ES2334421B1 - Levaduras vinicas recombinantes. - Google Patents
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Abstract
Levaduras vínicas recombinantes.
Método de obtención de cepas que secretan una
mayor concentración de manoproteínas al medio, cepa de la levadura
Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Española
de Cultivos Tipo (CECT), con el número CECT 13012, y usos de dichas
cepas.
Description
Levaduras vínicas recombinantes.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la biología molecular aplicada a la alimentación, de la
ingeniería genética, y más específicamente en el campo de la
enología. En concreto se refiere a levaduras vínicas recombinantes
que estabilizan el vino frente a la quiebra proteica y secretan
mayor cantidad de manoproteínas que las cepas no modificadas, así
como su modo de obtención. Estas cepas permiten además mejorar la
calidad del vino, gracias a su contribución al aumento en la
concentración de manoproteínas, sin recurrir a la adición de
preparados exógenos, permitiendo reducir el consumo de bentonita,
con el consiguiente ahorro en producto, así como la reducción del
impacto negativo de la bentonita en la complejidad sensorial del
vino y en la recuperación volumétrica de vino tras el
tratamiento.
La industria del vino tiene una gran importancia
económica y social, ya no exclusivamente en las regiones de clima
mediterráneo, sino que el sector vitivinícola ha alcanzado
importancia mundial. Por tanto, el control de los procesos que
tienen lugar en la viticultura, es fundamental para el desarrollo y
expansión de esta industria.
Uno de los problemas que suele afectar a los
vinos blancos y rosados, en la fase de fermentación, es la quiebra
proteica. Se conoce como quiebra proteica el enturbiamiento
ocasional de los vinos blancos y rosados que se produce por una
floculación (reposo) de las proteínas naturales de la uva, debido a
las altas temperaturas o el tiempo de almacenamiento. Esta turbidez
puede ser apreciada por los consumidores como una alteración
(Waters, E., Dupin, I. and Stockdale, V. 2000. A review of current
knowledge on polysaccharides that protect against protein haze in
white wine. Aust. Grapegrower Winemaker, 438a:
13-16).
Actualmente, el único sistema realmente eficaz
para evitar la quiebra proteica es la eliminación de las proteínas
inestables, lo que únicamente se puede conseguir con el tratamiento
con bentonita o mediante ultrafiltración.
No obstante, la clarificación con bentonita es
un proceso que afecta la calidad sensorial del vino. Al eliminar
gran parte de las proteínas, el vino pierde estructura y
untuosidad. Además la bentonita afecta seriamente el aroma del
vino, ya que absorbe directamente aromas, o indirectamente ya que
las proteínas son fijadores de aromas y al ser eliminadas del vino
arrastran con ellas parte de estos aromas. Además, las proteínas
son moléculas tensoactivas y se ha comprobado que son factores muy
positivos para la espumabilidad y la persistencia de la espuma de
los vinos espumosos. La alternativa de la ultrafiltración también
afecta significativamente el aroma y la untuosidad del vino, además
de que su implantación requiere llevar a cabo una inversión
cuantiosa por parte de las bodegas.
El origen de las proteínas del vino es múltiple,
ya que pueden proceder de la misma uva, de las levaduras por
autolisis y de los productos de clarificación o de los coadyuvantes
de tiraje de naturaleza proteica. Por ello, la fracción proteica de
un vino estará condicionada entre otros por aspectos tales como la
variedad vinífera, el grado de madurez, el sistema de vinificación,
la cepa de levadura, el tiempo de contacto con las lías, la dosis y
el tipo de clarificante empleado, y el en el caso de los vinos
espumosos, por el tiempo de crianza y por el tipo y la dosis del
coadyuvante de tiraje empleado.
Las proteínas fundamentalmente implicadas en la
quiebra proteica son las procedentes de la uva, mientras que parece
que las manoproteínas liberadas por las levaduras en la
vinificación ejercen un efecto estabilizador frente a la misma, ya
que actúan como coloides protectores e incrementan la estabilidad
del vino. Por tanto, la cepa de levadura, que es uno de los factores
que controlan la cantidad de manoproteínas liberadas durante la
producción enológica, es un factor determinante de la quiebra
proteica. Además las levaduras liberan constituyentes celulares,
como proteínas o polisacáridos, que también contribuyen a la
calidad del vino (Feuillat, M. 2003. Yeast macromolecules: Origin,
Composition and Enological interest. Am J. Enol. Vitic. 54:
211-213). Otras propiedades enológicas de las
manoproteínas son la protección frente a la inestabilidad
tartárica, la retención de compuestos del aroma, la reducción de la
astringencia, aumento de la sensación dulce, y aumento del cuerpo y
redondez en boca, especialmente apreciados en vino tinto. Además,
las manoproteínas estimulan el crecimiento de bacterias lácticas, y
consecuentemente la fermentación maloláctica, y mejoran la calidad
de la espuma de vinos espumosos.
