ES2223231B1 - Construccion de una cepa de levadura enologica de saccharomyces cerevisiae recombinante que sobreexpresa una endopoligalacturonasa. - Google Patents
Construccion de una cepa de levadura enologica de saccharomyces cerevisiae recombinante que sobreexpresa una endopoligalacturonasa.Info
- Publication number
- ES2223231B1 ES2223231B1 ES200201596A ES200201596A ES2223231B1 ES 2223231 B1 ES2223231 B1 ES 2223231B1 ES 200201596 A ES200201596 A ES 200201596A ES 200201596 A ES200201596 A ES 200201596A ES 2223231 B1 ES2223231 B1 ES 2223231B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- yeast
- strain
- enzymes
- saccharomyces cerevisiae
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
- C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
- C12H1/003—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages by a biochemical process
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
- C12N1/185—Saccharomyces isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
- C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Construcción de una cepa de levadura enológica de Saccharomyces cerevisiae recombinante para el gen PGU1, que sobreexpresa una endopoligalacturonasa. La cepa de levadura sintetiza y secreta una poligalacturonasa/pecinasa a concentraciones altas, para su utilización en la industria enológica. Mejora los procesos de clarificación y filtración de los vinos, sin modificar su aroma ni aumentar el nivel de metanol de los mismos.
Description
Construcción de una cepa de levadura enológica de
Saccharomyces cerevisiae recombinante que sobreexpresa una
endopoligalacturonasa.
Construcción de una cepa de levadura enológica de
Saccharomyces cerevisiae recombinante que sobreexpresa una
endopoligalacturonasa, para ser utilizada en la elaboración de
vinos.
El gen PGU1 es un gen que codifica para la
producción de poligalacturonasas en levaduras. La sobreexpresión
del gen PGU1 en la cepa de levadura silvestre MR-7
de Saccharomyces cerevisiae (cepa seleccionada de la
microbiota autóctona de la variedad de uva Albariño en Galicia) da
lugar a una superproducción de poligalacturonasa que es secretada
al sobrenadante de cultivo de la levadura. Estos enzimas,
poligalacturonasas, son muy utilizados en la industria enológica
para realizar el desfangado y la clarificación de mostos y vinos lo
cual facilita las tareas de filtrado de los mismos, ya que degradan
las sustancia pécticas.
Las sustancias pécticas son un grupo de
polisacáridos complejos que aparecen en cantidad variable en todos
los tejidos de plantas superiores. Se localizan en los espacios
intercelulares formando parte de la lámina media, y por tanto, son
los principales responsables de la integridad y coherencia de los
tejidos de las plantas. Estos polímeros están constituidos por una
cadena principal de unidades de ácido
(1,4)-\alpha-D-galacturónico
parcialmente esterificadas con grupos metilo.
Los polisacáridos de la uva son el resultado de
la degradación y solubilización de una parte de las sustancias
pécticas de la pared de las células del hollejo y de la pulpa y
estos pueden ser pectinas o gomas. Las pectinas son cadenas
formadas casi exclusivamente por unidades de ácido galacturónico
parcialmente esterificado por metanol. Las gomas son los residuos
de la transformación de las sustancias pécticas del mosto, después
de la acción de las pectinasas endógenas o exógenas (Dubourdieu
y col., 1981. Connaisance Vigne Vin. 15:
29-40).
En el vino las sustancias pécticas suponen un
problema ya que afectan a la clarificación, estabilización y
filtración (Pilnik y Rombouts 1985. Carbohydr. Res. 142:
93-105). Las sustancias pécticas colmatan las capas
filtrantes durante la filtración de los vinos. Por este motivo y
para mejorar los problemas de filtración se utilizan los enzimas
pectolíticos. Las sustancias pécticas son degradadas de forma
natural por los enzimas pécticos. Los enzimas pécticos, pectinasas
o enzimas pectolíticos se clasifican en pectinasas y enzimas
depolimerizantes.
Pectinesterasas (PME), son los enzimas encargados
de liberar los grupos metilo de la pectina, formando ácido péctico.
Son producidos por las plantas superiores, numerosos hongos,
bacterias y algunas levaduras (Sakai y col., 1993. Science.
230: 1350-1354).
Depolimerasas, rompen los enlaces \alpha-(1,4)
entre residuos de ácido galacturónico de las sustancias pécticas
bien por hidrólisis (hidrolasas o poligalacturonasas) o por
\beta-eliminación (liasas). Son producidos por
numerosos hongos y bacterias, algunas levaduras y por plantas
superiores. Las endopoligalacturonasas (endo-PG)
que rompen el polímero en el interior de la cadena, dan lugar a una
acusada reducción de la viscosidad, mientras que las
exo-PG, que cortan en los extremos del polímero,
producen una reducción mucho menor de la viscosidad.
