CZ537190A3 - Způsob izolování faktoru VIII - Google Patents
Způsob izolování faktoru VIII Download PDFInfo
- Publication number
- CZ537190A3 CZ537190A3 CS905371A CS537190A CZ537190A3 CZ 537190 A3 CZ537190 A3 CZ 537190A3 CS 905371 A CS905371 A CS 905371A CS 537190 A CS537190 A CS 537190A CZ 537190 A3 CZ537190 A3 CZ 537190A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- factor viii
- plasma
- volume
- gel filtration
- factor
- Prior art date
Links
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims abstract description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 102
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 73
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 15
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 32
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 6
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 6
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 5
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 4
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 4
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 4
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 4
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 3
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 3
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 108010035369 Cohn fraction I Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229940124135 Factor VIII inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000007696 Kjeldahl method Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 238000006887 Ullmann reaction Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229910001361 White metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000603 anti-haemophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000010969 white metal Substances 0.000 description 1
- -1 α-2-macroglubulin Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Networks Using Active Elements (AREA)
- Housing For Livestock And Birds (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu isolování faktoru Vlil 2 tělesných“ tekutin jako plasmy při použití filtrace ns gelu jako prvého izolačního stupně.
Dosavadní stav .techniky'
FaktoruVIII, známý také jako antihemofilický faktor A M-nebo AHF^jo-bílkovinou plasmy,*►která -ce účastní’ ns-· vnitřním— nechanému srážení krve. ' ·...·'·. '
Faktor-Vili- j3· přítomný, v krevní plasmě va-velmi-'nís- kých koncentracích vc forma nekovalentního komplexu ovou bílkovin c koegulacní účinností faktoru VIII (faktor VIII : C) ε účinností ristooetinu jako pomocného faktoru (z Willebrsnoova faktoru vWF); komplex má molekulovou hmotnost/.' as 20 χ 1Οδ. ' r ,
Faktor VIII chybí, nebo je ho velmi málo u οεο’ογ trpící chx^bmofilií A, přibližně připadá 5 takových na 100 000.
Faktor von Willebrandův se váže na aktivované krevní destičky takovým způsobem, že podporuje shlukování sktivovanýcldesticek. Iento účinek lze prokázat in vitro shlukováním destiček po indukování fistocetinem. S tohoto důvodu je možno pozorovat v případě Willebrancovy choroby prodlouženou dobu krvácení v důsledku právě toho, že chybí Willebrandův faktor nebo je sníženo jeho- množství., iiemocní, trpící hemofilií A a těžkými příznaky Willebrsadový choroby, jsou dnes páčeni koncentráty s obsahem faktoru
VIII i C/vW? a tato léčba zvýší kvalitu jejich íivot&/ s
IVA
ί.
a. jýjich práceschopnost podstatným způsobem a přispívá také k prodloužení jejich života.
Farmaceutické prostředky, které obsahují Faktor
VIII ( Faktor VIII:C a/nebo vWF) je možno získat z krve ne£ , . bo z: krevní plasmy. Tyto prostředky je možno vyrábět různým “*** způsobem, avšak1-vždy je výroba spojena s nízkým výtěžkemp—·~~ zejména v případě faktoru VIII:C. Téměř všechny postupy vy· B . .
.h , , + žadují počáteční čištění včetně kryoprecipitace, při tomto / čištění se plasma rozmrazí při teplotě 0 až 4 °C, č&nž dojde ke vzniku sraženiny, která obsahuje faktoř VIII, který je možno oddělit například odstředěním. I když jde o poměrně jednoduchý postup, má tento postup velké nevýhody při použití ve velkém měřítku, například u směsí plasmy é hmotností více než 5 kg poskytuje tento postup nízké výtěžky faktoru VIII:C ( 30 až 45% obsahu v pl^lmě), což znamená, že konečný výtěžek je nízký bez ohledu na to, jakých čistících postupů se pak použije.
Mimoto se pří výrobě faktoru VIII obvykle zařazuje stupeň^ při němž dochází k inaktivaci virů. Tyto stupně zvyšují bezpečnost použiti těchto prostředků, avšak ve většině případů také snižuji ještě více výtěžek faktoru VIII:C.
Celkové velmi nízké výtěžky faktoru VIII vedly k jeho nedostatku v různých místech. Je zřejmé, že by-bylo zapotřebí nových postupů pro čištění faktoru VIII k jeho získání ve větších množstvích pro potřeby hemofiliků.
Nové metody pro izolaci faktoru VIII by byly nejvhodnější přímo z plasmy vzhle<^ k tomu, že až 70 % obsahu tohoto faktoru v plasmě se ztrácí v počátečních stupních, tj. při kryoprecipitaci nebo ještě před ní.
A.·.
Nyní byly prováděny pokusy izolovat faktor VIII z plasmy přímo při použití afinitní chromatografie podle publikace Thromb. Haemost. 61 (2),234 až 237 (1989), bylo však dosaženo výtěžku méně než 60 % a specifické účinnosti 1 IU (mezinárodní jednotka) faktoru VlII/mg bílkoviny ve frakci s obsahem faktoru VIII.
Gelová filtrace nebo chromatografie na gelu, při níž obvykle dochází takél^dělení podle velikosti molekul/ je řízený postup, který se užívá k dělení rozpuštěných látek podle jejich velikosti. Rozpuštěné materiály se nechají projít porézními částicemi gelu s velikostí pórů, vylučující největší molekuly, kdežto menší molekuly difundují do stacionární fáze uvnitř částic gelu. To znamená, že největší částice, zcela vyloučené z gelových částic se vymývají jakó první spolu s prázdným objemem”, kdežto malé molekuly ,· se vymývají až po delší době podle své zmenšující se velíu kosti se zvyšujícím se elučním objemem.
Filtraci na gelu je možno provádět dvěma ráznými způsoby:
1. Dělení do skupin ”
Při tomto postupu sě rozpuštěné látky dělí do * dvou skupin s velkým rozdílem v molekulových rozměrech, jedna z těchto skupin se vymývá již na počátku s prázdným objemem, kdežto druhá mnohem později v objemu,'který často odpovídá celkovému objemu užité vrstvy. Tento postup se užívá především k dělení bílkovin od rozpuštěných solí nebo k výměně pufru a někdy se označuje jako odsolení. K tomuto účelu se užívá pevných gelů s malým rozměrem pórů a postup je možno provádět při použití velkého množství matefl riálu ( objem vzorku může být 20 až 30 % objemu vrstvy) a velkých průtokových rychlostí (přibližně objem vrstvy za hodinů), kapacita sloupce je tedy vysoká.
