CN1229495C

CN1229495C - 具有果胶酯酶活性的酶

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Publication number: CN1229495C
Application number: CNB971925003A
Authority: CN
Inventors: L·N·安德森; M·S·考普比能; G·布朵夫森
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-18
Publication date: 2005-11-30
Anticipated expiration: 2017-02-18
Also published as: ES2219752T3; EP0885295B1; WO1997031102A1; CN1212010A; DE69728863T2; ATE265527T1; JP2000504587A; AU1719497A; US6069000A; DE69728863D1; EP0885295A1; JP4243348B2

Abstract

本发明涉及具有果胶酯酶活性的酶、编码具有果胶酯酶活性的酶的DNA构建体、产生这种酶的方法、包含所说的具有果胶酯酶活性的酶的酶组合物及所说的酶和酶组合物在许多工业应用中的用途。

Description

具有果胶酯酶活性的酶

发明领域

本发明涉及具有果胶酯酶活性的酶、编码具有果胶酯酶活性的酶的DNA构建体、产生酶的方法、包含所说的具有果胶酯酶活性的酶的酶组合物及所说的酶和酶组合物在许多工业应用中的用途。

发明背景

果胶聚合物是植物初生细胞壁的重要组分。它们由1，4-连接的α-D-半乳糖醛酸和其甲基化衍生物的链组成。利用果胶降解酶(如多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、果胶裂合酶或果胶酸酯裂合酶)对食品工业，主要在水果和蔬菜加工(如果汁的生产或酒的酿制)中是重要的，其中在水果和蔬菜加工中，利用这些酶催化降解果胶聚合物主链的能力。

为了许多目的，理想的是：提供各种果胶降解酶，例如，这些酶以不含其它组分的形式存在于包含许多不同果胶降解酶的商业制剂(这类制剂的例子是Pectinex Ultra SP^，从棘孢曲霉制备，由Novo Nordisk A/S提供)中。按照这一点，将可能产生适应于特定的目的的酶制剂(如或包含一种单一的果胶降解酶或包含它们的任意结合物的酶制剂)。为此，利用重组DNA技术提供单一组分的果胶降解酶是方便的。

果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)催化甲醇从果胶除去，导致果胶酸(多聚半乳糖醛酸)的形成。

果胶甲基酯酶由许多微生物产生，并已发现存在于许多高等植物的叶、根、柄和果实中。微生物果胶甲基酯酶已由Khanh等(1990)，“从黑曲霉菌株RH5344分离的果胶酯酶的核苷酸及衍生的氨基酸序列”，核酸研究18：4262；Khanh等(1991)，“黑曲霉中编码基因组果胶甲基酯酶的基因的特征化和表达”，基因106：71-77；Spok等，(1991)，“青枯假单胞菌的果胶酯酶基因的分子克隆和测序”，微生物遗传学杂志137：131-140；Plastow(1988)，“菊欧文氏菌B374的果胶甲基酯酶基因的分子克隆和核苷酸测序”，分子微生物2：247-254；Laurent等，(1993)，“编码菊欧文氏菌菌株3937的果胶甲基酯酶pem基因的特征化和超量表达”，基因131：17-25；Tierny等，(1994)，“编码来自多形拟杆菌的果胶酸酯裂合酶和果胶酶甲基酯酶活性的基因的分子克隆和在大肠杆菌中的表达”，应用细菌学杂志，76：592-602。

WO 94/25575描述了来自棘孢曲霉的果胶甲基酯酶的克隆。

发明概述

按照本发明，发明人现已成功地分离并特征化来自担子菌门真菌的DNA序列，因此使制备单一组分的果胶酯酶组合物成为可能，其中，所说的DNA序列编码一种显示果胶甲基酯酶活性的酶，该果胶甲基酯酶也称为果胶酯酶。

因此，第一方面，本发明涉及一种DNA构建体，该构建体包含编码显示果胶酯酶活性的酶的DNA序列，此DNA序列包含：

a)克隆进存在于大肠杆菌DSM 10357中的质粒pYES 2.0中的DNA序列果胶酯酶编码部分，或

b)与a)中限定的DNA序列类似的序列，该序列

i)与a)中限定的DNA序列至少60％是同源的，或

ii)与SEQ ID NO：1中位置4-933显示的DNA序列在严格性差的条件下杂交，或

iii)编码一种多肽，该多肽与由包含a)中限定的DNA序列的DNA序列编码的多肽有至少50％的同源性，或

iv)编码一种多肽，该多肽与针对纯化的果胶酯酶产生的抗体是免疫反应性的，其中所说的果胶酯酶由a)中限定的DNA序列编码。

编码果胶酯酶的全长cDNA序列已从丝状真菌Meripilus giganteus菌株获得，并已克隆进存在于大肠杆菌菌株DSM No.10357的质粒pYES 2.0中。

人们相信：所说的大肠杆菌DSM 10357中包含的编码果胶酯酶的DNA序列具有与SEQ ID NO：1代表的DNA序列相同的序列。因此，只要提及克隆进存在于DSM 10357中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的果胶酯酶编码部分，也旨在于包括SEQ ID NO：1代表的DNA序列的果胶酯酶编码部分。

因此，术语“克隆进存在于DSM 10357中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的果胶酯酶编码部分”和“SEQ ID NO：1代表的DNA序列的果胶酯酶编码部分”可互换。

另一方面，本发明还提供了包含本发明的DNA构建体的表达载体、包含所说的DNA构建体或所说的表达载体的细胞及产生显示果胶酯酶活性的酶的方法，此方法包括：在允许这种酶产生的条件下，培养所说的细胞，并从培养物中回收该酶。

另一方面，本发明还提供了显示果胶酯酶活性的酶，这种酶

(a)由本发明的DNA构建体编码；或

(b)由本发明的方法产生；和/或

(c)与针对纯化的果胶酯酶产生的抗体是免疫反应性的，这种纯化的果胶酯酶由克隆进存在于大肠杆菌DSM 10357的质粒pYES 2.0中的DNA序列的果胶酯酶编码部分编码。在一个优选的实施方案中，这种酶具有推断的氨基酸序列SEQ ID NO：2。

另一方面，本发明提供了对降解或修饰植物材料或其组分有用的酶组合物、所说的组合物富含显示出如上所述的果胶酯酶活性的酶。

另一方面，本发明涉及本发明的酶或酶组合物在各种工业应用中的用途。

最后，本发明涉及大肠杆菌菌株DSM 10357的分离的实质上纯化的生物培养物，该菌株包含编码果胶酯酶的DNA序列(克隆进存在于大肠杆菌DSM 10357的质粒pYES 2.0中的DNA序列的果胶酯酶编码部分)，该DNA序列来源于丝状真菌Meripilus giganteus的菌株或所说的保持果胶酯酶编码能力的大肠杆菌菌株的任意突变体，本发明也涉及分离的实质上纯化的丝状真菌Meripilus giganteus CBS 521.95的生物培养物，从其中已获得了SEQ ID No.1所示的DNA序列。

发明详述

DNA构建体

本发明提供了一种DNA构建体，该构建体包含编码显示果胶酯酶活性的酶的DNA序列，该DNA序列包含

a)克隆进存在于大肠杆菌DSM 10357的质粒pYES 2.0中的DNA序列的果胶酯酶编码部分，或

b)与a)中限定的DNA序列类似的序列，其中该类似序列

i)与a)中所限定的DNA序列至少60％是同源的，或

ii)与SEQ ID NO：1中4-933位置显示的DNA序列以低严格性杂交，或

iii)编码一种多肽，该多肽与由包含a)中限定的DNA序列的DNA序列编码的多肽至少50％是同源的，或

iv)编码一种多肽，该多肽与针对纯化的果胶酯酶产生的抗体是免疫反应性的，其中，所说的果胶酯酶由a)中限定的DNA序列编码。

如本文所限定的，与克隆进存在于大肠杆菌DSM 10357的质粒pYES2.0中的DNA序列的果胶酯酶编码部分类似的DNA序列旨在表明编码显示果胶酯酶活性的酶的任意DNA序列，其中，所说的显示果胶酯酶活性的酶具有一种或多种以上(i)-(iv)指出的性质。