Los enzimas pécticos son producidos por plantas y
microorganismos, aunque también se ha descrito su presencia en
insectos, nematodos y algunos protozoos. Son numerosas las
revisiones sobre los enzimas pécticos (Reková-Benková y Markovic,
1976. Adv. Carbhydr. Chem. Biochem. 33: 323-385;
Fogarty W.M. y col., 1983. Applied Science Pubkishers;
Rombouts F..M. y col., 1989. Economic Microbiology. 5:
227-282; Sakai T. y col., 1993. Adv. Appl.
Microbiol. 39: 213-294).
Los enzimas producidos por hongos han sido
estudiados especialmente en Aspergillus, porque este hongo
se utiliza como fuente productora de poligalacturonasas a nivel
industrial (Maldonado y col., 1994. Curr. Microbiol. 28:
193-196). Se han clonado varios genes que codifican
para la producción de poligalacturonasas y pectin liasas,
especialmente a partir de Aspergillus niger (Gysler y
col., 1990. Gene. 89: 101-108; Ruttkowski y
col., 1991; Bussink y col., 1991. Mol. Microbiol. 5,6:
1353-1361; Bussink y col., 1992. Eur. J.
Biochem. 208:83-90; Ho y col., 1995. Curr.
Genet. 27: 141-149; Cary y col., 1995. Gene.
153:129-133).
La síntesis de enzimas pécticos en levaduras no
está tan extendida como en bacterias y hongos, y además, el
espectro de enzimas producidas es más reducido. El enzima producido
por las levaduras es casi siempre una poligalacturonasa (endo o
exo).
Los primeros autores que estudiaron la presencia
de enzimas pécticos en la levadura Saccharomyces cerevisiae
fueron Luh y Phaff (Luh B.S. y col., 1954. Arch. Biochem.
Biophys. 33: 213-22). Mckay (Mckay 1990. Letters of
Applied Microbiology. 11:41-44) publica la
degradación de ácido poligalacturónico por dos cepas de S.
cerevisiae. Gainvors y col., (1994) Yeast
10:1311-1319, encontraron la presencia de actividad
poligalacturonasa, pectinesterasa y pectato liasa en una cepa de
esta levadura; y Blanco y col., (1994). Can. J. Microbiol.
40: 974-977, caracterizaron la
endo-PG de la cepa S. cerevisiae 1389.
\newpage
Laing y Pretorius, (1993). J. Appl. Bacteriol.
75: 149-158 y Van Resburg y col., (1994).
Curr. Genet. 27: 17-22, obtuvieron cepas
recombinantes de S. cerevisiae expresando un gen de una
pectato liasa de Erwinia chrysanthemi y un gen de una
poligalacturonasa de Erwinia carotovora en levaduras de
vino. González Candelas y col., (1995) FEMS Microbiol.
Letters. 126: 263-270, construye una cepa
recombinante de levadura de vino de la especie S.
cerevisiae, expresando un gen que codifica para una pectin liasa
de Fusarium solani.
Siekstele y col., (1999) Yeast.
15:311-322, realizan la clonación y expresión de un
gen que codifica para una endopoligalacturonasa de Kluyveromices
marxianus (EPGU1), encontrando que la secuencia de aminoácidos
mostraba gran similitud con poligalacturonasas de hongos.
En la industria enológica, durante la
transformación del mosto en la vinificación, las sustancias
pécticas son modificadas por la acción de pectinasas naturales de
la uva o por enzimas industriales, añadidos durante la
fermentación, para facilitar los procesos de clarificación y
filtración.
Como ya se ha indicado anteriormente, los
preparados comerciales de enzimas pécticos se obtienen
fundamentalmente de Aspergillus niger y están constituidos
por una mezcla de enzimas, que representan un espectro bastante
amplio de actividades enzimáticas, alguna de las cuales se
consideran desfavorables ya que dan lugar a características no
deseadas en el vino. En este sentido, hay que tener en cuenta que
la calidad y rendimiento son importantes puesto que, como
demostraron Sims y col., (1988). Am. J. Enol. and Vitic.
39,4: 341-343 y Haight y Gump (1994). Am. J. Enol.
and Vitic. 45,1: 113-116, cuando se utilizan
preparados comerciales que contienen enzimas de diversos tipos, el
rendimiento es mayor que en el caso de utilizar enzimas pécticos
únicamente.
Williams y col., (1978) Am. J. Enol. and
Vitic. 29:92-96, comprobaron que los vinos
clarificados rápidamente eran claros y afrutados, mientras que los
que estaban más tiempo en contacto con los residuos tenían malos
aromas.
En el caso de vinificación en blanco, estos
enzimas pueden dar lugar a una aumento de
vinil-fenoles y como consecuencia una depreciación
de la calidad aromática del vino. Esto es debido a que las
pectinasas industriales, de Aspergillus niger, contienen
actividad de tipo cinamil esterasa (CE) que catalizan la hidrólisis
de los ésteres tártricos de los ácidos hidroxicinámicos del mosto
durante la fase prefermentativa. Bajo la acción de la cinamato
decarboxilasa de S. cerevisiae, los ácidos
p-cumarico y ferúlico son transformados en
vinil-fenoles
(vinil-4-fenol y
vinil-4-gaiacol) durante la
fermentación alcohólica (Chatonnet y col., 1992. Revue
Franraise d'Oenologie. 138: 21-24).
