CN1137291A - 饮料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有蛋白质和/或肽的饮料，其特征在于它含有各类LTP和/或本文所限定的同源物和/或可以谷类LTP和/或同源物经加热，煮沸和/或糖化于pH在3和7之间的水中的谷类LTP和/或同源物获得的修饰的谷类LTP片段。本发明还涉及其制备方法和泡沫形成添加剂的使用。

Description

饮料及其制备方法
本发明涉及泡沫饮料(如啤酒)，生产泡沫饮料的方法和泡沫形成添加剂的应用。
饮料在日常生活中起着重要作用，它不仅作为一种必需的液体和营养供应，而且作为一种兴奋剂。除了口味外，对于高质量的饮料而言，结构特征(如粘度)和泡沫特征也很重要。
现在，在市场上可买到许多泡沫饮料，例如，啤酒、牛奶冰淇淋和一些软饮料。然而，仍需要新的泡沫饮料以及需要改进已知泡沫饮料的品质。
为研究和分离啤酒中的泡沫形成剂和为改进啤酒的泡沫特征已做出了许多努力。
啤酒的泡沫特征受其蛋白质含量的影响(在典型的啤酒中蛋白质含量为大约3-4mg/ml)且不含脂类和清洁剂残余物可能有损于啤酒泡沫稳定性，人们了解这些事实已50多年。
为了澄清啤酒中的蛋白质含量是否与泡沫稳定性有关已做了许多研究(参考文献1，2，4，17)，但对这一问题没有产生明确的答案。有人认为啤酒中蛋白质的一些分子量级别对泡沫较重要(参考文献2，11，20)。
啤酒蛋白质的分子量范围从小多肽到超过150,000道尔顿。而且发现分子量高达大约100,000道尔顿的啤酒蛋白质对啤酒泡沫的稳定性具有正影响，而小多肽，特别是分子量低于5，000道尔顿的多肽被认为对泡沫具有负影响(6，19)。另外，Sharpe等(15)的研究认为啤酒的泡沫稳定性与高、低分子量多肽的比率有关。关于特定蛋白质的重要性，Yokoi等(参考文献20)认为蛋白质Z(40,000道尔顿的大麦胚乳)在泡沫稳定性中充当最重要的角色。这与Hollemans和Tomies(参考文献11)的结果相反，Hollemans和Tomies显示经特异性固相抗体从啤酒中完全和选择性地去掉该蛋白质仅对泡沫稳定性产生微弱的影响。
在啤酒泡沫中还发现浓缩了来自酵母且主要具有碳水化合物特征的高分子量成份(参考文献10。12)。
上述大多数结论是从分级分离啤酒蛋白质并测定不同部分产生稳定泡沫的能力而获得的。没有在研究中采取任何步骤改进啤酒泡沫的质量。
讨论泡沫质量时，有两个重要参数，即形成泡沫的能力和稳定泡沫的能力。
令人惊奇的是现在发现了一组特定的蛋白质(命名为谷类LTP)具有在饮料中形成泡沫的能力。
因此，本发明涉及一种含有蛋白质和/或肽的饮料，其特征在于它具有权利要求1的特征。
谷类LTP指来自谷类，分类为脂类转移蛋白质的蛋白质或肽。表I显示了一些这种谷类LTP和其它植物LTP的序列。Molina等进一步描述了这些蛋白质(参考文献13)。
同源物是指具有50-110氨基酸，特别是80-100个氨基酸且与谷类LTP至少30％，优选60％，最佳为80％或更多序列同源的蛋白质。
结构关系特别重要。因此优选的是同源蛋白质包含至少6个半胱氨酸残基，优选8个半胱氨酸残基以形成3或4个二硫键。
优选的同源蛋白质是TLTP，SLTP，CLTP，CB-A，CB-B和CB-C。
在本发明中优选谷类种子LTP。
特别优选的谷类LTP是来自大麦种子的大麦LTP，表I中命名为BLTP，在实施例中命名为LTP1。
BLTP是碱性蛋白质，在大麦种子糊粉层中较丰富(参考文献14，16)。其分子量为9.694道尔顿，包含91个氨基酸残基，其中包括8个半胱氨酸(参考文献18)。已测定了其氨基酸序列(参考文献18)。已克隆并测定了其cDNA的核苷酸序列(参考文献14)。
在本发明下面的描述中，术语谷类LTP或其亚组(如大麦LTP)也指上面定义的与所述LTP组具有序列同源性的同源物。而且，术语谷类LTP或其亚组还指可以所述LTP或其同源物经加热，煮沸和/或糖化LTP获得的修饰的谷类LTP片段。优选的是，谷类LTP未完全变性，即由于半胱氨酸形成二硫键的能力而存在一些结构。
当对谷类LTP进行下文所述的，一般在啤酒酿造过程中进行的加热，煮沸和/或糖化步骤时，它基本上维持其全部一级序列，而二级和三级结构发生或多或少的改变，一些或全部二硫键可能重排。在酿造过程中，大麦LTP1的甲硫氨酸氨基酸通常被氧化。本发明的发明者还观察到LTP-二聚体和寡聚体形成，这很可能是经过存在于LTP中的一个或几个二硫键发生重排形成的，如下文所述，LTP也可与在煮沸步骤中存在的其它成份(例如：大麦醇溶蛋白片段，啤酒花和脂类)结合。
                        表I
            植物脂类转移蛋白质的氨基酸序列对比BLTP：-LNCGQVDSKMKPCLTYV--QGGPGPSGECCNGVRDLHNQAQSSGDRQTVCLC-LKGIARGIHNLNLNNAASIPSKCNVNVPYTISPDIDCSRIY(LTP1)WLTP：-IDCGHVDSLVRPCLSYV--QGGPGPSGQCCDGVKNLHNQARSQSDRQSACNC-LKGIARGIHNLNEDNARSIPPKCGVNLPYTISLNIDCSRVMLTP：ALSCGQVASAIAPCISYA-RGQGSGPSAGCCSGVRSLNNAARTTADRRAACNC-LKNAAAGVSGLNAGNAASIPSKCGVSIPYTISTSTDCSRVNRiLTP：-ITCGQVNSAVGPCLTYA-RG-GAGPSAACCSGVRSLKAAASTTADRRTACNC-LKNAARGIKGLNAGNAASIPSKCGVSVPYTISASIDCSRVSRaLTP：AISCGQVSSAIGPCLAYA-RGAGAAPSASCQSGVRSLNAAARTTADRRAACNCSLKSAASRVSGLNAGKASSIPGRCGVRLPYAISASIDCSRVNNCw18：AITCGQVSSALGPCAAYA-KGSGTSPSAGCCSGVKRLAGLARSTADKQATCRC-LKSVAGAY---NAGRAAGIPSRCGVSVPYTISASVDCSKIHCw21：AISCGQVSSALSPCISYA-RGNGAKPPAACCSGVKRLAGAAQSTADKQAACKC-IKSAAGGL---NAGKAAGIPSMCGVSVPYAISASVDCSKIRCB-A：-VDCGQVNSSLASCIPFL-TGGVASPSASCCAGVQNLKTLAPTSADRRAACEC-IKAAAARFPTIKQDAASSLPKKCGVDINIPISKTTNCQAINCB-B：-VNCGQVNKALSSCVPFL-TGFDTTPSLTCCAGVMLLKRLAPTVKDKRIACEC-VKTAAARYPNIREDAASSLPYKCGWINVPISKTTNCHEINCB-C：AVPCSTVDMKAAACVGFA-TGKDSKPSQACCTGLQQLAQTVKTVDDKKAICRC-LK-ASSKSLGIKDQFLSKIPAACNIKVGFPVSTNTNCETIHTLTP：ALTCGQVTAGLAPCLPYL-QGRGP--LGGCCGGVKNLLGSAKTTADRKTACTC-LKSAANAIKGIDLNKAAGIPSVCKVNIPYKISPSTDCSTVQSLTP：GITCGMVSSKLAPCIGYL-KGGP--LGGGCCGGIKALNAAAATTPDRKTACNC-LKSAANAIKGINYGKAAGLPGMCGVHIPYAISPSTNCNAVHCLTP：VLTCGQVTGALAPCLGYLSRQVNVPVPLTCCNVVRGLNNAARTTLDKRTACGC-LKQTANAVTGLNLNAAAGLPARCGVNIPYKISPTTDCNRVV为显示同源性而导入缺口(-)。BLTP指来自大麦种子的LTP。WLTP指来自小麦的LTP。MLTP指来自玉米的LTP。RILTP指来自稻谷的LTP。RaLTP指来自印度指粟(粗稷)的LTP。Cw18指来自大麦叶的LTP。Cw21指来自大麦叶的LTP。CB-A指来自蓖麻籽的LTP。CB-B指来自蓖麻籽的LTP。CB-C指来自蓖麻籽的LTP。TLTP指来自西红柿的LTP。SLTP指来自菠菜的LTP。CLTP指来自胡萝卜的LTP。