因此，类似的DNA序列可从产生具有果胶酯酶活性的酶的丝状真菌Meripilus giganteus或另一种或相关的生物(例如，克隆进存在于大肠杆菌DSM 10357的质粒pYES 2.0中的DNA序列的果胶酯酶编码部分的等位基因或物种变体)的菌株分离。

此外，类似序列可基于SEQ ID NO：1的果胶酯酶编码部分所代表的DNA序列(例如，可以是它的子序列)构建，和/或通过引入核苷酸取代构建(其中，该取代不产生DNA序列编码的果胶酯酶的另一种氨基酸序列，但符合产生酶需要的宿主生物的密码子选择)，或通过引入可产生不同氨基酸序列的核苷酸取代构建。

进行核苷酸取代时，优选地，氨基酸变化是一种次要的性质，即，是保守的氨基酸取代(它不显著影响蛋白质的折叠或活性)、小的缺失(典型地，为1至约30个氨基酸的缺失)、小的氨基或羧基末端突出(如氨基末端甲硫氨酸残基、达约20-25个残基的小接头肽)或有利于纯化的小突出(如多聚组氨酸片段、抗原表位或结合结构域)。

保守取代的例子在碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)以及小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)组内。对于核苷酸取代的一般描述，参见，例如Ford等，(1991)，蛋白质表达和纯化2，95-107。

对本领域技术人员将明显的是：这类取代可发生在分子功能关键性区域外部，并仍然产生活性多肽。对由本发明的DNA构建体编码的多肽的活性是必需的，因而优选地不易取代的氨基酸，可按照本领域已知的方法(如，定点诱变、丙氨酸扫描诱变)鉴定(参见，例如Cunningham和Wells，(1989)，科学244，1081-1085)。在后一技术中，在分子的每个残基上引入突变，并检验产生的突变体分子的生物学(即果胶酯酶)活性，以确定对分子活性关键的氨基酸残基。如通过诸如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记的技术测定底物-酶相互作用的位点，也可由晶体结构的分析测定底物-酶相互作用的位点(参见，例如，de Vos等，(1992)，科学255，306-312；Smith等，(1992)，分子生物学杂志224，899-904；Wlodaver等，(1992)，FEBS Lett.309，59-64)。

以上i)所提到的同源性作为两种序列间的同源程度测定，这种同源程度表明第一种序列来源于第二种序列。同源性可通过本领域已知的计算机程序(如GCG程序包提供的GAP)适当地测定(Wisconsin包的程序手册，第8版本，1994年8月，遗传学计算机小组，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，美国53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-453)。利用GAP(该GAP具有用于DNA序列比较的下列配置：GAP产生罚5.0，GAP延伸罚0.3)，DNA序列的编码区域显示与SEQ ID NO：1中所显示的DNA序列的果胶酯酶编码部分同源程度，优选地至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，更优选地至少97％。

以上(ii)中提到的杂交旨在表明：类似的DNA序列与相同于编码果胶酯酶的DNA序列的探针在一定的规定条件下杂交，这些条件在下文材料和方法部分中详述。利用的寡核苷酸探针是与SEQ ID NO：1中显示的DNA序列的果胶酯酶编码部分对应的。

以上iii)中提到的同源性作为两种序列间的同源程度测定，这种同源程度表明第一种序列来源于第二种序列。同源性可通过本领域已知的计算机程序(如GCG程序包提供的GAP)适当地测定(Wisconsin包的程序手册，第8版本，1994年8月，遗传学计算机小组，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，美国53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-453)。利用GAP(该GAP具有用于DNA序列比较的下列配置：GAP产生罚3.0，GAP延伸罚0.1)，由类似的DNA序列编码的多肽与DNA构建体编码的酶(如与SEQ ID NO：2氨基酸序列)显示的同源程度，优选地至少50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，尤其优选地至少97％，其中，该DNA构建体包含SEQ ID NO：1中所显示的DNA序列的果胶酯酶编码部分。

本发明也涉及果胶酯酶变体，这些变体具有的氨基酸序列由于最多三个氨基酸，优选地由于最多两个氨基酸，更优选地由于最多一个氨基酸，因而与SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列的成熟部分不同。

关于性质iv)，免疫反应性可通过以下材料和方法部分中所述的方法测定。

编码本发明的果胶酯酶的DNA序列可利用标准方法，从大肠杆菌DSM 10357菌株中分离，例如，如由Sambrook等，(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室；冷泉港，NY描述的。

编码显示本发明的果胶酯酶活性的酶的DNA序列也可通过任何普通的方法分离，这些方法包括：

在合适的载体中，克隆来自任何期望产生兴趣果胶酯酶的生物的cDNA文库，

以所说的载体，转化合适的酵母宿主细胞，

在合适的条件下，培养宿主细胞，以表达任何由cDNA文库的克隆编码的兴趣酶，

通过测定任何由这类克隆产生的酶的果胶酯酶活性，筛选阳性克隆，并

从这类克隆分离编码该酶的DNA。

普通分离方法已在WO 93/11249或WO 94/14953中公开，其内容本文一并参考。筛选方法的更详细描述在以下的实施例1中给出。

此外，编码本发明的果胶酯酶的DNA，依照众所周知的方法，通过利用基于本文公开的DNA序列制备的合成寡核苷酸探针，可方便地从合适的源(如以下提及的任何生物)分离。例如，合适的寡核苷酸探针可基于作为SEQ ID NO：1表达的核苷酸序列的果胶酯酶编码部分或其任何适合的子序列制备或基于SEQ ID NO：2氨基酸序列制备。

微生物源

在一个优选的实施方案中，编码果胶酯酶的DNA序列来源于属于多孔菌科的菌株，按照entrez browser NCBI分类学，3,3版本(最新95.12.13)，该科是非褶菌目内的一个科，此非褶菌目属于担子菌门层菌纲。

现在预期：编码与本发明的酶同源的酶的DNA序列(即，类似的DNA序列)可得自其它微生物。例如，DNA序列可通过类似地筛选其它微生物(如曲霉属、酵母属、拟杆菌属、欧文氏菌属、假单胞菌属、梭菌属的菌株)的cDNA文库衍生。

本发明的果胶酯酶可从中衍生的Meripilus giganteus菌株的分离物已按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，由发明人保藏在Centraalbureau voor Schimmelcultures，P.O.Box 273，3740 AGBaarn，荷兰(CBS)。

保藏日期：04.07.95

保藏者的参考号：NN006040

CBS指定号：Meripilus giganteus CBS No.521.95

包含编码本发明的果胶酯酶的全长cDNA序列的表达质粒pYES 2.0已转化进入大肠杆菌菌株，且按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，该菌株由发明人保藏在Deutshe Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH.，Masheroder Weg 1b，D-38124 Raunschweig，联邦德国，(DSM)。

保藏日期：06.12.95

保藏者的参考号：NN049144

DSM指定号：大肠杆菌DSM 10357

表达载体

另一方面，本发明提供了包含本发明的DNA构建体的重组表达载体。

本发明的表达载体可以是任何表达载体，这些载体易于方便地进行重组DNA过程，因而，载体的选择将经常取决于将要引入的宿主细胞。因此，这种载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，它们的复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。另外，载体可以是这样的载体，当把它引入宿主细胞时，整合进入宿主细胞基因组，并与已整合进入的染色体一起复制。

