BG100605A

BG100605A - Напитка и метод за получаването й

Info

Publication number: BG100605A
Application number: BG100605A
Authority: BG
Inventors: Lene Bech; Steen Sorensen; Pia Vaag; Marianne Muldbjerg; Thorkild Beenfeldt; Robert Leah; Klaus Breddam
Original assignee: Carlsberg A/S
Priority date: 1993-11-08
Filing date: 1996-05-20
Publication date: 1996-12-31
Anticipated expiration: 2016-05-20
Also published as: ATE152765T1; ES2103626T3; GR3024227T3; RO112763B1; CA2175908A1; HU9601228D0; FI961937A; PL314262A1; DE69403092T2; CZ290031B6; EP0728188B1; AU8104894A; DK126693D0; NO961845L; CZ129296A3; FI961937A0; JP3501808B2; EP0728188A1; US5993865A; NZ275797A

Abstract

Изобретението се отнася до пенлива напитка, коятое получена на основата на мляко, плодове или зърнени храни и може да бъде ферментационна, по-специално бира. Съставът й съдържа основно протеини и/или пептиди и освен това включва и транспортиращи липидите протеини (lтр), предимно зърнени lтр и/или техни хомолози, и/или модифицирана зърнена lтр фракция, получена чрез нагряване, варене и/или пасиране във вода при рн между 3 и 7. Зърнените lтр образуват пяна в напитките, поради което намират приложение като пенообразуваща добавка. С комбиниране на съставките се постига синергетичен ефект при формирането на пяната, осигурява се нейното стабилизиране и се подобрява вкусът и консистенцията на напитката.

Description

Изобретението се отнася до пенлиВа напитка, като бира, метод за получаване на пенливата напитка и приложение на ценообразуваща добавка.

Напитките играят важна роля в нашето ежедневие, не само като необходима течност и източник на хранителни вещества, но също и като стимулант. Освен вкуса, за висококачествените напитки са особено важни и техните структурни свойства като вискозитет и качество на пяната.

Понастоящем на пазара са достъпни множество напитки, като напр. бира, млечен шейк и някои сухи продукти. Независимо от това, налице е необходимост от нови пенливи напитки, а така също и необходимостта от подобряване качеството на известните вече пенливи напитки.

Положени са доста усилия за изследване и изолиране на формиращите пяната вещества в бирата и за подобряване пенливостта на бирата.

От повече от 50 години е известно, че качеството пенливост на бирата се регулира от нейното протеиново съдържимо, което е около 3- 4 mg/ ml в обикновената бира, и че свободните липиди и остатъците от детсргенти може да бъдат вредни за стабилността на бирената, пяна.

Обект на множество изследвания (1,2,4,17) е изясняването на проблема кои протеинови компоненти в бирата се включват в стабилизирането на пяната. Предполага се, че важни за формирането на пяната са няколко класа протеини, формирани по молекулното им тегло (2, 11,20).

Молекулярният профил на протеините на бирата показва, че тази напитка включва от малки полипептиди до такива с тегло над 150 000 Далтона Установено е най- общо, че протеини притежаващи молекулни тегла до около 100 000 Далтона имат позитивен ефект върху стабилизирането на пяната на бирата, докато малки полипептиди, в частност полипептиди с молекулно тегло под 5 000 Далтона, се счита че имат негативен ефект върху пяната (6,19). Нещо повече, изследвания на Sharpe et al. (15) предполагат, че стабилността на пяната е свързана със съотношението между полипетидите с високо и ниско молекулно тегло. Приемайки под внимание важността на специфичните протеини, Yokoi et aL (20) твърдят, че протеин Z, ечемичен албумин с 40 000 Далтона, играе найважна роля за стабилността на пяната. Това е в противовест на резултатите на Hollemans and Tonies (11), които показват, че пълното и селективно отстраняванет на този протеин от бирата от специфични, имобилизирани антитела има само слаб ефект върху стабилността на пяната.

Установено е също, че в бирената пяна са концентрирани компоненти с високо молекулно тегло, произхождащи от дрождите и главно тези с въглехидратна природа (10,12).

До повечето от изброените по- горе заключения е достигнато чрез фракциониране на протеините на бирата и определяне способността на различните фракции да образуват стабилна пяна. В нито едно от изследванията не е проведен какъвто и да е етап за подобряване качеството на бирената пяна.

Когато се дискутира качеството на пяната, от особено значение са два параметъра, а именно способността за формиране на пяна и способността за стабилизиране на пяната.

Изненадващо е намерено, че специална група протеини, означени като зърнени- LTP притежават способността да формират пяна в напитките.

Поради това настоящето изобретение се отнася до напитка, съдържаща протеин и/ или пептиди, които се характеризират с особеностите съгласно претенция 1.

Зърнени -LTP означава протеини или пептиди от зърнени култури, класифицирани като транспортиращи липидите протеини (Lipid Transfer Proteins). Таблица I показва последователността на някои такива зърнениLTP и други растителни LTP. По- наяататък тези протеини са описани от

Molina et al. (13).

Хомолози означава протеини с 50 -110 амино киселини и по- специално 80-100 амино киселини и с поне 60%, за предпочитане 80% или повече секвенционна хомоложност със зърнени LTP.

Особено важни са структурните взаимоотношения. Хомоложните протеини поради това включват поне 6 цистеиноби групи и по- специално 8 цистеинови групи за изграждане на 3 или 4 дисулфидни моста

Предпочитани хомоложни протеини са TLTP, SLTP, CLTP, СВ- А, СВ- В иСВ-С.

В настоящето изобретение се предпочитат LTP от семена на зърнени култури.

Специално предпочитани зърнени- LTP са ечемичени- LTP от семена на ечемик, на Таблица I означени като BLTP и означени също като LTP1 6 примерите.

BLTP е основен протеин, намиращ се 6 изобилие в алеуроновия слой на ечемиченото зърно (14,16). Той има молекулно тегло от 9. 649 Далтона, съдържа 91 амино киселинни остатъка, включително 8 цистеина. Амино

киселинната последователност е определена (18). Тя е клонирана и нуклеотидната последователност на сДНК също е определена (14).

В описанието на изобретението, което следва по- долу, терминът зърнени- LTP или субгрупи от тях, като ечемичени - LTP, също означава хомолозите както са определени по- горе със секвенционна хомоложност спрямо отбелязаните LTP групи. По- нататък, терминът зърнени- LTP или техни субгрупи означава модифицирана зърнена- LTP фракция, която се получава от LTP или техни хомолози чрез нагряване, варене и/ или пасиране на LTP. За предпочитане, зърнените LTP не са денатурирани напълно, т. е. някои структури присъстват поради способността на цистеините да формират дисулфидни мостове.

Когато зърнени- LTP се подлагат на етап на нагряване, варене и/ или пасиране, както е описано по- нататък и както е нормално за процеса на варене на бирата, те съхраняват по същество всички свои първични последователности, докато вторичните и третични структури се променят повече или по- малко и някои или всички дисулфидни мостове може да бъдат разместени. В процеса на варене на пивото метиониновата амино киселина от ечемичените LTP1 често е окислена. Изобретателите на настоящето изобретение са наблюдавали също формирането на LTP- димери и - олигомери, вероятно чрез разместване на един или няколко от дисулфидните моста, намиращи се в LTP. Както по- нататък се описва, върху LTP може да се комбинира с други компоненти, присъстващи в етапа на варене, напр. хордеиноВи фрагменти, хмел и липиди.

Модифицираните зърнени- LTP могат за предпочитане да бъдат получени чрез нагряване на обичайните зърнени- LTP във Воден разтвор за Време до три часа при температура между 50 и 95°С или чрез Варене под атмосферно налягане за Време до два часа и/ или пасиране, проВедено по обичайния В пивоВарстВото начин.

WO 95/13359

	Е-·	Ζ	co	co	Е-·
£		Р	си	си	си
co	ω	co	co	co	co
и	м	>	м	и	м
си	О,	си	ίΖ	<	iZ
м		Ьи	>	>	>
Ζ	ζ	О	си	а.	си
н	м	Р>	н	м	и

сс	(X	Σ bZ	iz η:
о	co	co	χ,	>	-е
си	си	CU	CU	CU	си
и	Μ	Η	j	j	►4
CO	ο	ο	CO	co	ΪΖ
co	<		CO	co	co
<	<	»<	<	<	и
iZ	tx	Ьч	<	<<	Ьи
ο	ο	ο	Q	Q	8
<	<	<	Ο	ω
ζ	ζ	ζ	bZ	(X	ii
«J	1	1		Μ	►ч
ο	1	1	Ε-<	ζ	е
co	1	1	CU	CU	•j
>	>	J		>	co
ex	<	Ο	re	κ	iZ
CO	ο	Ο		<	co
<	<	<	<	<	co
<	>	<	<	<	<
CO	co	CO	<	Ε-	I
:Z	ζ	X		hZ	bZ
J CO o	►J	Μ	Μ	>	\|J
ΰ	1 υ	1 ο	1 ο	1 o

<	<	<	<	<	ZJ	Z3	<
>	£	>	>	>	bu	u,	u.
co	<	<	co	CU	pu	o
M O	d	d	o	n u	►4 o	5	δ
CU	CU	CU	CU	CU	co	co
«?	o	e	o	co	<.	co
M	>	t-l	-j		ZJ		<<
<	<	<			co
co	co	<0	co	co	co		£

а. Я
fi	е.
η	£	£
□		f*
co		яч W*
co	co

По- долу терминът “зърнени- LTP” означава също техни хомолози или модифицирани зърнени- LTP и модифицирани хомолози, доколкото не се твърди друго.