2. Frakcionaee
Při tomto postupu se dělí roz/puštěné látky s podobnou velikostí molekul. Jde často o dělení bílkovin.
K tomuto účelu se užívají Částice gelu s. velkými póry a materiál pro filtraci gelem se užije tak, aby bílkoviny byly vymývány mezi prázdným objemem a objemem, který je roven celkovému objemu vrstvy. Jednotlivé látky ee vymývají velmi blízko sebe a mohou se překrývat. Vysoká rychlost průtoku je nežádoucí, protože při ní nedochází k účinnému dělení bil kovin a zatížení sloupce má být malé, aby bylo možno dosáh6 dostatečného odděleni jednotlivých bílkovin. Tento postup je proto doporučován při dělení bílkovin až jako poslední čistící stupeň, v němž již objem, v němž se frakcionace pro« vádí je malý C Jagschies, Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, sv. B3Í10), 1988 a Bio/Technol., 4, 954 až) ,958,,(1986).
Byly činěny pokusy izolovat Faktor VIII z plasmy při použití filtrace na gdn podle J. Lab. Clin. Med., (6), 1968, 1007-1008 a J. Clin Invest. 48, 1969, 957 962.Byl získán velmi čistý produkt, avšak výtěžek byl pouze 40 až 50 %. Bylo ¥jištěno, že čistota frakcí s obsahem faktoru VIII závisí na výchozí plasmě tak, že velký počet chylomikronů a vysoký obsah lipidů dává vznik zakaleným frakcím s obsahem faktoru VIII s nízkou specifickou účinností. Bylo takě pozorováno, že použitý postup gelově filtrace neumožňoval použití větších objemů plasmy, přestože předběžné pokusy ukazovaly, že by bylo tímto způsobem možno získat dalfeko koncentrovanější Cohnovu frakci I.
Mimoto se v ^blikači Paulssen a další, Thromb, Diathes. Haemorr. 22, 1969, 577-583 uvádí, že faktor VIII by patrně bylo možno oddělit od jiných plasmatických bílkovin při použití gelu Sepharose 6B, avšak Že by patrně chromatografii na gelu bylo možno použít ve větším měřítku jen v tom případě, že by se jako výchozí materiál užila sraženina po kryoprecipitačnim stupni po svém opětném rozpuštění.
V US patentovém spisu č. 3 637 489 se popisuje postup pro dělení krevních složek při použití filtrace na gelu a porézních skleněných kuliček. Postup je určen zvláště pro dělení imunologicky aktivních materiálů od jiných slo4/ · žek krevní plasmy nebo séra· . <
. f * ” Bylá'provedena ještě řada pokusů přo, použití >.
filtrace na gelu k Čištění,faktoru Vlil, avšak tyto pokusy tu se soustředily na filtraci částečně čištěných frakcí plasmy ( znovu rozpuštěné sraženiny po kryoprecipitac i a jiných čištěných frakcí). Všechnyj^pokusy byly prováděny při použití malého objemu vzorku vzhledem k objemu sloupce a/nebo malé rychlosti průtoku nebo při kombinaci obdu těchto opatření.
Filtrace na gelu jako prostředek pro frakcionaci bílkovin je známa od roku 1959 a je široce využívána v biochemických výzkumných laboratořích jako postup pro zjišťování vlastností bílkovin a čištění bílkovin ze vzorků s malým objemem, například meníším než 1 litr. Až dosud nebyl tento postup použit vé velkém měřítku pro frakcionaci plasmy « nebo dělení bílkovin, jedeným použitím bylo Odstranění solí z ethanolu a z^á albuminových roztoků. Uvádí se například:
Hlavním důvodem, proč se nestala filtrace na gelu hlavním í/ postupem při frakcionaci plajámy^ je nízký průtok bílkoviny v poměru k objemu sloupce -J.H.Berglof: Fřactionation by gel filtrát!on, str. 163 áž 173 v J.M.Curling : Methods in
Plasma Protein Fřactionation, Academie Press, Londýn 1980.
Jinde se uvádí:
Naneštěstí je množství bílkoviny, které je možno zpracovat pomocí sloupců s rozumným objemem malé a není možno zanedbat zředění vzorku. Z těchto důvodu není po&
stup příliš využíván při frakcionaci plasmy - J.J. Morganΐ’ thaler adalší :Preservationof structure and function du- *' ring isolation of human plasma proteine, str. 127-138 v Smit Sibinga a další: Plasma fracti on a ti on and Blood transfusion, Martinus Nijhoff Publishers, Boston 1985.
V US patentovém spisu č. 4 675 385 se popisuje • i způsob izolace faktoru 7111 ( protokoagulační bílkoviny) z plasmy s obsahem faktoru VIII nebo z preparátu pla^šmy, způsob izolace vysokomolekulárních složek a nízkomolekulárních složek postupnou vysoce účinnou chromatografií tak, že se v prvním stupni připraví ve vodném pufru roztok frakce plasmy a nízkomolekulární složky se oddělí na chromatografickém sloupci vysokotlakou kapalinovou chromatografií při použití částic materiálu o rozměru 13 až 35 /um, jako eluční Činidlo se užije vodný pufr,. Aby bylo zajištěno dobré oddělení, doporučuje se použití sloupců s poměrem délky k šířce 10 až 40, což snižuje kapacitu, avšak nezaručuje dobrou izolaci fakteru VIII od nízkomolekulárních složek plasmy.
Tato první izolace tedy nezajistí dobré oddělení bílkovin s účinností faktoru VIII:C od jiných bílkovinných složek plasmy, tbho je možno dosáhnout pouze provedením další vysokotlaké kapalinové chromatografie.
j Je. tedy zrajme, že až dosud je obecně přijímanou skutečností, Se filtrace na gelu saní vhodným postupem pro celení bílkovin při frakcionování plazmy, zejména v případe použití větších objemů, například nad 5 litrů.
Podstata vynálezu , . kyní bylo' neočekávaně nalezeno, že v případě, kdy ss volí materiál pro filtraci na pelu z prostředků, určených pro rychle průtoky, je možno izolovat faktor VLIT ve.for- .· ku přímo, z plszmy^^.
velmi šetrným mechanickým, dočtením, 'aniž by bylo zapotřebí
R· 'obvyklé počáteční-kjlyoprecipitsce.
Vynález se'tedy týká' způsobu isolování faktoru VIII ve formo komplexu faktoru VIII:C ε ν'ύΤ od jiných bílkovin krevní plazmy-'při použití gelové filtrac^.
