KR100357670B1 - 형질전이비인간포유류중의재조합인체bssl/cel의제조에사용되는dna서열및유아용조제분유에사용되는그로부터제조된bssl/cel - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인트론 서열을 함유하고, 작용 부위에 따라 담즙산염-자극 리파아제(BSSL) 또는 카르복실 에스테르 리파아제(CEL)로 불리는 인체 단백질을 코딩하는 DNA 분자에 관한 것이다. DNA 분자는 바람직하게는 형질전이(transgenic) 비인간 포유류에서의 생산에 의한 재조합 인체 BSSL/CEL의 생산에 유리하게 사용된다. 재조합 인체 BSSL/CEL는 모유의 대체물로 유아에게 공급하는 유아용 조제 분유의 성분으로, 또는 예를 들면 지방 흡수 불량, 낭포성 섬유증 및 만성 췌장염을 치료하는 의약의 제조에 사용될 수 있다.
Description
기술 분야
본 발명은 작용 부위에 따라 담즙산염-자극 리파아제(BSSL) 또는 카르복실산 에스테르 리파아제(CEL)로 불리는 인체 단백질을 코딩하며 인트론 서열을 함유한 DNA 분자에 관한 것이다. 이 DNA 분자는 바람직하게는 형질전이(transgenic) 비인간 포유류에서의 생산에 의한 재조합 인체 BSSL/CEL의 생산에 유리하게 사용된다. 재조합 인체 BSSL/CEL는 모유와 대체물로 유아에게 공급하는 유아용 조제분유의 성분으로, 또는 예를 들면 지방 흡수 불량, 낭포성 섬유증 및 만성 췌장염을 치료하는 의약의 제조에 사용될 수 있다.
발명의 배경
식이 지질의 가수분해
식이 지질은 중요한 에너지원이다. 에너지가 풍부한 트리아실글리세롤이 이질 지질의 95 % 이상을 구성한다. 이들 지질 중 일부, 예를 들면 특정 지방산 및 지용성 비타민은 필수 식이 성분이다. 소량 성분, 즉 에스테르화 지용성 비타민 및 콜레스테롤, 및 디아실포스파티딜글리세롤 뿐 아니라 트리아실글리세롤은 위장관에서 흡수되기에 앞서 덜 소수성이고 흡수 가능한 물질이 되도록 에스테르 결합이 가수분해되어야 한다. 이들 반응은 리파아제로 불리는 특정한 효소군에 의해 촉매된다.
성인의 경우, 관련된 필수 리파아제는 위의 리파아제, 췌장의 코리파아제-의존리파아제(트리- 및 디아실글리세롤의 가수분해), 췌장의 포스포리파아제 A2(디아실포스파티딜글리세롤의 가수분해) 및 카르복실산 에스테르 리파아제(CEL)(콜레스테릴- 및 지용성 비타민 에스테르의 가수분해)로 알려져 있다. 젖먹이 신생아의 경우에는, 담즙산염-자극 리파아제(BSSL)가 상기 지방 중 몇몇의 가수분해에 필수적인 역할을 한다. 지질 소화 생성물은 담즙산염과 함께 흡수가 일어나는 혼합 미셀(micelle)을 형성한다.
담즙산염-자극 리파아제
인체의 수유중인 유선은 주요 담즙산염에 의한 특이적 활성화 후 젖먹이 유아에게 내인성 장내 지방 소화능을 갖게 하는 담즙산염-자극 피라아제(BSSL)(등 1987)를 합성하고 젖과 함께 분비한다. 총 젖 단백질의 약 1 %를 차지하는(＆ Hernell, 1981) 상기 효소는 젖과 함께 위를 통과하는 동안에는 분해되지 않으며, 십이지장 내용물 중에서는 담즙산염에 의해 트립신 및 키모트립신과 같은 췌장 프로테아제에 의한 불활성화로부터 보호된다. 그러나, 이 효소는 젖을 저온 살균, 예를 들면 62.5 ℃로 30 분간 가열하면 불활성화된다(Bjorksten 등, 1980).
시험관 내에서의 모델 실험은 트리아실글리세롤 소화의 최종 생성물은 BSSL가 존재하는 경우 상이한 것으로 나타났다(등, 1990; Hernell ＆, 1982). 신생아기 동안 관강내 담즘산염의 농도가 더 낮기 때문에, 이는 생성물 흡수에 유리할 수 있다.
카르복실산 에스테르 리파아제
인체 췌장액의 카르복실산 에스테르 리파아제(CEL)(Lombardo 등, 1978)는 BSSL와 기능적으로 동일하거나, 또는 적어도 매우 유사한 것으로 보인다(등, 1981). 또한 이들은 동일한 에피토프를 공유하고, 동일한 N-말단 아미노산 서열을 가지며(Abouakil 등, 1988), 세린 에스테라아제의 억제제, 예를 들면 에세린 및 디이소프로필플루오로포스페이트에 의해 억제된다. 몇몇 연구소에서 나온 최근 연구에서 젖 리파아제 및 췌장 리파아제 모두의 cDNA. 구조를 규명하였고(Baba 등, 1991; Hui 등, 1991; Nilwwon 등, 1990; Reue 등, 1991) 결론은 상기 젖 효소 및 췌장 효소가 동일한 유전자의 생성물이라는 것이다(본 출원에서 CEL 유전자로 지칭됨, EC 3.1.1.1). CEL 유전자의 cDNA 서열 및 추정된 아미노산 서열이 국제 특허 공개 제91/15234호 (오클라호마 메디칼 리써치 파운데이션) 및 동 공개 제91/18923호 (악티에볼라게트 아스트라)에 기재되어 있다.
따라서 CEL는 BSSL와 동일한 것으로 추측되고, CEL 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 본 명세서에서는 BSSL/CEL로 명시하였다.
지질 흡수 불량
지질 흡수 불량 및 그에 따른 영양 불량의 흔한 원인은 췌장의 코리파아제-의 존 리파아제 및(또는) 담즙산염의 관강내 농도 감소이다. 이러한 리파아제 결핍의 전형적인 예는 환자의 약 80 %에서 평생동안의 결핍을 초래하는 흔한 유전병인 낭포성 섬유증, 및 흔히 만성 알콜 중독에서 기인하는 만성 췌장염을 앓는 환자이다.
현재 췌장 리파아제의 결핍을 앓고 있는 환자에 대한 치료는 돼지 췌장 효소의 미정제 제제를 다량으로 경구 투여하는 것이다. 그러나, 코리파아제-의존 췌장 리파아제는 위를 지배하는 낮은 pH에 의해 불활성화된다. 이러한 효과는 효소의 다량 투여로도 완전히 극복할 수 없다. 따라서 다량 투여는 대부분의 환자에게 적합하지 않고, 또한 제제는 불순하며 입에 맞지 않다.
위의 산성 부위를 통과하고 비교적 알칼리 환경인 공장에서만 효소를 방출시키는 특정 정제가 제조되어 왔다. 그러나, 췌장 질병을 앓고 있는 환자의 다수는 비정상적으로 산성인 공장을 가지고 있으며, 이러한 경우 정제가 효소를 방출시키지 못할 수 있다.
또한, 시판되는 제제는 비인체원이기 때문에 환자에게 유해한 효과를 가져오거나 치료 효과의 감소를 초래할 수 있는 면역 반응의 위험이 있다. 기존 제제의 또다른 단점은 코리파아제-의존 리파아제 외의 다른 지방 분해 활성의 함량이 기술되어 있지 않다는 것이다. 사실상, 이들 대부분은 BSSL/CEL 활성을 매우 낮은 농도로 함유한다. 이는 낭포성 섬유증을 앓고 있는 다수 환자들이 보충제 치료에도 불구하고 지용성 비타민 및 필수 지방산의 결핍으로 고통받는 이유가 될 수 있다.
따라서, 인체 리파아제로부터 유래하는 특성 및 구조를 갖고 광범위한 기질 특이성을 지니며 1종 또는 수종의 췌장 지방 분해 효소의 결핍을 앓고 있는 환자에게 경구로 투여될 수 있는 제품이 강력히 요구된다. 본 발명을 사용하여 얻을 수 있는 제품은 그 자체로, 또는 다른 리파아제를 함유하는 제제와 혼합하여 상기 요구를 충족시킨다.
유아용 조제 분유
유아에게 모유 수유가 조제 분유 식이보다 우수한 것으로 여겨진다는 것이 널리 공지되어 있다. 모유는 균형잡힌 영양분을 제공할 뿐 아니라, 유아가 쉽게 소화한다. 따라서, 감염을 방지하는데 필요한 성분 및 모유로부터 영양분의 흡수를 촉진하는 성분을 포함하여 유아의 체내에서 생리적 기능을 갖는 것으로 공지된 몇가지 생물학적 활성 성분이 모유의 성분으로 존재하거나 그의 소화 과정에서 생성된다.
