WO1993010676A1 - Process for producing sweetness inducer miraculin - Google Patents

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WO1993010676A1
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Naohisa Kamimura
Tomoyuki Makino
Akiko Hirano
Yoshie Kurihara
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Mitsubishi Oil Co., Ltd.
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    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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    • A23L27/31—Artificial sweetening agents containing amino acids, nucleotides, peptides or derivatives

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently and stably producing a sweetness-inducing substance, miraculin, from a raw material containing miraculin.
  • the extract obtained from the above (1) and (2) has a strong color due to the presence of impurities, and is not preferable in terms of hue. Further, the removal of this colored substance is performed by ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography. It was difficult to use various biochemical separation methods such as affinity chromatography and electrophoresis.
  • the miraculin-containing liquid has a pH of 2 or less or a pH of 11 or more.
  • the activity of the miraculin component tends to be deactivated, and extraction with excessively acidic or alkaline properties is not preferable.
  • the pH of the extract is excessively lowered by various acidic substances in the impurities, and the activity of the miraculin component is reduced.
  • deactivating Since these impurities are considered to be soluble in water, in recent extraction methods, miraculin is extracted with a neutral NaC solution after pre-treatment with water washing in order to remove it in advance.
  • the complex in which impurities are strongly bound to miraculin reduces coloration and activity, and decreases activity due to various acidic substances that excessively lower pH.
  • it is necessary to carry out pretreatment with water washing to remove impurities that form a complex with miraculin which requires a great deal of time.
  • a method for producing miraculin that is colorless and has excellent stability without reducing the activity It is also necessary to develop a method for industrially mass-producing miraculin capable of producing high-purity active powder in terms of use in foods and beverages and pharmaceuticals, and also in terms of long-term storage and transport.
  • the inventors of the present invention aim at more efficiently producing clean and stabilized miraculin without the need for pretreatment such as water washing. Focusing on impurities that easily form a strong complex with miraclein in the miracle fruit during the extraction process, we conducted various studies and found that a buffered aqueous solution in the pH range of 3.5 to 5.5 was obtained.
  • fresh pulp of the miracle fruit is frozen with liquid N 2 and the like, and dried under reduced pressure of 10 to 100 mmHg.
  • the freeze-dried pulp is pulverized and mixed with a buffered aqueous solution having a concentration of 0.5 M or less in a pH range of 3.5 to 5.5 under a temperature range of 0 to 5 ° C.
  • Add an acidic buffered salt solution to which NaC was added to a concentration of 5 M, in the range of 5 to 50; After centrifugation, the supernatant is collected and used as an extract. This extraction process is preferably repeated twice or more than once.
  • the aqueous acidic buffer solution used for the extraction treatment should be adjusted to 0.4 to 0.5 M in a buffer aqueous solution with a concentration of 0.1 to 0.2 M that can maintain the pH in the range of 3.5 to 5.5. It is preferable to add NaCf to the buffer solution, and more preferable to add NaCf to a buffer aqueous solution having a concentration of 0.1 M so as to have a concentration of 0.5 M. There is no particular limitation as long as the conditions are satisfied. For example, sodium citrate monosodium citrate solution (0.1 M), sodium acetate monoacetate solution (0.1 M) ) And pH adjusted using a 1M phthalic acid solution (0.1 M), and then NaCl is added to a concentration of 0.5 M for use.
  • freeze-dried pulp of miracle fruit is preferably used, but fresh pulp may be used.
  • the extract obtained by the above method contains NaCf, it is desalted by filtration, ultrafiltration (including reverse osmosis, ion exchange membrane electrodialysis, etc.), gel filtration, etc. Colored by freeze-drying A white Miraclean crude powder with extremely low density is obtained. To prevent moisture absorption, this Miraclean crude powder maintains its sweetness inducing activity stably for 3 months or more by sealing with a hygroscopic agent such as silica gel or filling with nitrogen gas, etc. Can be provided.
  • a hygroscopic agent such as silica gel or filling with nitrogen gas, etc.
  • the miraculin extract after desalting is subjected to various precipitation separation methods, such as salting out of ammonium sulfate, sodium sulfate, potassium phosphate, etc., isoelectric point precipitation, and aqueous solution.
  • the purity can be increased by co-precipitation with polyethylene glycol, dextran, etc., which is a hydrophilic polymer, or various chromatographic methods, such as ion-exchange chromatographic methods, Chromatography, Gel Chromatography, Hydrophobic Chromatography, Hydrogen Bonding Chromatography, Chromatography Focusing Chromatography, etc.
  • the Miraclean extract obtained by the method of the present invention has very little coloring, and Miracle having a purity of 99% or more can be easily obtained by using the above various purification methods.
  • the Miraculin extract or the Miraclein powder obtained from the Miraculin extract is formed by forming a strong complex with Miraculin in the miracle fruit pulp. Due to the easy impurities, these also become light brown or brown colored impurities after the complex is formed, which also leads to a decrease in the activity of inducing the sweetness of miraclean. Then, it is extremely difficult to remove impurities from the complex formed once with Miraclean.
  • flavonoid dyes, acidic substances, or their complexes are considered as impurities that easily form a complex with miraclean, but these substances are still elucidated. Has not been.
