ES2328323B1 - Cepa de levadura saccharomyces cerevisiae cect 11783, modificada geneticamente con actividad pectinolitica: su metodo de obtencion y aplicacion. - Google Patents
Cepa de levadura saccharomyces cerevisiae cect 11783, modificada geneticamente con actividad pectinolitica: su metodo de obtencion y aplicacion.Info
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Abstract
Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae
CECT
11783, modificada genéticamente con actividad pectinolítica: su método de obtención y aplicación.
11783, modificada genéticamente con actividad pectinolítica: su método de obtención y aplicación.
Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae
CECT
11783 modificada genéticamente capaz de expresar y escretar en, cantidades comercialmente útiles una endopoligalacturonasa, para su empleo en la industria de alimentos y bebidas. Para lograr este objetivo, se incluyó en el genoma de una cepa de Saccharomyces cerevisiae el fragmento lineal de DNA de secuencia definida con el gen que codifica para la endopoligalacturonasa (PGU1) unido en fusión transcripcional al promotor del gen de la fosfogliceratoquinasa (PGK1) ambos de origen Saccharomyces cerevisiae, desprovistos de secuencias bacterianas o de cualquier otro organismo distinto al citado.
11783 modificada genéticamente capaz de expresar y escretar en, cantidades comercialmente útiles una endopoligalacturonasa, para su empleo en la industria de alimentos y bebidas. Para lograr este objetivo, se incluyó en el genoma de una cepa de Saccharomyces cerevisiae el fragmento lineal de DNA de secuencia definida con el gen que codifica para la endopoligalacturonasa (PGU1) unido en fusión transcripcional al promotor del gen de la fosfogliceratoquinasa (PGK1) ambos de origen Saccharomyces cerevisiae, desprovistos de secuencias bacterianas o de cualquier otro organismo distinto al citado.
Esta cepa puede ser empleada para sintetizar la
enzima y posteriormente purificarla y adicionarla a los zumos de
frutas para mejorar la clarificación y el rendimiento en la
extracción, o bien, como ocurre en los productos fermentados, que
la levadura produzca la enzima directamente durante el proceso, sin
necesidad de ser adicionada al medio.
Description
Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae
CECT 11783, modificada genéticamente con actividad pectinolítica:
su método de obtención y aplicación.
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Técnicas de ingeniería genética. Fabricación de
alimentos y bebidas. Levaduras vínicas.
Las pectinas son heteropolisacáridos, y los
principales constituyentes de la lámina media y pared primaria
celular de las plantas superiores. Son las responsables de la
integridad y coherencia de los tejidos vegetales y además de su
función como agentes lubricantes y cementantes, están involucradas
en las interacciones entre la planta el ataque de patógenos (Van
Rensburg y Pretorious, 2000).
En la industria alimentaria, las pectinas pueden
originar problemas, durante la extracción, filtración y
clarificación de los zumos de frutas, por la turbidez y viscosidad
que comunican a los mismos.
En vinificación se utilizan las pectinasas para
mejorar los rendimientos de extracción de mosto por degradación de
los polisacáridos estructurales que interfieren en la extracción
(Sims et al., 1988), para aumentar la liberación de
compuestos del color y del aroma en los mostos antes y durante la
fermentación y la maceración, así como, para facilitar la
clarificación y filtración de los vinos (Villetaz, 1990, 1996 y
Servili et al., 1992).
Las enzimas pectinolíticas se encuentran
principalmente en los mohos y en las bacterias, pero también están
presentes en algunas levaduras. Debido al papel desempeñado por las
levaduras, especialmente del género Saccharomyces, en los
productos fermentados, es interesante profundizar en el estudio de
sus enzimas pectinolíticas con dos objetivos: o bien utilizar la
levadura para sintetizar las enzimas y posteriormente purificarlas y
adicionarlas a los zumos de frutas para favorecer así la
clarificación y la extracción o bien, como ocurre en los productos
fermentados, que la levadura produzca la enzima directamente durante
el proceso, sin necesidad de ser adicionada al medio.
La mayoría de los preparados comerciales de
pectinasas usados en la industria de los alimentos, proceden de
Aspergillus Níger, que además de producir grandes cantidades
de estas enzimas es considerado un microorganismo GRAS (Generaly
Recognized as Safe). Sin embargo este moho secreta, otras menos
deseables en la producción de vino o de zumos de frutas, como por
ejemplo la arabinofuranosidasa que puede causar turbidez (Whitaker,
1984).