Напитката може да бъде която и да е течност за пиене, като напр. напитка на базата на мляко или на базата на плодове и бира.

Като малко количество, напр. около 50 mg/l, което е налице в познати видове бира, това ниво на техниката е изключено в претенция 1.

Получаването на бира или процеса на варенето на бира, така както е известно от нивото на техниката, е описано в подробности в литературата напр. Malting and Brewing Science, Vol. I, D. E. Briggs, J. S. Hough, R. Stevens and T. W. Young. Chapman and Hall, London (1981) and Volume II, J. S. Hough, D. E. Briggs, R. Stevens and T. W. Young. Chapman and Hall (1982) описват много варианти на сурови материали и процеси. Най- общо процесите следват етапите A- D.

A) Подбор на суровите материали и получаване.

Суровите материали съдържат:

Вода; въглехидрати и протеини (присъстващи в зърнени храни като ечемик, пшеница, ориз, царевица, сорго); захар; сиропи; малцови екстракти; ензими, получени по време на образуването на малца от зърнените (напр. ечемик и пшеница) или микробиологични продукти; компоненти на брашното (печен слад, хмел и други растителни материали или сокове).

Суровите материали от зърнени може да бъдат : малцовани; смляни; разделени (за. получаване на компоненти със специфичен вкус и ензимна активност).

B) Пасиране и получаване на слад

Включващо:

Екстрахиране чрез контролирано омокряне (температура и време) на получените сурови материали; варене и разделяне на слада от неразтворимите материали.

C) ферментация на слада

Ферментацията се осъществява след добавянето на дрождевата суспенсия към охладения аериран слад. По време на контролираните температурни условия, дрождевият метаболизъм (ферментацията) ще превърне слада в бира, включваща определени продуцирани от дрождите компоненти като алкохол и вкусови продукти. Този етап може да бъде контролиран чрез параметрите на процеса: Температура и дозиране на дрождите, както и селекциониране на дрождите.

D) Осветляване и завършване

След съхраняване и зреене, останалите дрожди и протеинови/ танинови седименти се филтрират и се включват коригенси на въгледвуокисното съдържимо, цвета, стабилността и вкуса.

Основно правило за специалистите в пивоварството е, че бирата, получена само от малцов ечемик или малцова царевица е с пяна с по- висок потенциал (способност да формира пяна) и по- добра стабилност отколкото бирата, варена със спомагателни средства.

Анализите на съдържимото на. зърнени- LTP в бирата, получена по известните методи показват, че концентрацията на зърнени- LTP е далече по- малка от 300 mg/1.

Качеството на бирената пяна заВиси както от процеса на варенето на бирата, така и от вида на използваните сурови материали. Доколкото настоящето изобретение се отнася главно до суровите материали, съдържанието на зърнени - LTP В следващата по обогатяване с оригиналната бира, е най- близко до съдържанието на зърнени- LTP В слада, получен съгласно ЕВС ( Европейска Конвенция за пивоварство) стандартен метод, означен като “конгресен слад”. За несмляни зърнени храни могат да се използват сходни процедури на екстракция, ако е необходимо чрез Включване на нормални нива, на бирена ензимна активност.

Наличните в известният сладък слад за получаване на бира зърнени- LTP са първични LTP1 или слабо модифицирани LTP1. Степента на модификация зависи от процеса по който е получен. Коаато конгресният слад е напраВен съгласно ЕВС стандартен метод за пасиране, около 90% от наличните 8 конгресният слад зърнени- LTP се измерват чрез ELISA с помощта на антитела, създадени срещу немодифицирани LTP1, докато ELISA се осъществява съгласно стандартни процедури, както са описани по- нататък.

Концентрацията на зърнени- LTP в позната бира е по- малка от X и далече по- малка от XI, където X и XI означават нивата, получени за бира, варена от сурови материали, които чрез използването на ЕВС стандартният метод за пасиране дава конгресен слад с концентрация на зърнени- LTP, съответстваща на 125 pg/ ml и 150 pg/ ml, съответно, за зърнени - LTP, измерено с ELISA с помощта на антитела, създадени срещу немодифицирани LTP1.

Терминът “първи слад” обозначава слада, получен в първия филтрационен етап преди промиването на филтрационната утайка.

Терминът “сладък слад” обозначава слада, получен след финалният етап на филтрация, т. е. след като филтрационната утайка е промита с вода. Сладкият слад поради това е смес от първият слад и промивната вода.

Терминът “слад” обозначава крайният слад след промиване, филтриране и варене.

Най- напред, всички зърнени- LTP присъстващи в слада могат да бъдат намерени в бирата, получена от него. 1 ml от слада обикновено дава около 1 до 2 ml бира.

Това означава, че слад с концентрация на зърнени- LTP 125 pg/ ml може да даде бира с концентрация на зърнени- LTP до 125 pg/ ml.

Стандартната ЕВС процедура на промиване е описана детайлно в ^ANALYTICA- ЕВС**, четвърто издание, 1987, стр. Е59, публ. от Brauerei und Getranke- Rutidschau, CH- 8047 Zurich, Switzerland.

Напитката съгласно изобретението включва за предпочитане поне 25 Mg/ ml зърнени- LTP, докато стандартната концентрация на зърнени- LTP и в частност LTP от семена на зърнени култури е 100 pg/ ml или повече.

Зърнените- LTP могат да бъдат разпознати по тяхната секвенционна структура.

Концентрацията на зърнени- LTP може да бъде измерена с помощта на Ензимно- свързано имуносорбентно изпитване (ELISA) за зърнени- LTP. Такива зърнени- LTP ELISA не са достъпни на пазара, но могат да бъдат получени следвайки стандартни техники, които влючват етапите :

а) получаване на антитяло срещу зърнени- LTP чрез имунизиране на животно, получаване на серум и пречистване на антитялото,

В) биотиниране на антитялото, и

с) правене на LTP стандартна крива посредством конкурентна ELISA процедура, Включваща компонент, който може да бъде измерен чрез напр. спектрофотометър.

ELISA методите като такива са обикновено познати на специалистите в областта и представлява един от най- общоприетите методи за измерване на биологично активни компоненти.

Информация относно ELISA изпитването може да бъде намерена в литературната справка под N 23.

За предпочитане, напитката съгласно изобретението съдържа още хордеин, глутеин, други албумини като протеин Z, получаван от бирата и/ или хмелови компоненти като хмелови изо- а киселини и други горчиви смоли от хмела Тези компоненти притежават стабилизиращ пяната ефект и синергитичен ефект за формиране на пяната със зърнените - LTP.

Напитката може също да съдържа въглехидрат, липиди и/ или мастни киселини Тези компоненти подобряват вкуса и консистенцията на напитката

Някои от маркираните по- горе компоненти, като хордеин, хмел и липиди, могат да бъдат комбинирани с LTP, ако са варени заедно.

При модифициране на зърнените LTP чрез Варене с хмелови компоненти и/ или триглицерид, свойството им за ценообразуване се подобряват.

Напитката може да съдържа също и други компоненти в малки количества, като стабилизатори (алгинови киселини, алгинат, карагенан, глицериди, гумиарабика, пектин), изкусвени подсладители, овкусители, оцветители, витамини, минерали, консерванти, еффересцентни средства, антиоксиданти и ензими, по- специално разграждащи протеина ензими и въглехидрат разграждащи ензими.

Когато напитката от настоящето изобретение е бира, съдържанието на зърнени- LTP е за предпочитане повече от 5 тегл. % , по- специално 10 тегл. %, и най- вече повече от 15 тегл. % от общото протеиново съдържание. Теглото на модифицираните зърнени- LTP се изчислява като теглото на съответното количество немодифицирани зърнени LTP, т. е. теглото на други компоненти, свързани към зърнени- LTP не е включено.

Настоящето изобретение включва също метод за получаване на напитка, съдържаща протеин и/ или пептид. Този метод се характеризира с особеностите по претенция 11.

Зърнените- LTP може да бъдат добавяни във всяка форма, при условие че е поне частично разтворима.

На практика те могат да бъдат добавяни под формата на смлян или натрошен зърнен материал или под формата на екстракт от зърнени материали.

Такъв екстракт може да бъде получен по който и да е начин, напр. чрез варене и/ или пасиране на зърнени или зърнени материали в течност и, по желание, пречистване на филтрата. Течността може да съдържа в зависимост от предпочитанието хмел и/ или масти, по- специално

триглицериди. Екстракта може също така да бъде изсушен, т. е. чрез лиофилизация или разпръсквателно сушене.

Зърнените LTP могат напр. да бъдат получени в модифицирана форма от бира както е описано в примера по- нататък.

Зърнените- LTP могат също така да бъдат получени от микроорганизми, напр. дрожди, гъби или бактерии, съдържащи ДНК последователността, която кодира зърнени- LTP в генома им. Доколкото са известни множество ДНК последователности, кодиращи зърнени- LTP, специалиста в областта би бил способен да включи подобна последователност в генома на бактерии, дрожди или гъби чрез използването на познати техники. Дрождите могат да бъдат напр. Saccharomyc.es carlsbergensis или cerevisiae.

Зърнените LTP могат да бъдат получени напр. чрез продуциращи зърнени- LTP микроорганизми В напитката в етапа на ферментираме.

Ако напитката не е ферментационна, зърнените LTP за предпочитане се добавят под формата на пречистен разтворим ектракт.

