JPH06172388A - 甘味誘導物質ミラクリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ミラクリン含有原料から酸性緩衝塩水溶液に
よって、ミラクリンを抽出する。 【効果】 甘味誘導活性が安定し、着色不純物のない精
製されたミラクリンを効率的に工業生産することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ミラクリンを含有する
原料から甘味誘導物質、ミラクリン（ｍｉｒａｃｕｌｉ
ｎ）を効率的かつ安定的に製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】西アフリカ原産の植物（Ｒｉｃｈａｄｅ
ｌｌａ ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）、通称ミラクルフルーツ
には、これを食した直後に酸味のものを味わうと甘く感
じるという独特の性質を持っている。そして、この作用
は甘味誘導物質ミラクリンによることが知られている。

【０００３】その甘味誘導作用の詳細な機構は現在の所
明らかではないが、ミラクリンそのものとしては精製さ
れ、既に、純品が得られており、分子量４００００前後
の糖タンパク質としてアミノ酸配列も明らかになってい
る（特開平３−２１８４００号公報）。

【０００４】この甘味誘導物質ミラクリンの製造方法と
して、これまで次のような方法が提案されている。

【０００５】１．Ｋ．Ｋｕｒｉｈａｒａ，Ｌ．Ｍ．Ｂｅ
ｉｄｌｅｒ；Ｓｉｅｎｃｅ，１６１，１２４１（１９６
８）によれば、凍結乾燥したミラクルフルーツの果肉を
ｐＨ１０．５の炭酸塩緩衝液中でホモジナイズし活性部
分を抽出する。更に、Ｙ．Ｋｕｒｉｈａｒａ．Ｓ．Ｔｅ
ｒａｓａｋｉ；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃ
ｔａ，７１９，４４４（１９８２）によれば、同様の抽
出処理で得られた抽出液に硫酸アンモニュウムを加えて
塩析して、沈澱物をリン酸緩衝液に溶解し、透析により
硫酸アンモニュウムを除去する。さらに得られた溶液を
等電点電気泳動等で精製した後ミラクリンを得る。

【０００６】２．又、特開昭６２−２４２７００号公報
によれば、ミラクルフルーツの果肉から抽出溶媒とし
て、ｐＨ６〜９付近の中性塩溶液を用いてミラクリンを
抽出する。

【０００７】３．そして、特開昭６３−１８５３４９号
公報によれば、ミラクルフルーツの果肉を粉砕し、水を
添加後ホモジナイズし洗浄液が着色しなくなるまで水洗
いする。洗浄後の果肉に中性の塩化ナトリウム水溶液を
加えミラクリンを抽出する。次に、この抽出液を硫酸ア
ンモニュウムで塩析し、ミラクリン画分の沈澱物を得
る。この沈澱物を中性のリン酸緩衝液に溶解し、ＣＭセ
ファロースイオン交換クロマトグラフィーにかけ、さら
にアフィニティークロマトグラフィーにかけて精製す
る、方法である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
（１）及び（２）から得られる抽出液は不純物を有する
ため濃い着色を示し、色相的に好ましくなく、しかも、
この着色物質の除去は硫安沈澱、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳
動等の生化学的な様々の分離方法を利用しても困難であ
った。

【０００９】又、さらに着色原因となる不純物がミラク
リンに強く結合していると考えられるため、その活性の
一部が失われ、高純度のミラクリンが得られないばかり
か、甘味誘導活性の低下が認められるという重大な問題
があった。

【００１０】そこで、（３）の製造方法においては、着
色物質を除去する手段として、ミラクルフルーツの果肉
を洗液が着色しなくなるまで水洗している。しかし、こ
の方法で甘味誘導活性の高いミラクリンの抽出を行なう
ためには、抽出前処理として水洗浄を洗液が着色しなく
なるまで繰り返し行わねばならず、洗浄、分離のために
相当の時間と労力が必要になり、しかもミラクルフルー
ツ果肉中に含まれるミラクリンの安定性が低いため、長
時間の抽出前処理を行うことは何等かの悪影響を及ぼす
恐れも考えられる。更にミラクリン含有液は、ｐＨ２以
下もしくはｐＨ１１以上になるとミラクリン成分の活性
が失活し易い性質があり、過度の酸性やアルカリ性での
抽出は好ましくはない。又、（３）の方法における水洗
浄前処理をせずに抽出を行なうと、不純物質中の種々酸
性物質により抽出液のｐＨが過度に低下し、ミラクリン
成分の活性をも失活させる問題もある。そしてこれら不
純物質は水に可溶性のものと考えられるため、近年の抽
出法ではあらかじめ除去する目的で、水洗浄前処理を行
なった後、ミラクリンをＮａＣｌ中性溶液により抽出し
ている。

