CZ288677B6 - Izolovaná DNA molekula genomu, replikovatelný expresní vektor, buňka jej nesoucí a způsob produkce lidské BSSL/CEL - Google Patents

Izolovaná DNA molekula genomu, replikovatelný expresní vektor, buňka jej nesoucí a způsob produkce lidské BSSL/CEL Download PDF

Info

Publication number
CZ288677B6
CZ288677B6 CZ19943091A CZ309194A CZ288677B6 CZ 288677 B6 CZ288677 B6 CZ 288677B6 CZ 19943091 A CZ19943091 A CZ 19943091A CZ 309194 A CZ309194 A CZ 309194A CZ 288677 B6 CZ288677 B6 CZ 288677B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cel
human
bssl
vector
gene
Prior art date
Application number
CZ19943091A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ309194A3 (en
Inventor
Karl Gunnar Bjursell
Peter Nils Carlsson
Magnus Sven Curt Erbäck
Lennart Stig Hansson
Pontus Fredrik Ulf Lidberg
Annika Jeanette Nilsson
Fredrik Birger Jan Törnell
Original Assignee
Aktiebolaget Astra
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from SE9201809A external-priority patent/SE9201809D0/xx
Priority claimed from SE9201826A external-priority patent/SE9201826D0/xx
Priority claimed from SE9202088A external-priority patent/SE9202088D0/xx
Priority claimed from SE9300902A external-priority patent/SE9300902D0/xx
Application filed by Aktiebolaget Astra filed Critical Aktiebolaget Astra
Publication of CZ309194A3 publication Critical patent/CZ309194A3/cs
Publication of CZ288677B6 publication Critical patent/CZ288677B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Humanized animals, e.g. knockin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/20—Dietetic milk products not covered by groups A23C9/12 - A23C9/18
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Abstract

eÜen se t²k DNA molekuly genomu obsahuj c intronov sekvence a k duj c lidsk² protein, kter² je nazv n lip za stimulovan lu ov²mi solemi/karboxyesterlip za (BSSL/CEL). D le se t²k expresn ho vektoru, kter² nese a je schopen zprost°edkovat expresi DNA molekuly k duj c lidskou BSSL/CEL, bu ky, kter je z sk na z mnohobun n ho organismu a nese takov² expresn vektor, a zp sobu produkce lidsk BSSL/CEL, kter² zahrnuje a) vlo en k duj c DNA molekuly do vektoru, kter² je schopen se replikovat ve specifick hostitelsk bu ce, b) zaveden v²sledn ho rekombinantn ho vektoru do hostitelsk bu ky, c) r st v²sledn bu ky v kultiva n m nebo na kultiva n m m diu pro expresi polypeptidu a d) z sk n polypeptidu.\