  • various acidic substances that excessively lower the pH also decrease the sweetness-inducing activity of miraclean. Invite.
  • the impurities that easily form a complex with miraculin which is a coloring factor, are difficult to dissociate or dissociate under acidic conditions using an acidic buffered salt solution.
  • the reactivity is significantly reduced or inactivated, and binding to miraculin is suppressed.
  • a highly transparent miraculin extract is obtained.
  • the problem of lowering the pH of the extract, which has a negative effect on miraculin activity is that the buffer solution does not cause excessive pH reduction due to various acidic substances in the pulp. It also prevents a decrease in the activity of miraculin components in the environment.
  • the present invention can suppress the influence of impurities that easily form a complex with miraculin, and can maintain a suitable extraction pH, so that there is extremely little coloring without washing with water. In addition, it is possible to easily collect a superior miraculin powder having a stable sweetness inducing activity.
  • 1g of lyophilized miracle fruit (Richadel la dul ci fi ca) pulp was prepared at various pHs shown in Table 1 at a temperature of about 0 ° C (in ice water). (Include 0.5 M NaC £ in solution) Add 15 and homogenize four times with ultrasonic waves (20 kHz) for 30 seconds. Thereafter, an extraction treatment was carried out by centrifuging at 100 rpm for 45 minutes. After centrifugation, the supernatant was collected and used as an extract. The same extraction treatment was repeated on the residue, and a second supernatant was collected. The two extracts obtained by the extraction treatment with each of the buffered saline solutions of each pH were combined to obtain a miraculin extract.
  • Hue 4 levels (2.5, 5, 7.5, 10)
  • the aqueous solution of an acidic buffered salt of the present invention has a higher miraclean content than other aqueous solutions of acidic buffered salt. From this fact, it is clear that the use of the acidic buffered saline solution of the present invention can reduce the amount of impurities and stabilize and extract miraculin. Table 4 Miraclean content in the extract
  • the reaction was stopped by adding a stop solution of the same kit. Then, the absorbance (405 nm) was measured using an im- minder, and the miraculin solution 0.5 having the above known concentration was measured. , 1.0, 2.0, 5.0, 10, 0, 20, 50, 100,