El uso de poligalacturonasas de levaduras no
provoca el aumento en el contenido de metanol de los vinos. Se sabe
que el contenido en metanol de los vinos obtenidos a partir de
mostos extraídos con enzimas pécticos comerciales es mayor que el
de vinos obtenidos en condiciones controladas en ausencia de estos
enzimas (Bertrand y col., 1996. Revue Francaise d'Oenologie.
157: 28-30).
Este último dato es un factor a tener en cuenta,
ya que durante la actuación de las pectinasas de Aspergillus
niger se liberan estos grupos metilo al medio, los cuales
influyen negativamente sobre las características organolépticas de
los vinos obtenidos a partir de estos mostos.
Otros autores (Gainvors y col, 1994. Yeast
10: 1311-1319), manifiestan el interés enológico de
una fuente pectinolítica natural, presente en las levaduras de
vinificación, sin el riesgo que producen los preparados enzimáticos
procedentes de Aspergillus niger y otros hongos. Delfini C.,
1994. Assoc. Enol. Enotec. Ital. Sciacia., destaca la gran utilidad
que tiene el disponer de una cepa de levadura con alta actividad
pectolítica, ya que además ayudaría a extraer de la piel de la uva
las moléculas precursoras del aroma que se incorporarían al proceso
normal de la fermentación.
Belarbi y Lemaresquier, 1994. Assoc. Enol.
Enotec. Ital. Sciacia, evidenciaron la efectividad de la cepa C94
de S. cerevisiae en la clarificación de los vinos,
atribuyéndola a la actividad pectolítica que disminuía la viscosidad
del mosto.
En este sentido Gainvors y col., 1994.
Yeast 10: 1311-1319, demuestra que añadir al mosto
un extracto enzimático de S. cerevisiae (SCPP 2180) con
actividad pectinesterasa, pectinliasa y poligalacturonasa tiene el
mismo efecto sobre la turbidez que la misma cantidad de la
preparación comercial Endozyme (Pascal Biotech
SARL-Paris). Blanco y col., 1997. Tesis
Doctoral, Universidad de Santiago de Compostela, demuestran también
que en la fermentación del vino, llevada a cabo con cepas de
levadura de S. cerevisiae poligalacturonasa +, el proceso de
clarificación es mas fácil y el tiempo de filtración se reduce en
un 50% en algunos casos.
La presencia de poligalacturonasas en cepas de
S. cerevisiae también fue descrita en un 75% de las cepas de
S. cerevisiae aisladas en fermentaciones espontáneas de
mostos del NW de España.
Debido a los problemas que supone la utilización
de enzimas pectolíticos comerciales en la elaboración de los vinos,
la presente invención propone el uso en la fermentación alcohólica
de los mostos, de una levadura modificada genéticamente, que
produzca grandes cantidades de enzima, para conseguir los mismos
efectos que los enzimas comerciales, a nivel de clarificación y
filtración de los vinos, pero sin los problemas que estos enzimas
conllevan a nivel aromático de los vinos y de producción de
metanol.
Las cepas y plásmidos utilizados están descritos
en la Tabla 1.
| Cepa/plásmido | Características relevantes | Referencia |
| Cepas S. cerevisiae | ||
| MR-7 | Cepa enológica seleccionada | Este estudio |
| USC1 | Cepa transformada con el gen PGU1 | Este estudio |
| Bacterias | ||
| Escherichia coli DH5\alpha | Hanahan (1983) | |
| Plásmidos | ||
| pBSK^{+} - PGU1 | \hskip0,5cm 4,05 Kb. Amp^{R}, \beta-GAL | Blanco (1997) |
| pBEJ16 - PGU1 | 10,09 Kb. Amp^{R} LEU2, pPGK | Blanco (1997) |
Los medios de cultivo utilizados para el
crecimiento de levaduras y bacterias se describen a
continuación:
Extracto de levadura (1%), peptona (2%), glucosa
(2%).
Para medio sólido se añade agar bacteriológico al
2%.
Para seleccionar las cepas transformantes de
levadura se utilizó como medio YEPD + geneticina (G418) (Handfield
y col., 1990. Curr. Genet. 18: 303-313).
En placa: acido poligalacturónico (0.5%),
sacarosa (0.5%), YNB w/o aminoácidos (0.7%), aminoácido necesarios
en cada caso y agar bacteriológico al 2%. El poligalacturónico se
disuelve en agua destilada hirviendo, se añaden los demás
componentes y finalmente se ajusta el pH a 8.0.
Contiene triptona (1%), extracto de levadura
(0.5%), cloruro sódico (1%) y agar bacteriológico al 2%. Cuando fue
necesario el medio se suplemento con ampicilina a una concentración
final de 60 \mug/mL.
