 itiöllä ja kasvatettiin enimmillään 10 vuorokautta 28 °C:ssa nopeudella 250 rpm ravistellen. Kaikissa kolmessa Trichoderma konstruktissa, eli niissä, jotka transformoitiin Coprinus geenillä 09668, 07482 ja vastaavasti 20 05430, ilmeni p-NPB aktiivisuutta. Kuusi transformanttia, joissa ilmeni kunkin geenin suurimpia aktiivisuuksia, viljeltiin uudelleen perusteellisemman analyysin tekemiseksi. C. cinereus 09668 vaikutti lupaavimmalta ehdokkaalta, ja sitä viljeltiin laboratorio-mittakaavan käymislaitteessa. Myös kaikkein potentiaalisimmat transformantit (p-NPB:llä tehdyn aktiivisuustestin perusteella), jotka 25 kantoivat T. reesein kutinaasi- tai suberinaasigeeniä valittiin myös käymislaitteessa tapahtuvaan viljelyyn.

Esimerkki 8. Uusien esteraasien tuottaminen laboratoriomittakaavan käymislaitteessa

Kutinaasia tuottavaa transformanttia 09668 (CcCUT) viljeltiin Braun 30 Biostat C -käymislaitteessa (B. Braun Biotech, Saksa), jonka työtilavuus oli 20 litraa. Kasvualusta sisälsi (grammoina Γ1): laktoosia (60), (NH4)2SC>4 (5) ja KH2PO4 (5). Kasvualustan nestafaasi oli tislaajan jäteviljasta tehty vesipitoinen uute, joka oli valmistettu kuumentamalla 60 g Γ1 jäteviljaa 115 °C:ssa 20 minuutin ajan autoklaavissa, jäähdyttämällä ja sentrifugoimalla kiinteiden aines-35 osien poistamiseksi. Sentrifugointisupernatanttia, joka sisälsi sekä typpilähteen 16 että kiihdyttimiä, käytettiin kasvualustassa ainoana nesteenä. Viljelylämpötila oli 28 °C ja pH oli 5,0 - 5,5 (ohjattu lisäämällä ammoniumhydroksidia ja fosfori-happoa). Liuotettu happi pidettiin arvossa >30 % sekoittamalla sitä nopeudella 300...700 rpm ja ilmastamalla jatkuvasti 8 I min'1. Vaahtoamista kontrolloitiin 5 lisäämällä automaattisesti Struktol J633-polyoleaattia vaahtoamisen estämiseksi (Schill & Seilacher, Saksa). Viljelyn jälkeen solut poistettiin sentrifugoi-malla ja viljelysupernatantti tiivistettiin ultrafiltraatiolla käyttämällä Millipore (Ranska) BioMax 10 -kalvoja, nimellinen halkaisija 10 kDa.

C. cinereus -kutinaasia (CcCUT) tuotettiin menestyksellisesti käy-10 mislaitteessa. Kutinaasin tuotanto lisääntyi maksimiin, joka oli yli 8000 nkat ml'1 96 tunnissa (kuvio 2). Kymmenkertaisella viljelysuodoksella oli esteraasiaktiivi-suus (p-NPB:llä), joka oli 70 000 nkat ml"1, kokonaisproteiinisisältö 104 mg ml"1 ja kutinaasimäärä, joka oli noin 23 mg ml'1. Kutinolyyttisen aktiivisuuden läsnäolo viljelysupernatantissa vahvistettiin myös eristetyllä omenakutiinilla ennen 15 lisätutkimuksia (taulukko 4). Kutiinia käsiteltiin viljelysupernatantilla (45 tunnin näyte, p-NPB-aktiivisuus 1780 nkat ml"1) 0,1 % Triton X-100:a läsnäollessa käyttämällä 1000, 5000 ja 20 000 nkat g"1 entsyymiannoksia substraattia (pH 7, 40 °C).

