CN104704116B - 具有过氧合酶活性的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有过氧合酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。编码过氧合酶的多核苷酸分离自黄褐毁丝霉。

Description

具有过氧合酶活性的多肽
对序列表的引用
本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
背景
发明领域
本发明涉及具有过氧合酶(peroxygenase)活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及核酸构建体、载体以及包括这些多核苷酸的宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。
相关技术说明
WO 2006/034702 A1披露了使用茶树菇TM A1的AaP过氧合酶来酶促羟基化未活化的烃(例如，萘、甲苯和环己烷)的方法。这也描述于乌尔里克(Ullrich)和霍夫里克特(Hofrichter)，2005，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)579:6247-6250中。
DE 10332065A1披露了用于通过使用茶树菇TM A1的AaP过氧合酶通过醛的中间形成从醇中酶法制备酸的方法。
报道了用于通过该AaP过氧合酶而快速和选择性地以分光光度计直接检测芳香族羟基化的方法(克卢格(Kluge)等人，2007，应用微生物学和生物技术(Appl MicrobiolBiotechnol)75:1473-1478)。
从嗜粪真菌辐毛鬼伞(Coprinus radians)中分离了另一种能够进行芳香族过氧合化(peroxygenation)的过氧合酶并对其进行了表征，鉴定了N-末端16个氨基酸并与较早公布的茶树菇的AaP酶的N-末端14个氨基酸进行了比对；但是未分离编码基因(安赫(Anh)等人，2007，应用与环境微生物学(Appl Env Microbiol)73(17):5477-5485)。
WO 2008/119780披露了若干种不同的过氧合酶多肽及其编码多核苷酸连同其重组产生。
WO 2011/120938披露了使用过氧合酶多肽的脂肪烃的位点特异性羟基化。
本发明提供了具有过氧合酶活性的新颖多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
发明概述
本发明涉及具有过氧合酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％的序列一致性；
(b)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严谨度条件下与(i)SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；
(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或其cDNA序列具有至少60％序列一致性；
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有过氧合酶活性。
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
本发明还涉及使用本发明的多肽的方法。
本发明还涉及一种编码信号肽的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-17至-1或由其组成，该多核苷酸被可操作地连接至编码一种蛋白质的基因；包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；以及产生一种蛋白质的方法。
定义
过氧合酶(Peroxygenase)：术语“过氧合酶”意指根据EC 1.11.2.1的一种“非特异性过氧合酶”活性，其催化来自H2O2的一个氧原子插入多种底物(例如硝基苯并二噁茂)中。出于本发明的目的，过氧合酶活性是根据描述于实例2，或描述于以下中的程序确定的：M.波拉杰-可比尔斯考(Poraj-Kobielska)，M.金尼(Kinne)，R.乌尔里克(Ullrich)，K.诗切布内尔(Scheibner)，M.霍夫里克特(Hofrichter)，“用于检测真菌过氧合酶的分光光度计测定(A spectrophotometric assay for the detection of fungal peroxygenases)”，分析生物化学(Analytical Biochemistry)(2012)，第421卷，第1期，第327–329页。
在一个方面中，本发明的这些多肽(过氧合酶)具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的过氧合酶活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中该片段具有过氧合酶活性。在一个方面中，一个片段包含至少240个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至240或SEQID NO:2的氨基酸20至240)、至少230个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至230或SEQ ID NO:2的氨基酸20至230)或至少220个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至220或SEQ ID NO:2的氨基酸20至220)。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等是易感的。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，基于预测SEQID NO:2的氨基酸-17至-1是信号肽的SignalP 3.0程序，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至244。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有过氧合酶活性的成熟多肽的一种多核苷酸。在一个方面中，基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP 3.0程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸52至88、175至412、502至773以及908至1092，或其cDNA序列。
中严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严谨度条件：术语“中-高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或者以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
在一个实施例中，比对长度是至少150个氨基酸残基，优选至少180个氨基酸残基，更优选至少200个氨基酸残基，并且最优选至少220个氨基酸残基。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有过氧合酶活性的一个片段。在一个方面中，子序列包含至少600个核苷酸、至少650个核苷酸或至少700个核苷酸。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有过氧合酶活性的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
详细说明
具有过氧合酶活性的多肽
在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽，这些分离的多肽具有过氧合酶活性。在一个方面中，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个。
本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有过氧合酶活性的片段。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-17至244或SEQ ID NO:2的氨基酸1至244或由其组成。
本发明的多肽可以包括如以下所示的氨基酸序列：
Glu-His-Asp-Gly-Ser-Leu-Ser-Arg(SEQ ID NO:3)，
Glu-His-Asp-Ala-Ser-Leu-Ser-Arg(SEQ ID NO:4)，
Glu-His-Asp-Gly-Ser-Ile-Ser-Arg(SEQ ID NO:5)，或
Glu-His-Asp-Ala-Ser-Ile-Ser-Arg(SEQ ID NO:6)。
-其对应于SEQ ID NO:2的氨基酸86-93，并且其配位血红素基附近的Mn原子。
因此，本发明的多肽的氨基酸序列可以包括如以下所示的基序(其是将SEQ IDNO:3组合至SEQ ID NO:6的结果)：
E-H-D-[G,A]-S-[L,I]-S-R(SEQ ID NO：7)。
本发明的多肽可以包括如以下所示的氨基酸序列：
Arg-Gly-Pro-Cys-Pro-Xaa-Met-Asn-Ser-Leu(SEQ ID NO:8)，
