JPH0654659A - 甘味誘導物質ミラクリンの製造方法 - Google Patents
甘味誘導物質ミラクリンの製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ミラクリン含有原料から酸性緩衝塩水溶液に
よって、ミラクリンを抽出する。 【効果】 甘味誘導活性が安定し、着色不純物のない精
製されたミラクリンを効率的に工業生産することができ
る。
よって、ミラクリンを抽出する。 【効果】 甘味誘導活性が安定し、着色不純物のない精
製されたミラクリンを効率的に工業生産することができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ミラクリンを含有する
原料から甘味誘導物質、ミラクリン（ｍｉｒａｃｕｌｉ
ｎ）を効率的かつ安定的に製造する方法に関する。
原料から甘味誘導物質、ミラクリン（ｍｉｒａｃｕｌｉ
ｎ）を効率的かつ安定的に製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】西アフリカ原産の植物（Ｒｉｃｈａｄｅ
ｌｌａ ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）、通称ミラクルフルーツ
には、これを口に含んだ後に酸味のものを味わうと甘く
感じるという独特の性質を持っている。そして、この作
用は甘味誘導物質ミラクリンによることが知られてい
る。
ｌｌａ ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）、通称ミラクルフルーツ
には、これを口に含んだ後に酸味のものを味わうと甘く
感じるという独特の性質を持っている。そして、この作
用は甘味誘導物質ミラクリンによることが知られてい
る。
【０００３】その甘味誘導作用の詳細な機構は現在の所
明らかではないが、ミラクリンそのものとしては精製さ
れ、既に、純品が得られており、分子量４００００前後
の糖タンパク質としてアミノ酸配列も明らかになってい
る（特開平３−２１８４００号公報）。
明らかではないが、ミラクリンそのものとしては精製さ
れ、既に、純品が得られており、分子量４００００前後
の糖タンパク質としてアミノ酸配列も明らかになってい
る（特開平３−２１８４００号公報）。
【０００４】この甘味誘導物質ミラクリンの製造方法と
して、これまで次のような方法が提案されている。
して、これまで次のような方法が提案されている。
【０００５】１．Ｋ．Ｋｕｒｉｈａｒａ，Ｌ．Ｍ．Ｂｅ
ｉｄｌｅｒ；Ｓcｉｅｎｃｅ，１６１，１２４１（１９
６８）によれば、凍結乾燥したミラクルフルーツの果肉
をｐＨ１０．５の炭酸塩緩衝液中でホモジナイズし活性
部分を抽出する。この抽出液に硫酸アンモニュウムを加
えで塩析する。得られた沈澱物をリン酸塩緩衝液に溶解
し、透析により硫酸アンモニュウムを除去する。さらに
得られた溶液を等電点電気泳動等で精製する。
ｉｄｌｅｒ；Ｓcｉｅｎｃｅ，１６１，１２４１（１９
６８）によれば、凍結乾燥したミラクルフルーツの果肉
をｐＨ１０．５の炭酸塩緩衝液中でホモジナイズし活性
部分を抽出する。この抽出液に硫酸アンモニュウムを加
えで塩析する。得られた沈澱物をリン酸塩緩衝液に溶解
し、透析により硫酸アンモニュウムを除去する。さらに
得られた溶液を等電点電気泳動等で精製する。
【０００６】２．又、特開昭６２−２４２７００号公報
によれば、ミラクルフルーツの果肉から抽出溶媒とし
て、ｐＨ６〜９付近の中性塩溶液を用いてミラクリンを
抽出する。
によれば、ミラクルフルーツの果肉から抽出溶媒とし
て、ｐＨ６〜９付近の中性塩溶液を用いてミラクリンを
抽出する。
【０００７】３．そして、特開昭６３−１８５３４９号
公報によれば、ミラクルフルーツの果肉を粉砕し、水を
添加後ホモジナイズし洗浄液が着色しなくなるまで水洗
いする。洗浄後の果肉に中性の塩化ナトリウム水溶液を
加えミラクリンを抽出する。次に、この抽出液を硫酸ア
ンモニュウムで塩析し、ミラクリン画分の沈澱物を得
る。この沈澱物を中性のリン酸緩衝液に溶解し、ＣＭセ
ファロースイオン交換クロマトグラフィーにかけ、さら
にアフィニティークロマトグラフィーにかけて精製す
る、方法である。
公報によれば、ミラクルフルーツの果肉を粉砕し、水を
添加後ホモジナイズし洗浄液が着色しなくなるまで水洗
いする。洗浄後の果肉に中性の塩化ナトリウム水溶液を
加えミラクリンを抽出する。次に、この抽出液を硫酸ア
ンモニュウムで塩析し、ミラクリン画分の沈澱物を得
る。この沈澱物を中性のリン酸緩衝液に溶解し、ＣＭセ
ファロースイオン交換クロマトグラフィーにかけ、さら
にアフィニティークロマトグラフィーにかけて精製す
る、方法である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
（１）及び（２）から得られる抽出液は不純物を有する
ため濃い着色を示し、色相的に好ましくなく、しかも、
この着色物質の除去は硫安沈澱、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳
動等の生化学的な様々の分離方法を利用しても困難であ
った。
（１）及び（２）から得られる抽出液は不純物を有する
ため濃い着色を示し、色相的に好ましくなく、しかも、
この着色物質の除去は硫安沈澱、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳
動等の生化学的な様々の分離方法を利用しても困難であ
った。
【０００９】又、さらに着色原因となる不純物がミラク
リンに強く結合していると考えられるため、その活性の
一部が失われ、高純度のミラクリンが得られないばかり
か、甘味誘導活性の低下が認められるという重大な問題
があった。
リンに強く結合していると考えられるため、その活性の
一部が失われ、高純度のミラクリンが得られないばかり
か、甘味誘導活性の低下が認められるという重大な問題
があった。
【００１０】そこで、（３）の製造方法においては、ミ
ラクリンの抽出前に着色原因となる着色物質を除去する
手段として、ミラクルフルーツの果肉を洗液が着色しな
くなるまで水洗している。しかし、この方法ではミラク
リン抽出液の着色は認められず、かつ甘味誘導活性は高
いもののミラクリンの抽出を行うためには、前処理とし
て水洗浄を洗液が着色しなくなるまで行わねばならず、
洗浄、分離のために相当の時間と労力が必要になり、し
かもミラクルフルーツ果肉中に含まれるミラクリンは安
定性が低いため、長時間の抽出前処理を行うことは何等
かの悪影響を及ぼす恐れも考えられる。
ラクリンの抽出前に着色原因となる着色物質を除去する
手段として、ミラクルフルーツの果肉を洗液が着色しな
くなるまで水洗している。しかし、この方法ではミラク
リン抽出液の着色は認められず、かつ甘味誘導活性は高
いもののミラクリンの抽出を行うためには、前処理とし
て水洗浄を洗液が着色しなくなるまで行わねばならず、
洗浄、分離のために相当の時間と労力が必要になり、し
かもミラクルフルーツ果肉中に含まれるミラクリンは安
定性が低いため、長時間の抽出前処理を行うことは何等
かの悪影響を及ぼす恐れも考えられる。
【００１１】以上のように、これまでのミラクリン製造
方法では抽出液の着色及びこれら不純物による活性の低
下、もしくは着色不純物質の除去に多大な時間を要する
という問題があり、より効率的に、着色のない安定性に
優れたミラクリンの製造方法が求められていた。また、
飲食品や医薬品への利用上の面から、そしてまた長期保
存や移動運送の面からも、高純度の活性粉末化可能なミ
ラクリンを工業的に大量生産し得る方法の開発も当業界
において強く求められていた。
方法では抽出液の着色及びこれら不純物による活性の低
下、もしくは着色不純物質の除去に多大な時間を要する
という問題があり、より効率的に、着色のない安定性に
優れたミラクリンの製造方法が求められていた。また、
飲食品や医薬品への利用上の面から、そしてまた長期保
存や移動運送の面からも、高純度の活性粉末化可能なミ
ラクリンを工業的に大量生産し得る方法の開発も当業界
において強く求められていた。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点に鑑み、活性の安定化したミラクリンの製造をより効
率的に行うことを目的とし、抽出過程におけるミラクリ
ン含有物中の着色不純物質に着目し、種々検討を重ねた
結果、酸性緩衝塩水溶液を用い、抽出操作を行うことで
抽出前処理等を行なわなくとも、清浄で安定性の高いミ
ラクリンが得られること、そしてまた高純度の精製粉末
ミラクリンを工業的に製造しうることを見出し本発明を
するに至った。
点に鑑み、活性の安定化したミラクリンの製造をより効
率的に行うことを目的とし、抽出過程におけるミラクリ
ン含有物中の着色不純物質に着目し、種々検討を重ねた
結果、酸性緩衝塩水溶液を用い、抽出操作を行うことで
抽出前処理等を行なわなくとも、清浄で安定性の高いミ
ラクリンが得られること、そしてまた高純度の精製粉末
ミラクリンを工業的に製造しうることを見出し本発明を
するに至った。
【００１３】さらに詳しくは、ミラクルフルーツの凍結
乾燥果肉を粉砕し、５℃以下の低温条件下で酸性緩衝塩
水溶液を添加し、超音波等でこれをホモジナイズした
後、遠心分離により上澄みを採取し抽出液とする。この
抽出液はほぼ無色透明で口に含むと高い甘味誘導活性を
示す。この時抽出に用いる酸性緩衝塩水溶液のｐＨは
３．６〜６．５の範囲が望ましく、好ましくはｐＨ３．
１〜５．９、更に好ましくはｐＨ３．５〜５．５の範囲
が良い。又、ここで用いる酸性緩衝塩水溶液の種類も上
記ｐＨの範囲にあれば特に制限はしないが、好ましく
は、例えばリン酸１ナトリウム−リン酸２ナトリウム溶
液（０．１Ｍ）、炭酸水素ナトリウム（０．１ＭＨＣｌ
水溶液で調製）溶液（０．１Ｍ）、クエン酸１ナトリウ
ム−クエン酸２ナトリウム溶液（０．１Ｍ）、酢酸−酢
酸ナトリウム溶液（０．１Ｍ）、フタル酸−フタル酸１
カリウム溶液（０．１Ｍ）、さらに、これらにＮａＣｌ
を０．５Ｍ相当添加して用いる。
乾燥果肉を粉砕し、５℃以下の低温条件下で酸性緩衝塩
水溶液を添加し、超音波等でこれをホモジナイズした
後、遠心分離により上澄みを採取し抽出液とする。この
抽出液はほぼ無色透明で口に含むと高い甘味誘導活性を
示す。この時抽出に用いる酸性緩衝塩水溶液のｐＨは
３．６〜６．５の範囲が望ましく、好ましくはｐＨ３．
１〜５．９、更に好ましくはｐＨ３．５〜５．５の範囲
が良い。又、ここで用いる酸性緩衝塩水溶液の種類も上
記ｐＨの範囲にあれば特に制限はしないが、好ましく
は、例えばリン酸１ナトリウム−リン酸２ナトリウム溶
液（０．１Ｍ）、炭酸水素ナトリウム（０．１ＭＨＣｌ
水溶液で調製）溶液（０．１Ｍ）、クエン酸１ナトリウ
ム−クエン酸２ナトリウム溶液（０．１Ｍ）、酢酸−酢
酸ナトリウム溶液（０．１Ｍ）、フタル酸−フタル酸１
カリウム溶液（０．１Ｍ）、さらに、これらにＮａＣｌ
を０．５Ｍ相当添加して用いる。
【００１４】本発明において使用する酸性緩衝塩水溶液
としては、上記した酸性ｐＨ域を維持しうる緩衝能を有
する塩類であれば上記に限定されることなく使用でき
る。
としては、上記した酸性ｐＨ域を維持しうる緩衝能を有
する塩類であれば上記に限定されることなく使用でき
る。