Зърнените LTP може да бъдат добавени към ферментационната напитка и под форма на пречистен разтворим екстракт, но получаването на ферментационна напитка обиковено включва етап на филтриране, където може да няма нужда да бъде пречистван зърненият LTP екстракт.

Зърнените LTP могат да бъдат добавяни в който и да е етап на получаване на напитката, изцяло наведнъж или малко по малко, непрекъснато или с прекъсвания.

Когато напитката е бира, зърнените LTP могат да. бъдат добавяни напр. в етапа на получаване на малца от зърното, което е доведено до високо съдържание на LTP. напр. чрез използване на генетична трансмисия.

Зърнените LTP могат да бъдат добавяни също и по време на получаването на слада, напр. под формата на смлян или натрошен зърнен материал, в частност смляни семена, които се добавят преди етапа на пасиране.

Настоящето изобретение включва също приложение на зърнени- LTP като пенообразуваща добавка в напитка. Това приложение е претендирало в претенции 21- 23.

Когато зърнените LTP се използват съгласно изобретението, те могат да бъдат комбинирани с други компоненти включително протеини, но се предпочита зърнените LTP да се състоят от поне 15%, още по- добре от 25% тегл. от общото протеиново съдържимо. Теглото на модифицираните зърнени LTP се изчислява като теглото на съответното количество немодифицирани зърнени LTP, т. е. теглото на други компоненти, свързани към зърнените LTP не е включено.

Изобретението ще бъде описано по- подробно със следните примери, фигура 1 показва кула за пяна за 1. 651 бира, конструирана от боросиликатно стъкло.

фигура 2 показва гел филтрация на разрушена пяна от третата флотация на лагерна бира върху Сефадекс G- 75 (5 см х 87 см, 1700 ml), еквилибрирана с 50 тМ амониев ацетат, pH 4. 5.

фигура 3 показва зависимостта на потенциала на пяната от концентрацията на LMW в проби от пяна.

фигура 4 показва зависимостта на времето на полу- живот на пяната при концентрация на HMW във вода, съдържаща 0. 3 mg/ ml LMW.

фигура 5 показва:

A) SDS- полиакриламидна гел електрофореза на HMW, LMW и ечемичени LTP1. (20% хомогенен гел. Phastsystem. Оцветяване no Coomassie Blue R 350).

B) РазслояВане no Westwm HMW. LMW и ечемичени LTP1 с помощта на специфични антитела срещу ечемичени LTP1.

фигура 6 показва йонообменна хроматография на LMW върху Ssepharose Fast Flow (5x7 cm, 135 ml) еквилибрирана c 20 mM Na ацетат, pH

4. 9------NaCl градиент;______абсорбция при 280 nm.

фигура Ί показва потенциалите на пяната, получени от проби пяна, осъществени на дистилирана вода, съдържаща повишаващи се концентрации на Pool I, Pool III или LTP1. Концентрацията на разтвореният протеин е изчислена от амино киселинните анализи.

фигура 8 показва потенциалите на пяната, получени от пробите пяна, осъществени на бира, съдържаща повишаващи се концентрации на Pool I, Pool III или LTP1. Концентрацията на разтвореният протеин е изчислена от амино киселинните анализи.

фигура. 9 показва потенциалите на пяната, получена от пробите пяна, осъществени на водни разтвори, съдържащи повишени концентрации от ечемичени - LTP самостоятелно или в присъствието на 0. 4 mg/ ml Pool I.

Концентрацията на разтвореният протеин е изчислена от амино киселинните анализи.

фигура 10 показва потенциалите на пяната, получена от пробите пяна осъществени на водни разтвори съдържащи повишени концентрации на Pool Ш самостоятелно или в присъствието на 0. 4 mg/ ml Pool I. Концентрацията на разтвореният протеин е изчислена от амино киселинните анализи.

фигура 11 показва гелфилтрация на Pool III, изолиран от третата флотация на лагерна бира върху Sephadex G- 50 , еквилибрирана с 20 тМ NaAc, 0. 1 М NaCl, pH 4. 9.

фигури 12А и 12В показват Ή NMR спектъра на LTP1 от ечемичено зърно и LTP1 от бирена пяна, съответно.

Получаване на малц

Използваният в следващите примери малц е получен като лагерен малц (светъл малц).

ПОЛУЧАВАНЕ НА КОНГРЕСЕН СЛАД С ПОМОЩТА НА СТАНДАРТЕН МЕТОД НА ПАСИРАНЕ

Смилане g малц се смила и 50 g брашно се прехвърля в съда за разбъркване на мъстта.

Процесът на смилане се осъществява в дискова мелница на Buhler- Miag с разстояние 0. 2 тт между дисковете.

Пасиране

Ваната за пасиране се темперира до около 45° С.

200 ml дистилирана вода с температура около 46°С се отлива в съда за разбъркване със стъклена пръчка за избягване на формирането на топчести образувания.

Установява се, че температурата на масата е точно 45°С.

Съда за разбъркване се поставя веднага във вана за пасиране и бъркалката се включва. Температурата на мъстта се поддържа на 45°С за точно 30 минути. След това тази температура се повишава с 1°С за минута в продължение на 25 минути.

След като се достигне температура 70 °C, се добавят други 100 ml дистилирана вода със 70° С. Температурата се поддържа на 70°С в продължение на 1 час. Мъстта се охлажда до стайна температура за 10 -15 мин. Бъркалката се промива с малко количество дистилирана вода, изсушава се извън съда за разбъркване и съдържимото му се довежда до 450. 0 g чрез добавяне на дистилирана вода.

филтриране

Съдържанието на съда за разбъркване старателно се разбърква със стъклена пръчка и се изсипва незабавно и изцяло върху филтърна хартия.

Първите 100 ml от филтрата се връщат във филтровалната тръбичка.

филтрацията се спира когато филтрата изглежда сух или в случай на бавно филтриране след 2 часа.

АНАЛИТИЧНИ ПРОЦЕДУРИ

Идентифициране на ечемичени- LTP1 (Разслояване no Western)

SDS полиакриламидна гел електрофореза се осъществява след варене за 15 мин с 10 тМ дитиотреитол с помощта на Pharmacia Phast- System и 20% хомогенни гелове. След това се осъществява разслояване върху нитроцелулоза в апарат Phast- System при 70°С за 30 минути. След промиване с вода, нитроцелулозата се инкубира за 30 мин с телешки серум за блокиране на неспецифичното свързване и след това се инкубира за една нощ със специфични LTP1 антитела (получени както е описано в Пример 8. След това се прилага Promega Westwrn blot АР system (Каталожен N W3930) за откриване на специфично антитяло свързване. Смес от нитро блу тетразолиум и 5- бромо- 4- хлоро- 3- индолил фосфат се използва като субстрат за развиване на цвета за алкална фосфатаза.

(Съгласуване на N- крайни амино киселини)

Съгласуването на N - крайни амино киселини се осъществява на газовофазен секвенатор Applied Biosystems модел 470А с помощта на програма, осигурена от компанията. Амино киселините, белязани с фенилтиохидантоин от секвенатора се идентифицират on- line чрез обратно- фазова HPLC с помощта на фенилтиохидантоинов анализатор Applied Biosvstems модел 120А

Съставът на амино киселините се определя върху LKB, модел Alpha Plus, анализатор на амино киселини след хидролиза в 6 М HCI при 110°С за 24 часа във вакуумна среда.

Определяне на въглехидратното съдържимо

Въглехидратното съдържимо се определя по метода с фенол/ сярна киселина (7).

Определяне на протеиново съдържимо

Протеиновото съдържимо се определя ат амино киселинните анализи или чрез метода на свързване на багрило на Bradford (5).

Изпитване на пяната

За измерване потенциала на пяната и времето на нейния полу- живот се използва оптико- електрична система за изпитване на пяната (8, 9) чрез анализ на дигитален видео образ на проба от 10 ml. Потенциалът на пяната (Р) е количеството пяна в ml, формирана отначахо за 1 ml проба Времето на полу- живот (F) е времето в секунди, необходимо на стълба пяна да достигне половината от началния обем. Съдържанието на пяната е потенциала на пяната умножено по обема в ml. фракции или пулове от фракции, получени след хроматография се диализират срещу дистилирана вода в диализна мембрана Spectra/por® (граница 3 500 Далтона) преди осъществяване изпитването на пробата или лиофилизирането й за отстраняване на амониев ацетат. Изпитването на пяната се провежда четирикратно.

Анализаторът за изпитване стабилността на пяната, System Carlsberg, (21) се използва за изпитване на проба от бутилирана бира, съдържаща СО₂. Полу- изтичането на пяната, определено по този метод, е полу- животът (в секунди) за спадането на пяната в бирата след пълно превръщане на 150 g бира в пяна. ТоВа спадане, след едно начално забавяне от 30 секунди, е процес от първи порядък (22).