유아용 조제 분유를 제조하는데 투자된 지대한 노력에도 불구하고, 본질적으로 모유의 장점을 갖는 조제 분유의 제조는 불가능하였다. 따라서, 주로 우유를 기재로 제조되는 유아용 조제 분유는 일반적으로 유아에 의해 불완전하게 소화되고 유아의 생리 기능상 효과를 갖는 것으로 공지된 물질이 결여되어 있다. 모유와 유사한 영양가를 갖는 유아용 조제 분유를 얻기 위해서, 정상적으로는 유아가 모유를 소화하는 과정에서 형성되거나 또는 흡수되는 단백질 단편, 비타민, 미네랄 등을 포함한 다수의 첨가제가 조제 분유에 함유되므로 그에 의해 간 및 신장과 같은 중요기관에 부담을 주고 장기적으로는 손싱을 줄 수 있다는 위험이 있다. 우유를 기재로 한 조제 분유의 또다른 단점은 유아에게서 소 단백질에 대한 알레르기를 유도할 위험을 증가시킨다는 것이다.
우유를 기재로 한 유아용 조제 분유의 대체물로서, 소위 밀크 뱅크로부터 얻을 수 있는 모유를 사용해 왔다. 그러나, 모유 중의 HIV 및 CMV와 같은 감염원의 존재에 대한 두려움 때문에, 신생아를 밀크 뱅크의 모유로 수유하는 것을 최근에는 점점 피하는 추세이다. 모유 중의 감염원을 제거하기 위해서는 젖을 사용 전에 저온 살균할 필요가 있다. 그러나, 저온 살균에 의해 젖 성분들의 영양가 및 생물학적 효과가 감소되고, 그 예로 상기와 같이 BSSL가 불활성화된다.
유아용 조제 분유의 리파아제 첨가
췌장 및 간 기능은 출생시, 특히 예정일 전에 태어난 영아에서는 완전히 발달되지 않는다. 생리적 원인에 의한 지방 흡수 불량은 흔히 발견되며 관강내 췌장 코리파아제-의존 리파아제 및 담즙산염의 저농도에 기인하는 것으로 추측된다. 그러나 BSSL 때문에, 이러한 흡수 불량은 저온 살균한 모유 또는 유아용 조제 분유를 먹인 유아보다 모유 수유한 유아에게서 빈도가 훨씬 더 낮다 (등, 1990).
저온 살균한 모유 및 우유를 기재로 한 유아용 조제 분유와 연관된 상기 단점들을 제거하기 위해, 모유에 보다 근접한 조성의 유아용 조제 분유, 예를 들면 모유단백질로 이루어진 조제 분유의 제조가 바람직할 것이다.
BSSL/CEL는 유아용 조제 분유의 보충물로서 이상적으로 적합한 하기의 몇가지 독특한 특성을 갖는다:
천연적으로 경구 투여를 위해 고안되었다. 따라서, 위의 통과에 대해 내성을 갖고 소장의 내용물 중에서 활성화된다.
특이적 활성화 기전이 저장 및 그의 작용 부위 통과시 식품 또는 조직 지질의 유해한 지방 분해를 방지할 것이다.
광범위한 기질 특이성으로 인해 그 자체가 지용성 비타민 에스테르를 포함한 대부분의 식이 지방의 완전한 소화를 대개하는 능력을 갖는다.
BSSL/CEL는 장쇄 다중불포화 지방산을 함유한 에스테르 결합을 가수분해 하는데 있어서 췌장 코리파아제-의존 리파아제보다 더 우수할 수 있다.
위 리파아제의 존재하 및 코리파아제-의존 리파아제의 부재하 또는 저농도에서, BSSL/CEL는 신생아와 같이 담즙산염 농도가 낮을 경우에도 시험관내에서 트리아실글리세롤을 완전히 소화시킬 수 있다. BSSL/CEL의 존재하에 트리아실글리세롤을 소화시킨 최종 생성물은 다른 두가지 리파아제에 의해 생성되는 유리 지방산 및 모노아실글리세롤이 아니라 유리 지방산 및 유리 글리세롤이었다(등, 1990). 이는 특히 관강내 담즙산염 농도가 낮을 경우의 생성물 흡수에 유리할 수 있다.
그러나 유아용 조제 분유의 보충물로 BSSL/CEL를 사용하기 위해서는 다량의 물질을 얻을 수 있어야 한다. 모유 단백질을 모유로부터 직접 정제할 수는 있겠지만 이것은 대규모의 조제 분유 생산에 필요한 다량을 얻는데는 실제적이고 충분히 경제적인 방법이 아니므로, 모유 단백질로 이루어지는 유아용 조제 분유를 제조하려면 다른 방법이 개발되어야 한다. 본 발명은 BSSL/CEL를 다량으로 제조하는 그러한 방법에 관한 것이다.
형질전이 동물의 젖에서의 단백질 생산
약리학적 활성을 지닌 단백질을 코딩하는 유전자의 단리에 의해 이종 조직에서의 이러한 단백질의 저렴한 생산이 가능해졌다. 젖 단백질에 적합한 발현계는 형질전이 동물이다([Hennighausen 등, 1990] 참조). 예를 들어 형질전이 동물 기술에서 유래된 담즙산염-활성화 리파아제를 포함하는 식이 조성물이 유럽 특허 제 317,355호에 기재되어 있다(오클라호마 메디칼 리써치 파운데이션).
형질전이 동물에서, 단백질을 코딩하는 서열은 cDNA로서 또는 게놈 서열로서 도입될 수 있다. 형질전이 동물에서 바르게 조절된 유전자 발현을 위해서는 인트론이 필요할 수 있으므로(Brinster 등, 1988; Whitelaw 등, 1991) 많은 경우 구조 유전자의 cDNA 형태보다는 게놈 형태를 사용하는 것이 바람직하다. 국제 특허 공개 제 90/15188호(파마슈티칼 프로테인스 리미티드)는 형질전이 동물에서, 그 단백질을 코딩하는 유전자에 본래 존재하는 인트론 중 전부는 아니지만 하나 이상을 함유한 단백질-코딩 DNA의 사용을 기재하고 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 저온 살균한 젖 및 소 단백질을 기재로 한 조제 분유의 단점을 제거하기 위해 유아용 조제 분유에 사용하기 위한, 재조합 인체 BSSL/CEL를 고수율 및 현실적인 가격으로 생산하는 수단을 제공하는 것이다.
발명의 간단한 설명
본 발명의 목적은 인체 CEL 유전자를 클로닝 및 서열결정함으로써 성취되었다. BSSL/CEL의 수율을 개선하기 위해, 인체 CEL 유전자의 공지된 cDNA 서열대신, 인트론 서열을 포함하고 있는 얻어진 DNA 분자를 형질전이 비인간 포유류에서 인체BSSL/CEL를 생산하는 데 사용하였다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 서열표에서 서열 확인 번호:1로 표시된 DNA 분자, 또는 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열표에서 서열 확인 번호:1로 표시된 DNA 분자 또는 그의 특정 부분과 혼성화하는 상기 DNA 분자의 유사체에 관한 것이다.
인체 BSSL/CEL DNA 분자를 단리하는데 사용되는 방법이 하기 실시예에 요약되어 있다.
상기의 엄격한 혼성화 조건은 그의 통상의 의미, 즉 샘브룩 등(1989)의 문헌에서와 같은 통상의 실험실 방법에 따라 혼성화를 수행함을 의미한다.
본 발명의 다른 측면은, 혼성 유전자를 보유한 포유류의 성숙한 암컷의 유선에서 발현되는 혼성 유전자를 형성하여 혼성 유전자가 발현될 때 인체 BSSL/CEL가 생산되도록 비인간 포유류의 젖 단백질을 코딩하는 유전자에 삽입된 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 포유류 발현계를 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 상기한 포유류 발현계를 포유류의 수정난 또는 태아 세포에 삽입하여 발현계를 포유류의 배엽으로 혼입시키고, 생성되는 주입된 수정난 또는 태아를 성숙한 암컷 포유류로 성장시키는 것을 포함하는, 인체 BSSL/CEL를 발현시킬 수 있는 형질전이 비인간 포유류의 생산 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
11531 bp의 전체 길이를 갖는, 서열표에 서열 확인 번호:1로 표시된 DNA 분자는 하기의 특징을 지닌다 :
본 명세서에서, 용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬을 생산하는 데 관련되며, 코딩 영역에 선행하거나 뒤따르는 영역 (5'-상류 및 3'-하류 시열)뿐 아니라 개별코딩 단편(소위 엑손) 사이나 5'-상류 또는 3'-하류 영역에 위치하는 개재 서열, 소위 인트론을 포함하는 DNA 서열을 나타내는데 사용된다. 5'-상류 영역은 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열,통상적으로는 프로모터로 이루어진다. 3'-하류 영역은 유전자의 전사 종결에 관련된 서열 및 경우에 따라서는 전사물 및 3' 비해독영역의 폴리아데닐화를 담당하는 서열로 이루어진다.
