RU2055593C1 - Способ выделения фактора viii из других белков в плазме крови - Google Patents
Способ выделения фактора viii из других белков в плазме крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2055593C1 RU2055593C1 SU905052211A SU5052211A RU2055593C1 RU 2055593 C1 RU2055593 C1 RU 2055593C1 SU 905052211 A SU905052211 A SU 905052211A SU 5052211 A SU5052211 A SU 5052211A RU 2055593 C1 RU2055593 C1 RU 2055593C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- factor viii
- plasma
- volume
- gel filtration
- layer
- Prior art date
Links
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims abstract description 121
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 51
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 120
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 120
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 79
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 7
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 2
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 17
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 8
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 4
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 4
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012108 two-stage analysis Methods 0.000 description 4
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 3
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 3
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 3
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 3
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 3
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 3
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 3
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 2
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 2
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229940124135 Factor VIII inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- -1 complex proteins Chemical class 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011141 high resolution liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229950004257 ristocetin Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Networks Using Active Elements (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
Abstract
Использование: в медицине, медицинской промышленности, биохимии крови, для выделения фактора VIII из крови. Сущность изобретения: плазма крови подвергается гельфильтрации в условиях группового разделения с получением фракции, включающей фактор VIII с очень высоким выходом и практически не содержащей других белков. 5 з. п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.
Description
Изобретение относится к способу выделения биологических соединений, таких, как сложные белки, в частности коагулирующего фактора VIII из жидких содержимых организма, таких, как плазма крови, с использованием гель-фильтрации на первой стадии выделения.
Фактор VIII, также известный в качестве интигемофильного фактора А или AHF, представляет собой белок плазмы крови, который принимает участие в процессе коагуляции крови. Фактор VIII циркулирует в плазме крови в исключительно низкой концентрации в виде нековалентного комплекса из двух протеинов, имеющий активность коагулянта (фактор VIII:C) и активность кофактора ристоцетина (фактор Ван-Виллебранда (vWF), соответственно, упомянутого комплекса, имеющего мол.м. порядка 1-20 х 106 D.
У лиц, страдающих от нарушения кровотечения гомофилин А фактор VIII:C отсутствует или нарушен, он поражает примерно 5 из 100000 людей.
Фактор Виллебранда связывается с активированными тромбоцитами таким образом, что агрегация активированных тромбоцитов усиливается. Этот эффект может детектироваться вне организма агрегацией индуцированных ристоцетином тромбоцитов. Наряду с болезнью Виллебранда, пролонгированное время кровотечения наблюдается у пациентов из-за отсутствия или пониженного уровня биологической активности фактора Виллебранда.
Лечение больных, страдающих от гемофилии А, и пациентов, страдающих от тяжелых случаев заболевания болезнью Виллебранда, в настоящее время проводится концентратами, содержащими фактор VII:C/vWF. Это лечение значительно повышает жизнеспособность и трудоспособность и способствует увеличению продолжительности жизни этих пациентов.
Фармацевтические препараты, содержащие в себе фактор VIII (фактор VIII:C и/или vWF), могут получаться из крови или плазмы крови. Производство таких препаратов может осуществляться различными известными способами, которые характеризуются низким выходом особенно фактора VIII:C. Общим почти или всех является стадия первоначальной очистки, включающая криопреципитацию. Посредством криопрепипитации замороженная плазма оттаивает при температуре 0-4оС, что способствует повышению выхода преципитата, содержащего фактор VIII, который может собираться, например, центрифугированием. Даже если криопреципитация проводится относительно простым способом, она имеет существенный недостаток, так как при использовании в большом объеме, т.е. пулов плазмы крови, содержащих более 5 кг, дает низкий выход фактора VIII:C (30-45% от содержания плазмы). Это означает, что выход конечного продукта является низким независимо от того, какие стадии очистки будут использоваться в дальнейшем.
Далее, стадия инактивации вируса включается в производство препаратов, содержащих фактор VIII. Приемы инактивации вирусов в значительной степени повышают безопасность препаратов относительно вирусов, однако в большинстве случаев служат причиной дальнейшего понижения выхода фактора VIII:C.
Очень низкий общий выход фактора VIII привел к нехватке этих препаратов и поэтому существует необходимость в разработке новых способов очистки фактора VIII c высоким выходом в соответствии с требованиями в факторе VIII или лечения больных гемофилией.
