JPH05501557A - 生物学的に活性な化合物の単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 を、血漿の如き体液から第１の単離工程としてゲル濾過を用いて単離する方法に 関する。

背景技術 抗血友病因子Ａ又はＡＨＦとして知られている因子■は、血液凝固の本質的経過 に関係する血漿蛍白質である。

因子■は、因子■凝固活性（因子■：Ｃ）およびリストセチン補因子活性（フォ ンウレブランド因子（ｖＷＦ））をそれぞれ有する２種の蛋白質の非共有複合体 （この複合体は分子量１〜２０Ｘ１０”Ｄを有する）の形態で極めて低濃度で血 漿中を循環する。

因子■：Ｃは、１００，０００人の内的５人が患っている、出血疾患血友病Ａの 個人において存在しないか、又は欠陥がある。

ウオンウレブランド因子は、活性化血小板の凝集が増大するような方法で活性化 血小板に結合する。この効果は、リストセチン誘発血小板の凝集により試験管内 で検知できる。ウオンウレブランド疾患と共に、出血時間の延びは、ウオンウレ ブランド因子の欠乏又は生物学的活性レベルの減少に起因するように思われる。

血友病Ａを患う血友病者およびウォンウレブランド疾患の激しい症状を患う患者 は、今日因子■：Ｃ／ｖＷＦを含むコンセントレートで治療を受けており、その 治療は患者の寿命および経済的能力を相当に改善しており、そして患者の寿命の 延命に寄与している。

因子■（因子■：Ｃおよび／又はｖ　Ｗ　Ｆ　）を含有する医薬製剤は、血液又 は血漿から調製できる。このような製剤の製造は、種々の公知方法で行うことが でき、これらの全ては低収率の特に因子■：Ｃに特徴を有する。殆ど全てに共通 の方法は、寒冷沈降方法を含む初期の精製工程である。寒冷沈降方法により、凍 結血漿は０°〜４°Ｃの温度で解け、これは因子■を含む沈殿物を生じさせ、該 因子■は例えば遠心分離により採取される。寒冷沈降方法は比較的簡単であるが 、本質的に欠点を有する。何故なら、大規模で、すなわち５ｋｇ以上の血漿のプ ールを用いた場合、低収率の因子■：Ｃ（血漿濃度の３０〜４５％）をもたらし 、このことは最終収率が、下流精製工程が用いられるにもかかわらず低いことを 意味する。

更に、一般にウィルス不活化工程は、因子■製剤の製造中に含まれている。ウィ ルス不活化工程は、ウィルスに対し製剤の安全性を相当に増加させているが、し かし、大抵の場合、更に因子■：Ｃの収率の減少をもたらす。

因子■の全体の低収率は、幾つかの場所でこれらの製造の不足を導いている。従 って、血友病の治療に対し因子■の要求に応えるため、高収率で因子■を精製す る新しい方法が必要とされる。

血漿から高収率で直接因子■を単離する新規な方法は、非常に興味がある。と言 うのは血漿中因子■の濃度の７０％までが、寒冷沈降方法において又はその前に すみやかに失われるからである。

近年、アフィニティクロマトグラフィーを用い血漿がら因子■を直接単離するこ とが試みられた（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｎａｏｓｈ、、６１゜（２）　、２３４ 〜２３７（１９８９））、　Ｌかし、６０％未満の収率であり、更に単離された 因子■含有分画のｌａｉｇ蛋白質当たり１１ｔＪ因子■の比活性が得られるのみ であった。

ゲル濾過、又ゲル浸透クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーは 、拡散制御プロセスであり、このプロセスはそれらのサイズに応じて溶出液を分 離するために用いられる。溶出液を、最大分子を排除する孔径を有する不活性多 孔質ゲル粒子で充てんされたカラムを通ずが、一方、より以上な分子はゲル粒子 の内側の静的相に拡散する。従って、ゲル粒子から完全に排除された最大の分子 は、まず「空隙量Ｊを有して溶出され、一方より小さな分子は、カラムを通過す るのにより長い時間費しそして「溶出量」の増加に伴いサイズの減少に従って溶 出される。