  • the miraculin content in the extract was measured based on a calibration curve created from the measured values of 200, 500, and ng (nanogram).
  • the present invention provides an effect of suppressing the reactivity of impurities that easily form a complex with miraculin, which causes coloration and a decrease in sweetness-inducing activity, by performing extraction using an aqueous acidic buffer salt solution.
  • it also prevents a decrease in the activity of the miraculin component.
  • miraculin with very little coloring and a stable sweetness inducing activity can be obtained, highly purified purified miraculin can be easily industrially produced, and can be used for the production of foods and beverages and pharmaceuticals. It is a very beneficial contribution.

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Description

明 細 書
甘味誘導物質ミ ラク リ ンの製造方法 技術分野
本発明は、 ミ ラク リ ンを含有する原料から甘味誘導物質、 ミ ラ ク リ ン（miraculin) を効率的かつ安定的に製造する方法に関する。 背景技術
西ァフ リ力原産の植物 （Richadella dulcif ica) 、 通称ミ ラ クル フルーツには、 これを食した直後に酸味のものを味わう と甘く 感じ るという独特の性質を持っている。 そして、 この作用は甘味誘導物 質ミ ラク リ ンによることが知られている。
その甘味誘導作用の詳細な機構は現在のところ明らかではないが ミ ラク リ ンそのものと しては精製され、 既に、 純品が得られており 分子量 40， 000前後の糖タンパク質と してァ ミ ノ酸配列も明らかにな つている （特開平 3— 218400号公報） 。
この甘味誘導物質ミ ラク リ ンの製造方法と して、 これまで次のよ うな方法が提案されている。
(1) K. Kurihara, L. . Beidler ； Science, 161, 1241 (1968) によれば、 凍結乾燥したミ ラクルフルーツの果肉を p H l 0. 5 の 炭酸塩緩衝液中でホモジナイ ズし活性部分を抽出する。 更に、 Y. Kurihara. S. Terasak i ； Biochem. B i ophy s. Acta, 719, 444 (1982)によれば、 同様の抽出処理で得られた抽出液に硫酸ア ンモニ ユウムを加えて塩析して、 沈澱物をリ ン酸緩衝液に溶解し、 透析に より硫酸アンモニユウムを除去する。 さ らに得られた溶液を等電点 電気泳動等で精製した後ミ ラク リ ンを得る。
(2) 又、 特開昭 62— 242700号公報によれば、 ミ ラ クルフルーツの 果肉から抽出溶媒と して、 P H 6〜 9付近の中性塩溶液を用いて ミ ラク リ ンを抽出する。
(3) そして、 特開昭 63— 185349号公報によれば、 ミ ラクルフル一 ッの果肉を粉碎し、 水を添加後ホモジナイズし洗浄液が着色しなく なるまで水洗いする。 洗浄後の果肉に中性の塩化ナ ト リ ウム水溶液 を加えミラク リ ンを抽出する。 次に、 この抽出液を硫酸ァンモニュ ゥムで塩折し、 ミ ラク リ ン画分の沈殿物を得る。 この沈殿物を中性 のリ ン酸緩衝液に溶解し、 C Mセファロースィォン交換クロマ トグ ラフィーにかけ、 さ らにァフィ二ティークロマ トグラフィーにかけ て精製する、 方法である。
しかしながら、 上記 (1)及び (2)から得られる抽出液は不純物を有す るため濃い着色を示し、 色相的に好ま しくなく、 しかも、 この着色 物質の除去は硫安沈殿、 イオン交換クロマトグラフィ "^ ァフィ二 ティークロマ トグラフィー、 電気泳動等の生化学的な様々の分離方 法を利用しても困難であった。
又、 さらに着色原因となる不純物がミ ラク リ ンに強く結合してい ると考えられるため、 その活性の一部が失われ、 高純度のミ ラク リ ンが得られないばかりか、 甘味誘導活性の低下が認められるという 重大な問題があった。
