SK286993B6 - DNA sekvencie používané pri produkcii rekombinantnej BSSL/CEL u transgénnych cicavcov, ktorými nie sú ľudia, a produkované BSSL/CEL v dojčenskej výžive - Google Patents

DNA sekvencie používané pri produkcii rekombinantnej BSSL/CEL u transgénnych cicavcov, ktorými nie sú ľudia, a produkované BSSL/CEL v dojčenskej výžive Download PDF

Info

Publication number
SK286993B6
SK286993B6 SK1486-94A SK148694A SK286993B6 SK 286993 B6 SK286993 B6 SK 286993B6 SK 148694 A SK148694 A SK 148694A SK 286993 B6 SK286993 B6 SK 286993B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
human
cel
bssl
lipase
gene
Prior art date
Application number
SK1486-94A
Other languages
English (en)
Other versions
SK148694A3 (en
Inventor
Karl Gunnar Bjursel
Peter Nils Ivar Carlsson
Sven Curt Magnus Enerb�Ck
Stig Lennart Hansson
Ulf Fredrik Pontu Lidberg
Jeanette Annika Nilsson
Jan Birger Fredrik T�Rnell
Original Assignee
Arexis Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from SE9201809A external-priority patent/SE9201809D0/xx
Priority claimed from SE9201826A external-priority patent/SE9201826D0/xx
Priority claimed from SE9202088A external-priority patent/SE9202088D0/xx
Priority claimed from SE9300902A external-priority patent/SE9300902D0/xx
Application filed by Arexis Ab filed Critical Arexis Ab
Publication of SK148694A3 publication Critical patent/SK148694A3/sk
Publication of SK286993B6 publication Critical patent/SK286993B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/20—Dietetic milk products not covered by groups A23C9/12 - A23C9/18
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Predložený vynález sa týka DNA molekuly, obsahujúcej intrónové sekvencie a kódujúcej ľudský proteín, ktorý je, v závislosti od miesta pôsobenia, nazvaný lipáza stimulovaná žlčovými soľami (BSSL) alebo karboxyester lipáza (CEL). DNA molekula je s výhodne použitá pri produkcii rekombinantnej ľudskej BSSL/CEL, výhodne pomocou produkcie transgénnych cicavcov, ktorými nie sú ľudia. Rekombinantná ľudská BSSL/CEL môže byť použitá ako zložka dojčenských výživ používaných na kŕmenie dojčiat ako náhrada ľudského mlieka.

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka DNA molekuly, obsahujúcej intrónové sekvencie a kódujúcej ľudský protein, ktorý je, v závislosti od miesta pôsobenia, nazvaný lipáza stimulovaná žlčovými soľami (bile salt-stimulated lipase - BSSL) alebo karboxyester lipáza (carboxyl ester lipase - CEL). DNA molekula sa výhodne používa pri produkcii rekombinantných BSSL/CEL, výhodne prostredníctvom produkcie transgénnych cicavcov, ktorými nie sú ľudia. Rekombinantné ľudské BSSL/CEL sa môžu použiť ako zložka prípravkov pre dojčatá, ktoré sa používajú na kŕmenie dojčiať ako náhrada materského mlieka.
Doterajší stav techniky
Hydrolýza lipidov obsiahnutých v potrave
Lipidy obsiahnuté v dennom prídele potravy sú dôležitým zdrojom energie. Triacylglyceroly, ktoré sú energeticky bohaté, tvoria viac ako 95 % týchto lipidov. Niektoré z týchto lipidov, napríklad určité mastné kyseliny a vitamíny rozpustné v tukoch, sú podstatnými zložkami potravy. Pred gastrointestinálnou absorpciou triacylglyceroly ako aj minoritné zložky, t. j. esterifikované vitamíny rozpustné v tukoch a cholesterol, a diacylfosfatidylglyceroly, vyžadujú hydrolýzu esterových väzieb, za zvýšenia množstva menej hydrofóbnych, absorbovateľných produktov. Tieto reakcie sú katalyzované špecifickou skupinou enzýmov nazývaných lipázy.
U dospelých ľudí základné lipázy zahŕňa žalúdočnú lipázu, pankreatickú colipázu-závislú lipázu /hydrolýza tri- a diacyl- glycerolov/, pankreatickú fosfolipázu A2 /hydrolýza diacylfosfatidylglycerolov/ a karboxyester lipázu /CEL/ /hydrolýza cholesteryl- a esterov vitamínov rozpustných v tukoch/. V prípade dojčenských novorodencov má podstatnú úlohu pri hydrolýze niektorých uvedených lipidov lipáza stimulovaná žlčovými soľami (BSSL). Spolu so žlčovými soľami tvoria produkty lipidového štiepenia zmesové micely, z ktorých prebieha absorpcia.
Lipáza stimulovaná žlčovými soľami
Ľudská laktujúca mliečna žľaza syntetizuje a sekretuje s mliekom lipázu stimulovanú žlčovými soľami (BSSL) (Bláckberg a kol., 1987) a po špecifickej aktivácii primáme žlčových solí, poskytuje dojčenému dieťaťu endogénnu kapacitu intestinálneho štiepenia tukov. Tento enzým, ktorý tvorí približne 1 % celkového mliečneho proteínu (Bláckberg a Hemell, 1981), nie je degradovaný počas prechodu s mliekom žalúdkom a v duodenálnom obsahuje chránený žlčovými soľami pred inaktivovaním pankreatickou proteázou, ako je trypsín a chymotrypsín. Napriek tomu je inaktivovaný, ak je mlieko pasterizované, napr. zahriate na 62,5 °C, počas 30 minút (Bjorksten a kol., 1980).
Modelové pokusy in vitro potvrdzujú, že konečné produkty štiepenia triacylglycerolu sú rozdielne v prítomnosti BSSL (Bembáck a kol., 1990, Hemel a Bláckberg, 1982). Vďaka nižším intraluminálnym koncentráciám žlčových solí počas neonatálneho obdobia môže byť toto prínosom pre absorpciu produktu.
Karboxyester lipáza
Karboxyester lipáza /CEL/ ľudskej pankreatickej šťavy (Lombardo a kol., 1978) sa javí ako funkčne identická alebo veľmi podobná BSSL (Bláckberg a kol., 1981). Podieľajú sa taktiež na bežných epitopoch, majú identické N-terminálne aminokyselinové sekvencie (Abouakil a kol., 1988) a sú inhibované inhibítormi serin esteráz, napr. eserínom a diizopropylfluórfosfátom. V štúdiách z posledného obdobia boli charakterizované cDNA štruktúry tak mliečnej lipázy ako lipázy pankreasu (Baba a koľ, 1991, Hui a kol., 1991, Nilsson a kol., 1990, Reue a kol., 1991) a záverom je, že mliečny enzým a pankreatický enzým sú produktmi toho istého génu (v tejto prihláške označovaný ako CEL gén, EC 3.1.1.1). cDNA sekvencie a dedukované aminokyselinové sekvencie CEL génu sú opísané vo WO 91/15 234 (Oklahoma Medical Research Foundation) a vo WO 91/18 923 (Aktiebolaget Astra).
CEL je takto hodnotená ako indentická s BSSL a polypeptid kódovaný CEL génom je v predloženej súvislosti nazývaný BSSL/CEL.
Lipidová malasorpcia
Zvyčajnými prípadmi lipidovej malasorpcie a tým malnutrície sú zníženie intraluminálnej hladiny pankreatickej kolipáza-dependentnej lipázy a/alebo žlčové soli. Typickými príkladmi takejto lipázovej deficiencie sú pacienti, ktorí trpia cystickou fibrózou, bežnou genetickou poruchou, vedúcou k dlhodobej deficiencii u 30 % pacientov a chronickej pankreatitíde, často vďaka chronickému alkoholizmu.
Súčasné liečenie pacientov, trpiacich nedostatkom pankreatickej lipázy, je orálne podanie veľmi veľkých dávok surového prípravku pankreatických enzýmov ošípaných. V každom prípade je kolipáza - závislá pankreatická lipáza inaktivovaná nízkym pH prevládajúcim v žalúdku. Tento efekt nemôže byť celkom prekona
SK 286993 Β6 ný použitím vysokých dávok enzýmu. Vysoké podávané dávky sú takto neadekvátne pre väčšinu pacientov a okrem toho sú prípravky nečisté a nepríjemnej chuti.
Boli formulované určité tablety, ktoré prechádzajú kyslými oblasťami žalúdka a uvoľňujú enzým len v relatívne alkalickom prostredí lačnika. V každom prípade mnoho pacientov trpiacich pankreatickými chorobami má abnormálne kyslý lačník, a v takýchto prípadoch tablety nemusia uvoľňovať enzým.
Navyše, pretože prípravky v súčasnom období dostupné na trhu sú z iných zdrojov ako ľudských, jestvuje tu nebezpečenstvo imunoreakcií, čo môže vyvolávať nežiaduce účinky u pacientov, alebo viesť ku zníženej účinnosti liečby. Ďalšou nevýhodou jestvujúcich prípravkov je, že obsahujú i iné lipolytické aktivity ako kolipáza - závislá lipáza. V skutočnosti obsahujú veľmi malé hladiny BSSL/CEL-aktivity. Toto môže byť príčinou, prečo mnoho pacientov, trpiacich cystickou fibrózou napriek doplnkovej terapii, trpí na nedostatok vitamínov rozpustných v tukoch a nedostatok esenciálnych mastných kyselín.
Existuje tu preto potreba produktov s vlastnosťami a štruktúrou odvodenou od ľudských lipáz a so širokou substrátovou špecifitou, ktoré by sa mohli podávať pacientom trpiacim nedostatočnosťou jedného alebo niekoľkých pankreatických lipolytických enzýmov. Produkty, ktoré sa môžu získať použitím predloženého vynálezu, v plnej miere napĺňajú túto potrebu samy osebe alebo v kombinácii s prípravkami, obsahujúcimi iné lipázy.
Prípravky pre dojčatá
Je dobre známe, že dojčenie detí sa považuje za vynikajúce, pokiaľ sa jedná o zloženie potravy pre dojčatá. Ľudské mlieko nielen poskytuje veľmi dobre vyvážené podávané živiny, ale dojčatá ich tiež ľahko trávia. Niektoré biologicky aktívne zložky, o ktorých je známe, že majú fyziologické funkcie u dojčiat, sú alebo zložkou materského mlieka alebo sú produkované počas jeho trávenia, zahrnujú zložky pôsobiace pri obrane proti infekcii a zložky uľahčujúce príjem živín z materského mlieka.
Napriek veľkému úsiliu, ktoré bolo vynaložené na prípravu prípravkov pre dojčatá, nie je možné pripraviť také zloženie, ktoré by malo rovnaké podstatné výhody ako ľudské materské mlieko. Dojčenské prípravky, pripravované často na báze kravského mlieka, sa zvyčajne u dojčiat neúplne štiepia a chýbajú im substancie, známe ako látky pôsobiace na fyziologické funkcie dojčiat. Na účely získania dojčenskej výživy s nutritívnou hodnotou podobnou ľudskému mlieku, je množstvo aditív, vrátane proteínových fragmentov, vitamínov, minerálov atd’., ktoré sú bežne prítomné alebo sa získavajú počas štiepenia ľudského mlieka kojencom, zahrnutých v dojčenskej výžive, s nebezpečím zvýšeného namáhania alebo možného dlhodobého poškodenia dôležitých orgánov, ako je pečeň a obličky. Inou nevýhodou spojenou s použitím výživ na báze kravského mlieka je zvýšenie rizika vyvolania alergie u dojčiat voči hovädzím proteínom.
Ako alternatíva ku dojčenským výživám na báze kravského mlieka bolo použité ľudské mlieko, ktoré sa dá získať z takzvaných mliečnych bánk. Ale kŕmenie novorodencov mliekom z mliečnych bánk sa v posledných rokoch zavrhuje pre obavu z prítomnosti ingekčných činidiel, ako je HIV a CMV v ľudskom mlieku. Na účely zničenia infekčných činidiel v ľudskom mlieku sa javí byť ako nevyhnutné pasterizovanie mlieka pred použitím. Akokoľvek, pri pasterizácii sa nutričná hodnota a biologické účinky zložiek mlieka znižujú, napríklad BSSL je inaktivovaná, ako bolo uvedené.
Prídavok lipázy ku dojčenskej výžive
Funkcie podžalúdkovej žľazy a pečene nie sú pri narodení plne vyvinuté, najmä u predčasne narodených novorodencov. Tuková malasorpcia, z fyziologických dôvodov, sa bežne vyskytuje a predpokladá sa, že vzniká z nízkej intraluminálnej pankreatická kolipáza-depentnej lipázy a žlčových solí. Akokoľvek, z dôvodu BSSL, je takáto malasorpcia menej častá u dojčených novorodencov ako u novorodencov kŕmených pasterizovaným mliekom alebo dojčenskou výživou (Bemback a spol., 1990).
Po vylúčení uvedených nevýhod spojených s pasterizovaným mliekom a dojčenskou výživou na báze hovädzieho mlieka, by bolo žiaduce pripraviť dojčenské výživy so zložením čo najbližším ľudskému mlieku, t. j. výživy, obsahujúce proteíny ľudského mlieka.
BSSL/CEL má niektoré jedinečné vlastnosti, ktoré ju robia ideálne vhodnou na doplnenie dojčenskej výživy:
- Bola formulovaná na orálne podávanie. Je rezistentná pri prechode žalúdkom a je aktivovaná v obsahu tenkého čreva.
Jej špecifický mechanizmus aktivácie by mal brániť nebezpečnej lipolýze potravinových alebo tkanivových lipidov počas uchovávania a prechodu na miesto ich pôsobenia.
Vďaka svojej širokej substrátovej špecifickosti je schopná, sama osebe, sprostredkovať kompletné štiepenie väčšiny potravinových lipidov, vrátane esterov vitamínov rozpustných v tukoch.
- BSSL/CEL môže byť vynikajúcou pre pankreatická kolipáza-dependentná lipáza pre hydrolýzu esterových väzieb obsiahnutých v polynenasýtených mastných kyselinách s dlhým reťazcom.
V prítomnosti žalúdočnej lipázy a v jej neprítomnosti, alebo pri nízkych hladinách kolipáza-dependentnej lipázy, môže BSSL/CEL uskutočniť kompletné triacylglycerolové štiepenie in vitro, aj keď sú hladiny žlčo vých solí také nízke, ako je tomu u novorodencov. V prítomnosti BSSL/CEL konečné produkty triacylglycerolového štiepenia sú skôr voľné mastné kyseliny a voľný glycerol, než voľné mastné kyseliny a monoacylglycerol generovaný inými dvoma lipázami (Bembáck a spol., 1990). Toto sú priaznivé podmienky pre absorpciu, predovšetkým keď sú intraluminálne hladiny žlčových solí nízke.
Využitie BSSL/CEL na doplnenie dojčenskej výživy v každom prípade vyžaduje dostupnosť veľkých množstiev produktov. I keď proteíny ľudského mlieka sa môžu čistiť priamo z ľudského mlieka, nie je to reálna a dostatočne ekonomická cesta na získanie veľkých množstiev potrebných na výrobu dojčenskej výživy vo veľkom a je potrebné vyvinúť iné metódy, aby mohla byť pripravovaná dojčenská výživa, obsahujúca proteíny ľudského mlieka. Predložený vynález poskytuje takéto metódy na prípravu BSSL/CEL vo veľkých množstvách.
Produkcia proteínov v mlieku transgénnych zvierat
Izolácia génov, kódujúcich farmakologicky aktívne proteíny, umožnila zlacniť produkciu takýchto proteinov v heterológnych systémoch. Príťažlivým expresným systémom pre mliečne proteíny je transgénne zviera (prehľad pozri Hennighausen a kol., 1990). Diétne prípravky, obsahujúce žlčové soli aktivujúcu lipázu získané napr. technológiou transgénnych zvierat, sú opísané v EP 317 355 (Oklahoma Medical Reseach Foundation).
Do transgénneho zvieraťa môže byť proteín kódujúca sekvencia zavedená ako cDNA alebo ako genómová sekvencia. Pretože intróny môžu byť nevyhnutné pre riadenú génovú expresiu pri transgénnych zvieratách (Brinster a spol., 1988, Whitelaw a spol., 1991), je v mnohých prípadoch výhodné použiť skôr genómovú formu ako cDNA formu štruktúrneho génu. WO 90/05 188 (Pharmaceutical Proteins Limited) opisuje použitie transgénnych zvierat pre proteín kódujúcu DNA, obsahujúcu aspoň jeden, ale nie všetky intróny, prirodzene sa vyskytujúce v géne, kódujúcom proteín.