명세서에 설명된 본 발명의 DNA 분자는 합성 뿐 아니라 천연 DNA 서열로 이루어질 수 있고, 여기서 천연 서열은 대개 하기와 같이 일반적으로는 포유류 기원의 게놈 DNA로부터 직접 유도된다. 합성 서열은 DNA 분자를 합성하는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 또한 DNA, 서열은 게놈과 합성의 혼합에서 유래할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열을 보유하고 그의 발전을 매개할 수 있는 복제 가능한 발현 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서, 용어 "복제 가능"은 벡터가 도입된 주어진 숙주 세포에서 복제철 수 있음을 의미한다. 인체 BSSL/CEL DNA 서열의 바로 상류에는 신호 펩티드클 코딩하는 서열이 제공될 수 있는데, 이의 존재는 벡터를 보유한 숙주 세포에 의해 발현되는 인체 BSSL/CEL의 분비를 보장한다. 신호 서열은 인체 BSSL/CEL DNA 서열에 본래 연관된 것일 수도 있고 다른 데서 유래한 것일 수도 있다.
벡터는 재조합 DNA 방법을 편리하게 적용할 수 있는 임의의 벡터일 수 있고, 도입될 숙주 세포에 따라 벡터가 선택될 것이다. 따라서, 벡터는 자율 복제 벡터, 즉 염색체외 독립체로 존재하는 벡터로서 그의 복제가 염색체의 복제와는 독립적인 벡터일 수 있으며; 이러한 벡터의 예로는 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니-염색체 또는 비루스를 들 수 있다. 별법으로, 벡터는 숙주 세포로 도입되면 숙주 세포 게놈에 통합되고 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다. 적합한 벡터의 예로는 세균 발현 벡터 및 효모 발현 벡터가 있다. 본 발명의 벡터는 상기한 본 발명의 DNA 분자중 임의의 것을 보유할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 복제 가능한 발현 벡터를 보유한 세포에 관한 것이다. 원칙적으로, 이 세포는 모든 종류의 세포, 즉 원핵 세포, 진핵 단세포 생물체 또는 다세포 생물체, 예를 들면 포유류로부터 유래한 세포일 수 있다. 하기에 더 논의되는 포유류의 세포가 목적에 특히 적합한다.
본 발명의 다른 하나의 측면은 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열을 특정 숙주 세포 중에서 복제할 수 있는 벡터 중에 삽입하고, 생성된 재조합 벡터를 적절한 조건 하에서 BSSL/CEL의 발현을 위한 적합한 배양 배지 중에서 또는 배지상에서 성장하는 숙주 세포에 도입한 후,인체 BSSL/CEL를 회수하는, 재조합 인체 BSSL/SEL의 제조 방법에 관한 것이다.
세포를 성장시키는데 사용되는 배지는 목적에 적합한 임의의 통상의 배지일 수 있다. 적합한 벡터는 상기한 벡터 중 임의의 것일 수 있고, 적절한 숙주 세포는 상기한 세포 종류 중 임의의 것일 수 있다. 벡터를 제고하고 그것을 숙주 세포에 도입시키는 데 사용되는 방법은 재조합 DNA 분야에서 상기 목적으로 공지된 임의의 방법일 수 있다. 세포에 의해 발현되는 재조합 인체 BSSL/CEL은 세포 종류 및 벡터의 구성에 따라 분비, 즉 세포막을 통해 방출될 수 있다.
인체 BSSL/CEL가 재조합 숙주에 의해 세포내에서 생산되는 경우, 즉 세포에의해 분비되지 않는 경우에는, 음파처리 또는 균질화 등의 기계적 수단, 또는 효소적 또는 화학적 수단에 의한 세포 파괴 후 정제하는 표준적인 방법에 의해 회수할 수 있다.
분비되기 위해서는, 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열에 신호 펩티드를 코딩하는 서열이 선행해야 하는데, 이의 존재가 세포로부터 인체 BSSL/CEL의 분비를 보장하므로 발현되는 인체 BSSL/CEL의 적어도 상당 부분이 배양 배지로 분비되고 회수된다.
본 발명의 재조합 인체 BSSL/CEL을 생산하는 현재의 바람직한 방법은 그의 젖으로 인체 BSSL/CEL를 방출시킬 수 있는 형질전이 비인간 포유류를 사용하는 것이다. 형질전이 비인간 포유류를 사용하는 경우 고수율의 재조합 인체 BSSL/CEL를 저렴한 가격으로 얻을 수 있고, 특히 비인간 포유류가 소인 경우, 재조합 인체 BSSL/CEL가 예를 들면 유아용 조제 분유 등의 일반 성분인 젖 중에 생산되므로 재조합 인체 BSSL/CEL를 우유-기재 제품 중의 영양 보충물로 사용하려는 경우에 대규모 정제를 필요로 하지 않는다. 또한, 비인간 포유류와 같은 고등생물에서 생산하면 상기의 후해독 프로세싱 및 적절한 폴딩 등의 면에서 포유류 단백질의 올바른 프로세싱으로 이어진다. 또한 실질적으로 순수한 인체 BSSL/CEL을 다량으로 얻을 수도 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 중요한 측면은 그 혼성 유전자를 보유한 포유류의 성숙한 암컷의 유선에서 발현될 수 있는 혼성 유전자를 형성하도록 비인간 포유류의 젖 단백질을 코딩하는 유전자에 삽입된, 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열을포함하는 포유류 발현계에 관한 것이다.
인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열은 바람직하게는 서열표에 서열 확인번호:1로 표시된 DNA 서열 또는 게놈의 인체 BSSL/CEL 유전자 또는 그의 유사체이다.
젖 단백질은 유선에서 본래 고발현 수준으로 생산되므로, 발현 조직으로서의 유선 및 젖 단백질을 코딩하는 유전자는 일반적으로 형질전이 비인간 포유류에서 이종 단백질을 생산하는 데 사용하기에 특히 적합하다고 여겨진다. 또한, 젖은 용이하게 수거되고 다량으로 얻을 수 있다. 본 발명에서 재조합 인체 BSSL/CEL의 생산에 젖 단백질 유전자를 사용하는 것은 발현의 조절 및 생산 부위(유선) 면에서 자연적인 생산 조건과 유사한 조건 하에서 생산된다는 또다른 장점을 갖는다.
본 명세서에서 용어 "혼성 유전자"는 한편으로는 상기한 바와 같이 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열 및 다른 한편으로는 혼성 유전자 생성물의 발현을 매개할 수 있는 젖 단백질 유전자의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 나타낸다. 용어 "젖 단백질을 코딩하는 유전자"는 대상 조직, 즉 유선으로의 혼성 유전자의 발현을 매개하고 표적화할 수 있는 전체 유전자 및 그의 부분서열을 의미한다. 통상적으로, 상기 부분서열은 적어도 1종 이상의 프로모터 영역, 전사 개시 부위, 3' 및 5' 비코딩 영역 및 구조 서열을 보유하는 서열이다. 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA서열은 클로닝 등에 뒤이어 그것과 연결될 수 있는 원핵 세포 서열, 예를 들면 벡터 서열이 실질적으로 없는 것이 바람직하다.
혼성 유전자는 바람직하게는 시험관내에서 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열을 당업계에 공지된 기술을 사용하여 젖 단백질 유전자에 삽입함으로써 형성된다. 별법으로, 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열은 생체내에서 동종 재조합에 의해 삽입될 수 있다.
일반적으로, 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열은 선택된 젖 단백질 유전자의 첫번째 엑손 중의 하나, 또는 첫번째 엑손과 바람직하게는 조절상 중요성을 지닌 것으로 추정되는 5' 플랭킹 서열의 상당한 부분으로 이루어지는 그의 유효 부분서열 중에 삽입된다.
혼성 유전자는 혼성 유전자 생성물이 유선으로 적절히 분비될 수 있도록 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 대개 신호 펩티드는 문제의 젖 단백질 유전자에서 정상적으로 발견되는 것이거나 또는 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열에 연결된 것이다. 그러나,유선으로의 혼성 유전자 생성물의 분비를 매개할 수 있는 다른 신호 서열 또한 적합하다. 물론, 혼성 유전자의 각종 요소는 유전자 생성물의 올바른 발현 및 프로세싱을 가능하게 하도록 융합되어야 한다. 따라서, 일반적으로 선택된 신호 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열의 N-말단부에 정확하게 융합되어야 한다. 혼성 유전자에서, 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열은 일반적으로 그의 정지 코돈을 포함하지만 그 자체의 메세지 절단 및 폴리아데닐화 부위는 포함하지 않는다. 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열의 하류에는, 젖 단백질 유전자의 mRNA 프로세싱 서열이 통상 유지될 것이다.