そこで、 （3)の製造方法においては、 着色物質を除去する手段と し て、 - ミラクルフルーツの果肉を洗液が着色しなく なるまで水洗して いる。 しかし、 この方法で甘味誘導活性の高いミ ラク リ ンの抽出を 行なうためには、 抽出前処理として水洗浄を洗液が着色しなく なる まで繰り返し行わねばならず、 洗浄、 分離のために相当の時間と労 力が必要になり、 しかも ミ ラクルフルーツ果肉中に含まれる ミ ラク リ ンの安定性が低いため、 長時間の抽出前処理を行なう ことは何等 かの悪影響を及ぼす恐れも考えられる。
更にミ ラク リ ン含有液は、 P H 2以下もしく は p H 1 1以上にな ると ミ ラク リ ン成分の活性が失活し易い性質があり、 過度の酸性や アルカ リ性での抽出は好ま しく はない。 又、 （3)の方法における水洗 浄前処理をせずに抽出を行なう と、 不純物質中の種々酸性物質によ り抽出液の p Hが過度に低下し、 ミ ラク リ ン成分の活性をも失活さ せる問題もある。 そしてこれら不純物質は水に可溶性のものと考え られるため、 近年の抽出法ではあらかじめ除去する目的で、 水洗浄 前処理を行なった後、 ミ ラク リ ンを NaC£中性溶液により抽出してい る
以上のように、 これまでのミ ラク リ ン抽出方法では不純物がミ ラ ク リ ンに強く結合した複合体により着色及び活性の低下や、 過度に p Hを低下させる種々酸性物質による活性の低下、 そしてこれらを 防ぐためにはミ ラク リ ンとの複合体を形成する不純物質の除去をす るのに、 水洗浄前処理を行なわねばならず多大な時間を要するとい う問題があり、 より効率的に、 活性を低下させることなく 、 着色の ない安定性に優れたミ ラク リ ンの製造方法が求められていた。 また 飲食品や医薬品への利用上の面から、 そしてまた長期保存や移動運 送の面からも、 高純度の活性粉末可能な ミ ラク リ ンを工業的に大量 生産し得る方法の開発も当業界において強く求められていた。 ― 発明の開示
本発明者らは、 上記問題点に鑑み、 水洗浄等の前処理を必要とせ ずに、 清浄で活性の安定化したミ ラク リ ンの製造をより効率的に行 なう ことを目的と し、 抽出過程における ミ ラクルフルーツ中の ミ ラ ク リ ンと強固な複合体を形成し易い不純物質に着目 し、 種々検討を 重ねた結果、 P H 3 . 5〜 5 . 5の範囲にある緩衝水溶液に NaC を 添加した、 酸性緩衝塩水溶液を用いた抽出処理を行なう ことで、 ミ ラクルフルーツ中に含まれる不純物を除去するための、 水洗浄等の 前処理を一切必要とせずに、 また、 果肉中の種々酸性物質による過 度な p H低下を防止できるので、 ミ ラク リ ン活性の失活も無く 、 着 色の極めて少ないミ ラク リ ンの抽出を行なう ことができ、 しかも清 浄で安定性に優れたミ ラク リ ンが得られることを見出し本発明をす るに至った。
さらに詳しく は、 ミ ラクルフルーツの新鮮果肉を液体 N 2.等で凍 結し、 1 0〜 1 0 0 mmHgの減圧下で乾燥させる。 この凍結乾燥果肉 を粉砕し、 0〜 5 °Cの温度範囲の条件下で、 p H 3. 5〜 5. 5の 範囲にある濃度 0. 5 M以下の緩衝水溶液に、 0. 4〜 0. 5 Mに なるように NaC£を添加した酸性緩衝塩水溶液を、 ミ ラクルフルーツ 凍結乾燥果肉 1 gに対し 5〜 5 0； ^の範囲で加え、 超音波等でホモ ジナイズする。 これを遠心分離した後、 上澄み液を採取し抽出液と する。 この抽出処理は 2回又は 2回以上操り返すことが好ま しい。 抽出処理に用いる酸性緩衝塩水溶液としては、 P H 3. 5 ~ 5. 5 の範囲を維持しえる濃度 0. 1〜 0. 2 Mの緩衝水溶液に、 0. 4 〜 0. 5 Mになるように NaC£を添加したものが好ま しく、 濃度 0. 1 Mの緩衝水溶液に、 0. 5 Mになるように NaCfを添加したものがよ り好ま しい。 当該条件を満たすものであれば特に制限はしないが、 例えばクェン酸 1 ナ ト リ ウム一クェン酸 2ナト リウム溶液 （ 0. 1 M) 、 酢酸一酢酸ナ ト リ ゥム溶液 （ 0. 1 M) 、 フタル酸 1 力 リ ウ ム溶液 （ 0. 1 M) を用い p Hを調整した後、 NaC£を 0. 5 Mにな るように添加して用いる。
抽出対象としての ミ ラク リ ン含有物はミ ラクルフルーツの凍結乾 燥果肉が好適に用いられるが、 新鮮果肉であつても良い。
上記方法によって得られた抽出液には NaCfを含んでいるため、 透 析、 限外ろ過 （逆浸透法、 イオン交換膜電気透析法等を含む） 、 ゲ ルろ過等により脱塩した後、 これを凍結乾燥等することにより着色 の極めて少ない白色の ミ ラ ク リ ン粗製粉末が得られる。 この ミ ラ ク リ ン粗製粉末は吸湿を防ぐためシ リ 力ゲル等の吸湿剤で密封処理、 又は窒素ガス封入等を施す事で 3 ヶ月以上甘味誘導活性を安定的に 維持し、 充分実用に供するこ とができる。 さ らに脱塩後の ミ ラ ク リ ン抽出液は種々の沈殿分離法、 すなわち硫酸アンモニユウム、 硫酸 ナ ト リ ウム、 リ ン酸カ リ ゥム等の塩析、 等電点沈殿法、 水溶性ポ リ マ一であるポリエチレングリ コール、 デキス トラ ン等による共沈等 によって純度を上げるこ と もでき、 あるいは、 各種ク ロマ ト グラ フ ィ 一、 例えばイオン交換ク ロマ トグラフ ィ ー、 ァフ ィ 二ティ 一ク ロ マ トグラフ ィ 一、 ゲルろ過ク ロマ トグラフ ィ ー、 疎水性ク ロマ ト グ ラフィ一、. 水素結合ク ロマ トグラフ ィ ー、 ク ロマ トフ ォーカ シ ング ク ロマ トグラフ ィ ー等の利用や、 さ らには電気泳動、 分子量分画に 基づいた膜分離、 ァフ ィ二ティ ー担体やイオン交換担体を結合させ たメ ンブレンリ アクタ一等によっても精製をする こ とが可能である。 本発明の方法によって得られる ミ ラ ク リ ン抽出液は着色が極めて 少なく 、 上記種々の精製法を利用されれば容易に純度 9 9 %以上の ミ ラク リ ンを獲得するこ とができる。
