FI123867B - Uusia kutinaaseja, niiden tuottaminen ja käytöt - Google Patents

Uusia kutinaaseja, niiden tuottaminen ja käytöt Download PDF

Info

Publication number
FI123867B
FI123867B FI20115328A FI20115328A FI123867B FI 123867 B FI123867 B FI 123867B FI 20115328 A FI20115328 A FI 20115328A FI 20115328 A FI20115328 A FI 20115328A FI 123867 B FI123867 B FI 123867B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
polypeptide
fragment
activity
cutinase
sequence
Prior art date
Application number
FI20115328A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20115328A0 (fi
FI20115328A (fi
Inventor
Johanna Buchert
Tiina Nakari-Setaelae
Hanna Kontkanen
Markku Saloheimo
Antti Nyyssoelae
Mari Haekkinen
Ville Pihlajaniemi
Original Assignee
Teknologian Tutkimuskeskus Vtt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Teknologian Tutkimuskeskus Vtt filed Critical Teknologian Tutkimuskeskus Vtt
Priority to FI20115328A priority Critical patent/FI123867B/fi
Publication of FI20115328A0 publication Critical patent/FI20115328A0/fi
Priority to PCT/FI2012/050356 priority patent/WO2012136898A2/en
Priority to US14/009,796 priority patent/US9783793B2/en
Priority to EP12768424.9A priority patent/EP2694649A4/en
Publication of FI20115328A publication Critical patent/FI20115328A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI123867B publication Critical patent/FI123867B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C02F3/342—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used characterised by the enzymes used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38636—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing enzymes other than protease, amylase, lipase, cellulase, oxidase or reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01074—Cutinase (3.1.1.74)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06L—DRY-CLEANING, WASHING OR BLEACHING FIBRES, FILAMENTS, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR MADE-UP FIBROUS GOODS; BLEACHING LEATHER OR FURS
    • D06L1/00—Dry-cleaning or washing fibres, filaments, threads, yarns, fabrics, feathers or made-up fibrous goods
    • D06L1/12—Dry-cleaning or washing fibres, filaments, threads, yarns, fabrics, feathers or made-up fibrous goods using aqueous solvents
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06L—DRY-CLEANING, WASHING OR BLEACHING FIBRES, FILAMENTS, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR MADE-UP FIBROUS GOODS; BLEACHING LEATHER OR FURS
    • D06L4/00—Bleaching fibres, filaments, threads, yarns, fabrics, feathers or made-up fibrous goods; Bleaching leather or furs
    • D06L4/40—Bleaching fibres, filaments, threads, yarns, fabrics, feathers or made-up fibrous goods; Bleaching leather or furs using enzymes
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21B—FIBROUS RAW MATERIALS OR THEIR MECHANICAL TREATMENT
    • D21B1/00—Fibrous raw materials or their mechanical treatment
    • D21B1/02—Pretreatment of the raw materials by chemical or physical means
    • D21B1/021—Pretreatment of the raw materials by chemical or physical means by chemical means
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