Новые способы выделения фактора VIII непосредственно из плазмы крови с высоким выходом могли бы представлять большой интерес, поскольку вплоть до 70% содержимого фактора VIII в плазме крови теряется по криопрецидитации или в процессе таковой.
Была сделана попытка выделить фактор VIII непосредственно из плазмы крови, пользуясь афинной хроматографией (Thromb. Haemost. 61 (2), 234-237. 1989), однако выход составил менее 60% и удельная активность порядка 1 иммунизирующей единицы фактора VIII/мг протеина фракции выделенного фактора VIII.
Гель-фильтрация, также называемая гель-проникающей хроматографией или хроматографией исключения размера, представляет собой процесс с управляемой диффузией, который используется для сепарации растворенных веществ в соответствии с размером частиц. Растворенные вещества пропускаются через аппарат колонного типа, заполненный в качестве насадочного материала инертными частицами пористого геля, размер пор которого исключает прохождение самых крупных молекул, между тем как менее крупные молекулы диффундируют в стационарную фазу внутри частиц геля. Таким образом, самые крупные молекулы, будучи полностью исключенными из частиц геля, подвергаются элюции вначале "свободным объемом", между тем как менее крупные молекулы тратят более продолжительное время, проходя через аппарат колонного типа, и элюируют в соответствии с уменьшением размера при увеличении "объемов элюирования".
Гель-фильтрация может осуществляться двумя различными способами.
1. Способ группового разделения.
В способе группового разделения растворенные вещества (сорбаты) разделяются на две группы, имеющие большое различие размеров молекул, причем одна группа элюируется в свободном объеме, а другая группа элюируется позже в гораздо большем "объеме элюирования", часто близком к общему "объему слоя". Этот способ используется в основном для разделения белков и растворенных солей или для обмена буферного вещества, и называется "обессоливанием". Для "обессоливания" используются жесткие гели, имеющие малый размер пор. Этот процесс может осуществляться с использованием больших количеств материала (объем, составляющий 20-30% от объема слоя) и с использованием высокой скорости потока (примерно один объем буферного вещества в час). Таким образом, производительность аппарата колонного типа достаточно велика.
2. Способ фракционирования.
Этим способом разделяются растворенные вещества, имеющие одинаковую молекулярную массу. Этот способ часто используется для разделения белков. Для этой цели используются частицы геля, имеющие большие поры и выбирается такая гелевая фильтрующая среда, которая гарантирует элюирование белков между свободным объемом и объемом элюирования, соответствующим общему объему слоя. Эти вещества элюируются более строго, чем при групповом разделении и возможном перекрывании одного другим. Кроме того, высокие скорости потока являются нежелательными, так как это не позволяет эффективно отделять белки. Нагрузка аппарата колонного типа должна поддерживаться низкой для разделения различных белков. Таким образом гель-фильтрация, используемая в способе фракционирования, может применяться только для сепарации белков в качестве последнего этапа, где объем фракционирования мал.
Уже делались попытки выделить фактор VIII из плазмы крови способом гель-фильтрации (J. Lab. Clin. Med. 7236, 1968, 1007-1008 и J. Clin. Invest. 48, 1969, 957-962). Высокая степень очистки была достигнута во время экспериментов, однако выход составил лишь около 40-50% Было установлено, что чистота полученной фракции, содержащей фактор VIII, зависит от исходной плазмы, так как большое содержание липидов и хилемикрон способствовало образованию мутной фракции фактора VIII, имевшей пониженную специфическую активность. Применявшаяся техника гель-фильтрации не позволяла производить обработку больших количеств плазмы, даже если предварительные эксперименты показывали, что гель-фильтрация гораздо более концентрированной первой фракции Кона казалась возможной.
Кроме того, было ранее установлено, что фактор VIII мог бы выделяться из других белков плазмы крови при использовании гелевой среды Сефарозы 6В. Однако хроматография с применением гель-фильтрации казалась возможной только в больших объемах, когда повторно растворенный криопреципитат использовался в качестве исходного материала.
Был раскрыт процесс для разделения компонентов крови, использующий гель-фильтрацию и использующий пористые стеклянные шарики. Этот процесс специально предназначается для разделения иммунологически активных материалов от других компонентов в иммунной сыворотке или плазме крови.