다수의 요인이 특정 혼성 유전자의 실제 발현 수준에 영향을 주는 것으로 추정된다. 상기한 다른 조절 서열 및 프로모터의 능력, 포유류 게놈 중의 발현계의 통합 부위, 젖 단백질 코딩 유전자 중의 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열의 통합 부위, 전사후 조절에 관여하는 요소 및 다른 유사 인자들이 발현 수준을 얻는데 있어서 매우 중요할 수 있다. 혼성 유전자의 발현 수준에 영향을 미치는 각종 요인에 대한 지식을 근거로 하여, 당업자는 본 발명의 목적에 유용한 발현계를 고안하는 방법을 인지할 것이다.
다양한 각종 젖 단백질이 유선에 의해 분비된다. 젖 단백질의 두가지 주요 종류는 말하자면 카제인 및 유청 단백질이다. 상이한 종으로부터의 젖 성분은 이들 단백질의 질 및 양에 있어서 다양하다. 대부분 비인간 포유류는 3가지 상이한 종류의 카제인, 즉 α-카제인, β-카제인 및 κ-카제인을 생산한다. 가장 일반적인 소 유청 단백질은 α-락트알부민 및 β-락트알부민이다. 다양한 급원으로부터의 젖의 성분이 클라크 등(1987)에 의한 문헌에 상세히 기재되어 있다.
사용되는 젖 단백질 유전자는 발현계가 삽입되는 동일한 종으로부터 유도될 수 있거나, 또는 다른 종으로부터 유도될 수 있다. 이러한 면에서 유선으로의 유전자 발현을 표적화하는 조절 요소는 종의 경계를 기능적으로 넘을 수 있는데, 이는 공통 조상의 가능성 때문이다(Hennighausen 등, 1990).
본 발명의 발현계의 제조에 사용되는 젖 단백질 또는 그의 효과적인 부분서열을 코딩하는 적합한 유전자의 예는 일반적으로 각종 포유류 기원의 유청 단백질, 예를 들면 바람직하게는 쥐에서 얻어지는 유청 산성 단백질(WAP) 유전자 및 바람직하게는 양에서 얻어지는 β-락토글로불린 유전자 중에서 발견된다. 또한 각종 급원의 카제인 유전자가 인체 BSSL/CEL의 형질전이 생산에 적합한 것으로 밝혀질 수 있고, 예를 들면 소 αS1-자제인 및 토끼 β-카제인이 있다. 현재 바람직한 유전자는여러 형질전이 동물의 젖 중에 다수의 외래 인체 단백질을 고도의 수준으로 발현시킬 수 있는 것으로 밝혀진 쥐 WAP 유전자이다(Hennighausen 등, 1990).
본 발명의 발현계와 연관된 다른 바람직한 서열은 고도의 발현을 매개할 수 있는 소위 발현 안정화 서열이다. 이러한 안정화 서열이 젖 단백질 유전자의 주변 및 상류에서 발견된다는 명백한 증거들이 있다.
본 발명의 발현계에 삽입되는 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열은 게놈 또는 합성원 또는 임의의 그의 혼합물일 수 있다. 몇몇 발현계는 만족스러운 발현을 얻기 위해 인트론 및 그의 조절 부위를 필요로 하는 것으로 나타났다(Hennighausen 등, 1990). 어떤 경우에는 벡터 구조물에 폴리펩티드 코딩 요소로서 cDNA 보다는 게놈 구조를 도입하는 것이 유리할 수 있다(Brinster 등). 인트론과 엑손 구조는 cDNA 기재 벡터를 사용할 경우 얻을 수 있는 것보다 높은 정상상태 mRNA 수준을 가져올 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 비인간 포유류의 젖 단백질을 코딩하는 유전자에 삽입된 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열로서, 혼성 유전자를 보유한 포유류의 성숙한 암컷의 유선에서 발현되도록 젖 단백질 유전자에 삽입된 DNA 서열을 포함하는 혼성 유전자에 관한 것이다. 혼성 유전자 및 그의 성분은 위에서 상술되었다. 혼성 유전자는 상기한 본 발명의 발현계의 제조에서 중요한 중간체를 구성한다.
본 발명의 또다른 측면은 상기 발현계를 보유하는 비인간 포유류 세포에 관한 것이다. 포유류 세포는 바람직하게는 태아 세포 또는 전핵(pro-nucleus)이다. 발현계는 바람직하게는 하기에 설명되고 특히 하기 실시예로 예시되는 방법을 사용하여 포유류 세포 중에 적절히 삽입된다.
본 발명의 보다 중요한 측면은 발현계가 포유류의 배엽에 혼입되도록 상기 본 발명의 발현계를 포유류의 수정난 또는 태아 세포에 주입하고, 생성되는 주입된 수정난 또는 태아를 성숙한 암컷 포유류로 성숙시키는 것을 포함하는, 인체 BSSL/CEL를 발현시킬 수 있는 형질전이 비인간 포유류를 생산하는 방법에 관한 것이다.
발현계의 포유류 배엽으로의 혼입은 임의의 적합한 기술, 예를 들면 문헌["Manipulating the Mouse Embryo", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986]에 기재된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 수백개의 발현계가 선택된 포유류의 수정난, 예를 들면 수정된 1 세포 단계의 난자 또는 그의 전핵, 또는 태아에 직접 주입될 수 있고, 이어서 미세주입된 난자를 가임 수양모의 수란관으로 옮긴 후 성장시킬 수 있다. 일반적으로, 주입된 난자 모두가 인체 BSSL/CEL를 발현시키는 성숙 암컷으로 성장하지는 않는다. 따라서, 통계학적 괸점에서 포유류 중 약 반은 다음 세대에서 그로부터 암컷이 출생할 수 있는 수컷일 것이다.
일단 배엽에 통합된 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열은 대상 포유류의 안정한 세포주에서 바람직하게 프로세싱된 기능성 인체 BSSL/CEL를 고도로 발현시킬 수 있다.
(a) 실질적으로 포유류의 BSSL/CEL가 발현될 수 없도록 포유류의 포유류 BSSL/CEL 발현능을 제거하고, 상기한 본 발명의 발현계 또는 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열을 인체 BSSL/CEL를 포유류에서 발현시키는 방식으로 포유류의 배엽에 삽입하는 단계; 및(또는) (b) 포유류의 BSSL/CEL 유전자 또는 그 일부를 상기한 본 발명의 발현계 또는 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열로 대체시키는 단계를 포함하는, 인체 BSSL/CEL는 발현시킬 수 있고 실질적으로 포유류자체로부터의 BSSL/CEL는 발현시킬 수 없는 형질전이 비인간 포유류의 생산 방법에 더 관심이 있다.
포유류 BSSL/CEL의 발현능은 편리하게는 BSSL/CEL의 발현을 담당하는 DNA 서열에 변이를 유도함으로써 제거한다. 이러한 변이는 DNA 서열을 프레임에서 이탈시키거나, 정지 코돈의 도입 또는 DNA 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 삭제하는 변이로 이루어질 수 있다.
포유류의 BSSL/CEL 유전자 또는 그 일부는 동종 재조합의 널리 공지된 원리를 사용하여 상기한 발현계 또는 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 DNA 서열로 대체될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 방법에 의해 제조된 형질전이 비인간 포유류에 관한 것이다.
본 발명의 형질전이 비인간 포유류가 그의 가장 넓은 측면에서는 특정 유형의 포유류에 제한되지 않지만, 생쥐, 쥐, 토끼, 양, 돼지, 염소 및 소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 일반적이다. 인체 BSSL/CEL의 대규모 생산의 경우 일반적으로 양, 염소, 돼지 및 특히 소와 같이 큰 동물이 그의 높은 젖 생산으로 인해 선호된다. 그러나, 생쥐, 토끼 및 쥐 또한 이들 동물의 조작이 보다 간단하고,예를들면 소에 관한 경우보다 더 신속히 형질전이 동물을 생산한다는 사실 때문에 관심을 가질만하다.
또한 인체 BSSL/CEL를 생산할 수 있는 상기한 형질전이 포유류의 자손도 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 다른 하나의 측면에는 재조합 인체 BSSL/CEL를 포함하는, 비인간 포유류로부터의 젖이 포함된다.
본 발명의 또하나의 측면은 재조합 인체 BSSL/CEL, 특히 상기한 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 유아용 조제 분유에 관한 것이다. 유아용 조제 분유는 재조합 인체 BSSL/CEL 또는 정제되거나 또는 부분 정제된 형태의 폴리펩티드를 유아용 조제 분유의 일반 성분엔 첨가함으로써 제조할 수 있다. 그러나, 일반적으로 특히 소 급원일 경우에는 상기 본 발명의 젖으로 유아용 조제 분유를 제조하는 것이 바람직하다. 유아용 조제 분유는 통상의 방법을 사용하여 제조할 수 있고 미네랄, 비타민 등과 같은 필요한 첨가제를 함유할 수 있다.
실시예
실시예 1 : CEL 유전자의 게놈 구성, 서열 분석 및 염색체상 위치확인
별기가 없는 한 표준적인 분자 생물학 기술을 사용하였다(Maniatis 등, 1982; Ausubel 등, 1987; Sambrook 등, 1989).