Arg-Ala-Pro-Cys-Pro-Xaa-Met-Asn-Ser-Leu(SEQ ID NO:9)，
Arg-Gly-Pro-Cys-Pro-Xaa-Leu-Asn-Ser-Leu(SEQ ID NO:10)，
Arg-Ala-Pro-Cys-Pro-Xaa-Leu-Asn-Ser-Leu(SEQ ID NO:11)，
Arg-Gly-Pro-Cys-Pro-Xaa-Met-Asn-Thr-Leu(SEQ ID NO:12)，
Arg-Ala-Pro-Cys-Pro-Xaa-Met-Asn-Thr-Leu(SEQ ID NO:13)，
Arg-Gly-Pro-Cys-Pro-Xaa-Leu-Asn-Thr-Leu(SEQ ID NO:14)，或
Arg-Ala-Pro-Cys-Pro-Xaa-Leu-Asn-Thr-Leu(SEQ ID NO:15)；
-其对应于SEQ ID NO:2的氨基酸14-23，并且其形成连接至血红素基的必需结构元件。Xaa可以是任何氨基酸，但是优选地，它是Met、Gly、Ala或Val。
因此，本发明的多肽的氨基酸序列可以包括如以下所示的基序(其是将SEQ IDNO:8组合至SEQ ID NO:15的结果)：
R-[G,A]-P-C-P-X-[M,L]-N-[S,T]-L(SEQ ID NO:16)；并且优选地
R-[G,A]-P-C-P-[M,G,A,V]-[M,L]-N-[S,T]-L。
在另一个实施例中，本发明涉及一种由以下多核苷酸编码的具有过氧合酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有过氧合酶活性的多肽的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有过氧合酶活性的多肽的DNA，对从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的，杂交指示多核苷酸在非常低至非常高严谨度条件下与一种标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全长互补体；或(v)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针杂交的分子。
在一个方面中，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸393至412。在另一个方面中，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一个方面中，该核酸探针是SEQ ID NO:1或其cDNA序列。
在另一个实施例中，本发明涉及一种由以下多核苷酸编码的具有过氧合酶活性的分离的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％,，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。
在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、或9。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的过氧合酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能与遗传(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(Drug Discovery World)4:35-48。
具有过氧合酶活性的多肽的来源
本发明的具有过氧合酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是一种真菌多肽，例如一种来自毛壳菌科的真菌的多肽。例如，该多肽可以是一种毁丝霉属多肽，例如弗格斯毁丝霉(Myceliophthora fergusii)(同义词嗜热棒囊孢壳菌(Corynascus thermophiles))、黄褐毁丝霉(Myceliophthora hinnulea)、黄毁丝霉(Myceliophthora lutea)、棉毛毁丝霉(Myceliophthora vellerea)或嗜热毁丝霉多肽。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook(萨姆布鲁克)等人，1989，同上)。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
有用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中描述。
控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’-末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还可能希望地是添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调控系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883披露的方法完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及变铅青链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。在一个优选方面中，该细胞是毁丝霉属细胞。在一个更优选的方面中，该细胞是黄褐毁丝霉细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一个本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括本发明的多肽，从而表达并且产生可回收的量的多肽或结构域。多肽或结构域可从植物或植物部分回收。作为替代方案，包括该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中并且将所得改性植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞来构建植物或植物细胞。
表达构建体方便地是核酸构建体，它包括编码多肽或结构域的多核苷酸，该多核苷酸可操作地与选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调节序列连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。
例如基于希望在何时、何处、和怎样表达该多肽或结构域来确定调节序列，例如启动子和终止子序列以及任选的信号序列或转运序列的选择。例如编码多肽或结构域的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以被靶向至特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块茎、和果实)(Edwards(爱德华兹)和Coruzzi(科鲁兹)，1990,Ann.Rev.Genet.(遗传学年鉴)24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织)(Ito(伊藤)等人，1994,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)24:863-878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu(吴)等人，1998,Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998,J.Plant Physiol.(植物生理学杂志)152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen(陈)等人，1998,Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO91/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(Plant Physiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。
还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(加塞尔(Gasser)等人，1990，科学244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然338:274)。
目前根癌农杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学21:415-428所描述。另外的转化方法包括美国专利号6,395,966和7,151,204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。
在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。
除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码多肽或结构域的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7,151,204中。