ゲル濾過は、２種の異なる方法で行なわれる。

１、　グループ　モード グループ分離モードにおいて、溶質は分子径の大きな相違を有する二つのグルー プに分離される。一つのグループは、空隙量を伴って溶出され、他のグループは しばしば全「ベッド（床）量」に近いより多量の溶出量を伴って後に溶出される 。この手順は、主に溶解している塩から蛋白質を分離するため、又は緩衝液を交 換するために主に用いられており、「脱塩」として呼ばれる。「脱塩」に対し小 孔径を有する硬いゲルが用いられ、プロセスは、多量の材料（ベッド量の２０〜 ３０％を構成するサンプル量）を用いかつ高流速（１時間当たり緩衝液の約１ベ ツド量）を用いて行なわれる。従って、カラムの容量は大きいものとなろう。

２　分厚トに一旦 分別モードにおいて、近似分子量を有する溶質が分離される：この手順は、しば しば衝臼譬の分離に用いられる。この目的に対し、より大きな径のゲル粒子が用 いられ、そしてゲル濾過媒質が、次の内容が確保されるように選ばれる。すなわ ち、蛋白質が空隙量を全ベッド量に相当する溶出量間で溶出される。物質は、グ ループ分離条件を用いる場合よりもより接近して溶出され、更に重なる可能性が ある。更に高流速は、望まれない。と言うのは、これは蛋白質の有効な分離苓考 慮（７ておらず、更にカラム装入量は個々の蛋白質を合理的に分離するため低く 保たねばならないからである。従って、分別モー　ドで用いられるゲル濾過は、 分別されるべき量が少ない最後の仕Ｊ−げ工程とし、て蛋白質の分離に対しての ろ推賞されてきている（ヤグシーズ５、ｌＪｌｌｍａｎｎｓ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐ ｅｄｉａ　ｏｆＩｎｄｖｌｓｔｒｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌ　Ｒ３（ １０）、１９８８およびＲｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．。

４、９５４〜５８（１９８６））　Ｄ ゲル濾過ヲ用いて血漿′から因子■を単離する試みがなされた（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃ ｌ１ｎ、Ｍｏｄ、　、　７２．　（６）　、　１９６８．１００７−１００８お よびＪ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、４８，１９６９．９５７−９６２）、実験中、優れた精製が見 出されたが、収率はわずか約４０〜５０％であった。得られた因子■含有分画は 、出発血漿に依存していることが見出された。

と言うのは、多量の脂質およびキロミクロンが、より低い比活性を有する濁った 因子■分画を生じさせるからである。以下の内容が注目された。すなわち、用い たゲル濾過技術は、多量の血漿の取扱いを許容しないと云うことである。しかし 、予備的実験では、はるかに多くの濃コーン（Ｃｏｈｎ）分画のゲル濾過は可能 であるように思われる。

更に、ボールセン等（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｄｉａｔｈｅｓ、Ｈａｅｍｏｒｒ、２２． １９６９＋５７７〜５８３）は以下の内容を見出した。すなわち、因子■は、ゲ ル媒質セファロース６Ｂを用いて他の血漿から分離されるであろうが、しかしゲ ル濾過を用いてクロマトグラフィーは、再溶解した凍結沈殿物を出発物質を１７ で用いる場合、大規模で可能であると思われた。

米国特許３．６３７．４８９は、ゲル濾過を用いかつ孔質ガラスピーズを用いる 血液成分の分離方法を開示している。該方法は、特許ご血清もしくは血漿中の他 の成分から免疫学的に活性な分質の分離を特に意図しでいる。

因子＼１を精製するためにゲル濾過を用いる幾つかの試みがなされて以来、血漿 の部分精製分画（再溶解した凍結沈殿物および更にその精製分画）のゲル濾過に 試みが集中しでいる。