在表达载体中，应把编码果胶酯酶的DNA序列可操作地连接到合适的启动子与终止子序列上。启动子可以是任何在选择的宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，且可来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于分别连接编码果胶酯酶的DNA序列，启动子和终止子，且把它们插入到合适的载体的方法对本领域技术人员是众所周知的(参见，例如，Sambrook等，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港，NY)。

例如，在丝状真菌宿主细胞中利用的合适的启动子的例子是ADH3启动子(McKnight等，EMBO杂志4(1985)，2093-2099)或tpiA启动子。其它有用的启动子的例子是那些来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、Rhizomucormiehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的基因的启动子。

宿主细胞

另一方面，本发明提供了包含本发明的DNA构建体和/或本发明的重组表达载体的宿主细胞。

优选地，本发明的宿主细胞是真核细胞，尤其是真菌细胞，如酵母或丝状真菌细胞。尤其是，细胞可属于木霉属物种(优选地为Trichodermaharzianum或Trichoderma reesei)或曲霉属物种(最优选地为米曲霉或黑曲霉)或镰孢属的物种(尤其是禾谷镰孢、Fusarium cerealis菌株)。真菌细胞可通过一种方法转化，此方法包括原生质体形成和原生质体转化，接着由本身已知的方式再生细胞壁。曲霉属作为宿主微生物的用途在EP238 023中描述(Novo Nordisk A/S)，其内容本文一并参考。宿主细胞也可以是酵母细胞，例如，酵母属的菌株(尤其是酿酒酵母、克鲁弗酵母或葡萄汁酵母)、Schizosaccharomyces sp.菌株(如粟酒裂殖酵母)、Hansenulasp.菌株、Pichia sp.菌株、Yarrowia sp.(如Yarrowia lipolytica)菌株或Kluyveromyces sp.(如乳酸克鲁维酵母)菌株。

产生果胶酯酶的方法

另一方面，本发明提供了产生按照本发明的酶的方法，其中把以编码这种酶的DNA序列转化的合适的宿主细胞在允许这种酶产生的条件下培养，并从此培养物回收产生的酶。

用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合谈及的宿主细胞生长的常规培养基。表达的果胶酯酶可方便地分泌进入培养基，并可通过众所周知的方法从其中回收，该方法包括：通过离心或过滤，从培养基分离细胞，通过盐(如硫酸铵)沉淀培养基的蛋白质组分，接着是层析过程(如离子交换层析、亲和层析或类似的过程)。

酶组合物

另一方面，本发明涉及利于修饰或降解植物细胞壁组分的一种酶组合物、所说的组合物富含上述的显示果胶酯酶活性的酶。

例如，富含本发明的酶的酶组合物可以是包含多种酶促活性的酶组合物，特别可以是包含多种植物细胞壁降解酶(如Viscozym^、Pectinex^或Pectinex Ultra SP^)的酶组合物(全部由Novo Nordisk A/S提供)。以这种方式，将可提高这种酶组合物的细胞壁降解能力。

在本文中，术语“富含”旨在表明：这种酶组合物的果胶酯酶活性已增加了，例如，富集系数为1.1，由于方便地添加了通过上述的方法制备的本发明的一种酶，提高了酶活性。

另外，富含显示果胶酯酶活性的酶的酶组合物可以是一种把本发明的酶作为主要的酶促组分包含的酶组合物，例如单一组分的酶组合物。

酶组合物可依据本领域已知的方法制备，并可以是液态形式的组合物或干燥形式的组合物。例如，酶组合物可以是粒状形式或微粒状形式。依据本领域已知的方法，将要包含在组合物中的酶可以是稳定化的。

以下给出本发明的酶组合物的优选用途的例子。本发明的酶组合物的剂量和利用该组合物的其它条件可基于本领域已知的方法确定。

按照本发明，该酶组合物可至少对下列目的之一是有用的。

植物材料的降解或修饰：

该酶组合物可有利地用于处理包含果胶的植物材料，如，蔬菜或水果来源的材料，例如，得自大豆、糖甜菜或苹果的材料，以降低粘度，因此，改进谈论的植物材料的加工或外观。粘度的降低可利用本发明的酶制剂，在适于包含果胶的材料全部或部分降解的条件下，通过处理包含果胶的植物材料达到。

这种酶组合物可用于脱果胶及降低蔬菜或水果汁的粘度，尤其是降低苹果或梨汁的粘度。

这种酶制剂可用于处理来自水果和蔬菜的麦芽汁，例如，可用于生产汁用的苹果和梨的麦芽汁处理，并可用于生产酒用的葡萄的麦芽汁处理。

这种酶组合物可用于柑橘类的植物汁的生产，例如，压榨后，用于部分或完全降解汁中存在的果肉。

对于上述用法，优选的是，除果胶酯酶外，这种酶组合物包含含有多聚半乳糖醛酸酶的酶制剂。

利用本发明的酶制剂，调节加工的水果或蔬菜的稠度和外观是可能的。因此，已发现这种稠度和外观将是用于加工的酶的实际结合的产物，即酶(尤其是果胶降解酶)的性质，本发明的果胶甲基酯酶与该酶结合。

具有可利用本发明的酶制剂产生的特异性性质的产物的例子包括来自苹果、梨或浆果的澄清汁、来自苹果、梨、浆果、柑橘类的植物或番茄的混浊稳定的汁及来自胡萝卜和番茄的浆。

由先前公开的内容看，明显的是：本发明的果胶酯酶可作为实质上无其它酶活性(如多聚半乳糖醛酸酶和/或果胶裂合酶活性)的单一组分生产，其中所说的酶活性通常发现存在于商业上可得的包含果胶酯酶的果胶溶解制剂中。

基于这一方面，本发明的果胶酯酶的用途对其中这类所说的其它酶活性的作用不受欢迎的目的尤其是有利的。

这类目的的例子包括：在加工或未加工的水果和蔬菜中，用于全部或部分使果胶脱甲基化的果胶甲基酯酶的用途。

例如，当要求水果或蔬菜的硬度改进时，部分脱甲基化是重要的。这样，硬度经常在加工(例如罐装和灭菌)过程中降低。通过利用控制本发明的果胶酯酶的量，可达到水果与蔬菜中存在的果胶的部分脱甲基化，产生的部分脱甲基化的果胶可与例如，二价离子(如钙)交联，因此，可形成更硬的水果或蔬菜。因此，例如，本发明的果胶酯酶可用于改进红和绿胡椒、大豆、豌豆及可切的水果(如梨和苹果)的硬度。

可进行酶的浸制，例如通过浸渍无助于或通过真空处理有助于此过程。

此目的的另一个例子是果胶的脱甲基化，例如来自柑橘类的植物、苹果、向日葵和/或糖甜菜的果胶的脱甲基化。

此外，果胶酯酶可用于获得各种基于蔬菜或水果的产品中原位粘度的增加或凝胶的形成。

本发明的果胶酯酶可单独地或与其它酶一起用于改进包含果胶的动物饲料(例如，由大豆、糖甜菜或油菜种子制备的饲料)的可消化性。为了这一目的，把本发明的酶组合物加至饲料中。

果胶酯酶活性可与其它酶一起用于由包含果胶的材料(如糖甜菜果肉)，依据众所周知的方法，产生包含寡糖的单半乳糖醛酸或半乳糖醛酸。单半乳糖醛酸可用于产生半乳糖醛酸或产生脂肪酸和脂肪醇酯和/或半乳糖醛酸的醚。包含寡糖的半乳糖醛酸可用作人类食品或动物饲料的添加剂。

