ES2219752T3

ES2219752T3 - Enzima con actividad pectina esterasa.

Info

Publication number: ES2219752T3
Application number: ES97904350T
Authority: ES
Inventors: Lene Nonboe Andersen; Markus Sakari Kauppinen; Gitte Budolfsen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-18
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2017-02-18
Also published as: ATE265527T1; AU1719497A; CN1212010A; CN1229495C; DE69728863T2; EP0885295B1; DE69728863D1; EP0885295A1; US6069000A; JP2000504587A; WO1997031102A1; JP4243348B2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA ENZIMA CON ACTIVIDAD PECTIN ESTERASA, UNA CONSTRUCCION DE ADN QUE CODIFICA PARA LA ENZIMA CON ACTIVIDAD PECTIN ESTERASA, UN METODO PARA LA PRODUCCION DE LA ENZIMA, UNA COMPOSICION ENZIMATICA QUE COMPRENDE DICHA ENZIMA CON ACTIVIDAD PECTIN ESTERASA Y EL USO DE DICHA ENZIMA Y COMPOSICION ENZIMATICA PARA VARIAS APLICACIONES INDUSTRIALES.

Description

Enzima con actividad pectina esterasa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una enzima con actividad pectina esterasa, un constructo de ADN que codifica la enzima con actividad pectina esterasa, un método de producción de la enzima, una composición enzimática que comprende dicha enzima con actividad pectina esterasa, y el uso de dicha enzima y de la composición enzimática para varias aplicaciones industriales.

Antecedentes de la invención

Los polímeros de pectina son unos constituyentes importantes de las paredes de células vegetales primarias. Estos están compuestos por cadenas de ácido galacturónico \alpha-D ligado 1,4 y por sus derivados metilados. El uso de enzimas de degradación de la pectina como la poligalacturonasa, la pectina metilesterasa, la pectina liasa o la pectato liasa es importante para la industria alimenticia, principalmente para el tratamiento de frutas y verduras, por ejemplo, para la producción de zumos o para la fabricación de vinos, debido al uso que se hace de su capacidad para catalizar la degradación del esqueleto del polímero de la pectina.

Para varios propósitos, sería deseable proporcionar cada una de las enzimas de degradación de la pectina presentes, por ejemplo, en unas preparaciones comerciales que contienen un número de distintas enzimas de degradación de la pectina (Pectinex Ultra SP® es un ejemplo de este tipo de preparación, preparada a base de Aspergillus aculeatus, disponible en Novo Nordisk A/S) en una forma libre de otros componentes. De esta manera, se podrían producir preparaciones enzimáticas adaptadas para unos objetivos específicos, las cuales contienen una única enzima de degradación de la pectina, o bien, unas combinaciones arbitrarias de ésta. Para este objetivo, es conveniente proporcionar unas enzimas de degradación de la pectina de un único componente mediante técnicas del ADN recombinante.

La pectina metilesterasa (EC 3.1.1.11) cataliza la eliminación del metanol de la pectina, lo que produce la formación de ácido péptico (ácido poligalacturónico).

Las pectina metilesterasas son producidas por varios microorganismos y se ha descubierto que también están presentes en hojas, raíces, tallos y frutas de muchas plantas grandes. Las pectinas metilesterasas microbianas han sido donadas por Khanh et al. (1990) "Nucleotide and derived amino acid sequence of a pestinesterase cDNA isolated from Aspergillus niger strain RH5344", Nucleic Acids Res. 18:4262; Khanh et al. (1991) "Characterization and expression of a genomic pectin methyl esterase-encoding gene in Aspergillus Niger", Gene 106:71-77; Spok et al. (1991) "Molecular cloning and sequencing of a pectinesterase gene from Pseudomonas solanacearum", J. Gen. Microbiol. 137:131-140; Plastow (1988) "Molecular cloning and nucleotide sequence of the pectin methyl esterase gene of Erwinia chrysanthemi B374", Mol. Microbiol. 2:247-254; Laurent et al. (1993) "Characterization and overexpression of the pem gene encoding pectin methylesterase of Erwinia chrysanthemi 3937", Gene 131:17-25; Tierny et al. (1994) "Molecular cloning and expression in Escherichia coli of genes encoding pectate lyase and pectin methylesterase activities from Bacteroides thetaiotaomicron", J. Appl. Bacteriol. 76:592-602.

El documento WO 94/25575 describe la clonación de una pectina metilesterasa de Aspergillus aculeatus.

Resumen de la invención

Según la presente invención, los inventores han conseguido el aislamiento y la caracterización de una secuencia de ADN, a partir de un hongo Basidiomycota, que codifica una enzima que muestra una pectina metilesterasa que se conoce también como actividad de la pectina esterasa, por lo que se puede preparar una composición monocomponente de pectina esterasa.

Por lo tanto, en un primer aspecto la invención se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima que muestra una actividad de pectina esterasa, cuya secuencia de ADN comprende

a): la parte que codifica la pectina esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido pYES 2.0 presente en E. coli DSM 10357, o

b): un análogo de la secuencia de ADN definida en a) que

i): es homólogo al menos al 60% a la secuencia de ADN definida en a), o

ii): hibridiza con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 4-933 en la SEC ID Nº 1 con baja astringencia, o

iii): codifica un polipéptido que es homólogo al menos al 50% al polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN definida en a), o

iv): codifica un polipéptido que es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo desarrollado contra la pectina esterasa purificada y codificada por la secuencia de ADN definida en a).

La longitud total de la secuencia de ADNc que codifica una pectina esterasa ha sido derivada de una cepa del hongo filamentoso Meripilus giganteus y ha sido clonada en un plásmido pYES 2.0 presente en la cepa de Escherichia coli DSM Nº 10357.

Dicha secuencia de ADN que codifica la pectina esterasa incluida en E. coli DSM 10357 tiene, según se cree, la misma secuencia que la que aparece en la SEC ID Nº 1. Por lo tanto, siempre que se hace referencia a la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido pYES 2.0 presente en DSM 10357, dicha referencia está destinada también a incluir la parte que codifica la pectina de esterasa de la secuencia de ADN presente en la SEC ID Nº 1.

Por lo tanto, los términos "parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido pYES 2.0 presente en DSM 10357" y "parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN presente en la SEC ID Nº 1" puede ser utilizada de manera intercambiable.

En otros aspectos, la invención proporciona un vector de expresión que incluye el constructo de ADN de la invención, una célula que comprende dicho constructo de ADN o dicho vector de expresión, y un método de producción de una enzima que muestre actividad pectina esterasa, método que comprende el cultivo de dicha célula bajo condiciones que permitan la producción de la enzima y la recuperación de la enzima del cultivo.

También en otro aspecto, la invención proporciona una enzima que muestra actividad pectina esterasa, y dicha enzima,

(a) es codificada por un constructo de ADN de la invención; o

(b) es producida mediante el método de la invención; y/o

(c) es inmunológicamente reactiva con un anticuerpo desarrollado contra una pectina esterasa purificada codificada por la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido pYES 2.0 presente en E. coli DSM 10357. En una forma de realización preferida la enzima tiene la secuencia aminoácida deducida SEC ID Nº 2.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición enzimática útil para la degradación o la modificación de una materia vegetal o de sus componentes, dicha composición está enriquecida con una enzima que muestra actividad pectina esterasa según se ha descrito anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una enzima o una composición enzimática de la invención para varias aplicaciones industriales.

Finalmente, la invención hace referencia a un cultivo biológico esencialmente puro aislado de la cepa de E. coli DSM Nº 10357, que incluye una secuencia de ADN de codificación de la pectina esterasa (la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido pYES 2.0 presente en E. coli DSM 10357) derivada de una cepa del hongo filamentoso Meripilus giganteus, o de cualquier mutante de dicha cepa de E. coli que ha retenido la capacidad de codificación de la pectina esterasa; y a un cultivo biológico esencialmente puro aislado del hongo filamentoso Meripilus giganteus CBS Nº 521.95, del cual deriva la secuencia de ADN presentada como SEC ID Nº 1.