小装入量のカラムおよび／又は小流速又はそれらの組合せを用いた全ての試みが なされた。

蛋白質分別方法としてのゲル濾過は、１９５９年以来公知であり、蛋白質の特徴 化方法又は小量のサンプルから蛋白質の精製方法として生物化学的研究において 広く用いられている。血漿分画中の蛋白質分離に対し、ゲル濾過は本発明までは 大規模には行なわれていなかった。ただアルブミン溶液からエタノールと塩の脱 塩に用いられていた。従って、参考文献には次のように記載されている：「血漿 分別においてゲル濾過が主要に技術になっていない主な理由は、カラム容量光た り蛋白質の低スループットである（Ｊ、Ｈ，ベルブローフ：ｒＦｒａｃｔｉｏｎ ａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｇｅｌ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｊ　、１６３〜１７３頁、 Ｊ、Ｍ、カーリング（ｌｉｄ）　：　ｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｌａｓｍｅ　 Ｐｒｏｌｅｉｎ　Ｆｒａｃ−ｔｉｏｎａｔｉｏｎ　Ｊ　、アカテミックプレス、 ロンドン、１９８０）および［不幸にも、合理的に決められた大きさのカラムに よって取り扱うことのできる蛋白質量は少なく、かつサンプルの希釈は無視でき ない。該方法は、従って、血漿分別には多く用いられないＪ　（Ｊ、Ｊ、モーゲ ンターラー等：　「ヒト血漿の単離中、構造と機能の保存Ｊ　、１２７〜１３８ 頁、スミットシピンガ等（Ｗ）：　ｒＰＩａｓ＋ｍａ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉ ｏｎ　ａｎｄ　Ｂｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｎｃｔｉｏｎｊ。

マーチナスニジョフ出版社、ボストン、１９８５）。

米国特許４，６７５．３８５は、第１の工程において、血漿製剤の緩衝水性組成 物を調製し、次いで組成物を、約１３ミフロン〜約３５ミクロンの寸法を有する 多孔質高速液体クロマトグラフィービーズのクロマトカラムに導入し次いで緩衝 水性溶離液で溶出することによる連続的高速サイズ排除クロマトグラフィーによ り、因子■高分子量成分および低分子量成分を有する血漿調製品から因子■プロ 凝固蛋白質の単離を開示している。良好な分離の得るため、米国特許４，６７５ ，３８５は、容量を減少させるが低分子量の血漿蛋白質から因子■成分の良好な 分離を確保しない４０〜８０よりもより少なくないアスペクト比を有するカラム の使用を開示している。しかし、この第１の単離は、第２のＨＰＬＣを行うこと によってのみ得られる血漿調製品の他の蛍白質成分から因子■：Ｃ活性を示す蛋 白質の良好な分離は確保しない。かくして、本発明まで、以下ように一般的に受 け入れられていた。すなわち、ゲル濾過はより多量、例えば５２以上を取扱う場 合、血漿分別において蛋白質の分離に対し適当な方法でない。

驚くべきことに以下の事実が見出された。すなわち、高速が望まれているゲル濾 過物質を選択する場合、通常の最初の凍結沈殿方法に依存する必要なく極めて穏 やかな機械的分離により、血漿から極めて高収率でかつ純粋な形態で因子■を直 接を単離することが可能となった。

発明の詳細な説明 本発明は、ゲル濾過を用い血漿中の他の蛋白質から因子■：Ｃおよびｖ　Ｗ　Ｆ 複合体の形態で因子■を単離する方法に関する。

本発明方法は、単離された血漿又は凍結血漿を新たに解かしたものを高装入およ び高流速を用いたグループ分離条件下でゲル濾過に委ねることを特徴とし、ゲル 濾過媒質は、因子■に不活性でありかつｌＸＩＯ３〜１×１０Ｉ′、より好まし くは１×１０４〜５ｘｉｏ’の間隔の分別範囲を有する粒子から構成されている 。分別範囲は、例えば５Ｘ１０’〜４×１０７　の間隔内にある。

好ましい態様において、加えられる血漿の量は、ベッド量の少なくとも５％であ る。加えられる血漿の量は、好ましくはベッド床の１５〜４０％である。

本発明方法は、好ましくは１時間当たり、少なくとも０．３ベツド量、最も好ま しくは１時間当たり０．５〜２ベツド量の流速を用いて行なわれる。

本発明の目的に対し、速やかな溶出を許容する硬さを有するゲル濾過媒質を用い る。更に、ゲルは、ゲル濾過中天子■に対し化学的かつ免疫学的に不活性でなけ ればならない。実験によれば、本発明方法はセファロースＣＬ−４Ｂ、セファロ ースＣＬ−６Ｂ、セファロース４ＦＦ、セファロース６ＦＦ、セファクリルＳ− ４００、セファクリルＳ−５００、フラクトゲルＴＳＫ　ＨＭ−６５（Ｆ）およ びマドレックスセルフインＣＧＬ２０００の如き商業的ゲルを用いて行うことが でき、これらは全て本発明の目的に対し適当である。このようなゲルは、一般に 約３２μｍ〜約２００μｍの範囲の粒径（ウェット）を有する。