【００１１】以上のように、これまでのミラクリン抽出
方法では不純物がミラクリンに強く結合した複合体によ
る着色及び活性の低下や、過度にｐＨを低下させる種々
酸性物質による活性の低下、そしてこれらを防ぐために
はミラクリンとの複合体を形成する不純物質の除去をす
るのに、水洗浄前処理を行なわねならず多大な時間を要
するという問題があり、より効率的に、活性を低下させ
ることなく着色のない安定性に優れたミラクリンの製造
方法が求められていた。また、飲食品や医薬品への利用
上の面から、そしてまた長期保存や移動運送の面から
も、高純度の活性粉末可能なミラクリンを工業的に大量
生産し得る方法の開発も当業界において強く求められて
いた。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点に鑑み、水洗浄等の前処理を必要とせずに、清浄で活
性の安定化したミラクリンの製造をより効率的に行うこ
とを目的とし、抽出過程におけるミラクルフルーツ中の
ミラクリンと強固な複合体を形成し易い不純物質に着目
し、種々検討を重ねた結果、ｐＨ３．５〜５．５の範囲
にある緩衝水溶液にＮａＣｌを添加した、酸性緩衝塩水
溶液を用いて抽出処理を行なうことで、ミラクルフルー
ツ中に含まれる不純物を除去するための、水洗浄等の前
処理を一切必要とせずに、また、果肉中の種々酸性物質
による過度なｐＨ低下を防止できるので、ミラクリン活
性の失活も無く、着色の極めて少ないミラクリンの抽出
を行なうことができ、しかも清浄で安定性に優れたミラ
クリンが得られることを見出し本発明をするに至った。

【００１３】さらに詳しくは、ミラクルフルーツの新鮮
果肉を液体Ｎ₂等で凍結し、１０〜１００ｍｍＨｇの減
圧下で乾燥させる。この凍結乾燥果肉を粉砕し、０〜５
℃の温度範囲の条件下で、ｐＨ３．５〜５．５の範囲に
ある濃度０．５Ｍ以下の緩衝水溶液に、０．４〜０．５
ＭになるようにＮａＣｌを添加した酸性緩衝塩水溶液
を、ミラクルフルーツ凍結乾燥果肉１ｇに対し５〜５０
ｍｌの範囲で加え、超音波等でホモジナイズする。これ
を遠心分離した後、上澄み液を採取し抽出液とする。こ
の抽出処理は２回又は２回以上繰り返すことが好まし
い。抽出処理に用いる酸性緩衝塩水溶液としては、ｐＨ
３．５〜５．５の範囲を維持しえる濃度０．１〜０．２
Ｍの緩衝水溶液に、０．４〜０．５ＭになるようにＮａ
Ｃｌを添加したものが好ましく、濃度０．１Ｍの緩衝水
溶液に、０．５ＭになるようにＮａＣｌを添加したもの
がより好ましい。当該条件を満たすものであれば特に制
限はしないが、例えば、クエン酸１ナトリウム−クエン
酸２ナトリウム溶液（０．１Ｍ）、酢酸−酢酸ナトリウ
ム溶液（０．１Ｍ）、フタル酸１カリウム溶液（０．１
Ｍ）を用いｐＨを調整した後に、ＮａＣｌを０．５Ｍに
なるように添加して用いる。