Description

Oblast techniky
Tento vynález se týká izolované DNA molekuly genomu, replikovatelného expresního vektoru, buňky nesoucí takový expresní vektor a způsobu produkce lidské BSSL/GEL.
Dosavadní stav techniky
Hydrolýza lipidů obsažených v potravě
Lipidy obsažené v potravě jsou důležitým zdrojem energie. Triacylglyceroly, které jsou energeticky bohaté, tvoří více než 95 % těchto lipidů.Některé z těchto lipidů, například určité mastné kyseliny a vitaminy rozpustné v tucích, jsou nezbytnými složkami potravy. Před gastrointestinální absorpcí vyžadují traciacylglyceroly jakož i minoritní složky, tj. esterifikované vitaminy rozpustné v tucích a cholesterol, a diacylfosfatidylglyceroly, hydrolýzu esterových vazeb ke vzniku méně hydrofobních, absorbovatelných produktů. Tyto reakce jsou katalyzovány specifickou skupinou enzymů nazvaných lipázy.
U dospělých lidí se za nezbytné lipázy účastnící se těchto pochodů považují žaludeční lipáza, pankreatická lipáza závislá na kolipáze (hydrolýza tria diacylglycerolů) pankreatická fosfolipáza A2 (hydrolýza diacylfosfatidylglycerolů) a karboxyester lipázy (CEL) (hydrolýza cholesterylesterů a esterů vitaminů rozpustných v tucích). V případě kojených novorozenců hraje při hydrolýze některých výše uvedených lipidů nezbytnou roli lipáza stimulovaná žlučovými solemi (BSSL). Spolu se žlučovými solemi tvoří produkty trávení lipidů směsné micely, ze kterých dochází k absorpci.
Lipáza stimulovaná žlučovými solemi
Lidská laktující mléčná žláza syntetizuje a secemuje spolu s mlékem lipázu stimulovanou žlučovými solemi (BSSL) (Bláckberg a kol., 1987) a po specifické aktivaci primárnímu žlučovými solemi přispívá k vnitřní kapacitě trávení tuků ve střevě kojence. Tento enzym, který činí přibližně 1 % celkového mléčného proteinu (Bláckberg a Hemell, 1981) se během průchodu žaludkem s mlékem nedegraduje a v duoderálním obsahuje je před inaktivaci pankreatickými proteásami, jako je trypsin a chymotropsin, chráněn žlučovými solemi. Je však inaktivován při pasteurizaci mléka, např. při zahřátí na teplotu 62,5 °C po dobu 30 minut (Bjorksten a kol., 1980).
Modelové pokusy in vitro ukazují, že konečné produkty štěpení triacylglycerolu jsou za přítomnosti BSSL odlišné (Bembáck a kol., 1190). Hemell a Bláckberg, 1982). Díky nižším intraluminálním koncentracím žlučových solí během novorozeneckého období toto může být přínosem pro absorpci produktu.
Karboxyesterlipáza
Karboxyesterlipáza (CEL) lidské pankreatické šťávy (Lombardo a kol.m, 1978) se jeví být funkčně identická, nebo alespoň velmi podobná, BSSL (Bláckberg a kol., 1981). Sdílejí rovněž shodné epitopy, mají identické sekvence A-koncových aminokyselin (Aboukali a kol., 1988) a jsou inhibovány inhibitory serinesterás, např. eserinem a diisopropylfluorfosfátem. Ve studií z poslední doby byly charakterizovány struktury cDNA jak mléčné lipázy a pankreatické lipázy (Baba a kol., 1991, Hui a kol., 1991, Nilsson a kol., 1990, Reue a kol., 1991), přičemž závěr je takový, že mléčný enzym a pankreatický enzym jsou produkty stejného genu (v této přihlášce
-1 CZ 288677 B6 označovaného jako gen CEL, EC 3.1.1.1). Sekvence cDNA a odvozené sekvence aminokyselin genu CEL jsou popsány ve WO 91/15234 (Oklahoma Medical Research Foundation) a ve
WO 91/18923 (Aktiebolaget Astra).
Má se tedy zato, že CEL je identická s BSSL, přičemž polypeptid kódovaný genem CEL je v předložené souvislosti nazýván BSSL/CEL.
Malabsorpce lipidů
Obvyklými příčinami malabsorpce lipidů a tím i malnutrice jsou snížení intraluminální hladiny pankreatické lipázy závislé na kolipáze a/nebo žlučových solí. Typickými příklady takového lipázového deficitu jsou pacienti trpící cystickou fibrósou, běžnou genetickou poruchou vedoucí k celoživotnímu deficitu u 80 % pacientů a chronická pankreatitida, často v důsledku chronického alkoholismu.
Současná léčba pacientů trpících deficitem pankreatické lipázy spočívá v orálním podávání velmi vysokých dávek surového přípravku vepřových pankreatických enzymů. Pankreatická lipáza závislá na kolipáze je však při nízké hodnotě pH, která v žaludku převažuje, inaktivována. Tento účinek nelze použitím vysokých dávek enzymu zcela překonat. Pro většinu pacientů jsou tedy vysoké dávky neadekvátní a navíc jsou přípravky nečisté a mají nepříjemnou chuť.
Byly formulovány určité tablety, které procházejí kyselými oblastmi žaludku a uvolňují enzym pouze v relativně zásaditém prostředí jejuna. Mnoho pacientů trpících pankreatickými poruchami však má prostředí vjejunu abnormálně kyselé a v takových případech může dojít ktomu, že tablety enzym neuvolní.
Jelikož jsou v současnosti obchodované přípravky ze zdrojů jiných, než je člověk, existuje navíc riziko imunoreakcí, které mohou zapříčinit škodlivé účinky na pacienty nebo vést ke snížení účinnosti léčby. Další nevýhodou současných přípravků je to, že nemají stanoven obsah jiných lipolytických aktivit než je lipáza závislá na kolipáze. Ve skutečnosti většina z nich obsahuje velmi nízké hladiny aktivity BSSL/CEL. To může být jedním z důvodů, proč mnoho pacientů trpících cystickou fibrósou navzdory doplňování trpí deficity vitaminů rozpustných v tucích a esenciálních mastných kyselin.
Existuje tedy potřeba produktů s vlastnostmi a strukturou odvozenou od lidských lipáz a se širokou substrátovou specificitou, přičemž tyto produkty by mohly být podávány pacientům trpícím deficitem jednoho nebo několika pankreatických lipolytických enzymů orálně. Produkty, které mohou být odvozeny z použití předloženého vynálezu naplňují tuto potřebu samy o sobě nebo v kombinaci s přípravky obsahujícími jiné lipázy.
Přípravky pro kojence
Je dobře známo, že kojení je požadováno za lepší, než používání umělé výživy. Lidské mléko poskytuje nejen vyvážený zdroj živin, ale je také kojencem snadno tráveno. Několik biologicky aktivních složek, o nichž je známo, že mají u kojence fyziologické funkce, je tedy buď složkou lidského mléka, nebo se během jeho trávení vytvoří, včetně usnadňujících příjem živin z lidského mléka.
Přes velké úsilí, které bylo vynaloženo na přípravu kojenecké výživy, nebylo možné vyrobit přípravek, který by podstatnou měrou měl výhodné vlastnosti lidského mléka. Kojenecké výživy, často připravované na bázi kravského mléka, jsou tedy kojencem obecně neúplně tráveny a postrádají látky, o nichž je známo, že mají na fyziologické funkce kojence účinek. Za účelem získání kojeneckého přípravku s nutriční hodnotou podobnou lidskému mléku se do přípravku zahrnují četné přísady, včetně fragmentů proteinů, vitaminů, minerálů atd., které se normálně tvoří nebo jsou přijímány během trávení lidského mléka kojencem, což s sebou nese následné
-2CZ 288677 B6 riziko zvýšeného namáhání a možného dlouhodobého poškození důležitých orgánů, jako jsou játra a ledviny. Další nevýhodou spjatou s používáním přípravků založených na kravském mléce je zvýšené riziko, že se u kojence navodí alergie na hovězí proteiny.
Jako alternativa ke kojeneckým přípravkům založeným na kravském mléce bylo použito lidské mléko získatelné z tzv. mléčných bank. Krmení novorozenců lidským mlékem z mléčných bank je však v posledních letech zavrhováno kvůli obavám z přítomnosti infekčních agens, jako je HIV a CMV, v lidském mléce. Za účelem zničení infekčních agens v lidském mléce se stalo nezbytným mléko před použitím pasteurizovat. Pasteurizací se však nutriční hodnota a biologický účinek složek mléka sníží, například BSSL se inaktivuje, jak je uvedeno výše.
Přídavek lipázy ke kojenecké výživě
Funkce slinivky břišní a jater nejsou při narození plně vyvinuty, obzvláště u předčasně narozených dětí. Z fyziologických důvodů je malabsorpce tuku obvyklým nálezem a má se za to, že plyne z nízké koncentrace pankreatické lipázy závislé a kolipáze a žlučových solí. U kojených novorozenců je však taková malabsorpce díky BSSL než u kojenců krmených pasteurizovaným lidským mlékem nebo kojeneckou výživou (Bembáck a kol., 1990).
Pro vyloučení výše uvedených nevýhod spojených s pasteurizovaným mlékem a kojeneckou výživou založenou na hovězím mléce by tedy bylo žádoucí připravit kojeneckou výživu se složením bližším složení lidského mléka, tj. přípravek obsahující proteiny lidského mléka.
BSSL/CEL má několik jedinečných vlastností, které ji činí ideálně vhodným pro doplňování kojenecké výživy:
Je přirozeně formována pro orální podání. Odolává tedy průchodu žaludkem a je aktivována obsahem tenkého střeva.
Její specifický mechanismus aktivace by měl zabránit nebezpečné lipolýze potravních nebo tkáňových lipidů během skladování a průchodu na místo jejího účinku.
Díky její široké substrátové specificitě je schopna sama o sobě zprostředkovat úplné trávení většiny potravinových lipidů, včetně esterů vitaminů rozpustných v tucích.
BSSL/CEL může při hydrolýze esterových vazeb obsahujících polynenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem předčit pankreatickou lipázu závislou na kolipáze.
Za přítomnosti žaludeční lipázy a při její nepřítomnosti nebo při nízkých hladinách lipázy závislé na kolipáze může BSSL/CEL uskutečnit úplné trávení triacylglycerolů in vitro dokonce i pokud jsou koncentrace žlučových solí tak nízké, jako u novorozenců. Za přítomnosti BSSL/CEL se konečnými produkty trávení triacylglycerolů stávají spíš mastné kyseliny a volný glycerol spíše než volné mastné kyseliny a monocylglycerol vytvářené dalšími dvěma lipázami (Bembáck a kol., 1990). To může usnadnit absorpci produktu obzvláště pokud jsou intraluminální hladiny žlučových solí nízké.
Využití BSSL/CEL pro doplňování kojenecké výživy však vyžaduje přístup k velkým množstvím tohoto produktu. Ačkoliv lidské proteiny mohou být získány čištěním přímo z lidského mléka, není to reálnou a dostatečnou ekonomickou cestou k získání velkých množství potřebných k výrobě kojeneckých přípravků ve velkém a je tedy nutno vyvinout jiné postupy, dříve než budou moci být připraveny kojenecké výživy obsahující proteiny lidského mléka. Předložený vynález takové postupy pro přípravu BSSL/CEL ve velkých množstvích poskytuje.
-3CZ 288677 B6
Produkce proteinů v mléku transgenních zvířat
Izolace genů kódujících farmakologicky aktivní proteiny umožnila levnější produkci takových proteinů v heterologních systémech. Přitažlivým expresním systémem pokud jde o mléčné proteiny je transgenní zvíře (přehled viz Hennighausen a kol., 1990). Potravní přípravky obsahující lipázu aktivovanou žlučovými solemi získané například technologií transgenních zvířat je popsána v EP 317 355 (Oklahoma Medical Research Foundation).
Do transgenního zvířete může být sekvence kódující protein zavedena jako cDNA nebo jako genomová sekvence. Jelikož pro regulovatelnou expresi genu u transgenních zvířat mohou být nezbytné introny (Brinster a kol., 1988, Whitelaw a kol., 1991), je v mnoha případech výhodné použít spíše genomovou strukturního genu, než formu cDNA. WO 90/05188 (Pharmaceutical Proteins Limited) popisuje použití transgenních zvířat s DNA kódující protein, která obsahuje alespoň jeden, ale ne všechny, z intronů, které se přirozeně nacházejí v genu kódujícím daný protein.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je izolovaná DNA molekula genomu kódující pro lidskou biologicky funkční lipázu stimulovanou žlučovými solemi/karboxyesterlipázu (BSSL/CEL), přičemž uvedená DNA molekula má nukleotidovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí pod SEQ ID č. 1 nebo sekvenci schopnou hybridizovat s uvedenou sekvencí nebo její specifickou částí za příslušných hybridizačních podmínek.
Výhodné provedení podle tohoto vynálezu spočívá v DNA molekule, která je uvedena v seznamu sekvencí pod SEQ ID č. 1.
Předmětem předloženého vynálezu je také replikovatelný expresní vektor, který nese a je schopen zprostředkovat expresi isolované DNA molekuly genomu kódující lidskou biologicky funkční lipázu stimulovanou žlučovými solemi/karboxyesterlipázu (BSSL/CEL).
Výhodné provedení podle předloženého vynálezu spočívá ve výše definovaném replikovatelném expresním vektoru, který obsahuje regulační prvky genů vybraných ze souboru sestávajícího z genů syrovátkových proteinů a kaseinových proteinů, který zaměřuje expresi BSSL/CEL do mléčné žlázy savce odlišného od člověka.
Obzvláště výhodným provedením podle předloženého vynálezu je vektor pS 452 (DSM 7499).
Předmětem předloženého vynálezu je také buňka, která se získá z mnohobuněčného organismu a která nese vektor, který nese a je schopen zprostředkovat expresi izolované DNA molekuly genomu kódující lidskou biologicky funkční lipázu stimulovanou žlučovými solemi/karboxyesterlipázu (BSSL/CEL).
Rovněž je předmětem tohoto vynálezu způsob produkce lidské BSSL/CEL zahrnující
a) vložení DNA molekuly definované výše do vektoru, který je schopen se replikovat ve specifické hostitelské buňce,
b) zavedení výsledného rekombinantního vektoru do hostitelské buňky,
c) růst výsledné buňky v kultivačním nebo na kultivačním médiu pro expresi polypeptidu a
d) získání polypeptidu.
-4CZ 288677 B6
Detailní popis vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí prostředků pro produkci rekombinantní lidské BSSL/CEL ve vysokém výtěžku a při realistické ceně, pro použití v kojeneckých přípravcích s cílem vyloučit nevýhody provázející pasteurizované mléko a přípravky založené na hovězích proteinech.
Cíle vynálezu se dosáhlo klonováním a sekvenováním lidského genu CEL. Za účelem zlepšení výtěžku BSSL/CEL se k produkci lidské BSSL/CEL v transgenním savci, kterým není člověk, použije získaná molekula DNA lidského genu CEL obsahující intronové sekvence místo známé sekvence cDNA.
Postup použitý k izolaci molekuly lidské DNA kódující BSSL/CEL je uveden v následujících příkladech.
Přísné hybridizační podmínky uvedené výše je třeba chápat v běžném smyslu, tj. že se hybridizace provádí podle obvyklého laboratorního postupu, jaký je například uveden v Sambrook a kol. (1989). Jde například o tyto přísné hybridizační podmínky. Hybridizace se provádí 6 až 8 hodin při teplotě 68 °C v hybridizačním roztoku (6 x SSC, 5 x Denhardtův roztok, 0,5 % SDS a 100 pg/ml denaturované fragmentované lososí spermatické DNA), přičemž jeden druh DNA je navázán na nitrocelulózové nebo nylonové membrány a druhý druh DNA, působící jako sonda, je radioaktivně označen na koncentraci okolo 1 až 2 ng/ml se specifickou aktivitou například 109 cpm/pg nebo vyšší. Filtr se poté promývá následovně: 5 minut při teplotě místnosti ve 2 x SSC, 0,5% SDS, poté 15 minut při teplotě místnosti ve 2xSSC, 0,1% SDS, poté 30 minut při teplotě 37 °C v 0,1 x SSC, 0,5 % SDS a poté 30 minut při teplotě 68 °C v 0,1 x SSC, 0,5 % SDS.
K přípravě zásobního roztoku 20 x SSC se rozpustí 175,3 g chloridu sodného a 88,2 g citrátu sodného v 800 ml vody, hodnota pH se upraví na 7,4 pomocí roztoku hydroxidu sodného a objem se upraví na 1 000 ml. 50 x Denhardtův zásobní roztok obsahuje 5 g Ficoll, 5 g polyvinylpyrrolidonu, 5 g hovězího sérového albuminu a vodu do objemu 500 ml.
Pro poskytnutí komplexní informace se dále uvádí, že existuje savčí expresní systém obsahující sekvenci DNA kódující lidskou BSSL/CEL vloženou do genu kódujícího mléčný protein savce jiného, než je člověk k vytvoření hybridního genu, který se exprimovatelný v mléčné žláze dospělé samice savce, která nese uvedený hybridní gen, takže se při expresi hybridního genu vytváří lidská BSSL/CEL.
Dále se pro poskytnutí komplexní informace uvádí, že existují způsoby produkce transgenního savce, kterým není člověk, schopného exprimovat lidskou BSSL/CEL, které zahrnují injikování savčího expresního systému definovaného výše do oplodněného vajíčka nebo buňky embrya savce k zahrnutí expresního systému do rozmnožovací linie savce a výsledné oplodněné vajíčko nebo embryo s injikovatelným systémem se vyvíjí na dospělou samici savce.
Molekula DNA znázorněná na seznamu sekvencí jako SEQIDč.: 1, která má celkovou délku 11531 párů bází (bp), má následující charakteristiky:
-5CZ 288677 B6
Charakteristika od báze k bázi
5‘-lemuj ící oblast 1 1640
TATA box 1611 1617
exon 1 1641 1727
počátek translace 1653 1653
exon 2 4071 4221
exon 3 4307 4429
exon 4 4707 4904
exon 5 6193 6323
exon 6 6501 6608
exon 7 6751 6868
exon 8 8335 8521
exon 9 8719 8922
exon 10 10124 10321
exon 11 10650 11490
3‘-lemuj ící oblast 11491 11531