修饰的谷类LTP可优选经过将普通谷类LTP水溶液在50℃和95℃之间加热达3小时的一段时间或经过在大气压下煮沸达2小时和/或以在啤酒生产中的常规糖化步骤进行糖化来获得。
在下文中，术语“谷类  LTP”也指其同源物或修饰的谷类LTP及修饰的同源物，除非另有说明。
饮料可以是任何可饮用的液体，如牛奶型和水果型饮料及啤酒。
在已知的啤酒中以小量(即大约50mg/l)存在，而在权利要求1的背景技术中否认这点。
背景技术中已知的啤酒生产或酿造过程在文献(如Maltingand Brewing Science，volume I.D.E.Briggs，J.S.Hough，R.Stevens and T.W.Young.chapman and Hall.London(1981)和Volume II，J.S.Hough，D.E.Briggs，R.Stevens and T.W.Young.Chapman and Hall(1982))中进行了详细描述，在这些文献中描述了原料和加工方法的许多变化。一般来说，加工按步骤A)-D)进行：
A)原料的选择和制备
原料含有：水、碳水化合物和蛋白质(存在于谷类、如大麦、小麦、稻谷、玉米、高梁)；糖；糖浆，麦芽提取物；谷类(即大麦和小麦)发芽过程中或微生物生产过程中形成的酶；调味成份(烘烤的麦芽、啤酒花及其它植物材料或果汁)。
谷类原料可以是：发芽的；磨碎的；分离的(以产生具有特定口味和酶活性的成份)。
B)淀粉糖化和麦芽汁的生产：
包含：经过控制对制备的原料的浸泡(温度和时间)进行提取；煮沸并从不溶性物质中分离麦芽汁。
C)麦芽汁的发酵：
向冷却的且通气的麦芽汁中加入酵母悬液后开始发酵。在控制的温度条件下，酵母代谢(发酵)过程中将麦芽汁转变成啤酒，它含有酵母产生的某些成份，如乙醇和调味成份。这一步骤可经过该过程的参考来控制，这些参数是：温度、酵母剂量及酵母繁殖。
D)澄清和完成
贮存和成熟后，过滤剩余的酵母和蛋白质/丹宁沉淀，补充二氧化碳，颜料和其它矫正添加剂，如稳定剂和调味成份。
仅用发芽的大麦或发芽的小麦生产的啤酒比用添加剂酿造的啤酒产生潜力(形成泡沫的能力)更高和稳定性更好的泡沫。
对背景技术啤酒中谷类LTP含量的分析表明已知具有最高泡沫潜力的啤酒中谷类LTP浓度远低于300mg/l。
啤酒泡沫的质量取决于酿造过程和所用的原料。由于本发明基本上涉及原料，啤酒中谷类LTP的含量(接近原始重力)主要与根据EBC(欧洲酿酒会议)标准糖化方法制备的麦芽汁(也称混合麦芽汁)中的谷类LTP有关。对于未发芽的谷类，可使用相似的提取程序，如果必要，可包括加入常规水平的酿造酶活性。
在已知的用于生产啤酒的淡麦芽汁中存在的谷类LTP主要是LTP1或轻微修饰的LTP1。修饰的程度取决于制备它的方法。当根据EBC标准淀粉糖化方法制备混合麦芽汁时，使用抗未修饰LTP 1的抗体经ELISA测定大约90％的谷类LTP存在于混合麦芽汁中，ELISA根据标准程序按下文所述进行。
在已知啤酒中谷类LTP的浓度不超过X且远小于X1，其中X和X1分别指对原料使用EBC标准糖化方法产生混合麦芽汁酿造的啤酒中可得的相应于125μg/ml和150μg/ml的谷类LTP浓度水平。谷类LTP使用抗未修饰的LTP1抗体经ELISA测量。
术语“第一麦芽汁”指在糖化步骤后第一次过滤步骤中获得的麦芽汁。第一次过滤步骤是在洗涤滤饼之前的普通过滤。
术语“淡麦芽汁”指最终过滤步骤后(即用水洗涤滤饼之后)获得的麦芽汁。因此，淡麦芽汁是第一麦芽汁与洗涤水的混合物。
术语“混合麦芽汁”指根据EBC标准糖化方法制备的麦芽汁。
术语“麦芽汁”指糖化，过滤和煮沸后的最终麦芽汁。
首先，在啤酒中可发现存在于麦芽汁中的全部谷类LTP，其中1ml麦芽汁一般产生大约1到2ml啤酒。
这意味着具有125μg/ml谷类LTP浓度的麦芽汁可产生高达125μg/ml谷类LTP浓度的啤酒。
EBC标准糖化方法的详细描述见“ANALYTICA-EBC”，第四版1987年，第E59页，瑞士CH-8047 Zurich，Branerei undGetranke-Rundschau出版。
本发明的饮料优选包含至少25μg/ml谷类LTP，而最佳谷类LTP且特别是谷类种子LTP的浓度是100μg/ml或更多。
谷类LTP可用其序列结构来识别。
可经过使用对谷类LTP的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定谷类LTP的浓度。这种谷类LTP ELISA在市场上不能买到，但可按照包含下列步骤的标准技术进行生产：
a)经免疫动物，获得血清和纯化抗体来生产抗谷类-LTP的抗体，
b)生物素标记抗体，
c)以涉及可被诸如分光光度计测量之成份的竞争ELISA程序的方法制备LTD标准曲线。
象这样的ELSA方法是本领域的技术人员公知的，且是目前用于测量生物活性成份最常用的方法之一。
关于ELISA试验的一般资料可见参考文献23。
优选的是本发明的饮料还含有大麦醇溶蛋白，谷蛋白，其它白蛋白(如可从啤酒中获得的蛋白质Z)和/或啤酒花成份(如啤酒花异α-酸和其它啤酒花苦味树脂)。这些成份具有泡沫稳定效应和与谷类LTP协同的泡沫形成效应。
该饮料还可含有碳水化合物，脂类和/或脂肪酸。这些成份改善了饮料的口味和稠度。
如果一起煮沸时，一些上述成份(例如大麦醇溶蛋白，啤酒花和脂类可与LTP结合。经过与啤酒花成份和/或甘油三酯煮沸修饰的谷类LTP的泡沫特征得到改善。
该饮料还可含少量的其它成份，如：稳定剂(藻酸、藻酸盐、角叉藻聚糖、甘油酯、阿拉伯胶、果胶)人工增甜剂、调味剂，着色剂，维生素，矿物质，保存剂，起泡剂，抗氧化剂和酶，特别是蛋白质降解酶和碳水化合物降解酶。
当本发明的饮料是啤酒时，谷类LTP含量占总蛋白质含量的百分数优选大于5％(重量)，特别是大于10％(重量)，优选大于15％。以相应于未修饰的谷类LTP量的重量来计算修饰的谷类LTP重量，即不包括结合到谷类LTP上的其它成份重量。
本发明还包含制备含蛋白质和/或肽的饮料的方法。该方法的特征在于具有权利要求11的特征。
在其至少部分可溶的前提下可加入任意形式的谷类LTP。
实际上可加入磨碎或压碎形式的谷类材料或提取物形式的谷类材料。
可以任意方式获得这种提取物，例如经煮沸和/或糖化液体中的谷类或谷类材料，如果需要，经过滤并选择性分级分离滤液来纯化。该液体还可优选含啤酒花和/或脂类，特别是甘油三酯。也可以干燥提取物，例如经冻干或喷雾干燥。
例如可按下文实施例所述从啤酒中以修饰的形式得到谷类LTP。
谷类LTP也可从微生物，例如在基因组中含有编码谷类LTP之DNA序列的酵母，真菌或细菌获得。由于已知许多编码谷类LTP的DNA序列，使用已知的技术本领域的技术人员可将该DNA序列插入细菌，酵母或真菌的基因组中。例如，酵母可以是卡尔酵母或酿酒酵母。
例如可用饮料中生产谷类LTP的微生物在发酵步骤中生产谷类LTP。
如果饮料不发酵，优选以纯化的可溶性提取取物的形式加入谷类LTP。
实际上也可向发酵饮料中以纯化的可溶性提取物形式加入谷类LTP，但由于发酵饮料的生产一般包含过滤步骤，因此不需要纯化谷类LTP提取物。
可以在任何生产步骤中加入谷类LTP，全部同时加入或连续或不连续地逐渐加入。
当饮料是啤酒时，谷类LTP可在(例如)以谷类种子(提炼谷类种子时具有高含量的LTP)制备麦芽的制备麦芽或麦芽提取物步骤中加入例如可经过使用遗传传递来加入。
谷类LTP也可在制备麦芽汁期间加入，例如以磨碎或压碎的谷类材料，特别是磨碎的种子的形式在糖化步骤前加入。
本发明还包括谷类LTP作为饮料的泡沫形成添加剂的应用。该用途在权利要求18中要求。