【００１４】抽出対象としてのミラクリン含有物はミラ
クルフルーツの凍結乾燥果肉が好適に用いられるが、新
鮮果肉であっても良い。

【００１５】上記方法によって得られた抽出液にはＮａ
Ｃｌを含んでいるため、透析、限外ろ過（逆浸透法、イ
オン交換膜電気透析法等を含む）、ゲルろ過等により脱
塩した後、これを凍結乾燥等することにより着色の極め
て少ない白色のミラクリン粗製粉末が得られる。このミ
ラクリン粗製粉末は吸湿を防ぐためシリカゲル等の吸湿
剤で密封処理、又は窒素ガス封入等を施す事で３ケ月以
上甘味誘導活性を安定的に維持し、充分実用に供するこ
とができる。さらに脱塩後のミラクリン抽出液は種々の
沈殿分離法、すなわち硫酸アンモニュウム、硫酸ナトリ
ウム、リン酸カリウム等の塩析、等電点沈殿法、水溶性
ポリマーであるポリエチレングリコール、デキストラン
等による共沈等によって純度を上げることもでき、ある
いは、各種クロマトグラフィー、例えばイオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、水素結合クロマトグラフィー、クロマトフォーカシ
ングクロマトグラフィー等の利用や、さらには電気泳
動、分子量分画に基づいた膜分離、アフィニティー担体
やイオン交換担体を結合させたメンブレンリアクター等
によっても精製をすることが可能である。本発明の方法
によって得られるミラクリン抽出液は着色が極めて少な
く、上記種々の精製法を利用すれば容易に純度９９％以
上のミラクリンを獲得することができる。

【００１６】

【作用】ミラクリン抽出液もしくは、これより得られる
ミラクリン粉末の着色要因としては、ミラクルフルーツ
果肉中のミラクリンと強固な複合体を形成し易い不純物
質によること、さらにこれらは、複合体を形成した後は
薄茶乃至は褐色の着色不純物質となり、ミラクリンの甘
味誘導活性の低下をも招く。そして一度形成されたミラ
クリンとの複合体から不純物質を除去することは著しく
困難である。又ミラクリンとの複合体を形成し易い不純
物質としては、フラボノイド色素や酸性物質もしくはこ
れらの複合体とも考えられているが、未だ、その物質に
ついて解明はされていない。又さらに、過度にｐＨを低
下させる種々の酸性物質もミラクリンの甘味誘導活性の
低下を招く。

【００１７】しかし、これらミラクリンと複合体を形成
し易い不純物質の影響や種々の酸性物質の影響は、水洗
浄前処理することなく、本発明による酸性緩衝塩水溶液
を用いた抽出を行なうことで容易に解決することができ
た。

【００１８】即ち、着色要因となるミラクリンと複合体
を形成し易い不純物質は、酸性緩衝塩水溶液を用いた酸
性条件下では、反応基が解離しないか、解離しにくくな
ることによって、その反応性が著しく低下もしくは不活
化してミラクリンとの結合が抑制され、その結果、透明
度の高いミラクリン抽出液が得られる。一方、ミラクリ
ン活性に悪影響を及ぼす抽出液のｐＨ低下の問題は、緩
衝水溶液の作用により、果肉中の種々酸性物質による抽
出液の過度なｐＨ低下がなくなるため、抽出液中におけ
るミラクリン成分の活性低下も防げる。本発明は、ミラ
クリンとの複合体を形成し易い不純物質の影響を抑え、
かつ好適な抽出ｐＨを維持しうることができるため、水
洗浄をせずとも着色の極めて少ない、甘味誘導活性の安
定な優れたミラクリン粉末の採取を容易に行ない得るも
のである。

【００１９】

【実施例】次に実施例を示し、本発明を具体的に説明す
るが要旨を越えない限りこれに限定されるものではな
い。また比較のため本発明のｐＨ範囲外のものについて
も同時に評価を行なった。

【００２０】

【実施例１】ミラクルフルーツ（Ｒｉｃｈａｄｅｌｌａ
ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）の果肉の凍結乾燥物１ｇに対
し、約０℃（氷水中）の温度条件で表１に示す各種ｐＨ
に調製した緩衝塩水溶液（溶液中０．５ＭのＮａＣｌを
含む）１５ｍｌを加え、超音波（２０ｋＨｚ）で３０秒
間、４回繰り返しホモジナイズした後、１００００ｒｐ
ｍで４５分間遠心分離する抽出処理を行なった。遠心分
離後、上澄み液を採取しこれを抽出液とした。さらに残
渣に対し同様の抽出処理を繰り返し、２回目の上澄み液
を採取した。各種ｐＨの緩衝塩水溶液ごとによる抽出処
理で得た２回分の抽出液を合わせ、ミラクリン抽出液と
した。

【００２１】

【表１】

【００２２】ここで各種ｐＨの緩衝塩水溶液（溶液中
０．５ＭのＮａＣｌを含む）の調製法を下記に示す。な
お、下記に使用する試薬は、和光純薬社製ですべて特級
を使用した。