本発明方法の一つの態様によれば、凍結血漿は溶解され、そして全ての因子■は 溶解されており、しかる後溶解血漿は好ましくは全ての因子■が溶解した後直ち にカラムに添加されることが確保される。温度は、好ましくは因子■の広範な分 解を避けるため高すぎないようにする。血漿は、例えばヘパリン、シトレート、 スクロース、アミノ酸、他の安定化剤を添加することにより予備処理され、所望 により濾過され、遠心分離され、限外濾過により濃縮され、通常の沈殿剤を用い て予備沈殿されるか又は他の所望の予備処理が血漿の因子■の内容物に著るしい 影響を有しない限りカラムにそれを添加する前に同等の方法で予備処理される。

驚くべきことに、本発明方法は、極めて高収率の因子■を与える。典型的には、 血漿の因子■の内容物の７０％超が生成物中に回収され、そして該方法は蛋白ｆ ｌ＋ｇ当たり１〜約４１Ｕ因子■：Ｃの比活性を有する極めて純粋な生成物をも たらす。このことは特に次の事実に起因する。すなわち、本発明方法を用いるこ とにより因子■は、単離過程において極めて初期に因子■：Ｃの分解を通常引き おこす蛋白分解酵素からも分離される。

本発明方法は、高純度での因子■を極めて高度に回収するようにしたゲル濾過に おいて高装入および高流速を用いて血漿を通用する条件のもとの多量の血漿の処 理を可能とする。

ゲル濾過からの因子■含有分画又は更にゲル濾過して一緒にした分画は、次いで 濃縮され、更に自体公知技術、例えば限外濾過、沈殿イオン交換、アフィニイテ ィクロマトグラフィー等を用いて精製される。

残りの血漿蛋白質、例えばアルブミン、イミノグロブリン、プロトロンビン複合 体、アンチトロンビン■および他のものは又は、自体公知の技術、例えば、アル コールを用いる沈殿、ＰＥＧ−沈殿、クロマトグラフィー等を用いてゲル濾過の 後の分画から単離できる。

因子■：Ｃ−活性の決定は、２工程分析又は１工程分析を用いＣ行うことができ る。１工程および２工程分析でサンプル中の因子■：Ｃ活性が異なることば確立 された事実である。

更に、同ザンブルに対し同分析を用いたくりかえし測定は、因子：Ｃ活性の決定 に変化をもたらすことも知られている。

本発明中、表現、「血漿」は、全ての血球および血小板が、例えば遠心分離によ り除去された血液を意味する。

「因子■：ＡｇＪは抗原に対する因子■を示し、甲乙ごｒ　ｖ　Ｗ　Ｆ−Ａ　ｇ 　Ｊは抗原に関するウオンウレブランド因子を示ず。［−・、ノド＠−１は、充 てんゲル媒質および間隙液体の星ｌニジ７て定義される。「空隙量」はゲル粒子 間の緩衝液の量として定義され、更に「溶出量」は特定物質を溶出さ琵るために 用いた緩衝液の量で１イへる９表現「カラム装入量」はへノドに添加される量を 示すために用いられ、ヘッド量の％とじて計算される。表現「分別範囲」は、ゲ ル物質が供給者により増価されている（球状の）蛋白質又はより大きな分子の分 子量の範囲否決定することを意図する。

本発明方法を、以下に図面および本発明の詳細な説明する実施例を参照しつつ甲 乙こ説明する。

実施例は、例示目的のためであり、本発明を何ら制限するものではない。

図面の簡単な説明 本発明を添加の図面により更に説明する。

第１図は、種々の分析により測定される本発明に従ったゲル濾過による因子〜韮 の溶出を示すグラフであり、そして第２図は本発明方法に従ったゲル濾過による 種々の血漿蛋白質の溶出の順位を示す。