M, to/Ěí/A t „ ·
Způsobydle tohoto vynálezu áétrzi v tom, že se izolovaná plasma nebo Čerstvě rozmražená plazmy podrobí gelóvé r- 4 * filtraci sa podmínek, obvyklých·' pro dělení do skupin při použití velkého zatížení sloupce a vysoké průtokové rychlosti, přičemž gelové filtrační prostředí se volí z částic, inertních vůči faktoru Vili 3 frakciona Čním rozmezím od
1. x Ičr a z do.
řrakčionačním 7
1.x.'10°, s výhodou od 1 x 10' sž do o x rozmezím může být například rozsahu 5 x 10‘ * 104 až 4 x 10
Při výhodném provedení odpovídá objem přidané plazmy alespoň 5%. objemu vrstvy vesloupci, ε ε výhodou činí tento objem plasmy 15 as 40% tohoto objemu.
ř
Způsob podle vynálezu se s výhodou provádí při použiti rychlosti průtoku alespoň 0,3 objemu vrstvy za hodinu, zvláště 0,5 až 2 objemy vrstvy za hodinu.
Pro účely vynálezu má mít prostředek pro filtr raci na gelu rigiditu, která umožní rychlou eluci* Mimoto \ ·* -f . .
musí“být*použitý“gel chemicky a imunologicky-inertní^vzhle- * dem k faktoru Vlil v průběhu filtrace. Pokusy ukázaly, že způsob podle vynálezu je možno provádět při použití běžně
MS dodávaných gelů jako jsou Sepharóse CL-4B, Sepharose CL-6B,
Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S-400, Sephacryl 1
S-500, Fractogel TSK HW-65(F) a Mat/řex Cellufine CGL 2000. Všechny tyto prostředky je možno použít pro účely vynálezu· Tyto typy gelů mají obvykle za vlhka velikost Částic v rozmezí 32 až 200 /um.
Podle jedi/oho provedeni způsobu podle vynálezu se zmrazená plasma nechá roztát a zajistí se rozpuštění veškerého množství faktoru VIII, načež se plasma s výhodou nanese na sloupec bezprostředně po rozpuštěni veškerého množství faktoru VIII. S výhodou se nenechá teplota vystoupit příliš vysoko, aby nedošlo k příliš velké degradaci faktoru VIII. Plácnu je možno předběžně zpracovávat například přidánim hepaiijnu, citrátu, sacharozy, aminokyselin, solí nebo jiných stabilizátorů a popřípadě zfiltrovat, odstředit, zahustit ultrafiltrací, předem srážet při použití běžných srážecích čjjnidel nebo předem zpracovávat jiným způsobem před nanesením na sloupec, pokud toto zpracování nemá podstatný i
il, vliv na pbsah faktoru VIII v plasmě.
- 11 Neočekávané bylo zjištěno, že způsob podle vynálezu poskytuje velmi vysoké výtěžky faktoru VIII, Je možno získat vlče než 70 % původního obsahu faktoru VIII v plasmě, mimoto metoda poskytuje velmi čisté produkty se specifickou účinnosti 1 až 4 IU faktoru VIII:C/mg bílkoviny.
• - · i- ... . , .
Tuto skutečnost je možno částečně vysvětlit tím, že způso· -I --«lÍtil· hfWMMiMp •p* •f’1'-·*·’ “* ·ΡΡ Μ - . η>^^·'·ΜΙΙΙ*·44ΙιΙμι ι i ‘bea podle vynálezu je'faktor VIII izolován také od proteolytických enzymů, které za obvyklých okolností způsobí pokles obsahu faktoru VIIÍ:C již v časných stadiích izolace.
Způsob podle vynálezu umožňuje zpracování velkých objemů pla/my tak, že je možno nanést velké množství nej^nou při vysoké rychlosti průtoku při vysokém výtěžku a také vysoké Čistotě, Jde tedy o velmi účinný postup, který je možno průmyslově využít. . . /
Frakce z filtrace na gelu, které obsahuji faktor VIII nebo spojené frakce z většího.množství filtrací^ je pak možno koncentrovat a dále čistit při použiti známých postupů jako jsou ultrafiltrace, srážení, iontoměničové postupy, afinitní chromatografie a podobně.
Zbývající pla/Žmatícké bílkoviny jako albumin, imunoglobuliny, komplex prothrombinu, antithrombin III a další je možno rovněž izolovat z dalších frakcí filtrace na gelu při použití známých postupů jako jsou srážení alkoholem, sráženi polyethylenglykolem, chromatografie a podobně.
Stanoveni účinnosti faktoru VIlJíC je možno provádět jako jednostupňové nebo dvoustupňové. Je známo, že každý z těchto postupů může poskytovat poněkud odlišné výsledky v tomtéž vzorku. Mimoto je známo, že při opakovaném stanovení stejným způsobem může rovněž-dojlt k určitému rožptylu naměřenýcbrhodnot pro účinnost faktoru-VIII:C.~~—
Pod pojmem plasma” se v průběhu přihlášky rozumí krev, z níž byly odstraněny všechny druhy krvinek a destičky například odstředěním.
Pod pojmem faktor VIII :Ag se rozumí ar ti gen, vztahující se k faktoru VIII a vWF-Ag je odpovídající antigen pro Villebrandův faktor.
Pod pojmem objem vrstvy se rozumí objem vrat vy použitého gelu v naplněném sloupci spolu s objemem kapalného prostředí, které tato vrstva obsahuje. Prázdný obi jem je definován jako objem pufru mezi Částicemi gelu, eluční objem je objem pufru, použitého k eluci specifické ho materiálu. Pod pojmem zatíženi sloupce se rozumí objem materiálu, naneseného na sloupec, přepočítaný na objem vrstvy a uvedený v procentech. Pod pojmem frakcionačnl rozmezí se rozumí rozmezí molekulových hmotností (globulárních) bílkovin nebo větších molekul, pro něž je gel doporučen výrobcem.
Způsob podle vynálezu bude dále osvětlen s při hlódnutím k přiloženým výkresům, které stejně jako příklady slouží k osvětlení způsobu podle vynálezu.
ι . '
Na obr. 1 je znázorněn graf, který ilustruje eluci faktoru VIII při filtraci na gelu způsobem podle vynálezu při stanovení různým způsobem.
Na obr. 2 je znázorněno pořadí eluce různých b - , > bílkovin plasmy při filtraci na gelu způsobem podle vy— “ ·*Η.·Χ-Φ··ι*·** * - *<- - «tt - **· * * - ' τ .· “ J||li*'*X' nálezu.
Příklad 1 ' lb
Filtrace plasmy na gelu k izolaci faktoru VIII
Sloupec o průměru 2,6 cm byl naplněn prostředkem Šepharojse CL-4B do výšky 60 cm.