게놈 재조합체의 단리
2개의 상이한 인체 게놈 파지 라이브러리인 λDASH(미합중국 캘리포니아주 팔로 알토 소재, Clonentech Laboratories Inc.) 및 λEMBL-3 SP6/T7(미합중국 캘리포니아주 라졸라 소재, Stratagene)을 올리고표지화 기술(Feinberg 등, 1983)에 의해 [α-32P]dCTP로 표지된 각종의 서브클로닝된 cDNA 제한 단편(Nilsson 등, 1990)을 프로프로서 사용하여 플라그 혼성화함으로써 스크리닝하였다.
게놈 클론의 매핑(Mapping), 서브클로닝 및 서열결정
양성 클론을 각종 제한 효소로 소화시키고, 1 %의 아가로스겔 상에서 전기영동시킨 후 나일론 막으로 진공전이시켰다 (스웨덴 왕국 웁살라 소재, Pharmacia). 막을 각종 cDNA 프로브와 혼성화시켰다. 프로브로 혼성화시킨 제한 단편을 등속도이동법(Ofverstedt 등, 1984)을 사용하여 단리하였다. 800 bp 이하의 소단편은 숙주 박테리아로서 대장균 TG1을 사용하여 M13mp18, M13mp19, M13BM20 또는 M13BM21 벡터에 직접 삽입 및 서열결정하였고, 반면에 거대 단편은 숙주 박테리아로서 대장균 DH5α를 사용하여 pTZ18R 또는 pTZ19R 벡터로 서브클로닝시키고, 더 소화시켰다. (따라서 하기 실시예 2에 사용되는 플라스미드 pS309, pS310 및 pS451가 생산되었다.) 또한 단리된 단편 중 몇몇은 혼성화에서 프로브로서 사용하였다. 뉴클레오티드 서열 모두를 클리노(Klenow) 효소 및 또한 측정 올리고뉴클레오티드의 M13 보편 서열결정 프라이머를 사용한 디데옥시 사슬 종결화법(Sanger 등, 1977)으로 동정하였다. 서열 정보를 쇠베르크 등(Sjoberg, 1989)에 의해 기재된 바와 같이 소프트웨어 MS-EdSeq를 사용하여 자동 방사선 사진으로부터 얻었다. 서열을 UWGCG 소프트웨어 패키지사(Devereux 등, 1984)에서 제공받은 프로그램을 사용하여 분석하였다.
프라이머 연장
구아니디늄 이소티오시아네이트-CsCl 방법(Chirgwin 등, 1979)에 의해 인체췌장, 젖분비 유선 및 지방 조직으로부터 전체 RNA를 단리하였다. 프라이머 연장을 전체 RNA 및 nt 위치 33-58의 안티센스 26-머 올리고뉴클레오티드(5'-AGGTGAGGCCCAACACAACCAGTTGC-3')를 사용하여 문헌 (Ausubel 등, 1987)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 전체 RNA 20 ㎍과 프라이머의 혼성화를 30℃에서 0.9 M NaCl, 0.15 M Hepes pH 7.5 및 0.3 M EDTA 30 ㎕중에서 철야로 수행하였다. 역전사에 의한 연장 반응이 완료된 후, 연장 생성물을 6 %의 변성 폴리아크릴아미드겔을 통한 전기영동으로 분석하였다.
체세포 혼성물
CEL 유전자의 염색체상 위치확인을 위해 NIGMS 인체 유전자 변이 세포 기탁소(Human Genetic Mutant Cell Repository)(뉴저지주 캠덴 소재, 코리엘 의학 연구소)에서 제공받은 16개의 인체-설치류 체세포 혼성 세포주에서 얻은 DNA를 사용하였다. 이 인체-생쥐 체세포 혼성물 GM09925 내지 GM09940을 인체 남성 태아의 섬유아세포(IMR-91)와 티미딘 키나제 결핍 생쥐 세포 세포주 B-82(Taggart 등, 1985; Mohandas 등, 1986)와의 융합을 통해 유도된 것이다. 혼성물 GM10324 및 GM02860은 HPRT 및 APRT 결핍 생쥐 세포 세포주 A9(Callen 등, 1986)에서 얻은 반면, 혼성물 GM10611은 레트로비루스 벡터 SP-1으로 감염된 인체 림프아세포 세포주 GM07890와 중국 햄스터 난소 세포주 UV-135의 미소세포 융합에서 얻어진 것이다(Warburton 등, 1990). 혼성물 GM10095는 균형화된 46,X,t(X;9)(Q13;34) 핵형의 암컷으로부터의 림프구와 중국 햄스터 세포주 CHW1102의 융합을 통해 유도하였다(Mohandas 등,1979). 세포 유전자 분석 및 써던 블라트 분석(Southern blot analysis) 및 계내 (in-situ) 혼성화 분석으로 동정한 혼성 세포주의 인체 염색체 함량을 표 1에 나타내었다. 생쥐, 중국 햄스터 및 인체 어버이 세포주 및 16개 혼성 세포주로부터 단리한 고분자량의 DNA를 EcoRI로 소화시키고, 0.8 %의 아가로스겔 중에서 분획화하고, 나일론 필터로 옮겼다. [α-32P]dCTP-표지된 CEL cDNA 프로브(완전한 길이의 cDNA)를 올리고표지화(Feinberg 및 Vogelstein, 1983)로 제조하고 필터에 혼성화시켰다. 필터를 65 ℃의 6 x SSC/0.5 % SDS 및 2 x SSC/0.5 % SDS 중에서 각각 60 분간 세척하였다.
폴리머라제 연쇄 반응
백혈구에서 단리한 전체 인간 게놈 DNA, 체세포 혼성물 및 양성 게놈 재조합 체로부터의 DNA, 및 인체 젖분비 유선 및 인체 췌장으로부터의 전체 RNA를 엑손10 및 엑손 11에 대해 증폭시켰다. DNA 2 ㎍을 사용하였다. 사용된 프라이머를 표 2에 기재하였다. 모든 프라이머 쌍에 대해 부피 100 ㎕[10 mM 트리스-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM의 각 dNTP, 100 ㎍/㎖ 젤라틴, 100 pmol의 각 프라이머, 1.5 U의 Taq DNA 폴리머라제(미합중국 코네티컷주 노르워크 소재, Perkin-Elmer Cetus사 제품)] 및 어닐링 온도 55 ℃로 PCR을 30회 수행하였다. 상보적 DNA(cDNA)와 PCR 방법을 결합하여 RNA 서열을 증폭시켰다. 42 ℃에서 30분간 50 mM 트리스-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl 10 mH MgCl2, 10㎍/㎖ BSA, 1 mM의 각 dNTP, 500 ng의 올리고(dt)12-18, 40 U의 리보뉴클레아제억제제, 및 200 U의 역전사효소(MoMuLV)(미합중국 뉴욕주 소재, BRL, Bethesda Research Laborataries)를 함유한 용액 40 ㎕ 중의 전체 RNA 10 ㎍으로부터 cDNA를 합성하였다. cDNA를 H2O 25 ㎕ 중에 침전 및 재현탁시키고; 그 중 2㎕를 상기한 바와 같이 증폭시켰다. 증폭된 단편을 2 %의 아가로스겔 상에서 분석하였다. 상기 단편 중 몇몇을 추가로 서브클로닝하고 서열결정하였다.
인체 CEL 유전자의 유전자 구조
각 게놈 라이브러리에서, 106재조합체를 스크리닝하였고 스크리닝 결과 모두 단리되고 매핑된 몇몇 양성 클론을 얻었다. λBSSL1 및 λBSSL5A로 명시된 2개의 클론을 더 분석하였다. 몇몇 효소로 제한 효소 소화를 실행하고, 써던 블라팅한 후 cDNA 프로브로 혼성화한 결과, λBSSL5A 클론은 전체 CEL 유전자에 걸쳐 존재하고 λBSSL1 클론은 5'-중간 및 약 10 kb의 5'-플랭킹 부위에 걸쳐 존재하는 것으로 나타났다(제1도). 이들 2개의 클론은 함께 약 25 kb의 인체 게놈에 걸쳐 존재한다.
서브클로닝 및 제한 효소 소화 후, 서열결정에 적합한 단편을 얻었고, 1640 bp의 5'-플랭킹 부위 및 41 bp의 3'-플랭킹 부위를 포함한 CEL 유전자의 전체 서열을 결정할 수 있었다. 이들 데이타는 인체 CEL 유전자(서열 확인 번호:1)가 10 인트론이 사이에 끼어있는 11 엑손을 포함하며, 9850 bp의 영역을 아우른다는 것을 나타내었다(제1도). 이는 엑손 및 특히 인트론이 비교적 작음을 의미한다. 사실상, 엑손 1-10은 87-204 bp의 크기이고 반면에 엑손 11은 841 bp의 길이이다. 인트론들은 각기 85-2343 bp의 크기이다. 표 3에서 볼 수 있듯이, 모든 엑손/인트론의 범위는 AT/GT 법칙에 따르고 마운트 등(Mount, 1990)이 제시한 컨센서스 서열에 들어맞았다. CEL 유전자의 코딩 부분을 cDNA와 비교할 경우 (Nilsson 등, 1990), 뉴클레오티드 서열에 있어서 단지 하나의 차이만이 발견되었다 (엑손 1에서의 두번째 nt가 C이고, 이는 cDNA에서는 T이다). 상기 위치가 해독 개시 코돈 ATG의 상류쪽으로 10 nt째에 위치하기 때문에, 이 차이는 아미노산 서열에는 영향을 미치지 않는다.