Objektom predloženého vynálezu je poskytnúť prostriedky na produkciu ľudskej BSSL/CEL, vo vysokom výťažku a za reálnu cenu, na použitie v dojčenských výživách s cieľom vylúčiť nevýhody spojené s pasterizovaným mliekom a výživami na báze proteínov hovädzieho dobytka.
Podstata vynálezu
Cieľ vynálezu sa dosiahol klonovaním a sekvenovaním ľudského CEL génu. Na účely zlepšenia výťažku BSSL/CEL sa použila získaná DNA molekula, obsahujúca intrónovú sekvenciu, namiesto známej cDNA sekvencie, ľudského CEL génu, na produkciu ľudskej BSSL/CEL pri transgénnych cicavcoch, ktorými nie sú ľudia.
V súlade s tým, v jednom aspekte predloženého vynálezu sa tento týka DNA molekuly znázornenej na zozname sekvencií ako SEQ ID č. 1, alebo analógu tejto uvedenej DNA molekuly, ktorý hybridizuje s DNA molekulou znázornenou v zozname sekvencií ako SEQ ID č. 1, alebo jej špecifickou časťou, za presných hybridizačných podmienok.
Postup použitý na izoláciu molekuly ľudskej BSSL/CEL DNA je uvedený v nasledujúcich príkladoch.
Presné hybridizačné podmienky uvedené skôr je treba chápať v bežnom zmysle slova, t. j., že sa hybridizácia uskutočňuje podľa zvyčajného laboratórneho manuálu, ako je Sambrook a kol., 1989.
V inom aspekte poskytuje predložený vynález expresný systém cicavca obsahujúci DNA sekvenciu, kódujúcu ľudské BSSL/CEL vloženú do génu, kódujúceho mliečny proteín cicavca, ktorým nie je človek, tak, že sa vytvára hybridný gén, ktorý je exprimovateľný v mliečnej žľaze dospelej samice cicavca, nesúceho uvedený hybridný gén, takže ľudská BSSL/CEL je produkovaná, ak je hybridný gén exprimovaný.
V ešte ďalšom aspekte sa predložený vynález týka metódy produkcie transgénneho cicavca, ktorým nie je človek, schopného exprimovať ľudskú BSSL/CEL, ktorá zahrnuje injektovanie epresného systému cicavca, ako je definovaný skôr, do oplodneného vajíčka alebo bunky embrya cicavca, čím sa inkorporuje expresný systém do rozmnožovacej línie cicavca a výsledné injektované oplodnené vajíčko alebo embryo sa vyvíja na dospelú samicu cicavca.
DNA molekula uvedená na zozname sekvencií ako SEQ ID č. 1, ktorá má celkovú dĺžku 11531 bp, má nasledujúce charakteristiky:
Charakteristika od bázy k báze
5>-priliehajúca oblast 1 1640
TATA box íen 1617
exón 1 1641 1727
štart translácie 1653 1653
exón 2 4071 4221
exón 3 4307 4429
exón 4 4707 4904
exón 5 6193 6323
exón 6 6501 6608
exón 7 6751 6868
exón 8 8335 8521
exón 9 8719 8922
exón 10 10124 10321
exón 11 10650 11490
3'-priliehajúca oblast 11491 11531
V tomto kontexte sa výraz „gén“ používa na označenie DNA sekvencie, ktorá je zahrnutá v produkcii polypeptidového reťazca a ktorá zahrnuje oblasti, ktoré predchádzajúce a nasledujúce po kódujúcej oblasti (5' -
- proti smeru a 3' - po smere sekvencie), ako aj vložené sekvencie, takzvané intróny, ktoré sú umiestnené medzi jednotlivými kódujúcimi segmentmi (takzvaných exónmi) oblasť 5' - proti smeru alebo 3' - po smere. 5' -
- oblasť proti smeru obsahuje regulačnú sekvenciu, ktorá reguluje expresiu génu, typicky promótor. 3' - oblasť po smere obsahuje sekvencie, ktoré sú zahrnuté v terminácii transkripcie génu a prípadne sekvencie, zodpovedné za polyadenyláciu transkriptu a 3' netranslátované oblasti.
DNA molekuly podľa vynálezu, ktoré sú tu uvedené, môžu obsahovať prirodzené ako aj syntetické DNA sekvencie, prirodzené sekvencie sú zvyčajne odvodené priamo z genómovej DNA, zvyčajne cicavčieho pôvodu, napr. ako je opísané. Syntetická sekvencia môže byť pripravená konvenčnými metódami pre prípravu synteticky pripravovaných DNA molekúl. DNA sekvencia môže ďalej byť zmiešaného genómového a syntetického pôvodu.
V ďalšom aspekte sa predložený vynález týka replikovateľného expresného vektora, ktorý nesie a je schopný sprostredkovania expresie DNA sekvencie, kódujúcej ľudskú BSSL/CEL.
V predloženom kontexte výraz „replikovateľný“ znamená, že vektor je schopný replikovať sa v danom type hostiteľskej bunky, do ktorej bol zavedený. Bezprostredne proti smeru ľudskej BSSL/CEL DNA sekvencie tu môže byť poskytnutá sekvencia, kódujúca signálny peptid, ktorého prítomnosť zaručuje sekréciu ľudskej BSSL/CEL exprimovanej hostiteľskými bunkami, nesúcimi vektor. Signálna sekvencia môže byť buď prírodné spojenie s ľudskou BSSL/CEL DNA sekvenciou alebo byť iného pôvodu.
Vektorom môže byť akýkoľvek vektor, ktorý môže byť bežne podrobený postupu rekombinantnej DNA a voľba vektora bude často závisieť od hostiteľskej bunky, do ktorej je tento zavádzaný. Takto môže vektorom byť autonómne replikujúci vektor, t. j. vektor, ktorý existuje ako extrachromozomálna entita, ktorého replikácia závisí od chromozomálnej replikácie, príkladmi takýchto vektorov sú plazmid, fág, kozmid, minichromozóm alebo vírus. Alternatívne môže byť vektorom taký vektor, ktorý pri zavedení do hostiteľskej bunky je integrovaný v genóme hostiteľskej bunky a replikovaný spolu s chromozómom/chromozómami do ktorého/ktorých bol integrovaný. Príkladmi vhodných vektorov sú bakteriálny expresný vektor a kvasinkový expresný vektor. Vektor podľa vynálezu môže niesť akúkoľvek z DNA molekúl podľa vynálezu, ako sú definované skôr.
Predložený vynález sa ďalej týka bunky, nesúcej replikovateľný expresný vektor, ako je definovaný skôr. Principiálne môže byť táto bunka akéhokoľvek bunkového typu, t. j. prokaryotická bunka, jednobunkový eukaryotický organizmus alebo bunka odvodená z viacbunkového organizmu, napr. cicavca. Cicavčie bunky sú predovšetkým vhodné na tento účel a podrobnejšie sú diskutované neskôr.
V ďalšom dôležitom aspekte sa vynález týka metódy produkcie ľudskej rekombinantnej BSSL/CEL, v ktorej je DNA sekvencia, kódujúca ľudskú BSSL/CEL, vložená do vektora, ktorý je schopný byť replikovaný v špecifickej hostiteľskej bunke, výsledný rekombinantný vektor je zavedený do hostiteľskej bunky, ktorá je kultivovaná v alebo na vhodnom kultivačnom médiu pri vhodných podmienkach na expresiu ľudskej BSSL/CEL a získa sa ľudská BSSL/CEL.
Médium použité na rast buniek môže byť akékoľvek konvenčné médium vhodné na tento účel. Vhodným vektorom môže byť akýkoľvek z opísaných vektorov a vhodnou hostiteľskou bunkou môže byť akákoľvek z
SK 286993 Β6 uvedených buniek. Metódy použité na konštrukciu vektora a uskutočnenie jeho zavedenia do hostiteľskej bunky môžu byť akékoľvek metódy známe na tieto účely v oblasti rekombmantnej DNA. Rekombinantná ľudská BSSL/CEL exprimovaná bunkami môže byť sekrétovaná, t. j. exportovaná bunkovú membránou, v závislosti od typu bunky a zloženia vektora.
Ak je ľudská BSSL/CEL produkovaná intraceluláme rekombinantným hostiteľom, t. j. nie je sekrétovaná bunkou, môže sa získať štandardnými postupmi, zahrnujúcimi rozrušenie bunky mechanickými prostriedkami, napr. ultrazvukom alebo homogenizáciou, alebo enzymatickými alebo chemickými prostriedkami s nasledujúcim čistením.
Aby bola sekrétovaná, mala by DNA sekvencia, kódujúca ľudskú BSSL/CEL byť predchádzaná sekvenciou, kódujúcou signálny peptid, ktorej prítomnosť zabezpečuje sekréciu ľudskej BSSL/CEL z buniek tak, že prinajmenšom významný podiel exprimovanej ľudskej BSSL/CEL je sekrétovaný do kultivačného média a získaný.
Výhodná metóda podľa predloženého vynálezu na produkciu rekombmantnej ľudskej BSSL/CEL je použitie transgénnych cicavcov, ktorými nie sú ľudia, schopných exkrécie ľudskej BSSL/CEL do ich mlieka. Použitie transgénnych cicavcov, ktorými nie sú ľudia, má tú výhodu, že sa získajú veľké výťažky rekombmantnej ľudskej BSSL/CEL pri prijateľných nákladoch a predovšetkým, ak je týmto cicavcom krava, potom sa rekombinantná ľudská BSSL/CEL produkuje do mlieka, ktoré je normálnou zložkou, napr. dojčenskej výživy, takže nie je nutné nákladné čistenie, ak sa rekombinantná ľudská BSSL/CEL používa ako nutričný doplnok produktov na báze mlieka. Ďalej, produkcia vo vyššom organizme, ako je cicavec, ktorým nie je človek, spravidla vedie ku správnemu opracovaniu cicavčieho proteínu, napríklad vzhľadom na post-translačné opracovanie, ako je diskutované a k vhodnému zloženiu. Taktiež sa môžu získať veľké množstvá v podstate čistej ľudskej BSSL/CEL.
V súlade s tým je ďalším dôležitým aspektom predloženého vynálezu expresný systém cicavca, obsahujúci DNA sekvenciu, kódujúcu ľudskú BSSL/CEL inzertovanú do génu, kódujúceho mliečny proteín cicavca, ktorým nie je človek, takže sa vytvára hybridný gén, ktorý je exprimovateľný v mliečnej žľaze dospelej samice cicavca, ktorý nesie uvedený hybridný gén.
DNA sekvencia, kódujúca ľudskú BSSL/CEL, je výhodne DNA sekvencia, ako je uvedené v zozname sekvencii, ako SEQ ID č. 1 alebo genómový ľudský BSSL/CEL gén, alebo ich analógy.
Mliečna žľaza je tkanivo, kde dochádza k expresii a gény, kódujúce mliečne proteíny, sú vo všeobecnosti považované za predovšetkým vhodné na použitie pri produkcii heterológnych proteínov v transgénnych cicavcoch, ktorými nie sú ľudia, pretože mliečne proteíny sú prirodzene produkované vo vysokých hladinách expresie v mliečnej žlaze. Mlieko sa tiež ľahko zhromažďuje a je dostupné vo veľkých množstvách. V predložených súvislostiach použitie génu mliečnych proteínov pri produkcii rekombmantnej ľudskej BSSL/CEL má tú ďalšiu výhodu, že je produkovaná za podmienok podobných podmienkam, pri ktorých sa produkuje prirodzene, pokiaľ ide o reguláciu expresie a produkcie na určitom mieste /mliečna žľaza.
V predloženom kontexte znamená výraz „hybroidný gén“ DNA sekvencie obsahujúce jednak DNA sekvenciu, kódujúcu ľudskú BSSL/CEL, ako je definovaná a na druhej strane DNA sekvenciu génu mliečneho proteínu, ktorá je schopná sprostredkovať expresiu hybridného génového produktu. Výraz „gén kódujúci mliečny proteín“ označuje celý gén ako aj jeho subsekvencie, schopné sprostredkovať a smerovať expresiu hybridného génu do tkaniva, ktoré je cieľom záujmu, t. j. mliečnej žľazy. Bežne je uvedenou subsekvenciou jedna zo subsekvencií, ktorá nesie aspoň jednu alebo viac promótorových oblastí, miesti štartu transkripcie, 3' a 5' nekódujúcu oblasť a štruktúrne sekvencie. DNA sekvencia, kódujúca ľudskú BSSL/CEL, je výhodne prostá prokaryotických sekvencii, ako sú vektorové sekvencie, ktoré môžu byť spojené s DNA sekvenciou po, napr. ich klonovaní.
Hybridný gén je výhodne formulovaný inzerciou in vitro DNA sekvencie, kódujúcej ľudskú BSSL/CEL do génu mliečneho proteínu použitím techník, ktoré sú známe v odbore. Alternatívne, DNA sekvencia, kódujúca ľudskú BSSL/CEL, môže byť inzertovaná in vivo homológnou rekombináciou.
Normálne DNA sekvencia, kódujúca ľudskú BSSL/CEL, bude inzertovaná do jedného z prvých exónov, výhodne génu mliečneho proteínu alebo jeho účinnej subsekvencie, zahrnujúcej prvé exóny a výhodne podstatnú časť 5' - priliehajúcu sekvenciu, ktorá je považovaná za dôležitú pri regulácii.
Hybridný gén výhodne obsahuje sekvencie, kódujúce signálny peptid, umožňujúce, aby hybridný génový produkt bol sekrétovaný správne do mliečnej žľazy. Signálnym peptidom bude typicky ten, ktorý sa bežne nachádza v géne mliečneho proteínu, ako bol uvedený, alebo ten, ktorý je spojený s DNA sekvenciou, kódujúcou ľudský BSSL/CEL. V každom prípade sú relevantné tiež iné signálne sekvencie, ktoré sú schopné sprostredkovať sekréciu hybridného génového produktu v mliečnej žľaze. Samozrejme by rozličné elementy hybridného génu mali byť fuzované takým spôsobom, aby bola umožnená správna expresia a spracovanie génového produktu. Takto by normálna DNA sekvencia, kódujúca signálny peptid, ako je tu uvedené, mala byť presne fuzovaná ku N-koncovej časti NDA sekvencie, kódujúcej ľudskú BSSL/CEL. V hybridnom géne bude DNA sekvencia kódujúca ľudskú BSSL/CEL normálne zahrnovať jej stop kodón, ale nie miesta jej
SK 286993 Β6 vlastného štiepenia a polyadenylácie. Po smere expresie DNA sekvencie kódujúcej ľudskú BSSL/CEL zostanú bežne zachované mRNA spracovávajúce sekvencie génu mliečneho proteínu.
Mnoho faktorov sa považuje za zodpovedných pre aktuálnu expresiu hladiny jednotlivého hybridného génu. Schopnosť promótora ako aj iných regulátorových sekvencií, ako je uvedené, integračné miesto expresného systému v genóme cicavca, integračné miesto DNA sekvencie, kódujúcej ľudskú BSSL/CEL v mliečnom proteíne kódujúcom géne, elementy udeľujúce post-transkripčnú reguláciu a ďalšie podobné faktory môžu mať životnú dôležitosť pre hladinu získanú expresiou. Na základe znalostí rozličných faktorov ovplyvňujúcich hladinu expresie hybridného génu by mohol odborník v odbore spoznať, ako zostaviť expresný systém vhodný na predložený účel.
Mliečnou žľazou je sekrétovaných mnoho rôznych mliečnych proteínov. Sú známe dve hlavné skupiny mliečnych proteínov, sú to kazeíny a srvátkové proteíny. Zloženie mlieka od rôznych druhov sa mení kvalitatívne aj kvantitatívne, pokiaľ ide o tieto proteíny. Väčšina cicavcov, ktorými nie sú ľudia, produkuje tri rozličné typy kazeínu a to α-kazeín, 0-kazeín a k-kazeín. Väčšinu zvyčajných proteínov kravskej srvátky tvoria oí-laktalbumin a /3-lakalbumín. Zloženie mlieka rozličného pôvodu opisuje Clark a kol. (1987).
Gén mliečneho proteínu, ktorý sa používa, môže byť odvodený od rovnakých druhov, ako je ten, do ktorého expresného systému má byť inzertovaný, alebo môže byť odvodený od iných druhov. V tejto súvislosti je potrebné uviesť, že regulátorové elementy, ktoré smerujú génovú expresiu do mliečnej žľazy, sú funkčne skrížené hraničné druhy, ktoré sú umožnené vďaka spoločnému pôvodu (Henninghausen a kol., 1990).