Taulukko 4. CcCUT:n kutinolyyttinen aktiivisuus

Annos (nkat/g) Vapautuneet rasvahapot* __(% substraatista) _Viite__0J1_ _1 000__2,31_ _5 000__3J59_ 20 000 3,78 20 * kokonaismäärä, sisältää mono- ja oligomeerejä

Trichoderma reesei -kutinaasia (TrCUT) ja -suberinaasia (TrSUB) tuottavia transformantteja viljeltiin käymislaitteessa laboratoriossa vastaavalla tavalla kuin edellä on kuvattu CcCUT:n osalta. Kuviossa 3 nähdään entsyymi-25 en aktiivisuudet ajan funktiona.

Esimerkki 9. Rekombinanttientsyymien puhdistus C-terminaalisen His(6)-tagin läsnäolo teki mahdolliseksi CcCUT:n ja TrCUT:n yksivaiheisen puhdistuksen käyttämällä immobilisoitua metalliaffini-teettikromatografiaa (IMAC). Tiivistetty viljelysupernatantti vietiin kelatoivaan 17

Sefaroosi FF kolonniin (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden), joka oli etukäteen ladattu Ni2+:lla ja tasapainotettu 50 mM:lla natriumfosfaattia, joka sisälsi 500 mM NaCI ja 5 mM imidatsolia, pH 7,2. Kolonni pestiin tasapainottavalla puskurilla, jossa oli supplementtina imidatsolia 50 mM (CcCUT:lle) tai 20 5 mM (TrCUT.IIe) sitoutumattoman materiaalin poistamiseksi. Rekombinanttipro-teiini eluoitiin tasapainottavalla puskurilla, jossa oli supplementtina 200 mM imidatsolia, ja fraktioita kerättiin ja seulottiin niiden p-NPB:n aktiivisuuden ja proteiinin läsnäolon suhteen SDS-PAGE:lla. SDS-PAGE (12 % Tris-HCI Ready Gel:iä, Bio-Rad) tehtiin Laemmlin (1970) mukaan käyttämällä Pre-stained 10 SDS-PAGE Standards (Broad Range Cat. no. 161-0318, Bio-Rad tai LMW, Cat. No 17-0446-01, GE Healthcare) ja Coomassie Brilliant Blue:sta (R350; Pharmacia) proteiinien värjäämiseen.

Puhdistettu CcCUT osoitti homogeenisyyttä SDS-PAGE:n suhteen, ja noin 10 grammaa puhdistettua entsyymiä valmistettiin lisäkarakterisointia ja 15 hydrolyysitutkimuksia varten. 3 grammaa TrCUT:a puhdistettiin siten, että valmisteen puhtaus oli noin 95 % (SDS-PAGE analyysin mukaan). TrSUB puhdistetaan samalla tavalla kuin CcCUT ja TrCUT karakterisointia varten.

Esimerkki 10. Uusien polyesteraasien karakterisointi

Puhdistetut Coprinus cinereus (CcCUT) ja Trichoderma reesei 20 (TrCUT) -kutinaasit karakterisoitiin biokemiallisesti koon, aktiivisuuden, substraatin spesifisyyden, pH:n ja lämpötilaominaisuuksien osalta.

Substraatin spesifisyys

Substraatin spesifisyys määritettiin käyttämällä p-nitrofenoleja, jotka oli esteröity asetaatilla (C2), propionaatilla (C3), butyraatilla (C4), valeraatilla 25 (C5), kaproaatilla (C6), kapraatilla (C10), lauraatilla (C12), myristaatilla (C14), palmitaatilla (C16) ja stearaatilla (C18). Substraattidispersioiden konsentraatiot olivat 5 mM. Alempaa p-nitrofenyylistearaatin konsentraatiota (2,5 mM) käytettiin sen heikomman liukenevuuden vuoksi. Aktiivisuustestejä tehtiin kuvatulla tavalla p-nitrofenyylibutyraatille (p-NPB) pH:ssa 7, 40 °C:ssa (esimerkki 1). 30 Saadut spesifit aktiivisuudet on esitetty kuviossa 4. CcCUT:n ja TrCUT:n aktiivisuus oli korkeampi lyhyemmillä (C2 - C10) rasvahapoilla kuin pidemmillä (C16 ja C18). Yllättäen p-NP asetaattien (C2) ja propionaattien (C3) aktiivisuuksien havaittiin olevan selvästi korkeampia kuin p-NPB:llä (C4). CcCUT:n ja TrCUT:n C4/C16 -suhde oli 1,8 ja vastaavasti 3,1. Tyypillisesti kutinaasien 35 aktiivisuus on korkeampi rasvahapoilla C2 - C8, ja suhde C4/C16 on välillä 1 - 18 4. C4/C16 -suhde, joka on noin 1 tai <1 indikoi, että kutinolyyttistä aktiivisuutta ei ole (Kolattukudy, 1984).

