NO180741B

NO180741B - Fremgangsmåte for isolering av Faktor VIII

Info

Publication number: NO180741B
Application number: NO921839A
Authority: NO
Inventors: Per Kaersgaard
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1989-11-09
Filing date: 1992-05-08
Publication date: 1997-03-03
Also published as: ATE118508T1; NO921839L; PT95830B; FI922105A; BG96316A; UA29421C2; IL96277A; PT95830A; FI922105A0; NO180741C; FI103510B1; WO1991007438A1; YU210590A; YU47524B; IE66836B1; DE69017050D1; ZA908599B; CN1044121C; IE904022A1; SK278640B6

Description

Den foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte for å isolere biologiske forbindelser slik som proteiner, spesielt koagulasjonsfaktor VIII, fra kroppsvæsker slik som plasma ved bruk av gelfiltrering som et første isolerings-trinn.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Faktor VIII, også kjent som antihemofilfaktor A eller AHF, er et plasmaprotein som deltar i den indre (intrinsic) reaksjonsvei i blodkoagulasjon.

Faktor VIII sirkulerer i blodplasma i ytterst små konsen-trasjoner i en form av et ikke-kovalent kompleks av hhv. to proteiner som har faktor VIII koagulerende aktivivitet (Faktor VIII:C) og ristocetin ko-faktoraktivitet (von Willebrand Factor (vWF)), og nevnte kompleks har en molekylvekt på 1-20 x IO<6>D.

Faktor VIII:C er fraværende eller defekt hos individer som lider av blødningssykdommen Haemophilia A hvilken rammer omtrent 5 av 100.000 personer.

von Willebrand Faktor binder til aktiverte plater på en slik måte at aggregeringen av de aktiverte platene blir øket. Denne effekt kan bli påvist in vitro ved aggregering av risto-cetinbehandlede plater. Sammen med von Willebrands sykdom blir en forlenget blødningstid observert p.g.a. mangelen på eller reduserte nivåer av biologisk aktivitet av von Willebrand Faktor.

Hemofilikere lider av haemophilia A, og pasienter som lider fra alvorlige tilfeller av von Willebarnds sykdom, blir i dag behandlet med konsentrater som består av Faktor VIII:C/vWF, en behandling som har øket deres livskvalitet og økonomiske evne i betraktelig grad og har bidratt til en øket livslengde for disse pasientene.

Farmasøytiske forbindelser som inneholder Faktor VIII (Faktor VIII:C og/eller vWF) kan fremstilles fra blod eller blodplasma. Fremstillingen av slike forbindelser kan bli utført på forskjellige kjente måter, alle disse erkarakterisertav lavt utbytte av spesiell Faktor VIII:C. Felles for nesten alle fremgangsmåtene er et første rensetrinn som erkarakterisert veden kryopresipitering. For kryopresipitering blir frosset plasma tint ved en temperatur på 0-4°C som gir opphav til et bunnfall som omfatter Faktor VIII som kan bli samlet ved f.eks. sentrifugering. Selv om kryopresipiteringen er relativt enkel har den en vesentlig ulempe fordi når den blir benyttet i større skala, dvs. sammenslått plasma som består av mer enn 5 kg, gir det et lavt utbytte av Faktor VIII:C (30-45% av innholdet i plasma), hvilket betyr at det endelige utbyttet er lavt uansett hvilke nedstrøms opprensk-ningstrinn som blir benyttet.

Videre, har et generelt virusinaktiverende trinn blitt inkludert under tillagning av Faktor Vlll-preparter. De virusinaktiverende trinnene har øket sikkerheten mot virus i preparatene i betydelig grad, men forårsaker i de fleste tilfeller en videre reduksjon i utbyttet av Faktor VIII:C.

Det meget lave samlede utbyttet av Faktor VIII har ført til en mangel på disse preparatene på flere steder og således, er det et behov for nye fremgangsmåter for å rense Faktor VIII med høyt utbytte for å etterkomme behovet for Faktor VIII når det gjelder behandling av haemofilikere.

Nye fremgangsmåter for å isolere Faktor VIII direkte fra plasma med høyt utbytte ville være av stor interesse fordi opp til 70% av Faktor VIII-innholdet i plasma blir tapt så tidlig som i eller før kryopresipiteringen.

Nylig er det blitt forsøkt å isolere Faktor VIII direkte fra plasma ved bruk av affinitetskromatografi (Thromb. Haemost., 61,(2), 234-237 (1989)), men bare et utbytte på mindre enn 60% og en spesifikk aktivitet på 1 IU Faktor VIII/mg protein for den isolerte Faktor VIII-inneholdende fraksjon ble oppnådd.