UUSIA KUTINAASEJA, NIIDEN TUOTTAMINEN JA KÄYTÖT Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee uusia polypeptidejä, erityisesti polypeptidejä, joilla on kutinaasiak-tiivisuus myös happamassa pH:ssa. Keksintö koskee myös rekombinanttipolynukleotideja, vektoreita ja isäntäsoluja, jotka ovat käyttökelpoisia mainittujen polypeptidien tuotossa, menetelmää mainitun polypeptidin saamiseksi ja koostumuksia, jotka käsittävät polypepti-din. Edelleen keksintö koskee esterisidosten hydrolyysimenetelmiä ja polypeptidien käytit) tötarkoituksia.
Tunnetun tiedon kuvaus
Kutiini on yleisesti esiintyvä biopolymeeri, jota on kasvien maanpäällisten osien suojaa-15 vassa vahamaisessa kerroksessa. Se koostuu vaihtelevasti substituoiduista rasvahapoista, jotka ovat kytkeytyneet keskenään esteri sidoksilla. Kutiinin tyypillisiä rakennekomponentteja ovat hydroksyyli- ja epoksisubstituoidut ω-hydroksirasvahapot, joilla on Cl6- ja Cl8-hiiliketjut. Kutiinipolymeeri on muodostunut primaaristen alkoholien esteröitymisen kautta. Suberiini on eräs toinen yleinen suojaava biopolymeeri. Sitä on esimerkiksi puiden 20 kaarnassa, korkissa ja juurissa. Suberiini koostuu polyfenolisesta domainista ja polyesteri-domainista. Polyesteridomaini on kemiallisesti samanlainen kuin kutiinissa, mutta voi erota jonkin verran rasvahappokoostumukseltaan (läsnä voi olla pidemmät hiiliketjut omaavia rasvahappoja) ja ristisitoutumisen muodossa. Glyseroli on joissakin lajeissa tärkeä suberii- nin komponentti ja toimii ristisitojana suberiinimonomeerien välillä, co o 25
CvJ
g Kutinaasi! ovat entsyymejä, jotka katalysoivat kutiinin, suberiinin, lipidien vahojen ja mui- o den esterien esterisidosten hydrolyysiä. Kaikki biokemiallisesti hyvin karakterisoidut ku- x tinaasit ovat seriiniesteraaseja, jotka sisältävät Ser-His-Asp-triadin, joka on samanlainen kuin seriiniproteaaseilla ja useilla lipaaseilla (Carvalho et ai., 1998). Kaikilla tunnetuilla m 30 kutinaaseilla on neutraali tai emäksinen pH-optimi matalalla tai mitättömällä aktiivisuudel- ^ la matalassa pH:ssa. Kutinaaseihin, joiden on raportoitu olevan toiminnallisia hieman hap-
C\J
pamassa pH:ssa, kuuluvat seuraavat. Raportissa Shishiyama et ai. (1970) esitettiin yhden Botrytis cinerea -sienestä peräisin olevan kutinaasin omaavan optimaalisen aktiivisuuden pH:ssa 5 ilman havaittavaa aktiivisuutta pH:ssa 4,0 ja tämän alapuolella. Salinas et ai.
2 (1986) kuvaavat Botrytis cinerea -kutinaasin, jolla on pH-optimi välillä 5,5 - 6,0. Mitään tietoja ei kuitenkaan ole annettu entsyymin aktiivisuudesta alemmassa pH:ssa. Eräässä toisessa raportissa Botrytis cinerea -kutinaasista määritettiin pH-optimi 5,6, mutta aktiivisuudesta muilla pH-arvoilla ei annettu mitään tietoa (van der Vlugt-Bergmans et ai., 1997). 5 Yhden Trichoderma reesei -kutinaasin on raportoitu omaavan paikallisen pH-optimin pH:ssa 4 /?-nitrofenyylibutyraatti (pNPB) esteraasiaktiivisuudelle. pH:n vaikutusta hydro-lyyttiselle aktiivisuudelle luonnollisia substraatteja, kutiinia tai suberiinia, vastaan ei kuitenkaan raportoitu tälle entsyymille (W02009007510). Trail ja Köller (1993) kuvaavat kahta kutinaasia Alternaria brassicicola -sienestä, joilla on pH-optimit 6,5:ssä ja 8,5:ssä. 10 Nämä entsyymit omaavat vain vaatimattoman aktiivisuuden pH:ssa 5,0. Köller ja Parker (1989) kuvaavat Venturia inaequalis -kutinaasin, jolla on pH-optimi välillä 6,0 - 7,0. Kirjoittajat eivät kuitenkaan anna mitään tietoja tämän entsyymin aktiivisuudesta pH:ssa alle pH 5,0.
15 Kutinaaseja on ehdotettu joukkoon käyttötarkoituksia, joista ainoastaan muutamat on esitetty tässä. Kutinaaseja voitaisiin käyttää puhdistusaineissa astianpesu- ja pyykki sovellutuksissa. Emäksisen pH-optimin omaavat kutinaasit ovat sopivia käytettäväksi emäksisissä pesuaineissa. Kutinaasit, joilla on hapan - neutraali pH-optimi, voisivat olla sopivia huuhteluaineisiin, kevytpesuaineisiin ja teollisuuspuhdistusaineisiin (WO9403578).
20
Tekstiiliteollisuudessa käytettäväksi on kehitetty biohankausmenetelmä, joka käyttää kutinaaseja puuvillassa olevan vahamaisen kerroksen poistamiseksi (Agrawal, 2005). Kutinaaseja on käytetty myös polyesterikuitujen pintojen muokkaamiseksi (E1S2002007518) ja villakankaiden huopumisen estossa (CN101565902).
CO
S 25 c\j σ> Hydrolyyttisten reaktioiden lisäksi kutinaaseja voidaan käyttää katalysoimaan inter- ja i o transesterifikaatioreaktioita sekä myös esterien synteesiin (Pio ja Macedo, 2009; Pinto- x Sousa et ai., 1994; de Barros et ai., 2009). Lähiaikoina on patentoitu kutinaasien käyttö
CL
kuumankestävällä mykotoksiinilla zearalenoni saastuneiden rehutuotteiden detoksifikaati-co 30 oon (US2009162480). Kutinaaseja on myös ehdotettu käytettäväksi yhdistelmänä muiden ^ hydrolyyttisten entsyymien kanssa kasvimateriaalien hajottamiseen (US20090325240) ja
C\J
puuta sisältävän materiaalin esikäsittelyyn (W02009042622).
3
Elintarvike-, maatalous- ja metsäteollisuuden tuottamissa vähäarvoisissa jätemateriaaleissa on suuria määriä kutiinia ja suberiinia. Nämä vahamaiset materiaalit ovat hydrofobisia ja niiden rakenne on hankalasti käsiteltävä. Ne voivat siten haitata kasvimateriaalien teollista prosessointia. Polyesteraasien käyttö voisi parantaa useiden kasvimateriaalien kuten viljo-5 jen, hedelmien, vihannesten ja marjojen prosessointia ja hyödyntämistä ja parantavat myös arvokkaiden bioaktiivisten ja funktionaalisten komponenttien vapautumista ja talteenottoa näistä materiaaleista.
Kutiinia on esimerkiksi hedelmien, vihannesten ja marjojen prosessointijätteissä. Lisäksi 10 metsäteollisuus tuottaa suuria määriä kuorijätettä, josta suberiini on pääkomponentti. Nämä polyesterimateriaalit ovat rikas arvokkaiden kemikaalien lähde, jolla on mahdollista käyttöä esimerkiksi voiteluaineiden ja sideaineiden tuotossa.
Useat näistä yllä kuvatuista polyesteriä sisältävistä materiaaleista ovat happamia. Niiden 15 laajoista mahdollisuuksista huolimatta tunnettujen kutinaasien sovellettavuus on rajallista, koska raportoidut kutinolyyttiset ja suberinolyyttiset aktiivisuudet ovat joko heikot tai olemattomat matalassa pH:ssa. Tämä tarkoittaa, että happamia materiaaleja ei voida hydrolysoida tunnetuilla kutinaaseilla. Lisäksi pH-väli, jolla tunnetut kutinaasit ovat aktiivisia, on tyypillisesti kapea. Tunnettuja kutinaaseja voidaan siten käyttää vain rajallisissa olosuh-20 teissä, mikä on merkittävä epäkohta teollisissa prosesseissa erityisesti, kun edellytetään entsyymiseosten käyttöä. On olemassa tarve kutinaaseille, jotka ovat stabiileja ja aktiivisia laajalla pH-välillä happamasta neutraaliin. Esillä oleva keksintö tyydyttää tämän tarpeen.
Keksinnön tavoitteet ja yhteenveto o 25
CvJ
g Esillä olevan keksinnön tavoite on tuoda esille uusia polypeptidejä tai polypeptidien frag- o mentteja. Erityisesti tämän keksinnön tavoite on tuoda esille polypeptidejä, joilla on este- x raasi- ja edullisesti kutinaasi-, suberinaasi- ja/tai lipaasiaktiivisuus happamassa pH:ssa, ja polypeptidejä, jotka ovat käyttökelpoisia laajalla pH-välillä. Lisäksi tavoitteena on tuoda g 30 esille nukleotideja, jotka koodaavat mainittuja polypeptidejä, keinoja mainittujen polypep- g tidien tuottamiseksi ja polypeptidejä sisältäviä valmisteita.
CVJ
4
Keksinnön ensimmäinen näkökanta on uusi polypeptidi. Ominaista polypeptidille on, että se käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 70 % sekvenssin identtisyys sekvenssin SEQ ID NO 1 tai mainitun polypeptidin fragmentin kanssa.
5 Keksinnön toinen näkökanta on rekombinantti polynukleotidi. Ominaista polynukleotidille on, että se käsittää nukleotidisekvenssin, jolla on ainakin 80 % identtisyys sekvenssin SEQ ID NO 2 nukleotidien 52 - 606 tai sekvenssin SEQ ID NO 3 nukleotidien 7-561 tai näiden kanssa komplementaarisen juosteen tai sekvenssin SEQ ID NO 2 kodoni-optimoidun sekvenssin kanssa.
10
Keksinnön kolmas näkökanta on vektori. Ominaista vektorille on, että se käsittää keksinnön polynukleotidin.
Keksinnön neljäs näkökanta on isäntäsolu. Isäntäsolulle ominaista on, että se on transfor-15 moitu keksinnön vektorilla.
Keksinnön viides näkökanta on menetelmä keksinnön polypeptidin saamiseksi. Keksinnön mukaan menetelmä käsittää mikro-organismin transformoimisen tämän keksinnön vektorilla, transformoidun mikro-organismin kasvattamisen olosuhteissa, jotka sallivat mainitun 20 polynukleotidin ilmentymisen, ja ilmennetyn polypeptidin talteenoton.
Keksinnön kuudes näkökanta on entsyymivalmiste. Entsyymivalmisteelle on ominaista, että se käsittää polypeptidin tai sen keksinnön mukaisen fragmentin.
co o 25 Keksinnön seitsemäs näkökanta on menetelmä esterisidosten hydro ly soimi seksi. Keksin- g nön mukaan menetelmä käsittää esterisidoksia sisältävän materiaalin saattamisen yhteen o mainitun tämän keksinnön mukaisen polypeptidin tai sen fragmentin kanssa hydrolyysille x sopivissa olosuhteissa.
CL
00 co 30 Keksinnön kahdeksas näkökanta on trans- tai interesteröinnin menetelmä. Keksinnön mu in ^ kaan menetelmä käsittää esteröitävän materiaalin saattamisen kosketuksiin tämän keksin- o
CVJ
nön polypeptidin tai fragmentin kanssa esteröintiin sopivissa olosuhteissa.
5
Edelleen yhdeksäs keksinnön näkökanta on tämän keksinnön polypeptidin tai fragmentin tai tämän keksinnön entsyymi valmisteen käyttö elintarviketeollisuudessa sellu- tai paperiteollisuudessa, detoksifikaatiosovellutuksissa, tekstiiliteollisuudessa tai pyykki- tai astian-pesusovellutuksissa tai kemiallisissa synteeseissä.
5
Keksinnön edulliset suoritusmuodot ja edut on kuvattu seuraavassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa viitaten liitettyihin piirroksiin.
Piirrosten lyhyt kuvaus 10