Descripción detallada de la invención Constructos de ADN

La presente invención proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima que muestra actividad pectina esterasa, y dicha secuencia de ADN comprende

a) la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido pYES 2.0 presente en E. coli DSM 10357, o

b) un análogo de la secuencia de ADN definida en a) que

i): es homólogo al menos al 60% a la secuencia de ADN definida en a), o

iv): codifica un polipéptido que es immunológicamente reactivo con un anticuerpo desarrollado contra la pectina esterasa purificada codificada por la secuencia de ADN definida en a).

Tal y como se define en la presente, una secuencia de ADN análoga a la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido pYES 2.0 presente en E. coli DSM 10357 pretende indicar cualquier secuencia de ADN de codificación de una enzima que muestra actividad pectina esterasa, y dicha enzima posee una o más propiedades como las que se han citado anteriormente en (i)-(iv).

La secuencia de ADN análoga puede estar aislada de una cepa del hongo filamentoso Meripilus giganteus de producción de la enzima con actividad pectina esterasa, u otro organismo o un organismo relacionado, que de esta manera, puede ser, por ejemplo, un variante alélico o especies de la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN clonada en un plásmido pYES 2.0 presente en E. coli DSM 10357.

De forma alternativa, la secuencia análoga puede estar construida en base a la secuencia de ADN definida como la parte de codificación de la pectina esterasa de la SEC ID Nº 1, por ejemplo, puede ser una subsecuencia de ésta, y/o mediante la introducción de unas sustituciones nucleótidas que no producen ninguna secuencia de aminoácidos de la pectina esterasa codificada por la secuencia de ADN, pero que corresponde al uso del codón del organismo huésped previsto para la producción de la enzima, o mediante la introducción de unas sustituciones nucleótidas que pueden producir una secuencia de aminoácidos diferente.

Cuando se realizan las sustituciones nucleótidas, los cambios de aminoácidos son de preferencia menores, es decir sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan de forma significativa a la funcionalidad o a la actividad de la proteína, pequeñas deleciones, normalmente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones terminales amino- o carboxilo-, como un residuo de metionina en terminal amino, un péptido de enlace pequeño con hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación, como una cola de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de enlace.

Los ejemplos de sustituciones conservadoras forman parte del grupo de aminoácidos básicos (como la arginina, lisina, histidina), los aminoácidos acídicos (como el ácido glutámico y el ácido aspártico), los aminoácidos polares (como la glutamina y la asparragina), los aminoácidos hidrofóbicos (como la leucina, isoleucina, valina), los aminoácidos aromáticos (como la fenilalanina, el triptófano, la tirosina) y pequeños aminoácidos (como la glicina, alanina, serina, treonina, metionina). Para una descripción general de la sustitución nucleótida, nos referiremos por ejemplo a Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification 2, 95-107.

Será evidente para los expertos en la técnica que dichas sustituciones pueden realizarse fuera de las regiones fundamentales para la función de la molécula y que dan como resultado un polipéptido activo. Los aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por el constructo de ADN de la invención, y por lo tanto, en una forma preferida, no sometido a la sustitución, pueden ser identificados según los procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida o mutagénesis de reconocimiento de la alanina (en referencia por ejemplo a Cunningham and Wells, (1989), Science 244, 1081-1085). En la técnica precedente, se han introducido mutaciones en cada residuo de molécula, y se han realizado pruebas con las moléculas mutantes obtenidas con respecto a su actividad biológica (es decir de pectina esterasa) para identificar los residuos de aminoácidos fundamentales para la actividad de la molécula. También se pueden determinar los lugares de interacción del sustrato-enzima mediante un análisis de la estructura cristalina definida por ejemplo por técnicas tales como el análisis por resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (cf. por ejemplo de Vos et al., (1992), Science 255, 306-312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol. 224, 899-904; Wlodaver et al., (1992), FEBS Lett. 309, 59-64).

La homología a la que se hace referencia en el párrafo i) anterior se define como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia con respecto a la segunda. La homología puede ser determinada convenientemente por unos programas informáticos conocidos en la técnica, como por ejemplo el GAP proporcionado en el paquete del programa GCG (Manual de Programa para el paquete Wisconsin, Versión 8, Agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Se utiliza el GAP con las siguientes configuraciones para la comparación de la secuencia de ADN: penalización por creación del GAP de 5.0, y penalización por extensión del GAP de 0.3, la parte que codifica la secuencia de ADN muestra un grado de identidad preferiblemente de al menos el 60%, más preferiblemente al menos del 70%, más preferiblemente al menos del 80%, más preferiblemente al menos del 90%, más preferiblemente al menos del 95%, e incluso más preferiblemente al menos del 97%, con la parte que codifica la pectina esterasa de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº 1.

La hibridación indicada anteriormente en el párrafo (ii) pretende indicar que la secuencia análoga de ADN hibridiza la misma sonda que la secuencia de ADN que codifica la enzima de pectina esterasa bajo una condiciones determinadas específicas que están descritas, de manera más detallada, en la sección Materiales y Métodos en el texto a continuación. La sonda de oligonucleótidos que debe ser utilizada es la secuencia de ADN correspondiente a la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº 1.

La homología indicada en el párrafo iii) anterior se define como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia con respecto a la segunda. La homología puede ser determinada convenientemente por unos programas informáticos conocidos en la técnica, como por ejemplo el GAP proporcionado en el paquete del programa GCG (Manual de Programa del paquete Wisconsin, versión 8, Agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EEUU 53711) (Needleman, S.B. And Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Se utiliza el GAP con las siguientes configuraciones para la comparación de la secuencia polipéptida: penalización por creación del GAP de 3.0 y penalización por extensión del GAP de 0.1, el polipéptido codificado por una secuencia análoga de ADN muestra un grado de identidad preferiblemente de al menos el 50%, más preferiblemente al menos del 60%, más preferiblemente al menos del 70%, más preferiblemente al menos del 80%, más preferiblemente al menos del 90%, más preferiblemente al menos del 95%, y especialmente al menos del 97% con la enzima codificada por un constructo de ADN que comprende la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº 1, por ejemplo con la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2.

La presente invención se refiere también a las variantes de pectina esterasa que poseen una secuencia de aminoácidos, que difiere de no más de tres aminoácidos, preferiblemente de no más de dos aminoácidos, y más preferiblemente de no más de un aminoácido desde la parte madura de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

En relación con la característica iv) la reactividad inmunológica puede ser determinada por el método descrito en la sección Materiales y Métodos en el texto a continuación.

La secuencia de ADN de codificación de una pectina esterasa de la invención puede ser aislada de la cepa de Escherichia coli DSM 10357 usando unos métodos estándar por ejemplo tal y como describe Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY.

La secuencia de ADN de codificación de una enzima que muestra actividad pectina esterasa según la invención, también puede ser aislada por cualquier método general consistente en

-: la clonación, en vectores adecuados, de una biblioteca de ADNc de cualquier organismo destinado a producir la pectina esterasa de interés,

-: la transformación de células huésped de levadura apropiadas con dichos vectores,

-: el cultivo de células huésped en condiciones adecuadas para expresar cualquier enzima de interés codificada por un clon en la biblioteca de ADNc,

-: la selección de clones positivos para la determinación de cualquier actividad pectina esterasa de la enzima producida por dichos clones, y

-: el aislamiento del ADN de codificación de la enzima a partir de dichos clones.

Ha sido descrito un método de aislamiento general en las patentes WO 93/11249 o WO 94/14953, cuyos contenidos han sido añadidos a la presente como referencia. Una descripción más detallada del método de selección está indicado posteriormente en el ejemplo 1.

De forma alternativa, el ADN de codificación de una pectina esterasa según la invención puede, de acuerdo con los procedimientos ya conocidos, ser aislado de una fuente adecuada de manera apropiada, como cualquiera de los organismos que se van a mencionar después, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos sintéticos preparados en base a una secuencia de ADN como la que se describe en la presente. Por ejemplo, se puede preparar una sonda de oligonucleótidos adecuada en base a la parte de codificación de la pectina esterasa de las secuencias nucleótidas presentadas como SEC ID Nº 1 o de cualquier subsecuencia apropiada derivada de ésta, o en base a la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2.

Fuentes microbianas

En una forma de realización preferida, la secuencia de ADN de codificación de la pectina esterasa, deriva de una cepa que pertenece a la familia de Polyporaceae, que según la versión 3.3 de taxonomía del servidor entrez del NCBI (actualizada el 13-12-95), es una familia que forma parte de la categoría de Aphyllophorales, perteneciente a la clase Hymenomycetes situada debajo de la clase Basidiomycota.