植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且(b)回收该多肽或结构域。
过氧合酶活性的除去或降低
本发明还涉及产生亲本细胞的突变体的方法，该方法包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，这导致突变体细胞比在相同条件下培养的亲本细胞产生的多肽少。
可以使用本领域熟知的方法通过降低或消除该多核苷酸的表达来构建突变体细胞，例如插入、破坏、替换、或缺失。在一个优选方面，将该多核苷酸失活。例如，待修饰或失活的多核苷酸可以是活性必需的编码区或其部分，或编码区的表达所需的调节元件。这种调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该多核苷酸的表达的部分。可修饰的其他控制序列包括但不局限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子、和转录激活因子。
该多核苷酸的修饰或失活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该多核苷酸的表达被降低或消除的突变体细胞来进行。所述诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用适宜的物理或化学诱变剂、通过使用适宜的寡核苷酸、或通过对DNA序列PCR产生诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任意组合来进行。
适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，诱变一般是在适宜条件下在所选的诱变处理试剂的存在下通过孵育有待诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞来进行的。
该多核苷酸的修饰或失活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调节元件中插入、取代、或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可插入或除去核苷酸从而形成终止密码子的引入、起始密码子的除去、或开放读码框的改变。这些修饰或失活可根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。尽管原则上，修饰可以在体内进行，即直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但是优选的是如下所示例地在体外进行修饰。
便利的消除或降低多核苷酸的表达的方法的实例是基于基因替换、基因缺失、或基因破坏技术的。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，该缺陷的核酸序列替换内源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸还编码可用于选择其中该多核苷酸已经被修饰或破坏的转化体的标记。在一个方面，用例如在此描述的那些选择性标记来破坏该多核苷酸。
本发明还涉及抑制具有过氧合酶活性的多肽在细胞中的表达的方法，这些方法包括向该细胞给予或在其中表达一种双链RNA(dsRNA)分子，其中该dsRNA包括本发明的多核苷酸的一个子序列。在一个优选方面，该dsRNA长约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个双核苷酸。
该dsRNA优选是一个小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在一个优选方面，该dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选方面，该dsRNA是用于抑制翻译的微小RNA。
本发明还涉及此类双链RNA(dsRNA)分子，包括用于抑制该多肽在细胞中的表达的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的部分。虽然本发明不局限于任何具体的作用机制，但是该dsRNA可以进入一个细胞并且导致相似的或相同的序列的单链RNA(ssRNA)(包括内源mRNA)的降解。当细胞被暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地被一种叫做RNA干扰(RNAi)的过程所降解。
本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一个方面，本发明提供了使用本发明的dsRNAi来选择性地降解RNA的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一个方面，可以使用这些dsRNA分子来在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。用于制备并使用dsRNA分子选择性降解RNA的方法在本领域中是熟知的；参见例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824；以及6,515,109。
本发明进一步涉及在编码该多肽的多核苷酸或其控制序列或编码该多肽的沉默基因中包括破坏或缺失的亲本细胞的突变体细胞，这导致与亲本细胞相比，该突变体细胞产生的多肽少或不产生多肽。
这些多肽缺陷的突变体细胞作为用于原生和异源多肽的表达的宿主细胞尤其有用。因此，本发明进一步涉及产生天然或异源多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养该突变体细胞；并且(b)回收该多肽。术语“异源多肽”是指对该宿主细胞来说不是原生的多肽，例如天然蛋白质的变体。该宿主细胞可以包括多于一个拷贝的编码该原生或异源多肽的多核苷酸。
可使用本领域已知的方法进行培养和目的产物的纯化。
本发明用于产生基本上不含过氧合酶的产物的方法在真核多肽的生产中是特别感兴趣的，尤其是真菌蛋白质，例如酶。过氧合酶缺陷的细胞还可用于表达药学感兴趣的异源蛋白，例如激素、生长因子、受体等。术语“真核多肽”不仅包括原生多肽，还包括经过氨基酸替代、缺失或添加的修饰或用以增强活性、热稳定性、pH耐受性等的其他此类修饰的多肽，例如酶。
在另一个方面中，本发明涉及通过本发明的方法生产的基本上不含过氧合酶活性的蛋白产物。
组合物
可以将本发明的过氧合酶多肽添加至洗涤剂组合物中并且因此使其成为洗涤剂组合物的组分。
本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
在一个特定的方面中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括如在此描述的本发明的多肽。
洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、以及在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、以及其组合。
洗涤剂组合物可以包括按重量计0-65％的洗涤剂助洗剂或共-助洗剂、或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐(如三磷酸钠(STP或STPP))、碳酸盐(如碳酸钠)、可溶性硅酸盐(如偏硅酸钠)、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚胺基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氨基三乙醇(TEA))、以及羧甲基菊粉(CMI)、以及其组合。
洗涤剂组合物可以包含按重量计0-50％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预制的过酸和其混合物。适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过白啶酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待于在此使用的适合的漂白活化剂包括属于酯酰胺类、酰亚胺类或酐类的那些，适合的例子是四乙酰乙二胺(TAED)、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸钠、二过氧十二烷酸、4-(十二烷酰氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐(ISONOBS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)和/或WO 98/17767中披露的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像特雷森(Triacin))具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，如6-(邻苯二甲酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括一种漂白催化剂。
洗涤剂组合物的其他本领域中所有熟知的成分包括助水溶物，织物调色剂，消泡剂，去污聚合物，抗再沉积剂，等。