Gelfiltrering også betegnet gelpermeeringskromatografi eller størrelseseksklusjonskromatografi er en diffusjons-kontrollert prosess som blir benyttet for å separere løsnings-midler ifølge deres størrelse. Løsningsmidlene blir passert gjennom en søyle som er pakket med inerte porøse gelpartikler som har en porestørrelse som ekskluderer de største molekylene mens de minste molekylene diffunderer inn i den stasjonære fasen på innsiden av gelpartiklene. Således, blir de største molekylene fullstendig ekskludert fra gelpartiklene og eluert først sammen med "void-volum", mens de mindre molekylene tilbringer en lengre tid når det gjelder å passere søylen og blir eluert ifølge avtagende størrelse med økende "elueringsvolum".

Gelfiltrering kan bli utført på 2 forskjellige måter:

1. Gruppesepareringssystem

I gruppesepareringssystemet blir løsningsmidlene adskilt i to grupper som har store forskjeller i deres molekyl-størrelser, én gruppe blir eluert med void-volumet og den andre gruppen blir eluerert senere i et meget større elueringsvolum ofte nær opp til det totale "gelvolum". Denne fremgangsmåte blir først og fremst benyttet for å separere proteiner fra oppløste salter eller for å utveksle buffer og bli referert til som "avsalting". For "avsalting" blir rigide geler som har en liten porestørrelse benyttet og fremgangsmåten kan bli utført ved bruk av store mengder materiale (prøvevolumene består av 20-30% av gelvolumet) og ved bruk av høy strømhastighet (omkring ett gelvolum av buffer pr. time). Således vil kapasiteten til søylen bli stor.

2. Fraksi oneringssystem

I fraksjoneringssysternet blir oppløsningsmidlene som har lignende molekylvekt adskilt. Denne fremgangsmåte blir ofte benyttet for å adskille proteiner. For dette formål, blir gelpartikler som har større porer benyttet og gelfiltreringsmediet blir valgt for å sikre at proteinene blir eluert mellom void-volumet og et elueringsvolum som korresponderer til det totale gelvolum. Forbindelsene blir eluert nærmere hverandre enn når gruppesepareringsbetingelser blir benyttet og kan overlappe. Høye strømhastigheter er videre ikke ønskelig fordi dette ikke tillater en effektiv separering av proteiner, og søylebelastningen må bli holdt lav for å oppnå en rimelig separering av de individuelle proteinene. Således gelfiltrering benyttet i fraksjoneringshensikt har bare blitt anbefalt for -separering av proteiner som et siste avsluttende trinn hvor volumet som skal fraksjoneres er lite (Jagschies, Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol B3(10), 1988 og Bio/Technol., 4, 954-58(1986)).

Det har vært forsøkt å isolere Faktor VIII fra plasma ved bruk av gelfiltrering (J. Lab. Clin. Med., 72, (6), 1968, 1007-1008 og J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962). En stor opprensing ble oppnådd under eksperimentene, men utbyttene var bare omtrent 40-50%. Renheten av den resulterende Faktor VIII-inneholdende fraksjon ble funnet å være avhengig av startplasmaet, siden et større innhold av lipider og chylo-mikroner ga opphav til en uklar faktor VIII-fraksjon som hadde lavere spesifikk aktivitet. Det ble registrert at gel-filtreringsteknikken som ble benyttet ikke tillot håndtering av store mengder plasma selv om preliminære eksperimenter antydet at gelfiltrering av den meget mer konsentrerte Cohn fraksjon I syntes mulig.

Videre, Paulssen et al. (Thromb. Diathes. Haemorr., 22, 1969, 577-583) fant at Faktor VIII kan bli adskilt fra andre plasmaproteiner ved bruk av gelmedium Sepharose 6B, men at kromatografi ved bruk av gelfiltrering bare syntes mulig i stor skala når gjenoppløst kryopresipitat ble benyttet som startmateriale.

US patent nr. 3.637.489 beskriver en fremgangsmåte for å separere blodkomponenter ved bruk av gelfiltrering og ved å bruke porøse glasskuler. Fremgangsmåten er spesielt ment for separering av immunologiske aktive forbindelser fra andre bestanddeler i serum eller plasma.

Siden da har flere forsøk på å benytte gelfiltrering for å rense faktor VIII blitt forsøkt, men forsøkene har konsentrert seg på gelfiltrering av delvis rensede fraksjoner av plasma (gjenoppløst kryopresipitat og videre rensede fraksjoner av dette). Alle forsøk ble utført ved bruk av enten små belastninger på søylene og/eller små strømhastigheter eller kombinasjoner av dette.