После этого предпринималось несколько попыток использовать гель-фильтрацию для очистки фактора VIII, однако эти попытки сосредотачивались на гель-фильтрации частично очищенных фракций плазмы крови (повторно растворенного криопреципитата и далее его очищенных фракций). Все исследования проводились при использовании либо малых нагрузок аппарата колоннового типа, либо малых скоростей потоков, или комбинаций таковых.
Гель-фильтрация в качестве способа фракционирования белков была известна с 1959 года и широко используется в биохимических исследовательских лабораториях для характеристики белков и для очистки белков с малым объемом проб, например менее 1 л. Гель-фильтрация вплоть до предлагаемого способа не использовалась в большом масштабе для фракционирования плазмы крови при разделении белков. Единственным применением являлось обессоливание этанола и солей из альбуминных растворов. Таким образом, как утверждалось ранее, основной причиной, почему гель-фильтрация не стала главным способом для фракционирования плазмы крови является низкий выход белка на объем аппарата колонного типа. К сожалению, массы белков, которые могут обрабатываться, ограничены размерами аппаратов колонного типа, при этом нельзя пренебрегать разведением пробы. Поэтому способ не используется широко для фракционирования плазмы крови.
Известен процесс выделения прокоагулянта белка фактора VIII из препарата плазмы крови, содержащего фактор VIII компоненты с большой молекулярной массой и компоненты с малой молекулярной массой, последовательной высокоразрешающей хроматографией по размеру молекул путем приготовления, на первой стадии, буферного водного раствора препарата плазмы крови и отделения компонентов с низким молекулярным весом, посредством введения композиции в хроматографическую колонну высокоразрешающей жидкостной хроматографии, заполненную пористыми шариками, имеющими размер от около 13 мк до около 35 мк, и элюирования буферным водным элюентом. Для хорошего разделения в данном случае предлагается использование колонок, имеющих отношение высоты к ширине не ниже, чем между 10 и 40, что снижает пропускную способность, но не гарантирует хорошее отделение фактора VIII от белков плазмы крови с низкой молекулярной массой. Однако первое отделение не гарантирует хорошего разделения белков, показывающих активность фактора VIII:C, от других белковых компонентов препарата плазмы крови, которая получается только проведением второй жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД).
Таким образом, вплоть до настоящего времени, считалось что гель-фильтрация является неприемлемым способом для разделения белков при фракционировании плазмы крови, когда обрабатываются более крупные объемы, например более 5 л.
Неожиданно было установлено, что выбирая материалы для гель-фильтрации, которые были разработаны для высоких скоростей потока, представляется возможным выделить фактор VIII в виде чистой фракции с высоким выходом непосредственно из плазмы крови посредством очень мягкого механического разделения, не принимая в расчет первоначальную криопреципитацию.
Изобретение относится к способу выделения фактора VIII в виде комплекса фактор VIII:C и vWF из других белков плазмы крови с использованием гель-фильтрации.
Способ согласно изобретению заключается в том, что выделенная плазма или размороженная свежезамороженная плазма крови подвергается групповому разделению способом гель-фильтрации при использовании большой нагрузки и высокой скорости потока, причем среда для гель-фильтрации состоит из частиц, которые являются инертными относительно фактора VIII и имеют диапазон фракционирования в интервале от 1 х 103 до 1 х 108 и более предпочтительно от 1 х 104 до 8 х 107. Диапазон фракционирования может, например, находиться в интервале от 5 х 104 до 4 х 107.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения объем добавленной плазмы крови составляет по меньшей мере 5% от объема слоя. Количество добавленной плазмы крови предпочтительно составляет 15-40% от объема слоя.
Способ согласно изобретению осуществляется при скорости потока равном по меньшей мере 0,3 объема слоя в час, более предпочтительно, 0,5-2 объемов слоя в час.
В изобретении используется среда для гель-фильтрации, имеющая такую жесткость, которая дает быстрое элюирование. Более того, гель обязательно должен быть химически иммунологически инертным относительно фактора VIII при проведении гель-фильтрации. Эксперименты показали, что способ согласно изобретению может осуществляться при использовании таких гелей как Сефароза CL-4B, Сефароза CL-6B, Сефароза 4FF, Сефароза 6FF, Сефакрил S-400, Cефакрил S-500, Фрактогель TSK MW 65(F) и Матрекс Целлюфин CGL 2000, причем все эти гели пригодны для использования в изобретении. Подобные гели имеют размер частиц (смоченных), находящийся в интервале от около 32 мк до около 200 мк.