V tomto kontextu se pojem „gen“ používá k označení sekvence DNA, která se účastní tvorby polypeptidového řetězce a která zahrnuje oblasti předcházející a následující po kódující oblasti (sekvence před 5‘-koncem a za 3‘-koncem), stejně jako vložené sekvence, tzv. introny, které jsou umístěny mezi jednotlivými kódujícími segmenty (tzv. exony) nebo v oblasti před 5‘-koncem nebo za 3‘-koncem. Oblast před 5‘-koncem obsahuje regulační sekvencí, která řídí expresi genu, obvykle promotor. Oblast za 3‘-koncem obsahuje sekvence, které se účastní ukončení transkripce genu a případně sekvence, které jsou odpovědné za polyadenylaci transkriptu a netranslatované oblasti za 3‘-koncem.
Molekuly DNA podle tohoto vynálezu, které jsou zde popsány, mohou obsahovat přirozené, stejně jako syntetické sekvence DNA, přičemž přirozené sekvence jsou obvykle odvozeny přímo z genomové DNA, běžně savčího původu, např. jak je popsáno dále. Syntetická sekvence se může připravit obvyklými postupy syntetické přípravy molekul DNA. Sekvence DNA může být dále smíšeného genomového a syntetického původu.
V předloženém kontextu pojem „replikovatelný“ znamená, že vektor je schopen replikace v daném typu hostitelské buňky, do níž byl zaveden. Bezprostředně před sekvencí DNA lidské BSSL/CEL může být poskytnuta sekvence kódující signální peptid, jehož přítomnost zaručuje sekvenci lidské BSSL/CEL exprimované hostitelskými buňkami nesoucími vektor. Signální sekvencí může být sekvence přirozeně provázející sekvenci DNA kódující lidskou BSSL/CEL nebo sekvence jiného původu.
Vektorem může být jakýkoli vektor, který může příhodně být podroben postupům s rekombinantní DNA, přičemž volba vektoru bude často záviset na hostitelské buňce, do níž má být zaveden. Vektorem může tedy být autonomně se replikující vektor, tj. vektor, který existuje jako extrachromosomální entita, jejíž replikace je nezávislá na replikaci chromosomální, příklady takového vektoru jsou plazmid, fád, kosmid, minichromosom nebo virus. Alternativně vektorem může být takový vektor, který je při zavádění do hostitelské buňky integrován do genomu hostitelské buňky a replikován spolu schromosomem (chromosomy), do něhož (nichž) je integrován. Příklady vhodných vektorů jsou bakteriální expresní vektor a kvasinkový expresní vektor. Vektor podle tohoto vynálezu může nést kteroukoli z molekul DNA podle tohoto vynálezu jak jsou definovány výše.
Předložený vynález se dále týká buňky, která nese replikovatelný expresní vektor jak je definován výše. Principiálně může tato buňka být jakéhokoli buněčného typu, tj. prokaryotická
-6CZ 288677 Β6 buňka, jednobuněčný eukaryotický organismus nebo buňka odvozená z vícebuněčného organismu, např. savce. Savčí buňky jsou pro tento účel zvláště vhodné a jsou podrobněji diskutovány dále.
Médiem použitým pro růst buněk může být jakékoli obvyklé médium vhodné k tomuto účelu. Vhodným vektorem může být jakýkoli z vektorů popsaných výše, přičemž vhodnou hostitelskou buňkou může být kterýkoli z typů buněk uvedených výše. Postupy použité ke konstrukci vektoru a uskutečnění jeho vložení do hostitelské buňky mohou být jakékoli postupy známé k takovému účelu v oboru rekombinantní DNA. Rekombinantní lidská BSSL/CEL exprimovaná buňkami může být secemována, tj. exportována přes buněčnou membránu, v závislosti na typu buňky a složení vektoru.
Pokud se lidská BSSL/CEL vytvoří intracelulámě rekombinantním hostitelem, tj. není buňkou secemována, může se získat standardními postupy zahrnujícími rozrušení buňky mechanickými prostředky, např. ultrazvukem nebo homogenizací, nebo enzymatickými nebo chemickými prostředky s následujícím čištěním.
K dosažení sekrece může sekvencí DNA kódující lidskou BSSL/CEL předcházet sekvence kódující signální peptid, jehož přítomnost zajišťuje sekreci lidské BSSL/CEL z buněk tak, že alespoň významný podíl exprimované lidské BSSL/CEL je secemován do kultivačního média a získán.
V současnosti je výhodným postupem produkce rekombinantní lidské BSSL/CEL podle tohoto vynálezu použití transgenních savců, kterými nejsou lidé, schopných exkrece lidské BSSL/CEL do jejich mléka. Použití transgenních savců, kterými nejsou lidé, má tu výhodu, že se při rozumných nákladech dají získat velké výtěžky rekombinantní lidské BSSL/CEL a, zvláště pokud je savcem, kterým není člověk, kráva, tu výhodu, že rekombinantní lidská BSSL/CEL je produkována v mléce, které je normální složkou např. kojenecké výživy, takže není třeba rozsáhlého čištění, pokud se má rekombinantní lidská BSSL/CEL použít jako nutriční doplněk produktů na bázi mléka. Produkce ve vyšších organismech, jako je savec, kterým není člověk, dále obvykle vede ke správné úpravě savčího proteinu, např. s ohledem na postranslační úpravu jak je diskutováno výše a řádnému složení. Mohou se také získat velké množství v podstatě čisté lidské BSSL/CEL.
Pro hlubší informaci je možno uvést, že se dá uskutečnit savčí expresní systém obsahující sekvenci DNA kódující lidskou BSSL/CEL vloženou do genu kódujícího mléčný protein savce, kterým není člověk, k vytvoření hybridního genu, který je exprimovatelný v mléčné žláze dospělé samice savce, kteiý nese uvedený hybridní gen.
Sekvencí DNA kódující lidskou BSSL/CEL je výhodně sekvence uvedená v seznamu sekvencí jako SEQ ID č.: 1 nebo genomový gen lidské BSSL/CEL nebo jeho analog.
Mléčná žláza je tkáň, kde dochází k expresi a geny kódující mléčné proteiny jsou obecně považovány za obzvláště vhodné k použití při produkci heterologních proteinů u transgenních savců, kterými nejsou lidé, jelikož mléčné proteiny jsou v mléčné žláze přirozeně produkovány ve vysokých hladinách exprese. Mléko se také snadno shromažďuje a je dostupné ve velkých množstvích. V předložených souvislostech má použití genů mléčných proteinů při produkci rekombinantní lidské BSSL/CEL tu další výhodu, že se vytváří za podmínek podobných podmínkám své přirozené produkce, pokud jde o regulaci exprese a místo produkce (mléčná žláza).
V předloženém kontextu pojem „hybridní gen“ označuje sekvenci DNA obsahující na jedné straně sekvenci DNA kódující lidskou BSSL/CEL jak je definována výše a na druhou stranu sekvenci DNA genu mléčného proteinu, která je schopna zprostředkovat expresi produktu hybridního genu. Pojem „gen kódující mléčný protein“ označuje celý gen stejně jako jeho
-7CZ 288677 B6 subsekvenci, který je schopen zprostředkovat a směrovat expresi hybridního genu do tkáně, která je cílem zájmu, tj. mléčné žlázy. Obvykle je uvedenou subsekvenci subsekvence, která nese alespoň jednu nebo více oblastí promotoru, místo počátku transkripce, 3‘ a 5‘ nekódující oblasti a strukturní sekvence. Sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL je výhodně v podstatě prostá prokaryotických sekvencí, jako jsou vektorové sekvence, které mohou být spjaty se sekvencí DNA například po jejím klonování.
Hybridní gen je výhodně tvořen in vitro vložením sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL do genu mléčného proteinu použitím postupů známých v oboru. Alternativně mohou být sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL vloženy in vivo homologní rekombinací.
Obvykle se sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL vloží do jednoho z prvních exonů zvoleného genu mléčného proteinu, nebo jeho účinné subsekvence zahrnující první exony a výhodně podstatnou část sekvence lemující 5‘-konec, o níž se věří, že je důležitá pro regulaci.
Hybridní gen výhodně zahrnuje sekvenci kódující signální peptid k umožnění správné sekrece produktu hybridního genu do mléčné žlázy. Signálním peptidem bude typicky peptid, který se obvykle nalézá v genu mléčného proteinu o nějž jde, nebo peptid, který spojený se sekvencí DNA kódující lidskou BSSL/CEL. Jiné signální sekvence schopné zprostředkovat sekreci produktu hybridního genu do mléčné žlázy jsou však také relevantní. Různé prvky hybridního genu mohou samozřejmě být spojeny takovým způsobem, že umožní řádnou expresi a úpravu produktu genu. Normálně by tedy sekvence DNA kódující zvolený signální peptid měla být přesně napojena na A-koncovou část sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL. V hybridním genu bude sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL normálně zahrnovat svůj stop kodon, ale nikoli místa svého vlastního štěpení a polyadenylace. Po směru čtení sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL budou sekvence úpravy mRNA mléčného proteinu normálně zachovány.
Má se za to, že za skutečnou hladinu exprese určitého hybridního genu je odpovědná řada faktorů. Schopnost promotoru stejně jako regulačních sekvencí zmíněných výše, místo integrace expresního systému v genomu savce, místo integrace sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL v genu kódujícím mléčný protein, prvky umožňující posttranslační regulaci a jiné podobné faktory mohou být životně důležité pro dosaženou hladinu exprese. Na základě znalostí různých faktorů ovlivňujících hladinu exprese hybridního genu odborník v oboru bude vědět, jak sestavit expresní systém vhodný k předloženému účelu.
Mléčná žláza secemuje řadu různých mléčných proteinů. Existují dvě hlavní skupiny mléčných proteinů, zejména kaseiny a syrovátkové proteiny. Složení mléka různých druhů se liší pokud jde o tyto proteiny kvantitativně stejně jako kvalitativně. Většina savců, kterými nejsou lidé, vytváří 3 různé druhy kaseinu, zejména a-kasein, β-kasien a κ-kasein. Nejběžnějšími hovězími syrovátkovými proteiny jsou α-laktalbumin a β-laktalbumin. Složení mléka různého původu dále popsal Clark a kol., (1987).
Gen mléčného proteinu, který se má použít, se může odvodit ze stejného druhu jako gen, do nějž se má expresní systém vložit, nebo může být odvozen z jiných druhů. V této souvislosti bylo ukázáno, že regulační prvky, které směřují expresi genu do mléčné žlázy, jsou funkční napříč hranicemi druhů, což může být důsledkem skutečnosti, že mají společného předka (Hennighausen a kol., 1990).
Příklady vhodných genů kódujících mléčný protein nebo jeho účinných sekvencí, které se mají použít ke konstrukci expresního systému se normálně nalézají mezi syrovátkovými proteiny původem z různých savců, např. gen syrovátkového kyselého proteinu (WAP), výhodně myšího původu, a gen β-laktoglobulinu, výhodně ovčího původu. Také geny kaseinu různého původu mohou být shledány jako vhodné pro transgenní produkci lidské BSSL/CEL, např. hovězí aSl-kasein a králičí β-kasein. V současnosti je výhodným genem myší gen WAP, jelikož je
-8CZ 288677 B6 shledáván schopným poskytnout vysokou hladinu exprese četných cizích lidských proteinů do mléka různých transgenních zvířat (Hennighausen a kol., 1990).
Další sekvencí výhodně spojenou s expresním systémem je tzv. expresní stabilizační sekvence schopná zprostředkovat vysokou hladinu exprese. Existují silné náznaky, že takové stabilizující sekvence se nalézají v blízkosti a proti směru čtení genů mléčných proteinů.
Sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL, která má být vložena do expresního systému může být genomického nebo syntetického původu nebo může být jakoukoli jejich kombinací. U některých expresních systémů bylo zjištěno, že k dosažení uspokojivé exprese vyžadují přítomnost intronů a jiných regulačních oblastí (Hennighausen a kol., 1990). V některých případech může být výhodné zavést genomové struktury, spíše než struktury cDNA, jako je prvek kódující polypeptid ve vektorových konstruktech (Brinster a kol.). Intronová a exonová struktura může vést k vyšším ustáleným hladinám mRNA, než které se získají při použití vektorů na bázi cDNA.
Pro poskytnutí komplexnější informace se dále uvádí, že lze vytvořit hybridní gen obsahující sekvenci DNA kódující lidskou BSSL/CEL, která je vložena do genu kódujícího mléčný protein savce, kterým není člověk, přičemž sekvence DNA je vložena do genu mléčného proteinu tím způsobem, že je exprimovatelný v mléčné žláze dospělé samice savce, který hybridní gen nese. Hybridní gen a jeho konstituenty jsou detailně diskutovány výše. Hybridní gen tvoří důležitý meziprodukt k konstrukci expresního systému popsaného výše.
Dále lze uvést, že lze vytvořit savčí buňku, savce, kterým není člověk, nesoucí expresní systém popsaný výše. Savčí buňkou je výhodně embryonální buňka nebo pronukleus. Expresní systém se vhodně vloží do savčí buňky za použití způsobu vysvětleného dále a specificky ilustrovaného v dále uvedených příkladech.
Existuje také způsob produkce transgenního savce, kterým není člověk, který je schopen exprimovat lidskou BSSL/CEL, přičemž tento způsob zahrnuje injikování expresního systému definovaného výše do oplodněného vajíčka nebo embryonální buňky savce tak, aby se expresní systém začlenil do zárodečné linie savce a aby došlo k vývoj i výsledného oplodněného injikováného vajíčka nebo embrya v dospělou samici savce.
Zahrnutí expresního systému do zárodečné linie savce se může provést za použití jakéhokoli vhodného postupu, např. podle popisu v „Manipulating the Mouše Embryo“, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Přímo do oplodněného vajíčka, např. oplodněného jednobuněčného vajíčka nebo jeho pronukleu, nebo embrya zvoleného savce lze například injikovat pár set molekul expresního systému, přičemž mikroinjikovaná vajíčka lze následně přenést do vejcovodů pseudopregnantních náhradních matek a nechat se vyvinout. Obvykle se ne všechna injikovaná vajíčka vyvinou v dospělé samici exprimující lidskou BSSL/CEL. Ze statistického hlediska bude tedy asi polovina ze savců samci, z nichž však lze v příštích generacích vypěstovat samice.
Jakmile je inkorporována do zárodečné linie, může být sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL exprimována ve vysokých hladinách k produkci řádně exprimovné a funkční BSSL/CEL ve stabilních liniích daných savců.
Dále může existovat způsob produkce transgenního savce, kterým není člověk, který je schopen exprimovat lidskou BSSL/CEL a je v podstatě neschopen exprimovat BSSL/CEL savce samotného, který zahrnuje (a) destrukci schopnosti savce produkovat savčí BSSL/CEL tak, aby se neexprimovala v podstatě žádná savčí BSSL/CEL, a vložení expresního systému popsaného výše nebo sekvence DNA kódující lidskou BSSL/CEL do zárodečné linie savce takovým způsobem, že se v savci exprimuje lidská BSSL/CEL, a/nebo (b) nahrazením savčího genu
-9CZ 288677 B6
BSSL/CEL nebo jeho části expresním systémem popsaným výše nebo sekvencí DNA kódující lidskou BSSL/CEL.
Schopnost exprese savčí BSSL/CEL se obvykle rozruší zavedením mutací do sekvence DNA odpovědné za expresi BSSL/CEL. Takové mutace mohou zahrnovat mutace, které vyjímají sekvenci DNA ze čteného rámce, nebo zavedením stop kodonu nebo delecí jednoho nebo více nukleotidů sekvence DNA.
Gen savčí BSSL/CEL nebo jeho část se může nahradit expresním systémem popsaným výše nebo sekvencí DNA kódující lidskou BSSL/CEL použitím známých postupů homologní rekombinace.
Způsobem popsaným výše je možné vytvářet transgenního savce, kterým není člověk.
Jakkoli není volba takového savce, kterým není člověk, nijak omezena, bude savec obvykle zvolen ze skupiny zahrnující myši, krysy, králíky, ovce, prasata, kozy a hovězí dobytek. Pro produkci lidské BSSL/CEL ve velkém jsou v důsledku jejich vysoké produkce mléka obvykle výhodná větší zvířata, jako jsou ovce, kozy, prasata a zvláště hovězí dobytek. Nicméně také myši, králíci a krysy mohou být také zajímavé díky skutečnosti, že nakládání s těmito zvířaty je jednodušší a vznik transgenního zvířete je rychlejší, než je tomu například u hovězího dobytka.
Dále lze uvést, že lze připravit kojeneckou výživu obsahující rekombinantní lidskou BSSL/CEL, obzvláště polypeptid popsaný výše. Kojenecká výživa se může připravit přidáním rekombinantní lidské BSSL/CEL nebo polypeptidu v čištěné nebo částečně čištěné formě k obvyklým složkám kojenecké výživy. Obvykle je však výhodné, pokud je kojenecká výživa připraveny z mléka popsaného výše, obzvláště pokud je hovězího původu. Kojenecký přípravek se může připravit obvyklými postupy a obsahovat jakékoli nezbytné přísady, jako jsou minerály, vitaminy atd.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Uspořádání genomu, sekvenční analýza a chromosomální lokalizace genu CEL
Pokud není uvedeno jinak, použijí se standardní postupy molekulární biologie (Maniatis a kol., 1982, Ausubel a kol., 1987, Sambrook a kol., 1989).