実験部分 見権例−り 血−゛から因子■を単離するゲル濾過 直径２．、６　ｃｍのカラムにセファロ−・スＣＩ−−−４Ｂを充てんし最終高 さ６０口とした。

デンマ・−り細潰銀行からの凍結血漿を水浴）　２５　”Ｃまで溶解した。１１ 　［、Ｊベパリン／ｉを添加後、面子５０〆（ベッド量の１６％）を流速１００ 　ｄ／ｈｒでカラムに添加し５、しかる後、１時間当たり０．６３ベツド量に相 当する強制流速２００ｄ／ｈｒｆｆｌ衝液を用いてカラムを溶出させた。カラム の平衡化および溶出は、緩衝液、０．０２　ＭのシトレートＮａＣ１，ｐｌ！７ 、４を用いて行なわれた。更に緩衝液に、ＩＩｄ当たり０．　１　Ｍの□ａｃ１ ．７ー２５ｄを添加ｊ７、これは約７×１０−５Ｍの遊離カルシウムイオン（　 Ｃ　ａ　”）濃度をりえる。

インボルドＧｍｂＨ（フランクフルト／マイン、ＦＲＧ）型造のカルシウム選択 的電極を用いて遊離カルシウムイオン濃度をチ．５ー．ツクｊ，また。分画を集 め、各分画に対（２、ＯＤ２１１０、因子■：Ｃ（１工程凝固分析および２工程 金色分析の双方を用いる）、因子■：Ａｇ、アルブミン、ｒｇＧ、フィブリノー ゲン、ＩｇＭ、α−　２−メルカプトグロブリン、因子ＴＸ、因子Ｘ、蛋白質Ｃ および抗トロンビン■を測定した，　Ｏ　Ｄ　２１１０Ｖこより測定した蛋白質 は、空隙量で小さなピークをもって溶出され（分画１０−・１日）、次いで極め て大きな幅広いピークをもって溶出された（分画１９へ・５０、第７図参照）。

２工程分析により測定される如く８２％の因子■：Ｃおよび１工程凝固分析によ り測定される如く９１％の因子■：Ｃ活性は、空隙量（因子■−主分画）の集合 ピークおよび最も早い小さな蛋白質ピークで溶出された。因子■の残りは直ちに 小量の連続ビー・り−テールで溶出された。因子■：ＡｇおよびｖＷＦ：Ａｇば 、因子Ｖｌｌ：Ｃと共に溶出されたが幾分幅広い連続ピーク−テールを有してい た。決定された全ての他の血漿蛋白質は、因子■−主分画後、大きな幅広い蛋白 質ピーク（図２参照）と共に溶出された。因子■：Ｃから分離される血漿蛋白質 は、、その分子量を有していた。

アンチＩ・ロンドンＩＩＩ　：　６５，０００　Ｄｉ自ｉｔｃ　：　６２，００ ０　Ｄ 因子Ｘ　：　５９．０００　Ｄ 因子ｉＸ：　５７．０００　Ｄ α−２−１゛クログロブリン：　７１８，０００　ＤＩ　ｇ　Ｍ　：　９００， ０００　Ｄ フィブリ、ノ・−ゲラ　３４０，０００　Ｄｌ、マ←骸　１５０，０００　１） アル、ノ゛ミン：　６７、０００　０ ２丁，桿り１−７７（・ゲラクイ−分析を用いる因子Ｖｌ！Ｉ：Ｃー活性の決定 は、発色阜質法（ＫＡＢ　Ｉ　、−、Ｊ−テスト因了■）を用いて行なわね、、 ３゛ｔ″Ｃで試験管を用いるもとの力法は、試左ｊを減少量でミイノ１」クイク ーブレ〜　１・を用いて行・うたぬに修正された。後にリン脂質、因子ＩＸａ　 、因子ＸおよびＣａＣ１２の溶液７５μｐと混合する、５０μ！のサンプル又は 標準物を３７°Ｃで１５分間インキュベートし、しかる後５　０　ｌ／　（’． の基質を添加する。更に２０分後２　３７°Ｃでインキエベ・−ジョンし、５０ μβの１Ｍクエン酸を添加して反応物を急冷する。

発色を４０５ｎｍで話みとるが、、対照は４９２ｎｍである。

１工程分析を用い因子■：Ｃ活性の決定は、Ａ　Ｐ　Ｔ　Ｔ　−法（活性化部分 ］・ロンビンブラスチンタイム）を用いて行なう、１００μ２のサンプル又は標 準をビベントで採集してキュベツトに入れ、しかる後１００μｐの欠乏血漿（因 子■欠乏面子、ジュネラルダイアゴノスナック）を添加し７、溶液を３７゛Ｃで ５分間一定温度に調節する６　１００ミクロタイターの０、０３ＭＣａＣβ２を 添加後、溶液の凝固までの時間を決定する。

