CN107205409A - 包含酪蛋白的组合物及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了包括酪蛋白的方法和组合物，以及制备这些组合物的方法。

Description

包含酪蛋白的组合物及其生产方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年8月21日提交的美国临时专利申请号62/040,393的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及乳制品替代物、其制造方法和包含不含动物成分的乳脂和用于食品应用的蛋白质诸如乳、黄油、奶酪、酸奶和奶油的组合物。
发明背景
全球乳制品市场估计为5000亿美元，平均年增长率为4％。牛乳占市场的很大一部分，而基于植物的替代物在美国占10亿美元，并且对于乳糖不耐性乳估计约7亿美元。已知牛乳具有四种特定酪蛋白，α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。哺乳动物或哺乳类动物产生的乳是非常复杂的流体，其包括数千种组分(例如，如果鉴定所有三酸甘油酯)。哺乳动物或哺乳类动物产生的乳包括水、各种不同的脂质、糖、各种不同的蛋白质和各种不同的无机盐和化合物(参见例如，Boland and Thompson (Eds), Milk Proteins fromExpression to Food, Academic Press, 2014)。尽管哺乳动物产生的乳(诸如牛乳)被许多人认为是理想的营养来源，但由于与哺乳动物或哺乳类动物产生的乳的过敏原性、某些组分的乳糖不耐受性、个人偏好以及感知的乳制品行业减小的环境效益相关的原因，已寻求哺乳动物或哺乳类动物产生的乳(诸如牛乳)的各种乳替代物，诸如基于植物或坚果的乳，例如大豆、杏仁或椰子奶。
例如，由乳制品排放造成的环境影响可导致显著水平的硝酸盐，其有可能污染地下水。地下水形成其中地表水供应受限的许多城镇和农场的主要水供来源。在美国，一半人口完全或部分地依赖地下水，而欧洲也有类似的数据(参见例如在www.depi.vic.gov.au/agriculture-and-food/dairy/managing-effluent/dairy-effluent-protecting-groundwater的维多利亚州环境与初级产业政府部门网站)。乳中食物传播的病原体的存在是由于与乳制品农场环境中受污染源的直接接触以及受感染动物的乳房排泄物。人类疾病的爆发已经追溯到未经巴氏杀菌的乳的消耗，并且也已经追溯到巴氏杀菌的乳。乳和奶制品中通常遇到的主要污染物包括杀虫剂残留物、重金属和黄曲霉毒素M1(Awasthi等人,Indian J. Public Health 56:95-99, 2012)。
现有的乳制品替代物，诸如大豆、杏仁或椰子奶在风味和功能方面都不符合标准；此外，乳制品乳的大部分工业和文化意义源自其在衍生产品诸如奶酪、酸奶、奶油或黄油中的有用性。基于非乳制品植物的乳，尽管解决了环境和健康问题(并且尽管为小部分人口提供足够的风味)，但当经受用于乳制品乳的相同过程时，几乎普遍无法形成这样的衍生产品。
因此，需要的是具有期望的风味和性能特征的乳制品替代物或组合物，例如，复制乳制品风味、使食物传播的病原体最少化并且在生产中具有较低的环境影响、同时保留用于乳制品乳的衍生物或下游应用且同时提供与哺乳动物或哺乳类动物产生的乳类似的营养特征的组合物。
发明概述
本发明基于以下发现：哺乳动物产生的乳中组分的仅一个子集可用于生成具有哺乳动物产生的乳的类似风味、类似外观、类似营养价值、类似香气和类似口感的组合物。
本文提供了组合物，其包括：约0.3g/L至约1.1g/L κ-酪蛋白蛋白质；约1.25g/L至约4.9g/L β-酪蛋白蛋白质；最终总浓度为约0重量％至约45重量％的一种或多种脂质；最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％的一种或多种风味化合物；最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％的一种或多种甜味剂；和最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％的灰分，其中所述组合物不包括动物来源组分。
还提供了组合物，其包括：约0.3g/L至约1.1g/L κ-酪蛋白蛋白质；约1.25g/L至约4.9g/L β-酪蛋白蛋白质；最终总浓度为约0重量％至约45重量％的一种或多种脂质；最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％的一种或多种风味化合物；最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％的一种或多种甜味剂；和最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％的灰分，其中所述组合物：不包括在哺乳动物产生的乳中发现的至少一种组分；包括哺乳动物产生的乳中不存在的至少一种组分；和/或包括与哺乳动物产生的乳中的至少一种组分的浓度相比更高或更低浓度的至少一种组分。在这些组合物的一些实施方案中，所述组合物包括与哺乳动物产生的乳中的一种或多种组分的浓度相比更高浓度的至少一种组分，所述组分选自：钙、磷酸盐、B复合维生素、维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。在这些组合物的一些实施方案中，所述组合物不包括在哺乳动物产生的乳中发现的至少一种组分，所述组分选自：乳糖、细菌、分枝杆菌、过敏原、病毒、朊病毒、酵母、生长激素、白细胞、抗生素、重金属、免疫球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶和脂肪酶。在这些组合物的一些实施方案中，其中所述组合物包括哺乳动物产生的乳中不存在的至少一种组分，所述组分选自人造甜味剂、植物来源的脂质、非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质。
还提供了组合物，其包括：约0.3g/L至约1.1g/L非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质；约1.25g/L至约4.9g/L非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质；最终总浓度为约0重量％至约45重量％的一种或多种脂质；最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％的一种或多种风味化合物；最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％的一种或多种甜味剂；和最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％的灰分。
还提供了包括包含κ-酪蛋白蛋白质和β-酪蛋白蛋白质的胶束的组合物，其中所述胶束具有约50nm至约350nm的直径，且所述κ-酪蛋白蛋白质和β-酪蛋白蛋白质是非糖基化的或具有非哺乳动物糖基化模式。在这些方法的一些实施方案中，所述组合物包括最终浓度为约2.0重量％至约6重量％的胶束。在这些组合物的一些实施方案中，所述胶束中β-酪蛋白蛋白质与κ-酪蛋白蛋白质的比率为约3.5:1至约5.5:1(例如约4:1至约5:1)。在这些方法的一些实施方案中，所述组合物还包括：最终总浓度为约0重量％至约45重量％的一种或多种脂质；最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％的一种或多种风味化合物；最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％的一种或多种甜味剂；和最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％的灰分。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述组合物包含约0.27重量％至约0.75重量％的κ-酪蛋白蛋白质和约1.23重量％至约3.27重量％的β-酪蛋白蛋白质。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，一种或多种脂质的最终总浓度为约0重量％至约4.5重量％。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述一种或多种脂质选自：向日葵油、椰子油、三丁酸甘油酯、单酸甘油酯和双酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述组合物包括下列中的一种或多种：最终浓度为约1重量％至约28重量％的向日葵油；最终浓度为约0.5重量％至约14重量％的椰子油；最终浓度为约0.05重量％至约1.0重量％的三丁酸甘油酯；最终总浓度为约0.08重量％至约1.2重量％的单酸甘油酯和双酸甘油酯；最终总浓度为约0.02重量％至约0.28重量％的游离脂肪酸；和最终总浓度为约0.02重量％至约0.3重量％的磷脂。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述游离脂肪酸包含至少一种选自以下的脂肪酸：丁酸、己酸、辛酸和癸酸。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述磷脂是大豆卵磷脂磷脂、向日葵卵磷脂磷脂、棉花卵磷脂磷脂或油菜籽卵磷脂磷脂。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述单酸甘油酯和双酸甘油酯是植物来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯，或者是细菌来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述风味化合物包括至少一种选自以下的风味化合物：δ-癸内酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯和δ-十一内酯。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述一种或多种甜味剂是糖。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述糖选自：葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、莫纳甜和塔格糖。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述一种或多种甜味剂是人造甜味剂。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述人造甜味剂选自：甜叶菊、阿司帕坦、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜苷、布拉齐因、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽糖醇、乳糖醇（lacititol）、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、神秘果蛋白、莫纳甜、莫奈林（monelin）、奥斯来丁（osladin）、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、advantame、阿力甜、阿司帕坦-乙酰氨基磺酸盐、环己烷氨基磺酸钠、甘素、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜和P-4000。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述灰分包括下列中的一种或多种：钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐和氯化物。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述灰分包含CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠中的一种或多种(例如，一种、两种或三种)。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，CaCl2具有约0.05g/L至约0.2g/L的最终浓度；KH2PO4具有约0.2g/L至约0.4g/L的最终浓度；且柠檬酸钠具有约0.1g/L至约0.3g/L的最终浓度。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述κ-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象κ-酪蛋白蛋白质。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述β-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountaingoat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-酪蛋白蛋白质。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述组合物还包括：最终浓度为约0.4g/L重量％至约2.5重量％的α-乳白蛋白蛋白质；和/或最终浓度为约2.5重量％至约4.5重量％的β-乳球蛋白蛋白质。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述α-乳白蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-乳白蛋白蛋白质。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述β-乳球蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-乳球蛋白蛋白质。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述组合物还包括：最终浓度为约11重量％至约16重量％的α-S1-酪蛋白蛋白质；和/或最终浓度为约2重量％至约5重量％的α-S2-酪蛋白蛋白质。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述α-S1-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-S1-酪蛋白蛋白质；和/或所述α-S2-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-S2-酪蛋白蛋白质。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述组合物还包括下列中的一种或多种：血清白蛋白、乳铁蛋白和转铁蛋白。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述血清白蛋白是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象血清白蛋白；所述乳铁蛋白是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象乳铁蛋白；和/或所述转铁蛋白是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountaingoat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象转铁蛋白。
本文所述的任何组合物的一些实施方案还包括一种或多种颜色平衡剂。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述一种或多种颜色平衡剂是β-胡萝卜素或胭脂树橙。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述组合物具有约6.2至约7.2(例如约6.2至约6.8)的pH。
还提供了组合物，其包括：哺乳动物产生的乳或加工的哺乳动物产生的乳；和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质中的一种或两种。在这些方法的一些实施方案中，所述组合物中非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质的最终浓度为0.02重量％至约3.0重量％。在这些方法的一些实施方案中，所述组合物中非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质的最终浓度为0.02重量％至约3.0重量％。在这些方法的一些实施方案中，所述组合物中非糖基化和/或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质的最终浓度为约0.02重量％至约0.6重量％；且所述组合物中非糖基化和/或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白的最终浓度为约0.02重量％至约2.5重量％。
还提供了粉末组合物，其包括：最终浓度为约3.6重量％至约5.4重量％的κ-酪蛋白蛋白质；最终浓度为约16.3重量％至约24.5重量％的β-酪蛋白蛋白质；最终浓度为约35重量％至约40重量％的甜味剂；最终浓度为约25重量％至约30重量％的一种或多种脂质；最终浓度为约5重量％至约7重量％的灰分；和最终浓度为约2重量％至约5重量％的水，其中所述κ-酪蛋白蛋白质是非糖基化的和/或具有非哺乳动物糖基化模式，和/或所述β-酪蛋白蛋白质是非糖基化的和/或具有非哺乳动物糖基化模式。
还提供了核酸，其包括：启动子；编码信号序列的序列；编码乳蛋白质的序列；和酵母终止序列，其中启动子可操作地连接至信号序列，所述信号序列可操作地连接至编码乳蛋白质的序列，且所述终止序列可操作地连接至编码乳蛋白质的序列。在这些核酸的一些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在这些核酸的一些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。在这些核酸的一些实施方案中，所述信号序列是来自编码的乳蛋白质或不同乳蛋白质的信号序列，或者是来自酵母交配因子的信号序列。在这些核酸的一些实施方案中，所述编码的乳蛋白质选自：β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白或转铁蛋白。在这些核酸的一些实施方案中，所述核酸包含细菌复制起点。在这些核酸的一些实施方案中，所述核酸还包括选择标记物。在这些核酸的一些实施方案中，所述选择标记物是抗生素抗性基因。
这些核酸的一些实施方案还包括：另外的启动子序列；编码信号序列的另外的序列；编码另外的乳蛋白质的序列；和另外的酵母终止序列，其中另外的启动子序列可操作地连接至编码信号序列的另外的序列，编码信号序列的序列可操作地连接至编码另外的乳蛋白质的序列，且编码另外的乳蛋白质的序列可操作地连接至另外的酵母终止序列。
还提供了包括本文所述的任何核酸的宿主细胞。在这些宿主细胞的一些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株(例如，克鲁维酵母属种、毕赤酵母属种、酵母属种、四膜虫属种、耶氏酵母属种、汉逊酵母属种、布氏菌属种(Blastobotrys sp.)、念珠菌属种、接合酵母属种或德巴利氏酵母属种)。
本文还提供了生产非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的重组乳蛋白质的方法，所述方法包括：在足以允许分泌非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的乳蛋白质的条件下在培养基中培养本文所述的任何宿主细胞；和从培养基中收获非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的乳蛋白质。
还提供了生产包括非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白的胶束的方法，其包括：在足以允许从宿主细胞释放胶束的条件下在培养基中培养本文提供的任何宿主细胞，其中所述宿主细胞包括核酸，所述核酸包括编码β-酪蛋白的序列和编码κ-酪蛋白的序列。
还提供了补充哺乳动物产生的乳的方法，其包括：提供哺乳动物产生的乳或加工的哺乳动物产生的乳；和将以下中的至少一种混合至所述乳中：非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质；非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质；以及包括非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质的胶束。
还提供了生产组合物的方法，其包括：超声处理包括包含β-酪蛋白蛋白质和κ-酪蛋白蛋白质或包含含有β-酪蛋白蛋白质和κ-酪蛋白蛋白质的胶束的蛋白质混合物的液体；将灰分混入液体中；向所述液体中加入一种或多种脂质、一种或多种风味化合物和一种或多种颜色平衡剂的混合物，且超声处理所述液体；和向所述液体中加入一种或多种甜味剂，从而生产组合物。在这些方法的一些实施方案中，所述β-酪蛋白蛋白质是非糖基化的或具有非哺乳动物糖基化模式，和/或κ-酪蛋白蛋白质是非糖基化的或具有非哺乳动物糖基化模式。在这些方法的一些实施方案中，所述灰分包括下列中的一种或多种：钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐和氯化物。在这些方法的一些实施方案中，添加的灰分包括CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠中的一种或多种(例如，一种、两种或三种)。在这些方法的一些实施方案中，所述一种或多种脂质包含以下中的至少一种：向日葵油、椰子油、三丁酸甘油酯、单酸甘油酯和双酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂。在这些方法的一些实施方案中，所述游离脂肪酸包含至少一种选自以下的脂肪酸：丁酸、己酸、辛酸和癸酸。在这些方法的一些实施方案中，所述磷脂是大豆卵磷脂磷脂、向日葵卵磷脂磷脂、棉花卵磷脂磷脂或油菜籽卵磷脂磷脂。在这些方法的一些实施方案中，所述单酸甘油酯和双酸甘油酯是植物来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯，或者是细菌来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯。在这些方法的一些实施方案中，所述风味化合物包括至少一种选自以下的风味化合物：δ-癸内酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯和δ-十一内酯。在这些方法的一些实施方案中，所述一种或多种颜色平衡剂是β-胡萝卜素或胭脂树橙。在这些方法的一些实施方案中，所述一种或多种甜味剂是糖。在这些方法的一些实施方案中，所述糖选自：葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、莫纳甜和塔格糖。在这些方法的一些实施方案中，所述一种或多种甜味剂是人造甜味剂。在这些方法的一些实施方案中，所述人造甜味剂选自：甜叶菊、阿司帕坦、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜苷、布拉齐因、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、神秘果蛋白、莫纳甜、莫奈林、奥斯来丁、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、advantame、阿力甜、阿司帕坦-乙酰氨基磺酸盐、环己烷氨基磺酸钠、甘素、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜和P-4000。在这些方法的一些实施方案中，所述液体的pH为约6.2至约7.4(例如约6.4至约6.8)。在这些方法的一些实施方案中，所述β-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-酪蛋白；和/或所述κ-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象κ-酪蛋白蛋白质。在这些方法的一些实施方案中，所述蛋白质混合物还包括一种或多种选自以下的蛋白质：α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白、乳铁蛋白、转铁蛋白和血清白蛋白。
还提供了通过本文所述的任何方法产生的组合物。
还提供了制备黄油、奶酪、酪蛋白酸盐或酸奶的方法，其包括：提供本文所述的任何组合物；和使用本文所述的任何组合物作为起始材料生产黄油、奶酪、酪蛋白酸盐或酸奶。
还提供了试剂盒，其包括：(a)一种或多种乳蛋白质、一种或多种脂肪和一种或风味化合物的混合物；和(b)灰分和至少一种甜味剂的混合物。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述一种或多种乳蛋白质选自：β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白、乳铁蛋白、转铁蛋白和血清白蛋白。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述一种或多种乳蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象乳蛋白质。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述一种或多种脂肪选自：向日葵油、椰子油、三丁酸甘油酯、单酸甘油酯和双酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述游离脂肪酸包括至少一种选自以下的脂肪酸：丁酸、己酸、辛酸和癸酸。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述磷脂是大豆卵磷脂磷脂、向日葵卵磷脂磷脂、棉花卵磷脂磷脂或油菜籽卵磷脂磷脂。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述单酸甘油酯和双酸甘油酯是植物来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯，或者是细菌来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述风味化合物包含至少一种选自以下的风味化合物：δ-癸内酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯和δ-十一内酯。在这些试剂盒的一些实施方案中，(a)中的混合物还包括一种或多种颜色平衡剂。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述一种或多种颜色平衡剂是β-胡萝卜素或胭脂树橙。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述一种或多种甜味剂是糖(例如，选自以下的糖：葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、莫纳甜和塔格糖)。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述一种或多种甜味剂是人造甜味剂(例如，选自以下的人造甜味剂：甜叶菊、阿司帕坦、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜苷、布拉齐因、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、神秘果蛋白、莫纳甜、莫奈林、奥斯来丁、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、advantame、阿力甜、阿司帕坦-乙酰氨基磺酸盐、环己烷氨基磺酸钠、甘素、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜和P-4000)。在任何这些试剂盒的一些实施方案中，所述灰分包括下列中的一种或多种：钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐和氯化物。在这些试剂盒的一些实施方案中，所述灰分包括CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠中的一种或多种(例如，一种、两种或三种)。这些试剂盒的一些实施方案还包括制备本文所述的任何组合物的说明书。
还提供了包括至少一种本文所述的核酸的试剂盒。
本文还提供了乳制品替代食品，其包括一种或多种分离的乳蛋白质组分、脂肪、碳水化合物和灰分。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述食品是非动物来源的。在这些替代食品的一些实施方案中，所述食品包括乳、黄油、奶酪、酪蛋白酸盐、酸奶和奶油。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述分离的乳蛋白质组分包括酪蛋白和乳清蛋白质。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述酪蛋白蛋白质还包括α-s1、α-s2、β和κ-酪蛋白。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述酪蛋白蛋白质还包括α-s1、β和κ-酪蛋白蛋白质。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述酪蛋白蛋白质还包括用于胶束形成的组分。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述酪蛋白蛋白质在pH4.0-6.0下表现出乳凝性质。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述酪蛋白蛋白质为至少或等于2.5% (w/v)且小于或等于10% (w/v)。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述乳清蛋白质还包括β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述乳清蛋白质形成聚合物基质凝胶。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述乳清蛋白质为至少0.1 % (w/v)且小于或等于1% (w/v)。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述一种或多种乳蛋白质组分与微生物分离。在任何这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述一种或多种乳蛋白质组分与重组微生物分离。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述一种或多种乳蛋白质组分在真核微生物中合成。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述真核微生物包括酵母。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述酵母包括克鲁维酵母菌属种、毕赤酵母属种、酵母属种和四膜虫属种(Tetrahymena sp.)。
在这些替代食品的一些实施方案中，所述脂肪包括三酸甘油酯。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述脂肪包含高油酸油。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述高油酸油还包括单不饱和物、油酸、亚油酸、亚麻酸和饱和物中的一种或多种。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述脂肪包含短链脂肪酸。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述短链脂肪酸包括丁酸、己酸、辛酸和癸酸。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述一种或多种脂肪包含反式酯化脂肪酸。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述一种或多种脂肪分离自植物。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述植物选自下列中的一种或多种：向日葵、玉米、橄榄、大豆、花生、胡桃、杏仁、芝麻、棉籽、卡诺拉、红花、亚麻籽、棕榈、棕榈仁、棕榈果、椰子、巴巴苏、乳木果油、芒果脂、可可脂、小麦胚芽和米糠油。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述糖包含半乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述乳制品替代食品基本上不含乳糖。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述灰分包括矿物质。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述矿物质还包括下列中的一种或多种：钠、钾、钙、镁、磷、铁、铜、锌、氯化物、锰、硒、碘、视黄醇、胡萝卜素、维生素、维生素D、维生素E、维生素B12、硫胺素和核黄素。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述灰分包括阴离子。在这些乳制品替代食品的一些实施方案中，所述矿物质还包括下列中的一种或多种：磷酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐、碳酸盐和氯化物。
还提供了制备乳制品替代食品的方法，其包括使一种或多种分离的乳蛋白质组分、互酯化脂肪、碳水化合物和灰分接触的步骤。这些方法的一些实施方案还包括从低级真核生物分离一种或多种乳蛋白质组分的步骤。
还提供了改变乳制品替代产品的风味特征的方法，其包括调节包括乳蛋白质组分、碳水化合物和灰分的混合物中的脂肪酸的组合。在这些方法的一些实施方案中，所述调节步骤包括包含三种油酸的三酸甘油酯和包含丁酸、一种己酸和一种辛酸的短链三酸甘油酯。在这些方法的一些实施方案中，所述调节步骤包括增加或减少包含丁酸、己酸、辛酸和癸酸的脂肪酸。在这些方法的一些实施方案中，乳制品替代产品的风味特征模拟一种或多种乳制品的风味特征。在这些方法的一些实施方案中，一种或多种乳制品的风味特征包括牛乳、山羊乳、豆乳、杏仁乳和椰子乳。在这些方法的一些实施方案中，所述风味特征包括选自以下的一种或多种感官印象：黄油味的、坚果味的、甜味的、酸味的、水果味的、花香味的、苦味的、木质味的、土味的、豆腥味的、辣味的、金属味的、甜味的、霉味的、油味的和醋味的。
本文公开了生产乳制品替代产品的方法和组合物。在一些实施方案中，提供了用于乳制品替代食品的方法和组合物，所述乳制品替代食品包含一种或多种分离的乳蛋白质组分、脂肪、碳水化合物和灰分。在某些实施方案中，提供用于包含酪蛋白蛋白质和乳清蛋白质的乳制品替代组合物的方法和组合物，其中所述组合物基本上不含动物产品，且其中所述酪蛋白蛋白质与乳清蛋白质的比率优选为优选的(w/v)比率。在某些其他实施方案中，提供了调节乳制品替代食品的风味特征的方法，其包括调节包含乳蛋白质组分、脂肪、碳水化合物和灰分的混合物中的脂肪酸含量。优选的调节步骤包括增加或减少包含丁酸、己酸、辛酸和癸酸的一种或多种脂肪酸。在另外实施方案中，本发明的方法和组合物提供所需(w/v)比率的乳蛋白质组分和脂肪。
