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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Enzym mit Pektinesterase-Aktivität, ein DNA-Konstrukt, das das Enzym
mit der Pektinesterase-Aktivität
kodiert, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms, eine Enzymzusammensetzung,
die das Enzym mit der Pektinesterase-Aktivität umfasst und die Verwendung
des Enzyms und der Enzymzusammensetzung für eine Vielzahl von industriellen
Anwendungen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Pektin-Polymere sind wichtige Bestandteile
von primären
Pflanzenzellwänden.
Sie sind aus Ketten von 1,4-verbundenen α-D-Galacturonsäure und
methylierten Derivaten davon zusammengesetzt. Die Verwendung von
Pektin-degradierenden Enzymen, wie z. B. Polygalacturonase, Pektin-Methylesterase,
Pektin-Lyase oder Pektat-Lyase, ist wichtig für die Nahrungsmittelindustrie,
hauptsächlich
bei der Frucht- und Gemüseverarbeitung,
wie z. B. der Fruchtsaftproduktion oder der Weinherstellung, wo
ihre Fähigkeit,
die Degradierung des Rückgrats
des Pektinpolymers zu katalysieren, ausgenutzt wird.
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Für
viele Zwecke würde
es wünschenswert
sein, jedes der Pektin-abbauenden Enzyme, die zum Beispiel in kommerziellen
Zubereitungen, die eine Vielzahl von verschiedenen Pektin-abbauenden
Enzymen enthalten (ein Beispiel einer solchen Zubereitung ist Pectinex
Ultra SP®,
zubereitet aus Aspergillus aculeatus, erhältlich von Novo Nordisk A/S),
in einer Form zur Verfügung
zu stellen, die frei von anderen Bestandteilen ist. Auf diese Art
und Weise würde
es möglich
sein, Enzymzubereitungen herzustellen, die für bestimmte Zwecke geeignet
sind, solche Zubereitungen enthalten entweder ein einzelnes Pektin-abbauendes
Enzym oder beliebige Kombinationen davon. Um das zu erreichen, ist
es komfortabel, Einzel bestandteil-Pektin-degradierende Enzyme durch
rekombinante DNA-Techniken zur Verfügung zu stellen. Pektin-Methylesterase
(EC 3.1.1.11) katalysiert die Entfernung von Methanol aus Pektin,
resultierend in der Bildung von Pektinsäure (Polygalacturonsäure).
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Pektin-Methylesterasen werden von
einer Vielzahl von Mikroorganismen hergestellt und sind auch in Blättern, Wurzeln,
Stengeln und Früchten
von vielen höheren
Pflanzen gefunden worden. Mikrobielle Pektin-Methylesterasen sind
von Khanh et al. (1990) kloniert worden "Nucleotide and derived amino acid sequence of
a pectinesterase cDNA isolated from Aspergillus niger strain RH5344", Nucleic Acids Res.
18: 4262; Khanh et al. (1991) "Characterization
and expression of a genomic pectin methyl esterase-encoding gene
in Aspergillus niger",
Gene 106: 71–77;
Spok et al. (1991) "Molecular
cloning and sequencing of a pectinesterase gene from Pseudomonas
solanacearum", J.
Gen. Microbiol. 137: 131–140;
Plastow 81988) "Molecular
cloning and nucleotide sequence of the pectin methyl esterase gene
of Erwinia chrysanthemi B374",
Mol. Microbiol. 2: 247–254;
Laurent et al. (1993) "Characterization
and overexpression of the pem gene encoding pectin methylesterase
of Erwinia chrysanthemi strain 3937", Gene 131: 17–25; Tierny et al. (1994) "Molecular cloning
and expression in Escherichia coli of genes encoding pectate lyase
and pectin methylesterase activities from Bacteroides thetaiotaomicron", J. Appl. Bacteriol.
76: 592–602.
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WO 94/25575 beschreibt die Klonierung
einer Pektin-Methylesterase aus Aspergillus aculeatus.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
waren die Erfinder bei der Isolierung und Charakterisierung einer DNA-Sequenz
aus einem Basidiomycota-Pilz, welcher ein Enzym kodiert, das Pektin-Methylesterase,
auch bekannt als Pektinesterase- Aktivität, zeigt,
nun erfolgreich, wodurch es möglich
wurde, eine Mono-Bestandteil-Pektinesterase-Zusammensetzung
herzustellen.
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Demgemäß betrifft die Erfindung in
einem ersten Aspekt ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz, die
ein Enzym kodiert, welches Pektinesterase-Aktivität zeigt,
umfasst, wobei die DNA-Sequenz umfasst
- (a)
den Pektinesterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, kloniert in
Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli DSM 10357, oder
- (b) ein Analogon der in (a) definierten DNA-Sequenz, welche
- (i) zu mindestens 60% homolog ist zu der in (a) definierten
DNA-Sequenz oder
- (ii) mit der in den Positionen 4–933 in SEQ ID NR: 1 gezeigten
DNA-Sequenz bei
niedriger Stringenz hybridisiert, oder
- (iii) ein Polypeptid kodiert, welches zu mindestens 50% homolog
ist zu dem Polypeptid, kodiert von einer DNA-Sequenz, welche die
in (a) definierte DNA-Sequenz umfasst, oder
- (iv) ein Polypeptid kodiert, welches immunologisch reaktiv ist
mit einem Antikörper,
der gegen die aufgereinigte Pektinesterase, kodiert von der in (a)
definierten DNA-Sequenz, erzeugt wurde.
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Die volle Länge cDNA-Sequenz, die eine
Pektinesterase kodiert, wurde von einem Stamm des filamentösen Pilzes
Meripilus giganteus abgeleitet und wurde in Plasmid pYES 2.0, vorliegend
in dem Escherichia coli-Stamm DSM Nr. 10357, kloniert.
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Von der Pektinesterase-kodierenden
DNA-Sequenz, beherbergt in E. coli DSM 10357, wird angenommen, dass
sie die gleiche DNA-Sequenz hat wie die in SEQ ID NR: 1 vorliegende.
Dementsprechend, wann immer Bezug genommen wird auf den Pektinesterase-kodierenden
Teil der DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in
DSM 10357, ist es auch beabsichtigt, dass solcher Bezug den Pektinesterase-kodierenden
Teil der in SEQ ID NR: 1 vorliegenden DNA-Sequenz miteinschließt.
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Demgemäß können die Ausdrücke "der Pektinesterase-kodierende
Teil der DNA-Sequenz,
kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in DSM 10357" und "der Pektinesterase-kodierende
Teil der DNA-Sequenz, vorliegend in SEQ ID NR: 1" untereinander austauschbar verwendet
werden.
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In weiteren Aspekten stellt die Erfindung
einen Expressionsvektor zur Verfügung,
der das DNA-Konstrukt der Erfindung beherbergt, eine Zelle, die
das DNA-Konstrukt
umfasst, oder den Expressionsvektor und ein Verfahren zur Herstellung
eines Enzyms, das Pektinesterase-Aktivität zeigt, welches Verfahren
das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die die Herstellung
des Enzyms und die Wiedergewinnung des Enzyms aus der Kultur erlauben,
umfasst.
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In noch einem anderen Aspekt stellt
die Erfindung ein Enzym zur Verfügung,
das Pektinesterase-Aktivität
zeigt, welches Enzym
- (a) durch ein DNA-Konstrukt
der Erfindung kodiert wird; oder
- (b) durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wird; und/oder
- (c) immunologisch reaktiv ist mit einem Antikörper, der
gegen eine aufgereinigte Pektinesterase, kodiert durch den Pektinesterase-kodierenden
Teil der DNA-Sequenz,
kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli DSM 10357, erzeugt
wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform
hat das Enzym die abgeleitete Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2.
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In noch einem anderen Aspekt stellt
die vorliegende Erfindung eine Enzymzusammensetzung zur Verfügung, die
zur Degradierung oder Modifizierung von Pflanzenmaterial oder Bestandteilen
davon nützlich
ist, die Zusammensetzung wurde mit einem Enzym, das wie oben beschrieben
Pektinesterase-Aktivität
zeigt, angereichert.
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In noch einem anderen Aspekt betrifft
die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Enzyms oder einer
Enzymzusammensetzung der Erfindung für verschiedene industrielle
Anwendungen.
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Schließlich bezieht sich die Erfindung
auf eine isolierte, im Wesentlichen reine biologische Kultur des E.
coli-Stammes DSM Nr. 10357, welcher eine Pektinesterase-kodierende
DNA-Sequenz beherbergt (den Pektinesterase-kodierenden Teil der
DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli
DSM 10357), abgeleitet von einem Stamm des filamentösen Pilzes
Meripilus giganteus, oder jeglicher Mutante des E. coli-Stammes,
der die Fähigkeit
zur Kodierung der Pektinesterase beibehalten hat; und auf eine isolierte,
im Wesentlichen reine biologische Kultur des filamentösen Pilzes
Meripilus giganteus CBS Nr. 521.95, aus welcher die DNA-Sequenz,
wie in SEQ ID NR: 1 vorliegend, abgeleitet worden ist.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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DNA-Konstrukte
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Die vorliegende Erfindung stellt
ein DNA-Konstrukt zur Verfügung,
das eine DNA-Sequenz, welche ein Enzym, welches Pektinesterase-Aktivität zeigt,
kodiert, umfasst, wobei die DNA-Sequenz umfasst
- (a)
den Pektinesterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, kloniert in
Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli DSM 10357, oder
- (b) ein Analogon der in (a) definierten DNA-Sequenz, welches
- (i) zu mindestens 60% homolog ist zu der in (a) definierten
DNA-Sequenz, oder
- (ii) mit der in den Positionen 4 – 933 in SEQ ID NR: 1 gezeigten
DNA-Sequenz bei
niedriger Stringenz hybridisiert, oder
- (iii) welches ein Polypeptid kodiert, welches zu mindestens
50% homolog ist zu dem Polypeptid, das von einer DNA-Sequenz kodiert
wird, welche die in (a) definierte DNA-Sequenz umfasst, oder
- (iv) welches ein Polypeptid kodiert, welches immunologisch reaktiv
ist mit einem Antikörper,
der gegen die aufgereinigte Pektinesterase, kodiert von der in (a)
definierte DNA-Sequenz, erzeugt wurde.