４個の定量的測定に対し、、ＷＨＯ標準（　Ｆ　Ｖ　ＩＩＩの第３回国際標準、 ヒト血漿、３．　９　Ｉ　Ｕ／ｄ）に対ｊ７て較正された国際標準に基づく較正 曲線を作成する。本発明で記載する如く２工程分析は、１工程分析よりもより小 さい（約１０倍）の検出限界を有ｊ〜でいる。ヘパリンを添加する場合、２工程 分析を用いることば有利であり、分析に対するへ・バリンの何らの１響は、希釈 Ｑこよりより容易に除去されるで、ちろう。

ミクロタイターへプレー　１・（ヌンク、カムスト・ラッグ、４０００ロスキル デ、デンマーク）へのコ・−チイング材料とし“ζ′困子＼フィンヒビクー愚者 からの抗体を用い更に結合因子■（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．　、　５３ （３）　、１９８５．、３４６　”−３５０）を測定するため同一インヒビター 患者がらのベルオキダーゼ、ラベル化Ｆ（ＡＢ’）ｚフラグメントを用い、ＥＬ 　Ｉ　ＳＡを用いて測定した。ＷＨＯ標準（第１図）ＩＲＰ、１９８２年確立） に対して較正されたプールした標準血漿を用い、標準曲線を作成した。

ｖＷＦ：Ａｇも又、ＥＬ／ＩＳＡを用いて測定したが、しかし、コーテング材料 として家兎抗−ヒトｖＷＦ（ダコ、デンマーク）を用い更に結合ｖ　Ｗ　Ｆを測 定するためペルオキシダーゼラベル化家兎抗ヒ）ｖＷＦ（デコ、デンマーク）を 用いた。因子■：Ａｇ　ＥＬＩＳＡに関し、同ヒト血漿を用い標準曲線を作成し た。

因子ＩＸを、因子■：Ｃと同様の方法で１工程凝固分析を用いて測定したが、但 し、因子ＩＸ欠乏血漿を用いた。ＩｇＧを、放射免疫拡散（免疫化学、２．１９ ６５．２３５〜２５４）を用いて測定し、次いでアルブミン、フィブリノーゲン 、α−２−マクログロブリン、因子Ｘ、蛍白′１ｔＣおよび抗トロンビンを、ロ ケント免疫電気泳動（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５，１９６６．４５〜５２ ）を測定した。０Ｄ２８゜、を分光光度計（ミルトロロイカンパニー製の５ｐｅ ｃｔｒｏｎｉｃ　６０１）を用いて測定し、次いでケルプールを用いた蛋白質を 、ＴＣＡによる沈殿なしでｐｈ。

Ｅｕｒ、第２版、１．　Ｖ、３．　５．　２に従い測定した。精製分画の比活性 を、０Ｄ２８゜に対するか又はケールプールを用いて測定した如く蛋白質の濃度 に対する因子■：Ｃ４度の割合として計算した。比活性の計算に対し０Ｄ２８゜ を用いる場合、もしも同し出発血漿を用いないなら得られた結果は直接比較でき ない。何故なら因子■を含有する分画がしばしば濁っているからである（　Ｊ、 ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、４８．１９６９．９５７−９６２）。

実験で用いられる種々のゲル濾過媒質は、次の会社からのものである： セファロースＣＬ−６Ｂ、セファロースＣＬ−４Ｂ、セファロースＣＬ−２Ｂ、 セファロース６ＦＦ、セファロース４ＦＦ、セフアククルＳ−４００、およびセ ファクリルＳ−５００は、全てファルマシア（ヒルラルド、デンマーク）製造の ものであり、バイオゲルＡ−５ｍ、ファインはバイオランド（パイアンドバルン セン、ルードレ、デンマークｍ）Ｗ　造のものであり、フラクトゲルＴＳＫ　Ｈ Ｗ−６５（Ｆ）は、マーク（ストルーエル、ルドレ、デンマーク国）Ｗ造のもの であり、更にマドレックスセルファインＧＣＬ２０００は、アミコン（ヘルシン キ、スフエーデン）製造のものである。