□paasi- ja kolesteryyliesteraasiaktiivisuus

Lipaasiaktiivisuutta testattiin käyttämällä oliiviöljyemulsiota sub-5 straattina Kontkasen et ai. (2004) mukaan. Taulukossa 5 on esitetty CcCUT:n ja TrCUT:n lipaasiaktiivisuus.

Kolesteryyliesteraasin (CE) aktiivisuuden määrittämiseen käytetty testi perustui vapautuneen kolesterolin spektrofotometriseen määritykseen Tenkasen et ai. (2002) mukaan tehdyn 4,3 mM:n kolesteryylioleaatin hydrolyy-10 sin jälkeen. CcCUT-valmisteessa ei ilmennyt kolesteryyliesteraasiaktiivisuutta. TrCUT-valmisteen aktiivisuutta ei määritetty.

Proteiinikoe

Proteiinikonsentraatio määritettiin Bio-Rad DC -proteiinitestipak-kauksella (Bio-Rad, Richmond, Kalifornia), jossa standardina käytettiin naudan 15 seerumin albumiinia.

Lämpötilan vakaus

CcCUT:n ja TrCUT:n lämpötilan vakaus tutkittiin inkuboimalla entsyymejä 30 - 80 °C:ssa 1, 3 ja 20 tuntia 5 mg/ml proteiinikonsentraatiossa ja pH:ssa 5 (20 mM natriumasetaattipuskuria). Inkubaatioiden jälkeen jäännösak-20 tiivisuus mitattiin käyttämällä p-NPB:tä substraattina (pH 7 ja 40 °C). CcCUT oli melko vakaa 50 °C:een lämpötiloihin asti, mutta jäännösaktiivisuus laski jyrkästi 60 °C:ssa. TrCUT oli jokseenkin vakaa ja säilytti 80 % aktiivisuudestaan, kun sitä inkuboitiin 50 °C:ssa 20 tuntia tai 60 °C:ssa 1 tunti (taulukko 5).

pH:n vakaus 25 CcCUT:n ja TrCUTin pH:n vakaus määritettiin inkuboimalla puhdis tettuja entsyymiliuoksia eri pH-arvoissa huoneenlämpötilassa ja 50 °C:ssa 20 tuntia. Liuoksen pH säädettiin Mcllvainen puskurilla (0,2 M Na2HP04:a ja 0,1 M sitruunahappoa) pH:ssa 2,2 - 8,0, 0,2 M Tris-HCI -puskuria pH:ssa 7,2 - 9,1 tai 0,2 M glysiini-NaOH-puskuria pH:ssa 8,6 - 10,6, jotta saatiin 5 mg ml'1 prote-30 iinikonsentraatio. Jäännösaktiivisuus mitattiin p-NPB:llä pH:ssa 7 ja 40 °C:ssa. Tulokset on esitetty taulukossa 5. Siitä voidaan nähdä, että molemmat entsyymit olivat aktiivisia laajalla pH-alueella, johon kuului myös hapan alue. CcCUT:n jäännösaktiivisuus oli noin 80 % pH.ssa 3 huoneenlämpötilassa, kun 19 taas jäännösaktiivisuus 50 °C:ssa oli noin 40 % pH:ssa 5 ja noin 100 % pH:ssa 6. Osoittautui, että TrCUT säilytti yli 90 % aktiivisuudestaan pH-alueella 4-7.

