PL175404B1 - Wyizolowana cząsteczka DNA i sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL - Google Patents

Abstract

1. Wyizolowana czasteczka DNA kodujaca funkcjonalne bialko BSSL/CEL i zawierajaca sekwencje intronowe, z n a m ie n n a ty m , ze czasteczka DNA hybrydyzuje z sekwencja DNA, przedstawiona w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ ID Nr: 1, w ostrych warunkach hybry- dyzacji. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka DNA i sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL. Cząsteczka DNA zawierająca sekwencje intronowe, kodująca ludzkie białko, zwane jest zależnie od miejsca jego działania, lipazą stymulowaną solami żółciowymi (Bile Salt-Stimulated Lipase; BSSL) lub lipazą estrów karboksylowych (Carboxyl Ester Lipase; CEL). Tę cząsteczkę DNA korzystnie zastosowano do wytwarzania rekombinantowego białka BSSL/CEL, zwłaszcza w sposób wykorzystujący rransgenicze organizmu ssaków za wyjątkiem ludzi. Takie rekombinantowe ludzkie białko BSSL/CEL może być użyte jako składnik pożywek dla niemowląt, przeznaczonych do ich karmienia jako substytut mleka ludzkiego albo do produkcji leków stosowanych w stanach upośledzenia przyswajania pokarmu, mukowiscydozy i przewlekłego zapalenia trzustki.

Hydroliza lipidów pokarmowych

Lipidy spożywane w pokarmach są ważnym źródłem energii. Przeszło 95% tych lipidów stanowią wysoko- energetyczne trójacyloglicerole. Niektóre z tych lipidów, np. pewne kwasy tłuszczowe i witaminy rozpuszczalne w tłuszczach są niezbędnymi składnikami pokarmowymi. Trójacyloglicerole, jak również składniki występujące w niewielkich ilościach, takie jak zestryfikowane rozpuszczalne w tłuszczach witaminy i cholesterol oraz diacylofosfatydyloglicerole, zanim zostaną zaabsorbowane w przewodzie pokarmowym wymagają hydrolizy wiązań estrowych z wytworzeniem mniej hydrofobowych, absorbowalnych produktów. Reakcje te są katalizowane przez specyficzną grupę enzymów zwanych lipazami.

U ludzki dorosłych za lipazy niezbędne uważa się lipazę żołądkową, zależną od kolipazy lipazę trzustkową (hydrolizującą trój- i diacyloglicerole), trzustkową fosfolipazę A2 (hydrolizującą diacylofosfatydyloglicerole) i lipazę estrów karboksylowych (CEL), hydrolizującą estry cholesterolowe i estry witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. U noworodków karmionych piersią podstawową rolę w hydrolizowaniu niektórych z wyżej wymienionych lipidów spełnia lipaza stymulowana solami żółciowymi (BSSL). Łącznie z solami żółciowymi, produkty trawienia lipidów tworzą mieszane micele, z których następuje absorpcja.

Lipaza stymulowana solami żółciowymi

Gruczoł sutkowy u kobiet w okresie laktacji syntetyzuje i wydziela z mlekiem lipazę stymulowaną solami żółciowymi (BSSL) (Blacberg i wsp., 1987), która po swoistej aktywacji przez pierwszorzędowe sole żółciowe przyczynia się do zdolności trawienia tłuszczów w jelicie niemowlęcia karmionego piersią. Enzym ten, stanowiący około 1% całkowitego białka mleka (Blackberg i Hamell, 1981) nie ulega degradacji podczas przejścia mleka przez żołądek, a przed jego maktywacją w dwunastnicy przez proteazy trzustkowe takie jak trypsyna i chymotrypsyna chronią go kwasy tłuszczowe. Ulega on jednak inaktywacji podczas pasteryzacji mleka, to jest podczas ogrzewania w temperaturze 62,5°C przez 30 minut (Bjorksten i wsp., 1980).

Modelowe doświadczenia in vitro wskazują na to, że końcowe produkty trawienia trójacylogliceroli są inne jeśli trawienie zachodzi w obecności BSSL (Bemaback i wsp., 1990; Hernell i Blackberg, 1982). Przy niższych stężeniach soli żółciowych w świetle jelit w okresie niemowlęcym może to być korzystne dla absorpcji tych produktów.

Lipaza estrów karboksylowych

Lipaza estrów karboksylowych (CEL) występująca w soku trzustkowym w ludzi (Lombardo i wsp., 1978) wydaje się identyczna lub przynajmniej bardzo zbliżona pod względem funkcjonalnym do BSSL (Blackberg i wsp., 1981). Enzymy te mają również wspólne epitopy, posiadają identyczne N-terminalne sekwencje aminokwasowe (Abouakil i wsp., 1988) i są hamowane przez inhibitory esteraz serynowych, np. przez eserynę i fluorofosforan diizopropylowy. W badaniach wykonanych ostatnio w kilku laboratoriach scharakteryzowano struktury cDNA dla lipazy z mleka i lipazy trzustkowej (Baba i wsp., 1991; Hul i wsp., 1991; Nilsson i wsp., 1990; Reue i wsp., 1991). Z badań tych wynika, że enzym występujący w mleku i enzym trzustkowy są produktami tego samego genu (w niniejszym zgłoszeniu enzym ten nazwany jest genem CEL,EC3.1. 1. 1). Sekwencja cDNA i wyprowadzona z niej sekwencja aminokwasową dl a genu CEL są podane w opisie patentowym PCT WO 91/15234 (Oklahoma Medical Research Foundation) i w opisie patentowym PCT WO 91/18923 (Aktiebolaget Astra).

Tak więc, zakłada się, że enzym CEL jest identyczny z enzymem BSSL i dla polipeptydu kodowanego przez gen CEL przyjęto w niniejszym opisie nazwę BSSL/CEL.

175 404

Upośledzenie absorpcji lipidów

Pospolite przypadki upośledzenia absorpcji lipidów i wynikającego z niego niedożywienia to obniżone poziomy zależnej od kolipazy lipazy trzustkowej i/lub soli żółciowych w świetle jelit. Typowymi przykładami tego typu niedoboru lipazy są pacjenci cierpiący na mukowiscydozę, powszechną wadę genetyczną powodującą niedobory tego enzymu w ciągu całego życia u 80% tych pacjentów oraz pacjenci z chronicznym zapaleniem trzustki, często występującym jako wynik przewlekłego alkoholizmu.

Obecnie, leczenie pacjentów cierpiących na niedobór lipazy trzustkowej polega na doustnym przyjmowaniu olbrzymich dawek surowego preparatu świńskich enzymów trzustkowych. Jednakże, zależna od kolipazy lipaza trzustkowa ulega inaktywacji w wyniku niskiego pH w żołądku. Nie można tego całkowicie przezwyciężyć przez podawanie ogromnych dawek enzymu. Dla większości pacjentów tak duże dawki są nieodpowiednie a ponadto, preparaty te są nieoczyszczone i mają nieprzyjemny smak.

W niektórych preparatach odpowiednie przygotowanie tabletki umożliwia jej przejście przez kwaśne regiony żołądka i uwolnienie enzymu dopiero w stosunkowo alkalicznym środowisku jelita czczego. U niektórych pacjentów z zaburzeniami funkcji trzustki występuje jednak nienormalnie kwaśne środowisko w jelicie czczym i w takich przypadkach nie następuje uwolnienie enzymu z tabletki.

Ponadto, dostępne obecnie na rynku preparaty są wytwarzane z surowca nie-ludzkiego a więc, związane są z ryzykiem wystąpienia reakcji immunologicznych, które mogą wywołać niepożądane skutki u pacjenta i zmniejszyć skuteczność terapii. Następną wadą tych preparatów jest to, że nie jest w nich ustalona zawartość enzymów lipolitycznych innych niż lipaza zależna od kolipazy. Faktycznie, wiele z nich zawiera bardzo niskie poziomy aktywności BSSL/CEL. Może to tłumaczyć fakt, że wiele pacjentów cierpiących na mukowiscydozę pomimo leczenia uzupełniającego cierpi na niedobory rozpuszczalnych w tłuszczach witamin i niezbędnych kwasów tłuszczowych.

Tak więc, istnieje ogromne zapotrzebowanie na produkty o właściwościach i strukturze wywodzącej się z lipaz pochodzenia ludzkiego i o szerokiej specyficzności w stosunku do substratu, które to produkty mogłyby być doustnie podawane pacjentom cierpiącym na niedobór jednego lub kilku lipolitycznych enzymów trzustkowych. Produkty, które mogą być wytwarzane przez zastosowanie niniejszego wynalazku spełniają te wymagania jako takie lub w połączeniu z innymi preparatami zawierającymi inne lipazy.

Receptura pożywek dla niemowląt

Wiadomo, że karmienie niemowląt mlekiem ludzkim jest korzystniejsze niż karmienie pożywkami. Mleko ludzkie dostarcza nie tylko składników pokarmowych o dobrze zrównoważonym składzie lecz jest ono łatwo trawione przez niemowlę. Wiele biologicznie aktywnych składników, o których wiadomo, że pełnią funkcje fizjologiczne w organizmie niemowlęcia występuje bądź jako składniki ludzkiego mleka bądź powstaje podczas jego trawienia. Zalicza się do nich również składniki zaangażowane w obronę przed infekcją i składniki ułatwiające przyswajanie pokarmu z ludzkiego mleka.

Pomimo ogromnych wysiłków włożonych w przygotowywanie receptur pożywek dla niemowląt, nie udało się opracować pożywki, która w zasadniczym zakresie posiadałaby korzystne właściwości mleka ludzkiego. Pożywki te, często wytwarzane na bazie mleka krowiego są z zasady niecałkowicie trawione przez niemowlę i nie zawierają substancji wykazujących wpływ na funkcje fizjologiczne niemowlęcia. W celu,wytworzenia pożywek dla niemowląt o wartości odżywczej podobnej do mleka ludzkiego, dodaje się do nich wiele dodatków takich jak fragmenty białek, witaminy, składniki mineralne i podobne, które w stanie naturalnym powstają lub są dostarczane podczas trawienia mleka ludzkiego przez niemowlę. Konsekwencją tego jest ryzyko zwiększonego obciążenia i możliwość długotrwałego uszkodzenia narządów takich jak wątroba i nerki. Inną niekorzystną stroną karmienia mieszankami opartymi na mleku krowim jest zwiększone ryzyko rozwoju u niemowlęcia alergii na białka krowie.

Alternatywę dla mieszanek dla niemowląt opartych na mleku krowim stanowi mleko ludzkie uzyskiwane z tak zwanych banków mleka. Jednakże w ostatnich latach w coraz większym stopniu unika się karmienia noworodków mlekiem ludzkim pochodzącym z banków

175 404 mleka z powodu obawy przed obecnością w takim mleku czynników zakaźnych takich jak wirus HIV i wirus cytomegalii. Dla zabicia tych czynników konieczna jest pasteryzacja mleka przed użyciem. Pasteryzacja obniża jednak wartość odżywczą i działanie biologiczne składników mleka, np. jak wspomniano powyżej, ulega dezaktywacji enzym BSSL.

Dodawanie lipaz do pożywek dla niemowląt

W momencie narodzin, zwłaszcza u wcześniaków, nie są w pełni rozwinięte funkcje trzustki i wątroby. Z przyczyn fizjologicznych powszechnie obserwuje się złe przyswajanie tłuszczy; przypuszcza się, że wynika to z niskich wewnątrzjelitowych stężeń zależnej od kolipazy lipazy trzustkowej i soli żółciowych. Jednakże, w wyniku obecności BSSL to złe przyswajanie występuje znacznie żadziej u niemowląt karmionych piersią niż u niemowląt karmionych pasteryzowanym mlekiem ludzkim albo mieszankami dla niemowląt (Barnback i wsp., 1990).

Dla uniknięcia opisanych powyżej ujemnych stron związanych z karmieniem mlekiem pasteryzowanym i mieszankami opartymi na mleku krowim, byłoby pożądane opracowanie pożywki dla niemowląt o składzie bardziej zbliżonym do mleka ludzkiego, to jest, zawierającej białka mleka ludzkiego.

Enzym BSSL/CEL posiada szereg unikalnych właściwości, które sprawiają, że idealnie się nadaje do wzbogacania mieszanek dla niemowląt:

- został zaprojektowany przez naturę tak, aby się nadawał do podawania doustnego. Enzym ten wytrzymuje więc przejście przez żołądek i jest aktywowany w zawartości jelita cienkiego.

- specyficzny mechanizm aktywacji tego enzymu powinien zapobiegać niebezpiecznej lipolizie tłuszczy pokarmowych lub tkankowych podczas przechowywania i podczas przechodzenia do miejsca działania.

- dzięki specyficzności w stosunku do wielu różnych substratów, posiada sam z siebie właściwość pośredniczenia w całkowitym trawieniu większości tłuszczy pokarmowych, w tym również estrów witamin rozpuszczalnych w tłuszczach.

- BSSL/CEL może wykazywać wyższość nad lipazą trzustkową zależną od kolipazy pod względem hydrolizowania wiązań estrowych z estrów zawierających długołańcuchowe, polinienasycone kwasy tłuszczowe.

- w obecności lipazy żołądkowej i przy braku lub niskich poziomach lipazy zależnej od kolipazy, BSSL/CEL może zapewnić całkowite trawienie trójacyloglicerolu in vitro, nawet przy niskich poziomach soli żółciowych, jak to ma miejsce u noworodków. W obecności BSSL/CEL, końcowymi produktami trawienia trójgliceroli są wolne kwasy tłuszczowe i wolny glicerol a nie wolne kwasy tłuszczowe i monoacyloglicerol powstający w wyniku działania dwu innych lipaz (Bernaback i wsp. 1990). Może to sprzyjać absorpcji produktu, zwłaszcza przy niskich wewnątrzjelitowych poziomach soli żółciowych.

Zastosowanie BSSL/CEL do wzbogacania pożywek dla niemowląt wymaga jednakże dostępu do ogromnych ilości tego produktu. Jakkolwiek białka mleka ludzkiego mogą być wyodrębniane bezpośrednio z mleka ludzkiego, nie jest to realistyczna i wystarczająco ekonomiczna droga pozyskiwania ogromnych ilości potrzebnych do produkcji mieszanek na wielką skalę i zanim można będzie wytwarzać mieszanki dla niemowląt zawierające białka mleka ludzkiego należy opracować inne metody wytwarzania tego enzymu. Przedmiotem wynalazku jest właśnie sposób wytwarzania białka BSSL/CEL w ogromnych ilościach.

Wytwarzanie białek w mleku zwierząt transgenicznych

Izolacja genów kodujących białka aktywne farmakologicznie pozwoliło na tańszą produkcję tych białek w układach heterologicznych. Zastępczym układem ekspresyjnym dla białek mleka jest zwierzę transgeniczne (Przeglądu wiedzy w tym zakresie dokonał Hennighausen i wsp., 1990). Pożywki zawierające w swym składzie lipazę aktywowaną solami żółciowymi otrzymane technologią wykorzystującą zwierzęta transgeniczne są ujawnione w opisie patentowym europejskim EP 317.355 (Oklahoma Medical Research Foundation).

Sekwencję kodującą dane białko wprowadza się do transgenicznego zwierzęcia w postaci cDNA lub sekwencji genomowej. Ponieważ do regulowanej ekspresji genu w organizmach zwierząt transgenicznych niezbędne są introny (Brinster i wsp., 1988; Whitelaw i wsp., 1991), w wielu przypadkach bardziej korzystne jest użycie genomowej formy genu strukturalnego niż jego formy cDNA. W opisie patentowym PCT, Wo 90/05188 (Pharmaceutical Proteins Limited)

175 404 podane jest zastosowanie w transgenicznych zwierzętach DNA kodującego białko, zawierającego co najmniej jeden ale nie wszystkie introny występujące w stanie naturalnym w genie kodującym to białko.

Celem wynalazku było opracowanie sposobu wytwarzania rekombinantowego ludzkiego białka BSSL/CEL z wysoką wydajnością i o realistycznej cenie, przeznaczonego do stosowania w pożywkach dla niemowląt w celu wyeliminowania ujemnych cech mleka pasteryzowanego i mieszanek opartych na białkach mleka krowiego.

Cel wynalazku osiągnięto przez sklonowanie i sekwencjonowanie ludzkiego genu dla enzymu CEL. W celu zwiększenia wydajności BSSL/CEL, do produkcji ludzkiego BSSL/CEL w transgenicznych organizmach ssaków (poza człowiekiem) użyto otrzymaną cząsteczkę DNA zawierającą sekwencje intronowe z ludzkiego genu CEL zamiast znanej sekwencji cDNA tego genu.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka DNA kodująca funkcjonalne białko BSSL/CEL i zawierające sekwencje intronowe, charakteryzująca się tym, że cząsteczka DNA hybrydyzuje z sekwencją DNA, przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ ID Nr: 1, w ostrych warunkach hybrydyzacji. Korzystnie cząsteczka DNA ma sekwencję przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ ID Nr:1. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL, polegający na tym, że (a) wprowadza się przez insercję wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą funkcjonalne białko BSSL/CEL hybrydyzującą z sekwencją DNA przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ Nr:1, w ostrych warunkach hybrydyzacji, do wektora zdolnego do replikacji w odpowiedniej komórce gospadarza; (b) wprowadza się wytworzony wektor rekombinantowy do komórki gospodarza: (c) prowadzi się wzrost tej komórki w pożywce lub na podłożu hodowlanym, w którym zachodzi ekspresja tego polipeptydu; (d) odzyskuje się polipeptyd.