Izolace genomových rekombinantů
Dvě různé knihovny lidského genomového fága, XDACH (Clonentech Laboratories lne., Palo Alto, Ca, USA) a ÁEMBL-3 SP6/T7 (Stratagene, La Jolla, Ca, USA) byly prohledány plakovou hybridizací za použití různých restrikčních fragmentů subklonované cDNA (Nilsson a kol., 1990) jako sond značených [a-32P]dCTP technikou oligoznačení (Feinberg a kol., 1983).
Mapování, subklonvání a sekvenování genomových klonů
Positivní klony se štěpí různými restrikčními enzymy, podrobí se elektroforéze na 1 % agarózovém gelu a poté se vakuově přenesou (Pharmacia LKBBTG, Uppsala, Švédsko) na nylonovou membránu. Membrána se hybridizuje různými sondami cDNA. Restrikční fragmenty, které hybridizují se sondami, se izolují za použití isotachoforézové metody (ófverstedt a kol., 1984). Menší fragmenty, méně než 800 párů bází (bp), se vloží přímo do vektorů M13mpl8, M13mpl9, M13BM20 nebo M13BM21 a sekvenují se za použití E. coli TG1 jako hostitelské bakterie, zatímco větší fragmenty se subklonují do vektorů pTZ18R nebo pTZ19R za použití E. coli DH5a jako hostitelské bakterie a dále se štěpí. (Plazmidy pS309, pS310 a pS451 použité
-10CZ 288677 B6 v příkladu 2 uvedeném dále se připraví obdobně). Některé z izolovaných fragmentů se také použijí při hybridizaci jako sondy. Všechny nukleotidové sekvence se stanoví způsobem ukončení dideoxyřetězce (Sanger a kol., 1977) za použití Klenowova enzymu a nebo univerzálního sekvenčního příměru specifických oligonukleotidů M13. Sekvenční informace se získají z autoradiogramů za použití softwaru MS-EdSeq, který popsal Sjóberg a kol., 1989). Sekvence se analyzují za použití programů získaných ze softwarového balíku UWGCG (Devereux a kol., 1984).
Prodlužování primeru
Celková RNA se izoluje z lidské slinivky břišní, laktující mléčné žlázy a tukové tkáně postupem guanidiniumisothiokyanat-CsCl (Chirgwing a kol., 1979). Prodloužení primeru se provede podle Ausubela kol. (1987) za použití celkové RNA a 26-merového oligonukleotidu s opačným smyslem (5-AGGTGAGGCCCAACACAACCAGTTGC-34), poloha 33 až 58. Hybridizace primeru pomocí 20 pg celkové RNA se provede ve 30 μΐ 0,9 M roztoku chloridu sodného, 0,15 M Hepes s hodnotou pH 7,5 a 0,3 M EDTA při teplotě 30 °C přes noc. Po prodlužovací reakci s reverzní transkriptásou se produkty prodlužování analyzují elektroforézou přes 6 % denaturující polyakrylamidový gel.
Somatické buněčné hybridy
DNA ze 16 somatických buněčných hybridních linií člověk-hlodavec, získaných od NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository (Corriel Institute for Medical Research, Camden, NJ), se použijí k označení genu CEL na chromosomu. Lidské-myší somatické buněčné hybridy GM09925 až GM09940 se získají z fúzí fetálních lidských mužských fíbroblastů (IMR-91) s myší buněčnou linií B-82 s deficitem thymidinkonásy (Taggart a kol., 1985, Hohandas a kol., 1986). Hybridy GM10324 a GM2860 s myší buněčnou linií A9 s deficitem HPRT a APRT (Callen a kol., 1986), zatímco hybrid GM10611 vznikl z mikrobuněčné fúze lidské fíbroblastové buněčné linie GM07890 infikované retrovirovým vektorem SP-1 s ovariální linií čínského křečka UV-135 (Warburton a kol., 1990). Hybrid GM10095 se odvodí z fúze lymfocytů samice s vyváženým karyotypem 46,X,t(X,9) (ql3,34) s buněčnou linií čínského křečka CHW1102 (Mohandas a kol., 1979). Obsah hybridních linií v lidském chromosomu, který se stanoví cytogenetickou analýzou stejně jako analýzou Southem blot a analýzou hybridizace in šitu, je uveden v tabulce 1. Molekuly DNA s vysokou molekulovou hmotností izolované z myši, čínského křečka a lidské rodičovské buněčné linie a 16 hybridních buněčných linií se rozštěpí pomocí EcoRI, frakcionuje se v 0,8 % agarózových gelech a přenese se na nylonové filtry. Oligoznačením se připraví sonda cDNA kódující CEL (cDNA o plné délce) značená [a-32P]dCTP (Feinberg a Vogelstein, 1983) a hybridizuje se na filtry. Filtry se 60 minut promývají každý při teplotě 65 °C v 6 x SSC/0,5 % SDS a v 2 x SSC/0,5 % SDS.
Polymerásová řetězová reakce
Celková lidská genomová DNA izolovaná z leukocytů, DNA ze somatických buněčných hybridů a z některých positivních genomových rekombinantů a celková RNA z lidské laktující mléčné žlázy a lidské slinivky břišní se namnoží pokud jde o exon 10 a 11. Použijí se 2 pg DNA. Použité primery jsou uvedeny v tabulce 2. Provede se 30 cyklů PCR ve 100 pl objemu (10 mM Tris-Hcl, pH 8,3, 50 mM Kel, 1,5 mM MgCl2, 200 pM každé dNTP, 100 pg/ml želatiny, lOOpmol každého primeru, 1,5 jednotek Taq DNA polymerásy (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) a teplotě zpracování 55 °C pro všechny páry primerů. Sekvence RNA se namnoží použitím postupů kombinované komplementární DNA (cDNA) a PCR. cDNA se syntetitzuje z 10 pg celkové RNA ve 40 pi roztoku obsahujícího 50 mM tris-Hcl, pH 8,3, 50 mM Kel, 10 mM MgCl2, 10 pg/ml BSA, 1 mM každého dNTP, 500 ng oligo(dt)]2_i8, 40 jednotek inhibitoru ribonukleásy a 200 jednotek reversní transkrioptásy (MoMuLV), (BRL, Bethesda Research laboratories, N.Y., USA) 30 minut při teplotě 42 °C. cDNA se vysráží a resuspenduje ve 25 pl
-11CZ 288677 B6 vody, 2 μΐ se namnoží podle popisu uvedeného výše. Namnožené fragmenty se analyzují na % agarózovém gelu. Některé z fragmentů se dále subklonují a sekvenují.
Genová struktura genu lidské CEL
V každé genomové knihovně bylo prohledáno 106 rekombinantů a prohledávání přineslo několik positivních klonů, které všechny byly izolovány a zmapovány. Dva klony, XBSSLl a ZBSSL5A, byly dále analyzovány. Restrikční enzymová štěpení pomocí několika enzymů Southem blotting a následující hybridizací se sondami cDNA ukazují, že klon XBSSL5A pokrývá celý gen CEL a že klon XBSSLl pokrývá polovinu na 5‘-konci a 10 kb oblasti lemující 5‘-konec (obr. 1). Dohromady tyto dva klony pokrývají 25 kb lidského genomu.
Po subklonování a štěpení restrikčním enzymem se získají vhodné fragmenty pro sekvenování, takže může být stanovena celá sekvence genu CEL, včetně 1640 párů bází (bp) oblasti lemující 5‘-konec a 41 párů bází (bp) oblasti lemující 3‘-konec. Tato data odhalila, že gen lidské CEL (SEQ ID č.: 1) pokrývá oblast o délce 9 850 párů bází (bp), která obsahuje 11 exonů přerušených 10 introny (obr. 1). To znamená, že exony a zvláště introny jsou relativně malé. Ve skutečnosti exony 1 až 10 mají velikosti v rozmezí 87 až 204 párů bází (bp), zatímco exon 11 má velikost 841 párů bází (bp). Introny mají velikost v rozmezí velikostí 85 až 2 343 párů (bp). Jak lze shledat z tabulky 3, veškeré hranice exon/intron respektují pravidlo AG/GT a dobře vyhovují konsensuální sekvenci, kterou navrhl Mount a kol. (1982). Když se kódující část genu CEL srovná s cDNA (Nilsson a kol., 1990) nalezne se v sekvenci nukleotidů pouze jeden rozdíl, druhá poloha v exonu 1, C, který je v sekvenci cDNA T. Jelikož je tato poloha umístěna na 10. místě proti směru translace od startovacího kodonu ATG, neovlivňuje tento rozdíl sekvenci aminokyselin.
V sekvenované oblasti je přítomno sedm členů skupiny Alu repetitivních prvků DNA, značených Alul-Alu7 (5‘-3‘), jeden v oblasti lemující 5‘-konec a šest dalších uvnitř genu CEL.
Místa iniciace transkripce a oblast lemující 5‘-konec
K zmapování iniciačního místa (iniciačních míst) transkripce genu lidské CEL se provede primerová prodlužovací analýza za použití celkové RNA z lidské slinivky břišní, taktující mléčné žlázy a tukové tkáně. Výsledky naznačí, že hlavní místo počátku transkripce je umístěno 12 párů bází (bp), a vedlejší místo počátku transkripce je umístěno 8 bází, proti směru iniciátoru methioninu. Místa iniciace transkripce jsou shodná jak u slinivky břišní, tak u taktující mléčné žlázy, zatímco u tukové tkáně není možno detekovat žádný signál (obr. 2). Sekvenovaná oblast zahrnuje polohu 1 640 DNA lemující 5‘-konec. Podle podobnosti sekvence a sekvence podobné TATA-box, byl ve vzdálenosti 30 proti směru transkripce od transkripčního iniciačního místa nalezena sekvence CATAAAT (obr. 4). Ani struktura CAAT-box ani GC boxy nejsou v této oblasti zřejmé.
Sekvence lemující 5‘-konec se počítačově prohledá v obou řetězcích na nukleotidové sekvence, o nichž se ví, že v jiných genech specifických pro mléčnou žlázu a slinivku břišní fungují jako vazebné sekvence pro transkripční faktor. Bylo nalezeno několik domnělých rozpoznávacích sekvencím, viz obr. 4.
Chromosomální lokalizace genu CEL
U lidské kontrolní DNA detekuje sonda cDNA CEL čtyři fragmenty EcoRI o velikosti přibližně 13 kb, 10 kb, 2,2 kb a 2,0 kb, zatímco v myších a křeččích kontrolních DNA se detekují jednotlivé fragmenty o velikosti okolo 25 kb respektive 8,6 kb. Přítomnost sekvencí genu lidské CEL v hybridních klonech koreluje pouze s přítomností lidského chromosomu 9 (tabulka 1). Pouze jeden ze 16 analyzovaných hybridů je pozitivní na gen lidské CEL, tento hybrid obsahuje chromosom 9 jako jediný lidský chromosom. V lokalizaci tohoto chromosomu se nenaleznou
-12CZ 288677 B6 žádné poruchy, zatímco u lokalizace jakéhokoli jiného chromosomu se naleznou alespoň dvě poruchy (tabulka 1). K další sublokalizaci genu CEL se použije hybrid člověk-čínský křeček (GM 10095) obsahující translikační chromosom der(9) (9pter->9q34:Xql3->Xqter) jako jedinou lidskou DNA. Pomocí Southem blottingu se v tomto hybridu nezjistí žádné sekvence genu CEL, což naznačuje, že gen CEL sídlí uvnitř oblasti 9q34-qter.
Příklad 2
Konstrukce expresních vektorů
Ke konstrukci expresního vektoru pro produkci rekombinantní lidské CEL v mléce transgenních živočichů se použije následující postup (obr. 5).
Za použití postupu popsaného výše se získají tři plazmidy založené na pTZ (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) obsahující různé části genu lidské CEL, pS309, pS310 a pS311. Plazmid pS309 obsahuje fragment Sphl pokrývající gen CEL od 5‘-netranskribované oblasti po část čtvrtého intronu. Plazmid pS310 obsahuje fragment Sací pokrývající sekvenci genu CEL od části prvního intronu po část šestého intronu. Třetí, plazmid pS311 obsahuje fragment BamHI pokrývající variantu genu CEL od hlavní části pátého intronu a zbytek struktury intron/exon. V tomto plazmidu je repetitivní sekvence exonu 11, které obvykle kóduje 16 opakování, mutována tak, že kóduje zkrácenou variantu, která má 9 opakování.
Další plazmid, pS283, který obsahuje část lidské cDNA kódující CEL klonovanou do plazmidu pUC19 na místech HindlII a Sací, se použije pro fúzi genomových sekvencí. pS283 se také použije k získání příhodného místa pro enzymovou restrtikci, KpnI, umístěného v 5 netranslatované vodicí sekvenci CEL. Plazmid pS283 se poté rozštěpí pomocí Ncol a Sací a izoluje se fragment o velikosti okolo 2,7 kb. Plazmid pS309 se štěpí pomocí Ncol a BspEI a izoluje se fragment o velikosti okolo 2,3 kb obsahující 5‘-koncovou část genu CEL. Plazmid pS310 se štěpí pomocí BspEI a Sací a izoluje se fragment o velikosti okolo 2,7 kb obsahující část střední oblasti genu CEL. Tyto tři fragmenty se spojí a transformují do kompetentní E. coli, kmen TG2, a transformanty se izolují ampicilinovou selekcí. Z četných transformantů se připraví plazmidy a jeden plazmid, zvaný pS312 (obr. 6), který obsahuje požadovaný konstrukt, se použije k dalším experimentům.
K získání modifikace pS311, ve které se místo BamHI umístěné po směru translace od stop kodonu se konverguje na místo Sáli k usnadnění dalšího klonování, se použije následující postup. pS311 se linearizuje částečným štěpením BamHI. Linearizovaný fragment se izoluje a vloží se syntetický linker DNA, který konverguje místo BamHI na místo Sací (5‘-GATCGTCGAC-3‘), čímž se místo BamHI zničí. Jelikož existují dvě možné polohy pro integraci syntetického linkeru, analyzují se výsledné plazmidy štěpením restrikčním enzymem. Plazmid s linkerem vloženým do požadované polohy po směru translace od exonu 11 se izoluje a označí pS313.
K získání konstruktu expresního vektoru, který nese genomové sekvence CEL a kóduje zkrácenou variantu CEL, se použije plazmid pS314, který je určen ke zprostředkování místně a tkáňově specifické exprese v buňkách mléčné žlázy v době laktace. Plazmid pS314 obsahuje genomový fragment genu myšího syrovátkového kyselého proteinu (WAP) (Campbell a kol., 1984) klonovaný jako fragment Notl. Genomový fragment je veliký přibližně 4,5 kb od regulační sekvence proti směru translace (URS), celou transkribovanou oblast exon/intron a okolo 3 kb sekvencí od posledního exonu po směru translace. Jedinečné místo KpnI je umístěno v prvním exonu 24 párů bází (bp) od kodonu iniciace translace přirozeného WAP po směru translace. Další jedinečné místo pro restrikční enzym je místo Sall umístěné v exonu 3. V pS314 se toto místo zničí štěpením, vyplní za použití Klenowova enzymu a religuje se. Místo toho se zavede nové místo Sall přímo po směru translace od místa KpnI v exonu 1. To se provede štěpením KpnI a zavedením anelovaných syntetických oligomerů SYM 2401 5‘-CGTCGACGTAC-3‘ a SYM
-13CZ 288677 B6
2402 5‘-GTCGACGGTAC-3‘ na toto místo (obr. 8). Mezi tato místa, KpnI a Sall, se následujícím postupem vloží genomová sekvence CEL. Nejprve se pS314 štěpí pomocí KpnI a Sall a fragment představující štěpený plazmid se elektroforeticky izoluje, za druhé se pS312 štěpí pomocí KpnI a BamHI a izoluje se fragment veliký přibližně 4,7 kb, který představuje 5 koncovou část genu lidské CEL. Za třetí se pS313 štěpí pomocí BamHI a Sall a izoluje se 3 konec genu lidské CEL. Tyto tři fragmenty se ligují, transformují do kompetentní bakterie E. coli a transformanty se izolují po ampicilinové selekci. Z několika transformantů se připraví plazmidy a ty se opatrně analyzují mapováním restrikčním enzymem a sekvenční analýzou. Definuje se jeden plazmid představující požadovaný expresní vektor a označí se pS317.
Za účelem konstrukce genomového expresního vektoru CEL kódujícího plnou délku CEL se pS317 modifikuje následujícím způsobem (obr. 5). Nejprve se plazmid pTZ18R (Pharmacia), obsahující 5,2 kb fragmentu BamHI genu lidské CEL sahající od pátého intronu po směru translace k jedenáctému exonu, pS451, štěpení pomocí HindlII a Sací. Toto štěpení vytvoří fragment o velikosti okolo 1,7 kb, který sahá od místa HindlII umístěného v intronu 9 k místu Sací umístěnému v exonu 11. Za druhé se plazmid pS313 štěpí pomocí Sací a Sall a izoluje se fragment o velikosti 71 párů bází obsahující 3‘-konec exonu 11 a vytvoření místo Sall. Za třetí se pS317 izolují zbytek rekombinantního genu WAP/CEL a plazmidové sekvence jako fragment Sall/HindlII o velikosti okolo 20 kb. Tyto tři fragmenty se ligují a transformují do bakterie. Z několika transformantů se připraví plazmidy. Plazmidy se štěpí různými restrikčními enzymy a podrobí se sekvenční analýze. Identifikuje se plazmid obsahující požadovaný rekombinantní gen. tento konečný expresní vektor se označí pS542 (obr. 7).
K odstranění prokaryotických plazmidových sekrecí se pS452 štěpí pomocí Notl. Poté se agarovou elektroforézou izoluje prvek rekombinantního vektoru sestávající z myší sekvence WAP lemující genomový fragment lidské CEL. Izolovaný fragment se před injekcí do myších embryí dále čistí za použití elektroeluce.
Rekombinantní gen WAP/CEL pro expresi v mléčné žláze transgenních zvířat je ukázán na obr. 8.
Uložení
Následující plazmidy jsou uloženy podle Budapešťské smlouvy u DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen):
Plazmid Číslo uložení Datum uložení
pS309 DSM 7101 12. červen 1992
pS310 DSM 7102
pS451 DSM 7498 26. únor 1993
pS452 DSM 7499
-14CZ 288677 B6
Odkazy:
Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. & Lombardo, D. (1988): Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308.
Ausubel, F.M., Brent, R.E., Moore, D.D., Smiyh, J.A., Seidman, J.G. and Struhl, K.: Current Protocols in Molecular Biology. (Wiley Interscience, New York 1987)
Baba, T., Downs, D., Jackson, K.W., Tang, J. and Wang, C.S. (1991): Biochemistry 30, 500-510.
Beato, M. (1989): Cell 56, 335-344.
Bembáck, S., Bláckberg, L. & Hernell, O. (1990): J. Clin. Invest. 221-226.
Bjórksten,B., Burman, L.G., deChateau, P., Fredrikzon, B., Gothefors, L. & Hernell, O. (1980): Br. Med. J. 201, 267-272.
Bláckberg, L., Angquist, K.A, & Hernell, O. (1987): FEBS Lett. 217, 37-41.
Bláckberg, L. & Hernell, O. (1981): Eur. J. Biochem 116, 221-225.