El proceso que se describe a continuación
comienza con la selección de levaduras silvestres que posean
actividad poligalacturonasa, ya que esta actividad es la que
queremos incrementar en dicha cepa, de forma que al producir vino
con ella logremos los mismo efectos que los enzimas comerciales. A
continuación se describe paso a paso el proceso realizado.
En primer lugar se seleccionaron levaduras
silvestres y se comprobó si poseían genotipo poligalacturonasa +.
Esta comprobación se realiza mediante PCR y mediante hibridación
ADN-ADN (Southern E.M. 1975. J. Mol. Biol.. 98:
503-517). Se comprueba que todas las cepas
silvestres de S. cerevisiae analizadas portan el gen PGU1
(gen que codifica para la producción de poligalacturonasa).
Posteriormente se mide la actividad poligalacturonasa en placa y en
medio líquido comprobándose que no todas tienen actividad, lo que
nos indica que algunas cepas de levadura portan el gen pero no es
activo.
Teniendo en cuenta que hay cepas con y sin
actividad poligalacturonasa, nos interesa una cepa que sea
poligalacturonasa positiva, es decir que produzca el enzima, para
así manipularla de forma que incrementemos la cantidad de enzima
producido. Para ello se realizó la construcción de una levadura
enológica de Saccharomyces cerevisiae recombinante, con la
finalidad de sobreexpresar una endopoligalacturonasa, para ser
utilizada en la elaboración de vino. Esto se llevó a cabo con una
cepa silvestre poligalacturonasa + denominada S. cerevisiae
MR-7.
La manipulación del DNA (tratamiento con enzimas
de restricción, ligaciones, transformación de E. coli,
cuantificación de DNA y aislamiento de plásmidos se llevó a cabo
siguiendo la metodología descrita por Sambrook y col.
(1989). Molecular cloning: A laboratory manual (2ª ed). Para la
recuperación de DNA a partir de geles de agarosa se utilizó el kit
de Biorad. El aislamiento de ADN plasmídico de bacterias se realiza
utilizando un kit comercial de Promega (Wizard^{R} Plus
Midipreps-DNA Purification System). El aislamiento
de ADN genómico de S. cerevisiae se llevó a cabo según el
protocolo descrito por Struhl, con ligeras modificaciones (Struhl
y col., 1979. Proc. Natl. Acad.Sci.USA.
76:1035-1039). El aislamiento de ADN genómico de
S. cerevisiae se llevó a cabo según el protocolo descrito
por Struhl, con ligeras modificaciones (Struhl y col., 1979.
Proc. Natl. Acad.Sci.USA. 76:1035-1039).
La detección de secuencias de ADN específicas se
realizó siguiendo la técnica descrita_por Southern (Southern E.M.
1975. J. Mol. Biol.. 98: 503-517). El ADN genómico
(digerido totalmente con el enzima Hind III) se hibridó con
una sonda de ADN marcada con un kit no radiactivo (DIG High DNA
Labeling and Detection Starter Kit II) de Boehringer Mannheim.
Para la detección del gen PGU1 en las cepas, se
llevó a cabo la PCR utilizando DNA polimerasa (Promega). La mezcla
de reacción contenía 1 \muL de cada dNTP (5 mM), 1 \muL de cada
oligonucleótido (PG-1 y PG-2), 10
\muL (4x10^{6} celulas/mL), 10 \muL del tampón 10X de la Taq
DNA Polimerasa, 3.5 \muL de MgCl_{2} (50 mM), 1 \muL de Taq
ADN Polimerasa (Promega). Se completó el volumen con agua
mili-Q estéril. El volumen final de la reacción fue
de 100 \muL.
PG1
(5'CGCGGATCCATGATTTCTGCTAATTCATTACTTATTT3')
PG1r (5'CGCGGATCCTTAACAGCTTGCACCAGATCCAG3')
Las condiciones de amplificación fueron:
- 1 ciclo a 94°C, 2 min para la
desnaturalización,
- 30 ciclos a 94°C 30 s, 55°C 30 s, y 72°C 30 s
para la amplificación, y
- 1 ciclo a 72 °C, 5 min para finalizar la
reacción.
Para la detección en placa de cepas productoras
de enzimas pécticos se utilizó un medio YNB. Las placas se
incubaron 5 días a 30°C y la producción de enzimas pécticas se
detectó añadiendo ClH 6N sobre la placa como describen Blanco y
col., (1994). Cuando la cepa es productora de enzimas que
degradan la pectina, aparece un halo de hidrólisis alrededor de la
colonia, fácilmente reconocible frente al medio opaco.
La actividad poligalacturonasa fue determinada en
medio líquido según el método de Somogyi (Somogy M. 1952. J. Biol..
Chem. 159:19-23) modificado por Nelson (Nelson N.J.