Korzystnie w sposobie według wynalazku jako cząsteczkę DNA stosuje się cząsteczkę DNA przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja ID Nr.1. Jako wektor korzystnie stosuje się replikujący się wektor ekspresyjny będący nośnikiem cząsteczki DNA kodującej ludzkie białko BSSL/CEL i wykazujący zdolność pośredniczenia w ekspresji tej cząsteczki DNA. Wektor ekspresyjny zdolny jest do kodowania funkcjonalnego biologicznie białka BSSL/CEL i zawierający elementy regulacyjne kierujące ekspresję do gruczołu mlecznego ssaka (nie człowieka). Jeszcze bardziej korzystnie stosuje się wektor będący wektorem p5452/DSM 7499/. W sposobie według wynalazku korzystnie jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę pochodzącą z organizmu wielokomórkowego. Korzystnie jako komórkę organizmu wielokomórkowego stosuje się komórkę ssaka, a szczególnie korzystnie jako komórkę ssaka stosuje się komórkę ssaka zawierającą układ ekspresyjny. Komórka ta może być komórką ssaka (nie człowieka) będącą komórką embrionalną.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL, polegający na tym, że (a) wprowadza się przez insercję wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą funkcjonalne białko BSSL/CEL hybrydyzującą z sekwencją DNA przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ ID Nr:1, w ostrych warunkach hybrydyzacji, do wektora zdolnego do replikacji w odpowiedniej komórce gospodarza; (b) wprowadza się wytworzony wektor rekombinantowy do komórki gospodarza: (c) prowadzi się wzrost tej komórki w pożywce lub na podłożu hodowlanym, w którym zachodzi ekspresja tego polipetydu; (d) odzyskuje się polipeptyd. Korzystnie jako cząsteczkę DNA stosuje się cząsteczkę DNA przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja ID Nr:1, a jako wektor stosuje się replikujący się wektor ekspresyjny będący nośnikiem cząsteczki DNA kodującej ludzkie białko BSSL/cEL i wykazujący zdolność pośredniczenia w ekspresji tej cząsteczki DNA. Jeszcze bardziej korzystnie wektorem tymjest wektor ekspresyjny zdolny do kodowania funkcjonalnego biologicznie białka BSSL/CEL i zawierający elementy regulacyjne kierujące ekspresję do gruczołu mlecznego ssaka (nie człowieka), a w najbardziej korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku stosuje się wektor będący wektorem p5452/DSM 7499/.

Procedura zastosowania do izolacji cząsteczki ludzkiego DNA BSSL/CEL jest przedstawiona w przykładach.

Termin ostre warunki hybrydyzacji ma w niniejszym opisie konwencjonalne znaczenie i oznacza, że hybrydyzację prowadzi się według znanych przepisów laboratoryjnych, np.

175 404 podanych przez Sambrook'a i wsp. (1989). Wyizolowana cząsteczka według wynalazku jest stosowana do sporządzenia układu ekspresyjnego ssaka, który to układ ekspresyjny zawiera sekwencję DNA kodującą ludzkie białko BSSL/CEL, wprowadzoną przez insercję do genu kodującego białka mleka ssaka (nie człowieka), z wytworzeniem genu hybrydowego podlegającego ekspresji w gruczole mlecznym dorosłej samicy ssaka będącego nosicielem tego genu, przy czym, w wyniku ekspresji tego genu hybrydowego wytwarzane jest ludzkie białko BSSL/CEL. W oparciu o tak skonstruowany układ ekspresyjny można otrzymać transgeniczne ssaki (nie ludzi) zdolne do ekspresji ludzkiego białka BSSL/CEL. Metoda ta polega na iniekcji wyżej określonego układu ekspresyjnego ssaka do zapłodnionej komórki jajowej lub komórki embrionu tego ssaka, z wprowadzeniem tego układu ekspresyjnego do linii zarodowej tego ssaka i na prowadzeniu rozwoju tego zapłodnionego jaja lub zarodka po iniekcji, aż do uzyskania dorosłego żeńskiego osobnika tego ssaka.

Cząsteczka DNA przedstawiona na wykazie sekwencji jako SEQ ID Nr:1, posiadająca całkowitą długość 11531 par zasad (bp) charakteryzuje się następującymi cechami:

Cecha	od zasady	do zasady
Region flankujący 5'	1	1640
skrzynki TATA	1611	1617
Egzon 1	1641	1727
Początek translacji	1653	1653
Egzon 2	4071	4221
Egzon 3	4307	4429
Egzon 4	4707	4904
Egzon 5	6193	6323
Egzon 6	6501	6608
Egzon 7	6751	6868
Egzon 8	8335	8521
Egzon 9	8719	8922
Egzon 10	10124	10321
Egzon 11	10650	11490
Region flankujący 3'	11491	11531

W niniejszym opisie termin gen stosuje się do określenia sekwencji DNA zaangażowanej w wytwarzanie łańcucha polipeptydowego i zawierającej regiony poprzedzające i następujące po regionie kodującym (sekwencje w kierunku 5' i sekwencje w kierunku 3') oraz sekwencje wtrącone, tak zwane introny, znajdujące się pomiędzy poszczególnymi segmentami kodującymi (tak zwanymi egzonami) albo w regionie znajdującym się w kierunku 5' albo w kierunku 3'. Region w kierunku 5' zawiera sekwencję regulacyjną, kierującą ekspresją tego genu, zazwyczaj sekwencję promotora. Region w kierunku 3' zawiera sekwencje zaangażowane w zakańczanie transkrypcji tego genu i ewentualnie sekwencje odpowiedzialne za poliadenylację wytworzonego transkryptu i nie podlegający translacji region 3'.

Opisane powyżej cząsteczki DNA według wynalazku mogą zawierać naturalne i syntetyczne sekwencje DNA, przy czym naturalna sekwencja DNA pochodzi zazwyczaj bezpośrednio z genomowego DNA, którego źródłem jest ssak, np. jest to sekwencja opisana poniżej. Syntetyczną sekwencję DNA można uzyskać metodami zazwyczaj stosowanymi do wytwarzania syntetycznych cząsteczek DNA. Taka sekwencja DNA może być poza tym cząsteczką mieszaną, genomowo-syntetyczną.

Podlegający replikacji wektor ekspresyjny, stosowany w sposobie według wynalazku, który jest nośnikiem sekwencji DNA kodującej ludzkie białko BSSL/CEL i ma zdolność pośredniczenia w ekspresji tej sekwencji.

W niniejszym opisie termin podlegający replikacji oznacza, że wektor ten ma zdolność replikacji w danym typie komórek gospodarza, do których został wprowadzony. Bezpośrednio w górę od sekwencji DNA kodującej ludzie białko BSSL/CEL można wprowadzić sekwencję kodującą peptyd sygnalny, obecność którego zapewnia sekrecję ludzkiego białka BSSL/CEL wytwarzanego przez komórki gospodarza posiadające ten wektor. Taką sekwencją sygnalną

175 404 może być sekwencja naturalnie związana z sekwencją DNA dla ludzkiego BSSL/CEL albo sekwencja innego pochodzenia.

Jako wektor można użyć dowolny wektor podlegający łatwo procedurom rekombinacji DNA, a wybór wektora często zależy od komórki gospodarza, do której ma on być wprowadzony. Tak więc, wektorem tym może być wektor replikujący się autonomicznie, to jest wektor występujący jako jednostka pozachromosomalna, której replikacja jest niezależna od replikacji chromosomu. Przykładami takiego wektora są: plazmid, fag, kosmid, minichromosom lub wirus. Alternatywnie, można stosować wektor, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza integruje się z genomem tej komórki i replikuje się razem z chromosomem, do którego został włączony. Przykładami takich wektorów są: bakteryjny wektor ekspresyjny i drożdżowy wektor ekspresyjny. Wektor według wynalazku może zawierać dowolne, zdefiniowane powyżej cząsteczki DNA według wynalazku.

Stosowana w sposobie według wynalazku komórka zawierająca podlegający replikacji wektor ekspresyjny zdefiniowany powyżej może to być komórka dowolnego typu, np. komórka prokariotyczna, komórkajednokomórkowego organizmu eukariotycznego albo komórka pochodząca z organizmu wielokomórkowego, np. ssaka. Do celów niniejszego wynalazku szczególnie nadaje się komórki ssaków i są one opisane w dalszej części opisu.

W innym ważnym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania rekombinantowego ludzkiego białka BSSL/CEL, w którym to sposobie sekwencję DNA kodującą ludzkie BSSL/CEL umieszcza się w wektorze zdolnym do replikacji w specyficznej komórce gospodarza, wytworzony rekombinantowy wektor wprowadza się do komórki gospodarza, po czym prowadzi się hodowlę tej komórki w odpowiedniej pożywce lub podłożu w warunkach odpowiednich do ekspresji ludzkiego BSSL/CEL i odzyskuje się to ludzkie białko BSSL/CEL.

Do wzrostu komórek można zastosować dowolną znaną pożywkę odpowiednią do tego celu. Jako wektor można stosować dowolny, opisany powyżej wektor, a jako komórkę gospodarza można użyć dowolny, wymieniony powyżej typ komórki. Do konstruowania wektora i wprowadzania go do komórki gospodarza można zastosować dowolne, nadające się do tych celów techniki znane w dziedzinie rekombinancji DNA. Rekombinantowe ludzkie BSSL/CEL wytwarzane przez komórki może być wydzielane, to znaczy, transportowane przez błonę komórkową, zależnie od typu komórki i budowy wektora.

Jeśli ludzkie BSSL/CEL jest wytwarzane przez rekombinantowego gospodarza wewnątrzkomórkowo, to znaczy, nie jest ono wydzielane poza komórkę, wówczas można go odzyskiwać stosując standardowe procedury polegające na mechanicznym uszkodzeniu komórki, np. przez działanie ultradźwiękami lub przez homogenizację bądź procedury wykorzystujące metody enzymatyczne lub chemiczne i następnie oczyszczać to białko.

Po to, aby zachodziła sekrecja, sekwencja DNA kodująca ludzkie BSSL/CEL powinna być poprzedzona przez sekwencję kodującą peptyd sygnalny, obecność którego zapewnia sekrecję ludzkiego BSSL/CEL z komórek i w ten sposób co najmniej znaczna część wytwarzanego ludzkiego BSSL/CEL jest wydzielana do podłoża hodowli i odzyskiwana.

Najbardziej optymalną metodą wytwarzania rekombinantowego ludzkiego BSSL/CEL według wynalazku polega na zastosowaniu transgenicznych ssaków zdolnych do wydzielania ludzkiego BSSL/CEL razem z mlekiem. Użycie transgenicznych ssaków ma tę zaletę, że przy możliwych do uznania kosztach można uzyskać duże ilości rekombinantowego BSSL/CEL, zwłaszcza wtedy, gdy jako ssaka użyje się krowy; takie rekombinantowe BSSL/CEL jest wówczas wytwarzane z mlekiem będącym normalnym składnikiem między innymi pożywek dla niemowląt, a więc, nie ma potrzeby dokładnego oczyszczania, jeśli to rekombinantowe ludzkie BSSL/CEL ma być użyte jako dodatek odżywczy w produktach opartych na mleku.

Ponadto, wytwarzanie w organizmie wyższym, takim jak organizm ssaka, na ogół prowadzi się do prawidłowego przetworzenia białka tego ssaka, np. w odniesieniu do opisanego powyżej przetwarzania post-translacyjnego i prawidłowego sfałdowania. Można również uzyskać wielkie ilości w zasadzie czystego ludzkiego BSSL/CEL.

Układ ekspresyjny ssaka stosowany w sposobie według wynalazku zawiera sekwencję DNA kodującą ludzkie BSSL/CEL, wbudowaną przez insercję do genu kodującego białka mleka

175 404 ssaka (nie człowieka), z utworzeniem genu hybrydowego podlegającego ekspresji w gruczole mlecznym dorosłego żeńskiego osobnika tego ssaka posiadającego wspomniany gen hybrydowy.

Sekwencją DNA kodującą ludzkie BSSL/CEL jest w tym przypadku sekwenja DNA wskazana w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 1 albo genomowy ludzki gen BSSL/CEL lub jego analog.

Gruczoł mleczny jako tkanka, w której zachodzi ekspresja genów kodujących białka mleka generalnie uznaje się za szczególnie odpowiedni do użycia przy wytwarzaniu heterologicznych białek w transgenicznych ssakach ponieważ białka mleka są w naturalnym stanie wytwarzane przy wysokich poziomach ekspresji właśnie w gruczole mlecznym. Poza tym mleko łatwo jest zbierać i uzyskiwać w ogromnych ilościach. W związku z tym sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL przy użyciu genów białka mleka do produkcji rekombinantowego ludzkiego BSSL/CEL ma następną zaletę polegającą na tym, że enzym ten jest wytwarzany w warunkach podobnych do tych, jakie występują w stanie naturalnym w odniesieniu do regulowania ekspresji i miejsca produkcji (gruczoł mleczny).

W niniejszym kontekście, termin gen hybrydowy oznacza sekwencję DNA zawierającą z jednej strony zdefiniowaną powyżej sekwencję DNA kodującą ludzkie BSSL/CEL, a z drugiej strony sekwencję DNA genu białka mleka, która to sekwencja ma zdolność pośredniczenia w ekspresji produktu tego genu hybrydowego. Termin gen kodujący białko mleka oznacza cały gen jak również również jego sub-sekwencję zdolną do pośredniczenia i kierowania ekspresji tego genu hybrydowego do żądanej tkanki, w tym przypadku gruczołu mlecznego. Na ogół, taka sub-sekwencja co najmniej zawiera jeden lub większą ilość elementów, takich jak region promotora, miejsce początku transkrypcji, regiony niekodujące 3' i 5' oraz sekwencje strukturalne. Sekwencja DNA kodująca ludzkie BSSL/CEL jest zasadniczo wolna od sekwencji prokanotycznych, takich jak sekwencje wektorowe, które mogły być powiązane z tą sekwencją DNA np. po jej klonowaniu.

Gen hybrydowy konstruuje się przez insercję in vitro sekwencji DNA kodującej ludzki enzym BSSL/CEL do genu białka mleka wykorzystując znane techniki. Alternatywnie, sekwencję DNA kodującą ludzkie BSSL/CEL wbudowuje się in vivo przez rekombinancję homologiczną.

Na ogół, insercji sekwencji DNA kodującej ludzki BSSL/CEL będzie się dokonywać w jednym z pierwszych egzonów wybranego genu białka mleka lub jego efektywnej subsekwencji zawierającej pierwsze egzony i korzystnie znaczną część sekwencji flankującej 5', którą uznaje się za sekwencję o znaczeniu regulacyjnym.

Taki gen hybrydowy zawiera sekwencję kodującą peptyd sygnalny dla umożliwienia prawidłowej sekrecji produktu tego genu hybrydowego do gruczołu mlecznego. W zasadzie, peptydem sygnalnym może być peptyd znajdujący się normalnie w genie białka mleka albo związany z sekwencją DNA kodującą ludzki BsSl/CEL. Można jednak również użyć inne sekwencje sygnalne zdolne do pośredniczenia w sekrecji produktu tego genu hybrydowego do gruczołu mlecznego. Różne elementy tego genu hybrydowego powinny być oczywiście sprzęgnięte w taki sposób, który będzie pozwalał na prawidłową ekspresję i przetwarzanie produktu tego genu. Tak więc, sekwencja DNA kodująca wybrany peptyd sygnalny powinna być precyzyjnie sprzęgnięta z N-terminalną częścią sekwencji DNA kodującej ludzki BSSL/CEL. W genie hybrydowym, sekwencja DNA koduj ąca ludzki BSSL/CEL będzie normalnie zawierać jej kodon stopu ale nie jej własne miejsce sygnałowe i miejsce poliadenylacji. W dół od sekwencji DNA kodującej ludzki BSSL/CEL będą na ogół zachowane sekwencje przetwarzające mRNA w genie białka mleka.

Uważa się, że za rzeczywisty poziom ekspresji konkretnego genu hybrydowego odpowiedzialnych jest wiele czynników. Żywotne znacznie dla uzyskanego poziomu ekspresji mogą mieć takie czynniki jak możliwości promotora i innych wspomnianych powyżej sekwencji regulacyjnych, miejsce integracji układu ekspresyjnego w genomie ssaka, miejsce integracji sekwencji DNA kodującej ludzki BSSL/CEL w genie kodującym białko mleka, elementy umożliwiające regulację post-transkrypcyjną i inne podobne czynniki. Na podstawie wiedzy o różnych czynnikach wpływających na poziom ekspresji genu hybrydowego specjalista z tej dziedziny powinien wiedzieć jak skonstruować układ ekspresyjny przydatny do celu według wynalazku.

175 404

Przez gruczoł mleczny wydzielanych j est wiele różnych białek mleka. Istniej ą dwie główne grupy białek mleka, to znaczy kazeiny i białka serwatki. W odniesieniu do tych białek, skład mleka pochodzącego od różnych gatunków ssaków różni się jakościowo i ilościowo. W organizmach większości ssaków zwierzęcych (nie ludzki) wytwarzane są trzy różne typy kazeiny, a mianowicie α-kazeina, β-kazeina i -kazeina. Najpowszechniej występujące białka serwatki u bydląt to α-laktoalbumina i β-laktoalbumina. Skład mleka pochodzącego od różnych gatunów został opisany przez Clark'a i wsp. (1987).