ミ ラ ク リ ン抽出液も し く は、 これより得られる ミ ラ ク リ ン粉末の 着色要因と しては、 ミ ラ クルフルーツ果肉中の ミ ラ ク リ ンと強固な 複合体を形成し易い不純物質による こ と、 さ らにこれらは、 複合体 を形成した後は薄茶乃至は褐色の着色不純物質となり、 ミ ラ ク リ ン の甘味誘導活性の低下をも招く 。 そ して一度形成された ミ ラ ク リ ン との複合体から不純物質を除去するこ とは著し く 困難である。 又 ミ ラ ク リ ンとの複合体を形成し易い不純物質と しては、 フラボノ イ ド 色素や酸性物質も しく はこれらの複合体と も考えられているが、 未 だ、 その物質について解明はされていない。 又さ らに、 過度に p H. を低下させる種々の酸性物質も ミ ラ ク リ ンの甘味誘導活性の低下を 招く。
しかし、 これら ミ ラク リ ンと複合体を形成し易い不純物質の影響 や種々の酸性物質の影響は、 水洗浄前処理することなく、 本発明に よる酸性緩衝塩水溶液を用いた抽出を行なう ことで容易に解決する ことができた。
即ち、 着色要因となる ミ ラク リ ンと複合体を形成し易い不純物質 は、 酸性緩衝塩水溶液を用いた酸性条件下では、 反応基が解離しな いか、 解離しにく く なることによって、 その反応性が著しく低下も しく は不活化してミラク リ ンとの結合が抑制され、 その結果、 透明 度の高いミ ラク リン抽出液が得られる。 一方、 ミ ラク リ ン活性に悪 影響を及ぼす抽出液の P H低下の問題は、 緩衝水溶液の作用により、 果肉中の種々酸性物質による抽出液 ©過度な p H低下がなく なるた め、 抽出液中における ミ ラク リ ン成分の活性低下も防げる。 本発明 は、 ミ ラク リ ンとの複合体を形成し易い不純物質の影響を抑え、 か つ好適な抽出 p Hを維持しうることができるため、 水洗浄をせずと も着色の極めて少ない、 甘味誘導活性の安定な優れたミ ラク リ ン粉 末の採取を容易に行ない得るものである。 発明を実施するための最良の形態
次に実施例を示し、 本発明を具体的に説明するが要旨を越えない 限りこれに限定されるものではない。 また比較のため本発明の p H 範囲外のものについても同時に評価を行なつた。
実施例 1
ミ ラクルフルーツ（R i chadel l a dul ci f i ca)の果肉の凍結乾燥物 1 gに対し、 約 0 °C (氷水中） の温度条件下で表 1 に示す各種p Hに 調製した緩衝塩水溶液 （溶液中 0 . 5 Mの NaC£を含む） 1 5 を加 え、 超音波（2 0 kHz)で 3 0秒間、 4回繰り返しホモジナイズした ' 後、 1 0 0 0 0 rpmで 4 5分間遠心分離する抽出処理を行なった。 遠心分離後、 上澄み液を採取しこれを抽出液と した。 さ らに残渣に 対し同様の抽出処理を繰り返し、 2回目の上澄み液を採取した。 各 種 p Hの緩衝塩水溶液ごとによる抽出処理で得た 2 回分の抽出液を 合わせ、 ミ ラク リ ン抽出液と した。
表 1 各種 P Hの緩衝塩水溶液の調製
。 緩衝液の種類
P H (各溶液中には 0 . 5 M濃度の
(M) NaC£を含む）
1 (比 較） 3. 1 0. 1 クェ ン酸一ク ェン酸 1 ナ ト リ ウ ム
2 (実施例） 3. 5 0. 1 フ タル酸 1 カ リ ウ ム
( 1 N塩酸で調整）
3 (実施例） 4. 5 0. 1 酢酸一酢酸ナ ト リ ウ ム
4 (実施例） 5. 1 0. 1 酢酸一酢酸ナ ト リ ウム
5 (実施例） 5. 5 0. 1 クェン酸 1 ナ ト リ ウム一 クェ ン酸
2 ナ ト リ ウ ム
6 (比 較） 6. 5 0. 1 炭酸水素ナ ト リ ウ ム
( 1 N塩酸で調整）
7 (比 較） 7. 5 0. 1 リ ン酸 1 ナ ト リ ウム一 リ ン酸 2 ナ ト リ ウ ム
8 (比 較） 8. 3 0. 1 グ リ シルグ リ シ ン
( 1 N水酸化ナ ト リ ウムで調整）
9 (比 較） 9. 2 0. 1 ホウ酸一ホウ酸ナ ト リ ゥ ム
10 (比 較） 10. 1 0. 1 炭酸 1 ナ ト リ ウ ム—炭酸 2 ナ ト リ ゥ ム ここで各種 p Hの緩衝塩水溶液 （溶液中ひ . 5 Mの NaC を含む） の調製法を下記に示す。 なお、 下記に使用した試薬は、 和光純薬社 製ですベて特級を使用した。
(1) H 3. 1緩衝塩水溶液の調製
0. 1 Mクェン酸水溶液と 0. 1 Mクェン酸 1ナ ト リ ウム水溶液 を p Hメータ一により p Hを確認しながら p Hが 3. 1 になるまで 両液を混合する。 P H 3. 1 になったら、 この溶液中の NaOT濃度が 0. 5 Mになるように NaCfを加え調製する。
(2) p H 3. 5緩衝塩水溶液の調製