1957. Academic Press. New York. 3:85-86). La mezcla
de ensayo, que contenía 500 p.L de muestra (sobrenadante
concentrado y dializado) y 500 µL de sustrato (PGA al 0.5% disuelto
en tampón acético-acetato 50 mM, pH 5.5) se incubó,
a 37°C, durante un periodo de tiempo variable según las
muestras.
El contenido de proteína de las muestras fue
determinado siguiendo el método de Lowry (Lowry y col.,
1951. J. Biol.. Chem. 193: 265-275), utilizando
seroalbúmina bovina (BSA) como patrón de concentración conocida.
Para la construcción de la cepa que produzca una
gran cantidad de enzima, hay que aumentar el número de copias del
gen que codifica para la producción del enzima en cuestión (gen
PGU1) en la levadura silvestre, es decir la sobreexpresión de dicho
gen.
El plásmido pBEJ16-PGU1 fue
utilizado para la transformación de S. cerevisiae
MR-7 y esta se llevó a cabo siguiendo el protocolo
descrito por Ito y col. (Ito y col., 1983. J.
Bacteriol. 153: 163-168). Para ello, las células se
crecieron en YEPD hasta que la absorbancia, a 600 nm, estuviera
comprendida entre 0.7-0.9. Se centrifugaron 10 mL
del cultivo y las células se lavaron 2 veces con agua estéril, se
resuspendieron en 1 mL de acetato de litio 0.1 M en TE y se
incubaron a 30°C con agitación suave durante 1-2
horas.
A continuación, se hicieron alícuotas de 100
\muL a las que se añadieron 40 µg de "ADN carrier" (ADN de
esperma de salmón hervido 15 min) y 1-2 \mug de
DNA transformante y la mezcla se incubó durante 30 min a 30°C, tras
lo cual se añadieron 0.7 mL de PEG-4000 al 40% en
acetato de litio 0.1 M y se incubó de nuevo a 30 °C 30 min.
Seguidamente, las células se sometieron a choque térmico 5 min a
42°C y, después de lavarlas dos veces con TE, se sembraron por
extensión en placas con el medio selectivo adecuado.
En la Figura 1 se representa la ligación y
transferencia de E. Coli.
En la Figura 2 se representa la recuperación del
plásmido con el gen PGU1.
La cepa recombinante (USC-1),
depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el
número de orden CECT 11777, mostró una gran actividad pectolítica
(520 U/mL) en medio líquido con respecto a la cepa silvestre
MR-7 (142 U/ml). La actividad poligalacturonasa fue
determinada en el sobrenadante, dializado en tampón
acético-acetato durante 24 horas, mediante
Somogy-Nelson.
La diferencia de actividad entre ambas cepas
demostró la sobreexpresión del gen PGU1 en la cepa
USC-1, ya que la producción de enzima es mucho mayor
que la cepa parental, lo que pone de manifiesto la correcta
transformación.
A continuación se intenta demostrar que la nueva
cepa (USC-1) produce los efectos esperados en la
vinificación, para lo cual se realizan vinificaciones y se comparan
los resultados de las mismas con los resultados obtenidos cuando se
utilizan enzimas comerciales.
Los ensayos de vinificación se realizaron en
recipientes de vidrio de 10 litros. Estos recipientes se llenaron
con mosto estéril de la variedad Albariño variedad blanca autóctona
de Galicia). Se prepararon los preinóculos con las cepas a estudiar
en mosto de Albariño y se incubaron 24 horas a 30°C con 160 rpm.
Posteriormente se inocularon ' adicionando el volumen adecuado de
estos cultivos, hasta obtener una densidad celular de 10^{6}
cel/mL. Las fermentaciones se realizan a una temperatura de
18°C.
En los casos donde fue necesario se utilizaron
también dos enzimas de la empresa Novo Nordisk: A (Novoclair FCE G)
que es un preparado enzimático pectolítico purificado procedente de
Aspergillus niger, especialmente seleccionado para la
clarificación de mostos blancos por su actividad pectin
metil-esterasa; y B (Vinozym FCE G) que también
procede de Aspergillus niger y contiene actividades
pectolíticas y actividades secundarias como hemicelulasas y
celulasas. A se utilizó en una dosis de l g/hL y B en 3 g/hL.
Para comprobar la dominancia de la cepa inoculada
sobre la microbiota del mosto en las distintas fases de la
fermentación, se extrajeron muestras cada 24 horas y se sembraron
en medio YEPD para S. cerevisiae MR-7 y en
YEPD+geneticina (0.5 mg/mL) para la cepa USC-1.
Posteriormente, se realizaron estudios de PCR y Electroforesis en
Campo Pulsante de 20 colonias al azar, para comparar los perfiles y
cariotipos de las cepas encontradas con los de las cepas inoculadas.
Los resultados ponen de manifiesto la dominancia de la cepa
USC-1, frente a la microbiota propia del mosto.