Kuvio 1. Sirococcus conigenus -kutinaasin aminohapposekvenssin rinnastus muiden sienten kutinaasisekvenssien kanssa. Lyhenteet: Scsc - Sclerotinia sclerotiorum (GenBank XP_001558272), Boci - Botrytis cinerea (GenBank ΧΡ 001558272), Mofr - Monilirtia fructicola (Uniprot Q8TGB8), ScCut - Sirococcus conigenus, Fuso - Fusarium solani f. sp. 15 pisi (GenBank P00590). Identtiset tähteet on kehystetty mustalla kun taas samankaltaiset tähteet on kehystetty harmaalla. Katalyyttiseen triadiin kuuluvat kolme aminohappoa (Ser, His, Asp) on merkitty suorakaiteilla.
Kuvio 2. ScCut-geeniä ilmentävän Pichia pastoris -transformantin kasvatusliuoksen 20 /;NPB-esteraasiaktiivisuus (pH:ssa 3,5).
Kuvio 3. ScCutrn esteraasin (/;NPB:n hydrolyysinä) ja kutiinin hydrolysoiva tehokkuus. Esteraasiaktiivisuudet määritettiin kineettisesti 25 °C:ssa. Vapautuneet kutiinin mono- ja oligomeerien määrät määritettiin 40 °C:ssa 24 h ajan ja esitetään prosentteina maksimista, o 25 Virhepylväät edustavat standardipoikkeamia.
i O) o o Kuvio 4. Jäljelle jäänyt ScCutrn /;NPB-esteraasiaktiivisuus 24 h 40 °C:ssa inkubaation x jälkeen.
CL
00 oo 30 Kuvio 5. Rasvahappoketjun pituuden vaikutus ScCut-kutinaasin esterolyyttiseen aktiivi- ^ suuteen määritettynä 25 °C:ssa ja pH:ssa 4,5.
CVJ
5 6
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Keksintö tuo esille uusia polypeptidejä, jolla on sekvenssi SEQ ID NO 1 tai ainakin 70 % identtisyys sekvenssin SEQ ID NO 1 kanssa.
Yhdessä keksinnön suoritusmuodossa polypeptidi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on ainakin 70 %, edullisesti ainakin 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % tai 99 % identtisyys sekvenssiin SEQ ID NO 1 nähden tai mainitun polypeptidin fragmentti. Edelleen yhdessä suoritusmuodossa polypeptidi koostuu aminohapposekvenssistä, jolla on ainakin 70 %, 10 edullisesti ainakin 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % tai 99 % identtisyys sekvenssiin SEQ ID NO 1 tai sen fragmenttiin nähden.
Kuten sitä tässä käytetään, tarkoittaa termi ’’identtisyys” sekvenssien identtisyyttä kahden aminohapposekvenssin tai nukleotidisekvenssin välillä verrattuna toisiinsa. Erityisesti 15 identtisyys tarkoittaa sekvenssien vastaavien fragmenttien globaalia identtisyyttä. Alan ammattilaiselle on ilmeistä, että esim. kypsä polypeptidi ei ole verrattavissa signaalipepti-din omaavaan polypeptidiin. Sekvenssien identtisyys määritetään käyttäen ClustalW-rinnastusta (esim. osoitteessa www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw) käyttäen oletusasetuksia ja Blosum62:a substituutiomatriisinä (Thompson et ai., 1994).
20 Tässä yhteydessä termi ’’fragmentti” tarkoittaa sellaista osaa sekvenssistä SEQ ID NO 1, joka pystyy ilmentämään ainakin yhtä kypsän polypeptidin aktiivisuutta. Fragmentin aktiivisuus on edullisesti ainakin 30 % kypsän proteiinin aktiivisuudesta. Yhdessä suoritus-muodossa aktiivisella fragmentilla on ainakin osa sekvenssissä SEQ ID NO 1 määritellyn o 25 polypeptidin aktiivisuuksista, edullisesti sillä on ainakin 40 %, edullisemmin 50 %, 60 %, o) 70 %, 80 %, 90 % tai jopa olennaisesti sama aktiivisuus kuin kypsällä proteiinilla (eli sek- i o venssin SEQ ID NO 1 aminohapoilla 18 - 202, joita koodaa sekvenssin SEQ ID NO 2 nuk- x leotidit 52 - 606 ja sekvenssin SEQ ID NO 3 nukleotidit 7 - 561). Yhdessä suoritusmuo-
CL
dossa aktiivinen fragmentti käsittää ainakin 73 aminohappoa, edullisesti sekvenssin SEQ m 30 ID NO 1 aminohapot 116 - 188. Tässä suoritusmuodossa fragmentin identtisyys on ainakin ^ 76 %, edullisesti ainakin 80 %, edullisemmin ainakin 85 %, 90 %, 95 % tai jopa 98 %.
C\l Tämän keksinnön polypeptidit ovat erityisesti esteraasientsyymejä, jotka kuuluvat alaluokkaan EC 3.1.1 (järjestön International Union of Biochemistry and Molecular Biology ni 7 mistö) ja jotka hydrolysoivat karboksyylihappoestereitä muodostaen alkoholia ja karbok-syylihappoanionin. Tyypillisesti tämän keksinnön entsyymeillä on aktiivisuutta useita substraatteja kohtaan.
5 Polyesterit ovat polymeerejä, jotka sisältävät funktionaalisen esteriryhmän. Polyesterit voivat olla synteettisiä (kuten esimerkiksi polyetyleenitereftalaatti, polykaprolaktoni ja poly-laktaatti) tai luonnollisia (kuten esimerkiksi suberiini ja kutiini).
Kutinaasit (kutiinihydrolaasit, EC 3.1.1.74) ovat seriiniesteraaseja, jotka sisältävät tyypilli-10 sesti seriinihydrolaasien Ser, His, Asp -triadin ja katalysoivat kutiinin ja suberiinin karbok-syyliesterisidosten, mutta myös lipidien, vahojen ja muiden polyesterien ja esterien, hydro-lyysiä. Suberinaasi on entsyymi, joka katalysoi suberiinin hajottamista. Lipaasit (triasyyli-glyserolilipaasit E C. 3.1.13) ovat esteraaseja, jotka hydrolysoivat veteen liukenemattomia substraatteja kuten pitkäketjuisia triglyseridejä substraatin ja veden rajapinnalla. Esteraasit 15 kuten karboksyyliesteraasit (E C. 3.1.1.1) voivat myös hydrolysoida karboksyylihappojen vesiliukoisia estereitä.
Keksinnön yhdessä suoritusmuodossa on polypeptidillä tai sen fragmentilla ainakin yksi esteraasiaktiivisuus. Eräässä toisessa suoritusmuodossa aktiivisuus on kutinaasiaktiivisuus, 20 edelleen yhdessä suoritusmuodossa aktiivisuus on suberinaasiaktiivisuus ja edelleen vielä yhdessä suoritusmuodossa aktiivisuus on lipaasiaktiivisuus. Edullisemmassa suoritusmuodossa polypeptidillä tai sen fragmentilla on kaksi yllä määritellyistä aktiivisuuksista, edullisimmin kaikki kolme mainituista aktiivisuuksista.
co o 25 Yhdessä keksinnön suoritusmuodossa keksinnön polypeptidi tai sen fragmentti on aktiivien) nen alle pH 5:ssä, edullisesti alle 4,5:ssä, edullisemmin alle 4:ssä, alle 3,5:ssä tai alle o i o 3,0:ssa, edullisimmin alle 2,5:ssä tai jopa noin 2:ssa. Happamat olosuhteet kutinaasikäsitte- x lylle ovat edullisia esimerkiksi prosessoitaessa elintarvike- ja rehutuotteita, koska mikrobi-
CL
kontaminaation riski on alentunut matalassa pH:ssa. co CU o r\ co 30 m ^ Yhdessä keksinnön suoritusmuodossa keksinnön polypeptidi tai sen fragmentti on aktiivi- cu nen polyestereitä vastaan välillä pH 2,5 - 7,5; edullisesti välillä 3,5 - 6,5. pH-optimi kutiinin hydrolyysille on välillä pH 3,5 - 4,5. Polypeptidillä on myös paikallinen pH-optimi välillä pH 6 - 7. Aktiivisuus on hyvin korkea myös näiden kahden optimin välissä, suu 8 rempi kuin 85 % maksimiaktiivisuudesta. pH-optimi /»NPB-esteraasiaktiivisuudelle on välillä 4,5 - 5.
Yhdessä suoritusmuodossa polypeptidi tai sen fragmentti on aktiivinen rasvahappopolyes-5 tereille.
Leveä pH-väli korkealle aktiivisuudelle (katso esimerkki 6 ja kuviot 3 ja 4) saa tämän entsyymin sopivaksi käytettäväksi erilaisissa prosessiolosuhteissa, mahdollisesti yhdessä muiden entsyymien kanssa.
10
Yhdessä keksinnön suoritusmuodossa keksinnön polypeptidi tai sen fragmentti on stabiili pH-välillä 2,0 - 8,0 40 °C:ssa tai alemmissa lämpötiloissa. Edullisessa suoritusmuodossa entsyymillä on 80 %, edullisemmin 90 %, stabiilisuus pH-välillä 3,5 - 7,5 40 °C:ssa tai alemmassa lämpötilassa. Laaja pH-stabiilisuus on etu prosesseissa, joissa pH-olosuhteet 15 muuttuvat prosessin aikana. Keksinnön polypeptidin pH-ominaisuudet on analysoitu esimerkissä 6.
Keksinnön polypeptidi (tai sen fragmentti) on aktiivinen matalassa pH:ssa eri molekyyli-massat omaavia substraatteja vastaan polyestereistä kuten kutiinista tai suberiinista pie-20 nempiin molekyyleihin kuten pNPB:hen asti. Tämä voi olla etu, kun hydrolysoidaan erityyppisiä esteröityjä aineita sisältäviä materiaaleja.
Yhdessä keksinnön suoritusmuodossa polypeptidi tai sen fragmentti saadaan suoraan tai epäsuoraan Sirococcus-sienestä, edullisesti Sirococcus conigenus -sienestä. Discella, Hy-o 25 poderma, Hysterium ja Phoma ovat Sirococcus-sienen synonyymejä. Discella strobilina, σ> Hypoderma conigenum, Hysterium conigenum, Phoma conigena ja Sirococcus strobilinus i o ovat Sirococcus conigenus -sienen synonyymejä. Tässä yhteydessä ’’saatu suoraan” tarkoit- x taa, että polypeptidi tai fragmentti on tuotettu Sirococcus-sienellä, kun taas ’’saatu epäsuo-
CL
raan” tarkoittaa, että geeni tai sekvenssitieto on olennaisesti peräisin Sirococcus-sienestä, co 30 Siten synteettinen polypeptidi, jolla on sekvenssin SEQ ID NO 1 aminohapposekvenssi (eli 5 Sirococcus conigenus -sienestä peräisin olevan kutinaasin polypeptidisekvenssi) kuuluu
C\J
tämän keksinnön piiriin.
9 Täytyy ymmärtää, että kannasta saadun geenin tai polypeptidin sekvenssiä voidaan muokata siten, että koodatun polypeptidin tai fragmentin aktiivisuus ei olennaisesti muutu, ja sama pätee mahdollisiin translaation jälkeisiin modifikaatioihin tai synteettisen polynukleoti-din tai polypeptidin modifikaatioihin. Tyypillinen polypeptidiä koodaavien nukleotidien 5 modifikaatio on kodonin optimointi tuotannon parantamiseksi vieraissa tuotantoisännissä. Esimerkkejä post-translationaalisista modifikaatioista ovat glykosylaatio, fosforylaatio tai pilkkominen pienemmiksi fragmenteiksi.
Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa keksinnön polypeptidi tai sen fragmentti tuotetaan 10 käyttäen rekombinanttiteknologiaa.
Keksintö kohdistuu myös rekombinanttipolynukleotideihin, jotka koodaavat keksinnön polypeptidejä. Rekombinanttipolynukleotidi eristetään luovuttajaorganismin genomista tai monistetaan luovuttajaorganismin genomi templaattina tai syntetisoidaan perustuen luovut-15 tajaorganismin nukleotiditietoon ja siirretään tuotanto-organismiin. Uskotaan, että optimaaliset kodonit auttavat saavuttamaan suuremmat translaationopeudet ja suuren tarkkuuden erilaisissa isäntäorganismeissa, joten alan ammattilainen ymmärtää, että myös kodoni-en suhteen optimoidut sekvenssit kuuluvat keksinnön piiriin.
20 Tämän keksinnön polypeptidit tai fragmentit tai niitä koodaavat polynukleotidit voidaan tunnistaa, eristää, kloonata ja tuottaa alalla tunnetuilla menetelmillä.