0. 1 Mフタル酸 1カ リウムに p Hメータ一により p Hを確認し ながら p Hが 3. 5になるまで 1 Nの HC£水溶液を加える。 p H力 3. 5になったら、 この溶液中の NaC£濃度が 0. 5 Mになるように NaC を加え調製する。
(3) p H 4. 5緩衝塩水溶液の調製
0. 1 M酢酸水溶液と 0·. 1 M酢酸ナ ト リム水溶液を p Hメータ 一により p Hを確認しながら p Hが 4. 5になるまで両液を混合す る。 p Hが 4. 5になったら、 この溶液中の NaC£濃度が 0. 5 Mに なるように NaCfを加え調製する。
(4) p H 5. 1緩衝塩水溶液の調製
ϋ . 1 M酢酸水溶液と 0. 1 Μ酢酸ナ トリウム水溶液を ρ Ηメー タ一により ρ Ηを確認しながら ρ Ηが 5. 1になるまで両液を混合 する。 p Hが 5. 1 になったら、 この溶液中の NaCf濃度が 0. 5 M になるように NaC£を加え調製する。
(5) p H 5. 5緩衝塩水溶液の調製
0. 1 Mクェン酸 1ナ ト リウム水溶液と 0. 1 Mクェン酸 2ナ ト リウム水溶液を P Hメーターにより P Hを確認しながら p Hが 5. 5· になるまで両液を混合する。 p Hが 5. 5になったら、 この溶液中 の NaC 濃度が 0. 5 Mになるよう に NaC£を加え調製する。
(6) p H 6. 5緩衝塩水溶液の調製
0. 1 M炭酸水素ナ ト リ ウム水溶液に p Hメ ータ一によ り p Hを 確認しながら P Hが 6. 5 になるまで 1 Nの H 水溶液を加える： p H力く 6. 5 になったら、 この溶液中の NaC 濃度が 0 . 5 Mになる ように NaCf を加え調製する。
(7) p H 7. 5緩衝塩水溶液の調製
0 . 1 Mリ ン酸 1 ナ ト リ ウム水溶液と 0 . 1 Mリ ン酸 2 ナ ト リ ウ ム水溶液を P Hメ ーターにより p Hを確認しながら p Hが 7 . 5 に なるまで両液を混合する。 p Hが 7. 5 になったら、 この溶液中の NaC£濃度が 0. 5 Mになるように NaC を加え調製する。
(8) p H 8. 3緩衝塩水溶液の調製
0. 1 Mグリ シルグリ シン水溶液 （ 1 3. 2 gを純水 1 0 0 0 で調製） に p Hメ ータ一により p Hを確認しながら p Hが 8 . 3 に なるまで 1 Nの NaOH水溶液を加える。 p Hが 8 . 3 になったら、 こ の溶液中の NaCf濃度が 0 . 5 Mになるように NaC£を加え調製する。
(9) p H 9. 2緩衝塩水溶液の調製
0. 1 Mホウ酸水溶液と 0 . 1 Mホウ酸ナ ト リ ウム水溶液を p H メ ーターにより p Hを確認しながら p Hが 9. 2 になるまで両液を 混合する。 p Hが 9. 2 になったら、 この溶液中の Na 濃度が 0. 5 Mになるように NaCf を加え調製する。
(10) p H 1 0 . 1 緩衝塩水溶液の調製
0. 1 M炭酸 1 ナ ト リ ウム水溶液と 0. 1 M炭酸 2 ナ ト リ ウム水 溶液を p Hメ ーターによ り p Hを確認しながら p Hが 1 0 . 1 にな るまで両液を混合する。 p H力く 1 0. 1 になったら、 この溶液中の NaW濃度が 0. 5 Mになるように Na を加え調製する。
得られた各種 p Hの緩衝塩水溶液による ミ ラ ク リ ン抽出液 5 ^を、 純水で平銜化してある脱塩用ゲルろ過ク口マ トグラフィ一 （フアル マシア社製） により脱塩し、 7 mlの脱塩液を得、 これをミ ラク リ ン 抽出脱塩液とした。
各種 p Hのミ ラク リ ン抽出脱塩液について J I S Z 8 7 2 1 に 規定する色度票を用い着色度を、 さらには甘味誘導活性の官能試験 を下記の手順に従って評価し、 得られた結果を表 2に示した。 尚、 表中の着色度に記載される 「一 J は無色透明であったことを示す。 表 2から、 各種 p Hの緩衝塩水溶液の内、 本願の酸性緩衝塩水溶 液によるものが着色度もなく甘味誘導活性も高いことが判る。
着色度試験手順
直射日光をさけた自然光下で、 内径 1 9 mm、 外径 2 1 mmの試験管 にミ ラク リ ン抽出脱塩液 3 . 5 r を入れ、 垂直に立てた。 横からみ た抽出脱塩液について、 色相、 明度、 彩度を表示する J I S Z 8 7 2 1色度票と隣接させて比較して着色度を測定した。
甘味誘導活性評価手順
① 0 . 1 Mクェン酸溶液を 2〜 3 、 口に含み、 酸味を感ずる 事を確認する。
② 吐き出して水で口をすすぐ。
③ ミラク リ ン抽出脱塩液 2 . 5 ^を口に含む。
④ 1分間、 舌の上でころがすようにして舌に十分吸着させる。
⑤ 吐き出して水で口をすすぐ。
⑥ 0 . 1 Mクェン酸溶液を 2〜 3 、 口に含む。 この時の甘さ ¾r目じ fe、し一しおく 。
⑦ 標準甘味溶液（0. 1， 0. 2， 0. 3， 0. 4， 0. 5Mショ糖溶液） 2〜 3 ^を口に含み 0 . 1 Mクェン酸を味わったときとの甘味を比 較し同等の甘味をもつショ糖溶液の濃度を決定し、 その濃度を甘味 誘導活性とする。 表 2 抽出脱塩液の着色度
号 P H 着色度 甘味誘導活性
1 (比 較） 3 . 1 0 . 2
2 (実施例） 3 . 5 0 . 3