Zmrazená plasma z dánské krevní banky byla rozmražena při teplotě 25 °C ve vodní lázni. Pak byla přidán&l Ϊ& heparinu/ml, 50 ml ( 16 % objemu vrstvy) plasmy bylo naneseno na sloupec, rychlost průtoku byla 100 ml za hodinu a pak byl sloupec vymýván pod tlakem množstvím 200 ml pufru za hodinu, cojí odpovídá rychlosti 0,63 objemu vrstvy za hodinu. Dosažení rovnovážného stavu a eluce byly prováděny při použití pufru ( 0,02 M citrát, 0,15 M NaCl, pH 7,4).
K pufru bylo dále přidáno 2,55 ml 1 ií CaClg na litr, to znamená koncentraci volných vápenatých iontů přibližně 7 x —5
M. Koncentrace volných vápenatých iontů byla ověřena použitím elektrody, selektivně citlivé na vápník (Ingrid
O
GmbH, Fankfurt nad Mohanem, SRN). Byly odebírány frakce a pro každou frakci bylo stanoveno množství faktoru
VIII:C.( při použití jednostupňovó koagulace i dvoustupňo ' /í'.
vého chroraogenního„stanovení),-Faktor VIII: Ag,-albumin;*“'·“·’' ft 'V » ' , . IR* ·’ . , 'γ ú
KiSs
IgG, fibrinogen, IgM, α-2-makroglQbulin» faktor IX, faktor X/ bílkvina C a antithrombin III. Bílkovina, měřená, při GD280 byla vymývána při prázdném objemu ( frakce 10 aj 18), pak následoval velký a široký vrchol ( frakce 19 až 50; obr. 1). Dvoustupňovou chromogennl zkouškou bylo zjištěno 82 % faktoru VIII:C, jednostupňovou koagulační zkouškou 91 % faktoru VIII:C, a to v jediném vrcholu společně s malým vrcholem pro bílkoviny. Zbytek faktoru VIII byl vymyt jako malý následný vrchol bezprostředně po hlavní frakci (frakce 19 až 26). Faktory VIII:Ag a vWF:Ag byly vymyty společně s faktorem VIII:C, avšak měly širší následné vrcholy. Všechny ostatní bílkoviny plasmy, které byly stanovenyybyly vymyty ve frakci, následující po frakci s obsahem faktoru VIII spolu s velkým a širokým vrcholem pro bílkoviny, jak je znᣠzorněno na obr. 2. Pla^matioké bílkoviny, které byly oddě• >
lény od faktoru VIII:C měly následující molekulové hmotnost ti:
| Antithrombin III | 65 | 000 | |
| Bílkovina C > | 62 | 000 | |
| Faktor X | 59 | 000 | |
| faktor IX | 57 | 000 | |
| α-2-makroglQbulin ' | ·£ | 718 | 000 |
| IgM | . 900 ‘^3 # _ | 000 | |
| ‘fibrinogen ‘ | 340 | 000 | |
| IgG | 150 | 000 | |
| albumin | ή X | 67 | 000 |
Stanovení účinnosti faktoru VIII:C při použití dvoustupňové chromogennl zkoušky bylo prováděno při použiti chromogenního substrátu ( KABI Coatěst Factor VIII), původní metoda s použitím zkumavek byla modifikována tak, aby bylo možno použít mikrotitrační plotny při nižSím množství reakčních složek. Zkouška se provádí při 37 °C. Užije se i vzorek s objemem 50 ^ul nebo standard s tímtéž objemem, po promísenl se 75/ul roztoku fosfolipidu, faktoru IXa, faktoru
Λ «ί fc *»·* _
X a CaClg se směs inkubuje při 37 °C na 15, minut, pak se přidá 50/ul substrátu. Po dalších 20 minutách inkubace při 37 °C se reakce zastaví přidáním 50/Ul ÍM kyseliny citrónové. Vzniklé zabarvení se odečítá při 405 nm, kontrola při 492 nm, lA
Stanovení účinnosti faktoru VIII:C jedno stupňovým způsobem se provádí při použití metody APTT (Activated
Partial Thromboplastin Time), lOO^ul vzorku nebo standardu se napipetuje do kývete, pak se přidá lOO^ul deficientní
V,.
plasmy ( chudé na faktor VIII, General Diagnostic) a roztok se uloží do thermostatu při 37 °C na 5 minut* Pak se přidá lOO^ul 0,03 11 chloridu vápenatého a stanoví se čas do vzni ku koagulace. ,
Pro kvantitativní stanovení byly připraveny kalibrační křivky na základě zřeáovací řady vnitřního standardu proti standardu WHO (3. mezinárodni standard F VIII, lidská plasma, 3,9 IU/M1), Dvoustupňová zkouška má přibližně lOx nižší mez detekce než zkouška jednostupňová, V přív pádě přidání heparinu je vhodné použít dvoustupňovou zkouš,*í?:
ku vzhledem k tomu, že je možné snadno ředěním vyloučit jakýkoliv případný vliv heparinu.
Faktor VIII:Ag byl stanoven při použití zkoušky ELISA s použitím protilátek nemocného s inhibitorem faktoru VIII jako povlaku na mikrotitaíaČních plotnách (Nunc, Kamstrup, 4 000 Roskilde, Dánsko) a při použití fragmentů F(ABÍ2, značených peroxidázou z téhož nemocného pro stanové ní vázaného faktoru VIII ( Thromb. Haemost,, 63(3), 1986, 346-350. Standardní křivky byly připraveny s použitím směsí normální plasmy, kalibrované proti standardu WHO (1, IRP, 1982).
Faktor vWF:Ag byl rovněž stanoven při použití zkoušky ELISA, avšak při použití králičí protilátky proti lidskému vffF (DAKO, Dánsko) jako povlaku a peroxidázou značené králičí protilátky proti lidskému vWF (DAKO, Dánsko) pro stanovení vázaného vffF. Standardní křivky byly získány při použití téže normální plasmy jako v případě zkoušky ELISA na faktor VIII:Ag.