当根据本发明使用谷类LTP时，可优选与包括蛋白质的其它成份结合，但优选谷类LTP占总蛋白质含量重量的至少15％，最优选25％。修饰的谷类LTP重量以相应的未修饰的谷类LTP重量来计算，即，不包括结合到谷类LTP上的其它成份的重量。
在下面实施例中将进一步描述本发明。
图1显示了硼硅酸盐玻璃制成的1.65l啤酒的泡沫塔。
图2显示了用50mM乙酸铵，PH4.5平衡的Sephadex G-75(5cm×87cm，1700ml)上对窖藏啤酒第三次浮选的萎缩泡沫进行的凝胶过滤。
图3显示了在泡沫试验中泡沫潜力对LMW浓度的依赖性。
图4显示了在含0.3mg/ml LMW的水中泡沫半衰期对HMW浓度的依赖性。
图5显示了A)HMW，LMW和大麦LTP1的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。(20％均匀凝胶。Phastsystem，考马斯蓝R350染色)。M1和M2是分子量标记物。B)使用抗大麦LTP1的特异性抗体对HMW，LMW和大麦LTP1的Western印迹。
图6显示了在用20mM乙酸钠PH 4.9
平衡的S-Sepharose Fast Flow(5×7cm，135ml)上对LMW的离子交换色谱，---Nall梯度；-在280nM下的吸光值。
图7显示了对含有合并液I，合并液III或LTP1浓度递增的蒸馏水进行泡沫试验时获得的泡沫潜力。从氨基酸分析计算溶解的蛋白质浓度。
图8显示了对含有合并液I，合并液III或LTP1浓度递增的啤酒进行泡沫试验时获得的泡沫潜力。从氨基酸分析计算溶解的蛋白质浓度。
图9显示了对仅含大麦LTP1浓度递增的水溶液或在0.4mg/ml合并液I存在的条件下进行泡沫试验时获得的泡沫潜力。从氨基酸分析计算溶解的蛋白质浓度。
图10显示了对仅含合并液III浓度递增的水溶液或在0.4mg/ml合并液I存在的条件下进行泡沫试验时获得的泡沫潜力。从氨基酸分析计算溶解的蛋白质浓度。
图11显示了在用20nM NaAc，0.1M Nacl，PH 4.9平衡的Sephadex G-50上对窖藏啤酒第三次浮选分离的合并液III进行的凝胶过滤。
图12A和12B分别显示了大麦种子LTP1和啤酒泡沫LTP1的1H NMR谱。
麦芽的生产
在下面实施例中使用的麦芽以窖藏麦芽(需光麦芽)的形式生产。
使用EBC标准糖化方法生产混合麦芽汁：
磨碎：
经研磨磨碎55g麦芽并将50g面粉转移到糖化烧杯中。
在盘间距为0.2mm的Buhler-Miag园盘磨上进行磨碎过程。
糖化：
糖化水浴调到大约45℃。
边用玻璃棒搅拌边向烧杯中注入温度为大约46℃的200ml蒸馏水并避免结块。确保麦芽汁的温度刚好为45℃，
将烧杯立即放入糖化水溶中并让搅拌器转动。在麦芽汁中将温度维持在45℃刚好30分钟。
然后在25分钟内每隔1分钟将麦芽汁的温度升高1℃。
当温度达到70℃时，再加入100ml70℃的蒸馏水。将温度维持在70℃1小时。在10-15分钟内将麦芽汁冷却到室温。用少量蒸馏水洗涤搅拌器，干燥烧杯外表面，经加入蒸馏水将烧杯内容物调到450.0g。
过滤：
用玻璃棒彻底搅拌烧杯内容物并立即完全倒在滤纸上。
将开始100ml滤液返回到漏斗中。
在2小时后滤饼似乎干燥时或在缓慢过滤的情况下终止过滤。
分析程序：
大麦LTP1的鉴定(Western印迹)
与10mM二硫苏糖醇煮沸15分钟后用Pharmacia Phast-System和20％均匀凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在Phast-System装置上70℃印迹到硝化纤维素上30分钟。用水洗涤后，将硝化纤维素与小牛血清保温30分钟以封闭非特异性的结合，然后与特异性LTP 1抗体(按实施例8所述制备)保温过夜。用Promega Western印迹AP系统(目录号W3930)检测特异性抗体结合。氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐的混合物用作碱性磷酸酶的显色底物。
(N-末端氨基酸测序)
在Applied biosystems 470 A型气相序列仪上使用该公司提供的程序进行N-末端氨基酸测序。使用Applied biosystems 120 A型乙内酰苯硫脲分析仪以反相HPLC鉴定序列仪上乙内酰苯硫脲标记的氨基酸。
在抽空的管内以6M Hcl在110℃水解24小时后在LKB，αPlus型氨基酸分析仪上测定氨基酸组成。
碳水化合物含量的测定：
以酚/硫酸方法(参考文献7)测定碳水化合物含量。
蛋白质含量的测定：
从氨基酸分析或从Bradford的染料结合方法(参考文献5)测定蛋白质含量。
泡沫试验：
使用数字视频图像分析的光电泡沫试验系统(参考文献8，9)测量10ml样品的泡沫潜力和泡沫半衰期。泡沫潜力(P)是每ml样品中最初形成的泡沫ml量。泡沫半衰期(F)是泡沫柱达到最初体积一半时的时间秒数。泡沫含量是泡沫潜力乘体积ml数。在进行泡沫试验前将色谱后得到的级分成级分汇合物在Spelctra/por透析膜(截留3，500道尔顿)上用蒸馏水透析或冻干以去掉乙酸铵。泡沫试验以一式四份进行。
泡沫稳定性分析仪，System Carlsberg，(参考文献21)用于对含CO2的瓶装啤酒的泡沫试验。以这种方法测定的泡沫排放半衰期是150g啤酒充分转变成泡沫后萎缩回啤酒中的泡沫半衰期(以秒表示)。这种衰变是大约30秒的起始延迟后的一级过程(参考文献22)。
                  实施例1
以大麦种子中分离和纯化各类LTP(LTP 1)程序a)。
用250l水在PH6.5下提取2小时从25kg大麦面粉(1992年在丹麦收获的品种Alexis)中分离纯的大麦LTP1。混合物在2℃静置过夜使不溶物沉淀。经超滤将上清液浓缩到71，加硫酸铵至40％饱和。2℃2-3小时后离心去掉沉淀。向上清液中加入硫酸铵至75％饱和。2℃16小时后离心所得的悬液，产生的沉淀可在2℃贮存几周。将沉淀的1/4溶于500ml水中，加热到100℃并立即在冰上冷却。离心溶液以去掉任何沉淀物并在Spectra/por透析膜(截留3，500道尔顿)中用水透析。离心后，经加入NaOH将PH调至7.0的透析物在用20mM磷酸钠PH7.0平衡的CM纤维素柱(5cm×25cm，500ml)上进行离子交换层析。Western印迹显示了将被Nacl梯度从0到0.1M的溶液洗脱的大麦LTP 1。合并含LTP 1的级分，在Spectra/por膜中用水透析并上样到在20mM Hepes PH 7.0中平衡的S-Sepharose FastFlow柱(5cm×15cm，300ml)上。在相同的缓冲液中用NaCl梯度从0到0.3M的NaCl溶液洗脱大麦-LTP1。合并以Western印迹发现含大麦LTP 1的级分，在Spectra/por透析膜中用蒸馏水透析并冻干。N-末端氨基酸测序显示序列Leu-Asn-*-Gly-Gln-Val-Asp-Ser-，其中星号表示的空白位置，与在LTP 1该位置发现的半胱氨酸相对应，表明分离的LTP 1是纯的。程序b)
与程序a)相似，除了省去加热步骤。
根据程序a)或b)制备的LTP在泡沫特征或免疫反应性方面观察不到区别。
实施例2
从啤酒泡沫中纯化LTP 1
以硼硅酸盐玻璃制成的连续泡沫塔如图1所示。以450ml/分氮气喷雾过夜从15l(或1.65l，在该情况下，下面所述化合物的总量除系数9)窖藏啤酒中产生泡沫。在导入泡沫塔前用水蒸汽饱和氮气。在输出端收集的气泡萎缩并用蒸馏水稀释成原始啤酒体积，再导入泡沫塔。如上所述进行第二次和第三次浮选。发现从窖藏啤酒第三次浮选收集的泡沫含原始啤酒总泡沫量的35％。