ПРИМЕР 1

Изолиране и пречистване на зърнени -LTP от семена на ечемик (LTP1)

Процедура a)

Чисти ечемичени LTP се изолират от 25 kg ечемичено брашно (сорт Alexis, отгледан 6 Дания през 1992) чрез екстракция с 2501 вода при pH 6. 5 за 2 часа. Сместа бе оставена за една нощ при 2°С, което да позволи на материала да преципитира. Супернатантата се концентрира чрез ултрафилтрация. След 2- 3 часа при 2°С преципитата се отстранява чрез центрофугиране и към супернатантата се добавя амониев сулфат при 75% насищане. След 16 часа при 2°С получената в резултат суспенсия се центрофугира, водещо до получаване на преципитат, който би могъл да бъде съхранявай на 2°С в продължение на няколко седмици. Една четвърт от преципитата се разтваря в 500 ml вода, загрява се до 100°С и незабавно се охлажда върху лед. Разтворът се центрофугира за отстраняване на каквопю и да е преципитирано вещество и се диализира на диализна мембрана Spectra/ рог® (граница 3 500 Далтона) срещу вода. След центрофугиране диализата, доведен до pH = 7. 0 чрез добавяне на NaOH се подлага на йонообменна хроматография на колона от СМ цеулоза (5 см х 25 см, 500 ml), еквилибрирана с 20 тМ Na- фосфат, pH 7. 0. Разслояване no Western показва, че ечемичени LTP1 следва да бъдат елуирани с градиент NaCl от 0 до 0. 1 М. фракции, съдържащи LTP1 се комбинират, диализират в мембрана Spectra/ рог® срещу вода и се прилагат на S- Sepharose Fast Flow колона (5 cm х 15 cm, 300 ml), еквилибрирана в 20 тМ Hepes, pH Ί. 0. Ечемичените LTP1 се елуират чрез прилагане на градиент на NaCl от 0 до 0. 3 М NaCl 8 същия буфер, фракции, съдържащи ечемичени LTP1 както е установено чрез разслояване no Western се отливат, диализират срещу дистилирана вода в Spectra/ рог® диализна мембрана и се лиофилизират. Съгласуването на N- кайните амино киселини показва последователността Leu- Asn- *- Gly- Gin- Vai- Asp- Ser- , където звездата означава празна позиция, съответстваща на цистеин, намерен в тази позиция в LTP1 и което показва, че изолираните LTP1 са чисти.

Процедура b)

Аналогично на процедура а) с изключение на това, че етапа на нагряване се прескача.

Няма наблюдавана разлика в свойствата на пенообразуване или имунореактивността за LTP, получени съгласно процедура а) или Ь).

ПРИМЕР 2

Пречистване на LTP1 от бирена пяна

Конструира се непрекъсната колона за пяна от боросиликатно стъкло, както е показано на фиг. 1. Пяната се получава от 15 I ( или от 1. 651 в който случай цялото количество химикали се редуцира от фактор 9) от лагерна бира чрез разпръскване с 450 mV min азотен газ за една нощ. Азотният газ се насища с водна пара преди въвеждане в кулата за пяна Пяната, събрана на изхода се разрушава и разрежда с оригиналния обем бира с дистилирана вода и отново се въвежда в кулата за пяна. Втора и трета флотация се осъществяват както е описано по- горе, и е установено, че пяната, събрана от третата флотация на лааерувала бира съдържа 35% от общото съдържимо на пяна в оригиналната бира.

Компонентите, съдържащи се в разрушената пяна от предишната флотация се разделят съгласно молекулното им тегло чрез гел филтрация върху Sephadex G- 75 в колона (5 cm х 87 cm, 1700 ml), еквилибрирана с 50 тМ амониев ацетат, pH 4. 5. Гел- филтрацията на разрушената пяна от третата флотация върху Sephadex G- 75 води до получаване на три пика на абсорбция при 280 пт (фиг. 2). Два от тях са наречени HMW и LMW, съответно, както е показано на фигура 2. HMW- фракцията е съставена от около 90% въглехидрат и 10% протеин, докато LMW- фракцията е съставена, от 90% протеин и 10% въглехидрат. Третият пик е установено че съдържа, съединения с ниско молекулно тегло като амино киселини, изохумулони (горчиво вещество на хмела) и въглехидрати.

Амино киселинният състав на LMW фракцията и събраните ракции възстановяват амино киселинният състав на добре познатия ечемичен липид трансфериращ протеин (LTP1) (18) (Таблица II). SDS полиакриламидната гел електрофореза на LMW показва петно от оцветяване с Coomassie Blue R 350, покриващо молекулни тегла в интервала 6 000-18 000 Далтона (фигура 5). Обаче, разслояване no Westwm с помощта на специфични антитела срещу ечемичени- LTP1 показва, че ечемичени LTP1 (молекулно тегло 9 700 Далтона) са основният компонент на LMW (фиг. 5). Това се потвърждава от съгласуването на N- крайните амино киселини.

Амино киселинният състав на LMW показва тВърде Високи степени на Pro и Glx В сравнение с този на ечемичен LTP1 (18) (Табл. II), Вероятно дължащо се на присъствието на хордеиноВи и глутеинови фрагменти; петното, установено със сребърно оцветяване след SDS полиакриамидна гел електрофореза би могло да е от такива фрагменти.

LMW- фракцията от пяна се подлага на лиофилизация за отстраняване на амониеВ ацетат. LTP1 се пречиства от LMW- фракцията, получена от 15 1 лагерувала бира чрез йонообменна хроматография Върху S- Sepharose Fast Flow (фиг. 6). LMW фракцията се прилага върху колона (5x7 cm, 135 ml), еквилибрира се с 20 тМ Na ацетат, pH 4. 9 и след промиване LTP1 се елуира (Пул II- IV, фиг. 6) чрез прилагане на линеарен Nel градиент (0- 0. 3 М) В същият буфер. Пропусканата фракция и трите събрани фракции съдържащи LTP1 както е определено чрез разслояване no Western се диализират срещу дистилирана вода в Spectra/ рог® диализна мембрана (граница 3 500 Далтона) и се лиофилизират.

Ултрафилтър: DDS- GR81PP, Dow Filtrations, Denmark

Spectra/рог® Spectrum Medical Industries, Inc., USA CM- cellulose: Whatman Biosystems Ltd., England

S- Sepharose Fast Flow: Pharmacia, Sweden

Sephadex G- 75: Pharmacia, Sweden

ТАБАИЦАЛ

Пулове от хроматография на LMW върху S- Sepharose Fast Flow

	Пул I	Пул II	Пул III	Пул IV	LMW	LTPla)
Asx (mol %)	7.8	11.5	14.3	14.5	12.6	16.5
Thr (mol %)	6.1	4.3	3.8	3.7	4.5	3.3
Ser (mol %)	6.7	7.3	7.8	7. 8	7.4	8.8
GIx (mol %)	20.7	13.7	10.2	9.6	13.3	6.6
Pro (mol %)	9.6	8.5	7.8	7.9	8.1	6.6
Gly (mol %)	7.1	8.5	9.6	9.6	8.9	9.9
Ala (mol %)	7.3	6.3	5.5	5.8	6.1	4.4
1/2 Cys (mol %)	4.3	6.5	7.6	7.5	6.4	8.8
Vai (mol%)	6.8	6.9	6.4	6. 1	6.6	6.6
Met (mol %)	2.2	1.6	1.3	1.2	1.6	1.1
lie (mol %)	3.7	4.6	5. 1	5.0	4.7	6.6
Ley (mol %)	7.8	7.8	7.4	7.2	7.5	6.6

Туг (то! %) Phe	1.7 2.5	2.1 1.5	2.5 0.6	2.5 0.6	2.3 1.2	3.3 0
(mol %)
Hys	1.2	1.7	1.8	2.0	1.7	2.2
(mol %)
Arg	2.5	4.1	4.6	5.0	4.1	4.4

(mol %)

Протеин (mg)	87	33	190	38	398
Въглехидрат (mg)	24	1.3	0	0	25.6
Полу-живот⁴⁾ (sec.)	365	44	68	54	172
Потенциал на пяната⁴’ ml пяна/ml проба	1.3	1.1	1.5	0.8	1.3
Съдържание на пяна	378	73	658	63	1260

a) Степени no (18)

b) Измерено във водни разтвори с А(280 пт) — 0. 5

Амино киселинните анализи след хидролиза на киселините (Таблица II), представени на амплитудата на критичната точка и трите пула включващи широката амплитуда показват, че критичните фракции притежават амино киселинни състави, събиращи хордеини и глутеини с високо съдържание на Glx и Pro, докато широката амплитуда, елуирана при NaCl градиента се оценява като твърде чист LTP1 от амино киселинните анализи (Таблица II) и от съгласуването на N- крайните амино киселини, макар SDS полиакриламидната гел електрофореза все още да показва следи от оцветяване с Coomassie съединения с молекулни тегла в интервала 6 000 -18 © 000 Далтона в трите пула, които включват широка амплитуда на елуиране.

Както хордеиновите, така и глутеиновите критични фракции (Пул I) и LTP1 фракциите (Пулове II - IV) образуват пяна с добър потенциал във вода (Таблица II), но полу- живота на пяната за LTP1 фракциите е твърде нисък, обратно на хордеин/ глутеиновата фракция, образуваща пяна с висока степен на полу- живот (Таблица II). Изчисляването на съдържанието на пяна в четирите пула показва, че 95% от съдържанието на пяната се основава на LM\V, налично в четирите пула (Таблица II).

ф ПРИМЕР 2А фракциониране на Пул Ш

Пул III, получен от лагерна бира, както е описано в Пример 2, се подлага на фракциониране по молекулно тегло чрез гел филтрация на Sephadex G- 50 в колона (2. 6 cm х 67 cm, 330 ml) еквилибрирана с 20 тМ NaAc, 0. 1 NaCI, рП 4. 9. Това разделяне води до получаване на два абсорбционни пика - при 280 пт, пул А и пул В (фигура 11). SDS- PAGE при нередукционни условия и разслояване по Westwm с помощта на спецефечни антитела срещу ечемичени - LTP1 показват, че пул А е съставен главно от димерни форми на LTP, но са наблюдавани и по- големи мултимерни форми. В противовест на това, в пул В са намерени само мономерни LTP1.