Bláckberg, L. Lombardo, D., Hernell, O., Guy, O. & Olivecrona, T. (1981): FEBS Lett, 136, 284-288.
Boulet, A.M., Erwin, C.R. and Rutter, W.J. (1986): Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83, 3599-3603.
Brinster, R.L., Allen, J.M., Behringer, R.R., Gelinas, R.E. & Palmiter, R.D. (1988): Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85, 836-840.
Callen, D.F. (1986): Ann. Genet. 29, 235-239.
Campbell, S.M., Rosen, J.M., Hennighausen, L.G., Strech-Jurk, U. and Sippel, A.E. (1984): Nucleic Acid Res. 12, 8685-8697.
Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J. and Rutter, W.J. (1979): Biochemistry 18, 5294-5299.
Clark, A.J., Simons, P., Wilmut, I. and Lahte, R. (1987): TIBTECH 5, 20-24.
-15CZ 288677 B6
Devereux, J., Haeberli, P. and Smithies. (1984):
Nucleic Acids Res. 12, 387-395.
Feinberg, A. and Vogelstein, B. (1983): Anal. Biochem. 132. 6-13.
Hennighausen, L., Ruiz, L. & Wall, R. (1990): Current Opinion in Biotechnology 1, 74-78.
Hemell, O. & Bláckberg, L. (1982): Pediatr. Res. 16, 882-885.
Hogan, B., Constantini, F. and Lacy, E. (1986): Manipulating the mouše embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Hui, D. and Kissel, J.A. (1990): Febs Lett. 276, 131134.
Lombardo, D., Guy, O. & Figarella, C. (1978): Biochim. Etophys. Acta 527, 142-149.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, NY, 1982)
Mohandas, T., Sparkes, R.S., Sparkes, M.C., Shulkin,
J.D., Toomey, K.E. and Funderburk, S.J. (1979): Am. J. Hum. Genet. 31, 586-600.
Mohandas, T., Heinzmann, C., Sparkes, R.S. Wasmuth, J., Edwards, P. and Lusis, A.J. (1986): Somatic Cell. Mol. Genet. 12, 89-94.
Mount, S.M. (1982): Nucleic Acids Res. 10, 459-472.
Nilsson, J., Bláckberg, L·., Carlsson, P., Enerbáck, S., Hernell, O. and Bjursell, G. (1990): Eur. J. Biochem. 192, 543-550.
Qasba, M., and Safaya, S.K. (1984): Nátuře 308, 377380.
Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, T.H., Ronk, M., Shively, J.E., Sternhy, B., Borgstrům, B., Ameis, D. and Schotz, M.C. (1991): J. Lipid. Res. 32, 267-276.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.E.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, NY, 1989)
Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977): Proč.
Nati. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467.
Sjóberg, S., Carlsson, P., Enerbáck, S. and Bjursell, G. (1989): Comput. Appl. Biol. Sci. 5,41-46.
-16CZ 288677 B6
Taggart. R.T., Mohandas, T., Shows, T.B. and Bell, G.I.
(1985): Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6240-6244.
Warburton, D., Gersen, S., Yu, M.T., Jackson, C., Handelin, B. and Housman, D. (1990): Genomics 6, 358366.
Whitelaw et al. (1991): Transgenic Research 1, 3-13.
Yu-Lee, L., Richter-Mann, L., Couch, C., Stewart, F., Mackinlay, G. and Rosen, J. (1986): Nucleic. Acid. Res. 14, 1883-1902.
Ófverstedt, L.G., Hammarstróm, K., Balgobin, N., Hjerten, S., Petterson, U. and Chattopadhyaya, J. (1984): Biochim. Biophys. Acta 782, 120-126.
-17CZ 288677 B6
Tabulka 1. Korelace sekvencí CEL s lidskými chromosomy u 16 hybridů somatických buněk člověk hlodave
O O O oo o 04 Cj O o O O 04 o o o o o
o O 04 X© o o o o o o O o o θ' o o JO 0 ©X
x© o- o <D X© r- o oo 00 04 Γ- OO o o x© c o o o e
o o O 04 00 CM o v θ' ©x «0 ©x O o x© Γ- o o o o o
OO 0X co O PM ot O ΓΜ m ©x 0 04 o O oo o o o o o
x© V P- 00 04 O CM O oo o O 0 0 o 0 o o o o o
x© o Cl r* O oo Γ- O o Γ- 0x 00 ©x V» O X© \O O o o o o o ecl^
□0 Cx 00 X0 CX o 00 x© ©x ΟΟ OO o 0» Cl ©X o o X© ©> CM ©x o o o o o o qí
•r O o o α o O O o O O c a 00 o> o o
ao r- O ©χ CM 04 o CM CX 0* OO O 04 o X© 0 CM o o o o o -lí
O eo 0* p- ©» «η Pt 00 o 00 r- 04 Pí Γ- OO 00 O r* O oo o o o o o 2|i£
>© rr- o X© o τ co O 0 r- 03 o o o o o o o
9C >© O ©χ XT CM CM X© P4 o Vl ΓΟΟ ΓΜ PM O ΓΜ v 04 ©X o o o o o Ο|Ό
O m m xO 00 Pí O Ορ- c 0 Cl o X© d o o o o o
O cm oo o O Pl X© ο 00 x© 0 O o o o o o CMt^
O O o O o O o O O O o Φ o o o Ό •a 0 0x A—
00 r- m r— ©χ O OO •0 ví ΓΟΟ o O o r- 0 CM Ό o o o o
PM OO ©x r- 04 04 O PM ©x 0 o o r- 0 vn X© CO MT 00 o o o o
O x© o ©χ Cl χτ O >© X© r- 0» Γ- 04 %© 0 04 X© 00 00 O o o o o qs
w© r- O © PM \© 00 •e c» 00 00 ΓΜ o O o X© o o o o o r-lí
*·& r- rr- ©x •n oo X© x© O O oo 00 ci oo 00 o o o o o
O r* X© (M xO O 5T oo o PM wn o 0 Ή CM Ό 5Γ •o o o o OOi«
rt d oo o Cl O O o *n O o O o o o o o o
v r- o x© o O O o vn O O O O o o o o o o
Obecně byl lidský chromosom přítomen ve více než 20 až 22 % buněk podle analýzy Southern blot * Obsahuje 9pter-J> q34 a Xql3 qter
α νΊ r- 0X o 04 m d d 0 d νΊ ci v© d r* d CO d O 0 0 PM r\© zx *n ©X
2 0x ©* 0x ©x ©X ©X ©X ©X ©X ©X ©X ©X 0X 0X ©X ©X 0X ©X ©X ©X ©\ 0% 01 01 d 2 0» o X© o s 5-1 >φ
CQ > O s O s O s o 2 O s O s O s O Σ O Σ o Σ O Σ O Σ Σ Σ i Σ 6 O
O O o O □ □ o O □ □ Q O O □ o O Du
18· £3 O ffl o c o > v 0 n
MU C eJ > O Λ* ••4 U4 c o X Ό
O
Π. fi «?
al
JZ o
O o4
N £1 o r-í i-í
5» Ή
U O r* 0*
0 M-t c
ε -n o
P X
tl Cb 0
O. o
r4 >
0
r\ M
o «-Ι o K c MU >
·— o
c rj
O o
X ω X Q. c
co Ci CTI m ox n
o VD rx r> o •o
tn XO cs o r-l r-
co CO r- σ\ OX ox
t 1 1 1 i 1
CÍ X0 o xo OX Oí
σ* «Ν r-< co n
0> xo M O o r-
CO co Γ- ox 0X Ox
Xabulfca 2
Prinery použitá pro DUA anplifi'caci
r-í <N CU 0»
·· ·· in O. o.
\o ro. cu
-19CZ 288677 B6
H
0 r* «0 r* cm 0 r* eo
eO r* 0 r* 0 0 O CM
CM CM «Μ c-4 0 «Μ cm m
w r4
O Dl Dl Di Di a a a a
4 4 4 4 4 4 4 4 4
O 0 0 xl U 0 U o u
Dl x> U Dl U u u υ a
x> u u U u o O XI XI
U XI u u u 4 U υ υ
0 4 D u o □ 0 υ XI
4 O Dl Xl oi 0 Xl o υ
O u XI Dl Xl o u υ 4
O o O Dl U Xl 4 XI υ
a u O O x> u a υ Xl
U u U XI xl x> XI XI υ
υ X) t> U ε» O xi υ Xl
0 u XI XI o O u XI Μ
x> Dl υ XI xl 9 4 a υ
4 υ u a υ u 0 a 4
α a a u 4 a a a a
a u o XI e 4 4 4 4
a u a u e a « a 4
χ> 44 XI XI X» XI XI XI 44
a a a a a a a a a
οοουΟοίδ
Exon-intron organizace CEL genu tn CM
r· co
CM <»l tn CM i
0 0 CM 0 CM r4 0 CM 0 0
r* CO cm 0 O 0 o a 0
W CM n <n m 0 0 Γ*
I 1 1 1 1 1 1 I | 1
0 0 r* Cl c* <*» CM ω 0
CM t* r4 co CM 0 O 0 Cl «
w CM CM o Cl 0 0
-I <*» •η <M
co m
«4 a 0 cb 0 0 «4 CM H O
S 0 0 0 0 CM 0 0 0 0
A c* CM 0 a CM 0 CM 0 0
ÍM CM •CB 0 0 0 0 r* 0 a
1 1 1 1 1 t 1 1 1 |
t* r* m r-f 0 Ol 0 O
0 0 BA 0 K a Γ* 0 0
9 w o BA ω w 0 o 0 O
CM CM n 0 0 0 0 r* 0 a
o m to r*
-20CZ 288677 B6
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje lokus genu CEL.
Obr. 2 ukazuje analýzu RNA prodlužováním primeru z lidské taktující mléčné žlázy, slinivky břišní a tukové tkáně.
Obr. 3 ukazuje dotplotovou analýzu oblasti lemujících 5‘-konec genu lidské CEL a krysí CEL.
Obr. 4 ukazuje analýzu sekvence lemující 5‘-konec genu lidské CEL.
Obr. 5 ukazuje způsob produkce plazmidů pS452.
Obr. 6 ukazuje schématickou strukturu plazmidů pS312.
Obr. 7 ukazuje schématickou strukturu plazmidů pS452.
Obr. 8 ukazuje fyzickou mapu představující fyzické zavedení genomové struktury lidské BSSL/CEL do prvního exonu genu WAP, jakje popsáno v příkladu 2.
Obr. 9 ukazuje schématické znázornění lokalizace příměrů PCR použitých pro identifikaci transgenních zvířat.
Obr. 10 ukazuje imunoblotovou analýzu mléka z myší transgenní linie pokud jde o rekombinantní gen myší WAP/lidské CEL plazmidů pS452.
Na obr. 1 je vedena lokalizace a restrikční enzymová mapa dvou částečně se překrývajících klonů, XBSSL1 a ZBSSL5A. Uspořádání exonů-intronů a použité místo restrikčního enzymu jsou ukázány dále. Exony jsou představovány boxy číslovanými 1 až 11. Asp = Asp700, B = BamHI, E = EcoRI, S = Sací, Sp = Sphl a X = Xbal. Polohy a orientace repetitivních prvků Alu jsou ukázány tučnými šipkami, a až h představují subklonované fragmenty.
Na obr. 2 se k nastartování reversní transkripce RNA použije 26-memí oligonukleotid na konci radioaktivně značený, který je komplentámí k polohám 33 až 58 genu CEL. Dráha A je markérem molekulové velikosti (sekvenční stupně), dráha B je RNA ze slinivky břišní, dráha C je RNA z tukové tkáně a dráha D je RNA z taktující mléčné žlázy.
Na obr. 3 jsou homologní oblasti značeny A až H, přičemž jsou popsány sekvence představující tyto části, horní je lidská, spodní kiysí.
Na obr. 4 jsou domnělé rozpoznávací sekvence podtrženy nahoře nebo dole, což představuje komplentámí řetězec. Tučné písmo ukazuje umístění homologií s rCEL (oblasti A až Η). TATAbox je podtržen tečkované.
Jsou zde dvě sekvence, které obě ukazují 80 % podrobnost s konvenční sekvencí vazebného místa glukokortikoidního receptoru, GGTACANNNTGTTCT, (Beato, M., 1989), první je na komplementárním řetězci v poloze - 231 (IA) a druhý v poloze -811 (IB). Navíc v poloze -816 (2) je sekvence, která ukazuje 87 % podobnost s konvenční sekvencí vazebného místa pro estrogen, AGGTCANNNTGACCT, (Beato, M., 1989).
Lubon a Hennighausen (1987) analyzovali sekvenci promotoru a sekvenci lemující 5‘-konec genu syrovátkového kyselého proteinu (WAP) a stanovili vazebná místa pro jedemé proteiny buněk taktující mléčné žlázy. Jedna z nich, konzervovaná sekvence o 11 párech bází (bp) AAGAAGGAAAGT, je přítomna v četných genech mléčných proteinů studovaných např. v genu krysího α-laktalbuminu (Qasba a kol., 1984) a genu krysího α-kaseinu (Yu-Lee a kol., 1986).
-21CZ 288677 B6
V oblasti lemující 5‘-konec genu CEL, v komplementárním řetězci v poloze -1299 (3) je sekvence, která vykazuje 82 % podobnost s touto konzervovanou sekvencí.
Při studiu regulace genu β-kaseinu se v jaderných extraktech těhotných nebo laktujících myší nalezl tkáňově specifický faktor mléčné žlázy (MGF), jehož sekvence byla identifikována (ANTTCTTGGNA). V oblasti lemující 5‘-konec genu lidské CEL jsou dvě sekvence, jedna v komplementárním řetězci v poloze -368 (4A) a druhá v poloze -1095 (4B), přičemž obě vykazují 82 % podobnost s konvenční sekvencí vazebného místa pro MGF. Vedla těchto dvou domnělých vazebných míst pro MGF v oblasti 5‘-konce existuje sekvence v komplementárním řetězci v poloze 275 v intronu I, AGTTCTTGGCA, která vykazuje 100 % identitu s konvenční sekvencí vazebného místa pro MGF.
Dále jsou zde čtyři sekvence, které všechny vykazují 65 % podobnost s konvenční sekvencí krysího posilovacího (enhancer) prvku specifického pro slinivku břišní, GTCACCTGTGCTTTTCCCTG, (Boulet a kol., 1986), jedna v poloze -395 (5A), druhá v poloze -718 (5B), třetí v poloze -1140 (5C) a poslední v poloze -1277 (5D).
Podrobnosti k obr. 5 jsou uvedeny v příkladu 2.
Na obr. 9 je 5‘-koncový primer umístěn uvnitř sekvence WAP počínající v poloze -148 párů bází (bp) proti směru translace od fůze mezi WAP a BSSL/CEL. 3‘-koncový primer je umístěn v prvním intronu BSSL/CEL konče 398 párů bází (bp) po směru translace od bodu fuze.
A. Sekvence použitých primerů PCR.
B. Agarosový gel ukazující typickou analýzu analýzy PCR potenciálně základních zvířat. M: markéry molekulové hmotnosti. Dráha 1: kontrolní produkt PCR generovaný z plazmidu pS452. Dráhy 2 až 13: reakce PCR provedené s přípravky DNA z potenciálních základních zvířat.
Na obr. 10 se proteiny oddělí na SDS-PAGE, přenesou se na membrány Immobilon (Millipore) a zviditelní se pomocí polyklonálních králičích protilátek vytvořených za použití vysoce čištěné lidské přirozené CEL, následuje alkalická fosfatása značená prasečím protikráličím IgG (Dakopatts). Dráha 1: markéry nízké molekulové hmotnosti, 106, 80, 49,5, 32,5 27,5 nebo 18,5 kDa. Dráha 2: markéry vysoké molekulové hmotnosti, 205, 116,5, 80 nebo 49,5 kDa. Dráha 3: 25 ng čištěné nerekombinantní CEL z lidského mléka. Dráha 4: 2 μΐ vzorku mléka z transgenní CEL myši zředěného 1:10. Dráhy 5 a 6: 2 μΐ vzorků mléka ze dvou různých transgenní non-CEL myši, zředěné 1:10, jako kontrolní vzorky.
Seznam sekvencí:
1/Obecná informace:
i/ přihlašovatel:
A/jméno: AB ASTRA
B/ ulice: Kvambergagatan 16
C/ měst: Sodertalje
E/ země: Švédsko
F/ pošt.kod/ZIP/: S-151 85
G/telefon: +46-8-553 26000
H/telefax: +46-8-553 28820
1/ telex: 19237 astra a ii/ název vynálezu: Nové DNA sekvence iii/ počet sekvencí: 1 iv/ počítačově čtecí forma:
-22CZ 288677 B6
A/ typ média: floppy disk
B/ počítač: IBM PC kompatibilní
C/ operační systém: PC-DOS/MS-DOS
D/ software: Patentln Release č. 1,0, Version č. 1,25/EPO/ vi/ prioritní údaje přihlášky:
A/ č.přihlášky: SE 9201809-2
B/ datum podání: 11.6.1992 vi/ prioritní údaje přihlášky:
A/ číslo přihlášky: SE 9201826-6
B/ datum podání: 12.6.1992 vi/ prioritní údaje přihlášky:
A/ číslo přihlášky: SE 9202088-2
B/ datum podání: 3.7.1992 vi/ prioritní údaje přihlášky:
A/ číslo přihlášky: SE 9300902-5
B/datum podání: 19.3.1992
2/ Informace o sekvenci ID č. 1:
i/ charakteristiky sekvence:
A/ délka: 11531 párů bází
B/ typ: nukleová kyselina
C/ řetězec: dvojitý
D/ topologie: lineární ii/ typ molekuly: DNA /genomová/ vi/ zdroj původu:
A/ organismus: Homo sapiens
F/ typ tkáně: mléčná žláza ix/ rysy:
A/ jméno/klíč: CDS
B/ lokace: spoj /1653..1727,4071..4221, 4307..4429, 4707..4904, 6193..6323,
6501.. 6608, 6751..6868, 8335..8521, 8719..8922, 10124..10321,
10650.. 11394/ ix/ rysy:
A/jméno/klíč: mat_peptid
B/ lokace: spoj /1722..1727, 4071..4221, 4307..4429, 4707..4906, 6193..6323,
6501.. 6608, 6751..6868, 8335..8521, 8719..8922, 10124..10321,
10650.. 11391/
-23CZ 288677 B6 (D) «falší informace:/EC_číslo=3.1.1.1 /produkt= „lipasa stimulovaná žlučovými solemi (ix) (ix) rysy:
(λ) WnQ/EHŽžTMKjignal (B)f3RMčé . 1611.. 1617
(ix) rysy: (A)jnÉno/klíč: exon (BHokace : 1641..1727
(ix) rysy: (AHnÉno/klíc: exon (B)lokace 4071..4221
(ix) rysy: (jQ^náno/kliG exon (B(lokace : 4307..4429
(ix) rysy: (A) jtnéno/klíq exon (B) lokace ' 4707..4904
(ix) rysy: (A) jnéno/klíc: exon tB)lokace ’ «1*3..6323
(ix) ( A^4-*|Anrj/(rlí í- · eXOR (B) : .6608 lokace
(ix) rysy: (AJjrnéno/klíčs exon (B) lokace : 6751..6868
(ix) rysy: (AHncno/klíČ·· exon <Bťckace : 8335..8521
(ix) rysy: JJJjnálo/klíČ? g7i9,.8922 lokace
(ix) rvsy:
(X^jfflúno/lťLÍG: exon (B) lcécaco 10124..10321 (ix) rysyi (A) jnéno/klíú: exon (B>lokace : 10650..11490 (ix) rysy:
(B) 11491.. 11531 lokace:
(xi) popis sekvence: ; SEQ ID č.:i·
GGATCCCTCG AACCCAGGAG TTCAAGACTG CAGTGAGCTA TGATTGTGCC ACTGCACTCT
AGCCTGGGTG ACAGAGACCC TGTCTCAAAA AAACAAACAA ACAAAAAACC TCTGTGGACT
CCCGGTGATA ATGACATGTC AATGTCGATT CATCAGGTGT TAACAGCTCT ACCCCCTGGT
120
180
-24CZ 288677 B6
GGGGGATGTT GATAACGGGG GAGACTGGAG TGGGGCGAGG ACATACGGGA AATCTCTGTA 240
ATCTTCCTCT AATTTTGCTG TGAACCTAAA GCTGCTCTAA AAATGTACAT AGATATAAAC300
TGGGGCCTTC CTTTCCCTCT GCCCTGCCCC AGCCCTCCCC CACCTCOTTC CTCTCCCTGC360
TGCCTCCCCT CTGCCCTCCC CTTTCCTCCT TAGCCACTGT AAATGACACT GCAGCAAAGG420
TCTGAGGCAA ATGCCTTTGC CCTGGGGCGC CCCAGCCACC TGCACGCCCC TTATTTCCTG480
TGGCCGAGCT CCTCCTCCCA CCCTCCAGTC CTTTCCCCAG CCTCCCTCGC CCACTAGGCC540
TCCTGAATTG CTGGCACCGG CTGTGGTCGA CAGACAGAGG GACAGACGTG GCTCTGCAGG600
TCCACTCGGT CCCTGGCACC GGCCGCAGGG GTGGCAGAAC GGGAGTGTGG TTGGTGTGGG660
AAGCACAGGC CCCAGTGTCT CCTGGGGGAC TGTTGGGTCG GAAGGCTCTG GCTCCCCTCA720
CCCTGTTCCC ATCACTGCAG AGGGCTGTGC GGTGGCTGGA GCTGCCACTG AGTGTCTCGG780
TGAGGGTGAC CTCACACTGG CTGAGCTTAA AGGCCCCATC TGAAGACTTT GTTCGTGGTG840
TTCTTTCACT TCTCAGAGCC TTTCCTGGCT CCAGGATTAA TACCTGTTCA CAGAAAATAC900
GAGTCGCCTC CTCCTCCACA ACCTCACACG ACCTTCTCCC TTCCCTCCCG CTGGCCTCTT960
TCCCTCCCCT TCTGTCACTC TGCCTGGGCA TGCCCCAGGG CCTCGGCTGG GCCCTTTGTT1020
TCCACAGGGA AACCTACATG GTTGGGCTAG ATOCCTCCGC ACCCCCCCAC CCACACCCCC1080
TGAGCCTCTA GTCCTCCCTC CCAGGACACA TCAGGCTGGA TGGTGACACT TCCACACCCT1140
TGAGTGGGAC TGCCTTGTGC TGCTCTGGGA TTCGCACCCA GCTTGGACTA CCCGCTCCAC1200
GGGCCCCAGG AAAAGCTCGT ACAGATAAGG TCAGCCACAT GAGTCGAGGG CCTGCAGCAT1260
GCTCCCCTTT CTGTCCCAGA AGTCACGTGC TCGGTCCCCT CTGAAGCCCC TTTGGGGACC1320
TAGGGGACAA GCAGGGCATG GAGACATGGA GACAAAGTAT GCCCTTTTCT CTGACAGTGA1380
CACCAAGCCC TGTGAACAAA CCAGAAGGCA GGGCACTGTG CACCCTGCCC GGCCCCACCA1440
TCCCCCTTAC CACCCGCCAC CTTGCCACCT GCCTCTGCTC CCAGGTAAGT GGTAACCTGC1500
ACAGGTGCAC TGTGGGTTTG GGGAAAACTG GATCTCCCTG CACCTGAGGG GGTAGAGGGG1560
AGGGAGTGCC TGAGAGCTCA TGAACAAGCA TGTGACCTTG GATCCAGCTC CATAAATACC1620
CGAGGCCCAG GGGGAGGGCC ACCCAGAGGC TG ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG1673
Met Leu Thr Met Gly Arg Leu
-23-20
CAA CTG GTT GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC1721
Gin Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala
-15 -10-5
GCG AAG GTAAGAGCCC AGCAGAGGGG CAGGTCCTGC TGCTCTCTCG CTCAATCAGA1777
Ala Lys
TCTGGAAACT TCGGGCCAGG CTGAGAAAGA GCCCAGCACA GCCCCGCAGC AGATCCCGGG1837
CACTCACGCT CATTTCTATG GGGACAGGTG CCAGGTAGAA CACACGATGC CCAATTCCAT1897
TTGAATTTCA GATAAACTGC CAAGAACTGC TGTGTAAGTA TGTCCCATGC AATATTTGAA1957