Gen białka mleka, który ma być użyty może pochodzić z tego samego gatunku, do którego będzie dokonana insercja układu ekspresyjnego lub też może pochodzić z innych gatunków. W związku z tym okazało się, że elementy regulacyjne, które kierują ekspresję genu do gruczołu mlecznego funkcjonują pomiędzy gatunkami, co może wynikać ze wspólnego przodka (Henninghausen i wsp. 1990).

Przykładami genów kodujących białko mleko lub efektywnych sub-sekwencji tych genów odpowiednich do użycia przy konstruowaniu układu ekspresyjnego stosowanego w sposobie według wynalazku są geny dla białek serwatki występujące u różnych ssaków, np. gen kwaśnej proteiny serwatki (WAP), korzystnie mysi oraz gen β-laktoglobuliny, korzystnie owczy. Również geny kazeiny różnego pochodzenia, np. bydlęcy gen kazeiny α S1 i króiiczy gen β-kaz.einy , mogą się okazać odpowiednie do transgenicznej produkcji ludzkiego BSSL/CEL. Genem korzystnym w niniejszym wynalazku jest mysi gen WAP, gdyż okazało się, że wykazuje on wysoki stopień ekspresji wielu obcych ludzkich białek w mleku różnych zwierząt transgenicznych (Hennighausen i wsp., 1990).

Inną sekwencją korzystnie związaną z układem ekspresyjnym jest tak zwana sekwencja stabilizująca ekspresję, wykazująca właściwości utrzymywania wysokiego poziomu ekspresji. Istnieją mocne wskazówki na to, że takie stabilizujące sekwencje znajdują się w sąsiedztwie genów białka mleka, w górę od tych genów.

Sekwencją DNA kodującą ludzki BSSL/CEL przeznaczoną do insercji w układzie ekspresyjnym stosowanym w sposobie według wynalazku może być sekwencja pochodzenia genomowego, syntetycznego lub pochodząca z kombinacji tych sekwencji. Okazało się, ze w niektórych układach ekspresyjnych, dla uzyskania zadawalającej ekspresji wymagana jest obecność intronów i innych regionów regulacyjnych (Hennighausen i wsp., 1990). W pewnych przypadkach, zamiast elementów cDNA takich jak element kodujący polipeptyd, korzystne jest wprowadzenie struktur genomowych do konstrukcji wektorowych (Brinster i wsp.). Struktura intronowo egzonowa może dawać wyższy poziom stanu ustalonego mRNA niż taka, w której stosuje się wektory oparte na cDNA.

Gen hybrydowy zawiera sekwencję DNA kodującą ludzi BSSL/CEL według wynalazku wbudowaną przez insercję do genu kodującego białko mleka pochodzącego od ssaka (nie człowieka), przy czym ta sekwencja DNA wbudowana jest do genu białka mleka w taki sposób, że podlega ekspresji w gruczole mlecznym dorosłego osobnika żeńskiego ssaka posiadającego taki gen hybrydowy. Ten hybrydowy gen i jego części składowe są szczegółowo opisane powyżej. Stanowi on ważny produkt pośredni przy konstruowaniu ujawnionego powyżej układu ekspresyjnego.

W sposobie według wynalazku stosuje się komórki ssaka (nie człowieka) zawierającej zdefiniowany powyżej układ ekspresyjny. Taką komórką ssaka może być komórka zarodkowa (pierwotna z podziału jaja) albo pro-jądro. Ten układ ekspresyjny wprowadza się do komórki ssaka w sposób opisany w dalszej części opisu i zilustrowany szczegółowo w przykładzie. Metoda produkcji transgenicznego ssaka (nie człowieka), w organizmie którego zachodzi ekspresja ludzkiego BSSL/CEL, polega na wstrzyknięciu zdefiniowanego powyżej układu ekspresyjnego do zapłodnionego jaja lub komórki zarodka tego ssaka, aby wprowadzić ten układ ekspresyjny do linii zarodowej tego zwierzęcia i na utrzymywaniu rozwoju zapłodnionego jaja lub komórki zarodka po iniekcji aż do stadium dorosłego żeńskiego osobnika tego ssaka.

Wprowadzenia tego układu ekspresyjnego do linii zarodowej ssaka można dokonać stosując dowolną odpowiednią technikę, np. opisaną w podręczniku Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1986). Przykładowo, można bezpośrednio do zapłodnionego jaja, to znaczy, do zapłodnionej jednej komórki jaja albo

175 404 do pro-jądra lub zarodka wybranego ssaka wstrzyknąć kilkaset cząsteczek tego układu ekspresyjnego i jaja po mikromiekcji przenieść do jajowodu pseudociężarnej matki zastępczej i prowadzić dalszy rozwój. Na ogół, nie wszystkie jaja po iniekcji będą się rozwijać do stadium dorosłych osobników wytwarzając ludzkie BSSL/CEL. Ze statystycznego punktu widzenia, około połowa ssaków, będzie płci męskiej, samice jednak będą hodowane dając następne pokolenia.

Po integracji w linii zarodkowej może z dużą wydajnością zachodzić ekspresja sekwencji DNA kodującej ludzki BSSL/CEL, z wytworzeniem prawidłowo przetworzonego, funkcyjnego ludzkiego BSSL/CEL w trwałych liniach takich ssaków. Metoda wytwarzania transgenicznego ssaka (nie człowieka), w organizmie którego będzie zachodzić ekspresja ludzkiego BSSL/CEL, natomiast nie będzie w zasadzie zachodzić ekspresja BSSL/CEL tego właśnie ssaka, polega na: (a) zniszczeniu zdolności ekspresji zwierzęcego BSSL/CEL u tego ssaka, co spowoduje, ze organizm tego ssaka nie będzie wytwarzał zwierzęcego BSSL/CEL i insercji zdefiniowanego powyżej układu ekspresyjnego według wynalazku albo sekwencji DNA kodującej ludzki BSSL/CEL do linii zarodowej tego ssaka w taki sposób, że u tego ssaka będzie wytwarzane ludzkie BSSL/CEL; i/lub (b) zastąpieniu genu BSSL/CEL ssaka lub części tego genu wyżej zdefiniowanym układem ekspresyjnym według wynalazku albo sekwencją DNA kodującą ludzki BSSL/CEL.

Zdolność ekspresji zwierzęcego BSSL/CEL dogodnie niszczy się wprowadzając mutacje w sekwencji DNA odpowiedzialnej za ekspresję tego BSSL/CEL. Do takich mutacji mogą należeć mutacje polegające na zmianie fazy odczytu w tej sekwencji albo na wprowadzeniu kodonu stopu albo delecji jednego lub większej ilości nukleotydów w tej sekwencji DNA.

Gen BSSL/CEL ssaka lub część tego genu może być zastąpiony wyżej zdefiniowanym układem ekspresyjnym albo sekwencją DNA kodującą ludzki BSSL/CEL według wynalazku z zastosowaniem ogólnie znanych zasad rekombinancji homologicznej. Otrzymany powyżej opisaną metodą transgeniczny ssak nie ogranicza się do konkretnego typu ssaka, to na ogół będzie się go dobierać spośród myszy, szczurów, królików, owiec, świń, kóz i krów. Do produkcji ludzkiego BSSL/CEL na dużą skalę preferuje się zwierzęta większe, takie jak owce, kozy, świnie a zwłaszcza krowy z powodu ich dużej mleczności. Jednakże myszy, króliki i szczury mogą być również interesujące z tego powodu, że manipulacje prowadzone na tych zwierzętach są znacznie prostsze a wyniki doświadczeń z ich udziałem uzyskuje się znacznie szybciej niż np. w doświadczeniach z krowami.

Potomstwo zdefiniowanego powyżej transgenicznego ssaka zdolne jest do wytwarzania ludzkiego BSSL/CEL.

Mleka otrzymane od ssaka (nie człowieka) można wykorzystać do produkcji pożywki dla niemowląt. Pożywka dla niemowląt w tym przypadku zawiera rekombinantowe ludzkie BSSL/CEL, a zwłaszcza zdefiniowany powyżej polipeptyd według wynalazku. Taką pożywkę dla niemowląt można wytwarzać przez dodanie do normalnych składników takiej pożywki rekombinantowego ludzkiego BSSL/CEL albo polipeptydu w formie oczyszczonej lub częściowo oczyszczonej. Jednak w zasadzie jest korzystne, aby taka pożywka dla niemowląt była przygotowana ze zdefiniowanego powyżej mleka, zwłaszcza mleka pochodzącego od krów. Taką pożywkę można wytwarzać stosując znane procedury; może ona zawierać wszystkie niezbędne dodatki, takie jak sole mineralne, witaminy i podobne.

Przykłady.

Przykład 1: Organizacja genomu, analiza sekwencji i lokalizacja w chromosomie genu komórkowego.

O ile nie podano inaczej, stosuje się standardowe techniki biologii molekularnej (Maniatis i wsp., 1982; Ausubel i wsp., 1987; Sambrook i wsp., 1989).

Izolacja rekombinantów genomowych

Skrining dwu różnych ludzkich banków fagów genomowych, ADASH (Clonentech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, Stany Zjednoczone) i AEMBL-3 SP6/T7 (Stratagene, La Jolla, CA, Stany Zjednoczone) prowadzi się na drodze hybrydyzacji łysinek stosując jako sondy różne subklonowane fragmenty restrykcyjne cDNA (Nilsson i wsp., 1990) znakowane [α-³²P]dCTD techniką oligoznakowania (Feinberg i wsp., 1983).

175 404

Mapowanie, subklonowanie i sekwencjonowanie klonów genomowych

Klony pozytywne trawi się różnymi enzymami restrykcyjnymi, poddaje elektroforezie na

1% żelach agarozowych i następnie przenosi się za pomocą próżni (Pharmacia LKB BTG, Upsala, Szwecja) na filtr nylonowy. Filtr hybrydyzuje się z różnymi sondami cDNA. Fragmenty restrykcyjne hybrydyzujące z tymi sondami izoluje się metodą izotachoforezy (Ofverstedt i wsp., 1984). Mniejsze fragmenty, poniżej 800 par zasad, włącza się bezpośrednio przez insercję do wektorów M13mp18, M13mp19, M13BM20 lub M13BM21 i sekwencjonuje stosując bakterię E. coli TG1 jako gospodarza. Większe fragmenty subklonuje się do wektorów pTZ18R albo pTZ19R stosując jako gospodarza bakterię E. coli DH5a i następnie trawi się (wytwarzając odpowiednio plazmidy pS309, pS310 i pS451 stosowane w przykładzie 2). Niektóre z wyizolowanych fragmentów stosuje się również jako sondy do hybrydyzacji. Całą sekwencję nukleotydową oznacza się metodą zakańczania łańcucha didezoksy (Sanger i wsp., 1977) stosując enzym Klenowa i/lub uniwersalny primer sekwencjonujący M13 specyficznych oligonukleotydów. Informację o sekwencji odczytuje się z autoradiogramów stosując program komputerowy MS-EdSeq opisany przez Sjoberga i wsp. (1989). Sekwencje analizuje się wykorzystując programy otrzymane z pakietu programowego UWGCG (Devereux i wsp. 1984).

Wydłużanie primera

Z ludzkich trzustek, gruczołów mlecznych w okresie laktacji i tkanki tłuszczowej izoluje się całkowity RNA stosując metodę z izotiocyjanianem guanidyniowym -CsC 1 (Chirgwin i wsp., 1979). Wydłużanie primera prowadzi się metodą AusbeFa i wsp. (1987), stosując całkowity RNA i antysensowny 25-merowy oligonukleotyd (5'-AgGtGagGcCCAACACAACCAGTTGC-3', pozycja nt 33-58. Hybrydyzację tego primera z 20 μg całkowitego RNA prowadzi się w 30 μΐ roztworu o składzie: 0,9 M NaCl, 0,15 M buforu HEPES (pH 7,5) i 0,3 M EDTA, w temperaturze 30°C przez dobę. Po przeprowadzeniu reakcji wydłużania z udziałem odwrotnej transkryptazy, produkty wydłużenia analizuje się przez elektroforezę w 6% denaturowanym żelu poliakryloamidowym.

Hybrydy komórek somatycznych

Do wyznaczenia miejsca genu CEL w chromosomie zastosowano DNA z 16 hybrydowych ludzko-gryzoniowych somatycznych linii komórkowych otrzymanych z NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ). Ludzkomysie hybrydy komórek somatycznych GM09925 do GM09940 pochodziły z fuzji płodowych ludzkich męskich fibroblastów (IMR-91) z linią mysich komórek B-82 z niedoborem tymidyno-kinazy (Taggart i wsp., 1985; Mohandas i wsp., 1986). Hybrydy GM10324 i GM02860 pochodziły z fuzji mysiej linii komórkowej A9 z deficytem HPRT i APRT (Callen i wsp., 1986) a hybrydy GM 10611 pochodziły z fuzji mikrokomórkowej linii ludzkich fibroblastów GM07890 zakażonych retrowirusowym wektorem SP-1 z linią komórek jajnika chomika, UV-135 (Warburton i wsp., 1990). Hybryda GM10095 pochodziła z fuzji limfocytów kobiecych o zrównoważonych kariotypie 46, X, t(X; 9) (q13; 34) z linią komórkową CHW1102 chomika (Mohandas i wsp., 1979). Zawartość ludzkich chromosomów w hybrydowych liniach komórkowych oznaczona na drodze analizy cytogenetycznej oraz metodami analizy Southerna i hybrydyzacji in situ jest przedstawiona w tabeli 1. DNA o wysokich masach molowych, wyizolowane z linii komórkowych mysich, chomika i ludzkich macierzystych oraz z 16 powyższych hybrydowych linii komórkowych trawiono enzymem EcoRI, frakcjonowano w 0,8% żelach agarozowych i przenoszono na filtry nylonowe. Znakowaną [a-³²P]dCTP sondę cDNA genu Cel (cDNA o pełnej długości) przygotowano przez oligoznakowanie (Feinberg i Vogelstein, 1983) i hybrydyzowano z filtrami. Filtry przemywano w czasie po 60 minut w temperaturze 65°C o roztworach o składzie: 6 x SSC/0,5% SDS i 2 x SSC/0,5% SDS.

Reakcja enzymatycznej amplifikacji DNA in vitro (reakcja PCR)

Całkowity, ludzki genomowy DNA wyizolowany z leukocytów, DNA z hybrydów komórek somatycznych i z niektórych pozytywnych genomowych rekombinantów oraz całkowity RNA z ludzkiego gruczołu mlecznego w okresie laktacji i z trzustek ludzkich poddaje się amplifikacji dla egzonu 10 i egzonu 11. Stosuje się 2 μg DNA. Zastosowane primery są wymienione w tabeli 2. Trzydzieści cykli reakcji POR prowadzi się w objętości 100 μl roztworu o składzie: 10 mM Tris-HCl (pH = 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCh, po 200 μM każdego z

175 404 dNTP, 100 gg/ml żelatyny, po 100 pmoli każdego z primerów, 1,5 jednostek Taq DNA polimerazy (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) stosując temperaturę kończenia cyklu 55°C dla wszystkich par primerów. Sekwencję RNA amplifikowano stosując komplementarny DNA (cDNA) i metodologię reakcji PCR. cDNA syntetyzowano z 10 gg całkowitego RNA w 40 gl roztworu o składzie: 50 mM Tris-HCl (pH = 8,3), 50 mM KCl, 10 mm MgCb, 10 gg/ml BSA, po 1 mM każdego dNTP, 500 ng oligo(dt)i2-i 8,40 jednostek inhibitora rybonukleazy 1200 jednostek odwrotnej transkryptazy (MoMuLV) (BRL, Bethesda Research Laboratories, N. Y., USA) w czasie 30 minut w temperaturze 42°C. cDNA strącano i zawieszano w 25 gl H2O. Ilość 2 gl tej zawiesiny amplifikowano w sposób opisirny powyżej. Amplifikowane fragmenty analizowano w 2% żelu agarozowym. Następnie, niektóre z tych fragmentów subklonowano i sekwencj onowano.

Struktura ludzkiego genu CEL

Dla każdego banku genomowego prowadzono skrining 10⁶ rekombinantów. Skrining ten wykazał kilka klonów pozytywnych. Wszystkie te klony wyizolowano i mapowano. Dwa klony oznaczone symbolami XBSSL1 i XBSSL5A poddano dalszej analizie. Trawienie kilkoma enzymami restrykcyjnymi i analiza Southerna z następną hybrydyzacją z sondami cDNA wykazały, że klon XBsSL5A zawiera cały gen CEL i że klon ZBSSL1 zawiera połowę 5' i około kilozasad regionu flankującego 5' (fig. 1). Łącznie, obydwa te klony zawierają około 25 kilozasad ludzkiego genomu.