ПРИМЕР 2В

Записва се Ή NMR спектъра на LTP1, получен от ечемик (Пример lb) и LTP, получен от бирената пяна, съответно. Спектърът е записан при 310 К (37°С)ирН4. 0.

Получените в резултат спектри са показани на фигури 12А и 12В.

Спектърът на LTP1 от ечемичени зърна показва Ή NMR спектър, който е типичен за глобуларните протеини, където повечепю от вторичните структури са а- хеликоидални.

Това се вижда от повечето от Н“ ядрата, притежаващи химичен пренос под 4. 8 ррт. Нещо повече, дисперсията на NMR сигналите е отчетлива индикация, че съществена част от протеина е огънат и че това е добре дефинирана вторична структура.

Подробен анализ на COSY (корелационна спектроскопия), TOCSY (тотална корелационна спектроскопия) и NOESY (ядрена оверхаузер спектроскопия) спектрите потвърждават факта, че LTP1 на ечемичени зърна е алобуларен протеин с добре дефинирана структура.

Спектърът на LTP на бирената пяна (фиг. 12В) е типичен за протеини които са изцяло или частично огънати, които по същество нямат вторична или третична структура. Може да се заключи, че LTP1 изолиран от бира е повече или по- малко денатуриран.

ПРИМЕР 3

Пречистване на LTP1 от първи слад

Първи слад е получен от продукцията на лагерна бира от Карлсбергската пивоварна. Сладът се центрофугира за 30 мин при 4 000 грт за отстраняване на каквито и да са неразтворими материали. Добавя се амониев сулфат до крайна концентрация 85% и след 16 часа на 4°С получената в резултат суспенсия се центрофугира за 30 мин при 4 000 грт. Преципитата се разтваря в 300 ml вода и 2 х 60 ml се подлага на гел филтрация със Sephadex G- 75 в колона (5 cm х 87 cm, 1700 ml), еквилибриран с 50 тМ амониев ацетат, pH 4. 5. Елуационните образци са сходни с тези, получени при гел филтрация на разрушена пяна (фиг. 2). Комбинираните LMW фракции се лиофилизират (за отстраняване на амониевия ацетат), разтварят се във вода, диализират се и се подлагат на йонообменна хроматография върху S- Sepharose Fast Flow (5x7 cm), еквилибрирана c 20 тМ Na ацетат, pH 4. 9. LTP1 се елуира c линеарен NaCI градиент (0- 0. 3 M) в същия буфер. Елуационният профил е сходен с този, показан на фиг. 6 за фракциониране на LMW фракция, изолирана от пяна, фракции, състоящи се от Пул III се събират и диализират срещу дистилирана вода в Spectra/ рог® диализна мембрана (гранични 3 500 Далтона) и се лиофилизират. Концентрацията на LTP1 (модифицирани и немодифицирани) се определя чрез амино киселинен анализ.

ПРИМЕР 4

Фракциите HMW и LMW получени от лагерна бира, както е описано в Пример 2 се тестуват за способността им да формират пяна във вода. Получените резултати са изложени на Таблица III.

ТАБЛИЦА III

Потенциал на пяната (Р) и времето на полу- живот на пяната (F) за смеси от HMW и LMW във вода

LMW	HMW (pg/ml)
(pg/ ml)	0		0. 3 0. 6
75 Р (ml пяна/ml	0. 56 ±0.04	0.63 ±0.04	0.68 ±0.03
проба)
F(sec)	199 ±15	251 ± 67	236 ±26
150 P (ml пяна/ ml	0. 89 ±0.05	0. 95±0. 03	0.97 ±0.03
проба)
F (sec)	177 ± 14	251 ±27	309 ±30
300 P (ml пяна/ ml	1. 34 ±0.02	1.34 ±0.09	1.40 ±0.01
проба)
F ( sec)	185 + 32	251± 18	251 ±29
600 P (ml пяна! ml	1. 89 ±0. 08	1. 99±0.15	1. 83 ±0. 05
проба)
F (sec)	208 ± 61	258 ±65	239 ± 10

LMW

HMW (pg/ ml)

1. 2 2. 4

75 Р (ml пяна/ ml проба)	0. 69 ± 0.06	0.75 ±0.05
F (sec)	300 ± 3	313 ±71
150 Р (ml пяна/ ml проба)	1. 04 ± 0. 03	1.09 ± 0.05
F (sec)	276± 8	293 ±37
300 Р(т1 пяна / ml проба)	1. 41 ±0.05	1.47±0.06
F ( sec)	290 ±39	290 ±29
600 Р (ml пяна/ ml проба)	2. 01 ±0.09	2.-10 ± 0.07
F(sec)	263 ± 102	277 ±24

Резултатът показва, че концентрацията на LMW фракцията има голямо влияние на потенциала на пяната и респективно на концентрацията на HMW. Това се илюстрира на фигури 3 и 4 с помощта на стойностите от Таблица Ш.

ПЕИМЕР1

LTP1 е изолиран от 5 различни лагерни бири, различаващи се по техния потенциал на пяната. LTP е получен от 1. 65 1 бира по същество както е описано в Пример 2, само с помощта на разделяне върху Mono S вместо върху

S- Sepharose Fast Flow.

Лагерните бири са получени от различни ечемичени сортове а именно :

А:	Blenheim
В:	Caruso
С:	Grit
D:	Eminant
Смес:	Смес от неизвестни сортове ечемик

Резултатите са видни на Таблица IV.

ТАБЛИЦА IV

Изследване на стабилизиращите пяната фракции от лагерна бира, получена от различни сортове ечемик

Малц	Смес'*’	А	В	с	D
	Пот. на пяната ml пяна/ml	0.72	1.13	1. 13	1.44	1.20
Бира	Време на полуживот (sec)	181	200	189	258	179
	Съдърж. на пяна	715	1130	1130	1440	1200

2-ра флотаци	за 1 бира Възст. нз протеина (%) Оьд. на пяна за 1 бира	32 240	21 490	32 360	30 670	31 520
HMW	Протеин (% w/w)	16	12	8	15	14
	Въалех. (% w/w)	84	88	92	85	86
	Съдърж. на пяна за 1 бира	210	160	190	270	210
LMW	Протеин (% w/w)	86	76	71	76	85
	Въалех. (% w/w)	14	24	29	24	15
Моно S^d)	фракция при пуск (% прот)	25	10	40	8	8
	Елуирана	75	90	60	92	92

фракция (% npom)

а) Хмел не е използван

b) Йонообменна смола, Pharmacia, Sweden

ПЕИМЕЕ-6

Изпитването на пяната се осъществява на LTP1, изолиран от ечемичено брашно както е описано в Пример 1, процедура Ь) и на Пул I и Пул III, получен от лагерна бира, както е описано в Пример 2.

Използваната вода е дистилирана вода.

Използваната бира е лагерна бира марка Карлсберг.

Във всеки тест се използват 10 ml от водата или бирата и пуловете или LTP се добавят незабавно преди образуване на пяната както е описано порано.

При повишаване концентрациите на изолирания LTP1, Пул I или Пул III се разтварят във вода или бира, съответно, разтворите показват повишен потенциал на пробите от пяна (фигури 7 и 8), макар увеличението потенциала на бирата да е по- малко ясно изразен за разтворите от бира (фиг. 8), отколкото водните разтвори (фиг. 7), вероятно благодарение на позитивните компоненти на пяната, които вече присъстват в бирата. При ниски протеинови концентрации, ефекта на добавяне на бирената LTP1 фракция (Пул III) е по- голям от фракцията, съдържаща хордеин/ глутеинови фрагменти (Пул I). Добавяне на LTP1, изолиран от ечемичено брашно към бирата повишава както потенциала на пяната (фиг. 8), така и времето на полу- живот на пяната. Нещо повече, ефекта на потенциала на бирата при повишени концентрации на LTP1 (Пример 5) е по- ясно изразен за LTP1, изолиран от бира (Пул III), отколкото LTP1, изолиран от ечемик (фиг. 8). Рекомбинационните експерименти, напр. изпитване на бирата, осъществено на разтвори от 0. 4 nig/ ml Пул I в дистилирана вода с повишени концентрации на LTP1, изолирани независимо дали от ечемик или от бира (Пул III) потвърждават това наблюдение (фигури 9 и 10). Ефекта на ечемичени LTP1 върху потенциала на пяната в присъствие на Пул I е помалък от ефекта на сходна концентрация от Пул III.

ПРИМЕР 7

ELJSA изпитване (за определяне концентрацията на LTP1)

Получаване на антитела срещу ечемичени LTP1

Имунизират се два заека със 100 pg ечемичени LTP1 (получени от брашно на ечемик сорт Алексис както е описано в Пример 1, процедура а)) за имунизация съгласно стандартната имунизационна схема, използвана от Dako, Glostrup, Denmark.

От всяко животно са получени 20 ml серум 54 дни след първото инжектиране и след това на месечни интервали.

Серумът, получен от първото взимане на кръв от едно животно се използва по време на експериментите, описани по- долу.

Пречистване на антитела

Антитела от имуноглобулиновия клас G (IgG) се пречистват от други серумни компоненти чрез афинитетна хроматография върху Протеин АSepharose (Pharmacia, Uppsala, Sweden) съгласно инструкциите на производителя.