在各个方面，本发明的方法和组合物提供仍然保持其功能特征和感官性质的乳制品替代物。在一些实施方案中，核心功能可以是但不限于实现类似于常规乳制品的营养特征，并且复制其核心功能中的一种或多种(如果不是全部)。
在其他实施方案中，所述核心功能可以是但不限于复制与传统的基于乳制品的产品相同或类似的感官特征，其包括但不限于味道、外观、处理和口感、所需密度、结构、质地、弹力、弹性、凝结、结合、发酵、通气、发泡、乳脂性和乳化。
优选的方法和组合物提供乳制品替代产品，诸如乳、黄油、奶酪、酸奶和奶油。本文提供了包含(3.3％)一种或多种分离的乳蛋白质组分、(4.0％)脂肪、(2.4％)碳水化合物和(0.7％)灰分(w/v)的非乳制品乳替代物的制剂。通过调节三酸甘油酯水平和三酸甘油酯的脂肪酸组成来改变脂肪含量，增强了非乳制品乳替代物的风味特征。
所述方法和乳制品替代物组合物的优点包括减少或去除天然乳制品中通常发现的抗生素残留物、重金属、细菌和掺杂物以及减少环境影响。
因此，本发明的某些方面提供了不含动物成分的乳制品替代物，其具有所需风味特征，例如复制乳制品风味、使食物传播的病原体最少化，且具有较低的环境影响，同时保持乳制品乳的下游应用。
除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数术语，并且复数术语应当包括单数术语。通常，与本文所述的乳制品加工、生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学和杂交关联使用的命名，和其技术，是本领域公知并且通常使用的那些。
本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法和实例仅仅是说明性的，且并不意欲是限制性的。
本文中提及的所有出版物、专利、专利申请、序列、数据库条目和其他参考文献都通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、序列、数据库条目和其他参考文献被具体且单独地指明通过引用并入。在冲突的情况下，将以本说明书，包括定义，为准。
本发明的其他特征和优点从以下详述和附图以及权利要求书将是显而易见的。
本文使用的术语和描述仅用于描述特定实施方案的目的，且不旨在限制本发明。如本文所使用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”同样包括复数对象，除非上下文另有明确指出。术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体旨在以类似于术语“包含”的方式包括。
“分离的”RNA、DNA或混合聚合物是与天然伴随其天然宿主细胞中的天然多核苷酸的其他细胞成分(例如核糖体、聚合酶和与其天然相关的基因组序列)基本上分离的RNA、DNA或混合聚合物。
如本文中所用，“分离的”有机分子(例如，脂肪酸或SCFA)是与其起源的宿主细胞的细胞成分(膜脂质、染色体、蛋白质)基本上分离的有机分子。如本文中所用，关于蛋白质的术语“分离的”表示蛋白质的制剂为至少60％纯，例如大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％ 或99％纯。该术语不要求生物分子已经与所有其他化学品分离，尽管某些分离的生物分子可以纯化至接近均匀性。
术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指至少10个碱基长度的核苷酸的聚合形式。该术语包括DNA分子(例如cDNA或基因组或合成DNA)和RNA分子(例如mRNA或合成RNA)，以及含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键或两者的DNA或RNA的类似物。核酸可以是任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链或双链或环状的。
术语“SCFA”是短链脂肪酸的缩写，术语“HOSO”是高油酸向日葵油的缩写，“SCTG”是短链三酸甘油酯的缩写。
术语“乳蛋白质组分”是指在乳中发现的蛋白质或蛋白质等同物和变体，诸如酪蛋白、乳清或酪蛋白和乳清的组合，包括它们的亚基，其衍生自各种来源并且如本文进一步定义。
术语“乳蛋白质”是指哺乳动物产生的乳中发现的蛋白质或具有与哺乳动物产生的乳中发现的蛋白质的序列至少80％同一(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一)的序列的蛋白质。乳蛋白质的非限制性实例包括：β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、转铁蛋白和血清白蛋白。另外的乳蛋白质是本领域已知的。
术语“酪蛋白蛋白质”是本领域已知的，并且表示存在于哺乳动物产生的乳中并且能够与家族中的其他蛋白质自组装以形成胶束和/或在酸性pH下从水溶液中沉淀出来的蛋白质家族。酪蛋白蛋白质的非限制性实例包括：β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白和α-S2-酪蛋白。本文提供了来自不同哺乳动物的酪蛋白蛋白质的序列的非限制性实例。其他哺乳动物酪蛋白的另外的序列是本领域已知的。
术语“哺乳动物产生的乳”是本领域已知的，并且是指由哺乳动物产生的乳。
术语“加工的哺乳动物产生的乳”是指使用乳制品工业中已知的一个或多个步骤(例如均质化、巴氏杀菌、照射或补充)加工的哺乳动物产生的乳。
术语“哺乳动物来源的组分”是指从哺乳动物的体内获得的分子或化合物(例如，蛋白质、脂质或核酸)或从由哺乳动物产生的流体或固体获得的分子。
术语“乳的组分”或“乳组分”是哺乳动物产生的乳中存在的分子、化合物、元素或离子。
术语“非哺乳动物糖基化模式”是指与参考蛋白质(例如，哺乳动物细胞、例如CHO细胞、MEK细胞或哺乳动物乳房细胞中产生和翻译后修饰的的相同蛋白质))相比，非哺乳动物细胞(例如，酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞)中产生和翻译后修饰的蛋白质中糖基化的一个或多个位置的差异和/或所述蛋白质中一个或多个位置的糖基化的量和/或类型的差异之一。
术语“脂质”是指包括脂肪酰基(例如，饱和或不饱和酰基链)的一种或多种分子(例如，生物分子)。例如，术语脂质包括油、磷脂、游离脂肪酸、磷脂、单酸甘油酯、双酸甘油酯和三酸甘油酯。脂质的非限制性实例在本文中描述。脂质的另外实例是本领域已知的。
术语“植物来源的脂质”是指由植物(例如单子叶植物或双子叶植物)获得和/或产生的脂质。
术语“甜味剂”是指当加入组合物时使得组合物当被哺乳动物(诸如人)摄入时尝起来甜的糖(例如，单糖、二糖或多糖)或人造甜味剂(例如，小分子人造甜味剂或蛋白质人造甜味剂)。甜味剂的非限制性实例在本文中描述。甜味剂的另外实例是本领域已知的。
术语“灰分”是本领域已知的术语，并且表示可以在哺乳动物产生的乳中发现的一种或多种离子、元素、矿物质和/或化合物。在哺乳动物产生的乳中发现的非限制性离子、元素、矿物质和化合物在本文中描述。在哺乳动物产生的乳中发现的另外的离子、元素、矿物质和化合物也是本领域已知的。
术语“颜色平衡剂”或“着色剂”是指加入组合物中以调节组合物的颜色、例如使组合物的颜色看起来更类似于哺乳动物产生的乳的试剂。颜色平衡剂或着色剂的非限制性实例包括β-胡萝卜素和胭脂树橙。颜色平衡剂的其他实例是本领域已知的。颜色平衡剂或着色剂可以由植物产生或获得。
术语“胶束”是指作为组合物中的分散体存在的通常(或大致)球形超分子结构。胶束可以具有例如由带电外层构成的表面。胶束可以包封一种或多种生物分子。例如，胶束可以包封两种或更多种蛋白质(例如，β-酪蛋白蛋白质和κ-酪蛋白蛋白质)。胶束可以具有约10nm至约350nm的直径。胶束的另外方面和特征是本领域已知的。
短语“哺乳动物产生的乳中的组分的浓度”是指由哺乳动物产生的乳中的组分的浓度或由相同物种的哺乳动物群体产生的乳中的组分的平均浓度。
如本文中所用的术语“衰减”通常是指对基因序列或控制基因序列转录的序列进行的功能缺失，包括突变，部分或完全缺失，插入或其他变型，其减少或抑制基因产物的产生，或使基因产物无功能。在一些情况下，功能缺失被描述为敲除突变。衰减还包括通过改变核酸序列、将基因置于较低活性启动子的控制下、下调、表达靶向感兴趣的基因的干扰RNA、核酶或反义序列或通过本领域已知的任何其他技术的氨基酸序列变化。在一个实例中，特定酶对反馈抑制或由不是产物或反应物的组合物引起的抑制(非途径特异性反馈)的敏感性被减弱，使得酶活性不受化合物的存在的影响。在其他情况下，已经被改变为活性较低的酶可以被称为减毒的。
缺失：从核酸分子中去除一个或多个核苷酸或从蛋白质中去除一个或多个氨基酸，任一侧的区域连接在一起。
敲除：其表达或活性水平已降低至零的基因。在一些实例中，经由其编码序列的一些或全部的缺失敲除基因。在其他实例中，经由将一个或多个核苷酸引入其开放阅读框中来敲除基因，这导致无义或另外非功能性蛋白质产物的翻译。
术语“合成乳替代物”是指与乳制品乳相似、类似、等于或几乎相同的组合物。
术语“风味”是指食物或饮料的味道和/或香气。
术语“重组”是本领域已知的术语。当提及核酸(例如基因)时，术语“重组”可用于例如描述已经从其天然存在环境中移取的核酸，与当其在自然界中发现时与所述核酸相邻或接近的核酸的全部或部分不缔合的核酸，可操作地连接至其在自然界中不连接的核酸的核酸或在自然界中不存在的核酸。术语“重组”可用于例如描述克隆的DNA分离物，或包括化学合成的核苷酸类似物的核酸。当使用“重组”来描述蛋白质时，其可以是指例如与自然界中产生蛋白质的细胞的种类或类型相比不同种类或类型的细胞中产生的蛋白质。
如本文中所用，如果将异源序列放置邻近于内源核酸序列、使得该内源核酸序列的表达被改变，则生物体基因组中的内源核酸序列(或该序列的编码的蛋白质产物)在本文中被认为是“重组的”。在这种背景下，异源序列是不是天然邻近于内源核酸序列的序列，无论异源序列本身是内源的(源自相同的宿主细胞或其后代)还是外源的(源自不同的宿主细胞或其后代)。举例来说，启动子序列可以取代(例如，通过同源重组)宿主细胞基因组中基因的天然启动子，使得该基因具有改变的表达模式。该基因现在将变得“重组”，因为它与天然侧接其的至少一些序列分离。
如果核酸含有对基因组中的相应核酸不天然存在的任何修饰，则其也被认为是“重组的”。例如，如果内源编码序列含有人工(例如通过人为干预)引入的插入、缺失或点突变，则其被认为是“重组的”。“重组核酸”还包括在异源部位整合到宿主细胞染色体中的核酸和作为附加体存在的核酸构建体。
在核酸序列的背景下，术语“百分比序列同一性”或“同一”是指当针对最大对应比对时，两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以在至少约九个核苷酸、通常至少约20个核苷酸、更通常至少约24个核苷酸、通常至少约28个核苷酸、更通常至少约32个核苷酸且优选地至少约36或更多个核苷酸的区段。存在本领域已知的许多可用于测量核苷酸序列同一性的不同算法。例如，可以使用FASTA、Gap或Bestfit来比较多核苷酸序列，所述FASTA、Gap或Bestfit是Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group(GCG), Madison, Wis中的程序。FASTA提供在查询和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。参见例如，Pearson, Methods Enzymol.183:63-98, 1990(其全文通过引用并入本文)。例如，核酸序列之间的百分比序列同一性可以使用具有其默认参数(字长为6，评分矩阵的NOPAM因子)的FASTA或使用具有如GCG版本6.1(其通过引用并入本文)中提供的其默认参数的Gap来确定。或者，可以使用计算机程序BLAST (Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Gish和States, Nature Genet.3:266-272, 1993;Madden等人, Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul等人, Nucleic Acids Res.25:3389-3402, 1997; Zhang和Madden, Genome Res.7:649-656, 1997)，特别是blastp或tblastn (Altschul等人, Nucleic Acids Res.25:3389-3402, 1997)来比较序列。
当涉及核酸或其片段时，术语“基本上同源性”或“基本上相似性”表示当与另一核酸(或其互补链)具有适当核苷酸插入或缺失的情况下最佳比对时，在核苷酸碱基的至少约76％、80％、85％、优选至少约90％、更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％中存在核苷酸序列同一性，如通过任何公知的序列同一性算法，诸如如上所讨论的FASTA、BLAST或Gap所测量。
可选地，当在严格杂交条件下核酸或其片段与另一核酸、另一核酸的链或其互补链杂交时，存在基本上同源性或相似性。在核酸杂交实验的背景下，“严格杂交条件”和“严格洗涤条件”取决于许多不同的物理参数。核酸杂交将受条件诸如盐浓度、温度、溶剂、杂交物质的碱基组成、互补区的长度以及杂交核酸之间核苷酸碱基错配的数目的影响，如本领域技术人员所容易理解。本领域普通技术人员知道如何改变这些参数以实现杂交的特别严格性。
一般而言，在特定的一组条件下，在特定DNA杂合体的热熔点(Tm)下约25℃进行“严格杂交”。在特定的一组条件下，在特定DNA杂合体的Tm下约5℃的温度进行“严格洗涤”。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。参见Sambrook等人, MolecularCloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y., 第9.51页, 1989，其通过引用并入本文。为了本文的目的，对于溶液相杂交，“严格条件”被定义为在6xSSC(其中20xSSC含有3.0 M NaCl和0.3M柠檬酸钠)、1％ SDS中在65℃下水相杂交(即，不含甲酰胺)8-12小时，然后在0.2xSSC、0.1％ SDS中在65℃下两次洗涤20分钟。本领域技术人员将理解，65℃下的杂交将以不同的速率发生，这取决于许多因素，包括杂交的序列的长度和百分比同一性。
本发明的核酸(也称为多核苷酸)可以包括RNA、cDNA、基因组DNA和合成形式的有义链和反义链以及上述的混合聚合物。它们可以被化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然或衍生的核苷酸碱基，如本领域技术人员将容易理解。这样的修饰包括例如标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰诸如不带电荷的键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、突出部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和修饰的键(例如，α异头核酸等)。修饰的核苷酸的实例描述于Malyshev等人, Nature509:385-388, 2014;和Li等人, J. Am. Chem. Soc. 136:826-829, 2014。还包括在其经由氢键键合和其他化学相互作用结合指定序列的能力方面模拟多核苷酸的合成分子。这样的分子是本领域已知的，并且包括例如其中肽链取代分子主链中的磷酸酯键的那些。其他修饰可以包括例如其中核糖环含有桥连部分或其他结构诸如“锁定”核酸中发现的修饰的类似物。
当应用于核酸序列时，术语“突变的”意味着与参考核酸序列相比，核酸序列中的核苷酸可被插入、缺失或改变。可以在基因座进行单个改变(点突变)，或者可以在单个基因座插入、缺失或改变多个核苷酸。此外，可以在核酸序列内的任何数目的基因座进行一个或多个改变。核酸序列可以通过本领域已知的任何方法进行突变，所述方法包括但不限于诱变技术诸如“易错PCR”(在DNA聚合酶的复制保真度低的条件下进行PCR的方法，使得沿着PCR产物的整个长度获得高点突变率；参见例如Leung等人, Technique 1:11-15, 1989,以及Caldwell和Joyce, PCR Methods Applic.2:28-33, 1992)；和“寡核苷酸定向诱变”(能够在任何感兴趣的克隆的DNA片段中产生位点特异性突变的方法；参见例如Reidhaar-Olson和Sauer, Science 241:53-57, 1988)。
如本文中所用的术语“载体”意指能够运输已与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其通常是指可以连接入另外的DNA区段的环状双链DNA环，但也包括线性双链分子，诸如从通过聚合酶链式反应(PCR)的扩增或用限制酶处理环状质粒得到的那些。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中(下面更详细地讨论)。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体可以引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。此外，某些优选的载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
可用于表达本文所述的重组基因的启动子包括组成型和诱导型/抑制型启动子。诱导型/抑制型启动子的实例包括半乳糖诱导型启动子(例如，PLAC4-PBI)。当多个重组基因在工程改造的酵母中表达时，不同的基因可以通过不同的启动子或通过不同的操纵子中的不同的启动子控制，或者两个或更多个基因的表达可以通过作为操纵子的一部分的单个启动子来控制。
术语“可操作地连接的”表达控制序列是指其中表达控制序列与感兴趣的基因连续以控制感兴趣的基因以及与以反式或一定距离起作用的表达控制序列连续以控制感兴趣的基因的键。
术语“表达控制序列”或“调节序列”可互换使用，并且如本文中所用，是指对于影响其可操作地连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，诸如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定胞浆mRNA的序列；提高翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；并且当需要时，增强蛋白质分泌的序列。这种控制序列的性质根据宿主生物体而不同；在原核生物中，这种控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”旨在至少包括其存在对于表达必不可少的所有组分，并且还可以包括其存在有利的另外组分，例如前导序列和融合伴侣序列。
术语“转染(transfect)”、“转染(transfection)”、“转染(transfecting)”等是指将异源核酸引入真核生物细胞(高等和低等真核生物细胞)。历史上，术语“转化”已被用于描述将核酸引入酵母或真菌细胞中；然而，在本文中，术语“转染”用于指将核酸引入任何真核细胞，包括酵母和真菌细胞。
如本文中所用的术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”、“表达宿主系统”、“表达系统”或简称“宿主细胞”)意指重组载体已经引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅意指特定受试细胞，而且意指这种细胞的后代。因为某些修饰可以由于突变或环境的影响发生在后代中，这样的后代，实际上可能与亲本细胞不相同，但仍然被包括在如本文中所用的宿主细胞的范围内。重组宿主细胞可以是在培养物中生长的分离的细胞或细胞系，或者可以是驻留在活组织或生物体中的细胞。优选的宿主细胞是酵母和真菌。
术语“酵母和丝状真菌”包括但不限于任何克鲁维酵母属，诸如乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母，酵母属，诸如酿酒酵母，毕赤酵母属，诸如巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、考拉姆毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、微小毕赤酵母(Ogataea minuta、林德内氏毕赤酵母)、opuntiae毕赤酵母、耐热毕赤酵母、salictaria毕赤酵母、guercuum毕赤酵母、皮杰普氏毕赤酵母、stiptis毕赤酵母、甲醇毕赤酵母，多形汉逊酵母，白色念珠菌，任何曲霉属，诸如构巢曲霉菌、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、金孢子菌，镰刀菌属，禾谷镰孢菌、镰孢霉、小立碗藓和粗糙脉孢菌。
如本文中所用，术语“主要”或其变体将被理解为是指，例如，a)在脂肪的背景下，特定脂肪酸组合物相对于脂肪酸组合物的总量的量；b)在蛋白质的背景下，特定蛋白质组合物(例如，β-酪蛋白)相对于蛋白质组合物的总量(例如α-、β-和κ-酪蛋白)的量。
术语“约”、“近似”或“类似于”是指如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，其部分取决于如何测量或确定所述值，或测量系统的限制。应当理解，下面描述的所有范围和量都是近似值，并不意图限制本发明。当使用范围和数字的情况下，这些可以是近似的，以包括统计范围或测量误差或变化。在一些实施方案中，例如，测量可以是正或负10％。
短语“基本上不含”用于表示指示的组分(如果存在)以不对组合物的性质有贡献或仅以极小的方式贡献的量存在。在各种实施方案中，在组合物基本上不含特定组分的情况下，所述组分以小于功能量存在。在各种实施方案中，所述组分可以以痕量存在。特定限值将根据组分的性质而变化，但可以是例如选自小于10重量％、小于9重量％、小于8重量％、小于7重量％、少于6重量％、小于5重量％、小于4重量％、小于3重量％、小于2重量％、小于1重量％、或小于0.5重量％。
如本文中所用，术语“基本上不含”特定碳水化合物，诸如乳糖，用于表明食物组合物基本上没有碳水化合物残留物。以纯度表示，基本上不含意味着碳水化合物残留物的量不超过10％，优选低于5％，更优选低于1％，最优选低于0.5％，其中百分比以重量或摩尔百分比计。因此，根据本发明的食物组合物中基本上所有的碳水化合物残留物都不含例如乳糖。
除非另有说明，成分的百分比(％)是指总重量％。
除非另有说明，并且作为一般格式“SEQ ID NO:”下描述的所有序列的实例，“包含SEQ ID NO:1的核酸”是指核酸，其至少一部分具有(i )SEQ ID NO:1的序列，或(ii)与SEQID NO:1互补的序列。两者之间的选择由上下文决定。例如，如果核酸用作探针，则两者之间的选择由探针与所需靶标互补的要求决定。
附图简述
图1表示代表生产合成乳替代物的示例性方法的流程图。
图2A表示描绘示例性乳蛋白质组分的沉淀物的图片。
图2B表示描绘示例性乳蛋白质组分的团粒的图片。
图3表示显现乳蛋白质组分的银染SDS-PAGE凝胶的图像。
图4是SYPRO Ruby染色的SDS-PAGE凝胶，其显示由OST信号序列、天然α-乳白蛋白信号序列和α交配因子信号序列介导的α-乳白蛋白的分泌水平，如实施例6中所述。
图5显示使用天然α-乳白蛋白信号肽或OST1信号肽的野生型酵母细胞或表达α-乳白蛋白的酵母细胞分泌α-乳白蛋白的水平(通过如实施例6中所述的ELISA测定法所测定)。
图6显示野生型酵母细胞和包括如实施例6中所述的载体的酵母细胞分泌β-乳球蛋白的水平(使用SDS-PAGE)。
图7是显示野生型酵母和包括如实施例6中所述的载体的酵母细胞分泌β-乳球蛋白的水平的蛋白质印迹。
图8是显示野生型酵母和包括如实施例6中所述的载体的酵母细胞产生的分泌的β-酪蛋白和分泌的α-S1-酪蛋白的水平的图。
图9是显示实施例7中描述的方法中的步骤的示意图。
图10是通过本文所述的方法制成的组合物的图像。
发明详述
本发明基于哺乳动物产生的乳中存在的仅有少数组分提供了哺乳动物产生的乳的质地和味道的发现，以及与哺乳动物产生的乳相比具有类似味道、香气和口感的组合物的开发。鉴于这一发现，本文提供了这样的组合物、制备组合物的方法以及包括这些组合物和可用于制备这些组合物的混合物的试剂盒。
本文提供的组合物提供了与哺乳动物产生的乳相比具有类似味道、口感、香气和营养价值、但是缺乏可被认为是不期望的哺乳动物产生的乳的一种或多种组分(例如过敏原、乳糖、抗生素、激素(例如应激激素和/或生长激素)、重金属、细菌(例如大肠杆菌)、病毒和朊病毒)的组合物。本文提供的组合物相比于哺乳动物产生的乳具有改善的保质期，并且相比于哺乳动物产生的乳可以具有改善的香味特征。
本文还提供了用于乳制品替代食品的方法和组合物，所述乳制品替代食品包含一种或多种分离的乳蛋白质组分、脂肪、碳水化合物和灰分。在某些方面，所述方法和组合物包含乳或乳样蛋白质等效物。优选地，乳蛋白质组分基本上不含杂质。在一些实施方案中，乳蛋白质组分包含微生物衍生或产生的酪蛋白、乳清或其组合。更优选地，提供了引入编码一种或多种乳蛋白质组分的工程改造的核酸序列的方法。甚至更优选地，乳蛋白质组分不是动物来源的。在其他优选的实施方案中，修饰重组乳蛋白质组分以表达相同的磷酸酯基团或缺乏与酪蛋白蛋白质连接的磷酸酯基团和/或碳水化合物基团。通过使重组β-酪蛋白和κ-酪蛋白具有与哺乳动物产生的乳中存在的相同蛋白质相同的磷酸酯基团，重组β-酪蛋白和重组κ-酪蛋白能够形成胶束。
通常根据本领域众所周知的常规方法，并且如本说明书通篇引用并讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述，执行本发明的方法和技术，除非另有指明。参见例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel等人, CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992, andSupplements to 2002); Harlow和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1990; Taylor和Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press, 2003;Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.;Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press, 1976;Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press, 1976;Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999。
用于任何方法和组合物中的示例性材料和方法描述如下，并且可以以任何组合使用。可用于任何方法和组合物中的另外材料和方法也是本领域已知的。
酪蛋白蛋白质
酪蛋白蛋白质包括哺乳动物乳中发现的多种不同蛋白质。酪蛋白蛋白质的非限制性实例包括：β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S2-酪蛋白和α-S1-酪蛋白。
作为从哺乳动物或哺乳动物产生的乳获得酪蛋白蛋白质用于乳制品制造中的替代方案，本发明提供了用于生产重组酪蛋白蛋白质的方法和组合物。在本发明的各个方面，提供了用于非动物来源的酪蛋白的方法和组合物，所述非动物来源的酪蛋白具有类似的溶解度和类似的浊度，以及适于掺入各种食品中的热稳定性。优选地，非动物来源的酪蛋白具有优异的溶解度、类似的浊度和适于掺入各种乳制品替代产品中的热稳定性。另外，所述蛋白质的进一步特征包括在这种热处理期间更少或没有聚集或沉淀，并且适用于程序诸如巴氏杀菌、浓缩等。
乳中非动物来源的酪蛋白的功能差异可以在以下方面表征：液体的粘度；蛋白质耐热的能力；蛋白质形成胶束的能力；和蛋白质保持不同矿物质和维生素的能力。
β-酪蛋白
如由Greenberg等人(J. Biol. Chem. 259:5132-5138, 1984)测定的人β-酪蛋白的初级结构显示为磷酸化蛋白质，其在位于氨基末端附近的特定丝氨酰和苏氨酰残基处具有磷酸化位点。人和牛β-酪蛋白的比较显示47％同一性。
β-酪蛋白蛋白质的非限制性实例是SEQ ID No:25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44和46。编码β-酪蛋白蛋白质的核酸序列的非限制性实例是SEQ ID No:26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、47和144。β-酪蛋白蛋白质可以是来自任何哺乳动物物种的β-酪蛋白蛋白质，例如牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-酪蛋白蛋白质。不同β-酪蛋白蛋白质和编码不同β-酪蛋白蛋白质的核酸的另外的序列是本领域已知的。
β-酪蛋白蛋白质还可以是与野生型β-酪蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44或46)至少50％(例如，至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％)同一的蛋白质。编码β-酪蛋白蛋白质的核酸可以编码与野生型β-酪蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、44或46)至少50％(例如，至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％)同一的蛋白质。
已知用于从基因工程改造的细菌细胞分离β-酪蛋白已知的方法通常涉及从源自裂解或分级的细胞的上清液沉淀β-酪蛋白。例如，Simons, 等人, Protein Eng. 6:763-770 (1993)，使用基因工程改造的大肠杆菌来表达牛β-酪蛋白。积聚在细菌的周质空间中的蛋白质通过渗透压休克释放至细胞悬浮液中。离心悬浮液后，将沉淀中的β-酪蛋白重新悬浮于冷水洗涤液中，并再次离心。存在于上清液中的β-酪蛋白通过用乙酸酸化来沉淀，过滤，并通过HPLC进一步纯化。类似地，Hansson, 等人, Protein Express. Purif. 4:373-381, 1993，使用基因工程改造的大肠杆菌来表达β-酪蛋白。存在于细胞裂解物中的β-酪蛋白用硫酸铵沉淀，溶解在乙醇胺和6M尿素中，并通过离子交换色谱进一步纯化。参见例如美国专利号6,121,421。
此外，比已知技术更简单和更有效的用于分离在酵母中重组产生的β-酪蛋白的方法也是已知的。Choi等人, J. Agric. Food Chem.49(4):1761-1766, 2001. 巴斯德毕赤酵母中糖基化牛β-酪蛋白(L70S/P71S)的表达和纯化导致以下观察结果：大多数牛β-酪蛋白在巴斯德毕赤酵母中不被高糖基化，且其分子量被估计为33.6 kDa。糖基化的牛β-酪蛋白通常在与天然牛β-酪蛋白相同的程度上被磷酸化。
κ-酪蛋白
κ-酪蛋白均被磷酸化和糖基化。人κ-酪蛋白的序列由Brignon等人(Fed. Eur. Biol.Soc. Lett. 188:48-54, 1985)测定。参见例如美国专利号5,710,044。
κ-酪蛋白蛋白质的非限制性实例是SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和23。编码κ-酪蛋白蛋白质的核酸序列的非限制性实例是SEQ ID No:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和148。κ-酪蛋白蛋白质可以是来自任何哺乳动物物种的κ-酪蛋白蛋白质，例如牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象κ-酪蛋白蛋白质。不同κ-酪蛋白蛋白质和编码不同κ-酪蛋白蛋白质的核酸的另外的序列是本领域已知的。
κ-酪蛋白蛋白质还可以是与野生型κ-酪蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23)至少50％(例如，至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％)同一的蛋白质。编码κ-酪蛋白蛋白质的核酸可以编码与野生型κ-酪蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21或23)至少50％(例如，至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％)同一的蛋白质。
α-S1-酪蛋白
α-S1-酪蛋白蛋白质的非限制性实例是SEQ ID No:48、50、52、54、56、57、59、61、63、64、66、68、70、72、74和76。编码α-S1-酪蛋白蛋白质的核酸序列的非限制性实例是SEQ ID No:49、51、53、55、58、60、62、65、67、69、71、73、75、77和147。α-S1-酪蛋白蛋白质可以是来自任何哺乳动物物种的α-S1-酪蛋白蛋白质，例如牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-S1-酪蛋白蛋白质。不同α-S1-酪蛋白蛋白质和编码不同α-S1-酪蛋白蛋白质的核酸的另外的序列是本领域已知的。
α-S1-酪蛋白蛋白质还可以是与野生型α-S1-酪蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:48、50、52、54、56、57、59、61、63、64、66、68、70、72、74或76)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。编码α-S1-酪蛋白蛋白质的核酸可以编码与野生型α-S1-酪蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:48、50、52、54、56、57、59、61、63、64、66、68、70、72、74或76)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。
α-S2-酪蛋白
α-S2-酪蛋白蛋白质的非限制性实例是SEQ ID No:78、80、82、84、86、88和90。编码α-S2-酪蛋白蛋白质的核酸序列的非限制性实例是SEQ ID No:79、81、83、85、87、89、91、145和146。α-S2-酪蛋白蛋白质可以是来自任何哺乳动物物种的α-S2-酪蛋白蛋白质，例如牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-S2-酪蛋白蛋白质。不同α-S2-酪蛋白蛋白质和编码不同α-S2-酪蛋白蛋白质的核酸的另外的序列是本领域已知的。
α-S2-酪蛋白蛋白质还可以是与野生型α-S2-酪蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:78、80、82、84、86、88或90)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。编码α-S2-酪蛋白蛋白质的核酸可以编码与野生型α-S2-酪蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:78、80、82、84、86、88或90)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。
包括酪蛋白蛋白质的胶束
在牛乳中，酪蛋白或酪蛋白胶束通常占悬浮液中整个混合物的2.5％。如果不存在足够的酪蛋白，则不会形成对乳的最佳表现非常重要的胶束。太多蛋白质不能正确溶解，导致不合需要的混合物。酪蛋白胶束可以包括水和盐 - 主要是钙和磷。通过离心容易地分离和移取酪蛋白胶束。通过用酸沉淀酪蛋白以将pH降低至约4.6来容易地从乳清分离。