Príkladmi vhodných génov kódujúcich mliečny proteín alebo jeho účinné subsekvencie, ktoré sa používajú v konštrukcii expresného systému podľa vynálezu, sú bežne sa vyskytujúce srvátkové proteíny rôzneho cicavčieho pôvodu, napr. gén srvátkového kyslého proteínu /WAP/, výhodne myšieho pôvodu, a B-laktoglobulínový gén, výhodne ovčieho pôvodu. Taktiež môžu byť kazeínové gény zistené ako vhodné na transgénnu produkciu ľudskej BSSL/CEL, napr. hovädzí α-Sl -kazeín a králičí B-kazeín. V súčasnom období preferovaným génom je myšací WAP gén, pretože sa zistilo, že poskytuje vysokú hladinu expresie mnohých cudzích ľudských proteínov v mlieku rôznych transgénnych zvierat (Hennig-hausen a kol., 1990).
Inou sekvenciou výhodne spojenou s expresným systémom podľa vynálezu je takzvaná expresiu stabilizujúca sekvencia schopná sprostredkovania vysokej hladiny expresie. Existuje mnoho indikácií o tom, že takéto stabilizujúce sekvencie sa nachádzajú v blízkosti a proti smeru génov mliečneho proteínu.
DNA sekvencia, kódujúca ľudskú BSSL/CEL, ktorá má byť inzertovaná do expresného systému podľa vynálezu, môže byť genómového alebo syntetického pôvodu alebo byť ich akoukoľvek kombináciou. Zistilo sa, že niektoré expresné systémy vyžadujú prítomnosť intrónov a iných regulátorových oblastí na účely získania bezpečnej expresie (Hennighausen a kol., 1990). V niektorých prípadoch môže byť výhodné zavádzať genómové štruktúry, prednostne pred cDNA elementmi, ako polypeptid kódujúci element do vektorových konštrukcií (Brinster a kol.). Intrónová a exónová štruktúra môže viesť k vyšším ustáleným nRNA hladinám, ako sú tie, ktoré sa získajú, ak sa použijú vektory na báze cDNA.
V ďalšom aspekte sa predložený vynález týka hybridného génu, obsahujúceho DNA sekvenciu, kódujúcu ľudskú BSSL/CEL, inzertovanú do génu, kódujúceho mliečny proteín cicavca, ktorým nie je človek. DNA sekvencia je inzertovaná do génu mliečneho proteínu takým spôsobom, že tento je exprimovatelný v mliečnej žľaze dospelej samice cicavca, nesúceho tento hybridný gén. Hybridný gén a jeho zložky boli podrobne diskutované skôr. Hybridný gén tvorí dôležitý medziprodukt v konštrukcii expresného systému podľa vynálezu, ako je uvedené skôr.
V inom aspekte sa predložený vynález týka cicavčích buniek, kde cicavec nie je človek, nesúcich expresný systém definovaný skôr. Cicavčou bunkou je výhodne bunkové embryo alebo pronucleus. Expresný systém je vhodne inzertovaný do cicavčej bunky pri použití metódy objasnenej ďalej a špecificky ilustrovanej v príkladoch.
V ďalšom dôležitom aspekte sa predložený vynález týka metódy produkcie transgénneho cicavca, ktorým nie je človek, schopného expresie ľudskej BSSL/CEL, zahrnujúcej injektovanie expresného systému podľa vynálezu, ako je definovaný, do oplodneného vajíčka alebo bunky embrya cicavca tak, že sa expresný systém inkorporuje do zárodočnej línie cicavca a vývojom výsledného injektovaného oplodneného vajíčka alebo embrya na dospelú samicu cicavca.
Inkorporácia expresného systému do zárodočnej línie cicavca môže byť uskutočnená s použitím akejkoľvek vhodnej techniky, napr. ako je opísaná v „Manipulating the Mouse Emryo“, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986, napríklad môže byť niekoľko sto molekúl expresného systému priamo injektovaných do oplodneného vajíčka, napr. oplodneného jednobunkového vajíčka alebo jeho pronucleus, alebo embryo uvedeného cicavca a mikroinjektované vajíčka môžu byť potom následne prenesené do vajcovodu pseudopregnantnej náhradnej matky a nechajú sa vyvinúť. Normálne sa nie všetky injektované vajíčka vyvinú na dospelú samicu tak, že budú exprimovať ľudské BSSL/CEL. Takto asi polovica cicavcov bude zo štatistického hľadiska samcami, z ktorých sa však v nasledujúcich generáciách budú rodiť samice.
SK 286993 Β6
Ak je integrovaná v zárodočnej línii, môže byť DNA sekvencia, kódujúca ľudskú BSSL/CEL exprimovaná vo vysokých hladinách, pri produkcii správne spracovaných a funkčných ľudských BSSL/CEL v stabilných líniách daných cicavcov.
Ďalším cieľom je metóda produkcie transgénneho cicavca, ktorým nie je človek, ktorý je schopný expresie ľudských BSSL/CEL a v podstate neschopný expresie BSSL/CEL samotným cicavcom, ktorá zahrnuje
a) rozrušenie cicavčej BSSL/CEL exprimujúcej schopnosti cicavca tak, že v podstate nie je exprimovaná žiadna cicavčia BSSL/CEL a inzertovanie expresného systému podľa vynálezu, ako je definované alebo DNA sekvencia, kódujúca ľudskú BSSL/CEL do zárodočnej línie cicavca takým spôsobom, že je ľudská BSSL/CEL exprimovaná v cicavcovi, a/alebo
b) nahradenie cicavčieho BSSL/CEL génu alebo jeho časti expresným systémom podľa vynálezu, ako je definovaný skôr, alebo DNA sekvencie, kódujúcej ľudskú BSSL/CEL.
Schopnosť exprimovať cicavčiu BSSL/CEL je zvyčajne rozrušená zavedením mutácií do DNA sekvencie zodpovednej za expresiu BSSL/CEL. Takéto mutácie môžu zahrnovať mutácie, ktoré vyberajú DNA sekvenciu z rámčeka, alebo zavedenie stop kodómu alebo deléciu jedného alebo viacerých nukleotidov DNA sekvencie.
Gén cicavčej BSSL/CEL alebo jeho časti môžu byť nahradené expresným systémom, ako je definovaný, alebo DNA sekvenciou, kódujúcou ľudskú BSSL/CEL použitím dobre známych zásad homológovej rekombinácie.
V ďalšom aspekte sa predložený vynález týka transgénneho cicavca, ktorým nie je človek, pripraveného opísanou metódou.
I keď transgénny cicavec, ktorým nie je človek, z hľadiska širokého rozsahu vynálezu, nie obmedzený na žiaden typ cicavca, cicavec je zvyčajne vybraný zo skupiny zahrnujúcej myši, potkany, králiky, ovce, ošípané, kozy a dobytok. Pre veľkokapacitnú výrobu ľudskej BSSL/CEL sa zvyčajne uprednostňujú väčšie zvieratá, ako ovce, kozy, ošípané a predovšetkým dobytok, vzhľadom na ich vysokú produkciu mlieka. Ale tiež myši, králiky a potkany môžu byť zaujímavé, z toho dôvodu, že manipulácia týchto zvierat je jednoduchšia a výsledky pri transgénnych zvieratách rýchlejšie, ako keď, sa napríklad, týkajú dobytka.
Taktiež potomstvo transgénneho cicavca, ako je definované, schopné produkcie ľudskej BSSL/CEL, spadá do rozsahu predloženého vynálezu.
V ďalšom aspekte predložený vynález zahrnuje mlieko z cicavca, ktorým nie je človek, obsahujúce ľudskú BSSL/CEL.
V ešte ďalšom aspekte sa predložený vynález týka prípravkov do dojčenskej výživy, ktoré obsahujú rekombinantné ľudské BSSL/CEL, predovšetkým polypeptid podľa vynálezu, ako je definovaný skôr. Dojčenská výživa môže byť pripravená prídavkom rekombinantnej ľudskej BSSL/CEL alebo polypeptidu v čistenej alebo čiastočne vyčistenej forme k normálnym zložkám, ktoré tvoria dojčenskú výživu. V každom prípade je zvyčajne výhodné, že sa dojčenská výživa pripravuje z mlieka podľa vynálezu ako je definované skôr, predovšetkým ak je hovädzieho pôvodu. Dojčenská výživa môže byť pripravená s použitím bežných postupov a môže obsahovať akékoľvek nevyhnutné prísady, ako sú minerály, vitamíny atď.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Genómové usporiadanie, sekvenčná analýza a chromozomálna lokalizácia CEL génu
Ak nie je uvedené inak, boli použité štandardné techniky molekulárnej biológie (Maniatis a kol., 1982, Ausubel a kol., 1987, Sambrook a kol., 1989).
Izolácia genómových rekombinantov
Dve rôzne knižnice ľudského genómového fága, λ DASH (Clonentech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, USA) a ÄEMBL-3 SP6/T7 (Stratagene, La Jolla, C A, USA) boli monitorované plakovou hybridizáciou pri použití rôznych subklonovaných cDNA reštrikčných fragmentov (Nilsson a kol., 1990) ako sond, značených /a-32P/dCTP technikou oligoznačení (Feinberg a kol., 1983).
Mapovanie, subklonovanie a sekvenovanie genómových klonov
Pozitívne klony boli štiepené rôznymi reštrikčnými enzýmami, elektroforézované na 1 % agarózových géloch a potom vákuovo prenesené (Pharmacia LKB BTG, Uppsala, Švédsko) na nylonovú membránu. Membrána bola hybridizovaná s rozličnými cDNA sondami. Reštrikčné fragmenty, hybridizujúce sa sondami, boli izolované pri použití izotachoforézovej metódy (Ofverstedt a kol., 1984). Menšie fragmenty, < 800 bp, boli priamo inzertované do M13mpl8, M13mpl9, M13BM20 alebo M13BM21 vektorov a sekvenované pri použití E. coli TGI ako hostiteľskej baktérie, zatiaľ čo väčšie fragmenty boli subklonované do pTZ18R alebo pTZ19R vektorov pri použití E. coli DH5a ako hostiteľskej baktérie a ďalej štiepené. (Plazmidy pS309, pS310 a pS451 použité v príklade 2 sa ďalej získali podobne.) Niektoré z izolovaných fragmentov sa taktiež používajú ako sondy pri hybridizáciách. Všetky nukleotidové sekvencie boli ukončené dideoxy reťazovou terminačnou metódou (Sanger a kol., 1977) pri použití Klenowovho enzýmu a M13 univerzálneho sekvenčného priméru špecifických oligonukleotidov. Sekvenčné informácie boli získané z autorádiogramov s použitím softvéru MS-EdSeq, ako opísal Sjoberg a kol. (1989). Sekvencie boli analyzované za použitia programov získaných od UWGCG softvérových návodov (Devereux a kol., 1984).
Predlžovanie primeru
Celková RNA bola izolovaná z ľudskej podžalúdkovej žľazy, taktujúcej mliečnej žľazy a adipózneho tkaniva guanidínium izotiokyanát-CsCl postupom (Chirgwin a kol., 1979). Predlžovanie priméru bolo uskutočnené podľa Ausubela a kol., 1987, pri použití celkovej RNA a antisense 26-mérového oligonukleotidu /5'-AGGTGAGGCCCAACACAACCAGTTGC-37, poloha 33-58. Hybridizácia priméru s 20 p^ celkovej RNA bola uskutočnené v 30 μΐ 0,9 M NaCl, 0,15 M Hepes pH 7,5 a 0,3 M EDTA pri teplote 30 °C cez noc. Po predlžovacej reakcii s reverznou transkriptázou boli produkty predlžovania analyzované elektroforézou cez 6 % denaturovaný polyakrylamidový gél.
Somatické bunkové hybridy
DNA zo 16 somatických bunkových hybridných línií človek - hlodavec, získaná z NIGMS Human Genetic Mutant Celí Repository (Coriell Inštitúte for Medical Reseach, Camden, NJ) bola použitá na chromozonálne hodnotenie CEL génu. Ľudské - myšacie somatické bunkové hybridy GM09925 až GM09940 boli získané z fúzií fetálnych ľudských mužských fibroplastov /IMR-91/, s tymidín kináza deficitnou myšacou bunkovou líniou B-82 (Taggart a kol., 1985, Mohandas a kol., 1986). Hybridy GM10324 a GM02860 s HPRT a APRT deficientnou myšacou bunkovou líniou A9 (Callen a kol., 1986), zatiaľ čo hybrid GM10611 vznikol z mikrobunkovej íuzie retrovirusového vektora SP-1, infikovaného ľudskou lymfoblastovou bunkovou líniou GM07890 s líniou UV-135 vaječníkov čínskeho škrečka (Warburton a kol., 1990). Hybrid GM10095 bol získaný z fúzie lymfocytov ženy s vyváženým 46,X,t/X,9//ql3,34/ karyotypom s bunkovou líniou CHW1102 čínskeho škrečka (Mohandas a spol., 1979). Obsah ľudských chromozómov v hybridnej línii, ktorý bol stanovený cytogenetickou analýzou, ako aj Southem blot analýzou a in situ hybridizačnou analýzou, je uvedený v tabuľke 1. DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou izolované z myší, čínskeho škrečka a ľudskej rodičovskej línie a 15 hybridných bunkových línií, boli Štiepené EcoRI, frakcionované v 0,8 % agarózových géloch a transferované na nylonové filtre. /a-32P/dCTP-značená CEL, cDNA sondy (plná dĺžka cDNA) boli pripravené oligoznačením (Feinberg a Vogelstein, 1983) a hybridizované na filtre. Filtre boli premyté po 60 min. vždy pri teplote 65 °C v 6 X SSC/0,5 % SDS a 2 x SSC/0,5 % SDS.
Polymerázová reťazová reakcia
Celková ľudská genómová DNA izolovaná z leukocytov, DNA zo somatických bunkových hybridov a z niektorých pozitívnych genómových rekombinantov a celkovej RNA ľudskej laktujúcej mliečnej žľazy a ľudskej podžalúdkovej žľazy boli amplifikované pri exóne 10 a exóne 11. Boli použité 2 pg DNA. Použité priméry sú uvedené v tabuľke 2. Tridsať cyklov PCR bolo uskutočnených v 100 μΐ objemu (10 mM Tris-HC1, pH 8,3, 50 mM KC1,1,5 mM MgCl2, 200 μΜ každého dNTP, 100 pg želatíny, 100 pmol každého priméru, 1,5 J Taq DNA polymerázy (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) a teplote spracovania 55 °C pre všetky primérové páry. RNA sekvencia bola amplifikovaná použitím kombinovanej komplementárnej DNA /cDNA/ a PCR metodológie, cDNA bola syntetizovaná z 10 pg celkovej RNA v 40 pl roztoku obsahujúceho 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM K.C1, 10 mM MgCl2, 10 pg/mlBSA, 1 mM každého dNTP, 500 ng oligo/dt/i2_is, 40 J ribonukleázového inhibítora a 200 J reverznej transkriptázy /MoMuLV/, (BRL, Bethesda Research Laboratories, N.Y., USA) po 30 minútach pri teplote 42 °C. cDNA bola vyzrážaná a resuspendovaná v 25 μΐ vody, 2 pl tohto roztoku boli amplifikované, ako je opísané. Amplifikované fragmenty boli analyzované na 2 % agarózovom géli. Niektoré z fragmentov boli ďalej subklonované a sekvenované.
Génová štruktúra ľudského CEL génu
V každej genómovej knižnici bolo prehľadané 106 rekombinantov a toto prehľadanie poskytlo niekoľko pozitívnych klonov, ktoré boli izolované a mapované. Dva klony, označené XBSSL1 a XBSSL5A, boli ďalej analyzované. Štiepenie reštrikčnými enzýmami, Southem blotting s nasledujúcou hybridizáciou s cDNA sondami, indikujú, že XBSSL5A kloň pokrýva celý gén a že XBSSL1 kloň pokrýva 5'-polovicu a asi 10 kb 5'-priliehajúce oblasti (obr. 1). Spoločne tieto dva klony pokrývajú asi 25 kb ľudského genómu.