根据在用50mM乙酸铵PH4.5平衡的柱(5cm×87cm，1700ml)上经Sephadex G-75凝胶过滤的分子量分离最后一次浮选的萎缩泡沫中所含的成份。在Sephadex G-75上对第三次浮选的萎缩泡沫进行凝胶过滤在280nm下产生3个吸收峰(图2)。其中的两个峰分别命名为HMW和LMW，如图2所示，HMW级分由大约90％碳水化合物和10％的蛋白质组成，而LMW级分由90％的蛋白质和10％的碳水化合物组成。发现第三个峰含低分子量化合物，如氨基酸，异葎草酮和碳水化合物。
LMW级分和合并的级分氨基酸组成与熟知的大麦脂类转移蛋白质(LTP1)的氨基酸组成(参考文献18)相似(表II)。LMW的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示经考马斯蓝R350染色的涂片覆盖的分子量范围为6,000-18,000道尔顿(图5)。然而，使用抗大麦LTP 1的特异性抗体的Western印迹显示大麦LTP1(分子量为9，700道尔顿)是LMW的主要成份(图5)。经N-末端氨基酸测序证实了这一点。
与大麦LTP1(参考文献18)相比时，LMW的氨基酸组成显示出更高的Pro和Glx值，很可能是由于存在大麦醇溶蛋白和谷蛋白片段；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后经银染发现的涂片可能是这类片段。
冻干LMW泡沫级分以去掉乙酸铵。经过在S-SepharoseFast Flow上进行离子交换层析从15l窖藏啤酒获得的LMW泡沫级分中纯化LTP1(图6)。将LMW级分上样到用20mM乙酸钠PH 4.9平衡的柱(5×7cm，135ml)上，洗涤后用相同缓冲液的线型Nacl梯度(0-0.3M)在宽大的峰(合并液II-IV，图6)内洗脱LTP1。流过的级分和以Western印迹测定的含LTP1的级分的三种合并液在Spectra/por透析膜(截留3，500道尔顿)中用蒸馏水透析并冻干。
超滤膜：DDS-GR81PP，Dow Filtrations，丹麦
Spectra/por：Sepctrum Medical Industries，Inc.，美国
CM-纤维素：Whatman Biosystems Ltd.，英国
S-Sepharose Fast Flow：Pharmacia，瑞典
Sephadex G-75：Pharmacia，瑞典
                     表II
LMW S-Sepharose Fast Flow层析的合并液
               合并液  合并液  合并液  合并液  LMW   LTP 1a)
                  I      II      III     IVAsx(mol％)           7.8    11.5     14.3    14.5  12.6  16.5Thr(mol％)           6.1     4.3      3.8    3.7    4.5   3.3Ser(mol％)           6.7     7.3      7.8    7.8    7.4   8.8Glx(mol％)           20.7   13.7     10.2    9.6   13.3   6.6Pro(mol％)           9.6     8.5      7.8    7.9    8.1   6.6Gly(mol％)           7.1     8.5      9.6    9.6    8.9   9.9Ala(mol％)           7.3     6.3      5.5    5.8    6.1   4.41/2CYS(mol％)        4.3     6.5      7.6    7.5    6.4   8.8Val(mol％)           6.8     6.9      6.4    6.1    6.6   6.6Met(mol％)           2.2     1.6      1.3    1.2    1.6   1.1Ile(mol％)        3.7           4.6         5.1         5.0        4.7        6.6Leu(mol％)        7.8           7.8         7.4         7.2        7.5        6.6Tyr(mol％)        1.7           2.1         2.5         2.5        2.3        3.3Phe(mol％)        2.5           1.5         0.6         0.6        1.2        0His(mol％)        1.2           1.7         1.8         2.0        1.7        2.2Lys(mol％)        2.0           3.3         3.6         4.1        3.3        4.4Arg(mol％)        2.5           4.1         4.6         5.0        4.1        4.4蛋白质(mg)        87            33          190         38         392碳水化合物(mg)    24.0          1.3         0           0          25.6泡沫半衰期b)(秒) 356           44          68          54         172泡沫潜力b)ml泡沫/ml样       1.3           1.1         1.5         0.8        1.3泡沫含量          378           73          685         63         1260
a)值来自参考文献18
b)在具有A(280nm)＝0.5的水溶液中测量。
对狭窄峰和包含三种合并液的宽大峰进行酸水解后的氨基酸分析(表II)表明狭窄峰级分的氨基酸组成与具有高Glx和Pro含量的大麦醇溶蛋白和谷蛋白相似，而氨基酸分析(表II)和N-末端氨基酸测序估计Nacl梯度洗脱的宽大峰为相当纯的LTP1，尽管SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳仍显示在含三种合并液的宽大洗脱峰中具有分子量范围为6,000-18,000道尔顿的微量考马斯蓝染色化合物。含大麦醇溶蛋白/谷蛋白的狭窄级分(合并液I)和LTP 1级分(合并液II-IV)在水中都产生良好潜力的泡沫(表II)，但LTP 1级分的泡沫半衰期非常低，与此相反，大麦醇溶蛋白/谷蛋白级分产生的泡沫具有较高的泡沫半衰期(表II)。在四种合并液中泡沫含量的计算表明在LMW中发现的95％的泡沫含量存在于四种合并液中(表II)。
实施例 2A
合并液III的分级分离：
按实施例2所述从窖藏啤酒得到的合并液III根据分子量在用20mM NaAc，0.1M NaCl，PH 4.9平衡的Sephadex G-50柱(2.6cm×67cm，330ml)上经凝胶分离进行分级分离。这一分离步骤在280nm下产生两个吸收峰：合并液A和合并液B(图11)。在非还原条件下的SDS-PAGE和使用抗大麦LTP 1的特异性抗体的Western印迹显示合并液A主要由LTP的二聚体形式组成，但也观察到更大的多聚体形式，与此相反，在合并液B中仅观察到LTP 1单体。
实施例2B
分别记录了以大麦(实施例1b)得到的LTP 1和以啤酒泡沫得到的LTP 1的1HNMB谱。光谱在310K(37℃)和PH 4.0下记录。
所得的光谱如图12A和12B所示。