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Wie hierin definiert, ist eine DNA-Sequenz,
die analog ist zu dem Pektinesterase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, kloniert
in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli DSM 10357, dazu bestimmt,
jegliche DNA-Sequenz anzuzeigen, die ein Enzym kodiert, welches
Pektinesterase-Aktivität
zeigt, welches Enzym eine oder mehrere der unter (i)–(iv) oben
zitierten Eigenschaften hat.
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Die analoge DNA-Sequenz kann aus
einem Stamm des filamentösen
Pilzes Meripilus giganteus isoliert werden, der das Enzym mit Pektinesterase-Aktivität herstellt,
oder einem anderen oder verwandtem Organismus, und so z. B. eine
allele oder Artvariante des Pektinesterase-kodierenden Teils der
DNA-Sequenz, kloniert in Plasmid pYES 2.0, vorliegend in E. coli
DSM 10357, sein.
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Alternativ kann die analoge Sequenz
auf Grundlage der DNA-Sequenz, vorgelegt als der Pektinesterase-kodierende
Teil von SEQ ID NR: 1, konstruiert werden, z. B. kann sie eine Untersequenz
davon sein und/oder durch die Einführung von Nukleotidsubstitutionen,
welche keine andere Aminosäuresequenz
der von der DNA-Sequenz
kodierten Pektinesterase zur Folge haben, aber welche dem Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus
entsprechen, welche zur Herstellung des Enzyms bestimmt ist, oder
durch Einführung
von Nukleotid-Substitutionen, welche eine unterschiedliche Aminosäuresequenz
zur Folge haben können.
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Wenn Nukleotid-Substitutionen ausgeführt werden,
sind Aminosäure-Veränderungen
bevorzugt von kleinerer Natur, d. h. konservative Aminosäure-Substitutionen, die
nicht signifikant die Faltung oder die Aktivität des Proteins betreffen, kleine
Deletionen, typischerweise von einer bis ungefähr 30 Aminosäuren; kleine
Amino- oder Carboxyl-terminale Extensionen, wie z. B. ein Amino-terminaler Methioninrest,
ein kleines Linker-Peptid von bis zu ungefähr 20 bis 25 Resten, oder eine
kleine Extension, welche die Aufreinigung erleichtert, wie z. B.
ein Polyhistidinteil, ein antigenes Epitop oder eine Bindungsdomäne.
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Beispiele von konservativen Substitutionen
sind innerhalb der Gruppe der basischen Aminosäuren (wie z. B. Arginin, Lysin,
Histidin), der sauren Aminosäuren
(wie z. B. Glutaminsäure
und Asparaginsäure),
der polaren Aminosäuren
(wie z. B. Glutamin und Asparagin), der hydrophoben Aminosäuren (wie
z. B. Leucin, Isoleucin, Valin), der aromatischen Aminosäuren (wie
z. B. Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und der kleinen Aminosäuren (wie
z. B. Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin). Für eine allgemeine
Beschreibung der Nukleotid-Substitution
siehe z. B. Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification
2, 95–107.
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Es ist den Fachleuten klar, dass
solche Substitutionen außerhalb
von Regionen gemacht werden können,
die kritisch sind für
die Funktion des Moleküls,
und immer noch in einem aktiven Polypeptid resultieren. Aminosäuren, die
essentiell sind für
die Aktivität
des von dem DNA-Konstrukt der Erfindung kodierten Polypeptids, und
deshalb bevorzugt nicht einer Substitution unterzogen werden, können gemäß Verfahren,
die in der Technik bekannt sind, identifiziert werden, z. B. durch
ortsspezifische Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenesis (vgl.
Cunningham and Wells (1989), Science 244, 1081–1085). In der letzteren Technik
werden Mutationen in jedem Rest des Moleküls eingeführt und das resultierende mutierte
Molekül
wird auf biologische Aktivität
(z. B. Pektinesterase) getestet, um die Aminosäurereste zu identifizieren,
die für
die Aktivität
des Moleküls
kritisch sind. Stellen von Substrat-Enzym-Interaktion können auch
durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, bestimmt durch
solche Techniken wie Kernspinnresonanz, Kristallographie oder Fotoaffinitätsmarkierung
(vgl. z. B. de Vos et al., (1992), Science 255, 306–312; Smith
et al., (1992), J. Mol. Biol. 224, 899–904; Wlodaver et al., (1992),
FEBS Lett. 309, 59–64).
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Die Homologie, auf die in (i) oben
Bezug genommen wird, wird bestimmt als das Mass der Identität zwischen
den zwei Sequenzen, welcher eine Ableitung der ersten Sequenz von
der zweiten anzeigt. Die Homologie kann geeigneterweise bestimmt
werden mit Hilfe von Computerprogrammen, die in der Technik bekannt
sind, wie z. B. GAP, zur Verfügung
gestellt in dem GCG-Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin
Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science
Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. and Wunsch,
C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453). Verwendung
von GAP mit den folgenden Einstellungen für den DNA-Sequenz-Vergleich: GAP Creation
Penalty von 5.0 und GAP Extension Penalty von 0.3, die kodierende
Region der DNA-Sequenz zeigt das Mass an Identität, vorzugsweise von mindestens
60%, mehr bevorzugt von mindestens 70%, mehr bevorzugt von mindestens
80%, mehr bevorzugt von mindestens 90%, mehr bevorzugt von mindestens
95%, und noch mehr bevorzugt bei mindestens 97% zu dem Pektinesterase-kodierenden
Teil der in SEQ ID NR: 1 gezeigten DNA-Sequenz.
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Die Hybridisierung, auf die in (ii)
oben Bezug genommen wird, ist dazu bestimmt, anzuzeigen, dass die
analoge DNA-Sequenz mit der gleichen Probe wie die DNA-Sequenz,
die das Pektinesterase-Enzym kodiert, unter bestimmten spezifischen
Bedingungen, welche im Detail im Material und Methodenteil nachfolgend beschrieben
sind, hybridisiert. Die Oligonukleotidprobe, die verwendet werden
muss, ist die DNA-Sequenz, die dem Pektinesterase-kodierenden Teil
der SEQ ID NR: 1 gezeigten DNA-Sequenz entspricht.
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Die Homologie, auf die in (iii) oben
Bezug genommen wird, ist bestimmt als das Mass an Identität zwischen
den zwei Sequenzen, anzeigend eine Ableitung der ersten Sequenz
von der zweiten. Die Homologie kann geeigneterweise bestimmt werden
mit Hilfe von Computerprogrammen, die in der Technik bekannt sind, wie
z. B. GAP, zur Verfügung
gestellt in dem GCG-Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin
Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science
Drive, Madison, Winsconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. and Wunsch,
C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443–453. Verwendung von
GAP mit den folgenden Einstellungen zum Polypeptid-Sequenzvergleich:
GAP Creation Penalty von 3.0 und GAP Extension Penalty von 0.1,
das Polypeptid, kodiert durch eine analoge DNA-Sequenz, zeigt ein
Mass an Identität
bevorzugt von mindestens 50%, mehr bevorzugt von mindestens 60%,
mehr bevorzugt von mindestens 70%, mehr bevorzugt von mindestens
80%, mehr bevorzugt von mindestens 90%, mehr bevorzugt von mindestens
95%, und speziell von mindestens 97% zu dem Enzym, das durch das
DNA-Konstrukt, welches den Pektinesterase-kodierenden Teil der in
SEQ ID NR: 1 gezeigten DNA-Sequenz umfasst, kodiert wird, zu der
Aminosäuresequenz
SEQ ID NR: 2.
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Die vorliegende Erfindung gilt auch
für Pektinesterase-Varianten,
welche eine Aminosäuresequenz haben,
welche sich durch nicht mehr als drei Aminosäuren von dem maturen Teil der
in SEQ ID NR: 2 dargelegten Aminosäuresequenz unterscheidet, bevorzugt
durch nicht mehr als zwei Aminosäuren
und mehr bevorzugt durch nicht mehr als eine Aminosäure.
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In Verbindung mit Eigenschaft (iv)
kann die immunologische Reaktivität durch das im unteren Material und
Methodenabschnitt beschriebene Verfahren bestimmt werden.
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Die DNA-Sequenz, die eine Pektinesterase
der Erfindung kodiert, kann aus dem Stamm Escherichia coli DSM 10357
unter Verwendung von Standardverfahren, z. B. wie beschrieben von
Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbour, NY, isoliert werden.