La capacidad de S. cerevisiae para
degradar el ácido poligalacturónico podría tener importantes
consecuencias en la fermentación de sustratos derivados de plantas
ya que se han encontrado cepas que poseen la capacidad para
degradarlo (Mc Kay. 1990). Gainvors et al. (1994a)
encontraron que la cepa SCPP, recientemente identificada como S.
bayanus, (Naumov et al. 2001) producía tres tipos de
enzimas pectinolíticos, pectin metil esterasa, pectin liasa y
poligalacturonasa y además demostraron (Gainvors et al.,
1994b) que cuando a un mosto fresco se le adicionaba el extracto
enzimático de dicha cepa, se obtenían los mismos resultados sobre la
turbidez, que cuando se añadía una preparación enzimática comercial
(Endozyme ®).
Blanco et al. (1997) observaron que al
vinificar con cepas S. cerevisiae PG+, en algunos casos se
reducía el tiempo de filtración en un 50% aproximadamente, sin
obtener cambios apreciables en la viscosidad.
Probablemente el principal problema de utilizar
enzimas pectinolíticas de levaduras en el procesado industrial,
reside en los bajos rendimientos de actividad en la fermentación;
por lo que una alternativa sería clonar y sobreexpresar los genes
estructurales responsables de estas actividades enzimáticas,
obteniendo así una cepa de levadura vínica que facilitara la
clarificación del mosto y del vino durante la fermentación con la
consiguiente ventaja económica. Estas cepas podrían además
incrementar el color y el aroma de los vinos (Van Rensburg y
Pretorious, 2000).
La presente invención se refiere a la
transformación de la cepa vínica UCLMS-1 con buenas
cualidades enológicas con el gen PGU1 procedente de la cepa
UCLMS-29, unida en fusión transcripcional al
promotor del gen PGK1 con el fin de incrementar su expresión durante
el proceso de vinificación. La primera referencia a este promotor
fue publicada en 1987 (Clive Stanway et al. "The UAS of
the yeast PGK gene contains functionally distinct domains".
Nucleic Acids Research. Volume 15, number 17, 1987) y su
secuencia de nucleótidos, que está localizada en el cromosoma III
de Saccharomyces cerevisiae (NC_001135), fue publicada el 24
de abril de 1996
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=85666111;
range from 137164-137743); (http:
//www.yeastgenome.org/archive/sequence_done.shtml).
//www.yeastgenome.org/archive/sequence_done.shtml).
Se realizaron ensayos de microvinificación tanto
en mosto blanco como en tinto, con la cepa transformadora CECT
11783, y con la misma cepa sin transformar, comparándose los
resultados obtenidos.
Figura 1. Esquema de la transformación de la
levadura Saccharomyces cerevisiae (UCLMS-1)
con actividad endopoligalacturonasa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La presente invención se relaciona con la rama
de la Biotecnología y la Ingeniería Genética, y en particular con
una nueva cepa de levadura modificada genéticamente productora de
una endopoligalacturonasa, así como con el procedimiento para su
obtención.
El objetivo técnico que persigue la misma es la
obtención de una cepa de levadura capaz de expresar y excretar en
cantidades comercialmente útiles esta enzima con actividad
pectinolítica, para su empleo en la industria de alimentos y
bebidas.
Para lograr este objetivo se incluyó en el
genoma de la cepa de Saccharomyces cerevisiae
UCLMS-1 con buenas propiedades enológicas el gen
que codifica para la endopoligalacturonasa (PGU1) (SEQ ID NO 1)
unido en fusión transcripcional al promotor del gen de la
fosfogliceratoquinasa (PGK1) (PGK1p) (SEQ ID NO 2) proveniente de
la cepa Saccharomyces cerevisiae UCLMS-39,
obteniéndose una cepa hiperproductora de la enzima durante el
proceso de fermentación, mejorando considerablemente el rendimiento
de extracción de mosto/zumo a partir de la materia prima. Esta cepa
ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con la
referencia CECT 11783, con sede en la Universidad de Valencia, la
que ostenta la categoría de Autoridad de Depósito autorizada según
el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del
Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en
materia de Patentes.