在一些实施方案中，胶束可以包括β-酪蛋白蛋白质(例如本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)和κ-酪蛋白蛋白质(例如本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)。在一些实例中，所述胶束中β-酪蛋白蛋白质与κ-酪蛋白蛋白质的比率为约2.0:1至约5.5:1、2.0:1至约5.0:1、2.0:1至约4.5:1、约2.0:1至约4.0:1、约2.0:1至约3.5:1、约2.0:1至约3.0:1、约2.0:1至约2.5:1、约2.5:1至约5.0:1、约2.5:1至约4.5:1、约2.5:1至约4.0:1、约2.5:1至约3.5:1、约2.5:1至约3.0:1、3.0:1至约5.0:1、约3.0:1至约4.5:1、约3.0:1至约4.0:1、约3.0:1至约3.5:1、约3.5:1至约5.0:1、约3.5:1至约4.5:1、约3.5:1至约4.0:1、约4.0:1至约5.0:1、约4.0:1至约4.5:1或约4.5:1至约5.0:1。
在一些实例中，所述胶束具有以下的直径(或胶束群具有以下的平均直径)：20 nm至约350 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm、约240 nm、约220 nm、约200 nm、约180 nm、约160 nm、约140 nm、约120 nm、约100 nm、约80 nm、约60 nm或约40 nm；约40 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm、约240 nm、约220 nm、约200nm、约180 nm、约160 nm、约140 nm、约120 nm、约100 nm、约80 nm或约60 nm；约60 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm、约240 nm、约220 nm、约200nm、约180 nm、约160 nm、约140 nm、约120 nm或约100 nm；约80 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm、约240 nm、约220 nm、约200 nm、约180 nm、约160nm、约140 nm、约120 nm或约100 nm；约100 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm、约240 nm、约220 nm、约200 nm、约180 nm、约160 nm、约140 nm或约120 nm；约120 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm、约240nm、约220 nm、约200 nm、约180 nm、约160 nm或约140 nm；约140 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm、约240 nm、约220 nm、约200 nm、约180 nm或约160 nm；约160 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm、约240nm、约220 nm、约200 nm或约180 nm；约180 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm、约240 nm、约220 nm或约200 nm；约200 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm、约240 nm或约220 nm；约220 nm至约350 nm、约340nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm、约260 nm或约240 nm；约240 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm、约280 nm或约260 nm；约260 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm、约300 nm或约280 nm；约280 nm至约350 nm、约340 nm、约320 nm或约300 nm；约300 nm至约350 nm或约325 nm；或约325 nm至约350 nm。
乳清蛋白
乳清通常被称为奶酪的副产品，并且也被认为是乳过敏的一个原因。典型的乳清组合物包含β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白和转铁蛋白的混合物。乳清蛋白不含磷，并且在低pH下保留在溶液中，而酪蛋白不是如此。在一个实施方案中，使用包含β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的乳白蛋白的选择组合作为乳蛋白组分或组合物的主要组分或至少一部分。以下提供不同乳清蛋白的非限制性实例。
α-乳白蛋白
α-乳白蛋白蛋白质的非限制性实例是SEQ ID No:92、94、96和98。编码α-乳白蛋白蛋白质的核酸序列的非限制性实例是SEQ ID NO:93、95、97、99和157。α-乳白蛋白蛋白质可以是来自任何哺乳动物物种的α-乳白蛋白蛋白质，例如牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-乳白蛋白蛋白质。不同α-乳白蛋白蛋白质和编码不同α-乳白蛋白蛋白质的核酸的另外的序列是本领域已知的。
α-乳白蛋白蛋白质还可以是与野生型α-乳白蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:92、94、96或98)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。编码α-乳白蛋白蛋白质的核酸可以编码与野生型α-乳白蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:92、94、96或98)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。
β-乳球蛋白
β-乳球蛋白蛋白质的非限制性实例是SEQ ID No:100、102、104和106。编码β-乳球蛋白蛋白质的核酸序列的非限制性实例是SEQ ID NO:101、103、105、107和143。β-乳球蛋白蛋白质可以是来自任何哺乳动物物种的β-乳球蛋白蛋白质，例如牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-乳球蛋白蛋白质。不同β-乳球蛋白蛋白质和编码不同β-乳球蛋白蛋白质的核酸的另外的序列是本领域已知的。
β-乳球蛋白蛋白质还可以是与野生型β-乳球蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:100、102、104或106)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。编码β-乳球蛋白蛋白质的核酸可以编码与野生型β-乳球蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:100、102、104或106)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。
乳铁蛋白
乳铁蛋白蛋白质的非限制性实例是SEQ ID No:108、110、112和114。编码乳铁蛋白蛋白质的核酸序列的非限制性实例是SEQ ID NO:109、111、113和115。乳铁蛋白蛋白质可以是来自任何哺乳动物物种的乳铁蛋白蛋白质，例如牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象乳铁蛋白蛋白质。不同乳铁蛋白蛋白质和编码不同乳铁蛋白蛋白质的核酸的另外的序列是本领域已知的。
乳铁蛋白蛋白质还可以是与野生型乳铁蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:108、110、112或114)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。编码乳铁蛋白蛋白质的核酸可以编码与野生型乳铁蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:108、110、112或114)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。
转铁蛋白
转铁蛋白蛋白质的非限制性实例是SEQ ID No:116和118。编码转铁蛋白蛋白质的核酸序列的非限制性实例是SEQ ID NO:117和119。转铁蛋白蛋白质可以是来自任何哺乳动物物种的转铁蛋白蛋白质，例如牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象转铁蛋白蛋白质。不同转铁蛋白蛋白质和编码不同转铁蛋白蛋白质的核酸的另外的序列是本领域已知的。
转铁蛋白蛋白质还可以是与野生型转铁蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:116或118)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。编码转铁蛋白蛋白质的核酸可以编码与野生型转铁蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:116或118)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。
血清白蛋白
血清白蛋白蛋白质的非限制性实例是SEQ ID No:120、122、124和126。编码血清白蛋白蛋白质的核酸序列的非限制性实例是SEQ ID NO:121、123、125和127。血清白蛋白蛋白质可以是来自任何哺乳动物物种的血清白蛋白蛋白质，例如牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象血清白蛋白蛋白质。不同血清白蛋白蛋白质和编码不同血清白蛋白蛋白质的核酸的另外的序列是本领域已知的。
血清白蛋白蛋白质还可以是与野生型血清白蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:20、122、124或126)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。编码血清白蛋白蛋白质的核酸可以编码与野生型血清白蛋白蛋白质(例如SEQ ID No:20、122、124或126)至少80％(例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5％)同一的蛋白质。
哺乳动物生产的乳中的脂质
乳脂肪含有约400种不同的脂肪酸，使其成为所有天然脂肪中最复杂的。乳脂肪酸几乎等同地源自两个来源，奶牛的瘤胃中的饲料和微生物活性，而牛乳中的脂质主要作为水包油乳剂存在于小球中。脂肪存在于所有天然乳制品中，并且对于感官特征诸如风味、口感和稠度至关重要。此外，脂肪提供营养和健康益处。
乳脂肪主要由三酸甘油酯组成，约98％，而其他乳脂质是二酰基甘油(约2％的脂质级分)，胆固醇(小于0.5％)，磷脂(约1％)和游离脂肪酸(FFA)(约0.1％) Jensen RG,Newburg DS. Bovine milk lipids, Handbook of milk composition. Jensen RGLondon: Academic Press; 1995. 543–75. 此外，还有痕量的乙醚脂质、碳氢化合物、脂溶性维生素、风味化合物和由饲料引入的化合物(Lindmark Mansson H., Food & NutritionResearch 2008. DOI: 10.3402/fnr.v52i0.1821)。
乳脂肪三酸甘油酯由超过400种不同的脂肪酸合成，使乳脂肪成为所有天然脂肪中最复杂的。乳中几乎所有脂肪酸都以痕量存在，而仅约15种酸以1％或更高水平存在。许多因素与牛乳脂质的量和脂肪酸组成的变化相关。它们可以是动物来源的，即与遗传学(品种和选择)、哺乳期、乳腺炎和瘤胃发酵相关，或者它们可能是饲料相关的因素，即与纤维和能量摄入量、膳食脂肪以及季节和区域效果相关。乳脂肪中的脂肪酸根据似乎在反刍动物中普遍使用的模式排列在三酸甘油酯中。山羊中不饱和脂肪酸(例如，油酸和亚麻酸)百分比与对于牛乳发现的平均值没有差异。山羊和奶牛的乳脂肪之间的主要差异是特定短链脂肪酸之间的百分比分布。山羊具有显著更高的癸酸、辛酸和己酸。大量的这些特定脂肪酸是与山羊乳相关的特征风味和气味的原因。John C. Bruhn, FST, UC Davis, Davis, CA95616-8598; Seewww.drinc.ucdavis.edu/goat1.htm; www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC2596709/# __ffn_sectitle;Food Nutr Res. 2008; 52: 10.3402/fnr.v52i0.1821. 2008年6月11日公开。doi: 10.3402/fnr. v52i0.1821。
乳脂肪酸几乎等同地来源于两个来源，奶牛的瘤胃中的饲料和微生物活性。奶牛的乳腺中的脂肪酸合成系统产生长度为4-16个碳的偶数碳的脂肪酸，并且以摩尔和重量计占脂肪酸的约60％和45％。乳腺中的这种从头合成是4:0–14:0酸以及16:0的约一半来自乙酸酯和β-羟基丁酸酯。通过饲料组分的发酵在瘤胃中产生乙酸和丁酸。在通过瘤胃上皮吸收期间，丁酸被转化成β-羟基丁酸酯。
中链和长链脂肪酸，但主要是18:0，可以在乳腺中去饱和以形成相应的单饱和酸。
脂肪酸不在三酰基甘油分子的三个位置随机酯化(MacGibbon AHK, Taylor MW.Composition and structure of bovine milk lipidsAdvanced dairy chemistry. FoxPFMcSweeney PLHNew York: Springer; 2006. 1–42.)。短链酸丁酸(4:0)和己糖(6:0)几乎完全在sn-3酯化。中链脂肪酸(8:0–14:0)以及16:0优先在位置sn-1和sn-2酯化。将硬脂酸(18:0)选择性置于位置sn-1，而油酸(18:1)显示出对位置sn-1和sn-3的偏好(Lindmark2008)。
存在具有配制成所选脂肪酸特征的脂肪组分的乳替代产品，然而，这种三酸甘油酯不被酯交换至长链单不饱和脂肪酸三酸甘油酯，诸如植物油中所发现。美国专利申请号20140147548公开了通过添加中链三酸甘油酯、特别是己酸、辛酸、癸酸和月桂酸脂肪酸或其组合的年幼动物的乳替代品。
本组合物中的脂质
任何组合物中或用于本文所述的任何方法中的脂质可包括：一种或多种脂肪、一种或多种油、一种或多种单酸甘油酯、双酸甘油酯和/或三酸甘油酯、一种或多种游离脂肪酸和一种或多种磷脂。示例性的油、单酸甘油酯、双酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂如下所述。脂肪、油、单酸甘油酯、双酸甘油酯、三酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂的另外实例是本领域已知的。
油
用于本组合物或方法中的油可包括例如植物来源的油。基于植物的油的非限制性实例包括向日葵油、椰子油、花生油、玉米油、棉籽油、橄榄油、棕榈油、菜籽油、红花油、芝麻油、大豆油、杏仁油、山毛榉坚果油、巴西坚果油、腰果油、榛子油、澳洲坚果油、蒙古坚果油、山核桃油、松子油、开心果油、核桃油和鳄梨油。
单酸甘油酯和双酸甘油酯
可用于本发明中的单酸甘油酯和双酸甘油酯可以是植物来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯。例如，单酸甘油酯和双酸甘油酯可以源自向日葵、椰子、花生、棉籽、橄榄、棕榈、菜籽、红花、芝麻籽、大豆、杏仁、山毛榉坚果、巴西坚果、腰果、榛子、澳洲坚果、蒙古坚果、山核桃、松子、开心果、核桃油和鳄梨。单酸甘油酯和双酸甘油酯可以包括本文列出的任何游离脂肪酸的酰基链。单酸甘油酯和双酸甘油酯的另外实例是本领域已知的。
游离脂肪酸
本文所述的组合物可以包括并且本文所述的方法可以包括使用一种或多种游离脂肪酸。游离脂肪酸的非限制性实例包括丁酸、己酸、辛酸和癸酸。脂肪酸的另外实例包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、二十四烷酸、蜡酸、肉豆蔻油酸、棕榈油酸(pamitoleic acid)、sapienic acid、油酸、反油酸、异油酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸。在一些实例中，游离脂肪酸是饱和的。在一些实例中，游离脂肪酸是不饱和的。在一些实施方案中，游离脂肪酸不是源自哺乳动物或由哺乳动物产生。游离脂肪酸的另外实例是本领域已知的。
磷脂
本文所述的组合物和本文所述的方法可以包括使用一种或多种磷脂。磷脂的非限制性实例包括卵磷脂磷脂(例如大豆卵磷脂磷脂、向日葵卵磷脂磷脂、棉卵磷脂磷脂、油菜籽卵磷脂磷脂、米糠卵磷脂磷脂和玉米卵磷脂磷脂)。在一些实施方案中，磷脂不是源自哺乳动物或由哺乳动物产生。磷脂的另外方面是本领域已知的。
风味化合物
本文所述的任何组合物或方法可以包括或包括使用一种或多种不同的风味化合物。风味化合物的非限制性实例包括δ-癸内酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯和δ-十一内酯。风味化合物的另外实例包括人造香料，例如巧克力、咖啡、草莓、杏仁、榛子、香草、绿茶、爱尔兰奶油和椰子调味剂。风味化合物的另外实例是本领域已知的。
灰分
本文所述的任何组合物或方法可以包括或包括使用灰分。灰分可以例如包括下列中的一种或多种(二种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种)：钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐、氯化物、磷酸盐、镁、铁、钼、锰、铜、硫胺素(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、泛酸(维生素B5)、维生素B6(吡哆醇)、维生素B12(钴胺素)、维生素C、叶酸盐、维生素A、维生素D、维生素E和维生素。在一些实例中，所述灰分包括CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠中的一种或多种(例如，两种或三种)。灰分可以作为粉末或溶液提供。灰分的另外组分和方面是本领域已知的。在一些实施方案中，所述灰分不是源自哺乳动物或由哺乳动物产生。
颜色平衡剂
各种不同颜色平衡剂是本领域已知的。例如，颜色平衡剂可以是从植物(例如，单子叶植物或双子叶植物)获得的化合物。在一些实例中，所述颜色平衡剂是合成化合物。在一些实例中，所述颜色平衡剂不是从哺乳动物或哺乳动物细胞获得或由哺乳动物或哺乳动物细胞产生。颜色平衡剂的非限制性实例包括β-胡萝卜素和胭脂树橙。
甜味剂
甜味剂可以是糖(例如，单糖、二糖或多糖)或人造甜味剂。作为糖的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、莫纳甜和塔格糖。在本文所述的任何组合物或方法中可用作甜味剂的糖的另外实例是本领域已知的。
作为人造甜味剂的甜味剂的非限制性实例包括甜叶菊、阿司帕坦、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜苷、布拉齐因、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、神秘果蛋白、莫纳甜、莫奈林、奥斯来丁、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、advantame、阿力甜、阿司帕坦-乙酰氨基磺酸盐、环己烷氨基磺酸钠、甘素、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜和P-4000。本文所述的任何组合物或方法中可用作甜味剂的另外人造甜味剂是本领域已知的。
组合物
本文提供了组合物，其包括：约0.3 g/L至约1.1 g/L (例如，约0.3 g/L至约1.0 g/L、约0.3 g/L至约0.9 g/L、约0.3 g/L至约0.8 g/L、约0.3 g/L至约0.7 g/L、约0.3 g/L至约0.6 g/L、约0.3 g/L至约0.5 g/L、约0.3 g/L至约0.4 g/L、约0.4 g/L至约1.1 g/L、约0.4g/L至约1.0 g/L、约0.4 g/L至约0.9 g/L、约0.4 g/L至约0.8 g/L、约0.4 g/L至约0.7 g/L、约0.4 g/L至约0.6 g/L、约0.4 g/L至约0.5 g/L、约0.5 g/L至约1.1 g/L、约0.5 g/L至约1.0 g/L、约0.5 g/L至约0.9 g/L、约0.5 g/L至约0.8 g/L、约0.5 g/L至约0.7 g/L、约0.5 g/L至约0.6 g/L、约0.6 g/L至约1.1 g/L、约0.6 g/L至约1.0 g/L、约0.6 g/L至约0.9g/L、约0.6 g/L至约0.8 g/L、约0.6 g/L至约0.7 g/L、约0.7 g/L至约1.1 g/L、约0.7 g/L至约1.0 g/L、约0.7 g/L至约0.9 g/L、约0.7 g/L至约0.8 g/L、约0.8 g/L至约1.1 g/L、约0.8 g/L至约1.0 g/L、约0.8 g/L至约0.9 g/L、约0.9 g/L至约1.1 g/L、约0.9 g/L至约1.0g/L、约1.0 g/L至约1.1 g/L、或约0.27重量%至约0.75重量%) κ-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)；约1.25 g/L至约4.9 g/L (例如，约1.25 g/L至约4.6 g/L、约1.25 g/L至约4.4 g/L、约1.25 g/L至约4.2 g/L、约1.25 g/L至约4.0 g/L、约1.25 g/L至约3.8 g/L、约1.25 g/L至约3.6 g/L、约1.25 g/L至约3.4 g/L、约1.25 g/L至约3.2 g/L、约1.25 g/L至约3.0 g/L、约1.25 g/L至约2.8 g/L、约1.25 g/L至约2.6 g/L、约1.25 g/L至约2.4 g/L、约1.25 g/L至约2.2 g/L、约1.25 g/L至约2.0 g/L、约1.25 g/L至约1.8 g/L、约1.25 g/L至约1.6 g/L、约1.25 g/L至约1.4 g/L、约1.4 g/L至约4.9 g/L、约1.4 g/L至约4.6 g/L、约1.4 g/L至约4.4 g/L、约1.4 g/L至约4.2 g/L、约1.4 g/L至约4.0 g/L、约1.4 g/L至约3.8 g/L、约1.4 g/L至约3.6 g/L、约1.4 g/L至约3.4 g/L、约1.4 g/L至约3.2g/L、约1.4 g/L至约3.0 g/L、约1.4 g/L至约2.8 g/L, 1.4 g/L至约2.6 g/L、约1.4 g/L至约2.4 g/L、约1.4 g/L至约2.2 g/L、约1.4 g/L至约2.0 g/L、约1.4 g/L至约1.8 g/L、约1.4 g/L至约1.6 g/L、约1.6 g/L至约4.9 g/L、约1.6 g/L至约4.6 g/L、约1.6 g/L至约4.4g/L、约1.6 g/L至约4.2 g/L、约1.6 g/L至约4.0 g/L、约1.6 g/L至约3.8 g/L、约1.6 g/L至约3.6 g/L、约1.6 g/L至约3.4 g/L、约1.6 g/L至约3.2 g/L、约1.6 g/L至约3.0 g/L、约1.6 g/L至约2.8 g/L, 1.6 g/L至约2.6 g/L、约1.6 g/L至约2.4 g/L、约1.6 g/L至约2.2g/L、约1.6 g/L至约2.0 g/L、约1.6 g/L至约1.8 g/L、约1.8 g/L至约4.9 g/L、约1.8 g/L至约4.6 g/L、约1.8 g/L至约4.4 g/L、约1.8 g/L至约4.2 g/L、约1.8 g/L至约4.0 g/L、约1.8 g/L至约3.8 g/L、约1.8 g/L至约3.6 g/L、约1.8 g/L至约3.4 g/L、约1.8 g/L至约3.2g/L、约1.8 g/L至约3.0 g/L、约1.8 g/L至约2.8 g/L, 1.8 g/L至约2.6 g/L、约1.8 g/L至约2.4 g/L、约1.8 g/L至约2.2 g/L、约1.8 g/L至约2.0 g/L、约2.0 g/L至约4.9 g/L、约2.0 g/L至约4.6 g/L、约2.0 g/L至约4.4 g/L、约2.0 g/L至约4.2 g/L、约2.0 g/L至约4.0g/L、约2.0 g/L至约3.8 g/L、约2.0 g/L至约3.6 g/L、约2.0 g/L至约3.4 g/L、约2.0 g/L至约3.2 g/L、约2.0 g/L至约3.0 g/L、约2.0 g/L至约2.8 g/L, 2.0 g/L至约2.6 g/L、约2.0 g/L至约2.4 g/L、约2.0 g/L至约2.2 g/L、约2.2 g/L至约4.9 g/L、约2.2 g/L至约4.6g/L、约2.2 g/L至约4.4 g/L、约2.2 g/L至约4.2 g/L、约2.2 g/L至约4.0 g/L、约2.2 g/L至约3.8 g/L、约2.2 g/L至约3.6 g/L、约2.2 g/L至约3.4 g/L、约2.2 g/L至约3.2 g/L、约2.2 g/L至约3.0 g/L、约2.2 g/L至约2.8 g/L, 2.2 g/L至约2.6 g/L、约2.2 g/L至约2.4g/L、约2.4 g/L至约4.9 g/L、约2.4 g/L至约4.6 g/L、约2.4 g/L至约4.4 g/L、约2.4 g/L至约4.2 g/L、约2.4 g/L至约4.0 g/L、约2.4 g/L至约3.8 g/L、约2.4 g/L至约3.6 g/L、约2.4 g/L至约3.4 g/L、约2.4 g/L至约3.2 g/L、约2.4 g/L至约3.0 g/L、约2.4 g/L至约2.8g/L, 2.4 g/L至约2.6 g/L、约2.6 g/L至约4.9 g/L、约2.6 g/L至约4.6 g/L、约2.6 g/L至约4.4 g/L、约2.6 g/L至约4.2 g/L、约2.6 g/L至约4.0 g/L、约2.6 g/L至约3.8 g/L、约2.6 g/L至约3.6 g/L、约2.6 g/L至约3.4 g/L、约2.6 g/L至约3.2 g/L、约2.6 g/L至约3.0g/L、约2.6 g/L至约2.8 g/L、约2.8 g/L至约4.9 g/L、约2.8 g/L至约4.6 g/L、约2.8 g/L至约4.4 g/L、约2.8 g/L至约4.2 g/L、约2.8 g/L至约4.0 g/L、约2.8 g/L至约3.8 g/L、约2.8 g/L至约3.6 g/L、约2.8 g/L至约3.4 g/L、约2.8 g/L至约3.2 g/L、约2.8 g/L至约3.0g/L、约3.0 g/L至约4.9 g/L、约3.0 g/L至约4.6 g/L、约3.0 g/L至约4.4 g/L、约3.0 g/L至约4.2 g/L、约3.0 g/L至约4.0 g/L、约3.0 g/L至约3.8 g/L、约3.0 g/L至约3.6 g/L、约3.0 g/L至约3.4 g/L、约3.0 g/L至约3.2 g/L、约3.2 g/L至约4.9 g/L、约3.2 g/L至约4.6g/L、约3.2 g/L至约4.4 g/L、约3.2 g/L至约4.2 g/L、约3.2 g/L至约4.0 g/L、约3.2 g/L至约3.8 g/L、约3.2 g/L至约3.6 g/L、约3.2 g/L至约3.4 g/L、约3.4 g/L至约4.9 g/L、约3.4 g/L至约4.6 g/L、约3.4 g/L至约4.4 g/L、约3.4 g/L至约4.2 g/L、约3.4 g/L至约4.0g/L、约3.4 g/L至约3.8 g/L、约3.4 g/L至约3.6 g/L、约3.6 g/L至约4.9 g/L、约3.6 g/L至约4.6 g/L、约3.6 g/L至约4.4 g/L、约3.6 g/L至约4.2 g/L、约3.6 g/L至约4.0 g/L、约3.6 g/L至约3.8 g/L、约3.8 g/L至约4.9 g/L、约3.8 g/L至约4.6 g/L、约3.8 g/L至约4.4g/L、约3.8 g/L至约4.2 g/L、约3.8 g/L至约4.0 g/L、约4.0 g/L至约4.9 g/L、约4.0 g/L至约4.6 g/L、约4.0 g/L至约4.4 g/L、约4.0 g/L至约4.2 g/L、约4.2 g/L至约4.9 g/L、约4.2 g/L至约4.6 g/L、约4.2 g/L至约4.4 g/L、约4.4 g/L至约4.9 g/L、约4.4 g/L至约4.6g/L、约4,6 g/L至约4.9 g/L、或约1.23重量%至约3.27重量%) β-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)；最终总浓度为约0重量%至约45重量% (例如，0重量%；约0重量%至约4.5重量%；约0.5重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、约25重量%、约20重量%、约15重量%、约10重量%、约8重量%、约6重量%、约5重量%、约4重量%、约3重量%、约2重量%、或约1重量%；约1.0重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、约25重量%、约20重量%、约15重量%、约10重量%、约8重量%、约6重量%、约5重量%、约4重量%、约3重量%、或约2重量%；约2重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、约25重量%、约20重量%、约15重量%、约10重量%、约8重量%、约6重量%、约5重量%、约4重量%、或约3重量%；约3重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、约25重量%、约20重量%、约15重量%、约10重量%、约8重量%、约6重量%、约5重量%、或约4重量%；约4重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、约25重量%、约20重量%、约15重量%、约10重量%、约8重量%、约6重量%、或约5重量%；约5重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、约25重量%、约20重量%、约15重量%、约10重量%、约8重量%、或约6重量%；约6重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、约25重量%、约20重量%、约15重量%、约10重量%、或约8重量%；约8重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、约25重量%、约20重量%、约15重量%、或约10重量%；约10重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、约25重量%、约20重量%、或约15重量%；约15重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、约25重量%、或约20重量%；约20重量%至约40重量%、约35重量%、约30重量%、或约25重量%；约25重量%至约40重量%、约35重量%、或约30重量%；约30重量%至约40重量%、或约35重量%；或约35重量%至约40重量%)的一种或多种脂质(例如，本文所述的任何一种或多种脂质)；最终总浓度为约0.01重量%至约6重量% (例如，约0.1重量%至约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、约2.5重量%、约2.0重量%、约1.5重量%、约1.0重量%、或约0.5重量%；约0.5重量%至约6重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、约2.5重量%、约2.0重量%、约1.5重量%、或约1.0重量%；约1.0重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、约2.5重量%、约2.0重量%、或约1.5重量%；约1.5重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、约2.5重量%、或约2.0重量%；约2.0重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、或约2.5重量%；约2.5重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、或约3.0重量%；约3.0重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、或约3.5重量%；约3.5重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、或约4.0重量%；约4.0重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%；约4.5重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、或约5.0重量%；约5.0重量%至约6.0重量%或约5.5重量%；或约5.5重量%至约6.0重量%)的一种或多种风味化合物(例如，本文所述的任何一种或多种风味化合物)；最终总浓度为约0.1重量%至约6重量% (例如，约0.1重量%至约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、约2.5重量%、约2.0重量%、约1.5重量%、约1.0重量%、或约0.5重量%；约0.5重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、约2.5重量%、约2.0重量%、约1.5重量%、或约1.0重量%；约1.0重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、约2.5重量%、约2.0重量%、或约1.5重量%；约1.5重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、约2.5重量%、或约2.0重量%；约2.0重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、或约2.5重量%；约2.5重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、或约3.0重量%；约3.0重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、或约3.5重量%；约3.5重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、约4.5重量%、或约4.0重量%；约4.0重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、约5.0重量%、或约4.5重量%；约4.5重量%至约6.0重量%、约5.5重量%、或约5.0重量%；约5.0重量%至约6.0重量%、或约5.5重量%；或约5.5重量%至约6.0重量%)的一种或多种甜味剂(例如，本文所述的任何一种或多种甜味剂)；和最终总浓度为约0.15重量%至约1.5重量% (例如，约0.15重量%至约1.4重量%、约1.3重量%、约1.2重量%、约1.1重量%、约1.0重量%、约0.9重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、约0.5重量%、约0.4重量%、约0.3重量%、或约0.2重量%；约0.2重量%至约1.5重量%、约1.4重量%、约1.3重量%、约1.2重量%、约1.1重量%、约1.0重量%、约0.9重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、约0.5重量%、约0.4重量%、或约0.3重量%；约0.3重量%至约1.5重量%、约1.4重量%、约1.3重量%、约1.2重量%、约1.1重量%、约1.0重量%、约0.9重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、约0.5重量%、或约0.4重量%；约0.4重量%至约1.5重量%、约1.4重量%、约1.3重量%、约1.2重量%、约1.1重量%、约1.0重量%、约0.9重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、或约0.5重量%；约0.5重量%至约1.5重量%、约1.4重量%、约1.3重量%、约1.2重量%、约1.1重量%、约1.0重量%、约0.9重量%、约0.8重量%、或约0.6重量%；约0.6重量%至约1.5重量%、约1.4重量%、约1.3重量%、约1.2重量%、约1.1重量%、约1.0重量%、约0.9重量%、或约0.8重量%；约0.8重量%至约1.4重量%、约1.3重量%、约1.2重量%、约1.1重量%、约1.0重量%、或约0.9重量%；约0.9重量%至约1.5重量%、约1.4重量%、约1.3重量%、约1.2重量%、约1.1重量%、或约1.0重量%；约1.0重量%至约1.5重量%、约1.4重量%、约1.3重量%、约1.2重量%、或约1.1重量%；约1.1重量%至约1.5重量%、约1.4重量%、约1.3重量%、或约1.2重量%；约1.2重量%至约1.5重量%、约1.4重量%、或约1.3重量%；约1.3重量%至约1.5重量%或约1.4重量%；或约1.4重量%至约1.5重量%)的灰分，其中所述组合物不包含动物来源组分。