【００２３】（１）ｐＨ３．１緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍクエン酸水溶液と０．１Ｍクエン酸１ナトリウ
ム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨ
が３．１になるまで両液を混合する。ｐＨが３．１にな
ったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍになるよ
うにＮａＣｌを加え調製する。

【００２４】（２）ｐＨ３．５緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍフタル酸１カリウムにｐＨメーターによりｐＨ
を確認しながらｐＨが３．５になるまで１Ｎ ＨＣｌ水
溶液を加える。ｐＨが３．５になったら、この溶液中の
ＮａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａＣｌを加え調
製する。

【００２５】（３）ｐＨ４．５緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍ酢酸水溶液と０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を
ｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが４．５に
なるまで両液を混合する。ｐＨが４．５になったら、こ
の溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａＣ
ｌを加え調製する。

【００２６】（４）ｐＨ５．１緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍ酢酸水溶液と０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を
ｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが５．１に
なるまでに両液を混合する。ｐＨが５．１になったら、
この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａ
Ｃｌを加え調製する。

【００２７】（５）ｐＨ５．５緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍクエン酸１ナトリウム水溶液と０．１Ｍクエン
酸２ナトリウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認
しながらｐＨが５．５になるまでに両液を混合する。ｐ
Ｈが５．５になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が
０．５ＭになるようにＮａＣｌを加え調製する。

【００２８】（６）ｐＨ６．５緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液にｐＨメーターによ
りｐＨを確認しながらｐＨが６．５になるまで１Ｎ Ｈ
Ｃｌ水溶液を加える。ｐＨが６．５になったら、この溶
液中のＮａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａＣｌを
加え調製する。

【００２９】（７）ｐＨ７．５緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍリン酸１ナトリウム水溶液と０．１Ｍリン酸２
ナトリウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しな
がらｐＨが７．５になるまで両液を混合する。ｐＨが
７．５になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５
ＭになるようにＮａＣｌを加え調製する。

【００３０】（８）ｐＨ８．３緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍグリシルグリシン水溶液（１３．２ｇを純水１
０００ｍｌで調製）にｐＨメーターによりｐＨを確認し
ながらｐＨが８．３になるまで１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を
加える。ｐＨが８．３になったら、この溶液中のＮａＣ
ｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａＣｌを加え調製す
る。

【００３１】（９）ｐＨ９．２緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍホウ酸水溶液と０．１Ｍホウ酸ナトリウム水溶
液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが９．
２になるまで両液を混合する。ｐＨが９．２になった
ら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍになるように
ＮａＣｌを加え調製する。

【００３２】（１０）ｐＨ１０．１緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍ炭酸１ナトリウム水溶液と０．１Ｍ炭酸２ナト
リウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながら
ｐＨが１０．１になるまで両液を混合する。ｐＨが１
０．１になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５
ＭになるようにＮａＣｌを加え調製する。

【００３３】得られた各種ｐＨの緩衝塩水溶液によるミ
ラクリン抽出液５ｍｌを、純水で平衡化してある脱塩用
ゲルろ過クロマトグラフィー（ファルマシア社製）によ
り脱塩し、７ｍｌの脱塩液を得、これをミラクリン抽出
脱塩液とした。各種ｐＨのミラクリン抽出脱塩液につい
てＪＩＳ Ｚ８７２１に規定する色度票を用い、着色度
を、さらには甘味誘導活性の官能試験を下記の手順に従
って評価し、得られた結果を表２に示した。尚、表中の
着色度に記載される「−」は無色透明であったことを示
す。

【００３４】

【表２】

【００３５】表２から、各種ｐＨの緩衝塩水溶液の内、
本願の酸性緩衝塩水溶液によるものが着色度もなく甘味
誘導活性も高いことが判る。

【００３６】着色度試験手順 直射日光をさけた自然光下で、内径１９ｍｍ、外径２１
ｍｍの試験管にミラクリン抽出脱塩液３．５ｍｌを入
れ、垂直に立てた。横からみた抽出脱塩液について、色
相、明度、彩度を表示するＪＩＳ Ｚ８７２１色度票と
隣接させて比較して着色度を測定した。