Algunas proteínas concretas de la pared celular
de la levadura se ha demostrado específicamente que son capaces de
estabilizar el vino frente a quiebra proteica (Waters, E.J.,
Wallace, W., Tate, M.E. and Williams, P.J. 1993. Isolation and
partial charachterization of a natural haze protective factor from
wine. J. Agric. Food Chem. 41:724-730;
Waters, E.J., Pellerin, P. and Brillouet, J.M. 1994. A
Saccharomyces mannoprotein that protects wine from protein haze.
Carbohydr. Polym. 23:185-191.). Brown y
colaboradores (Brown et al. 2007. Reducing haziness in white
wine by overexpression of Saccharomyces cerevisiae genes
YOL155c and YDR055w. Appl. Microbiol. Biotechnol.
73:1363-1376) clonaron y sobreexpresaron en cepas de
laboratorio de S. cerevisiae los genes YOL155c and YDR055w,
que codifican respectivamente las proteínas Hpf1p y Hpf2p, y
demostraron que la proteína Hpf2 así producida reducía la turbidez
hasta un 40% cuando se añadía al vino. Sin embargo no existe
ninguna cepa vínica recombinante que secrete más manoproteínas
durante la fermentación alcohólica.
\newpage
La estrategia general en ingeniería genética
para sobreexpresar una determinada proteína es clonar el gen, o los
genes, que codifican dicha proteína en el organismo de interés.
Dicho gen o proteína de interés, comprendido en una secuencia
polinucleotídica, es introducido en el organismo hospedador,
generalmente mediante un sistema o vector de expresión génica,
operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la
transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con
otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su
regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de
inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación,
origen de replicación, activadores transcripcionales
(enhancers), silenciadores transcripcionales
(silencers), etc... Existen numerosos ejemplos, como la
solicitud de patente WO/2003/04037, o la patente estadounidense US
6,274,311.
En resultados previos con cepas de laboratorio,
se ha demostrado que, no la inserción, sino la deleción de los
genes FKS1, GPI7, GAS1 ó KNR4 (aunque en este
contexto no es muy importante sería más correcto poner en itálica
los nombres de los genes, pero no de las proteínas, a lo largo de
todo el texto, los he señalado en azul), daba lugar a un incremento
en la liberación de manoproteínas en medios de cultivo
(González-Ramos, D. and González, R. 2006. Genetic
determinants of the release of mannoproteins of enological interest
by Saccharomyces cerevisiae. J. Agric. Food Chem.
54:9411-9416). Este fenotipo es recesivo y depende
del fondo genético. El sobrenadante de las cepas que carecen de
todas las copias de los genes correspondientes es más rico en
manoproteínas que el de las cepas control, ya desde el inicio de la
fase estacionaria. Cuando se añaden exógenamente a un vino, los
polisacáridos aislados de estos sobrenadantes permiten mejorar la
estabilidad proteica de los vinos acabados, de acuerdo con el
contenido relativo en manoproteínas de cada uno.
Existe la necesidad de obtener vinos de elevada
estabilidad frente a la quiebra proteica y que conserve las
cualidades organolépticas óptimas, no mermando la calidad de los
mismos mediante la adición en elevadas cantidades de otros
componentes, como la bentonita. Las manoproteínas liberadas por las
levaduras en la vinificación actúan como coloides protectores e
incrementan la estabilidad del vino, ejerciendo un efecto
estabilizador frente a la quiebra proteica, además de mejorar
algunas cualidades organolépticas del vino resultante.
A pesar de los resultados previos obtenidos en
cepas de laboratorio, la mejora genética de cepas industriales
implica la superación de dos problemas técnicos:
1- El efecto impredecible del fondo genético de
las cepas industriales sobre el fenotipo de los mutantes, ya que
los estudios de laboratorio habían revelado una importante
influencia del fondo genético.
2- En cepas de laboratorio, el incremento en la
secreción de manoproteínas siempre ha estado aparejado a problemas
de crecimiento, de modo que cabría esperar dificultades para la
fermentación del mosto de uva, al realizar la modificación de cepas
industriales.
Los autores de la presente invención, mediante
ingeniería genética, han desarrollado un método que permite obtener
cepas que incrementan la secreción de manoproteínas. Además, han
obtenido una cepa, que tiene delecionado el gen KNR4, y que
incrementa la secreción de dichas manoproteínas sin disminuir la
tasa de crecimiento, manteniendo los niveles de fermentación
adecuados. Estas manoproteínas de la pared celular aportan
características beneficiosas al vino resultante, como estabilidad
proteica y tartárica, estabilidad en el aroma y color, o
astringencia.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se
proporciona un método para obtener cepas de levadura recombinantes
industriales (de aquí en adelante método de la invención), que
aumentan la concentración de manoproteínas secretadas al medio, y
que comprende delecionar en un fondo genético de cepas de
levadura industriales genes relacionados con la biogénesis de
la pared celular o la liberación de proteínas. Preferiblemente, las
cepas pertenecen al género Saccharomyces, y más
preferiblemente, a la especie S. cerevisiae. Entre los genes
delecionados, preferiblemente se encuentran GPI7, FKS1 y
GAS1, y aún más preferiblemente el gen KNR4.