还提供了组合物，其包括：约0.3g/L至约1.1g/L(例如，上述段落中描述的约0.3g/L至约1.1g/L的任何子范围)κ-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)；约1.25 g/L至约4.9 g/L(例如，上述段落中描述的约1.25 g/L至约4.9 g/L的任何子范围)β-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)；最终总浓度为约0重量％至约45重量％(例如，上述段落中描述的约0重量％至约45重量％的所有子范围)的一种或多种脂质(例如，本文所述的任何一种或多种脂质)；最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％(例如，上述段落中描述的约0.01重量％至约6重量％的所有子范围)的一种或多种风味化合物(例如，本文所述的任何一种或多种风味化合物)；最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％(例如，上述段落中描述的约0.1重量％至约6重量％的所有子范围)的一种或多种甜味剂(例如，本文所述的任何一种或多种甜味剂)；和最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％(例如，上述段落中描述的约0.15重量％至约1.5重量％的所有子范围)的灰分(例如，本文所述的任何示例性灰分)，其中：所述组合物：不包括在哺乳动物产生的乳中发现的至少一种组分；包括哺乳动物产生的乳中不存在的至少一种组分；和/或包括与哺乳动物产生的乳中的至少一种组分的浓度相比更高或更低浓度的至少一种组分。在这些组合物的一些实例中，所述组合物包括与哺乳动物产生的乳中的一种或多种组分的浓度相比更高浓度的至少一种组分，所述组分选自：钙、磷酸盐、B复合维生素、维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。在这些组合物的一些实施方案中，所述组合物不包括在哺乳动物产生的乳中发现的至少一种组分，所述组分选自：乳糖、细菌、分枝杆菌、过敏原、病毒、朊病毒、酵母、生长激素、白细胞、抗生素、重金属、免疫球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶和脂肪酶。在这些组合物的一些实例中，所述组合物包括哺乳动物产生的乳中不存在的至少一种组分，所述组分选自人造甜味剂、植物来源的脂质、非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质。
还提供了组合物，其包括：约0.3g/L至约1.1g/L(例如，该章节中描述的约0.3g/L至约1.1g/L的任何子范围)非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)；约1.25 g/L至约4.9 g/L(例如，该章节中描述的约1.25 g/L至约4.9 g/L的任何子范围)非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)；最终总浓度为约0重量％至约45重量％(例如，该章节中描述的约0重量％至约45重量％的所有子范围)的一种或多种脂质(例如，本文所述的任何一种或多种脂质)；最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％(例如，该章节中描述的约0.01重量％至约6重量％的所有子范围)的一种或多种风味化合物(例如，本文所述的任何一种或多种风味化合物)；最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％(例如，该章节中描述的约0.1重量％至约6重量％的所有子范围)的一种或多种甜味剂(例如，本文所述的任何一种或多种甜味剂)；和最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％(例如，该章节中描述的约0.15重量％至约1.5重量％的所有子范围)的灰分(例如，本文所述的任何灰分)。
还提供了包括胶束的组合物，所述胶束包括κ-酪蛋白蛋白质(例如本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)和β-酪蛋白蛋白质(例如本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)，其中所述胶束具有约50nm至约350nm的直径(例如，本文所述的胶束的直径的任何子范围)，且所述κ-酪蛋白蛋白质和β-酪蛋白蛋白质是非糖基化的或具有非哺乳动物糖基化模式。在一些实施方案中，所述组合物包括最终浓度为以下的胶束：约2.0重量%至约6重量% (例如，约 2.0重量%至约5.5重量%、约 5.0重量%、约 4.5重量%、约 4.0重量%、约 3.5重量%、约 3.0重量%、或约 2.5重量%；约 2.5重量%至约6.0重量%、约 5.5重量%、约 5.0重量%、约 4.5重量%、约4.0重量%、约 3.5重量%、或约 3.0重量%；约 3.0重量%至约6.0重量%、约 5.5重量%、约 5.0重量%、约 4.5重量%、约 4.0重量%、或约 3.5重量%；约 3.5重量%至约6.0重量%、约 5.5重量%、约 5.0重量%、约 4.5重量%、约 4.0重量%、或约 3.5重量%；约 3.5重量%至约6.0重量%、约 5.5重量%、约 5.0重量%、约 4.5重量%、或约 4.0重量%；约 4.5重量%至约6.0重量%、约 5.5重量%、约 5.0重量%、约 4.5重量%、或约 4.0重量%；约 4.0重量%至约6.0重量%、约 5.5重量%、约 5.0重量%、或约 4.5重量%；约 4.5重量%至约5.5重量%、或约 5.0重量%；约 5.0重量%至约6.0重量%或5.5重量%；或约5.5重量%至约6.0重量%)。在这些组合物的一些实施方案中，所述胶束中β-酪蛋白蛋白质与κ-酪蛋白蛋白质的比率为约2.0:1至约5.5:1(例如，对于本文胶束所述的比率约2.0:1至约5.5:1的任何子范围)。在一些实施方案中，这些组合物还包括：最终总浓度为约0重量％至约45重量％(例如，该章节中描述的约0重量％至约45重量％的所有子范围)的一种或多种脂质(例如，本文所述的任何一种或多种脂质)；最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％(例如，该章节中描述的0.01重量％至约6重量％的所有子范围)的一种或多种风味化合物(例如，本文所述的任何一种或多种风味化合物)；最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％(例如，该章节中描述的约0.1重量％至约6重量％的所有子范围)的一种或多种甜味剂(例如，本文所述的任何一种或多种甜味剂)；和最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％(例如，该章节中描述的约0.15重量％至约1.5重量％的所有子范围)的灰分(例如，本文所述的任何灰分)。
在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述一种或多种脂质选自：向日葵油、椰子油、三丁酸甘油酯、单酸甘油酯和双酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂。本文所述的任何组合物的一些实例还包括下列中的一种或多种：最终浓度为约1重量%至约28重量% (例如，约1重量%至约26重量%、约24重量%、约22重量%、约20重量%、约18重量%、约16重量%、约14重量%、约12重量%、约10重量%、约8重量%、约6重量%、约4重量%、或约2重量%；约2重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%、约22重量%、约20重量%、约18重量%、约16重量%、约14重量%、约12重量%、约10重量%、约8重量%、约6重量%、或约4重量%；约4重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%、约22重量%、约20重量%、约18重量%、约16重量%、约14重量%、约12重量%、约10重量%、约8重量%、或约6重量%；约6重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%、约22重量%、约20重量%、约18重量%、约16重量%、约14重量%、约12重量%、约10重量%、或约8重量%；约8重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%、约22重量%、约20重量%、约18重量%、约16重量%、约14重量%、约12重量%、或约10重量%；约10重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%、约22重量%、约20重量%、约18重量%、约16重量%、约14重量%、或约12重量%；约12重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%、约22重量%、约20重量%、约18重量%、约16重量%、或约14重量%；约14重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%、约22重量%、约20重量%、约18重量%、或约16重量%；约16重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%、约22重量%、约20重量%、约18重量%；约18重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%、约22重量%、或约20重量%；约20重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%、约22重量%；约22重量%至约28重量%、约26重量%、约24重量%；约24重量%至约28重量%或约26重量%；或约28重量%至约30重量%)的向日葵油；最终浓度为约0.5重量%至约14重量% (例如，约0.5重量%至约12重量%、约10重量%、约8重量%、约6重量%、约4重量%、约2重量%、或约1重量%；约1重量%至约14重量%、约12重量%、约10重量%、约8重量%、约6重量%、约4重量%、或约2重量%；约2重量%至约12重量%、约10重量%、约8重量%、约6重量%、或约4重量%；约4重量%至约14重量%、约12重量%、约10重量%、约8重量%、或约6重量%；约6重量%至约14重量%、约12重量%、约10重量%、或约8重量%；约8重量%至约14重量%、约12重量%、或约10重量%；约10重量%至约14重量%或12重量%；或约12重量%至约14重量%)的椰子油；最终浓度为约0.05重量to 约1.0重量% (例如，约0.05重量%至约0.9重量%、约0.8重量%、约0.7重量%、约0.6重量%、约0.5重量%、约0.4重量%、约0.3重量%、或约0.2重量%；0.1重量%至约1.0重量%、约0.9重量%、约0.8重量%、约0.7重量%、约0.6重量%、约0.5重量%、约0.4重量%、约0.3重量%、或约0.2重量%；约0.2重量%至约1.0重量%、约0.9重量%、约0.8重量%、约0.7重量%、约0.6重量%、约0.5重量%、或约0.4重量%；约0.4重量%至约1.0重量%、约0.9重量%、约0.8重量%、约0.7重量%、约0.6重量%、或约0.5重量%；约0.5重量%至约1.0重量%、约0.9重量%、约0.8重量%、约0.7重量%、或约0.6重量%；约0.6重量%至约1.0重量%、约0.9重量%、约0.8重量%、或约0.7重量%；约0.7重量%至约1.0重量%、约0.9重量%、或约0.8重量%；约0.8重量%至约1.0重量%或约0.9重量%；或约0.9重量%至约1.0重量%)的三丁酸甘油酯；
最终浓度为约0.08重量%至约1.2重量% (例如，0.08重量%至约1.0重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、约0.4重量%、或约0.2重量%；约0.2重量%至约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、或约0.4重量%；约0.4重量%至约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、或约0.6重量%；约0.6重量%至约1.2重量%、约1.0重量%、或约0.8重量%；约0.8重量%至约1.2重量%或约1.0重量%的单酸甘油酯和双酸甘油酯(例如本文所述的任何一种或多种单甘油酯或双酸甘油酯)；或约1.0重量%至约1.2重量%)；和最终总浓度为约0.02重量%至约0.28重量%的游离脂肪酸；和最终总浓度为约0.02重量%至约0.3重量% (例如，约0.02重量%至约0.25重量%、约0.20重量%、约0.15重量%、或约0.10重量%；约0.05重量%至约0.3重量%、约0.25重量%、约0.20重量%、约0.15重量%、或约0.10重量%；约0.10重量%至约0.30重量%、约0.25重量%、约0.20重量%、或约0.15重量%；约0.15重量%至约0.30重量%、约0.25重量%、或约0.20重量%；约0.20重量%至约0.30重量%或约0.25重量%；或约0.25重量%至约0.30重量%)的磷脂(例如，本文所述的任何一种或多种磷脂)。
在任何组合物的一些实施方案中，所述游离脂肪酸包括至少一种(例如，两种、三种或四种)选自以下的脂肪酸：丁酸、己酸、辛酸和癸酸。在任何组合物的一些实施方案中，所述磷脂是大豆卵磷脂磷脂、向日葵卵磷脂磷脂、棉花卵磷脂磷脂或油菜籽卵磷脂磷脂。在本文所述的任何组合物的一些实例中，所述风味化合物包括至少一种选自以下的风味化合物：δ-癸内酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯和δ-十一内酯。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述一种或多种甜味剂是糖(例如，葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、莫纳甜或塔格糖)。在本文所述的任何组合物的一些实例中，所述一种或多种甜味剂是人造甜味剂(例如，甜叶菊、阿司帕坦、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜苷、布拉齐因、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、神秘果蛋白、莫纳甜、莫奈林、奥斯来丁、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、advantame、阿力甜、阿司帕坦-乙酰氨基磺酸盐、环己烷氨基磺酸钠、甘素、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜或P-4000)。
在本文所述的任何组合物的一些实例中，所述灰分包括下列中的一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种或六种)：钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐和氯化物。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述灰分包含CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠中的一种或多种(例如，两种或三种)。本文所述的组合物的一些实施方案包括：最终浓度为约0.05 g/L至约0.2 g/L(例如，约0.05 g/L至约0.15 g/L、约0.05 g/L至约0.10 g/L、约0.10 g/L至约0.20 g/L、约0.10 g/L至约0.15 g/L、或约0.15 g/L至约0.2 g/L)的CaCl2；最终浓度为约0.2 g/L至约0.4 g/L (例如，约0.2 g/L至约0.35 g/L、约0.2 g/L至约0.30 g/L、约0.2 g/L至约0.25g/L、约0.25 g/L至约0.4 g/L、约0.25 g/L至约0.30 g/L、约0.30 g/L至约0.40 g/L、或约0.30 g/L至约0.35 g/L、或约0.35 g/L至约0.40 g/L)的KH2PO4；和/或最终浓度为约0.1 g/L至约0.3 g/L (例如，0.1 g/L至约0.25 g/L、约0.1 g/L至约0.20 g/L、约0.1 g/L至约0.15 g/L、约0.15 g/L至约0.30 g/L、约0.15 g/L至约0.25 g/L、约0.15 g/L至约0.20 g/L、约0.20 g/L至约0.30 g/L、约0.20 g/L至约0.25 g/L、或约0.25 g/L至约0.30 g/L)的柠檬酸钠。
在本文所述的任何组合物中，所述κ-酪蛋白蛋白质可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountaingoat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象κ-酪蛋白蛋白质。在本文所述的任何组合物中，所述β-酪蛋白蛋白质可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-酪蛋白蛋白质。
在本文所述的任何组合物的一些实例中，其还可以包括：最终浓度为约0.4重量%至约2.5重量% (例如，约0.4重量%至约2.0重量%、约1.5重量%、或约1.0重量%；约1.0重量%至约2.5重量%、约2.0重量%、或约1.5重量%、约1.5重量%至约2.5重量%或2.0重量%；或约2.0重量%至约2.5重量%)的α-乳白蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何α-乳白蛋白蛋白质)，和/或最终浓度为约2.5重量％至约4.5重量％的β-乳球蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何β-乳球蛋白蛋白质)。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述α-乳白蛋白蛋白质可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-乳白蛋白蛋白质。在本文所述的任何组合物的一些实施方案中，所述β-乳球蛋白蛋白质可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-乳球蛋白蛋白质。
本文所述的任何组合物的一些实施方案还包括：最终浓度为约11重量%至约16重量% (例如，约11重量%至约15重量%、约14重量%、约13重量%、或约12重量%；约12重量%至约16重量%、约15重量%、约14重量%、或约13重量%；约13重量%至约16重量%、约15重量%、或约14重量%；约14重量%至约16重量%或15重量%；或约15重量%至约16重量%)的α-S1-酪蛋白蛋白质(例如本文所述的任何α-S1-酪蛋白蛋白质)；和/或最终浓度为约2重量%至约5重量% (例如，约2重量%至约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、约3.0重量%、或约2.5重量%；约2.5重量%至约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、约3.5重量%、或约3.0重量%；约3.0重量%至约5.0重量%、约4.5重量%、约4.0重量%、或约3.5重量%；约3.5重量%至约5重量%、约4.5重量%、或约4.0重量%；约4.0重量%至约5.0重量%或4.5重量%；或约4.5重量%至约5.0重量%)的α-S2-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何α-S2-酪蛋白蛋白质)。
在本文所述的任何组合物的一些实例中，所述α-S1-酪蛋白蛋白质可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-S1-酪蛋白蛋白质；和/或所述α-S2-酪蛋白蛋白质可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-S2-酪蛋白蛋白质。
本文所述的任何组合物的一些实例还包括血清白蛋白(例如，本文所述的任何血清白蛋白蛋白质)、乳铁蛋白(例如，本文所述的任何乳铁蛋白蛋白质)和转铁蛋白(例如，本文所述的任何转铁蛋白)中的一种或多种(例如，两种或三种)。在本文所述的任何组合物的一些实例中，所述血清白蛋白可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象血清白蛋白；所述乳铁蛋白可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountaingoat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象乳铁蛋白；和/或所述转铁蛋白可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象转铁蛋白。
在本文所述的任何组合物的一些实例中，所述组合物还包括一种或多种颜色平衡剂(例如，本文所述的任何着色剂，例如，β-胡萝卜素或胭脂树橙)。
本文所述的任何组合物可以具有约6.2至约7.2 (例如，约6.2至约7.0、约6.2至约6.8、约6.2至约6.6、约6.2至约6.4、约6.4至约7.2、约6.4至约7.0、约6.4至约6.8、约6.4至约6.6、约6.6至约7.2、约6.6至约7.0、约6.6至约6.8、约6.8至约7.2、约6.8至约7.0、或约7.0至约7.2)的pH。
在各种实施方案中，以干重或总重计，所述乳蛋白质组分包含约0.5%、约1%、约1.5%、约2%、约2.5%、约3%、约3.5%、约4%、约4.5%、约5%、约6%乳蛋白质。在一些实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约0.5-2.5%、约1-2%、约2-3%、或约4-10%蛋白质。在具体实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约10-15％蛋白质。
广泛范围的酪蛋白，包括与野生型酪蛋白具有实质同源性的酪蛋白、酪蛋白的变体、突变体作为乳蛋白质的组分表达并掺入。
干燥组合物
还提供了粉末组合物，其包括：最终浓度为约3.6重量%至约5.4重量% (例如，约3.6重量%至约5.2重量%、约5.0重量%、约4.8重量%、约4.6重量%、约4.4重量%、约4.2重量%、约4.0重量%、或约3.8重量%；约3.8重量%至约5.4重量%、约5.2重量%、约5.0重量%、约4.8重量%、约4.6重量%、约4.4重量%、约4.2重量%、或约4.0重量%；约4.0重量%至约5.4重量%、约5.2重量%、约5.0重量%、约4.8重量%、约4.6重量%、约4.4重量%、或约4.2重量%；约4.2重量%至约5.2重量%、约5.2重量%、约5.0重量%、约4.8重量%、约4.6重量%、或约4.4重量%；约4.8重量%至约5.4重量%、约5.2重量%、或约5.0重量%；约5.0重量%至约5.4重量%或约5.2重量%；或约5.2重量%至约5.4重量%)的κ-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何α-酪蛋白蛋白质)；最终浓度为约16.3重量%至约24.5重量%; 16.3重量%至约22重量%、约20重量%、或约18重量%；约18重量%至约24.5重量%、约22重量%、或约20重量%；约20重量%至约24.5重量%至约22重量%；或约22重量%至约24.5重量%)的β-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)；最终浓度为约35重量%至约40重量% (例如，约35重量%至约39重量%、约38重量%、约37重量%、或约36重量%；约36重量%至约40重量%、约39重量%、约38重量%、或约37重量%；约37重量%至约40重量%、约39重量%、或约38重量%；约38重量%至约40重量%或39重量%；或约39重量%至约40重量%)的甜味剂(例如，本文所述的任何一种或多种甜味剂)；最终浓度为约25重量%至约30重量% (例如，约25重量%至约29重量%、约28重量%、约27重量%、或约26重量%；约26重量%至约30重量%、约29重量%、约28重量%、或约27重量%；约27重量%至约30重量%、约29重量%、或约28重量%；约28重量%至约30重量%或约29重量%；或约29重量%至约30重量%)的一种或多种脂质(例如，本文所述的任何一种或多种脂质)；最终浓度为约5重量%至约7重量%(例如，约5重量%至约6.5重量%、约6.0重量%、或约5.5重量%；约5.5重量%至约7.0重量%、约6.5重量%、或约6.0重量%；约6.0重量%至约7.0重量%或约6.5重量%；或约6.5重量%至约7.0重量%)的灰分(例如，本文所述的任何灰分)；和最终浓度为约2重量%至约5重量% (例如，约2重量%至约4重量%或约3重量%；约3重量%至约5重量%或约4重量%；或约4重量%至约5重量%)的水，其中所述κ-酪蛋白蛋白质是非糖基化的和/或具有非哺乳动物糖基化模式，和/或所述β-酪蛋白蛋白质是非糖基化的和/或具有非哺乳动物糖基化模式。
任何粉末组合物可以含有本文所述的任何组合物中所述的任何组分(例如，分别为本文对于每种组分所述的任何浓度的任何一种或多种配色剂，α-S1-酪蛋白蛋白质、α-S2-酪蛋白蛋白质、α-乳白蛋白蛋白质、β-乳球蛋白蛋白质、乳铁蛋白蛋白质、转铁蛋白蛋白质和血清白蛋白蛋白质)。
补充的乳组合物
本文还提供了组合物，其包括：哺乳动物产生的乳或加工的哺乳动物产生的乳；和下列中的一种或多种(例如两种或三种)：非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质；非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质；或包括非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质的胶束。
在一些实例中，所述组合物包括哺乳动物产生的乳或加工的哺乳动物产生的乳和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质。在一些实例中，所述组合物包括哺乳动物产生的乳或加工的哺乳动物产生的乳和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质。在其他实例中，所述组合物包括哺乳动物产生的乳或加工的哺乳动物产生的乳和包括非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质的胶束。
在一些实例中，所述组合物中非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质的最终浓度或非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质的最终浓度为：(最终组合物的)0.02重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、约0.4重量%、约0.2重量%、或约0.1重量%；约0.1重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、约0.4重量%、或约0.2重量%；约0.2重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、或约0.4重量%；约0.8重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、或约1.0重量%；约1.0重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、或约1.2重量%；约1.2重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、或约1.4重量%；约1.4重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、或约1.6重量%；约1.6重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、或约1.8重量%；约1.8重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、或约2.0重量%；约2.0重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、或约2.2重量%；约2.2重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、或约2.4重量%；约2.4重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、或约2.6重量%；约2.6重量%至约3.0重量%或约2.8重量%；或约2.8重量%至约3.0重量%。
在一些组合物中，所述组合物中非糖基化和/或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质的最终浓度为约0.02重量%至约0.6重量% (例如，约0.02重量%至约0.5重量%、约0.02重量%至约0.4重量%、约0.02重量%至约0.3重量%、约0.02重量%至约0.2重量%、约0.02重量%至约0.1重量%、约0.1重量%至约0.5重量%、约0.1重量%,至约0.4重量%、约0.1重量%至约0.3重量%、约0.1重量%至约0.2重量%、约0.2重量%至约0.5重量%、约0.2重量%至约0.4重量%、约0.2重量%至约0.3重量%、约0.3重量%至约0.5重量%、约0.3重量%至约0.4重量%、或约0.4重量%至约0.5重量%)；且所述组合物中非糖基化和/或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质的最终浓度为约0.02重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、约0.4重量%、或约0.2重量%；约0.2重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、或约0.4重量%；约0.4重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、或约0.6重量%；约0.6重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、约1.0重量%、或约0.8重量%；约0.8重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、或约1.0重量%；约1.0重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、或约1.2重量%；约1.2重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、或约1.4重量%；约1.4重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、或约1.6重量%；约1.6重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、或约1.8重量%；约1.8重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、或约2.0重量%；约1.8重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、或约2.0重量%；约2.0重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、或约2.2重量%；约2.2重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、或约2.4重量%；约2.4重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、约2.8重量%、或约2.6重量%；约2.6重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、约3.0重量%、或约2.8重量%；约2.8重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、约3.2重量%、或约3.0重量%；约3.0重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、约3.4重量%、或约3.2重量%；约3.2重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、约3.6重量%、或约3.4重量%；约3.4重量%至约4.0重量%、约3.8重量%、或约3.6重量%；约3.6重量%至约4.0重量%或约3.8重量%；或约3.8重量%至约4.0重量%。