Gelfiltrering som en fremgangsmåte for proteinfrak-sjonering har vært kjent siden 1959 og er vidt benyttet i biokjemiske forskningslaboratorier som en fremgangsmåte for å karakterisere proteiner og for opprensking av proteiner fra prøver med små volum, dvs. mindre enn 1 liter. Gelfiltrering har opp til nåværende oppfinnelse ikke blitt benyttet på storskala i plasmafraksjonering for proteinseparering, den eneste anvendelse har vært avsalting av etanol og salter fra albuminløsninger. Således som beskrevet i referansebøker: "Hovedgrunnen til hvorfor gelfiltrering ikke har blitt en hovedfremgangsmåte i plasmafraksjonering er den lave gjennom-kjøring av protein pr. søylevolum" (J.H. Berglof: "Fractionation by Gel Filtration", s. 163-173 in J. M. Curling (Ed.): "Methods of Plasma Protein Fractionation", Academic Press, London, 1980) og "Uheldigvis, proteinmengdene som kan bli håndtert av søyler med vanlig størrelse er små, og fortynnin-gen av prøven kan ikke bli neglisjert. Fremgangsmåten er derfor ikke meget benyttet for plasmafraksjonering" (J.J. Morgenthaler et al.: "Preservation of structure and function during isolation of human plasma proteins", s. 127-138 in Smit Sibinga et al. (Eds.): "Plasma Fractionation and Blood Trans-fusion", Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 1985).

US patent nr. 4.675.385 beskriver en fremgangsmåte for å isolere Faktor VIII prokoaguleringsprotein fra et plasma-preparat som består av Faktor VIII, høymolekylvektbestanddeler og lavmolekylvektbestanddeler ved sekvensiell høy oppløse-lighetsstørrelses-eksklusjonskromatografi ved å anvende, i det første trinn, en bufret vandig sammensetning av et plasma-preparat og separering av lavmolekylvektbestanddelene ved å sette sammensetningen på en kromatografisøyle av porøse høy-oppløselighetsvæskekromatografikuler som har en størrelse fra omtrent 13 mikron til omkring 35 mikron og eluering av søylen med et bufret vandig elueringsmiddel. For å få en god separering beskriver US patent nr. 4.675.385 bruken av søyler som har en aspektratio som ikke er lavere enn mellom 10 og 40 og som reduserer kapasiteten, men som ikke sikrer en god separering av Faktor VIII-bestanddeler fra lavmolekylvektplasma-proteiner. Imidlertid, denne første isolering sikrer ikke en god separering av proteinene som viser Faktor VIII:C-aktivitet fra andre proteinbestanddeler i plasmapreparatet, hvilket blir kun oppnådd ved å utføre en annen HPLC.

Således har det opp til den nåværende oppfinnelse vært et generelt akseptert faktum, at gelfiltrering ikke er en passende fremgangsmåte for proteinseparering for plasmafraksjonering, når større volum skal håndteres, dvs. over 5 liter.

Det er nå overraskende blitt funnet at når gelfil-treringsmaterialer blir valgt for å passe til høye strøm-hastigheter er det mulig å isolere Faktor VIII i form av en ren fraksjon og med meget høyt utbytte direkte fra plasma ved hjelp av meget forsiktig mekanisk separering uten å måtte stole på den normale første kryopresipitering.

KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte for å isolere Faktor VIII i form av et kompleks av Faktor VIII:C og vWF fra andre proteiner i blodplasma ved bruk av gelfiltrering.

Fremgangsmåten i oppfinnelsen erkarakterisert vedat isolert plasma eller tint friskt frosset plasma blir gjenstand for gelfiltrering under gruppesepareringsbetingelser ved bruk av en høy påsettingsgrad og en høy strømhastighet, gelfiltreringsmediet består av partikler som er ufølsomme overfor Faktor VIII og som har et fraksjoneringsområde i området fra 1 x IO<3>til 1 x IO<8>, helst foretrekkes fra 1 x IO<4>til 8 x 10 . Fraksjoneringsområdet kan f.eks. være i intervallet fra

5 x 10<4>til 4 x IO<7>.

I en foretrukket utførelsesform, blir plasmavolumet påsatt til minst 5% av gelvolumet. Mengden plasma påsatt er fortrinnsvis 15-40% av gelvolumet.

Fremgangsmåten i oppfinnelsen blir fortrinnsvis utført ved bruk av en strømhastighet på minst 0,3 gelvolumer pr. time, helst 0,5-2 gelvolumer pr. time.