大麦种子LTP 1光谱(图12A)表现为典型的球状蛋白1HNMR光谱，其中大多数二级结构是α螺旋。
这是经过在低于4.8ppm时大多数Hα核具有化学位移而观察到的。而且，NMR信号的分散清楚地表明蛋白质的实质部分析叠并且具有非常明确的二级结构。
COSY关联能谱法，TOCSY(总关联能谱法)和NOESY(核极化光谱学)的详细分析证实了大麦种子LTP 1是具有非常明确的结构的球状蛋白质。
啤酒泡沫LTP的光谱是基本上无二级和三级结构的基本上或部分无折叠的蛋白质的典型光谱。可推论从啤酒分离的LTP 1或多或少发生了变性。
实施例3
从第一麦芽汁纯化LTP 1
从Carlsberg Brewery窖藏啤酒的生产中获得第一麦芽汁。将麦芽汁在Sorwall RC3离心机中以4,000rpm离心30分钟以去掉任何不溶物。加入硫酸铵使终浓度为85％，在4℃静置16小时后将所得悬液在4,000rpm下离心30分钟。沉淀溶于300ml水中，取2×60ml使用以50mM乙酸铵PH 4.5平衡的SephadexG-75柱(5cm×87cm，1700ml)进行凝胶过滤。洗脱图形与在萎缩泡沫的凝胶过滤中所得的相似(图2)。将合并的LMW级分冻干(去掉乙酸铵)溶于水中，透析并在用20mM乙酸Na PH4.9平衡的S-Sepharose Fast Flow(5×7cm)上进行离子交换层析。经过使用在相同缓冲液中的线性NaCl梯度(0-0.3M)洗脱LTP 1。洗脱分布型与图6所示的从泡沫分离LMW级分的分极分离结果相似。合并构成合并液III的级分，在Spectra/por透析膜(截留3，500道尔顿)中用蒸馏水透析并冻干。以氨基酸分析测定LTP 1(修饰的和未修饰的)浓度。
实施例4
按实施例2所述从窖藏啤酒中获得的HMW和LMW级分试验其在水中形成泡沫的能力。结果如表III所示。
                 表III
HMW和LMW水溶液的混合物之泡沫潜力(P)和泡沫半衰期(F)
LMW                                             HMW(μg/ml)(μg/ml)                          0             0.3          0.675 P  (ml泡沫/ml样品)     0.56±0.04     0.63±0.04    0.68±0.03
  F          (秒)         199±15       2.51±67       236±26150 P  (ml泡沫/ml样品)     0.89±0.05     0.95±0.03    0.97±0.03
  F          (秒)         177±14        251±27       309±30300 P  (ml泡沫/ml样品)     1.34±0.02     1.34±0.09    1.40±0.01
  F          (秒)         185±32        251±18       251±29600 P  (ml泡沫/ml样品)     1.89±0.08     1.99±0.15    1.83±0.05
  F          (秒)         208±61        258±65       239±10
LMW                                       HMW(μg/ml)
                             1.2          2.475 P  (ml泡沫/ml样品)     0.69±0.06     0.75±0.05
  F         (秒)          300±3         313±71150 P  (ml泡沫/ml样品)     1.04±0.03     1.09±0.05
  F         (秒)          276±8         293±37300 P  (ml泡沫/ml样品)     1.41±0.05     1.47±0.06
  F         (秒)          290±39        290±29600 P  (ml泡沫ml样品)      2.01±0.09     2.10±0.07
  F         (秒)          263±102       277±24
结果表明：不论HMW浓度、LMW级分的浓度对泡沫潜力有极大的影响。使用表III的值的图3和4中进行了进一步的说明。
实施例5
从泡沫潜力不同的5种不同窖藏啤酒中分离LTP 1。除使用Mono S代替S-Sepharose Fast Flow分离外基本上按实施例2所述从1.65l啤酒中得到LTP。
窖藏啤酒用根据下列所示的不同大麦品种酿造。
A：Blenheim，B：Caruso，C：Grit D：Eminant
混合物：未知大麦品种的混合物
结果见表IV。
                    表IV
用不同大麦品种酿造的窖藏啤酒泡沫稳定级分的研究
麦芽                          混合物a)    A      B      C      D
啤酒  泡沫潜力ml泡沫/ml         0.72       1.13   1.13   1.44   1.20
      样品
      泡沫半衰期(秒)             181       200    189    258    179
      每l啤酒泡沫含量            715       1130   1130   1440   1200第二次蛋  白质回收率(％)             32        21     32     30     31浮选    每l啤酒泡沫含量            240       490    360    670    520HMW     蛋白质(％(w/w))            16        12     8      15     14
      碳水化合物(％(w/w))        84        88     92     85     86LMW     每l啤酒泡沫含量            210       160    190    270    210
      蛋白质(％(w/w))            86        76     71     76     85
      碳水化合物(％(w/w))        14        24     29     24     15Mono  Sb)流过的级分(蛋白质％)       25        10     40     8      8
      洗脱级分(蛋白质％)         75        90     60     92     92
a) 未用啤酒花
b) 离子交换树脂，Pharmacia，Sweden
实施例6
对按实施例1，程序b)所述从大麦面粉分离的LTP 1和对按实施例2所述从窖藏啤酒获得的合并液I和合并液III进行泡沫试验。
所用的水是蒸馏水。
所用的啤酒是Carlsberg窖藏啤酒。
在每次试验中使用10ml水或啤酒，按前面所述刚好在产生泡沫前加入合并液或LTP。
当溶于水或啤酒中的分离的LTP1，合并液I或合并液III的浓度分别增加时，在泡沫试验中表现为溶液的泡沫潜力增加(图7和8)，尽管泡沫潜力的增强对啤酒溶液(图8)不如对水溶液(图7)那么显著，这很可能是由于在啤酒中已经存在泡沫正效应成份的缘故。蛋白质溶液较低时，加入啤酒LTP 1级分(合并液III)的影响比加入含大麦醇溶蛋白/谷蛋白片段的级分(合并液I)的影响要大。向啤酒中加入从大麦面粉分离的LTP 1少量增加泡沫潜力(图8)和泡沫半衰期。而且就增加LTP 1的浓度(实施例5)对泡沫潜力的影响而言，从啤酒分离的LTP 1(合并液III)比从大麦分离的LTP 1的效果更显著(图8)。重组实验，即对含有浓度增加的从大麦或啤酒(合并液III)分离的LTP1的0.4mg/ml合并液I的蒸馏水溶液进行泡沫试验支持这一观察结果(图9和10)在合并液I存在的条件下大麦LTP 1对泡沫潜力的影响不如在相同浓度的合并液III存在下的影响。