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、碳水化合物酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如漆酶)和/或过氧化物酶。
可以将本发明的多肽以对应于以下各项的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升洗涤液0.001-100mg的蛋白质，例如0.01-100mg的蛋白质，优选是0.005-50mg的蛋白质，更优选是0.01-25mg的蛋白质，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白质，最优选是0.05-5mg的蛋白质，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白质。
具有过氧合酶活性的多肽(过氧合酶)以及任选地还有过氧化氢源可以被配制为液体(例如水性)、固体、凝胶、糊状或干产品配制品。干产品配制品随后可以被重新水化，以形成在本发明的方法中可用的活性液体或半液体配制品。
当过氧合酶和过氧化氢源被配制为干配制品时，可以将这些组分混合、安排于离散层中或分开包装。
当使用不同于干燥形式的配制品时，并且甚至那样的话，优选的是使用具有与过氧化氢源分开的过氧合酶的双部分配制品系统。
本发明的组合物可以进一步包括助剂，例如润湿剂、增稠剂、用于pH控制的一种或多种缓冲液、稳定剂、香料、着色剂、填充物等。
有用的润湿剂是表面活性剂，即非离子、阴离子、两性或兼性离子表面活性剂。上文进一步描述了表面活性剂。
方法和用途
本发明的过氧合酶多肽可以用于脂肪烃的位置2或位置3的位点特异性羟基化。脂肪烃必须包括一条具有至少3个碳的链，并且脂肪烃的任一(一个或多个)端都可以被用作起始点，以确定哪个碳处于位置2或3。脂肪烃必须具有至少一个附接至位置2或3的碳(其被羟基化)的氢。在一个优选实施例中，处于位置2或3的碳(其被过氧合酶羟基化)未被取代(在进行羟基化之前)。
因此，在第一方面中，本发明提供了一种用于取代的或未取代的、直链的或支链的具有至少3个碳并且具有附接至位置2或3的碳的氢的脂肪烃的任一端(一端或多端)的位置2或3的羟基化的方法，该方法包括使该脂肪烃与过氧化氢和本发明的具有过氧合酶活性的多肽接触。
本发明的方法可以用于多种目的，像散装化学品合成(生物催化)、增加脂肪烃的水溶解度、生物治理以及食物产品的特征的修饰。
本发明的方法还可以用于多种其中所述羟基化反应是有益的工业过程。此类用途的一个实例是在生产纸浆和纸产品中，其中存在于木材(树脂)中的烷烃以及其他相关脂肪烃可以在纸浆和纸生产过程中引起沉积问题。这些疏水化合物是纸浆和纸生产过程内所谓的沥青沉积物的前体。沥青沉积形成低质量纸浆，并且可以导致纸浆厂运转停工。与具有高提取物含量的纸浆相关的具体问题包括运行性能问题、纸上有斑点和洞以及纸页断裂。用过氧合酶处理可以增加所述化合物的溶解度并且因此减轻问题。
本发明的方法的又另一种用途即是在石油或煤炭精炼厂中，其中过氧合酶催化的羟基化可以用于修饰烃类的溶解度、粘度和/或燃烧特性。确切而言，该处理可以引起经受该处理的烃类的发烟点、着火点、燃点以及沸点的变化。
在散装化学品、农用化学品(包括杀有害生物剂)、专用化学品以及药物的合成中，本发明的方法就在底物中选择性引入羟基从而影响修饰的化合物的溶解度而言可以是显而易见地相关的。此外，选择性羟基化为通过有机化学合成和化学酶促合成领域已知的方法进行的进一步修饰提供了位点。
天然气被广泛加工，以除去高级烷烃。此类高级烷烃的羟基化可以用于改进水溶性，并且因此有助于通过洗涤天然气流而除去高级烷烃。可以在井中或在精炼过程中进行除去。
石油废料的羟基化将显著改善生物降解性并且与来自精炼厂的废水处理和污染的地面或水的生物治理两者相联系将是可适用的。
在第二方面中，本发明提供了一种用于脂质的酰基的末端的位置2或3的羟基化的方法，该方法包括使该脂质与过氧化氢和本发明的具有过氧合酶活性的多肽接触。
脂质的酰基的羟基化通常改善该脂质的水溶解度。因此，本发明的方法可以用于从衣物上除去或减少包含油或脂质的污物(像巧克力)，这是通过使该衣物与过氧合酶和过氧化氢源以及任选地一种表面活性剂接触。
在另一个方面中，本发明的方法可以用于减少衣物的令人不愉快的气味，这是通过使该衣物与过氧合酶和过氧化氢源以及任选地一种表面活性剂接触。本发明的方法引起衣物中的丁酸(酪酸)的量减少。在洗涤衣物过程中形成丁酸，当某些动物油脂和植物油被例如洗涤剂脂肪酶水解时，以产生游离脂肪酸(包括丁酸)。丁酸具有极其令人不愉快的气味。过氧合酶将丁酸羟基化为2-羟基丁酸(α-羟基丁酸)或3-羟基丁酸(β-羟基丁酸)。
本发明还提供了一种用于在脂肪烃的至少两个端点的第二个或第三个碳处位点特异性引入羟基和/或氧代(酮基)基团的方法，该方法使用本发明的过氧合酶多肽和过氧化氢。
脂肪烃必须包括一条具有至少五个碳的链。通过从脂肪烃的任意端的碳原子计数来确定第二个碳和第三个碳。
脂肪烃必须具有至少一个附接至碳的氢，该碳通过羟基的附接而被羟基化；以及至少两个当引入氧代基团时附接至碳的氢。在一个优选实施例中，在与过氧合酶接触之前，第二个或第三个碳未被取代。
根据本发明的方法，在脂肪烃的(至少)两个端处独立于彼此地引入羟基和/或氧代基团。因此，可以在一端引入羟基，同时在另一(另外一)端引入氧代基团-反之亦然。不可以在脂肪烃的同一端引入两个羟基、或两个氧代基团、或一个羟基和一个氧代基团。
在本发明的背景下，“氧化”意指引入羟基和/或氧代基团。
因此，在第一方面中，本发明提供了一种用于在取代或未取代的、直链的或支链的脂肪烃的(至少)两个端的第二个或第三个碳处引入羟基和/或氧代(酮基)基团的方法,该脂肪烃具有至少五个碳并且具有至少一个附接至所述第二个或第三个碳的氢，该方法包括使该脂肪烃与过氧化氢和本发明的具有过氧合酶活性的多肽接触。
在一个优选实施例中，通过引入两个羟基将脂肪烃氧化为(转化为)二醇。更优选地，这两个羟基位于直链脂肪烃的每一端。
本发明的方法可以用于多种目的，像散装化学品合成(生物催化)、增加脂肪烃的水溶解度、生物治理以及食物产品的特征的修饰。
本发明的方法还可以用于多种其中所述氧化反应是有益的工业过程。此类用途的一个实例是在生产纸浆和纸产品中，其中存在于木材(树脂)中的烷烃以及其他相关脂肪烃可以在纸浆和纸生产过程中引起沉积问题。这些疏水化合物是纸浆和纸生产过程内所谓的沥青沉积物的前体。沥青沉积形成低质量纸浆，并且可以导致纸浆厂运转停工。与具有高提取物含量的纸浆相关的具体问题包括运行性能问题、纸上有斑点和洞以及纸页断裂。用过氧合酶处理可以增加所述化合物的溶解度并且因此减轻问题。
本发明的方法的又另一种用途是例如在石油或煤炭精炼厂中，其中过氧合酶催化的氧化可以用于修饰烃类的溶解度、粘度和/或燃烧特性。确切而言，该处理可以引起经受该处理的烃类的发烟点、着火点、燃点以及沸点的变化。
在散装化学品、农用化学品(包括杀有害生物剂)、专用化学品以及药物的合成中，本发明的方法就在底物中选择性引入羟基从而影响修饰的化合物的溶解度而言可以是显而易见地相关的。此外，选择性氧化为通过有机化学合成和化学酶促合成领域已知的方法进行的进一步修饰提供了位点。
天然气被广泛加工，以除去高级烷烃。此类高级烷烃的氧化可以用于改进水溶性，并且因此有助于通过洗涤天然气流而除去高级烷烃。可以在井中或在精炼过程中进行除去。
根据本发明，石油废料的氧化将显著改善生物降解性并且与来自精炼厂的废水处理和污染的地面或水的生物治理两者相联系将是可适用的。
可以用本发明的固定的过氧合酶多肽进行本发明的方法。
本发明的方法可在一种水性溶剂(反应介质)、各种醇、醚、其他极性或非极性溶剂、或其混合物中进行。通过研究在本发明的方法中使用的脂肪族碳氢化合物的特征，本领域的普通技术人员容易识别适合的溶剂的实例。通过升高或降低进行羟基化/氧化的压力，可在反应温度下将溶剂(反应介质)和脂肪烃维持在液相中。
根据本发明的方法可在0和90摄氏度之间、优选5和80摄氏度之间、更优选10和70摄氏度之间、甚至更优选15和60摄氏度之间、最优选20和50摄氏度之间、和特别是20和40摄氏度之间的一个温度下进行。
本发明的方法可采用从10秒到(至少)24小时、优选从1分钟到(至少)12小时、更优选从5分钟到(至少)6小时、最优选从5分钟到(至少)3小时、并且特别是从5分钟到(至少)1小时的处理时间。
通过本发明的方法产生的二醇(二-羟基脂肪烃)可以用于生产聚氨酯。聚氨酯是一种由通过氨基甲酸酯(尿烷)连接而连接的有机单元链构成的聚合物。聚氨酯聚合物是通过使单体(具有至少两个异氰酸酯官能团)与另一单体(具有至少两个羟基)在催化剂的存在下发生反应经由逐步增长聚合而形成的。
本发明还提供了一种用于在取代或未取代的、直链的或支链的脂肪烃的第二个或第三个碳处引入氧代(酮基)基团的方法，该脂肪烃具有至少五个碳并且具有至少两个附接至所述第二个或第三个碳的氢，该方法包括使该脂肪烃与过氧化氢和本发明的具有过氧合酶活性的多肽接触。
在又另一个方面中，本发明还提供了一种用于在具有至少五个碳的被羧基取代的直链的或支链的脂肪烃的末端碳处引入羟基或氧代基团的方法，该方法包括使该脂肪烃与过氧化氢和本发明的具有过氧合酶活性的多肽接触。
在一个实施例中，被羧基取代的脂肪烃是一种脂肪酸；优选是丁酸(酪酸)、戊酸(缬草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(天竺葵酸)、癸酸(羊蜡酸)、十二烷酸(月桂酸)、十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕榈酸)、十八烷酸(硬脂酸)、二十烷酸(花生酸)、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