Av hensyn til formålet til den foreliggende oppfinnelse blir et gelfiltreringsmedium benyttet som har en stivhet som tillater hurtig eluering. Videre, gelen må være kjemisk og immunologisk inert (ufølsom) overfor Faktor VIII under gelfiltreringen. Eksperimenter har vist at fremgangsmåten til den foreliggende oppfinnelse kan bli utført ved bruk av kommersi-elle geler som Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S-400, Sephacryl S-500, Fractogel TSK HW-65(F) og Matrex Cellufine CGL 2000 alle er passende for formålet i den foreliggende oppfinnelsen. Slike geler er generelt av en partikkelstørrelse (våt) i intervallet fra 32fim til 200fim.

Ifølge én utførelsesform av fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelse blir frosset plasma tint, og det blir fast-slått at all Faktor VIII er blitt oppløst, hvoretter det tinte plasma blir fortrinnsvis påsatt søylen øyeblikkelig etter at all Faktor VIII har blitt oppløst. Temperaturen blir fortrinnsvis ikke tillatt å stige for høyt for å unngå for omfat-tende degradering av Faktor VIII. Plasmaet kan bli forbehandlet ved tilsetning av f.eks. heparin, citrat, sukrose, aminosyrer, salter eller andre stabilisatorer og valgfritt filtrert, sentrifugert, konsentrert ved ultrafiltrering, på forhånd bunnfelt ved bruk av vanlige bunnfellingsforbindelser, eller forbehandlet på annen måte før påsetning på søylen så lenge som en valgfri forbehandling ikke har noen særlig innflytelse på innholdet til Faktor VIII i plasmaet.

Fremgangsmåten i oppfinnelsen har overraskende vist å gi et meget høyt utbytte av Faktor VIII. Typisk over 70% av innholdet til Faktor VIII i plasmaet blir beholdt i produktet, og fremgangsmåten gir meget rene produkter som har en spesifikk aktivitet fra 1 til 4 IU Faktor VIII:C/mg protein. Dette kan delvis bli tilskrevet det faktum at ved å bruke fremgangsmåten til oppfinnelsen blir Faktor VIII også adskilt fra proteolytiske enzymer som meget lett normalt kan forårsake en nedbryting av Faktor VIII:C i isoleringsprosessen.

Fremgangsmåten til oppfinnelsen muliggjør behandlingen av store mengder plasma under betingelser hvor plasmaet blir påsatt ved bruk av større volum og høye strømhastigheter i en gelfiltrering som gir meget høy gjenvinning av Faktor VIII i stor renhet. Således blir en meget effektiv fremgangsmåte som har industriell bruksverdi tilbudt.

Faktor VIII-inneholdende fraksjon(er) fra gelfiltreringen eller de kombinerte fraksjonene fra flere gelfiltreringer kan så bli konsentrert og videre renset ved bruk av fremgangsmåter kjent per se slik som ultrafiltrering, presipitering, ione-bytte, affinitetskromatografi e.l..

De gjenværende plasmaproteiner slik som albumin, immun-globuliner, prothrombinkomplekset, antithrombin III og andre kan også bli isolert fra de senere fraksjonene i gelfiltreringen ved bruk av fremgangsmåter som er kjente per se, slik som bunnfelling med alkohol, PEG-presipiteringer, krofta-tografi e.l..

Bestemmelsen av Faktor VIII:C-aktivitet kan bli utført ved bruk av enten en to-trinnsmetode eller én-trinnsmetode. Det er et etablert faktum at én-trinn- og to-trinn-metodene kan resultere i ulik bestemmelse av Faktor VIII:C-aktiviteten i en prøve. Videre, er det kjent at gjentatte bestemmelser ved bruk av samme metode på den samme prøven kan gi opphav til variasjoner i bestemmelsen av Faktor VIII:C-aktiviteten.

Som benyttet her betyr uttrykket "plasma" blod fra hvilke alle blodlegemene og platene er blitt fjernet f.eks. ved sentrifugering.

"Faktor VIIIrAg" betegner Faktor VIII beslektet antigen, og "vWF-Ag" von Willebrand Factor beslektet antigen. "Søylevolumet" er definert som volumet av det pakkede gelmedium og den mellomliggende (interstitielle) væsken. "Void-volumet" blir definert som volumet av buffer mellom gelpartiklene, og "elueringsvolumet" er volumet av bufferen benyttet for å eluere en spesifikk forbindelse. Uttrykket "søylebelastning" blir benyttet for å betegne volumet av materialet som blir påsatt gelen, beregnet som % av gelvolumet. Uttrykket "fraksjoneringsområdet" er ment å betegne området av molekylvekter til (globulære) proteiner eller større molekyler for hvilke gelmaterialet blir anbefalt av produsenten.