pH-optimi

Puhdistettujen kutinaasivalmisteiden esteraasiaktiivisuuksia mitattiin 5 eri pH-arvoilla käyttämällä Mcllvainen puskuria (0,2 M Na2HP04:a ja 0,1 M sitruunahappoa) pH:ssa 2,3 - 8,0, 0,2 M Tris-HCI -puskuria pH:ssa 7,2 - 9,1 ja 0,2 M glysiini-NaOH -puskuria pH:ssa 8,6 - 10,6 käyttämällä p-NPB:tä substraattina. Reaktioaika oli 10 minuuttia 40 °C:ssa. Tulokset on esitetty taulukossa 5. CcCUT:n pH-optimi oli noin 7-8, kun taas TrCUT:lla ilmeni kaksi sello västi erilaista pH-optimia (noin 4 ja 8). TrCUT on siis sopiva happamammalla alueella tapahtuviin käsittelyihin.

Taulukko 5. Coprinus cinereus -kutinaasin 09668 (CcCUT) ja Trichoderma reesei -kutinaasin (TrCUT) biokemiallisia ominaisuuksia

Ominaisuus__CcCUT__TrCUT_

Molekyylipaino, kDa (SDS-PAGE) 22 (20,83) 28 (25,93)

Kypsän proteiinin pituus (aa)__181__231_ Lämpövakaus (pH 5) T1/2 50°C >20 h (70%) >20 h (80%) T1/2 55°C 3 h n.d.

__T1/4 60°C <1h__t5h_ pH-vakaus (20h) 50°C 6-9 4-7 __23°C 4-9__md._ pH-optimi (p-NPB:lla)__7^8__4 ja 8_

Aktiivisuus (nkat mg'1) Lipaasi 234 88 _CE 0_[md_ a) teoreettinen Mw 15 n.d. = ei määritetty (not determined)

Esimerkki 11. Eristetyn omenakutiinin hydrolyysi

Eristettyä omenakutiinia käsiteltiin CcCUT:lla ja TrCUT:lla. Substraatti käsiteltiin entsymaattisesti ja kemiallisesti karbohydraattien ja pektiinin sekä ei-kovalenttisten lipidien poistamiseksi, tässä järjestyksessä. Kutiini sus-20 pendoitiin 0,2 M:ssa natriumfosfaattipuskuria, pH 8, 20 mg ml'1:n konsentraati-ossa ja käsiteltiin CcCUT:lla ja TrCUT:lla 45 °C:ssa 20 tunnin ajan. Entsyy-miannokset olivat 1000 ja 10 000 nkat g'1 substraattia (p-NPB-aktiivisuus), ja käsittelyt tehtiin Triton X-100 -lisäyksellä ja ilman sitä. Hydrolysaatit uutettiin 20 kahdesti 2 MTBE-volyymillä, jotta kaikki rasvahapot, sekä mono- että oligo-meerit, saatiin talteen kiinteästä matriisista. MTBE-uutteessa olevia vapaita rasvahappoja analysoitiin suoraan sekä vapautuneiden oligomeerien alkalihydro-lyysin jälkeen käyttämällä entsymaattista kolorimetristä menetelmää (Free fatty 5 acids, Roche Diagnostics Ltd.) Vapautuneiden rasvahappojen määrä on esitetty taulukossa 6. Molemmat kutinaasit kykenivät hydrolysoimaan omenakutiinia.

Taulukko 6. Omenakutiinin käsittely CcCUT:lla ja TrCUT:lla

Entsyymi Annos _Ei pesuainetta__0,1% Triton X-100 (nkat/g) Monomeerit* Mono- ja Mono- Mono- ja ____oligomeerit* meerit* oligomeerit*

Viite__0__023__051__022__0,63

CcCut 1000__030__2jy\__1^53__1,68 __10 000__030__10,08__097__6,50

TrCut 1000 0,85 1,21 0,57 0,74 * % substraatista, steariinihappona laskettuna (284,5 g/mol)

Esimerkki 12. Koivuntuohen suberiinin hydrolyysi 10 Höyry-räjäytettyä koivun ulommaisen tuohen suberiinia käsiteltiin

CcCUT:lla ja TrCUT:lla vastaavalla tavalla kuin edellä kuvatuissa kutiinikäsitte-lyissä. Tulokset on esitetty taulukossa 7.