Po subklonovaní a štiepení reštrikčným enzýmom sa získajú vhodné fragmenty na sekvenovanie a mohla by byť stanovená celá sekvencia CEL génu, ktorá zahrnuje 1640 bp 5'-priliehajúce oblasti a 41 bp 3'-priliehajúce oblasti. Tieto údaje naznačujú, že ľudský CEL gén /SEQ ID č: 1/1/ oblasť dĺžky 9850 bp, obsahujúce 11 exónov prerušených 10 intrónmi (obr. 1). To znamená, že exóny a predovšetkým intróny sú rela9 tívne malé. V skutočnosti sú exóny 1-10 v rozmedzí veľkosti od 87-204 bp, zatiaľ čo exón 11 je dlhý 841 bp. Ako je zrejmé z tabuľky 3, všetky spojenia exón/intrón sa riadia AN/GT pravidlom a dobre potvrdzujú zhodu so sekvenciou podľa Bounta a kol. (1982). Pri porovnaní kódujúcej časti CEL génu s cDNA (Nilsson a kol., 1990) bol nájdený len jeden rozdiel v nukleotidovej sekvencií, druhá poloha v exóne 1, C, ktorou je cDNA sekvencia T. Pretože táto poloha je umiestnená na 10 mieste proti smeru translácie štart kodónu ATG, nemá tento rozdiel vplyv na aminokyselinovú sekvenciu.
Sedem členov Alu triedy opakujúcich sa DNAa elementov je prítomných v sekvenovanej oblasti, značenej Alul-Alu7 /5-37 (obr. 1), jeden v 5'-priliehajúcej oblasti a šesť zostávajúcich v CEL géne.
Transkripcia iniciačných miest a 5'-priliehajúce oblasti
Po mapovaní transkripčných iniciačných miest (miesta) ľudského CEL génu boli uskutočnené analýzy primérového predĺženia pri použití celkovej RNA z ľudskej podžalúdkovej žľazy, taktujúcej mliečnej žľazy a adipozového tkaniva. Výsledky indikujú hlavné transkripčné štart miesto umiestnené 12 bp a vedľajšie štart miesto umiestnené 8 báz proti smeru iniciátora metionínu. Iniciačné miesta transkripcie sú rovnaké tak v podžalúdkovej žľaze ako v taktujúcej mliečnej žľaze, zatiaľ čo žiaden signál nemohol byť detegovaný v adipózovom tkanive (obr. 2). Sekvenovaná oblasť zahrnuje 1640 dĺžku 5'-priliehajúcu DNA. Podľa podobnosti sekvencie s TATA-box podobnou sekvenciou bola CATAAAT nájdená vo vzdialenosti 30 nt proti smeru od počiatočného miesta transkripcie (obr. 4). Ani CAAT-box štruktúra ani GC boxy nie sú v tejto oblasti zrejmé.
5'-priliehajúca sekvencia bola počítačovo prehľadaná, v oboch reťazcoch, na nukleotidové sekvencie známe ako faktor transkripcie, viažuce sekvencie v iných génoch špecifických pre mliečnu žľazu a pre podžalúdkovú žľazu. Boli nájdené niektoré zdanlivé rozpoznávacie sekvencie, pozri obr. 4.
Chromozomálna lokalizácia CEL génu
V ľudskej kontrolnej DNA deteguje CEL cDNA sonda štyri EcoRI fragmenty približne 13 kb, 10 kb, 2,2 kb a 2,0 kb, zatiaľ čo v kontrolných DNA myší a škrečkov boli detegované jednotlivé fragmenty asi 25 kb a
8,6 kb. Prítomnosť sekvencií ľudského CEL génu v hybridných klonoch je v korelácii len s prítomnosťou ľudského chromozómu 9 (tabuľka 1). Len jeden zo 16 hybridov, ktoré boli analyzované, bol pozitívny pre ľudský CEL gén, tento hybrid obsahuje chromozóm 9 ako výlučne ľudský chromozóm. Nezistili sa žiadne poruchy v lokalizácii tohto chromozómu, zatiaľ čo tu existujú aspoň dve poruchy pre lokalizáciu akéhokoľvek iného chromozómu (tabuľka 1). Na ďalšiu sublokalizáciu CEL génu bol využitý hybrid človek-čínsky škrečok /GM 10095/, uchovávajúci der/9/ translokáciu chromozómu /9pter—>9q34:Xql3—>Xqter/ ako výlučne ľudská DNA. Pri Southem blote nebola detegovaná akákoľvek sekvencia CEL génu v tomto hybride, čo znamená, že je CEL gén umiestnený v oblasti 9q34-qter.
Príklad 2
Konštrukcia expresných vektorov
Na konštrukciu expresného vektora pre produkciu rekombinantnej ľudskej CEL v mlieku z transgénnych živočíchov bola použitá nasledujúca stratégia (obr. 5).
Tri plazmidy na báze pTZ (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) obsahujúce rozličné časti ľudského CEL génu, pS309, pS310 a pS311 boli získané použitím opísaných metód. Plazmid pS309 obsahuje Sphl fragment pokrývajúci CEL gén od 5'-netranskribované oblasti k časti štvrtého intrónu. Plazmid pS310 obsahuje Sací fragment pokrývajúci CEL génovú sekvenciu od časti prvého intrónu po časť šiesteho intrónu. Tretí plazmid pS311 obsahuje BamHI fragment pokrývajúci variant CEL génu od hlavnej časti piateho intrónu a zvyšok štruktúry intrón/exón. V tomto plazmide opakujúca sa sekvencia exónu 11, ktorá normálne kóduje 16 opakovaní, bola mutovaná pre kódovanie skráteného variantu, ktorý má 9 opakovaní.
Iný plazmid, pS283, obsahujúci časť ľudskej CEL cDNA klonovaný od plazmidu pUcl9 v HindlII a Sací miestach bol použitý na fúziu genómových sekvencií. pS283 bol taktiež použitý na poskytnutie zvyčajného reštrikčného miesta, KpnI, umiestneného v 5 -netranslátovanej vedúcej sekvencií CEL. Plazmid pS283 bol potom štiepený Ncol a Sací a fragment asi 2,7 kb bol izolovaný. Plazmid pS309 bol štiepený Ncol a BspEI a bol izolovaný fragment asi 2,3 kb, obsahujúci 5 '-časť CEL génu. Plazmid ps310 bol štiepený BspEI a Sací a bol izolovaný fragment asi 2,7 kb, obsahujúci časť strednej oblasti CEL génu. Tieto tri fragmenty boli ligované a transformované do kompetentného E. coli kmeňa TG2, a transformanty boli izolované ampicilínovou selekciou. Plazmidy boli pripravené z mnohých transformantov a jeden plazmid, nazvaný ps312 (obr. 6), obsahujúci požadovaný konštrukt, bol použitý na ďalšie pokusy.
Na získame modifikácie pS311, v ktorej bolo BamHI miesto lokalizované po smere stop kodónu a bolo konvertované na Sali miesto, na uľahčenie ďalšieho klonovania, bola použitá nasledujúca metóda. pS311 bol linearizovaný čiastočným BamHI štiepením. Linearizovaný fragment bol izolovaný a bol inzertovaný syntetický DNA linker, ktorý konvertuje BamHI na Sali miesto /5'-GATCGTCGAC-3'/, čím sa rozruší BamHI miesto. Pretože sa tu vyskytujú dve potencionálne polohy na integráciu syntetického linkeru, boli výsledné plazmidy analyzované štiepením reštrikčným enzýmom. Plazmid s linkerom inzertovaným v požadovanej polohe po smere od exónu 11 bol izolovaný a označenýpS313.
Na získanie konštruktu expresného vektora, ktorý nesie CEL genómové štruktúry a kóduje skrátený CEL variant, bol použitý plazmid pS314, ktorý bol zostavený pre sprostredkovanie a tkanivovo špecifickú expresiu v bunkách mliečnej žľazy počas laktačného obdobia. Plazmid pS314 obsahuje genómový fragment z myšacieho srvátkového kyslého proteínového /WAP/ génu (Campbell a kol., 1984) klonovaný ako Nôti fragment. Genómový fragment bol približne 4,5 kb od smeru regulačnej sekvencie /URS/, celá transkribovaná exón/intrón oblasť a asi 3 kb sekvencia po smere posledného exónu. Jedinečné KpnI miesto je umiestnené v prvom exóne 24 bp od prirodzeného WAP translačného iniciačného kodónu. Ďalšie injekčné miesto pre reštrikčný enzým je umiestnené v exóne 3. V pS314 bolo Sali miesto zničené štiepením, naplnené s použitím Klenowa a religácie. Namiesto neho bolo nové Sali miesto zavedené priamo po smere od KpnI miesta v exóne 1. Toto bolo uskutočnené KpnI štiepením a zavedením anelovaných syntetických oligomérov SYM 2401 5'-CGTCGACGTAC-3' a SYM 2402 5'-GTCGACGGTAC-3', v týchto polohách (obr. 8). Ľudská CEL genómová sekvencia bola inzertovaná medzi tieto miesta, KpnI a Sali, s nasledujúcou stratégiou. Najskôr bol pS314 štiepený s KpnI a Sali a fragment predstavujúci štiepený plazmid bol elektroforeticky izolovaný. Po druhé, pS312 bol štiepený s KpnI a BamHI a bol izolovaný 4,7 kb fragment predstavujúci 5' časť ľudského CEL génu. Po tretie pS313 bol štiepený s BamHI a Sali a 3'-časť ľudského CEL génu bola izolovaná. Tieto tretie fragmenty boli ligované, transformované do kompetentnej E. coli baktérie a transformanty boli izolované po ampicilínovej selekcii. Plazmidy boli pripravené z niekoľkých transformantov a starostlivo analyzované mapovaním reštrikčnými enzýmami a sekvenčnou analýzou. Jeden plazmid, predstavujúci požadovanbý expresný vektor, bol definovaný a označený pS317.
Na účely konštrukcie genómového CEL expresného vektora, kódujúceho celú dĺžku CEL, bol pS317 modifikovaný nasledovne (obr. 5). Najskôr bol pTZ18R plazmid (Pharmacia), obsahujúci 5,2 kb BamHI fragment ľudského CEL génu, zasahujúci od piateho intrónu po smere k jedenástemu exónu, pS451 /, bol štiepený s HindlII a Sací. Toto štiepenie vytvára fragment o asi 1,7 kb, ktorý sa rozkladá od HindlII miesta umiestneného v intróne 9 k Sací miestu umiestnenému v exóne 11. Po druhé bol plazmid pS313 štiepený so Sací a Sali a 71 bp fragment, obsahujúci 3' časť exónu 11 a generované Sali miesto bol izolovaný. Po tretie, bol izolovaný zvyšok WAP/CEL rekombinantného génu a plazmidové sekvencie boli izolované ako Sall/Hindlll fragment o asi 20 kb z pS317. Tieto tri fragmenty boli ligované a transformované do baktérie. Plazmidy boli pripravené z niekoľkých transformantov. Plazmidy boli štiepené s rôznymi reštrikčnými enzýmami a podrobené sekvenčnej analýze. Jeden plazmid, obsahujúci požadovaný rekombinantný gén, bol identifikovaný. Tento konečný expresný vektor bol označený pS4 5 2 (obr. 7).
Na odstránenie prokaryotických plazmidových sekvencií bol pS452 štiepený s Nôti. Rekombinantný vektorový element, obsahujúci myšací WAP sekvencií priliehajúci k ľudskému CEL genómovému fragmentu bol potom izolovaný agarovou elektroforézou. Izolovaný fragment sa potom čistil s použitím elektroelúcie predtým, ako bol injektovaný do myšacích embryí.
Rekombinantný WAP/CEL gén na expresiu v mliečnej žľaze transgénnych živočíchov je uvedený na obr.
8.
Zloženie
Nasledujúce plazmidy boli uložené podľa Budapeštianskej zmluvy v DSN (Deutsche Sammlung von Mikroorgamsmen und Zell-kulturen):
Plazmid
Číslo uloženia
Dátum uloženia
pS309 DSM 7101
pS310 DSM 7102 12. júna 1992
pS451 DSM 7498
pS452 DSM 7499 26. februára 1993
Príklad 3
Generovanie transgénnych zvierat
Nôti fragment bol izolovaný z plazmidu pS452 podľa príkladu 2. Tento DNA fragment obsahuje myšací WAP promótor napojený ku genómovej sekvencií kódujúcej ľudskú BSSL/CEL. Izolovaný fragment, v koncentrácii 3 ng/μΐ, bol injektovaný do pronuclea 350 C57Bl/6JxCBA/2J-f2embryí získaných od myšieho darcu primovaného s 5 m.j. pregnantného sérového gonádotropínu kobyly pre superovuláciu. C57Bl/6xCBA/2J-fi zvieratá boli získané od Bomholtgard Breeding and Research Centre BTD, Ry, Dánsko. Po odobratí embryí z vajcovodu boli tieto oddelené od cumulus buniek spracovaním s hyaluronidázou v médiu M2 (Hogan a kol., 1986). Po premytí boli embryá transferované na médiu Ml 6 (Hogan a kol., 1986) a udržiavané v inkubátore s
SK 286993 Β6 % CO-atmosférou. Injekcie boli uskutočnené v mikrokvapačke M2 pod ľahkým parafínovým olejom pri použití Narishigi hydraulických mikromanipulátorov a Nikon invertovaného mikroskopu vybaveného Nomarski optikou. Po injekcii boli zdravo vyzerajúce embryá implantované do pseudopregnantných C57Bl/6JxCBA/2J-f] príjemcov pomocou 0,37 ml 2,58 % Avertínu intraperitoneálne. Myši, ktoré mali integrovaný transgén, boli identifikované PCR analýzou DNA zo vzoriek chvostovej biopsie získaných tri týždne po narodení zvierat. Pozitívne výsledky boli potvrdené analýzou Southem blot.
Príklad 4
Expresia BSSL/CEL pri transgénnych myšiach
Transgénna myš bola identifikovaná analýzou DNA, ktorá bola pripravená z vyrezaných vzoriek chvosta. Vzorky tkaniva boli inkubované s proteinázou K a extrahované fenol/chloroformom. Izolovaná DNA bola použitá v reakciách polymerázovej výstavby reťazca s primérmi, ktoré ampflikujú špecifické fragmenty, ak heterológne zavádzaná DNA, predstavujúca expresný vektorový fragment, je prítomná. Zvieratá boli tiež analyzované DNA hybridizačnými experimentmi na potvrdenie PCR údajov a na test možných znovupreskupení, štruktúru integrovaných vektorových prvkov a na získame informácie o počte kópií integrovaných vektorových prvkov.
V jednom sete pokusov bolo analyzovaných 18 myší dvoma metódami a výsledky demonštrujú, že myš nesie heterológny DNA vektorový element odvodený od pS452. Výsledok z PCR analýzy a hybridizačných experimentov bol identický (obr. 9).
Myš identifikovaná ako nesúca vektorový DNA alement (nájdené zviera) bola potom spárená a Fl vrh bol analyzovaný na transgén rovnakými postupmi.
Laktujúce samice zvierat boli injektované s 2 m.j. oxytocínu s 40 ml 2,5 % Avertínu intraperitoneálne. Zariadenie na zber mlieka bolo pripojené ku struku silikonizovaným potrubím a mlieko sa zbieralo do 1,5 ml Eppendorfovej skúmavky šetrným maskovaním mliečnej žľazy. Množstvo mlieka sa menilo v závislosti odo dňa akácie, medzi 0,1 a 0,5 ml na myš a súbor.
Analýza na prítomnosť rekombinantnej ľudskej BSSL/CEL bola uskutočnená SDS-PAGE, transfer na nitrocelulózové membrány a inkubácia s polyklonálnymi protilátkami generovanými proti natívnej ľudskej BSSL/CEL. Získané výsledky demonštrujú expresiu rekombinantnej ľudskej BSSL/CEL do mlieka transgénnej myši. Obr. 10 demonštruje prítomnosť rekombinantnej ľudskej BSSL/CEL v mlieku transgénnej myši, pruh pri asi 116,5.
Stabilné línie transgénnych zvierat sú generované. Podobným spôsobom môžu byť pripravené iné transgénne zvieratá, ako je krava alebo ovca, schopné expresie ľudskej BSSL/CEL.
Odkazy:
Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. & Lombardo, D. (1988): Biochim. Biophys. Acta 961,299-308. Ausubel, F. M., Brent, R. E., Moore, D. D., Smiyh, J. A., Seidman, J. G. arid Struhl, K.: Current Protocols in Molecular Biology. (Wiley Interscience, New York 1987).
Baba, T., Downs, D., Jackson, K.W., Táng, J. and Wang, C.S. (1991): Biochemistry 30, 500-510. Beato, M. (1989): Celí 56,335-344.
Bemback, S., Blackberg, L. & Hemell, 0. (1990): J. Clin. Invest. 221-226.