【００１５】抽出対象としてのミラクリン含有物はミラ
クルフルーツの凍結乾燥果肉が好適に用いられるが、新
鮮果肉であっても良い。
クルフルーツの凍結乾燥果肉が好適に用いられるが、新
鮮果肉であっても良い。
【００１６】上記方法によって得られた抽出液を透析、
限外ろ過（逆浸透法、イオン交換膜電気透析法等を含
む）、ゲルろ過等により脱塩し、これを凍結乾燥等する
ことによりミラクリン粗粉末が得られる。ミラクリン粗
粉末は白色であり、吸湿を防ぐためシリカゲル等の吸湿
剤で密封処理、又は窒素ガス封入等を施す事により最低
３ケ月以上の甘味誘導活性を維持し、充分実用に供する
ことができる。さらにミラクリン抽出液は種々の沈澱分
離法、すなわち硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム等の塩析、等電点沈澱法、水溶性ポリマー
であるポリエチレングリコール、デキストラン等による
共沈等によって純度を上げることもでき、あるいは、各
種クロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、水素
結合クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングクロ
マトグラフィー等の利用や、さらには電気泳動、分子量
分画に基づいた膜分離、アフィニティー担体やイオン交
換担体を結合させたメンブレンリアクター等によっても
精製をすることも可能である。
限外ろ過（逆浸透法、イオン交換膜電気透析法等を含
む）、ゲルろ過等により脱塩し、これを凍結乾燥等する
ことによりミラクリン粗粉末が得られる。ミラクリン粗
粉末は白色であり、吸湿を防ぐためシリカゲル等の吸湿
剤で密封処理、又は窒素ガス封入等を施す事により最低
３ケ月以上の甘味誘導活性を維持し、充分実用に供する
ことができる。さらにミラクリン抽出液は種々の沈澱分
離法、すなわち硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム等の塩析、等電点沈澱法、水溶性ポリマー
であるポリエチレングリコール、デキストラン等による
共沈等によって純度を上げることもでき、あるいは、各
種クロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、水素
結合クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングクロ
マトグラフィー等の利用や、さらには電気泳動、分子量
分画に基づいた膜分離、アフィニティー担体やイオン交
換担体を結合させたメンブレンリアクター等によっても
精製をすることも可能である。
【００１７】
【作用】ミラクリンの抽出液の着色要因としては、ミラ
クリン含有物中の着色不純物質によること、さらに、こ
れはミラクリンと強固な複合体を形成し易く、複合体を
形成した後は着色不純物質の除去は著しく困難であると
されていた。またこの複合体を形成し易い物質として
は、ポリフェノール様の物質、もしくは酸性物質とも考
えられていたが、未だ、その物質について解明はされて
いない。
クリン含有物中の着色不純物質によること、さらに、こ
れはミラクリンと強固な複合体を形成し易く、複合体を
形成した後は着色不純物質の除去は著しく困難であると
されていた。またこの複合体を形成し易い物質として
は、ポリフェノール様の物質、もしくは酸性物質とも考
えられていたが、未だ、その物質について解明はされて
いない。
【００１８】しかし、これらの影響は、本発明による酸
性緩衝塩水溶液を用いた抽出を行なうことで容易に解決
することができた。
性緩衝塩水溶液を用いた抽出を行なうことで容易に解決
することができた。
【００１９】即ち、これら着色不純物質は酸性緩衝塩水
溶液を用いた酸性条件下では、反応基が解離しないか解
離しにくくなることによって、その反応性が著しく低下
もしくは不活化してミラクリンへの結合が抑制されたも
のと考えられ、その結果、透明度の高い抽出液さらには
着色のない甘味誘導活性の安定なミラクリンの抽出を容
易に行ない得るものである。
溶液を用いた酸性条件下では、反応基が解離しないか解
離しにくくなることによって、その反応性が著しく低下
もしくは不活化してミラクリンへの結合が抑制されたも
のと考えられ、その結果、透明度の高い抽出液さらには
着色のない甘味誘導活性の安定なミラクリンの抽出を容
易に行ない得るものである。
【００２０】
【実施例】次に実施例を示し、本発明を具体的に説明す
るが要旨を越えない限りこれに限定されるものではな
い。
るが要旨を越えない限りこれに限定されるものではな
い。
【００２１】
【実施例１】ミラクルフルーツ（Ｒｉｃｈａｄｅｌｌａ
ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）の果肉の凍結乾燥物１ｇに対
し、下記の表１に示す各種ｐＨに調製した緩衝水溶塩
（０．５Ｍ相当のＮａＣｌを添加）３０ｍｌを加え、超
音波（２００ｋＨｚ）で３０秒間、４回繰り返しホモジ
ナイズした後、１００００ｒｐｍで４５分間遠心分離し
て上澄みを採取した。残渣に対し同様の操作を繰り返し
２回目の上澄みとして採取した。これら２回分の上澄み
を合わせ、ミラクリン抽出液とした。
ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）の果肉の凍結乾燥物１ｇに対
し、下記の表１に示す各種ｐＨに調製した緩衝水溶塩
（０．５Ｍ相当のＮａＣｌを添加）３０ｍｌを加え、超
音波（２００ｋＨｚ）で３０秒間、４回繰り返しホモジ
ナイズした後、１００００ｒｐｍで４５分間遠心分離し
て上澄みを採取した。残渣に対し同様の操作を繰り返し
２回目の上澄みとして採取した。これら２回分の上澄み
を合わせ、ミラクリン抽出液とした。
【００２２】さらに、この各種ｐＨによるミラクリン抽
出液５ｍｌを脱塩用ゲルろ過クロマトグラフィー（ファ
ルマシア社製）により脱塩し７ｍｌの脱塩液を得、これ
をミラクリン抽出脱塩液とした。この内の３．５ｍｌを
凍結乾燥してミラクリン粗粉末を得た。
出液５ｍｌを脱塩用ゲルろ過クロマトグラフィー（ファ
ルマシア社製）により脱塩し７ｍｌの脱塩液を得、これ
をミラクリン抽出脱塩液とした。この内の３．５ｍｌを
凍結乾燥してミラクリン粗粉末を得た。
【００２３】
【表１】
【００２４】ここで各種ｐＨの緩衝水溶液（０．５Ｍ相
当のＮａＣｌを含む）の調製法を下記に示す。なお、下
記に使用する試薬は、和光純薬社製ですべて特級を使用
した。
当のＮａＣｌを含む）の調製法を下記に示す。なお、下
記に使用する試薬は、和光純薬社製ですべて特級を使用
した。
【００２５】（１）ｐＨ３．１緩衝水溶液の調製 ０．１Ｍクエン酸水溶液と０．１Ｍクエン酸１ナトリウ
ム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨ
が３．１になるまで両液を混合する。ｐＨが３．１にな
ったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当にな
るようにＮａＣｌを加え調製する。
ム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨ
が３．１になるまで両液を混合する。ｐＨが３．１にな
ったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当にな
るようにＮａＣｌを加え調製する。
【００２６】（２）ｐＨ３．５緩衝水溶液の調製 ０．１Ｍフタル酸水溶液と０．１Ｍフタル酸１カリウム
水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが
３．５になるまで両液を混合する。ｐＨが３．５になっ
たら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当になる
ようにＮａＣｌを加え調製する。
水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが
３．５になるまで両液を混合する。ｐＨが３．５になっ
たら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当になる
ようにＮａＣｌを加え調製する。
【００２７】（３）ｐＨ４．５緩衝水溶液の調製 ０．１Ｍ酢酸水溶液と０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を
ｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが４．５に
なるまで両液を混合する。ｐＨが４．５になったら、こ
の溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当になるようにＮ
ａＣｌを加え調製する。
ｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが４．５に
なるまで両液を混合する。ｐＨが４．５になったら、こ
の溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当になるようにＮ
ａＣｌを加え調製する。
【００２８】（４）ｐＨ５．１緩衝水溶液の調製 ０．１Ｍ酢酸水溶液と０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を
ｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが５．１に
なるまでに両液を混合する。ｐＨが５．１になったら、
この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当になるように
ＮａＣｌを加え調製する。
ｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが５．１に
なるまでに両液を混合する。ｐＨが５．１になったら、
この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当になるように
ＮａＣｌを加え調製する。
【００２９】（５）ｐＨ５．５緩衝水溶液の調製 ０．１Ｍクエン酸１ナトリウム水溶液と０．１Ｍクエン
酸２ナトリウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認
しながらｐＨが５．５になるまでに両液を混合する。ｐ
Ｈが５．５になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が
０．５Ｍ相当になるようにＮａＣｌを加え調製する。
酸２ナトリウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認
しながらｐＨが５．５になるまでに両液を混合する。ｐ
Ｈが５．５になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が
０．５Ｍ相当になるようにＮａＣｌを加え調製する。
【００３０】（６）ｐＨ６．５緩衝水溶液の調製 ０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液にｐＨメーターによ