Антителата, разпознаващи LTP1 се разделят от антителата с други специфики чрез афинитетна хроматография върху малка колона, изготвена от коваленпшо присъединени LTP1 от ечемик към Sepharose. 64 mg ечемичени LTP1 се разтварят в 10 ml 0.1 М NaHCO ,,0,5 М NaCl при pH 8. 3 и се куплират към 2 g активирана с CNBr Sepharose 4В (Pharmacia, Sweden) съгласно инструкциите на производителя. След това 1т1 от имуноаясорбенгпа се напълват в малка, колона и се еквилибрират с 10 тМ

натриев фосфат, 150 тМ NaCl, pH 7. 3 (PBS₁₀). Имуноглобулиновата фракция, пречистена чрез хроматография на протеин A- Sepharose се прилага Върху колона, която се промива с екбилибрационен буфер докато стойността на А^ достигне 0. 002. Свързаният IgG се елуира с 0. 05 М мравчена киселина, pH 2.0, разредена с 4 обема 10 х PBS₁₀ и pH се довежда до

4. 0 с NaOH. Накрая пробата се диализира срещу PBS₁₀ 8 мембрана Spectra/ рог® мембрана (гранични размери 3 500 Далтона) и се подлага на биотинилиране както е описано по- долу.

Биотинилиране на антитела mg антитела в 1 ml PBS се смесват с. 0.1 ml натриево карбонатен буфер с pH 9. 5. След това антителата се биотинилират чрез добавяне на 57 μΐ 0. 1 М BXNHS (биотинамидокапроатен Ν- хидроксисукцинимиден естер от Sygma, USA, Cat. No. В 2643) в DMSO (диметилсулфоксид). Сместа се оставя 1 час на стайна температура. След тованереагиралият BXNHS се отстранява и буферът се променя до PBSi₀ чрез гелфилтрация, осъществена съгласно инструкциите на производителя върху малка колона с възможност за отвеждане на продукта Sephadex G- 25 (PD-10, Pharmacia, Upsala, Sweden), еквилибрирана c PBS,_Q. Концентрацията на натителата в реагента се довежда до 1 mg/ ml чрез добавяне на PBS₁₀ към общ обем от 10 ml. След добавяне на 100 mg BSA ( телешки серумен албумин), реагента се съхранява в аликвоти при - 20 °C.

Ензимно свързано имуносорбентно изпитване (ELISA) за LTP LTP се определя посредством конкурентна ELISA процедура.

Отначало пречистеният ечемичен LTP се адсорбира към инертната повърхност на полистиренови кладенчета. Кладенчетата са оформени 6 участъци по 12, а участъците са поместени в рамки, всяка съдържаща 8 участъка (Nunc Immuno

Module С12 M&dsorb from Nunc, Denmark). 200 pl разреден разтвор на LTP1, получен както е описано в Пример 1, процедура а) (100 ng/ ml PBS₁₀) се добавят към всяко кладенче и се инкубират при 4° С, 1620 часа. След това инкубиране, остатъчните места на свързване върху полистиреновата повърхност се блокират чрез инкубиране на 225 μΐ BSA PBST (1 mg BSA/ ml PBST. където PBST e PBS_!0 c добавка на 0.05% Tween 20) във всяко кладенче при 37° С, 1 час. След това кладенчетата се изпразват и промиват шесткратно с PBST посредством съоръжение за ръчно промиване и калибриране на полистиреновите участъци (Nunc Immuno Wash 12 from Nunc, Denmark) и се съхраняват на - 20°C до използването им.

Преди анализирането им, пробите съдържащи LTP1 се разреждат подходящо в SA PBST и стандартните разтвори, получени както е описано в Пример 1, процедура а) се изготвят в същия буфер. Биотинилираните антитела разпознаващи ечемичените LTP1 се добавят до крайна концентрация 100 ng/ ml. 200 μΐ аликвоти от смесите се инкубират след това в кладенчетата за 1 час при 37°С. Всяка проба или стандарт се анализира трикратно. След инкубиране, кладенчетата се изпразват и се промиват както е описано по- рано.

В следващият етап, 200 μΐ аликвоти от стрептавидинов пероксидазен конюгат от хрян (Sygma, USA Cat. No. S 5512), разреден до 250 ng/ ml в BSA PBST се инкубират в кладенчетата 10 минути при 20- 22° С. След това, кладенчетата отново се изпразват и се промиват.

Накрая, 200 μΐ към всяко кладенче се добавя субстратен разтвор, съдържащ 3,3*. 5,5 - тетраметилинбанзидин (ТМВ, 100 pg/ ml) и 0.015% Н, О₂ във фосфатно нитратен буфер, pH 5. 0 и се инкубира за 10 мин при 20 22° С. Ензимната реакция се спира чрез добавяне на 125 μ 1 4Ν IIQ към всяко кладенче и абсорбцията на кладенчетата при 450 пт се измерва в спектрофотометър, калибриращ 96- кладенчовите рамки (Perkin- Elmer Lambda Reader).

Всяка серия анализи включва стандарти в интервала 8 000- 62.5 ng ечемичени LTP1/ ml. Стандартната крива е направена на базата на абсорията срещу логаритъма от LTP1 концентрацията и всички концентрации на LTP1 в проби се изчисляват съответно на тази крива.

Специфичност на антителата

Изградените срещу ечемичени LTP1 антитела и афинитетно пречистени както е описано по- горе, се подлагат на разслояване no Western срещу ечемичени и пшенични екстракти, слад и бира. Не са наблюдавани реакции с други компоненти освен LTP1 или модифицирани LTP1.

В ELISA изпитванията, антителата разпознават LTP1 или модифицирани LTP1 от първия слад и пяна, но в по- малък мащаб от LTP1 от ечемик. Ниската реактивност се дължи на модификациите, случващи се по време на пасирането, варенето на слада, ферментацията и образуването на пяната, В сравнение с концентрациите, определени чрез амино киселинен анализ (Пример 3), реакцията с LTP1 или модифицирани LTP1 от ървия слад е около 65% от реакцията с LTP1, получена от ечемичено брашно както е описано в Пример 1, процедура а). Реакцията с LTP1 или модифицирани LTP1 от конгресен слад се определя като около 90% от реакцията с LTP1, получена от ечемичено брашно. Тъй като стандартната крива е направена на базата на ечемичени LTP (получени както е описано в Пример 1, процедура а), актуалното количество LTP1 или модифицирани LTP1 в конгресен слад може да бъде определен чрез мултиплициране на резултата от ечемичено- LTP1 стандартната крива с 10/ 9.

Добавяне на I. ТР по време на получаването на слада

За изследване ефекта на добавяне на LTP по време на етапа на варене на слада, се установява моделна система. Сладкият слад се вари в колба с кръгло дъно, свързана към рефлуксен оладител за 90 мин, с помощта на кожух. Провеждат се два типа експерименти: а) чисти ечемичени LTP1 от сорт Alexis (DK, 1992), получени както е описано в Пример 1, процедура а) (0. 5 mg/ ml) и/ или екстракт от хмел (61 mg а- киселина /1) се добавят в началото на варенето и Ь) чисти ечемичени LTP1 се добавят към слада (варен или неварен, със или без хмелов екстракт (61 mg а- киселина /1), но не ®се подлагат на варене.

ТАБЛИЦА V

Без добавени Потенциал на Добавяне на Потенциал на

LTP пяната LTP (0.5 g/ml) пяната

Сладък слад	0. 37 ±0. 01	Сладък слад	0. 75 ±0.05
Слад варен без	0. 91 ±0. 96	LTP добавен към	1.15 ±0.02
хмел		слада преди варене без хмел LTP разтворен 6 слад варен без	1. 24 ±0. 09
		хмел
Слад варен с хмел	1. 68 ± 0. 07	LTP добавен към	2.15 ±0.02
		слада преди варенето с хмел LTP разтворен в слад, варен е хмел	1. 93 ±0. 17

ПРИМЕР 9

Бира с висока концентрация на LTP се получава в 50L пилотна пивоварна на Карлсберг, с помощта на 60% лагерувал слад и 40% спомагателни материали (царевично едро смляно брашно). Царевичното брашно е съгласно спецификацията на пивоварната на Карлсберг, и по- специално :

вода - %	< 12.5
екстракт, сухо вещество, %	>89%
мазнини, сухо вещество, %	< 1. 0 %
Сортирани със сито на Pfungstadter	> 2 тт 0 %
	> 1, 27 тт < 3. 5 %

< 0. 25 тт <5.0%

Процесът на варенето на пиво включва изваряване на пулпата и варене на слада за 90 мин с 10 % изпаряване. 15 минути след началото на варенето на слада суровият продукт на LTP1 се добавя към казана със слад. Този продукт се екстрахира от 6 х 25 kg ечемично брашно сорт Алексис, отгледан в Деяния. 1992, концентрира се чрез ултрафилтрация и се преципитира с амониев сулфат както е описано по- горе. Преципшпатът се разтваря в 51 вода, диафилтрира се до 850 ml, нагява се до 100° С и незабавно се охлажда върху лед. Разтворът се центрофугира в центрофуга на Сорвал RC3 за 30 мин при 4 000 грт. Концентрацията на LTP1 в супернатантата, както е определена с ELISA е 60 mg/ ml, и се добавят 800 ml към казана със слада. Крайният слад е 14. 4% Plato. Бирата ферментира с дрожди на Карлсберг (Sacharomyces carlsbergcnsis) в цилиндрични конични танкове. Първичната ферментация се провежда за 9 дни и съзряването и стабилизирането продължава 10 дни. Накрая бирата се филтрира и до 10. 6% Plato.