Bjorksten,B., Burman, L. G., deChateau, P., Fredrikzon, B., Gothefors, L. & Hemell, O. (1980): Br. Med. J. 201,267-272.
Blackberg, L., Angquist, K. A, & Hemell, O. (1987): FEBS Lett. 217, 37-41.
Blackberg, L. & Hemell, O. (1981): Eur. J. Biochem 116, 221-225.
Blackberg, L. Lombardo, D., Hemell, O., Guy, O. & Olivecrona, T. (1981): FEBS Lett. 136, 284-288. Boulet, A. M., Erwin, C. R. and Rutter, W. J. (1986): Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 3599-3603. Brinster, R. L., Alien, J. M., Behringer, R. R., Gelinas, R. E. & Palmiter, R. D. (1988): Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 836-840.
Callen, D. F. (1986): Ann. Genet. 29,235-239.
Campbell, S. M., Rosen, J. M., Hennighausen, L.G., Strech-Jurk, U. and Sippel, A. E. (1984): Nucleic Acid Res. 12, 8685-8697.
Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J. and Rutter, W. J. (1979): Biochemistry 18, 5294-5299. Clark, A. J., Simons, P., Wilmut, I. and Lahte, R. (1987): TIBTECH 5, 20-24.
Devereux, J., Haeberli, P. and Smithies. (1984): Nucleic Acids Res. 12, 387-395. Feinberg, A. and Vogelstein, B. (1983): Anál. Biochem. 132, 6-13.
Hennighausen, L., Ruiz, L. & Wall, R. (1990): Current Opinion in Biotechnology 1, 74-78. Hemell, O. & Blackberg, L. (1982): Pediatr. Res. 16, 882-885.
Hogan, B., Constantini, F. and Lacy, E. (1986): Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Hui, D. andKissel, J.A. (1990): Febs Lett. 276, 131-134.
Lombardo, D., Guy, O. & Figarella, C. (1978): Biochim. Eiophys. Acta 527,142-149.
Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, NY, 1982).
Mohandas, T., Sparkes, R. S., Sparkes; M. C., Shulkin, J. D., Toomey, K. E. and Funderburk, S. J. (1979): Am. J. Hum. Genet. 31, 586-600.
Mohandas, T., Heinzmann, C„ Sparkes, R. S. Wasmuth, J., Edwards, P. and Lusis, A. J. (1986): Somatic Celí. Mol. Genet. 12, 89-94.
Mount, S. M. (1982): Nucleic Acids Res. 10,459-472.
Nilsson, J., Bläckberg, L.( Carlsson, P., Enerbäck, S., Hemell, O. and Bjursell, G. (1990): Eur. J. Biochera. 192, 543-550.
Qasba, M., and Safaya, S. K. (1984): Náture 308,377-380.
Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, T. H., Ronk, M., Shively, J .E., Stemby, B., Borgstrom, B., Ameis, D. and Schotz, M. C. (1991): J. Lipid. Res. 32,267-276.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. E.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R. (1977): Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467.
Sjoberg, S., Carlsson, P., Enerbäck, S. and Bjursell, G. (1989): Comput. Appl. Biol. Sci. 5, 41-46.
Taggart. R. T., Mohandas, T., Shows, T. B. and Beli, G. I. (1985): Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6240-6244.
Warburton, D., Gersen, S., Yu, M.T., Jackson, C., Handelin, B. and Housman, D. (1990): Genomics 6, 358-366.
Whitelaw et al. (1991): Transgenic Research 1, 3-13.
Yu-Lee, L., Richter-Mann, L., Couch, C, Stewart, F., Mackinlay, G. and Rosen, J. (1986): Nucleic. Acid. Res. 14,1883-1902.
Ôfverstedt, L.G., Hammarstrôm, K., Balgobin, N., Hjerten, S. Petterson, U. and Chattopadhyaya, J. (1984): Biochim. Biophys. Acta 782,120-126.
Tabuľka 1
Korelácie CEL sekvencií s ľudskými chromozónami v 16 bunkových hybridoch človeka
Percentá buniek s ľudskými chromozómami0
CHROMOSOM .. 1 ...2,. 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1? 1} 14 K 16 17 18 ľ ?o 71 ?*> Y
HYBRID GM09925 74 24 0 74 76 60 82 78 0 0 4 68 6 86 78 14 98 96 46 84 0 76 0
GM09927 69 83 75 77 0 93 79 73 0 82 0 0 77 79 90 0 81 73 87 89 0 0 0
GMO9929 0 0 61 59 0 43 2 49 0 0 33 49 0 59 2 0 96 0 2 31 0 0 2
CMO993OA 0 34 62 4 12' 0 26 4 0 0 6 22 56 82 12 0 86 78 0 22 82 76 6
GM09932 0 0 0 68 86 46 0 80 0 2 28 26 0 0 0 0 96 0 2 0 92 0 0
GM09933 50 0 84 16 54 76 92 54 0 6 0 50 84 78 92 0 88 70 80 32 94 88 0
GM09934 0 50 0 0 83 79 4 87 0 0 77 87 0 2 89 0 90 89 0 91 89 2 0
GM09935A 0 0 52 10 28 12 0 0 0 8 0 22 74 72 0 0 93 59 0 9 91 71 0
GM09936 0 0 0 18 0 46 70 10 0 16 ' 34 0 2; 88 2 0 100 0 44 24 0 18 0
CM09937 0 0 54 38 0 62 54 70 0 4 0 42 0 70 60 0 96 66 0 0 0 0 0
GM09938 0 0 2 88 60 88 86 4 0 0 36 92 0 80 4 0 92 0 4 80 76 60 0’
GM09940 0 0 46 0 0 0 84 62 0 0 0 0 0 0 62 0 100 0 ' 0 0 0 0 0
GM 10324 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 90
GM10567 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 98 0 0 ‘0 0 0 0 0
GM10611 . 0 0 0 0 0 0 0 0 69 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
GM 10095 '0 0 0 0 0 0 0 0 94 b 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ô 0 0 94b
pomer nesúladu 4 16 16 ä 16 7 Í6 7 16 10 16 2 16 9 16 Jl 16 l 16 ž 16 10 16 5 16 10 16 7 16 2 16 13 16 8 16 s 16 9 16 7 16 á 16 3 16
X
No všeobecnosti bol ľudský chromozóm prítomný vo viac ako 20 až 22 % buniek podľa analýzy Southern blot ^Obsahuje 9ptér--*. q34 a Xql3 -___*. qter
CEl,
SK 286993 Β6
Tabuľka 2
Priméry použité pre DNA amplifikáciu
Oligonukleotid poloha3 amplifikované sekvencie
PI: 5·-AGACCTÄCGCCTACCTG-3· 8492-8509 Exon 10
P2: 5·-TCCAGTAGGCGATCATG-3' 8646-8662
P4 j 5' -GACCGATGTCCTCTTCCTGG-3’ 7220-7239 Exóh 10 s primérmi z exónov,
P5: S·-CAGCCGAGTCGCCCATGTTG-3' 9016-9035 obklopujúcich exón 10
P6; 5'-ACCAAGAAGATGGGCAGCAGC-3' 9039-9109 opakovanie v exóne 11
P7: 5'-GACTGCAGGCATCTGAGCTTC-3' 9722-9742
aNukleotidová poloha je daná počtom báz od štartu prvého exónu. 2a účelom porovnania nukleotidovej polohy so SEQ ID č. 1, pridaj 1640 bá2 k číslu v stĺpci.
kpre amplifikáciu exónu 10 z cDNA
Tabuľka 3
Exón-intrón organizácia CEL génu aminoky-
č. poloha nukleotidu3 dĺžka seliny polrč-r-
1 1-87 87 1-25 (251
i 2431-2SB1 151 26- 75 (50)
3 2667-2789 123 76-116 (41)
4 3067-3264 198 117-152 £65)
S 4553-4683 131 183-226 (44)
č 4061-4968 108 227-262 (36)
7 5111-5228 118 .263-301 £39)
8 6695-6881 187 302-364 (63)
9 7079-7282 204 365-432 £68)
10 3404-8681 198 433-498 £66)
11 9010-9850 841 499-745 (247)
sekvencia spojenia exón-intrón intrón
5'--rez 3 71AG gtaaga....gtgtctccctcgcag 'akceptor CTG GGC GCC Č. 1 I dĺžka 2343
GCC GCG
TGG CAA G gtggga.. ..tcctgccacctgcag GG ACC CTG IZ 8S
AAG CAA G gtctgc.. ..gctcccccatctcag TC TCC CGG 111 277
CTG CCA G gtgcgĽ.. ..ctgccctgcccccag GT AAC TAT IV 1288
TCT CTG CAG glctcg.. ..ttGtgggtcccgtag ACC CTC TCC v 17.7
GCC AAA AAG gtaaac.. ..tggctcCgcecceeg CTG GCT CAG VI 142
CTG GAG T gcgagc.. ..ggctcccccacccag AC CCC ATG VII 1466
GTC ACG GA gtaage.. ..acttgattcccccag C GAG GAC VIII 197
AAT GCC AA gtgagg.. ..gtctctcccctccag G AGT GCC IX 1201
AAA ACA GG gtaaga.. ..cttctcactctgcag G GAC CCC x 328
aNukleotidová poloha je daná počtom báz od štartu prvého exónu. 2a účelom porovnania nukleotidovej polohy so SEQ ID č. 1/ pridaj 1640 bá2 k číslu v stĺpci.
Opis výkresov na obrázkoch obr. 1
Lokus CEL génu. Lokalizácia a reštrikčná enzýmová mapa dvoch čiastočne presahujúcich klonov, λ BSSL1 a XBSSL5A. Nižšie sú uvedené organizácie exón-intrón a použité reštrikčné enzýmové miesto. Exóny sú označené boxami číslovanými 1-11. Asp = Asp700, B = BamHI, E = EcoRI, S = Sací, Sa = Sali, Sp = = Sphl aX = Xbal. Polohy a orientácie Alu opakujúcich sa elementov sú označené šípkami, a-h predstavuje rozdielne subklonované fragmenty.
Obr. 2
Analýza predlžovania primérov RNA z ľudskej taktujúcej mliečnej žľazy, podžalúdkovej žľazy a adipózneho tkaniva. Na konci rádioaktívne značený 26-merový oligonukleotid, ktorý je komplementárny k polohám 33 až 58 CEL génu, bol použitý na primovanie reverznej transkripcie RNA. Dráha A je marker veľkosti molekuly (sekvenčného stupňa), dráha B RNA podžalúdkovej žľazy, dráha C RNA adipózneho tkaniva a dráha D RNA taktujúcej mliečnej žľazy.
Obr. 3
Dotplot analýza 5'-priliehajúcich oblastí ľudského CEL a krysieho CEL génu. Homológne oblasti sú označené A-H a sú opísané sekvencie, predstavujúce tieto časti, horné je ľudské a spodné je krysie.
Obr. 4
Analýza 5'-priliehajúcej sekvencie ľudského CEL génu. Zdanlivé rozpoznávacie sekvencie sú podčiarknuté buď hore, alebo dolu, podľa komplementárneho reťazca. Tučné písmená ukazujú umiestnenie homológií k rCEL (oblasti A-H). TATA-box je podčiarknutý bodkované.
Sú tu dve sekvencie, ktoré obe majú 80 % podobnosť ku konsenzus sekvencie glukokortikoid receptor väzbového miesta, GGTACANNNTGTTCT (Beato M., 1989), prvá z nich na komplementárnom reťazci v polohe -231 /IA/ a druhá v polohe -811 /1B/. Ale v polohe -861 /2/ je tu sekvencia, ktorá má 87 % podobnosť ku konsenzus sekvencií estrogén receptov väzbového miesta, AGGTCANNNTGACCT (Beato M., 1989).
Lubon a Henninghausen (1987) analyzovali promótor a 5'-prilehajúce sekvencie srvátkového kyslého proteínového /WAP/ génu a stanovili väzbové miesta pre nukleárne proteíny buniek laktujúcej mliečnej žľazy. Jedna z nich, na 11 bp chránená sekvencia, AAGAAGGAAGT, je prítomná v mnohých génoch mliečnych proteínov, ktoré boli študované, napr. gén krysieho α-laktalbumínu (Qasba a kol., 1984) a gén krysieho α-kazeínu (Yu-Lee a kol., 1986). V CEL génovej priliehajúcej oblasti na komplementárnom reťazci v polohe -1299 /3/je tu sekvencia, ktorá má 82 % podobnosť.
V štúdii 0-kazeín génovej regulácie bol nájdený tkanivovo špecifický faktor mliečnej žľazy /MGF/ v nukleárnych extraktoch pregnantnej alebo laktujúcej myši a jeho rozpoznávajúca sekvencia bola zhodná /ANTTCTTGGNA/. V 5'-priliehajúcej oblasti ľudského CEL génu jestvujú dve sekvencie, jedna na komplementárnom reťazci v polohe -368 /4A/ a druhá v polohe -1095 /4B/, obidve majú 82 % podobnosť ku konsenzus sekvencií MGF väzbového miesta. Za týmito dvoma domnelými MGF väzbovými miestami v 5'-priliehajúcej oblasti je tu sekvencia na komplementárnom reťazci v polohe 275 v intróne I, AGTTCTTGGCA, ktorá má 100 % identitu ku konsenzus sekvencií MGF väzbového miesta.
Ďalej sú tu štyri sekvencie, ktoré všetky majú 65 % podobnosť s konsenzus sekvenciou krysieho pancreas-špecifického posilňovacieho (enhancer) prvku, GTCACCTGTGCTTTTCCCTG (Boulet a kol., 1986), jedna v polohe -359 /5A/ a druhá v polohe -718 /5B/, tretia v polohe -1140 /5C/ a posledná v polohe -1277 /5D/.
Obr. 5
Metóda na produkciu plazmidu pS452. Podrobnejšie pozri príklad 2.
Obr. 6
Schematická štruktúra plazmidu pS312.
Obr. 7
Schematická štruktúra plazmidu pS452.
Obr. 8
Fyzická mapa znázorňujúca fyzické zavedenie ľudskej BSSL/CEL genómovej štruktúry do prvého exónu WAT génu, ako je opísané v príklade 2.
Obr. 9
A. Schematické znázornenie lokalizácie PCR-primérov použitých na identifikáciu transgénnych zvierat. 5'-primér je umiestnený vo WAP sekvencií počnúc polohou -148 bp proti fúzii medzi WAP a BSSL/CEL. 3'-primér je lokalizovaný v prvom BSSL/CEL intróne, končiac 398 bp po smere od bodu fúzie.
B. Sekvencia použitých PCR primérov
C. Agarózový gél znázorňujúci typické analýzy PCR analýzy potencionálne základných zvierat. M: markery molekulovej hmotnosti.
Dráha 1: kontrolný PCR-produkt generovaný z plazmidu pS452.
Dráha 2-13: PCR reakcie s DNA preparátmi potencionálnych základných zvierat.
Obr. 10
Imunoblot analýzy mlieka z myší transgénnej línie na rekombinantné myši WAP/ľudská CEL gén pS452. Proteíny boli odčlenené na DSD-Page, prenesené na Immobilon membrány (Millipore) a vizualizované polyklonálnymi králičími protilátkami, pri použití vysoko čistenej ľudskej natívnej CEL, nasledovanými alkalickou fosfatázou značeným anti-králičím IgC ošípaných (Dakopatts). Dráha 1, markery nízkomolekulámej hmotnosti, 106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 a 18,5 kDa. Dráha 2, markery vysokomolekulárnej hmotnosti 205, 116,5, 80 a 49,5 kDa. Dráha 3, 25 mg čistenej nerekombinnatnej CEL z ľudského mlieka. Dráha 4, 2 μΐ mliečnej vzorky z CEL transgénnej myši, zriedené 1 : 10. Dráhy 5 a 6, 2 μΐ mliečnej vzorky od dvoch rozdielnych neCEL transgénnych myší, zriedené 1:10, ako kontrolné vzorky.