在一些实例中，所述组合物中包括非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质的胶束的最终浓度为：(最终组合物的)0.02重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、约0.4重量%、约0.2重量%、或约0.1重量%；约0.1重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、约0.4重量%、或约0.2重量%；约0.2重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、约1.0重量%、约0.8重量%、约0.6重量%、或约0.4重量%；约0.8重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、约1.2重量%、或约1.0重量%；约1.0重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、约1.4重量%、或约1.2重量%；约1.2重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、约1.6重量%、或约1.4重量%；约1.4重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、约1.8重量%、或约1.6重量%；约1.6重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、约2.0重量%、或约1.8重量%；约1.8重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、约2.2重量%、或约2.0重量%；约2.0重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、约2.4重量%、或约2.2重量%；约2.2重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、约2.6重量%、或约2.4重量%；约2.4重量%至约3.0重量%、约2.8重量%、或约2.6重量%；约2.6重量%至约3.0重量%或约2.8重量%；或约2.8重量%至约3.0重量%。
核酸和载体
还提供了核酸(例如，载体)，其包括：启动子(例如，酵母、细菌或哺乳动物启动子)；编码信号序列的序列；编码乳蛋白质的序列(例如，本文所述的任何示例性序列)；和酵母终止序列，其中启动子可操作地连接至信号序列，所述信号序列可操作地连接至编码乳蛋白质的序列，且所述终止序列可操作地连接至编码乳蛋白质的序列。在这些核酸的一些实例中，所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。启动子的非限制性实例在本文中描述。可用于这些核酸中的另外启动子是本领域已知的。
本文所述的任何载体中的信号序列可以是来自编码的乳蛋白质或不同乳蛋白质的信号序列，或者是来自酵母交配因子(例如，任何α交配因子)的信号序列。在一些实例中，编码的乳蛋白质选自：β-酪蛋白(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)、κ-酪蛋白(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)、α -S1-酪蛋白(例如，本文所述的任何α-S1-酪蛋白蛋白质)、α-S2-酪蛋白(例如，本文所述的任何α-S2-酪蛋白蛋白质)、α-乳白蛋白(例如，本文所述的α-乳白蛋白蛋白质)、β-乳球蛋白(例如，本文所述的任何β-乳球蛋白蛋白质)、乳铁蛋白(例如，本文所述的任何乳铁蛋白蛋白质)或转铁蛋白(例如，本文所述的任何转铁蛋白蛋白质)。可用于本发明载体中的另外信号序列是本领域已知的。
本文所述的任何核酸还可包括细菌复制起点。本文所述的任何核酸还可包括选择标记物(例如，抗生素抗性基因)。细菌复制起点的序列是本领域已知的。抗生素抗性基因的非限制性实例在本文中描述。抗性基因的另外实例是本领域已知的。
终止序列的非限制性实例在本文中描述。终止序列的另外实例是本领域已知的。
本文提供的核酸的一些实施方案还包括：另外的启动子序列(例如，本文所述的任何示例性启动子)；编码信号序列(例如，本文所述的任何示例性信号序列)的另外的序列；编码另外的乳蛋白质(例如，编码本文所述的乳蛋白质的任何示例性序列)的序列；和另外的酵母终止序列(例如，本文所述的任何示例性酵母终止序列)，其中另外的启动子序列可操作地连接至编码信号序列的另外的序列，编码信号序列的序列可操作地连接至编码另外的乳蛋白质的序列，且编码另外的乳蛋白质的序列可操作地连接至另外酵母末端序列。另外的乳蛋白质可以是例如β-酪蛋白(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)、κ-酪蛋白(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)、α -S1-酪蛋白(例如，本文所述的任何α-S1-酪蛋白蛋白质)、α-S2-酪蛋白(例如，本文所述的任何α-S2-酪蛋白蛋白质)、α-乳白蛋白(例如，本文所述的α-乳白蛋白蛋白质)、β-乳球蛋白(例如，本文所述的任何β-乳球蛋白蛋白质)、乳铁蛋白(例如，本文所述的任何乳铁蛋白蛋白质)或转铁蛋白(例如，本文所述的任何转铁蛋白蛋白质)。在一些实施方案中，所述核酸包括编码β-酪蛋白的序列和编码κ-酪蛋白的序列。所述启动子和另外启动子可以相同或不同。酵母终止序列和另外的酵母终止序列可以相同或不同。信号序列和另外信号序列可以相同或不同。
本发明还包括含有编码酪蛋白或乳清多肽的分离的DNA序列的载体和包含所述载体的宿主细胞。所述载体还可包含分离的DNA序列，其包含编码酪蛋白的核苷酸序列(其中所述核苷酸序列可操作地连接至启动子)，编码α交配因子或其变体的核苷酸序列，编码细菌抗性标记物的核苷酸序列和转录终止子。一种或多种合适的启动子用于表达编码酪蛋白或乳清蛋白质的基因，其可以是在宿主细胞中有功能并且能够诱导由该基因编码的产物的表达的任何启动子。合适的启动子包括例如PLAC4-PBI、T7、Ptac、Pgal、λPL、λPR、bla、spa、Adh、CYC、TDH3、ADH1和CLB1。
将核酸引入细胞
将核酸(例如，本文所述的任何核酸)引入细胞以生成宿主细胞的方法是本领域公知的。可用于将核酸引入细胞的技术的非限制性实例包括：磷酸钙转染、树枝状大分子转染、脂质体转染(例如，阳离子脂质体转染)、阳离子聚合物转染、电穿孔、细胞挤压、超声处理、光学转染、原生质体融合、impalefection、水动力递送、基因枪、磁转染和病毒转导。
基于本领域用于将核酸引入细胞的某些技术对于不同类型的宿主细胞更有效的知识，本领域技术人员将能够选择用于将核酸引入细胞的一种或多种合适的技术。用于将核酸引入酵母细胞的示例性方法描述于Kawai等人, Bioeng.Bugs 1:395-403, 2010。
宿主细胞
本文还提供了包含本文所述的任何核酸(例如，载体)的宿主细胞。在一些实例中，本文所述的核酸稳定整合在宿主细胞的基因组(例如染色体)内。在其他实例中，本文所述的核酸并不稳定整合在宿主细胞的基因组内。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株或细菌菌株。在一些实施方案中，所述宿主细胞可以是例如选自以下的酵母菌株：克鲁维酵母属种、毕赤酵母属种、酵母属种、四膜虫属种、耶氏酵母属种、汉逊酵母属种、布氏菌属种(Blastobotrys sp.)、念珠菌属种、接合酵母属种和德巴利氏酵母属种。可用作宿主细胞的酵母菌株的另外非限制性实例是乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。可用作宿主细胞的另外酵母菌株种是本领域已知的。
在一些实例中，所述宿主细胞可以是原生动物，诸如例如嗜热四膜虫、hegewischi四膜虫、hyperangularis四膜虫、malaccensis四膜虫、色点四膜虫、梨形四膜虫和贪食四膜虫。
本发明的一个目标是通过在本文提供的任何宿主细胞中重组表达乳蛋白质组分来将其分离。
生产重组乳蛋白质的方法和制备胶束的方法
还提供了生产非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的重组乳蛋白质(例如，本文所述的任何一种或多种乳蛋白质)的方法，其包括：在足以允许分泌非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的乳蛋白质的条件下在培养基中培养本文所述的任何宿主细胞；和从培养基中收获非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的乳蛋白质。用于这些方法中的合适的培养基是本领域已知的。足以允许分泌乳蛋白质的培养条件也是本领域已知的。在这些方法中使用的宿主细胞可以是本文所述的任何宿主细胞。宿主细胞可以包括本文所述的任何核酸。产生的重组乳蛋白质可以是下列中的一种或多种：β-酪蛋白(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)、κ-酪蛋白(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)、α -S1-酪蛋白(例如，本文所述的任何α-S1-酪蛋白)、α-S2-酪蛋白(例如，本文所述的任何α-S2-酪蛋白)、α-乳白蛋白(例如，本文所述的任何α-乳白蛋白蛋白质)、β-乳球蛋白(例如，本文所述的任何β-乳球蛋白蛋白质)、乳铁蛋白(例如，本文所述的任何乳铁蛋白蛋白质)、转铁蛋白(例如，本文所述的任何转铁蛋白蛋白质)和血清白蛋白(例如，本文所述的任何血清白蛋白蛋白质)。这些方法中的一些还包括从培养基中分离(例如，纯化)重组乳蛋白质。从液体中分离(例如，纯化)重组乳蛋白质的方法是本领域公知的。用于分离(例如，纯化)重组乳蛋白质的示例性方法描述于Imafidon等人, Crit. Rev. Food Sci.Nutrition 37:663-669, 1997)。
还提供了生产包括非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)的胶束的方法，其包括：在足以允许从宿主细胞释放胶束的条件下在培养基中培养本文所述的任何宿主细胞，其中所述宿主细胞包含核酸，所述核酸包括编码β-酪蛋白的序列和编码κ-酪蛋白的序列；和从培养基中收获胶束。用于这些方法中的合适的培养基是本领域已知的。在这些方法中使用的宿主细胞可以是本文所述的任何宿主细胞。宿主细胞可以包括本文所述的任何核酸。产生的胶束可以是本文所述的任何胶束(并且可以具有本文所述的胶束的任何物理特征)。这些方法中的一些还包括从培养基中分离(例如，纯化)胶束。从液体中分离(例如，纯化)胶束的方法是本领域公知的(例如，超速离心)。
培养酵母宿主细胞的示例性详情描述于Idiris等人, Appl. Microbiol. Biotechnol. 86:403-417, 2010; Zhang等人, Biotechnol. Bioprocess. Eng. 5:275-287, 2000; Zhu, Biotechnol. Adv. 30:1158-1170, 2012; Li等人, MAbs 2:466-477,2010。
本发明的目的是表达一种或多种不同形式的酪蛋白，以应用于各种类型的乳制品替代产品。酪蛋白亚基诸如α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的差异在于一个或多个氨基酸变化。在某些实施方案中，所述方法和组合物包括掺入牛酪蛋白诸如α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。在其他实施方案中，所述方法和组合物包括掺入人酪蛋白诸如β-酪蛋白和κ-酪蛋白。参见美国专利号5,942,274。在替代实施方案中，所述酪蛋白选自一种或多种以下来源，包括但不限于：牛、人、水牛、骆驼、山羊、绵羊、马、海豚、鲸鱼、北美野山羊和猪。
还提供了用于生产乳蛋白质组分的方法，其可以包括例如使用如实施例1中所述的本发明的质粒或构建体。该方法包括制备感兴趣的质粒，将质粒插入适当的宿主细胞中，在使得感兴趣的蛋白质表达的合适时间和合适条件下培养宿主细胞，然后纯化蛋白质。
可以基于其分子量，例如通过尺寸排阻色谱法、通过膜进行超滤或密度离心，分离蛋白质。在一些实施方案中，可以基于其表面电荷，例如通过等电沉淀、阴离子交换色谱或阳离子交换色谱，分离蛋白质。也可以基于其溶解度，例如通过硫酸铵沉淀、等电沉淀、表面活性剂、洗涤剂或溶剂萃取，分离蛋白质。也可以通过它们与另一分子的亲和力，使用例如疏水相互作用色谱、活性染料或羟基磷灰石，分离蛋白质。亲和色谱还可以包括使用对蛋白质具有特异性结合亲和力的抗体，用于His标记的重组蛋白质的镍NTA，结合糖蛋白上的糖部分的凝集素，或特异性结合蛋白质的其他分子。
通常，在最佳pH下离心，得到纯化效率> 95％。天然酪蛋白和乳清蛋白的等电点是已知的。在本质上，牛α-s1-酪蛋白的pH为4.91，牛α-s2-酪蛋白的pH为4.1，牛β-酪蛋白的pH为4.5，牛κ-酪蛋白的pH为4.1，牛α-乳白蛋白的pH为4.2，且牛β-乳球蛋白的pH为5.2。重组产生的酪蛋白和乳清可以在其磷酸酯基团和糖基团方面不同。用于蛋白质纯化的其他方法包括膜过滤以除去任何潜在的细菌或污染物，随后冻干用于蛋白质分离。
优选地，所述方法和组合物提供在等于或低于$1,000/kg、$500/kg、$10/kg、$1.0/kg、$0.10/kg、$0.010/kg或$0.0010/kg乳蛋白质组分下有竞争力的生产成本。在更优选的实施方案中，所述成本低于 $0.009、$0.007、$0.006、$0.005/kg的乳蛋白质组分。
补充哺乳动物产生的乳的方法
本文还提供了补充哺乳动物产生的乳的方法，其包括：提供哺乳动物产生的乳或加工的哺乳动物产生的乳；和将以下中的至少一种混合至所述乳中：非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)；非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)；和包含非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)的胶束(例如，本文所述的任何胶束)。
可以将β-酪蛋白、κ-酪蛋白和胶束中的一种或多种混入乳中，以实现本文中称为“补充的乳组合物”的章节中描述的组合物中β-酪蛋白蛋白质、κ-酪蛋白蛋白质和胶束中任何示例性最终浓度。混合的方法是本领域公知的。如本领域技术人员可以理解，本文所述的另外组分也可以混入乳中(例如，本文所述的任何组分而不限于此)。
制备组合物的方法
还提供了生产组合物的方法，其包括：超声处理液体，所述液体包括包含β-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)和κ-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)的蛋白质混合物，或包括包含β-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何β-酪蛋白蛋白质)和κ-酪蛋白蛋白质(例如，本文所述的任何κ-酪蛋白蛋白质)的胶束；将灰分(例如，本文所述的任何灰分)混入液体中；向所述液体中加入一种或多种脂质(例如，本文所述的任何一种或多种液体)、一种或多种风味化合物(例如，本文所述的任何一种或多种风味化合物)和一种或多种颜色平衡剂(例如，本文所述的任何一种或多种颜色平衡剂)的混合物，并且超声处理液体；和向所述液体中加入一种或多种甜味剂(例如，本文所述的任何一种或多种甜味剂)，由此产生所述组合物。
在这些方法的一些实例中，所述β-酪蛋白蛋白质是非糖基化的或具有非哺乳动物糖基化模式，和/或κ-酪蛋白蛋白质是非糖基化的或具有非哺乳动物糖基化模式。在这些方法的一些实例中，所述灰分包括下列中的一种或多种：钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐和氯化物。在任何这些方法的一些实例中，添加的灰分包括CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠中的一种或多种(例如，两种或三种)。
在这些方法的一些实例中，所述一种或多种脂质包含以下中的至少一种(例如两种、三种、四种、五种、六种或七种)：向日葵油、椰子油、三丁酸甘油酯、单酸甘油酯和双酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂。在这些方法的一些实例中，所述游离脂肪酸包含至少一种选自以下的脂肪酸：丁酸、己酸、辛酸和癸酸。在这些方法的一些实例中，所述磷脂是大豆卵磷脂磷脂、向日葵卵磷脂磷脂、棉花卵磷脂磷脂或油菜籽卵磷脂磷脂。在这些方法的一些实施方案中，所述风味化合物包括至少一种(例如两种、三种、四种、五种或六种)选自以下的风味化合物：δ-癸内酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯和δ-十一内酯。
在这些方法的一些实例中，所述一种或多种颜色平衡剂是β-胡萝卜素或胭脂树橙。在这些方法的一些实施方案中，所述一种或多种甜味剂是糖(例如，葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、莫纳甜或塔格糖)或人造甜味剂(例如，甜叶菊、阿司帕坦、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜苷、布拉齐因、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、神秘果蛋白、莫纳甜、莫奈林、奥斯来丁、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、advantame、阿力甜、阿司帕坦-乙酰氨基磺酸盐、环己烷氨基磺酸钠、甘素、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜或P-4000)。
所得组合物的pH可以为约pH 6.2至约pH 7.4(例如，约6.2至约7.2；约6.2至约7.0、约6.2至约6.8、约6.2至约6.6、约6.2至约6.4、约6.4至约7.2、约6.4至约7.0、约6.4至约6.8、约6.4至约6.6、约6.6至约7.2、约6.6至约7.0、约6.6至约6.8、约6.8至约7.2、约6.8至约7.0、或约7.0至约7.2)。
在任何这些方法中，所述β-酪蛋白蛋白质可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-酪蛋白蛋白质；和/或所述κ-酪蛋白蛋白质可以是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象κ-酪蛋白蛋白质。
在这些方法的一些实施方案中，所述蛋白质混合物还包含一种或多种选自以下的蛋白质：α-乳白蛋白(例如，本文所述的任何α-乳白蛋白蛋白质)、β-乳球蛋白(例如，本文所述的任何β-乳球蛋白蛋白质)、α-S1-酪蛋白(例如，本文所述的任何α-S1-酪蛋白蛋白质)、α-S2-酪蛋白(例如，本文所述的任何α-S2-酪蛋白蛋白质)、乳铁蛋白(例如，本文所述的任何乳铁蛋白蛋白质)、转铁蛋白(例如，本文所述的任何转铁蛋白蛋白质)和血清白蛋白(例如，本文所述的任何血清白蛋白蛋白质)。
如本领域技术人员可以理解，可以计算在这些方法中使用的每种组分的量，以便产生本文所述的任何组合物。
制备黄油、奶酪、酪蛋白酸盐或酸奶的方法
本文还提供了制备黄油、奶酪、酪蛋白酸盐或酸奶的方法，其包括提供本文提供的任何组合物；和使用本文提供的任何组合物作为起始材料生产黄油、奶酪、酪蛋白酸盐或酸奶。
制备黄油、奶酪、酪蛋白酸盐或酸奶的方法是本领域公知的。参见例如Scott,Cheesemaking Practice, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY, 1998；美国专利号4,360,535(其描述制备奶油的方法)；U.S 285,878(其描述制备黄油的方法)。
试剂盒
还提供了试剂盒，其包括：(a)一种或多种乳蛋白质(例如，本文所述的任何乳蛋白质，包括本文所述的β-酪蛋白蛋白质、κ-酪蛋白蛋白质、α-S1-蛋白质、α-S2蛋白质、α-乳白蛋白蛋白质、β-乳球蛋白蛋白质、乳铁蛋白蛋白质、转铁蛋白质蛋白质和血清白蛋白蛋白质中的任何一种或多种)、一种或多种脂质(例如，本文所述的任何一种或多种脂质)和一种或风味化合物(例如，本文所述的任何一种或多种风味化合物)的混合物；和(b)灰分(例如，本文所述的任何灰分)和至少一种甜味剂(例如，本文所述的任何一种或多种甜味剂)的混合物。在这些试剂盒的一些实例中，所述一种或多种乳蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊(mountain goat)、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠(wallaby)、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈(mandrill)、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象乳蛋白质。
在这些试剂盒的一些实例中，所述一种或多种脂肪选自：向日葵油、椰子油、三丁酸甘油酯、单酸甘油酯和双酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂。所述试剂盒中存在的脂肪酸可以包括至少一种选自以下的脂肪酸：丁酸、己酸、辛酸和癸酸。所述试剂盒中的磷脂可以是大豆卵磷脂磷脂、向日葵卵磷脂磷脂、棉花卵磷脂磷脂或油菜籽卵磷脂磷脂。
所述试剂盒中的风味化合物可以包括至少一种选自以下的风味化合物：δ-癸内酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯和δ-十一内酯。
在所述试剂盒的一些实施方案中，(a)中的混合物还包括一种或多种颜色平衡剂(例如，本文所述的任何颜色平衡剂，例如β-胡萝卜素或胭脂树橙)。
在所述试剂盒的一些实例中，所述一种或多种甜味剂是糖(例如，葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、莫纳甜或塔格糖)或人造甜味剂(例如，甜叶菊、阿司帕坦、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜苷、布拉齐因、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、神秘果蛋白、莫纳甜、莫奈林、奥斯来丁、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、advantame、阿力甜、阿司帕坦-乙酰氨基磺酸盐、环己烷氨基磺酸钠、甘素、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜或P-4000)。
所述试剂盒可以包括灰分，其包括下列中的一种或多种：钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐和氯化物。在一些实例中，所述试剂盒中的灰分包括CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠中的一种或多种(例如，两种或三种)。
在所述试剂盒的一些实施方案中，(a)中的混合物提供在光密和气密的包装(例如，金属箔，例如铝箔)中，和/或(b)中的混合物提供在气密包装(例如，密封塑料袋)中。
所述试剂盒的一些实例还包括制备本文所述的任何组合物的说明书。
本文还提供了包含至少一种本文所述的核酸的试剂盒。
调节风味特征
感觉印象诸如“饲料样”、“乏味”或“不洁净”被描述为从牛摄入的食物和其周围的气味中吸收的风味描述。其他由于大量细菌生长而通过微生物作用发展。化学变化也可以通过酶作用、与金属(诸如铜)接触或暴露于阳光或强烈荧光而进行。质量控制主管不断努力避免乳和其他乳制品中的异味。因此，本发明的一个目的是减少、消除或甚至掩盖各种乳制品的不期望风味和气味。
在本发明的某些优选方面，改变脂肪含量可以改变各种乳制品替代产品的风味和气味。例如，增加丁酸含量可以将非乳制奶酪的风味特征改变成类似于帕尔马奶酪的风味特征。在其他实施方案中，调节三酸甘油酯诸如己酸、癸酸和/或辛酸导致类似于山羊奶酪的风味特征。因此，用脂肪酸组分的比率调节三酸甘油酯提供了不同的风味特征，其可以被微调以类似于各种所需乳制品的那些。
类似地，所述方法和组合物通过调节掺入乳制品替代产品中的各种三酸甘油酯来使一种或多种不期望的香气最小化。
在某些方面，通过以所需组合掺入与基于植物的油(例如向日葵油)组合的合成的短链三酸甘油酯来调节。例如，[C18 C18 C6]和[C18 C6 C18]的混合物提供与[C18 C4 C4]和[C18 C10 C10]的混合物不同的风味特征。
乳制品替代产品
可以使用本发明的方法和组合物制备各种各样乳制品替代产品。这样的产品包括但不限于乳、全乳、酪乳、脱脂乳、婴儿配方、炼乳、干乳、蒸乳、黄油、澄清黄油、奶油和各种类型的奶酪。
乳制品替代产品也可以作为乳制品的替代物掺入各种食品应用中，其包括以下冰淇淋、冷冻奶油冻、冷冻酸奶、饼干、蛋糕、白软干酪、奶油干酪、法式鲜奶油、凝乳和酸奶。
在某些方面，本发明提供了一种或多种选自α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的酪蛋白的亚基，其用于乳制品替代产品中的乳蛋白质组分。酪蛋白亚基的选择组合用作乳蛋白质组分的主要或至少一部分。在优选实施方案中，所述酪蛋白组合物包含以下量的酪蛋白亚基，使得约12-15g/L α-s1-酪蛋白、约3-4g/L α-s2-酪蛋白、约9-11g/L β-酪蛋白和约2-4g/L κ-酪蛋白代表合成乳制品中的总酪蛋白。
在各种实施方案中，以干重或总重计，所述酪蛋白组合物可以包含约0.5%、约1%、约1.5%、约2%、约2.5%、约3%、约3.5%、约4%、约4.5%、约5%、约6%蛋白质。在一些实施方案中，以干重或总重计，所述酪蛋白组合物可以包含约0.5-2.5%、约1-2%、约2-3%、或约4-10%酪蛋白蛋白质。在具体实施方案中，以干重或总重计，所述酪蛋白组合物可以包含约1.5-10％蛋白质。
在某些方面，乳制品替代产品的方法和组合物基本上不含一种或多种血清蛋白质。血清蛋白质通常包含酶、激素、生长因子、营养素转运蛋白和抗病因子等蛋白质。在另外实施方案中，乳制品替代产品的方法和组合物基本上不含一种或多种免疫球蛋白，其可诱导不期望的免疫应答。
在一些实施方案中，以干重或总重计，乳清组合物可以包含约0.001％、约0.05％、约0.1％、约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4%乳清蛋白质。在一些实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约0.1-1%、约1-2%、约2-3%、或约0.1-2.3%蛋白质。在具体实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约10-15％蛋白质。
在各种实施方案中，将碳水化合物掺入乳制品替代产品中。这些碳水化合物为产品的风味特征提供温和的甜味，并且还充当快速作用的能量和营养来源。碳水化合物包括但不限于糖诸如半乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖。不含乳制品的糖源包括但不限于甜菜和其他植物诸如芹菜、罗勒属植物、蜂蜜、樱桃、玉米、菠菜、李子、猕猴桃和豌豆。
乳糖不耐受是许多乳消费者常见的。因此，在优选的实施方案中，从乳制品替代组合物省略了碳水化合物诸如乳糖。在优选的实施方案中，乳制品替代组合物的方法和组合物基本上不含乳糖。
在一些实施方案中，以干重或总重计，所述碳水化合物组合物可以包含约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％碳水化合物。在一些实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约1-3％、约2-4％或约10-30％碳水化合物。在具体实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约2-5％碳水化合物。
灰分归因于酪蛋白胶束的结构和稳定性。灰分对于将作为乳或奶油的乳液保持在一起是非常重要的。存在于灰分中的钙和磷酸盐与脂肪球和酪蛋白胶束相互作用以保持乳化混合物。
所述灰分还影响感觉特征，诸如口感，稠度，和在一定程度上，乳的风味。
在一些实施方案中，以干重或总重计，所述灰分组合物可以包含约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％或约3％灰分。在一些实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约0.1-0.3％、约0.5-0.7％、约0.7-1％或约1-2％灰分。在具体实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约0.6-0.8％蛋白质。
各种不含动物成分的乳制品的另外成分包括维生素、调味剂、天然或人造甜味剂、着色剂、盐、pH调节剂、粘合剂、缓冲剂、稳定剂、必需氨基酸、抗结块剂、消泡剂和其混合物。
在一些实施方案中，以干重或总重计，剩余的成分组合物可以包含约0％、约0.01％、约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％或约5％添加剂。在一些实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约0.001-0.01％、约0.01-1％、约0.01-2％、或约1-5％添加剂。在具体实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约0-10％添加剂。
在一些方面，本发明提供具有脂肪的乳制品替代物的方法和组合物，其包含各种水平的三酸甘油酯含量。在优选的实施方案中，来自各种植物来源的分离的三酸甘油酯与乳蛋白组分、碳水化合物和灰分一起掺入。本发明的一个目的是调节在植物中分离并在乳品替代产品中酯交换的脂肪酸以类似于天然乳制品中发现的脂肪酸的百分比，和/或开发具有自然界中未发现的改善风味的新颖风味特征。在一些实施方案中，调节特异性短链-中链链脂肪酸包括但不限于丁酸、癸酸、辛酸、己酸和月桂酸，在乳制品替代产品中提供所需的风味特征。
在一些实施方案中，以干重或总重计，合成乳中的脂肪组合物包含约0％、约1％、约2％、约3％、约3.5％、约4％脂肪。在一些实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约1-2％、约2-3％、约3-4％脂肪。在具体实施方案中，以干重或总重计，所述组合物可以包含约3-4％脂肪。在替代实施方案中，奶油中的脂肪组合物可以包含约10％、约20％、约30％、约40％、约50％或甚至60％。优选地，奶油中的脂肪组合物通常为约40至约50％。
在一些方面，短链三酸甘油酯与较长的链油组合以产生酯交换的脂肪酸酯。优选地，所述较长链油选自：向日葵、玉米、橄榄、大豆、花生、胡桃、杏仁、芝麻、棉籽、卡诺拉、红花、亚麻籽、棕榈、棕榈仁、棕榈果、椰子、巴巴苏、乳木果油、芒果脂、可可脂、小麦胚芽和米糠油。更优选地，所述较长链油包含工程改造的向日葵品种，其将油酸过表达400％。
较长链油也可以提供风味特征，例如，减少或甚至去除鲜明并柔和所需最终产品的整体风味特征。
在一些实施方案中，乳制品替代品的脂肪组分包含酯交换为更长链油诸如高油酸向日葵油的选择三酸甘油酯(实施例2)。预期相同的四种短链脂肪酸可以给予乳和衍生产品诸如奶酪其特定的风味，诸如坚固性和丰富度。掺入三酸甘油酯和较长链油的各种组合以产生许多不同的风味特征。在一个实施方案中，具有三种油酸的三酸甘油酯和在这种情况下具有一种丁酸、一种己酸和一种辛酸合成的短链三酸甘油酯，产生所需的合成“乳脂肪”三酸甘油酯。另外的实施方案包括掺入各种短链三酸甘油酯以调节稍微不同的风味特征，例如包含己酸的短链三酸甘油酯；包含己酸和丁酸的短链三酸甘油酯；包含己酸和癸酸的短链三酸甘油酯。因此，方法和组合物提供合成的短链三酸甘油酯与向日葵油三酸甘油酯的各种组合，导致不同的风味特征。
合成乳
包含本发明的微生物衍生的蛋白质的合成乳制剂的示例性实施方案在实施例4中说明。例如，本发明的制剂掺入牛酪蛋白的所有四个亚基：α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白和两种乳清蛋白质α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作为制剂中主要的乳蛋白质组分。示例性合成乳制剂还包含如图1中所示的基于植物的酯交换脂肪。另外组分包括碳水化合物和灰分。所得乳替代产品表现出看起来、功能、味道、闻起来和感觉像天然乳的特征。作为本发明的关键方面之一，修改合成乳的制剂可以通过调节油含量、即加入以模仿不同风味的乳中的三酸甘油酯的类型来表现出不同的感官印象，诸如调味。
如Young W. Park, Bioactive Components in Milk and Dairy Products,Technology & Engineering, pp 60, 2009中所述，甾醇是乳中总脂质的一小部分，主要甾醇为胆固醇(300 mg/100 g脂肪，其等效于10 mg/100 mL牛乳)(Park等人, Small Rumin. Res. 68:88-113, 2007)。山羊乳已被显示含有比其他乳更少的胆固醇，但通常含有比牛乳更高的总脂肪。参见，Posati等人, 1976. Composition of Foods. Agric. Handbook No.8 - 1. ARS, USDA, Washington, D.C., 1976; Jenness, J. Dairy Sci. 63:1605 –1630, 1980;和Juarez等人, Intl. Dairy Fed. Bull. No. 202. pp. 54-67, 1986,已经显示山羊乳比牛具有更多棕榈酸和油酸级分。胆固醇含量在不同品种间显著变化，而山羊乳中的大多数胆固醇呈游离状态，其中酯形式中仅为少量52 mg/100 g脂肪。参见例如，Arora等人, Ind. J. Dairy Sci. 29: 191。
在某些实施方案中，本发明的方法和组合物通过调节油含量、即三酸甘油酯的类型来提供与乳制品相比具有较少胆固醇或不含胆固醇或具有相同胆固醇含量的合成乳制品。在其他实施方案中，与乳制乳相比，饱和和不饱和脂肪的量也在奶制品替代物中调节至至少更少或相同量的脂肪。在优选的实施方案中，本发明的合成乳制品的饱和脂肪非常低，但是闻起来和尝起来像乳制乳。在本发明的优选实施方案中，长链脂肪酸，通常是乳中的饱和脂肪酸，而不是单不饱和酸，诸如油酸。
本发明可能不需要或至少使巴氏杀菌最少化，因为在通过配制方法组合之前，可以分别使每种组分无菌。在本发明的其他实施方案中，本发明的合成乳制品可经历巴氏杀菌。
均质化对于本发明的方法和组合物是任选的，如同天然乳的情况。当作为独立液体饮料销售时，本发明的合成乳制品可以以均匀的形式销售。
本发明的乳替代物与乳制乳之间的差异包括风味、营养价值和储存稳定性。调味可以基于三酸甘油酯以及可赋予乏味度或清晰度或不同香味(诸如奶牛、山羊、椰子、杏仁或大豆)的其他天然或人造香料调节至所需的感官印象。
合成奶酪
在本发明的其他方面，提供了包含一种或多种分离的乳蛋白质组分、脂肪、碳水化合物和灰分的方法和组合物，以产生各种类型的奶酪产品。通常，所述奶酪由本发明的乳蛋白质组分制成。通过调节三酸甘油酯将一种或多种感官印象掺入奶酪产品中。因此，可以产生具有不同外观、香气、味道和质地的所需感官特征的乳酪。对于一些奶酪品种，除了调节三酸甘油酯之外，还在奶酪制作过程中使用一种或多种细菌用于发酵，其中产生发酵产物和副产物诸如乳酸、二氧化碳、醇类、醛类和酮类。奶酪的类型包括乳清干酪诸如意大利乳清干酪(ricotta)和马苏里拉奶酪(mozzarella)，半软乳酪包括哈瓦蒂干酪(havarti)和芒斯特芝士(munster)，中等硬奶酪诸如Swiss和Jarlsberg，硬奶酪诸如切达干酪(Cheddar)和软成熟干酪诸如布里干酪(Brie)和卡门伯特干酪(Camembert)。
合成奶油
直接可用的奶油替代物应优选包含约50至90重量％水，更优选约65至80重量％水，其中碱分散在水中。用于替代奶油的基料应有利地含有(使用基料的总重量作为100％计算的所有百分比)约22至87重量％碳水化合物(更优选约30至64％)，约12至70重量％的颗粒脂肪(最优选约28至60％)和约0.4至8重量％的所选乳化剂或其组群(最优选约1至4％)。
在优选的实施方案中，本发明的产品在水性乳液中是稳定的。如本文中所用，当满足以下最低标准时，干燥的含液体脂肪的非乳制食品被认为是“稳定的”：重新配制的乳液稳定性、增白能力、上油或油分离、羽化沉淀。参见美国专利号4,310,561。
合成黄油