~ Faktor*IX-byl-stanoven pomocí jednostupnové—— koagulační zkoušky obdobným způsobem jako faktor VIII?C s tím rozdílem, že byla užita plasma, deficientní na faktor IX.tIgG byl stanoven pomocí radiální imunodifuse ( Immunoóhemistry, 2, 1965, 235-254) a albumin, fibrinogen, α-2-makroglubulin, faktor X, bílkovina C a antithrombin III byly stanoveny pomocí speciální imunoelektroforézy (Anal. Biochem. 15, 1966, 45-52). θ&280 byla stanovena při použití spektrofotometru (Spectronic 601, Milron Roy Company) a bílkoviny pomocí Kjeldahlovy zkoušky byly stanoveny podle Ph. Eur., 2. vydání, I, Sv. 3.5.2 bez srážení TCA. Specifické účinnosti Čištěných frakcí byly vypočítány jako poměr koncent^ace faktoru VIII:C bud k OD280 &eb° koncentraci bílkoviny Kjeldahlovou metodou. Při použiti 0D280 pro vypočítání specifické účinnosti nejsou výsledky různých pokusů přímo srovnatelné vzhledem k tomu, že frakce^ obsahující faktor VIII jsou Často zakalené, jak je uvedeno také v publikaci Ratnoff a další, J. Clin, Invest. 48, 1969, 957-962.
Různé prostředky pro filtraci na gelu byly zlákány od následujících firem:
Sepharose CL-6B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose 6FF, Sepharose 4FF, Sephacryl S-400 a S/phacryl S-500 byly získány od Pharmacia (Hilleréd, Dánsko), Biogel A-5m,Fine byl získán od BioRad (Bie α Berntseh, Rhdovre, Dánsko), . Fractogel TSK Hff-65 (F) byl získán od Merck (Struers, Rhdovre, Dánsko) a Matrox Cellufine GCL 2000 byl získán od Ami—>
** ·. .4··:*» lllill ^ΤΊΒίι Γ' ~ΊίΙΤΓ · ''‘yVjriilílřjri/iTi . -J- - * ΜΟΠΤ. «ΜΗΜ·)·· ί·» - TW ‘ 'l· con (Helsingborg, Švédsko). ·
Příklad 2
Filtrace plasmy na gelu k izolaci faktoru Vlil při použití různých prostředků pro filtraci na gelu
J
Sloupec o průměru 2,6 cm byl naplněn různými prostředky pro filtraci na gelu s různým rozmezím frakcionace a různou strukturou. Ve všech případech byla konečná
Ž výška náplně 60 cm. Plasma byla rozmražena stejným způsobem jako v příkladu 1 a byla přidána 1 IU heparinu na ml. Při použití každého prostředku pro filtraci byle na sloupec naíl neseno 50 ml plasmy , tj. 16 % vrstvy. Zatížení sloupce a eluce pufrem byla prováděna podle příkladu 1· Průtoky byly ve všech případech stejné jako v v příkladu 1 s výjimkou použití prostředku Biogel A-5m, kde byla rjíshlost průtoku snížena na 50 ml za hodinu vzhledem ke zvýšenému zpětnému »
tlaku. Byly shromažďovány frakce a pro každou frakci byla stanovená hodnota ODggQ a VIII :C při použiti prostředku Coatest. Specifická účinnost hlavní frakce s obsahem faktoru VIII byla vypočítána jako poměr množství faktoru VIII:C/ml k ODggQ. Pokusy byly opakovány n-krát při použití —různých-druhů-plasmy v-každém jednotlivém případě a byly*vypočítány průměrné hodnoty pro výtěžky a pro specifickou ú... ... ,1 . ‘ ~ .. ». . , ' V · . *
Činnost. Hlavní frakce s obsahem faktoru VIII byla oddělena stejným způsobem jako v přikladu 1 a výtěžek byl stánor ven'jako obsah faktoru VIII:C v hlavní frakci s obsahem faktoru VIII v procentech obsahu faktoru VIII:C ve zpracovávané plasmě.
Frakcionační rozmezí a rozměry Částic pro různá prostředí pro filtraci na gelu spolu: s průměrnými hodnotami pro výtěžek a specifickou účinnost jsou uvedeny v tabulí- ’ ’ .· ' cel ř ‘ Pro jednotlivé materiály je v tabulce 1 užito následujících zkratek:
A:
0:
G:
I:
Sepharose CL-6B Sepharose 6FF Biogel A-5m Fine Matrox Cellufine
B: Sepharose E: Sepharose H: Fractogel
GCt 2000
CL-4B C: Sepharose CL-2B 4FF F: Sephacryl S-500 TSK Hff-65 (F)
J: Sephacryl S-400
| Tabulka | I Výtěžek Specif. | id . f.! Průměr částic za vlhka . * /um < *· f | |||
| Prostředek pro filtraci na gelu | Frakcionační rozmezí mol«hmotnosti | Počet pokusů n | |||
| % - | účinnost | ||||
| (Λκ/ J Ím·ΈΛ**τ'·ίρ **! £* - ... | ’·’ ·*»· ' | ||||
| A | 1x10’ - 4x10° | 3 | 95 | 0,16 | 40-165 Ί ΐ |
| B | 6xl04 - 8xl07 ' | 4 | 82 | 0,88 | 40-165 |
| C | 7xl05 - 4xl07 | 3 | 68 | 0,24 | 60-200 |
| D | lxlO4 - 4xl06 | 3 | 96 | 0,71 | 40-165 |
| E | 6xl04 - 2xl07 | 3 | “86 | 1,35 .1 | 40-165 |
| F | 6xl04 - 8xl07 | 3 | 91 | 0,28 | 40-105 |
| G | lxlO4 - 5xl06 v | 1 | 71 | 0,12 | 40-80 i |
| H | 5xl04 - 5xl06 | 2 | 84 | 0,18 | 32- 63 |
| I | lxlO4 - 3xl06 | 2 | 92 | 0,18 | 45-105 |
| J | lxlO4 - 8xl06 | 3 | 101 | 0,75 | 40-105 |
Příklad 3
Filtrace plasmy na gelu k izolaci faktoru VIII při použití různého zatížení sloupce
Sloupe.c o průměru 2,6 cm byl naplněn prostΛ ředkem Sepharose 4FF do konečné výšky vrstvy 60 cm. Plasma byla rozmražena způsobem podle příkladu 1. Po rozmražení
A' bylo pH plasmy upraveno na 7,0 přidáním 0,5 M HC1,bylazpridána 1;IU heparinu na ml a plasma byla zfiltrovárjy přes filtr s průměrem otvorů 10/um z nylonu. Na sloupec bylo naneseno č,:
30, 40, 50, 60 a 70 ml plasmy. Bylo užito podmínek z příkladu 1 s tím rozdílem, že pH pufru bylo upraveno na 7,0.