Actualmente, está comprobado que, a partir de otros microorganismos, se puede obtener una secuencia de ADN de codificación de una enzima homóloga a la enzima de la invención, es decir una secuencia análoga de ADN. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede derivar, de forma similar mediante la selección de una biblioteca de ADNc de otro microorganismo, como una cepa de Aspergillus, saccharomyces, Bacteroides, Erwinia, Pseudomonas o Clostridium.

Un aislamiento de una cepa de Meripilus giganteus de la que puede derivar una pectina esterasa según la invención, ha sido depositada por los inventores según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes en el Centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Países Bajos (CBS).

\newpage

Fecha de depósito	: 04.07.95
Ref. Solicitante	: NN006040
Designación CBS	: Meripilus giganteus CBS Nª 521.95

El plásmido de expresión pYES 2.0 que comprende la totalidad de la secuencia de ADNc de codificación de la pectina esterasa según la invención, ha sido transformada en una cepa de E. coli que ha sido depositada por los inventores según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes en el Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH., Masheroder Weg 1b, D-38124 Raunschweig, República Federal de Alemania, (DSM).

Fecha de depósito	: 06.12.95
Ref. solicitante	: NN049144
Designación DSM	: Escherichia coli DSM 10357

Vectores de expresión

En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ADN según la invención.

El vector de expresión de la invención puede ser cualquier vector de expresión expuesto de manera apropiada a procedimientos recombinantes de ADN, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que debe ser introducido. Además, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. De forma alternativa, el vector puede ser cualquier vector que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el(los) cromosoma(s) donde se ha integrado.

En el vector de expresión, la secuencia de ADN de codificación de la pectina esterasa debería estar conectada, de forma operativa, a una secuencia promotora y terminadora conveniente. La secuencia promotora puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped seleccionada y que puede derivar de proteínas de codificación de genes, que pueden ser homologas o heterólogas a la célula huésped. Los procedimientos utilizados para unir las secuencias de ADN de codificación de la pectina esterasa, respectivamente, la promotora y la terminadora, y para insertarlas en los vectores apropiados, son conocidos por los expertos en la técnica (cf. por ejemplo Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).

Los ejemplos de secuencias promotoras convenientes para una utilización con células huésped de hongos filamentosos, son por ejemplo, la promotora de ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093 - 2099) o la promotora de tpiA. Existen otros ejemplos de secuencias promotoras útiles, que derivan del gen que codifica la amilasa Aspergillus oryzae TAKA, proteinasa aspártica Rhizomucor miehei, la \alpha-amilasa neutra de Aspergillus Niger, la \alpha-amilasa ácido estable Aspergillus Niger, la glucoamilasa (gluA) de Aspergillus Niger o Aspergillus awamori, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la isomerasa de triosa fosfato de Aspergillus oryzae o la acetamidasa de Aspergillus nidulans.

Células huésped

También en otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped que comprende el constructo de ADN según la invención y/o el vector recombinante de expresión según la invención.

De preferencia, la célula huésped según la invención es una célula eucariótica, en particular una célula fúngica como una célula fúngica de la levadura o filamentosa. En una forma particular, la célula puede pertenecer a una cepa de Trichoderma, preferiblemente Trichoderma harzianum o Trichoderma reesei, o especies de Aspergillus, más preferiblemente Aspergillus oryzae o Aspergillus Niger, o especies de Fusarium, en particular una cepa de Fusarium graminearum, Fusarium cerealis. Se pueden transformar las células fúngicas mediante un proceso que incluye, la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos seguida de la regeneración de la membrana celular en una forma conocida per se. El uso del Aspergillus como microorganismo huésped está descrito en la patente
EP 238 023 (Novo Nordisk A/S), cuyos contenidos están incorporados en la presente como referencia. La célula huésped también puede ser una célula de levadura, por ejemplo una cepa de Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces kluyveri o Saccharomyces uvarum, una cepa de Schizosaccharomyces sp., como Schizo-saccharomyces Pombe, una cepa de Hansenula sp., Pichia sp., Yarrowia sp., como Yarrowia lipolytica, o Kluyveromyces sp., como kluyveromyces lactis.

Método de producción de pectina esterasa

En otro aspecto ulterior, la presente invención proporciona un método para la producción de una enzima según la invención, donde una célula huésped adecuada, que ha sido transformada mediante una secuencia de ADN de codificación de la enzima, es cultivada bajo unas condiciones que permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante es recuperada del cultivo.

El medio utilizado para cultivar las células huésped transformadas puede ser cualquier medio convencional apropiado para el crecimiento de las células huésped en cuestión. De manera adecuada, la pectina esterasa expresada puede ser segregada en el medio de cultivo, y puede ser recuperada de dicho medio mediante unos procedimientos ya conocidos que incluyen la separación de las células del medio por centrifugado o filtración, precipitación de los componentes proteínicos del medio a través de una sal como por ejemplo sulfato amónico, y posteriormente mediante unos procesos cromatográficos como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, u otro proceso si-
milar.

Composiciones enzimáticas

En otro aspecto ulterior, la presente invención se refiere a una composición enzimática utilizada para la modificación o la degradación de componentes de la membrana celular vegetal, y dicha composición está enriquecida con una enzima que muestra actividad pectina esterasa según el método descrito anteriormente.

La composición enzimática ha sido enriquecida con una enzima según la invención, que puede ser por ejemplo, una composición enzimática que comprende varias actividades enzimáticas, en particular una composición enzimática que comprende unas enzimas de degradación de la membrana celular vegetal múltiple como Viscozim®, Pectinex® o Pectinex Ultra SP® (todos fabricados por Novo Nordisk A/S). De esta manera, se puede conseguir un aumento de la capacidad de degradación de la membrana celular de la composición enzimática.

En el presente contexto, el término "enriquecido" pretende indicar que la actividad pectina esterasa de la composición enzimática ha sido aumentada, por ejemplo con un factor de enriquecimiento de 1.1, de forma adecuada, debido a la adición de una enzima de la invención preparada según el método descrito anteriormente.

De forma alternativa, la composición enzimática enriquecida con una enzima que muestra actividad pectina esterasa, puede ser una composición que comprende una enzima según la invención como componente enzimático más importante, por ejemplo, una composición enzimática de un solo componente.

La composición enzimática puede ser preparada según unos métodos conocidos en la técnica y puede estar en forma de composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición enzimática puede encontrarse en forma de granulado o microgranulado. La enzima que debe ser incluida en la composición, puede ser estabilizada según unos métodos conocidos en la técnica.

Los ejemplos indicados más abajo indican las utilizaciones preferidas de la composición enzimática según la invención. La dosificación de la composición enzimática según la invención, y otras condiciones para la utilización de la composición, pueden ser determinadas a partir de unos métodos conocidos en la técnica.

La composición enzimática según la invención puede ser útil al menos con respecto a uno de los objetivos indicados a continuación.

Degradación o modificación de la materia vegetal

De manera ventajosa, se puede utilizar la composición enzimática para el tratamiento de una materia vegetal que contiene pectina, por ejemplo de origen vegetal o frutal, como la materia obtenida de la soja, las remolachas azucareras o las manzanas, para reducir la viscosidad y así, mejorar el tratamiento o la apariencia de la materia vegetal en cuestión. Se puede obtener una reducción de la viscosidad mediante el tratamiento de la materia vegetal que contiene la pectina con una preparación enzimática según la invención bajo unas condiciones adecuadas para la degradación total o parcial de la materia que contiene la pectina.

Se puede utilizar la composición enzimática para la despectinización y la reducción de la viscosidad de los zumos vegetales o frutales, especialmente en zumos de manzana o de pera.

Se puede utilizar la preparación enzimática en el tratamiento de triturados de frutas y verduras, por ejemplo en el tratamiento de triturados de manzana y de pera para la producción de zumos, y en el tratamiento de triturados de uvas para la producción de vino.

Se puede utilizar la composición enzimática para la producción de zumo a base de cítricos, por ejemplo para la degradación parcial o completa de la pulpa presente en el zumo después del prensado.