此外，果胶酯酶可与其它酶结合用于从植物纤维除去果胶物质，这种除去是十分重要的，例如，在纺织纤维或其它纤维素材料的生产中是十分重要的。为了这一目的，把植物纤维材料利用适合量的本发明的果胶酯酶，在适于达到全部或部分降解与植物纤维材料有关的果胶物质的条件下处理。

分块对随机切割的作用方式：

羧基基团在果胶中的分布对果胶的功能性质是重要的。

已描述了用于测定果胶上游离羧基基团的分布的几种方法(Grasdalen，H.等，碳水化合物研究289，105(1995))。为了使果胶酯酶的作用方式特征化，酸基团的分布通过由Mort等描述的方法测定(Mort，A.J.等，碳水化合物研究247，21(1993))。酯化的半乳糖醛酸通过以氢硼化钠的还原转化为半乳糖。此后，产生的半乳糖残基的糖苷键通过HF溶剂解选择性地切割。这导致了低聚物(Gal A)n-Gal的产生。这些低聚物表明了果胶中甲基酯化的残基间的Gal A残基的邻近伸展。比较本发明的克隆的酯酶与桔子酯酶及碱处理。通过高效阴离子交换层析，把六个半乳糖醛酸残基的低聚物分离和量化。由这些寡聚物的分布，可确定果胶中酸基团是随机分布还是分块分布。

Grasdalen等，1995描述了作为获得关于组合物的定量信息和果胶的顺序结构的一种有用方法的NMR光谱法。与由Mort等定义的方法相反，1993 NMR光谱法表明了检验顺序结构的一种直接方法，仅需要中等程度的聚合物降解。

不受任何理论的束缚，现在人们相信：用于许多工业应用(如在果酱的凝胶化中)的本发明的果胶酯酶的改进的性能(见下文中实施例4)是由于本发明的酶的作用方式，此方式优选地提供了果胶中酸基团的分块分布。

在下列实施例中，进一步详细描述本发明，其中，下列实施例不打算以任何方式限制如权利要求中要求的本发明的范围。

材料和方法

保藏的生物：

Meripilus giganteus CBS 521.95包含本发明的编码果胶酯酶的DNA序列。

包含含有穿梭载体pYES 2.0中编码本发明的果胶酯酶的全长cDNA序列的质粒的大肠杆菌DSM 10357。

其它菌株：

酵母菌株：所利用的酿酒酵母菌株是W3124(MATα；ura 3-52；leu2-3，112；his 3-D200；pep 4-1137；prc1：：HIS3；prb1：：LEU2；cir+)

大肠杆菌菌株：DH10B(生命技术公司)

质粒：

曲霉属表达载体pHD414是质粒p775(在EP 238 023中描述)的衍生物。pHD414的构建在WO 93/11249中进一步描述。

pYES 2.0(Invitrogen)

pA2PE18(参见实施例1)

全部RNA的抽提以硫氰酸胍，接着是通过5.7M CsCl垫层的超速离心，聚(A)+RNA的分离利用WO 94/14953中描述的方法，通过寡(dT)-纤维素的亲和层析进行。

cDNA合成：双链cDNA是由5μg聚(A)+RNA通过RNase H方法(Gubler和Hoffman(1983)，基因25：263-269，Sambrook等，(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY)，利用由F.S.Hagen开发的发夹修饰(pers.comm.)合成的。把聚(A)+RNA(5μg在5μl DEPC处理的水中)在预先硅化的无RNA酶的Eppendorph试管中在70℃下加热8分钟，在冰上淬火，并在50μl的终体积中与逆转录酶缓冲液(50mMTris-Cl，pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl₂、10mM DTT，Bethesda研究实验室)合并，该缓冲液包含1mM的dATP、dGTP和dTTP及0.5mM的5-甲基-dCTP(Pharmacia)、40个单位的人胎盘核糖核酸酶抑制剂(RNasin，Promega)、1.45μg的寡(dT)₁₈-Not I引物(Pharmacia)和1000个单位的SuperScript II RNA酶H的逆转录酶(Bethesda研究实验室)。第一条链cDNA通过在45℃温育反应混合物1小时合成。合成后，把mRNA∶cDNA杂交混合物按照制造厂商的指导通过MicroSpin S-400HR(Pharmacia)旋转柱凝胶过滤。

凝胶过滤后，把杂交物在250μl的第二链缓冲液(20mM Tris-Cl，pH7.4、90mM KCl、4.6mM MgCl₂、10mM(NH₄)₂SO₄、0.16mMβNAD+)中稀释，这种第二链缓冲液包含每种dNTP各200μM、60个单位的大肠杆菌DNA聚合酶I(Pharmacia)、5.25个单位的RNA酶H(Promega)和15个单位的大肠杆菌DNA连接酶(BoehringerMannheim)。第二条链cDNA的合成通过在16℃温育反应试管2小时及在25℃温育15分钟完成。反应通过加入EDTA至20mM的终浓度停止，接着以苯酚和氯仿提取。

绿豆核酸酶处理：把双链cDNA在-20℃下，通过加入2体积96％EtOH、0.2体积10M NH₄Ac沉淀12小时，通过离心回收，以70％EtOH洗涤，干燥，并重新悬浮在包含25个单位绿豆核酸酶(Pharmacia)的30μl绿豆核酸酶缓冲液(30mM NaAc，pH4.6、300mMNaCl、1mM ZnSO₄、0.35mM DTT、2％甘油)中。单链发夹DNA通过在30℃温育反应物30分钟夹住，接着加入70μl 10mM pH7.5 Tris-Cl、1mM EDTA、苯酚抽提，并以2体积96％EtOH和0.1体积3MpH5.2NaAc在冰上沉淀30分钟。

以T4 DNA聚合酶钝化末端：双链cDNAs通过离心回收，并在30μl包含每种dNTP各0.5mM及5个单位的T4 DNA聚合酶(新英格兰Biolabs)的T4 DNA聚合酶缓冲液(20mM pH7.9 Tris-乙酸盐、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT)中，通过在16℃温育反应混合物1小时钝化末端。反应通过加入EDTA至20mM的终浓度停止，接着以苯酚和氯仿抽取，并通过加入2体积96％EtOH和0.1体积3M pH5.2NaAc在-20℃沉淀12小时。

衔接头连接、Not I消化以及大小选择：

填充反应后，cDNAs通过离心回收，以70％EtOH洗涤，并干燥。把cDNA沉淀重新悬浮在25μl包含2.5μg非回文BstXI衔接头(Invitrogen)和30个单位T4连接酶(Promega)的连接缓冲液(30mM pH7.8Tris-Cl、10mM MgCl₂、10mM DTT、0.5mM ATP)中，并在16℃下温育12小时。反应通过在65℃下加热20分钟停止，然后在冰上冷却5分钟。连接的cDNA通过加入20μl水、5μl 10×Not I限制酶缓冲液(新英格兰Biolabs)和50个单位的Not I(新英格兰Biolabs)，以Not I限制酶消化，接着在37℃下温育2.5小时。反应通过在65℃下加热10分钟停止。把cDNAs通过在1×TBE中的0.8％SeaPlaque GTG低熔点琼脂糖凝胶(FMC)上的凝胶电泳进行大小分馏，以分离未连接的衔接头和小的cDNA。cDNA是以0.7kb为截止进行大小选择的，并按照制造厂商的指导，通过利用β-琼脂酶(新英兰格Biolabs)，从凝胶中释放，通过加入2体积96％EtOH和0.1体积3M pH5.2NaAc在-20℃下沉淀12小时。