ACAAATTTCT ATGGGCCGGG CGCAGTGGCT CACACCTGCA ATCCCACCAG TTTGGGAGGC2017
-25CZ 288677 B6
CGAGGTGGGT GGATCACTTG CCCCGTCTCT ACTAAAAATA AGCTACTCGG GAGGCTGAGG AGCTGAGATC ACGCTACTGC ATAGAAAAAG AAAAAAATGA ATGTAACTGG GCCTCTTGAA TCTGTTGTTC CCATTTTACA GGCAGACGGG TGGAGAGAAG CTATTCCTGT GCAGGAAGCT GAAAGAGAGC CGGCAGGCAG TGTGAAGGAG AAGCCACAGA CAGTCCCTGC CCCCAGCAGG CTCCCTCCGG TGTCTCAGGC CACTCCCTGG CCCTGGGACC AGAGGTCACC TTCTTCTTGG ATCACGACCC CTCCCCATTT GATCACGCCA CTGGCACAAG ATGTGTTGCT TCTGGTTCCT GACAGGGGGC CCATCACCCT GTGTAGGGCC ACCCTGCCCT ATGACCTGGT CCCACCATGC GTGGCACTGG GGCAGACAGC GCCTCAGTTC CGTCAGGGAC GTGGACAGCT TGGTGCACAG AGGTGTGGTC CCTAGGGGGT CATGGGGCCA TCGACTTTGT GAAAAGCAGG CCCCACCCCT TGAGCATTGG GTACACTCCT CCGACAGGAG ACACGGCTGT AGCTGGGCGG CCATAGCCAG TGGGAACACT GGTTGAACCA AAGGAGAGGA ACAGGAATCC TCTCCTGTGC AGAGCTGTCC CTTGCCTTGC CCCCTCCGGA
AGGTCAGGAG TTGGAGACCA CAAATATTAA TCGGGCGTGG CAGGAGAACC GCTTGAAGCT ACTCCAGCCT GGGTGACAGG AACATACTAA AAAACAATTC TTTACATTTG CTAATCCTGG GAAGGGGAAA CGGGCCCAGG CAGGCAGGCA GTTTGCCCAG GAAAGCCGGG CTACTCCACA GAGCTCTCTC GAGGCATCCA AACCCCAAGC CCCACAGGAA AGTCACACAG GGGACCCCAG CCTGGGGACT CCTGTCTCCA GGGAGGTTTG GGCAGTGGTC GCGAGCTCTT CTTGGGGTGC CCCCACCCTG AGGCCCTCTG GAGACACAGA TGCCTCGCAG TTCCTCCAGT TCCAACCGCC AGACTTCAGA GGGCTGCTGG TCCCCACCTG GAACCTGGCA ACCACGGGAA GAGGGAGCTG TGCTTCTCAA CAGGGTGACT AGAGGGTGGA TGAGCACCAA AGGCCATTTT CATGGCACAG TCTTTACCAG CAGGGGGCTC GCCCAGCCAG CTAGGCCCTG CAGAAAGGAG GAAGGTTGGT CCCGGGAGCT GGACAGGCCT TGCTCGTCTT CCACATGGGG AACCCAAACC TCCATCCCAC gtttcctcta agattctggg TAAAGCCCTG AGCATTGCAG TGCTTTGAAG CTGTCTTTGC TTCAGGCCGA TGGGGCTTGA
GCCTCGCCAA CATGGTGAAA TGGTGGGTGC CTGTAATCCC GGGAGGTGGA GATTGCGGTG GCGAGACTCT GTCTCAAAAA ACTGTTTACC TGAAATTCAA TGATTCCACC TACCAACCTC GGCAGGCAGT GTGGAGAGCA CATGGCACAG CTGCTGCCTC CCCGGGTCCG GGTCCCTCCA TAAATTCTAC CCTCTCTGCC GCCGGTCTCG GTGCCCGGCC ATCCCAACCA CGCTGTTCTG CCTCTGCTGC CTGCTCTCCA TTGGGCTCCT GACTCAAAGG TGAGAGGCCT TCGGCAGGTC GCCAGTCTCA ATTGCACAGG GGGATGCCCA CGATGCCTGC GCACTCTCCC ACACCAGTCT GACCCTGGCT GGGCCTGGGG CAGGTGACAG CCAGCAAGCA CTGCCCAAGA TGGACAGGAG TCAAGCCCAA AAGCTGCCCA CCTCCAGGCC CCTCGTGGGG GGAAGCGTCG CGGGGGTGGG AGGAACTGTG GGGACTTGGG TGCAGGGAGA TGGGAGGAGG GTGAAACATC CCGGGTACAC CCCATGTGAT GGCAAACAGG AAACTGAGGA TCGGAGTCAA CTCTTGGCCG GCTTCCCTAG AGCAGGACAC CCCCAGGGAT GGCAGGGGGT GCTGCCTGGG CTCTGGGCAC GCGGAGTCGG GCCCCCCTGA CCCTGCCCGT
2077
2137
2197
2257
2317
2377
2437
2497
2557
2617
2677
2737
2797
2857
2917
2977
3037
3097
3157
3217
3277
3337
3397
3457
3517
3577
3637
3697
3757
3817
387?
3937
3997
4057
-26CZ 288677 B6
GTCTCCCTCG CAG CTG GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG CAA 4106
Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Ph· Val Glu
10
GGC GTC AAT AAG AAG CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC4154
Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp IlePhe
20 2530
AAG GGC ATC CCC TTC GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG4202
Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn ProGin
4045
CCA CAT CCT GGC TGG CAA G GTGGGAGTGG GTGGTGCCGG ACTGGCCCTG4251
Pro His Pro Gly Trp Gin
CGGCGGGGCG GGTGAGGGCC GCTGCCTTCC TCATGCCAAC TCCTGCCACC TGCAG GG 4308
Gly
ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC ACC ATC4356
Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gin Ala ThrIle
6065
ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC AAC ATT4404
Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu AsnIle
75 8085
TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA G GTCTGCCTCC CCTCTACTCC4449
Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin
CCAAGGGACC CTCCCATGCA GCCACTGCCC CGGGTCTACT CCTGGCTTGA GTCTGGGGGC 4509 TGCAAAGCTG AACTTCCATG AAATCCCACA GAGGCGGGGA GGGGAGCCCC CACTGCCGTT 4569 GCCCAGCCTG GGGCAGGGCA GCGCCTTGGA GCACCTCCCT GTCTTGGCCC CAGGCACCTG 4629
CTGCACAGGG ACAGGGGACC GGCTGGAGAC AGGGCCAGGC GGGGCGTCTG CGGTCACCAG4689
CCGCTCCCCC ATCTCAG TC TCC CGG GAC CTG CCC GTT ATG ATC TGG ATC4738
Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Het Ile Trp Ile
95100
TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT GGG GCC AAC TTC CTC4786
Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Ala Asn PheLeu
105 110 US120
AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC ACA CGC GGA AAC GTC4834
Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala Thr Arg Gly AsnVal
125 130135
ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC CTT GGG TTC CTC AGC4882
Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe LeuSer
140 145150
ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA G GTGCGTGGGT GCCTTCGGCC CTGAGGTGGG4934
Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro
155
GCGACCAGCA TGCTGAGCCC AGCAGGGAGA TTTTCCTCAG CACCCCTCAC CCCAAACAAC4994
CAGTGGCGGT TCACAGAAAG ACCCQGAAGC TCGAGTAGAA TCATGAGATG CAGGAGGCCC5054
TTGGTAGCTG TAGTAAAATA AAAGXTGCTG CAGAGGCCGG GAGAGATGGC TCACGCCTGT5114
AATCCCAGCA CTTTAGGAGG CCCACACAGG TGGGTCACTT GAGCGCAGAA GTTCAAGACC5174
-27CZ 288677 B6
AGCCTGAAAA TCACTGGGAG ACCCCCATCT CTACACAAAA ATTAAAAATT AGCTGGGGAC 5234
TGGGCGCGGC GGCTCACCTC TGTAATCCCA GCACGTTGGG AGCCCAAGGT GGGTAGATCA5294
CCTGAGGTCA GGAGTTTGAG ACCAGCCTGA CTAAAATGGA GAAACCTCTT CTCTACTAAA5354
AATACAAAAT TAGCCAGGCG TGGTGGCGCT TGCCTGTAAT CCCAGCTACT CGGGAGGCTG5414
AGGCAGGAGA ATCGCTTGAA CTCAGGAGGC GGAGGTTGCG GTGAGCCGAG ATCATGCCAC5474
TGCACTCCAG CCTGGAGAAC AAGAGTAAAA CTCTGTCTCA AAAAAAAAAA ΑΑΑΑΑΛΑΑλλ5534
ATAGCCAGGC GTGGTATCTC ATGCCTCTGT CCTCAGCTAC CTGGGAGGCA GAGGTGGAAG5594
GATCGCTTGA GCCCAGGGGT TCAAAGCTGC AGTGAGCCGT GGTCGTGCCA CTGCACTCCA5654
GCCTGGGCGA CAGAGTGAGG CCCCATCTCA AAAATAAGAG GCTGTGGGAC AGACAGACAG5714
GCAGACAGGC TGAGGCTCAG AGAGAAACCA GGAGAGCAGA GCTGAGTGAG AGACAGAGAA5774
CAATACCTTG AGGCAGAGAC AGCTGTGGAC ACAGAAGTGG CAGGACACAG ACAGGAGGGA5834
CTGGGGCAGG GGCAGGAGAG GTGCATGGGC CTGACCATCC TGCCCCCGAC AAACACCACC5894
CCCTCCAGCA CCACACCAAC CCAACCTCCT GGGGACCCAC CCCATACAGC ACCGCACCCG5954
ACTCAGCCTC CTGGGACCCA CCCACTCCAG CAACCAACGT GACCTAGTCT CCTGGGACCC6014
ACCCCCTCCA GCACCCTACC CGACCCAGCT TCTTAGGGAC CCACCATTTG CCAACTGGGC6074
TCTGCCATGG CCCCAACTCT GTTGAGGGCA TTTCCACCCC ACCTATGCTG ATCTCCCCTC6134
CTGGAGGCCA GGCCTGGGCC ACTGGTCTCT AGCACCCCCT CCCCTGCCCT GCCCCCAG GT 6194
Gly
160
AAC TAT GGC CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG6242
Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin His Met Ala Ile Ala Trp Val LysArg
16S 170175
AAT ATC GCG GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGC6290
Asn Zle Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu PheGly
180 185190
GAG TCT GCT GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG GTCTCGGGAT CCCTGTGGGG6343
Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gin
195200
AGGGCCTGCC CCACAGGTTG AGAGGAAGCT CAAACGGGAA GGGGAGGGTG GGAGGAGGAG6403
CGTGGAGCTG GGGCTGTGGT GCTGGGGTGT CCTTGTCCCA GCGTGGGGTG GGCAGAGTGG6463
GGAGCGGCCT TGGTGACGGG ATTTCTGGGT CCCGTAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC 6518
Thr Leu Ser Pro Tyr Asn
205
AAG GGC CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT6566
Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gin Ser Gly Val Ala LeuSer
210 215 220225
CCC TGG GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG6608
Pro Trp Val Ile Gin Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala LysLys
230235
GTAAACGGAG GAGGGCAGGG CIGGGCGGGG TGGGGGCTGT CCACATTTCC GTTCTTTATC6668
CTGGACCCCA TCCTTGCCTT CAAATGGTTC TGAGCCCTGA GCTCCGGCCT CACCTACCTG6728
-28CZ 288677 B6
CTGGCCTTGG TTCTGCCCCC AG GTG Vel 240
GCT GAG AAG Ale Glu Lys
GTG GGT TGC CCT GTG GGT
Vel Gly Cys Pro Val Gly 245
6780
GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG GTT ACT GAT CCC CGA GCC 6828
Asp Ala Ala Arg Met Ala Gin cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala
250 255 260 265
CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA GGC CTG GAC T GTGAGTAGCT 6878
Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu
270 275
GCTCGGGTTG GCCCATGGGG TCTCGAGGTG GGGGTTGAGG GGGGTACTGC CAGGGAGTAC 6938
TCCGGAGGAG AGAGGAAGGT GCCAGAGCTG CGGTCTTGTC CTGTCACCAA CTAGCTGGTG 6998
TCTCCCCTCG AAGGCCCCAG CTGTAAGGGA GAGGGGGTGC CGTTTCTTCT TTTTTTTTGA 7058
GATGGAGTCT CACTGTTGCC CAGGCTGGAG TGCAGTGTCA CGATCTCAGC TCACTGCAAC 7118
CTCCACCTCC TGGGTTCAAG TGATTCTCTG ACTCAACCTC CCATGTAGCT GGGACTACAG 7178
GCACATGCCA CCATGCCCAG ATAATTTTTC TCTGTGTTTA GTAGGGATGG AGTTTCATCG 7238
TGTTAGCTAG GATGATCTCG GTCTTGGGAC CTCATGATCT GCCCACCTCG GCCTCCCAAA 7298
GTGCTGGAAT TACAGGCGTG AGCCACTGTG CCCGGCCCCT TCTTTATTCT TATCTCCCAT 7358
GAGTTACAGA CTCCCCTTTG AGAAGCTGAT GAACATTTGG GGCCCCCTCC CCCACCTCAT 7418
GCATTCATAT GCAGTCATTT GCATATAATT TTAGGGAGAC TCATAGACCT CAGACCAAGA 7478
GCCTTTGTGC TAGATGACCG TTCATTCATT CGTTCATTCA TTCAGCAAAC ATTTACTGAA 7538
CCGTAGCACT GGGGCCCAGC CTCCAGCTCC ACTATTCTGT ACCCCGGGAA GGCCTGGGGA 7598
CCCATTCCAC AAACACCTCT GCATGTCAGC CTTACCAGCT TGCTACGCTA AGGCTGTCCC 7658
TCACTCATTC TTCTATGGCA ACATGCCATG AAGCCAAGTC ATCTGCACGT TTACCTGACA 7718
TGAGCTCAAC TGCACGGGCT GGACAAGCCC AAACAAAGCA ACCCCCACOG CCCCGCTAGA 7778
AGCAAAACCT GCTGTGCTGG GCCCAGTGAC AGCCAGGCCC CGCCTGCCTC AGCAGCCACT 7838
GGGTCCTCTA GGGGCCCGTC CAGGGGTCTG GAGTACAATG CAGACCTCCC ACCATTTTTG 7898
GCTGATGGAC TGGAACCCAG CCCTGAGAGA GGGAGCTCCT TCTCCATCAC TTCCCTCAGT 7958
GGCTTCTAAG TTTCCTCCTT CCTGCTTCAG GCCCAGCAAA GAGAGAGAGG AGAGGGAGGG 8018
GCTGCCGCTG AAGAGGACAG ATCTGGCCCT AGACAGTGAC TCTCAGCCTG GGGACGTGTG 8078
GCAGGGCCTG GAGACATCTG TGATTGTCAC AGCTGGGGAG GGGGTGCTCC TGGCACCTCG 8138
TGGGTCGAGG CCGGGGATGC TCTAAACATC CTACAGGGCA CAGGATGCCC CTGATGGTGC 8198
AGAATCAACC CTGCCCCAAG TGTCCATAGA TCAGAGAAGG GAGGACATAG CCAATTCCAG 8258
CCCTGAGAGG CAAGGGGCGG CTCAGGGGAA ACTGGGAGGT ACAAGAACCT GCTAACCTGC 8318
TGGCTCTCCC ACCCAG AC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT 8366
Tyr Pro Met Leu His Tyr Vel Gly Phe Val Pro 280 285
GTG ATT GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp 290 295
CCG ATC AAC CTG TAC GCC Pro Ile Asn Leu Tyr Ala 300 305
8414
-29CZ 288677 B6
AAC GCC GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC 8462
Asn Ala Ala Asp II* Asp Tyr II· Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly
310 315 320
CAC ATC TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG8510
His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly AsnLys
325 330335
AAA GTC ACG GA GTAAGCAGGG GGCACAGGAC TCAGGGGCGA CCCGTGCGGG8561
Lys Val Thr Glu
340
AGGGCCGCCG GGAAAGCACT GGCGAGGGGG CCAGCCTGGA GGAGGAAGGC ATTGAGTGGA8621
GGACTGGGAG TGAGGAAGTT AGCACCGGTC GGGGTGAGTA TGCACACACC TTCCTGTTGG8681
CACAGGCTGA GTGTCAGTGC CTACTTGATT CCCCCAG G GAG GAC TTC TAC AAG8734
Glu Asp Phe Tyr Lys
345
CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG8782
Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala LysThr
350 355360
ACC ŤTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG8830
Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gin Asp Pro Ser GinGlu
365 370375
AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTC GAC TTT GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG8878
Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu PheLeu
380 385390
GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG CAC AGA GCC AAT GCC AA8922
Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gin His Arg Ala Asn AlaLys
395 400405
GTGAGGATCT GGGCAGCGGG TGGCTCCTGG GGGCCTTCCT GGGGTGCTGC ACCTTCCAGC8982
CGAGGCCTCG CTGTGGGTGG CTCTCAGGTG TCTGGGTTGT CTGGGAAAGT GGTGCTTCAG9042
TCCCCACCTG TGCCTGCCTG ATCCACTTTG CTGAGGCCTG GCAAGACTTG AGGGCCTCTT9102
TTTACCTCCC AGCCTACAGG GCTTTACAAA CCCTATGATC CTCTGCCCTG CTCAGCCCTG9162
CACCCCATGG TCCTTCCCAC TGGAGAGTTC TIGAGCTACC TTCCATCCCC CATGCTGTGT9222
GCACTGAGAG AACACTGGAC AATAGTTTCT ATCCACTGAC TCTTATGGGC CTCAACTTTG9282
CCCATAATTT CAGCCCACCA CCACATTAAA AATCTTCATG TAATAATAGC CAATTATAAT9342
AAAAAATAAG GCCAGACACA GTAGCTCATG CCTOTAATCC CAGCACATTS GGAGGTCAAG9402
GTGGGAGGAT CACTTGAGGT CAGGAGTCTG AGACTAGTCT GGCCAACATG GCAAAXCCCC9462
ATCTCTACTA AAAATACAAA AATTATCCAG GCATGGTGGT GCATGCCTAT AATCCTAGCT9522
ACTCAGGAGG CTGAGGTAGC ACAATTGATT GACCCAGGGA GGTGGAGGTT GCAGTGAGCC9582
GAGATTACGC CACTGCACTC CAGCAGGGGC AACAGAGTGA GACTGTGTCT CGAATAAATA9642
AGTAAATAAA TAATAAAAAT AAAAAATAAG TTAGGAATAC GAAAAAGATA GGAAGATAAA9702
AGTATACCTA GAAGTCTAGG ATGAAAGCTT TGCAGCAACT AAGCAGTACA TTTAGCTGTG9762
AGCCTCCTTT CAGTCAAGGC AAAAAGGGAA ACAGTTGAGG GCCTATACCT TGTCCAATCT9822
AATTGAAGAA TGCACATTCA CTTGGAGAGC AAAATATTTC TTGATACTCA ATTCTAGAAG9882
-30CZ 288677 B6
GAAGGTCCCT CACAATGTTT TGTGGAGGTC catgaAtcca tcaatttggt tctcagcttt TTCATGTCAA TTCCCCAGAC ACTTCCCTGC TCTCTCGGCT GATCGGTCCC CAGTGAGCAC
AAGTATAAAT TCAGCTGAAA TTGTGGAACC9942
CCCTTCCCTG GGTCTAAGAA GCCCCATCTC10002
CCACTGCCCG GGACCTCCCT CCAAGTCCGG10062
CCTCCCTACT TGGGTCGTCT CTCCCCTCCA10122
G G AGT GCC Ser Ais AAG ACC Lys Thr TAC GCC Tyr Ala 415 TAC CTC TTT TCC CAT CCC TCT CGG ATC 10169
Tyr Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met
410
CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT GCA GAT GAC ATT CAG 10217
Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gin
425 430 435 440
TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG GGC TAC CGG CCC CAA 10265
Tyr Val Ph· Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gin
445 450 455
GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATC ATC GCC TAC TGG ACC AAC TTT GCC 10313
Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Zle Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala
460 465 470
AAA ACA QG GTAAGACGTC GGTTGAGTCC AGGGCGGAGG GCCACAGCCG10361
Lys Thr Gly
475
AGAAGGGCCT CCCACCACGA GGCCTTGTTC AGTCACTTAA CCTCCCCCTG CATCGGAATC AGAGCCCCAA GCCCATGCAC GTGCACAGCC CCCAGGGCCA GCTCAGAGGG CGGGGATCGC GCCCCCTCGG AGTCCCCAGC CCCTGCACAG
CCTCATTTGC CAGTCGAGGG ACTTTCGGCA 10421
CATCTCTCTT TCAGGATGAG AGTTACTCGC10481
AGTCCCCAGT ATCCAGTCAG GGGCATCGTC10541
TCAGGCGTCC AGGTCGAGAG CAGGGCTTCA10601
CCTCTTCTCA CTCTGCAG G GAC CCC10656
Asp Pro
AAC ATC GGC GAC Gly Asp 480 TCG GCT GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG 10704
Asn Met Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr
485 490
GAA AAC AGC GGC TAC CTG GAG ATC ACC AAG AAG ATC GGC AGC AGC TCC 10752
Glu Asn 495 Ser Gly Tyr Leu Glu 500 Ile Thr Lys Lys Met 505 Gly Ser Ser Ser
ATG AAG CGG AGC CTG AGA ACC AAC TTC CTG CGC TAC TCG ACC CTC ACC 10800
Met 510 Lys Arg Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr Trp Thr Leu Thr 525
TAT CTC GCG CTG CCC ACA GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTC CCC 10848
Tyr Leu Ala Leu Pro 530 Thr Val Thr Asp Gin 535 Glu Ala Thr Pro Val 540 Pro
CCC ACA GGG GAC TCC GAG GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC 10896
Pro Thr Gly Asp 545 Ser Glu Ala Thr Pro 550 Val Pro Pro Thr Gly 555 Asp Ser
GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTC 10944
Glu Thr Ala 560 Pro Val Pro Pro Thr 565 Gly Asp Ser Gly Ala 570 Pro Pro Val
CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTC CCG CCC ACG GGT GAC 10992
Pro Pro 575 Thr Gly Asp Ser Gly 580 Ala Pro Pro Val Pro 585 Pro Thr Gly Asp
-31CZ 288677 B6
TCC GGG GCC CCC Ala Pro CCC GTC CCG CCC ACG GGT GAC TCC CGG GCC CCC CCC
Ser 590 Gly Pro Val 595 Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala 600 Pro Pro 605
GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC ccc GTC CCG CCC ACG GGT
Val Pro Pro Thr Gly 610 Asp Ser Gly Ala Pro 615 Pro Val Pro Pro Thr 620 Gly
GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC
Asp Ser Gly Ala 625 Pro Pro Val Pro Pro 630 Thr Gly Asp Ser Gly 635 Ala Pro
ccc GTG CCG CCC ACG GGT GAC GCC GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG
Pro Val Pro 640 Pro Thr Gly Asp Ala 645 Gly Pro Pro Pro Val 650 Pro Pro Thr
GGT GAC TCC GGC GCC CCC CCC GTC CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC
Gly Asp 655 Ser Gly Ala Pro Pro 660 Val Pro Pro Thr Gly 665 Asp Ser Gly Ala
CCC CCC GTC ACC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTC CCG CCC
Pro 670 Pro Val Thr Pro Thr 675 Gly Asp Ser Glu Thr 680 Ala Pro Val Pro Pro 685
ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCT GTC CCC CCC ACG GGT GAC TCT GAG
Thr Gly Asp Ser Gly 690 Ala Pro Pro Val Pro 695 Pro Thr Gly Asp Ser 700 Glu
GCT GCC CCT GTC CCC CCC ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATC CCT
Ala Ala Pro Val 705 Pro Pro Thr Asp Asp 710 Ser Lys Glu Ala Gin 715 Met Pro
GCA GTC ATT AGG TTT TAGCGTCCCA TGAGCCTTCG TATCAAGAGG CCACAAGAGT Ala Val Ile Arg Phe
720
GGGACCCCAG GGGCTCCCCT CCCATCTTGA GCTCTTCCTC AATAAAGCCT CATACCCCTC
TCGGTGTCTT TCTTTGCTCC CAAGGCTAAG CTCCAGGATC