Vektorit, jotka sisältävät tämän keksinnön polypeptidiä tai fragmenttia koodaavan nukleotidin, ovat myös tämän keksinnön piirissä. Vektorit voidaan tuottaa alalla tunnetuilla mene-co o 25 telmillä. Tyypillisesti ekspressiovektorit sisältävät välineet (ainakin promoottorin ja lope- g tussignaalin, jotka on toiminnallisesti kytketty tuotettavaan polypeptidiin) translaation sää- o telemiseksi halutussa tuotto-organismissa ja mahdollisesti välineet selektiota ja kohdistet- x tua transformaatiota varten. Vektori voi myös sisältää tuottoisännälle optimaalisen signaa-
CL
lisekvenssin.
oo cu ΛΛ co 30 m ^ Vektori transformoidaan sitten isäntäorganismiin, yleensä isäntäsoluun. Stabiili transfor- cu mäntti on edullinen ja se on myös edellytys suuren mittakaavan tuotannolle. Voidaan käyttää mitä tahansa alalla tunnettua menetelmää. Sopiviin isäntiin kuuluvat sienet, hiivat, bakteerit kuin myös eläin- ja hyönteissolut. Rihmasienet kuten Trichoderma ja Aspergillus 10 ovat esimerkkejä sopivista sieni-isännistä, Saccharomyces, Hansenula, Kluyveromyces ja Pichia ovat esimerkkejä sopivista hiivaisännistä ja Bacillus, Escherichia, Streptomyces, Lactobacillus, Lactococcus ja Pseudomonas ovat esimerkkejä sopivista bakteeri-isännistä. Isäntää kasvatetaan sitten olosuhteissa, jotka mahdollistavat halutun polypeptidin ilmenty-5 misen. Ilmentymistasoa voidaan kasvattaa tunnetuilla menetelmillä kuten käyttämällä useampaa kopiota transloitavasta geenistä tai ilmentämällä geeniä vahvan promoottorin kuten Trichoderman cbhl alaisuudessa tai käyttämällä isäntää, jossa yksi tai useampi endogeeni-nen geeni on käännetty päälle tai poistettu. Esim. Gellissen (2005) kuvailee polypeptidien rekombinanttituotantoa erilaisissa isäntäjärjestelmissä.
10
Edullisessa suoritusmuodossa polypeptidi (tai fragmentti) eritetään kasvatusliuokseen. Valmiste voi siten olla käytettyä kasvatusliuosta, joka sisältää polypeptidin (yleensä solujen erottamisen jälkeen). On kuitenkin myös mahdollista hajottaa isäntäsolut (jos polypep-tidituotetta ei eritetä) ja siten vapauttaa polypeptidi käyttöä tai talteenottoa varten. Polypep-15 tidi voidaan puhdistaa korkeampaan puhtausasteeseen tunnetuilla menetelmillä kuten suodattamalla, konsentroimalla, affiniteettimenetelmillä jne. ja formuloida tarvittaessa lopulliseksi tuotteeksi. Lisäksi, sovellutuksesta riippuen, on mahdollista, että valmiste sisältää myös tuotantoisännän.
20 Tässä yhteydessä ’’entsyymivalmiste” on mikä tahansa koostumus, joka käsittää keksinnön polypeptidin/polypeptidit tai fragmentin/fragmentit. Läsnä voi mahdollisesti olla muita entsyymejä ja komponentteja (kuten stabilisaattoreita, pinta-aktiivi siä aineita tai puskuroin-tiaineita) riippuen soveltamisen alasta. Keksinnön polypeptidiä voidaan esimerkiksi käyt-tää komponenttina kasvimateriaalia hajottavassa entsyymicocktailissa, joka sisältää mitkä o 25 tahansa seuraavista entsymaattisista aktiivisuuksista: esim. proteaasi, sellulaasi, ligninaasi, σ> beetta-glukosidaasi, hemisellulaasi, ksylanaasi, alfa-amylaasi, amyloglukosidaasi, pek- i o tinaasit, lakkaasi, peroksidaasi, ripaasi tai ekspansiini. Edelleen voidaan esim. proteaasia, x alfa-amylaasia, lipaasia, sellulaasia, ksylanaasia, beetta-glukanaasia, pektinaasia, lipoksy-
CL
genaasia, peroksidaasia tai lakkaasia käyttää pesuainekoostumuksessa yhdessä esillä ole- co 30 van keksinnön polypeptidin kanssa. Polypeptidi voi valmisteessa olla missä tahansa yllä g käsitellyssä muodossa.
c\j
Yhdessä keksinnön suoritusmuodossa saadaan polypeptidi transformoimalla mikro-organismi vektorilla, joka sisältää polypeptidiä koodaavan polynukleotidin. Stabiili trans- 11 formaatio, esim. tuotantokonstruktin integroiminen isännän genomiin, on edullinen. Isän-täsolua kasvatetaan sitten olosuhteissa, jotka ovat sopivia polynukleotidin ilmentämiseksi. Nämä olosuhteet riippuvat suuresti isännän tyypistä. Polypeptidi otetaan edullisesti talteen keräämällä kasvatusliuos, johon polypeptidi eritetään, mutta myös muut keinot ovat mah-5 dollisia.
Tämän keksinnön piiriin kuuluu myös esterisidosten hydrolyysimenetelmä, jossa este-risidoksia sisältävä materiaali saatetaan yhteen tämän keksinnön polypeptidin (tai fragmentin) kanssa hydrolyysiin sopivissa olosuhteissa.
10
Menetelmä on sopiva kutiini- tai suberiinimonomeerien tai -oligomeerien vapauttamiseksi kasvimateriaalista kutiinista tai suberiinista peräisin olevien kemikaalien kuten polymeeri-lisäaineiden, polyesterien, polyuretaanien, funktionalisoitujen polymeerien, pehmentimien, voiteluaineiden, kytkentäaineiden, hajotusaineiden, pohjaöljyjen, korroosionestäjien, ras-15 van sakeuttajien, biodieselin, alkyydihartsien, polyuretaanihartsien, kuivausöljyjen, paino-musteen lisäaineiden, kostutusaineiden, viskositeetinmuuttajien, emulgaattorien, stabilaat-torien, päällysteiden, rakennetta parantavien lisäaineiden, antioksidanttien, väriaineiden, makuaineiden, ravintolisäaineiden, kosmeettisten tuotteiden, lääkkeiden (esim. UV-suojaa, ikääntymisenestoa, hyperkolesterolemian hoitoa, mutageneesin estoa ravinnon karsinogee-20 nien adsorptiota varten), texturized rasvojen, terveydelle hyödyllisten rasvojen tuotantoa varten tai trans- tai interesterifikaatioreaktioiden reaktanteiksi.
Yksi erityinen suoritusmuoto on menetelmä esimerkiksi vihanneksista, hedelmistä, rypä-leistä, marjoista tai viljoista saatujen maatalouden tai elintarvikkeiden raaka-aineiden tai o 25 sivutuotteiden käsittelemiseksi keksinnön polypeptidillä tai fragmentilla bioaktiivisten yh- g disteiden (esimerkiksi polyfenolien) vapauttamiseksi alkuperäisestä biomatriisista tai kas- o vin pintarakenteen avaamiseksi muita hajottavia entsyymejä, esimerkiksi sellulaaseja, lig- x ninaaseja, hemisellulaaseja, pektinaaseja tai ksylanaaseja varten. Lisäksi käsittely keksin- nön polypeptidillä tai fragmentilla voi auttaa näiden materiaalien prosessointia.
cu ΛΛ co 30 m ^ Eräs toinen suoritusmuoto on menetelmä puuraaka-aineiden, sellu- ja paperituotteiden tai
CM
prosessijätteiden tai -vesien tai sivutuotteiden käsittelemiseksi mainitulla proteiinilla sub-eriinioligomeerien tai -monomeerien vapauttamiseksi ja/tai puun tai puusta peräisin olevi- 12 en materiaalien prosessoinnin avustamiseksi käyttämällä tämän keksinnön polypeptidiä tai fragmenttia.
Eräs toinen suoritusmuoto on menetelmä tekstiilien valmistuksessa, elektroniikkateollisuu-5 dessa tai biolääketieteessä käytettyjen materiaalien muokkaamiseksi sovellutuksissa, joissa edellytetään näiden materiaalien hydrofiilisyyden lisäystä, käyttämällä tämän keksinnön polypeptidiä tai fragmenttia.
Yksi suoritusmuoto on menetelmä synteettisten tai muiden valmistettujen polyesterikuitu-10 jen tai tekstiilien muokkaamiseksi käyttäen tämän keksinnön polypeptidiä tai fragmenttia.
Edelleen yksi suoritusmuoto on menetelmä pinttyneen lian tai rasvan poistamiseksi pyykistä ja tiskeistä käyttämällä tämän keksinnön polypeptidiä tai fragmenttia.
15 Eräs toinen suoritusmuoto on menetelmä makua parantavien rasvahappojen vapauttamiseksi maitorasvasta meijerituotteisiin käyttämällä tämän keksinnön polypeptidiä tai fragmenttia.
Eräs toinen suoritusmuoto on menetelmä toksisten tai haitallisten esteriyhdisteiden kuten 20 kasvinsuojeluaineiden tai muovien hajottamiseksi käyttämällä tämän keksinnön polypeptidiä tai fragmenttia.
Eräs toinen suoritusmuoto on menetelmä maataloudessa käytettyjen kemikaalien farmakologisten vaikutusten lisääminen tämän keksinnön polypeptidillä tai fragmentilla.
CO
δ 25
(M
g Tämän keksinnön erilaiset suoritusmuodot, erityisesti sekvenssin SEQ ID NO 1 omaavan o polypeptidin tai sen pienempien fragmenttien (pienempien polypeptidien) rakenteelliset ja x toiminnalliset ominaisuudet, voidaan yhdistää rajoituksetta.
CL
00 g 30 Yllä kuvatut suoritusmuodot ja esimerkit ja tähän liitetyt piirrokset on annettu ainoastaan ^ havainnollistamistarkoituksessa ja ne on tarkoitettu ei-rajoittaviksi. Keksinnön piiri on
CVJ
määritelty seuraavissa patenttivaatimuksissa, jotka pitää tulkita koko laajuudessaan ja ottaen vastaavuudet huomioon.
13
Esimerkit
Esimerkki 1: Määäritysmenettelytapa 5 1. Kutinaasimääritys käyttäen 3H-leimattua kutiinia
Omenan kutiini eristettiin kuten kuvattu aikaisemmin artikkelissa Halonen et ai. (2009). Rutiinin hydrolyysin laajuus määritettiin käyttäen 3H-leimattua kutiinia substraattina aiemmin kuvatun menetelmän muunnelmalla (Davies et ai, 2000). Tässä menetelmässä mi-10 tataan kutiinisubstraatista liuokseen vapautuneiden hydrolyysituotteiden määrä.
Leimattu kutiini (spesifinen aktiivisuus 4 x 106 dpm/mg) sekoitettiin leimaamattoman ku-tiinin kanssa sopivan spesifisen aktiivisuuden saavuttamiseksi radioaktiivisia mittauksia varten. 50 μΐ entsyyminäytettä inkuboitiin 1,2 mg 3H-kutiinin läsnä ollessa kokonaistila-15 vuudessa 200 μΐ. Reaktioseokset puskuroitiin Mcllvainella. Inkuboinnin jälkeen reak-tioseokset sentrifugoitiin ja 150 μΐ supernatanttia analysoitiin käyttäen tuikelaskuria. Kaikki näytteet analysoitiin kahtena rinnakkaisena ja laskettiin keskimääräiset dpm-arvot. Kontrolleina käytettiin nollanäytteitä, joissa oli puskuria entsyymin sijaan, ja saadut arvot vähennettiin entsyyminäytteillä saaduista arvoista.
20 2, /;-Nitrofenyylibutyraattiesteraasimääritys
Esteraasiaktiivisuus määritettiin käyttäen /;-nitrofenyylibutyraattia (pNPB) malli sub straat-tina aiemmin julkaisulla Davies et ai. (2000) kuvatun menetelmän muunnoksella. Reak-o 25 tioseokset (300 μΐ) sisälsivät 2 mM/?NPB, 0,5 % (w/v) Triton X-100, Mcllvaine-puskuria σ> ja 50 μΐ entsyyminäytettä. Muutosta absorbanssissa seurattiin 340 nm:ssä ja 25 °C:ssa. p- i 0 Nitrofenolia käytettiin standardina alkuperäisten nopeuksien laskemista varten.
CC
CL