实施例7
ELISA试验(用于测定LTP 1浓度)
抗大麦LTP 1抗体的生产：
根据Dako，Glostrup，Denmark使用的标准免疫程序每次免疫用100μg大麦的LTP 1(按实施例1程序a)所述从Alexis大麦面粉获得免疫两只兔子。
从第一次注射54天后的每只动物中获得20ml血清，然后以每月间隔取血。
从一只动物第一次抽血取得的血清用于下述全部实验。抗体的纯化：
经过在蛋白A-Sepharose(Pharmacia，Vppsala，瑞典)上根据厂家说明进行新和层析从其它血清成份中纯化出免疫球蛋白G类(IgG)抗体。
在将大麦LTP1共价连接有于Sepharose上制备的小型柱下进行新和层析来从具有其它特异性的抗体中分离识别LTP 1的抗体。64mg大麦LTP 1溶于10ml 0.1M NaHCO3，0.5M NaCl pH8.3的溶液中并根据厂家说明书偶联到2g CNBr活化的Sepharose4B(Pharmacia，瑞典)上。然后将1ml免疫吸附剂填充到小型柱中并用10mM磷酸钠，150mM NaCl，PH 7.3(PBS10)平衡。将在蛋白质A-Sepharose上层析纯化的IgG级分上样到柱上，用平衡缓冲液洗涤至A280为0.002。用0.5M甲酸PH2.0洗脱结合的lgG，用4倍体积的10×PBS10稀释并用NaOH将PH调至4.0。最后，在Spectra/por膜(截留3，500道尔顿)上用PBS10透析样品并按下面所述进行生物素标记。抗体的生物素标记
含10mg抗体的1ml PBS10与0.1ml 1M碳酸钠缓冲液PH 9.5混合。然后经过加入57μl溶于DMSO(二甲亚砜)的0.1M BXNHS(生物素酰胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)对抗体进行生物素标记。混合物在室温下静置1小时。然后去掉未反应的BXNHS，根据厂家说明书用PBS10平衡的小型一次应用的Sephadex G-25柱(PD-10，Pharmacia，Upp sala，瑞典)上进行凝胶过滤将缓冲液换成PB10。经过加入PBS10至总体积为10ml将试剂中的抗体浓度调成1mg/ml。加入100mg BSA(牛血清白蛋白)后，试剂以等份试样贮存于-20℃。LTP的酶联免疫吸附试验(ELISA)
用竞争性ELISA程序的方法测定LTP。
开始纯化的大麦LTP吸附到聚苯乙烯孔的内表面。该孔以12个一条进行排列，带孔条位于支架上，每个支架含8条孔(NuncImmuno Module C12 Maxisorb，Nunc，丹麦)。向各孔中加入200μl按实施例1程序a)所述获得的稀释的LTP 1溶液(100ng/mlPBS10)，4℃保温16-20小时。保温后，在每孔中用225μl BSA/PBST(1mg BSA/ml PBST，其中PBST是加入了0.05％Tween20的PBS10)37℃保温1小时封闭聚苯乙烯表面残余的结合位点。然后倒空各孔用与聚钵乙烯条相匹配的手控洗涤装置(NuncImmuno Wash 12，Nunc丹麦)以PBST洗涤6次并贮存于-20℃备用。
分析前，在BSA/PBST中适当稀释含LTP 1的样品，在相同的缓冲液中制备按实施例，程序a)所述获得的LTP1的标准溶液。加入识别大麦LTP 1的生物素标记的杭体至终浓度为100μg/ml然后将该混合物200μl的等份试样在孔中37℃保温1小时，每份样品或标准品以一式三份进行分析。保温后，倒空各孔并按前面所述洗涤。
在下一步骤中，将200μl在BSA/PBST中稀释成250ng/ml的链霉抗生物素蛋白辣根过氧化物酶连接物(Sigma，USA，Cat，No.S5512)的等分试样在各孔中20-22℃温育10分钟。然后，再倒空各孔并洗涤。
最后，向每孔中加入200μl含2，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，100μg/ml)和0.015％H2O2的溶于磷酸盐柠檬酸盐缓冲液PH 5.0中的底物溶液并在20-22℃保温10分钟。然后经过向每孔中加入125μl 4NHCl终止酶反应，在与96孔架相匹配的分光光度计(Perkin-Elmerλ阅读器)中测量450nm下各孔的吸光度。
分析的每一系列包括在8000-62.5ng大麦LTP 1/ml范围内的标准品。经过标绘吸光度对LTP 1浓度的对数制备标准曲线，相对于该曲线计算所有样品中的LTP 1浓度。抗体特异性：
抗大麦LTP 1的且按上述亲和纯化的抗体用于对大麦和麦芽提取物，麦芽汁和啤酒的Western印迹。除了LTP 1或修饰的LTP1外，对其它成份观察不到反应。
在ELISA试验中，该抗体识别来自第一麦芽汁和泡沫的LTP1或修饰的LTP 1，但比识别来自大麦LTP 1的程度要小。较低的反应性是由于在糖化，麦芽汁煮沸，发酵和形成泡沫过程中发生了修饰。与氨基酸分析测定的浓度(实施例3)相比，与第一麦芽汁LTP 1或修饰的LTP 1的反应性是与实施例1，程序a)所述从大麦面粉获得的LTP 1的反应性的大约65％。与来自混合麦芽汁LTP 1或修饰的LTP 1的反应性测定为大约是与从大麦面粉获得的LTP 1的反应性的90％。由于标准曲线根据大麦LTP(按实施例1，程序a)所述获得)制备，可将来自大麦LTP 1标准曲线的估计值乘10/9来确定混合麦芽汁中LTP 1或修饰的LTP 1的实际量。
实施例8在制备麦芽汁期间加入LTP：
为了研究在麦芽汁煮沸步骤期间加入LTP的影响而建立了一个模型系统。使用加热架在与回流冷凝器相连的圆底烧瓶中煮沸淡麦芽汁90分钟。进行两种类型的实验：a)在开始煮沸时加入按实施例1，程序a)所述获得的Alexis(DK.1992)纯大麦LTP1(0.5mg/ml)和/或啤酒花提取物(61mgα酸/l)，b)向麦芽汁(煮沸过的或未煮沸的，含有或不含啤酒花提取物(61mgα酸/l))中加入纯大麦LTP 1，但不进行煮沸。
                   表V未加入LTP       泡沫潜力       加入LTP(0.5mg/ml)        泡沫潜力淡麦芽汁        0.37±0.01  淡麦芽汁                    0.75±0.05煮沸的不合啤    0.91±0.06  不含啤酒花，在煮沸前向      1.15±0.02酒花的麦芽汁                麦芽汁中加入LTP
                        LTP溶于煮沸的麦芽汁         1.24±0.09
                        中不含啤酒花煮沸的含啤酒    1.68±0.07  煮沸前向麦芽汁中加入        2.15±0.02花的麦芽汁                  LTP，含有啤酒花
                        LTP溶于煮沸的麦芽汁         1.93±0.17
                        中，含有啤酒花
                     实施例9
使用60％窖藏麦芽和40％添加物(玉米渣)在Carlsberg 50LPilot Plant Brewery生产具有高浓度LTP 1的啤酒。玉米渣根据Carlsberg Breweries的说明书制备，即：水％                                  ＜12.5提取物，干重，％P                     ＞89％脂肪，干重，％                        ＜1.0％以Pfungstadter筛面粉机筛选            ＞2mm 0％