Claims (7)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaná DNA molekula genomu, kódující biologicky funkční lipázu stimulovanou žlučovými solemi /karboxyester lipázu (BSSL/CEL), přičemž uvedená DNA molekula má nukleotidovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí pod SEQ ID č. 1, nebo sekvenci schopnou hybridizovat s uvedenou sekvencí nebo její specifickou částí za přísných hybridizačních podmínek.
  2. 2. DNA molekula podle nároku 1, která je uvedena v seznamu sekvencí pod SEQ ID č. 1.
  3. 3. Replikovatelný expresní vektor, který nese a je schopen zprostředkovat expresi DNA molekuly podle některého z nároků 1 a 2, kódující lidskou BSSL/CEL.
  4. 4. Vektor podle nároku 3, který je schopen kódovat biologicky funkční BSSL/CEL a obsahující regulační prvky genů vybraných ze souboru sestávajícího z genů syrovátkových proteinů a kaseinových proteinů, který zaměřuje expresi BSSL/CEL do mléčné žlázy savce odlišného od člověka.
  5. 5. Vektor podle nároku 3, kterým je vektor pS452 DSM 7499.
  6. 6. Buňka, která je získána z mnohobuněčného organizmu a nese vektor podle nároku 3.
  7. 7. Způsob produkce lidské BSSL/CEL, vyznačující se tím, že zahrnuje
    a) vložení DNA molekuly definované v kterémkoli z nároků 1 a 2 do vektoru, který je schopen se replikovat ve specifické hostitelské buňce,
    b) zavedení výsledného rekombinantního vektoru do hostitelské buňky,
    c) růst výsledné buňky v kultivačním nebo na kultivačním médiu pro expresi polypeptidu a
    d) získání polypeptidu.
CZ19943091A 1992-06-11 1993-06-09 Izolovaná DNA molekula genomu, replikovatelný expresní vektor, buňka jej nesoucí a způsob produkce lidské BSSL/CEL CZ288677B6 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9201809A SE9201809D0 (sv) 1992-06-11 1992-06-11 New dna sequences
SE9201826A SE9201826D0 (sv) 1992-06-12 1992-06-12 New dna sequences ii
SE9202088A SE9202088D0 (sv) 1992-07-03 1992-07-03 New dna sequences iii
SE9300902A SE9300902D0 (sv) 1993-03-19 1993-03-19 New dna sequences iv