La invención consiste en el desarrollo de una
cepa de Saccharomyces cerevisiae con buenas propiedades
enológicas, capaz de producir pectinasas durante la fermentación
alcohólica. Para ello se seleccionó una cepa de Saccharomyces
cerevisiae con actividad endopoligalacturonásica, cuyo gen PGU1
(SEQ ID NO 1) era funcional bajo su propio promotor y bajo el
promotor GAL1, y con el fin de incrementar sus niveles de
expresión, en condiciones fermentativas, se sustituyó el promotor
nativo del gen PGU1 (SEQ ID NO 1) por el promotor de
expresión fuerte del gen PGK1 (3-fosfoglicerato
quinasa) (PGK1p) (SEQ ID NO 2) de S. cerevisiae. Su
secuencia contenía una mutación en el nucleótido 877
(A\rightarrowG) que le confería el cambio de un aminoácido (Ser
293\rightarrowGly) de los 361 que constituían la proteína,
comparada con la encontrada en la base de datos para la cepa S288C
(correspondiente a ORF YJR 153W, localizada en el cromosoma X).
En una primera reacción de amplificación
(PCR1), se amplificó un fragmento de DNA que portaba el
promotor del gen PGK1, nt-580 a +3, en el extremo
5' las secuencias de reconocimiento para las enzimas NcoI y
BamHI y en el extremo 3' una porción correspondiente al
principio de la zona codificante del gen PGU1, nt +1 a+22,
utilizando los oligonucleótidos 5'-PGK1p (SEQ
ID NO 4) y R-PGU1-PGK1p (SEQ
ID NO 5).
Por otra parte se amplificó en otra mezcla de
reacción (PCR2), la zona codificante del gen PGU1, nt +1 a
+1086, en el extremo 5' una porción de la secuencia correspondiente
al promotor del gen PGK1, nt-13 a +3, y en el 3' la
secuencia de reconocimiento de la enzima BamHI, utilizando
los oligonucleátidos
F-PGK1p-PGU1 (SEQ ID NO 6) y
CT-PGU1 (SEQ ID NO 7).
En una tercera reacción (PCR3), se obtuvo
un fragmento de DNA que portaba la secuencia del promotor del gen
PGK1, nt-580 a +3, fusionada a la región
codificante del gen PGU1, nt +1 a +1086,utilizando los
oligonucleótidos 5'GK1p (SEQ ID NO 4) y
CT-PGU1 (SEQ ID NO 7) anteriormente
citados.
El fragmento obtenido mediante PCR3 se trató con
BamHI, se purificó con Geneclean II, se ligó utilizando T4
DNA ligasa al plásmido YCp50, previamente linealizado con BamHI,
transformando a continuación E. coli DH5\alpha con el
plásmido formado. Las construcciones se chequearon mediante
restricción y PCR4.
El DNA plasmídico extraído de los
transformadores DH5\alpha con la construcción de interés, se usó
para transformar S. cerevisiae W3031b, seleccionando por el
fenotipo Ura^{+}, y después por PG+.
Con el fin de obtener una cepa de levadura
vínica capaz de hidrolizar las pectinas durante el proceso de
vinificación, se incluyó en el genoma de S. cerevisiae
UCLMS-1 el gen que codifica para la
endopoligalacturonasa (PGU1) (SEQ ID NO 1), procedente de la cepa
S. cerevisiae UCLMS-39, unido en fusión
transcripcional al promotor de la fosfoglicerato quinasa
(PGK1p) (SEQ ID NO 2) obtenido de la misma cepa, y descrito
en el apartado anterior.
La estrategia seguida fue la integración
dirigida al locus ILV2 (SMR1, THI1),
ORF YMR108W, en el cromosoma XIII, que codifica para la biosíntesis
de la enzima acetolactato sintasa (ALS) y que permite la utilización
del herbicida sulfometurón metil (SMR1) como marcador de
selección (Falco et al., 1985). Este marcador se ha
utilizado en la transformación de algunas levaduras industriales
(Gasent-Ramírez, et al., 1995, Marin et
al., 2001).