En los usos mencionados más arriba se prefiere el hecho de que la composición enzimática incluya una preparación enzimática que contenga poligalacturonasa, además de pectina esterasa.

Usando una preparación enzimática según la invención, se puede regular la consistencia y la apariencia de la fruta o de las verduras tratadas. De esta manera, se ha descubierto que la consistencia y la apariencia forman parte del resultado de esta combinación de enzimas utilizada en el tratamiento, es decir del tipo de enzimas (especialmente

\hbox{la(s)}

enzima(s) de degradación de la pectina) con las que está combinada la pectina metilesterasa de la invención.

Algunos ejemplos de productos con propiedades específicas que pueden ser producidas usando una preparación enzimática de la invención son el zumo filtrado a base de manzanas, peras, bayas, cítricos o tomates, y purés de zanahorias y tomates.

A partir de la descripción precedente, se considerará, de manera evidente, que se pueda producir la pectinesterasa de la invención como un único componente esencialmente libre de otras actividades enzimáticas como la actividad poligalacturonasa y/o pectina liasa, presentes habitualmente en las preparaciones pectinolíticas comercialmente disponibles y que contienen pectinesterasa.

Según este concepto, el uso de la pectina esterasa según la invención es particularmente apropiado para ciertos fines en los que no se desea la acción de otras actividades enzimáticas.

Algunos ejemplos de estos fines incluyen el uso de la pectina metilesterasa para una desmetilación completa o parcial de la pectina con frutas y verduras tratadas o no tratadas.

La desmetilación parcial es importante, por ejemplo cuando se desea obtener una firmeza mejorada de las frutas o verduras. Puesto que la disminución de esta firmeza es frecuente durante el tratamiento (por ejemplo durante el envasado y la pasteurización). Usando una cantidad controlada de pectina esterasa de la invención, se puede conseguir una desmetilación parcial de la pectina presente en las frutas y verduras, y esta pectina parcialmente desmetilada obtenida puede enlazarse de forma reticular, por ejemplo con unos iones divalentes como el calcio, formando de este modo frutas o verduras con mayor firmeza. De esta manera, se puede utilizar la pectina esterasa según la invención para mejorar la textura, por ejemplo, de pimientos rojos y verdes, judías, guisantes y de frutas troceadas como peras y manzanas.

Se puede realizar una infusión de la enzima, por ejemplo, no asistida por inmersión o asistida por tratamiento al vacío.

Otro ejemplo de estos fines es la desmetilación de la pectina, por ejemplo de cítricos, manzanas, girasoles y/o remolachas azucareras.

Además, se puede utilizar la pectina esterasa para obtener un aumento de la viscosidad in situ o la formación de gel en varios productos a base de verduras o frutas.

Se puede utilizar la pectina esterasa de la invención sola o con otras enzimas para mejorar la digestibilidad de los alimentos para animales que contienen pectina, por ejemplo los alimentos preparados a base de soja, de remolacha azucarera o de semillas de colza. Para tal fin, se añade una composición enzimática según la invención a los productos alimentarios.

Se puede utilizar la actividad pectina esterasa junto a otras enzimas, para producir ácido monogalacturónico o ácido galacturónico con un contenido de oligosacáridos de una materia que contiene pectina, como la pulpa de remolacha azucarera y según los métodos conocidos. Se puede utilizar el ácido monogalacturónico para la producción del ácido galactárico o para la producción del ácido graso y de ésteres alcohólicos grasos y/o éteres de ácido galacturónico. Se pueden utilizar los oligosacáridos que contienen ácido galacturónico como aditivos tanto para los alimentos para humanos como para animales.

Además, se puede utilizar la pectina esterasa, en combinación con otras enzimas, para eliminar las sustancias pécticas de las fibras vegetales, cuya eliminación es importante, por ejemplo, para la producción de fibras textiles u otras materias celulósicas. Para este propósito, se ha tratado la materia de fibra vegetal con una cantidad apropiada de pectina esterasa según la invención, en condiciones apropiadas, para obtener una degradación completa o parcial de las sustancias pécticas asociadas a la materia de fibra vegetal.

Modo de Acción en Bloque vs División Aleatoria

La distribución de los grupos carboxilo en la pectina es importante para las propiedades funcionales de la pectina.

Se han descrito diferentes métodos que permiten determinar la distribución de los grupos carboxilo libres en la pectina (Grasdalen, H. et al, Carbohydrate Res., 289, 105 (1995)). Con el fin de caracterizar el modo de acción de una pectina esterasa, se ha determinado la distribución de los grupos de ácidos mediante un método descrito por Mort et al. (Mort, A.J. et al, Carbohyd. Res., 247, 21 (1993)). Los ácidos galacturónicos esterificados son convertidos en galactosa por reducción con borohidruro sódico. A continuación, se dividen los enlaces glicosídicos de los residuos de galactosa obtenidos de manera selectiva, mediante la solvolisis de HF. Esto conduce a la producción de oligómeros: (Gal A)_{n} - Gal. Estos oligómeros representan las extensiones contiguas de los residuos Gal A entre los residuos esterificados por metilo en la pectina. La esterasa clonada de la invención fue comparada con una esterasa de naranja y con un tratamiento alcalino. Mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento, se separaron los oligómeros de seis residuos de ácido galacturónico, y éstos fueron cuantificados. A partir de la distribución de estos oligómeros, se puede determinar si los grupos ácidos en la pectina están distribuidos de forma aleatoria o en bloque.

Grasdalen et al. en 1995 describe que la espectroscopia NMR es un método útil para obtener una información cuantitativa sobre la composición y la estructura secuencial de la pectina. Contrariamente al método definido por Mort et al. en 1993, la espectroscopia NMR representa un proceso directo para verificar la estructura secuencial, y que sólo necesita un nivel medio de degradación del polímero.

Sin tener ningún vínculo con otra teoría cualquiera, se considera en la actualidad, que el rendimiento mejorado de la pectina esterasa según la invención, aplicada en varios procesos industriales como la gelatinización de la mermelada (ver ejemplo 4 en la presente), se debe al modo de acción de la enzima de la invención, que prevé preferiblemente una distribución en bloque de los grupos ácidos en la pectina.

La invención está descrita de forma más detallada en los ejemplos siguientes que no están, de ningún modo, destinados a limitar el objetivo de la invención, de acuerdo con las reivindicaciones.

Materias y Métodos Organismos depositados

Meripilus giganteus CBS 521.95 incluye la secuencia de ADN de codificación de la pectina esterasa según la invención.

Escherichia Coli DSM 10357 contiene el plásmido que incluye toda la secuencia de ADNc, que codifica la pectina esterasa de la invención, en el vector transportador pYES 2.0.

Otras cepas

Cepa de levadura: La cepa de Saccharomyces cerevisiae utilizada fue W3124 (MAT\alpha; ura 3-52; leu 2-3, 112;
his 3-D200; pep 4-1137; prc1::HIS3; prb1:: LEU2; cir+).

Cepa de E. coli: DH10B (Life Technologies)

Plásmidos

El vector pHD414 de expresión de Aspergillus es un derivado del plásmido p775 (descrito en la patente EP
238 023). La construcción de pHD414 también está descrita en la patente WO 93/11249.

pYES 2.0 (Invitrogen)

pA2PE18 (ver ejemplo 1)

La extracción del ARN total se realiza con tiocianato de guanidino, seguido por ultracentrifugado a través de un amortiguador de CsCl 5.7 M, obteniéndose el aislamiento del ARN poli(A)^{+} por cromatografía de afinidad de la

\hbox{oligo(dT)-}

celulosa a través del uso de unos procedimientos descritos en la patente WO 94/14953.