이 서열 결정된 영역에는 반복적 DNA 요소 중 Alu 류에 속하는 일곱 개 (도 1에서 Alu1-Alu7(5'-3')으로 표지)가 있으며, 하나는 5'-플랭킹 영역에, 그리고 여섯 개는 CEL 영역에 존재한다.
전사 개시 부위 및 5'-플랭킹 영역
인체 CEL 유전자 전사 개시 부위(들)를 매핑하기 위해 인체의 췌장, 수유중인 유선 및 지방 조직으로부터의 전체 RNA를 사용하여 프라이머 연장 분석을 수행하였다. 결과는 주전사 개시 부위는 출발 메티오닌으로부터 상류쪽으로 12 bp에 위치하고, 부전사 부위는 8 염기에 위치하는 것으로 나타났다. 전사 개시 부위는 췌장 및 수유중인 유선에서는 동일한 반면 지방 조직에서는 아무런 신호를 감지할수 없었다(제2도). 서열결정 영역에는 5'-플랭킹 DNA의 1640 nt가 포함된다. 서열 유사성을 근거로, TATA-박스형 서열인 CATAAAT가 전사 개시 부위의 상류로 30 nt에서 발견되었다(제4도). CAAT-박스 구조 또는 GC 박스는 둘다 이 영역에 나타나지 않았다.
그외 유선- 및 췌장-특이적 유전자에서 전사 인자 결합 서열로 공지되어 있는 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'-플랭킹 서열의 스트랜드(strand) 2개 모두를 컴퓨터 스크리닝하였다. 인지 서열로 추정되는 몇몇을 발견하였다(제4도 참고).
CEL 유전자의 염색체상 위치확인
생쥐 및 햄스터 조절 DNA에서는 각각 약 25 kb 및 8.6 kb의 단독 단편만이 검출된 반면, 인체 조절 DNA에서는 CEL cDNA 프로브가 약 13 kb, 10 kb, 2.2 kb 및 2.0 kb의 4개의 EcoRI 단편을 검출하였다. 혼성 클론 중의 인체 CEL 유전자 서열의 존재 여부는 인체 염색체 9의 존재와만 상호 연관성이 있다(표 1). 분석된 16개의 혼성물 중 단지 1개만이 인체 CEL 유전자에 대해 양성이었고; 이 혼성물은 인체 염색체로서 염색체 9만을 함유하였다. 상기 염색체로 위치를 추정하는 데에는 불일치가 발견되지 않은 반면, 다른 임의의 염색체로 위치를 추정하기에는 2개 이상의 불일치가 있었다(표 1). CEL 유전자를 추가로 세부위치를 확인하기 위해 본 발명자들은 데르(der)(9) 전위(translocation) 염색체(9pter 9q34:Xq13 Xqter)를 단지 1개의 인체 DNA로서 보유하는 인체-중국 햄스터 혼성물(GM10095)을 사용하였다. 본 발명자들은 써던 블라트로는 이 혼성물에서 임의의 CEL 유전자 서열을 검출하지 못했고, 이는 CEL 유전자 잔기가 9q34qter 영역 내에 있음을 나타낸다.
실시예 2 : 발현 벡터의 제조
형질전이 동물로부터의 젖에서 재조합 인체 CEL을 생산하기 위한 발현 벡터를 제조하기 위해 하기의 방법을 사용하였다(제5도).
상이한 부분의 인체 CEL 유전자를 함유하는 3가지의 pTZ 기재 폴라스미드(스웨덴 왕국 웁살라 소재, 파마시아사 제품)인 pS309, pS310 및 pS311을 상기 방법을 사용하여 얻었다. 플라스미드 pS309는 CEL 유전자의 5' 비전사 부위부터 4째 인트론 부분까지 존재하는 SphI 단편을 포함한다. 플라스미드 pS310은 CEL 유전자의 첫째 인트론부터 6째 인트론 부분까지 존재하는 SacI 단편을 포함한다. 세번째로, 플라스미드 pS311은 CEL 유전자 변형체의 5째 인트론의 대부분 및 인트론/엑손 구조의 나머지가 존재하는 BamHI 단편을 포함한다. 상기 플라스미드에서, 일반적으로 16회 반복을 코딩하는 엑손 11의 반복 서열이 9회 반복을 갖는 절단된 변형체를 코딩하도록 변이되었다.
플라스미드 pUC19의 HindIII 및 SacI 부위 중에 클로닝된 인체 CEL cDNA 일부를 함유하는 또다른 플라스미드 pS283을 게놈 서열의 융합에 사용하였다. 또한 pS283을 CEL의 5' 미해독 리더 서열에 위치하는 편리한 제한 효소 부위 kpnI를 얻는데도 사용하였다. 이어서 플라스미드 pS283을 NcoI 및 SacI로 소화시키고 약 2.7 kb의 단편을 단리하였다. 플라스미드 pS309를 NcoI 및 BspEI로 소화시키고 CEL 유전자의 5'-부분을 함유하는 약 2.3 kb의 단편을 단리하였다. 플라스미드 pS310을 BspEI 및 SacI로 소화시키고 CEL 유전자의 중간 부위의 일부를 함유하는 약 2.7 kb의 단편을 단리하였다. 상기 3가지 단편을 결합시키고 적당한 대장균 균주 TG2를 형질전환시키고, 형질전환체를 암피실린 선택으로 단리하였다. 다수의 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하고, 바람직한 구조물을 포함하는 pS312로 불리는 하나의 플라스미드(제6도)를 이후 실험에 사용하였다.
정지 코돈의 하류에 위치한 BamHI 부위가 SalI 부위로 전환되어 추가의 클로닝을 촉진시키도록 하는 pS311의 변형을 수행하기 위해, 하기 방법을 사용하였다. pS311을 BamHI에 의한 부분 소화로 선형화하였다. 선형화된 단편을 단리하고,BamHI를 SalI 부위(5'-GATCGTCGAC-3')로 전환시킨 후 이어서 BamHI 부위를 제거하는 합성 DNA 링커(linker)를 삽입하였다. 합성 링커의 통합을 위한 2개의 가능한 부위가 있기 때문에, 생성되는 플라스미드를 제한 효소 절단에 의해 분석하였다. 엑손 11의 바람직한 하류 위치에 삽입된 링커를 갖는 플라스미드를 단리하고 pS313으로 명시하였다.
CEL 게놈 서열을 보유하고 절단된 CEL 변형체를 코딩하는 발현 벡터 구조물을 얻기 위해, 젖 분비 기간 중 유선 세포 중에서의 매개 단계 및 조직 특이적 발현을 위해 고안된 플라스미드 pS314를 사용하였다. 플라스미드 pS314는 생쥐의 유청 산성 단백질(WAP) 유전자로부터 NotI 단편으로서 클로닝한 게놈 단편을 포함한다(Campbell 등, 1984). 게놈 단편은 약 4.5 kb의 상류의 조절 서열(URS) 및 엑손/인트론의 전체 전사된 부위 및 약 3 kb의 최종 엑손의 하류 서열을 갖는다. 독특한 KpnI 부위는 천연 WAP 해독 개시 코돈의 상류로 24 bp인 첫째 엑손에 위치한다. 다른 독특한 제한 효소 부위는 엑손 3에 위치하는 SalI 부위이다. pS314에서, 상기 SalI 부위는 소화, 클리노를 사용한 보충 및 재결합으로 제거하였다. 대신에, 새로운 SalI 부위를 엑손 1 중의 KpnI의 하류에 직접 도입하였다. 이는 상기 위치에서 KpnI 소화 및 서서히 달구어진 합성 올리고머 SYM 2401 5'-CSTCGACGTAC-3' 및 SYM 2402 5'-GTCGACGGTAC-3'의 도입에 의해 수행하였다(제8도). 인체 CEL 게놈 서열을 하기 방법으로 이들 부위, KpnI 및 SalI 사이에 삽입하였다. 첫째로, pS314를 KpnI 및 SalI로 소화시키고 절단된 플라스미드를 나타내는 단편을 전기영동적으로 단리하였다. 둘째로, ps312를 KpnI 및 BamHI로 소화시키고 인체 CEL 유전자의 5' 부분을 나타내는 약 4.7 kb의 단편을 단리하였다. 세째로, pS313을 BamHI 및 SalI로 소화시키고 인체 CEL 유전자의 3'-부분을 단리하였다. 상기 3개의 단편을 결합시키고, 적당한 대장균 박테리아로 형질전환시키고 암피실린 선택 후 형질전환체를 단리하였다. 플라스미드를 몇몇 형질전환체로부터 제조하고 제한 효소 매핑 및 서열 분석으로 조심스럽게 분석하였다. 바람직한 발현 벡터를 나타내는 하나의 플라스미드를 규정하고 pS317로 명시하였다.