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Die DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert,
welches Pektinesterase-Aktivität
der Erfindung zeigt, kann auch durch ein allgemeines Verfahren isoliert
werden, einschließend
- – Klonieren
einer cDNA-Bibliothek von jeglichem Organismus, von dein erwartet
wird, interessierende Pektinesterase herzustellen, in geeignete
Vektoren,
- – Transformieren
geeigneter Wirtshefezellen mit den Vektoren,
- – Kultivieren
der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um jegliches Enzym
von Interesse, kodiert von einem Klon in der cDNA-Bibliothek, zu
exprimieren,
- – Screening
nach positiven Klonen durch Bestimmen jeglicher Pektinesterase-Aktivität des von
solchen Klonen hergestellten Enzyms, und
- – Isolieren
der Enzym-kodierenden DNA aus solchen Klonen.
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Ein allgemeines Isolierungsverfahren
ist in WO 93/11249 oder WO 94/14953 offenbart worden, die Inhalte
davon sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind. Eine detailliertere
Beschreibung des Screening-Verfahrens ist in Beispiel 1 unten gegeben.
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Alternativ kann die DNA, die eine
Pektinesterase-Aktivität
kodiert, in Übereinstimmung
mit wohl bekannten Prozeduren, in geeigneter An und Weise aus einer
geeigneten Quelle isoliert werden, wie z. B. irgendeiner der unten
genannten Organismen, unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotidproben,
die auf der Grundlage der hier offenbarten DNA-Sequenzen hergestellt
wurden. Zum Beispiel kann eine geeignete Oligonukleotidprobe auf
der Grundlage des Pektinesterase-kodierenden Teils der als SEQ ID
NR: 1 präsentierten
Nukleotid-Sequenzen
oder jeder geeigneten Untersequenz davon, oder auf der Grundlage
der Aminosäure-Sequenz
SEQ ID NR: 2 hergestellt werden.
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Mikrobielle
Quellen
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In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die DNA-Sequenz, die die Pektinesterase kodiert, von einem
Stamm abgeleitet, der zu der Polyporaceae-Familie gehört, welche
gemäß dem Entrez-Browser
NCBI Taxonomie-Version 3,3 (aktualisiert 95.12.13) eine Familie
innerhalb der Ordnung Aphyllophorales ist, welche zu der Klasse
der Hymenomyceten unter den Basidiomycota gehört.
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Im Moment wird es in Erwägung gezogen,
dass eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das homolog zu dem
Enzym der Erfindung ist, z. B. eine analoge DNA-Sequenz, aus anderen
Mikroorganismen erhalten werden kann. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz
durch ein auf gleiche Art und Weise erfolgtes Screenen einer cDNA-Bibliothek
eines anderen Mikroorganismus erhalten werden, wie z. B. eines Stammes
von Aspergillus, Saccharomyces, Bacteroides, Erwinia, Pseudomonas
oder Clostridium.
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Ein Isolat eines Stammes von Meripilus
giganteus, aus welchem eine Pektinesterase der Erfindung abgeleitet
werden kann, ist von den Erfindern gemäß dem Budapester Übereinkommen über die
Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
zum Zwecke des Patentverfahrens beim Centraalbureau voor Schimmelcultures,
P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Niederlande (CBS) abgelegt worden.
Ablagedatum: | 04.07.95 |
Ref.
des Ablegers: | NN006040 |
CBS-Bezeichnung: | Meripilus
giganteus CBS Nr. 521.95 |
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Das Expressionsplasmid pYES 2.0,
das die volle Länge
cDNa-Sequenz enthält,
die die Pektinesterase der Erfindung kodiert, wurde in einen Stamm
von E. coli transformiert, welcher von den Erfindern gemäß dem Budapester Übereinkommen über die
Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
zum Zwecke des Patentverfahrens bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 2b, D-38124 Braunschweig,
Bundesrepublik Deutschland, (DSM) abgelegt wurde.
Ablagedatum: | 06.12.95 |
Ref.
des Ablegers: | NN049144 |
CBS-Bezeichnung: | Escherichia
coli DSM 10357 |
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Expressionsvektoren
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In einem anderen Aspekt stellt die
Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor zur Verfügung, der
das DNA-Konstrukt der Erfindung umfasst. Der Expressionsvektor der
Erfindung kann jeglicher Expressionsvektor sein, der in geeigneter
Art und Weise rekombinanten DNA-Verfahren unterworfen werden kann,
und die Wahl des Vektors wird oft von der Wirtszelle abhängen, in
welche er eingeführt
werden muss. Folglich kann der Vektor ein autonom replizierender
Vektor sein, z. B. ein Vektor, welcher als eine extrachromosomale
Einheit existiert, die Replikation von diesem ist unabhängig von
der chromosomalen Replikation, z. B. ein Plasmid. Alternativ kann
der Vektor einer sein, der, wenn in eine Wirtszelle eingeführt, in
das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit dem Chromosom/mit
den Chromosomen repliziert, in welche er integriert wurde.
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In dem Expressionsvektor sollte die
DNA-Sequenz, die Pektinesterase kodiert, funktionsfähig mit
einer geeigneten Promotor- und Terminator-Sequenz verbunden sein.
Der Promotor kann jegliche DNA-Sequenz sein, welche transkriptionelle
Aktivität
in der Wirtszelle der Wahl zeigt und kann von Genen abgeleitet sein,
welche Proteine kodieren, welche entweder homolog oder heterolog
zu der Wirtszelle sind. Die verwendeten Verfahren, um die DNA-Sequenzen,
die die Pektinesterase kodieren und den Promotor bzw. den Terminator
zu ligieren, sind Facharbeitern wohl bekannt (vgl. z. B. Sambrook
et al., (1989), Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, NY).
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Beispiele von geeigneten Promotoren
zur Verwendung in filamentösen
Pilz-Wirtszellen
sind z. B. der ADH3-Promotor (McKnight et al., THE EMBO J. 4 (1985),
2093–2099)
oder der tpiA-Promotor. Beispiele anderer nützlicher Promotoren sind solche,
die von dem Gen abgeleitet sind, das Aspergillus oryzae TAKA-Amylase
kodiert, Rhizomucor miehei Asparagin-Proteinase, Aspergillus niger
neutrale α-Amylase,
Aspergillus niger säurestabile α-Amylase,
Aspergillus niger oder Aspergillus awamori Glucoamylase (gluA),
Rhizomucor miehei Lipase, Aspergillus oryzae alkaline Protease,
Aspergillus oryzae Triose-Phosphatisomerase
oder Aspergillus nidulans Acetamidase.
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Wirtszellen
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In noch einem anderen Aspekt stellt
die Erfindung eine Wirtszelle zur Verfügung, welche das DNA-Konstrukt
der Erfindung umfasst, und/oder den rekombinanten Expressionsvektor
der Erfindung.
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Bevorzugt ist die Wirtszelle der
Erfindung eine eukaryotische Zelle, insbesondere eine fungöse Zelle, wie
z. B. eine Hefe- oder filamentöse
fungöse
Zelle. Insbesondere kann die Zelle zu einer Art von Trichoderma gehören, bevorzugt
Trichoderma harzianum oder Trichoderma reesei, oder eine Art von
Aspergillus, am meisten bevorzugt Aspergillus oryzae oder Aspergillus
niger oder eine Art von Fusarium, insbesondere eines Stammes von
Fusarium graminearum, Fusarium cerealis. Fungöse Zellen können durch ein Verfahren transformiert werden,
welches Protoplast-Bildung und Transformation des Protoplasten beinhaltet,
gefolgt durch Regenerierung der Zellwand in einer per se bekannten
Weise. Die Verwendung von Aspergillus als ein Wirtsorganismus ist
in
EP 238 023 (Novo Nordisk
A/S) beschrieben, die Inhalte davon sind hiermit durch Referenz
inkorporiert. Die Wirtszelle kann auch eine Hefezelle sein, z. B.
ein Stamm von Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces kluyveri oder Saccharomyces uvarum, ein Stamm von
Schizosaccharomyces pombe, wie z. B. Schizosaccharomyces pombe,
ein Stamm von Hansenula sp., Pichia sp., Yarrowia sp., wie z. B.
Yarrowia lipolytica, oder Kluyveromyces sp., wie z. B. Kluyveromyces
lactis.
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Verfahren zur Herstellung
von Pektinesterase
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In noch einem weiteren Aspekt stellt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms
gemäß der Erfindung
zur Verfügung,
worin eine geeignete Wirtszelle, welche mit einer DNA-Sequenz transformiert
worden ist, welche das Enzym kodiert, unter Bedingungen kultiviert
wird, welche die Herstellung des Enzyms erlaubt, und das resultierende
Enzym aus der Kultur wiedergewonnen wird.
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Das für die Kultivierung der transformierten
Wirtszellen verwendete Medium kann jedes konventionelle Medium sein,
das geeignet für
das Wachstum der besagten Wirtszellen ist. Die exprimierte Pektinesterase kann
in geeigneter Weise in das Kulturmedium abgesondert werden und kann
daraus durch bekannte Verfahren wiedergewonnen werden, einschließlich Abtrennen
der Zellen von dem Medium durch Zentrifugieren oder Filtrieren,
Präzipitieren
von proteinösen
Komponenten des Mediums mithilfe eines Salzes, wie z. B. Ammoniumsulfat,
gefolgt von chromatographischen Verfahren, wie z. B. Ionenaustausch-Chromatographie,
Affinitätschromatographie,
oder Ähnliches.