El término "levadura" en esta memoria, se
aplica a diversos hongos ascomicetos unicelulares que se reproducen
por gemación o división, y llevan a cabo la fermentación alcohólica
de los hidratos de carbono. Así, se encuentran incluidos dentro de
este término todos los organismos que pueden ser clasificados
dentro del Orden Saccharomycetales, y especialmente todas las
especies que se encuentran dentro del género Saccharomyces.
También incluye las especies de Hanseníaspora (principalmente H.
uvarum).
Por "fondo genético" se entiende la
información genética total que poseen los miembros reproductores de
una población de organismos o especie, o cepa en cierto
momento.
GPI7 (YJL062w) es un gen que codifica una
enzima involucrada en las síntesis del anclaje GPI. El GPI es una
estructura que interviene en la unión de algunas proteínas a la
membrana plasmática o a la pared celular.
GAS1 (YMR307w) codifica para una
glicoproteína de la membrana plasmática. GAS1p posee
actividad
\beta-1,3-glucanosiltransferasa y
está involucrada en la elongación de las ramificaciones
\beta-1,3-glucano.
FKSI (YLR342w) codifica para una
subunidad de la
\beta-1,3-glucanosintasa.
KNR4 (YGR229c) codifica una proteína
reguladora y está también involucrado en la síntesis de
\beta-1,3-glucano.
\vskip1.000000\baselineskip
Generalmente, los métodos de deleción implican
varios pasos de clonación, y comprenden la construcción de un
cassette de deleción que contiene un cassette de expresión para un
gen marcador flanqueado con secuencias de pares de bases
correspondientes al promotor y terminador del gen a delecionar.
Posteriormente, los casetes de deleción se amplifican por PCR y se
utilizan para transformar las cepas de levaduras industriales
seleccionadas. A continuación, los transformantes se seleccionan en
función de dicho gen marcador. En el caso de los genes KNR4,
GPI7, FKS1 y GAS1 el fenotipo de mayor liberación de
manoproteínas ligado a los mismos es recesivo, por lo que es
necesario delecionar todas las copias de los mismos en los dos
fondos genéticos que se seleccionen, utilizando diversos cassettes
de deleción con diferentes genes marcadores.
Un "cassette" o "casete" es una región
codificante de un gen procedente de un organismo procariota o
eucariota flanqueada por los elementos reguladores necesarios para
su expresión in vivo o in vitro. Aunque los casetes de
expresión pueden tener configuraciones muy variadas, deben contener
por lo menos un promotor (promoter), una región codificante
(ADNc eucariota o gen procariota) y un terminador de la
transcripción (terminator) o un sitio de poliadenilación, según se
trate de un gen derivado de un organismo procariota o de un ADNc
procedente de un organismo eucariota. A esta configuración básica
se le añade, si fuera necesario, una secuencia con función
reguladora para la expresión natural del gen en el sistema elegido,
p. ej.: un operador, un potenciador, la secuencia de Shine y
Dalgarno para la unión al ARNr de E. coli, o las secuencias
de un péptido señal (si la proteína se exporta).
Otro aspecto de la invención lo constituyen las
cepas obtenidas por el método de la invención. Dichas cepas
tendrían un fondo genético en el que estarían delecionados genes
relacionados con una mayor secreción de manoproteínas al medio.
Preferiblemente, las cepas tendrían delecionados todas las copias
presentes en el genoma de los genes KNR4, GPI7, FKS1, GAS1, o
cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente las cepas
tendrían delecionado el gen KNR4.
En otro aspecto de la invención se proporciona
una cepa de la levadura Saccharomyces cerevisiae, depositada
el 14 de mayo de 2008 en la Colección Española de Cultivos Tipo
(CECT), con el número CECT 13012.
Los organismos de la especie Saccharomyces
cerevisiae pertenecen al Superreino Eukaryota, (grupo
Metazoa/Fungi), Reino Fungi, Subreino
Dikarya, Phylum Ascomycota, Subphylum
Saccharomycotina, Clase Saccharomycetes, Orden
Saccharomycetales, Familia Saccharomycetaceae y Género
Saccharomyces.
La cepa de Saccharomyces cerevisiae de la
invención (CECT 13012), que se ha obtenido mediante el método de la
invención, es capaz de secretar una gran cantidad de manoproteínas
en todas las condiciones de cultivo ensayadas. Dichas manoproteínas
estabilizan el vino resultante frente a la quiebra proteica, por lo
que la cantidad de bentonita que es necesario añadir a estos vinos
es hasta un 25% menor, con lo que se incrementan las cualidades
sensoriales y organolépticas del vino resultante.