Po subklonowaniu i trawieniu enzymami restrykcyjnymi otrzymano odpowiednie fragmenty do sekwencjonowania i można było oznaczyć całą sekwencję genu CEL, włącznie z 1640 parami zasad regionu flankującego - 5' i 41 parami zasad regionu flankującego - 3'. Dane te ujawniły, że ludzki gen CEL (sekwencja SEQ ID NR: 1) zajmuje obszar 9850 par zasad i zawiera egzonów przerywanych 10 intronami (fig. 1). Oznacza to, że egzony, a zwłaszcza introny są stosunkowo małe, i rzeczywiście, egzony 1 do 10 mają wielkości odpowiednio od 87 do 204 par zasad a egzon 11 ma długość 841 par zasad. Introny mieszczą się w zakresie odpowiednio od 85 do 2343 par zasad. Jak to jest przedstawione w tabeli 3, wszystkie połączenia egzon/intron są zgodne z regułą AG/GT i dobrze pasują do sekwencji consensus proponowanej przez Mount'a i wsp. (1982). Jeśli część kodującą genu CEL porównano z cDNA (Nilsson i wsp., 1990), znaleziono tylko jedną różnicę w sekwencji nukleotydowej: w pozycji nt 2 w egzonie 1 występuje C, podczas gdy w sekwencji cDNA występuje T. Ponieważ ta pozycja jest zlokalizowana 10 nt w górę od kodonu początku transkrypcji ATG, różnica ta nie wpływa na sekwencję aminokwasową.

W sekwencjonowanym regionie oznaczonym symbolami Alu1-Alu7 (5'-3') (fig. 1) występuje siedem przedstawicieli powtarzalnych elementów DNA klasy Alu, z czego jeden występuje z regionie flankującym 5' a sześć innych w genie CEL.

Miejsca inicjacji transkrypcji i region flankujący 5'

W celu zmapowania miejsca inicjacji transkrypcji w ludzkim genie CEL, przeprowadzono analizę wydłużania primera stosując całkowity RNA z ludzkich trzustek, gruczołów mlecznych w okresie laktacji i z tkanki tłuszczowej. Wyniki wskazują na większe miejsce początku transkrypcji zlokalizowane przy 12 bp i mniejsze miejsce początku transkrypcji zlokalizowane przy 8 bp w górę od inicjatora metioniny. Te miejsca inicjacji transkrypcji są takie same w trzustkach i w gruczołach mlecznych w okresie laktacji podczas, gdy w tkance tłuszczowej nie można było wykryć żądanego sygnału (fig. 2). Ten sekwencjonowany region zawiera 1640 nt DNA 5'-flankującegw. W oparciu o podobieństwa sekwencji, znaleziono sekwencję podobną do skrzynki TATA, CATmmAT w miejscu 30 nt w górę od miejsca inicjacji transkrypcji (fig. 4). W tym regionie nie było widocznych ani struktury skrzynki CAAT ani skrzynek GC.

Skrining sekwencji flankującej 5' wykonywano komputerowo, w obydwu niciach, szukając sekwencji nukleotydowych znanych jako sekwencje wiążące czynnik transkrypcji w innych genach swoistych dla gruczołu mlecznego i trzustki. Znaleziono pewne przypuszczalne sekwencje rozpoznawania (fig. 4).

Lokalizacja genu CEL w chromosomie

W kontrolnym ludzkim DNA sonda cDNA genu CEL wykryła cztery fragmenty EcoRI o wielkości 13 kb, 10kb, 2,2 kb i 2,0 kb podczas, gdy w kontrolnym DNA myszy i chomika wykryto pojedyncze fragmenty o wielkości odpowiednio około 25 kb i 8,6 kb. Sekwencje ludzkiego genu

175 404

CEL w klonach hybrydowych korelowały jedynie z ludzkim chromosomem 9 (tabela 1). Jedynie jeden z 16 analizowanych hybrydów dal pozytywną odpowiedź na ludzki gen CEL; ten hybryd zawierał chromosom 9 jako jedyny chromosom ludzki. Nie wykryto niezgodności co do lokalizacji tego chromosomu, podczas gdy stwierdzono przynajmniej dwie niezgodności co do lokalizacji każdego innego chromosomu (tabela 1). W celu dokładniejszego zlokalizowania genu CEL, zastosowano hybrydę ludzko-chemiczną GM 10095 zatrzymującą chromosom translokacji der (9), (9pter—>9q34:Xq13—>Xqter) jako jedyny ludzki DNA. Metodą analizy Southerna nie udało się wykryć żadnych sekwencji genu CEL w tej hybrydzie, co wskazuje, że gen CEL ma siedzibę w regionie 9q34-qter.

Przykład 2. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych

W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego mającego służyć do produkcji rekombinantowego ludzkiego CEL w mleku transgenicznych zwierząt, przyjęto następującą strategię postępowania (fig. 5).

Stosując opisane powyżej techniki, otrzymano trzy plazmidy oparte na pTZ (Pharmacia, Upsala, Szwecja) zawierające różne części ludzkiego genu CEL, pS309, pS310 i pS311. Plazmid pS309 zawierał fragment Sphl obejmujący gen CEL od nie podlegającego transkrypcji regionu 5' do części czwartego intronu. Plazmid pS310 zawierał fragment Sacl obejmujący sekwencję genu CEL od części pierwszego intronu do części szóstego intronu. Trzeci plazmid, pS311 zawierał fragment BamHI obejmujący wariant genu CEL od większej części piątego intronu i resztę struktury intron/egzon. W tym plazmidzie zmutowano repetytywną sekwencję egzonu 11, która normalnie koduje 16 powtórzeń tak, aby kodowała skrócony wariant zawierający 9 powtórzeń. Inny plazmid, pS283, zawierający część ludzkiego cDNA CEL klonowanego do plazmidu pUC19 w miejscach HindIII i SacI stosowano do fuzji sekwencji genomowych. Plazmid pS283 użyto również w celu uzyskania dogodnego miejsca dla enzymu restrykcyjnego KpnI, zlokalizowanego w nie podlegającej translacji liderowej sekwencji 5' w genie CEL. Plazmid pS283 trawiono następnie enzymami NcoI i SacI i izolowano fragment o wielkości około 2,7 kb. Plazmid pS309 trawiono enzymami Ncol i BspEI i izolowano fragment o wielkości około 2,3 kb zawierający część 5' genu CEL. Plazmid pS310 trawiono restryktazami BspEI i SacI i izolowano fragment o wielkości około 2,7 kb zawierający część środkowego regionu genu CEL. Te trzy fragmenty poddawano ligacji i transformowano nimi kompetentne komórki E. coli, szczep TG2. Transformanty izolowano przez selekcję ampicyliną. Z wielu transformantów przygotowywano plazmidy. Jeden plazmid, oznaczony symbolem pS312 (fig. 6) zawierający żądaną konstrukcję użyto do dalszych doświadczeń.

W celu uzyskania zmodyfikowanego plazmidu pS311, w którym miejsce BamHI znajdujące się w dół od kodonu stopu przeprowadzono w miejsce SalI dla ułatwienia dalszego klonowania, zastosowano następujący sposób. Plazmid pS311 linearyzowano przez częściowe trawienie BamHI. Otrzymany liniowy fragment izolowano i dokonywano insercji syntetycznego linkera DNA, który zamienia miejsce BamHI na miejsce SalI (5'-GaTCGTCGAC-3'), niszcząc przez to miejsce BamHI. Ponieważ występowały dwie pozycje dla potencjalnej integracji z syntetycznym linkerem, otrzymane plazmidy analizowano przez rozszczepianie enzymem restrykcyjnym. Wyizolowano i oznaczono symbolem pS313 plazmid z insercją linkera w żądanej pozycji w dół od egzonu 11.

W celu uzyskania konstrukcji wektora ekspresyjnego, w którym byłyby zawarte sekwencje genomowe CEL i który kodowałby skrócony wariant CEL, użyto plazmid pS314, tak zaprojektowany, aby pośredniczył w etapowej i tkankowej ekspresji w komórkach gruczołu mlecznego w okresach laktacji. Plazmid pS314 zawiera fragment genomowy z mysiego genu kwaśnej proteiny serwatki (WAP) (Campbell i wsp., 1984) klonowany jako fragment NotI. Ten genomowy fragment posiada górne sekwencje regulatorowe o wielkości 4,5 kb (URS), cały, podlegający transkrypcji region egzon/intron i około 3 kb sekwencji w dół od ostatniego egzonu. Unikalne miejsce restrykcyjne KpnI znajduje się w pierwszym egzonie, 24 bp w górę od kodonu początku translacji naturalnego WAP. Innym unikalnym miejscem restrykcyjnym jest miejsce SalI zlokalizowane w egzonie 3. W plazmidzie pS314, to miejsce Sali zniszczono przez trawienie, wypełniono go stosując fragment Klenowa i poddano powtórnej ligacji wprowadzając w zamian nowe miejsce Sali bezpośrednio w dół od miejsca KpnI w egzonie I. Przeprowadzono to przez

175 404 trawienie KpnI i wprowadzenie w tę pozycję żarzonych syntetycznych oligomerów SYM 2401 (5'-CGTCGACGTAC-3') oraz SYM 2402 (5'-GTCGACGGTAC-3') (fig. 8). Pomiędzy te miejsca, KpnI i Sali wprowadzono insercję ludzkiej sekwencji genomowej CEL stosując następującą strategię. Plazmid pS314 trawiono enzymami KpnI i Sali i izolowano metodą elektroforezy fragment reprezentujący rozszczepiony plazmid. Plazmid pS312 trawiono enzymami KpnI i BamHI i izolowano fragment o wielkości około 4.7 kb reprezentujący część 5' ludzkiego genu CEL. Plazmid pS313 trawiono enzymami BamHI i Sali i izolowano część 3' ludzkiego genu CEL. Te trzy fragmenty poddawano ligacji, dokonywano transformacji do kompetentnych bakterii E. coli i izolowano transformanty po selekcji ampicyliną. Z kilku transformantów sporządzono plazmidy i dokładnie je analizowano przez mapowanie enzymami restrykcyjnymi i analizę sekwencji. Jeden z plazmidów reprezentujący żądany wektor ekspresyjny zdefiniowano i oznaczono symbolem pS317.

W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego genomowego CEL kodującego białko CEL w pełnej długości, modyfikowano plazmid pS317 w następujący sposób (fig. 5). Po pierwsze, trawiono enzymami HindIn i SacI plazmid pTZ18R (Pharmacia) zawierający fragment BamHI ludzkiego genu CEL o wielkości 5,2 kb, rozciągający się od piątego intronu w dół do jedenastego egzonu, pS451. Trawienie to generowało fragment o wielkości około 1,7 kb, rozciągający się od miejsca HindIII w intronie 9 do miejsca SacI w egzonie 11. Po drugie, plazmid pS313 trawiono enzymami SacI i SalI i izolowano fragment o wielkości 71 bp zawierający część 3' egzonu 11 i utworzone miejsce SalI. Po trzecie, z plazmidu pS317 izolowano resztę rekombinantowego genu WAP/CEL i sekwencje plazmidowe w postaci fragmentu SalI/HindIII o wielkości około 20 kb. Te trzy fragmenty poddawano ligacji, dokonywano transformacji do bakterii. Z kilku transformantów sporządzono plazmidy. Plazmidy te trawiono różnymi enzymami restrykcyjnymi i poddawano analizie sekwencji. Zidentyfikowano jeden z plazmidów reprezentujący żądany gen rekombinantowy. Ten ostateczny wektor ekspresyjny oznaczono symbolem pS452 (fig· 7).

Dla usunięcia prokariotycznych sekwencji plazmidowych trawiono plazmid pS452 enzymem NotI. Następnie, metodą elektroforezy w żelu agarozowym wyizolowano element wektora rekombinantowego składający się z mysiej sekwencji WAP flankującej ludzki fragment genomowy CEL. Ten wyizolowany fragment dalej oczyszczano metodą elektroeluowania i wstrzykiwano do embrionów mysich.

Rekombinantowy gen WAP/CEL do ekspresji w gruczole mlecznym transgenicznych zwierząt jest przedstawiony na fig. 8.

Depozyty

W Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen zdeponowano zgodnie z Układem Budapesztańskim następujące plazmidy:

Plazmid	Numer depozytu	Data złozenia depozytu
pS309 pS310	DSM7101 DSM 7102	12 czerwiec 1992
pS451 pS452	DSM 7498 DSM 7499	26 luty 1993

Przykład 3. Generowanie transgenicznych zwierząt

Z plazmidu pS452 izolowano fragment NotI według przykładu 2. Ten fragment DNA zawierał mysi promotor WAP związany z sekwencją genomową kodującą ludzkie BSSL/CEL. Ten wyizolowany fragment wstrzykiwano w stężeniu 3 ng/pl do projądra 350 embrionów C57B l/6JxCB A/2J-f2 uzyskanych od myszy traktowanych uprzednio 5 jednostkami międzynarodowymi gonadotropiny surowicy ciężarnych klaczy w celu wywołania superowulacji. Zwierzęta C57B 1/6JxCBA/2J--2 otrzymano z ośrodka Bomholtgard Breeding and Research Centre LTD, Ry, Dania. Po zebraniu embrionów z jajowodów, oddzielono je od komórek wzgórka przez tiaktowanie hialuronidazą w pożywce M2 (Hogan i wsp., 1986). Po przemyciu, embriony przenoszono do pożywki M16 (Hogan i wsp., 1986) i utrzymywano w inkubatorze w atmosferze

175 404 zawierającej 5% CO2. Wstrzykiwań dokonywano w mikrokropli pożywki M2 pod lekkim olejem parafinowym, stosując mikromanipulatory hydrauliczne Narishigi i mikroskop inwersyjny Nikon z układem optycznym Nomarski. Po iniekcji, zdrowo wyglądające embriony implantowano do biorców C57B 1/6JxCBA/2J-f2 z ciążą rzekomą, którym uprzednio podano dootrzewnowo 0,37 ml 2,5% preparatu Avertin. Myszy, u których nastąpiła integracja obcego genu identyfikowano metodą enzymatycznej amplifikacji DNA, pobierając próbki z biopsji ogona po trzecich tygodniach po narodzinach zwierząt. Pozytywne wyniki potwierdzano metodą analizy Southerna.

Przykład 4. Ekspresja białka BSSL/CEL w transgenicznych myszach

Transgeniczne myszy identyfikowano na drodze analizy DNA wypreparowanego z próbek ogona. Próbki tkanki inkubowano z proteinazą K i ekstrahowano fenolem i chloroformem. Wyizolowany DNA stosowano w reakcjach PCR z primerami, które amplifikują specyficzne fragmenty jeśli obecny jest heterologicznie wprowadzony DNA reprezentujący fragment wektora ekspresyjnego. Zwierzęta analizowano również w próbkach hybrydyzacji DNA dla potwierdzenia wyników reakcji PCR i dla stwierdzenia ewentualnych przegrupowań, określenia struktury zintegrowanych elementów wektora i uzyskania informacji o liczbie kopii zintegrowanych elementów wektora.

W jednej grupie doświadczeń analizowano tymi metodami 18 myszy. Wykazano, że u jednej myszy występował element wektora heterologicznego DNA pochodzący z pS452. Wyniki uzyskane z reakcji PCR i prób hybrydyzacji były identyczne (fig. 9).

Mysz zidentyfikowaną jako nosicielkę elementu wektora DNA (zwierzę fundator) kojarzono 1 miot F1 analizowano na obecność genu transgenicznego, stosując taki sam sposób postępowania.

Samicom zwierząt w okresie laktacji podawano dootrzewnowo 2 jednostki międzynarodowe oksytocyny i po 10 minutach usypiano ilością 0,40 ml 2,5% preparatu Avertion podanego dootrzewnowo. Do brodawki sutkowej przyłączano pojemnik do zbierania mleka i poprzez silikonową rurkę mleko zbierano do probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml, łagodnie masując gruczoł mleczny. Ilość zebranego mleka wahała się zależnie od dnia laktacji od 0,1 do 0,5 ml na mysz. Analizę na obecność rekombinantowego ludzkiego BSSL/CEL prowadzono na drodze elektroforezy SDS-PAGE, przeniesienia na filtry nitrocelulozowe i inkubacji z poliklonalnymi przeciwciałami przeciw natywnemu ludzkiemu BSSL/CEL. Uzyskane wyniki wykazały ekspresję rekombinantowego ludzkiego BSSL/CEL w mleku myszy transgenicznych. Fig. 10 przedstawia obecność rekombinantowego ludzkiego BSSL/CEL w mleku transgenicznych myszy: jest to pasmo w pozycji około 116,5. Generowano trwałe linie transgenicznych zwierząt. W podobny sposób można otrzymać inne transgeniczne zwierzęta, takiejak krowy i owce, zdolne do ekspresji ludzkiego BSSL/CEL.

175 404

Pozycje literaturowe

Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. & Lombardo, D. (1988): Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308.

Ausubel, F. M., Brent, R. E., Moore, D. D., Smiyh, J. A., Seidman, J. G. and Struhl, K.: Current Protocols in Molecular Biology. (Wiley Interscience, New York 1987).

Baba, T., Downs, D., Jackson, K. W., Tang, J. and Wang, C. S. (1991): Biochemistry 30,500-510. Beato, M. (1989): Cell 56, 335-344.

Bernback, S., Blackberg, L. & Hernell, O. (1990)· J. Clin. Invest. 221-226.

Bjórksten, B., Burman, L. G., deChateau, P., Fredrikzon, B., Gothefors, L. & Hernell, O. (1980): Br. Med. J. 201,267-272.

Blackberg, L., Angquist, K. A. & Hernell, O. (1987): FEBS Lett. 217, 37-41.

Blackberg, L. & Hernell, O. (1981): Eur. J. Biochem. 116, 221-225.

Blackberg, L. Lombardo, D., Hernell, O., Guy, O. & Olivecrona, T. (1981): FEBS Lett. 136, 284-288.

Boulet, A. M., Erwin, C. R. and Rutter, W. J. (1986): Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, 3599-3603.

Brinster, R. L., Allen, J. M. Behringer, R. R., Gelinas, R. E. & Palmiter, R. D. (1988): Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 836-840.