商业黄油含有80-82％乳脂肪、16-17％水和1-2％除脂肪外的乳固体(有时称为凝乳)。
本文提供的乳制品替代产品或组合物的优点
本发明的所需优点是与常规乳制品相比环境性质的，诸如8倍能量效率，260倍水效率。其他环境优势包括比常规乳生产更少的用水量，其估计为约1000 L/L，和对于传统乳生产减少的土地使用量通常需要放牧，作物土地，每年减少从传统的乳生产中排放的6000亿kg二氧化碳的能力。本发明还提供饲料、操作、劳动、动物和销售的成本的减少或消除。优选地，基本上将饲料成本降低8倍。
食品安全的优点包括减少或去除抗生素残留物、重金属、细菌、掺杂物。因此，本发明的某些方面提供无细菌的不含动物成分的乳，不需要巴氏杀菌或冷运输，但具有延长的保存期限并且表现出许多特征，诸如味道、外观、处理和口感特性，其与其传统的乳制品对应物相同或至少非常类似。优选地，乳制品替代产品基本上不含细菌，诸如布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Camplyobacter)、利斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、耶尔森菌属(Yersinia)、贾第虫属(Giardia)和诺如病毒(noroviruses)，因此对于食用更安全。另外优点包括最少巴氏灭菌或没有巴氏灭菌和/或均质化。更优选地，乳制品替代物对于生产和分配持续相对长时段(例如，至少三周，优选较长的)是储存稳定的。甚至更优选地，乳制品替代产品具有较低的环境影响。
下面参考示例性应用来描述本发明的几个方面用于说明。应当理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的完全理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易地认识到，可以在没有一个或多个具体细节或具有其他方法的情况下实践本发明。
实施例
实施例1
载体
蛋白质序列牛α-S1酪蛋白(UniProt登录号P02662)、牛α-2酪蛋白(UniProt登录号P02663)、牛β-酪蛋白(UniProt登录号P02666)、牛κ-酪蛋白(UniProt登录号P02668)、牛α-乳白蛋白(UniProt登录号B6V3I5)和牛β-乳球蛋白(UniProt登录号P02754)在Uniprot.org上获得，并用以下变化改变：从N-末端去除15或21-残基信号肽；向DNA的5'末端加入XhoI(CTC GAG)核酸内切酶识别序列和KEX内肽酶识别序列(AAA AGA)；和向DNA的3'末端加入SalI (GTC GAC)核酸内切酶识别序列。通过以上示顺序组合四个酪蛋白的序列来制备另外的组合序列，用以下DNA段分离每个序列：
GGC TCA GGA TCA GGG TCG AAA AGA GGC TCA GGA TCA GGG TCG (SEQ ID NO:128)。
在这里，未加下划线的片段编码(GS)6接头序列用于足够的翻译后间隔和对KEX蛋白酶的可及性，并且加下划线的区段编码翻译后切开蛋白质的KEX内肽酶序列。如上，整个盒在5'末端侧接XhoI，且在3'末端侧接SalI，用于连接至pKLAC2 (New England Biolabs,Beverly, MA)中。DNA由Gen9, Inc. (Cambridge, MA)或IDT (Coralville, IA)合成。所使用的质粒尤其具有多克隆位点、Lac启动子、基于乙酰胺的报告基因和α-交配因子基因，其用作融合蛋白用于分泌外源蛋白质。
酵母转染
通过将0.5mL含有25％甘油的感受态细胞的管在冰上解冻并加入0.62mL酵母转染试剂来完成酵母的转染。然后将混合物在30℃下加热30分钟，在37℃下热休克1小时。然后将细胞以7000rpm沉淀并用1.0mL YPGal培养基洗涤两次。然后将细胞混合物转移至无菌培养管中，并在30℃下在300rpm恒速摇动下培育3小时。然后将细胞混合物转移至无菌的1.5mL微量离心管中，并以7000rpm将细胞沉淀2分钟，并重新悬浮于1mL无菌的1X PBS中。将10、50和100μL的细胞悬浮液置于分开的各自含有50μL无菌去离子水的新鲜无菌的1.5mL微量离心管中。将管短暂混合并铺展至含有用于选择的5mM乙酰胺的单独的酵母碳基琼脂(YCB琼脂)平板上。然后将平板在30℃下倒置培育4天，直至形成菌落。然后将15个单独的菌落划线至含有5mM乙酰胺的新鲜YCB琼脂平板上，并在30℃下培育2天。
内部设计编码α-乳白蛋白和β-乳球蛋白(两种主要乳白蛋白)的DNA，并从IDT预定合成，并根据供应商提供的方案转染入来自New England Biolabs试剂盒(目录号E1000S)的感受态乳酸克鲁维酵母细胞。
高通量转染子选择
从每个YCB琼脂平板，一旦菌落已足够生长，就测试30个平板中的每一个的载体质粒的成功整合。这随后进行每个平板的PCR分析，以测试具有多个载体整合体的特殊细胞。一旦分离，使用产量最高的个别培养物用于放大培养。该过程可以用连续更高浓度的选择压力迭代，以迫使菌落形成更高拷贝数的我们工程改造的质粒。
进行5次转染事件，并铺板在5个由无氮酵母碳基培养基组成的平板上。(因此，如果不摄取外源DNA本身，这些平板上任何观察到的生长都暗示质粒的成功摄取)。在这5个平板中，100％显示阳性生长。选择来自5个平板的30个单独的菌落用于放大培养，并且每个在单独的YCB琼脂平板上生长以产生纯合培养平板，以允许容易的表征和管理。3天生长期后，将来自每个平板的单个菌落最初加入含有2ml YPGal培养基的10ml玻璃培养管中，以测试蛋白质表达。在两天的生长期后，将细胞沉淀出来，并将上清液在SDS PAGE凝胶上运行以检查蛋白质表达。将提供最佳蛋白质表达的菌株放大培养至10ml、100ml、500ml和最终1L培养容器。使来自每种乳清蛋白的2升培养物生长。从总量中收集约1克蛋白质，表明0.5 g/L的非优化产率/生产率。
在1L摇瓶培养物中放大培养
将培养物放大培养并以至少1:10的分割比率接种在1L摇瓶中。在接种前，使接种烧瓶在没有乙酰胺补充的生产培养基中生长24小时。在分批补料生产运行的开始当天，将反应器装入目标起始体积的90％，并加热至运行温度。现在，将温度设置在30°C，以节省与加热反应器相关的能量成本。可以在工艺优化阶段中探索另外参数。当反应器达到30℃时，使用蠕动泵将接种烧瓶逐滴加入反应容器中。使用供应商提供的软件将反应器维持在目标pH。每天两次从反应器液体培养基取出样品，以定量细胞的葡萄糖和电解质使用量，且作为反应器的pH和溶解气体测量的双重检查。每次测量后，加入大剂量葡萄糖以维持目标葡萄糖浓度10％开始，尽管这在工艺开发中也可改变。当细胞达到最大密度时，通过加入半乳糖(这引发了我们的pKLAC2质粒上的启动子)来触发蛋白质产生。补充半乳糖，直到运行结束。最佳运行长度同样可以在工艺开发中确定，但设定为5天分批补料。完全运行后，从反应器移取酵母细胞，并如下所讨论纯化蛋白质。
酪蛋白蛋白质纯化
以下酪蛋白蛋白质α-s1酪蛋白、α-s2酪蛋白和β-酪蛋白是固有地疏水性的，当从酵母分泌并与水接触时，其沉淀出来。从反应器介质的纯化包括从培养基表面收集蛋白质，随后干燥以分离纯蛋白质。Κ-酪蛋白是固有地亲水性的，并且κ-酪蛋白的纯化包括溶液的pH变化为4.6，随后以10,000rcf离心。组合的酪蛋白盒以与κ-酪蛋白相同的方式作用。
乳清蛋白质纯化
α-乳白蛋白：α-乳白蛋白的等电点为4.2。当生物反应器介质溶液的pH降至4.2时，蛋白质的溶解度最低。这将蛋白质从溶液中敲出并允许通过离心收集。β-乳球蛋白：类似于α-乳白蛋白的纯化，溶液的pH降低至5.2，β-乳球蛋白的等电点。这中和蛋白质的电荷，并允许通过以14,000 rcf离心将其收集。
蛋白质纯化
将2L培养基在地板离心机中以3,000g离心以沉淀出酵母细胞。将沉淀弃去，并将上清液转移至新的容器中，对于α-乳白蛋白，将溶液的pH降低至4.2，且对于β-乳球蛋白，将溶液的pH降低至5.2(图2A)。这随后为将上清液在35℃下在摇瓶中培育30分钟，在地板离心机中以14,000g离心以沉淀出蛋白质混合物(图2B)。
蛋白质表征
通过离心分离蛋白质后，将固体沉淀和上清液溶液在14％ SDA-PAGE凝胶上运行以检查蛋白质的表达。在14kDa和18kDa处观察到阳性条带(图3)，其分别与牛来源的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的大小相关。进行进一步表征，以确定在初级序列、糖基化和磷酸化方面的等效性。
实施例2
三酸甘油酯合成
通过将短链三酸甘油酯酯交换至高油酸向日葵油(来自定制工程改造的向日葵变体(其表达如表1中所述的以下比率的脂肪酸酯)的油)来制备乳脂肪三酸甘油酯：
表1：
www.sunflowernsa.com/uploads/resources/51/warner_.pdf。
短链三酸甘油酯制备
主要负责乳和奶油中丰富风味的短链脂肪酸是具有4至10的偶数碳的分子，并如表2中所述以以下比率混合：
表2：
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2596709/pdf/FNR-52-1821.pdf。
表3：
链长 名称 混合物中的质量分数(％)
4 丁酸/丁酸 40
6 己酸/己酸 26
8 辛酸/辛酸 11
10 癸酸/癸酸 22
表3中的分数基于牛乳中这些物质的相对存在率，但可以在工艺开发期间进行改变，以便设计更好的品尝产品和设计其他物种诸如水牛或山羊的乳。将上示质量比的短链脂肪酸与甲苯、对甲苯磺酸和甘油在通常用于酯化反应的Dean-Stark分水器中组合，以除去在缩合反应中产生的水。反应在通风柜中进行数小时，直到观察到进入分水器的水位持续30分钟以上不变。使容器冷却并将混合物从反应烧瓶中取出。将混合物用5％碳酸钠溶液洗涤两次，并用纯水洗涤5次。定期添加盐水(10％NaCl水溶液)，以破坏在分液漏斗中形成的乳液。将短链三酸甘油酯、水、甲苯和杂质的洗涤混合物在旋转蒸发器中在90℃和54mbar气氛下干燥1小时，直到其过量进行得很好，以便最小化食物污染的机会。
酯交换
将短链三酸甘油酯混合物与高油酸向日葵油以1:8的体积比组合。加入等于油混合物质量的1％的质量的甲醇钠以催化酯交换反应，并将反应容器加热至65℃，在惰性氩气气氛下连续搅拌6小时。加入5％乙酸混合物以淬灭反应，然后将油用去离子水洗涤5次，并在旋转蒸发器中在> 90℃下干燥1小时。将成品乳脂肪高压灭菌以确保无菌性，并因此适用于如上所述的乳或奶油。
实施例3
乳制剂
一种非限制性乳组合物制剂描述如下。
表4：
组分 % (w/v)范围 量(g/L)
酪蛋白蛋白质 1 – 10 10 – 100
乳清蛋白质 0 – 1 0 – 10
基于植物的乳脂肪 0 – 8 0 – 80 ml/L
糖 0 – 5 0 – 50
灰分 0.1 – 1 1 – 10
钙 0.1 – 0.5 1 – L
X(功能添加剂) 0 - 1 0 – 10L
按照表4，每1升乳通过以下程序实现乳制剂。将26克酪蛋白、3.5克乳清和5克灰分组合并充分混合。将40mL三酸甘油酯解冻并加热至55℃。将蛋白质混合物缓慢倒入三酸甘油酯中并以高速涡旋5分钟。同时，将3.5克乳清和24克半乳糖加入850 mL去离子水中；将混合物加热至37℃。将三酸甘油酯/蛋白质/灰分混合物移入Waring商业搅拌机并以低速共混。将乳清/半乳糖/水混合物缓慢倒入混合器中；盖子置于搅拌器上。将混合物以高速共混十分钟。加入去离子水至1000 mL的最终体积。可以使用现有方法任选地均化乳。可以通过改变固体的比率来改变用于奶油或任意奶制剂的上述方案；然而，我们的初步研究表明，蛋白质混合物中灰分的存在和相当大比例的乳清的分离可以极大地影响乳液的质量。
实施例4
合成的乳制剂
作为初步的概念证据，为了确定是否可以重组乳的关键组分以形成乳，购买干燥食品级纯化酪蛋白和研究级乳清。爱尔兰奶油获自当地来源，并通过以14,000g离心奶油而从其中分离纯化的脂肪。最后，所有使用的矿物质均购自Sigma Aldrich。
术语：
C-油糊= 通过将酪蛋白蛋白质和脂肪混合在一起、同时将混合物的温度保持在37℃而制成的油糊。
W-油糊= 通过将乳清蛋白质和脂肪混合在一起、同时将混合物的温度保持在37℃而制成的油糊。
CW-油糊=通过首先将酪蛋白和乳清蛋白质一起混合在混合物中、加入脂肪并在37℃下混合而制备的油糊。
表 5：
实验 结果
酪蛋白+脂肪+水 淡黄色液体，味道不好，蛋白质沉淀，且口感不好(水样)。
酪蛋白+水+脂肪 淡黄色液体，味道不好，蛋白质沉淀，且口感不好(水样)。
(酪蛋白+脂肪)以制备油糊。油糊+水 淡黄色液体，味道平均，且口感不好(水样)。观察到低蛋白沉淀。
假设口感不好(例如，多水)是由于缺乏乳清蛋白。
表 6：
实验 结果
酪蛋白+乳清+脂肪+水 淡黄色-白色液体，味道不好，蛋白质沉淀，且口感不好。
C-油糊+乳清+水 淡黄色-白色液体，味道平均，低蛋白质沉淀，且口感不好
W-油糊+乳清+水 淡黄色-白色液体，味道平均，低蛋白质沉淀，且口感不好。
CW-油糊+水 淡黄色-白色液体，味道平均，且口感不好。零蛋白质沉淀。
假设口感不好是因为不期望的酪蛋白胶束形成，Ca的添加将允许胶束再次形成。
表 7：
实验 结果
CW-油糊+水+磷酸钙(通过试验和误差计算出Ca的最佳量) 白色液体，口感正常。零蛋白质沉淀。味道平均
为了改善味道，将不同浓度的不同糖加入上述混合物中。
表 8：
糖 2.4% 3.0% 3.6% 4.2% 4.8%
葡萄糖 良好 太甜 太甜 太甜 太甜
半乳糖 乏味 优异 平均 优异 太甜
蔗糖 不好 不好 不好 不好 不好
麦芽糖 乏味 优异 优异 太甜 太甜
掺入牛乳中发现的所有其他离子，以重新产生自然界中发现的离子环境。
参考文献：R. Rosmaninho, L.F. Melo / Journal of Food Engineering 73(2006) 379–387
表 9：
试剂 组成(mM)
KH2PO4 11.60
柠檬酸钾H2Oa 3.7
柠檬酸钠2H2O 6.1
K2SO4 1.03
K2CO3 2.17
KCL 8.0
CaCL2. 2H2O 8.98
最终结果是亮白色的液体，这可能是因为离子环境使乳中存在的固体保持在一起，并增加了溶液的总体折射率。味道是优异的，但是它具有平均的口感(例如，在液体中观察到一定量的垩白质)。如表9中所述的精确矿物组成可以提供优异的口感。
乳脂肪合成
通过将存在于高油酸向日葵油三酸甘油酯中的大链脂肪酸中的短链脂肪酸酯交换来制备合成的乳脂肪。使用的四条短链是：
40% C4：丁酸。发现于乳，特别是山羊、绵羊和水牛乳，黄油，帕尔马奶酪，且作为厌氧发酵的产物(包括结肠中且作为身体气味)。它具有令人不愉快的味道和刺激的味道，具有甜味的回味(类似于乙醚)。丁酸存在于人中，并且是人类呕吐物的主要特征气味。
26% C6：己酸。一种无色油状液体，具有脂肪样、奶酪样、蜡质和类似于山羊或其他农场动物的气味。
11% C8：辛酸。它是一种极少溶于水的油状液体，具有轻微令人不愉快的酸败样气味和味道。
22% C10: 癸酸。没有太多可提及的风味，而且碳链越长，你开始得到越少风味。这是在椰子油中，所以它不是本身和其他的一样多的乳脂肪风味。
迭代包括月桂酸(C12)，因为它以牛乳中总脂肪酸含量的2.9％存在(Beare-Rogers, J.; Dieffenbacher, A.; Holm, J.V. (2001). "Lexicon of lipid nutrition(IUPAC Technical Report)". Pure and Applied Chemistry 73 (4): 685–744. doi:10.1351/pac200173040685.)
在以下指定量的四分之一中按照如Yu等人, The modification an analysis ofvegetable oil for cheese making. J. Am. Oil Chem. Soc., 77:911 (2000)中所述的以下程序：
将与乳脂肪样品中所见相同的比率[参见上文]和总共7.26mol的丁酸、己酸、辛酸和癸酸(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、21.42g对甲苯磺酸(Sigma Chemical Co.)、2.305mol甘油(Sigma Chemical Co.)和458mL甲苯(Fisher Scientific)的混合物用Dean-Stark分水器回流6小时。当水不再滴入分水器中时，认为反应完成。将SCTG用5％碳酸钠溶液洗涤一次，并用水洗涤数次。然后，将SCTG在85℃下在旋转蒸发器中加热以除去水和甲苯。
来自商业和天然来源的SCTG与HOSO (Trisun 80, RBD; AC Humko, Memphis,TN)以1:8.82的SCTG/HOSO比率进行酯交换，以产生具有与乳脂肪相同百分比的SCFA的脂肪。来自商业来源的SCTG还以1:7.19的SCTG/HOSO比率进行酯交换，以产生具有等于乳脂肪中的120％的水平的SCFA的脂肪。以总油重量的0.5％使用甲醇钠(Aldrich ChemicalCompany, St. Louis, MO)作为催化剂。反应在65℃、氮气下搅拌进行6小时。接下来，加入5％乙酸(Fisher Scientific)以中和催化剂，然后将油用蒸馏水洗涤几次，并在旋转蒸发仪上在90℃下干燥30分钟。
类似于Smouse (Smouse, T.H., A Laboratory Continuous Deodorizer,inform 8:1176–1181 (1997).)描述的中试规模连续除臭剂用于将酯交换的油除臭。油流速为600 mL/h，柱温为180°C，压力为0.5托，且蒸汽速率为12.6 mL/h。品尝每批除臭油以确保风味。将除臭的油储存在4℃，直到用于制备奶酪。
实施例5
脂肪酸的调节
将具有三种油酸的向日葵油三酸甘油酯与作为合成乳产品的混合物中的脂肪组合物的一部分的含有一种丁酸、一种己酸和一种辛酸的四种短链脂肪酸进行酯交换。预期这种脂肪的阵列或组合导致合成的乳脂肪，与天然乳制品乳相比，其提供其丰富的味道。控制一种或多种三酸甘油酯的组成的能力可能增强或改变合成乳制品产品的风味特征。因此，长链和短链的矩阵(matrix)可以在风味特征中产生，包括但不限于与黄油味的、坚果味的、甜味的、酸味的、水果味的、花香味的、苦味的、木质味的、土味的、豆腥味的、辣味的、金属味的、甜味的、霉味的、油味的和醋味的感官印象相关的多种芳族化合物。此外，相对于相应的乳制品，可以显示出质地诸如乳脂度的增加，熔化特性或耐受性的提高以及拉伸能力的增加。
实施例6. 乳蛋白质的重组生产
在重组酵母菌株(毕赤酵母)菌株中生产α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。由于酵母中的糖基化酶与哺乳动物细胞不同，由酵母产生的蛋白质将是非葡萄糖基化的或具有非哺乳动物糖基化模式。产生的蛋白质可以用作本文所述的任何组合物中的组分。
质粒
构建质粒用于表达每种蛋白质。每种质粒包括以下组分：所表达的每种蛋白质的诱导型启动子(例如，AOX1启动子)或组成型(GAP启动子或PGK启动子)启动子；编码每种蛋白质的信号肽的序列，其源自天然牛蛋白质序列或来自酵母蛋白质序列(α交配因子或OST1)；编码待表达的乳蛋白质的序列；所表达的每种蛋白质的酵母转录终止子序列(例如，AOX1、AOD或CYC1)；来自pUC19的细菌复制起点，其使得能够在大肠杆菌中复制；和可选择标记物盒(例如，kanR或zeocinR)，其使得能够在细菌和酵母中用抗生素进行选择。
用于产生不同蛋白质的不同质粒列于下表10中。
表10. 表达质粒(SEQ ID NO)
1SEQ ID NO:159 (合成的)
然后将这些质粒整合到野生型巴斯德毕赤酵母中用于表达。通过SDS-PAGE、ELISA和蛋白质印迹检测蛋白质的产生。
α-乳白蛋白
菌株构建
产生三种质粒，将牛α-乳白蛋白(bvLAA)的表达置于甲醇诱导的启动子PAOX1的控制下，其具有天然LAA信号肽(pJAG-nat-LAA)、全长α交配因子信号肽(pJAG-aMF-LAA)或OST1信号肽(pJAG-OST-LAA)。
在转化前，通过用限制酶SacI消化将20μg每种质粒线性化。然后通过乙醇沉淀浓缩消化的质粒，并重新悬浮于10μl蒸馏水中。
如下制备感受态巴斯德毕赤酵母细胞：使巴斯德毕赤酵母的培养物在YPD培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)中生长至对数期(OD600 ~1.0)。通过离心收集1.5mL等分试样，然后重新悬浮于1mL的YPD+20 mM HEPES (pH 8):1M乙酸锂的1:1混合物中。加入10μL 1M二硫苏糖醇后，将细胞在振荡器中以300 rpm在30℃下培育15分钟。通过离心沉淀细胞，并在1mL冰冷的1M山梨醇中洗涤三次。最终洗涤后，将细胞重新悬浮于50μL1M山梨醇中。
将细胞与线性化质粒DNA在冷却的2mm电穿孔小槽中组合，并进行1.5kV脉冲(25μF，200Ω)。将细胞转移到具有200μL冷1:1 YPD:1 M山梨糖醇的培养管中，并使其在30℃(300rpm)下恢复2小时。最后，将细胞铺板在含有博莱霉素的YPD琼脂平板上，并在30℃下生长两天。
蛋白质表达
从琼脂平板挑取菌落，并在750 µL BMD1% (0.2M磷酸钾缓冲液、13.4g/L酵母氮源、0.4mg/ml生物素、1.1％葡萄糖)中在30℃、300rpm下生长。48小时后，使用900μL培养物来接种750 µL BMM2(0.2M磷酸钾缓冲液、13.4g/L酵母氮源、0.4 mg/ml生物素、1％甲醇)。24小时后，150 µL BMM10 (BMM10:0.2M磷酸钾缓冲液、13.4g/L酵母氮源、0.4 mg/ml生物素、5％甲醇)，并在再一天后收获样品用于分析。
分析
在离心以除去细胞团的培养物的样品中分析蛋白质表达。然后通过SDS-PAGE、ELISA和蛋白质印迹来评估澄清的上清液。
为了经由SDS-PAGE显现总蛋白，将无细胞上清液用SDS-PAGE样品缓冲液处理，煮沸，并在10％聚丙烯酰胺凝胶上运行。凝胶用SYPRO Ruby染料(Life Technologies)染色。所得凝胶显示使用OST1或天然乳白蛋白信号肽发生α-乳白蛋白的分泌(图4)。
为了经由ELISA测量蛋白质滴度，将25μL每种样品置于半区域96孔微量滴定板中，并使其在4℃下结合过夜。除去样品后，通过用溶解在Tris缓冲盐水(50 mM Tris, pH 7.6,150 mM NaCl)中的1% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)填充每个孔并在室温下培育1小时来封闭结合表面。然后将样品在1% BSA/TBS + 0.1% (v/v) Tween-20中稀释的一抗中培育1.5小时。在TBS + Tween中三次洗涤后，将样品和与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗培育另外一小时。在TBS + Tween中三次最终洗涤后，加入显色底物(TMB单一溶液, LifeTechnologies)，并测量650nm处的吸光度。所得数据显示，使用天然α-乳白蛋白信号肽或OST1信号肽分泌α-乳白蛋白(图5)。
为了经由蛋白质印迹分析样品，将一个体积的样品与等体积的SDS-PAGE样品缓冲液组合并在10％聚丙烯酰胺凝胶上运行。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，其通过用1%BSA/TBS处理来封闭1小时。在用1% BSA/TBS+Tween中稀释的一抗培育1.5小时后，将印迹在TBS+Tween中洗涤三次。然后将印迹和与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗培育另外一小时。在TBS + Tween中三次最终洗涤后，加入显色底物(1步Ultra TMB印迹溶液, ThermoFisher)。染色完成后，将印迹在蒸馏水中洗涤。
β-乳球蛋白
菌株构建
组装三个质粒，将牛β-乳球蛋白(bvLGB)的表达置于甲醇诱导的启动子(pLH37中的PAOX1)或两种组成型启动子之一(pLH44中的PGAP或pLH45中的PPGK)的控制下。
在转化前，通过用限制酶SacI消化将20 µg pLH37线性化。将相同量的pLH44和pLH45用酶ApaLI线性化。然后通过乙醇沉淀浓缩消化的质粒，并重新悬浮于10μl蒸馏水中。
如下制备感受态巴斯德毕赤酵母细胞：使巴斯德毕赤酵母的培养物在YPD培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)中生长至对数期(OD600 ~1.0)。通过离心收集1.5mL等分试样，然后重新悬浮于1mL的YPD+20 mM HEPES (pH 8):1M乙酸锂的1:1混合物中。加入10μL 1M二硫苏糖醇后，将细胞在振荡器中以300 rpm在30℃下培育15分钟。通过离心沉淀细胞，并在1mL冰冷的1M山梨醇中洗涤三次。最终洗涤后，将细胞重新悬浮于50μL1M山梨醇中。
将细胞与线性化质粒DNA在冷却的2mm电穿孔小槽中组合，并进行1.5kV脉冲(25μF，200Ω)。将细胞转移到具有200μL冷1:1 YPD:1 M山梨糖醇的培养管中，并使其在30℃(300rpm)下恢复2小时。最后，将细胞铺板在含有博莱霉素的YPD琼脂平板上，并在30℃下生长两天。
蛋白质表达
为了评估用含有甲醇诱导型启动子的质粒(pLH37)转化的克隆中的表达，将各克隆在750 µL BMD1% (0.2M磷酸钾缓冲液、13.4g/L酵母氮源、0.4mg/ml生物素、1.1％葡萄糖)中在30℃、300rpm下生长。48小时后，使用900μL培养物来接种750 µL BMM2(0.2M磷酸钾缓冲液、13.4g/L酵母氮源、0.4 mg/ml生物素、1％甲醇)。24小时后，150 µL BMM10 (BMM10:0.2M磷酸钾缓冲液、13.4g/L酵母氮源、0.4 mg/ml生物素、5％甲醇)，并在再一天后收获样品用于分析。
为了评估用支持组成型表达的质粒(pLH44或pLH45)转化的克隆中的表达，将各克隆在PG培养基(20g/L蛋白胨、2％甘油)中在30℃下在300rpm摇动下生长过夜。将培养物在最小硫酸盐培养基中1:10稀释：
葡萄糖 20 g/L
氯化钙(CaCl2) 1 g/L
磷酸钠(Na2PO4) 24 g/L
硫酸钾(K2SO4) 18.2 g/L
硫酸镁(MgSO4-7H2O) 14.9 g/L
硫酸铵(NH4)2SO4 9 g/L
EDTA(乙二胺四乙酸) 65.25mg/L
FeSO4-7H2O (硫酸铁七水合物)12.18 g/L
ZnSO4-7H2O (硫酸锌七水合物) 25.0125 g/L
CaCl2-2H2O(氯化钙二水合物)12.615 g/L
CuSO4-5H2O (硫酸铜五水合物) 2.175 g/L
NaMoO4-2H2O (钼酸钠二水合物) 2.088 g/L
CoCl2-6H2O (氯化钴六水合物) 2.0445 g/L
MnCl2-4H2O (氯化锰四水合物) 1.392 g/L
生物素 0.2175 g/L
48小时后，收集样品用于分析。
分析
在离心以除去细胞团的培养物的样品中分析蛋白质表达。然后通过ELISA和蛋白质印迹来评估澄清的上清液。
为了经由ELISA测量蛋白质滴度，将25μL每种样品置于半区域96孔微量滴定板中，并使其在4℃下结合过夜。除去样品后，通过用溶解在Tris缓冲盐水(50 mM Tris, pH 7.6,150 mM NaCl)中的1% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)填充每个孔并在室温下培育1小时来封闭结合表面。然后将样品在1% BSA/TBS + 0.1% (v/v) Tween-20中稀释的一抗中培育1.5小时。在TBS + Tween中三次洗涤后，将样品和与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗培育另外一小时。在TBS + Tween中三次最终洗涤后，加入显色底物(TMB单一溶液, LifeTechnologies)，并测量650nm处的吸光度。所得数据显示β-乳球蛋白的分泌(图6)。
为了经由蛋白质印迹分析样品，将一个体积的样品与等体积的SDS-PAGE样品缓冲液组合并在10％聚丙烯酰胺凝胶上运行。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，其通过用1%BSA/TBS处理来封闭1小时。在用1% BSA/TBS+Tween中稀释的一抗培育1.5小时后，将印迹在TBS+Tween中洗涤三次。然后将印迹和与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗培育另外一小时。在TBS + Tween中三次最终洗涤后，加入显色底物(1步Ultra TMB印迹溶液, ThermoFisher)。染色完成后，将印迹在蒸馏水中洗涤。所得蛋白质印迹显示β-乳球蛋白从重组酵母分泌(图7)。
牛酪蛋白
构建了双重表达质粒，以支持一种质粒中α-S1-酪蛋白与β-酪蛋白的表达，以及另一种质粒中α-S2-酪蛋白与κ-酪蛋白的表达。选择这些配对，因为流体乳中α-S1：α-S2：β：κ的摩尔比为约5.5：1.5：4.0：1.5；因此希望具有类似拷贝数的α-S1-酪蛋白和β-酪蛋白，以及类似拷贝数的α-S2-酪蛋白和κ-酪蛋白。
将β-酪蛋白和α-S2-酪蛋白置于其各自质粒中的组成型PGAP启动子的控制下，而将α-S1-酪蛋白和κ-酪蛋白置于组成型PPGK启动子的控制下。
为了将蛋白质导入分泌途径，表达具有其天然信号肽(pLH46和pLH47)或OST1信号肽(pLH48和pLH49)的蛋白质。此外，制备质粒，其中表达一种具有其天然信号肽的蛋白质，而表达另一种具有OST1信号肽的蛋白质：
pLH0050 OST1-β，天然-α-S1
pLH0051 天然-β, OST1-α-S1
pLH0054 OST1-α-S2，天然-κ
pLH0055 天然-α-S2, OST1-κ。
为了产生表达所有四种酪蛋白的菌株，首先用编码β-酪蛋白和α-S1-酪蛋白的质粒转化酵母细胞。在转化前，用酶ApaLI将20μg每种质粒线性化。然后通过乙醇沉淀浓缩消化的质粒，并重新悬浮于10μl蒸馏水中。
如下制备感受态巴斯德毕赤酵母细胞：使巴斯德毕赤酵母的培养物在YPD培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)中生长至对数期(OD600 ~1.0)。通过离心收集1.5mL等分试样，然后重新悬浮于1mL的YPD+20 mM HEPES (pH 8):1M乙酸锂的1:1混合物中。加入10μL 1M二硫苏糖醇后，将细胞在振荡器中以300 rpm在30℃下培育15分钟。通过离心沉淀细胞，并在1mL冰冷的1M山梨醇中洗涤三次。最终洗涤后，将细胞重新悬浮于50μL1M山梨醇中。
将细胞与线性化质粒DNA在冷却的2mm电穿孔小槽中组合，并进行1.5kV脉冲(25μF，200Ω)。将细胞转移到具有200μL冷1:1 YPD:1 M山梨糖醇的培养管中，并使其在30℃(300rpm)下恢复2小时。最后，将细胞铺板在含有博莱霉素的PG琼脂(20g/L蛋白胨，2% (v/v)甘油，2％琼脂)平板上，并在30℃下生长两天。
然后使来自β+αS1平板的六个克隆在培养物中生长，并使用上述程序使其能够进行DNA摄取。然后将它们用线性化的αS2+κ质粒转化，并在含有G418的PG平板上在30℃下生长两天。
表达
为了评估牛酪蛋白蛋白质的生产，将表达酪蛋白的5个克隆和野生型酵母阴性对照在PG培养基(20g/L蛋白胨、2％甘油)中在30℃下在300rpm摇动下生长过夜。所有五种酪蛋白表达克隆都表达具有相应的天然酪蛋白信号肽的α2和κ-酪蛋白。克隆sLH115、116、117和118表达具有各自天然信号肽的β-酪蛋白和α-S1-酪蛋白；克隆sLH122表达具有OST1信号肽的β-酪蛋白和α-S1-酪蛋白。将培养物在最小硫酸盐培养基中1:10稀释：
葡萄糖 20 g/L
氯化钙(CaCl2) 1 g/L
磷酸钠(Na2PO4) 24 g/L
硫酸钾(K2SO4) 18.2 g/L
硫酸镁(MgSO4-7H2O) 14.9 g/L
硫酸铵(NH4)2SO4 9 g/L
EDTA(乙二胺四乙酸) 65.25mg/L
FeSO4-7H2O (硫酸铁七水合物)12.18 g/L
ZnSO4-7H2O (硫酸锌七水合物) 25.0125 g/L
CaCl2-2H2O(氯化钙二水合物)12.615 g/L
CuSO4-5H2O (硫酸铜五水合物) 2.175 g/L
NaMoO4-2H2O (钼酸钠二水合物) 2.088 g/L
CoCl2-6H2O (氯化钴六水合物) 2.0445 g/L
MnCl2-4H2O (氯化锰四水合物) 1.392 g/L
生物素 0.2175 g/L
48小时后，收集样品用于分析。
分析
在离心以除去细胞团的培养物的样品中分析蛋白质表达。然后通过ELISA和蛋白质印迹来评估澄清的上清液。
为了经由ELISA测量蛋白质滴度，将25μL每种样品置于半区域96孔微量滴定板中，并使其在4℃下结合过夜。除去样品后，通过用溶解在Tris缓冲盐水(50 mM Tris, pH 7.6,150 mM NaCl)中的1% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)填充每个孔并在室温下培育1小时来封闭结合表面。然后将样品在1% BSA/TBS + 0.1% (v/v) Tween-20中稀释的一抗中培育1.5小时。在TBS + Tween中三次洗涤后，将样品和与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗培育另外一小时。在TBS + Tween中三次最终洗涤后，加入显色底物(TMB单一溶液, LifeTechnologies)，并测量650nm处的吸光度。ELISA数据显示不同的酵母菌株可以将α-S1酪蛋白和β-酪蛋白分泌到培养基中(图8)。
为了经由蛋白质印迹分析样品，将一个体积的样品与等体积的SDS-PAGE样品缓冲液组合并在10％聚丙烯酰胺凝胶上运行。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，其通过用1%BSA/TBS处理来封闭1小时。在用1% BSA/TBS+Tween中稀释的一抗培育1.5小时后，将印迹在TBS+Tween中洗涤三次。然后将印迹和与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗培育另外一小时。在TBS + Tween中三次最终洗涤后，加入显色底物(1步Ultra TMB印迹溶液, ThermoFisher)。染色完成后，将印迹在蒸馏水中洗涤。
本实施例中的数据显示，本文所述的不同表达载体可用于生成分泌不同乳蛋白的转基因酵母菌株。
实施例7. 制备组合物的方法
使用下述具体方法生成本文所述的示例性组合物。该方法的示意图显示于图9中。
为了制备奶制品，采用实验室设备诸如混合器、搅拌板和超声仪。对于大规模生产，应使用标准流体乳加工设备。
如图9所示，有三种主要组分用于该制备组合物的方法。这些步骤包括：
A.蛋白质溶液的制备
B.油混合物的制备
C.乳固体的重构。
在步骤A中，将粉末状胶束酪蛋白和乳清蛋白混合并共混(步骤1)，随后与去离子(DI)水混合(步骤2)以获得蛋白质溶液1。通常，这在该溶液中含有2.8％粉末状胶束酪蛋白、0.7 ％粉末状乳清蛋白和85.5％水。覆盖混合容器以防止水分蒸发。该混合在足够的时间段(约30分钟)内由混合器、搅拌板或超声仪进行。该混合时间确保所有蛋白质都分散在水中。混合速度已经被优化为中等，其提供足够的力来分散蛋白质并避免空气在溶液中的捕获。水含量可根据其他成分的用量进行调整。
在步骤3中，CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠在水中的分离溶液是用于制备与天然牛乳类似的矿物质特征的矿物质来源。在典型的情况下，CaCl2溶液浓度为0.1 g/mL，KH2PO4为0.27g/mL，而柠檬酸钠溶液为0.21 g/ml柠檬酸钠。用于制备KH2PO4与柠檬酸钠溶液的水通常是温热的，以确保KH2PO4的完全溶解。在蛋白质溶液1的混合期间，缓慢加入0.015% CaCl2(步骤4)。使用的CaCl2溶液的体积根据所需的CaCl2的重量百分数进行调整。混合持续约30分钟，以使蛋白质与Ca2+离子完全相互作用。随后，将0.27% KH2PO4和0.21％柠檬酸钠分为5份，并将各部分以5至10分钟的间隔时间缓慢加入混合溶液(步骤5)。将0.085% CaCl2分为4份，并将各部分以4-10分钟的间隔时间缓慢加入混合溶液(步骤6)。混合持续至少30分钟，优选1-2小时，以获得蛋白质溶液2。