文库的构建：定向的、以大小选择的cDNA通过离心回收，以70％的EtOH洗涤，干燥，并重新悬浮在30μl pH7.510mM Tris-Cl、1mMEDTA中。按照制造厂商的指导，把cDNAs通过穿过MicroSpin S-300HR(Pharmacia)旋转柱的凝胶过滤脱盐。三种检验连接在10μl的连接缓冲液(30mM pH7.8 Tris-Cl、10mM MgCl₂、10mM DTT、0.5mMATP)中进行，该缓冲液包含5μl双链cDNA(反应试管#1和#2)、15个单位的T4连接酶(Promega)和30ng(试管#1)、40ng(试管#2)以及40ng(试管#3，载体背景对照)BstXI-Not I切割的pYES 2.0载体。连接反应通过在16℃下温育12小时，70℃下加热20分钟，并向每根试管加入10μl水完成。如描述的，把1μl每种连接混合物电穿孔进入40μl电感受态大肠杆菌DH10B细胞(Bethesda研究实验室)(Sambrook等，(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY)。利用最佳条件，在由库组成的大肠杆菌中，建立文库。每个库通过在37℃下温育24小时后，在LB+氨苄青霉素琼脂平板上涂布转化的大肠杆菌，且每板涂布15.000-30.000菌落制造。把20mlLB+氨苄青霉素加至这些平板，并把细胞悬浮在其中。把细胞悬浮液在37℃下在50ml的试管中摇动1小时。利用QIAGEN质粒试剂盒，按照制造厂商的指导，从细胞中分离质粒DNA，并把分离的质粒DNA在-20℃保存。

把来自每个库的1μl等分试样的纯化的质粒DNA(100ng/μl)，通过电穿孔法，转化进入酿酒酵母W3124((Becker和Guarante(1991)，酶学方法194：182-187)，并把转化体涂布在包含2％葡萄糖的SC琼脂板上，并在30℃下温育。

阳性克隆的鉴定：

温育3-5天后，这些SC琼脂平板是涂布在一系列SC+半乳糖琼脂平板上的复制品。把那些SC平板在30℃温育2-4天，并以在一种适合缓冲液中的包含1％苹果果胶DE 75％、1％HSB琼脂糖的果胶高嵌体凝胶覆盖，以检测溶果胶酶的活性。在30℃温育过夜后，把10-15ml的1％MTAB(混合烷基三甲基溴化铵)溶液注入高嵌体，1小时后除去。果胶甲基酯酶阳性菌落作为由一白晕轮围绕的菌落鉴定。

阳性克隆的特征化：阳性克隆作为单一菌落获得，cDNA插入序列利用生物素化多接头引物直接从酵母菌落扩增，利用磁珠(Dynabead M-280，Dynal)系统纯化，利用链终止法(桑格等，(1977)，美国国家科学院学报74：5463-5467)和测序酶系统(美国生物化学)，通过每种cDNA克隆5’末端的测序，使每种特征化。

在曲霉属中表达的cDNA基因的分离：

把产生果胶酯酶的酵母菌落接种进入50ml玻璃试管中的20ml YPD肉汤中。把试管在30℃下摇动2天。通过以3000rpm离心10分钟收获细胞。

按照WO 94/14953分离DNA，并把DNA溶解在50μl水中。通过标准方法，把DNA转化进入大肠杆菌。利用标准方法，把质粒DNA从大肠杆菌中分离，并通过限制酶分析，分析此质粒DNA。把cDNA插入序列利用适合的限制酶切断并连结进入曲霉属表达载体。

米曲霉或黑曲霉的转化

如在WO 95/02043，16页21行-17页12行中描述的，可制备原生质体，这些本文一并参考。

把100μl原生质体悬浮液与10μl STC(1.2M山梨醇、10mM pH＝7.5Tris-HCl、10mM CaCl₂)中5-25μg适合的DNA混合。把原生质体与p3SR2(携带构巢曲霉基因的质粒)混合。把混合物在室温下放置25分钟。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH 29576)、10mM CaCl₂和10mM pH7.5Tris-HCl，并小心地混合(两次)，最后加入0.85ml的相同溶液，并细心地混合。把混合物在室温下放置25分钟，以2500g旋转15分钟，并把沉淀重新悬浮在2ml 1.2M山梨醇中。又一次沉降后，把原生质体涂布在基本平板(Cove，生物化学生物物理学报 113(1966)51-56)上，该平板包含1.0M pH7.0蔗糖、作为氮源的10mM乙酰胺，并包含20mM CsCl以抑制背景生长。在37℃下温育4-7天后，挑选孢子，并把它作为单一菌落涂布。重复此过程，并把第二次再分离后的单一菌落的孢子作为指定的转化体保藏。

米曲霉转化体的检验

把每种转化体在10ml的YPM(参见以下)中接种，并繁殖。在30℃下温育2-5天后，除去上清液。果胶酯酶活性通过把10μl上清液施用于在包含1％苹果果胶DE 75％的琼脂糖凝胶中打开的直径4mm的孔，如上所述，在30℃温育过夜，并用MTAB沉淀鉴定。然后，果胶酯酶活性由一白晕轮鉴定。

分批进料发酵

发酵以作为碳源的麦芽糖糊精、作为氮源的尿素和酵母提取物分批进料的方法进行。整个过程中，使pH保持在7.0，温度保持在34℃。发酵后，通过离心和细菌过滤回收果胶酯酶。

酶的纯化

来自米曲霉的重组果胶酯酶纯化如下：培养5天后，收获培养物上清液，并离心，细菌过滤，及在3kDa截止的Filtron盒(Minisette)上超滤至最小量。把25ml超滤液以50mM H₃BO₃、5mM DMG、1mM CaCl₂pH7.0透析，并施用于40ml以相同缓冲液预平衡的Q-琼脂糖凝胶FF柱(Pharmacia，瑞典)。洗涤此柱后，把结合的蛋白质以线型NaCl梯度(从0-0.5M NaCl)洗脱。通过如上述的苹果果胶测定，分析柱上组分的果胶酯酶活性。大多数果胶酯酶活性在进行过程中看见，而大多数蛋白质结合至柱上。

进行过程中的pH以CH₃COOH调整到pH4.5，并施用于以25mMCH₃COOH/NaOH pH4.5平衡的50ml S-琼脂糖凝胶HP柱(Pharmacia，瑞典)。洗涤柱后，结合的蛋白质以线型NaCl梯度(从0至0.25M NaCl)洗脱。分析柱上组分的果胶酯酶活性。果胶酯酶活性的主要部分在一个峰中洗脱，集中峰组分。

把硫酸铵(AMS)加至库至最后1.6M的AMS浓度，并把酶加至以100mM H₃BO₃、10mM DMG、2mM CaCl₂、1.6M pH7.0平衡的40ml苯基Toyopearl柱。洗涤柱后，把结合的蛋白质以线型AMS梯度(从1.6至0M AMS)洗脱。洗脱果胶酯酶峰的缓冲液通过在以25mMCH₃COOH/NaOH pH4.5平衡的1.4L G25葡聚糖凝胶柱上的穿过交换为25mM CH₃COOH/NaOH pH4.5。

把果胶酯酶施用于以25mM CH₃COOH/NaOH pH4.5平衡的50ml S-葡聚糖凝胶HP柱。洗涤柱后，结合的蛋白质以线型NaCl梯度(从0至0.1M NaCl)洗脱。具有果胶酯酶活性的组分通过SDS-PAGE分析。该组分仅仅包含一个带。

电泳

SDS-PAGE电泳在作为Laemli方法(Laemmli(1970)自然227：680-685)的改进形式的Mini-Leak 4电泳装置(Kem-En-Tec，丹麦)中完成。把凝胶按照制造厂商的指导进行考马斯染色。