Callen, D. F. (1986): Ann. Genet. 29, 235-239.

Campbell, S. M., Rosen, J. M., Hennighausen, L. G., Strech-Jurk, U. and Sippel, A. E. (1984): Nucleic Acid Res. 12, 8685-8697.

Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J. and Rutter, W. J. (1979): Biochemistry 18, 5294-5299.

Clark, A. J., Simons, P., Wilmut, I. and Lahte, R. (1987): TIBTECH 5, 20-24.

Devereux, J., Haeberli, P. and Smithies. (1984): Nucleic Acids Res. 12, 387-395.

Femberg, A. and Vogelstein, B. (1983): Anal. Biochem. 132, 6-13.

Hennighausen, L., Ruiz, L. & Wall, R. (1990): Current Opinion in Biotechnology 1, 74-78. Hernell, O. & Blackberg, L. (1982): Pediatr. Res. 16, 882-885.

Hogan, B., Constantini, F. and Lacy, E. (1986): Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Hui, D. and Kissel, J. A. (1990): Febs Lett. 276, 131-134.

Lombardo, D., Guy, O. & Figarella, C. (1978): Biochim. Biophys. Acta 527, 142-149

Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J.: Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, NY, 1982).

175 404

Mahandas, T., Sparkes, R. S., Sparkes, M. C., Shulkin, J. D., Toomey, K. E. and Funderburk, S. J. (1979): Am. J. Hum. Genet. 31, 586-600.

Mohandas, T., Heinzmann, C., Sparkes, R. S. Wasmuth, J., Edwards, P. and Lusis, A. J. (1986): Somatic Cell. Mol.Genet. 12, 89-94.

Mount, S. M. (1982): Nucleic Acids Res. 10,459-472.

Nilsson, J., Blackberg, L., Carlsson, P., Enerback, S., Hernell, O. and Bjursell, G. (1990): Eur. J. Biochem. 192, 543-550.

Qasba, M., and Safaya, S. K. (1984): Nature 308, 377-380.

Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, T. H., Ronk, M., Shively, J. E., Sternby, B., Borgstrom, B., Ameis, D. and Schotz, M. C. (1991): J. Lipid. Res. 32, 267-276.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. E.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R. (1977): Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467.

Sjoberg, S., Carlsson, P., Enerb ack, S. and Bjursell, G. (1989): Comput. Appl. Biol. Sci. 5,41-46.

Taggart. R. T., Mohandas, T., Shows, T. B. and Bell, G. I. (1985): Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 6240-6244.

Warburton. D., Gersen, S., Yu, M. T., Jackson, C., Handelin, B. and Housman, D. (1990): Genomics 6, 358-366.

Whitelaw et al. (1991): Transgenic Research 1, 3-13.

Yu-Lee, L., Richter-Mann, L., Couch, C., Stewart, F., Mackinlay, G. and Rosen, J. (1986): Nucleic. Acid. Res. 14, 1883-1902.

Ofverstedt, L. G., Hammarstrom, K. Balgobin, N., Hjerten, S., Petterson, U. and Chattopadhyaya, J. (1984): Biochim. Biophys. Acta 782, 120-126.

175 404 r· u

Tabela 1 Korelacja sekwencji CEL z ludzkimi chromosomami somatycznych 1udzko-azczurzych hybrydach komórkowych <

X g r

............. , +

o X

>

o

O

O

OO

o

CM C

O

o

o

o

CM

o

o

o

o

o

rMI^

X)

X

o

o

CM

-O

o

O

o

o

o

o

O

o

o θ'

o

o

TT θ'

CM CM

sO c-

o

O

Ό Γ—

o

oc oo

CM

r—

00

o

O sO

o

O

o

o

O

CM

o

O

CM 00

CM O

Ty ON

On oo

CN

o

o

vC Γ

o

o

o

o

o

® LI

O cm

-’Τ oc

o^ oo

rc

CM CM

o

CM C

O

o

T CM

o

o oo

o

o

o

o

o

X N

o

”y

Γ- oc

CM

O

CM

O OC

c

c

TT TT

o

Ό

o

o

o

c

o

w-l|

O □ _1

oo

o θ'

c, Γ-

O

oc Γ-

O

o Γ-

o 00

SC)

o

s£> Ό

O

o

o

o

o

c

0Cli2

>

r-·

ac

-

sO

sG

lO

ΟΟ

o

C

o o

\O

CM

o o

X

θ'

ΟΟ

o

OC

o

oc

o

O

c·

θ'

o

o

o

o

o

w o

sC

o

o

O

o

o

o

O

o

o

O

c

O

oo θ'

o

c

CMI

z

o cc

V*.

□c r-

o o

CM

CM

o

CM o

Os oo

c

CM

o sO

Ty

CM sC

o

o

o

X

u

oc

r-

O sCl

CM OC

c

oo Γ—

CM

CM Γ-

oo OC

O t—

O oc

c

o

o

o

o

O|sC

X

(J >

m

c

r— r-

O

\© vCl

c

*T OO

o

•y Γ—

CM

O

O

o

o

o

o

o

M~.|

u

< ”5 <

CM

ac 'O

C

o

CM CM

C CM

LO

Γ- ΟΟ

CM CM

o

CM TT

CM θ'

c

-

o

o

o

Ol O

a. UJ

—

O

c> C

s£>

oo CM

o

Γ- Γ--

O

TT Cl

O

x£> C

o

o

o

o

o

XII i

5 5 N

O

e

CM oc

O

O

CM

sO

o

00

o

TT

O

o

o

o

o

o

CMI

jC

X UJ

ON

c

o

O

O

O

o

o

O

O

O

O

c

o

o

θ' Ό

TT o

CC Ό χ

oo

30 Γ-

Cl Γ-

ON Ό

Ό

O OC

TT SCI

Γ- ΟΟ

O

O

O Γ—

Ό

CM Ό

o

o

o

o

σΊ^2

O

X

Γ—

CM os

o r*-

CM

sO CM

o

CM ON

Ty

O

O r~

TT W1

MO OO

TT oo

o

o

o

o

l··

Z LI

\O

o sO

ci ON

C Ό

O

X> ττ

nO Γ-

ON r-~

CM

Ό Ty

CM M5

OO 00

O

o

o

o

o

OjsO

U

o a.

s/D

Ό r-

O

O

CM

Ό OC

Ό un

c 00

OC CM

o

O

o \O

o

o

o

o

-li

0.

Ty

’Τ r-

r- r-

O wn

Ό

OO sC

O

c

oo

00 m

oo oo

o

o

o

o

o

—ii

Cl

O

NO c-

CM vO

O

tt 00

o

CM NC.

o

TT SCi

CM

Ό TT

o

o

o

o

«ii

cm

’Τ CM

f*~} oo

O

T? Ci

O

o

o sci

O

o

O

O

O

o

o

o

o

sciji

—

r-

ON sO

O

O

O

O SCI

O

o

o

O

o

O

o

o

o

o

Tni

£

0

ϋ

03

MO

0

0

i

<

wn

c-

O

< O

CM

c

Ty

<

ό

c-

OO

o

TT

t~.

sc>

c < 73

cc X

a

CM

CM

CM

c

m

o

ci

o

C-l

Cl

c

TT

CM

Ό

θ'

41 0

>

θ'

Os

ON

ON

σ'

ON

On

Os

Os

θ'

^N

σ'

m

Ό

8

- 0)

tt

Os

Os

Os

Os

o

Os

On

Os

Os

θ'

on

«Τ'

o

o

o

0. N 0 41 —

u

3

o

O

o

o

o

o

O

O

O

O

o

o

UJ >

Σ

s

Σ

£

Σ

Σ

s

2

Σ

s

s

Σ

i

s

Σ

5

X

O

O

Q

U

O

O

o

O

O

o

o

O

u

o

o

o

W C

ogół, chromosom ludzki ma być obecny w ponad EO - EEZ komórek, według analizy Southerna Tera 9pter->q34 i Xq43->qter.

e « a Z N a £i

175 404

Primery stosowane do amplifikacji

	B
			Ό
			C
			0
			Ν
			3
			a		Τ
a				Δ	Τ
3 0			Ν	ο <Τ	φ
c
a			Ε	C	C
B			a	0	0
JSf			6.	Ν	Ν
a			a	3	©
B			έ	a	Φ
a			L		£
c a			a.	ζ 0	Φ
B			Ν	3
0				ο	C
X	O		ο	V	a
·—	•Γ”		Τ“	'3	Ν
4-				a	(.
	c		C	Ν	ο
r·	0		0	ο	Ρ
Π	N		Ν	a	Β
Ę	3		3	ρ	0
*	a		UI	0	0.
d
P
c
	CO	(N	C	ιη	C	(Ν
a	o		η	η	ο
<_IJ	in		(Ν	ο	γΗ	Γ-
0 3	co i	CO I	Γ- 1	C	C	σ\
N	(N	<D	1 ο	SC	I C	( 3
0 Λ	ΟΊ	•rf	η	γ—<	C0	3
o.	Tf	SC	3	Ο	ο	r-
	CO	CO	Γ~	C	C	C
			-	«.	13	3
			η	ΓΠ	1	1
			I	1	υ	ο
		»	υ	ο	υ	3
	3	3	Ρ	μ	<	Ε-ι
	1	1	Ε-		υ	υ
	P	p	υ	υ	υ	υ
	t-	A	υ	t-	<	<
	U	<	£<	<	υ	υ
	U	υ	Ε-	υ	υ	Ε-
	*c	E-	υ	υ	υ	υ
	Ε-	<	ε-	υ	υ	Ε-
	υ	υ	υ	υ	Ε-	<
	U	υ	υ	υ		υ
	O	υ	ε-	ε-	υ	υ
	U	υ	υ	υ	α	υ
	<	<	Ε-	<	2	<
	Ε-	Ε-	<	υ	υ	υ
Ό	υ	υ	Ο	υ		υ
3	υ	<	υ	υ	2	Ε-
P	<	υ	υ	υ	υ	υ
0	o	υ	<		υ	<
a r-	<	Ε- I	ο	υ |	<	υ 1
3$			»		1 *	1
3 j;	in	ιη	m	ιη	ιη	ιη
0
3
	·	•·	··	··	• ·	··
	rH	03		ιη	ΙΟ	r-
o	CU	CU	α.	CU	CU	α.

P 3

L 3 C.

TJ a

P 3 E

Β P 3

C

TJ 41

0-0 •X Ό

TJ 3 a c tj a a a — b n ·-> a a n

ONO « o t o a o δ

a c

o •N a

L

B

P

B a

•3

TJ

P

- Ό c a a tj c o B TJ <0

O 3 O -N a a a c a o v egzonu □ ci c o

0	Ν	ο	F-	•3
a	3	UJ	0	0
R·	a	ω	X	a
X
3	0	«r	Β
C	3	•3		4·
	a	0	0
β	Ν	c	3
•3	Β	a	a	Ω.
0	Β	Β	C	ί
3	u	χ	a	a
Ν	a	a	Ό
0	—	Β	0	0
α	o.	Ν	α	TJ
a				Δ

175 404 c

o u

•U c

Ό «0 ⁰ ts © S? □

c.

c

Π>	IC	r-	OD	r-	rs	v£>	r-		co
•0*	OD	r—	®	r-		LO	σι	O	CJ
**i		ΓΜ	CJ					CJ
CJ			w			w		<-M
w	k-(	PM	>	>	PM	PM	pm	X	X
	W	W	PM		>	i-o	w	PM
		PM				>	pm
							>

Organizacja eksonów i intronów w genie CEL c

o

Ł.

c

I c

o

N ©

C

N

O ar

X* o

α s

<9

->

U c

X

B n

Q c

α υ

β a

c.

o ρ

α οι u

Λ β

in α

c α

X3 α

X α

L

O c

o •o a

β α

X o

c

E

Q

N

O

CL

O <B o— ©P

3C

I*-*

Ό

C

O

N ©

UJ «

© a

0P

->o

ΟΦ »NJS

0.C

c.

c

u ρ o	£ ρ	8 u	p £	Ρ Ρ Ρ	ο < ο	£ <	P < o	Ρ Ρ ο	Ρ Ρ Ρ
u	u	u	P	Ρ	Ρ	Ρ	o	Ρ	Ρ
δ	u	U	<	Ρ	u	Ρ	<	u	<
o	<	P		Ρ	u	Ρ	o		ο
p		P	p	Ρ	ρ	u	o	0	ο
r*	0	P	o	Ρ	Ρ	<
U				<	ο
O>	Oi	Ol	Oi	Ο*	0»	©	Ο»	Οι	0»
9	<ΰ	<0	4	4	4	4	4	4	4
U	u	u	U	XJ	υ	υ	υ	U	U
o>	Ot	XP	U	Ο>	υ	U	υ	υ	Οι
u	XP	u	υ	υ	υ	u	υ	ΧΡ	ΧΡ
XP	U	x>	υ	u	υ	4	υ	υ	υ
u	υ	(0	υ	υ	υ	0	υ	υ	ΧΡ
u	e	U	σ>	XJ	ο»	u	ΧΡ	0	υ
u	υ	U	jj	θ’	χ)	u	ΧΡ	υ	4
XJ	u	U	u	θ’	υ	ΧΡ	4	ΧΡ	0
υ	Oi	υ	υ	Οι	XJ	u	Ο»	U	ΧΡ
X>	xp	u	υ	XJ	ΧΡ	XP	ΧΡ	XJ	υ
o>	υ	XP	ο»	υ	Οι	υ	X)	υ	ΧΡ
X>	u	υ		ΧΡ	ο»	O)	υ	ΧΡ	ΧΡ
o>	x>	o>	0	Χ>	χ>	©	4	ο	υ

4	4	υ	ΧΡ	©	u	ΧΡ	υ	ο	4
ο>	Οι	©	Ο»	υ	4	©	ο»	σι	Ο»
4	Ο>	ΧΡ	υ	ΧΡ	4	4	4	4	4
4	Οι	υ	Οι	υ	4	©	4	Ο	4
ΧΡ	ΧΡ	ΧΡ	ΧΡ	ΧΡ	ΧΡ	ΧΡ	ΧΡ	ΧΡ	ΧΡ
σι	Οι	©	©	Οι	©	Οι	Οι	Οι	©
ο				ο	ο
				<	<		<		0
<	ο	ο	ο	Ρ	3	Ρ	ο	3	δ
ο	5	<	<	ρ		ο	ο	Ρ	<
u	<	<	ο	Ρ	2	<	u	υ	υ
ο	u	Ρ	Ρ	Ρ		u	<	ο	<
Ρ	0	ο	Ρ	Ρ	Ρ	ρ	Ρ	Ρ
u	0		Ρ	Ρ	<.)	Ρ			2
Ρ	r*	2	Ρ	Ρ	u	Ρ	ο	2	2

tn Ci	Ο ιη	TJ»	ΙΌ ΙΌ	*5» *5»	\ύ η	σι Γ*Ι	m ΙΌ	00 ΙΌ	ΙΌ ιο	Γ* <Ν
σι	m	\£>	CJ	LO	C3	»“Μ		(Ν	φ	ιη
cj	Γ-	»“Μ	ΟΟ	CJ	*ό	Ο	ιό	ΓΊ	σι	TJ
1	I	ł-M	—Μ	CI	CJ	4*1	ί*Ι		-«»	Γ*
«Ή	LO	ΙΌ	Γ-	m	Γ-	1*1	(Ν	σι	1 m	I σι
	<Ν	Γ*	γΗ	0D	C3	ΙΌ	Ο	Ό	rn	σι
			γΗ	t-M	CJ	CJ	<*>	ο		sy

Γ-	^4	η	CD	»•4	CD	CO	Γ-		οο	τΜ
ΟΟ	σι	Οί	σι	m	Ο	»Η	ΟΟ	Ο	σι	TJ
	Γ-<	ιΉ				Μ	γΗ			00

Γ- ΟΟ {	00 σι es I	σι CO Γ- (Ν	ΙΌ C4 m	f*l οο ΙΌ	C0 ΙΌ σι	C0 03 CN σ	w co 00 ΙΌ	CJ 00 CJ Γ-	r*4 00 ΙΌ 00	ο σι 00 σι
τΗ	τ-Η	Γ-	Γ-	«*ι		*-(	σι	σι	f	i ο
	f*l	φ	ΙΟ	σι	ΙΌ	*Η	σι	Γ-	00	rH
		u>	ο	σι	00		ΙΌ	ο		Ο
	C4	οι	<*ι		«φ	σι	ΙΌ	r-	00	σι
	<Ν	m		σι	ΙΌ	Γ-	00	σι	ο	e·^

3
+»		3
Ł.	3	C.
«	Ό	¢)
•Ρ	a	£
α	Ρ	3
	0	C
Ό	¢)
0		0
	3	Ό
Ό	3
α	C	Ό
α		«
«	—	β
Ν	·>	«
	0	Ν
—	a
U	Ν	Ο
«	0
0	0.	ιθ
F—		*-
—	«
	—	Ό
Β	C	β
	9	Ό
β	C	0
C	δ	Ό
0	Ό
Ν	(.	a
«	0	•Ν
C.	0.	Φ
a
δ	3	Q
	—	C
Ρ	ϋ
α	0	τ-
βι		·.
·->	»
3		2
Ό	3	α
a	C	—
Ρ	0
0	Ν	α
α	©	UJ
	01	α
J0
3	0	&
C	©	·->
	«1	υ
β	Ν	C
—>	α	φ
0	δ	Β
a	u
Ν	β	Φ
0	·—	Β
0.	α	Ν
«

ko 1umnie

175 404

Objaśnienia figur na rysunkach

Figura 1 przedstawia locus genu CEL. Podana jest lokalizacja i mapa restrykcyjna dwu częściowo nakładających się klonów, λΒ SSL11XBSSL5A. W dolnej części figury przedstawione jest wzajemne rozłożenie (organizacja) egzonów i intronów i zastosowane miejsce restrykcyjne. Egzony są oznaczone jako prostokąty numerowane od 1 do 11. Skróty mają następujące znaczenie: Asp = Asp700; B = BamHI; E = EcoRI, S = SacI; Sa = Sali; Sp = SphI i X = Xbal. Pozycje i orientacj repeptytywnycci ell^im^ir^ców Alu są oznaczone grubymi strzałkami. Litery od a do h oznaczają różne subklonowane fragmenty.