Byly odebírány frakce a pro každou frakci bylo stanoveno ODgSO ® množství faktoru VIII:'C (Coatest). Specifická účinnost'faktoru Vlil v hlavní frakci byla stanovena jako poměr faktoru VIII:C/ml k hodnotě OD
Pokusy byly třikrát oΙύ
280' pakovány při použiti tří různých vzorků plasmy pro každé zatížení a byly vypočítány průměrné hodnoty (x). Objem hlavní frakce s obsahem faktoru VIII v ml je ten objem uvedené frakce, který je možno odebrat před vymytím širokého hlavního vrcholu pro bílkoviny (QDgsO^* ^raltce se odebírá stejným způsobem jako v příkladu 1. Výtěžek se stanoví jakfo obsah faktoru VIII:C v hlavní frakci s obsahem faktoru VIII a uvádí se v procentech obsahu faktoru VIII:C ve zpracová£>
váné plasmě.
Takto získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce II.
Μ
| Tabulka II | Specifická účinnost -!$S Λϊ | ||||
| Λ’ Množství plašmy | Hl. frakce Výtěžek | ||||
| v ml | v % vrstvy | č.pokusu a ořúměr | faktoru VIII- ml | % | |
| 30 | .M . | . *70 | .88___ | ____0,81___4 | |
| 2 | 70 | 95 | 0,18 1 | ||
| 3 | 70 | 90 | 0,63 - | ||
| r | X | 70 | 91 | 0,54 | |
| 40 | 12,6 | 1 | 70 | 76 | 0,68 |
| 2, | 70 | 85 | 0,17 | ||
| 3 | 70 | 93 ' τ | 0,61 | ||
| X | 70 | 85 | 0,49 | ||
| 50 | 15,7 | 1 | 80 | 91 | 0,57 |
| 2 | 80 | 90 | 0,20 | ||
| 3 | 80 | 85 | 0,53 | ||
| X | 80 | 89 | 0.43 | ||
| 60 | 18,8 | 1 | 80 | 79 | 0,81 |
| 2 | 80 | 85 | 0,16 | ||
| 3 | 90 | 95 | 0,61 | ||
| X | 83 | 86 | 0,53 | ||
| 70 | 22,0 | 1 | 80 | 85 | 0,82 |
| 2 | 100 | 90 | 0,21 | ||
| 3 | 100 | 93 | 0,53 | ||
| X | 93 | 89 | 0,52 |
Příklad
Filtrace plasmy na gelu k izolaci faktoru Vlil při použití různé rychlosti eluce .
lo pH plasmy upraveno na 9,0 při použití 0,5M HCl, byla přidána 1 IU heparinu/ml a plasma byla zfiltrována přes nylonový filtr s průměrem Otvorů lO^um. Při použití tří různých •A' . · !* - , vzorků plapmy bylo užito rychlostí průtoku 100, 200 a 300 ml/h. Tatáž rychlost byla užita jak v průběhu přidávání pla/fI my, tak při následné eluci. Eluce byla prováděna při použití téhož pufru jako v přikladu 3. Byly odebírány frakce a pro každou frakci byla stanovena hodnota ODgSO a mno^s^vl faktoru VIII (Coátest). Specifická účinnost a výtěžek hlavní frakce s obsahem faktoru VIII byly vypočítány stejným způsobem jako v příkladu 3. Byly vypočítány také průměrné hodnoty (x) pro objem hlavní frakce s obsahem faktoru VIII, výtěžek a specifickou účinnost. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce III.
| 24 | |
| Tabulka | III |
| Rychlost průtoku v ml/h v podílu vrstvy/h | Vzorek plasmy č. | Hl.frakce f.VIII-ml | Výtěžek % | Specifická účinnost | |
| 100 | 0,31 | 1 | 80 | 89 | 0,75 J |
| 2 | 80 | 88 T | 0,17 | ||
| 3 | 80 | 80 | 0,65 | ||
| X | 80 | 86 | 0,52 | ||
| 200 | 0,63 | 1 | 80 | 84 | 0.99 |
| 2 | 80 | 88 | * 0,18 | ||
| 3 | 80 | 89 | 0,79 | ||
| X | 80 | 87 | 0,65 | ||
| 300 | 0,94 | 1 | 70 | 85 | 0,72 |
| • | 2 | 80 | 96 | 0,18 | |
| ‘ 3 | 80 | 83 | 0,44 | ||
| X | 77 | 8ft | 0,45 |
' '·1?ν
Příklad 5 » ·
Filtrace plasmy na gelu k izolaci faktoru VIII při použití různého zatížení sloupce
Sloupec s průměrem 10 cm byl naplněn prostředkem
Sepharose .4FF do konečné výšky“náplně 60*cm.’ Zmrazená plfyé'0 ma z dánské krevní banky byla rozmražena při teplotě 30 C na vodní lázni,.-Na sloupec bylo naneseno 925, 1497 a 2000 g
A plasmy. Průtok byl udržován na hodnotě 4200 ml/h v průběhu přidávání plasmy i eluce při použití čerpadla Masterflex * J (Buch α Holm, Herlev, Dánsko), rychlost průtoku byla 0,89 objemu vrstvy za hodinu, K elucí byl užit tentýž pufr jako v příkladu 1. θθ280 byla kontinuálně zaznamenávána při pou< žtií Pharmacia Monitor UV-1. Jakmile došlo ke stoupání hod•I noty ODggQ , začala být odebírána hlavní frakce S obsahem faktoru VIII. Odebírání této frakce bylo ukončeno v okamžiku, kdy z hodnoty ODggO bylo zřejmé, že začíná docházet k eluci hlavního širokého vrcholu pro bílkoviny, V hlavní frakci s obsahem faktoru VIII byl stanoven obsah faktoru VIII:C při použití jednostupúového koagulačního postupu, obsah bílkovin byl stanoven podle Kjeldahla. Specifická účinnost byla vypočítána jako pomér celkového počtu jednotek faktoru VIII:C v hlavní frakci s obsahem faktoru VIII k celkovému počtu mg bílkoviny v hlavní frakci s obsahem faktoru VIII, Výtěžek faktoru VlIIfC byl vypočítán jako obsah faktoru VIII : C v hlavní frakci s obsahem faktoru VIII v procentech obsahu ’
Λ ' faktoru VIII:C ve zpracovávané plasmě.
Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny v ýj následující tabulce IV, M
Tabulka IV
| Množství nanesené plasmy | Hl. frakce f.VIII v g | Výtěžek % | Specií létá účinnost IU/mg | |
| v « | v % objemu vrstvy | |||
| 925 | 19,6 | 1192 | 74 | ; 2,50 |
| 1497 | 31,8 | 1860 | 73 | 2,24 |
| 2000 | 42,2 | 2200 | 81 | 1,08 |
Přiklad 6 }ts -j
Filtrace plasmy na gelu k izolaci faktoru VIII při použití sloupce průmyslových rozměrů t t
c +
Sloupec o průměru 29 cm byl naplněn prostředkem
Sepharose 4FF. Po dosažení rovnovážného stavu při použití téhož pufru jako v příkladu 1 byla výška vrstvy gelu 53 cm.