りｐＨを確認しながらｐＨが６．５になるまで０．１Ｎ
ＨＣｌ水溶液を加える。ｐＨが６．５になったら、この
溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当になるようにＮａ
Ｃｌを加え調製する。
りｐＨを確認しながらｐＨが６．５になるまで０．１Ｎ
ＨＣｌ水溶液を加える。ｐＨが６．５になったら、この
溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当になるようにＮａ
Ｃｌを加え調製する。
【００３１】（７）ｐＨ７．５緩衝水溶液の調製 ０．１Ｍリン酸１ナトリウム水溶液と０．１Ｍリン酸２
ナトリウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しな
がらｐＨが７．５になるまで両液を混合する。ｐＨが
７．５になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５
Ｍ相当になるようにＮａＣｌを加え調製する。
ナトリウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しな
がらｐＨが７．５になるまで両液を混合する。ｐＨが
７．５になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５
Ｍ相当になるようにＮａＣｌを加え調製する。
【００３２】（８）ｐＨ８．３緩衝水溶液の調製 ０．１Ｍグリシルグリシン水溶液（１３．２ｇを純水１
０００ｍｌで調製）にｐＨメーターによりｐＨを確認し
ながらｐＨが８．３になるまで０．１ＮＮａＯＨ水溶液
を加える。ｐＨが８．３になったら、この溶液中のＮａ
Ｃｌ濃度が０．５Ｍ相当になるようにＮａＣｌを加え調
製する。
０００ｍｌで調製）にｐＨメーターによりｐＨを確認し
ながらｐＨが８．３になるまで０．１ＮＮａＯＨ水溶液
を加える。ｐＨが８．３になったら、この溶液中のＮａ
Ｃｌ濃度が０．５Ｍ相当になるようにＮａＣｌを加え調
製する。
【００３３】（９）ｐＨ９．２緩衝水溶液の調製 ０．１Ｍホウ酸水溶液と０．１Ｍホウ酸ナトリウム水溶
液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが９．
２になるまで両液を混合する。ｐＨを９．２になった
ら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当になるよ
うにＮａＣｌを加え調製する。
液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが９．
２になるまで両液を混合する。ｐＨを９．２になった
ら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍ相当になるよ
うにＮａＣｌを加え調製する。
【００３４】（１０）ｐＨ１０．１緩衝水溶液の調製 ０．１Ｍ炭酸１ナトリウム水溶液と０．１Ｍ炭酸２ナト
リウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながら
ｐＨが１０．１になるまで両液を混合する。ｐＨが１
０．１になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５
Ｍ相当になるようにＮａＣｌを加え調製する。
リウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながら
ｐＨが１０．１になるまで両液を混合する。ｐＨが１
０．１になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５
Ｍ相当になるようにＮａＣｌを加え調製する。
【００３５】
【実施例２】実施例１で得られた各種ｐＨのミラクリン
抽出脱塩液について、着色の度合い及び甘味誘導活性試
験を下記の表２の手順にしたがって測定評価し、得られ
た結果を下記の表３に示した。
抽出脱塩液について、着色の度合い及び甘味誘導活性試
験を下記の表２の手順にしたがって測定評価し、得られ
た結果を下記の表３に示した。
【００３６】
【表２】
【００３７】
【表３】
【００３８】さらに、実施例１で得られた、各種ｐＨの
ミラクリン抽出脱塩液の凍結乾燥粗粉末の着色をＪＩＳ
Ｚ ８７２１の色度票で評価し、その結果を下記の表
４に示した。
ミラクリン抽出脱塩液の凍結乾燥粗粉末の着色をＪＩＳ
Ｚ ８７２１の色度票で評価し、その結果を下記の表
４に示した。
【００３９】
【表４】
【００４０】
【実施例３】実施例１で得られた各種ｐＨによるミラク
リン抽出液それぞれについて、抗ミラクリンＩｇＧ（抗
体：イムノグロブリン）に酵素（ＰＯＤ：パーオキシダ
ーゼ）を結合し標識化したサンドイッチ法（Ｐ．Ｋ．Ｎ
ａＫａｎｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｗａｏｉ，（１９７４）
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅ
ｍ．，２２，１０８４−１０９１）によりミラクリンの
定量を行い、比較評価し、その結果を下記の表５に示し
た。
リン抽出液それぞれについて、抗ミラクリンＩｇＧ（抗
体：イムノグロブリン）に酵素（ＰＯＤ：パーオキシダ
ーゼ）を結合し標識化したサンドイッチ法（Ｐ．Ｋ．Ｎ
ａＫａｎｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｗａｏｉ，（１９７４）
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅ
ｍ．，２２，１０８４−１０９１）によりミラクリンの
定量を行い、比較評価し、その結果を下記の表５に示し
た。
【００４１】
【表５】
【００４２】ここで、ミラクリンの定量は次のようにし
て行った。
て行った。
【００４３】ミラクリン定量操作 ９６穴のマイクロプレートに１００μｌの抗ミラクリン
ＩｇＧを加え、４℃で一晩放置する。放置後、プレート
を０．１８％のリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．５）で
洗浄し、既知濃度のミラクリン溶液及び実施例１で得ら
れた各種ｐＨによるミラクリン抽出液を１００００倍に
希釈したもの１００μｌをウェル（穴）に加え、２時間
室温で放置する。再度、０．１８％のリン酸カリウム水
溶液（ｐＨ７．５）で洗浄し、標識化ＩｇＧを１００μ
ｌ加え、２時間放置する。０．１８％のリン酸カリウム
水溶液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、パーオキシダーゼ
用発色キットの発色液（住友ベークライト社製）を加
え、３分後、同キットの停止液（住友ベークライト社
製）を加えて反応を止めた後、イムノリーダーで吸光度
を測定し、上記既知濃度のミラクリン溶液 ０．５，
１．０，２．０，５．０，１０，２０，５０，１００，
２００，２５０，５００，ｎｇ（ナノグラム）／ｍｌの
測定値から作成した検量線を基に抽出液中のミラクリン
含量を測定した。
ＩｇＧを加え、４℃で一晩放置する。放置後、プレート
を０．１８％のリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．５）で
洗浄し、既知濃度のミラクリン溶液及び実施例１で得ら
れた各種ｐＨによるミラクリン抽出液を１００００倍に
希釈したもの１００μｌをウェル（穴）に加え、２時間
室温で放置する。再度、０．１８％のリン酸カリウム水
溶液（ｐＨ７．５）で洗浄し、標識化ＩｇＧを１００μ
ｌ加え、２時間放置する。０．１８％のリン酸カリウム
水溶液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、パーオキシダーゼ
用発色キットの発色液（住友ベークライト社製）を加
え、３分後、同キットの停止液（住友ベークライト社
製）を加えて反応を止めた後、イムノリーダーで吸光度
を測定し、上記既知濃度のミラクリン溶液 ０．５，
１．０，２．０，５．０，１０，２０，５０，１００，
２００，２５０，５００，ｎｇ（ナノグラム）／ｍｌの
測定値から作成した検量線を基に抽出液中のミラクリン
含量を測定した。
【００４４】抗ミラクリンＩｇＧの作製 純度９９．９％以上の精製ミラクリン２５０μｇを同量
の完全フロイントアジュバントで乳化した後、うさぎ
（体重：３〜３．５Ｋｇ）に注射し１０日後、２０日後
にさらに２５０μｇの不完全フロイントアジュバントを
うさぎに注射した。最後の注射から１週間後採血し、抗
ミラクリン血清を得た。
の完全フロイントアジュバントで乳化した後、うさぎ
（体重：３〜３．５Ｋｇ）に注射し１０日後、２０日後
にさらに２５０μｇの不完全フロイントアジュバントを
うさぎに注射した。最後の注射から１週間後採血し、抗
ミラクリン血清を得た。
【００４５】この血清７ｍｌを０．０５Ｍトリス塩酸塩
（ｐＨ８．５，０．１５ＭＮａＣｌ）で平衝化したプロ
テインＡ（生化学工業社製）５ｍｌに添加し低温室（４
℃〜１０℃）で２〜３時間スターラーでゆっくり攪拌し
て抗ミラクリンＩｇＧを吸着させた。カラムにこのプロ
テインＡを充填後、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．０，０．１５ＭＮａＣｌ）でＩｇＧを溶出する事に
より精製抗ミラクンＩｇＧ、約２５ｍｇを得た。
（ｐＨ８．５，０．１５ＭＮａＣｌ）で平衝化したプロ
テインＡ（生化学工業社製）５ｍｌに添加し低温室（４
℃〜１０℃）で２〜３時間スターラーでゆっくり攪拌し
て抗ミラクリンＩｇＧを吸着させた。カラムにこのプロ
テインＡを充填後、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．０，０．１５ＭＮａＣｌ）でＩｇＧを溶出する事に
より精製抗ミラクンＩｇＧ、約２５ｍｇを得た。
【００４６】ＩｇＧの酵素（ＰＯＤ）による標識化 ４ｍｇのＰＯＤ（パーオキシダーゼ：ベーリンガー社
製）を１ｍｌの純水に溶解した後、０．１Ｍ過ヨウ素酸
ナトリウム０．２ｍｌを加え室温で２０分間放置し、１
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）で一晩透析し
た。
製）を１ｍｌの純水に溶解した後、０．１Ｍ過ヨウ素酸
ナトリウム０．２ｍｌを加え室温で２０分間放置し、１
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）で一晩透析し
た。
【００４７】透析終了後のＰＯＤに０．２Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加えｐＨ９前後に調製し
た。このＰＯＤに８ｍｇのＩｇＧを含む１ｍｌの０．０
１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加え室温で
２時間振盪した。さらに、１ｍｌの純水に溶解した、４
ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを０．１ｍｌ加え、４℃
で２時間放置したのち、ゲルろ過クロマトグラフィー