Otro aspecto se refiere al uso de la cepa de
Saccharomyces cerevisiae de la invención para la
fermentación alcohólica. Más preferiblemente, la cepa de la
invención se usa para la vinificación de vinos blancos y rosados,
así como vinos tintos o vinos espumosos.
La fermentación alcohólica es un proceso
biológico de fermentación en plena ausencia de aire (oxígeno),
originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan
los hidratos de carbono (por regla general azúcares: como pueden
ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidón,
etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de
etanol, dióxido de carbono en forma de gas y unas moléculas de ATP
que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular
energético anaeróbico. Esta producción de etanol es característica
de la elaboración de algunas bebidas alcohólicas, tales como el
vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc.
Por "vinificación" se entiende la
fermentación del mosto de la uva, y la consecuente transformación
del zumo de ésta en vino.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
Figura 1 (Fig. 1). Concentración de
polisacáridos liberados en medio GCY por cepas delecionadas en los
genes KNR4, FKS1, GPI7 o GAS1. A- Cepas delecionadas en KNR4. B-
Cepas delecionadas en GPI7. C- Cepas delecionadas en FKS1. D- Cepas
delecionadas en GAS1.
Figura 2 (Fig. 2). Cinética de producción de CO2
por cepas salvajes (T73-4 y EC1118) or
recombinantes (EKD-13 y TKD-123) en
mostos Sauvignon Blanc de las cosechas 2006 y 2007. A- Cosecha
2006, cepas T73-4 y TKD-123. B-
Cosecha 2007, cepas T73-4 y TKD-123.
C- Cosecha 2006, cepas EC1118 y EKD-13. D- Cosecha
2007, cepas EC1118 y EKD-13.
Figura 3 (Fig. 3). Comparación de las
manoproteínas presentes en vinos Sauvignon Blanc fermentados con
EC1118 y EKD-13. A: vino del 2007; B: vino del
2006; 1: EC1118; 2: EKD-13.
Figura 4 (Fig. 4). Turbidez inducida de vinos
Sauvignon blanc fermentados con las diferentes cepas salvajes o
recombinantes obtenidos sobre mostos de las cosechas 2006 y 2007.
A- Cosecha 2006, cepas T73-4,
TKD-123 y TGD-13. B- Cosecha 2006,
cepas EC1118, EKD-13 y EFD-31. C-
Cosecha 2007, cepas T73-4, TKD-123,
TGD-13 y TGASD-31. D- Cosecha 2007,
cepas EC1118, EKD-13, EGD-13 y
EFD-31.
Figura 5 (Fig. 5). Estabilización por bentonita
de vinos Sauvignon Blanc obtenidos con EC1118 y las cepas
recombinantes EKD-13, EGD-13 y
EFD-13.
Figura 6 (Fig. 6): Manoproteínas que quedan tras
cada tratamiento con bentonita de los vinos obtenidos con EC1118 o
EKD-13.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la utilidad del método desarrollado, y de la cepa de la
invención, para disminuir la quiebra proteica en los vinos
obtenidos utilizando las cepas recombinantes. Se ensayó la deleción
de los genes KNR4, GPl7, FKS1 y GAS1 en dos fondos
genéticos industriales de Saccharomyces cerevisiae (EC1118 y
T73-4).
El fenotipo de mayor liberación de manoproteínas
ligado a la deleción de los genes KNR4, GPI7, FKS1 y
GAS1 es recesivo, de modo que fue necesario delecionar todas
las copias de los mismos en los dos fondos genéticos seleccionados.
Cada copia se delecionó usando un marcador de selección diferente,
se utilizaron ARO4-OFP y KanMX4, y en
el caso de una de las cepas, se utilizó también URA3 debido
a la presencia de una tercera copia del gen KNR4.
Los cassettes de deleción se construyeron
flanqueando el gen marcador con secuencias de alrededor de 500
pares de bases correspondientes al promotor y terminador del gen a
delecionar.
En primer lugar se clonó el marcador
ARO4-OFP en el plásmido bacteriano pUC19.
ARO4-OFP se aisló del plásmido pEA2
(Cebollero, E. and González, R. 2004. Comparison of two alternative
dominant selectable marker for wine yeast transformation. Appl.
Environ. Microbiol. 70:7018-7023) mediante su
digestión con las enzimas de restricción SacI y BamHI
y se insertó por ligación en pUC19 digerido con las mismas enzimas.
El plásmido resultante se denominó pUCARO.
Los cassettes de deleción de los diferentes
genes se construyeron como se describe a continuación.