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Enzymzusammensetzungen
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In noch einem anderen Aspekt bezieht
sich die vorliegende Erfindung auf eine Enzymzusammensetzung, die
geeignet ist für
die Modifizierung oder Degradierung von Pflanzenzellwand-Bestandteilen,
wobei die Zusammensetzung in einem Enzym, das Pektinesterase-Aktivität zeigt,
wie oben beschrieben angereichert wird.
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Die Enzymzusammensetzung, die mit
einem Enzym der Erfindung angereichert worden ist, kann z. B. eine
Enzymzusammensetzung sein, die vielfache enzymatische Aktivitäten umfasst,
insbesondere eine Enzymzusammensetzung, welche vielfache Pflanzenzellwand-abbauende
Enzyme umfasst, wie z. B. Viscozym®, Pectinex® oder
Pectinex ultra SP® (alle erhältlich von
Novo Nordisk A/S). Auf diese Weise kann eine Verstärkung der
Fähigkeit
der Enzymzusammensetzung, eine Zellwand abzubauen, erhalten werden.
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In dem vorliegenden Kontext ist der
Ausdruck "angereichert" dazu bestimmt, anzuzeigen,
dass die Pektinesterase-Aktivität
der Enzymzusammensetzung erhöht
worden ist, z. B. mit einem Anreicherungsfaktor von 1,1, zweckmäßig gemäß einer
Zugabe eines Enzyms der Erfindung, zubereitet durch das oben beschriebene
Verfahren.
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Alternativ kann die Enzymzusammensetzung,
angereichert in einem Enzym, das Pektinesterase-Aktivität zeigt,
eine sein, welche ein Enzym der Erfindung als den hauptenzymatischen
Bestandteil umfasst, z. B. eine Monokomponenten-Enzymzusammensetzung.
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Die Enzymzusammensetzung kann in Übereinstimmung
mit den in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden und
kann in der Form einer flüssigen
oder trockenen Zusammensetzung sein. Zum Beispiel kann die Enzymzusammensetzung
in der Form eines Granulates oder eines Mikrogranulates sein. Das
Enzym, das in die Zusammensetzung eingefügt werden muss, kann gemäß Verfahren,
die in der Technik bekannt sind, stabilisiert werden.
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Unten sind Beispiele von bevorzugten
Verwendungen der Enzymzusammensetzung der Erfindung gegeben. Die
Dosierung der Enzymzusammensetzung der Erfindung und andere Bedingungen,
unter welchen die Zusammensetzung verwendet wird, kann auf Grundlage
von Verfahren, die in der Technik bekannt sind, bestimmt werden.
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Die Enzymzusammensetzung gemäß der Erfindung
kann für
mindestens einen der folgenden Zwecke nützlich sein.
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Abbau oder Modfizierung
von Pflanzenmaterial:
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Die Enzymzusammensetzung kann vorteilhafterweise
zur Behandlung von Pektin-enthaltendem Pflanzenmaterial
verwendet werden, z. B. von Gemüse
oder Früchten
abstammend, wie z. B. aus Sojabohnen erhaltenem Material, Zuckerrüben oder Äpfeln, um
die Viskosität
zu reduzieren und so die Verarbeitung oder Erscheinung des besagten
Pflanzenmaterials zu verbessern. Die Viskositätsreduktion kann durch Behandeln des
Pektin-enthaltenden Pflanzenmaterials mit einer Enzymzubereitung
der Erfindung unter geeigneten Bedingungen zur kompletten oder teilweisen
Degradierung des Pektin-enthaltenden Materials erhalten werden.
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Die Enzymzusammensetzung kann für die Depektinisierung
und Viskositätsreduzierung
in Gemüse oder
Fruchtsaft, besonders in Apfel- oder Birnensaft, verwendet werden.
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Die Enzymzubereitung kann bei der
Behandlung von Brei von Früchten
und Gemüsen,
z. B. bei der Breibehandlung von Äpfeln und Birnen zur Saftherstellung,
und bei der Breibehandlung von Trauben zur Weinherstellung verwendet
werden.
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Die Enzymzusammensetzung kann bei
der Herstellung von Zitrusfrüchtesaft,
z. B. zur teilweisen oder vollständigen
Degradierung des Fruchtfleisches, das nach dem Pressen im Saft vorhanden
ist, verwendet werden.
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Für
die obigen Verwendungen ist es bevorzugt, dass die Enzymzusammensetzung
zusätzlich
zu Pektinesterase eine Polygalactoronase-enthaltende Enzymzubereitung
umfasst.
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Durch die Verwendung einer Enzymzubereitung
der Erfindung ist es möglich,
die Konsistenz und Erscheinung von verarbeiteter Frucht oder von
verarbeiteten Gemüsen
zu regulieren. So wurde entdeckt, dass die Konsistenz und Erscheinung
ein Produkt der gegenwärtigen
Kombination der für
das Verarbeiten verwendeten Enzyme ist, z. B. der Natur der Enzyme
(besonders der Pektin-degradierenden Enzyme (des Pektin-degradierenden
Enzyms)), mit welcher die Pektinmethylesterase der Erfindung kombiniert
wird.
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Beispiele von Produkten mit bestimmten
Eigenschaften, welche durch die Verwendung einer Enzymzubereitung
der Erfindung hergestellt werden können, schließen klaren
Saft von Äpfeln,
Birnen oder Beeren, trüben
dunklen Saft von Äpfeln,
Birnen, Beeren, Zitrusfrüchten
oder Tomaten, und Pürees
von Karotten und Tomaten mit ein.
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Aus der vorhergehenden Offenbarung
wird es offensichtlich sein, dass die Pektinesterase der Erfindung
als eine Einzelkomponente, die im Wesentlichen frei von anderen
Enzym-Aktivitäten
ist, wie z. B. Polygalctoronase- und/oder Pektinlyase-Aktivität, welche
normal in kommerziell erhältlicher
Pektinesterase, die pektinolytische Zubereitungen enthält, anwesend
ist, produziert werden kann.
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Auf dieser Grundlage ist die Verwendung
der Pektinesterase der Erfindung besonders vorteilhaft für Zwecke,
in welchen die Aktivität
von solchen anderen Aktivitäten
unerwünscht
ist.
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Beispiele von solchen Zwecken schließen die
Verwendung der Pektinmethylesterase für komplette oder teilweise
Demethylierung von Pektin in verarbeiteten oder nicht-verarbeiteten
Früchten
und Gemüsen
mit ein.
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Die teilweise Demethylierung ist
z. B. wichtig, wenn eine verbesserte Festigkeit der Früchte oder
Gemüse
wünschenswert
ist. So wird die Festigkeit während
der Verarbeitung (z. B. Konservenfabrikation und Pasteurisierung)
oft reduziert. Durch Verwendung einer kontrollierten Menge an Pektinesterase
der Erfindung kann eine teilweise Demethylierung von Pektinesterase,
die in den Früchten
und Gemüsen
vorhanden ist, erhalten werden, und das resultierende teilweise
demethylierte Pektin kann mit z. B. zweiwertigen Ionen, wie z. B.
Calcium, vernetzen, wodurch festere Früchte oder Gemüse geformt
werden können.
Demgemäß kann die Pektinesterase
der Erfindung zur Verbesserung der Festigkeit von z. B. roter und
grüner
Paprika, Bohnen, Birnen und geschnittenen Früchten wie z. B. Birnen und Äpfel, verwendet
werden.
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Die Infusion des Enzyms kann z. B.
nicht unterstützt
von Immersion oder unterstützt
durch Vakuumbehandlung durchgeführt
werden.
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Ein anderes Beispiel des Zweckes
ist die Methylierung von Pektin, z. B. von Zitrusfrüchten, Apfel,
Sonnenblume und/oder Zuckerrübe.
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Darüber hinaus kann die Pektinesterase
verwendet werden, um einen Viskositätsanstieg in situ zu erhalten
oder in verschiedenen auf Gemüse
oder Frucht basierenden Produkten Gelbildung zu erhöhen.
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Die Pektinesterase der Erfindung
kann alleine oder zusammen mit anderen Enzymen verwendet werden,
um die Verdaubarkeit von Pektin-enthaltendem Tierfutter zu verbessern,
z. B. Futter zubereitet aus Sojabohnen, Zuckerrüben oder Rapssaat. Zu diesem
Zwecke wird eine Enzymzusammensetzung der Erfindung zu dem Futter
hinzugefügt.
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Die Pektinesterase-Aktivität kann zusammen
mit anderen Enzymen verwendet werden, um Monogalacturonsäure oder
Galacturonsäure,
die Oligosaccharide aus Pektin-enthaltendem Material, wie z. B.
Zuckerrübenfruchtfleisch
enthalten, in Übereinstimmung
mit bekannten Verfahren herzustellen. Monogalacturonsäure kann
zur Herstellung von Galactarsäure
oder zur Herstellung von Fettsäure
und Fettalkoholester und/oder Ether von Galacturonsäure verwendet
werden. Galacturon-enthaltende Oligosaccharide können als Zusatzstoffe für Essen
für Menschen
oder Tierfutter verwendet werden.