SK 286993 Β6
Zoznam sekvencii:
(1) Všeobecná informácia:
i) prihlasovateľ:
A) meno: AB ASTRA
B) ulica: Kvambergagatan 16
C) mesto: Sodertalje
E) krajina: Švédsko
F) poštový kód/ZIP/: S-151 85
G) telefón: +46-8-553 26000
H) telefax: +46-8-553 28820
I) telex: 19237 astra s ii) názov vynálezu: Nové DNA sekvencie iii) počet sekvencii: 1 iv) počítačovo čítacia forma:
A) typ média: floppy disk
B) počítač: IBM PC kompatibilný
C) operačný systém: PC-DOS/MS-DOS
D) software: Patentln Release č. 1.0, Version č. 1,25(EPO) vi) prioritné údaje prihlášky:
A) č. prihlášky: SE 9201809-2
B) dátum podania: 11.6.1992 vi) prioritné údaje prihlášky:
A) Č. prihlášky: SE 9201826-6
B) dátumpodania: 12.6.1992 vi) prioritné údaje prihlášky:
A) č. prihlášky: SE 9202088-2
B) dátumpodania: 3.7.1992 vi) prioritné údaje prihlášky:
A) č. prihlášky: SE 9300902-5
B) dátumpodania: 19.3.1992
2) Informácie o sekvencii ID č.l:
i) charakteristiky sekvencie:
A) dĺžka 11531 párov báz
B) typ: nukleová kyselina
C) reťazec: dvojitý
D) topológia: lineárna ii) typ molekuly: DNA (genómová) vi) zdroj pôvodu:
A) organizmus: Homo sapiens
F) typ tkaniva: mliečna žľaza iv) rysy:
A) názov/kľúč: CDS
B) lokalizácia: spoj /1653..1727, 4071..4221, 4307.. ..4429, 4707..4904, 6193..6323, 6501..6608, 6751.
.6868, 8335. .8521, 8719. .8922, 10124..10321, 10650..11394/ ix) rysy:
A) názov/kľúč: mat_peptid
B) lokalizácia: spoj /1722..1727, 4071..4221, 4307....4429, 4707..4906, 6193..6323, 6501..6608,
6751..6868, 8335..8521, 8719..8922,10124..10321,10650..11391/ (D) ďalšie informácie: /EC číslo = 3.1.1.1 /produkt = „lipáza stimulovaná žlčovými soľami“ (ix) rysy:
(A) názov/kľúč: 5'UTR (B) lokalizácia: 1..1640 (ix) rysy:
(A) názov/kľúč: TATA_signál (B) lokalizácia: 1611..1617
SK 286993 Β6 (ix) rysy:
(A) názov/kľúč: exón (B) lokalizácia: 1641..1727 (ix)rysy:
(A) názov/kľúč: exón (B) lokalizácia: 4071..4221 (ix) rysy:
(A) názov/kľúč: exón (B) lokalizácia: 4307..4429 (ix) rysy:
(A) názov/kľúč: exón (B) lokalizácia: 4707..4904 (ix) rysy:
(A) názov/kľúč: exón (B) lokalizácia: 6193..6323 (ix) rysy:
(A) názov/kľúč: exón (B) lokalizácia: 6501..6608 (ix) rysy:
(A) názov/kľúč: exón (B) lokalizácia: 6751. .6868 (ix) rysy:
(A) názov/klúč: exón (B) lokalizácia: 8335..8521 (ix) rysy:
(A) názov/klúč: exón (B) lokalizácia: 8719..8922 (ix)rysy:
(A) názov/kľúč: exón (B) lokalizácia: 10124..10321 (ix) rysy:
(A) názov/kľúč: exón (B) lokalizácia: 10650..11490 (ix) rysy:
(A) názov/kľúč: 3'UTR (B) lokalizácia: 11491..11531 (xi) opis sekvencie : SEQ ID č. 1:
GGATCCCTCG AACCCAGGÄG TTCAAGACTG CAGTGACCTA TGATTCTGCC ACTGCÄCTCT
AGCCTGGGTG ACAGAGACCC TGTCTCAAAA AAACAAACAA ACAAAAAACC TCTGTGGACT
CCGGGTGATA ATGACATGTC AATGTGGATT CATCAGGTGT TAACAGCTGT ACCCCCTGGT
120
180
SK 286993 Β6
GGGGGATGTT GATAACGGGG GAGACTGGAG TGGGGCGAGG ACATACGGGA AATCTCTGTA 240
ATCTTCCTCT AATTTTGCTG TGAACCTAAA GCTGCTCTAA AAATGTACAT AGATATAAAC 300
TGGGGCCTTC CTTTCCCTCT GCCCTGCCCC AGCCCTCCCC CACCTCCTTC CTCTCCCTGC 360
TGCCTCCCCT CTGCCCTCCC CTTTCCTCCT TAGCCACTGT AAATGACACT GCAGCAAAGG 420
TCTGAGGCAA ATGCCTTTGC CCTGGGGCGC CCCAGCCACC TGCAGGCCCC TTATTTCCTG 480
TGGCCGAGCT CCTCCTCCCA CCCTCCAGTC CTTTCCCCAG CCTCCCTCGC CCACTÄGGCC 540
TCCTGAATTG CTGGCACCGG CTGTGGTCGA CAGACAGAGG GACAGACGTG GCTCTGCAGG 600
TCCACTCGGT CCCTGGCACC GGCCGCAGGG GTGGCAGAAC GGGAGTGTGG TTGGTGTGGG 660
AAGCACAGGC CCCAGTGTCT CCTGGGGGAC TGTTGGGTGG GAAGGCTCTG GCTGCCCTCA 720
CCCTGTTCCC ATCACTGCAG AGGGCTGTGC GGTGGCTGGA GCTGCCACTG AGTGTCTCGG 780
TGAGGGTGAC CTCACACTGG CTGAGCTTAA AGGCCCCATC TGAAGACTTT GTTCGTGGTG 840
TTCTTTCACT TCTCAGAGCC TTTCCTGGCT CCAGGATTAA TACCTGTTCA CAGAAAATAC 900
GAGTCGCCTC CTCCTCCACA ACCTCACACG ACCTTCTCCC TTCCCTCCCG CTGGCCTCTT 960
TCCCTCCCCT TCTGTCÄCTC TGCCTGGGCA TGCCCCAGGG CCTCGGCTGG GCCCTTTGTT 1020
TCCACAGGGA AACCTACATG GTTGGGCTAG ATGCCTCCGC ACCCCCCCAC CCACACCCCC 1080
TGAGCCTCTA GTCCTCCCTC CCAGGACACA TCAGGCTGGA TGGTGACACT TCCACACCCT 1140
TGAGTGGGAC TGCCTTGTGC TGCTCTGGGA TTCGCACCCA GCTTGGACTA CCCGCTCCAC 1200
GGGCCCCAGG AAAAGCTCGT ACÄGATAAGG TCAGCCACAT GAGTGGAGGG CCTGCAGCAT 1260
GCTGCCCTTT CTGTCCCAGA AGTCACGTGC TCGGTCCCCT CTGAAGCCCC TTTGGGGACC 1320
TAGGGGACAA GCAGGGCATG GAGACATGGA GACAAAGTAT GCCCTTTTCT CTGACAGTGA 1380
CACCAAGCCC TGTGAACAAA CCAGAAGGCA GGGCACTGTG CACCCTGCCC GGCCCCACCA 1440
TCCCCCTTAC CACCCGCCAC CTTGCCACCT GCCTCTGCTC CCAGGTAAGT GGTAACCTGC 1500
ACAGGTGCAC TGTGGGTTTG GGGAAAACTG GATCTCCCTG CACCTGAGGG GGTAGAGGGG 1560
AGGGAGTGCC TGAGAGCTCA TGAACAAGCA TGTGACCTTG GATCCAGCTC CATAAATACC 1620
CGAGGCCCAG GGGGAGGGCC ACCCAGAGGC TG ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG Met Leu Thr Met Gly Arg Leu -23 -20 1673
CAA CTG GTT GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC 1721
Gin Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala
-15 -10 -5
GCG AAG GTAAGAGCCC AGCAGAGGGG CAGGTCCTGC TGCTCTCTCG CTCAATCAGA 1777
Ala Lys
TCTGGAAACT
TCGGGCCAGG
CTGAGAAAGA
GCCCAGCACA
GCCCCGCAGC
AGATCCCGGG
1837
CACTCACGCT
CATTTCTATG
GGGACAGGTG
CCAGGTAGAA
CACAGGATGC
CCAATTCCAT
1897
TTGAATTTCA
GATAAACTGC
CAAGAACTGC
TGTGTAAGTA
TGTCCCATGC
AATATTTGAA
1957
ACAAATTTCT
ATGGGCCGGG
CGCAGTGGCT
CACACCTGCA
ATCCCACCAG
TTTGGGAGGC
2017
CGAGGTGGGT GGATCACTTG AGGTCAGGAG TTGGAGACCA GCCTGGCCAA CATGGTGAAA 2077
CCCCGTCTCT ACTAAAAATA CAAATATTAA TCGGGCGTGG TGGTGGGTGC CTGTAATCCC 2137
AGCTACTCGG GAGGCTGAGG CAGGAGAACC GCTTGAAGCT GGGAGGTGGA GATTGCGGTG 2197
AGCTGAGATC ACGCTACTGC ACTCCAGCCT GGGTGACAGG GCGAGACTCT GTCTCAAAAA 2257
ATAGAAAAAG AAAAAAATGA AACATACTAA AAAACAATTC ACTGTTTACC TGAAATTCAA 2317
ATGTAACTGG GCCTCTTGAA TTTACATTTG CTAATCCTGG TGATTCCACC TACCAACCTC 2377
TCTGTTGTTC CCATTTTACA GAAGGGGAAA CGGGCCCAGG GGCACGGAGT GTGGAGAGCA 2437
GGCAGACGGG TGGAGAGAAG CAGGCAGGCA GTTTGCCCAG CATGGCACAG CTGCTGCCTC | 24.97
CTATTCCTGT GCAGGAAGCT GAAAGCCGGG CTACTCCACA CCCGGGTCCG GGTCCCTCCA 2557
GAAAGAGAGC CGGCAGGCAG GAGCTCTCTC GAGGCATCCA TAAATTCTAC CCTCTCTGCC 2617
TGTGAAGGAG AAGCCACAGA AACCCCÄAGC CCCACAGGAA GCCGGTGTCG GTGCCCGGCC 2677
CAGTCCCTGC CCCCAGCAGG AGTCACACÄG GGGACCCCAG ATCCCAACCA CGCTGTTCTG 2737
CTGCCTGCGG TGTCTCAGGC CCTGGGGACT CCTGTCTCCA CCTCTGCTGC CTGCTCTCCA 2797
CACTCCCTGG CCCTCGGACC GGGAGGTTTG GGCAGTGGTC TTGGGCTCCT GACTCAAAGG 2857
AGAGGTCACC TTCTTCTTGG CCGAGCTCTT CTTGGGGTGC TGAGAGGCCT TCGGCAGGTC 2917
ATCACGACCC CTCCCCATTT CCCCACCCTG AGGCCCTCTG GCCAGTCTCA ATTGCACAGG 2977
GATCACGCCA CTGGCACAAG GAGACACAGA TGCCTCGCAG GGGATGCCCA CGATGCCTGC 3037
ATGTCTTGCT TCTGGTTCCT TTCCTCCAGT TCCAACCGCC GCACTCTCCC ACACCAGTGT 3097
GACAGGGGGC CCATCACCCT AGACTTCAGA GGGCTGCTGG GACCCTGGCT GGGCCTGGGG 3157
GTGTAGGGCC ACCCTGCCCT TCCCCACCTG GAACCTGGCA CAGGTGACAG CCAGCAAGCA 3217
ATGACCTGGT CCCACCATGC ACCACGGGAA GÄGGGAGCTG CTGCCCAAGA TGGACAGGAG 3277
GTGGCACTGG GGCAGACAGC TGCTTCTCAA CAGGGTGACT TCAAGCCCAA AAGCTGCCCA 3337
GCCTCAGTTC CGTCAGGGAC AGAGGGTGGA TGAGCACCAA CCTCCAGGCC CCTCGTGGGG 3397
GTGGACAGCT TGGTGCACAG AGGCCATTTT CATGGCACAG GGAAGCGTGG CGGGGGTGGG 3457
AGGTGTGGTC CCTAGGGGGT TCTTTACCAG CAGGGGGCTC AGGAACTGTG GGGACTTGGG 3517
CATGGGGCCA TCGACTTTGT GCCCAGC'CAG CTAGGCCCTG TGCAGGGAGÄ TGGGAGGAGG 3577
GAAAAGCAGG CCCCACCCCT CAGAAAGGAG GAAGGTTGGT GTGAAACATC CCGGGTACAC 3637
TGAGCATTGG GTACACTCCT CCCGGGAGCT GGACAGGCCT CCCATGTGAT GGCAAACAGG 3697
CCGACAGGAG ACACGGCTGT TGCTCGTCTT CCACATGGGG AAACTGAGGA TCCGAGTCAA 3757
AGCTGGGCGG CCATAGCCAG AACCCAAACC TCCATCCCAC CTCTTGGCCG GCTTCCCTAG 3817
TGGGAACACT GGTTGAACCA GTTTCCTCTA AGATTCTGGG AGCAGGACAC CCCCAGGGAT 3877
AAGGAGAGGA ACAGGAATCC TAAAGCCCTG AGCATTGCAG GGCAGGGGGT GCTGCCTGGG 3937
TCTCCTGTGC AOAGCTGTCC TGCTTTGAAG CTCTCTTTGC CTCTCGGCAC GCGGAGTCGG 3997
CTTGCCTTGC CCCCTCCGGA TTCAGGCCGA TGGGGCTTGA GCCCCCCTGA CCCTCCCCGT 4057
GTCTCCCTCG CAC CTG GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA410 6
Leu Gly Ale Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu
510
GGC GTC AAT AAG AAG CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC4154
Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp IlePhe
20 2530
AAG GGC ATC CCC TTC GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG4202
Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn ProGin
4045
CCA CAT CCT GGC TGG CAA G GTGGGAGTGG GTGGTGCCGG ACTGGCCCTG4251
Pro His Pro Gly Trp Gin
CGGCGGGGCG GGTGAGGGCG GCTGCCTTCC TCATGCCAAC TCCTGCCACC TGCAG GG4 308
Gly
ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC ACC ATC4356
Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gin Ala Thríle
6065
ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC AAC ATT44 04
Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu AsnIle
75 6085
TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA G GTCTGCCTCC CCTCTACTCC4449
Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin
CCAAGGGÄCC CTCCCATGCA GCCACTGCCC CGGGTCTACT CCTGGCTTGA GTCTGGGGGC4 509
TGCAAAGCTG AACTTCCATG AAATCCCACA GAGGCGGGGA GGGGAGCGCC CACTGCCGTT4 569
GCCCAGCCTG GGGCAGGGCA GCGCCTTGGA GCACCTCCCT GTCTTGGCCC CAGGCACCTG4 629
CTGCACAGGG ACAGGGGACC GGCTGGAGAC AGGGCCAGGC GGGGCGTCTG GGGTCACCAG4689
CCGCTCCCCC ATCTCAG TC TCC CGG GAC CTG CCC GTT ATG ATC TGG ATC473 8
Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile
95100
TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT GGG GCC AAC TTC CTC4786
Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Ala Asn PheLeu
105 110 115120
AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC ACA CGC GGA AAC GTC4834
Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu íle Ala Thr Arg Gly AsnVal
125 130135
ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC CTT GGG TTC CTC AGC4882
Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe LeuSer ' 140 145150
ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA G GTGCGTGGGT GCCTTCGGCC CTGAGGTGGG4934
Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro
155
GCGACCÄGCA TGCTGAGCCC AGCAGGGAGA TTTTCCTCAG CACCCCTCAC CCCAAACAAC4994
CAGTGGCGGT TCACAGAAAG ACCCGGAAGC TGGAGTAGAA TCATGAGATG CAGGAGGCCC5054
TTGGTAGCTG TAGTAAAATA AAAGATGCTG CAGAGGCCGG GAGAGATGGC TCACGCCTGT5114
AATCCCAGCA CTTTAGGAGG CCCACACAGG TGGGTCACTT GAGCGCAGAA GTTCAAGACC5174
SK 286993 Β6
AGCCTGAAAA TCACTGGGAG ACCCCCATCT CTACACAAAA ATTAAAAATT AGCTGGGGAC 5234
TGGGCGCGGC GGCTCACCTC TGTAATCCCA GCACGTTGGG AGCCCAAGGT GGGTAGATCA 5294
CCTGAGGTCA GGAGTTTGAG ACCAGCCTGA CTAAAATGGA GAAACCTCTT CTCTACTAAA 5354
AATACAAAAT TAGCCAGGCG TGGTGGCGCT TGCCTGTAAT CCCAGCTACT CGGGAGGCTG 5414
AGGCAGGAGA ATCGCTTGAA CTCAGGAGGC GGAGGTTGCG GTGAGCCGAG ATCATGCCAC 5474
TGCACTCCAG CCTGGAGAAC AAGAGTAAAA CTCTGTCTCA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 5534
ATAGCCAGGC GTGGTATCTC ATGCCTCTGT CCTCAGCTAC CTGGGAGGCA GAGGTGGAAG 5594
GATCGCTTGA GCCCAGGGGT TCAAAGCTGC AGTGAGCCGT GGTCGTGCCA CTGCACTCCA 5654
GCCTGGGCGA CAGAGTGAGG CCCCATCTCA AAAATAAGAG GCTGTGGGAC AGACAGACAG 5714
GCAGACAGGC TGAGGCTCAG AGAGAAACCA GGAGAGCAGA GCTGAGTGAG AGACAGAGAA 5774
CAATACCTTG AGGCAGAGAC AGCTGTGGAC ACAGAAGTGG CAGGACACAG ACAGGAGGGA 5834
CTGGGGCAGG GGCAGGAGAG GTGCATGGGC CTGACCATCC TGCCCCCGÄC AAACACCACC 5894
CCCTCCAGCA CCACACCAAC CCAACCTCCT GGGGACCCAC CCCATACAGC ACCGCACCCG 5954
ACTCAGCCTC CTGGGACCCA CCCACTCCAG CAACCAACGT GACCTAGTCT CCTGGGACCC 6014
ACCCCCTCCA GCACCCTACC CGACCCAGCT TCTTAGGGAC CCACCÄTTTG CCAACTGGGC 6074
TCTGCCATGG CCCCAACTCT GTTGAGGGCA TTTCCACCCC ACCTATGCTC ATCTCCCCTC 6134
CTGGAGGCCA GGCCTGGGCC ACTGGTCTCT AGCACCCCCT CCCCTGCCCT GCCCCCAG GT 6194
Gly
160
AAC TAT GGC CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG6242
Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin His Met Ala íle Ala Trp Val LysArg