在方法B中，低速混合足以实现不同油成分的均匀混合。以下用于制备油混合物1的每种组分的百分比基于总油混合物1重量。最初，将65％向日葵油、29％椰子油和2％三丁酸甘油酯混合在一起以形成油基料(步骤7)。将向日葵油和椰子油除臭以防止不想要的气味。向日葵油、椰子油和三丁酸甘油酯的组合可以模仿与天然乳类似的脂肪酸特征。油基成分及其含量可根据不同需要进行调整(不同类型的产品)。通过在向日葵油中混合不同香气组分来制备香气混合物(步骤8)。用于模拟香气的化合物含有、但不限于丁酸乙酯、δ-癸内酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯、δ-十一内酯、乙偶姻、糠醇、糠醛、2-甲基糠醛和2-甲基吡嗪。其含量可以通过不同的应用和偏好进行调整。加入2.5％单酸甘油酯和二酸甘油酯、0.6％游离脂肪酸、0.5％磷脂和0.4％芳香混合物以混合制备油混合物1(步骤9)。在典型的情况下，游离脂肪酸含有0.15％丁酸和0.45％己酸。大豆卵磷脂用作磷脂来源。大豆卵磷脂容易获得并且便宜。在向日葵油中以0.5 mg/g的浓度制备β-胡萝卜素溶液(步骤10)。将4％的油混合物1和0.06％的β-胡萝卜素溶液混合在一起，以获得油混合物2(步骤11)。调整β-胡萝卜素的用量以实现所述乳的不同颜色水平。油混合物1的用量也可以根据不同的乳制品应用进行调整。
在方法C中，将油混合物2缓慢加入蛋白质溶液2中并充分混合以制备产物混合物1(步骤12)。混合可以通过混合器或超声仪进行。在典型的情况下，将油混合物2和蛋白质溶液2在中等至高速度下混合以确保油均匀地分散在水溶液中。随后，应用超声处理以将油球分解成更小的尺寸，这导致其在溶液中的稳定性的增加。在混合期间必需防止溶液中捕获气泡。使用至少20分钟的混合时间将油混合物2搅拌到水溶液中并允许彻底分散。将4％麦芽糖溶液加入产物混合物1中，并连续混合另外30分钟，以得到产物混合物2(步骤13)。根据不同的应用，甜度可以通过糖含量进行调整。糖的来源也可以根据要求进行调整。可能需要另外的DI水以使最终总重量达到100％。
在该过程中不包括强化均质化、巴氏消毒和灭菌。然而，对于放大培养生产，有必要应用这些步骤来在方法C中制备产品混合物。
使用的设备
混合器：IKA-Labortechnik RW16 Basic，速度水平(4-6)
尖端超声仪：Qsonica型号CL-188，幅度70%
水浴超声波仪：Bransonic型号1510R-MT。
实施例8. 示例制剂
具有与全乳、奶油、高蛋白质乳、无脂乳和无糖乳类似的味道和质地特征的示例制剂组合物在下表11-15中提供。
如本领域可以理解，通过对实施例7中所述的方法进行必要的修改来制备表11-15中列出的组合物。
表11. 组合物样全乳。
表12. 组合物样奶油
表13. 组合物样富含蛋白质的乳。
表14. 组合物样无脂乳
表15. 组合物样无糖乳。
实施例9. 示例性组合物
通过目前描述的方法制备的示例性组合物显示在图10中。图10中的组合物具有与哺乳动物产生的乳类似的外观(颜色)、粘度、起泡性、风味和营养价值。图10中所示的组合物包含哺乳动物来源的蛋白质。
序列表
<110> Pandya, Ryan
Gandhi, Perumal
<120> 乳制品替代食物及制造方法
<130> 42233-0002WO1
<150> 62/040,393
<151> 2014-08-21
<160> 159
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
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Arg Ala Ala Val Pro Ile Asn Asn Pro Tyr Leu Ile Tyr Leu Tyr Pro
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Glu Asn Glu Glu Arg Leu Phe His Gln Val Thr Ala Pro Tyr Ile Pro
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Val His Tyr Val Met Asn Arg Tyr Pro Gln Tyr Glu Pro Ser Tyr Tyr
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Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys
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Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln Ser Leu Thr Leu Thr Asp
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Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gln Ser Trp Met His
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Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gln Ser
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Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala
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Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu Leu Tyr
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<213> 智人
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<212> PRT
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<221> 变体
<222> (0)...(0)
<223> 血清白蛋白
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Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala
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Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
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Leu Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gln Glu Cys Cys
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Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala
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Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Val Glu Val Thr Lys
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Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp
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aattagtgaa ggagctaact gagtttgcaa aaacatgtgt tgctgatgag tcacatgccg 300
gttgtgataa gtcacttcac actctctttg gagatgaatt gtgtaaagtt gcaacccttc 360
gcgaaaccta tggtgacatg gccgactgct gtgagaaaca agagcctgaa agaaatgaat 420
gcttcctgaa tcacaaagat gatagcccag acctccctaa actgaaacca gagcccgata 480
ctttgtgtgc cgagtttaag gcagatgaaa agaagttttg gggaaaatac ctatacgaag 540
ttgccagaag acatccctac ttttatgcac cagaactcct ttactatgct aataaatata 600
atggagtttt tcaagaatgc tgccaagctg aagataaagg tgcctgccta ctaccaaaga 660
ttgacgctat gagagaaaaa gtactggctt catctgccag acagagactc aggtgtgcca 720
gtattcaaaa attcggagaa agagctttaa aagcatggtc agtagctcgc ctgagccaga 780
aatttcccaa ggctgacttt acagatgtta ccaagatagt gacagatctc actaaggtcc 840
acaaggagtg ttgccatggt gacctgcttg aatgcgcaga cgacagggca gatcttgcca 900
agtacatatg tgatcatcaa gacgcactct ccagtaaact gaaggaatgc tgtgataagc 960
ctgtgttgga aaaatcccac tgcattgctg aggtagataa agatgccgtg cctgaaaacc 1020
tgcccccatt aactgctgac tttgctgaag ataaggaggt ttgcaaaaac tatcaggaag 1080
caaaagacgt cttcctgggc tcgtttttgt atgaatattc aagaaggcat cctgagtatg 1140
ctgtctcagt gctattgaga cttgccaagg aatatgaagc cacactggag gactgctgtg 1200
ccaaagaaga tccacatgcc tgctatgcca cagtgtttga caaacttaag catcttgtgg 1260
atgagcctca gaatttaatc aaaaaaaact gtgagctatt cgaaaaacat ggagagtatg 1320
gattccaaaa tgcgctcata gttcgttaca ccaggaaagc accccaagtg tcaactccaa 1380
ctctggtgga gatttcaaga agcctaggaa aagtgggcac taagtgttgt gcaaagcctg 1440
aatcagaaag aatgccctgt accgaagact atctgagctt gatcctgaac cggttgtgcg 1500
tgttgcatga gaagacacca gtgagtgaaa aagtcaccaa gtgctgcacg gagtcattgg 1560
tgaacagacg gccatgtttc tctgatctga cacttgacga aacatatgta cccaaaccct 1620
tcgatgagaa atttttcacc ttccatgcag atatatgcac acttcctgat actgagaaac 1680
aaatcaagaa acaaactgca cttgttgagc tgttgaaaca caagcccaag gcaacagatg 1740
aacaactgaa aaccgttatg gagaattttg tggcttttgt agacaagtgc tgtgcagctg 1800
atgacaaaga aggctgcttt gttctggagg gtccaaaact tgttgcttca actcaagcag 1860
ccttagccta aacacgacac aaccacaagc atctcagcct accctgagag tgagacgaaa 1920
aaagagaaat gaaaactcag agcttattca tctgttcttc ttttcgggtg ttggtgttaa 1980
acctacaccc tctctaaaga acataaattt ctttaaatat tttgcttctt ttgtttgtgc 2040
tacaattaat aaaaaatgaa aagactctaa aaaaaaaaaa aaggaattc 2089
<210> 128
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 128
Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly
20 25 30
Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr Cys Gly
35 40
<210> 129
<211> 943
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AOX1启动子
<400> 129
aacatccaaa gacgaaaggt tgaatgaaac ctttttgcca tccgacatcc acaggtccat 60
tctcacacat aagtgccaaa cgcaacagga ggggatacac tagcagcaga ccgttgcaaa 120
cgcaggacct ccactcctct tctcctcaac acccactttt gccatcgaaa aaccagccca 180
gttattgggc ttgattggag ctcgctcatt ccaattcctt ctattaggct actaacacca 240
tgactttatt agcctgtcta tcctggcccc cctggcgagg ttcatgtttg tttatttccg 300
aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac atcactccag atgagggctt tctgagtgtg 360
gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg cccaaaactg acagtttaaa cgctgtcttg 420
gaacctaata tgacaaaagc gtgatctcat ccaagatgaa ctaagtttgg ttcgttgaaa 480
tgctaacggc cagttggtca aaaagaaact tccaaaagtc ggcataccgt ttgtcttgtt 540
tggtattgat tgacgaatgc tcaaaaataa tctcattaat gcttagcgca gtctctctat 600
cgcttctgaa ccccggtgca cctgtgccga aacgcaaatg gggaaacacc cgctttttgg 660
atgattatgc attgtctcca cattgtatgc ttccaagatt ctggtgggaa tactgctgat 720
agcctaacgt tcatgatcaa aatttaactg ttctaacccc tacttgacag caatatataa 780
acagaaggaa gctgccctgt cttaaacctt tttttttatc atcattatta gcttactttc 840
ataattgcga ctggttccaa ttgacaagct tttgatttta acgactttta acgacaactt 900
gagaagatca aaaaacaact aattattgaa agaattcaaa acg 943
<210> 130
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAP1启动子
<400> 130
tttttgtaga aatgtcttgg tgtcctcgtc caatcaggta gccatctctg aaatatctgg 60
ctccgttgca actccgaacg acctgctggc aacgtaaaat tctccggggt aaaacttaaa 120
tgtggagtaa tggaaccaga aacgtctctt cccttctctc tccttccacc gcccgttacc 180
gtccctagga aattttactc tgctggagag cttcttctac ggcccccttg cagcaatgct 240
cttcccagca ttacgttgcg ggtaaaacgg aggtcgtgta cccgacctag cagcccaggg 300
atggaaaagt cccggccgtc gctggcaata atagcgggcg gacgcatgtc atgagattat 360
tggaaaccac cagaatcgaa tataaaaggc gaacaccttt cccaattttg gtttctcctg 420
acccaaagac tttaaattta atttatttgt ccctatttca atcaattgaa caactatcaa 480
aacaca 486
<210> 131
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PGK1启动子
<400> 131
agaacggaaa ggaatatatt tactgccgat cgcattttgg cctcaaataa atcttgagct 60
tttggacata gattatatgt tctttcttgg aagctctttc agctaatagt gaagtgtttc 120
ctactaagga tcgcctccaa acgttccaac tacgggcgga ggttgcaaag aaaacgggtc 180
tctcagcgaa ttgttctcat ccatgagtga gtcctctccg tcctttcctc gcgcctggca 240
ataaagcctc cttcggagga gctccgtcta gagaataatt gctgcctttc tgactttcgg 300
actagcgcca accgcgaacc acaccaccac accatcactg tcacccgtca tagttcatcc 360
ctctctcctt ataaagcatc taataggttc cacaattgtt tgccacaaaa atctcttagc 420
atagcccaat tgattacgaa a 441
<210> 132
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MF αT的信号肽
<400> 132
atgaggtttc cttctatctt cacggcagtt cttttcgctg catcttccgc attggct 57
<210> 133
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> α-S2的信号肽
<220>
<223> 卡那霉素抗性基因
<400> 133
atgaagttct tcatcttcac ttgtttgttg gctgttgctt tggct 45
<210> 134
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ost β的信号肽
<400> 134
atgagacagg tttggttctc ctggatcgtt ggtttgttct tgtgtttctt caacgtttcc 60
tccgctgct 69
<210> 135
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β的信号肽
<400> 135
atgaaggttt tgatcttggc ttgtttggtt gctttggctt tggct 45
<210> 136
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ost α-S2的信号肽
<400> 136
atgagacagg tttggttcag ttggatagtc ggtttattcc tatgcttttt taatgtctca 60
tccgccgct 69
<210> 137
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α-S1的信号肽
<400> 137
atgaagttgt tgatcttgac ttgtttggtt gctgttgctt tggct 45
<210> 138
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> k的信号肽
<400> 138
atgatgaagt ccttcttctt ggttgttact atcttggctt tgactttgcc attcttgggt 60
gct 63
<210> 139
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ost α-S1的信号肽
<400> 139
atgaggcaag tttggtttag ttggattgtt ggactgttcc tgtgcttttt caacgtgtca 60
tccgctgcc 69
<210> 140
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ost k的信号肽
<400> 140
atgcgacagg tatggttttc ttggattgtg gggttgtttc tatgtttctt taacgtttct 60
tctgctgca 69
<210> 141
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INU的信号肽
<400> 141
atgaagttgg cttactcctt gttgttgcca ttggctggtg tttctgct 48
<210> 142
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> INV的信号肽
<400> 142
atgttgttgc aggctttctt gttcttgttg gctggtttcg ctgctaagat ctctgct 57
<210> 143
<211> 489
<212> DNA
<213> 牛
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> β-乳球蛋白
<400> 143
ttaatcgtca ctcagacaat gaaaggtttg gacatccaaa aagttgctgg aacttggtat 60
tcattggcaa tggctgcaag cgatatctcc ctgttagacg cccaatcagc tccactaaga 120
gtgtatgtgg aggagctgaa gcccactcca gaaggtgatc ttgaaattct gttgcaaaaa 180
tgggaaaatg gtgagtgtgc tcagaaaaag attatcgccg agaaaaccaa gattccggct 240
gtattcaaga tagatgctct gaacgagaat aaggtgttgg tcctcgatac agactacaaa 300
aagtaccttc tattctgtat ggaaaattcg gcagaacctg agcaatcctt ggcttgtcaa 360
tgcttggtta gaactccaga agttgacgac gaggctttgg aaaagtttga taaagccctg 420
aaagccttgc ctatgcatat tcgtttaagt tttaacccaa cacaattgga ggaacagtgt 480
cacatttaa 489
<210> 144
<211> 630
<212> DNA
<213> 牛
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 酪蛋白β
<400> 144
agagagttgg aagagttgaa cgttccaggt gagatcgttg agtctttgtc ctcttcagaa 60
gagtccatca ctagaatcaa caagaagatc gagaagttcc agtccgagga acaacaacaa 120
actgaggacg agttgcagga caagattcac ccattcgctc aaactcagtc cttggtttac 180
ccattcccag gtccaattcc aaactccttg ccacagaaca tcccaccatt gactcagact 240
ccagttgttg ttccaccatt cttgcagcca gaggttatgg gtgtttccaa ggttaaggaa 300
gctatggctc caaagcacaa agagatgcca ttcccaaagt acccagttga gccattcact 360
gagtcccagt ccttgacttt gactgacgtt gagaacttgc acttgccatt gcctttgttg 420
caatcctgga tgcaccaacc acatcaacca ttgccaccaa ctgttatgtt cccaccacaa 480
tccgttttgt ccttgtccca atccaaggtt ttgccagttc cacagaaggc tgttccatac 540
cctcaaagag acatgccaat ccaggctttc ttgttgtacc aagagccagt tttgggtcca 600
gttagaggtc cattccctat catcgtttga 630
<210> 145
<211> 624
<212> DNA
<213> 牛
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 酪蛋白α-S2
<400> 145
aagaacacta tggaacacgt ttcatcctcc gaagagtcca tcatctccca agagacttac 60
aagcaagaga agaacatgga catcaaccca tccaaagaaa acttgtgttc cactttctgt 120
aaagaggttg ttagaaacgc taacgaggaa gagtactcca tcggttcctc atctgaagaa 180
tctgctgagg ttgctactga agaggttaag atcactgttg acgacaagca ctaccagaag 240
gctttgaacg agatcaacca gttctacaga aaattcccac aatacttgca gtacttgtac 300
cagggtccaa tcgttttgaa cccatgggac caggttaaga gaaacgctgt tcctatcact 360
ccaactttga acagagagca gttgtccact tccgaagaga actccaagaa aactgttgac 420
atggaatcca ctgaggtttt cactaagaaa actaagttga ctgaggaaga aaagaacaga 480
ttgaacttct tgaagaagat ctcccagaga taccagaagt tcgctttgcc acagtacttg 540
aaaacagttt accagcacca aaaggctatg aagccatgga tccagccaaa gactaaggtt 600
atcccatacg ttagatactt gtga 624
<210> 146
<211> 624
<212> DNA
<213> 牛
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 酪蛋白α-S2 K113E 变体
<400> 146
aagaacacta tggaacacgt ttcatcctcc gaagagtcca tcatctccca agagacttac 60
aagcaagaga agaacatgga catcaaccca tccaaagaaa acttgtgttc cactttctgt 120
aaagaggttg ttagaaacgc taacgaggaa gagtactcca tcggttcctc atctgaagaa 180
tctgctgagg ttgctactga agaggttaag atcactgttg acgacaagca ctaccagaag 240
gctttgaacg agatcaacca gttctacaga aaattcccac aatacttgca gtacttgtac 300
cagggtccaa tcgttttgaa cccatgggac caggttaagg aaaacgctgt tcctatcact 360
ccaactttga acagagagca gttgtccact tccgaagaga actccaagaa aactgttgac 420
atggaatcca ctgaggtttt cactaagaaa actaagttga ctgaggaaga aaagaacaga 480
ttgaacttct tgaagaagat ctcccagaga taccagaagt tcgctttgcc acagtacttg 540
aaaacagttt accagcacca aaaggctatg aagccatgga tccagccaaa gactaaggtt 600
atcccatacg ttagatactt gtga 624
<210> 147
<211> 600
<212> DNA
<213> 牛
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 酪蛋白α-S1
<400> 147
agacctaagc acccaatcaa gcaccaaggt ttgccacaag aggttttgaa cgagaacttg 60
ttgagattct tcgttgctcc attcccagag gttttcggta aagagaaggt taacgagttg 120
tccaaggaca tcggttctga atccactgag gaccaggcta tggaagatat caagcagatg 180
gaagctgagt ccatctcctc atccgaagag atcgttccaa actccgttga gcagaagcac 240
atccagaaag aggacgttcc atccgagaga tacttgggtt acttggagca gttgttgaga 300
ttgaagaagt acaaggttcc acagttggaa atcgttccta attccgctga agaaagattg 360
cactccatga aggaaggtat ccacgctcag cagaaagaac ctatgatcgg tgttaatcaa 420
gagttggctt acttctaccc agagttgttc agacagttct accagttgga cgcttaccca 480
tctggtgctt ggtactacgt tccattgggt actcagtaca ctgacgctcc atctttctcc 540
gacattccaa acccaattgg ttccgagaac tccggtaaga ctactatgcc attgtggtaa 600
<210> 148
<211> 510
<212> DNA
<213> 牛
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> 酪蛋白k
<400> 148
caagagcaaa atcaagagca gccaatcaga tgtgagaagg acgagagatt cttctcagac 60
aagatcgcta agtacatccc aatccagtac gttttgtcca gatacccatc ctacggtttg 120
aactactacc agcagaagcc agttgctttg atcaacaacc agttcttgcc atacccttac 180
tacgctaagc cagctgctgt tagatctcct gctcaaatct tgcagtggca ggttttgtct 240
aacactgttc cagctaagtc ctgtcaggct cagccaacta ctatggctag acatccacat 300
ccacacttgt ccttcatggc tatcccacca aagaagaacc aggacaagac tgagatccca 360
actatcaaca ctatcgcttc cggtgagcca acttccactc caactattga agctgttgag 420
tccactgttg ctactttgga agcttctcca gaggttattg aatccccacc agagatcaac 480
acagttcagg ttacttccac tgctgtttaa 510
<210> 149
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AOX1终止子序列
<400> 149
ggttaaaggg gcggccgctc aagaggatgt cagaatgcca tttgcctgag agatgcaggc 60
ttcatttttg atactttttt atttgtaacc tatatagtat aggatttttt ttgtcatttt 120
gtttcttctc gtacgagctt gctcctgatc agcctatctc gcagcagatg aatatcttgt 180
ggtaggggtt tgggaaaatc attcgagttt gatgtttttc ttggtatttc ccactcctct 240
tcagagtaca gaagattaag tgaaaccttc gtttgtgcg 279
<210> 150
<211> 271
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CYC1终止子序列
<400> 150
atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc cccccacatc cgctctaacc 60
gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg 120
ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta cagacgcgtg 180
tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg ctcgaaggct 240
ttaatttgcg gcccctcacc tgcacgcaaa a 271
<210> 151
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 博莱霉素抗性基因
<400> 151
atggctaaac tcacctctgc tgttccagtc ctgactgctc gtgatgttgc tggtgctgtt 60