La PCR para ver la implantación de las cepas se
realizó a partir de células enteras de S. cerevisiae
siguiendo el método de Bellis y col., (Bellis y col.,
1987. Nucleic. Acids. Research. 15, 16:6749). Los oligonucleótidos
utilizados fueron diseñados por Ness y col., (Ness y
col., 1992. J. Sci. Food Agric. 62: 89-94):
delta 1 (5'CAAAATTCACCTATA/TTCTCA3')
delta 2 (5'GTGGATTTTTATTCCAACA3')
La reacción se realizó en un volumen final de 100
\muL conteniendo:10 \muL (4 x10^{6} células/mL), 10 \muL de
tampón 10X de la Taq DNA polimerasa Promega), 1 \muM de cada
oligonucleótido, 200 \muM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
2.5 unidades de Taq DNA polimerasa (Promega). Los ciclos de
amplificación fueron realizados en un equipo Bio-Rad
Gene Cycler. La amplificación se desarrolla de la manera
siguiente:
- 4 ciclos: desnaturalización 95°C durante 30 s,
hibridación 45°C durante 30 s, síntesis 72°C durante 2 min.
- 30 ciclos: desnaturalización 95°C durante 30 s,
hibridación 42°C durante 30 s, síntesis: 72°C durante 2 min.
Las cepas de levaduras se prepararon según el
método de Bellis y col., (Bellis y col., 1987.
Nucleic. Acids. Research. 15, 16:6749). Las levaduras (50 \muL)
se crecieron en 150 mL de YEPD estéril durante una noche a 30°C y
con agitación (100 rpm). Al día siguiente se recogieron por
centrifugación (10 min a 3000 rpm), se lavaron dos veces en una
disolución de EDTA 0.05 M, pH 8.5 y se resuspendieron en 2 mL de
EDTA 0.05 M. A continuación se mezcló 1 mL de esta solución con 1
mL de agarosa 1% en EDTA 0.05 M y se colocó en pequeños moldes
dando lugar a unos bloques.
Después de su solidificación, los bloques se
incubaron en un tampón de lisis, durante 6 horas a 37°C, para
destruir las paredes celulares de las levaduras (NaCl 0.5 M, EDTA
0.25 M, Tris HC1 0.125 M, pH 7.5,
(\beta-mercaptoetanol 0.5 M). Posteriormente el
tampón de lisis se sustituyó por otra solución durante 36 horas a
42°C para destruir las proteínas celulares (Pronasa E de
Streptomyces griseus 1 mg/mL, sarcosyl 1%, EDTA 0.45 M). Los
bloques se lavaron tres veces durante 30 min en tampón TE a 50°C
(Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM), y otras tres veces durante 30 min en
el mismo tampón a temperatura ambiente. Los cromosomas de la
levadura se separan según su tamaño por electroforesis en gel de
agarosa. La agarosa se preparó a una concentración de 0.8% en
tampón 1X TBE (Tris base 50 mM, ácido bórico 50 mM y EDTA 1 mM,
pH=8).
La técnica empleada se llama CHEF (Countour
Clamped Homogeneous Electric Field), que utiliza campos eléctricos
alternativos homogéneos orientados a 120°C. Se utilizó un aparato
de la marca Pharmacia realizando la migración a voltaje constante
(165 V) y a una temperatura de 10°C. Las condiciones de
electroforesis son las siguientes: pulsadas de 90 s durante 20 h,
pulsadas 100 s durante 12 h, pulsadas 120 s durante 12 h, pulsadas
30 s durante 4 h. Los cromosomas de levadura utilizados como
marcadores de tamaño provienen de una cepa de S. cerevisiae
(YNN 295).
Como ya se dijo anteriormente; la finalidad del
uso de enzimas comerciales durante la fermentación alcohólica de
los mostos para producir vino, es provocar una buena clarificación,
lo que conlleva a una rápida y económica filtración de dichos
vinos. Por ello se realizó la medida de actividad enzimática en los
vinos elaborados y se midieron los tiempos de filtración, para así
poder comparar nuestra cepa con los enzimas comerciales.
La medida de la actividad enzimática en el vino
elaborado con USC-1 muestra un valor elevado si lo
comparamos con la cepa silvestre MR-7, como era de
esperar
Si comparamos el valor de actividad en el vino
elaborado con la cepa USC-1 respecto a las
fermentaciones suplementadas con enzimas pectolíticas, se pudo
apreciar que los dos últimos casos (Enzimas A y B) la actividad es
mayor. Sin embargo, si comparamos los tiempos de filtración de los
vinos elaborados, observamos diferencias muy significativas,
descritas en la Tabla 2.
| Fermentación | Tiempo de Filtración (s)^{a} | Actividad enzimática máxima |
| del vino (U/ml) | ||
| MR-7 | > 500 | 10 |
| USC-1 | 30 | 205 |
| USC-1+A | 20 | 1236 |
| USC-1+B | 20 | 720 |
| ^{a} El volumen filtrado fue 100 m1 a través de membranas Millipore de 0.45 µm de tamaño de poro. |
Según lo expuesto, la adición de enzimas
pectolíticos comerciales no seria necesaria en fermentaciones
llevadas a cabo con la cepa USC-1 o con cualquier
otra cepa seleccionada portando el mencionado gen PGU1 en
sobreexpresión plasmídica.