例２ 種々のゲル濾過媒質を用い因子■を分離するための血漿のゲル濾過 直径２．６　Ｃ１１のカラムを、異なる分画範囲および異なる構造を有する種々 のゲル濾過媒質を用いて充てんした。全ての場合に、充てん床の最終高さは６０ Ωであった。例１における如く血漿を解かし次いで１！ｄ当たりＩＩＵのヘパリ ンを添加した。ゲル濾過媒質の各々に対し、５０ｄの血漿を装入した（床容量の １６％）。カラムの装入および緩衝液による溶出は、例１に記載する如く行った 。流速はバイオゲルＡ−５ｍを用いての実験を除き、全ての場合例１におけると 同様であったが、そのバイオゲルＡ−５ｍを用いる場合、流速は増加した床圧力 のため５ｄ／時に減少しだ。分画を集め、次いでコーチストを用い、各分画に対 し０Ｄ２８゜および因子■：Ｃを測定した。因子■−主分画の比活性を、０Ｄ２ ８゜に対する因子■：Ｃ／ｄの割合として計算した。実験は、各装入に対し異な る血漿を用いｎ回くりかえし、収率および比活性の平均値を計算した。因子−生 分画を例１に記載の如く選択し、次いで収率を、因子■−主分画中の因子■：Ｃ の含量として添加された血漿の因子■：Ｃの含量の％とじて報告する。

種々の媒質および較正平均値に対する分画範囲および粒径を以下の表Ｉに示す。

Ａ：セファロースＣＬ−６Ｂ；　Ｂ：セファロースＣＬ−４８；Ｃ：セファロー スＣＬ−２８，Ｄ：セファロース６ＦＦ　。

Ｅ：セファロース４ＦＦ；　Ｆ：セファロースＳ−５００ｉＧ：バイオゲルＡ− ５ＩＩＩＦｉｎｅ　；　Ｈ：バイオゲルＴＳＫ　ＨＷ−６５（Ｆ）　；■：マト レックスセルファインＧＣＬ２０００；　Ｊ　：セフアクリルＳ−４００勇ユ 種々のカラム装入を用い因子■を分離するための血漿のゲル濾過 直径２．６１のカラムにセファロース４ＦＦを充てんし最終高さ６０ＣＩとした 。例１における如く血漿を解かした。解けた後、血漿のｐＨを、０．５ＭＨＣｌ を用いて７．０に調節し、１−当たりＩＩＵヘパリンを添加し、次いで血漿を１ ０μｍのナイロンフィルターを用いて濾過した。カラムに、それぞれ３０ｄ、４ ０ｄ、５０Ｈ１，６０−１および７０−の血漿を添加した。添加、流れおよび緩 衝液を用いた溶出を例１に記載の如く行ったが、緩衝液をｐＨ７，０に調節した 。分画を集め、次いで各分画に対し、コーチストを用いＯＤ２．。および因子■ ：Ｃを測定した。各装入に対し、３種の異なる血漿を用い実験を３回くり返し、 次いで平均！（ｘ）を計算した。因子■主分画（１ｄ）の量は、因子■含有分画 の量であり、この因子■は大きな巾広い蛋白質ピーク（ＯＤｚｓ。）に溶出され そして例１で記載の如く選択される前に集めることができる。

収率は、因子■主分画中の因子■：Ｃの含量として、添加された血漿の因子■： Ｃの含量の％とじて報告される。

計算した数値を表２に示す。

ｔｊＬ 例４ 種々の溶出速度を用い因子■を単離するための血漿のゲル濾過 例３で用いたカラムと同じカラムに前記の如く解がさがれる５０−の血漿を添加 した。解けた後、血漿のｐＨを、０．５　ＭＭＣＩを用いて７．０に調節し、Ｉ ＩＵヘパリン／　ｔｔｒｆｌを添加し、次いで血漿を１０μｍのナイロンフィル ターを通して濾過した。３種の異なる血漿流速１００，２００および３００ｄ／ 時をそれぞれ用いた。同じ流速を血漿の添加中およびその後の溶出中に用いた。