Síntesis del ADNc: se sintetiza el ADNc bicatenario a partir de 5 \mug de ARN poli(A)^{+} mediante el método de

\hbox{Rnasa H}

(Gubler y Hoffman (1983) Gene 25:263-269, Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) usando una modificación de la horquilla desarrollada por
F. S. Hagen (pers. comm.). El ARN poli(A)^{+} (5 \mug en 5 \mul de agua tratada con DEPC) es calentado a 70ºC durante

\hbox{8 min.}

en un tubo Eppendorph previamente siliconado, libre de RNasa, enfriado en hielo y combinado hasta un volumen final de 50 \mul con un tampón de transcriptasa inversa (Tris-Cl 50 mM, pH 8.3, KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM, DTT 10 mM, Bethesda Research Laboratories) que contiene 1 mM de dATP, dGTP y dTTP y 5-metil-dCTP 0.5 mM (Pharmacia), 40 unidades de inhibidor de ribonucleasa de placenta humana (RNasin, Promega), 1.45 \mug de un cebador de oligo(dT)_{18}-Not I (Pharmacia) y 1000 unidades de transcriptasa inversa SuperScript II RNasa H (Bethesda Research Laboratories). La primera cadena de ADNc es sintetizada por incubación de la mezcla de reacción a 45ºC durante
1 hora. Después de la síntesis, la mezcla híbrida de ARNm:ADNc es filtrada en gel a través de una columna MicroSpin S-400 HR (Pharmacia) según las instrucciones de los fabricantes.

Después de la filtración en gel, se diluyen los híbridos en un segundo tampón de cadena de 250 \mul (tris-Cl 20 mM, pH 7.4, KCl 90 mM, MgCl_{2} 4.6 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, \betaNAD+ 0.16 mM) que contiene 200 \muM de cada dNTP, 60 unidades de polimerasa I de ADN de E. coli (Pharmacia), 5.25 unidades de RNasa H (Promega) y 15 unidades de ligasa de ADN de E. coli (Boehringer Mannheim). La síntesis de la segunda cadena de ADNc se realiza mediante la incubación del tubo de reacción a una temperatura de 16ºC durante 2 horas, y después a 25ºC durante 15 min. Se detiene la reacción añadiendo EDTA a una concentración final de 20 mM seguida de las extracciones de fenol y de cloroformo.

Tratamiento de la nucleasa de judía Mung: el ADNc bicatenario es precipitado a -20ºC durante 12 horas mediante la adición de 2 vols de EtOH al 96%, 0.2 vol de NH_{4}Ac 10 M, recuperado por centrifugado, lavado en de EtOH al 70%, secado y vuelto a suspender en 30 \mul de un tampón de nucleasa de judía Mung (NaAc 30 mM, pH 4.6, NaCl 300 mM, ZnSO_{4} 1 mM, DTT 0.35 mM, glicerol al 2%) que contiene 25 unidades de nucleasa de judía Mung (Pharmacia). La horquilla de ADN monocatenario está cortada por incubación de la reacción a 30ºC durante 30 minutos, seguido de la adición de 70 \mul de tris-Cl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, la extracción del fenol y la precipitación con 2 vols de EtOH al 96% y 0.1 vol de NaAc 3 M, pH 5.2 en hielo durante 30 minutos.

Extremo romo con ADN polimerasa T4: Los ADNc bicatenarios son recuperados por centrifugado y dispuestos en extremo romo en 30 \mul de tampón de ADN polimerasa T4 (Tris-acetato 20 mM, pH 7.9, MgAc 10 mM, KAc 50 mM, DTT 1 mM) que contiene 0.5 mM de cada dNTP y 5 unidades de ADN polimerasa T4 (New England Biolabs) mediante la incubación de la mezcla reactiva a 16ºC durante 1 hora. Se detiene la reacción añadiendo EDTA a una concentración final de 20 mM, seguido de las extracciones de fenol y de cloroformo, y de la precipitación durante 12 horas a -20ºC mediante la adición de 2 vols de EtOH al 96% y 0.1 vol de NaAc 3 M con un pH de 5.2.

Ligadura del adaptador, digestión de NOT I y selección de tamaño

Tras la reacción del contenido, los ADNc son recuperados por centrifugado, lavados en EtOH al 70% y secados. Se vuelve a suspender el granulado de ADNc en un tampón de ligadura de 25 \mul (tris-Cl 30 mM, pH 7.8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 0.5 mM) que contiene 2.5 \mug de adaptadores BstXI no-palindrómicos (Invitrogen) y 30 unidades de ligasa T4 (Promega), y se incuba a 16ºC durante 12 horas. La reacción es detenida mediante su calentamiento a 65ºC durante 20 min. y posteriormente se enfría en hielo durante 5 min. El ADNc adaptado es digerido con una enzima de restricción NOT I mediante la adición de 20 \mul de agua, 5 \mul de un tampón enzimático de restricción 10x NOT I (New England Biolabs) y 50 unidades de Not I (New England Biolabs), seguido por la incubación durante 2.5 horas a 37ºC. La reacción es detenida por calentamiento a 65ºC durante 10 min. Se dividen los ADNc por tamaño mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa de SeaPlaque GTG al 0.8% de baja temperatura de fusión (FMC) en 1x TBE, para separar los adaptadores no ligados y los ADNc de tamaño pequeño. El ADNc es seleccionado por tamaños con un corte de 0.7 kb y liberado del gel mediante el uso de \beta-Agarasa (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante, y es precipitado durante 12 horas a -20ºC mediante la adición de 2 vols de EtOH al 96% y 0.1 vol de NaAc 3 M con un pH de 5.2.

Construcción de bibliotecas: Se recupera el ADNc direccional, seleccionado por tamaños mediante centrifugado, se lava en EtOH al 70%, se seca y se vuelve a suspender en 30 \mul de tris-Cl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM. Los ADNc son desalados mediante filtración en gel a través de una columna MicroSpin S-300 HR (Pharmacia) según las instrucciones de los fabricantes. Se realizan tres pruebas de ligaduras en un tampón de ligadura de 10 \mul (tris-Cl 30 mM, pH 7.8, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, ATP 0.5 mM) con un contenido de 5 \mul de ADNc bicatenario (tubos de reacción #1 y #2), 15 unidades de ligasa T4 (Promega) y 30 ng (tubo #1), 40 ng (tubo #2) y 40 ng (tubo #3, el control anterior del vector) del vector pYES 2.0 dividido BstXI-Not I. Se obtienen las reacciones de ligadura por incubación a 16ºC durante 12 horas, calentándose a 70ºC durante 20 min. y mediante la adición de 10 \mul de agua en cada tubo. Se somete a electroporación 1 \mul de cada mezcla de ligadura en 40 \mul de células electrocompetentes DH10B de
E. coli (Bethesda research Laboratories) según está descrito (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY). En condiciones óptimas, se establece una biblioteca en E. coli que consiste en agrupaciones. Cada agrupación está formada extendiendo la E. coli transformada en placas de agar LB+ampicillina dando como resultado 15.000-30.000 colonias/placa después de la incubación a 37ºC durante 24 horas. Se añaden 20 ml de LB+ampicilina a la placa y se suspenden las células en la misma. La suspensión de células es agitada en un tubo de 50 ml durante 1 hora a 37ºC. El ADN plásmido es aislado de las células según las instrucciones del fabricante mediante la utilización de un conjunto plásmido QIAGEN, y se almacena este último a -20ºC.

Se transforma 1 \mul de partes alícuotas de ADN plásmido purificado (100 ng/\mul) de agrupaciones individuales en S. cerevisiae W3124 por electroporación (Becker y Guarante (1991) Methods Enzymol. 194:182-187) y los transformantes son laminados en agar SC con un contenido de glucosa al 2% e incubados a 30ºC.

Identificación de clones positivos

De 3 a 5 días después de la incubación, se laminaron otra vez las placas agar SC en un conjunto de placas agar SC + galactosa. Estas placas fueron incubadas durante 2 a 4 días a 30ºC y cubiertas con un gel de recubrimiento a base de pectina, que contenía un 1% de pectina de manzana DE al 75%, agarosa HSB al 1% en un tampón apropiado, para detectar la actividad pectinolítica. Tras la incubación a 30ºC hasta el día siguiente, se vertieron 10-15 ml de una solución de MTAB al 1% (bromuro de alquiltrimetilamonio mezclado) sobre la capa de recubrimiento, y se eliminó después de 1 hora. Las colonias positivas de pectina metilesterasa fueron identificadas como colonias rodeadas por un halo blanco.

Caracterización de clones positivos

Se obtienen los clones positivos en forma de colonias individuales, las inserciones de ADNc fueron añadidas directamente a partir de la colonia de levadura usando cebadores poliligadores biotinilados, purificados por un sistema de cuentas magnéticas (Dynabead M-280, Dynal) y caracterizados individualmente mediante una secuenciación del extremo 5' de cada clon de ADNc mediante el método de terminación de cadena (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. E.E.U.U. 74:5463-5467) y el sistema Sequenase (United States Biochemical).