SEQ ID No：1中显示的DNA序列的分离：

编码本发明的果胶酯酶的SEQ ID NO1中所显示的DNA序列的果胶酯酶编码部分可按本领域已知的方法(Sambrook等，(1989)，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY)通过抽提质粒DNA，得自保藏的生物大肠杆菌DSM 10357。

杂交

用于测定核苷酸探针与本发明的“类似的”DNA序列之间杂交的合适的杂交条件可如下述的规定。将利用的寡核苷酸探针是与SEQ ID NO：1中显示的DNA序列的果胶酯酶编码部分对应的DNA序列，即SEQ IDNO：1的核苷酸4-933。

杂交条件

杂交条件参见本文，以定义如在本发明的第一个方面b)部分限定的类似的DNA序列，其中，该类似的DNA序列与SEQ ID NO：1中显示的DNA序列的果胶酯酶编码部分(即，核苷酸4-933)如以下详述的，在至少严格性低的条件，但优选地在严格性中等或高的条件下杂交。

用于测定核苷酸和同源DNA或RNA序列在低、中等或高严格性条件下杂交的合适的实验条件包括：使包含DNA片段或RNA的滤膜预先浸水以在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)杂交10分钟，及在5×SSC、5×Denhardt溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理的鲑精DNA(Sambrook等，1989)预杂交滤膜，接着在包含10ng/ml浓度的随机引物(Feinberg，A.p.和Vogelstein，B.(1983)生物化学年评132：6-13)、以32p-dCTP标记的(比活性＞1×10⁹cpm/μg)探针的相同溶液中在大约45℃杂交12小时。然后，把滤膜以2×SSC、0.5％SDS在至少55℃(严格性差)，更优选地至少60℃(中等严格性)，更优选地至少65℃(中等/高严格性)，更优选地至少70℃(高严格性)，更优选地至少75℃(十分高的严格性)下洗涤两次达30分钟。

在这些条件下与寡核苷酸探针杂交的分子利用X-射线胶片检测。

免疫交叉反应性：用于测定免疫交叉反应性的抗体可通过利用纯化的果胶酯酶制备。更具体地说，抗本发明的果胶酯酶的抗血清可按照由N.Axelsen等，在定量免疫电泳手册，Blackwell科学出版社，1973，第23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，实用免疫化学，Blackwell科学出版社，1982(更具体地说，p.27-31)描述的方法通过免疫兔(或其它啮齿动物)产生。纯化的免疫球蛋白可获自抗血清，例如，可通过盐沉淀((NH₄)₂SO₄)，接着进行透析和离子交换层析(例如，在DEAE-Sephadex(交联葡聚糖凝胶)上进行)获得。蛋白质的免疫化学特征化可通过Outcherlony双扩散分析(O.Ouchterlony在：实验免疫学手册(D.M.Weir，编者)，Blackwell科学出版社，1967，pp.655-706)或通过交叉免疫电泳(N.Axelsen等，同上，第3和4章)或通过火箭免疫电泳(N.Axelsen等，第2章)进行。

培养基

YPD：10g酵母提取物、20g蛋白胨、加水至900ml，高压灭菌，加入100ml 20％的葡萄糖(无菌过滤)。

YPM：10g酵母提取物、20g蛋白胨、加水至900ml，高压灭菌，加入100ml 20％的麦芽糖糊精(无菌过滤)。

10×基础盐：75g酵母含氮碱基、113g琥珀酸、68g NaOH、加水至1000ml，然后，无菌过滤。

SC-URA：100ml 10×基础盐、28ml不含维生素的20％酪蛋白氨基酸、10ml 1％色氨酸、加水至900ml，高压灭菌，加入3.6ml 5％的苏氨酸和100ml 20％的葡萄糖或20％的半乳糖。

SC-琼脂：加入SC-URA、20g/l琼脂。

PEG 4000(聚乙二醇，分子量＝4,000)(BDH，英国)

1％苹果果胶DE 75％(Herbstreith，德国)

1％HSB琼脂糖(FMC Litex A/S，丹麦)

MTAB(混合的烷基三甲基溴化铵)(Sigma)

实施例

实施例1

来自Meripilus giganteus CBS 521.95的果胶酯酶的克隆和表达

把mRNA从在包含纤维素的发酵培养基中生长的Meripilus giganteusCBS No.521.95中以搅拌分离以确保充分通气。生长3-5天后，收获菌丝体，把它立即在液氮中冷冻，并在-80℃保存。如所述的，以1％的载体背景，在大肠杆菌中构建来自M.giganteus CBS No.521.95且由大约10⁶单个克隆组成的文库。把来自某些库的质粒DNA转化进入酵母，包含250-400个酵母菌落的50-100个平板得自每个库。

果胶酯酶阳性菌落在SC-琼脂平板上通过苹果果胶测定鉴定和分离。cDNA插入序列直接从酵母菌落扩增，并如以上材料和方法部分中所述的特征化。编码果胶酯酶的cDNA的DNA序列在SEQ ID NO.1中显示，对应的氨基酸序列在SEQ ID NO.2中显示。SEQ ID NO.1中的从No.4至No.933的DNA核苷酸限定果胶酯酶的编码区域。

cDNA可得自DSM 10357中的质粒。

把全部DNA从酵母菌落中分离，如上述，通过大肠杆菌的转化拯救质粒DNA。为在曲霉属中表达果胶酯酶，把DNA以适当的限制酶消化，在凝胶上进行大小分馏，并纯化与果胶酯酶基因对应的片段。其后，把该基因连接到pHD414，以适当的限制酶消化，产生质粒pA2PE18。

在大肠杆菌中扩增DNA后，如上述，把该质粒转化进入米曲霉。

米曲霉转化体的检验

如上述，检验每种转化体的酶活性。某些转化体具有果胶酯酶活性，且该酶活性比米曲霉背景显著的大。这表明果胶酯酶在米曲霉中充分表达。

实施例2

与公开的果胶酯酶的同源性

同源性检索以本发明的果胶酯酶与核苷酸和蛋白质数据库对照完成。同源性检索表明：最相关的果胶酯酶是来自棘孢曲霉的果胶酯酶和来自Aspergillus tubigensis(以前所说的来自黑曲霉)的果胶酯酶。

按照“发明详述”中描述的方法，本发明的果胶酯酶与大多数现有技术果胶酯酶的DNA同源性，利用计算机程序GAP测定。本发明的果胶酯酶与来自棘孢曲霉的果胶酯酶仅有54％的DNA同源性(WO 94/25575)，本发明的果胶酯酶与来自Aspergillus tubigensis的果胶酯酶仅有56％的DNA同源性(Khanh等，(1990)，“从黑曲霉菌株RH5344分离的果胶酯酶cDNA的核苷酸及衍生的氨基酸的序列”，核酸研究18：4262；Khanh等，(1991)，“编码基因组果胶甲基酯酶的基因在黑曲霉中的特征化和表达”，基因106：71-77)。

按照“发明详述”中描述的方法，本发明的果胶酯酶与大多数现有技术果胶酯酶的DNA同源性，利用计算机程序GAP测定。本发明的果胶酯酶与来自棘孢曲霉的果胶酯酶仅有47％的多肽同源性，本发明的果胶酯酶与来自Aspergillus tubigensis的果胶酯酶仅有44％的多肽同源性。