3. Triglyseridien hydrolyysin määritys CU o r\ co 30 m ^ Kutinaasien triglyseridejä hydrolysoivat aktiivisuudet määritettiin käyttämällä Bertollin cu oliiviöljyn (Unilever) emulsiota substraattina olennaisesti kuten kuvattu julkaisulla Kontkanen et ai. (2004). Emulgointireagenssi valmistettiin liuottamalla 2,5 g arabikumia akasiapuusta 47 % (v/v) glyseroliin. 70 ml:an emulgointireagenssia lisättiin 30 ml oliiviöl- 14 jyä ja seos homogenisoitiin mekaanisesti. Reaktioseos sisälsi 100 μΐ entsyyminäytettä, 900 μΐ Mcllvaine-puskuria, pH 4,5 ja 1 ml oliiviöljyemulsiota. Reaktioseoksia inkuboitiin 40 °C:ssa magneettisekoituksessa 10 min ajan ja reaktio lopetettiin sijoittamalla putket kiehuvaan vesihauteeseen 5 min ajaksi. Sitten lisättiin 2 ml asetoni:etanolia (1:1) ja faasien an-5 nettiin erottua. Vapaiden rasvahappojen pitoisuus mitattiin ylemmästä nestekerroksesta käyttäen vapaiden rasvahappojen puolimikrotestiä (Roche). Kaikki näytteet analysoitiin kahtena rinnakkaisena.
4. Proteiinipitoisuuksien määrittäminen 10
Kaupallista BioRadin proteiinimäärityspakkausta (500-0112) käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttämällä standardina naudan seerumialbumiinia.
Esimerkki 2. Mikrobien seulonta polyesteriä hydrolysoivan aktiivisuuden suhteen 15 55 mikrobia (pääasiassa sienikantoja) VTT:n kantakokoelmasta (Suomi) kasvatettiin sub-eriinin läsnä ollessa hiivan peptoni tai hiivan typpipohja -kasvatusliuoksessa hieman hap-pamissa olosuhteissa ja analysoitiin suberinolyyttisen aktiivisuuden suhteen. Suberiinin hajoaminen analysoitiin GC/MS:llä kasvatuksesta otetuista suberiininäytteistä. GC/MS:llä 20 analysointia varten kiinteät näytteet kylmäkuivattiin. Kuivat näytteet uutettiin peräkkäin heksaanilla ja etanolilla lipofiilisten ja vastaavasti hydrofiilisten yhdisteiden saamiseksi. Uutot suoritettiin nopeutetun liuotinuuton järjestelmällä Dionexi ASE 200. Käytetyt lämpötilat olivat 90 °C heksaaniuutolle ja 100 °C etanoliuuttoja varten. Paine oli 100 bar molemmissa tapauksissa ja uuttoaika oli viisi minuuttia.
CO
δ 25
CM
g Uutteiden suberiinimonomeerien analyysiä varten käytetty GC-MS-laite koostui Agilent o 6890A -GC:stä ja 5973N MS:stä. Käytetty pylväs oli Nordion NB-54, jossa kiinteänä faa- oo x sinä 5 % fenyylimetyylipolysiloksaani. Näytteisiin lisättiin heptadekaanihappoa (100 pg)
CL
sisäisenä standardina ennen silylointia N,0-bis(trimetyylisilyyli)trifluoriasetamidilla ja co
CM
£3 30 trimetyylikloorisilaanilla. Lämpötilaohjelma oli: 100 °C -* 15 °C -* 280 °C (18 min). Rented tyt tulokset olivat massavälillä m/z 40 - 800 amu. Kasvanutta määrää pitkiä rasvahappoja kuten hydroksirasvahappoja ja dioleja käytettiin merkkinä suberiinin hajoamisesta kasvatusten aikana. Mikrobien kyky hajottaa suberiinia arvioitiin silmämääräisesti kasvatusten 15 aikana. Lisäksi seurattiin mikrobien kasvua suberiinin läsnä ollessa tai ilman. Sirococcus conigenus tunnistettiin käytetyillä menetelmillä suberinolyyttisten polyesteraasien tuottajaksi.
5 Esimerkki 3. Sirococcus conigenus -kutinaasin (ScCut) geenin kloonaus ja sekvensointi
Sirococcus conigenus -kutinaasientsyymiä (ScCut) koodaavan geenin fragmentti monistettiin PCR:llä (polymeraasiketjureaktio). S. conigenus -sienen genomista DNA:ta käytettiin 10 templaattina. Käytetyt degeneroidut alukkeet suunniteltiin GenBankin sekvenssitietokan-nasta saatujen sienten kutinaasien ja kutinaasin kaltaisten geenien sekvenssien pohjalta. Nämä sekvenssit olivat sienistä Aspergillus oryzae (BAA92327), Pyrenopeziza brassicae (CAB40372) ja Botrytis cinerea (XP_001554721). Käytettiin kahta erilaista sarjaa alukkei-ta: ensimmäisessä sarjassa ei otettu huomioon sienten kodoninkäyttöä ja toisessa sarjassa 15 alukkeet muokattiin heijastamaan S. conigenus -sienen kodoninkäyttöä (taulukko 1). Reaktioissa käytettiin polymeraasia Dynazyme EXT DNA (Finnzymes, Suomi). Monistukseen käytetyssä touchdown-PCR-ohjelmassa pariutumislämpötilaa laskettiin kunkin syklin jälkeen (taulukko 2). (SEQ IDN04 - 11) 20 Taulukko 1.
Monistukseen käytetyt degeneroidut alukkeet
Aluke Juoste Kodoninkäyttö Sekvenssi (5’-3’) _huomioitu_
AsKodlaF koodaava kyllä TTCGC Y CGY GGY AC YTC Y GAGCC Y GGY AA
co AsKodlbF koodaava kyllä GTCATGTCYGGYTAYTCYCARGG
° AsKod2aR ei- kyllä GGRTCRCCGAARATGAC
o koodaava
m AsKod2bR ei- kyllä CCYTGRGARTARCCRGA
| koodaava
oo AslaF koodaava ei TT Y GCIMGIGGIACIW SIGARCCIGGI AA
CM
S AslbF koodaava ei GTI AT GW SIGGIT AYW SIC ARGG
o As2aR ei- ei GGRT CICCRAAIATIAC
koodaava
As2bR ei- ei CCYTGISWRTAICCISW
16 koodaava
Taulukossa I merkitsee inosiiniä (n sekvenssilistauksessa), Y on C tai T, R on A tai G, W on A tai T ja S on G tai C.
Taulukko 2.
Touchdown-PCR-ohjelma ScCut-geenin fragmentin monistamiseksi Vaihe Inkubointiaika ja-lämpötila 1 94 °C 45 sekunnin ajan 2 50 °C 1 minuutin ajan - -1 °C/sykli 3 72 °C 3 minuutin ajan 4 14 kertaa takaisin vaiheeseen 1 5 94 °C 45 sekunnin ajan 6 36,9 °C 1 minuutin ajan 7 72 °C 3 minuutin ajan 8 25 kertaa takaisin vaiheeseen 5 9 72 °C 10 minuutin ajan 5 329 bp fragmentti monistettiin alukkeilla AsKodlaF ja As2aR. Puhdistettu fragmentti kloonattiin pCR2.1-vektoriin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen). Vektori transformoitiin kantaan Escherichia coli DH5a elektroporaatiolla TOPO TA -kloonauspakkauksen käsikirjan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen). Plasmidi-DNA eristettiin 10 transformanteista käyttäen QIAprep Spin miniprep-pakkausta (Qiagen). Vektoriin kloonattu fragmentti sekvensoitiin käyttäen pakkauksen BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequen-cing Kit (Applied Biosystems, USA) reagensseja julkaisun Platt et ai. (2007) ohjeiden mu-o kaisesti. Sekvensointiin käytettiin M13-alukkeita (5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’ ja g 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’, SEQ ID NO 12 ja vastaavasti SEQ ID NO 13).
i o 15 DNA-tietokantojen blastX-haun mukaan fragmentin sekvenssi oli samanlainen kuin useas- sa sienten kutinaasigeenissä.
CL
oo c\j g Ligaation välittämää PCR:ä (Fors et ai, 1990) käytettiin koko ScCut-geenin sekvenssin g saamiseksi. Genominen DNA pilkottiin tylpän pään muodostavilla restriktioentsyymeillä
CVJ
20 BmgBl, EcoRV, Fspl, Nrul ja Rsal. Fragmentit puhdistettiin (QiaQuick PCR-puhdistuspakkaus, Qiagen) ja ligoitiin linkkeriseokseen, joka sisältää linkkerin I: 5’-GCG GTG ACC CGG GAG ATC TGA ATT C-3’ ja linkkerin II: 5’GAA TTC AGA TCT-3’ 17 alukkeet (SEQ ID NO 14 ja vastaavasti SEQ ID NO 15) T4-ligaasilla. Ligaasi ja ligoitu-mattomat linkkerit poistettiin QiaQuick PCR-puhdistuspakkausta (Qiagen) käyttämällä suoritetun reaktion jälkeen.
5 Suunniteltiin neljä aluketta (taulukko 3) degeneroituja alukkeita käyttämällä monistetun fragmentin pohjalta. Ensimmäisissä PCR-reaktioissa fragmentit monistettiin käyttämällä alukkeita Cut2R ja linkkeriä I (reaktio a) ja CutlF ja linkkeriä I (reaktio b). Toisissa PCR-reaktioissa käytettiin templaatteina ensimmäisten reaktioiden PCR-tuotteita. Fragmentit monistettiin käyttämällä alukepareja CutlR ja linkkeri I (tuote reaktiosta a templaattina) ja 10 Cut2F ja linkkeri I (tuote reaktiosta b templaattina). Näissä PCR:issä käytettiin Dynazyme EXT DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja käytetty ohjelma oli: 94 °C 3 minuutin ajan ja tämän jälkeen 30 sykliä 94 °C 1 minuutin ajan, 60 °C 2 minuutin ajan, 72 °C 2 minuutin ajan. Lopullinen pidennys suoritettiin 72 °C:ssa 10 minuutin ajan. Tuotteet toisesta PCR-reaktiosta puhdistettiin geelillä ja sekvensoitiin suoraan joko alukkeella CutlR (tuot-15 teet PCR-reaktiosta a) tai alukkeella Cut2F (tuotteet PCR-reaktiosta b) ScCut-geenin sekvenssin saamiseksi. Sekvenssistä ei tunnistettu yhtään intronia.
Taulukko 3.
Ligaation välittämän PCR:n käytetyt alukkeet (SEQ ID NO 16 - 19)
Aluke Sekvenssi (5’-3’) PCR-reaktio
CutlF AATGTTGGCCGGGTAGTCGAC reaktio I a
CutlR GGACCATGTCGCAGGTCAACTCG reaktio II a
Cut2F TTGACAGCAGCGAAGAAGGGC reaktio II b
Cut2R GCAGCTGGTGCACACAACGCGGCCAA reaktio Ib
CO
δ c\j g 20 ScCut-kutinaasia koodaava geeni monistettiin käyttäen alukkeita, jotka sitoutuvat ScCut- i
g geenin aloituskodonin ylävirran puolelle (SconCutF: 5’-CAG GTC GTA CTG GAT TTC
g TG-3’, SEQ ID NO 20) ja lopetuskodonin alavirran puolelle (SconCutR: 5’-ACA GAA
m GTT TCC TGC CCC TT-3’, SEQ ID NO 21). Käytetty PCR-ohjelma oli: 94 °C 5 minuu-
C\J
g tin ajan, jonka jälkeen 25 sykliä 94 °C 45 sekunnin ajan, 50 °C 1 minuutin ajan ja 72 °C 3 o 25 minuutin ajan. Lopullinen pidennys suoritettiin 72 °C:ssa 10 minuutin ajan. Reaktiossa
CM
käytettiin Phusion DNA polymeraasia (Finnzymes, Suomi). Oikean kokoinen fragmentti puhdistettiin ja fragmenttiin liitettiin 3’-A -hännät Dynazyme DNA-polymeraasin (Finnzymes, Suomi) katalysoimassa reaktiossa. Fragmentti kloonattiin pCR2.1-vektoriin ja 18 muodostunut plasmidi transformoitiin kantaan Escherichia coli DH5a. Fragmentti sekven-soitiin käyttäen M13-alukkeita ja alukkeita SconCutF ja SconCutR.
Sekvenssiä verrattiin sitten tunnettuihin kutinaasisekvensseihin (kuvio 1) ohjelmalla Clus-5 talW käyttäen oletusasetuksia ja Blosum62:a substituutiomatriisia (Thompson et ai., 1994).
Esimerkki 4. ScCut-kutinaasigeenin kloonaus ja ilmentäminen
Sirococcus conigenus -kutinaasin (ScCut) geeni (SEQ ID NO 2) optimoitiin kodonien osal-10 ta (SEQ ID NO 3) ilmennettäväksi Pichiapastoris -hiivassa ja syntetisoitiin GenScriptillä (USA). Kloonaus ja ilmentäminen suoritettiin olennaisesti kuten kuvattu Invitrogenin käsikirjassa rekombinanttiproteiinien ilmentämiseksi Pichia pastoris -hiivassa (painoksen päiväys 7. syyskuuta, 2010, käsikirjan osat 25-0043). Geeniä täydennettiin sekvenssillä, joka koodaa C-terminaalista His-tagia ScCut-kutinaasin yksivaiheisen puhdistuksen mahdollis-15 tamiseksi immobilisoidulla metalliaffiniteettikromatografialla (IMAC). Geenin alkuperäinen sekreetiosignaalisekvenssi ennustettiin käyttämällä nettityökalua SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) ja jätettiin pois fragmentista. Kloonaamisen auttamiseksi lisättiin EcoRl- ja Ao/I-restriktiokohdat fragmentin 5’- ja vastaavasti 3’-päihin. Geeni eristettiin plasmideista, jotka lähetettiin GenScriptistä, pilkkomalla EcoFIMä. ja No-20 /I:llä ja geenifragmentti ligoitiin ekspressiovektoriin pPicZa-A (Invitrogen), jossa se fuusioitiin samaan lukukehykseen Saccharomyces cerevisiae α-faktorin erityksen signaalise-kvenssin kanssa. Vektori sisälsi vahvan metanolilla indusoituvan AOXl-promootterin geenin ilmentämiseksi. Konstruktit transformoitiin Escherichia coli -bakteeriin ja kymmenen transformanttipesäkettä seulottiin oikean insertin osalta PCR:llä. Plasmidi-DNA eristettiin o 25 viidestä positiivisesta kloonista ja DNA:t analysoitiin restriktiodigestioanalyysillä ja sek- σ> vensoimalla.