【００３７】甘味誘導活性評価手順 、０．１Ｍクエン酸溶液を２〜３ｍｌ、口に含み、酸
味を感ずる事を確認する。 、吐き出して水で口をすすぐ。 、ミラクリン抽出脱塩液２．５ｍｌを口に含む。 、１分間、舌の上でころがすようにして舌に十分吸着
させる。 、吐き出して水で口をすすぐ。 、０．１Ｍクエン酸溶液を２〜３ｍｌ、口に含む。こ
の時の甘さを記憶しておく。 、標準甘味溶液（０．１，０．２，０．３，０．４，
０．５Ｍショ糖溶液）２〜３ｍｌを口に含み０．１Ｍク
エン酸を味わったときとの甘味を比較し同等の甘味をも
つショ糖溶液の濃度を決定し、その濃度を甘味誘導活性
とする。

【００３８】次に、各種ｐＨのミラクリン抽出脱塩液を
３．５ｍｌを５ｍｌのバイアルビンに移し、これらを凍
結乾燥してミラクリン粗製粉末を得、これらの着色度を
同様にＪＩＳ Ｚ８７２１色度票とミラクリン粗製粉末
の入ったバイアルビンを隣接し比較して着色度を測定し
た。その結果を表３に示した。本発明の酸性緩衝塩水溶
液によるものからは、着色のない白色のミラクリン粗製
粉末が得られた。

【００３９】

【表３】

【００４０】各種ｐＨによるミラクリン抽出液それぞれ
について、抗ミラクリンＩｇＧ（抗体：イムノグロブリ
ン）に酵素（ＰＯＤ：パーオキシダーゼ）を結合し標識
化した。サンドイッチ法（Ｐ．Ｋ．ＮａＫａｎｅ，ａｎ
ｄ Ａ．Ｋａｗａｏｉ，（１９７４）Ｐｅｒｏｘｉｄａ
ｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ａ ｎｅｗ
ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｊ．
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，２２，１０
８４−１０９１）によりミラクリンの定量を行ない、比
較評価し、その結果を表４に示した。本発明の酸性緩衝
塩水溶液からのものは、他の酸性緩衝塩水溶液と比べミ
ラクリン含量が高い。このことから本願の酸性緩衝塩水
溶液を用いれば、不純物質が少なくミラクリンを安定化
して抽出できることは明らかである。

【００４１】

【表４】

【００４２】ここで、ミラクリンの定量は次のようにし
て行なった。ミラクリン定量操作 ９６穴のマイクロプレートのウエル（穴）各々に、１０
０μｌの抗ミラクリンＩｇＧを入れ、４℃で一晩放置
し、抗ミラクリンＩｇＧをウエル内壁に結合させる。放
置後ウエル内壁に結合させた抗ミラクリンＩｇＧを０．
１８％のリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．５）で洗浄す
る。ウエル内の残液を除去した後、０．１８％のリン酸
カリウム水溶液（ｐＨ７．５）に溶解した１％ＢＳＡ
（牛血清アルブミン：ＣＡＬＢＩＯＣＥＭ社製）溶液１
５０μ１を、各ウエルに加え２時間室温で放置する。ウ
エル内の１％ＢＳＡ溶液を除去した後、既知濃度のミラ
クリン溶液及び得られた各種ｐＨによるミラクリン抽出
液を１００００倍に希釈したもの１００μｌを、ウェル
内壁に結合している抗ミラクリンＩｇＧに加え、２時間
室温で放置する。再度０．１８％のリン酸カリウム水溶
液（ｐＨ７．５）で洗浄し、ウエル内の残液を除去した
後、標識化ＩｇＧ １００μｌ加え、２時間室温で放置
する。次に０．１８％のリン酸カリウム水溶液（ｐＨ
７．５）で洗浄し、ウエル内の残液を除去した後、各ウ
エルにパーオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライ
ト社製）の発色液を加えて発色させた。３分後、同キッ
トの停止液を加えて反応を止めた後、イムノリーダーで
吸光度（４０５ｎｍ）を測定し、上記既知濃度のミラク
リン溶液０．５，１．０，２．０，５．０，１０，２
０，５０，１００，２００，２５０，５００，ｎｇ（ナ
ノグラム）／ｍｌの測定値から作成した検量線を基に抽
出液中のミラクリン含量を測定した。又、上記で使用し
た抗ミラクリンＩｇＧ及び標識化ＩｇＧの作成法を下記
に示す。