- 27 10 kg zmrazené plagmy z dánské krevní banky bylo rozmraženo a zahřáto na 30 °C a pak naneseno na sloupec. Nanesené množství představovalo 28,8 % objemu vrstvy. Při použití čerpadla Masterflex byl udržován průtok 30 litrů/h, což odpovídá 0,86 objemu vrstvy za hodinu, a to v průběhu přidávání planiny i v průběhu eluce, která byla prováděna .puf-\ v R.rtl.inlWtymMi-frlrfť·· ·* ue.Íjw* ,□ M* Í „n -X*.- .. x..
·,, rem, užitým k dosažení rovnovážného stavu. Hodnota OD^qq byla kontinuálně sledována při použití přístroje Pharmacia ‘Monitor. UV-Ϊ kontinuálním způsobem, a jakmile doSlo k pevním známkám stoupání ODgao Ζ5*θ1·3 být odebírána hlavní frakce ,s obsahem faktoru VIII. Bylo získáno celkem 11,73 kg hlavní frakce s obsahem faktoru VIII. Obsah faktoru VIII:C byl stanoven pomocí jednostupňového koagulačního postupu, bílkovina byla stanovena podle Kjeldahla. V hlavní frakci s obsahem faktoru VIII bylo nalezeno celkem 8798 IU faktoru VIII:.C a méně než 2346 mg bílkoviny; výtěžek faktoru VIIIiC je tedy 880 ruAgHplasmy, což odpovídá výtěžku 88 % vé formě produktu se specifickou účinností vyšší než 3,75 IU/mg bílkoviny.
Takto získaný faktor VIII v hlavní frakci je možno dále Čistit způsobem, analogickým obvyklému čištění znovu rozpuštěného kryoprecipitátu, například dalším chromtografickým čištěním a lyofilizs.cí při použití běžných prostředků za získání stálého prostředku. Tento prostředek se před použitím rekonstituuje ve vhodném obvyklém nosiči.
Claims (5)
- lo Způsob isolování faktoru Vlil od jiných proteinů krevní plasmy sa použití prostředí gelové filtrace, vyznačující se -tím, že .se isolovaná plasma nebo čerstva roztálá zmrazená plazma, jež byla případně předem upravena potud, se případně pro* ru VIII vedená předběžná úprava nemá žádný zásadní. vliv na obsah ' · *· '“» r- C < 1 *|R x 4 MHL. - Jj- T-tt __ 4,41^^ _ faktoru VIII v plazmo, přímo zpracovává gelovou filtraci’ sa podmínek skupinového dělaní s tím, že objem přidané plasmy činí nejméně 5^ř a objemu·loze, -kdy-ž rychlost průtoku Siní nejméně 0,3 objemu lože aa hodinUj^^žtebíF^šs prostřsgelové filtrace představují Částečky inertní vůči fsktofrakcionačním rozmezím od 1.x 10^ do 1.x 10° a jímá no hlavní frakce.s faktorem Vili,
- 2 o Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím/ že ss jako orostředí pro gelovou filtraci neužije materiál Λ 7 s Sántečkami s frakcionačním rozmezím od 1 x 10' dc 3 x 10 .
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, r * 7 že se jako nrostředí pro gelovou filtraci použije, materiál > 4 7 s Částečkami s frakcionačním roamasím od 5- x 10' do 4 x-10 »
- 4o Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že objem plasmy, nanesená na sloupec, ss rovná 15 až 4 (Já ff/MÍ/ ~ 'I ob·)/vrstvy materiálu pro filtraci na gelu.
- 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím,. . , že rychlost průtoku se pohybuje v rozmezí od 0,5 až 2 objemy vrstvy materiálu pro filtraci na gelu aa hodinu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK562189A DK162233C (da) | 1989-11-09 | 1989-11-09 | Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ537190A3 true CZ537190A3 (cs) | 1998-05-13 |
Family
ID=8144000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS905371A CZ537190A3 (cs) | 1989-11-09 | 1990-11-01 | Způsob izolování faktoru VIII |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5245014A (cs) |
| EP (1) | EP0524172B1 (cs) |
| JP (1) | JP2509407B2 (cs) |
| CN (1) | CN1044121C (cs) |
| AT (1) | ATE118508T1 (cs) |
| AU (1) | AU631471B2 (cs) |
| BG (1) | BG61231B1 (cs) |
| CA (1) | CA2073012C (cs) |
| CZ (1) | CZ537190A3 (cs) |
| DE (1) | DE69017050T2 (cs) |
| DK (1) | DK162233C (cs) |
| ES (1) | ES2068404T3 (cs) |
| FI (1) | FI103510B1 (cs) |
| HU (1) | HU214905B (cs) |
| IE (1) | IE66836B1 (cs) |
| IL (1) | IL96277A (cs) |
| NO (1) | NO180741C (cs) |
| NZ (1) | NZ236004A (cs) |
| PL (1) | PL164894B1 (cs) |
| PT (1) | PT95830B (cs) |
| RU (1) | RU2055593C1 (cs) |
| SK (1) | SK537190A3 (cs) |
| UA (1) | UA29421C2 (cs) |
| WO (1) | WO1991007438A1 (cs) |
| YU (1) | YU47524B (cs) |
| ZA (1) | ZA908599B (cs) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2042138T3 (es) * | 1989-05-24 | 1993-12-01 | Miles Inc. | Filtracion en gel del factor viii tratado termicamente. |
| US5859204A (en) * | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6180371B1 (en) | 1996-06-26 | 2001-01-30 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5888974A (en) * | 1992-04-07 | 1999-03-30 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
| US7560107B2 (en) | 1996-06-26 | 2009-07-14 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6458563B1 (en) | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6531577B1 (en) * | 1997-12-15 | 2003-03-11 | Hemasure Denmark A/S | von Willebrand factor (vWF)-containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations |
| US6290527B1 (en) * | 1998-07-03 | 2001-09-18 | Nippon Telegraph And Telephone Corp. | Nippon telegraph and telephone corporation |
| US6586573B1 (en) | 1999-02-22 | 2003-07-01 | Baxter International Inc. | Albumin-free Factor VIII formulations |
| JP2002348300A (ja) * | 1999-04-12 | 2002-12-04 | Fujimori Kogyo Co Ltd | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子および血液凝固第ｖｉｉｉ因子／フォン・ビルブラント因子複合体の精製方法 |
| AUPR638801A0 (en) * | 2001-07-13 | 2001-08-09 | Life Therapeutics Limited | Factor viii separation |
| ES2449044T3 (es) | 2004-05-03 | 2014-03-18 | Emory University | Procedimiento de administración de fVIII sin dominio B porcino |
| CN101010333B (zh) * | 2004-08-27 | 2013-08-14 | 诺和诺德医疗保健公司 | 从生物材料中纯化凝血因子xⅲ多肽 |
| US20060226086A1 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Robinson Thomas C | Centrifuge for blood processing systems |
| AU2009313325B2 (en) * | 2008-11-07 | 2014-05-01 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Factor VIII formulations |
| BR112012024550B1 (pt) * | 2010-03-30 | 2020-12-08 | Octapharma Ag | processo de produção de uma proteína dependente de vitamina k livre de príons em uma sequência de purificação que emprega cromatografia |