Способносттта да образува пяна на тази бира и бирата, получена от същият суров материал при идентични условия, но без добавяне на LTP1, се измерва с анализатор за образуване на пяната, System Carlsberg. Времето на полу- живот на пяната на високо - LTP1 бирата се повишава до 113 сек в сравнение с 93 сек за бира без добавяне на LTP1.

ПРИМЕР 10

Нива на LTP1 (сумата от модифицирани и немодифицирани LTP1) в конгресен слад

Малцът се приготвя от множество различни сортове ечемик, които обикновено се използват в пивоварството. Сортовете ечемик са отглеждани в различни местности и са събрани през различили години.

Малцът за лагерна бира се изготвя както следва:

Конгресният слад се изготвя от проби на малца с помощта на ЕВС стандартния метод за пасиране както е описан по- горе.

LTP1 (семата от модифицирани и немодифицирани LTP1) нивата В пробите конгресен слад се определят чрез ELISA процедурата, описана погоре. Анализирани са общо 82 проби слад, които съответстват на 41 проби малц.

ELISA се провежда както е описано В Пример 7 и концентрацията на LTP1 се определя с помощта на стандартна крива като еквивалент на ечемичени LTP1, т. е. без мултиплициране с корекционния фактор.

Резултатите са изложени на Таблица VI. Всяка стойност представя средната стойност между два различни конгресни слада.

ТАБЛИЦА VI

Сортове ечемик Страна на

Година на

LTP в конгресен произхода събиране слад mg/ 1

Триумф	Франция	65
Ариел			70
неизвестен	Австралия		85
неизвестен	Германия	?	108
Алексис	Великобритания	1992	66
Триумф	франция	1992	76
.Ариел	Дания	1992	82
неизвестен	Австралия	9	99
неизвестен	Австралия	9	96
неизвестен	.Австралия	9	78
неизвестен	Англия	9	118
Наташа	франция	1992	118
Халцион	Франция	1992	78
BL. Ills		1991	92
Наташа	франция	1992	104
Наташа	франция	1992	102
Халцион	Дания	1992	109
Каруза	франция	1993	120
Сеньор	Дания	1993	70
Алексис- 81	Дания	1993	»3-1.
Йесика	Дания	1993	93
Чариот	Дания	1993	79
Голди	Дания	1993	84
Локи	Дания	1993	81

Мауд	Дания	1993	110
неизвестен	Индия	1993	121
неизвестен	Индия	1993	103
неизвестен	Англия	?	110
неизвестен	Шотландия	9	117
неизвестен	?	?	140
Ленка	Дания	1992	87
Ленка	Дания	1992	98
неизвестен	9	1993	61
Наташа	Франция	1992	76
Халцион	Дания	1992	69
Алексис	.Англия	1992	75
неизвестен	Дания	1992	100
неизвестен	Англия	1992	99
неизвестен	Англия	1992	93
.Алексис	Дания	1992	92
.Алексис	Дания	1992	91
неизвестен	Англия	1992	102
А\ексис	Дания	1993	67
Триумф	франция	1992	90

Изолиране « пречистване на зърнени LTP от пшеничено брашно

Чисти пшеничени LTP 1 се изолират от 30 kg пшеничено брашно чрез екстракция с 270 ί Вода при рП 7. 8 за 4 часа. Сместа се оставя за една нощ на 4°С което да позволи преципитирането на материала. 195 1 от супернатантата се концинтрира чрез ултрафилтрация до 6. 9 I и останалото брашно се отстранява чрез центрофугиране. Амониев сулфат се добавя до разреждане 80% и след 16 часа при 4° С получената в резултат суспенсия се подлага на центрофугиране. Една четвърт от t преципитата се разтваря в 400 ml вода и се диализира в Spectra/ рог® диализна мембрана (граничен размер 3 500 Далтона) срещу вода. Диализатът се центрофугира, pH се довежда до 6. 5 и се подлага на йонообменна хроматография с помощта на колона S- Sepharose Fast Flow (5 cm x 15 cm, 300 ml) еквилибрирана в 20 тМ Mes, pH 6. 5. Пшеничените LTP1 се елуират чрез добавяне на градиент NaCI (0 до 0. 1 М) в същия буфер.

Фракциите, съдържащи компонента с размерЮ kDa се идентифицира с ъс SDS- PAGE с помощта на Fast- System, Pharmacia, събират се и се концентрират под вакуум при 35° С с помощта на ротационен изпарител. Компонентите 6 концентрираната проба се разделят с гел филтриране върху Sephadex G50 в колона (2. 5 см х 67 см, 330 mi), еквилибрират се с 20 тМ NaAc, 0. 1 Μ· NaCI, pH 4. 9. Пикът, съдържащ 10 kD протеин се идентифицира чрез SDS- PAGE и съгласуване на N- крайни амино киселини, показвайки последователността He- Asp- * - Gly- His- Val- Asp- Ser- Leu- Val-, където звездичката означава празна позиция, съответства на Cys намерен в тази позиция в пшеничени LTP1, потвърждавайки че този компонент е чист пшеничен LTP1. Препаратът се диализира в Spectra- рог® диализна мембрана (граничен размер 3 500 Далтона) и се лиофилизира.

ПРИМЕР 12

Добавяне на пшеничени LTPI по време на получаване на слад

Ефекта от добавяне на пшеничени LTP1 по време на варенето на слада се изследва с помощта на моделна система, описана в Пример 8. Чисти пшеничени LTP (получени както е описало в Пример 11) (0. 5 mg/ ml) и/ или хмелов екстракт (61 mg сс- киселина/1) се добавят в началото на варенето.

Полученият в резултат потенциал на яната е виден на Таблица VII.

ТАБЛИЦА VII

Без добавяне	Потенциал	Добавяне на LTP	Потенциал на
наБТР	на пяната	(0.5 mg/ ml)	пяната ( ml/ ml)
	(ml/ ml)
Слад варен	1. 01+0.04	LTP добавен към	1. 76 ±0.07
без хмел		слада преди варене
		без хмел
Слад варен	1.65 ±0.05	БГР добавен към	2. 28 ±0. 08
с хмел		слада преди варене
		с хме/\

·<

Влияние на варенето Върху потенциала на ценообразуване е ечемичени и пшеничени LTP1

Ечемичени- или пшеничени LTP1 ( 0.5 mg/ ml) получени както е описано в Примери lb и 11, съответно, се разтварят в 20 mM Mes ( 2- (N- морфолино) етан сулфонова киселина), pH 5. 5. Добавят сс 2% етанол (със или без 2. 5 mg/ mi триолеан ) по време на обработка с ултразвук. Дабявя се екстракт на хмел до крайна концентрация 61 mg а- киселина /1 както е описано на Таблица VT!! и сместа се вари за 90 минути както е описано 6 Пример 8. Измерването на пяната се осъществява след добавяне на HMW фракцията (2. 5 pg mi), получена както е описано в Пример 2.

ТАБЛИЦА VIII

	Варене	Добавки	пяната
Ечемичени	-	-	0.78 ±0.02
LTP1	90 мин	-	0. 61 ±0. 03
	90 мин	хмел	1.40 ±0.05
	90 мин	хмел +	1. 92 ±0.05
		трилинеолин
Пшеничени	-	-	0.80-0. 04
LTP1	90 мин	-	1. 02 ±0. 03
	90 мин	хмел	1. 85 Ϊ 0. 06
г	90 мин	хмел +	1. 83 ±0.07
		трилинеолин

ЛИТЕРАТУРНА СПРАВКА

1. «Anderson, Е В. & Harris, G.: Nitroenous constituents of brewing materials. XII. Foam- stabilizing substances in beer. J. Inst. Brew. 69: 383- 388 (1963).

2. Asano, K. & Hashimoto, N.: Isolation and characterization of foaming proteins of beer. J. Am. Soc. Brew. Chem. 38:129- 137 (1980).

3. Bernhard, W. R. & Sornmerville, C. R.: Coidentity of putative amylase inhibitors from barley and finger millet with phospholipid transfer proteins inferred from amino acid sequence homology. Arch. Biochem. Biophys. 269: 695- 697 (1989).

4. Bishop, L R.: Haze- and foam- forming substances in beer. J. Inst. Brew. 81: 444- 449 (£975).

5. Bradford, Μ. M. : A rapid and sensitive method for the quantition of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- dye binding. Anal. Biochem. 72: 248- 254 (1976).

6. Da le, C. J. & Joung, T. W. : Ixrw olecular weigth nitrogenous components and their influence on the stability of beer foam. J. Inst. Brew. 98: 123- 127 (1992).

7. Dubois, M. . Gilles. K. A , Hamilton, J. K. Rebers. P. A & Smith, F.:

Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28.350- 356(1956)

8. Haugsted, C. & Erdal. K. : Head hunting. Proc. Eur. Brew. Conv. . 23th Congress. Lisbon 1991. p. 449- 456.

9. Haugsted, C.: Pedersen, Μ. B. & Erdal, K.: An optoelectricaJ foam assay system. Monatsschr. Brauwissenschaft 43: 336- 339 (1990).

10. Hejgaard. J. & Sorensen, S. B.: Characterization of a protein- rich beer fraction by two- dimensional immunoelectroforetie techniques. Compt. Rend. T'rav. Lab. Carlsberg 40: 187- 203 (1975).

11. Hollemans, Μ. & Tonies, A R. J. M.: The role of specific proteins in beer foam. Proc. Eur. Brew. Conv., 22nd Congress. Zurich 1989. p. 561- 568.

12. Mohan, S. B., Smith, L., Kemp, W. & Lyddiatt, A : An immunochemical analysis of beer foam. J. Inst. Brew. 98:187- 192 (1992).