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ｓ−２００カラム１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ６．８で平衝化）に添加し２
ｍｌずつフラクションを集め２８０ｎｍ（タンパクの吸
収を表わす）、４０３ｎｍ（ＰＯＤの吸収、正確にはＰ
ＯＤの中の鉄の吸収である）及び４０５ｎｍ（ＰＯＤ活
性の吸収を表わす）における吸収を測定した。これら３
つの吸収ピークをもつフラクションは、ＩｇＧと活性を
持つＰＯＤとが結合しているフラクションであり、これ
を集め混合後、ＢＳＡ（牛血清アルブミン；和光純薬社
製、免疫測定用）の最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるよう
にＢＳＡを加えて、ＰＯＤが結合した標識化ＩｇＧとし
た。
ウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加えｐＨ９前後に調製し
た。このＰＯＤに８ｍｇのＩｇＧを含む１ｍｌの０．０
１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加え室温で
２時間振盪した。さらに、１ｍｌの純水に溶解した、４
ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを０．１ｍｌ加え、４℃
で２時間放置したのち、ゲルろ過クロマトグラフィー
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ｓ−２００カラム１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ６．８で平衝化）に添加し２
ｍｌずつフラクションを集め２８０ｎｍ（タンパクの吸
収を表わす）、４０３ｎｍ（ＰＯＤの吸収、正確にはＰ
ＯＤの中の鉄の吸収である）及び４０５ｎｍ（ＰＯＤ活
性の吸収を表わす）における吸収を測定した。これら３
つの吸収ピークをもつフラクションは、ＩｇＧと活性を
持つＰＯＤとが結合しているフラクションであり、これ
を集め混合後、ＢＳＡ（牛血清アルブミン；和光純薬社
製、免疫測定用）の最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるよう
にＢＳＡを加えて、ＰＯＤが結合した標識化ＩｇＧとし
た。
【００４８】
【発明の効果】本発明は酸性塩水溶液を用いた抽出を行
なうことにより、ミラクリンと複合体を形成しやすいと
言われていた、着色性不純物質の活性もしくは反応性の
抑制を図れる効果を有するため、抽出前処理として着色
性不純物質の除去処理をする必要がなく、これまでの方
法に比べ効率的に甘味誘導活性の安定した、着色の無い
ミラクリンを得ることができ、効率的な工業生産に寄与
するものである。
なうことにより、ミラクリンと複合体を形成しやすいと
言われていた、着色性不純物質の活性もしくは反応性の
抑制を図れる効果を有するため、抽出前処理として着色
性不純物質の除去処理をする必要がなく、これまでの方
法に比べ効率的に甘味誘導活性の安定した、着色の無い
ミラクリンを得ることができ、効率的な工業生産に寄与
するものである。
【００４９】本発明によれば、活性が高く着色不純物の
ないすぐれた精製ミラクリンが工業生産できるので、本
発明は、飲食品や医薬品の製造上きわめて有利な貢献を
なすものである。
ないすぐれた精製ミラクリンが工業生産できるので、本
発明は、飲食品や医薬品の製造上きわめて有利な貢献を
なすものである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年４月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ミラクリン含有原料から酸性緩衝塩
水溶液によって、抽出することを特徴とするミラクリン
の製造方法。 ─────────────────────────────────────────────────────
水溶液によって、抽出することを特徴とするミラクリン
の製造方法。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年５月１１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 甘味誘導物質ミラクリンの製造方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ミラクリンを含有する
原料から甘味誘導物質、ミラクリン（ｍｉｒａｃｕｌｉ
ｎ）を効率的かつ安定的に製造する方法に関する。
原料から甘味誘導物質、ミラクリン（ｍｉｒａｃｕｌｉ
ｎ）を効率的かつ安定的に製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】西アフリカ原産の植物（Ｒｉｃｈａｄｅ
ｌｌａ ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）、通称ミラクルフルーツ
には、これを食した直後に酸味のものを味わうと甘く感
じるという独特の性質を持っている。そして、この作用
は甘味誘導物質ミラクリンによることが知られている。
ｌｌａ ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）、通称ミラクルフルーツ
には、これを食した直後に酸味のものを味わうと甘く感
じるという独特の性質を持っている。そして、この作用
は甘味誘導物質ミラクリンによることが知られている。
【０００３】その甘味誘導作用の詳細な機構は現在の所
明らかではないが、ミラクリンそのものとしては精製さ
れ、既に、純品が得られており、分子量４００００前後
の糖タンパク質としてアミノ酸配列も明らかになってい
る（特開平３−２１８４００号公報）。
明らかではないが、ミラクリンそのものとしては精製さ
れ、既に、純品が得られており、分子量４００００前後
の糖タンパク質としてアミノ酸配列も明らかになってい
る（特開平３−２１８４００号公報）。
【０００４】この甘味誘導物質ミラクリンの製造方法と
して、これまで次のような方法が提案されている。
して、これまで次のような方法が提案されている。
【０００５】１．Ｋ．Ｋｕｒｉｈａｒａ，Ｌ．Ｍ．Ｂｅ
ｉｄｌｅｒ；Ｓｉｅｎｃｅ，１６１，１２４１（１９６
８）によれば、凍結乾燥したミラクルフルーツの果肉を
ｐＨ１０．５の炭酸塩緩衝液中でホモジナイズし活性部
分を抽出する。この抽出液に硫酸アンモニュウムを加え
て塩析する。得られた沈澱物をリン酸塩緩衝液に溶解
し、透析により硫酸アンモニュウムを除去する。さらに
得られた溶液を等電点電気泳動等で精製する。
ｉｄｌｅｒ；Ｓｉｅｎｃｅ，１６１，１２４１（１９６
８）によれば、凍結乾燥したミラクルフルーツの果肉を
ｐＨ１０．５の炭酸塩緩衝液中でホモジナイズし活性部
分を抽出する。この抽出液に硫酸アンモニュウムを加え
て塩析する。得られた沈澱物をリン酸塩緩衝液に溶解
し、透析により硫酸アンモニュウムを除去する。さらに
得られた溶液を等電点電気泳動等で精製する。
【０００６】２．又、特開昭６２−２４２７００号公報
によれば、ミラクルフルーツの果肉から抽出溶媒とし
て、ｐＨ６〜９付近の中性塩溶液を用いてミラクリンを
抽出する。
によれば、ミラクルフルーツの果肉から抽出溶媒とし
て、ｐＨ６〜９付近の中性塩溶液を用いてミラクリンを
抽出する。
【０００７】３．そして、特開昭６３−１８５３４９号
公報によれば、ミラクルフルーツの果肉を粉砕し、水を
添加後ホモジナイズし洗浄液が着色しなくなるまで水洗
いする。洗浄後の果肉に中性の塩化ナトリウム水溶液を
加えミラクリンを抽出する。次に、この抽出液を硫酸ア
ンモニュウムで塩析し、ミラクリン画分の沈澱物を得
る。この沈澱物を中性のリン酸緩衝液に溶解し、ＣＭセ
ファロースイオン交換クロマトグラフィーにかけ、さら
にアフィニティークロマトグラフィーにかけて精製す
る、方法である。
公報によれば、ミラクルフルーツの果肉を粉砕し、水を
添加後ホモジナイズし洗浄液が着色しなくなるまで水洗
いする。洗浄後の果肉に中性の塩化ナトリウム水溶液を
加えミラクリンを抽出する。次に、この抽出液を硫酸ア
ンモニュウムで塩析し、ミラクリン画分の沈澱物を得
る。この沈澱物を中性のリン酸緩衝液に溶解し、ＣＭセ
ファロースイオン交換クロマトグラフィーにかけ、さら
にアフィニティークロマトグラフィーにかけて精製す
る、方法である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
（１）及び（２）から得られる抽出液は不純物を有する
ため濃い着色を示し、色相的に好ましくなく、しかも、
この着色物質の除去は硫安沈澱、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳
動等の生化学的な様々の分離方法を利用しても困難であ
った。
（１）及び（２）から得られる抽出液は不純物を有する
ため濃い着色を示し、色相的に好ましくなく、しかも、
この着色物質の除去は硫安沈澱、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳
動等の生化学的な様々の分離方法を利用しても困難であ
った。
【０００９】又、さらに着色原因となる不純物がミラク
リンに強く結合していると考えられるため、その活性の
一部が失われ、高純度のミラクリンが得られないばかり
か、甘味誘導活性の低下が認められるという重大な問題
があった。
リンに強く結合していると考えられるため、その活性の
一部が失われ、高純度のミラクリンが得られないばかり
か、甘味誘導活性の低下が認められるという重大な問題
があった。
【００１０】そこで、（３）の製造方法においては、ミ
ラクリンの抽出前に着色原因となる着色物質を除去する
手段として、ミラクルフルーツの果肉を洗液が着色しな
くなるまで水洗している。しかし、この方法ではミラク
リン抽出液の着色は認められず、かつ甘味誘導活性は高
いもののミラクリンの抽出を行うためには、前処理とし
て水洗浄を洗液が着色しなくなるまで行わねばならず、
洗浄、分離のために相当の時間と労力が必要になり、し
かもミラクルフルーツ果肉中に含まれるミラクリンは安
定性が低いため、長時間の抽出前処理を行うことは何等
かの悪影響を及ぼす恐れも考えられる。
ラクリンの抽出前に着色原因となる着色物質を除去する
手段として、ミラクルフルーツの果肉を洗液が着色しな
くなるまで水洗している。しかし、この方法ではミラク
リン抽出液の着色は認められず、かつ甘味誘導活性は高
いもののミラクリンの抽出を行うためには、前処理とし
て水洗浄を洗液が着色しなくなるまで行わねばならず、
洗浄、分離のために相当の時間と労力が必要になり、し
かもミラクルフルーツ果肉中に含まれるミラクリンは安
定性が低いため、長時間の抽出前処理を行うことは何等
かの悪影響を及ぼす恐れも考えられる。
【００１１】以上のように、これまでのミラクリン製造
方法では抽出液の着色及びこれら不純物による活性の低
下、もしくは着色不純物質の除去に多大な時間を要する
という問題があり、より効率的に、着色のない安定性に
優れたミラクリンの製造方法が求められていた。また、
飲食品や医薬品への利用上の面から、そしてまた長期保