3 (実施例） 4 . 5 0 . 3
4 (実施例） 5 . 1 0 . 3
5 (実施例） 5 . 5 0 . 3
6 (比 較） 6 . 5 5 Y R 8ノ / 2 0. 2
7 (比 較） 7 . 5 「 5 Y 8 / z 3 0 . 1
8 (比 較） 8 . 3 2. 5 Y 7 / z 6 0. 1
9 (比 較） 9 . 2 2. 5 Y 7 / z 8 0. 1
10 (比 較） 1 0 . 1 1 0 Y R 6 / z 8 0 . 1 着色度評価基準 （ J I S Z 8 7 2 1 )
例 ： （ 1 0 Y R 6 Z 8 )
1 i 1
色相 明度 彩度を表わす。
色相 ： 4段階 （2.5， 5， 7.5， 10)
Yは Yellow、 Rは Redの略
明度 ： 8段階 （2， 3, 4， 5， 6, 7, 8， 9)
暗い * *明るい
彩度 ： 色相が 5， 10の時、
10段階 （N， 1， 2, 3, 4， 6， 8， 10, 12， 14) 色相が 2.5, 7.5の時、
9段階 （N， 2， 3, 4， 6， 8， 10， 12， 14)
明るい （薄い） ^ "一"暗い （濃い） 次に、 各種 p Hのミ ラク リ ン抽出脱塩液 3. を のバイァ ルビンに移し、 これらを凍結乾燥してミ ラク リ ン粗製粉末を得、 こ れらの着色度を同様に J I S Z 8 7 2 1色度票と ミ ラク リ ン粗製 粉末の入ったバイアルビンを隣接し比較して着色度を測定した。 そ の結果を表 3 に示した。
本発明の酸性緩衝塩水溶液によるものからは、 着色のない白色の ミ ラク リ ン粗製粉末が得られた。
表 3 ミラク リ ン抽出脱塩液から得られた
凍結乾燥粗製粉末の着色度
P H 着色度
1 (比 較） 3. 1 2 . 5 R 9 /N
2 (実施例） 3. 5 2 . 5 R 9 ZN
3 (実施例） 4. 5 2 . 5 R 9 /N
4 (実施例） 5. 1 2 . 5 R 9 N
5 (実施例） 5. 5 2 . 5 R 9 /N
6 (比 6. 5 2 . 5 Y 7 / 4
7 (比 較） 7. 5 5 Y R 7 / 3
8 (比 較） 8. 3 7 . 5 Y 7 / 4
9 (比 較） 9. 2 7 . 5 Y 7 / 4
10 (比 較） 1 0. 1 5 Y 5 / 4 各種 p Hによる ミ ラ ク リ ン抽出液それぞれについて、 抗ミ ラ ク リ ン I g G (抗体 ： ィムノ グロブリ ン） に酵素 （ P 0 D ： パーォキシ 夕一ゼ） を結合し標識化した。 サン ドイ ッチ法（P. K. Nakane. and A. Kawao i , (1974) Perox i dase-Labe 1 ed antibody ： a new method of conjugation. J. H i s tochem. Cy tochem. , 22, 1084-1091 ) によ り ミ ラ ク リ ンの定量を行ない、 比較評価し、 その結果を表 4 に示し た。
本発明の酸性緩衝塩水溶液からのものは、 他の酸性緩衝塩水溶液 と比べミ ラ ク リ ン含量が高い。 このこ とから本発明の酸性緩衝塩水 溶液を用いれば、 不純物質が少な く ミ ラ ク リ ンを安定化して抽出で きることは明らかである。 表 4 抽出液中の ミ ラ ク リ ン含量
号 P H ミ ラ ク リ ン含量 { g / 7ni )
1 (比 較） 3. 1 1 6 0
2 (実施例） 3 . 5 2 5 7
3 (実施例） 4. 5 2 0 3
4 (実施例） 5. 1 2 0 2
5 (実施例） 5. 5 2 4 2
- 6 (比 較） 6. 5 1 7 3
7 (比 較） 7. 5 1 5 0
8 (比 較） 8. 3 1 5 2
9 (比 9 . 2 1 5 6
10 (比 較） 1 0. 1 7 4 ここで、 ミ ラク リ ンの定量は次のようにして行なった。
ミラク リ ン定量操作
9 6穴のマイクロプレー トのゥエル （穴） 各々に、 1 0 0〃£の抗 ミ ラク リ ン I g Gを入れ、 4 °Cで一晩放置し、 抗ミ ラク リ ン I g G をゥエル内壁に結合させる。 放置後ゥエル内壁に結合させた抗ミ ラ ク リ ン I g Gを 0. 1 8 %のリ ン酸カリ ウム水溶液 （p H 7. 5 ) で洗浄する。 ゥエル内の残液を除去した後、 0. 1 8 %リ ン酸カ リ ゥム水溶液 （P H 7. 5 ) に溶解した 1 %B S A (牛血清アルブミ ン ： CALBI0CEM 社製） 溶液 1 5 0 idを、 各ゥエルに加え 2時間室温 で放置する。 ゥエル内の 1 %B S A溶液を除去した後、 既知濃度の ミ ラク リ ン溶液および得られた各種 P Hによるミ ラク リ ン抽出液を
1 0 0 0 0倍に希釈したもの 1 0 Q idを、 ゥエル内壁に結合してい る抗ミ ラク リ ン I g Gに加え、 2時間室温で放置する。 再度 0. 1 8 %のリ ン酸カ リウム水溶液 （P H 7. 5 ) で洗浄し、 ゥエル内の残 液を除去した後、 標識化 I g Gを 1 0 0 £加え、 2時間室温で放置 する。 次に 0. 1 8 %のリ ン酸力リウム水溶液 （p H 7. 5 ) で洗 浄し、 ゥエル内の残液を除去した後、 各ゥエルにパーォキシターゼ 用発色キッ ト （住友べークライ ト社製） の発色液を加えて発色させ た。 3分後、 同キッ トの停止液を加えて反応を止めた後、 ィムノ リ —ダ一で吸光度 （ 4 0 5 nm) を測定し、 上記既知濃度のミ ラク リ ン 溶 ' 液 0. 5， 1. 0， 2. 0， 5. 0， 1 0， 2 0， 5 0， 1 0 0，