13. Molina, A , Segura, A & Garcia- Olmedo, F.: Lipid transfer proteins (nsLTPs) from barley and maize leaves are potent inhibitors of bacterial and fungal plant pathogens. FEBS Letters 316:119- 122 (1993).

14. Mundy. J. & Rogers, J. C.: Selective expression of a probable amylase/ protease inhibitor in barley aleurone cells: Comparison to the barley amylase/ subtilisin inhibitor. Planta 169: 51- 63 (1986).

15. Sharpe, F. R., Jacques, D.. Rowsell, A G. &. Whitear. A, L.: Rapid methods of measuring the foam- active nitrogenous components of worts and beers. Proc. Eur. Brew. Conv., 18th Congress Copenhagen 1981. p. 607- 614 (1981).

16. Skriver. K.. Leah. R., Muller- Uri, F., Olsen, F. - L. & Mundy, J.: Structure and expression of the barley lipid transfer protein gene Ltpl. Plant. Mol. Biol. 18: 585- 589 (1992).

17. Slack. Ρ. T & Bamforth, C. W.: The fractionation of polypeptides from barley and beer by hydrophobic interaction chromatogrphy: The influence of their hydrophobicity on foam stability. J. Inst. Brew. 89: 397- 401 (1983).

18. Svensson, B., Asano, K., Jonassen, I.. Poulsen, F. M. . Mundy, J. &

Svendsen. I. : A10 kDa barley seed protein homologous wiih an a- amylase inhibitor from Indian finger millet. Carlsberg Res. Commun. 31: 493- 500 (1986).

19. Whitear. A L. : Basic factors that determine loam stability. T'lie Institute of

Brewing Australia and New Zealand Section. Proc. 15lh Conv. New Zealand 1978. u.

W L

20. Yokoi. S., Maeda, K. , Xiao, R., Kamada, K. & Kamimura. M. :

Characterization of beer proteins responsible lor the loam of beer. Proc. Eur. Brew.

Conv. 22nd Congress. Zurich 1989. p. 503- 512 (1989).

21. Haligren. L., Rosendal, I. and Rasmussen. J. N.: Experiences with a new foam stability analizer, System Carlsberg J. Am. Soc. Brew. Chem. 49:78- 86 (1991).

22. Rasmussen, J. N.: Automated analysis of foam stability. Carsberg Res. Commun 46: 25- 36, (1981).

23. P. Vaag: The Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) in the Beverage Industries: Principles and Practice. In .Analysis of Nonalcocholic Beverages. Modern Methods of Plant Analysis, vol. 8 (Eds. Linskens, H. F. and Jackson, J. F.), Springer- Verlag, Berlin, 1988.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Напитка съдържаща протеини и/ или пептиди, характеризираща се с това, че съдържа зърнени LTP и/ или техни хомолози, определени като протеини с 50 -110 амино киселини, за предпочитане 80-100 киселини, притежаващи поне 60 %, за предпочитане 80% или повече секвенционна хомоложност със зърнени LTP, и/ или модифицирана фракция на зърнени LTP, получена от зърнените LTP и/ или хомолозите им чрез нагряване, варене и/ или пасиране на зърнените LTP и/ или хомолозите им във вода при pH между 3 и 7, при условие, че концентрацията на зърнените LTP и/ или хомолозите им и/ или модифицираната зърнена LTP фракция е поне X, за предпочитане поне Х1. когато напитката е бира, като X и XI означава нивата, получавани при варенето на бирата от суров материал, без по- нататъшно добавяне на LTPсъдържащи материали, чиито сурови материали при прилагането на ЕВС метода на стандартно пасиране дава конгресен слад с концентрация на зърнени LTP съответстваща на 125 pg/ ml, леспективно на 150 pg/ ml немодифициран LTP1.
2. Напитка съгласно претенция 1. характеризираща се с това, че съдържа ечемичени LTP и/ или хомолози както са определени тук и/ или модифицирани зърнени LTP фракции, получавани от ечемичени LTP.
3. Напитка съгласно претенция 1 или 2, характеризираща се с това, че напитката е ферментационна.
4. Напитка съгласно претенции 1. 2 или 3, характеризираща се с това, че концентрацията в напитката е поне 25 j.ig/ ml и за предпочитане повече от 100 iig/ mi.
5. Напитка съгласно която и да е от претенции 1- 4. характеризираща се с това, че съдържа и зърнени протеини като хордсин и/ или глутеин или техни фрагменти.
6. Напитка съгласно която и да е от претенции 1- 5, характеризираща се с това, че съдържа и други албумини, като протеин Z, получаван от бира.
7. Напитка съгласно която и да е от претенции 1-6, характеризиращ се с това, че съдържа и въглехидрати.
8. Напитка съгласно която и да е от претенции 1-7, характеризираща се с това, че съдържа и липиди и/ или мастни киселини.
9. Напитка съгласно която и да е от претенции 1- 8, характеризираща се с това, че напитката е бира.
10. Напитка съгласно която и да е от претенции 1- 9, характеризираща се с това, че съдържа и хмелови компоненти като хмелови изо- α киселини и други горчиви смоли на хмела.
11 Метод за получаване на протеин/ пептид съдържаща напитка, характеризиращ се с това, че зърнени LTP и/ или техни хомолози. определени като протеини с 50 -110 амин киселини, за предпочитане 80- 100 амино киселини, притежаващи поне 60%, за предпочитане 80% или повече секвенционна хомоложност със зърнени LTP и/ или пептид/ протеинова фракция. получавана от зърнени LTP и/ или хомолози чрез нагряване, варене и/ или пасиране на зърнените Ι.ΤΡ и/ или техните хомолози във вода при pH между 3 и 7, се добавят към напитката непрекъснато или в един или повече етапа на получаването, при условие че количеството на добавяните зърнени LTP и/ или хомолозите и/ или модифицираните фракции на зърнените LTP са поне X. за предпочитане поне XI, когато напитката е бира, при което X и XI означават нивата. получавани при варенето на бирата от суров материал, без по- нанатъшно добавяне на LTP- съдържащи материали, които проби материали с помощта на стандартния ЕВС метод за пасиране дава конгресен слад с концентрация на зърнени LTP. съответстващи на 125 ия ml и съответно 150 ug/ mi немодифицирани LTP1.
12. Метод съгласно претенция 11 и включваща етап на пасиране. характеризиращ се с това, че зърнените LTP и/ или техни хомолози и/ или техните модифицирани зърнени LTP фракции се добавят преди етапа на пасиране.
13. Метод съгласно претенция 11 и включващ етап на варене, характеризиращ се с това, че зърнени LTP и/ или техни хомолози и/' или техните модифицирани зърнени LTP фракции се добавят преди етапа на варене.
14. Метод съгласно която и да е от претенции 11-13, характеризиращ се с това, че зърнените LTP са ечемичени LTP1.
15. Метод съгласно която и да е от претенции 11-14, характеризиращ се с това, че зърнени LTP и/ или техни хомолози и/ или техни модифицирани зърнени фракции се добавят под форма на частично или по същество ра зтворим а доба в ка.
16. Метод съгласно която и да. е от претенции 11-15, характеризиращ се с това, че зърнени LTP и/ или хомолози и/ или техни модифицирани зърнени LTP фракции се добавят в количество от поне 25 pg/ ml и за предпочитане повече от 100 pg/ ml.
17. Метод съгласно която и да е от претенции 11-16, където напитката е бира и получаването включва етапите на

i) получаване на малц или малцов екстракт.

ii) получаване на слад, и iii) ферментация на слад а, iv) осветляване и окончателна облаботка на бирата, характеризиращ се с това, че зърнени- LTP и или хомолози и или техни модифицирани зърнени LTP фракции се добавят преди или в един или повече от етапите i), ii), iii) и iv).
18. Метод съгласно претенция '17. характеризиращ се с това, че зърнените LTP и и.хи хомолози ц/ или техни модифицирани зърнени LTP фракции се добавят, по- специално в или преди етап ii).
19. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че зърнените LTP и/ или хомолози и/ или техни модифицирани зърнени LTP фракции са получени от ечемик, който да е така преработен, че да бъде с високо съдържание на LTP, по- специално LTP1 посредством генетично трансмисиране и че малца е получен от суров материал, включващ семена на същия обработен ечемик.
20. Метод съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че зърнени LTP и/ или хомолози и/ или техни модифицирани зърнени LTP фрагменти са получени от дрожди, включващи ДНК последователността, кодираща зърнени LTP, по- специално LTP1 в генома, и че дрождите се добавят в етап iii).
21. Приложение на съединение, съдържащо зърнени ITP и или техни хомолози. определени като протеини с 50- 110 амино киселини, за предпочитане 80- 100 амино киселини, притежаващи поне 60%, за предпочитане 80% или повече секвенционна хомоложност със зърнени LTP и/ или модифицирана зърнена LTP фракция, получено от зърнените LTP и/ или техни хомолози чрез нагряване, варене и/ или пасиране на зърнените LTP и/ или техните хомолози във вода при pH между, 3 и 7 като ценообразуваща добавка към напитката.
22. Приложение съгласно претенция 21, където съединението включва зърнените LTP и' или хомолози и/ или тяхна модифицирана зърнена LTP фракция под формата на смляни или натрошени зърна или зърнени продукти или зърнен екстракт или зърнен продукт.
23. Приложение съгласно претенция 21, където модифицираната зърнена 1 .ГР фракция е получена от зърнени Ϊ.ΤΡ. които са варени във вода заедно с един или повече от следните компоненти : хордеин. хмелови компоненти и