| RU2445974C2 (ru) * | 2010-04-26 | 2012-03-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр ГНЦ РАМН | Способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека |
| KR101948337B1 (ko) | 2010-11-05 | 2019-02-14 | 박스알타 인코퍼레이티드 | 증가된 특이 활성도를 갖는 항혈우병 인자 ｖｉｉｉ의 신규 변이체 |
| CA2821711C (en) | 2010-12-15 | 2017-10-10 | Baxter International Inc. | Eluate collection using conductivity gradient |
| CN103506080A (zh) * | 2012-06-19 | 2014-01-15 | 汪志友 | 一种用于分离纯化凝血因子viii的介质及其制备方法 |
| CA2886326C (en) * | 2012-09-28 | 2021-11-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for evaluating blood coagulation reaction |
| US9663553B2 (en) | 2014-01-29 | 2017-05-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, immunoglobulins, clotting factor VIII and clotting factor IX) from human plasma |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
| US4543210A (en) * | 1984-10-04 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate |
| DK525384D0 (da) * | 1984-11-05 | 1984-11-05 | Nordisk Insulinlab | Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat |
| US4847362A (en) * | 1985-02-01 | 1989-07-11 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4675385A (en) * | 1985-03-27 | 1987-06-23 | Alpha Therapeutic Corporation | Isolation of human plasma procoagulant protein factor VIII from biological factors |
| US4758657A (en) * | 1985-07-11 | 1988-07-19 | Armour Pharmaceutical Company | Method of purifying Factor VIII:C |
| AT391808B (de) * | 1986-11-03 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf)-haeltigen fraktion |
| ATE112287T1 (de) * | 1987-12-21 | 1994-10-15 | Miles Inc | Faktor viii- gelfiltration. |
| WO1989009784A1 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-19 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Production of heat-stable factor viii concentrate |
| ES2042138T3 (es) * | 1989-05-24 | 1993-12-01 | Miles Inc. | Filtracion en gel del factor viii tratado termicamente. |
-
1989
- 1989-11-09 DK DK562189A patent/DK162233C/da not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-10-26 ZA ZA908599A patent/ZA908599B/xx unknown
- 1990-11-01 CZ CS905371A patent/CZ537190A3/cs unknown
- 1990-11-01 SK SK5371-90A patent/SK537190A3/sk unknown
- 1990-11-05 HU HU9201551A patent/HU214905B/hu unknown
- 1990-11-05 AT AT90917201T patent/ATE118508T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-05 UA UA94020494A patent/UA29421C2/uk unknown
- 1990-11-05 DE DE69017050T patent/DE69017050T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-05 AU AU67470/90A patent/AU631471B2/en not_active Ceased
- 1990-11-05 CA CA002073012A patent/CA2073012C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 JP JP3500067A patent/JP2509407B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 EP EP90917201A patent/EP0524172B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 WO PCT/DK1990/000279 patent/WO1991007438A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-05 RU SU905052211A patent/RU2055593C1/ru active
- 1990-11-05 ES ES90917201T patent/ES2068404T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-07 US US07/610,480 patent/US5245014A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-07 NZ NZ236004A patent/NZ236004A/xx unknown
- 1990-11-07 YU YU210590A patent/YU47524B/sh unknown
- 1990-11-08 IE IE402290A patent/IE66836B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 PT PT95830A patent/PT95830B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 IL IL9627790A patent/IL96277A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-09 PL PL90287703A patent/PL164894B1/pl unknown
- 1990-11-09 CN CN90109030A patent/CN1044121C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-08 BG BG96316A patent/BG61231B1/bg unknown
- 1992-05-08 FI FI922105A patent/FI103510B1/fi active
- 1992-05-08 NO NO921839A patent/NO180741C/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ537190A3 (cs) | Způsob izolování faktoru VIII | |
| Gralnick et al. | Studies of the human factor VIII/von Willebrand factor protein. III. Qualitative defects in von Willebrand's disease. | |
| Mazurier et al. | A new von Willebrand factor (vWF) defect in a patient with factor VIII (FVIII) deficiency but with normal levels and multimeric patterns of both plasma and platelet vWF. Characterization of abnormal vWF/FVIII interaction | |
| Sandset et al. | Depletion of extrinsic pathway inhibitor (EPI) sensitizes rabbits to disseminated intravascular coagulation induced with tissue factor: evidence supporting a physiologic role for EPI as a natural anticoagulant. | |
| US5288853A (en) | Factor viii purification process | |
| US5892005A (en) | High molecular and low molecular fractions of von willebrand factor | |
| JP2012211189A (ja) | 因子ｈ濃縮物の薬剤の形での使用 | |
| CA2189947C (en) | Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation | |
| EP0934748A2 (en) | Von Willenbrand factor (vWF)- containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations | |
| Facon et al. | Acquired type II von Willebrand's disease associated with adrenal cortical carcinoma | |
| NO324064B1 (no) | Farmasoytisk preparat omfattende vWF-propeptid samt fremgangsmate for fremstilling og anvendelse derav | |
| Mazurier et al. | In vitro evaluation of a very‐high‐purity, solvent/detergent‐treated, von Willebrand factor concentrate | |
| Holmberg et al. | Factor VIII: C and VIII: CAg response in patients with haemophilia A and von Willebrand's disease after administration of different factor VIII concentrates or plasma | |
| RU2734783C2 (ru) | Способ отделения фактора viii от продуктов крови | |
| JP2001506987A (ja) | フォンビルブラント因子誘導体及びタンパク質の単離法 | |
| Mazurier et al. | The role of fibronectin in factor VIII/von Willebrand factor cryoprecipitation | |
| Welbergen et al. | Purified Factor VIII: A high yield production method for routine Blood Banks | |
| HRP930277A2 (en) | A method for isolating biologically active compounds |