Por ello se utilizó el vector integrativo Pwx509
(Casey et al., 1988), al que se le insertó la construcción
pPGK1-PGU1 (SEQ ID NO 3), usando el sitio
BamHI. Este fragmento se trató con Klenow para obtener
extremos no cohesivos, subclonarse en el sitio SnaBI del vector
pWX509. A continuación se transformó E. coli seleccionando
aquellos Ap^{R}.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El DNA plasmídico una vez extraído y comprobada
que poseían la construcción de interés (pKUSa), se trató con
SalI, y la levadura vínica se transformó con el fragmento
lineal así obtenido, conteniendo la región SMR1, el cassette
pPGK1-PGU1 (SEQ ID NO 3), y las secuencias en los
flancos 5' y 3' del locus SMR1, seleccionando por resistencia a
sulfometuron (SMMR). Una vez transformada la levadura, se comprobó
que expresaba la actividad poligalacturonásica y que contenía el
inserto de interés mediante PCR4. En la Figura 1, se detalla el
procedimiento seguido para la obtención de esta cepa.
El cassette expresado en la cepa
UCLMS-1 dio lugar a otra, CECT 11783 motivo de la
invención, es de origen S. cerevisiae, siendo un organismo
genéticamente modificado, pero no transgénico, ya que no contiene
ninguna secuencia de fago o bacteria.
Se llevaron a cabo microvinificaciones por
quintuplicado de mosto blanco y tinto siguiendo el procedimiento
tradicional para la elaboración de estos vinos. Como cultivos
iniciadores se usaron las levaduras S. cerevisiae CECT 11783
y la misma cepa sin modificar, que se empleó como control.
El mosto blanco se obtuvo de uvas de la variedad
Airén y el tinto, de uvas de la variedad Cencibel, conservados a
-20ºC, hasta su uso. Los mostos, se adicionaron de 30ppm de SO2 y
se utilizaron tanto para la preparación del inóculo como para las
microvinificaciones. Estas se llevaron a cabo en matraces de 1L
provistos de válvulas Müller y se inocularon con una concentración
10^{7} clas/mL Para cada tipo de elaboración se observó un
comportamiento cinético similar independiente de la cepa de levadura
usada y mostraron una adecuada viabilidad celular, obteniéndose
recuentos propios en este tipo de procesos.
Respecto a la implantación de los cultivos,
todos los aislados analizados presentaron idéntico perfil de
restricción del DNA mitocondrial al de los cultivos iniciadores, y
los aislados procedentes de las microvinificaciones con la cepa
CECT 11783, mostraron actividad poligalacturonásica.
A los vinos obtenidos, se les analizaron los
parámetros convencionales, como la acidez volátil, el pH, los
azúcares reductores, el grado alcohólico, así como la intensidad
colorante y la tonalidad en los vinos tintos. Cuando se aplicó el
análisis estadístico (t-student para muestras
relacionadas), se observó que para los vinos blancos no existieron
diferencias significativas (p<0,05) para ninguno de los
parámetros físico-químicos estudiados. Sin embargo,
para los vinos tintos elaborados con la cepa CECT 11783 (TM) la
cantidad de azúcares reductores, fue significativamente superior
(p<0,05) con respecto al control (TC). Estos resultados son
lógicos, teniendo en cuenta que la maceración con este tipo de
enzimas da lugar a la hidrólisis lenta de las paredes celulares de
los hollejos, aumentando el contenido de polisacáridos pécticos
enzima-resistentes como el RG-1,
que pueden incrementar el poder reductor (Pellerin, 2001); no
obstante y como dato relevante, no existieron diferencias
significativas en el grado alcohólico. Además el TM tuvo mayor
intensidad colorante, y tonalidad roja, hecho muy valorado en las
fermentaciones de vino tinto, sin embargo, el TC presentó mayor
tonalidad.
Se midió la velocidad de filtración, la
viscosidad y el rendimiento de extracción de semifermentado sólo en
los vinos tintos. La gran mejora tecnológica fue la mayor
extracción de semifermentado a partir de las uvas tintas en los
vinos elaborados con la cepa CECT 11783, obteniéndose un 7% más de
rendimiento con respecto al control, debido a que la enzima
secretada, facilitó la ruptura de las paredes celulares de las
uvas, favoreciendo además la extracción de antocianos a partir de
los antocianoplastos (Rogerson et al., 2000), responsables
del incremento de la intensidad colorante. Respecto al tiempo de
filtración y la viscosidad cinemática, no se observaron diferencias
significativas entre los vinos elaborados con ambas cepas.