- \bullet
- KNR4: La región promotora y terminadora de KNR4 se amplificaron por PCR con los pares de cebadores PKARO-f/PKARO-r y TKARO-f/TKARO-r respectivamente (tabla 1). Estos dos insertos se donaron secuencialmente en pUCARO mediante la técnica de "primer extension" (Geiser, M., R. Cebe, D. Drewello, and R. Schmitz. 2001. Integration of PCR fragments at any specific site within cloning vectors without the use of restriction enzymes and DNA ligase. BioTechniques 31:88–92) y el plásmido resultante se denominó pDNKR4-1. El gen marcador URA3 se amplificó por PCR con el par de cebadores RURA-f/RURA-r (tabla 1) usando DNA genómico de la cepa EC1118 como molde y se donó en pDKNR4-1 por la técnica de "primer extensión" reemplazando el gen ARO4-OFP. El plásmido resultante se denominó pDKNR4-2. Finalmente el gen marcador KanMX4 se amplificó por PCR con el par de cebadores RKAN3-f/RKAN-r (tabla 1) usando el plásmido pITGPCR3 como molde (Tabera, L., Muñoz, R. and Gonzalez, R. 2006. Deletion of BCY1 from the Saccharomyces cerevisiae genome is semidominant and induces autolytic phenotypes suitable for improvement of sparklling wines. Appl. Environ. Microbiol. 72:2351-2358) y se clonó sobre pDKNR4-1 de igual manera que URA3, reemplazando el gen marcador. El plásmido resultante se denominó pDKNR4-3.
- \bullet
- GPI7: La región promotora y terminadora de GPI7 se amplificaron por PCR con los pares de cebadores PGARO-f/PGARO-r y TGARO-f/TGARO-r respectivamente (tabla 1). Se donaron secuencialmente en pUCARO para dar lugar al plásmido pDGPI7-1.
- \bullet
- FKS1: La región promotora y terminadora de FKS1 se amplificaron por PCR con los pares de cebadores PFKS-f/PFKS-r y TFKS-f/TFKS-r respectivamente (tabla 1). Se donaron secuencialmente en pUCARO para dar lugar al plásmido pDFKS1-1.
- \bullet
- GAS1: La región promotora y terminadora de FKS1 se amplificaron por PCR con los pares de cebadores PGAS-f/PGAS-r y TGAS-f/TGAS-r respectivamente (tabla 1). Se donaron secuencialmente en pUCARO para dar lugar al plásmido pDGAS1-1.
Los diferentes cassettes de deleción se
amplificaron por PCR tal y como se describe en la tabla 2.
Para la deleción de los genes GPI7, FKS1
y GAS1 con el marcador de selección KanMX4, no se
construyó un cassette de deleción. En su lugar, se utilizó como
molde el DNA genómico de cepas ya delecionadas en esos genes usando
el marcador KanMX4, y procedentes de la colección de cepas de
deleción Euroscarf (tabla 2).
Para la construcción de cepas vínicas de
Saccharomyces cerevisiae delecionadas en los genes ya
mencionados, se utilizaron dos cepas diferentes: EC1118 y
T73-4 (auxótrofa para uridina). La transformación de
las cepas con los cassettes de deleción se llevó a cabo mediante el
método de acetato de litio descrito por (Ito, H., Fukada, Y.,
Murata, K. and Kimura, A. 1983. Transformation of intact yeast
cells treated with alkali cations. J. Bacteriol.
153:163-168), y modificado por (Agatep, R.,
Kirkpatrick, R.D., Parchaliuk, D.L., Woods, R.A. and Gietz, R.D.
1998. Transformation of Saccharomyces cerevisae by the
lithium acetate/single-stranded carrier
DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol.
Technical Tips Online 1:51:P01525 (http://tto.trends.com)).
Brevemente, las cepas de levadura fueron transformadas con 20
\mul de la reacción de amplificación por PCR del cassette
de deleción correspondiente.
Para los cassettes con el marcador de
selección ARO4-OFP, tras la transformación,
las células se diluyeron 10 veces en YPD y se incubaron durante 17
horas a 30ºC y 200 rpm para permitir la expresión de la resistencia
antes de aplicar la presión selectiva. Los transformantes se
seleccionaron tras 5 días de incubación a 30ºC en placas de SD
conteniendo 2 g/l de PFP (glucosa 20 g/l, Yeast Nitrogen Base 6.7
g/l, Agar 20 g/l, Fenilalanina 0.9 g/l,
Parafluorofenilalanina
2 g/l).
2 g/l).
Para los cassettes con el marcador de
selección KanMX4, las células se diluyeron 2 veces en YPD y
se incubaron a 30ºC y 200 rpm para permitir la expresión del alelo
de resistencia. Los transformantes se seleccionaron tras dos días de
incubación a 30ºC en placas de YPD con 40 \mug/ml de G418
(glucosa 20 g/l, peptona 20 g/l, extracto de levadura
10 g/l, agar 20 g/l).
10 g/l, agar 20 g/l).
Finalmente, para el marcador URA3 los
transformantes se seleccionaron tras dos días de incubación a 30ºC
en placas de SD sin uridina.