165 170175
AAT ATC GCG GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG6290
Asn íle Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn íle Thr Leu PheGly lfiO 185190
GAG TCT GCT GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG GTCTCGGGAT CCCTGTGGGG6343
Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gin
195200
AGGGCCTGCC CCACAGGTTG AGAGGAAGCT CAAACGGGAA GGGGAGGGTG GGAGGAGGAG6403
CGTGGAGCTG GGGCTGTGGT GCTGGGGTGT CCTTGTCCCA GCGTGGGGTG GGCAGAGTGG6463
GGAGCGGCCT TGGTGACGGG ATTTCTGGGT CCCGTAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC 6518 Thr Leu Ser Pro Ty r Asn
205
AAG GGC CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT6566
Lys Gly Leu íle Arg Arg Ala íle Ser Gin Ser Gly Val Ala LeuSer
210 215 220225
CCC TGG GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG ,6608
Pro Trp Val íle Gin Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala LysLys
Q235
GTAAACGGAG GAGGGCAGGG CTGGGCGGGG TGGGGGCTGT CCACATTTCC GTTCTTTATC6668
CTGGACCCCA TCCTTGCCTT CAAATGGTTC TGAGCCCTGA GCTCCGGCCT CACCTACCTG6728
CTCGCCTTCG TTCTCCCCCC AG GTC GCT GAG AAG GTC GGT TCC CCT GTC GGT 5780
Val Ala Glu Lys V4I Gly Cys Pro Val Gly 240 245
GAT GCC GCC AGG ATC GCC CAG TCT CTC AAG GTT ACT GAT CCC CGA GCC 6828
Asp Ala Ala Arg Met Ala Gin Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala
250 255 260 265
CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTC CCG CTC GCA GGC CTC GAG T GTCAGTAGCT 6878
Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu
270 275
GCTCGGGTTG GCCCATCGGG TCTCGAGGTC GGGGTTCAGG GGGGTACTCC CAGGGAGTAC 6938
TCCGGAGGAG AGAGGAAGGT GCCAGAGCTC CGGTCTTGTC CTCTCACCAA CTAGCTCGTC 6998
TCTCCCCTCG AAGGCCCCAG CTCTAAGGGA GAGGGGGTCC CGTTTCTTCT TTTTTTTTCA 7058
GATCGAGTCT CACTCTTCCC CAGGCTCGAG TCCAGTCTCA CGATCTCAGC TCACTGCAAC 7118
CTCCACCTCC TCGGTTCAAG TCATTCTCTC ACTCAACCTC CCATGTAGCT GGGACTACAG 7178
GCACATCCCA CCATCCCCAG ATAATTTTTC TCTCTCTTTA GTAGGGATCG AGTTTCATCG 7238
TCTTAGCTAG GATCATCTCG GTCTTCGGAC CTCÄTCATCT GCCCACCTCG GCCTCCCAAA 7298
GTCCTCGAAT TACAGGCGTC AGCCACTGTC CCCGGCCCCT TCTTTATTCT TATCTCCCAT 73S8
GAGTTACAGA CTCCCCTTTG AGAAGCTGAT GAACATTTCG GGCCCCCTCC CCCACCTCAT 7418
GCATTCATAT GCAGTCATTT GCATATAATT TTAGGGAGAC TCATAGACCT CAGACCAAGA 7478
GCCTTTCTCC TAGATCACCG TTCATTCATT CGTTCATTCA TTCAGCAAAC ATTTACTCAA 7538
CCGTAGCACT GGGGCCCAGC CTCCAGCTCC ACTATTCTGT ACCCCGGGAA GGCCTCGGGA 7598
CCCATTCCAC AAACACCTCT GCATCTCAGC CTTACCAGCT TCCTACGCTA AGGCTCTCCC 7658
TCACTCATTC TTCTATCGCA ACATCCCATC AAGCCAAGTC ATCTCCACGT TTACCTCACA 7718
TCAGCTCAAC TCCACGGGCT GGACAAGCCC AAACAAAGCA ACCCCCACGG CCCCGCTAGA 7778
AGCAAAACCT GCTCTCCTCG GCCCAGTCAC AGCCAGGCCC CGCCTCCCTC AGCAGCCACT 7838
GGGTCCTCTA GGGGCCCGTC CÄGGGGTCTG GAGTACAATC CAGACCTCCC ACCATTTTTC 7898
GCTCATCGAC TCGAACCCAG CCCTCAGAGA GGGAGCTCCT TCTCCATCAG TTCCCTCAGT 7958 '
GGCTTCTAAG TTTCCTCCTT CCTGCTTCAG GCCCAGCAAA GAGAGAGAGG AGAGGGAGGG 8018
GCTCCCGCTC AAGAGGACAG ATCTCGCCCT AGACAGTCAC TCTCAGCCTG GGGACGTCTC 8078
GCAGGGCCTC GAGACATCTC TCATTCTCAC AGCTCGGGAG GGGGTCCTCC TCGCACCTCG 8138
TGGGTCGAGG CCGGGGATCC TCTAAACATC CTACAGGGCA CAGGATCCCC CTGATCGTCC 8198
ÄGAATCAACC CTCCCCCAAG TCTCCATAGA TCAGAGAAGG GAGGACATAG CCAATTCCAG 8258
CCCTCAGAGG CAAGGGGCGG CTCAGGGGAA ACTCGGAGGT ACAAGAACCT GCTAACCTCC 8318
TGGCTCTCCC ACCCAG AC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT Tyr Pro Met Leu Hie Tyr Val Gly Phe Val Pro 8366
280 285
GTC ATT GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC Val íle Asp Gly Asp Phe íle Pro Ala Asp 290 295
CCG ATC AAC CTG TAC GCC Pro íle Asn Leu Tyr Ala 300 305
8414
AAC GCC GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC 8462
Asn Ala Ala Asp íle Asp Tyr íle Ala Gly Thr Asn Asn MeC Asp Gly
310 '315 320
CAC ATC TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG 8510
His íle Phe Ala Ser íle Asp Met Pro Ala íle Asn Lys Gly Asn Lys
325 330 335
AAA GTC ACG GA GTAAGCAGGG GGCACAGGAC TCAGGGGCGA CCCGTGCGGG 8561
Lys Val Thr Glu
340
AGGGCCGCCG GGAAAGCACT GGCGAGGGGG CCAGCCTGGA GGAGGAAGGC ATTGAGTGGA 0621 t
GGACTGGGAG TGAGGAAGTT AGCACCGGTC GGGGTGAGTA TGCACACACC TTCCTGTTGG 8681
CACAGGCTGA GTGTCAGTGC CTACTTGATT CCCCCAG G GAG GAC TTC TAC AAG 8734
Glu Asp Phe Tyr Lys
345
CTG Leu GTC Val AGT Ser GAG Glu 350 TTC ACA ATC ACC AAG GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG 8782
Phe Thr íle Thr Lys Gly 355 Leu Arg Gly Ala 360 Lys Thr
ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG 8830
Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gin Asp Pro Ser Gin Glu
365 370 375
AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG 8878
Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu
380 385 390
GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG CAC AGA GCC AAT GCC AA 8922
Val Pro Thr Glu íle Ala Leu Ala Gin His Arg Ala Asn Ala Lys
395 400 405
GTGAGGATCT GGGCAGCGGG TGGCTCCTGG GGGCCTTCCT GGGGTGCTGC ACCTTCCAGC 8982
CGAGGCCTCG CTGTGGGTGG CTCTCÄGGTG TCTGGGTTGT CTGGGAAAGT GGTGCTTGAG 9042
TCCCCACCTG TGCCTGCCTG ATCCACTTTG CTGAGGCCTG GCAAGACTTG AGGGCCTCTT 9102
TTTACCTCCC AGCCTACAGG GCTTTACAAA CCCTATGATC CTCTGCCCTG CTCAGCCCTG 9162
CACCCCATGG TCCTTCCCAC TGGAGAGTTC TTGAGCTACC TTCCATCCCC CATGCTGTGT 9222
GCACTGAGAG AACACTGGAC AATAGTTTCT ATCCACTGAC TCTTATGGGC CTCAACTTTG 9282
CCCATAATTT CAGCCCACCA CCACATTAAA AATCTTCATG TAATAATAGC CAATTATAAT 9342
AAAAAATAAG GCCAGACACA GTAGCTCATG CCTGTÄATCC CAGCACATTG GGAGGTCAAG 9402
GTGGGAGGAT CACTTGAGGT CAGGAGTCTG AGACTAGTCT GGCCAACATG GCAAAACCCC 9462
ATCTCTACTA AAAATACAAA AATTATCCAG GCATGGTGGT GCATGCCTAT AATCCTAGCT 9522
ACTCAGGAGG CTGAGGTAGC AGAATTGATT GACCCAGGGA GGTGGAGGTT GCAGTGAGCC 9582
GAGATTACGC CACTGCACTC CAGCAGGGGC AACAGAGTGA GACTGTGTCT CGAATAAATA 9642
AGTAAATAAA TAATAAAAAT AAAAAATAAG TTAGGAATAC GAAAAAGATA GGAAGATAAA 9702
AGTATACCTA GAAGTCTAGG ATGAAAGCTT TGCAGCAACT AAGCAGTACA TTTAGCTGTG 9762
AGCCTCCTTT CAGTCAAGGC AAAAAGGGAA ACAGTTGAGG GCCTATACCT TGTCCAATCT 9822
AATTGAAGAA TCCACATTCA CTTCGAGAGC AAAATATTTC TTGATACTGA ATTCTAGAAG 9882
GAAGGTGCCT CACAATGTTT TGTGGAGGTG AAGTATAAAT TCAGCTGAAÄ TTGTGGAACC9942 catcaAtcca TGAATTTGGT TCTCAGCTTT cccttccctg ggtgtaagaa GCCCCATCTC10002
TTCATGTGAA TTCCCCAGAC ACTTCCCTGC CCACTGCCCG GGACCTCCCT CCÄACTCCGG10062
TCTCTGGGCT GATCGGTCCC CAGTGAGCAC CCTGCCTACT TGCGTGGTCT CTCCCCTCCA10122
G G AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC CAT CCC TCT CGG ATG10169
Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser His Pro Ser ArgMet
410 415420
CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT GCA GAT GAC ATT CAG10217
Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp IleGin
425 430 435440
TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG GGC TAC CGG CCC CAA10265
Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg ProGin
445 450455
GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC TGG ACC AAC TTT GCC10313
Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met íle Ala Tyr Trp Thr Asn PheAla
460 465470
AAA ACA GG GTAAGACGTG GGTTGAGTGC AGGGCGGAGG GCCACAGCCG 103 61
Lys Thr Gly
475
AGAAGGGCCT CCCACCACGA GGCCTTGTTC CCTCATTTGC CAGTGGAGGG ACTTTGGGCA 10421
AGTCACTTAA CCTCCCCCTG CATCGGAATC CATGTGTGTT TGAGGATGAG AGTTACTGGC10481
AGAGCCCCAA GCCCATGCAC GTGCACAGCC AGTGCCCAGT ATGCAGTGAG GGGCATGGTG10541
CCCAGGGCCA GCTCAGAGGG CGGGGATGGC TCAGGCGTGC AGGTGGAGAG CAGGGCTTCA10601
GCCCCCTGGG AGTCCCCAGC CCCTGCACAG CCTCTTCTCA CTCTGCAG G GAC CCC10656
Asp Pro
AAC ATG GGC GAC TCG GCT GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG10704
Asn Met Gly Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr ThrThr
480 485490
GAA AAC AGC GGC TAC CTG GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC10752
Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser SerSer
495 500505
ATG AAG CGG AGC CTG AGA ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC10800
Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr LeuThr
510 515 . 520525
TAT CTG GCG CTG CCC ACA GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC10848
Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gin Glu Ala Thr Pro ValPro
530 ' 535 540‘
CCC ACA GGG GAC TCC GAG GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC10896
Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly AspSer
545 550555
GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GÄC TCC GGG GCC CCC CCC GTG10944
Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro ProVal
560 565 .570
CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC . 10992
Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr GlyAsp
575 580S85
SK 286993 Β6
TCC GGG GCC CCC Pro CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC Pro CCC Pro 605 11040
Ser 590 Gly Ala Pro Val 595 Pro Pro Thr Gly Asp 600 Ser Gly Ala
GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT 11088
Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly
610 615 620
GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC . 11136
Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro
625 63 0 635
CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC GCC GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG 11184
Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr
640 645 650
í GGT GAC TCC GGC GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC 11232
Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
655 660 665
CCC CCC GTG ACC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC 11280
Pro Pro Val Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro
670 675 630 685
ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCT GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCT GAG 11328
Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu
690 69 5 700
GCT GCC CCT GTG CCC CCC ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT 11376
Ala Ala Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gin Met Pro
705 710 715
GCA GTC ATT AGG TTT TAGCGTCCCA TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT 11431 Ala Val íle Arg Phe
720
GGGACCCCAG GGGCTCCCCT CCCATCTTGA GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTG 11491
TCGGTGTCTT TCTTTGCTCC CAAGGCTAAG CTGCAGGATC 11531

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. DNA molekula kódujúca ľudskú lipázu stimulovanú žlčovými soľami/karboxylester lipázu (BSSL/CEL) obsahujúca 11 exónov prerušených 10 intrónmi, zahŕňajúca Sphl fragment plazmidu pS309 (DSM 7101), Sací fragment plazmidu pS310 (DSM 7102) a BamHI fragment plazmidu pS311.
  2. 2. DNA molekula kódujúca ľudskú lipázu stimulovanú žlčovými soľami/karboxylester lipázu (BSSL/CEL) obsahujúca 11 exónov prerušených 10 intrónmi, ktorá hybridizuje s DNA molekulou podľa nároku 1 za stringentných hybridizačných podmienok.
  3. 3. Hybridný gén, ktorý je exprimovateľný v mliečnej žľaze dospelej samice cicavca, ktorým nie je človek, nesúca uvedený hybridný gén, pričom uvedený hybridný gén obsahuje DNA molekulu podľa nárokov 1 alebo 2, a ďalej obsahuje DNA molekulu kódujúcu mliečny proteín cicavca, ktorým nie je človek, pričom DNA molekula kódujúca ľudskú lipázu stimulovanú žlčovými soľami/karboxylester lipázu (BSSL/CEL) je vložená do uvedeného génu mliečneho proteínu tak, že ľudská lipáza stimulovaná žlčovými soľami/karboxylester lipáza (BSSL/CEL) je produkovaná, ak je hybridný gén exprimovaný.
  4. 4. Hybridný gén podľa nároku 3, kde gén mliečneho proteínu cicavca, ktorým nie je človek, je vybraný z génu kódujúceho srvátkové proteiny a kazeíny.