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ309194A3 CZ309194A3 (en) 1995-07-12
CZ288677B6 true CZ288677B6 (cs) 2001-08-15

Family

ID=27484751

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19943091A CZ288677B6 (cs) 1992-06-11 1993-06-09 Izolovaná DNA molekula genomu, replikovatelný expresní vektor, buňka jej nesoucí a způsob produkce lidské BSSL/CEL

Country Status (31)

Country Link
US (2) US5616483A (cs)
EP (1) EP0651793B1 (cs)
JP (1) JP4231105B2 (cs)
KR (1) KR100357670B1 (cs)
CN (1) CN1071791C (cs)
AP (1) AP411A (cs)
AT (1) ATE447012T1 (cs)
AU (1) AU670598B2 (cs)
CA (1) CA2137815C (cs)
CZ (1) CZ288677B6 (cs)
DE (1) DE69334298D1 (cs)
DK (1) DK0651793T3 (cs)
ES (1) ES2335626T3 (cs)
FI (1) FI945793A (cs)
HR (1) HRP930935A2 (cs)
HU (1) HU220338B (cs)
IL (1) IL105874A (cs)
IS (1) IS4029A (cs)
MA (1) MA22905A1 (cs)
MX (1) MX9303439A (cs)
NO (1) NO944715L (cs)
NZ (1) NZ253391A (cs)
PH (1) PH31680A (cs)
PT (1) PT651793E (cs)
RU (1) RU2128708C1 (cs)
SG (1) SG52580A1 (cs)
SI (1) SI9300319A (cs)
SK (1) SK286993B6 (cs)
TN (1) TNSN93067A1 (cs)
UA (1) UA41322C2 (cs)
WO (1) WO1993025669A1 (cs)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2184688A1 (en) * 1994-03-09 1995-09-14 Pedro Antonio Prieto Transgenic animals producing oligosaccharides and glycoconjugates
US5907080A (en) * 1995-11-30 1999-05-25 Nexia Biotechnologies, Inc. Method for development of transgenic dwarf goats
US7008776B1 (en) * 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
SK287687B6 (sk) * 1996-12-06 2011-06-06 Aventis Pharmaceuticals Inc. Izolovaný polypeptid kódovaný génom podobným génu pre lipázu, prostriedok majúci fosfolipázovú účinnosť, farmaceutický prostriedok, antigénny fragment a izolovaná nukleová kyselina, biologicky aktívny prostriedok, vektor, rekombinovaná hostiteľská bunka, prostriedok využiteľný na transfekáciu cieľovej bunky, spôsob výroby polypeptidu a polypeptid takto vyrobený, protilátka, hybridomná bunka, spôsob in vitro sceeningu, spôsob in vitro enzymatickej hydrolýzy, použitie polypeptidu a protilátky a
FR2763958A1 (fr) * 1997-05-29 1998-12-04 Transgene Sa Produit de combinaison associant un acide nucleique a une substance desorganisant la matrice extracellulaire pour la therapie genique
US20020088019A1 (en) * 1997-09-02 2002-07-04 Oron Yacoby-Zeevi Methods of and pharmaceutical compositions for improving implantation of embryos
US6699672B1 (en) * 1997-09-02 2004-03-02 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use research and medical applications
US20010006630A1 (en) * 1997-09-02 2001-07-05 Oron Yacoby-Zeevi Introducing a biological material into a patient
US20040213789A1 (en) * 1997-09-02 2004-10-28 Oron Yacoby-Zeevi Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monoclonal antibody and other anti-heparanase antibodies
US6177545B1 (en) * 1997-09-02 2001-01-23 Insight Strategy & Marketing Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications
SE9801424D0 (sv) 1998-04-22 1998-04-22 Astra Ab Expression methods
US20030217375A1 (en) * 1998-08-31 2003-11-20 Eyal Zcharia Transgenic animals expressing heparanase and uses thereof
EP1157118A4 (en) * 1999-03-01 2002-07-17 Insight Strategy & Marketing POLYNUCLEOTID ENCODING A POLYPEPTIDE WITH HEPARANASE ACTIVITY AND ITS EXPRESSION IN GENETICALLY MODIFIED CELLS
AU4074400A (en) * 1999-04-09 2000-11-14 Human Genome Sciences, Inc. 49 human secreted proteins
AU5032600A (en) * 1999-05-19 2001-12-03 Barnes-Jewish Hospital Enhanced triglyceride digestion in a deficiency of bile salts
JP2004527210A (ja) 2000-08-02 2004-09-09 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー 内皮細胞発現パターンの評価法
IT1319655B1 (it) 2000-11-15 2003-10-23 Eurand Int Microsfere di enzimi pancreatici con elevata stabilita' e relativometodo di preparazione.
US20020182243A1 (en) * 2001-05-14 2002-12-05 Medo Elena Maria Method of producing nutritional products from human milk tissue and compositions thereof
US20100268658A1 (en) * 2001-05-14 2010-10-21 Prolacta Bioscience Method for collecting, testing and distributing milk
US6671189B2 (en) * 2001-11-09 2003-12-30 Minebea Co., Ltd. Power converter having primary and secondary side switches
US20030213007A1 (en) * 2002-03-27 2003-11-13 Slattery Charles Wilbur Human milk produced by human mammary tissue implanted in non-human host animals and uses thereof
US20060269552A1 (en) * 2003-06-09 2006-11-30 Oron Yacoby-Zeevi Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monclonal antibody and other anti-heparanase antibodies
EP1926834A4 (en) * 2005-09-20 2009-04-22 Prolacta Bioscience Inc METHOD FOR ANALYZING MILK
WO2007089133A1 (en) * 2006-02-03 2007-08-09 Academisch Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for influencing interactions between dc-sign and dc-sign ligands
ES2894973T3 (es) * 2006-11-29 2022-02-16 Prolacta Bioscience Inc Composiciones de leche materna y métodos de preparación y uso de las mismas
ES2396571T3 (es) * 2006-12-08 2013-02-22 Prolacta Bioscience, Inc. Composiciones de lípidos humanos y procedimientos de preparación y utilización de los mismos
US8246950B2 (en) 2007-02-20 2012-08-21 Aptalis Pharma Limited Stable digestive enzyme compositions
WO2009109856A2 (en) 2008-03-07 2009-09-11 Axcan Pharma Inc. Method for detecting infectious parvovirus in pharmaceutical preparations
WO2010065652A1 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Prolacta Bioscience, Inc. Human milk permeate compositions and methods of making and using same
CN108187033A (zh) 2010-10-01 2018-06-22 阿普塔利斯制药有限公司 肠溶包衣的低强度胰脂肪酶制剂
RU2013123056A (ru) 2010-10-21 2014-11-27 Сведиш Орфан Биовитрум Аб (Пабл) Способ повышения всасывания ненасыщенных жирных кислот у грудных детей
JP5850940B2 (ja) * 2010-10-21 2016-02-03 スウェディッシュ オーファン バイオビトラム パブリーク アクチエボラグ ヒト乳児の発育速度を増大させる方法
JP6062433B2 (ja) 2011-08-03 2017-01-18 プロラクタ バイオサイエンス，インコーポレイテッド 細菌汚染を低減するためのヒト乳の精密濾過
DK2741766T3 (en) 2011-08-08 2016-01-11 Aptalis Pharma Ltd Process for dissolving solid compositions containing digestive enzymes
CN103088000A (zh) * 2012-03-23 2013-05-08 北京济福霖生物技术有限公司 在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法
SI2852668T1 (sl) * 2012-07-12 2016-09-30 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonukleotidi za izvedbo spremembe v sekvenci tarčne molekule rna, prisotne v živeči celici
JP6853665B2 (ja) 2013-03-13 2021-03-31 プロラクタ バイオサイエンス，インコーポレイテッド 高脂質ヒト乳製品
US10184121B2 (en) 2013-06-28 2019-01-22 Allergan Pharmaceuticals International Limited Methods for removing viral contaminants from pancreatic extracts
MX2016001593A (es) 2013-08-09 2016-09-29 Allergan Pharmaceuticals Int Ltd Composicion de enzima digestiva adecuada para administracion enterica.
AU2016381834B2 (en) 2015-12-30 2021-09-23 Prolacta Bioscience, Inc. Human milk products useful in pre- and post-operative care

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3256150A (en) * 1964-04-20 1966-06-14 Dairyland Food Lab Method for treating malabsorption syndrome
GB1509866A (en) * 1975-06-10 1978-05-04 Johnson & Johnson Enteric coated digestive enzyme compositions
US4873316A (en) * 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5200183A (en) * 1987-11-19 1993-04-06 Oklahoma Medical Research Foundation Recombinant bile salt activated lipases
US4944944A (en) * 1987-11-19 1990-07-31 Oklahoma Medical Research Foundation Dietary compositions and methods using bile salt-activated lipase
US5173408A (en) * 1989-11-13 1992-12-22 Lange Louis George Iii Mammalian pancreatic cholesterol esterase
WO1991015534A1 (en) * 1990-03-30 1991-10-17 Allied-Signal Inc. Electrically conductive poly(aromatic vinylenes) and poly(heteroaromatic vinylenes)
SE9001985D0 (sv) * 1990-06-01 1990-06-01 Astra Ab New chemical products

Also Published As

Publication number Publication date
ATE447012T1 (de) 2009-11-15
MX9303439A (es) 1994-04-29
KR100357670B1 (ko) 2003-04-11
ES2335626T3 (es) 2010-03-30
AP411A (en) 1995-09-28
EP0651793B1 (en) 2009-10-28
HUT71789A (en) 1996-02-28
SG52580A1 (en) 1998-09-28
JPH07507687A (ja) 1995-08-31
AU670598B2 (en) 1996-07-25
TNSN93067A1 (fr) 1994-03-17
DE69334298D1 (de) 2009-12-10
US5716817A (en) 1998-02-10
IL105874A (en) 1998-12-27
JP4231105B2 (ja) 2009-02-25
SI9300319A (en) 1994-03-31
HU9403536D0 (en) 1995-02-28
SK286993B6 (sk) 2009-09-07
PT651793E (pt) 2010-01-20
CA2137815A1 (en) 1993-12-23
NZ253391A (en) 1996-01-26
IL105874A0 (en) 1993-10-20
CZ309194A3 (en) 1995-07-12
FI945793A (fi) 1995-02-09
CN1071791C (zh) 2001-09-26
FI945793A0 (fi) 1994-12-09
UA41322C2 (uk) 2001-09-17
EP0651793A1 (en) 1995-05-10
DK0651793T3 (da) 2010-03-15
IS4029A (is) 1993-12-12
PH31680A (en) 1999-01-18
WO1993025669A1 (en) 1993-12-23
HU220338B (hu) 2001-12-28
HRP930935A2 (en) 1994-12-31
RU94046360A (ru) 1997-06-10
AU4366793A (en) 1994-01-04
AP9300538A0 (en) 1993-07-31
NO944715D0 (no) 1994-12-07
SK148694A3 (en) 1995-08-09
NO944715L (no) 1995-02-07
US5616483A (en) 1997-04-01
CA2137815C (en) 2010-11-09
CN1086262A (zh) 1994-05-04
MA22905A1 (fr) 1993-12-31
RU2128708C1 (ru) 1999-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AP411A (en) DNA sequences used in the production of recombinant human BSSL/CEL in transgenic non-human mammals, and the produced BSSSL/CEL used in infant formulas.
US20070011754A1 (en) Lysosomal proteins produced in the milk of transgenic animals
RU2219239C2 (ru) Варианты стимулируемой солями желчи липазы, кодирующие их молекулы днк и трансгенные млекопитающие, не принадлежащие к человеку
US6525241B1 (en) Expression methods
PL175404B1 (pl) Wyizolowana cząsteczka DNA i sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL
LT4008B (en) Novel polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20130609