分画を集め、各分画に対しコーチストを用い０Ｄ２１１ｏおよび因子■：Ｃを測 定した。因子■主分画における比活性および収率を例３における如く計算した。

因子■主分画の量の平均値（Ｘ）、収率および比活性を計算した。

結果を以下の表３に示す。

１一旦 例５ 種々のカラム装入を用い因子■を単離するための血漿のゲル濾過 直径１０１のカラムにセファロース４ＦＦを充てんし最終高さ６０Ｃ１ｍとした 。デンマーク国の血液銀行からの凍結血漿を３０°Ｃの水溶で解かした。９２５ ｇ、１４９７ｇおよび２０００ｇをそれぞれカラムに添加した。毎時約０．８９ 床容量に相当するマスターフレックスホースポンプ（ブッケアンドホーム、ヘル レブ、デンマーク国）を用い、血漿の添加および溶出中流速を約４２００ｄ／時 に保持した。溶出に対し、例１に記載の如き同じ緩衝液を用いた。ファルマシア モニターＵＶ−１を用い０Ｄ２８゜を連続的に監視した。０Ｄ２８゜が空隙容量 で増大し始める時、因子■主分画の採取を開始し、次いでＯＤ２．。が大きい蛍 白質ピークが溶離した時採取を終了した。■主分画において、１工程の凝固分析 を用い、因子■：Ｃ含量を測定し、次いでケルプールを用い蛋白質を測定した。

比活性を、因子■−主分画巾蛋白質のｌ１ｇの合計数に対する因子■−主分画に おける因子■：Ｃ単位の合計数の割合として計算した。因子■：Ｃの収率を、添 加した血漿中の因子■：Ｃの含量％における因子主分画における因子■：Ｃの含 量として計算した。

結果を表■に示す。

表　■ 直径２９ｃｍ０カラムでセファロース４ＦＦで充てんした。

例１で記載したと同様の緩衝液を用いて平衡化した後、ゲル高さは５３ｃｍであ ったデンマーク国血液銀行からの凍結血漿１０ｋｇを解かし、３０″Ｃに加熱し 、しかる後カラムにこれを添加した。マスターフレックスホースポンプを用い、 毎時０．８６床量に相当する１時間当たり３０ｆの流速を、平衡化緩衝液を用い 添加中および溶出中保持した。０Ｄｚａｏを、ファレマシアモニターＵＶ−１を 用い連続的に監視した。空隙容量で０Ｄｚｓ。中、最初の上昇があられれた時、 因子■主分画を集めた。次いで、１工程凝固を用い、因子■：Ｃの含量を測定し 、次いで蛋白質をケルプールを用いて測定した。合計で８７９８１Ｕ因子■：Ｃ および２３４６ｇ未満の蛋白質が、因子■主分画内に見出され、ｌｌｌ１ｇの蛋 白質当たり３．７５ＩＵ以上の比活性を有する生成物の形態で８８％の収率に相 当する８　８０　Ｉ　Ｕ／ｋｇ血漿の因子■：Ｃの収率を与えた。

本発明方法に従って得られる因子■主分画は、例えば更にクロマトグラフィー精 製および通常の賦形剤を用いた凍結乾燥を用いて含んでなる再溶解凍結沈殿物の 通常の精製法に準じた方法で更に精製して安定な製剤を形成することができる。

製剤は、杆部な通常のビヒクルを用い使用前に再構成される。

ＦＪＧ、］　因子■の溶出 ＦＩＧ、２　種々の蛋白質の溶出 分画番号 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年５月　９日

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．ゲル濾過媒質を用い血漿中の他の蛋白質から因子ＶＩＩＩを分離する方法で あって、血漿を高装入および高流速を用いた分離条件下、グループ分離のもとゲ ル濾過に委ね、ゲル濾過媒質が因子ＶＩＩＩに対し不活性でありかつ１×１０− ３〜１×１０−８の間隔の分画範囲内を有するゲル物質から構成される、前記方 法。
2. ２．ゲル濾過媒質が、１×１０４〜８×１０−７の間隔の分画範囲を有するゲル 物質から構成される、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．ゲル濾過媒質が、５×１０４〜４×１０７の間隔の分画範囲を有するゲル物 質から構成される、請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．添加される血漿量が、床置の少なくとも５％である、請求の範囲第１〜３項 のいずれかに記載の方法。
5. ５．添加される血漿の量が、床置の１５〜４０％である、請求の範囲第４項記載 の方法。
6. ６．流速が少なくとも毎時０．３床置である、請求の範囲第１〜５項のいずれか に記載の方法。
7. ７．流速が、毎時０．５〜２床置である、請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法に従って単離された因子ＶＩ ＩＩを含んでなる医薬製剤。