Taulukko 7. Koivun tuohen suberiinin käsittely CcCUT:lla ja TrCUT:lla

Entsyymi Annos _Ei pesuainetta__0,1% Tr ton X-100 (nkat/g) Monomeerit* Mono-ja Mono- Mono-ja oligomeerit meerit* oligomeerit* *

Viite__0__004__007__006__0,09

CcCut 1000__030__024__048__0,45 __10 000__1j91__1J5__270__2,67

TrCut 1000 0,31 0,33 0,41 0,40 * % substraatista, steariinihappona laskettuna (284,5 g/mol) 15 Esimerkki 13. Kuorittujen vehnäjyvien käsittely

Kuorittuja vehnäjyviä käsiteltiin kutinaasilla (CcCUT) kuorten poistamiseksi, koska ne koostuvat pääasiassa substituoitumattomasta lineaarisesta ksylaanista ja kutiinikerroksista. Jyviä (2 g) käsiteltiin vesisuspensioissa 21 20 %:n kuiva-ainepitoisuudella 30 °C:ssa 2 tuntia ravistellen (100 rpm). CcCUT testattiin entsyymiannoksista, joissa oli 500 ja 5000 nkat g"1:n substraatti (p-NPB-aktiivisuutena). Kahden erilaisen ksylanaasin ja lipaasin vaikutus tutkittiin myös. Entsyymikäsittelyiden jälkeen tehtiin sentrifugointi (9700 g/10 min) nes-5 te- ja kiinteäfaasien erottamiseksi. Jyvät pestiin vedellä (10 ml) ja sentrifugointi toistettiin. Jyvät pakastekuivattiin ja punnittiin painonmenetyksen analysoimiseksi. Vertailukäsittelyt tehtiin identtisissä olosuhteissa, mutta ilman entsyymi-lisäyksiä. Vapautuneiden rasvahappojen määrä analysoitiin MTBE-uutoksen jälkeen, ja rasvahapot liuotettiin EtOH/Triton/vesi-liuokseen. Pelkistyvät sokerit 10 analysoitiin nestenäytteistä DNS-menetelmällä (Bernfield, 1955).

Vapautuneiden rasvahappojen ja solubilisoitujen hiilihydraattien määrät entsyymikäsittelyjen jälkeen on esitetty taulukossa 8. Siitä voidaan nähdä, että CcCUT selvästi lisäsi käytetyissä olosuhteissa vapautuneiden rasvahappojen määrää. Käsittelyillä ei ollut mitään vaikutusta hiilihydraattien määrään. 15 Jyvien ulkonäössä ei havaittu muutoksia kutiinin kohdistuvaa selektiivistä toimintaa osoittavien käsittelyjen jälkeen.

Taulukko 8. Kuorittujen vehnäjyvien entsymaattinen käsittely Käsittely Annos Muut entsyymit Rasvahapot Hiilihydraatit __(nkat g'1)___(ma)__(mg)

Viite__:__:__0,40__4J_

CcCUT__:__ksylanaasiA 100 nkat g'1__0,32__!T3_

CcCUT__-__ksylanaasiB 100 nkat g'1__0,45__5J)_

CcCUT__500 __OJ53__4,4

CcCUT__5000 __T23__3,7

CcCUT__500__ksylanaasiA 100 nkat g'1__0,88__5J)_

CcCUT 5000__ksylanaasiA 100 nkat g"1__1,02__4J2_

CcCUT__500__ksylanaasiB 100 nkat g'1__1,08__4^9_

CcCUT__5000__ksylanaasiB 100 nkat g'1__0,98__4J5_

CcCUT__:__lipaasiA 1000 nkat g'1__0,77__4T)_

CcCUT 1000__lipaasiA 1000 nkat g'1__1,42___3 J_ 22

Kirjallisuusviittet

Bernfeld, P. (1955) Amylases, a and b. Teoksessa: Colowick, S.P. and Kaplan, N.O. (toim.) Methods of enzymology, Vol 1, Academic press, NY, 5 s. 149-158.