Mediante cromatografía de gases se determinó el
contenido en acetaldehído, metanol, 1-propanol,
2-butanol, isobutanol,
2-metil-1-butanol,
3-metil-1-butanol,
y acetato de etilo. En los vinos blancos no se obtuvo ninguna
diferencia significativa en los compuestos analizados, sin embargo,
en los tintos se produjo un incremento en la concentración de
metanol en los elaborados con la cepa CECT 11783, lo cuál es lógico
debido a la degradación de las pectinas de la uva. Sin embargo,
estos valores se encontraron por muy por debajo del valor máximo
permitido en la legislación (500 mg/L).
Con el fin de conocer si existían diferencias
sensorialmente significativas, entre los distintos vinos, se
realizó una prueba triangular con los vinos elaborados con las dos
cepas. Los datos estadísticos mostraron que no existieron
diferencias significativa entre ellos (p<0,05). Por lo tanto, las
modificaciones en el contenido en polisacáridos pécticos no tienen
ninguna consecuencia directa en el gusto o el sabor del vino.
De los datos expuestos, se deduce que la ventaja
principal del uso de cepa modificada, reside sobre todo en un mayor
rendimiento de la extracción del mosto-vino,
afectando además, positivamente algunas de las variables
relacionadas con la apariencia.
La cepa CECT 11783 puede ser empleada para
sintetizar la enzima y posteriormente purificarla y adicionarla a
los zumos de frutas para favorecer así la clarificación y la
extracción, o bien, como ocurre en los productos fermentados, que
la levadura produzca la enzima directamente durante el proceso, sin
necesidad de ser adicionada al medio.
Claims (4)
1. Cepa de levadura S. cerevisiae
modificada genéticamente para la hiperproducción de la enzima
endopoligalacturonasa caracterizada porque comprende en su
genoma el gen que codifica para dicha enzima endopoligalacturonasa
(PGU1) (SEQ ID NO1) unido en fusión transcripcional al promotor del
gen de la fosfogliceratoquinasa (PGK1) (SEQ ID NO2), ambos de
origen S. cerevisiae.
2. Cepa de levadura S. cerevisiae, según
la reivindicación 1, depositada en la Colección Española de
Cultivos Tipo (CECT) con el nº de identificación 11783.
3. Uso de una cepa de levadura S.
cerevisae, según las reivindicaciones 1 y 2, en la elaboración
de bebidas alcohólicas fermentadas.
4. Uso de una cepa de levadura S.
cerevisae, según la reivindicación 3, en la elaboración del
vino.
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|---|---|---|---|
| ES200703243A ES2328323B1 (es) | 2007-12-05 | 2007-12-05 | Cepa de levadura saccharomyces cerevisiae cect 11783, modificada geneticamente con actividad pectinolitica: su metodo de obtencion y aplicacion. |
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|---|---|
| ES2328323A1 ES2328323A1 (es) | 2009-11-11 |
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2328323B1 (es) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2223231B1 (es) * | 2002-07-08 | 2005-11-01 | Universidad De Santiago De Compostela | Construccion de una cepa de levadura enologica de saccharomyces cerevisiae recombinante que sobreexpresa una endopoligalacturonasa. |
-
2007
- 2007-12-05 ES ES200703243A patent/ES2328323B1/es active Active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| M. FERNANDEZ GONZALEZ et al. "{}Engieering of an oenological Saccharomyces cerevisiae strain with pectinolytic activity and its effect on wine"{}. INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD. MICROBIOLOGY. 2005 Vol. 102, páginas 173-183. * |
| M. VILANOVA, et al. "{}Use of a PGU1 recombinant Saccharomyces cerevisiae strain in oenological fermentations"{}. JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY. 2000, Vol. 89, páginas 876-883. * |
| PILAR BLANCO, C. SIEIRO, N.M. REBOREDO, T.G. VILLA. "{}Cloning, molecular characterization, and expression of an endo- polygalacturonase-encoding gene from Saccharomyces cerevisiae IM1-8b"{}. FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, 1998. Vol. 164, páginas 249-255. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2328323A1 (es) | 2009-11-11 |
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