存や移動運送の面からも、高純度の活性粉末化可能なミ
ラクリンを工業的に大量生産し得る方法の開発も当業界
において強く求められていた。
方法では抽出液の着色及びこれら不純物による活性の低
下、もしくは着色不純物質の除去に多大な時間を要する
という問題があり、より効率的に、着色のない安定性に
優れたミラクリンの製造方法が求められていた。また、
飲食品や医薬品への利用上の面から、そしてまた長期保
存や移動運送の面からも、高純度の活性粉末化可能なミ
ラクリンを工業的に大量生産し得る方法の開発も当業界
において強く求められていた。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点に鑑み、活性の安定化したミラクリンの製造をより効
率的に行うことを目的とし、抽出過程におけるミラクリ
ン含有物中の着色不純物質に着目し、種々検討を重ねた
結果、酸性緩衝塩水溶液を用い、抽出操作を行うことで
抽出前処理等を行なわなくとも、清浄で安定性の高いミ
ラクリンが得られること、そしてまた高純度の精製粉末
ミラクリンを工業的に製造しうることを見出し本発明を
するに至った。
点に鑑み、活性の安定化したミラクリンの製造をより効
率的に行うことを目的とし、抽出過程におけるミラクリ
ン含有物中の着色不純物質に着目し、種々検討を重ねた
結果、酸性緩衝塩水溶液を用い、抽出操作を行うことで
抽出前処理等を行なわなくとも、清浄で安定性の高いミ
ラクリンが得られること、そしてまた高純度の精製粉末
ミラクリンを工業的に製造しうることを見出し本発明を
するに至った。
【００１３】さらに詳しくは、ミラクルフルーツの凍結
乾燥果肉を粉砕し、５℃以下の低温条件下で酸性緩衝塩
水溶液を添加し、超音波等でこれをホモジナイズした
後、遠心分離により上澄みを採取し抽出液とする。この
抽出液はほぼ無色透明で口に含むと高い甘味誘導活性を
示す。この時抽出に用いる酸性緩衝塩水溶液のｐＨは
３．１〜６．５の範囲が望ましく、好ましくはｐＨ３．
１〜５．９、更に好ましくはｐＨ３．５〜５．５の範囲
が良い。又、ここで用いる酸性緩衝塩水溶液の種類も上
記ｐＨの範囲にあれば特に制限はしないが、好ましく
は、例えば、クエン酸１ナトリウムークエン酸２ナトリ
ウム溶液（０．１Ｍ）、酢酸−酢酸ナトリウム溶液
（０．１Ｍ）、フタル酸−フタル酸１カリウム溶液
（０．１Ｍ）、を用いるのが良く、さらに、これらにＮ
ａＣｌを添加し、この溶液中の濃度を０．５Ｍにして用
いる。
乾燥果肉を粉砕し、５℃以下の低温条件下で酸性緩衝塩
水溶液を添加し、超音波等でこれをホモジナイズした
後、遠心分離により上澄みを採取し抽出液とする。この
抽出液はほぼ無色透明で口に含むと高い甘味誘導活性を
示す。この時抽出に用いる酸性緩衝塩水溶液のｐＨは
３．１〜６．５の範囲が望ましく、好ましくはｐＨ３．
１〜５．９、更に好ましくはｐＨ３．５〜５．５の範囲
が良い。又、ここで用いる酸性緩衝塩水溶液の種類も上
記ｐＨの範囲にあれば特に制限はしないが、好ましく
は、例えば、クエン酸１ナトリウムークエン酸２ナトリ
ウム溶液（０．１Ｍ）、酢酸−酢酸ナトリウム溶液
（０．１Ｍ）、フタル酸−フタル酸１カリウム溶液
（０．１Ｍ）、を用いるのが良く、さらに、これらにＮ
ａＣｌを添加し、この溶液中の濃度を０．５Ｍにして用
いる。
【００１４】本発明において使用する酸性緩衝塩水溶液
としては、上記した酸性ｐＨ域を維持しうる緩衝能を有
する塩類の水溶液であれば上記に限定されることなく使
用できる。
としては、上記した酸性ｐＨ域を維持しうる緩衝能を有
する塩類の水溶液であれば上記に限定されることなく使
用できる。
【００１５】抽出対象としてのミラクリン含有物はミラ
クルフルーツの凍結乾燥果肉が好適に用いられるが、新
鮮果肉であっても良い。
クルフルーツの凍結乾燥果肉が好適に用いられるが、新
鮮果肉であっても良い。
【００１６】上記方法によって得られた抽出液を透析、
限外ろ過（逆浸透法、イオン交換膜電気透析法等を含
む）、ゲルろ過等により脱塩し、これを凍結乾燥等する
ことによりミラクリン粗製粉末が得られる。ミラクリン
粗製粉末は白色であり、吸湿を防ぐためシリカゲル等の
吸湿剤で密封処理、又は窒素ガス封入等を施す事により
３ケ月以上の甘味誘導活性を維持し、充分実用に供する
ことができる。さらにミラクリン抽出液は種々の沈澱分
離法、すなわち硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム等の塩析、等電点沈澱法、水溶性ポリマー
であるポリエチレングリコール、デキストラン等による
共沈等によって純度を上げることもでき、あるいは、各
種クロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、水素
結合クロマトグラフイー、クロマトフォーカシングクロ
マトグラフィー等の利用や、さらには電気泳動、分子量
分画に基づいた膜分離、アフィニティー担体やイオン交
換担体を結合させたメンブレンリアクター等によっても
精製をすることも可能である。
限外ろ過（逆浸透法、イオン交換膜電気透析法等を含
む）、ゲルろ過等により脱塩し、これを凍結乾燥等する
ことによりミラクリン粗製粉末が得られる。ミラクリン
粗製粉末は白色であり、吸湿を防ぐためシリカゲル等の
吸湿剤で密封処理、又は窒素ガス封入等を施す事により
３ケ月以上の甘味誘導活性を維持し、充分実用に供する
ことができる。さらにミラクリン抽出液は種々の沈澱分
離法、すなわち硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム等の塩析、等電点沈澱法、水溶性ポリマー
であるポリエチレングリコール、デキストラン等による
共沈等によって純度を上げることもでき、あるいは、各
種クロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、水素
結合クロマトグラフイー、クロマトフォーカシングクロ
マトグラフィー等の利用や、さらには電気泳動、分子量
分画に基づいた膜分離、アフィニティー担体やイオン交
換担体を結合させたメンブレンリアクター等によっても
精製をすることも可能である。
【００１７】
【作用】ミラクリンの抽出液の着色要因としては、ミラ
クリン含有物中の着色不純物質によること、さらに、こ
れはミラクリンと強固な複合体を形成し易く、複合体を
形成した後は着色不純物質の除去は著しく困難であると
されていた。またこの複合体を形成し易い物質として
は、ポリフェノール様の物質、もしくは酸性物質とも考
えられていたが、未だ、その物質について解明はされて
いない。
クリン含有物中の着色不純物質によること、さらに、こ
れはミラクリンと強固な複合体を形成し易く、複合体を
形成した後は着色不純物質の除去は著しく困難であると
されていた。またこの複合体を形成し易い物質として
は、ポリフェノール様の物質、もしくは酸性物質とも考
えられていたが、未だ、その物質について解明はされて
いない。
【００１８】しかし、これらの影響は、本発明による酸
性緩衝塩水溶液を用いた抽出を行なうことで容易に解決
することができた。
性緩衝塩水溶液を用いた抽出を行なうことで容易に解決
することができた。
【００１９】即ち、これら着色不純物質は酸性緩衝塩水
溶液を用いた酸性条件下では、反応基が解離しないか解
離しにくくなることによって、その反応性が著しく低下
もしくは不活化してミラクリンへの結合が抑制されたも
のと考えられ、その結果、透明度の高い抽出液さらには
着色のない甘味誘導活性の安定なミラクリンの抽出を容
易に行ない得るものである。
溶液を用いた酸性条件下では、反応基が解離しないか解
離しにくくなることによって、その反応性が著しく低下
もしくは不活化してミラクリンへの結合が抑制されたも
のと考えられ、その結果、透明度の高い抽出液さらには
着色のない甘味誘導活性の安定なミラクリンの抽出を容
易に行ない得るものである。
【００２０】
【実施例】次に実施例を示し、本発明を具体的に説明す
るが要旨を越えない限りこれに限定されるものではな
い。
るが要旨を越えない限りこれに限定されるものではな
い。
【００２１】
【実施例１】ミラクルフルーツ（Ｒｉｃｈａｄｅｌｌａ
ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）の果肉の凍結乾燥物１ｇに対
し、下記の表１に示す各種ｐＨに調製した緩衝塩水溶液
（溶液中０．５ＭのＮａＣｌを含む）３０ｍｌを加え、
超音波（２００ｋＨｚ）で３０秒間、４回繰り返しホモ
ジナイズした後、１００００ｒｐｍで４５分間遠心分離
して上澄みを採取した。残渣に対し同様の操作を繰り返
し２回目の上澄みとして採取した。これら２回分の上澄
みを合わせ、ミラクリン抽出液とした。
ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）の果肉の凍結乾燥物１ｇに対
し、下記の表１に示す各種ｐＨに調製した緩衝塩水溶液
（溶液中０．５ＭのＮａＣｌを含む）３０ｍｌを加え、
超音波（２００ｋＨｚ）で３０秒間、４回繰り返しホモ
ジナイズした後、１００００ｒｐｍで４５分間遠心分離
して上澄みを採取した。残渣に対し同様の操作を繰り返
し２回目の上澄みとして採取した。これら２回分の上澄
みを合わせ、ミラクリン抽出液とした。
【００２２】さらに、この各種ｐＨによるミラクリン抽
出液５ｍｌを脱塩用ゲルろ過クロマトグラフィー（ファ
ルマシア社製）により脱塩し７ｍｌの脱塩液を得、これ
をミラクリン抽出脱塩液とした。この内の３．５ｍｌを
凍結乾燥してミラクリン粗製粉末を得た。
出液５ｍｌを脱塩用ゲルろ過クロマトグラフィー（ファ
ルマシア社製）により脱塩し７ｍｌの脱塩液を得、これ
をミラクリン抽出脱塩液とした。この内の３．５ｍｌを
凍結乾燥してミラクリン粗製粉末を得た。
【００２３】
【表１】
【００２４】ここで各種ｐＨの緩衝水溶液（溶液中０．
５ＭのＮａＣｌを含む）の調製法を下記に示す。なお、
下記に使用する試薬は、和光純薬社製ですべて特級を使
用した。
５ＭのＮａＣｌを含む）の調製法を下記に示す。なお、
下記に使用する試薬は、和光純薬社製ですべて特級を使
用した。
【００２５】（１）ｐＨ３．１緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍクエン酸水溶液と０．１Ｍクエン酸１ナトリウ
ム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨ
が３．１になるまで両液を混合する。ｐＨが３．１にな
ったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍになるよ
うにＮａＣｌを加え調製する。
ム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨ
が３．１になるまで両液を混合する。ｐＨが３．１にな
ったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍになるよ
うにＮａＣｌを加え調製する。
【００２６】（２）ｐＨ３．５緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍフタル酸水溶液と０．１Ｍフタル酸１カリウム
水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが
３．５になるまで両液を混合する。ｐＨが３．５になっ
たら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍになるよう
にＮａＣｌを加え調製する。
水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが
３．５になるまで両液を混合する。ｐＨが３．５になっ
たら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍになるよう
にＮａＣｌを加え調製する。
【００２７】（３）ｐＨ４．５緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍ酢酸水溶液と０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を
ｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが４．５に
なるまで両液を混合する。ｐＨが４．５になったら、こ
の溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａＣ
ｌを加え調製する。
ｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが４．５に
なるまで両液を混合する。ｐＨが４．５になったら、こ
の溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａＣ
ｌを加え調製する。
【００２８】（４）ｐＨ５．１緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍ酢酸水溶液と０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を
ｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが５．１に
なるまでに両液を混合する。ｐＨが５．１になったら、
この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａ
Ｃｌを加え調製する。
ｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが５．１に
なるまでに両液を混合する。ｐＨが５．１になったら、
この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａ
Ｃｌを加え調製する。
【００２９】（５）ｐＨ５．５緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍクエン酸１ナトリウム水溶液と０．１Ｍクエン
酸２ナトリウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認
しながらｐＨが５．５になるまでに両液を混合する。ｐ
Ｈが５．５になったら、この溶液中のＮａＣｌ満度が
０．５ＭになるようにＮａＣｌを加え調製する。
酸２ナトリウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認
しながらｐＨが５．５になるまでに両液を混合する。ｐ
Ｈが５．５になったら、この溶液中のＮａＣｌ満度が
０．５ＭになるようにＮａＣｌを加え調製する。
【００３０】（６）ｐＨ６．５緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液にｐＨメーターによ
りｐＨを確認しながらｐＨが６．５になるまで０．１Ｎ
ＨＣｌ水溶液を加える。ｐＨが６．５になったら、この
溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａＣｌ
を加え調製する。
りｐＨを確認しながらｐＨが６．５になるまで０．１Ｎ
ＨＣｌ水溶液を加える。ｐＨが６．５になったら、この
溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａＣｌ
を加え調製する。
【００３１】（７）ｐＨ７．５緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍリン酸１ナトリウム水溶液と０．１Ｍリン酸２
ナトリウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しな
がらｐＨが７．５になるまで両液を混合する。ｐＨが
７．５になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５
ＭになるようにＮａＣｌを加え調製する。
ナトリウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しな
がらｐＨが７．５になるまで両液を混合する。ｐＨが
７．５になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５
ＭになるようにＮａＣｌを加え調製する。
【００３２】（８）ｐＨ８．３緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍグリシルグリシン水溶液（１３．２ｇを純水１
０００ｍｌで調製）にｐＨメーターによりｐＨを確認し
ながらｐＨが８．３になるまで０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶
液を加える。ｐＨが８．３になったら、この溶液中のＮ
ａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａＣｌを加え調製
する。
０００ｍｌで調製）にｐＨメーターによりｐＨを確認し
ながらｐＨが８．３になるまで０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶
液を加える。ｐＨが８．３になったら、この溶液中のＮ
ａＣｌ濃度が０．５ＭになるようにＮａＣｌを加え調製
する。
【００３３】（９）ｐＨ９．２緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍホウ酸水溶液と０．１Ｍホウ酸ナトリウム水溶
液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが９．
２になるまで両液を混合する。ｐＨを９．２になった
ら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍになるように
ＮａＣｌを加え調製する。
液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながらｐＨが９．
２になるまで両液を混合する。ｐＨを９．２になった
ら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５Ｍになるように
ＮａＣｌを加え調製する。
【００３４】（１０）ｐＨ１０．１緩衝塩水溶液の調製 ０．１Ｍ炭酸１ナトリウム水溶液と０．１Ｍ炭酸２ナト
リウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながら
ｐＨが１０．１になるまで両液を混合する。ｐＨが１
０．１になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５
ＭになるようにＮａＣｌを加え調製する。
リウム水溶液をｐＨメーターによりｐＨを確認しながら
ｐＨが１０．１になるまで両液を混合する。ｐＨが１
０．１になったら、この溶液中のＮａＣｌ濃度が０．５
ＭになるようにＮａＣｌを加え調製する。
【００３５】
【実施例２】実施例１で得られた各種ｐＨのミラクリン
抽出脱塩液について、着色の度合い及び甘味誘導活性を
下記の手順にしたがって測定評価し、得られた結果を下
記の表２に示した。
抽出脱塩液について、着色の度合い及び甘味誘導活性を
下記の手順にしたがって測定評価し、得られた結果を下
記の表２に示した。
【００３６】着色度試験手順 直射日光をさけた自然光下で、内径１９ｍｍ外径２１ｍ
ｍの試験管にミラクリン抽出脱塩液を３．５ｍｌ入れ、
垂直に立てた。横からみた抽出脱塩液について色相、明
度、彩度を表示するＪＩＳ Ｚ ８７２１の色度票と隣
接させて比較して色を測定した。さらに、甘味誘導活性
を評価した。ここで官能試験は次のように行った。 、０．１Ｍクエン酸溶液を２〜３ｍｌ、口に含み、酸
味を感ずる事を確認する。 、吐き出して水で口をすすぐ。 、ミラクリン抽出脱塩液２．５ｍｌを口に含む。 、１分間、舌の上でころがすようにして舌に十分吸着
させる。 、吐き出して水で口をすすぐ。 、０．１Ｍクエン酸溶液を２〜３ｍｌ、口に含む。こ
の時の甘さを記憶しておく。 、標準甘味溶液（０．１，０．２，０．３，０．４，
０．５Ｍショ糖溶液）２〜３ｍｌを口に含み０．１Ｍク
エン酸を味わったときとの甘味を比較し同等の甘味をも
つショ糖溶液の濃度を決定し、その濃度を甘味誘導活性
とした。
ｍの試験管にミラクリン抽出脱塩液を３．５ｍｌ入れ、
垂直に立てた。横からみた抽出脱塩液について色相、明
度、彩度を表示するＪＩＳ Ｚ ８７２１の色度票と隣
接させて比較して色を測定した。さらに、甘味誘導活性
を評価した。ここで官能試験は次のように行った。 、０．１Ｍクエン酸溶液を２〜３ｍｌ、口に含み、酸
味を感ずる事を確認する。 、吐き出して水で口をすすぐ。 、ミラクリン抽出脱塩液２．５ｍｌを口に含む。 、１分間、舌の上でころがすようにして舌に十分吸着
させる。 、吐き出して水で口をすすぐ。 、０．１Ｍクエン酸溶液を２〜３ｍｌ、口に含む。こ
の時の甘さを記憶しておく。 、標準甘味溶液（０．１，０．２，０．３，０．４，
０．５Ｍショ糖溶液）２〜３ｍｌを口に含み０．１Ｍク
エン酸を味わったときとの甘味を比較し同等の甘味をも
つショ糖溶液の濃度を決定し、その濃度を甘味誘導活性
とした。
【００３７】
【表２】
【００３８】さらに、実施例１で得られた、各種ｐＨの
ミラクリン抽出脱塩液の凍結乾燥粗製粉末の着色をＪＩ
Ｓ Ｚ ８７２１の色度票で評価し、その結果を下記の
表３に示した。
ミラクリン抽出脱塩液の凍結乾燥粗製粉末の着色をＪＩ
Ｓ Ｚ ８７２１の色度票で評価し、その結果を下記の
表３に示した。
【００３９】
【表３】
【００４０】
【実施例３】実施例１で得られた各種ｐＨによるミラク
リン抽出液それぞれについて、抗ミラクリンＩｇＧ（抗
体：イムノグロブリン）に酵素（ＰＯＤ：パーオキシダ
ーゼ）を結合し標識化した。サンドイッチ法（Ｐ．Ｋ．
Ｎａｋａｎｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｗａｃｉ，（１９７
４）Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃ
ｈｅｍ．，２２，１０８４−１０９１）によりミラクリ
ンの定量を行い、比較評価し、その結果を下記の表４に
示した。
リン抽出液それぞれについて、抗ミラクリンＩｇＧ（抗
体：イムノグロブリン）に酵素（ＰＯＤ：パーオキシダ
ーゼ）を結合し標識化した。サンドイッチ法（Ｐ．Ｋ．
Ｎａｋａｎｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｗａｃｉ，（１９７
４）Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃ
ｈｅｍ．，２２，１０８４−１０９１）によりミラクリ
ンの定量を行い、比較評価し、その結果を下記の表４に
示した。
【００４１】
【表４】
【００４２】ここで、ミラクリンの定量は次のようにし
て行った。
て行った。
【００４３】ミラクリン定量操作 ９６穴のマイクロプレートのウェル（穴）各々に、１０
０μｌの抗ミラクリンＩｇＧを加え、４℃で一晩放置
し、抗ミラクリンＩｇＧをウェル内壁に結合させる。放
置後ウェル内壁に結合させた抗ミラクリンＩｇＧを０．
１８％のリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．５）で洗浄す
る。ウェル内の残液を除去した後、既知濃度のミラクリ
ン溶液及び実施例１で得られた各種ｐＨによるミラクリ
ン抽出液を１００００倍に希釈したもの１００μｌを、
ウェル内壁に結合している抗ミラクリンＩｇＧに加え、
２時間室温で放置する。再度、０．１８％のリン酸カリ
ウム水溶液（ｐＨ７．５）で洗浄し、ウェル内の残液を
除去した後、標識化ＩｇＧを１００μｌ加え、２時間室
温で放置する。次に０．１８％のリン酸カリウム水溶液
（ｐＨ７．５）で洗浄し、ウェル内の残液を除去した
後、パーオキシダーゼ用発色キットの発色液（住友ベー
クライト社製）を加え、更に３分後、同キットの停止液
（住友ベークライト社製）を加えて反応を止めた後、イ
ムノリーダーで吸光度を測定し、上記既知濃度のミラク
リン溶液０．５，１．０，２．０，５．０，１０，２
０，５０，１００，２００，２５０，５００，ｎｇ（ナ
ノグラム）／ｍｌの測定値から作成した検量線を基に抽
出液中のミラクリン含量を測定した。
０μｌの抗ミラクリンＩｇＧを加え、４℃で一晩放置
し、抗ミラクリンＩｇＧをウェル内壁に結合させる。放
置後ウェル内壁に結合させた抗ミラクリンＩｇＧを０．
１８％のリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．５）で洗浄す
る。ウェル内の残液を除去した後、既知濃度のミラクリ
ン溶液及び実施例１で得られた各種ｐＨによるミラクリ
ン抽出液を１００００倍に希釈したもの１００μｌを、
ウェル内壁に結合している抗ミラクリンＩｇＧに加え、
２時間室温で放置する。再度、０．１８％のリン酸カリ
ウム水溶液（ｐＨ７．５）で洗浄し、ウェル内の残液を
除去した後、標識化ＩｇＧを１００μｌ加え、２時間室
温で放置する。次に０．１８％のリン酸カリウム水溶液
（ｐＨ７．５）で洗浄し、ウェル内の残液を除去した
後、パーオキシダーゼ用発色キットの発色液（住友ベー
クライト社製）を加え、更に３分後、同キットの停止液
（住友ベークライト社製）を加えて反応を止めた後、イ
ムノリーダーで吸光度を測定し、上記既知濃度のミラク
リン溶液０．５，１．０，２．０，５．０，１０，２
０，５０，１００，２００，２５０，５００，ｎｇ（ナ
ノグラム）／ｍｌの測定値から作成した検量線を基に抽
出液中のミラクリン含量を測定した。
【００４４】抗ミラクリンＩｇＧの作製 純度９９．９％以上の精製ミラクリン２５０μｇを同量
の完全フロイントアジュバントで乳化した後、うさぎ
（体重：３〜３．５Ｋｇ）に注射し１０日後、２０日後
にさらに２５０μｇの不完全フロイントアジュバントを
うさぎに注射した。最後の注射から１週間後採血し、抗
ミラクリン血清を得た。
の完全フロイントアジュバントで乳化した後、うさぎ
（体重：３〜３．５Ｋｇ）に注射し１０日後、２０日後
にさらに２５０μｇの不完全フロイントアジュバントを
うさぎに注射した。最後の注射から１週間後採血し、抗
ミラクリン血清を得た。
【００４５】この血清７ｍｌを０．０５Ｍトリス塩酸塩
（ｐＨ８．５，０．１５ＭＮａＣｌ）で平衝化したプロ
テインＡ（生化学工業社製）５ｍｌに添加し低温室（４
℃〜１０℃）で２〜３時間スターラーでゆっくり撹拌し
て抗ミラクリンＩｇＧを吸着させた。カラムにこのプロ
テインＡを充填後、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．０，０．１５ＭＮａＣｌ）でＩｇＧを溶出する事に
より精製抗ミラクりンＩｇＧ、約２５ｍｇを得た。
（ｐＨ８．５，０．１５ＭＮａＣｌ）で平衝化したプロ
テインＡ（生化学工業社製）５ｍｌに添加し低温室（４
℃〜１０℃）で２〜３時間スターラーでゆっくり撹拌し
て抗ミラクリンＩｇＧを吸着させた。カラムにこのプロ
テインＡを充填後、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．０，０．１５ＭＮａＣｌ）でＩｇＧを溶出する事に
より精製抗ミラクりンＩｇＧ、約２５ｍｇを得た。
【００４６】ＩｇＧの酵素（ＰＯＤ）による標識化 ４ｍｇのＰＯＤ（パーオキシダーゼ：ベーリンガー社
製）を１ｍｌの純水に溶解した後、０．１Ｍ過ヨウ素酸
ナトリウム０．２ｍｌを加え室温で２０分間放置し、透
析チューブに入れ、１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４．４）で一晩透析した。
製）を１ｍｌの純水に溶解した後、０．１Ｍ過ヨウ素酸
ナトリウム０．２ｍｌを加え室温で２０分間放置し、透
析チューブに入れ、１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４．４）で一晩透析した。
【００４７】透析終了後のＰＯＤに０．２Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加えｐＨ９前後に調整し
た。このＰＯＤに８ｍｇのＩｇＧを含む１ｍｌの０．０
１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加え室温で
２時間振盪した。さらに、１ｍｌの純水に溶解した、４
ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを０．１ｍｌ加え、４℃
で２時間放置したのち、ゲルろ過クロマトグラフィー
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ｓ−２００カラム１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ６．８で平衝化）に添加し２
ｍｌずつフラクションを集め２８０ｎｍ（タンパクの吸
収を表わす）、４０３ｎｍ（ＰＯＤの吸収、正確にはＰ
ＯＤの中の鉄の吸収である）及び４０５ｎｍ（ＰＯＤ活
性の吸収を表わす）における吸収を測定した。これら３
つの吸収ピークをもつフラクションは、ＩｇＧと活性を
持つＰＯＤとが結合しているフラクションであり、これ
を集め混合後、ＢＳＡ（牛血清アルブミン；和光純薬社
製、免疫測定用）の最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるよう
にＢＳＡを加えて、ＰＯＤが結合した標識化ＩｇＧとし
た。
ウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加えｐＨ９前後に調整し
た。このＰＯＤに８ｍｇのＩｇＧを含む１ｍｌの０．０
１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加え室温で
２時間振盪した。さらに、１ｍｌの純水に溶解した、４
ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを０．１ｍｌ加え、４℃
で２時間放置したのち、ゲルろ過クロマトグラフィー
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ｓ−２００カラム１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ６．８で平衝化）に添加し２
ｍｌずつフラクションを集め２８０ｎｍ（タンパクの吸
収を表わす）、４０３ｎｍ（ＰＯＤの吸収、正確にはＰ
ＯＤの中の鉄の吸収である）及び４０５ｎｍ（ＰＯＤ活
性の吸収を表わす）における吸収を測定した。これら３
つの吸収ピークをもつフラクションは、ＩｇＧと活性を
持つＰＯＤとが結合しているフラクションであり、これ
を集め混合後、ＢＳＡ（牛血清アルブミン；和光純薬社
製、免疫測定用）の最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるよう
にＢＳＡを加えて、ＰＯＤが結合した標識化ＩｇＧとし
た。
【００４８】
【発明の効果】本発明は酸性塩水溶液を用いた抽出を行
なうことにより、ミラクリンと複合体を形成しやすいと
言われていた、着色性不純物質の活性もしくは反応性の
抑制を図れる効果を有するため、抽出前処理として着色
性不純物質の除去処理をする必要がなく、これまでの方
法に比べ効率的に甘味誘導活性の安定した、着色の無い
ミラクリンを得ることができ、効率的な工業生産に寄与
するものである。
なうことにより、ミラクリンと複合体を形成しやすいと
言われていた、着色性不純物質の活性もしくは反応性の
抑制を図れる効果を有するため、抽出前処理として着色
性不純物質の除去処理をする必要がなく、これまでの方
法に比べ効率的に甘味誘導活性の安定した、着色の無い
ミラクリンを得ることができ、効率的な工業生産に寄与
するものである。
【００４９】本発明によれば、活性が高く着色不純物の
ないすぐれた精製ミラクリンが工業生産できるので、本
発明は、飲食品や医薬品の製造上きわめて有利な貢献を
なすものである。 ─────────────────────────────────────────────────────
ないすぐれた精製ミラクリンが工業生産できるので、本
発明は、飲食品や医薬品の製造上きわめて有利な貢献を
なすものである。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年６月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】さらに詳しくは、ミラクルフルーツの凍結
乾燥果肉を粉砕し、５℃以下の低温条件下で酸性緩衝塩
水溶液を添加し、超音波等でこれをホモジナイズした
後、遠心分離により上澄みを採取し抽出液とする。この
抽出液はほぼ無色透明で口に含むと高い甘味誘導活性を
示す。この時抽出に用いる酸性緩衝塩水溶液のｐＨは
３．１〜６．５の範囲が望ましく、好ましくはｐＨ３．
１〜５．９、更に好ましくはｐＨ３．５〜５．５の範囲
が良い。又、ここで用いる酸性緩衝塩水溶液の種類も上
記ｐＨの範囲にあれば特に制限はしないが、好ましく
は、例えば、クエン酸１ナトリウム−クエン酸２ナトリ
ウム溶液（０．１Ｍ）、酢酸−酢酸ナトリウム溶液
（０．１Ｍ）、フタル酸−フタル酸１カリウム溶液
（０．１Ｍ）、を用いるのが良く、さらに、これらにＮ
ａＣｌを添加し、この溶液中の濃度を０．５Ｍにして用
いる。
乾燥果肉を粉砕し、５℃以下の低温条件下で酸性緩衝塩
水溶液を添加し、超音波等でこれをホモジナイズした
後、遠心分離により上澄みを採取し抽出液とする。この
抽出液はほぼ無色透明で口に含むと高い甘味誘導活性を