Figura 2 przedstawia analizę metodą wydłużania primera, RNA pochodzącego z ludzkiego gruczołu mlecznego w okresie laktacji, trzuski i tkanki tłuszczowej. Dla zainicjowania odwrotnej transkrypcji tego RNA zastosowano znakowany na końcu znacznikiem radioaktywnym 26-merowy oligonukleotyd, komplementarny do pozycji nt 33 do 58 genu CEL. Pasmo A jest pasmem znacznika mas cząsteczkowych (drabinka sekwencjonowania), pasmo B jest pasmem RNA trzustki, pasmo C jest pasmem tkanki tłuszczowej a pasmo D oznacza RNA gruczołu mlecznego w okresie laktacji.

Figura 3 przedstawia analizę punktową regionów flankujących 5' ludzkiego genu CEL i genu CEL szczura. Regiony wykazujące homologię są oznaczone literami od A do H a sekwencje reprezentujące te części są podkreślone: od góry - ludzkie a od dołu - szczurze.

Figura 4 przedstawia analizę sekwencji 5' flankującej ludzkiego genu CEL. Przypuszczalne sekwencje rozpoznania reprezentujące nić komplementarną są podkreślone od góry albo od dołu. Tłuste litery oznaczają miejsca homologii z genem CEL szczura (rCEL) (regiony A-H). Skrzynka TATA jest zaznaczona kropkami. Występują tu dwie sekwencje wykazujące 80% podobieństwo do sekwencji consensus miejsca wiązania z receptorem glukokortikoidowym, GGTACANNNTGTTCT (Beato M., 1989), pierwsza - na nici komplementarnej, w pozycji nt -231 (1A) a druga - w pozycji nt -811 (1B). Ponadto, w pozycji nt -861 (2) znajduje się sekwencja wykazująca 87% podobieństwo do sekwencji consensus miejsca wiązania z receptorem estrogenowym, AGGTCANNNTGACCT (Beato M., 1989).

Lubon i Hennighausen (1987) zanalizowali sekwencję promotorową i 5'-flankującą genu kwaśnej proteiny serwatki (WAP) i ustalili miejsca wiązania dla białek jądrowych komórek gruczołu mlecznego w okresie laktacji. Jedną z nich jest konserwatywna sekwencja o wielkości 11 bp , AAGAAGGAAGT , ^y^^ę^j^uj^c^a w wielu badanych genach białka mleka , np. w genie α-laktoalbuminy szczura (Qasba i wsp., 1984) i w genie α-kazeiny szczura (Yu-Lee i wsp., 1986). W regionie 5'-flankuJącym tego genu CEL, na komplementarnej nici w pozycji nt -1299 (3), występuje sekwencja o 82% podobieństwie do tej sekwencji konserwatywnej.

W badaniach regulacji genu β-kazeiny, w ekstraktach jądrowych od myszy ciężarnych lub w okresie laktacji wykryto swoisty tkankowo czynnik gruczołów mlecznych (MGF) i zidentyfikowano sekwencję rozpoznawania (ANTTCTTGGNA). W regionie 5'-flankującym ludzkiego genu CEL znajdują się dwie sekwencje, jedna na nici komplementarnej w pozycji nt -368 (4A) i druga w pozyccj nt -1095 (4B). Obydwie te sekwencce wykazuj 82% podobieństwo do sekwencji consensus miejsca wiązania MGF. Oprócz tych dwu przypuszczalnych miejsc wiązania MGF w regionie 5'-flankującym, występuje sekwencja na nici komplementarnej w pozycji nt 275 w intronie I, AGTTCTtGGCA, w 100% identyczna z sekwencją consensus miejsca wiązania MGF.

Ponadto, widoczne są cztery sekwencje, wszystkie wykazujące 65% podobieństwo do sekwencji consensus elementu swoistego wzmacniacza trzustki szczura,

175 404

GTCACCTGTGCTTTTCCCTG (Boulet i wsp., 1986), jedna w pozycji nt -359 (5A), druga w pozycji nt -718 (5B), trzecia w pozycji nt -1140 (5C) i ostatnia w pozycji nt -1277 (5D).

Figura 5 przedstawia sposób wytwarzania plazmidu pS452. Szczegóły opisane są w przykładzie 2.

Figura 6 przedstawia schematyczną strukturę plazmidu pS312.

Figura 7 przedstawia schematyczną strukturę plazmidu pS452.

Figura 8 przedstawia mapę fizyczną obrazującą fizyczne wprowadzenie ludzkiej struktury genomowej BSSL/CEL do pierwszego egzonu genu WAP w sposób opisany w przykładzie 2.

Figura 9A przedstawia schematycznie lokalizację primerów reakcji PCR użytych do identyfikacji zwierząt transgenicznych. Primer 5' jest usytuowany w obrębie sekwencji WAP, rozpoczynając się od pozycji -148 bp w górę od miejsca fuzji między WAP i BSSL/CEL. Primer 3' znajduje się w pierwszym intronie BSSL/CEL kończąc się na pozycji 398, w dół od punktu fuzji.

Figura 9B przedstawia sekwencje użytych primerów do reakcji PCR.

Figura 9C przedstawia żel agarozowy obrazujący typową analizę z reakcji PCR potencjalnych zwierząt - fundatorów. M: oznacza znaczniki mas cząsteczkowych. Pasmo 1 oznacza kontrolny produkt reakcji PCR, generowany z plazmidu pS452. Pasma 2-13 oznaczają reakcje PCR prowadzone z preparatami DNA od potencjalnych zwierząt - fundatorów.

Figura 10 przedstawia immunologiczną analizę punktową mleka pochodzącego z transgenicznej linii mysiej na obecność produktu rekombinantowego genu: mysi WAP/ludzkie CEL z plazmidu pS452. Białka rozdzielano metodą elektroforezy SDS-PAGE, przenoszono na filtry immobilon (Milipore) i wizualizowano za pomocą poliklonalnych przeciwciał królika otrzymanych z zastosowaniem wysoce oczyszczonego ludzkiego natywnego CEL i następnie działając świńską IgG przeciw-króliczą znaczoną alkaliczną fosfatazą (Dakopatts). Pasmo 1 oznacza znaczniki niskich mas cząsteczkowych, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 i 18,5 kDaltonów. Pasmo 2 przedstawia znaczniki wysokich mas cząsteczkowych, 205,116,5, 80 i 49,5 kDaltonów. Pasmo 3 reprezentuje 25 ng oczyszczonego nierekombinantowego CEL z mleka ludzkiego. Pasmo 4 jest próbką 2 gl mleka z transgenicznej myszy CEL w rozcieńczeniu 1:10. Pasma 5 i 6 oznaczają próbki 2 gl mleka od dwu różnych myszy nie-CEL transgenicznych w rozcieńczeniu 1:10 jako próbki kontrolne.

175 404

Wykazy sekwencji (1) INFORMACJA OGÓLNA (i) Zgłaszający:

(A) Nazwa: AB ASTRA (B) Ulica: Kvarnbergagatan 16 (C) Miasto: Sodertalje (D) Kraj: Szwecja (F) Kod pocztowy (ZIP): S-151 85 (G) Telefon: +46-8-553 26000 (H) Telefax: +46-8-553 28820 (I) Telex: 19237 a.st^i^u s (ii) Tytuł wynalazku: Nowe sekwencje DNA (iii) Numer sekwencji: 1 (iv) Forma komputerowa:

(A) Typ nośnika: Dyskietka (B) Komputer: PC kompatybilny z IBM (c) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Program: PatentIn Release #1,0, wersja #1,25 (EPO) (vi) Poprzednie zgłoszenia:

(a) Numer zgłoszenia: SE 9201809-2 (B) Data zgłoszenia: 11 czerwiec 1992 (vi) Poprzednie zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: SE 9201826-6 (B) Data zgłoszenia: 12 czerwiec 1992 (vi) Poprzednie zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: SE 92002088-2 (B) Data zgłoszenia: 3 lipiec 1992 (vi) Poprzednie zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: SE 930002 (B) Data zgłoszenia: 19 marzec 1992 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NR: 1 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 11531 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj nici: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organizm: Homo sapiens (B) Typ tkanki: gruczoł mleczny (ix) Cechy :

(A) Nazwa/kod: CDS (B) Położenie: połączenie (1653..1727, 4071..4221, 4307..4429, 4707..4904, 6193..6323,

6501..6608, 6751..6868, 8335..8521, 8719..8922, 10124..10321, 10650..11394)

175 404 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: peptyd mat (B) Położenie: połączenie (1722..1727, 4071..4221, 4307..4429, 4707..4904, 6193..6323,

6501..6608, 6751..6868, 8335..8521, 8719..8922, 10124..10321, 10650..11391) (D) Inna informacja: numer EC: 3.1.1.1 (produkt: Lipaza stymulowana solami żółciowymi) (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: 5TJTR (B) Położenie :1..1640 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: sygnał TATA (B) Położenie: 1611..1617 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 1641..1727 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 4071..4221 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 4307..4429 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 4707..4904 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 6193..6323 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 6501..6608 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 6751..6868 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 8335..8521 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 8719..8922 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 10124..10321 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: egzon (B) Położenie: 10650..11490 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/kod: 3' UTR

175 404 (B) Położenie: 11491 . . 11531 (χι) Opis sekwencji : SEQ ID NR: 1

GGATCCCTCG AACCCAGGAG TTCAAGACTG CAGTGAGCTA TGATTGTGCC ACTGCACTCT 60

AGCCTGGGTG ACAGAGACCC TGTCTCAAAA AAACAAACAA ACAAAAAACC TCTGTGGACT 120

CCGGGTGATA AATGACAATGTC AATGTGGATT CAATCACGJGTG TAACAGCTGT AACCCCCTGG 180

GGGGGATGTT	GGATAACGGG	GAGACTGGAG	TGGGGAGAJGG	ACATACGGGA	AATATA7G7A	2240
ATCTTCCTCT	AAATTTCGCT	TGAACCTAAA	GATSATATAA	AAAC'GTACAC	AGATATAAAA	300
TGGGGCCTTC	CCTTCCCCCC	GCCCTGCCCC	AGCCCTCCCC	CACC^C^C	ATATAAATGC	360
TGCCTCCCCT	CTCCCCTCCC	CCCCCCCCcT	TAGCCACTGT	AAA.ATGACAC	GGCAGCAAAG	420
TCTGAGGCAA	ACGCC'CCCGC	CCTGGGGCGC	CCCAGCCACC	'ITGGACGGCCC		480
TGGCCGAGCT	CCTCCTCCCA	CCCTCCAGTC	CCCTCCCCAG	CCTCCC7CGC	CCCACCAGGc	540
TCCTGAATTG	CTGGCACCGG	CTGTGGTCGA	CAGACAGAGG		GGTCCGCAAG	600
TCCACTCGGT	CCCTGGCACC	GGCCGCAGGG	GTGGCAGAAC	(GGGAGTCTGG	ΊCCGJGC^GCGG;	660
AAGCACAGGC	CCCAGTGTCT	CCTGGGGGAC	TGCCGGGTGG	GGAAGJATATG	GCTCCCCTCA	•720
CCCTGTTCCC	ATCACTGCAG	AGGGCTGTGC	GGTGGCTGGA	GATGAAAATG	AAGOGGCTCCGG	780
TGAGGGTGAC	CTCACACTGG	CTGAGC'TCAA	AGGCCCCATC	TGAAGACTr1	GTTAGTGGTG	840
TTCTTTCACT	TCTCAGAGCC	CTCCCCGGCC	CCAGGATTAA	'CACCTG'CCCA	CAGGAAAtTAC	900
GAGTCGCCTC	CTCCTCCACA	ACCTCACACG	ACCTTCTCCC	TTCCCTCCCG	07^077?^	600
TCCCTCCCCT	TCTGTCACTC	TGCCTGGGCA	TGCCCCAGGG	aatgcggatg:;	GGCC'CCCCGC	1000
TCCACAGGGA	AACCTACATG	GCCGGGCTAG	ATGCCTCCGC	ACCCCCCCAC	CCCAAACCCC	1008
TGAGCCTCTA	GTCCTCCCTC	CCAGGACACA	TCAGGCTGGA	TGGTCACAAT	'TCCCACACCT	1110
TGAGTGGGAC	TCCCTTGCGC	CGCCCTGGGA	TTCGCACCCA	GCrTGGACTA	CCCCGCTCCA	1120
GGGCCCCAGG	AAAAGC7CGT	ACAGATAAGG	TCAGCCACAT	GAGTGGACGGG	ACCTGCAGCA	1160
GCTGCCCTTT	CTGTCCCAGA	. AGTCACGTGC	TCGGTCCCCT	CTGAAGCCCC	TTTTGGGGAC	1320

TAGGGGACAA GCAGGGCATG GAGACATGGA GACAAAGTAT GCCCTTTTCT CCGGACAGGG 13 80

CACCAAGCCC	CGCGAACAAA CCAGAAGGCA GGGCAC'CGCG CACCCTGCCC GGGCCCCACC	1440
TCCCCCTTAC	CACCCGCCAC CTTGCCACCT GCCTCTGCTC CCAGGTAAGC GGGT^ACCTG	1S00
ACAGGTGCAC	'CG'CGGG7CT'G GGGAAAACTG GATCTCCCTG CACCTGAGGG CGTAGGAGGG	1560
AGGGAGTGCC	CGAGAGC<CCA CGAACAAGCA CGCGACCTTG GATCCAGCTC CATTAAAAAC	1620
CGAGGCCCAG	GGGGAGGGCC ACCCAGAGGC TG ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG Met Leu Thr Met Gly Arg Leu -23 -20	1673

175 404

CAA CTG GTCC GTC TG CACC CCC ACC ACC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC 1721

Gln Leu Val VaC Lec G5ly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala

-15 -10 -5

GCG AAG GTAAAAGCCC AGCAGAAATG CACTACCTAC TGCTCTCTCG CTCAATCAGA 1111

Ala Lys

TCTTTAAACT	TCGGGCCAGG	CTCAGAGAAA	AGCCAGCAAC	GCCCCCCOACO	aagttccctt	1837
CACTCACGCT	CATTCCTATG	gctaaacaaac	GCACTTAGAA	CACAGGATGO	CCWATCCAT	:1897
TTGAATTTCA	GATAAACTGC	CACAATAACC	CCATCATAAATA	TGGTCGCCATGCC	AAAAACTCAAAC	1557
ACAAATTTCT	ATGGGCCGGG	CGGAGAGCTT	TGC^^C^C^^CT^i^CA	A^TCG^C^C^CGę^C^G	TTKAATACAGA	:2077
CGAgGTGgGT	TAATCACTTG	AGATA ToAGa	TTTTA.GACCA	GCCCAGC2CTA	CAACTATTAAc	22077
CCCCGTCTCT	ACTAAAAATA	CWAAATACA	TGCAAACGATAG	'AACTATTOG	CCTGTAATCC	21137
ATCTACTCGG	GAGGCTGAGG	CACAGGATAA	ggctc;aaggt	GGGAGGAAAA	GCTTACCGCGA	21177
AGCTGAGATC	ACGCTACTGC	ACACCAGCGT	CGASTAACACAA	GCGAGACTCT	GTCOC2AAAAC	2277
ATAGAAAAAG	AAAAAAATTA	AACATACTAA	AAAAAACAAC	CCACTGTTCA	CGTTAAACTC	2331
ATGTAACTGG	GCCTCTTGAA	TTTACATTTT	CTCAAACCCT	GGTAACCCCA	CATACCAACC	23-37
TCTTTCATTC	CCATTTTACA	GAAAAAGAAA	CGCGGGCCCA	GGGACAGAAA	TTGTAGAGAG	2233
GGCAGACGGG	TGGAGAGAAG	CACACATACA	GTTTCC^A:CCC	AACATGACAC	GTCTACTGCC	2299

CTATTCCTGC	ACAAGAACCT	GAAAACCGAA	CTCCACCACA	ACCCCACACC	gggaccccca	2255
GAAAAAGAAC	CGACAAGCAG	GAGCTCTCTC	GAGAGACACC	AATAAACTCC	CCCCTCTCCA	2611
TGTGAAAGAG	AAACCACAGA	AACCCCAAAC	CCCACACAAGC	ACACCCATAT	ATACACCCAA	2277
CAATCCCTGC	CCCCAGCAGA	AGTCACACAA	GCTAGACCAG	ATACCOCAAA	ACCGCCTCTC	2777
CTACCTACAG	CGTCCCAAAC	CCTAGATACT	CCOCCTCTCCA	CCTCTCGTCC	CTCTTCCCCA	2777
CACTCCCTAA	CCCTGATACC	GTCATGTTTG	GGCACAATOTA	TTTTAA ACCT	GAAACCOAAAA	2257
AGAGATCACC	TTCTTCTCAA	ACAATCTCTT	CTTCTAGACC	TGAGAAAAAT	CCCC3CAAGTA	2917
ATCACAACCC	CTCCCCATTT	CCCCACCCTG	ACAACCCTCTG	GCCAGCCAGT	ATATCACACCA	2977
GATCACACCA	CCGACACAAA	GAGACACAGA	TACCTCGCAG	CTTATTCCCA	CGATTCCTTC	3037
ATATATTGCT	TCCGATTCCT	TTCCTCCAAT	TCCCAACCAC	GCACACACCC	ACACCACCAT	3097
GACAAAGAGC	CCATCACCCT	AGACTTCAGA	GGGCTGGOCA	GACCAACCCT	AOTTAGCCTCT	3157
GTATAGTaCC	ACCCTTCCCT	TCCCCACCTG	GGAACCTAAC	CAGGCCGGAG	CCAGCTGOGCA	3217
ATTACCTAGT	CCCACCATAC	ACCACGAGAA	GTAATGAGCT	CTGCCCJCOGA	TTAACACCAAG	3277
GTTACACTGG	GACAGACAGC	tacttctcaa	CCAGATTGAC	TCAAGCCCACO	OAAAATCCGA	3337
GCCTCAGTTC	CATCAGATAC	AGAGAATAAA	TCAAGCACCA	CCTCCACCCCC	CCKCTCTTGG	3397
gtgaacagct	CGATGCACAG	AAACCATTTC	CCATACCACA	GGAACTAAGC;	CCACTATATT	3457

175 404

AGGTGTGGTC CCTAGGGGGT TCTTTACCAG CAGGCGGCTC AGGAACTCTG GGGACTTTGG 3 511?