Una vez demostrado lo que se pretendía desde el
principio, se estudiaron otras facetas en los vinos para ver si con
la cepa USC-1 se evitaban los efectos perjudiciales
de los enzimas comerciales. Para ello, se estudió la producción de
metanol y de compuestos aromáticos durante la fermentación, ya que
los enzimas comerciales dan lugar a contenidos elevados en metanol
(alcohol tóxico) y dan lugar también a cambios en los aromas
típicos de la variedad de uva, tan valorados en los vinos
protegidos con denominación de origen.
Como fase final, se estudió la producción de
metanol y se hizo un estudio del perfil aromático de los vinos
elaborados con la cepa silvestre MR-7 de
Saccharomyces cerevisiae, con la recombinante
USC-1 y con enzimas pectolíticos comerciales (A y
B). Se realiza un análisis químico por cromatografia en fase
gaseosa y análisis organoléptico de los vinos elaborados. En cuanto
al metanol las diferencias fueron importantes, ya que la cantidad de
metanol se duplicaba cuando se utilizaban enzimas pectolíticos
comerciales.
Con respecto al perfil aromático de los vinos,
realizado por un comité de catadores profesionales, se observó que
el vino elaborado con la cepa USC-1 presentaba los
aromas más típicos de la variedad de uva, en este caso el aroma a
manzana considerado el aroma de la variedad de uva albariño.
Cuando se realizó cromatografa de gases para el
estudio aromático, se comprobó que la mayor concentración de
terpenos se encontraba en los vinos elaborados con las cepas
MR-7 (silvestre) y USC-1
(recombinante para el gen PGU1), concretamente el linalol y el
citronelol, compuestos considerados más importantes en la variedad
de uva albariño, corroborándose así la tipicidad.
<110> Universidad de Santiago de
Compostela
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Construcción de una cepa de levadura
enológica de Saccharomyces cerevisiae recombinante que
sobreexpresa una endopoligalacturonasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M20PGU1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> P200201596
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-08-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca tgatttctgc taattcatta cttattt
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcct taacagcttg caccagatcc ag
\hfill
Claims (3)
1. Procedimiento de construcción de una cepa de
levadura enológica de Saccharomyces cerevisiae recombinante
que sobreexpresa una endopoligalacturonasa mediante expresión del
plásmido pBEJ16-PGU1, caracterizado por:
a) Transformación de la levadura con el plásmido
pBEJ16-PGU1.
b) Expresión del plásmido
pBEJ16-PGUIen dicha levadura.
2. Cepa recombinante de Saccharomyces
cerevisiae, USC-1, según la reivindicación 1,
para el gen PGU1, depositada en la Colección Española de Cultivos
Tipo (CECT) con el número de orden CECT 11777.
3. Uso de la cepa recombinante
USC-1, según las reivindicaciones anteriores, para
la industria enológica.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200201596A ES2223231B1 (es) | 2002-07-08 | 2002-07-08 | Construccion de una cepa de levadura enologica de saccharomyces cerevisiae recombinante que sobreexpresa una endopoligalacturonasa. |
| PCT/ES2003/000324 WO2004005519A1 (es) | 2002-07-08 | 2003-07-01 | Construcción de una cepa de levadura enológica de saccharomyces cerevisiae recombinante que sobreexpresa una endopoligalacturonasa, para ser utilizada en la elaboracion de vinos |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200201596A ES2223231B1 (es) | 2002-07-08 | 2002-07-08 | Construccion de una cepa de levadura enologica de saccharomyces cerevisiae recombinante que sobreexpresa una endopoligalacturonasa. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2223231A1 ES2223231A1 (es) | 2005-02-16 |
| ES2223231B1 true ES2223231B1 (es) | 2005-11-01 |
Family
ID=30011358
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200201596A Expired - Fee Related ES2223231B1 (es) | 2002-07-08 | 2002-07-08 | Construccion de una cepa de levadura enologica de saccharomyces cerevisiae recombinante que sobreexpresa una endopoligalacturonasa. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2223231B1 (es) |
| WO (1) | WO2004005519A1 (es) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2328323A1 (es) * | 2007-12-05 | 2009-11-11 | Universidad De Castilla-La Mancha | Cepa de levadura saccharomyces cerevisiae cect 11783, modificada geneticamente con actividad pectinolitica: su metodo de obtencion y aplicacion. |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2880356B1 (fr) | 2005-01-05 | 2007-04-06 | Bayer Cropscience Sa Sa | Plantes transplastomiques exemptes du gene marqueur de selection |
| FR2880896B1 (fr) * | 2005-01-18 | 2007-04-20 | Univ Reims Champagne Ardenne | Procede pour transformer une souche de levure non productrice d'endopolygalacturonase en une souche la produisant |