示す。この時抽出に用いる酸性緩衝塩水溶液のｐＨは
３．１〜６．５の範囲が望ましく、好ましくはｐＨ３．
１〜５．９、更に好ましくはｐＨ３．５〜５．５の範囲
が良い。又、ここで用いる酸性緩衝塩水溶液の種類も上
記ｐＨの範囲にあれば特に制限はしないが、好ましく
は、例えば、クエン酸１ナトリウム−クエン酸２ナトリ
ウム溶液（０．１Ｍ）、酢酸−酢酸ナトリウム溶液
（０．１Ｍ）、フタル酸−フタル酸１カリウム溶液
（０．１Ｍ）、を用いるのが良く、さらに、これらにＮ
ａＣｌを添加し、この溶液中の濃度を０．５Ｍにして用
いる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】さらに、この各種ｐＨによるミラクリン抽
出液５ｍｌを脱塩用ゲルろ過クロマトグラフィー（ファ
ルマシア社製）により脱塩し７ｍｌの脱塩液を得、これ
をミラクリン抽出脱塩液とした。この内の３．５ｍｌを
凍結乾燥してミラクリン粗製粉末を得た。
出液５ｍｌを脱塩用ゲルろ過クロマトグラフィー（ファ
ルマシア社製）により脱塩し７ｍｌの脱塩液を得、これ
をミラクリン抽出脱塩液とした。この内の３．５ｍｌを
凍結乾燥してミラクリン粗製粉末を得た。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】ここで各種ｐＨの緩衝水溶液（溶液中０．
５ＭのＮａＣｌを含む）の調製法を下記に示す。なお、
下記に使用する試薬は、和光純薬社製ですべて特級を使
用した。
５ＭのＮａＣｌを含む）の調製法を下記に示す。なお、
下記に使用する試薬は、和光純薬社製ですべて特級を使
用した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】着色度試験手順 直射日光をさけた自然光下で、内径１９ｍｍ外径２１ｍ
ｍの試験管にミラクリン抽出脱塩液を３．５ｍｌ入れ、
垂直に立てた。横からみた抽出脱塩液について色相、明
度、彩度を表示するＪＩＳ Ｚ ８７２１の色度票と隣
接させて比較して色を測定した。さらに、甘味誘導活性
を評価した。ここで官能試験は次のように行った。 、０．１Ｍクエン酸溶液を２〜３ｍｌ、口に含み、酸
味を感ずる事を確認する。 、吐き出して水で口をすすぐ。 、ミラクリン抽出脱塩液２．５ｍｌを口に含む。 、１分間、舌の上でころがすようにして舌に十分吸着
させる。 、吐き出して水で口をすすぐ。 、０．１Ｍクエン酸溶液を２〜３ｍｌ、口に含む。こ
の時の甘さを記憶しておく。 、標準甘味溶液（０．１，０．２，０．３，０．４，
０．５Ｍショ糖溶液）２〜３ｍｌを口に含み０．１Ｍク
エン酸を味わったときとの甘味を比較し同等の甘味をも
つショ糖溶液の濃度を決定し、その濃度を甘味誘導活性
とした。
ｍの試験管にミラクリン抽出脱塩液を３．５ｍｌ入れ、
垂直に立てた。横からみた抽出脱塩液について色相、明
度、彩度を表示するＪＩＳ Ｚ ８７２１の色度票と隣
接させて比較して色を測定した。さらに、甘味誘導活性
を評価した。ここで官能試験は次のように行った。 、０．１Ｍクエン酸溶液を２〜３ｍｌ、口に含み、酸
味を感ずる事を確認する。 、吐き出して水で口をすすぐ。 、ミラクリン抽出脱塩液２．５ｍｌを口に含む。 、１分間、舌の上でころがすようにして舌に十分吸着
させる。 、吐き出して水で口をすすぐ。 、０．１Ｍクエン酸溶液を２〜３ｍｌ、口に含む。こ
の時の甘さを記憶しておく。 、標準甘味溶液（０．１，０．２，０．３，０．４，
０．５Ｍショ糖溶液）２〜３ｍｌを口に含み０．１Ｍク
エン酸を味わったときとの甘味を比較し同等の甘味をも
つショ糖溶液の濃度を決定し、その濃度を甘味誘導活性
とした。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】
【表２】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】さらに、実施例１で得られた、各種ｐＨの
ミラクリン抽出脱塩液の凍結乾燥粗製粉末の着色をＪＩ
Ｓ Ｚ ８７２１の色度票で評価し、その結果を下記の
表３に示した。
ミラクリン抽出脱塩液の凍結乾燥粗製粉末の着色をＪＩ
Ｓ Ｚ ８７２１の色度票で評価し、その結果を下記の
表３に示した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】
【表３】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】
【表４】
Claims (3)
- 【請求項１】 ミラクリン含有原料から酸性緩衝液水溶
液によって、抽出することを特徴とするミラクリンの製
造方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の酸性緩衝塩水溶液がｐＨ
３．５〜５．５の範囲であることを特徴とするミラクリ
ンの製造方法。 - 【請求項３】 ミラクリンが、甘味誘導活性にすぐれ且
つ着色不純物のない高純度の精製粉末であることを特徴
とする請求項１または請求項２のミラクリンの製造方
法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3347734A JPH0654659A (ja) | 1991-12-04 | 1991-12-04 | 甘味誘導物質ミラクリンの製造方法 |
| PCT/JP1992/001584 WO1993010676A1 (en) | 1991-12-04 | 1992-12-03 | Process for producing sweetness inducer miraculin |
| EP92924876A EP0570591A1 (en) | 1991-12-04 | 1992-12-03 | Process for producing sweetness inducer miraculin |
| KR1019930702296A KR930702907A (ko) | 1991-12-04 | 1992-12-03 | 감미-유도 물질인 미라쿨린의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3347734A JPH0654659A (ja) | 1991-12-04 | 1991-12-04 | 甘味誘導物質ミラクリンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0654659A true JPH0654659A (ja) | 1994-03-01 |
Family
ID=18392228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3347734A Pending JPH0654659A (ja) | 1991-12-04 | 1991-12-04 | 甘味誘導物質ミラクリンの製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0570591A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0654659A (ja) |
| KR (1) | KR930702907A (ja) |
| WO (1) | WO1993010676A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011212172A (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-27 | Mitsubishi Electric Corp | サイクロン分離装置並びに電気掃除機 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5886155A (en) * | 1997-06-18 | 1999-03-23 | Bioresources International Inc. | Purification of miraculin glycoprotein using tandem hydrophobic interaction chromatography |
| US20110144218A1 (en) * | 2009-12-11 | 2011-06-16 | David Posner | Taste-Modified Consumable Products And Methods Of Preparation |
| CN103082260A (zh) * | 2013-02-21 | 2013-05-08 | 万福群 | 一种从神秘果中提取神秘素的方法 |
| CN109430511A (zh) * | 2018-09-06 | 2019-03-08 | 南充好土优土农业开发有限公司 | 一种神秘果的甜味蛋白萃取方法及甜味蛋白饮品 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3925547A (en) * | 1973-04-24 | 1975-12-09 | Us Health Education & Welfare | Isolation and purification of active principle of fruit of synsepalum dulcificum |
| JPH0713079B2 (ja) * | 1986-04-14 | 1995-02-15 | ライオン株式会社 | ミラクリンの製造方法 |
| JPS63185349A (ja) * | 1986-12-04 | 1988-07-30 | Mitajiri Kagaku Kogyo Kk | 甘味誘導物質の製造方法 |
-
1991
- 1991-12-04 JP JP3347734A patent/JPH0654659A/ja active Pending
-
1992
- 1992-12-03 WO PCT/JP1992/001584 patent/WO1993010676A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1992-12-03 EP EP92924876A patent/EP0570591A1/en not_active Withdrawn
- 1992-12-03 KR KR1019930702296A patent/KR930702907A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011212172A (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-27 | Mitsubishi Electric Corp | サイクロン分離装置並びに電気掃除機 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0570591A1 (en) | 1993-11-24 |
| WO1993010676A1 (en) | 1993-06-10 |
| KR930702907A (ko) | 1993-11-29 |
| EP0570591A4 (ja) | 1994-04-27 |
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