这表明：本发明的果胶酯酶确实与任何已知的果胶酯酶关系远。

实施例3

本发明的重组果胶酯酶的纯化和特征化

如以上材料和方法中描述的，果胶酯酶是通过表达该酶的米曲霉的分批加料发酵产生的。

重组果胶酯酶用材料和方法部分中所描述的方法纯化和特征化。酶的分子量通过SDS-PAGE测定达37kDa。

实施例4

草莓果酱的原位胶凝作用

作为胶凝作用性质指示物的游离甲醇

材料和方法：

果胶酯酶批PPJ 4300，423PEU/g

果胶酯酶：Meripulus giganteus，2,4PEU/g

冷冻的草莓种类：Senga sengana

果胶酯酶活性以果胶酯酶单位(PEU)给出，其中，果胶酯酶单位(PEU)定义为：在标准条件下，每分钟释放1毫摩尔羧基基团的酶量(NovoNordisk测定ABT-SM-0005.02.1，可向Novo Nordisk A/S索取)。

果酱制备

果酱的制备按照用于果酱制备的标准方法(Novo Nordisk标准操作方法，ABF-SP-4002.02/01，可向Novo Nordisk A/S索取)进行。

制备300g一份的果酱。草莓和食糖的比例是：180g草莓+120g食糖。初始预蒸煮后，把水果泥分成2×3-50g的部分，把样品冷却到40℃，并如下加入酶：

1)不加酶的对照

2)PE，PPJ 4300，10PEU/kg水果

3)PE，Meripulus giganteus，10PEU/kg水果

密封样品，允许放置1小时，然后，把样品在90℃下热处理3分钟以灭活酶。

在本试验中，游离甲醇的量化在Alfred Jφrgensens实验室，A/S，哥本哈根进行。开始，蒸馏样品，然后与质谱检测结合利用具有毛细管的气相色谱仪分析。

结果和讨论：

结果在下表1显示：

表1 甲醇形成

甲醇，ppm

对照 12ppm

PE，PPJ 4300 200ppm

10PEU/kg水果

PE，M.gig. 340ppm

10PEU/kg水果

此表清楚的表明：来自Meripulus giganteus的果胶酯酶产生340ppm游离甲醇，此果胶酯酶优于更传统的曲霉属衍生的PE，该PE导致200ppm的游离甲醇形成。

如果草莓的果胶含量估计为0.6％，酯化度(DE)估计为70％，可以计算，传统PE产物的最终DE为52，而Meripulus giganteus-PE的DE为38。

酯化度对原位胶凝的果酱的质地特征具有重要性，对其它PE修饰的蔬菜产品也是重要的。酯化度决定可形成的Ca-桥的数量，因此，与凝胶强度有关，或与某种产物的粘度有关。

因此，明显的是：Meripulus giganteus衍生的酶在构造强而有用的凝胶中是一个有用的工具。这种酶也可能作为一种比传统的曲霉属衍生的PE产物对提取的果胶的化学修饰更强的替代品。

序列表

SEQ ID No.1显示了包含在转化进保藏的大肠杆菌DSM 10357中的DNA构建体中的全长cDNA序列的DNA序列。

序列表

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1128个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：cDNA

(vi)原始来源：

(A)有机体：Meripilus giganteus

(B)菌株：CBS 521.95

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：4..933

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

AGA ATG CAG TCC CAC TTG TTC TTG CTG TTC TCT TAC CTC ATC GCC TGT 48

Met Gln Ser His Leu Phe Leu Leu Phe Ser Tyr Leu Ile Ala Cys

1 5 10 15

GCG TCT GCG CTC AGC AGT CCG CCT GCA GGC GCA ATC ACC GTC GGC TCC 96

Ala Ser Ala Leu Ser Ser Pro Pro Ala Gly Ala Ile Thr Val Gly Ser

20 25 30

GGT GGC AAG TAT TCA ACG TTG TCC GCA GCC CTC AAG GAC ACG TCG AGC 144

Gly Gly Lys Tyr Ser Thr Leu Ser Ala Ala Leu Lys Asp Thr Ser Ser

35 40 45

TCC GTC TAC TTC GTG TTC TCC GGG ACA TAC ACG GAC ACC GCG ATT ATT 192

Ser Val Tyr Phe Val Phe Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Thr Ala Ile Ile

50 55 60

ACT CGG CCG AAC GTG AAG GTG TAC GGG CAG ACG AAC ACA CCG TCG TCC 240

Thr Arg Pro Asl Val Lys Val Tyr Gly Gln Thr Asn Thr Pro Ser Ser

65 70 75

TAT ACC GGC AAT ACT GTC ACC ATC ACC AAT AAC ATT CCG GCC TCC AAG 288

Tyr Thr Gly Asn Thr Val Thr Ile Thr Asr Asr Ile Pro Ala Ser Lys

80 85 90 95

GCG GGC TCC AAT GAT GCG AGC GGG ACG GTG CAA GTG CAC GCC GAG AAC 336

Ala Gly Ser Asr Asp Ala Ser Gly Thr Val Gln Val His Ala Glu Asn

100 105 110

GTG TCA CTC TAC AAC CTA AAC ATC GCG AAC ACG TAC GGC AAG ACA GTC 384

Val Ser Leu Tyr Asn Leu Asn Ile Ala Asr Thr Tyr Gly Lys Thr Val

115 120 125

GAC CAG GCG CAA GCG ATC GCA CTG AGC GTG CAG GCG GGC CAG TTC GGC 432

Asp Gln Ala Gln Ala Ile Ala Leu Ser Val Gln Ala Gly Gln Phe Gly

130 135 140

GCA TAC GGA CTC AAG ATT ACG GGG GAC CAG GAC ACC CTC CTA GCT AAC 480

Ala Tyr Gly Leu Lys Ile Thr Gly Asp Gln Asp Thr Leu Leu Ala Asn

145 150 155

GTC GGC GCG CAA TAC TAT GCG AAC AGC TGG ATA GAA GGC GCT GTG GAC 528

Val Gly Ala Gln Tyr Tyr Ala Asn Ser Trp Ile Glu Gly Ala Val Asp

160 165 170 175

TTC ATA TTC GGG ATG CAA GCC TCG ATC TGG ATC ACC CGC TCG GTC ATC 576

Phe Ile Phe Gly Met Gln Ala Ser Ile Trp Ile Thr Arg Ser Val Ile

180 185 190

AAC ACG ATC GGG AGC GGG TGC ATC ACC GCG TCG GGG CGC TCG AGT AAC 624

Asn Thr Ile Gly Ser Gly Cys Ile Thr Ala Ser Gly Arg Ser Ser Asn

195 200 205

GAC GGC TTC TGG TAT GTC ATC GAC AGC TCG ACC GTG CAG GGC ACC GGG 672

Asp Gly Phe Trp Tyr Val Ile Asp Ser Ser Thr Val Gln Gly Thr Gly

210 215 220

ACG GCG TAC CTC GGG CGC CCC TGG CGC GAC TAC GCG CGC GTC GTG TTC 720

Thr Ala Tyr Leu Gly Arg Pro Trp Arg Asp Tyr Ala Arg Val Val Phe

225 230 235

CAG AAG AGC ACG CTC GGG AGC AAC GTG CCC GCG GCC GGC TGG TCG ATT 768

Gln Lys Ser Thr Leu Gly Ser Asr Val pro Ala Ala Gly Trp Ser Ile

240 245 250 255

TGG AAC GTC GGC ACC CCG CAG ACC GAC CAT GTC ACG TTC GCC GAG TAC 816

Trp Asr Val Gly Thr Pro Gln Thr Asp His Val Thr Phe Ala Glu Tyr

260 265 270

GGG AAC ACC GGC CCC GGC GCG TCC GGC ACG CGC GCG AGC TTC AGC ACG 864

Gly Asn Thr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Thr Arg Ala Ser Phe Ser Thr