                                  ＞1.27mm  ＜3.5％
                                  ＜0.25nm  ＜5.0％
酿造过程包含煎熬糖化和麦芽汁煮沸90分钟蒸发10％，麦芽汁煮沸开始15分钟后向麦芽汁锅中加入LTP 1的粗制品。该制品从6×25kg 1992年在丹麦收获的Alexis大麦面粉中提取，经超滤浓缩，并按上面所述用硫酸铵沉淀。沉淀溶于5l水中，分滤成850ml，加热到100℃并立即在冰上冷却。在Sorwall RC3离心机中以4000rpm将溶液离心30分钟。以ELISA试验测定上清液中LTP 1的浓度60mg/ml，取800ml加入麦芽汁锅中。最终麦芽汁为14.5％Plato。该酿造物与Carlsberg酵母(卡尔酵母)在圆锥形罐中发酵。初次发酵进行9天，成熟和稳定持续10天。最后过滤啤酒并回复到10.6％Plato。
使用泡沫稳定性分析仪(System Carlsberg)测量该饮料和除了不加LTP 1外在相同条件下从相同原料制备的饮料的泡沫形成能力。高LTP 1啤酒的泡沫半衰期增加到113秒，与其相比，未加LTP 1的啤酒为93秒。
实施例10温和麦芽汁中LTP 1水平(修饰的和未修饰的LTP 1总量)
从正常情况下用于啤酒酿造的许多大麦品种制备麦芽。大麦品种在不同的地点生长并在不同的年份收获。
按上面所述制备麦芽用于窖藏啤酒。
使用如上所述的EBC标准糖化方法从麦芽样品中生产混合麦芽汁。
以上面所述的ELISA程序测定混和麦芽汁样品中的LTP 1(修饰的和未修饰的LTP 1总和)水平。总共分析了82个麦芽汁样品，与41个麦芽样品相对应。
按实施例7所述进行ELISA，使用与大麦LTP 1等同的标准曲线(即不乘相关系数)测定LTP 1的浓度。
结果见表V。每个值代表两个单独的混合麦芽汁的平均值。
                      表V大麦品种     来源国      收获年份     混合麦芽汁中LTPmg/lTriumph          法国                            65Ariel                                            70未知           澳大利亚                          85未知             德国           ？               108Alexis           英国         1992               66Triumph          法国         1992               76Ariel            丹麦         1992               82未知           澳大利亚         ？               99未知           澳大利亚         ？               96未知           澳大利亚         ？               78未知            英格兰          ？               118Natasha                 法国            1992            118Halcyon                 法国            1992            78BL.IIIS                  ？             1991            92Natasha                 法国            1992            104Natasha                 法国            1992            102Halcyon                 丹麦            1992            109Caruso                  法国            1993            120Senor                   丹麦            1993            70Alexis-81               丹麦            1993            82Jessica                 丹麦            1993            93Chariot                 丹麦            1993            79Goldie                  丹麦            1993            84Loke                    丹麦            1993            81Maud                    丹麦            1993            110未知                    印度            1993            121未知                    印度            1993            103未知                    英格兰           ？             110未知                    苏格兰           ？             117未知                      ？             ？             140Lenka                   丹麦            1992            87Lenka                   丹麦            1992            98未知                      ？            1993            61Natasha                 法国            1992            76Halcyon                 丹麦            1992            69Alexis                  英格兰          1992            75未知                    丹麦            1992            100未知                    英格兰          1992            99未知                    英格兰          1992            93Alexis                  丹麦            1992            92Alexis             丹麦                1992             91未知               英格兰              1992             102Alexis             丹麦                1993             67Triumph            法国                1992             90
实施例11从小麦面粉中分离和纯化谷类LTP