Fremgangsmåten i oppfinnelsen er videre forklart med referanse til figurer og eksempler som belyser utførelses-former av oppfinnelsen. Eksemplene er utelukkende for illustrasjonsformål og er ikke konstruert som begrensende for rammen av oppfinnelsen som er definert av de vedlagte kravene.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Den foreliggende oppfinnelse er videre illustrert med hensyn til de ledsagende figurene hvor Fig. 1 viser en tegning som illustrerer elueringen av Faktor VIII ved hjelp av gelfiltrering ifølge den foreliggende oppfinnelsen bestemt ved hjelp av forskjellige metoder, og Fig. 2 illustrerer elueringsrekkefølgen til forskjellige plasmaproteiner ved hjelp av gelfiltrering ifølge

oppfinnelsen.

EKSPERIMENTELL DEL

Eksempel1

Gelfiltrering av plasma for å isolere Faktor VIII.

En søyle på 0 2,6 cm ble pakket med Sepharose CL-4B til en endelig høyde på 60 cm.

Frosset plasma fra en dansk blodbank ble tint til 25°C på vannbad. Etter tilsetning av l IU heparin/ml, ble 50 ml (16% av gelvolumet) av plasma tilsatt søylen ved bruk av en strøm-hastighet på 100 ml/time hvoretter søylen ble eluert ved bruk av en øket strømhastighet på 200 ml/time buffer hvilket tilsvarte 0,63 gelvolum pr. time. Ekvilibreringen av søylen og elueringen ble utført ved bruk av en buffer, 0,02 M citrat, 0,15 M NaCl, pH 7,4. Til bufferen ble videre tilsatt 2,55 ml 1 M CaCl, pr. liter hvilket ga en fri kalsiumion (Ca<2+>) kon-sentrasjon på omtrent 7 x 10 M. Den fri kalsiumion-konsentrasjon ble undersøkt ved bruk av en kalsiumselektiv elektrode fra Ingold GmbH (Frankfurt/Main, FRG). Fraksjoner ble samlet, og for hver fraksjon bleOD2g0, Faktor VIII:C (ved bruk av både én-trinn koagulasjonsmetode og to-trinn kromogen-metode), Faktor VIII:Ag, albumin, IgG, fibrinogen, IgM, alfa-2-makroglobulin, Faktor IX, Faktor X, protein C og anti-thrombin III bestemt. Protein som målt ved OD280ble eluert med en liten topp i void-volum (fraksjoner 10-18), etterfulgt av en meget stor og bred topp (fraksjoner 19-50, cf fig. 1). 82% av Faktor VIII:C aktivitet som bestemt ved to-trinn og 91% av Faktor VIII:C aktivitet som bestemt ved én-trinn koagulasjonsmetode ble eluert i én sammensatt topp med void-volum

(Faktor VIII-hovedfraksjon) sammen med den tidligste lille proteintoppen. Det gjenværende av Faktor VIII ble eluert som en mindre etterfølgende topp-hale umiddelbart etter Faktor VIII-hovedfraksjonen (fraksjonene 19-26). Faktor VIII:Ag og vWF:Ag ble eluert sammen med Faktor VIII:C, men hadde en noe bredere etterfølgende topp-haler. Alle andre plasmaproteiner som ble bestemt ble eluert i fraksjonen etter Faktor VIII-hovedfraksjonen sammen med den store brede proteintoppen (vide fig. 2). Plasmaproteinene som ble separert fra Faktor VIII:C er av følgende molekylvekter:

Bestemmelse av Faktor VIII:C-aktivitet ved bruk av to-trinn kromogenmetoden ble utført ved bruk av kromogensubstrat-fremgangsmåten (KABI Coatest Faktor VIII), den opprinnelige metoden ved bruk av testrør ved 37°C ble modifisert til å bli utført ved bruk av mikrotiterplater som reduserte behovet for reagenser. En 50 mikroliter prøve eller standard blir benyttet som etter blanding med 75 mikroliter av en løsning med fosfolipid, Faktor IXa, Faktor X og CaCl2blir inkubert ved 37°C i 15 min., hvoretter 50 mikroliter av substrat ble tilsatt. Etter en videre 20 min. inkubasjon ved 37°C, ble reak-sjonen stoppet ved tilsetning av 50 mikroliter 1 M sitronsyre. Fargeutviklingen blir avlest ved 405 nm referansen er ved

492 nm.

Bestemmelsen av Faktor VIII:C-aktivitet ved bruk av én-trinnsmetoden blir utført ved bruk av APTT-fremgangsmåten (Aktivert Delvis Thromboplastintid). 100 mikroliters prøver eller standard blir pipettert over i kyvetter, hvoretter 100 mikroliter mangelplasma (Faktor VIII manglende plasma, General diagnostic) blir tilsatt, og løsningen blir varmet til 37°C i 5 min.. Etter tilsetning av 100 mikroliter 0,03 M CaCl2, blir tiden til koagulasjonen av løsningen bestemt.