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Darüber hinaus kann die Pektinesterase
in Kombination mit anderen Enzymen für die Entfernung von pektischen
Stoffen aus Pflanzenfasern verwendet werden, deren Entfernung, z.
B. bei der Herstellung von Textilfasern oder anderen Zellulose-haltigen
Materialien essentiell ist. Zu diesem Zweck wird Pflanzenfasermaterial
mit einer geeigneten Menge der Pektinesterase der Erfindung unter
geeigneten Bedingungen zum Erhalt von kompletter oder teilweiser
Degradierung der pektischen Substanzen, die mit dem Pflanzenfasermaterial verbunden
sind, behandelt.
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Art und Weise der Aktivität-Blockweise
gegen zufällige
Spaltung:
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Die Verteilung der Carboxylgruppen
in Pektin ist wichtig für
die funktionellen Eigenschaften des Pektins.
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Einige Verfahren zur Bestimmung der
Verteilung der freien Carboxylgruppen in Pektin sind beschrieben
worden (Grasdalen, H. et al., Carbohydrate Res., 289, 105 (1995)).
Mit dem Ziel der Charakterisierung der Art und Weise der Aktivität einer
Pektinesterase wird die Verteilung der Säuregruppen durch ein von Mort
et al. (Mort, A. J. et al., Carbohyd. Res., 247, 21 (1993)) beschriebenes
Verfahren bestimmt. Die veresterten Galacturonsäuren werden durch Reduzierung
mit Natriumborohydrid zu Galactose konvertiert. Anschließend werden
die glycosidischen Verbindungen der resultierenden Galactosereste
selektiv durch HF-Solvolyse
gespalten. Das führt
zu der Herstellung der Oligomere: (Gal A)n-Gal.
Diese Oligomere repräsentieren
die zusammenhängenden
Streifen von Gal-A-Resten
zwischen Methyl-veresterten Resten in dem Pektin. Die klonierte
Esterase der Erfindung wurde mit einer orangen Esterase und alkalischer
Behandlung verglichen. Durch Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatographie
wurden Oligomere von sechs Galacturonsäureresten abgetrennt und quantifiziert.
Von der Verteilung dieser Oligomere kann festgestellt werden, ob
die Säuregruppen
in dem Pektin zufällig
oder blockweise verteilt sind.
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Grasdalen et al., 1995, beschreibt
NMR-Spektroskopie als ein nützliches
Verfahren, um quantitative Information über die Zusammensetzung und
die sequentielle Struktur von Pektin zu erhalten. Im Gegensatz zu
dem von Mort et al. 1993 beschriebenen Verfahren repräsentiert
NMR-Spektroskopie einen direkten Ansatz, um die sequentielle Struktur
zu verifizieren, und nur ein moderates Ausmaß an Polymerdegradierung ist nötig.
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Ohne an irgendwelche Theorie gebunden
zu sein, wird gegenwärtig
angenommen, dass die verbesserte Aktivität der Pektinesterase der Erfindung
für eine
Vielzahl von industriellen Anwendungen, wie z. B. der Gelatinisierung
von Marmelade (siehe Beispiel 4 hierin) auf der Art und Weise der
Aktion des Enzyms der Erfindung beruht, vorzugsweise eine blockweise
Verteilung der Säuregruppen
in Pektin zur Verfügung
stellen.
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Die Erfindung wird in weiterem Detail
in den folgenden Beispielen beschrieben, welche nicht in irgendeiner
Art und Weise dazu gedacht sind, den Geltungsbereich der Erfindung
wie beansprucht einzuschränken.
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MATERIAL UND METHODEN
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Abgelegte Organismen:
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Meripilus giganteus CBS 521.95 umfasst
die Pektinesterase-kodierende DNA-Sequenz der Erfindung.
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Escherichia coli DSM 10357, enthaltend
das Plasmid, umfassend die volle Länge cDNA-Sequenz, die die Pektinesterase
der Erfindung kodiert, in dem Shuttle-Vektor pYES 2.0.
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Andere Stämme:
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- Hefestamm: Der verwendete Saccharomyces cerevisia-Stamm
war W3124 (MATα;
ura 3–52;
leu 2–3;
112; his 3-D200; pep 4–1127;
prc1::HIS3; prb1:: LEU2; cir+).
- E. coli-Stamm: DH10B (Life Technologies)
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Plasmide:
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Der Aspergillus-Expressionsvektor
pHD414 ist ein Abkömmling
von dem Plasmid p775 (beschrieben in
EP
238 023 ). Die Konstruktion von pHD414 ist ferner beschrieben
in WO 93/11249.
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PYES 2.0 (Invitrogen)
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PA2PE18 (siehe Beispiel 1)
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Extraktion von Gesamt-RNA wird durchgeführt mit
Guanidinthiocyanat, gefolgt durch Ultrazentrifugation durch einen
5,7-M-CsCl-Puffer und Isolierung von Poly(A)+RNA
wird ausgeführt
durch Oligo(dT)-Zellulose-Affinitätschromatographie unter Verwendung
der in WO 94/14953 beschriebenen Verfahren.
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cDNA-Synthese: Doppelsträngige cDNA
wird aus 5 μg
Poly(A)+RNA durch das RNase H-Verfahren (Gubler
and Hoffman (1983) Gene 25: 263–269
Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold
Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) unter Verwendung der
Haarnadel-Modifizierung, entwickelt von F. S. Hagen (pers. Komm.),
synthetisiert. Die Poly(A)+RNA (5 μg in 5 μl DEPC-behandeltem Wasser) wird
auf 70°C
für 8 min
in einem vorsilikonisierten RNase-freien Eppendorf-Reaktionsgefäß erhitzt,
auf Eis abgeschreckt und in einem finalen Volumen von 50 μl mit reservem
Transkriptasepuffer (50 mM Tris-Cl,
pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT,
Bethesda Research Laboratories) vereint, enthaltend 1 mM dATP, dGTP und
dTTP und 0,5 mM 5-Methyl-dCTP
(Pharmacia), 40 Einheiten an humanem plazentalem Ribonuklease-Inhibitor
(RNasin, Promega), 1,45 μg
Oligo(dT)18-Not I-Primer (Pharmacia) und
1000 Einheiten SuperScript II RNase H-reverse Transkriptase (Bethesda
Research Laboratories). Erster-Strang-cDNA wird durch Inkubation des
Reaktionsgemisches bei 45°C
für 1 Stunde
synthetisiert. Nach der Synthese wird die mRNA : cDNA- Hybridmischung durch
eine MicroSpin S-400 HR (Pharmacia) spin column gemäß den Herstellerangaben
gelfiltriert.
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Nach der Gelfiltration werden die
Hybride in 250 μl
zweiter-Strangpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 0,16 mM βNAD+) verdünnt, enthaltend
200 μM von
jedem dNTP, 60 Einheiten E. coli DNA-Polymerase I (Pharmacia), 5,25
Einheiten Rnase H (Promega) und 15 Einheiten E. coli DNA-Ligase
(Boehringer Mannheim). Zweiter-Strang-cDNA-Synthese wird durch Inkubieren des Reaktionsgefäßes bei
16°C für 2 Stunden
und zusätzlich
15 Minuten bei 25°C
durchgeführt.
Die Reaktion wird durch Hinzufügen
von EDTA zu einer finalen Konzentration von 20 mM, gestoppt, gefolgt
durch Phenol- und Chloroform-Extraktionen.
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Mungobohnen-Nukleasebehandlung: Die
doppelsträngige
cDNA wird bei –20°C für 12 Stunden
durch Hinzufügen
von 2 vol 96%-ig EtOH, 0,2 vol 10 M NH4Ac
präzipitiert,
durch Zentrifugation wiedergewonnen, gewaschen in 70% EtOH, getrocknet
und resuspendiert in 30 μl
Mungobohnen-Nukleasepuffer (30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM
ZnSO4, 0,35 mM DTT, 2% Glycerol), enthaltend
25 Einheiten Mungobohnen-Nuklease (Pharmacia). Die einzelsträngige Haarnadel-DNA
wird durch Inkubation der Reaktion bei 30°C für 30 Min. abgeschnitten, gefolgt
von Zugabe von 70 μl
10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion und Präzipitation
mit 2 vol 96% EtOH und 0,1 vol 3 M NaAc, pH 5,2, auf Eis für 30 min.
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Herstellen von stumpfen
Enden mit T4-DNA-Polymerase:
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Die doppelsträngigen cDNAs werden durch Zentrifugieren
wiedergewonnen und stumpfe Enden werden in 30 μl T4-DNA-Polymerase-Puffer (20
mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM Kac, 1 mM DTT), enthaltend
0,5 mM von jedem dNTP und 5 Einheiten T4-DNA-Polymerase (New England
Biolabs) durch Inkubieren der Reaktionsmischung bei 16°C für 1 Stunde
hergestellt. Die Reaktion wird durch Hinzufügen von EDTA zu einer finalen
Konzentration von 20 mM gestoppt, gefolgt von Phenol- und Chloroform-Extraktionen und
Präzipitation
für 12
Stunden bei –20°C unter Hinzufügen von
2 vol 96% EtOH und 0,1 vol 3 M NaAc pH 5,2.
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Adaptorligation, Not-I-Verdau
und Größenselektion:
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Nach der Auffüllreaktion werden die cDNAs
durch Zentrifugieren wiedergewonnen, in 70% EtOH gewaschen und getrocknet.