经过用270l水在PH 7.8下提取4小时从30kg小麦面粉中分离纯小麦LTP 1。混合物在4℃静置过夜不溶物沉淀。经超滤将195l上清液浓缩到6.9l，离心去掉残留的面粉。加入硫酸铵至80％饱和度，4℃静置16小时后离心所得的悬液。将1/4的沉淀溶于400ml水中并在Spectra/por透析膜(截留3，500道尔顿)中用水透析。离心透析物(1l)，调到PH 6.5并用以20nM Mes，PH6.5平衡的S-Sepharose Fast Flow(5cm×15cm，300ml)柱进行离子交换层析。在相同缓冲液中以NaCl梯度(0到0.1M)洗脱小麦LTP 1。使用Pharmacia和Phast-System以SDS-PAGE鉴定含10KDa成份的级分，合并后使用旋转蒸发器在35℃下在真空中浓缩。在用20mM NaAc，0.1M NaCl，PH 4.9平衡的Sephadex G50柱(2.5cm×67cm，330ml)上经凝胶过滤分离浓缩样品中的成份。以SDS-PAGE鉴定含10KD蛋白质的洗脱峰，N-末端氨基酸测序显示序列Ile-Asp-*-Gly-His-Val-Asp-Ser-Leu-Val-，其中星号表示与小麦LTP 1该位置发现的Cys相对应的空白位置，这证实了该成份是纯小麦LTP1。将该制品在Spectra/por透析膜(截留3500道尔顿)中透析并冻干。
实施例12在麦芽汁制备过程中加入小麦LTP 1：
使用实施例8所述的模型系统研究在麦芽汁煮沸步骤中加入小麦LTP 1的影响。开始煮沸时加入纯小麦LTP(按实施例11所述获得)(0.5mg/ml)和/或啤酒花提取物(61mgα酸/l)。所得的泡沫潜力见表VI。
                               表VI
    未加LTP     泡沫潜力(ml/ml)     加入LTP(0.5mg/ml)      泡沫潜力(ml/ml)
煮沸的麦芽汁，不含啤酒花   1.01±0.04 向煮沸前的麦芽汁中加入LTP，不含啤酒花     1.76±0.07
煮沸的麦芽汁，含有啤酒花   1.65±0.05 向煮沸前的麦芽汁中加入LTP，含有啤酒花     2.28±0.08
实施例13煮沸对大麦和小麦LTP 1泡沫潜力的影响
分别按实施例16和11所述获得的大麦或小麦LTP(0.5mg/ml)溶于20mM Mes(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)PH 5.5中。在声处理条件下加入2％乙醇(含有或不含2.5mg/ml三亚油精)。按表VII所示加入啤酒花提取物至终浓度为61mgα-酸/l，按实施例8所述将混合物煮沸90分钟。加入按实施例2所述获得的HMW级分(2.5μg/ml)后进行泡沫测量。
                        表VIl
    煮沸     添加剂     泡沫潜力
  大麦LTP 1      -90分90分90分 --啤酒花啤酒花+三亚油精    0.78±0.020.61±0.031.40±0.051.92±0.05
  小麦LTP 1      -90分90分90分 --啤酒花啤酒花+三亚油精     0.80±0.041.02±0.031.85±0.061.83±0.07
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Claims (23)

1.一种含有蛋白质和/或肽的饮料，其特征在于它含有谷类LTP和/或本文所限定的同源物和/或可从谷类LTP和/或同源物经加热，煮沸和/或糖化于PH在3到7之间的水中的谷类LTP和/或同源物获得的修饰的谷类LTP片段，其前提是当该饮料是啤酒时，谷类LTP和/或同源物和/或其片段的浓度至少为X，其中X指可以用不再加入含LTP物质的原料酿造的啤酒中获得的水平，其中的原料经过使用EBC标准糖化方法产生谷类LTP和/或其同源物和/或其片段的浓度与125μg/ml LTP 1相对应的麦芽汁。
2.根据权利要求1的饮料，其特征在于它含有大麦LTP和/或本文所限定的同源物和/或可以大麦LTP获得的修饰的谷类LTP片段。
3.根据权利要求1或2的饮料，其特征在于该饮料是发酵产生的。
4.根据权利要求1、2或3的饮料，其特征在于该饮料中的浓度至少为25μg/ml且优选不低于100μg/ml。
5.根据权利要求1-4任意一项的饮料，其特征在于它进一步含有谷类贮存蛋白质，如大麦醇溶蛋白和/或谷蛋白或其片段。
6.根据权利要求1-5任意一项的饮料，其特征在于它进一步含有其它白蛋白，如可从啤酒中获得的蛋白Z。
7.根据权利要求1-6任意一项的饮料，其特征在于它进一步含有碳水化合物。
8.根据权利要求1-7任意一项的饮料，其特征在于它含有脂类和/或脂肪酸。
9.根据权利要求1-8中任意一项的饮料，其特征在于该饮料是啤酒。
10.根据权利要求1-9任意一项的饮料，其特征在于它还含有啤酒花成份，如啤酒花异α酸和啤酒花的其它苦味树脂。
11.一种生产含有蛋白质/肽的饮料的方法，其特征在于谷类LTP和/或本文所定义的同源物和/或可从谷类LTP和/或同源物经加热，煮沸和/或糖化在PH为3到7之间的水中的谷类LTP和/或同源物获得的肽/蛋白质片段连续地或在一个或多个生产步骤中加到饮料中，其前提是加入的谷类LTP和/或其同源物和/或其片段至少为X，当该饮料是啤酒时，其中X指可从用不再加入含LTP物质的原料酿造的啤酒中获得的水平，其中的原料经过使用EBC标准糖化方法产生谷类LTP和/或其同源物和/或其片段的浓度与125μg/ml LTP1相对应的麦芽汁。
12.根据权利要求11且包含一个糖化步骤的方法，其特征在于谷类LTP和/或其同源物和/或其片段在糖化步骤前加入。
13.根据权利要求11且包含煮沸步骤的方法，其特征在于谷类LTP和/或其同源物和/或其片段在煮沸步骤前加入。
14.根据权利要求11-13任意一项的方法，其特征在于谷类LTP是大麦LTP1。
15.根据权利要求11-14中任意一项的方法，其特征在于谷类LTP和/或其同源物和/或其片段以部分或基本上可溶的添加物形式加入。
16.根据权利要求11-15中任意一项的方法，其特征在于谷类LTP和/或其同源物和/或其片段的加入量至少为25μg/ml，优选不低于100μg/ml。
17.根据权利要求11-16中任意一项的方法，其中该饮料是啤酒且生产包含下列步骤：
i)麦芽或麦芽提取物的制备，
ii)麦芽汁的制备，
iii)麦芽汁的发酵，
iv)澄清和制成啤酒，
其特征在于谷类LTP和/或其同源物和/或其片段在i)、ii)、iii)和iv)之前或在其中一步或多步中加入。
18.根据权利要求17的方法，其特征在于谷类LTP和/或其同源物和/或其片段特别在步骤ii)中或之前加入。
19.根据权利要求17的方法，其特征在于谷类LTP和/或其同源物和/或其片段从大麦中获得，其中大麦经使用遗传传递精炼成具有高含量的LTP，特别是LTP1，且麦芽从包含该精炼的大麦种子的  原料中制备。
20.根据权利要求17的方法，其特征在于谷类LTP和/或其同源物和/或其片段从在其基因组中含有编码谷类LTP，特别是LTP1的DNA序列的酵母中获得，且该酵母在步骤iii)中加入。
21.一种包含谷类LTP和/或本文所定义的的同源物和/或可从谷类LTP和/或同源物经加热，煮沸和/或糖化在PH为3到7之间的水中的谷类LTP和/或同源物获得的修饰的谷类LTP片段的化合物在作为饮料泡沫形成添加剂中的应用。
22.根据权利要求21的应用，其中的化合物包含以磨碎或压碎的种子或种子产物或种子或种子产物提取物形式的谷类LTP和/或同源物和/或其片段。
23.根据权利要求21的应用，其中修饰的谷类LTP片段从谷类LTP获得，该谷类LTP在水中与下列成份中的一种或多种一起煮沸，这些成份是：大麦醇溶蛋白、啤酒花成份和脂类、特别是甘油三酯。
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