For kvantitative bestemmelser blir kalibreringskurvene basert på fortynningsserier av en intern standard kalibrert mot WHO-standard (3rd Int. Standard of FVIII, Human Plasma, 3,9 IU/ml). To-trinnsmetoden som beskrevet heri har en lavere (omtrent 10 ganger) påvisningsgrense enn én-trinnsmetoden. Når heparin blir tilsatt er det en fordel å benytte to-trinnsmetoden, som enhver mulig innflytelse av heparin på metoden kan bli fjernet lettere ved fortynning.

Faktor VIII-.Ag ble bestemt ved bruk av ELISA ved å benytte antistoffer fra en Faktor Vlll-inhibitorpasient som dekkemateriale på mikrotiterplater (Nunc, Kamstrup, 4000 Roskilde, Danmark) og ved bruk av peroksidasemerket F(AB')2~fragmenter fra den samme inhibitorpasienten for å bestemme bundet Faktor VIII (Thomb. Haemost., 53(3), 198, 346-350). Standardkurver ble laget ved bruk av blandet normalplasma som var kalibrert mot en WHO-standard (1. IRP, etablert 1982) .

vWF:Ag ble også bestemt ved bruk av ELISA, men ved bruk av en kanin anti-human vWF (DAKO, Danmark) som dekkemateriale og peroksidasemerket kanin anti-human vWF (DAKO, Danmark) for å bestemme bundet vWF. Standardkurver ble laget ved bruk av samme normalplasma som for Faktor VIII:Ag ELISA.

Faktor IX ble bestemt ved å bruke én-trinnskoagulasjons-metode på analog måte som Faktor VIII:C ved å bruke bare Faktor IX manglende plasma. IgG ble bestemt ved bruk av radial immundiffusjon (Immunochemistry, 2, 1965, 235-254), og albumin, fibrinogen, alfa-2-makroglobulin, Faktor X, protein C og anti-thrombin III ble bestemt ved bruk av rakettimmun-elektroforese (Anal. Biochem, 15, 1966, 45-52). OD280kle bestemt ved bruk av et spektrofotometer (Spectronic 601 fra Milton Roy Company), og protein ved bruk av Kjeldahl ble bestemt ifølge Ph. Eur. 2nd. Ed., I, V.3.5.2 uten presipitering med TCA. Spesifikk aktivitet av rensede fraksjoner ble beregnet som forholdet av faktor VIII:C-konsentrasjon enten vis a vis OD2g0eller vis a vis proteinkonsentrasjonen som bestemt ved bruk av Kjeldahl. Når 0D2gQ ble benyttet for å beregne den spesifikke aktiviteten, er resultatene av forskjellige eksperimenter ikke direkte sammenlignbare, med mindre samme startplasma ble benyttet, siden fraksjonen som inneholder Faktor VIII er ofte turbid, vide resultatene til Ratnoff et al. (J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962).

De forskjellige gelfiltreringsmedia benyttet i eksperimentene var fra følgende kilder: Sepharose CL-6B, Sepharose SL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose 6FF, Sepharose 4FF, sephacryl S-400 og Sephacryl S-500 var alle fra Pharmacia (Hillerød, Danmark), Biogel A-5m, Fine var fra BioRad (Bie&Berntsen, Rødovre, Danmark); Fractogel TSK HW-65(F) var fra Merck (Struers, Rødovre, Danmark) og Matrex Cellufine GCL 2000 var fra Amicon (Helsingborg, Sverige).

Eksempel 2

Gelfiltrering av plasma for å isolere Faktor VIII ved bruk av forskj ellige gelfiltreringsmedia.

En søyle på 0 2,6 cm ble pakket med forskjellige gelfiltreringsmedia som hadde forskjellige fraksjoneringsområder og forskjellig struktur. I alle tilfellene var den endelige høyden av den pakkede søylen 60 cm. Plasma ble tint som beskrevet i eksempel 1 og 1 IU av Heparin pr. ml ble tilsatt. For hver av gelfiltreringsmediaene ble søylen påsatt 50 ml plasma (16% av gelvolumet). Påsettingen på søylen og eluering med buffer ble utført som beskrevet i eksempel 1. Strøm-hastigheten var i alle tilfellene den samme som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at eksperimentet benyttet Biogel A-5m, hvor strømhastigheten var senket til 50 ml/time p.g.a. øket tilbaketrykk. Fraksjonene ble samlet, og for hver fraksjon ble OD280°^Fa^tor VIII:C bestemt ved bruk av Coatest. Den spesifikke aktiviteten til faktor VIII-hovedfraksjon ble beregnet som forholdet mellom Faktor VIII:C/ml og OD28Q. Eksperimentene ble gjentatt n ganger ved bruk av forskjellige plasmaer for hver påsetting og gjennomsnittsverdiene med hensyn til utbytte og spesifikk aktivitet ble beregnet. Faktor VIII-hovedfraksjonen ble valgt på den samme måte som beskrevet i eksempel 1, og utbyttet er gitt som innholdet av Faktor VIII:C i Faktor VIII-hovedfraksjonen som prosent av innholdet til Faktor VIII:C i det påsatte plasma.