Das cDNA-Pellet wird in 25 μl
Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10
mM DTT, 0,5 mM ATP), enthaltend 2,5 μg nicht-palindromische BstXI-Adaptoren
(Invitrogen) und 30 Einheiten T4-Ligase (Promega) resuspendiert
und bei 16°C
für 12
Stunden inkubiert. Die Reaktion wird durch Erhitzen bei 65°C für 20 min
gestoppt und dann auf Eis für
5 min gekühlt.
Die adaptierte cDNA wird mit Not-I-Restriktionsenzym unter Hinzufügen von
20 μl Wasser,
5 μl 10 × Not-I-Restriktionsenzympuffer
(New England Biolabs) und 50 Einheiten Not-I (New England Biolabs)
verdaut, gefolgt durch Inkubation für 2,5 Stunden bei 37°C. Die Reaktion
wird durch Erhitzen bei 65°C
für 10
min gestoppt. Die cDNAs werden durch Gelelektrophorese auf einem
0,8% SeaPlaque GTG-niedrigem Schmelztemperatur-Agarosegel (FMC)
in 1 × TBE
größenfraktioniert,
um unligierte Adaptoren und kleine cDNAs abzutrennen. Die cDNA wird
mit einem Cut-off
bei 0,7 kb größenselektioniert
und aus dem Gel unter Verwendung von β-Agarose (New England Biolabs) gemäß den Herstellerangaben
wiedergewonnen und für
12 Stunden bei –20°C unter Hinzufügen von
2 vol 96% EtOH und 0,1 vol 3 M NaAc pH 5,2 präzipitiert.
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Konstruktion der Bibliotheken: Die
gerichtete, größenselektionierte
cDNA wird durch Zentrifugation wiedergewonnen, in 70% EtOH gewaschen,
getrocknet und in 30 μl
10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA resuspendiert. Die cDNAs werden
durch Gelfiltration durch einen MicroSpin S-300 HR (Pharmacia) Spin-Column gemäß den Herstellerangaben
entsalzt. Drei Testligationen werden in 10 μl Ligationspuffer (30 mM Tris-Cl,
pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP) ausgeführt, enthaltend
5 μl doppelsträngige cDNA
(Reaktionsgefäße #1 und
#2), 15 Einheiten T4-Ligase (Promega) und 30 ng (Gefäß #1), 40
ng (Gefäß #2) und
40 ng (Gefäß #3, die
Vektorhintergrundkontrolle) BstXI-Not-I-geschnittenen pYES 2,0 Vektor.
Die Ligationsreaktionen werden durch Inkubieren bei 16°C für 12 Stunden,
Erhitzen auf 70°C
für 20
min und Hinzufügen
von 10 μl
Wasser zu jedem Gefäß ausgeführt. 1 μl jeder Ligationsmischung
wird in 40 μl
elektrokomponente E. coli DH10B-Zellen (Bethesda Research Laboratories)
wie beschrieben (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory
manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) elektroporiert.
Unter Verwendung der optimalen Bedingungen wird eine Bibliothek
in E. coli etabliert, bestehend aus Pools. Jeder Pool wird durch das
Ausbreiten von transformierten E. coli auf LB + Ampicillin-Agarplatten
unter Zugabe von 15.000 bis 30.000 Kolonien/Platten nach Inkubation
bei 37°C
für 24
Stunden hergestellt. 20 ml LB + Ampicillin wird zu der Platte hinzugefügt und die
Zellen werden darin suspendiert. Die Zellsuspension wird in einem
50-ml-Gefäß für 1 Stunde
bei 37°C
geschüttelt.
Plasmid-DNA wird
aus den Zellen gemäß den Herstellerangaben
unter Verwendung eines QIAGEN-Plasmid-Kits isoliert und bei –20°C gelagert.
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1 μl
Aliquots von aufgereinigter Plasmid-DNA (100 ng/μl) aus einzelnen Pools werden
in S. cerevisiae W3124 durch Elektroporation transformiert (Becker
und Guarante (1991) Methods Enzymol. 194: 182–187) und die Transformanten
werden auf SC-Agar enthaltend 2% Glukose ausplattiert und bei 30°C inkubiert.
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Identifizierung von positiven
Klonen:
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Nach 3–5 Tagen Inkubation werden
die SC-Agar-Platten auf ein Set von SC + Galaktose-Agarplatten Replika-plattiert.
Diese Platten werden für
2 bis 4 Tage bei 30°C
inkubiert und mit einem Pektin-Überlagegel überlagert,
enthaltend 1% Apfelpektin DE 75%, 1% HSB-Agarose in einem geeigneten
Puffer, zur Detektion von pektinolytischer Aktivität. Nach
Inkubation bei 30°C über Nacht
wurden 10–15
ml einer 1%-Lösung
MTAB (gemischte Alkyltrimethylammoniumbromid) auf die Überlage
gegossen und nach 1 Stunde entfernt. Pektinmethyle sterase-positive
Kolonien wurden als Kolonien, umgeben von einem weißen Hof,
identifiziert.
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Charakterisierung von
positiven Klonen:
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Die positiven Klone werden als Einzelkolonien
erhalten, die cDNA-Inserts wurden direkt aus der Hefekolonie unter
Verwendung von biotinylierten Polylinker-Primern amplifiziert, durch ein System
aus magnetischen Kügelchen
(Dynabead M-280, Dynal) aufgereinigt und durch Sequenzieren des
5'-Endes eines jeden cDNA-Klons
unter Verwendung der Kettenabbruchmethode (Sanger et al. (1977)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463–5467) und des Sequenase-Systems
(United States Biochemical) einzeln charakterisiert.
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Isolierung eines cDNA-Gens
zur Expression in Aspergillus:
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Eine Pektinesterase-produzierende
Hefekolonie wird in 20 ml YPD-Kulturbrühe in ein 50-ml-Glastestreaktionsgefäß eingeimpft.
Das Reaktionsgefäß wird für 2 Tage
bei 30°C
geschüttelt.
Die Zellen werden durch Zentrifugieren für 10 min. bei 3.000 Upm geerntet.
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Die DNA wird gemäß WO 94/14953 isoliert und
in 50 μl
Wasser gelöst.
Die DNA wird in E. coli durch Standardverfahren transformiert. Plasmid-DNA
wird aus E. coli unter Verwendung von Standardverfahren isoliert,
und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Das cDNA-Insert wird
unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme ausgeschnitten und
in einen Aspergillus-Expressionsvektor ligiert.
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Transformation von Aspergillus
oryzae oder Aspergillus niger
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Protoplasten können wie in WO 95/02043, S.
16, Zeile 21 bis Seite 17, Zeile 12, zubereitet werden, was hierin
durch Referenz inkorporiert ist.
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100 μl der Protoplasten-Suspension
wird mit 5–25 μg der geeigneten
DNA in 10 μl
STC (1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl2) gemischt.
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Protoplasten werden mit p3SR2 (ein
A. nidulans amdS Gen-tragendes Plasmid) gemischt. Die Mischung wird
bei Raumtemperatur für
25 min. stehengelassen. 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl2 und 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, werden hinzugegeben
und vorsichtig gemischt (2 ×)
und final werden 0,85 ml der gleichen Lösung hinzugefügt und vorsichtig
gemischt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur für 25 min. stehengelassen, bei
2.500 g für
15 Minuten heruntergespinnt und das Pellet wird in 2 ml 1,2 M Sorbitol resuspendiert.
Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf Minimalplatten
ausgebreitet (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56), enthaltend
1,0 M Sucrose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20
mM CsCl, um Hintergrundwachstum zu inhibieren. Nach Inkubation für 4 bis
7 Tage bei 37°C
werden die Sporen gepickt und für
Signalkolonien ausgebreitet. Dieses Verfahren wird wiederholt und Sporen
einer Einzelkolonie nach der zweiten Reisolation werden als definierter
Transformant gelagert.
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Test der A. oryzae-Transformanten
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Jede der Transformanten werden in
10 ml YPM (vgl. unten) angeimpft und vermehrt. Nach 2 bis 5 Tagen
Inkubation bei 30°C
wird der Überstand
entfernt. Die Pektinesterase-Aktivität wird durch Applizieren von 10 μl Überstand
auf 4 mm Durchmesser-Löcher,
die aus einem Agarosegel, das 1% Apfelpektin DE 75% enthält, identifiziert,
Inkubation über
Nacht bei 30°C
und Präzipitation
mit MTAB wie oben beschrieben. Pektinesterase-Aktivität wird dann
identifiziert durch einen weißen
Hof.
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Fed-Batch-Fermentation
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Fermentationen wurden als Fed-Batch-Verfahren
mit Maltodextrin als Kohlenstoffquelle, Harnstoff als Stickstoffquelle
und Hefeextrakt durchgeführt.
Der pH wurde bei 7,0 gehalten, und die Temperatur wurde bei 34°C während des
gesamten Verfahrens gehalten. Nach der Fermentation wurde die Pektinesterase
durch Zentrifugieren und Keimfiltration wiedergewonnen.