Согласно одному из вариантов осуществления предлагаемого способа замороженная плазма крови оттаивается, при этом гарантируется, что весь фактор VIII растворяется, после чего размороженная плазма подается в аппарат колонного типа сразу после полного растворения фактора VIII. Предпочтительно, чтобы температура не поднималась слишком высоко, во избежание слишком экстенсивного разложения фактора VIII. Перед подачей в колонну плазма крови может быть предварительно обработана, например, гепараном, цитратом, сахарозой, аминокислотой, солями или другими стабилизаторами и выборочно отфильтрована, центрифугирована, концентрирована посредством ультрафильтрации, подвергнута предварительному осаждению с использованием обычных предварительно осаждающих агентов, или предварительно обработана другим образом, но так, чтобы предварительная обработка не оказывала значительного влияния на содержание фактора VIII плазмы крови.
Предлагаемый способ неожиданно обнаружил высокий выход фактора VIII. Обычно более 70% фактора VIII плазмы крови восстанавливается в конечном продукте и этот способ позволяет получать очень чистые препараты, имеющие удельную активность от 1 до примерно 4 иммунизирующих единиц фактора VIII:C/мг белка. В некоторой степени это можно объяснить тем, что при использовании предлагаемого способа фактор VIII также отделяется от протеолитических ферментов, которые обычно могут служить причиной разложения фактора VIII:C в процессе выделения.
Предлагаемый способ позволяет обрабатывать большие количества плазмы крови при условии, что плазма поступает на гель-фильтрацию при использовании больших нагрузок и высоких скоростей потока, в результате получают высокую степень восстановления фактора VIII при высокой степени чистоты. Таким образом, предлагается очень эффективный способ, имеющий промышленную применимость.
Фракция (фракции), содержащая фактор VIII после гель-фильтрации, или объединенные фракции после многих гель-фильтраций затем могут концентрироваться и далее очищаться с использованием известных в технике способов, таких как ультрафильтрация, преципитация, ионный обмен, аффинная хроматография и т.п.
Оставшиеся белки плазмы крови, такие как альбумин, иммуноглобулины, протромбиновый комплекс, антитромбин III и другие, также могут быть выделены из более поздних фракций гель-фильтрация, при использовании известных способов таких, как преципитация спиртом, преципитация полиэтиленгликолем, хроматография и т.п.
Определение активности фактора VIII:C может осуществляться либо при использовании двухстадийного анализа, либо одностадийного анализа. Установлено, что одностадийный и двухстадийный анализы могут давать различные показатели активности фактора VIII:C в дроби. Более того, известно, что повторное определение при использовании одинакового анализа на одинаковой пробе могут давать в результате вариации в определении активности фактора VIII:C.
В данном описании используется выражение "плазма", что означает кровь, из которой удалены все форменные элементы и тромбоциты, например, посредством центрифугирования. Фактор VIII: Ag "означает связанный с фактором VIII антиген, и "vWF-Ag" обозначает связанный с фактором Ван-Виллебранда антиген.
"Объем слоя" определяется как объем уплотненной среды, содержащей гель, и межстеночной жидкости. "Свободный объем" определяется как объем буферного раствора между частицами геля, а "объем элюирования" представляет собой объем буферного раствора, используемого для элюирования специфического материала. Выражение "нагрузка аппарата колонного типа" используется, чтобы обозначать объем материала, добавленного к слою, подсчитанного как процент от объема слоя. Выражение "диапазон фракционирования" обозначает диапазон молекулярных масс (глобулярных) белков или более крупных молекул, для которых материал геля используется в качестве носителя.
На фиг.1 показан график, иллюстрирующий элюирование фактора VIII посредством гель-фильтрации согласно изобретению, определенное в разных опытах; на фиг.2 порядок элюирования различных белков плазмы крови посредством гель-фильтрации согласно изобретению.
П р и м е р 1. Гель-фильтрация плазмы для выделения фактора VIII.
Аппарат колонного типа с диаметром колонки 2,6 см заполнялся Сефарозой С 4В в качестве насадочного материала на высоту 60 см.