在又另一个方面中，本发明还提供了一种用于将具有至少五个碳的直链的或支链的脂肪烃的伯醇改变(氧化)为对应的酸的方法，该方法包括使脂肪烃的该醇与过氧化氢和本发明的具有过氧合酶活性的多肽接触。
例如，戊醇可以被改变(氧化)为戊酸(缬草酸)，己醇可以被变为己酸(羊油酸)，庚醇可以被变为庚酸(葡萄花酸)，辛醇可以被变为辛酸(羊脂酸)，壬醇可以被变为壬酸(天竺葵酸)，癸醇可以被变为癸酸(羊蜡酸)，十二醇可以被变为十二烷酸(月桂酸)，十四醇可以被变为十四烷酸(肉豆蔻酸)，十六醇可以被变为十六烷酸(棕榈酸)，十八醇可以被变为十八烷酸(硬脂酸)，并且二十醇可以被变为二十烷酸(花生酸)。
本发明的具有过氧合酶活性的多肽(过氧合酶多肽或过氧合酶)以0.005-50ppm(mg/l)，或0.01-40、0.02-30、0.03-25、0.04-20、0.05-15、0.05-10、0.05-5、0.05-1、0.05-0.8、0.05-0.6或0.1-0.5ppm的量用于本发明的方法中。酶的量是指一种定义明确的酶制剂的mg。
在本发明的方法中，该过氧合酶可以单独应用或与一种另外的酶一起应用。术语“一种另外的酶”意指至少一种另外的酶，例如一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或甚至更多种另外的酶。
术语“与...一起应用”(或“与...一起使用”)意指另外的酶可以在本发明的方法的同一个或另一个步骤中应用。与使用过氧合酶的步骤相比，另一加工步骤可以是上游或下游。
在具体实施例中，该另外的酶是具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质酶、氧化还原酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、固醇酯酶和/或胆固醇酯酶活性的一种酶。氧化还原酶的实例是具有漆酶和/或过氧化酶活性的酶。
术语方法的“步骤”意指至少一个步骤，并且它可以是一个、两个、三个、四个、五个或甚至更多个方法步骤。换言之，本发明的过氧合酶可以在至少一个方法步骤中应用，并且一种或多种另外的酶也可以在至少一个方法步骤中应用，该至少一个方法步骤与使用该过氧合酶的步骤相比可以是相同的或不同的方法步骤。
术语“酶制剂”意指一种包含至少一种过氧合酶的产品。该酶制剂还可以包括具有其他酶活性的酶。除了该酶活性之外，这样的一种制剂优选地包含至少一种佐剂。佐剂的实例是缓冲液、聚合物、表面活性剂以及稳定剂。
过氧化氢
过氧合酶所需的过氧化氢(或过氧化氢源)可被提供为过氧化氢的一种水性溶液或用于原位生产过氧化氢的一种过氧化氢前体。任何在溶解时释放过氧合酶可用的过氧化物的固体实体都可充当过氧化氢的一个来源。在水或一种合适的基于水的介质中溶解时产生过氧化氢的化合物包括但不限于金属过氧化物、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过氧酸、烷基过氧化物、酰基过氧化物、过氧酯、过氧化脲、过硼酸盐和过氧羧酸或其盐。
过氧化氢的另一个来源是一种过氧化氢生成酶系统，例如一种氧化酶与用于该氧化酶的一种底物一起。氧化酶和底物的组合的实例包括但不限于氨基酸氧化酶(参见例如US 6,248,575)和一种适合的氨基酸、葡萄糖氧化酶(参见例如WO 95/29996)和葡萄糖、乳酸盐氧化酶和乳酸盐、半乳糖氧化酶(参见例如WO 00/50606)和半乳糖、以及醛糖氧化酶(参见例如WO 99/31990)和一种适合的醛糖。
通过研究EC 1.1.3._、EC 1.2.3._、EC 1.4.3._、以及EC 1.5.3._或类似类别(在国际生物化学协会下)，本领域的普通技术人员容易识别氧化酶和底物的这类组合的其他实例。
过氧化氢或一种过氧化氢源可以在本发明的方法开始时或进行中添加，例如为一次或多次分开添加过氧化氢，或连续地作为补料分批添加。过氧化氢的典型量对应于从0.001mM至25mM的水平，优选地从0.005mM至5mM的水平，并且特别是从0.01mM至1mM过氧化氢的水平。还可以按对应于以下各项的一个量使用过氧化氢：从0.1mM至25mM的水平，优选地至从0.5mM至15mM的水平，更优选地至从1mM至10mM的水平，以及最优选地至从2mM至8mM过氧化氢的水平。
脂肪烃
在本发明的方法中被羟基化的烃是具有一条至少3个碳的链并且具有一个附接至位置2或3的碳的氢的脂肪烃。优选地，该脂肪烃是一种烷烃或烯烃；更优选地，该脂肪烃是一种烷烃，例如丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷或癸烷或其异构体。
脂肪烃是直链的或支链的，但不是环状的，因为环烃的位点特异性羟基化是不可能的。支链烃对应于直链烃的异构体。
脂肪烃是取代的或未取代的。优选地，脂肪烃是未取代的，例如未活化烃。
当脂肪烃被取代(被官能团附接)时，优选的取代基是卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、巯基、磺酰基、甲酰基、乙酰基、甲氧基、乙氧基、苯基、苄基、二甲苯基、氨基甲酰基以及氨磺酰基；更优选的取代基是氯、羟基、羧基以及磺酰基；并且最优选的取代基是氯和羧基。
脂肪烃可以被多达10个取代基、多达8个取代基、多达6个取代基、多达4个取代基、多达2个取代基取代，或被多达一个取代基取代。
在一个优选实施例中，该脂肪烃是一种脂肪酸(取代基是羧基)。脂肪酸的实例包括但不限于，丁酸(酪酸)、戊酸(缬草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(天竺葵酸)、癸酸(羊蜡酸)、十二烷酸(月桂酸)、十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕榈酸)、十八烷酸(硬脂酸)、二十烷酸(花生酸)、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸。
在第二方面中，该脂肪烃是脂质的酰基基团，例如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂或鞘脂；并且羟基化发生在该酰基的末端的位置2或位置3。该酰基基团必须具有至少一个附接至末端的位置2或3的碳的氢。该酰基基团可以是饱和的或不饱和的，并且任选地，可以附接官能团(取代基)。酰基基团的实例包括但不限于以下各项的酰基形式：丁酸(酪酸)、戊酸(缬草酸)、己酸(羊油酸)、庚酸(葡萄花酸)、辛酸(羊脂酸)、壬酸(天竺葵酸)、癸酸(羊蜡酸)、十二烷酸(月桂酸)、十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕榈酸)、十八烷酸(硬脂酸)、二十烷酸(花生酸)、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸。
信号肽
本发明还涉及一种编码信号肽的分离的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-17至-1或由其组成。这些多核苷酸可以进一步包括一个编码蛋白质的基因，该蛋白质可操作地连接到该信号肽。该蛋白质优选地对于该信号肽来说是外源的。在一个方面中，编码该信号肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸1至51。
本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。
本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括(a)对包含这种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养；并且(b)回收该蛋白质。
该蛋白质对于宿主细胞来说可以是原生的或异源的。术语“蛋白质”在此不意图是指一种特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽及多肽。术语“蛋白质”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。
优选地，该蛋白质是一种激素、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告基因。例如，该蛋白质可以是一种水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
菌株
米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(参见WO2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因恢复pyrG营养缺陷型。根据WO 95/02043(“米曲霉或黑曲霉的转化(Transformation of Aspergillus oryzae orAspergillus niger)”)，但是使用Glucanex(与裂解酶西格玛(Sigma)L1412相同)代替234制备米曲霉MT3568的原生质体。
培养基和溶液
DAP-4C-1培养基
11g MgSO4,7H2O；
1.0g KH2PO4；
2.0g 柠檬酸(C6H8O7,H2O)；
20g 右旋糖；
10g 麦芽糖；
5.2g K3PO4,H2O；
0.5g酵母提取物；以及
0.5ml KU6痕量金属溶液(AMG，MSA-SUB-FS-0042)。