cp o co x P. pastoris X-33 kasvatettiin aerobisesti hiivauute-peptoni-dekstroosi-kasvatusliuoksessa
CL
30 °C:ssa. Solut kerättiin talteen sentrifugoimalla optisessa tiheydessä (600 nm) välillä 1,3 m 30 - 1,5. Solupelletti pestiin jääkylmällä vedellä ja jääkylmällä 1 M sorbitolilla. Sentrifugoin- ς nin jälkeen solut suspendoitiin l/125:en alkuperäisestä kasvatustilavuudesta 1 M sorbito- C\] liin ja pidettiin jäissä. DNA (7,5 pg), joka oli linearisoitu /Nzel-digestiolla, sekoitettiin 80 μΐ solususpension kanssa ja solut transformoitiin elektroporaatiolla. Lisättiin 1 ml 1 M sor- 19 bitolia ja soluja inkuboitiin 1 h ajan huoneenlämmössä ja maljattiin hiivaauute-peptoni-dekstroosi-agar -maljoillejotka sisälsivät 100 pg/ml zeosiiniä.
Transformantteja kasvatettiin yön yli puskuroidussa kompleksisessa glyserolikasvatusliu-5 oksessa 30 °C:ssa. Kun optiset tiheydet (600 nm) saavuttivat arvon 2,5 solut kerättiin sent-rifugoimalla ja suspendoitiin puskuroituun kompleksiseen metanolikasvatusliuokseen, joka sisälsi 0,5 % (v/v) metanolia, optiseen tiheyteen 0,45 600 nm:ssä. Soluja kasvatettiin aerobisesti 30 °C:ssa 6 päivän ajan. Metanolia lisättiin joka päivä 0,5 %:in (v/v) kokonaistilavuudesta haihtumisen kompensoimiseksi. Kutinaasigeenien ilmentymistä seurattiin mit-10 taamalla/?NPB-esteraasiaktiivisuutta pH:ssa 3,5 (kuten kuvattu esimerkissä 1) kasvatussu-pernatanteista. Tehokkaimmin esteraasia tuottava transformantti valittiin ScCut:n tuotantoon.
Esimerkki 5. ScCut-kutinaasin tuotantoja puhdistus 15 1 litra puskuroitua kompleksista metanolikasvatusliuosta ympättiin 50 ml:lla P. pastoris -transformantin kasvustoa, joka oli valittu kutinaasin tuotannon perusteella (kuvattu esimerkissä 4) ja soluja kasvatettiin aerobisesti 30 °C:ssa 3 päivän ajan. Seurattiin pNPB-esteraasiaktiivisuutta pH:ssa 3,5 (kuten kuvattu esimerkissä 1, kuvio 2) ja metanolia lisät-20 tiin päivittäin viljelmään 0,5 %:in (v/v). Kasvatuksen jälkeen solut poistettiin sentrifugoi-malla ja supernatantin pH säädettiin pH:ksi 8,0 NaOHdla. Supernatantti suodatettiin ja lisättiin 3 g trinatriumsitraatti-2-hydraattia fosfaattisaostumien ehkäisemiseksi. Superna-tanttiin lisättiin 1 mM proteaasi-inhibiittoria, fenyylimetaanisulfonyylifluoridia.
co o 25 C-terminaalinen His-tag, jossa oli 6 histidiiniä fuusioituna ScCut-kutinaasiin, mahdollisti cb entsyymin yksivaiheisen puhdistamisen IMAC:illa. Puhdistukseen käytettiin Ni-NTA- i o Agaroosia (Qiagen, 30210) pakattuna XK16-pylvääseen (Pharmasia), jonka tilavuus oli 4 x ml. Pylväs tasapainotettiin aloituspuskurilla, joka sisälsi 50 mM Na-fosfaattia, pH 8,0, ja 0_ 300 mM NaCl. Näyte (850 ml) lisättiin virtausnopeudella 1 ml/min. Pylvästä eluoitiin aloitti 30 tuspuskurilla, jota oli täydennetty 10 mM imidatsolilla, ja kerättiin fraktiot, joissa oli ^ pNPB-esteraasi aktiivi suutta pH:ssa 3,5 (määritetty kuten esimerkissä 1). Näiden fraktioi-
CM
den puskuri vaihdettiin 1:10 Mcllvaineksi, pH 7, ultrasuodatuksella ja laimentamalla. ScCut-kutinaasia sisältävien fraktioiden SDS-PAGE -analyysi osoitti proteiinijuovan, jonka molekyylipaino on noin 20 kDa. Tämä vastaa hyvin aminohapposekvenssin perusteella 20 laskettua molekyylipainoa 18,2 kDa. ScCut puhdistettiin lähes puhtaaksi IMAC:lla. Puhdistetulla proteiinilla oli spesifinen pNPB-esteraasiaktiivisuus 360 ncat/mg pH:ssa 3,5. Puhdistettua näytettä käytettiin entsyymin edelleen karakteri soimi seksi.
5 Esimerkki 6. ScCut-kutinaasin pH-profiili ja -stabiilisuus
ScCut-kutinaasin pH-profiilia tutkittiin välillä pH 2-8 kutinolyyttisen aktiivisuuden suhteen (käyttäen 3H-kutiinia substraattina) japNPB-esteraasiaktiivisuuden suhteen. Kokeissa käytettiin esimerkissä 1 kuvattuja määritysmenettelytapoja. Reaktiosokset puskuroitiin 10 Mcllvaine-puskurilla. Kutiinihydrolyysin pH-profiili ScCut-kutinaasilla määritettiin inku-boimalla entsyyminäytteitä 40 °C:ssa 24 h ajan proteiinilaimennoksella 0,2 mg/ml. pNPB-esteraasiaktiivisuudet määritettiin 25 °C:ssa käyttämällä proteiinilaimennosta 7,4 pg/ml. Tulokset on esitetty kuviossa 3 Tulokset 3H-kutiini substraattina on esitetty prosenttiosuuksina maksimista. ScCut-kutinaasin pH-optimi kutiinin hydrolyysille oli välillä 3,5 -15 4,5, kun taas pH-optimi pNPB-esteraasiaktiivisuudelle oli välillä 4,5 - 5. Sekä 3H-kutiini että/?NPB substraattina hydrolyysi havaittiin laajalla pH-välillä. Aktiivisuus oli kummallakin substraatilla havaittavissa alle pH 3:ssa. ScCut-kutinaasin kutiinia hydrolysoivaa kykyä verrattiin useimmille tunnetuille kutinaaseille raportoituihin tuloksiin \Botrytis cinerea -kutinaasit (Shishiyama et ai., 1970; Salinas et ai., 1986; van der Vlugt-Bergmans et ai., 20 1997), Venturia inaequalis -kutinaasi (Köller ja Parker, 1989) ja Alternaria brassicola - kutinaasi (Trail ja Köller, 1993)]. Vertailun perusteella voidaan vetää yhteen, että kutiinin hydrolyysiä alle pH 5,0:ssa ei ole esitetty millekään muulle kutinaasille kuin ScCut-kutinaasille.
co o 25 pH-stabiilisuus määritettiin samalla pH-välillä kuin yllä inkuboimalla entsyyminäytteitä 40 g °C:ssa 24 h ajan McHvaine-puskurissa. Inkuboinnin jälkeen näytteitä laimennettiin 1:5 o Mcllvaine-puskurilla pH 7:ssä ja määritettiin pNPB-esteraasiaktiivisuudet. Reaktioseokset x puskuroitiin 0,5 M Na-fosfaattipuskurilla pH:ssa 7 kaikkien näytteiden saamiseksi saman-
CL
laiseen pH-arvoon. Jäljelle jääneet pNPB-esteraasiaktiivisuudet määritettiin ja verrattiin g 30 alkuperäiseen pH 7:ssä määritettyyn aktiivisuuteen. Tulokset on esitetty kuviossa 4. ScCut ^ oli stabiili laajalla pH-arvojen välillä. Se omasi yli 90 % stabiilisuuden pH-välillä 3,5 - 7,5.
C\l
Stabiilisuus oli jonkin verran alempi tämän alueen ulkopuolella, mutta havaittiin selvä jäljelle jäänyt aktiivisuus. Tulokset osoittavat, että entsyymi on sekä stabiili että aktiivinen 21 erilaisissa pH-arvoissa ja voisi tämänkaltaisen kestävyyden vuoksi olla sopiva moniin erilaisiin sovellutuksiin.
Esimerkki 8. ScCut-kutinaasin lämpötilastabiilisuus 5
ScCut-kutinaasin lämpötilastabiilisuutta tutkittiin määrittämällä puoliintumisajat eri lämpötiloissa. ScCut-kutinaasia inkuboitiin pitoisuudella 37 pg/ml Mcllvaine-puskurissa pH:ssa 4,5. pNPB-esteraasiaktiivisuudet mitattiin kustakin näytteestä useampana ajankohtana kahden päivän aikana. Tulokset kuvattiin puolilogaritmiselle asteikolle (suhteellisen aktii-10 visuuden logaritmi ajan suhteen), ja puoliintumisajat laskettiin trendiviivan kulmakertoimesta. 4 °C:ssa ja 25 °C:ssa ei havaittu mitään aktiivisuuden laskua kahden päivän inku-baation aikana. Muissa lämpötiloissa määritetyt puoliintumisajat on esitetty taulukossa 4. Tulokset osoittavat, että ScCut on stabiili käytettäväksi pesuaine- ja kasvimateriaalin prosessoinnin sovellutuksissa.
15
Taulukko 4.
ScCut-kutinaasin puoliintumiajat eri lämpötiloissa Lämpötila Puoliintumisaika 42 °C 76 h 55°C 9 h 65 °C 4 h 85 °C 24 min
Esimerkki 9. Eri ketjun pituudet omaavien/7-nitrofenyyliesterien hydrolyysi δ
CvJ
g 20 ScCut-kutinaasin aktiivisuus eri hiiliketjun pituudet omaavia rasvahappoestereitä vastaan i o määritettiin pH 4,5:ssä käyttämällä pNP-butyraatin esteraasimäärityksen menettelytapaa g (esimerkki 1). Substraatteina käytettyjen /?-nitrofenyyliesterien rasvahapporakenneosat
CL
m olivat: asetaatti (C2), propionaatti (C3), butyraatti (C3), butyraatti (C4), valeraatti (C5), c\j g kaproaatti (C6), kapraatti (CIO), lauraatti (C12), myristaatti (C14), palmitaatti (C16) ja g 25 stearaatti (Cl8). Reaktioseoksessa käytettiin substraatin pitoisuutta 2 mM. Kuviossa 5 esi-
C\J
tetyt tulokset merkitsevät, että ScCut suosii lyhytketjuiset rasvahapot omaavia /?NP-estereitä. Tämä spesifisyysprofiili on tyypillinen kutinaaseille.
22
Esimerkki 10. Kutiinin, suberiinin ja triglyseridien hydrolyysi ScCut-kutinaasilla
Luonnolliset, uuttuvat substraatit, omenan kutiini ja koivuntuohen suberiini, eristettiin kuten aiemmin kuvattu julkaisussa Halonen et ai. (2009) ScCut-kutinaasin katalysoiman näi-5 den materiaalien hydrolyysin arvioimiseksi. Reaktioseokset käsittivät 50 mg/ml kutiinia tai suberiinia ja 100 nkat/ml ScCut (/iNPB-esteraasiaktiivisuutena määritettynä pH:ssa 4,5) ja Mcllvaine-puskuria pH:ssa 4,5. Reaktioseoksia inkuboitiin 48 h ajan 40 °C:ssa ja uutettiin metyyli-/er/-butyylieetterillä (MTBE) kiinteästä substraatista entsyymin vaikutuksesta vapautuneiden kutiinin ja suberiinin oligo-ja monomeerien talteenottamiseksi. Vapaat rasva-10 hapot MTBE-uutteessa analysoitiin suoraan ja vapautuneiden oligomeerien emäshydrolyy-sin jälkeen käyttäen vapaiden rasvahappojen puolimikrotestiä (Roche) kuten kuvattu julkaisussa Kontkanen et ai. (2009) ScCut-käsittelyllä vapautuneiden rasvahappojen määriä verrattiin substraattien kokonaisemäshydrolyysissä vapautuneiden rasvahappojen määrään. Käsittely ScCut-kutinaasilla vapautti 1,4 mol-% ja 3,0 mol-% kokonaisrasvahapoista sub-15 eri inistä ja vastaavasti kutiinista.
Spesifinen lipaasi- (triglyseridejä hydrolysoiva) aktiivisuus määritettiin pH:ssa 4,5, substraattina oliiviöljy, kuten kuvattu esimerkissä 1. ScCut omasi spesifisen lipaasiaktiivisuu- den 70,3 ± 3,7 nkat/mg.
20 co δ
CM
<T> cp o
CO
X
X
CL
CO
CM
CO
LO
δ
CM