Замороженная плазма из датского банка крови оттаивалась до температуры 25оС на водяной бане. После добавления 1 иммунирующей единицы гепарина/мл 50 мл (16% от объема слоя) плазмы направлялось в аппарат колонного типа со скоростью потока 100 мл/ч, после чего аппарат колонного типа элюировался с использованием усиленного потока буферного раствора со скоростью 200 мл/ч, соответствующего 0,63 объема слоя в час. Приведение в равновесие аппарата колонного типа и элюирование проводились с использованием буферного раствора, 0,02 М цитрата, 0,13 М NaCl c pH 7,4. Затем к буферному раствору добавлялось 2,55 мл 1 М CaCl2 на литр, в результате концентрация свободных ионов кальция (Са2+) составляла примерно 7 х 10-5 М. Концентрация свободных ионов кальция проверялась с использованием селективного электрода кальция фирмы Ingel ГмбХ (Франкфурт на Майне. ФРГ). Фракции собирались и для каждой фракции определялись OD280 (OD оптическая плотность), фактор VIII:C (c использованием как одностадийного коагуляционного анализа, так и двухстадийного хромогенного анализа), фактор VIII:Ag, альбумин, иммуноглобулин G, фабриноген, иммуноглобулин М, альфа-2-макроглобулин, фактор IX, фактор X, протеин С и антитромбрин III. При измерении посредством OD280 белок элюировался при небольшом пике в свободном объеме (Фракции 10-1В), который сопровождается большим пиком с широкой вершиной (фракция 19-60, cf на фиг.1). Фактор VIII:C активностью 82% как было определено двухстадийным анализом, и фактор VIII:C активностью 91% как было определено одностадийным коагуляционным анализом, элюировались в одном общей пике в свободном объеме (основная фракция фактора VIII) совместно с самым ранним малым пиком белка. Остаток фактора VIII элюировался в небольшом последующем "хвосте" пика непосредственно за основной фракцией фактора VIII (фракция 19-26). Фактор VIII: Ag и vWF:Ag элюировались вместе с фактором VIII:C в пике, имеющем до некоторой степени более широкие последующие "хвосты". Все другие определяемые белки плазмы крови элюировались во фракции после основной фракции фактора VIII c большим широким пиком протеина (см. фиг.2). Белки плазмы крови отделялись от фактора VIII: C и имели следующие молекулярные массы: Антитромбин III 65,000 D Белок С 62,000 D Фактор Х 59,000 D Фактор IX 57,000 D Альфа-2-макроглобулин 718,000 D Иммуноглобулин М 900,000 D Фибриноген 340,000 D Иммуноглобулин 150,000 D Альбумин 67,000 D
Определение активности фактора VIII:C c использованием двухстадийного хромогенного анализа проводилось с использованием способа хромогенного субстрата (KABI coatest фактор VIII). Первоначальный способ, в котором используют тестируемые пробирки при 37оС, модифицировали, чтобы проводить способ с использованием плашек или микротитрования с пониженным использованием реагентов. Использовали 50-микролитровую или стандартную пробу, которую после смешивания с 75 мкл раствора фосфолипида, фактора IXa, фактора X и CaCl2, инкубировали при температуре 37оС в течение 15 мин, после чего добавлялось 50 мкл субстрата. После дальнейшей инкубации при 37оС в течение 20 мин эта реакция гасилась путем добавления 50 мкл 1 М лимонной кислоты. Проявление цвета считывалось при 405 нм, в то время как опорное считывание при 492 нм.
Определение активности фактора VIII:C c использованием двухстадийного хромогенного анализа проводилось с использованием способа хромогенного субстрата (KABI coatest фактор VIII). Первоначальный способ, в котором используют тестируемые пробирки при 37оС, модифицировали, чтобы проводить способ с использованием плашек или микротитрования с пониженным использованием реагентов. Использовали 50-микролитровую или стандартную пробу, которую после смешивания с 75 мкл раствора фосфолипида, фактора IXa, фактора X и CaCl2, инкубировали при температуре 37оС в течение 15 мин, после чего добавлялось 50 мкл субстрата. После дальнейшей инкубации при 37оС в течение 20 мин эта реакция гасилась путем добавления 50 мкл 1 М лимонной кислоты. Проявление цвета считывалось при 405 нм, в то время как опорное считывание при 492 нм.