Aislamiento de un gen de ADNc para la expresión en Aspergillus

Una colonia de levadura productora de pectina esterasa es inoculada en 20 ml de caldo YPD en un tubo de ensayo de cristal de 50 ml. El tubo es agitado durante 2 días a 30ºC. Las células son recuperadas por centrifugado durante 10 min. de 3000 rpm.

El ADN es aislado, según la patente WO 94/14953, y disuelto en 50 \mul de agua. El ADN se convierte en E. coli mediante unos procedimientos estándar. El ADN plásmido es aislado de la E. coli mediante unos procedimientos estándar, y analizado mediante un análisis de las enzimas de restricción. Se elimina la inserción de ADNc usando unas enzimas de restricción apropiadas y ligándose en un vector de expresión de Aspergillus.

Transformación de Aspergillus oryzae o Aspergillus Niger

Se pueden preparar los protoplastos según se describe en la patente WO 95/02043, p.16, línea 21 - página 17, línea 12, incorporados como referencia en la presente.

Se mezcla una suspensión de 100 \mul de protoplasto con 5-25 \mug de ADN apropiado en 10 \mul de STC (Sorbitol
1.2 M, tris-HCl 10 mM, pH = 7.5, CaCl_{2} 10 mM). Se mezclan los protoplastos con p3SR2 (un plásmido transportador del gen amdS de A. nidulans). La mezcla es mantenida a temperatura ambiente durante 25 minutos. Se añaden 0.2 ml de PEG 4000 al 60% (BDH 29576), CaCl_{2} 10 mM y tris-HCl 10 mM, pH 7.5 y se mezclan cuidadosamente (dos veces), y finalmente se añade 0.85 ml de la misma solución y se mezcla cuidadosamente. La mezcla es mantenida a temperatura ambiente durante 25 minutos, centrifugada a 2500 g durante 15 minutos y se vuelve a suspender el granulado en 2 ml de Sorbitol 1.2 M. Después de otra sedimentación, los protoplastos son esparcidos en unas placas mínimas (Cove, Biochem. Biofis. Acta 113 (1966) 51-56) que contienen sacarosa 1.0 M, pH 7.0, acetamida 10 mM como fuente de nitrógeno y CsCl 20 mM para inhibir el crecimiento residual. Tras la incubación durante 4 a 7 días a 37ºC, se seleccionan las esporas y se esparcen en colonias individuales. Se repite este procedimiento y las esporas de una colonia individual son almacenadas como transformantes definidos después del segundo reaislamiento.

Prueba de transformantes de A. oryzae

Cada uno de los transformantes es inoculado en 10 ml de YPM (según se indica más abajo) y propagado. Después de 2 a 5 días de incubación a 30ºC, se elimina el sobrenadante. Se determina la actividad pectina esterasa mediante la aplicación de 10 \mul de sobrenadante en unos orificios de 4 mm de diámetro realizados en un gel de agarosa que contiene un 1% de pectina de manzana DE al 75%, la incubación hasta el día siguiente a 30ºC, y la precipitación con MTAB según el método descrito anteriormente. La actividad pectina esterasa es definida posteriormente por un halo blanco.

Fermentación discontinua

Se realizaron las fermentaciones en forma de procesos discontinuos con maltodextrina como fuente de carbono, urea como fuente de nitrógeno, y un extracto de levadura. Se mantuvo el pH a 7.0 y la temperatura a 34ºC durante todo el proceso. Después de la fermentación se recuperó la pectina esterasa por centrifugado y filtración del
germen.

Purificación de la enzima

Se purificó la esterasa de pectina recombinante de A. oryzae según se indica a continuación: después de 5 días de cultivo, se recuperó el sobrenadante de cultivo, y se centrifugó, se filtró el germen, y se ultrafiltró en un sistema de ultrafiltración Filtron (Minisette) de 3 kDa hasta un volumen mínimo. Se dializaron 25 ml de producto ultrafiltrado con H_{3}BO_{3} 50 mM, DMG 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, con un pH de 7.0, dispuestos en una columna de 40 ml de Q-Sepharose FF (Pharmacia, Suecia) equilibrado en el mismo tampón. Después del lavado de la columna, la proteína ligada fue eluida con un gradiente lineal de NaCl (de 0 a 0.5 M de NaCl). Para determinar la actividad pectina esterasa, se analizaron las fracciones obtenidas con la columna mediante el ensayo de la pectina de manzana según el método descrito anteriormente. La mayor parte de la actividad pectina esterasa fue detectada en el producto filtrado, mientras que la mayor parte de la proteína estaba ligada con la columna.

Se ajustó el pH del producto filtrado a 4.5 con CH_{3}COOH y se dispuso en una columna de 50 ml de S-Sepharose HP (Pharmacia, Suecia) equilibrado en 25 mM de CH_{3}COOH/NaOH, con un pH de 4.5. Después del lavado de la columna, la proteína ligada fue eluida con un gradiente lineal de NaCl (de 0 a 0.25 M de NaCl). Las fracciones obtenidas con la columna fueron analizadas para determinar la actividad pectina esterasa. Se eluyó la mayor parte de la actividad pectina esterasa hasta un valor máximo y se agruparon las fracciones de valor máximo.

Se añadió sulfato amónico (AMS) a la agrupación en una concentración final de AMS de 1.6 M, y la enzima fue añadida a una columna Phenyl Toyopearl de 40 ml equilibrada en H_{3}BO_{3} 100 mM, DMG 10 mM, CaCl_{2} 2 mM, AMS 1.6 M, con un pH de 7.0. Después del lavado de la columna, la proteína ligada fue eluida con un gradiente lineal de AMS (de 1.6 a 0 M de AMS). El tampón del valor máximo de la pectina esterasa fue sustituido por 25 mM de CH_{3}COOH/NaOH, con un pH de 4.5, por el paso a una columna de 1.4L de Sephadex G25 equilibrado en 25 mM de CH_{3}COOH/NaOH, con un pH de 4.5.

Se dispuso la enzima de pectina esterasa en una columna de 50 ml de S-Sepharose HP equilibrado en 25 mM de CH_{3}COOH/NaOH, con un pH de 4.5. Después del lavado de la columna, la proteína ligada fue eluida con un gradiente lineal de NaCl (de 0 a 0.1 M de NaCl). Se analizaron las fracciones con actividad pectina esterasa por SDS-PAGE. Las fracciones sólo contenían un enlace.

Electroforesis

Se realizó la electroforesis SDS-PAGE con una unidad de electroforesis Mini-Leak 4 (Kem-En-Tec, Dinamarca) que es una versión modificada del procedimiento Laemli (Laemmli (1970) Nature 227:680-685). Los geles fueron teñidos con Coomassie según las indicaciones del fabricante.

Aislamiento de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº 1

La parte que codifica la pectina esterasa de la secuencia de ADN, mostrada en la SEC ID Nº 1, que codifica la pectina esterasa según la invención, puede ser obtenida a partir de la Escherichia Coli DSM 10357 del organismo depositado mediante la extracción del ADN plásmido mediante unos unos métodos conocidos en la técnica (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY).

Hibridación

Las condiciones de hibridación adecuadas para la determinación de la hibridación entre una sonda nucleótida y una secuencia "análoga" de ADN según la invención puede estar definida según el método descrito posteriormente. La sonda de oligonucleótidos que se debe utilizar es la secuencia de ADN que corresponde a la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº 1, es decir a los nucleótidos 4-933 de la SEC ID Nº 1.

Condiciones de hibridación

Las condiciones de hibridación a las que se hace mención en la presente para definir una secuencia de ADN análoga tal y como se define en la parte b) del primer aspecto de la invención que hibrida la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº 1, es decir los nucleótidos 4-933, bajo al menos unas condiciones de baja astringencia, aunque preferiblemente unas condiciones de astringencia media o alta según se describe posteriormente en una forma más detallada.