CATGGGGCCA TAACCTTTAT AACCCACCCA CTA£CGAACTATGAcGAACA TTAAACA;ACG 3577

AAAACACAAA CCACAAAAAT AAAAAAAAAA G7A^AC1ATT31' TATAAAAAAT CACAA:AΓAAAA 3 637

TAAAAATTGA GTACAATACT AAAAAGAAAT GGAAACAAAT AAAAATATAA «^AJAA^C^J^C^ 33 697

AAAAAAAAAA ACACGGATGT TAATAATATT AAAAATCTGGG AAAATCAAAA TACGGAGTAAA 37 77

AACTAAAAAA AAATAAAAAA AAAAAAAAAA TCCATCCCACCATATTAGCC GCCTCCCTAG 38 77

TAAGACCAAT AATTAAACAA ATTTAATCTA AGA^^TO^ AAGCAAAACA CCCCAdSAT 3777

AAAAAAAAGA ACAAGAATTA TAAAACACTC ACAZATTCCAG GAACAAAAAA CA;'TGCCTAAG 3977

TATAATATAA AAA<A?'TATCA TACTTTAAAA CTCTCTTTTG CATATAAAAA CGACGGAGTAGG 9977

TTTAAATTAA AAAATCCAAA TTTAAACAAA TGGaGCTTTG GAAAAACTCA AAATCCCAAT 4577

ATATCACTAA CAG CTG GGC GCC GTG TAC ACA GAC GGT GGG TTC GTG GCA 4106

Leu Gly Ala Val T/r Thr Glu Gly Gly Phe Val Giu

10

GGC GTC AAT AAG AAG CTC GGC CTC CTC GGG GGA TTC GGT GGA ATA TTT 4115

Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Le, GGy Ατρ Ssr Val Atp He Phe

20 25 30

AAG GGC ATC CCC TTC GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG 42 02

Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln

40 45

AA A CCT CCT GGC TGG CAA G GT^^AG^^ ATAATAAAAA AATCAACCTC <2211

Pro His Pro Gly Trp Gin

AAAAAAAAAA G^TGA^G^CG AATAAATTAC TAATAAAAAA TACTAACACC TGCAG GG 4 3 08

Gly

CCC CTG AAG GCC AAG CCC TTC AAG AAG AAA TCC CTC CCG GGC ACC AAT 4 3 56

Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Ctg Cys Leu Gin AAa Thr Ile

60 65

CCC CAG GAC AGA ACC TAC dG GAT dAC GAC TCC CTC TAC CTC CCC AAT 1434

Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp du Asp O/s Leu Tyr Leu Ann Ile

75 80 35

TGG GTC CCC CAG AAA AGG AAG CAA G ATTTAAATAC CATCTACTAC 4499

Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln

AAAAAAAACC ATCACATACA GGACATC1AA CdAATTAAT AATAACTTAA ATC'AAAATCC 4509

TAAAAAAATA AACTTAAATA TCAATCCAAA GAdGOm AAAAAAAAAA AAATCCCATT 4569

AAAAAAAATA AAAAAAAATA GGGGAATdA GCACCTCCCT ATATTAACCA CAdCACCTC 4629

CTCCACAGGG AAAAAdAAA dridAGAC AdlGCAdC AAAAAATATA diTCACCAG 4 689

CCAATAACAA TTCCAAG TC TTC CCG GGA CTC CCC GGT ATG ATC TGG AAT 47 3 8

Val Sse Acr Aap Lli Pro Vaa Met Ile Trp IIe

100

TAT GGA GGC GCC TTC CCC ATG «Γ TCC CGC CAT GGG GCC AAC TTC CCC 47 86

Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met GGy Ser GGy His dy Ala Asn Phe Leu

105 110 115 120

AAC AAC TAC CTC TAT GGA GGC GAC GAG ATT GCC ACA CGC GGA AAC GG^ 483 4

Asn Asn Tyr Leu 'T/ir Asp Gly Glu Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Vaa

125 130 135

ATC GTG GTC ACC TTC MA TAC CGT GTC <GGC CCC CTT GGG TTC CTC AAG 4882

Ile Val Val Thr Phe Am Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ssu

140 145 150

ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA G CCCTTCCCCC CCCCCCCCCC 4934

Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro

155

TGCTCTSCCCAAGTCGGTCT TCCCCTCCCT CACCCCTCAC CCCACAAAC^A 4994

CAGCTTTTTC TCTCCCGAAC AACCCCCCCC CTAGTCGTTT 5054

TCGTTAGTTG TCCTCAAAAC CCCCCGCCCG GAGACA^^ ‘rcACCGCCTT 51114

ACTCTTCCTA CTTTTCGTCT CCCACACλCT; CTTTTCACCT GAGCTTCTCA GTTCJAGACC S1T4

CTCCTTCCCA CCACCTGGAT AG^C^TAT CTACACTCCC AST^,CSCAAST ACCTCC:GG;AA 53 4 4

CTTGCTCGTC TGCTASCCCT CCACCTCCCG ACCCCTCCTT CGT:;TAGAlC:A 12244

TTCCT'CTTCT ACCTTACTTA CTJSCCCTCTl CTCTACTAA 53 44

CCTCTCCCCT CCTTCCTTCC T«GTκCGCT TCCCTCTTAA CCCACCTTCT CCGGACdCTC 4144

ATGTATGACA CCTCCCTTCA CTCC^TS3C^CC^C CGACGTrcCG ATCATGCCAC 444 4

TGTCTTTTCT TCTTτCTCCC CCTCTCCAAC TTCCTCCCTC CAACACACAC AAAAAAAAAA 5554

CTCTTCATGT TTGTTCCTCC CTTCCTTTTT TTCTCTcCAC TTCGGCTGTC TCTT'CTGACT 5554

TCCTTTCCTC TCCCCTTTGC CTACATTTGT CTTTCCCCCC GTCCCCTCTC 5565

TTTCTTTCTC TCTCTCTCTT TTTCCTTTTC AACACCACAT TTTTCTGTCC CTCTCTCTCT 55 71

TTCTCCCTTT CTCTTTTTCT CTCTACCTTC TTCCCCCCTC TTTTCTTTCT CTCTCTCTCC 557 7

TCATCCTTTT CTTCATCTCC CTTTTTTGCT CTCCCCTCTT TCTTCCCCCT CTCTGCTGTC 5533

TTTGGTTCTG TTCCTTCTCT TCTTCCTGTT TCTCCCCCCC 5589

TCCCCTTCAC C^ASt^^T TTTTCTCCAC CTCCCCCCGT 5554

TCTGTCTTCC TCTCCCTTCT TCACTCACCC TCCTTCTTTC TTTTTGCTTT 6G14

ATTTTCTTTC TCCCCCCCTT TTCTTTCTTC TTCTACGTCT TTACCCTTCT TTCATTTGTT 660 4

TCTGTCCCGG TTTCACCTCT TCTTCTGGTC TCTTCCTCCC CTCCCTCTCT CTTCTTTTTT 6134

CTTGCTGTTC TTTCTTGGTC CTTTTTTTTC ATTCCTTCCC CTCTCTCCTT TCTCTTCT GT 6194 Gly 160

CCT TAT GGC CTT CGG GAT CAG CAC CTT GCC ATT GCT CTC ACT AGG 6242

Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg

165 170 175

175 404

AAT Asn

ATC Ile

GCG Ala

GCC Ala 180

TTC Phe

GGG Gly

GGG Gly

GAC Asp

CCC Pro 185

AAC Asn

AAC Asn

ATC Ile

ACG Thr

CTC Leu 190

TTC Phe

GGG Gly

6290

GAG

TCT

GCT

GGA

GGT

GCC

AGC

GTC

TCT

CTG

CAG

GTCTCGGGAT

CCCTGTGGGG

6343

Glu

Ser

Ala

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Gln

195

200

AGGGCCTGCC CCACAGGTTG AGAGGAAGCT CAAACGGGAA GGGGAGGGTG GGAGGAGGAG 6403

CGTGGAGCTG GGGCTGTGGT GCTGGGGTGT CCTTGTCCCA GCGTGGGGTG GGCAGAGTGG 6463

GGAGCGGCCT TGGTGACGGG ATTTCTGGGT CCCGTAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC 6518

Thr Leu Ser Pro Tyr Asn

205

AAG GGC CTC

ATC Ile

CGG Arg

CGA Arg 215

GCC Ala

ATC AGC CAG AGC GGC

GTG GCC

CTG AGT Leu Ser 225

Lys 210

Gly

Leu

Ile

Ser

Gln Ser 220

Gly

Val

Ala

CCC

TGG

GTC

ATC

CAG

AAA

AAC

CCA

CTC

TTC

TGG

GCC

AAA

AAG

Pro

Trp

Val

Ile

Gln

Lys

Asn

Pro

Leu

Phe

Trp

Ala

Lys

Lys

230

235

GTAAACGGAG GAGGGCAGGG CTGGGCGGGG TGGGGGCTGT CCACATTTCC GTTCTTTATC 6668 CTGGACCCCA TCCTTGCCTT CAAATGGTTC TGAGCCCTGA GCTCCGGCCT CACCTACCTG 6728

CTGGCCTTGG TTCTGCCCCC AG GTG GCT GAG AAG GTG GGT TGC CCT GTG GGT 6780

Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Yai Gly

	240	245
GAT GCC GCC	AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG GTT	ACT GAT CCC	CGA GCC	6828
Asp Ala Ala 250	Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys Val 255 260	Thr Asp Pro	Ara Ala 265
CTG ACG CTG Leu Thr Leu	GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA GGC Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly 270 275	CTG GAG T Leu Giu	GTGAGTAGCT	6878
GCTCGGGTTG	GCCCATGGGG TCTCGAGGTG GGGGTTGAGG	GGGGTACTGC	CAGGGAGTAC	6938
TCCGGAGGAG TCTCCCCTCG	AGAGGAAGGT GCCAGAGCTG CGGTCTTGTC AAGGCCCCAG CTGTAAGGGA GAGGGGGTGC	CTGTCACCAA CGTTTCTTCT	CTAGCTGGTG	6998 7058
TTTTTTTTGA
GATGGAGTCT	CACTGTTGCC CAGGCTGGAG TGCAGTGTCA	CGATCTCAGC	TCACTGCAAC	7118
CTCCACCTCC	TGGGTTCAAG TGATTCTCTG ACTCAACCTC	CCATGTAGCT	GGGACTACAG	7178
GCACATGCCA	CCATGCCCAG ATAATTTTTC TGTGTGTTTA	GTAGGGATGG	AGTTTCATCG	7238
TGTTAGCTAG	GATGATCTCG GTCTTGGGAC CTCATGATCT	GCCCACCTCG	GCCTCCCAAA	7298
GTGCTGGAAT	TACAGGCGTG AGCCACTGTG CCCGGCCCCT	TCTTTATTCT	TATCTCCCAT	7358
GAGTTACAGA	CTCCCCTTTG AGAAGCTGAT GAACATTTGG	GGCCCCCTCC	CCCACCTCAT	7418
GCATTCATAT	GCAGTCATTT GCATATAATT TTAGGGAGAC	TCATAGACCT	CAGACCAAGA	7478
GCCTTTGTGC	TAGATGACCG TTCATTCATT CGTTCATTCA	TTCAGCAAAC	ATTTACTGAA	7538

175 404

CCGTAGCACT GGGGCCCAGC CTCCAGCTCC ACTATTCTGT ACCCCGGGAA GGCCTGGGGA 7598 CCCATTCCAC AAACACCTCT GCATGTCAGC CTTACCAGCT TGCTACGCTA AGGCTGTCCC 7658

TCACTCATTC TTCTATGGCA ACATGCCATG AAGCCAAGTC ATCTGCACGT TTACCTGACA 7718

TGAGCTCAAC TGCACGGGCT GGACAAGCCC AAACAAAGCA ACCCCCACGG CCCCGCTAGA 7778

AGCAAAACCT GCTGTGCTGG GCCCAGTGAC AGCCAGGCCC CGCCTGCCTC AGCAGCCACT 7838

GGGTCCTCTA GGGGCCCGTC CAGGGGTCTG GAGTACAATG CAGACCTCCC ACCATTTTTG 7898

GCTGATGGAC TGGAACCCAG CCCTGAGAGA GGGAGCTCCT TCTCCATCAG TTCCCTCAGT 7958

GGCTTCTAAG TTTCCTCCTT CCTGCTTCAG GCCCAGCAAA GAGAGAGAGG AGAGGGAGGG 8018

GCTGCCGCTG AAGAGGACAG ATCTGGCCCT AGACAGTGAC TCTCAGCCTG GGGACGTGTG 8078

GCAGGGCCTG GAGACATCTG TGATTGTCAC AGCTGGGGAG GGGGTGCTCC TGGCACCTCG 8138

TGGGTCGAGG CCGGGGATGC TCTAAACATC CTACAGGGCA CAGGATGCCC CTGATGGTGC 819 8

AGAATCAACC CTGCCCCAAG TGTCCATAGA TCAGAGAAGG GAGGACATAG CCAATTCCAG 8258

CCCTGAGAGG CAAGGGGCGG CTCAGGGGAA ACTGGGAGGT ACAAGAACCT GCTAACCTGC 8318

TGGCTCTCCC ACCCAG AC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT 83 66

Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro

280 285

GTC ATT GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC 8414

Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala

290 295 300 305

AAC GCC GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AA 7 ATG GAC GGC 84 62