Claims (18)

1. Polypeptidi, joka käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 70 % identtisyys sekvenssin SEQ ID NO 1 kanssa, tai mainitun polypeptidin fragmentti, jolla mainitulla 5 polypeptidillä tai fragmentilla on ainakin yksi esteraasiaktiivisuus, joka on kutinaasiaktiivi-suus, suberinaasiaktiivisuus tai lipaasiaktiivisuus tai mikä tahansa mainittujen aktiivisuuksien yhdistelmä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi tai fragmentti, jolla on kutinaasi-, sub-10 erinaasi- ja lipaasiaktiivisuus.
3. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen polypeptidi tai fragmentti, jossa polypeptidi tai fragmentti on aktiivinen polyestereitä kohtaan pH-välillä 2,5 - 7,5.
4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen polypeptidi tai fragmentti, jossa polypeptidi tai fragmentti on aktiivinen polyestereitä kohtaan pH:ssa alle 5, edullisesti alle 4,5 ja edullisimmin alle 4.
5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen fragmentti, joka käsittää vähintään 20 77 aminohappoa.
6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen polypeptidi tai fragmentti, jossa mainittu proteiini on peräisin Sirococcus-sienestä, edullisesti Sirococcus conigenus -sienestä. CO δ 25 c\j σ>
7. Rekombinanttipolynukleotidi, joka koodaa patenttivaatimuksen 1 mukaista polypeptidiä i o tai sen fragmenttia, joka käsittää nukleotidisekvenssin, jolla on ainakin 80 % identtisyys x sekvenssin SEQ ID NO 2 nukleotideille 52 - 606 tai sekvenssin SEQ ID NO 3 nukleoti- CL deille 7 - 561 tai näiden komplementaariselle juosteelle tai sekvenssin SEQ ID NO 2 kodo-co 30 nien suhteen optimoidulle sekvenssille. δ CM
8. Vektori, joka käsittää patenttivaatimuksen 7 mukaisen polynukleotidin.
9. Isäntäsolu, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 8 mukaisella vektorilla.
10. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen polypeptidien saamiseksi, joka mainittu menetelmä käsittää mikro-organismin transformoinnin patenttivaatimuksen 7 mukaisella vektorilla, transformoidun mikro-organismin kasvatusolosuhteissa, jotka mahdollistavat mainitun polynukleotidin ilmentämisen, ja ilmennetyn polypeptidin talteenoton. 5
11. Entsyymivalmiste, joka käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen polypeptidin.
12. Hydrolyysimenetelmä, saattamalla esterisidoksia sisältävä materiaali yhteen jonkin 10 patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen polypeptidin tai fragmentin kanssa, hydrolyysin kannalta sopivissa olosuhteissa.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, joka käsittää vihanneksista, hedelmistä, rypäleistä, marjoista tai viljoista saatujen maatalouden tai elintarvikkeiden raaka-aineiden 15 tai sivutuotteiden käsittelemisen.
14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, joka käsittää puuraaka-aineiden, sellu- ja paperituotteiden tai prosessijätteiden tai -vesien tai sivutuotteiden käsittelemisen mainitulla proteiinilla. 20
15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, joka käsittää synteettisten tai muiden keinotekoisten polyesterikuitujen tai tekstiilien muokkauksen mainitulla proteiinilla.
16. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, joka käsittää pinttyneen lian tai rasvan o 25 poistamisen pyykistä ja tiskeistä mainitulla proteiinilla. σ> cp
17. Trans- tai interesteröintimenetelmä, joka käsittää esteröitävän materiaalin saattamisen co J x yhteen jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen polypeptidin tai fragmentin kanssa olo- CL suhteissa, jotka ovat sopivia esteröintiin. cu ™ co 30 LO timuksen 11 mukaisen entsyymivalmisteen käyttö elintarviketeollisuudessa, sellu- ja paperiteollisuudessa, detoksifikaatiosovellutuksissa, tekstiiliteollisuudessa tai pyykki- tai tis-kaussovellutuksissa tai kemiallisissa synteeseissä.
18. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen polypeptidin tai fragmentin tai patenttivaa- c\j
FI20115328A 2011-04-06 2011-04-06 Uusia kutinaaseja, niiden tuottaminen ja käytöt FI123867B (fi)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20115328A FI123867B (fi) 2011-04-06 2011-04-06 Uusia kutinaaseja, niiden tuottaminen ja käytöt
PCT/FI2012/050356 WO2012136898A2 (en) 2011-04-06 2012-04-11 Novel cutinases, their production and uses
US14/009,796 US9783793B2 (en) 2011-04-06 2012-04-11 Polypeptides and active fragments of polypeptides having at least one esterase activity
EP12768424.9A EP2694649A4 (en) 2011-04-06 2012-04-11 NEW CUTINASES, THEIR PREPARATION AND USES THEREOF