Las condiciones experimentales adecuadas para la determinación de la hibridación de baja, media, o alta astringencia, entre una sonda nucleótida y un ADN homólogo o una secuencia de ARN implica una inmersión previa del filtro que contiene los fragmentos de ADN o de ARN para la hibridización en 5 X SSC (cloruro sódico/citrato sódico, Sambrook et al. 1989) durante 10 minutos, y la prehibridación del filtro en una solución de 5 X SSC, una solución de 5 x de Denhardt (Sambrook et al. 1989), SDS al 0.5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y ultrasónico (Sambrook et al. 1989), seguido de una hibridación en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de una sonda cebada aleatoriamente (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), marcada en ^{32}P-dCTP (actividad específica > 1 x 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a 45ºC aproximadamente. Después, se procede a un doble lavado del filtro durante 30 minutos en 2 X SSC, SDS al 0.5% al menos a 55ºC (baja astringencia), más preferiblemente a 60ºC (astringencia media), y aún más preferiblemente a 65ºC (astringencia media/alta), incluso más preferiblemente a 70ºC (astringencia alta), y todavía más preferiblemente a 75ºC (astringencia excesivamente alta).

En esas condiciones, las moléculas con las que la sonda de oligonucleótidos se hibrida, son detectadas mediante el uso de una película rayos X.

Reactividad cruzada inmunológica

Los anticuerpos que se deben usar para la determinación de la reactividad cruzada inmunológica pueden ser preparados usando una pectina esterasa purificada. Más específicamente, el antisuero utilizado contra la pectina esterasa de la invención también puede ser aumentado para la inmunización de los conejos (u otros roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et al. en: A Manual of Quantitative Immmunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, capítulo 23, o A. Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más específicamente en las páginas 27 a 31). Se pueden obtener inmunoglobulinas purificadas con el antisuero, por ejemplo mediante una precipitación de la sal ((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguido de una diálisis y de una cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo con DEAE-Sephadex. Se puede realizar la caracterización inmunoquímica de las proteínas, por análisis de doble difusión de Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, páginas 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4), o bien por inmunoelectroforesis de cohete (N. Axelsen et al., Capí-
tulo 2).

Medios

YPD: 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, H_{2}O en 900 ml. Realización de autoclave, 100 ml de glucosa al 20% (filtrada de forma estéril) añadida.

YPM: 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, H_{2}O en 900 ml. Realización de autoclave, 100 ml de maltodextrina al 20% (filtrada de forma estéril) añadida.

10 x sal basal: 75 g de base de levadura nitrogenada, 113 g de ácido succínico, 68 g de NaOH, H_{2}O en 1000 ml, filtrada de forma estéril.

SC-URA: 100 ml de 10 Vol. de Sal basal, 28 ml de ácidos de casamino al 20% sin vitaminas, 10 ml de triptófano al 1%, H_{2}O en 900 ml, realización de autoclave, 3.6 ml de treonina al 5% y 100 ml de glucosa al 20% o de galactosa al 20% añadida.

SC-agar: SC-URA, 20 g/l de agar añadido.

PEG 4000 (glicol polietileno, peso molecular = 4,000) (BDH, Inglaterra)

1% de pectina de manzana DE 75% (Herbstreit, Alemania)

1% de agarosa HSB (FMC Litex A/S, Dinamarca)

MTAB (bromuro alquiltrimetilamonio mezclado) (Sigma)

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y expresión de una pectina esterasa de Meripilus giganteus CBS 521.95

Se aisló el ARNm del Meripilus giganteus, CBS Nº 521.95, cultivado en un medio de fermentación con un contenido de celulosa sometido a agitación para asegurar una aireación suficiente. Los micelios fueron extraídos después de 3 a 5 días de crecimiento, e inmediatamente congelados en nitrógeno líquido, y almacenados a -80ºC. Una biblioteca de M. giganteus, CBS Nº. 521.95, que comprende aproximadamente 10^{6} clones individuales, fue construida en E. coli, según está descrito con un vector de base del 1%. El ADN plásmido de algunas agrupaciones fue transformado en levadura, y se obtuvieron 50-100 placas que contenían 250-400 colonias de levadura por cada agrupación.

Las colonias de pectina esterasa positivas fueron identificadas y aisladas en placas de agar SC con la prueba de pectina de manzana. Los insertos de ADNc fueron ampliados directamente a partir de las colonias de levadura y caracterizadas según el modo descrito anteriormente en la sección Materiales y Métodos. La secuencia de ADN del ADNc de codificación de la pectina esterasa está mostrada en la SEC ID Nº 1, y la correspondiente secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº 2. En la SEC ID Nº 1, los nucleótidos de ADN desde el Nº 4 hasta el Nº 933, definen la región de codificación de la pectina esterasa.

Se puede obtener el ADNc a partir del plásmido en DSM 10357.

Se aisló el ADN total de una colonia de levadura y se recuperó el ADN plásmido mediante la transformación de E. coli según se ha descrito anteriormente. Con el fin de expresar la pectina esterasa en Aspergillus, el ADN fue digerido con enzimas de restricción apropiadas, fragmentado en gel por tamaños, y un fragmento correspondiente al gen de pectina esterasa fue purificado. El gen fue posteriormente ligado con pHD414, digerido con unas enzimas de restricción apropiadas, y el resultado fue el plásmido pA2PE18.

Después de la ampliación del ADN en E. coli, el plásmido se transformó en Aspergillus oryzae según el método descrito anteriormente.

Prueba de transformantes de A. oryzae

Se realizaron pruebas con cada uno de los transformantes para determinar la actividad enzimática, según el método descrito anteriormente. Algunos transformantes tenían actividad pectina esterasa, que era relativamente superior a la del Aspergillus oryzae de base. Lo que demuestra la expresión eficaz de la pectina esterasa en Aspergillus oryzae.

Ejemplo 2 Homología a pectinas esterasas conocidas

Se realizó un examen de homología de la pectina esterasa de la invención, con respecto a las bases de datos de nucleótidos y proteínas. El examen de homología demostró que la pectina esterasa más apropiada era una pectina esterasa de Aspergillus aculeatus y una pectina esterasa de Aspergillus tubigensis (previamente conocida como proveniente de A. Niger).

Según el método descrito en la "Descripción detallada de la invención", la homología del ADN de la pectina esterasa según la invención, con respecto a la mayoría de las pectinas esterasas de la técnica precedente, fue determinada a través del programa informático GAP. La pectina esterasa de la invención presenta únicamente una homología del ADN del 54% a la pectina esterasa de Aspergillus aculeatus (WO 94/25575), y la pectina esterasa de la invención presenta únicamente una homología del ADN del 56% a la pectina esterasa de Aspergillus tubigensis (Khanh et al. (1990) "Nucleotide and derived amino acid sequence of a pectinesterase cDNA isolated from Aspergillus Niger strain RH5344", Nucleic Acids Res. 18:4262; Khanh et al. (1991) "Characterization and expression of a genomic pectin methyl estterase-encoding gene in Aspergillus Niger", Gene 106:71-77).

Según el método descrito en el apartado "Descripción detallada de la invención", la homología del polipéptido de la pectina esterasa según la invención, con respecto a la mayoría de las pectinas esterasas de la técnica precedente, fue determinada a través del programa informático GAP. La pectina esterasa de la invención posee únicamente una homología del polipéptido del 47% a la pectina esterasa de Aspergillus aculeatus, y la pectina esterasa de la invención posee únicamente una homología del polipéptido del 44% a la pectina esterasa de Aspergillus tubigensis.

Esto indica que la pectina esterasa de la invención obtenida, es diferente a cualquier pectina esterasa conocida.

Ejemplo 3 Purificación y caracterización de la esterasa de pectina recombinante de la invención

La pectina esterasa fue producida por fermentación en flujo discontinuo de A. oryzae que expresaba la enzima como se describe en la sección anterior de Materiales y Métodos.

La pectina esterasa recombinante fue purificada y caracterizada según los métodos descritos en la sección anterior de Materiales y Métodos. El peso molecular de la enzima fue determinado en 37 kDa mediante SDS-PAGE.

Ejemplo 4 Gelificación in situ de la mermelada de fresa Metanol libre como indicación de las propiedades de gelificación Materiales y métodos

Lote de pectinesterasa PPJ 4300, 423 PEU/g

Pectinesterasa: Meripulus giganteus, 2,4 PEU/g

Fresas, congeladas, clase: Senga Sengana

La actividad de la pectinesterasa está indicada en unidades de pectina esterasa (PEU) que representan la cantidad de enzimas que, en condiciones estándar, libera unos grupos carboxilo de 1 mmol por minuto (ensayo de Novo Nordisk ABT-SM-0005.02.1, disponible bajo pedido en Novo Nordisk A/S).