Fraksjoneringsområdet og partikkelstørrelsen for de forskjellige media og de beregnede gjennomsnittsverdiene er beskrevet nedenfor i tabell I.

Eksempel 3

Gelfiltrering av plasma for å isolere Faktor VIII ved bruk av forskjellige søylebelastninger.

En søyle på 0 2,6 cm ble pakket med Sepharose 4FF til en endelig høyde på 60 cm. Plasma ble tint som beskrevet i eksempel 1. Etter tining, ble pH i plasmaet justert til 7,0 ved bruk av 0,5 M HC1, 1 IU heparin pr. ml ble tilsatt, og plasmaet ble filtrert gjennom et 10 mikrometer nylonfilter. Til søylen ble tilsatt hhv. 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml og 70 ml plasma. Tilsetningen, strømhastigheten, og elueringen ved bruk av buffer ble utført som beskrevet i eksempel 1, skjønt bufferen ble justert til pH 7,0. Fraksjoner ble samlet, og for hver fraksjon ble OD2g0og Faktor VIII:C bestemt ved å benytte Coatest. Spesifikk aktivitet til Faktor VIII-hovedfraksjonen ble beregnet som forholdet mellom faktor VIII:C/ml og OD280'. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger ved bruk av tre forskjellige plasma for hver belastning og gjennomsnittsverdiene (x) ble beregnet. Volumet av Faktor VIII-hovedfraksjon (ml) er volumet av fraksjoninneholdende Faktor VIII som kan bli samlet før den store brede proteintopp (OD28Q) blir eluert og blir valgt på samme måte som beskrevet i eksempel 1. Utbyttet blir angitt som innholdet av Faktor VIII:C i Faktor Vlll-hovedfraksjonen som prosent av innholdet av Faktor VIII:C i det tilsatte plasma.

De beregnede tallene er vist i tabell II nedenfor.

Eksempel 4

Gelfiltrering av plasma for å isolere Faktor VIII ved bruk av forskj ellige elueringshastigheter.

Til den samme søyle som benyttet i eksempel 3 ble tilsatt 50 ml plasma tint som beskrevet ovenfor. Etter tining ble pH i plasma justert til 7,0 ved bruk av 0,5M HC1, 1 IU heparin/ml ble tilsatt, og plasmaet ble filtrert gjennom et 10 mikrometer nylonfilter. Ved bruk av tre forskjellige deler av plasma ble strømhastigheter på hhv. 100, 200 og 300 ml/time undersøkt. Den samme strømhastighet ble benyttet under tilsetningen av plasmaet og den følgende elueringen. Elueringen ble utført ved bruk av den samme bufferen som beskrevet i eksempel 3. Fraksjoner ble samlet, og for hver fraksjon ble OD28Q og Faktor VIII:C bestemt ved bruk av Coatest. Spesifikk aktivitet og utbytte i Faktor Vlll-hovedfraksjon ble beregnet som i eksempel 3. Gjennomsnittsverdier (x) av volumet i faktor VIII-hovedfraksjon, utbytte og spesifikk aktivitet ble beregnet. Resultatene er vist nedenfor i tabell III.