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Aufreinigung des Enzyms
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Die rekombinante Pektinesterase aus
A. oryzae wurde wie folgt aufgereinigt: Kulturüberstand wurde nach 5 Tagen
von der Kultur geerntet und zentrifugiert, keimfiltriert und auf
einer 3-kDa-Cut-off-Filtrationskassette (Minisette) auf ein Minimalvolumen
ultrafiltriert. 25 ml des Ultrafiltrats wurden mit 50 mM H3BO3. 5 mM DMG, 1
mM CaCl2, pH 7,0 dialysiert, und auf eine
40 ml Q-Sepharose-FF-Säule (Pharmacie,
Schweden), in dem gleichen Puffer equilibriert, appliziert. Nach
dem Waschen der Säule
wurde gebundenes Protein mit einem linearen NaCl-Gradienten (von
0 bis 0,5 M NaCl) eluiert. Fraktionen der Säule wurden auf Pektinesterase-Aktivität hin durch
den wie oben beschriebenen Apfelpektin-Assay analysiert. Das meiste
der Pektinesterase-Aktivität
wurde im Durchfluss gesehen, wohingegen das meiste des Proteins
an die Säule
gebunden war.
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Der pH des Durchflusses wurde auf
pH 4,5 mit CH3COOH eingestellt und auf eine
50 ml S-Sepharose HP-Säule
(Pharmacia, Schweden), equilibriert in 25 mM CH3COOH/NaOH,
pH 4,5, aufgetragen. Nach Waschen der Säule wurde gebundenes Protein
mit einem linearen NaCl-Gradienten (von 0 bis 0,25 M NaCl) eluiert.
Fraktionen der Säule
wurden auf Pektinesterase-Aktivität hin analysiert. Der Hauptteil
der Pektinesterase-Aktivität
wurde in einer Spitze (Engl.: peak) eluiert, die Spitzen (Engl.:
peak)-Fraktionen wurden gepoolt.
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Ammoniumsulfat (AMS) wurde zu dem
Pool zu einer finalen AMS-Konzentration
von 1,6 M hinzugefügt
und das Enzym wurde zu einer 40 ml Phenyl-Toyopearl-Säule, equilibriert
in 100 mM H3BO3,
10 mM DMG, 2 mM CaCl2, 1,6 M AMS, pH 7,0,
hinzugefügt.
Nach Waschen der Säule
wurde gebundenes Protein mit einem linearen AMS-Gradienten (von
1,6 bis 0 M AMS) eluiert. Der Puffer der Pektinesterase-Spitze (Engl.:
peak) wurde für
25 mM CH3COOH/NaOH, pH 4,5, durch einen
Durchlauf auf einer 1,4-L-G25-Sephadex-Säule,
equilibriert in 25 mM CH3COOH/NaOH, pH 4,5,
ausgetauscht.
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Das Pektinesterase-Enzym wurde auf
eine 50-ml-S-Sepharose-HP-Säule,
equilibriert in 25 mM CH3COOH/NaOH, pH 4,5,
appliziert. Nach Waschen der Säule
wurde gebundenes Protein mit einem linearen NaCl-Gradienten (von
0 bis 0,1 M NaCl) eluiert. Fraktionen mit Pektinesterase-Aktivität wurden
durch SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen enthielten nur eine Bande.
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Elektrophorese
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SDS-PAGE-Elektrophorese wurde in
einer Mini-Leak-4-Elektrophorese-Einheit (Kem-En-Tec, Dänemark)
als eine modifizierte Version des Laemmli-Verfahrens (Laemmli (1970)
Nature 227: 680–685)
durchgeführt.
Die Gele wurden gemäß den Herstellerangaben
Coomassie-gefärbt.
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Isolierung der in SEQ
ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz:
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Der Pektinesterase-kodierende Teil
der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz, kodierend eine Pektinesterase
der Erfindung, kann aus dem abgelegten Organismus Escherichia coli
DSM 10357 durch Extraktion der Plasmid-DNA durch Verfahren, die
in der Technik bekannt sind (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning:
A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor
NY) erhalten werden.
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Hybridisierung
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Geeignete Hybridisierungsbedingungen,
um die Hybridisierung zwischen einer Nukleotidprobe und einer "analogen" DNA-Sequenz der
Erfindung zu bestimmen, können
wie unten beschrieben definiert werden. Die zu verwendende Oligonukleotidprobe
ist die DNA-Sequenz, die dem Pektinesterase-kodierenden Teil der in
SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz entspricht, z. B. Nukleotide
4–933
in SEQ ID NR. 1.
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Hybridisierungsbedingungen
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Die hierin bezeichneten Hybridisierungsbedingungen,
um eine analoge DNA-Sequenz
wie in Teil b) des ersten Aspekts der Erfindung zu definieren, welche
mit dem Pektinesterase-kodierenden Teil der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten
DNA-Sequenz, z.
B. Nukleotide 4–933,
unter mindestens niedrig-stringenten Bedingungen, aber mehr bevorzugt
bei mittleren oder höheren
Strigenzbedingungen hybridisiert, zu bezeichnen, sind im Detail
unten beschrieben.
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Geeignete experimentelle Bedingungen,
um Hybridisierung bei niedriger, mittlerer oder hoher Stringenz
zwischen einer Nukleotidprobe und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz
zu bestimmen, beinhaltet das Einweichen des Filters, der die zu
hybridisierenden DNA-Fragmente oder RNA enthält, in 5 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat,
Sambrook et al. 1989) für
10 min. und Vorhybridisierung des Filters in einer Lösung von
5 × SSC,
5 × Denhardt's-Lösung (Sambrook
et al., 1989), 0,5% SDS und 100 μg/ml
denaturierter sonifizierter Lachssperma-DNA (Sambrook et al., 1989), gefolgt
durch Hybridisierung in der gleichen Lösung, enthaltend eine Konzentration
von 10 ng/ml zufällig
geprimter (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem.
132: 6 – 13), 32P-dCTP-markierter (spezifische Aktivität > 1 × 109 cpm/μg) Probe
für 12
Stunden bei ca. 45°C.
Der Filter wird dann 2 × SSC,
0,5% SDS bei mindestens 55°C
(niedrige Stringenz) gewaschen, mehr bevorzugt bei mindestens 60°C (mittlere
Stringenz), noch mehr bevorzugt bei mindestens 65°C (mittlere/hohe Stringenz),
noch mehr bevorzugt bei mindestens 70°C (hohe Stringenz) und sogar
noch mehr bevorzugt bei mindestens 75°C (sehr hohe Stringenz).
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Moleküle, mit welchen die Oligonukleotidprobe
unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden unter Verwendung eines
Röntgenfilms
detektiert.
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Immunologische Kreuzreaktivität: Antikörper, die
zum Bestimmen immunologischer Kreuzreaktivität verwendet werden müssen, können durch
die Verwendung einer aufgereinigten Pektinesterase zubereitet werden.
Mehr spezifisch kann Antiserum gegen die Pektinesterase der Erfindung
durch Immunisierung von Hasen (oder anderen Nagetieren) gemäß dem von
N. Axelsen et al. In: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,
Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone
und R. Thorpe, Immunochemistray in Practice, Blackwell Scientific
Publications, 1982 (genauer S. 27–31) beschriebenem Verfahren
hochgezogen werden. Aufgereinigte Immunoglobuline können aus
den Antisera z. B. durch Salzfällung
((NH4)2SO4), erhalten werden, gefolgt von Dialyse
und Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex. Immunochemische
Charakterisierung von Proteinen kann entweder durch Outcherlony-Doppeldiffusionsanalyse
(O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir,
Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp. 655–706), durch
gekreuzte Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., oben, Kapitel
3 und 4), oder durch Raketenimmunoelektrophorese (Engl.: rocket
immunoelectrophoresis) (N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
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Medien
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- YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, mit H2O
auf 900 ml auffüllen.
Autoklaviert, 100 ml 20% Glukose (steril filtriert) hinzugefügt.
- YPM: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, mit Wasser auf 900 ml aufgefüllt. Autoklaviert,
100 ml 20% Maltodextrin (steril filtriert) hinzugefügt.
- 10 × Basalsalz:
75 g Hefe-Stickstoff-Base, 113 g Bernsteinsäure, 68 g NaOH, mit H2O auf 1000 ml aufgefüllt, steril filtriert.
- SC-URA: 100 ml 10 × Basalsalz,
28 ml 20% Casaminosäuren
ohne Vitamine, 10 ml 1% Tryptophan, mit Wasser auf 900 ml aufgefüllt, autoklaviert,
3,6 ml 5% Threonin und 100 ml 20% Glukose oder 20% Galactose hinzugefügt.
- SC-Agar: SC-URA, 20 g/l Agar hinzugefügt.
- PEG 4000 (Polyethylenglykol, Molekulargewicht = 4000) (BDH,
England)
- 1% Apfelpektin DE 75% (Herbstreith, Deutschland)
- 1% HSB-Agarose (FMC Litex A/S, Dänemark)
- MTAB (gemischtes Alkyltrimethylammoniumbromid) (Sigma)
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1
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Klonierung und Expression
einer Pektinesterase aus Meripilus giganteus CBS 521.95
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mRNA wurde aus Meripilus giganteus,
CBS Nr. 521.95, gewachsen in Zellulose- enthaltendem Fermentationsmedium unter
Rühren,
um ausreichende Belüftung
sicherzustellen, isoliert. Mycelien wurden nach 3 bis 5 Tagen Wachstum
geerntet, sofort in flüssigem
Stickstoff gefroren und bei –80°C gelagert.