Carvalho, C.M.L., Aires-Barros, M.R., Cabral, J.M.S. (1999) Cuti-nase: from molecular level to bioprocess development. Biotechnol Bioeng. 66:17-34.

Coen, D.M. 2001. The polymerase chain reaction. Teoksessa: 10 Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., More, D.D., Seidman, J.G., Smith, K. and Struhl, K. (toim.) Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons. Inc., Hoboken, USA.

Davies, K.A., de Lorono, I., Foster, S.J., Li, D., Johnstone, K., Ashby, A.M. (2000) Evidence for a role of cutinase in pathogenicity of 15 Pyrenopeziza brassicae on brassicas. Physiol. Mol. Plant Pathol. 57:63-75.

Fett, W.F., Gerard, H.C., Moreau, R.A., Osman, S.F., Jones, L.E. (1992) Cutinase production by Streptomyces spp. Curr Microbiol. 25:165-71.

Garcia-Lepe, R., Nuero, O.M., Reyes, F. (1997) Lipases autolysed cultures of filamentous fungit, Letters in Applied Microbiology. 25(2):127-130 20 Gindro, K., Pezet, R. (1999) Purification and characterization of a 40.8-kDa cutinase in ungerminated conidia of Botrytis cinerea Pers.: Fr. FEMS Microbiol Letters 171:239-243.

Gellissen, G. (toim.) 2005. Production of recombinant proteins. Novel microbial and eukaryotic expression systems. Wiley-VCH Verlag 25 Gmbh&Co. Weinheim, Saksa.

Kolattukudy, P.E. (1984) Cutinases from fungi and pollen. Teoksessa: Lipases (Borgström, B., Brockman, T. Toim.). Elsevier, Amsterdam. 471-504.

Kontkanen, H., Tenkanen, M., Fagerström, R., Reinikainen, T. 30 (2004) Characterisation of steryf esterase activities in commercial lipase prepa rations. J Biotechnol. 108:51-59.

Köller, W., Allan, C.R., Kolattukudy, P.E. (1982) Role of cutinase and cell wall degrading enzymes in infection of Pisum sativum by Fusarium solani f. sp. pisi. Physiol Plant Pathol. 20:47-60.

35 Köller, W., Parker, D.M. (1989) Purification and characterization of cutinase from Venturia inaequalis. Phys Biochem. 79:278-83.

23

Maeda, H., Yamagata, Y., Abe, K., Hasegawa, F., Machida, M., Ish-ioka, R., Gomi, K., Nakajima, T. (2005) Purification and characterization of a biodegradable plastic-degrading enzyme from Aspergillus oryzae. Appi Microbiol Biotechnol. 67:778-88.

5 Margolles-Clark, E., Tenkanen, M., Nakari-Setälä, T., Penttilä, M.

(1996) Cloning of genes encoding alpha-L-arabinofuranosidase and beta-xylosidase from Trichoderma reesei by expression in Saccharomyces cere-visiae. Appi Environ Microbiol. 62(10):3840-6.

Penttilä, M., Nevalainen, H., Rättö, M., Salminen, E., Knowles, J. K. 10 C. (1987) A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei, Gene 61:155-164

Raeder, 1)., Broda, P. (1985) Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett Appi Microbiol. 1:17-20.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 1989. Molecular clon-15 ing: A laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY.

Tenkanen, M., Kontkanen, H., Isoniemi, R., Spetz, P., Holmbom, B. (2002) Hydrolysis of steryl esters by a lipase (Lip 3) from Candida rugosa. Appi Microbiol Biotechnol. 60:120-127.

20 Thompson, J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680.

Trail, F., Köller, W. (1993) Diversity of cutinases from plant patho-25 genic fungi: Purification and characterization of two cutinases from Alternaria brassicola. Physiol Molec Plant Pathol. 42:205-20.