Eksempel 5

En søyle på 0 10 cm ble pakket med Sepharose 4FF til en endelig høyde på 60 cm. Frosset plasma fra en dansk blodbank ble tint ved 30°C i et vannbad. Hhv. 925 g, 1496 g og 2000 g ble påsatt søylen. Strømhastigheten ble holdt på omtrent 4200 ml/time under påsetting og eluering av plasma ved bruk av Masterflex pumpe (Buch&Holm, Herlev, Danmark) hvilket tilsvarte omtrent 0,89 gelvolum pr. time. For eluering ble den samme buffer som beskrevet i eksempel 1 benyttet. OD280 ble avlest kontinuerlig ved bruk av Pharmacia Monitor UV-l. Når OD2g0startet å øke ved void-volum, ble oppsamlingen av Faktor VIII hovedfraksjon startet og den ble avsluttet, når 0D2gQviste at den store proteintoppen begynte å bli eluert. I Faktor VIII-hovedfraksjonen ble Faktor VIII:C-innholdet bestemt ved bruk av én-trinn-koagulasjonsmetode, og protein ble bestemt ved bruk av Kjeldahl. Den spesifikke aktiviteten ble beregnet som forholdet mellom det totale antall av Faktor VIII:C-enheter i Faktor Vlll-hovedfraksjonen til det totale antall av milligram proteiner i Faktor VIII-hovedfraksjonen. Utbyttet av Faktor VIII:C ble beregnet som innholdet "av Faktor VIII:C i Faktor VIII-hovedfraksjonen i prosent av innholdet av Faktor VIII-C i plasma tilsatt.

Resultatene er vist under i tabell IV.

Eksempel 6

Gelfiltrering av plasma for å isolere Faktor VIII ved bruk av en søyle av industriell størrelse.

En søyle med 0 29 cm ble pakket med Sepharose 4FF. Etter ekvilibrering ved bruk av den samme buffer som beskrevet i eksempel 1, var gelhøyden 53 cm. 10 kg av frosset plasma fra en dansk blodbank ble tint og oppvarmet i 30°C, hvoretter den ble påsatt søylen. Den påsatte mengde bestod av 28,8% av gelvolumet. Ved bruk av en Masterflex-pumpe, ble en strøm-hastighet på 30 l/time, hvilket tilsvarte 0,86 gelvolum pr. time opprettholdt under påsettingen og elueringen under bruk av ekvilibreringsbufferen. OD280 ble av-Lest kontinuerlig ved bruk av en Pharmacia Monitor UV-l, og tidspunktet for den første antydning av en øking i OD2g0ved void-volum, ble Faktor VIII-hovedfraksjon samlet. Totalt ble 11,73 kg Faktor VIII-hovedfraksjon samlet. Så ble innholdet av Faktor VIII:C bestemt ved bruk av én-trinns-koagulasjonsmetode og protein ble bestemt ved bruk av Kjeldahl. Totalt ble 8798 IU Faktor VIII:C og mindre enn 2346 mg protein funnet i Faktor VIII-hovedfraksjonen hvilket ga et utbytte av Faktor VIII:C på 880 IU/kg plasma, hvilket tilsvarte et utbytte på 88% i form av et produkt som hadde en spesifikk aktivitet på mer enn 3,75 IU/mg protein.

Faktor VIII-hovedfraksjonen oppnådd ifølge fremgangsmåten til oppfinnelsen, kan bli videre renset på en måte som tilsva-rer konvensjonell opprensning av et gjenoppløst kryopresipitat, hvilket omfatter f.eks. videre kromatografisk opprensning og lyofilisering ved bruk av vanlige tilsetninger for å lage stabile preparater. Preparatet blir rekonstituert før bruk ved hjelp av en passende konvensjonell bærer.

Claims

1. Fremgangsmåte for isolering av Faktor VIII fra andre proteiner i blodplasma ved bruk av gelfiltreringsmedium, karakterisert ved ved at isolert plasma eller tint friskt frosset plasma, som eventuelt har blitt

forbehandlet, så lenge som enhver eventuell forbehandling ikke har noen nevneverdig innflytelse på innholdet av Faktor VIII i plasmaet, gelfiltreres direkte under gruppesepareringsbetingelser hvor volumet av tilsatt plasma er minst 5% av gelvolumet, og hvor strømhastigheten er minst 0,3 gelvolum pr. time, gelfiltreringsmediet består av partikler som er inerte (uføl-somme) overfor Faktor VIII og har et fraksjoneringsområde i 3 8 intervallet fra 1x10 til 1x10 , og hvor Faktor Vlll-hovedfraksjonen blir samlet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gelfiltreringsmediet består av et gelmateriale som har et fraksjoneringsområde i interallet fra lxlO <4> til 8xl0 <7> .

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at gelfiltreringsmediet består av gelmaterialet som har et fraksjoneringsområde i intervallet fra 5xl0 <4> til 4xl0 <7> .

4. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-3, karakterisert ved at plasmavolumet som blir påsatt er 15-40% av gelvolumet.

5. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-4, karakterisert ved at strømhastigheten er 0,5-2 gelvolum pr. time.

6. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-5, karakterisert ved at Faktor VIII som er oppnådd videre renses på en måte som er analog med den konvensjo-nelle rensing av et gjenoppløst kryopresipitat, som består av f.eks. videre kromatografisk rensing og lyofilisering ved bruk av vanlige tilsetninger for å fremstille et stabilt preparat.