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20115328 2011-04-06
FI20115328A FI123867B (fi) 2011-04-06 2011-04-06 Uusia kutinaaseja, niiden tuottaminen ja käytöt

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20115328A0 FI20115328A0 (fi) 2011-04-06
FI20115328A FI20115328A (fi) 2012-10-07
FI123867B true FI123867B (fi) 2013-11-29

Family

ID=43919651

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20115328A FI123867B (fi) 2011-04-06 2011-04-06 Uusia kutinaaseja, niiden tuottaminen ja käytöt

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9783793B2 (fi)
EP (1) EP2694649A4 (fi)
FI (1) FI123867B (fi)
WO (1) WO2012136898A2 (fi)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9744542B2 (en) 2013-07-29 2017-08-29 Apeel Technology, Inc. Agricultural skin grafting
JP7157531B2 (ja) 2015-05-20 2022-10-20 アピール テクノロジー，インコーポレイテッド 植物抽出物組成物およびその調製方法
JP7049245B2 (ja) 2015-09-16 2022-04-06 アピール テクノロジー，インコーポレイテッド 分子コーティングのための前駆体化合物
WO2017100636A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Apeel Technology, Inc. Plant extract compositions for forming protective coatings
TWI731928B (zh) 2016-01-26 2021-07-01 美商ａＰＥＥＬ科技公司 製備及保存經消毒產品之方法
EP3541192A4 (en) 2016-11-17 2020-07-01 Apeel Technology, Inc. COMPOSITIONS MOLDED FROM PLANT EXTRACTS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
JP2023516406A (ja) 2020-03-04 2023-04-19 アピール テクノロジー，インコーポレイテッド 被覆された農産物及び対応する方法
CN116457332A (zh) 2020-10-30 2023-07-18 阿比尔技术公司 组合物及其制备方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9216387D0 (en) 1992-07-31 1992-09-16 Unilever Plc Enzymatic detergent compositions
DE19859971A1 (de) 1998-12-23 2000-06-29 Gsf Forschungszentrum Umwelt DNA-Sequenzen zum Nachweis phytopathogener Erreger
US6254645B1 (en) 1999-08-20 2001-07-03 Genencor International, Inc. Enzymatic modification of the surface of a polyester fiber or article
FI120835B (fi) * 2007-07-10 2010-03-31 Valtion Teknillinen Uusia esteraaseja ja niiden käyttö
WO2009042622A2 (en) 2007-09-25 2009-04-02 Novozymes A/S Process for the production of a fermentation product from a wood-containing material, wherein the wood-containing material is treated with esterases
CA2709649A1 (en) 2007-12-20 2009-07-02 Novozymes A/S Cutinase for detoxification of feed products
WO2009108941A2 (en) * 2008-02-29 2009-09-03 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Production and use of plant degrading materials
CN101565902B (zh) 2009-04-22 2010-12-29 江南大学 一种基于弱氧化和角质酶预处理的羊毛织物蛋白酶防毡缩方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20140234921A1 (en) 2014-08-21
EP2694649A4 (en) 2015-07-29
FI20115328A0 (fi) 2011-04-06
WO2012136898A2 (en) 2012-10-11
EP2694649A2 (en) 2014-02-12
US9783793B2 (en) 2017-10-10
WO2012136898A3 (en) 2012-11-22
FI20115328A (fi) 2012-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI123867B (fi) Uusia kutinaaseja, niiden tuottaminen ja käytöt
AU2008274161B2 (en) Novel esterases and their use
Vakhlu Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning
De La Mare et al. Molecular and biochemical characterization of three GH62 α-L-arabinofuranosidases from the soil deuteromycete Penicillium funiculosum
DK2468859T3 (en) HIS UNKNOWN PROTEIN WITH B-GLUCOSIDASE ACTIVITY AND ITS USE
EP2912171B1 (en) Novel esterases in the treatment of cellulosic and lignocellulosic material
CN102272297A (zh) 真菌内切葡聚糖酶、它们的生产和应用
CN107002053A (zh) 脂肪酶变体以及编码它们的多核苷酸
Kontkanen et al. Novel Coprinopsis cinerea polyesterase that hydrolyzes cutin and suberin
EP1007694A2 (en) Esterases, dna encoding therefor and vectors and host cells incorporating same
Kumar et al. Characterization of partially purified lipase from Saccharomyces cerevisiae
CN104379736A (zh) 处理纤维素材料的新颖蛋白
CN104704115B (zh) 具有过氧合酶活性的多肽
CN107002049A (zh) 具有n‑乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽
US9434929B2 (en) Esterases useful in the treatment of cellulosic and lignocellulosic material
CN103732740B (zh) 具有过氧化酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸
CN104718287B (zh) 具有过氧合酶活性的多肽
CN104704116B (zh) 具有过氧合酶活性的多肽
CN104718286B (zh) 具有过氧合酶活性的多肽
CN104718288B (zh) 具有过氧合酶活性的多肽
AU2005259326B8 (en) New esterases from rumen
CN103797114A (zh) 生产能够水解叶绿素或叶绿素衍生物的重组酶的方法

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 123867

Country of ref document: FI

Kind code of ref document: B

MM Patent lapsed