Preparación de mermelada

La preparación de la mermelada se desarrolla según el proceso estándar de preparación de mermeladas (Proceso operativo estándar de Novo Nordisk, ABF-SP-4002.02/01, disponible bajo pedido en Novo Nordisk A/S).

Se preparó una parte de mermelada equivalente a 300 g. La proporción de fresa y de azúcar era de: 180 g de bayas + 120 g de azúcar. Después de realizar una cocción previa inicial, la pasta de fruta fue dividida en 2 X 3 partes de

\hbox{50
g,}

se enfriaron las muestras a 40ºC y, se añadió la enzima según se indica a continuación:

1) control sin enzima añadida

2) PE, PPJ 4300, 10 PEU/Kg de fruta

3) PE, Meripulus giganteus, 10 PEU/kg de fruta

Las muestras fueron selladas y mantenidas así durante 1 hora, luego fueron sometidas a una fuente de calor durante 3 minutos a 90ºC para inactivar la enzima.

En los ensayos indicados aquí, se efectuó una cuantificación del metanol libre en el laboratorio Alfred Jørgensens A/S, Copenhague. Primero, las muestras fueron destiladas, y después analizadas usando un cromatógrafo de gases capilar en combinación con la detección de la masa por espectrometría.

Resultados y argumentación

Los resultados aparecen en la tabla 1 siguiente:

TABLA 1 Formación de Metanol

		Metanol, ppm
	Control	12 ppm
	PE, PPJ 4300,	200 ppm
	10 PEU/kg de fruta
	PE, M.gig.,	340 ppm
	10 PEU/kg de fruta

Se ha demostrado claramente, que la pectinesterasa de Meripulus giganteus, con la que se obtienen 340 ppm de metanol libre, es superior al PE derivado de Aspergillus más tradicional, con el que se obtiene una formación de metanol libre de 200 ppm.

Si se estima que el contenido de pectina presente en las fresas es de 0.6%, y que el grado de esterificación (DE) es del 70%, se puede calcular que el DE final del producto de PE tradicional resulta en un DE de 52, mientras que el PE de Meripulus giganteus - resulta en un DE de 38.

El grado de esterificación es importante para las características de la textura de la mermelada gelatinizada in situ, y también para otros productos vegetales modificados de PE. El grado de esterificación determina el número de puentes de Ca que se pueden formar y por consiguiente, está relacionado con la resistencia del gel o la viscosidad de un producto determinado.

En consecuencia, parece obvio que la enzima derivada de Meripulus giganteus es un instrumento útil para la creación de geles fuertes y útiles. La enzima también puede ser una alternativa a la modificación química de las pectinas extraídas, incluso más fuerte que el producto de PE derivado de Aspergillus tradicional.

Listado de Secuencias

La SEC ID Nº 1 muestra la secuencia de ADN de toda la secuencia de ADNc incluida en la construcción del ADN transformado en la Escherichia Coli DSM 10357 depositada.

6

7

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1128 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: única

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(vi): FUENTE ORIGINAL:

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(A): ORGANISMO: Meripilus giganteus

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(B): CEPA: CBS 521.95

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 4..933

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

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1

2

3

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 310 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

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4

5

Claims

1. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN de codificación de una enzima que muestra actividad pectina esterasa, dicha secuencia de ADN comprende

a) la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN clonada en el plásmido pYES 2.0 presente en E. coli DSM 10357, o la parte de codificación de la pectina esterasa de la secuencia de ADN que corresponde a la SEC ID Nº 1; o

b) un análogo de las secuencias de ADN definidas en a) que

i): es homóloga al menos en un 70% a la secuencia de ADN definida en a), o

ii): hibrida con una astringencia media con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 4-933 en la SEC ID Nº 1, o

iii): codifica un polipéptido que es homólogo al menos en un 60% al polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN definida en a).

2. Constructo de ADN según la reivindicación 1, en el que se puede obtener la secuencia de ADN de codificación de una enzima que muestra actividad pectina esterasa a partir de un microorganismo, de preferencia un hongo filamentoso, una levadura, o una bacteria.

3. Constructo de ADN según la reivindicación 2, en el que se puede obtener la secuencia de ADN a partir de una cepa de Basidiomicota, de preferencia una cepa de la clase de las Hymenomycetes, más preferiblemente una cepa del orden de las Aphyllophorales, más preferiblemente una cepa de la familia de Polyporaceae, como por ejemplo, del género de Meripilus, en particular una cepa de Meripilus giganteus.

4. Constructo de ADN según la reivindicación 3, en el que la secuencia de ADN está aislada de o producida a partir de una biblioteca de ADN de la cepa Meripilus giganteus CBS 521.95.

5. Constructo de ADN según la reivindicación 2, en el que se puede obtener la secuencia de ADN a partir de una cepa de Aspergillus, Saccharomyces, Bacteroides, Erwinia, Pseudomonas o Clostridium.

6. Constructo de ADN según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ADN está aislada de Escherichia Coli DSM 10357.

7. Vector de expresión recombinante que comprende un constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Célula que comprende un constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector de expresión recombinante según la reivindicación 7.

9. La célula según la reivindicación 8, que es una célula eucariótica, en particular una célula fúngica, como una célula de levadura o una célula fúngica filamentosa.

10. La célula según la reivindicación 9, que es una cepa de Fusarium, de Aspergillus o de Trichoderma, en particular una cepa de Fusarium graminearum, Fusarium cerealis, Aspergillus Niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma harzianum o Trichoderma reesei.

11. La célula según la reivindicación 9, que es una cepa de Meripilus sp., en particular Meripilus giganteus.

12. La célula según la reivindicación 11, que es la cepa Meripilus giganteus CBS Nº 521.95.

13. La célula según la reivindicación 9, que es una cepa de Saccharomyces, en particular una cepa de Saccharomyces cerevisiae.

14. Un método de producción de una enzima que muestra actividad pectina esterasa, dicho método comprende el cultivo de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 en unas condiciones que permiten la producción de la enzima, y la recuperación de la enzima del cultivo.

15. Enzima que muestra actividad pectina esterasa, dicha enzima

(a): es codificada por un constructo de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el vector de expresión recombinante según la reivindicación 7, o

(b): comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga al menos en un 60% a la SEC Nº 2.

16. Enzima según la reivindicación 15, que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2.

17. Composición que comprende la enzima según la reivindicación 15 ó 16.

18. Composición enzimática que está enriquecida por una enzima que muestra actividad pectina esterasa según la reivindicación 15 ó 16.

19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18, que comprende también una \alpha-arabinosidasa, una \beta-galactosidasa, una \alpha-glucoronisidasa, \beta-xilosidasa, una acetil xilano esterasa, una xilanasa, una arabinanasa, una ramnogalacturonasa, una ramnogalacturonano acetilesterasa, una pectina acetilesterasa, una galactanasa, una poligalacturonasa, una pectina liasa, una pectato liasa, o una pectina metilesterasa.

20. Uso de una enzima según la reivindicación 15 ó 16 o de una composición enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 para mejorar la firmeza de una materia que contiene pectina.

21. Uso de una enzima según la reivindicación 15 ó 16 o de una composición enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 para aumentar la viscosidad de una materia que contiene pectina.

22. Uso según las reivindicaciones 20 y 21, en el que la materia que contiene pectina es una fruta o materia vegetal.

23. Uso de una enzima según la reivindicación 15 ó 16 o de una composición enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 para la desmetilación de una pectina.

24. Uso de una enzima según la reivindicación 15 ó 16 o de una composición enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 para la preparación de alimentos.

25. Uso de una enzima según la reivindicación 15 ó 16 en combinación con una preparación enzimática que contiene poligalacturonasa para reducir la viscosidad de una materia derivada de la pared de una célula vegetal.

26. Uso de una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 o de una composición enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 para la producción de vino o de zumo.

27. Escherichia Coli DSM 10357.

28. Meripilus giganteus CBS 521.95.