완전한 길이의 CEL를 코딩하는 게놈 CEL 발현 벡터를 제조하기 위해, pS317을 하기와 같이 변형시켰다(제5도). 첫째로, 인체 CEL의 5째 인트론부터 11째 엑손까지 늘어져 있는 5.2 kb의 BamHI 단편을 함유하는 pTZ18R 플라스미드(파마시아사 제품), pS451을 HindIII 및 SacI로 소화시켰다. 소화로 인해 인트론 9에 위치한 HindIII 부위부터 엑손 11에 위치한 SacI 부위까지 늘어져 있는 약 17 kb의 단편을 생성시켰다. 둘째로, 플라스미드 pS313을 SacI 및 SalI로 소화시키고, 엑손11의 3' 부분을 포함하는 71 bp의 단편 및 발생된 SalI 부위를 단리하였다. 세째로, pS317로부터 약 20 kb의 SalI/HindIII 단편으로서 WAP/CEL 재조합 유전자의 나머지 및 플라스미드 서열을 단리하였다. 상기 3가지 단편을 결합시키고 박테리아에 형질도입시켰다. 몇몇 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드를 각종 제한 효소로 소화시키고 서열 분석하였다. 바람직한 재조합 유전자를 포함하는 하나의 플라스미드를 동정하였다. 이 최종 발현 벡터를 pS452로 명시하였다(제7도).
원핵 세포 플라스미드 서열을 제거하기 위해, pS452를 NotI로 소화시켰다. 이어서 인체 CEL 게놈 단편에 이웃한 생쥐의 WAP 서열을 포함하는 재조합 벡터요소를 아가로스 전기영동으로 단리하였다. 단리된 단편을 생쥐 태아로 주입하기전, 전기용출을 사용하여 더 정제하였다.
형질전이 동물의 유선에서 발현시키기 위한 재조합 WAP/CEL 유전자를 제8도에 나타내었다.
기탁
부다페스트 조약에 따라 하기의 플라스미드를 DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에 기탁하였다 :
실시예 3 : 형질전이 동물의 생산
NotI 단편을 실시예 2에 따라 플라스미드 pS452로부터 단리하였다. 상기 DNA 단편은 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 게놈 서열에 연결된 생쥐 WAP 프로모터를 포함하였다. 3 ng/㎕ 농도의 단리된 단편을 과배란을 의해 임신한 암말 혈청 고나도트로핀 5 IU로 프라임된 공여자 생쥐로부터 얻은 350 C57Bl/6J x CBA/2J-f2태아의 전핵으로 주입하였다. C57Bl/6J x CBA/2J-f2동물은 덴마크 라이에 소재한 봄홀트가르트 브리딩 앤드 리써치 센터 엘티디(Bomgoldgard Breeding and Research Centre LTD)에서 얻었다. 수란관에서 태아를 수거한 후, 이를 배지 M2 중에서 히알우론산 분해 효소로 처리하여 퇴적 세포로부터 분리시켰다(Hogan 등, 1986). 세척 후 태아를 배지 M16으로 옮기고(Hogan 등, 1986), 5 % CO2-분위기의 인큐베이터 중에 두었다. 나리시끼(Narishigi) 수압 미세조절기 및 노말스키(Nomarski) 광도계를 갖춘 니콘(Nikon) 역현미경을 사용하여 농도가 옅은 파라핀 오일 하에서 M2의 미적 중에 주입을 수행하였다. 주입 후, 건강해 보이는 태아를 2.5 %의 아베르틴 0.37 ㎖를 복막내로 투여한 가임 O57Bl/6J x CBA/2J-f1피시험 동물에 이식하였다. 통합된 형질전이된 유전자를 가진 쥐에 대해 동물의 출생 후 3주째에 얻은 꼬리 생검 표본에서 얻은 DNA를 PCR 분석하였다. 써던 블라트 분석으로 양호한 결과를 확인하였다.
실시예 4 : 형질전이 생쥐에서의 BSSL/CEL 발현
형질전이 생쥐를 절제된 꼬리 샘플로부터 수득한 DNA를 분석하여 동정하였다. 조직 샘플을 단백질 분해 효소 K로 인큐베이트 시키고 페놀/클로로포름으로 추출하였다. 발현 벡터 단편을 나타내는 이형으로 도입된 DNA가 존재하는 경우에는 단리된 DNA를 특정 단편을 증폭시키는 프라이머와의 폴리머라제 사슬 반응에 사용하였다. 또한 PCR 데이타를 확인하고, 통합된 벡터 요소의 가능한 재배열 및 구조를 시험하며 통합된 벡터 요소의 개수에 대한 정보를 얻기 위해 동물을 DNA 혼성화 실험으로 분석하였다.
일련의 실험에서, 18 마리의 생쥐를 2가지 방법으로 분석하였고 결과는 1마리의 쥐가 pS452로부티 유도된 이형 DNA 벡터 요소를 갖는 것으로 나타났다. PCR 분석 및 혼성화 실험으로부터의 결과는 동일하였다(제9도).
이어서 벡터 DNA 요소를 갖는 것으로 동정된 생쥐(기초 동물)를 교배시키고동일한 방법으로 형질전이에 대해 F1 리터를 분석하였다.
암컷 수유 동물을 2 IU의 옥시토신을 복막내로 주입하고 10분 후 2.5 %의 아 베르틴 0.40 ㎖를 복막내로 투여하여 마취시켰다. 젖 수거 장치를 실리콘화 튜브를 통해 젖꼭지에 부착하고 유선을 부드럽게 마사지하여 1.5 ㎖의 에펜도르프(Eppendorf) 튜브로 수거하였다. 젖의 양은 젖분비일에 따라 쥐 및 수거 당 0.1 내지 0.5 ㎖로 다양하였다.
재조합 인체 BSSL/CEL의 존재에 대한 분석을 SDS-PAGE로 수행하고, 니트로셀룰로오스막으로 전이시키고 천연의 인체 BSSL/CEL에 길항하여 발생한 다클론성 항체로 인큐베이트시켰다. 재조합 인체 BSSL/CEL가 형질전이 쥐의 젖에서 발현됨을 나타내는 결과를 얻었다. 제10도는 형질전이 쥐의 젖 중에 재조합 인체 BSSL/CEL가 존재함을 나타낸다 : 밴드는 약 116.5에 나타났다.
형질전이 동물의 적합한 세포주를 발생시켰다.
유사한 방법으로, 인체 BSSL/CEL를 발현시킬 수 있는 소 또는 양과 같은 다른 형질전이 동물을 제조할 수 있다.
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도면의 설명
제1도
CEL 유전자 위치. 부분적으로 겹쳐 있는 2개의 클론, λBSSL1 및 λBSSL5A의 배치 및 제한 효소 도면을 나타내었다. 엑손-인트론 구성 및 사용된 효소 부위를 하기에 나타내었다. 엑손을 1-11의 숫자로 표시한 박스로 나타내었다. Asp=Asp700, B=BamHI, E=EcoRI, S=SacI, Sa=SalI, Sp=SphI 및 X=XbaI, Alu 반복 요소의 위치 및 배향을 진한 화살표로 나타내었다. a-h는 서브클로닝된 상이한 단편을 나타낸다.
제2도
인체 젖분비 유선, 췌장 및 지방 조직으로부터 얻은 RNA의 프라이머 연장 분석. CEL 유전자의 nt 위치 33 내지 58에 대해 상보성인 말단-방사성 표지된 26-메르 올리고뉴클레오티드를 RNA의 프라임 역전사에 사용하였다. 레인 A는 분자크기 마커(서열 사다리)이고, 레인 B는 췌장 RNA, 레인 C는 지방 조직 RNA 및 레인 D는 젖분비 유선 RNA이다.
제3도
인체 CEL 및 쥐 CEL 유전자 5'-플랭킹 부위에 대한 도트플라트(doplot) 분석. 상동 부위는 A-H로 라벨링하였고, 이 부분을 나타내는 서열을 상부는 인체 및 하부는 쥐에 대하여 기록하였다.
제4도
인체 CEL 유전자의 5'-플랭킹 서열의 분석, 추정되는 인지 서열은 강조된 밑줄 또는 상보 스트랜드를 나타내는 밑줄이다. 진한 문자는 rCEL에 대해 상동성인부위를 나타낸다(부위 A-H). TATA-박스는 점으로 밑줄을 그었다.