Asn Ala Aia Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asr. Met Asp Gly

310 315 320

CAC ATC TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG 8510

His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys

325 330 335

AAA GTC ACG GA GTAAGCAGGG GGCACAGGAC TCAGGGGCGA CCCGTGCGGG 8 561

Lys Val Thr Glu

340

AGGGCCGCCG GGAAAGCACT GGCGAGGGGG CCAGCCTGGA GGAGGAAGGC ATTGAGTGGA 8621

GGACTGGGAG TGAGGAAGTT AGCACCGGTC GGGGTGAGTA TGCACACACC TTCCTGTTGG 8681

CACAGGCTGA GTGTCAGTGC CTACTTGATT CCCCCAG G GAG GAC TTC TAC AAG 87 3 4

Glu Asp Phe Tyr Lys

345

CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG 87 32

Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr

350 355 360

ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG 8830

Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gin Asp Pro Ser Gin Glu

365 370 375

AAC AAA

AAG AAG ACC GGC

GCG Val 385

GGA Aap

TCTC GGA

AAC Thr

GAT GCC

CTC Llu

TTCC CTG Phe Leu

3 8~ 8

Asn

Lys 380

Lys

Lys

Thr

Val

Phh

GGu

Asp 390

Val

GCG

CCC

ACC

GAG

ATT

GGC

CCA

GGC

CAG

CAA

AGA

GCC

AAC

GCC

AA

3922

Val

Pro

Thr

Glu

Ile

AAa

Leu

AAa

GGn

His

AAg

Ala

Asn

Ala

Lys

395

400

405

GTGAGGCTCT	GGGCAGCGGG	TGGChCCCGG	GGGCTCTccT	GGGGGCGCCG	ACCTCCCAGC	3982
CGAGGCCTCG	CTGCGGGhGG	CCCTCAGGTG	CCCGGGhTGT	CCCGG^GAA^CG	CGGTGCTTGCG	9042
TCCCCACCCG	TGCCTGCCTG	ACCCCCTTCG	CCGCGGCCTG	GGCAGGACTG	CGGGCCTCTC	9102
TCCACCCCCC	AGCCCACAGG	GCCCCACCAC	CCCCATGCTC	cccctgccctc	CTCAGCCCTG	9162
CACCCCACGG	TCCCCCCCAC	TGGCGCGTCC	TTGAGCTACC	TTTCCATCCCC	CATGCCGCGh	9 2222
GCACTGAGCG	AACACTGGAC	AATCGTCCCT	CCCCACCGAC	'CCTCCCGGGC	CCCAACTCTG	9222
CCCACACCTC	CAGCCCACCA	CCCCACCAAA	AATCCCCCCG	TTAATAATACGC	CCACCAhAAT	9322
AAAAAATAAG	GCCCGCCCCC	GCAGCTCATG	CCGCAATCCC	AGCACACCGG	CGACGTCAAG	9402
GTGGGCGGAT	CACTTGAGGT	CAGGAGTCTG	GCCCAGGCCT	GCCAACACGG	GCAAAACCCC	9462
ACCCCTACCA	AAAATACAAA	AACCATCCCG	GCGCACGGCG	TGAAGGCTAT	TCATCCTAGCT	9 522
ACCCAGGAGG	CTGAGGTAGC	AGACT2CGATC	GAGACCCAGA	AGGGGGAGTT	GCAGTGAGCC	9582
GAGATTACGC	CAChGCCCTC	CAGCAGGGGC	AAAACAGAGA	GGACTGCGCT	CGAATAAATC	9642
AGCAAACAAA	CAChCCAAAT	AAAAAATAAG	TTACGGGATAC	CGAAAAAGTT	GGAAGATAAC	97 02
AGCATACCCA	GAAGTCTAGG	ATGAAAtGCTC	TCCGACGGCACT	AAAGCCGCAC	TTTAGCCGCG	9762
AGCCTCCCCT	CCGTCAAGGC	AAAAAGGGAA	ACAGAGTTACAG	GGCCTCCACC	TCGCCCACCC	9922
AATCGAAGAA	TGCACATTCA	CTCGGAGCGC	AAAAACTTCr	TCCGCTACTG	AACCCACTAC	9882
GAAGGTCCCT	CACAATCCTC	TGCGGAGGCG	CACCACAACh	TCCCGCCGAA	TChGCGGAAC	9942
CCCGCCCCCA	TGCACCTGGh	TChCCGCCTT	CCCCCCCCCG	GGGCGCAAGC	GGCCCCCCCC	10002
CCCATGCGAC	TTCCCCAGAC	CCTTCCCCCC	CCCCACTGCG	GGGACCCCCC	CCCAAGCCCG
TCCChGGGCT	GACCGGCCCC	CAGTGAGCAC	CCCCCGCCCT	TCGGGCGGhC	CCCCCCCCCC	10 122

G G

AGh Ser OO0

GGG Al a

CCC Lls

AAC TTr

TAC T/r

G>C<C Ala 415

TCA TT’y

L ct Llu

T2TT Phe

TCC Ser

CAT His 420

CCC Pro

ccc Ser

CGC Arg

ATG Met

11019

CCC

GCC

TAC

CCC

AAC

TGG

GTG

^^G

GGC

GAC

CAT

GCA

GAC

GCC

ATT

CCG

11027

Pro

Val

Tyr

Pro

Lls

Trp

Val

CGy

AAa

Asp

His

Ala

Csp

Asp

Ile

Gin

425

430

435

OO0

TAC

GTC

TTC

CGGG

TACA

CCC

ctc

GGC

AAC

CCC

CCG

GGC

TCC

CGG

CCC

CAA

H065

Tyr

Val

Phe

GGy

Lls

Pro

Phe

AAa

Thh

Pro

Thr

Gly

Cyr

Arg

Pro

Gln

445

450

455

10313

GAC AGG ACA GTC 'TCT AAG GCC AAC ACC GCC CCC TGG ACC AAC TCC GCC

Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Mee He Ala Cyr Crp Thr Asn Phe Ala

034 465 470

175 404

AAA ACA AC TCACTACTCT GCTTTACTTC CTGTCTTATT TTCACCTCCT 10311

Lys Thr Gly

475

ACAGCGACCT	TCTCCCCCCC	GACTTTAChC	CCCCCCCCTC	CCTCTTCTGT	GCh,hhCTCCA	10421
CTTTCCCCCC	TTTTCCCCCT	CATCCCCCTlC	catctttctt	TCGTGGTCAG	AGTTSACCAjC	10481
AAACTCTTAA	TTTTCCTCCT	GTCCACAGCC	AGTCCCCAGT	GTCCAGTCAC	(ΑΑΧλΆΑΓαϊ	10541
TTCCTTTCCC	TCTCACACGA	CCATACCTC	TCACTCGTCC	ATGTGTACAG	AACCAGCTTGA	10601
GCTCTTCATA	CTCCCCCcTT	CCCTCCCCAG	CCTCTTCTTA	CTCTCCAG C	ACC CCC Asp Pro	1.06556

AAC CTT GGC

CAC Asp

TCC GGC Sst Ala

GTC Val

CCC Ppo 485

ASA CAC

TGG GAA TTC TTC

AAC Th

AAC Th

10770

Asn

Met

Gly 480

Th

His

Trp

Gilu

Pro 490

T/r

GAG

AAC

AGA

CTC

TTC

CCT

GAG

ATC

AAC

CSC

AAG

ATT

CCC

AAG

AGC

TCC

11775

Glu

Asn

See

G Ty

lyr

Lee

Glu

Ile

Th

Lys

Lys

Met

Tly

Ser

See

See

495

500

505

ATA

AAA

CGG

GGC

CCT

AGA

ACC

AAC

TT^

CTC

CCC

TAT

TCT

ASC

CCT

AAC

11880

Met

Lys

Ar a

See

Lee

Asg

Thr

Asn

Phe·

Leu

Arg

Tyr

Trp

Th

Lee

Thh

510

515

520

525

TAT

CTC

GCG

CTT!

CCC

ACA

TTG

ACC

GAC

CAT

CAT

TTT

ATT

CCT

gct:

CCC

11088

Tyr

Leu

Ais

Ilu

Pro

TTh

Val

Thr

Asp

Tin

Clu

Ala

Thr

Ppo

Vaa

Pro

530

535

550

CCT

ACA

g<cc

GAC

TCC

GAG

ACC

ACT

CCC

CTC

CCC

TTT

ACC

(TA

GAG

TCC

110966

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

GCu

Ala

Th.1T

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

GCy

Asp>

Ser

545

550

555

AAT

ATC

GCC

CCC

gtc

CCG

CCC

ACG

GCT

TAC

tta

TGG

GCC

CCC

CCC

GTC

10944

Clu

Thr

Ala

Cro

Vaa

Pro

Pro

Tr

Gly

Asp

Ser

Tly

Ala

Pro

Pro

Val

560

565

570

CCT

TTT

ACG

(ATT

GAC

'TCC

TTT

GCT

CCC

CCC

CTC

CCT

CCC

ACG

CTT

GAC

10992

Pro

Pro

Thr

Gly

Hp

Ser

Tly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Th

Gly

Asp

57 5

seo

585

TCC Ser 590

AAA Tly

GCG Ais

CCC Pro

CCC Pro

GTC Vaa 595

TCT Pro

CCC Ppo

ACG Thr

ctt T xy

CSC Asp 600

TCT Ser

TCG Tly

GGC Ala

CCT Ppo

CCC Pro 605

11140

GTA

CCA

CCC

ACG

(TT

GCC

TCT

CCCC

GCA

ATT

ACA

TTT

CCC

CCC

ACG

CTT

11088

Val

Fro

Pro

Thh

GCy

Asp

Ser

GCy

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Ppo

Thh

Gly

610

615

660

AGC

TCC

GOC

GCC

CCC

CTC

CTC

CCG

CCC

GAT

TAT

CGT

TCC

GCC

GCC

CCC

11136

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Ppo

Val

Pro

Pro

Thr

Tly

Gsp

Ser

GCy

Ala

Pro

625

€30

665

CCC

CTG

CCG

CCC

ACG

(TT

CAT

GCC

ccc;

AAA

CAT

TTT

CTC

CCG

CCC

ACG

11184

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

GCy

Gsp

Ala

Gly

Pro

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Tr

640

645

650

AAT

CAC

TCC

(AGC

(ACC

ccc:

TTT

GTC

CCG

AAC

AAT

TGT

CGC

•TCC

(CTG

GCC

11232

Aly

Gsp

Ser-

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pito

Pro

Thr

Tly

Asp

Ser

Gly

Ala

655

660

(665

175 404

CCC Pro 670

CCC Pro

GTG Val

ACC Thr

CCC Pro

ACG Thr 675

GGT Gly

GAC Asp

TCC Ser

GAG Glu

ACC Thr 680

GCC Ala

CCC GTG

CCG Pro

CCC Pro 685

11280

Pro

Val

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCT

GTG

CCC

CCC

ACG

GGT

GAC

TCT

GAG

11328

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly 690

Ala

Pro

Pro

Val

Pro 695

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser 700

Glu

GCT

GCC

CCT

GTG

CCC

CCC

ACA

GAT

GAC

TCC

AAG

GAA

GCT

CAG

ATG

CCT

11376

Ala

Ala

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Asp

Asp

Ser

Lys

Glu

Ala

Gin

Met

Pro

705 710 715

GCA GTC ATT AGG TTT TAGCGTCCCA TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT 11431

Ala Val Ile Arg Phe

720

GGGACCCCAG GGGCTCCCCT CCCATCTTGA GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTG 11491

TCGGTGTCTT TCTTTGCTCC CAAGGCTAAG CTGCAGGATC 11531

175 404

XBSSL5A

175 404

A B C D

175 404

u — υ o — υ

θ'— θ'			υ —	u
0— <0			υ	Ρ
cn— cn			Ρ —	Ρ
u σ' υ ρ			0 ο—	u υ
u— υ		cn— σ»	ο—	ο
0- <0		0- 0	0 —	0
p—P		υ — ο	υ —	υ
aj— «3		υ— υ	υ—	υ
aj— as		υ— υ	υ—	υ
aj— aJ		Ρ — Ρ	υ —	υ
+J-p		υ— υ	θ'	υ
aj— <J	P—P	θ'— cn	σ'	Ρ
υ — u u — υ	jji-&	Ρ — Ρ ο — ο	u — υ—	υ υ
p— p	θ'— θ'	Ρ—Ρ	υ—	υ
υ— o	σ'— σ'	υ— υ	σ'—σ»
cn— cn	ρ °	υ—υ	Ρ	0
aj — <J	σ' u	cn— σ'	υ—	υ
o— υ	Ρ—Ρ	ρ σ»	υ—	υ
u — υ	υ — υ	υ— υ	ο	σ'
p— P	0- 0	ο—υ	0-	0
0 P	υ — υ	0- 0	υ—	υ
σ>— en	cn— σ'	β σ'	σ'	•
bv— cn	ρ —Ρ	u — 0	Ρ	•
P—P	σ*— σ'	υ—ο	cn	•
p—P	σ'—σ»	θ'— θ'	ρ—	Ρ
u — υ	0- 0	Ρ — Ρ	0 —	υ
υ—υ	ο—υ	Ρ 0	0-	0
aj— <o	0-0	υ—ο	υ—	0
QPl— θ'	υ — ο	υ—ο	σ'—σ'
Ρ—P
	r-t	r-Ι (Μ	00
00 r-<		00 00	(Μ	ίΜ
kt m	»-4 «Μ		<Ν	CJ

I I I I I I I

SJ

\^Q o — o cn— en <0 — <3 <9—O

	0	σ’	θ'	υ	u —	ο
ο —	ο	σ'— σ»	Ρ	υ	cn— σ'
0 —	0	0	-0	0-	0	ρ—	Ρ
θ'	0	u	— ο	0 —	υ	θ'	υ
Ρ —	Ρ	υ	Ρ	0-	0	Ρ	υ
σ'	0	υ	— ο	u—	υ	Ρ —	Ρ
0 —	0	Ρ	θ'	ο —	υ	u—	u
υ—	υ	Ον—— Βΐ	θ'— σ'	ο—	u
0-	0	Ρ	—Ρ	ο—	0	σ'— σ»
0>— ζρ	υ	— 0	0 —	υ	ρ—	Ρ
Ρ —	Ρ	Ρ	—Ρ	Ρ —	Ρ	υ—	υ
σ«	ιη	rd	ο	ο	ιη	Ή	σ'
Ό	Ό	r*	ιη	r-i	00	σ»	*Χ>
ΓΜ	(Μ	<η	η	Ό·	ΠΊ		«?
1	1	1	1	1	I	1	I

8h ta

o

-o

Osi

- I

UJ \

m . i

LU .o o

-o <s- I

Sekwencja flankująca 5' genu CEL

-1—i—i—i—|—1~

V emzozs ggo nuaL τ—i—i—i—i—i—i—|—i—i—i—i—i—r

S eCouewSps

I

I

175 404

u

υ

175 404

Ν m

rH

Π3

Tl tn ttf •H

O

Ml U <	i	8	8
O	«c	f·	o
u <	8
u	o	u	3
	< % u f )	<* 8	δ g
<	8		<

0	U	U		|b	U	*3
O	o	O	o	o	o	o
<s>						t?
r*	<0	m		m	w	oH

o

53»

I

U

U

C3

C3 o

δ

U <H

o o

o o

o o

o

175 404

Λ

Λ!

+J

C φ

ε

CP

Φ

Η

Κ ε

(0 m

ο φ σ>

•Η φ c 3 φ ο •Η ·Η 3 C φ ·Η Ρ r—| -Ρ

pS283

Φ

Ο

Η

Ο χη <υ>

Ν υ

C $

φ

-Η

C

Φ •Η

Φ ρ

Ε->

Ii BamHI. Izolowanie

Izolowanie fragmentu 4.7kb I ftagmentu

BamHI BamHI ’ BamHI

S ο

ζ

175 404

175 404 transformacja

-Q λ:

CM m

4J c

BamH!

ΝοΗ

ΝοΗ

Fig. 7.

tj 5	pS452	~F -o
	218kb

^Gen₀ mowy

BamHI

175 404

175 404

Fig.9A

Notl

L

Kpn1 ludzki \

Sali —r dgenomowy DNA BSSL

Not1

-148 +398

Fig.9B
Primer	Sekwencja ( 5'-3')
5'-primer	CTGTGTGGCAAGAAGGAAGTGTTGT
3' -primer	CAACTCCTGACCTCAAGTGATC

Fig. 9 C

	M12345678	9 10 Ή 12 13 M
2.0-	w i>O	§
1.0-	—	- ·
0.5-	C3#>

548 bp

175 404

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 6,00 zł

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wyizolowana cząsteczka DNA kodująca funkcjonalne białko BSSL/CEL i zawierająca sekwencje intronowe, znamienna tym, że cząsteczka DNA hybrydyzuje z sekwencją DNA, przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ ID Nr:1, w ostrych warunkach hybrydyzacji.
2. 2. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, o sekwencji DNA przedstawionej w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ ID Nr: 1.
3. 3. Sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL, znamienny tym, że (a) wprowadza się przez insercję wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą funkcjonalne białko BSSL/CEL hybrydyzującą z sekwencją DNA przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ ID Nr:1, w ostrych warunkach hybrydyzacji, do wektora zdolnego do replikacji w odpowiedniej komórce gospodarza; (b) wprowadza się wytworzony wektor rekombinantowy do komórki gospodarza: (c) prowadzi się wzrost tej komórki w pożywce lub na podłożu hodowlanym, w którym zachodzi ekspresja tego polipeptydu; (d) odzyskuje się polipeptyd.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako cząsteczkę DNA stosuje się cząsteczkę DNA przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja ID Nr: 1.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako wektor stosuje się replikujący się wektor ekspresyjny będący nośnikiem cząsteczki DNA kodującej ludzkie białko BssL/CEL i wykazujący zdolność pośredniczenia w ekspresji tej cząsteczki DNA.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresyjny zdolny do kodowania funkcjonalnego biologicznie białka BSSL/CEL i zawierający elementy regulacyjne kierujące ekspresję do gruczołu mlecznego ssaka (nie człowieka).
7. 7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę pochodzącą z organizmu wielokomórkowego.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako komórkę organizmu wielokomórkowego stosuje się komórkę ssaka.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako komórkę ssaka stosuje się komórkę ssaka zawierającą układ ekspresyjny.
10. 10. Sposób według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że jako komórkę ssaka stosuje się komórkę ssaka (nie człowieka) będącą komórką embrionalną.
11. 11. Sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL, znamienny tym, że (a) wprowadza się przez insercję wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą funkcjonalne białko BSSL/CEL hybrydyzującą z sekwencją DNA przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ ID Nr:1, w ostrych warunkach hybrydyzacji, do wektora zdolnego do replikacji w odpowiedniej komórce gospodarza; (b) wprowadza się wytworzony wektor rekombinantowy do komórki gospodarza: (c) prowadzi się wzrost tej komórki w pożywce lub na podłożu hodowlanym, w którym zachodzi ekspresja tego polipeptydu; (d) odzyskuje się polipeptyd.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako cząsteczkę DNA stosuje się cząsteczkę DNA przedstawioną w wykazie sekwencji jako sekwencja ID Nr: 1.
13. 13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako wektor stosuje się replikujący się wektor ekspresyjny będący nośnikiem cząsteczki DNA kodującej ludzkie białko BssL/CEL i wykazujący zdolność pośredniczenia w ekspresji tej cząsteczki DNA.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresyjny do kodowania funkcjonalnego biologicznie białka BSSL/CEL i zawierający elementy regulacyjne kierujące ekspresję do gruczołu mlecznego ssaka (nie człowieka).
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się wektor będący wektorem p5452/DSM 7499/.

    175 404