添加500ml Milli-Q-水并混合直到完全溶解。
添加1ml Dowfax 63N10(直链EO/PO嵌段共聚物，消泡(defoam/antifoam)剂)。
用Milli-Q-水将体积调节至1000ml。
添加0.5g的CaCO3片(每200ml添加1片)。
接种之前，向每个150ml的摇瓶中添加3.5ml的50％磷酸氢二铵((NH4)2HPO4)和5.0ml的20％乳酸。
KU6痕量金属溶液(AMG，MSA-SUB-FS-0042)
6.8g ZnCl2；
2.5g CuSO4,5H2O；
0.13g 无水氯化镍；
13.9g FeSO4,7H2O；
8.45g MnSO4,H2O；
3.0g柠檬酸(C6H8O7,H2O)；以及
补加至1000ml的离子交换水。
表1.KU6痕量金属溶液。
原材料 化学式 供应商 7-cif.no. 量
氯化锌 ZnCl2 默克108816 102-4965 6.8g
硫酸铜 CuSO4,5H2O 默克102790 109-0771 2.5g
无水氯化镍 NiCl2 默克806722 101-6652 0.13g
硫酸亚铁 FeSO4,7H2O 默克103965 13.9g
硫酸锰 MnSO4,H2O 默克105941 8.45g
柠檬酸 C6H8O7,H2O 默克100244 3.0g
离子交换水补加至 1000ml
LB板由10g的细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、5g的酵母提取物、10g的氯化钠、15g的细菌用琼脂(Bacto-agar)及补足至1升的去离子水构成。
LB培养基由10g的细菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物和10g的氯化钠，以及补足至1升的去离子水构成。
COVE蔗糖板由342g的蔗糖、20g的琼脂粉、20ml的COVE盐溶液以及补足至1升的去离子水构成。该培养基通过在15psi下高压杀菌15分钟来进行灭菌(细菌学分析手册(Bacteriological Analytical Manual)，第8版，修订A，1998)。将该培养基冷却至60℃并且添加10mM乙酰胺、TritonX-100(50μl/500ml)。
COVE盐溶液由26g的MgSO4·7H2O；26g的KCl；26g的KH2PO4；50ml的COVE痕量金属溶液，以及补足至1升的去离子水构成。
COVE痕量金属溶液由0.04g的Na2B4O7,10H2O；0.4g的CuSO4,5H2O；1.2g的FeSO4,7H2O；0.7g的MnSO4,H2O；0.8g的Na2MoO4,2H2O；10g的ZnSO4,7H2O；以及补足至1升的去离子水构成。
实例1
从黄褐毁丝霉表达成熟过氧合酶
SEQ ID NO:1的多核苷酸是编码分离自黄褐毁丝霉CBS 540.82的过氧合酶的基因组核苷酸序列。黄褐毁丝霉CBS 540.82(获得自Centraalbureau voor Schimmelcultures，荷兰)起源于新西兰(1976)。
通过PCR扩增SEQ ID NO:1的多核苷酸。该PCR由1μl的黄褐毁丝霉的基因组DNA、0.75μl的正向克隆引物(10μM)、0.75μl的反向克隆引物(10μM)、3μl的5X HF缓冲液(费泽姆公司(Finnzymes Oy)，芬兰)、0.25μl的50mM MgCl2、0.30μl的10mM dNTP、0.15μl的DNA聚合酶(费泽姆公司，芬兰)以及8.8μl PCR等级水构成。使用热循环仪进行扩增反应，其被编程为：在98℃下2分钟；随后是35个循环，每个循环由98℃持续10秒和72℃持续90秒组成；随后在72℃下单延伸(single extension)5分钟。
正向克隆引物(SEQ ID NO:17)：
5’-ACACAACTGGGGATCCACCATGAGAGCCTCTGTCTTGCCAGT-3’
反向克隆引物(SEQ ID NO:18)：
5’-AGATCTCGAGAAGCTTAGAAACCAAAGTGGGTGCGACGG-3’
在1.0％琼脂糖凝胶电泳上使用TAE缓冲液来分离PCR产物，其中将PCR带从该凝胶中切除并根据制造商的说明使用PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(Gel BandPurification Kit)(GE医疗公司(GE Healthcare)，希勒勒，丹麦)进行纯化。根据制造商的说明使用IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(BD生物科学公司(BD Biosciences)，帕洛阿尔托，加州，美国)将对应于黄褐毁丝霉过氧合酶基因的DNA(SEQ ID NO:1)克隆进先前被Bam HI和Hind III线性化的表达载体pDAu109中(参见WO 2005/042735)。
将1μl体积的未稀释的连接混合物用于转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加州，美国)。在包含100μg氨比西林/ml的LB琼脂板上选择两个菌落并在补充有100μg的氨比西林/ml的2ml LB培养基中培养过夜。根据制造商的说明使用Jetquick质粒小量制备旋转试剂盒(Jetquick Plasmid Miniprep Spin Kit)(Genomed有限公司，德国)纯化质粒DNA。
在异源表达之前，通过桑格测序(Sanger sequencing)验证黄褐毁丝霉过氧合酶基因序列。
针对过氧合酶基因在米曲霉MT3568宿主细胞中的异源表达选择包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的质粒。
米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(参见WO2002/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因恢复pyrG营养缺陷型。使用Glucanex(与裂解酶西格玛L1412相同)制备米曲霉MT3568的原生质体。
将100μl的米曲霉MT3568原生质体与包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的1-2μg曲霉属表达载体和250μl的60％PEG 4000(艾普利公司(Applichem)，达姆施塔特，德国)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2以及10mM Tris-HCl(pH 7.5)混合并轻轻混合。在37℃下孵育30分钟后，添加4ml的顶层琼脂(温度40℃)，并且将原生质体涂布在COVE板上用于选择。在37℃下孵育4-7天后，将四个转化体的孢子接种到96深孔板中的0.5ml的DAP-4C-01培养基中。在30℃下培养4-5天后，通过SDS-PAGE分析培养液，以鉴定从黄褐毁丝霉产生最大量的重组过氧合酶的转化体，并且还在测定中分析培养液用于确认活性。
将最好的转化体的孢子涂布于包含0.01％X-100的COVE板上，以便分离单个菌落。重复涂布两次。
将如上所述构建的米曲霉转化体在振荡平台恒温箱中的于26℃-30℃下孵育的500ml有凹槽的摇瓶中的150ml DAP-4C-01培养基中在150RPM旋转下发酵5天并且进一步用于如下所述的测定。
实例2
4-硝基苯并二噁茂的氧化
过氧合酶将4-硝基苯并二噁茂(1,2-(亚甲基二氧基)-4-硝基苯)氧化为4-硝基儿茶酚并且在425nm处用分光光度计量化产生的黄色(ε425＝9,700M-1cm-1)。
在乙腈中制备4-硝基苯并二噁茂的10mM储备溶液(98％纯，161500奥德里奇(Aldrich))。在去离子水中制备纯化的过氧合酶的0.1mg/ml储备溶液(包含SEQ ID NO:2的过氧合酶)。最终的反应混合物(0.2mL)包含1.0mM 4-硝基苯并二噁茂、10％乙腈、缓冲液(50mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)或50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)或25mM硼酸盐缓冲液(pH8.5))、0.002mg纯化的过氧合酶/ml以及0.5mM过氧化氢。通过添加过氧化氢来起始反应。使用来自Nunc的96孔微量滴定板(编号260836)，应用SpectraMax Plus 384读板仪(在30℃下、在425nm下的动力学)。一式三份地分析每个样品。将在未添加过氧化氢情况下制备的空白减掉。
经2分钟记录吸光度的增加，并且结果(参见表2)显示过氧合酶将4-硝基苯并二噁茂转化为4-硝基儿茶酚。
表2.吸光度(A425)测量值。
时间(秒) pH 4.5 pH 6.5 pH 8.5
0 0.018 0.101 0.062
40 0.031 0.213 0.115
80 0.031 0.232 0.106
120 0.032 0.238 0.106
实例3
藜芦基醇的氧化
使用0.01mg/mL的纯化的过氧合酶(由SEQ ID NO:1编码的成熟过氧合酶)在1mL的总反应体积中用20％乙腈和5mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)进行使用1mM H2O2的1mM藜芦基醇的氧化。将反应在室温下进行25分钟并且通过添加1μL的过氧化氢酶(Terminox Ultra50L，诺维信(Novozymes))而停止。