Los fenotipos de los transformantes se
confirmaron por réplica en placa sobre los mismos medios de
selección utilizados para la transformación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los diferentes transformantes se crecieron en
YPD líquido a 30ºC y 200 rpm. Se extrajo su DNA genómico siguiendo
el método descrito por Querol et al. (Querol, A., Barrio, E.
and Ramon, D. 1992. A comparative study of different methods of
yeast strain characterization. Syst. Appl. Microbiol.
15:439-446).
- \bullet
- KNR4: La integración del cassette DKNR4-1 se analizó por PCR en tiempo real ABI Prism 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). Los cebadores usados para ello fueron PromARO4Q y TermKNR4Q (tabla 3). La correcta inserción del cassette fue adicionalemente confirmada por la amplificación por PCR de todo el locus usando los cebadores CDKNR-f y CDKNR-r (tabla 3), y verificación del tamaño del amplicón por electroforesis en gel de agarosa. La inserción del resto de marcadores de selección fue analizada directamente de esta última forma.
- \bullet
- GPI7: En todos los casos, el locus GPI7 se amplificó con los cebadores CDGPI-f y CDGPI-r (tabla 3), y los tamaños de los amplicones fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa.
- \bullet
- FKS1: El locus FKS1 se amplificó con los cebadores CDFKS-f y CDFKS-r (tabla 3), y los tamaños de los amplicones fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa.
- \bullet
- GAS1: El locus CAS1 se amplificó con los cebadores CDGAS-f y CDGAS-r (tabla 3), y los tamaños de los amplicones fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas construidas se muestran en la tabla
4.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó medio GCY con cada cepa, a una DO600
de 0,1 a partir de un precultivo en el mismo medio, y se hizo un
seguimiento de la curva de crecimiento a 30ºC y 150 rpm, hasta fase
estacionaria. Los ensayos se llevaron a cabo con las cepas
parentales, EC1118 y T73-4, y las diferentes cepas
derivadas de las mismas, que aparecen en la tabla 4. Las deleción
daba lugar a un crecimiento más lento en algunas de las cepas,
sobre todo en las que llevaban todas las copias del gen
correspondiente delecionadas. También se observaba cierto efecto de
la modificación genética sobre la OD en fase estacionaria.
Se midió la cantidad de polisacáridos liberada
durante el crecimiento en medio GCY (2% glucose, 2% Bacto
Casaminoacids, 0.67% Difco Yeast Nitrogen Base). Para ello se
recuperó el sobrenadante por centrifugación y se separaron las
macromoléculas presentes en el mismo mediante exclusión molecular en
columnas Econo-Pac (Bio-Rad). La
concentración de manoproteínas y polisacáridos en la fracción
eluida se determinó frente a una curva de calibrado de manano
comercial mediante el método de fenol sulfúrico (Segarra, 1., Lao,
C., López-Tamames, E. and de la
Torre-Boronat, M.C. 1995. Spectrophotometric
methods for the analysis of polysaccharide levels in winemaking
products. Am J. Enl. Vitic. 46:564-570). Se
realizaron cinco replicas de cada determinación y se compararon
mediante ANOVA los resultados de las diferentes cepas.
También se llevó a cabo la detección de las
manoproteínas mediante el método de la Concanavalina A conjugada
con peroxidasa. Para ello se cargaron 10 \mul del sobrenadante de
cada cultivo en geles de SDS-PAGE (Laemmli, U. K.
1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature.
227:680-685). El material se transfirió a membranas
de nitrocelulosa usando el sistema Mini Protean de
Bio-Rad. La detección se llevó a cabo mediante el
método descrito por Klis et al. (Klis, F.M., Ram, A.F.J.,
Montijn, R C., Kapteyn, J.C., Caro, L.H.P., Vossen, J.H., Van
Berkel, M.A.A., Brekelmans, S.S.C. and Van den Ende, H. 1998.
Posttranslational modifications of secretory proteins. p
223-238. In Methods in Microbiology, Academic
Press: New York).
Algunos de los resultados obtenidos se muestran
en la figura 1. Se observa dependencia del fondo genético y del gen
concreto que se ha modificado. El mayor efecto se observó siempre
en el caso de las cepas delecionadas en todas las copias del gen
correspondiente, especialmente para KNR4 y GPI7. A
raíz de estos resultados se decidió completar la caracterización
fundamentalmente con las cepas delecionadas en todas las copias de
cada gen.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo ensayos de fermentación
utilizando diferentes lotes de mosto Sauvignon Blanc natural. El
contenido en azúcar del mosto de la cosecha 2006 fue alto (32%
p/v), mientras que el de la cosecha 2007 fue normal (25% p/v).