Eine Bibliothek von M. giganteus, CBS Nr. 521.95, bestehend aus
ungefähr
106 individuellen Klonen wurde in E. coli
wie beschrieben mit einem Vektorhintergrund von 1 konstruiert. Plasmid-DNA
von einigen der Pools wurde in Hefe transformiert, und 50 bis 100
Platten, enthaltend 250 bis 400 Hefekolonien, wurden aus jedem Pool
erhalten.
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Pektinesterase-positive Kolonien
wurden identifiziert und auf SC-Agar-Platten mit dem Apfelpektin-Assay
isoliert. cDNA-Inserts wurden direkt aus den Hefekolonien amplifiziert
und wie in dem Material- und Methodenteil oben beschrieben charakterisiert.
Die DNA-Sequenz der cDNA, die die Pektinesterase kodiert, ist in SEQ
ID Nr. 1 gezeigt, und die entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR.
2 gezeigt. In SEQ ID NR. 1 definieren DNA-Nukleotide von Nr. 4 bis
Nr. 933 die Pektinesterase-kodierende Region.
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Die cDNA kann aus dem Plasmid in
DSM 10357 erhalten werden.
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Gesamt-DNA wurde aus einer Hefekolonie
isoliert, und Plasmid-DNA wurde durch Transformation von E. coli
wie oben beschrieben wiedergewonnen. Um die Pektinesterase in Aspergillus
zu exprimieren, wurde die DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen
verdaut, der Größe nach
auf Gel aufgetrennt, und ein Fragment, entsprechend dem Pektinesterase-Gen,
wurde aufgereinigt. Das Gen wurde anschließend mit pHD414 ligiert, mit
geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, resultierend in dem Plasmid
pA2PE18.
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Nach der Amplifikation der DNA in
E. coli wurde das Plasmid in Aspergillus oryzae wie oben beschrieben
transformiert.
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Test der oryzae-Transformanten
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Jede der Transformanten wurde auf
Enzymaktivität
hin wie oben beschrieben getestet. Einige der Transformanten hatten
Pektinesterase-Aktivität,
welche signifikant höher
war als der Aspergillus oryzae-Hintergrund. Dies zeigt effiziente
Expression der Pektinesterase in Aspergillus oryzae.
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BEISPIEL 2
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Homologie
zu publizierten Pektinesterasen
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Eine Homologie-Suche mit der Pektinesterase
der Erfindung gegen eine Nukleotid- und Protein-Datenbank wurde
durchgeführt.
Die Homologie-Suche zeigte, dass die am meisten verwandten Pektinesterasen eine
Pektinesterase aus Aspergillus aculeatus und eine Pektinesterase
aus Aspergillus tubigensis (von der gesagt wurde, dass sie aus A.
niger stammt) sind.
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Gemäß dem in "DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG" beschriebenen Verfahren
wurde die DNA-Homologie der Pektinesterase der Erfindung gegen die
Pektinesterasen des Stands der Technik unter Verwendung des Computerprogramms
GAP bestimmt. Die Pektinesterase der Erfindung zeigte nur 54% DNA-Homologie
zu der Pektinesterase aus Aspergillus aculeatus (WO 94/25575) und
die Pektinesterase der Erfindung hat nur 56% DNA-Homologie zu der Pektinesterase aus
Aspergillus tubigensis (Khanh et al. (1990) "Nucleotide and derived amino acid sequence
of a pectinesterase c DNA isolated from Aspergillus niger strain RH5344", Nucleic Acids Res.
18: 4262; Khanh et al. (1991) "Characterization
and expression of a genomic pectin methyl esterase-encoding gene in
Aspergillus niger",
Gene 106: 71–77).
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Gemäß des in der "DETAILLIERTEN BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG" beschriebenen
Verfahrens wurde die Polypeptid-Homologie der Pektinesterase der
Erfindung gegen die Pektinesterasen des Stands der Technik unter
Verwendung des Computerprogramms GAP bestimmt. Die Pektinesterase
der Erfindung hat nur 47% Polypeptid-Homologie zu der Pektinesterase
aus Aspergillus aculeatus und die Pektinesterase der Erfindung hat
nur 44% Polypeptid-Homologie zu der Pektinesterase aus Aspergillus
tubigensis.
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Dies zeigt, dass die Pektinesterase
der Erfindung in der Tat von irgendwelchen bekannten Pektinesterasen
verschieden ist.
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BEISPIEL 3
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Aufreinigung
und Charakterisierung der rekombinanten Pektinesterase der Erfindung
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Die Pektinesterase wurde durch Fed-Batch-Fermentation
von A. oryzae, welches das Enzym, wie in Material und Methoden oben
beschrieben exprimiert, hergestellt.
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Die rekombinante Pektinesterase wurde
aufgereinigt und durch die in den Material- und Methodenteil oben
beschriebenen Verfahren charakterisiert. Das Molekulargewicht des
Enzyms wurde durch SDS-PAGE auf 37 kDa bestimmt.
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BEISPIEL 4
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In-situ-Gelierung von
Erdbeermarmelade
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Freies Methanol als ein
Indikator der Gel-bildenden Eigenschaften
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Material und Methoden:
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- Pektinesterase-Charge PPJ 4300, 423 PEU/g
- Pektinesterase: Meripilus giganteus, 2,4 PEU/g
- Erdbeeren, gefroren, Sorte: Senga sengana
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Die Aktivität der Pektinesterase ist in
Pektinesterase-Einheiten (PEU) angegeben, definiert als die Menge
an Enzym, welche unter standardisierten Bedingungen 1 mmol Carboxylgruppen
pro Minute freisetzt (Novo Nordisk-Assay ABT-SM-0005.02.1, erhältlich auf Anfrage von Novo
Nordisk A/S).
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Marmeladenzubereitung
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Die Zubereitung der Marmelade wird
gemäß dem Standardverfahren
für Marmeladenherstellung
ausgeführt
(Novo Nordisk Standard Operation Procedure, ABF-SP-4002.02/01, erhältlich auf Anfrage von Novo Nordisk
A/S).
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Eine Portion Marmelade von 300 g
wurde zubereitet. Das Verhältnis
von Erdbeere zu Zucker war: 180 g Beeren + 120 g Zucker. Nach einem
initialen VorKochen der Frucht wurde der dünne Brei in 2 × 3 – 50-g-Portionen
geteilt, die Proben wurden auf 40°C
abgekühlt
und Enzym wurde wie folgt zugegeben:
- (1) Kontrolle
mit keinem hinzugefügten
Enzym
- (2) PE, PPJ 4300, 10 PEU/kg Frucht
- (3) PE, Meripilus giganteus, 10 PEU/kg Frucht
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Die Proben wurden versiegelt und
für 1 Stunde
stehengelassen, dann wurden die Proben für 3 Minuten bei 90°C hitzebehandelt,
um das Enzym zu inaktivieren.
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In den vorliegenden Versuchen wurde
die Quantifizierung von freiem Methanol in Alfred Jørgensens Lab.
A/S, Kopenhagen, durchgeführt.
Die Proben wurden initial destilliert, dann unter Verwendung eines
Kapillar-Gaschromatographen in Kombination mit massenspektrometrischer
Detektion analysiert.
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Ergebnisse und Diskussion
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Die Resultate sind aus Tabelle 1
unten ersichtlich:
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Tabelle
1, Methanolbildung
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Es ist klar gezeigt, dass Pektinesterase
aus Meripilus giganteus, resultierend in 340 ppm freiem Methanol,
der mehr traditionelleren aus Aspergillus abgeleiteten PE überlegen
ist, resultierend in einer freien Methanolbildung von 200 ppm.
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Falls der Pektingehalt der Erdbeeren
auf 0,6% geschätzt
wird und das Maß der
Esterifizierung (DE) auf 70% geschätzt wird, kann errechnet werden,
dass das finale DE des traditionellen PE-Produkts in einer DE von
52 resultiert, wohingegen Meripilus giganteus – PE in einer DE von 38 resultiert.
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Das Ausmaß an Esterifizierung ist für die strukturellen
Eigenschaften von in situ gelierter Marmelade und auch für andere
DE-modifizierte Gemüseprodukte
von Wichtigkeit. Das Ausmaß an
Esterifizierung bestimmt die Anzahl der Ca- Brücken,
die gebildet werden können,
und ist so bezogen auf die Gelstärke
oder die Viskosität
eines bestimmten Produkts.
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Folglich ist es offensichtlich, dass
das Meripilus giganteus-abgeleitete Enzym ein nützliches Werkzeug bei der Erschaffung
von starken und nützlichen
Gels ist. Das Enzym ist wahrscheinlich auch eine noch stärkere Alternative
zu der chemischen Modifizierung von extrahierten Pektinen als das
traditionelle Aspergillus-abgeleitete
PE-Produkt.
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LISTE DER
SEQUENZEN
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SEQ ID Nr. 1 zeigt die DNA-Sequenz
der vollen Länge
cDNA-Sequenz, zusammengefasst in dem in das abgelegte Escherichia
coli DSM 10357 transformierte DNA-Konstrukt.
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ANGABEN,
DIE SICH AUF EINEN ABGELEGTEN MIKROORGANISMUS BEZIEHEN
(PCT-Richtlinie
13bis)
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ANGABEN,
DIE SICH AUF EINEN ABGELEGTEN MIKROORGANISMUS BEZIEHEN
(PCT-Richtlinie
13bis)