将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦(Agilent)1200HPLC系统(安捷伦公司(Agilent)，圣克拉拉市，加州，美国)上进行分析并且在来自菲罗门公司(Phenomenex)(托伦斯，加州，美国)的在40℃下恒温的Gemini C6-Phenyl(2x 150mm，3μm)柱上进行分离。使用两个流动相：(A)0.1％甲酸，和(B)乙腈中的0.1％甲酸。
使用以下分级梯度运行分离：以20％B保持1min起始，然后在4min内增加至55％B并且以0.4mL/min的恒定流速在55％下维持1min。
使用可靠标准品，基于其保留时间、UV吸收光谱(分别为230nm、280nm和260nm)通过外部校准对藜芦基醇及其氧化产物藜芦基醛和藜芦酸进行鉴定和量化。
过氧合酶氧化藜芦基醇，产生单一产物藜芦基醛(3.7％)。
实例4
二苯并噻吩的氧化
使用0.01mg/mL的纯化的过氧合酶(由SEQ ID NO:1编码的成熟过氧合酶)在1mL的总反应体积中用30％乙腈和处于指定pH值的10mM乙酸盐(pH 3-5)、磷酸盐(pH 6-7)或硼酸盐缓冲液(pH 8)进行使用1mM H2O2的1mM二苯并噻吩的氧化。将反应在室温下进行25分钟并且通过添加1μL的过氧化氢酶(Terminox Ultra 50L，诺维信)而停止。
将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦1200HPLC系统(安捷伦公司，圣克拉拉市，加州，美国)上进行分析并且在来自菲罗门公司(托伦斯，加州，美国)的在40℃下恒温的Gemini C6-Phenyl(2x 150mm，3μm)柱上进行分离。使用两个流动相：(A)0.1％甲酸，和(B)乙腈中的0.1％甲酸。
使用以下分级梯度运行分离：以30％B保持0.5min起始，然后在14.5min内增加至80％B并且以0.4mL/min的恒定流速在80％下维持3min。
使用可靠标准品，基于其保留时间、UV吸收光谱(230nm和260nm)通过外部校准对二苯并噻吩及其氧化产物二苯并噻吩砜进行鉴定和量化。二苯并噻吩氧化物标准品不可商购，使用二苯并噻吩砜校准曲线进行此化合物的量化。
过氧合酶氧化二苯并噻吩，产生一种产物二苯并噻吩氧化物(DBT-SO)。
表3.二苯并噻吩氧化物在不同pH下的产率。
实例5
萘的氧化
使用0.01mg/mL的纯化的过氧合酶(由SEQ ID NO:1编码的成熟过氧合酶)在1mL的总反应体积中与20％乙腈和处于指定pH值的10mM乙酸盐(pH 3-5)、磷酸盐(pH 6-7)或硼酸盐缓冲液(pH 8)进行使用1mM H2O2的1mM萘的氧化。将反应在室温下进行25分钟并且通过添加1μL的过氧化氢酶(Terminox Ultra 50L，诺维信)而停止。
将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦1200HPLC系统(安捷伦公司，圣克拉拉市，加州，美国)上进行分析并且在来自菲罗门公司(托伦斯，加州，美国)的在40℃下恒温的Gemini C6-Phenyl(2x 150mm，3μm)柱上进行分离。使用两个流动相：(A)0.1％甲酸，和(B)乙腈中的0.1％甲酸。
使用以下分级梯度运行分离：以30％B保持0.5min起始，然后在3.5min内增加至50％B并且然后以0.4mL/min的恒定流速在5min内增加至60％B。
使用可靠标准品，基于其保留时间和UV吸收光谱(210nm或204nm)鉴定萘及其可能的氧化产物1-萘酚、2-萘酚、1,4-萘醌以及萘-1,4-二醇。基于可靠标准品的外部校准进行量化，以下除外：将萘-1,4-二醇用作标准品鉴定1,4-萘醌。
过氧合酶氧化萘，产生两种产物1-萘酚(1-NOL)和萘-1,4-二醇(NPD)。
表4.不同pH下的萘氧化产物产率。
实例6
苯甲醇的氧化
使用0.01mg/mL的纯化的过氧合酶(由SEQ ID NO:1编码的成熟过氧合酶)在1mL的总反应体积中与30％乙腈和处于指定pH值的10mM乙酸盐(pH 3-5)、磷酸盐(pH 7)或硼酸盐缓冲液(pH 9)进行使用2mM H2O2的1mM苯甲醇的氧化。将反应在室温下进行25分钟并且通过添加1μL的过氧化氢酶(Terminox Ultra 50L，诺维信)而停止。
将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦1200HPLC系统(安捷伦公司，圣克拉拉市，加州，美国)上进行分析并且在来自菲罗门公司(托伦斯，加州，美国)的在40℃下恒温的Zorbax Stable Bond C18(2)(2.1x 50mm，1.8μm)柱上进行分离。使用两个流动相：(A)0.1％甲酸，和(B)乙腈中的0.1％甲酸。
使用以下分级梯度运行分离：以5％B保持4min起始，然后以0.5ml/min的恒定流速在6min内增加至100％B。
使用可靠标准品，基于其保留时间、UV吸收光谱(分别为210nm、250nm和230nm)通过外部校准对苯甲醇及其氧化产物苯甲醛和苯甲酸进行鉴定和量化。
过氧合酶氧化苯甲醇，产生两种产物苯甲醛和苯甲酸。
表5.在不同pH下，计算的总产物、苯甲醛(B-CHO)和苯甲酸(B-COOH)产率的比较。
实例7
4-羟基苯甲酸的氧化
使用0.01mg/mL的纯化的过氧合酶(由SEQ ID NO:1编码的成熟过氧合酶)以1mL的总反应体积中在20％乙腈和具有2mM抗坏血酸的10mM磷酸盐缓冲液(pH 6)中进行使用1mMH2O2的2mM 4-羟基苯甲酸的氧化。将反应在室温下进行15分钟并且通过添加1μL的过氧化氢酶(Terminox Ultra 50L，诺维信)而停止。
将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦1200HPLC系统(安捷伦公司，圣克拉拉市，加州，美国)上进行分析并且在来自菲罗门公司(托伦斯，加州，美国)的在40℃下恒温的Zorbax Stable Bond C18(2)(2.1x 50mm，1.8μm)柱上进行分离。使用两个流动相：(A)0.1％甲酸，和(B)乙腈中的0.1％甲酸。
使用以下分级梯度运行分离：以5％B保持4min起始，然后以0.5ml/min的恒定流速在6min内增加至100％B。
使用可靠标准品，基于其保留时间、210nm下的UV吸收光谱通过外部校准对4-羟基苯甲酸及其氧化产物3,4-二羟基苯甲酸进行鉴定和量化。
过氧合酶氧化4-羟基苯甲酸，产生单一产物3,4-二羟基苯甲酸(0.8％)。
实例8
正庚烷的氧化
使用0.01mg/mL的纯化的过氧合酶(由SEQ ID NO:1编码的成熟过氧合酶)在1mL的总反应体积中与20％丙酮和10mM磷酸盐缓冲液(pH 6)进行使用1mM H2O2的2mM正庚烷的氧化。将反应在室温下进行10分钟并且然后通过添加萃取溶剂乙酸乙酯将样品失活。
在配备有安捷伦5975C系列MSD系统的安捷伦7890A气相色谱仪(安捷伦公司，圣克拉拉市，加州，美国)和来自菲罗门公司(托伦斯，加州，美国)的ZB-5HT(15×0.25mm，0.1μm)柱上分析样品。将恒定流速为2mL/min的氦用作承载气体。
用于分析，将2μL的乙酸乙酯萃取物在250℃下以分流模式(50:1)注入GC系统中。使用以下温度程序运行分离：以45℃保持1min起始，然后以5℃/min的速率增加至50℃并保持1min，然后以30℃/min的速率增加至200℃并保持0.5min。
使用可靠标准品，基于其保留时间和70eV下的电子碰撞MS通过外部校准对正庚烷氧化产物进行鉴定和量化。
过氧合酶氧化正庚烷，产生多种产物2-庚醇、3-庚醇、2-庚酮以及3-庚酮。
表6.正庚烷氧化产物产率。
产物 产率(％)
2-庚醇 5.0
3-庚醇 3.5
2-庚酮 1.0
3-庚酮 0
总产物 9.5
实例9
异丁苯的氧化
使用0.01mg/mL的纯化的过氧合酶(由SEQ ID NO:1编码的成熟过氧合酶)在1mL的总反应体积中与20％乙腈和5mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)进行使用1mM H2O2的1mM异丁苯的氧化。将反应在室温下进行5分钟并且通过添加1μL的过氧化氢酶(Terminox Ultra 50L，诺维信(Novozymes))而停止。
将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦1200HPLC系统(安捷伦公司，圣克拉拉市，加州，美国)上进行分析并且在来自菲罗门公司(托伦斯，加州，美国)的在40℃下恒温的Gemini C6-Phenyl(2x 150mm，3μm)柱上进行分离。使用两个流动相：(A)0.1％甲酸，和(B)乙腈中的0.1％甲酸。
使用以下分级梯度运行分离：以40％B保持1min起始，然后在4.5min内增加至90％B并且以0.4mL/min的恒定流速在90％下维持2min。
使用可靠标准品，基于其保留时间、UV吸收光谱(210nm)通过外部校准对异丁苯及其氧化产物2-甲基-1-苯基-1-丙醇、异丁酰苯、2-甲基-1-苯基-2-丙醇进行鉴定和量化。
过氧合酶氧化异丁苯(IBB)，产生三种产物2-甲基-1-苯基-1-丙醇(MP1)、异丁酰苯(IBP)和2-甲基-1-苯基-2-丙醇(MP2)。
表7.异丁苯氧化产物产率。
产物 产率(％)
IBP 6.2
MP1 37.9
MP2 2.0
总产物 46.1
实例10
1-庚醇的氧化