2 0 0 , 5 0 0， ng (ナノ グラム） の測定値から作成した検量 線を基に抽出液中のミ ラク リ ン含量を測定した。
又、 上記で使用した抗ミ ラク リ ン I g G及び標識化 I g Gの作成 法を下記に示す。
抗ミ ラク リ ン I g Gの作成
純度 9 9. 9 %以上の精製ミ ラク リ ン 2 5 0 agを同量の完全フ口 イ ン ト ア ジュバン トで乳化した後、 う さ ぎ （体重 ： 3〜 3. 5 Kg) に注射し 1 0 日後、 2 0 日後にさ らに 2 5 O gの不完全フ ロ イ ン 卜 アジュバン トを、 う さ ぎに注射した。 最後の注射から 1 週間後採血 し、 抗ミ ラ ク リ ン血清を得た。
この血清 を 0. 0 5 M ト リ ス塩酸塩 （ p H 8. 5 , 0. 1 5
M NaC£) で平衝化したプロテイ ン A (生化学工業社製） 5 ^に添 加し、 低温室 （ 4 °C〜 1 0 °C) で 2〜 3時間スターラ ーでゆっ く り 攪拌して抗ミ ラ ク リ ン I g Gを吸着させた。 上述の平衡化したプロ ティ ン Aに抗ミ ラク リ ン I g Gを吸着させたものをカ ラ ムに充塡し た後、 0. 0 5 M酢酸ナ ト リ ウム （ P H 4. 0， 0. 1 5 M NaCf ) で I g Gを,溶出するこ とにより精製抗ミ ラ ク リ ン I g G、 約 2 5 mg を得た。
標識化 I g Gの作成
4 mgの P 0 D (パーォキシターゼ ： ベ一 リ ンガ一社製） を 1 miの 純水に溶解した後、 0. 1 M過ヨウ素酸ナ ト リ ウム 0. を加え 室温で 2 0分間放置し、 透析チューブに入れ、 1 mM酢酸ナ ト リ ウ ム 緩衝液 （ p H 4. 4 ) で一晩透析した。
抗ミ ラ ク リ ン I g Gに P O Dを結合させるため、 透析終了後の P .0 Dに 0. 2 M炭酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 9. 5 ) を加え p H 9前後に調整した。 この P 0 Dに 8 mgの抗ミ ラ ク リ ン I g Gを含む 1 ? の 0 . 0 1 M炭酸ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 9. 5 ) を加え室温 で 2時間振盪した。 さ らに、 P O Dが結合した抗ミ ラ ク リ ン I g G を分離するため、 の純水に溶解した 4 mgの水素化ホウ素ナ ト リ ゥムを 0. 1 mi加え、 4 °Cで 2時間放置した後、 ゲルろ過ク ロマ ト グラフ ィ ー （Sephacryl s — 200 カラム、 1 0 mMリ ン酸ナ ト リ ウム 緩衝液 p H 6. 8で平衝化） にかけ 2 ずつフ ラ ク シ ョ ンを採り ' だし、 フラク シ ョ ンごとの 2 8 O nm (タ ンパクの吸収を表わす） 、 4 0 3 nm( P O Dの吸収、 正確には P O Dの中の鉄の吸収である。 ） 及び 4 0 5 ηπι ( P 0 D活性の吸収を表わす） における吸収を測定し た。 これら 3つの吸収ピークをもつフラク ショ ンは、 抗ミ ラク リ ン
I g Gと活性を持つ P O Dとが結合しているフラクショ ンであり、 標識化された I g Gを含んだものである。 3つの吸収ピークを持つ フラクショ ンを集め、 そしてさらに、 標識化された I g Gを安定化 するため、 このフラク ショ ン中の B S A (粉末牛血清アルブミ ン ； 和光純薬社製、 免疫測定用） 濃度が 1 mgZ となるように B S Aを 加える。 これを標識化 I g Gと した。 産業上の利用可能性
本発明は酸性緩衝塩水溶液を用いた'抽出を行なう ことにより、 着 色や甘味誘導活性低下の要因となる ミラク リ ンと複合体を形成し易 い不純物質の、 反応性の抑制を図れる効果を有すると共に、 ミ ラク ルフルーツ中の種々酸性物質による過度な ρ Ηの低下もないので、 ミラク リ ン成分の活性低下をも防げる。 さらに抽出前処理としての 不純物質の除去処理をする必要もなくなり、 これまでの方法に比べ 効率的に甘味誘導活性の安定した、 着色の極めて少ないミラク リ ン を得ることができ、 効率的な工業生産に寄与するものである。
本発明によれば、 着色の極めて少ない甘味誘導活性の安定したミ ラク リ ンを得ることができるため、 純度の高い精製ミ ラク リ ンも容 易に工業生産でき、 飲食品や医薬品の製造上きわめて有利な貢献を なすものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ミ ラク リ ン含有原料から酸性緩衝塩水溶液によって、 抽出す るこ とを特徴とする ミ ラ ク リ ンの製造方法。
2 . 請求の範囲第 1 項に記載の酸性緩衝塩水溶液が p H 3 . 5 〜 5 . 5 の範囲であることを特徴とする ミ ラ ク リ ンの製造方法。
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