275 280 285

AAG CTG TCC GCG CCG GTC GCG ATC AAG ACG GTG CTG AAC TCG ACG AGC 912

Lys Leu Ser Ala Pro Val Ala Ile Lys Thr Val Leu Asn Ser Thr Ser

290 295 300

TGG ATC GAC CCC GCC TTC CTC TGACCCCGCC GACGGCAACG ACAAACGAGA 963

Trp Ile Asp Pro Ala Phe Leu

305 310

GAGAGCGAGG GCAGCAGAGG GACGAGTGCC GAGTGCCGGT GCGGCTGAGG GCTATGACGT 1023

CGATCGATGG TCGGCTTGAC GTCGTTGTAC ACGTACGGAT GCAGTCATCG AACGTTCGGT 1083

TGCGACTTGC CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 1128

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：310个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Gln Ser His Leu Phe Leu Leu Phe Ser Tyr Leu Ile Ala Cys Ala

1 5 10 15

Ser Ala Leu Ser Ser Pro Pro Ala Gly Ala Ile Thr Val Gly Ser Gly

20 25 30

Gly Lys Tyr Ser Thr Leu Ser Ala Ala Leu Lys Asp Thr Ser Ser Ser

35 40 45

Val Tyr Phe Val Phe Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Thr Ala Ile Ile Thr

50 55 60

Arg Pro Asn Val Lys Val Tyr Gly Gln Thr Asn Thr Pro Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Thr Gly Asn Thr Val Thr Ile Thr Asn Asn Ile Pro Ala Ser Lys Ala

85 90 95

Gly Ser Asn Asp Ala Ser Gly Thr Val Gln Val His Ala Glu Asn Val

100 105 110

Ser Leu Tyr Asn Leu Asn Ile Ala Asn Thr Tyr Gly Lys Thr Val Asp

115 120 125

Gln Ala Gln Ala Ile Ala Leu Ser Val Gln Ala Gly Gln Phe Gly Ala

130 135 140

Tyr Gly Leu Lys Ile Thr Gly Asp Gln Asp Thr Leu Leu Ala Asn Val

145 150 155 160

Gly Ala Gln Tyr Tyr Ala Asn Ser Trp Ile Glu Gly Ala Val Asp Phe

165 170 175

Ile Phe Gly Met Gln Ala Ser Ile Trp Ile Thr Arg Ser Val Ile Asn

180 185 190

Thr Ile Gly Ser Gly Cys Ile Thr Ala Ser Gly Arg Ser Ser Asn Asp

195 200 205

Gly Phe Trp Tyr Val Ile Asp Ser Ser Thr Val Gln Gly Thr Gly Thr

210 215 220

Ala Tyr Leu Gly Arg Pro Trp Arg Asp Tyr Ala Arg Val Val Phe Gln

225 230 235 240

Lys Ser Thr Leu Gly Ser Asn Val Pro Ala Ala Gly Trp Ser Ile Trp

245 250 255

Asn Val Gly Thr Pro Gln Thr Asp His Val Thr Phe Ala Glu Tyr Gly

260 265 270

Asn Thr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Thr Arg Ala Ser Phe Ser Thr Lys

275 280 285

Leu Ser Ala Pro Val Ala Ile Lys Thr Val Leu Asn Ser Thr Ser Trp

290 295 300

Ile Asp Pro Ala Phe Leu

305 310

Claims

1.一种DNA构建体，该构建体包含编码显示果胶酯酶活性的酶的DNA序列，其中，此DNA序列包含：

a)克隆进存在于大肠杆菌DSM 10357中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的果胶酯酶编码部分，或SEQ ID NO：1中所示的DNA序列的果胶酯酶编码部分；或

b)a)中限定的DNA序列的类似序列，该序列与SEQ ID NO：1中位置4-933中显示的DNA序列在高度严格性下杂交。

2.按照权利要求1的DNA构建体，其中所说的DNA序列可得自担子菌纲的菌株。

3.按照权利要求1的DNA构建体，其中所说的DNA序列可得自层菌纲的菌株。

4.按照权利要求1的DNA构建体，其中所说的DNA序列可得自非褶菌目的菌株。

5.按照权利要求4的DNA构建体，其中所说的DNA序列可得自多孔菌科的菌株。

6.按照权利要求5的DNA构建体，其中所说的DNA序列可得自Meripilus属的菌株。

7.按照权利要求6的DNA构建体，其中所说的DNA序列可得自Meripilus giganteus的菌株。

8.按照权利要求7的DNA构建体，其中所说的DNA序列从菌株Meripilus giganteus CBS 521.95的DNA文库分离或基于它产生的。

9.按照权利要求1的DNA构建体，其中所说的DNA序列是从大肠杆菌DSM 10357中分离的。

10.一种重组表达载体，该载体包含按照权利要求1-9之任一的DNA构建体。

11.一种细胞，该细胞包含按照权利要求1-9之任一的DNA构建体或按照权利要求10的重组表达载体。

12.按照权利要求11的细胞，此细胞是真核细胞。

13.按照权利要求12的细胞，此细胞是真菌细胞。

14.按照权利要求13的细胞，此细胞是酵母细胞或丝状真菌细胞。

15.按照权利要求13的细胞，该细胞是镰孢属或曲霉属或木霉属的菌株。

16.按照权利要求15的细胞，此细胞是禾谷镰孢、樱桃镰孢(Fusariumcerealis)、黑曲霉、米曲霉、Trichoderma harzianum或Trichoderma reesei的菌株。

17.按照权利要求12的细胞，该细胞是Meripilus sp.的菌株。

18.按照权利要求17的细胞，此细胞是Meripilus giganteus的菌株。

19.按照权利要求18的细胞，该细胞是菌株Meripilus giganteus CBSNo.521.95。

20.按照权利要求14的细胞，该细胞是酵母属的菌株。

21.按照权利要求20的细胞，此细胞是酿酒酵母的菌株。

22.一种产生显示果胶酯酶活性的酶的方法，此方法包括：在允许该酶产生的条件下，培养按照权利要求11-21之任一的细胞，并从培养物回收该酶。

23.一种显示果胶酯酶活性的酶，此酶由按照权利要求1-9之任一的DNA构建体或按照权利要求10的重组表达载体编码。

24.按照权利要求23的酶，此酶具有氨基酸序列SEQ ID NO：2。

25.一种组合物，该组合物包含按照权利要求23或24的酶。

26.一种酶组合物，该组合物富含按照权利要求23或24的显示果胶酯酶活性的酶。

27.按照权利要求25-26之任一的组合物，此组合物还包含α-阿拉伯糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖醛酸苷酶、β-木糖苷酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、阿聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、果胶乙酰酯酶、半乳聚糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂合酶、果胶酸酯裂合酶或果胶甲基酯酶。

28.按照权利要求23或24的酶或按照权利要求25-27之任一的酶组合物在改进包含果胶物质的硬度上的用途。

29.按照权利要求23或24的酶或按照权利要求25-27之任一的酶组合物在增加包含果胶物质的粘度上的用途。

30.按照权利要求28或29的用途，其中包含果胶的物质是水果或蔬菜物质。

31.按照权利要求23或24的酶或按照任何权利要求25-27之任一的酶组合物在果胶的脱甲基化上的用途。

32.按照权利要求23或24的酶或按照利要求25-27之任一的酶组合物在饲料制备中的用途。

33.按照权利要求23或24的酶的用途，该酶与包含聚半乳糖醛酸酶的酶制剂结合用于降低植物细胞壁来源的物质的粘度。

34.按照任何权利要求23或24的酶或按照权利要求25-27之任一的酶组合物在酒或汁的生产中的用途。

35.大肠杆菌DSM 10357。

36.Meripilus giganteus CBS 521.95。