| WO2017113024A1 (es) | 2015-12-30 | 2017-07-06 | Universidad De Chile | Novedosa poligalacturonasa activa a baja temperatura |
| CN114134059B (zh) * | 2021-11-17 | 2023-07-25 | 天津大学 | 生产毛喉素的重组酿酒酵母菌及构建方法 |
-
2002
- 2002-07-08 ES ES200201596A patent/ES2223231B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-07-01 WO PCT/ES2003/000324 patent/WO2004005519A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BLANCO, P. et al. "Cloning, molecular characterization and expression of an endo-polygalacturonase-encoding gene from Saccharomyces cerevisiae IM1-8b". FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, 1998, Vol. 164, páginas 249-255. Ver todo el documento. * |
| BLANCO, P. et al. "Production of pectic enzymes in yeasts". FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, 1999, Vol. 175, páginas 1-9. Ver todo el documento. * |
| GOGNIES, S. et al. "Cloning, sequence analysis and overexpression of a Saccharomyces cerevisiae endopolygalacturonase-encoding gene (PGL1)". YEAST, 1999, Vol. 15, páginas 11-22. Ver todo el documento. * |
| JIANHUA JIA et al. "Endopolygalacturonase genes and enzymes from Saccharomyces cerevisiae and Kluveromyces marxianus". CURR. GENET., 2000, Vol. 38, páginas 264-270. Ver todo el documento. * |
| VILANOVA, M. et al. "Use of a PGU1 recombinant Saccharomyces cerevisiae strain in oenological fermentations". JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY, 2000, Vol. 89, páginas 876-883. Ver todo el documento. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2328323A1 (es) * | 2007-12-05 | 2009-11-11 | Universidad De Castilla-La Mancha | Cepa de levadura saccharomyces cerevisiae cect 11783, modificada geneticamente con actividad pectinolitica: su metodo de obtencion y aplicacion. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2004005519A1 (es) | 2004-01-15 |
| ES2223231A1 (es) | 2005-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fernández-González et al. | Evaluation of polygalacturonase activity in Saccharomyces cerevisiae wine strains | |
| Esteve-Zarzoso et al. | The role of non-Saccharomyces yeasts in industrial winemaking | |
| Pretorius | Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the ancient art of winemaking | |
| Mehlomakulu et al. | Characterization of novel killer toxins secreted by wine-related non-Saccharomyces yeasts and their action on Brettanomyces spp. | |
| Blanco et al. | Production of pectic enzymes in yeasts | |
| US20110129566A1 (en) | Functional Enhancement of Yeast to Minimize Production of Ethyl Carbamate Via Modified Transporter Expression | |
| Gognies et al. | Cloning, sequence analysis and overexpression of a Saccharomyces cerevisiae endopolygalacturonase‐encoding gene (PGL1) | |
| AU679746B2 (en) | An enzyme exhibiting pectin methylesterase activity | |
| Fernandez-Gonzalez et al. | Engineering of an oenological Saccharomyces cerevisiae strain with pectinolytic activity and its effect on wine | |
| ES2223231B1 (es) | Construccion de una cepa de levadura enologica de saccharomyces cerevisiae recombinante que sobreexpresa una endopoligalacturonasa. | |
| CA2866238C (en) | Solution containing components of starting plant raw material, beverage, and method relating thereto | |
| ES2219752T3 (es) | Enzima con actividad pectina esterasa. | |
| EP0571475B1 (en) | Sg(beta)-1,4-GALACTANASE AND A DNA SEQUENCE | |
| Byaruagaba-Bazirake et al. | Characterisation of banana wine fermented with recombinant wine yeast strains | |
| CN114231514B (zh) | 一种重组褐藻胶裂解酶AlyL7及其应用 | |
| Massa et al. | Isolation, heterologous expression and characterization of an endo-polygalacturonase produced by the phytopathogen Burkholderia cepacia | |
| US5108925A (en) | Process for accelerated beer production by integrative expression in the PGK1 or ADC1 genes | |
| Teparić et al. | Genetic immobilization of RNase Rny1p at the Saccharomyces cerevisiae cell surface | |
| ES2238119B1 (es) | Procedimiento de obtencion de la enzima endopoligalacturonasa mediante el cultivo de cepas microbianas recombinantes que sobreexpresan el gen epg2 de kluyveromyces marxianus. | |
| CN110527633A (zh) | 一种米曲霉及其在制备单宁酶中的应用 | |
| CN110760531A (zh) | 一种剪接果胶酶基因中内含子的方法 | |
| Ramon et al. | Improvement of wine yeasts by genetic engineering | |
| EP2796543B1 (en) | Method for sterilizing microbial cells using polyethylene glycol-based nonionic surfactant | |
| JPH10243783A (ja) | 耐ストレス性酵母の作出方法 | |
| Damak et al. | Cloning and genomic organization of a rhamnogalacturonase gene from locally isolated strain of Aspergillus niger |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20050216 Kind code of ref document: A1 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2223231B1 Country of ref document: ES |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20220727 |