글루코코르티코이드 수용기 결합 부위의 상호 감지 서열인 GGTACANNNTGTTCT(Beato, M., 1989)에 대해 80 %의 유사성을 보이는 2개의 서열이 있으며, 첫번째는 상보 스트랜드 상에서 nt 위치 -231(1A)에 있고 두번째는 nt 위치 -811(1B)에 있다. 또한, 에스트로겐 수용기 결합 부위인 AGGTCANNNTGACCT의 일치 서열에 대해 87 %의 유사성을 나타내는 서열이 nt 위치 -861(2)에 있다(Beato, M., 1989).
루본 및 헨닝가우젠(Lubon and Henninghausen, 1987)이 유청 산성 단백질(WAP) 유전자의 프로모터 및 5'-플랭킹 서열을 분석하여 젖분비 유선 세포의 핵 단백질에 대한 결합 부위를 규명하였다. 그 중의 하나인 11 bp에 걸친 보존 서열, AAGAAGGAAGT는 연구된 다수의 젖단백질 유전자, 예를 들면 쥐 α-락트알부민 유전자(Qasba 등, 1984) 및 쥐 α-카제인 유전자(Yu-Lee 등, 1986)에 존재한다. CEL유전자의 5'∼플랭킹 부위에서, 상보 스트랜드 상의 nt 위치 -1299(3)에 상기 보존 서열에 대해 82 %의 유사성을 나타내는 서열이 존재한다.
β-카제인 유전자의 조절에 관한 연구에서, 임신한 또는 수유 생쥐로부터의 핵 추출물에서 조직 특이적 유선 인자(MGF)를 발견하고 이의 인지 서열(ANTTCTTGGNA)을 동정하였다. 인체 CEL 유전자의 5'-플랭킹 부위에서, 하나는 상보 스트랜드 상의 nt 위치 -368(4A) 및 다른 하나는 nt 위치 -1095(4B)에 있는 2개의 서열이 있고, 이는 모두 MGF 결합 부위의 일치 서열에 대해 82 %의 유사성을 나타낸다. 5'-플랭킹 부위 중의 상기 2개의 추정 MGF 결합 부위 외에도, 인트론 I중의 상보 스트랜드 상의 nt 위치 275에 있는 서열 AGTTCTTGGCA가 있으며, 이는 MGF 결합 부위의 일치 서열에 대해 100 %의 동일성을 나타낸다.
또한, 쥐 췌장-특이적 촉진 요소의 일치 서열인 GTCACCTGTGCTTTTCCCTG에 대해 모두 65%의 유사성을 나타내는 4개의 서열이 있으며(Boulet 등, 1986), 첫번째는 nt 위치 -359(5A), 두번째는 nt 위치-718(5B), 세번째는 nt 위치 -1140(5C) 및 마지막은 nt 위치 -1277(5D)이 있다.
제5도
플라스미드 pS452의 제조 방법. 상세한 설명을 위해 실시예 2를 참고한다.
제6도
플라스미드 pS312의 구조도
제7도
플라스미드 pS452의 구조도.
제8도
실시예 2에 설명된 바와 같이 WAP의 첫번째 엑손 중의 인체 BSSL/CEL 게놈 구조의 물리적 도입을 나타내는 물리적 도면.
제9도
A. 형질전이 동물의 동정에 사용되는 PCR-프라이머의 배치를 나타내는 도면. 5'-프라이머는 WAP 서열 내에서 WAP 및 BSSL/CEL간 융합의 상류로 위치-148 bp에서 출발하도록 위치한다. 3'- 프라이머는 첫번째 BSSL/CEL 인트론 중에서 융합점의 하류쪽 398 bp에서 종결되도록 위치한다.
B. PCR 프라이머의 서열을 사용하였다.
C. 잠재적인 기초 동물의 PCR 분석의 통상적인 분석을 나타내는 아가로스겔.
M : 분자량 마커. 레인 1 : 플라스미드 pS452로부터 생성된 조절 PCR-생성물. 레인 2-13 : 잠재적 기초 동물로부터의 DNA 제조로 수행된 PCR 반응.
제10도
pS452의 재조합 쥐 WAP/인체 CEL 유전자를 위한 생쥐 형질전이 세포주에서 얻은 젖의 면역블롯 분석. 단백질을 SDS-PAGE 상에서 분리하고, 임모빌론막(밀리포어)으로 전이시키고 고도로 정제된 인체 천연 CEL, 이어서 알칼리 포스파타제 표지된 돼지 항-토끼 IgG(Dakopatts)를 사용하여 발생시킨 다클론성 토끼 항체로 가시화하였다. 레인 1은 각각 106, 80, 49.5, 32.5, 27.5 및 18.5 kDa의 저분자량을 나타내었다. 레인 2는 각각 205, 116.5, 80 및 47.5 kDa의 고분자량을 표시하였다. 레일 3은 25 ng의 정제된 모유로부터의 비재조합 CEL이다. 레인 4는 1:10으로 희석된 CEL 형질전이 생쥐로부터의 젖 샘플 2 ㎕이다. 레인 5 및 6은 대조군 샘플로서1:10으로 희석된 2마리의 상이한 비-CEL 형질전이 생쥐로부터의 젖 샘플 2㎕이다.
Claims (21)
- 서열표에서 서열 확인 번호:1로 표시된, 생물학적으로 기능성인 담즙산염 자극 리파아제 (BSSL)/카르복실산 에스테르 리파아제 (CEL)를 코딩하고 인트론 서열을 포함하는 단리된 DNA 분자.
- 인체 BSSL/CEL를 코딩하는 제1항에 따른 DNA 분자를 보유하며 그의 발현을 매개할 수 있는 복제 가능한 발현 벡터.
- 제2항에 있어서 생물학적으로 기능성인 BSSL/CEL를 코딩할 수 있고 비인간 포유류 유선으로의 발현을 유도하는 조절 요소를 포함하는 벡터.
- 제2항에 있어서, 벡터 pS452(DSM 7499)인 벡터.
- 다세포 생물체로부터 유도된, 제2항에 따른 벡터를 보유하는 비인간 세포.
- (a) 제1항에 정의된 DNA 분자를 특정의 비인간 숙주 세포에서 복제할 수 있는 벡터 중에 삽입하는 단계;(b) 생성되는 재조합 벡터를 숙주 세포로 도입하는 단계;(C) 생성되는 세포를 폴리펩티드의 발현을 위한 배양 배지 중에 또는 배지상에서 성장시키는 단계; 및(d) 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 인체 BSSL/CEL의 제조 방법.
- 제1항에 따른 DNA 분자를 비인간 포유류의 젖 단백질 유전자를 조절하는 유전자에 삽입하여 제조한 혼성 유전자가 발현될 때 인체 BSSL/CEL가 생산될 수 있도록, 혼성 유전자를 보유한 비인간 포유류의 성숙한 암컷의 유선에서 발현되는, 혼성 유전자를 포함하는 포유류 발현계.
- 제7항에 정의된 혼성 유전자.
- 제7항에 정의된 발현계를 보유하는 포유류 세포.
- 제9항에 있어서, 태아 세포인 비인간 포유류 세포.
- (a) 제7항에 정의된 발현계를 비인간 포유류의 수정난 또는 태아 세포에 도입하여 발현계를 포유류의 배선에 혼입시키는 단계 및(b) 생성되는 도입된 수정난 또는 태아를 비인간 포유류의 성숙한 암컷으로 발생시키는 단계를 포함하는, 인체 BSSL/CEL를 발현시킬 수 있는 형질전이 비인간 포유류의생산방법.
- (a) 실질적으로 포유류 BSSL/CEL가 발현될 수 없도록 포유류의 BSSL/CEL 발현능을 제거하고, 포유류에서 인체 BSSL/CEL가 발현되게 하는 방식으로 제7항에 정의된 발현계를 포유류의 배선에 삽입하는 단계; 및(또는)(b) 포유류 BSSL/CEL 유전자 또는 그의 일부를 제7항에 정의된 발현계로 대체시키는 단계를 포함하는, 인체 BSSL/CEL는 발현시킬 수 있고 포유류 자신의 BSSL/CEL는 실질적으로 발현시킬 수 없는 형질전이 비인간 포유류의 생산 방법.
- 제1항에 따른 DNA 분자를 그의 게놈 중에 보유하는 형질전이 비인간 포유류.
- 제13항에 있어서, 상기 DNA 분자가 포유류의 배선중에 존재하는 형질전이 비인간 포유류.
- 제13항 또는 14항에 있어서, 상기 DNA 분자가 포유류의 젖 단백질 유전자 중에 존재하는 형질전이 비인간 포유류.
- 제11항의 방법에 의해 제조되는 형질전이 비인간 포유류.
- 제13항 또는 16항에 있어서, 생쥐, 쥐, 토끼, 양, 돼지 및 소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 형질전이 비인간 포유류.
- 제13 또는 16항에 따른 형질전이 비인간 포유류의 자손.
- 제13 또는 16항에 따른 형질전이 비인간 포유류로부터 얻은 젖.
- 제19항에 정의된 젖을 포함하는 유아용 조제 분유.
- 제1항에 따른 DNA 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 유아용 조제 식품에 보충하는 것을 포함하는 유아용 조제 분유의 제조 방법.
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