gagttctgga ctgatagact cggtttctcc cgtgacttcg tagaggacga ctttgccggt 120
gttgtacgtg acgacgttac cctgttcatc tccgcagttc aggaccaggt tgtgccagac 180
aacactctgg catgggtatg ggttcgtggt ctggacgaac tgtacgctga gtggtctgag 240
gtcgtgtcta ccaacttccg tgatgcatct ggtccagcta tgaccgagat cggtgaacag 300
ccctggggtc gtgagtttgc actgcgtgat ccagctggta actgcgtgca tttcgtcgca 360
gaagaacagg actaa 375
<210> 152
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 卡那霉素抗性基因
<400> 152
atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat 60
gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 120
tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 180
gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 240
cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 300
atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 360
gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 420
tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 480
gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 540
gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 600
cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 660
ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 720
ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 780
ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaa 816
<210> 153
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>启动子 AOX1
<400> 153
gatctaacat ccaaagacga aaggttgaat gaaacctttt tgccatccga catccacagg 60
tccattctca cacataagtg ccaaacgcaa caggagggga tacactagca gcagaccgtt 120
gcaaacgcag gacctccact cctcttctcc tcaacaccca cttttgccat cgaaaaacca 180
gcccagttat tgggcttgat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt aggctactaa 240
caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat gtttgtttat 300
ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag ggctttctga 360
gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt ttaaacgctg 420
tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag tttggttcgt 480
tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcggcat accgtttgtc 540
ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta gcgcagtctc 600
tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt gccgaaacgc aaatggggaa acacccgctt 660
tttggatgat tatgcattgt ctccacattg tatgcttcca agattctggt gggaatactg 720
ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt aactgttcta acccctactt gacagcaata 780
tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa accttttttt ttatcatcat tattagctta 840
ctttcataat tgcgactggt tccaattgac aagcttttga ttttaacgac ttttaacgac 900
aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta ttcgaaacg 939
<210> 154
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α交配因子的信号肽
<400> 154
atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagct 267
<210> 155
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OST1的信号肽
<400> 155
atgagacaag tttggttctc atggattgtt ggtttattct tgtgtttctt caacgtttct 60
tccgct 66
<210> 156
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α-乳白蛋白的信号肽
<400> 156
atgatgtcat ttgtttcttt gttgttggtt ggtatcctgt tccacgccac tcaagct 57
<210> 157
<211> 372
<212> DNA
<213> 牛
<220>
<221> misc_feature
<222> (0)...(0)
<223> α-乳白蛋白
<400> 157
gagcaattga ccaagtgtga agttttcaga gagttgaagg atttgaaggg ttacggtggt 60
gtttctcttc cagaatgggt ttgtaccgct ttccacactt ccggatacga tacacaagct 120
atcgttcaaa acaacgactc caccgagtac ggtttgttcc aaatcaacaa caagatttgg 180
tgtaaagacg atcaaaaccc tcactcttcc aacatttgca acatctcttg tgataagttc 240
ttggatgatg atctcaccga tgatatcatg tgtgttaaga agattttgga caaagttgga 300
atcaactact ggttggctca caaggctctt tgttcagaga agttggacca atggctatgt 360
gagaagttgt aa 372
<210> 158
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AOX1终止序列
<400> 158
tcaagaggat gtcagaatgc catttgcctg agagatgcag gcttcatttt tgatactttt 60
ttatttgtaa cctatatagt ataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc 120
ttgctcctga tcagcctatc tcgcagctga tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa 180
tcattcgagt ttgatgtttt tcttggtatt tcccactcct cttcagagta cagaagatta 240
agtgacacgt tcgtttgtgc aagcttcaac gatgccaaaa gggtataata agcgtcattt 300
gcagcattgt gaagaaaact atgtggcaag ccaagcctgc gaagaatgta 350
<210> 159
<211> 810
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 159
atgggtaagg aaaagactca cgtttccaga ccaagattga actctaacat ggacgctgac 60
ttgtacggtt acaagtgggc tagagacaac gttggtcaat ctggtgctac tatttacaga 120
ttgtacggta agccagacgc tccagagttg ttcttgaagc acggtaaggg ttctgttgct 180
aacgacgtta ctgacgagat ggttagattg aactggttga ctgagttcat gccattgcca 240
actattaagc acttcattag aactccagac gacgcttggt tgttgactac tgctattcca 300
ggtaagactg ctttccaagt tttggaggag tacccagact ctggtgagaa cattgttgac 360
gctttggctg ttttcttgag aagattgcac tctattccag tttgtaactg tccattcaac 420
tctgacagag ttttcagatt ggctcaagct caatccagaa tgaacaacgg tttggttgac 480
gcttctgact tcgacgacga gagaaacggt tggccagttg agcaagtttg gaaggagatg 540
cacaagttgt tgccattctc tccagactct gttgttactc acggtgactt ctctttggac 600
aacttgattt tcgacgaggg taagttgatt ggttgtattg acgttggtag agttggtatt 660
gctgacagat accaagactt ggctattttg tggaactgtt tgggtgagtt ctctccatct 720
ttgcaaaaga gattgttcca aaagtacggt attgacaacc cagacatgaa caagttgcaa 780
ttccacttga tgttggacga gttcttctaa 810

Claims (100)

1.一种组合物，其包含：
约0.3g/L至约1.1g/L κ-酪蛋白蛋白质，
约1.25 g/L至约4.9 g/L β-酪蛋白蛋白质，
最终总浓度为约0重量％至约45重量％的一种或多种脂质；
最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％的一种或多种风味化合物；
最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％的一种或多种甜味剂；和
最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％的灰分，
其中所述组合物不包含动物来源组分。
2.一种组合物，其包含：
约0.3g/L至约1.1g/L κ-酪蛋白蛋白质，
约1.25 g/L至约4.9 g/L β-酪蛋白蛋白质，
最终总浓度为约0重量％至约45重量％的一种或多种脂质；
最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％的一种或多种风味化合物；
最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％的一种或多种甜味剂；和
最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％的灰分，
其中所述组合物：
不包含在哺乳动物产生的乳中发现的至少一种组分；
包含哺乳动物产生的乳中不存在的至少一种组分；和/或
包含与哺乳动物产生的乳中的至少一种组分的浓度相比更高或更低浓度的至少一种组分。
3.一种组合物，其包含：
约0.3g/L至约1.1g/L非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白；
约1.25 g/L至约4.9 g/L非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白；
最终总浓度为约0重量％至约45重量％的一种或多种脂质；
最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％的一种或多种风味化合物；
最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％的一种或多种甜味剂；和
最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％的灰分。
4.一种组合物，其含有包含κ-酪蛋白蛋白质和β-酪蛋白蛋白质的胶束，其中所述胶束具有约50nm至约350nm的直径，且所述κ-酪蛋白蛋白质和β-酪蛋白蛋白质是非糖基化的或具有非哺乳动物糖基化模式。
5.权利要求4的组合物，其中所述组合物包含最终浓度为约2.0重量％至约6重量％的胶束。
6.权利要求4或5的组合物，其中所述胶束中β-酪蛋白蛋白质与κ-酪蛋白蛋白质的比率为约3.5:1至约5.5:1。
7.权利要求6的组合物，其中所述胶束中β-酪蛋白蛋白质与κ-酪蛋白蛋白质的比率为约4:1至约5:1。
8.权利要求4-7的组合物，其中所述组合物还包含：
最终总浓度为约0重量％至约45重量％的一种或多种脂质；
最终总浓度为约0.01重量％至约6重量％的一种或多种风味化合物；
最终总浓度为约0.1重量％至约6重量％的一种或多种甜味剂；和
最终总浓度为约0.15重量％至约1.5重量％的灰分。
9.权利要求2的组合物，其中所述组合物包含与哺乳动物产生的乳中的一种或多种组分的浓度相比更高浓度的至少一种组分，所述组分选自：钙、磷酸盐、B复合维生素、维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。
10.权利要求2或9的组合物，其中所述组合物不包含在哺乳动物产生的乳中发现的至少一种组分，所述组分选自：乳糖、细菌、分枝杆菌、过敏原、病毒、朊病毒、酵母、生长激素、白细胞、抗生素、重金属、免疫球蛋白、乳铁蛋白、乳过氧化物酶和脂肪酶。
11.权利要求2、9或10的组合物，其中所述组合物包含哺乳动物产生的乳中不存在的至少一种组分，所述组分选自人造甜味剂、植物来源的脂质、非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质。
12.权利要求1-11中任一项的组合物，其中所述组合物包含约0.27重量％至约0.75重量％κ-酪蛋白蛋白质和约1.23重量％至约3.27重量％β-酪蛋白。
13.权利要求1-3和8-12中任一项的组合物，其中一种或多种脂质的最终总浓度为约0重量％至约4.5重量％。
14.权利要求1-3和8-13中任一项的组合物，其中所述一种或多种脂质选自：向日葵油、椰子油、三丁酸甘油酯、单酸甘油酯和双酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂。
15.权利要求14的组合物，其中所述组合物包含下列中的一种或多种：
最终浓度为约1重量％至约28重量％的向日葵油；
最终浓度为约0.5重量％至约14重量％的椰子油；
最终浓度为约0.05重量％至约1.0重量％的三丁酸甘油酯；
最终总浓度为约0.08重量％至约1.2重量％的单酸甘油酯和双酸甘油酯；
最终总浓度为约0.02重量％至约0.28重量％的游离脂肪酸；和
最终总浓度为约0.02重量％至约0.3重量％的磷脂。
16.权利要求14或15的组合物，其中所述游离脂肪酸包含至少一种选自以下的脂肪酸：丁酸、己酸、辛酸和癸酸。
17.权利要求14-16中任一项的组合物，其中所述磷脂是大豆卵磷脂磷脂、向日葵卵磷脂磷脂、棉花卵磷脂磷脂或油菜籽卵磷脂磷脂。
18.权利要求14-17中任一项的组合物，其中所述单酸甘油酯和双酸甘油酯是植物来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯，或者是细菌来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯。
19.权利要求1-3和8-18中任一项的组合物，其中所述风味化合物包含至少一种选自以下的风味化合物：δ-癸内酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯和δ-十一内酯。
20.权利要求1-3和8-19中任一项的组合物，其中所述一种或多种甜味剂是糖。
21.权利要求20的组合物，其中所述糖选自：葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、莫纳甜和塔格糖。
22.权利要求1-3和8-19中任一项的组合物，其中所述一种或多种甜味剂是人造甜味剂。
23.权利要求22的组合物，其中所述人造甜味剂选自：甜叶菊、阿司帕坦、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜苷、布拉齐因、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、神秘果蛋白、莫纳甜、莫奈林、奥斯来丁、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、advantame、阿力甜、阿司帕坦-乙酰氨基磺酸盐、环己烷氨基磺酸钠、甘素、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜和P-4000。
24.权利要求1-3和8-23中任一项的组合物，其中所述灰分包含下列中的一种或多种：钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐和氯化物。
25.权利要求1-3和8-24中任一项的组合物，其中所述灰分包含CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠中的一种或多种。
26.权利要求25的组合物，其中所述灰分包含CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠。
27.权利要求26的组合物，其中：
所述CaCl2具有约0.05 g/L至约0.2 g/L的最终浓度；
所述KH2PO4具有约0.2 g/L至约0.4 g/L的最终浓度；且
所述柠檬酸钠具有约0.1 g/L至约0.3 g/L的最终浓度。
28.权利要求1-27中任一项的组合物，其中：
所述κ-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象κ-酪蛋白蛋白质。
29.权利要求1-28中任一项的组合物，其中：
所述β-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-酪蛋白蛋白质。
30.权利要求1-29中任一项的组合物，其中所述组合物还包含：
最终浓度为约0.4 g/L重量％至约2.5重量％的α-乳白蛋白蛋白质；和/或
最终浓度为约2.5重量％至约4.5重量％的β-乳球蛋白蛋白质。
31.权利要求30的组合物，其中：
α-乳白蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-乳白蛋白蛋白质。
32.权利要求30或31的组合物，其中：
所述β-乳球蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-乳球蛋白蛋白质。
33.权利要求1-32中任一项的组合物，其中所述组合物还包含：
最终浓度为约11重量％至约16重量％的α-S1-酪蛋白蛋白质；
最终浓度为约2重量％至约5重量％的α-S2-酪蛋白蛋白质。
34.权利要求33的组合物，其中：
所述α-S1-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-S1-酪蛋白蛋白质；和/或
所述α-S2-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象α-S2-酪蛋白蛋白质。
35.权利要求1-34中任一项的组合物，其中所述组合物还包含下列中的一种或多种：血清白蛋白、乳铁蛋白和转铁蛋白。
36.权利要求35的组合物，其中：
所述血清白蛋白是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象血清白蛋白；
所述乳铁蛋白是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象乳铁蛋白；和/或
所述转铁蛋白是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象转铁蛋白。
37.权利要求1-35中任一项的组合物，其还包含一种或多种颜色平衡剂。
38.权利要求37的组合物，其中所述一种或多种颜色平衡剂是β-胡萝卜素或胭脂树橙。
39.权利要求1-37中任一项的组合物，其中所述组合物具有约6.2至约7.2的pH。
40.权利要求40的组合物，其中所述组合物具有约6.2至约6.8的pH。
41.一种组合物，其包含：
哺乳动物产生的乳或加工的哺乳动物产生的乳；和
非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质以及非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质中的一种或两种。
42.权利要求41的组合物，其中所述组合物中非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质的最终浓度为0.02重量％至约3.0重量％。
43.权利要求41的组合物，其中所述组合物中非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质的最终浓度为0.02重量％至约3.0重量％。
44.权利要求41的组合物，其中：
所述组合物中非糖基化和/或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质的最终浓度为约0.02重量％至约0.6重量％；且
所述组合物中非糖基化和/或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白的最终浓度为约0.02重量％至约2.5重量％。
45.一种粉末组合物，其包含：
最终浓度为约3.6重量％至约5.4重量％的κ-酪蛋白蛋白质；
最终浓度为约16.3重量％至约24.5重量％的β-酪蛋白蛋白质；
最终浓度为约35重量％至约40重量％的甜味剂；
最终浓度为约25重量％至约30重量％的一种或多种脂质；
最终浓度为约5重量％至约7重量％的灰分；和
最终浓度为约2重量％至约5重量％的水，
其中所述κ-酪蛋白蛋白质是非糖基化的和/或具有非哺乳动物糖基化模式，和/或所述β-酪蛋白蛋白质是非糖基化的和/或具有非哺乳动物糖基化模式。
46.一种核酸，其包含：
启动子；
编码信号序列的序列；
编码乳蛋白质的序列；和
酵母终止序列，
其中所述启动子可操作地连接至所述信号序列，所述信号序列可操作地连接至编码所述乳蛋白质的序列，并且所述终止序列可操作地连接至编码所述乳蛋白质的序列。
47.权利要求46的核酸，其中所述启动子是组成型启动子。
48.权利要求47的核酸，其中所述启动子是诱导型启动子。
49.权利要求46-48中任一项的核酸，其中所述信号序列是来自编码的乳蛋白质或不同乳蛋白质的信号序列，或者是来自酵母交配因子的信号序列。
50.权利要求46-49中任一项的核酸，其中编码的乳蛋白质选自：β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白或转铁蛋白。
51.权利要求46-50中任一项的核酸，
其中所述核酸包含细菌复制起点。
52.权利要求46-51中任一项的核酸，其中所述核酸还包括选择标记物。
53.权利要求46-52中任一项的核酸，其中所述选择标记物是抗生素抗性基因。
54.权利要求46-53中任一项的核酸，其还包含：
另外的启动子序列；
编码信号序列的另外的序列；
编码另外的乳蛋白质的序列；和
另外的酵母终止序列，
其中另外的启动子序列可操作地连接至编码信号序列的另外的序列，编码信号序列的序列可操作地连接至编码另外的乳蛋白质的序列，且编码另外的乳蛋白质的序列可操作地连接至另外的酵母终止序列。
55.宿主细胞，其包含权利要求46-53中任一项的核酸。
56.权利要求55的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母菌株。
57.权利要求56的宿主细胞，其中所述酵母菌株是克鲁维酵母属种、毕赤酵母属种、酵母属种、四膜虫属种、耶氏酵母属种、汉逊酵母属种、布氏菌属种、念珠菌属种、接合酵母属种和德巴利氏酵母属种。
58.一种生产非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的重组乳蛋白质的方法，所述方法包括：
在足以允许分泌非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的乳蛋白质的条件下，在培养基中培养权利要求55-57中任一项的宿主细胞；和
从培养基中收获非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的乳蛋白质。
59.一种生产包含非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白的胶束的方法，其包括：
在足以允许从宿主细胞释放胶束的条件下在培养基中培养权利要求55-57中任一项的宿主细胞，
其中所述宿主细胞包含核酸，所述核酸包括编码β-酪蛋白的序列和编码κ-酪蛋白的序列。
60.一种补充哺乳动物产生的乳的方法，所述方法包括：
提供哺乳动物产生的乳或加工的哺乳动物产生的乳；和
将以下中的至少一种混入乳中：
非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质；
非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质；和
包含非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的β-酪蛋白蛋白质和非糖基化或具有非哺乳动物糖基化模式的κ-酪蛋白蛋白质的胶束。
61.一种产生组合物的方法，所述方法包括：
超声处理包括蛋白质混合物的液体，所述蛋白质混合物包含β-酪蛋白蛋白质和κ-酪蛋白蛋白质，或含有包含β-酪蛋白蛋白质和κ-酪蛋白蛋白质的胶束；
将灰分混入液体中；
向液体中加入一种或多种脂质、一种或多种风味化合物和一种或多种颜色平衡剂的混合物，并超声处理液体；和
向液体中加入一种或多种甜味剂，由此产生组合物。
62.权利要求61的方法，其中所述β-酪蛋白蛋白质是非糖基化的或具有非哺乳动物糖基化模式，和/或κ-酪蛋白蛋白质是非糖基化的或具有非哺乳动物糖基化模式。
63.权利要求61或62的方法，其中所述灰分包含下列中的一种或多种：钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐和氯化物。
64.权利要求61-63中任一项的方法，其中添加的灰分包含CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠中的一种或多种。
65.权利要求64的方法，其中添加的灰分包含CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠。
66.权利要求61-65中任一项的方法，其中所述一种或多种脂质包含以下中的至少一种：向日葵油、椰子油、三丁酸甘油酯、单酸甘油酯和双酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂。
67.权利要求66的方法，其中所述游离脂肪酸包含至少一种选自以下的脂肪酸：丁酸、己酸、辛酸和癸酸。
68.权利要求66和67的方法，其中所述磷脂是大豆卵磷脂磷脂、向日葵卵磷脂磷脂、棉花卵磷脂磷脂或油菜籽卵磷脂磷脂。
69.权利要求66-68中任一项的方法，其中所述单酸甘油酯和双酸甘油酯是植物来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯，或者是细菌来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯。
70.权利要求61-69中任一项的方法，其中所述风味化合物包含至少一种选自以下的风味化合物：δ-癸内酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯和δ-十一内酯。
71.权利要求61-70中任一项的方法，其中所述一种或多种颜色平衡剂是β-胡萝卜素或胭脂树橙。
72.权利要求61-71中任一项的方法，其中所述一种或多种甜味剂是糖。
73.权利要求72的方法，其中所述糖选自：葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、莫纳甜和塔格糖。
74.权利要求61-71中任一项的方法，其中所述一种或多种甜味剂是人造甜味剂。
75.权利要求74的方法，其中所述人造甜味剂选自：甜叶菊、阿司帕坦、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜苷、布拉齐因、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、神秘果蛋白、莫纳甜、莫奈林、奥斯来丁、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、advantame、阿力甜、阿司帕坦-乙酰氨基磺酸盐、环己烷氨基磺酸钠、甘素、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜和P-4000。
76.权利要求61-75中任一项的方法，其中所述液体的pH在约6.2和7.4之间。
77.权利要求76的方法，其中所述液体的pH在约6.4至约6.8之间。
78.权利要求61-77中任一项的方法，其中：
所述β-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象β-酪蛋白蛋白质；和/或
所述κ-酪蛋白蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象κ-酪蛋白蛋白质。
79.权利要求61-78中任一项的方法，其中所述蛋白质混合物还包含一种或多种选自以下的蛋白质：α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白、乳铁蛋白、转铁蛋白和血清白蛋白。
80.通过权利要求61-79中任一项的方法产生的组合物。
81.制备黄油、奶酪、酪蛋白酸盐或酸奶的方法，所述方法包括：
提供权利要求1-44和80中任一项的组合物；和
使用权利要求1-44和80中任一项的组合物作为起始材料生产黄油、奶酪、酪蛋白酸盐或酸奶。
82.试剂盒，其包含：
(a)一种或多种乳蛋白质、一种或多种脂肪和一种或多种风味化合物的混合物；和
(b)灰分和至少一种甜味剂的混合物。
83.权利要求81的试剂盒，其中所述一种或多种乳蛋白质选自：β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-S1-酪蛋白、α-S2-酪蛋白、乳铁蛋白、转铁蛋白和血清白蛋白。
84.权利要求82或83的试剂盒，其中所述一种或多种乳蛋白质是牛、人、绵羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、北美野山羊、猴、猿、猫、狗、沙袋鼠、大鼠、小鼠、象、负鼠、兔、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎、针鼹鼠或猛犸象乳蛋白质。
85.权利要求82-84中任一项的试剂盒，其中所述一种或多种脂肪选自：向日葵油、椰子油、三丁酸甘油酯、单酸甘油酯和双酸甘油酯、游离脂肪酸和磷脂。
86.权利要求85的试剂盒，其中所述游离脂肪酸包含至少一种选自以下的脂肪酸：丁酸、己酸、辛酸和癸酸。
87.权利要求85和86的试剂盒，其中所述磷脂是大豆卵磷脂磷脂、向日葵卵磷脂磷脂、棉花卵磷脂磷脂或油菜籽卵磷脂磷脂。
88.权利要求85-87中任一项的试剂盒，其中所述单酸甘油酯和双酸甘油酯是植物来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯，或者是细菌来源的单酸甘油酯和双酸甘油酯。
89.权利要求82-88中任一项的试剂盒，其中所述风味化合物包含至少一种选自以下的风味化合物：δ-癸内酯、丁酸乙酯、2-呋喃基甲基酮、2,3-戊二酮、γ-十一内酯和δ-十一内酯。
90.权利要求82-89中任一项的试剂盒，其中(a)中的混合物还包含一种或多种颜色平衡剂。
91.权利要求90的试剂盒，其中所述一种或多种颜色平衡剂是β-胡萝卜素或胭脂树橙。
92.权利要求82-91中任一项的试剂盒，其中所述一种或多种甜味剂是糖。
93.权利要求92的试剂盒，其中所述糖选自：葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、莫纳甜和塔格糖。
94.权利要求82-91中任一项的试剂盒，其中所述一种或多种甜味剂是人造甜味剂。
95.权利要求94的试剂盒，其中所述人造甜味剂选自：甜叶菊、阿司帕坦、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖、罗汉果甜苷、布拉齐因、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘草甜素、菊粉、异麦芽糖醇、乳糖醇、马槟榔甜蛋白、麦芽糖醇、甘露醇、神秘果蛋白、莫纳甜、莫奈林、奥斯来丁、倍他丁、山梨糖醇、奇异果甜蛋白、木糖醇、乙酰氨基磺酸钾、advantame、阿力甜、阿司帕坦-乙酰氨基磺酸盐、环己烷氨基磺酸钠、甘素、甜素、新橙皮苷二氢查耳酮、纽甜和P-4000。
96.权利要求82-95中任一项的试剂盒，其中所述灰分包含下列中的一种或多种：钙、磷、钾、钠、柠檬酸盐和氯化物。
97.权利要求96的试剂盒，其中所述灰分包含CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠中的一种或多种。
98.权利要求97的试剂盒，其中所述灰分包含CaCl2、KH2PO4和柠檬酸钠。
99.权利要求82-99中任一项的试剂盒，还包含用于制备权利要求1-44中任一项的组合物的说明书。
100.试剂盒，其包含至少一种权利要求46-54中任一项的核酸。
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