Claims

1. Polyesteraasiproteiini, joka sisältää aminohapposekvenssin, jolla on ainakin 50-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 2 tai 6 kanssa, tai sen 5 variantin, jolla on polyesteraasiaktiivisuutta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, joka mainittu proteiini käsittää sekvenssin nro 4, 7, 8 tai 9 mukaisen aminohapposekvenssin, tai sen variantin, jolla on polyesteraasiaktiivisuutta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, jolla mainitulla prote- 10 iinilla on vähintään 80-, 90-, 95- tai 98-prosenttinen identtisyys sekvenssin nro 2, 4 tai 6 kanssa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, jolla proteiinilla on vähintään kutinaasi- tai suberinaasiaktiivisuutta tai molempia.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen proteiini, jolla lisäksi on li- 15 paasiaktiivisuutta.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, joka proteiini on peräisin sienestä Coprinus, edullisesti Coprinus cinereus.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen proteiini, joka mainittu proteiini on peräisin sienestä C. cinereus, ja sisältää aminohapposekvenssin, joka vas- 20 taa sekvenssiä nro 2, 4, 6, 7, 8 tai 9, tai sen variantin, jolla on vähintään kutinaasi- tai suberinaasiaktiivisuutta tai molempia.

8. Eristetty polynukleotidi, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu: a) polynukleotidista, joka sisältää sekvenssin nro 1, 3, tai 5, mukaisen nukleodisekvenssin, tai nukleotidisekvenssin, joka koodaa patenttivaati- 25 muksen 1 mukaista proteiinia, b) kohdan a) komplementaarisesta säikeestä, ja c) sekvenssistä, joka on degeneroitunut geneettisen koodin suhteen jonkin kohdan a) tai b) mukaisesta sekvenssistä.

9. Vektori, joka sisältää patenttivaatimuksen 8 mukaisen polynukle- 30 otidin.

10. Geneettisesti modifioitu mikro-organismi, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 9 mukaisella vektorilla.

11. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen polyesteraasiprote-iinin tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa transformoidaan 35 mikro-organismi vektorilla, joka sisältää patenttivaatimuksen 8 mukaisen poly- nukleotidin, viljellään transformoitu mikro-organismi olosuhteissa, jotka sallivat mainitun polynukleotidin ekspression, ja otetaan talteen ekpressoitu proteiini.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, jossa polynukle-otidi saadaan sienestä Coprinus cinereus, ja ekspressoidaan isännässä, joka 5 valitaan ryhmästä, joka koostuu seuraavista: Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Aspergillus ja bakteerit, etenkin isäntä on T. reesei.

13. Entsyymivalmiste, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista proteiinia.

14. Menetelmä kutiinin, suberiinin tai muun polyesterin hydrolysoi-10 miseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa kutiinia, suberiinia tai muuta polyesteriä sisältävää materiaalia käsitellään patenttivaatimuksen 1 mukaisella proteiinilla olosuhteissa, jotka sallivat mainitun polyesterin osittaisen hydrolyy-sin tai kokonaishydrolyysin.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, joka menetelmä 15 käsittää vaiheen, jossa maatalous- tai elintarvikeraaka-aineita tai vihanneksista, hedelmistä, marjoista tai viljoista saatuja sivutuotteita käsitellään mainitulla proteiinilla.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, joka menetelmä käsittää vaiheen, jossa puun raaka-aineita, massa- tai paperituotteita, proses- 20 sin jätteitä tai vesiä tai sivutuotteita käsitellään mainitulla proteiinilla.

17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, joka käsittää vaiheen, jossa modifioidaan synteettisiä tai muita ihmisen valmistamia polyesteri-kuituja tai -tekstiilejä mainitulla proteiinilla.

18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, joka käsittää vai-25 heen, jossa mainitulla proteiinilla poistetaan tahroja tai rasvaa pyykistä tai tiskistä.

19. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, joka käsittää vaiheen, jossa depolymerisoidaan kutiinia tai suberiinia mainitulla proteiinilla.

20. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen proteiinin tai patenttivaatimuk-30 sen 13 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö elintarviketeollisuudessa, massa- ja paperiteollisuudessa, tekstiiliteollisuudessa, tai pyykki- ja astianpesusovel-luksissa tai kemiallisessa synteesissä.