Определение активности фактора VIII:C при использовании одностадийного анализа проводилось с использованием АРТТ-способа (Activated Partial Thromboplastin Time время образования частично активированного тромбопластина). Согласно этому способу 100-микролитровая проба (или стандарт) отмеривалась пипеткой в кюветы, после чего туда добавлялась 100-микролитровая проба недостающей плазмы (недостающая плазма фактора VIII, общая диагностика) и этот раствор выдерживался в термостате при 37оС в течение 5 мин. Затем добавлялось 100 мкл 0,03 М CaCl2 и определялось время до наступления коагуляции этого раствора.
Для количественных определений получают калибровочные кривые, описанные на серии разведений внутреннего стандарта, который градуируется по стандарту Всемирной организации здравоохранения (3-й Внутренний стандарт фактора VIII, плазмы крови человека, 3,9 иммунизирующей единицы/мл). Описанный двухстадийный анализ имеет пониженный (примерно в 10 раз) предел детектирования по сравнению с одностадийным анализом. При добавлении гепарина лучше использовать двухстадийный анализ, так как любое возможное влияние гепарина на анализ может быть устранено разбавлением.
Фактор VIII: Ag определялся способом ферментного иммуносорбентного анализа, использующего антитела от пациента ингибитора фактора VIII в качестве покрывающего материала на плашках или микротитрования (Nunc, Kamstrup, 4000 Roskilde, Denmark) и использующего фрагменты пероксилазы, маркированной F(AB2') от того же самого пациента ингибитора для определения связанного фактора VIII (Thromb. Haemost. 53 (3), 1985, 346-350). Стандартные кривые получались с использованием смешанной нормальной плазмы, градуированной по стандарту ВОЗ (1S+ IRP. 1982).
Фактор vWT: Ag также определялся при использовании ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), но с использованием кроличьего, противопоказанного для человека, фактора Ван-Виллебранда (фирма "ДАКО". Дания) в качестве покрывающего материала и пероксилазу, маркированную кроличий противопоказанный для человека фактор Ван-Виллебранда (фирма "ДАКО", Дания), для определения связанного фактора Ван-Виллебранда (vWF). Получались стандартные кривые при использовании одинаковой нормальной плазмы, как и для ферментного иммуносорбентного анализа для определения фактора VIII:Ag.
Фактор IX определялся при использовании одностадийного коагуляционного анализа аналогично тому, как определялся фактор VIII:C, только, пользуясь недостающей плазмой фактора IX. Иммуноглобулин G определялся при использовании радиальной иммунодиффузии (Immunochemistry, 2. 1965; 235-254), при этом альбумин, фибриноген, альфа-2-макроглобулин, фактор Х, белок С и антитромбин III определялись, пользуясь "ракетным" иммуноэлектрофорезом (Anal. Biochem. 15, 1966, c. 45-52).
OD280 определялась с использованием спектрофотометра (Spectronic 601 фирмы Milton Roy Company), а белок, содержащий фактор Кджелдаля, определялся (согласно Ph. Eur. 2-e издание, 1, Y. 3,5,2) без преципитации трикарбоновой (трихлоруксусной) кислотой. Удельная активность очищенных фракций вычислялась в виде отношения концентрации фактора VIII:C, либо к OD280, либо к концентрации белка, который определен, пользуясь фактором Кджелдаля. При использовании OD280 для вычисления удельной активности, результаты различных экспериментов не могут сравниваться непосредственно, если только не используется одинаковая исходная плазма, так как фракция, заключающая в себе фактор VIII, часто является мутной.
Различные среды для гель-фильтрации, применявшиеся в этих экспериментах, находились из следующих далее источников: Cефароза CL-6B, сефароза CL-4B, сефароза CL-2B, сефароза 6FF, сефароза 4FF, сефакрил S-400 и сефакрил S-500 были получены из фармацевтического предприятия (Hillerd, Denmark), биогель А-5m cверхтонкий материал был получен от фирмы "БиоРад" (Bie and Bernten Rdovu, Denmark, фрактогель TSK HW-65 был получен от фирмы "Мерк" (Struers, Rdovre, Denmark) и целлюфин "Матракс" GCL 2000 был получен от фирмы "Амикон" (Helsingborg, Sweden).
П р и м е р 2. Гель-фильтрация плазмы, чтобы выделить фактор VIII, пользуясь различными средами для гель-фильтрации.