  5. 5. Hybridný gén podľa nárokov 3 alebo 4,kde mliečny proteín je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z ot-kazeínu, /3-kazeínu, K-kazeínu, α-laktanbumínu a β-laktanbumínu, výhodne, kde gén je vybraný zo srvátkového kyslého proteínu (WAP), ovčieho /3-laktoglobulínu, hovädzieho oSl-kazeínu a králičieho /3-kazeínu.
  6. 6. Replikovateľný expresný vektor, ktorý nesie DNA molekulu podľa nárokov 1 alebo 2, alebo hybridný gén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 5, pričom vektor je schopný sprostredkovať expresiu DNA sekvencie kódujúcej ľudskú lipázu stimulovanú žlčovými soľami/karboxylester lipázu (BSSL/CEL).
  7. 7. Vektor podľa nároku 6 obsahujúci regulátorové elementy kontrolujúce expresiu do mliečnej žľazy cicavca, ktorým nie je človek.
    SK 286993 Β6
  8. 8. Cicavčí expresný vektorový systém, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa hybridný gén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 5.
  9. 9. Cicavčia bunka nesúca replikovateľný expresný vektor podľa nárokov 6 alebo 7, s podmienkou, že bunka nie je ľudskou bunkou embrya.
  10. 10. Cicavčia bunka nesúca expresný vektorový systém podľa nároku 8, s podmienkou, že bunka nie je ľudskou bunkou embrya.
  11. 11. Cicavčia bunka, nie ľudská, podľa nároku 9 alebo 10, ktorou je bunka embrya.
  12. 12. Spôsob produkcie transgénneho cicavca, ktorým nie je človek, schopného exprimovať ľudskú lipázu stimulovanú žlčovými soľami/karboxylester lipázu (BSSL/CEL), vyznačujúci sa tým, že zahrnuje zavedenie expresného vektorového systému podľa nároku 8 do oplodneného vajíčka alebo bunky embrya cicavca, ktorým nie je človek, tak že sa zabuduje uvedený expresný vektorový systém do zárodočnej línie cicavca; a vyvinutie vzniknutého zavedeného oplodneného vajíčka alebo embrya do dospelej samice cicavca, ktorým nie je človek.
  13. 13. Spôsob produkcie transgénneho cicavca, ktorý nie je človek, schopného exprimovať ľudskú lipázu stimulovanú žlčovými soľami/karboxylester lipázu (BSSL/CEL) a v podstate neschopného exprimovať lipázu stimulovanú žlčovými soľami/karboxylester lipázu (BSSL/CEL) z cicavca samotného, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa zničenie schopnosti exprimovať cicavčiu lipázu stimulovanú žlčovými soľami/karboxylester lipázu (BSSL/CEL) cicavca tak, že v podstate nie je exprimovaná žiadna cicavčia lipáza stimulovaná žlčovými soľami/karboxylester lipáza (BSSL/CEL) a vloženie expresného vektorového systému podľa nároku 8 do zárodočnej línie cicavca takým spôsobom, že ľudská lipáza stimulovaná žlčovými soľami/karboxylester lipáza (BSSL/CEL) je v cicavcovi exprimovaná; alebo nahradenie génu cicavčej lipázy stimulovanej žlčovými soľami/karboxylester lipázy (BSSL/CEL) alebo jeho časti expresným vektorovým systémom podľa nároku 8.
  14. 14. Transgénny cicavec, ktorým nie je človek, schopný exprimovania a exkrécie ľudskej lipázy stimulovanej žlčovými soľami/karboxylester lipázy (BSSL/CEL) do ich mlieka, nesúci vo svojej zárodočnej línii hybridný gén podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 5, expresný vektor podľa nároku 7 alebo expresný vektorový systém podľa nároku 8.
  15. 15. Transgénny cicavec, ktorým nie je človek, podľa nároku 14, pričom cicavec je zvolený zo skupiny zahŕňajúcej myši, krysy, králiky, ovce, kozy, ošípané a dobytok.
  16. 16. Transgénny cicavec, ktorým nie je človek, podľa nároku 15, pričom cicavec je zvolený zo skupiny zahŕňajúcej králiky, ovce, kozy a dobytok.
  17. 17. Potomstvo transgénneho cicavca, ktorým nie je človek, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 14 až 16, ktoré je schopné produkcie ľudskej lipázy stimulovanej žlčovými soľami/karboxylester lipázy (BSSL/CEL).
  18. 18. Použitie transgénneho cicavca, ktorým nie je človek, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 14 až 17 na produkciu mlieka.
  19. 19. Použitie mlieka produkovaného podľa nároku 18 na produkciu prípravkov pre dojčatá.
SK1486-94A 1992-06-11 1993-06-09 DNA sekvencie používané pri produkcii rekombinantnej BSSL/CEL u transgénnych cicavcov, ktorými nie sú ľudia, a produkované BSSL/CEL v dojčenskej výžive SK286993B6 (sk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9201809A SE9201809D0 (sv) 1992-06-11 1992-06-11 New dna sequences
SE9201826A SE9201826D0 (sv) 1992-06-12 1992-06-12 New dna sequences ii
SE9202088A SE9202088D0 (sv) 1992-07-03 1992-07-03 New dna sequences iii
SE9300902A SE9300902D0 (sv) 1993-03-19 1993-03-19 New dna sequences iv
PCT/SE1993/000515 WO1993025669A1 (en) 1992-06-11 1993-06-09 Dna sequences used in the production of recombinant human bssl/cel in transgenic non-human mammals, and the produced bssl/cel used in infant formulas

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK148694A3 SK148694A3 (en) 1995-08-09
SK286993B6 true SK286993B6 (sk) 2009-09-07

Family

ID=27484751

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1486-94A SK286993B6 (sk) 1992-06-11 1993-06-09 DNA sekvencie používané pri produkcii rekombinantnej BSSL/CEL u transgénnych cicavcov, ktorými nie sú ľudia, a produkované BSSL/CEL v dojčenskej výžive

Country Status (31)

Country Link
US (2) US5616483A (sk)
EP (1) EP0651793B1 (sk)
JP (1) JP4231105B2 (sk)
KR (1) KR100357670B1 (sk)
CN (1) CN1071791C (sk)
AP (1) AP411A (sk)
AT (1) ATE447012T1 (sk)
AU (1) AU670598B2 (sk)
CA (1) CA2137815C (sk)
CZ (1) CZ288677B6 (sk)
DE (1) DE69334298D1 (sk)
DK (1) DK0651793T3 (sk)
ES (1) ES2335626T3 (sk)
FI (1) FI945793A (sk)
HR (1) HRP930935A2 (sk)
HU (1) HU220338B (sk)
IL (1) IL105874A (sk)
IS (1) IS4029A (sk)
MA (1) MA22905A1 (sk)
MX (1) MX9303439A (sk)
NO (1) NO944715L (sk)
NZ (1) NZ253391A (sk)
PH (1) PH31680A (sk)
PT (1) PT651793E (sk)
RU (1) RU2128708C1 (sk)
SG (1) SG52580A1 (sk)
SI (1) SI9300319A (sk)
SK (1) SK286993B6 (sk)
TN (1) TNSN93067A1 (sk)
UA (1) UA41322C2 (sk)
WO (1) WO1993025669A1 (sk)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX198456B (es) * 1994-03-09 2000-09-05 Abbott Lab Animales trangenicos que producen oligosacaridos y glucoconjugados.
US5907080A (en) * 1995-11-30 1999-05-25 Nexia Biotechnologies, Inc. Method for development of transgenic dwarf goats
CN1167793C (zh) * 1996-12-06 2004-09-22 阿温蒂斯药物公司 人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法
US7008776B1 (en) * 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
FR2763958A1 (fr) * 1997-05-29 1998-12-04 Transgene Sa Produit de combinaison associant un acide nucleique a une substance desorganisant la matrice extracellulaire pour la therapie genique
US20010006630A1 (en) * 1997-09-02 2001-07-05 Oron Yacoby-Zeevi Introducing a biological material into a patient
US6699672B1 (en) * 1997-09-02 2004-03-02 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use research and medical applications
US20040213789A1 (en) * 1997-09-02 2004-10-28 Oron Yacoby-Zeevi Heparanase activity neutralizing anti-heparanase monoclonal antibody and other anti-heparanase antibodies
US6177545B1 (en) * 1997-09-02 2001-01-23 Insight Strategy & Marketing Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications
US20020088019A1 (en) * 1997-09-02 2002-07-04 Oron Yacoby-Zeevi Methods of and pharmaceutical compositions for improving implantation of embryos
SE9801424D0 (sv) * 1998-04-22 1998-04-22 Astra Ab Expression methods
US20030217375A1 (en) * 1998-08-31 2003-11-20 Eyal Zcharia Transgenic animals expressing heparanase and uses thereof
AU2878600A (en) * 1999-03-01 2000-09-21 Hadasit Medical Research Services & Development Company Ltd Polynucleotide encoding a polypeptide having heparanase activity and expression of same in genetically modified cells
CA2365918A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Human Genome Sciences, Inc. 49 human secreted proteins
WO2001089553A1 (en) * 1999-05-19 2001-11-29 Barnes Jewish Hospital Enhanced triglyceride digestion in a deficiency of bile salts
AU2001283062A1 (en) 2000-08-02 2002-02-13 The Johns Hopkins University Endothelial cell expression patterns
IT1319655B1 (it) 2000-11-15 2003-10-23 Eurand Int Microsfere di enzimi pancreatici con elevata stabilita' e relativometodo di preparazione.
US20100268658A1 (en) * 2001-05-14 2010-10-21 Prolacta Bioscience Method for collecting, testing and distributing milk
US20020182243A1 (en) * 2001-05-14 2002-12-05 Medo Elena Maria Method of producing nutritional products from human milk tissue and compositions thereof
US6671189B2 (en) * 2001-11-09 2003-12-30 Minebea Co., Ltd. Power converter having primary and secondary side switches
US20030213007A1 (en) * 2002-03-27 2003-11-13 Slattery Charles Wilbur Human milk produced by human mammary tissue implanted in non-human host animals and uses thereof
WO2004108065A2 (en) * 2003-06-09 2004-12-16 Insight Biopharmaceuticals Ltd. Heparanase activity neutralizing anti- heparanase monoclonal antibody and other anti-heparanase antibodies
WO2007035870A2 (en) * 2005-09-20 2007-03-29 Prolacta Bioscience, Inc. A method for testing milk
WO2007089133A1 (en) * 2006-02-03 2007-08-09 Academisch Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam Means and methods for influencing interactions between dc-sign and dc-sign ligands
CA2706722C (en) * 2006-11-29 2016-01-12 Prolacta Bioscience, Inc. Human milk compositions and methods of making and using same
JP5616066B2 (ja) * 2006-12-08 2014-10-29 プロラクタ バイオサイエンス，インコーポレイテッド ヒト脂質組成物ならびにその製造および使用方法
US8221747B2 (en) 2007-02-20 2012-07-17 Aptalis Pharma Limited Stable pancreatic enzyme compositions
US10087493B2 (en) 2008-03-07 2018-10-02 Aptalis Pharma Canada Ulc Method for detecting infectious parvovirus in pharmaceutical preparations
US8927027B2 (en) 2008-12-02 2015-01-06 Prolacta Bioscience Human milk permeate compositions and methods of making and using same
EA029101B1 (ru) 2010-10-01 2018-02-28 Апталис Фарма Лимитид Составы с низкой дозой панкрелипазы и кишечнорастворимым покрытием
CA2812852A1 (en) * 2010-10-21 2012-04-26 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Method to increase the absorption of unsaturated fatty acids by human infants
JP5850940B2 (ja) * 2010-10-21 2016-02-03 スウェディッシュ オーファン バイオビトラム パブリーク アクチエボラグ ヒト乳児の発育速度を増大させる方法
CN103987265B (zh) 2011-08-03 2017-05-24 普罗莱克塔生物科学公司 减少细菌污染的人乳微滤
US9976171B2 (en) 2011-08-08 2018-05-22 Allergan Pharmaceuticals International Limited Method for dissolution testing of solid compositions containing digestive enzymes
CN103088000A (zh) * 2012-03-23 2013-05-08 北京济福霖生物技术有限公司 在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法
EP3103872B1 (en) * 2012-07-12 2018-08-29 ProQR Therapeutics II B.V. Oligonucleotides for making a change in the sequence of a target rna molecule present in a living cell
ES2843254T3 (es) 2013-03-13 2021-07-16 Prolacta Bioscience Inc Productos de leche humana rica en grasas
ES2784227T3 (es) 2013-08-09 2020-09-23 Allergan Pharmaceuticals Int Ltd Composición de enzimas digestivos adecuada para la administración entérica
AU2015275860A1 (en) 2014-06-19 2016-11-03 Aptalis Pharma Ltd. Methods for removing viral contaminants from pancreatic extracts
EP3397064A4 (en) 2015-12-30 2019-10-30 Prolacta Bioscience, Inc. HUMAN MILK PRODUCTS USEFUL IN PRE- AND POST-OPERATIVE CARE

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3256150A (en) * 1964-04-20 1966-06-14 Dairyland Food Lab Method for treating malabsorption syndrome
GB1509866A (en) * 1975-06-10 1978-05-04 Johnson & Johnson Enteric coated digestive enzyme compositions
US4873316A (en) * 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5200183A (en) * 1987-11-19 1993-04-06 Oklahoma Medical Research Foundation Recombinant bile salt activated lipases
US4944944A (en) * 1987-11-19 1990-07-31 Oklahoma Medical Research Foundation Dietary compositions and methods using bile salt-activated lipase
US5173408A (en) * 1989-11-13 1992-12-22 Lange Louis George Iii Mammalian pancreatic cholesterol esterase
WO1991015534A1 (en) * 1990-03-30 1991-10-17 Allied-Signal Inc. Electrically conductive poly(aromatic vinylenes) and poly(heteroaromatic vinylenes)
SE9001985D0 (sv) * 1990-06-01 1990-06-01 Astra Ab New chemical products

Also Published As

Publication number Publication date
WO1993025669A1 (en) 1993-12-23
NO944715D0 (no) 1994-12-07
CN1086262A (zh) 1994-05-04
IL105874A0 (en) 1993-10-20
HUT71789A (en) 1996-02-28
CN1071791C (zh) 2001-09-26
CZ309194A3 (en) 1995-07-12
HU9403536D0 (en) 1995-02-28
HU220338B (hu) 2001-12-28
HRP930935A2 (en) 1994-12-31
MA22905A1 (fr) 1993-12-31
ATE447012T1 (de) 2009-11-15
JPH07507687A (ja) 1995-08-31
EP0651793A1 (en) 1995-05-10
CA2137815A1 (en) 1993-12-23
AU4366793A (en) 1994-01-04
FI945793A (fi) 1995-02-09
EP0651793B1 (en) 2009-10-28
JP4231105B2 (ja) 2009-02-25
SI9300319A (en) 1994-03-31
CZ288677B6 (cs) 2001-08-15
SK148694A3 (en) 1995-08-09
IS4029A (is) 1993-12-12
AP411A (en) 1995-09-28
PH31680A (en) 1999-01-18
RU94046360A (ru) 1997-06-10
UA41322C2 (uk) 2001-09-17
MX9303439A (es) 1994-04-29
AP9300538A0 (en) 1993-07-31
DK0651793T3 (da) 2010-03-15
FI945793A0 (fi) 1994-12-09
US5616483A (en) 1997-04-01
RU2128708C1 (ru) 1999-04-10
CA2137815C (en) 2010-11-09
NO944715L (no) 1995-02-07
TNSN93067A1 (fr) 1994-03-17
PT651793E (pt) 2010-01-20
NZ253391A (en) 1996-01-26
SG52580A1 (en) 1998-09-28
IL105874A (en) 1998-12-27
KR100357670B1 (ko) 2003-04-11
DE69334298D1 (de) 2009-12-10
US5716817A (en) 1998-02-10
AU670598B2 (en) 1996-07-25
ES2335626T3 (es) 2010-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AP411A (en) DNA sequences used in the production of recombinant human BSSL/CEL in transgenic non-human mammals, and the produced BSSSL/CEL used in infant formulas.
US20070011754A1 (en) Lysosomal proteins produced in the milk of transgenic animals
US5827683A (en) Nucleic acids encoding BSSL variants
US6525241B1 (en) Expression methods
Poorkhalkali et al. Bile salt-stimulated lipase (BSSL) distribution in rat, mouse and transgenic mouse expressing human BSSL
PL175404B1 (pl) Wyizolowana cząsteczka DNA i sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL
LT4008B (en) Novel polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20130609