使用0.01mg/mL的纯化的过氧合酶(由SEQ ID NO:1编码的成熟过氧合酶)在1mL的总反应体积中与20％丙酮和10mM磷酸盐缓冲液(pH 6)进行使用1mM H2O2的1mM 1-庚醇的氧化。将反应在室温下进行10分钟并且然后通过添加萃取溶剂乙酸乙酯将样品失活。
在配备有安捷伦5975C系列MSD系统的安捷伦7890A气相色谱仪(安捷伦公司，圣克拉拉市，加州，美国)和来自菲罗门公司(托伦斯，加州，美国)的ZB-5HT(15×0.25mm，0.1μm)柱上分析样品。将恒定流速为2mL/min的氦用作承载气体。
用于分析，将2μL的乙酸乙酯萃取物在250℃下以分流模式(50:1)注入GC系统中。使用以下温度程序运行分离：以45℃保持1min起始，然后以5℃/min的速率增加至50℃并保持1min，然后以30℃/min的速率增加至200℃并保持0.5min。
使用可靠标准品，基于其保留时间和70eV下的电子碰撞MS通过外部校准对1-庚醇及其可能的氧化产物进行鉴定和量化。
过氧合酶氧化1-庚醇，产生单一产物庚醛(4.0％)。
实例11
苄基甲基醚的切割
使用0.01mg/mL的纯化的过氧合酶(由SEQ ID NO:1编码的成熟过氧合酶)在1mL的总反应体积中与20％或30％乙腈和10mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)进行使用1mM H2O2的1mM苄基甲基醚的切割。将反应在室温下进行25分钟并且通过添加1μL的过氧化氢酶(TerminoxUltra 50L，诺维信)而停止。
将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦(Agilent)1200HPLC系统(安捷伦公司(Agilent)，圣克拉拉市，加州，美国)上进行分析并且在来自菲罗门公司(Phenomenex)(托伦斯，加州，美国)的在40℃下恒温的Gemini C6-Phenyl(2x 150mm，3μm)柱上进行分离。使用两个流动相：(A)0.1％甲酸，和(B)乙腈中的0.1％甲酸。
使用以下分级梯度运行分离：以10％B保持4min起始，然后在0.5min内增加至15％B并维持4min，然后在7.5min内增加至80％B并维持0.5min，以0.4mL/min的恒定流速。
使用可靠标准品，基于其保留时间、UV吸收光谱(210nm、230nm和260nm)通过外部校准对苄基甲基醚及其切割产物进行鉴定和量化。
过氧合酶氧化苄基甲基醚，产生单一产物苯甲醛，如表8所示。
表8.在20％和30％乙腈下，苯甲醛的产率。
实例12
2,3,6-三甲基苯酚的氧化
使用0.01mg/mL的纯化的过氧合酶(由SEQ ID NO:1编码的成熟过氧合酶)以1mL的总反应体积在30％乙腈和具有2mM的抗坏血酸的处于指定pH值的10mM乙酸盐(pH 3-5)、磷酸盐(pH 6-7)或硼酸盐(pH 8)缓冲液(参见表9)中进行使用1mM H2O2的1mM 2,3,6-三甲基苯酚的氧化。将反应在室温下进行15分钟并且通过添加1μL的过氧化氢酶(Terminox Ultra50L，诺维信)而停止。
将样品在配备有二极管阵列检测器的安捷伦1200HPLC系统(安捷伦公司，圣克拉拉市，加州，美国)上进行分析并且在来自菲罗门公司(托伦斯，加州，美国)的在40℃下恒温的Luna C-18(2)(2.0x 250mm，5μm)柱上进行分离。使用两个流动相：(A)0.1％甲酸，和(B)乙腈中的0.1％甲酸。
使用以下分级梯度运行分离：以30％B起始并在0.5min内增加至50％B，然后在1.5min内增加至80％B，并且然后在2min内再次增加至95％B，以0.5ml/min的恒定流速。
使用可靠标准品，基于其保留时间、UV吸收光谱(分别为220nm和250nm)通过外部校准对2,3,6-三甲基苯酚及其可能的氧化产物2,3,5-三甲基-对苯醌进行鉴定和量化。
基于2,3,6-三甲基苯酚校准曲线，在220nm波长下对三甲基氢醌以及其他未鉴定的产物进行检测和量化。
过氧合酶氧化2,3,6-三甲基苯酚，产生单一产物三甲基氢醌(TMHQ)，如表9所示。
表9.不同pH下的2,3,6-三甲基苯酚氧化产物产率的比较。

Claims (26)

1.一种具有过氧合酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％序列一致性，其中所述多肽源自黄褐毁丝霉(Myceliophthora hinnulea)，且所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至244；以及
(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少99％序列一致性，其中所述多肽源自黄褐毁丝霉。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有100％序列一致性，其中所述多肽源自黄褐毁丝霉，且所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至244。
3.如权利要求1所述的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有100％序列一致性，其中所述多肽源自黄褐毁丝霉。
4.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列包括以下基序：
E-H-D-[G,A]-S-[L,I]-S-R、或
R-[G,A]-P-C-P-X-[M,L]-N-[S,T]-L。
5.一种包括如权利要求1-4中任一项所述的多肽的组合物。
6.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-4中任一项所述的多肽。
7.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求6所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。
8.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求6所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
9.一种产生如权利要求1-4中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：
(a)培养一种黄褐毁丝霉细胞，该细胞在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；并且
(b)回收该多肽。
10.一种产生具有过氧合酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求8所述的宿主细胞；并且
(b)回收该多肽。
11.一种产生具有过氧合酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下，培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞经编码如权利要求1-4中任一项所述的多肽的多核苷酸转化；并且
(b)回收该多肽。
12.一种产生黄褐毁丝霉亲本细胞的突变体的方法，该方法包括使编码如权利要求1-4中任一项所述的多肽的多核苷酸失活，这导致该突变体比该亲本细胞产生的该多肽更少。
13.通过权利要求12的方法产生的一种突变体细胞。
14.如权利要求13所述的突变体细胞，该细胞进一步包括一种编码天然或异源蛋白的基因。
15.一种产生蛋白质的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该蛋白质的条件下培养如权利要求13或14所述的突变体细胞；并且
(b)回收该蛋白质。
16.一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包括一种表面活性剂和一种根据权利要求1-4中任一项所述的多肽。
17.一种用于取代的或未取代的、直链的或支链的具有至少3个碳并且具有附接至位置2或3的碳的氢的脂肪烃的任一端的位置2或3的羟基化的方法，该方法包括使该脂肪烃与过氧化氢和根据权利要求1-4中任一项所述的多肽接触。
18.一种用于脂质的酰基基团的末端的位置2或3的羟基化的方法，该方法包括使该脂质与过氧化氢和根据权利要求1-4中任一项所述的多肽接触。
19.一种用于在取代的或未取代的、直链的或支链的脂肪烃的至少两个端的第二个或第三个碳处引入羟基或酮基的方法，该脂肪烃具有至少五个碳并且具有至少一个附接至所述第二个或第三个碳的氢，该方法包括使该脂肪烃与过氧化氢和根据权利要求1-4中任一项所述的多肽接触。
20.如权利要求17或19所述的方法，其中该脂肪烃是一种烷烃。
21.如权利要求20所述的方法，其中该烷烃是戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其异构体。
22.如权利要求17或19所述的方法，其中该脂肪烃未被取代。
23.如权利要求17或19所述的方法，其中该脂肪烃是直链的。
24.如权利要求17或19所述的方法，其中通过引入两个羟基将该脂肪烃转化为一种二醇。
25.如权利要求17或19所述的方法，其中该脂肪烃是一种脂肪酸。
26.一种用于产生聚氨酯的酶促法，该方法包括根据权利要求24所述的方法，将脂肪烃转化为二醇，并且使用该二醇产生聚氨酯。
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