Estos ensayos se llevaron a cabo sólo con las cepas parentales y
los derivados con todas las copias del gen correspondiente
eliminadas. En la figura 2 se muestran algunos perfiles de
fermentación según la liberación de CO2, representativos de las
cepa más interesantes. Las determinaciones de azúcar residual y
etanol producido se llevaron a cabo mediante HPLC. Para ello se
utilizó un cromatógrafo Thermo (Thermo Electron Corporation),
equipado con una bomba SpectraSystem P400, detector SpectraSystem
Rll50, e inyector AS3000. Se utilizó una columna de
Bio-Rad HPX-87H en las siguientes
condiciones de elución: fase móvil H_{2}SO_{4} 1.5 mM, flujo
0.6 ml/min, temperatura del horno 50ºC. Las muestran se diluyeron
entre 2 y diez veces y se filtraron por un filtro de PVDF de 0.45
\mum. En conjunto se aprecia que el fondo T73-4
es poco apropiado en el caso de la deleción de KNR4, ya que
da lugar a problemas de fermentación, sobre todo con el mosto de
2006. Con el fondo EC11118 también se observa un ligero efecto
negativo con el mosto de 2006, que parece el más problemático, pero
este efecto parece compatible con la aplicación industrial de la
cepa.
\vskip1.000000\baselineskip
En la figura 3 se muestran los resultados del
análisis mediante el método de la Concanavalina A conjugada con
peroxidasa, de los sobrenadantes de cultivo obtenidos al final de la
fermentación, de las fermentaciones de mostos naturales descritas
más arriba. Se observa mayor liberación en el caso de la cepa
EKD-13.
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad proteica de los vinos obtenidos
de la fermentación de mostos naturales se examinó mediante
incubación de alícuotas de 5 ml a 85ºC durante 30 minutos y
enfriamiento en hielo. Posteriormente se midió la turbidez en un
nefelómetro (Hach). Se analizaron los datos de 9 réplicas mediante
ANOVA. En la figura 4 se muestran los valores de turbidez de los
vinos de las diferentes cepas tras el tratamiento. Destaca la
reducción de turbidez en la cepa EKD-13 y la falta
de reducción en TKD-123.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo fermentaciones de mostos
naturales y se trataron diversas alícuotas con cantidades
crecientes de bentonita, analizándose posteriormente la estabilidad
de los vinos obtenidos, en función del tratamiento con bentonita,
mediante el método descrito en el apartado anterior. Se determinó la
cantidad de bentonita mínima para alcanzar el mayor grado de
estabilización. Los resultados se presentan en la figura 5. En
función de los resultados previos, este análisis se llevó a cabo
únicamente con las cepas en fondo EC1118 en las que se habían
eliminado las dos copias del gen correspondiente. El resultado
principal es que en todos los casos se observa una estabilización
mejor en las cepas delecionadas que en la cepa control, con una
reducción aproximada de un 25% en la demanda de bentonita.
\newpage
Paralelamente se analizaron las manoproteínas
restantes en el vino después de cada tratamiento, observándose que
las muestras derivadas de las cepas modificadas conservaban,
después del tratamiento, cantidades apreciablemente superiores de
manoproteínas que la cepa control. Estos resultados se muestran en
la figura 6.
Todos estos ejemplos muestran que las cepas
recombinantes desarrolladas en esta invención dan lugar a vinos más
ricos en manoproteínas, incluso después de un tratamiento con
bentonita, más estables frente a quiebra proteica, y que requieren
menos bentonita para su estabilización. Al ser más ricos en
manoproteínas estos vinos tienen potencialmente mejoradas otros
rasgos de calidad asociados a un alto contenido en
manoproteínas.