【００４３】抗ミラクリンＩｇＧの作成 純度９９．９％以上の精製ミラクリン２５０μｇを同量
の完全フロイントアジュバントで乳化した後、うさぎ
（体重：３〜３．５Ｋｇ）に注射し１０日後、２０日後
にさらに２５０μｇの不完全フロイントアジュバント
を、うさぎに注射した。最後の注射から１週間後採血
し、抗ミラクリン血清を得た。

【００４４】この血清７ｍｌを０．０５Ｍトリス塩酸塩
（ｐＨ８．５，０．１５ＭＮａＣｌ）で平衝化したプロ
テインＡ（生化学工業社製）５ｍｌに添加し低温室（４
℃〜１０℃）で２〜３時間スターラーでゆっくり攪拌し
て抗ミラクリンＩｇＧを吸着させた。上述の平衡化した
プロテインＡに抗ミラクリンＩｇＧを吸着させたものを
カラムに充填した後、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．０，０．１５ＭＮａＣｌ）でＩｇＧを溶出する事に
より精製抗ミラクリンＩｇＧ、約２５ｍｇを得た。

【００４５】標識化ＩｇＧの作成 ４ｍｇのＰＯＤ（パーオキシダーゼ：ベーリンガー社
製）を１ｍｌの純水に溶解した後、０．１Ｍ過ヨウ素酸
ナトリウム０．２ｍｌを加え室温で２０分間放置し、透
析チューブに入れ、１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４．４）で一晩透析した。

【００４６】抗ミラクリンＩｇＧにＰＯＤを結合させる
ため、透析終了後のＰＯＤに０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．５）を加えｐＨ９前後に調整した。この
ＰＯＤに８ｍｇの抗ミラクリンＩｇＧを含む１ｍｌの
０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加え
室温で２時間振盪した。さらに、ＰＯＤが結合した抗ミ
ラクリンＩｇＧを分離するため、１ｍｌの純水に溶解し
た４ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを０．１ｍｌ加え、
４℃で２時間放置したのち、ゲルろ過クロマトグラフィ
ー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ｓ−２００カラム，１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ６．８で平衝化）にかけ
２ｍｌずつフラクションを採りだし、フラクションごと
の２８０ｎｍ（タンパクの吸収を表わす）、４０３ｎｍ
（ＰＯＤの吸収、正確にはＰＯＤの中の鉄の吸収であ
る）及び４０５ｎｍ（ＰＯＤ活性の吸収を表わす）にお
ける吸収を測定した。これら３つの吸収ピークをもつフ
ラクションは、抗ミラクリンＩｇＧと活性を持つＰＯＤ
とが結合しているフラクションであり、標識化されたＩ
ｇＧを含んだものである。３つの吸収ピークを持つフラ
クションを集め、そしてさらに、標識化されたＩｇＧを
安定化するため、このフラクション中のＢＳＡ（粉末牛
血清アルブミン；和光純薬社製、免疫測定用）濃度が１
ｍｇ／ｍｌとなるようにＢＳＡを加える。これを標識化
ＩｇＧとした。

【００４７】

【発明の効果】本発明は酸性緩衝塩水溶液を用いた抽出
を行なうことにより、着色や甘味誘導活性低下の要因と
なるミラクリンと複合体を形成し易い不純物質の、反応
性の抑制を図れる効果を有すると共に、ミラクルフルー
ツ中の種々の酸性物質による過度なｐＨの低下もないの
で、ミラクリン成分の活性低下をも防げる。さらに抽出
前処理としての不純物質の除去処理をする必要もなくな
り、これまでの方法に比べ効率的に甘味誘導活性の安定
した、着色の極めて少ないミラクリンを得ることがで
き、効率的な工業生産に寄与するものである。

【００４８】本発明によれば、着色の極めて少ない甘味
誘導活性の安定したミラクリンを得ることができるた
め、純度の高い精製ミラクリンも容易に工業生産でき、
飲食品や医薬品の製造上きわめて有利な貢献をなすもの
である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ミラクリン含有原料から酸性緩衝塩水溶
   液によって、抽出することを特徴とするミラクリンの製
   造方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の酸性緩衝塩水溶液がｐＨ
   ３．５〜５．５の範囲であることを特徴とするミラクリ
   ンの製造方法。