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas (CSIC)
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> LEVADURAS VÍNICAS RECOMBINANTES
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> E51641.56
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
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<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> cebador TKARO-f
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagtcacga cgttgtaaaa cgacggcttg gaccactgag ccctatttg
\hfill49
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 49
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> cebador TKARO-r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaccgagc tcgaattcac tggaaatatc acaattaaca ttctacaac
\hfill49
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 47
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<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> cebador PKARO-f
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatcctcta gagtcgacct gcctgccaag ttgtcgccta tagaacg
\hfill47
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 48
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PKARO-r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattacgcca agcttgcatg cctgcttcca aagccctatt ggaggtcg
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> cebador RURA3-f
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctagaggat cccccatggc gattcggtaa tctccgaaca gaag
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador RURA3-r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagtgaatt cgagctcggt accgggtaat aactgatata attaaattga agctctaat
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador RKAN3-f
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctagaggat cccccatggc tatcacgagg ccctttcgtc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador RKAN3-r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagtgaatt cgagctcggt acctcgatga taagctgtca aacatgag
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 47
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<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador TGARO-f
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagtcacga cgttgtaaaa cgacggcatc gtgatagtgt catcctc
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220> ADN sintético
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<223> cebador TGARO-r
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaccgagc tcgaattcac tggggacagc gataattgag tggtgg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 44
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220> ADN sintético
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<223> cebador PGARO-f
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatcctcta gagtcgacct gcggtgaagt gtgcgtggta gatg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
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<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PGARO-r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattacgcca agcttgcatg cctggtgtca cgggctctgt ttac
\hfill44
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
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<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> cebador PFKS-f
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipccagtcacga cgttgtaaaa cgacggcgtt ttgatgaagc acaggaag
\hfill48
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 49
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220> ADN sintético
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<223> cebador PFKS-r
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskipggtaccgagc tcgaattcac tgggaccgtt gtatgaaaga cttgatttc
\hfill49
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<210> 15
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<211> 47
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220> ADN sintético
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<223> cebador TFKS-f
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<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatcctcta gagtcgacct gccaatactt gcttgaacgc ttgattt
\hfill47
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
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<211> 48
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220> ADN sintético
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<223> cebador TFKS-r
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<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattacgcca agcttgcatg cctcaataat ggctgcgtaa aaattttg
\hfill48
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
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<211> 54
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220> ADN sintético
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<223> cebador PGAS-f
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<400> 17
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\hskip-.1em\dddseqskipccagtcacga cgttgtaaaa cgacggcaac accaacttta cctaccttta ggac
\hfill54
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 52
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<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PGAS-r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtaccgagc tcgaattcac tggctgtgtt tgttgttttt gttttatcag ac
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
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<223> cebador TGAS-f
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatcctcta gagtcgacct gcgcttcgac acatacataa taactcgata ag
\hfill52
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador TGAS-r
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<400> 20
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattacgcca agcttgcatg cctgagtcaa ttgattgaaa ataattcgc
\hfill49
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<210> 21
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<211> 23
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PromARO4Q
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<400> 21
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\hskip-.1em\dddseqskipccacggctaa ttaggtgatc atg
\hfill23
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<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador TermKNR4
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
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\hskip-.1em\dddseqskipcgaaaaccca attaccataa gc
\hfill22
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<210> 23
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<211> 29
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador CDKNR-f
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 23
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgtgacata tgtcattacc ctagattac
\hfill29
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador CDKNR-r
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttcatgct cttcaatgtc gttac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador CDGPI-f
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 25
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctttttcaag gcaatatgct cg
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador CDGPI-r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcaaaacga taggcttttc ttgc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador CDFKS-f
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaatagtct cacttactgg gcgac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador CDFKS-r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgaagagcc atgagacaat tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador CDGAS-f
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacaacgat actggtccaa atg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador CDGAS-r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgacaaaga agctgcctca ttc
\hfill23
Claims (10)
1. Método para obtener cepas de levadura
recombinantes industriales, que aumentan la concentración de
manoproteínas secretadas al medio, que comprende delecionar en un
fondo genético de cepas de levadura genes relacionados con la
biogénesis de la pared celular o la liberación de proteínas.
2. Método según la reivindicación anterior, en
el que las cepas pertenecen al género Saccharomyces.
3. Método según la reivindicación anterior, en
el que las cepas pertenecen a la especie Saccharomyces
cerevisiae.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que el gen delecionado
se selecciona de una lista que comprende:
- a.
- el gen KNR4,
- b.
- el gen GPI7,
- c.
- el gen FKS1,
- d.
- el gen GAS1,
o cualquiera de sus combinaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Método según la reivindicación 4, en el que
el gen delecionado es el KNR4.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en el que además se ha
eliminado el gen marcador.
7. Cepas de levadura obtenidas por el método
según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. Cepa de la levadura Saccharomyces
cerevisiae depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo
(CECT), con el número CECT 13012.
9. Uso de la cepa de Saccharomycetales
obtenida según cualquiera de las reivindicaciones
1-6, o de la cepa de Saccharomyces cerevisiae
según la reivindicación 8, para la fermentación alcohólica.
10. Uso de la cepa de Saccharomycetales
según la reivindicación anterior, donde la fermentación alcohólica
da lugar a vinos.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200801612A ES2334421B1 (es) | 2008-05-29 | 2008-05-29 | Levaduras vinicas recombinantes. |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200801612A ES2334421B1 (es) | 2008-05-29 | 2008-05-29 | Levaduras vinicas recombinantes. |
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| ES2334421A1 ES2334421A1 (es) | 2010-03-09 |
| ES2334421B1 true ES2334421B1 (es) | 2011-02-28 |
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Family Applications (1)
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Non-Patent Citations (5)
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|---|
| GONZALEZ-RAMOS DANIEL et al. "{}Genetic determinants of the release of mannoproteins of enological interest by Saccharomyces cerevisiae"{}. Journal of agricultural and food chemistry. 13.12.2006. Vol. 54, N$^{o}$ 25, páginas 9411-9416. ISSN 0021-8561. * |
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Also Published As
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| WO2009144358A2 (es) | 2009-12-03 |
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| ES2334421A1 (es) | 2010-03-09 |
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