Аппарат колонного типа, имеющий диаметр колонки 2,6 см, заполнялся различными средами для гель-фильтрации, имеющими различный диапазон фракционирования и различную структуру. Во всех случаях окончательная высота уплотненного слоя составляла 60 см. Плазма крови оттаивалась, как описано в примере 1, и добавлялась 1 иммунизирующая единица гепарина на 1 мл. Для каждой среды при проведении гель-фильтрации колонка нагружалась 50 мл плазмы (16% объема слоя). Загрузка аппарата колонного типа буферным раствором проводилась так, как описано в примере 1. Во всех случаях скорость потока была одинаковой, как констатировалось в примере 1, за исключением опыта, в котором применялся биогель А-5m, в этом опыте скорость потока понижалась до 50 мл/ч благодаря повышенному противодавлению. Фракции накапливались и для каждой фракции определялись, пользуясь "Коатестом", OD280 и фактор VIII:C. Удельная активность основной фракции фактора VIII вычислялась в виде отношения фактора VIII: C/мл к OD280. Эксперименты повторялись n раз, для каждой нагрузки использовались различные плазмы, и вычислялись средние значения выхода и удельной активности. Основная фракция фактора VIII выбиралась одинаковым методом, как описано в примере 1, и выход определялся по содержанию фактора VIII:C в основной фракции фактора VIII в процентном содержании фактора VIII: C добавленной плазмы.
Диапазон фракционирования и размер частиц различных сред и вычисленные средние значения приводятся в табл. 1.
П р и м е р 3. Гель-фильтрация плазмы для выделения фактора VIII c использованием различных нагрузок аппарата колонного типа.
Аппарат колонного типа с диаметром колонки 2,6 см заполнялся в качестве посадочного материала сефарозой 4FF до высоты 60 см. Плазма крови оттаивалась, как это описано в примере 1. После размораживания рН плазмы доводилось до 7,0, для чего использовалась 0,5 М HCl, добавлялась 1 иммунизирующая единица гепарина и плазма фильтровалась через 10-микронный нейлоновый фильтр. В аппарат колонного типа вводилось 30 мл, 40 мл, 50 л, 60 мл и 70 мл плазмы, соответственно. Все операции и элюирование проводились с использованием буферного раствора, как это описано в примере 1, хотя рН буферного раствора доводилось до 7,0. Фракции собирались и для каждой фракции определялись OD280 и фактор VIII:C, пользуясь "Коатестом". Удельная активность основной фракции фактора VIII вычислялась в виде отношения фактора VIII:C/мл к OD280. Эти эксперименты повторялись три раза, используя три различных плазмы крови для каждой нагрузки и вычислялись средние значения (Х). Объем основной фракции фактора VIII (мл) представляет объем фракции, заключающей в себе фактор VIII, которая может накапливаться перед большим широким пиком белка (OD280), затем элюируется и отделяется тем же способом, как описано в примере 1. Выход представляет содержание фактора VIII:C в основной фракции фактора VIII в виде процентного содержания фактора VIII:C добавленной плазмы.
Вычисленные показатели приведены в табл. 2.
П р и м е р 4. Гель-фильтрация плазмы для выделения фактора VIII при использовании различных скоростей элюирования.
В указанный аппарат колонного типа, аналогичный тому, который использовался в примере 3, добавлялось 50 мл плазмы, размороженной как описано выше. После размораживания рН плазмы доводилось до 7,0 при использовании 0,5 М HCl, затем добавлялась 1 иммунизирующая единица гепарина/мл и плазма фильтровалась через 10-микронный нейлоновый фильтр. Используя три различные части плазмы, проверялись три скорости потока 100, 200 и 300 мл/ч, соответственно. Во время добавления плазмы и последующего элюирования использовался одинаковый поток. Элюирование проводилось при использовании одного и того же буферного раствора, который описан в примере 3. Фракции собирались и для каждой фракции определялись OD280 и фактор VIII:C. Удельная активность и выход в основной фракции фактора VIII рассчитывались так, как указано в примере 3. Вычислялись средние значения (Х) объема основной фракции фактора VIII, выхода к удельной активности. Эти результаты приведены в табл. 3.
П р и м е р 5. Гель-фильтрация плазмы для выделения фактора VIII при различных нагрузках аппарата колонного типа.
Аппарат колонного типа, имеющий диаметр колонки 2,6 см, заполнялся Сефарозой 4FF до высоты столба 60 см. Замороженная плазма из Датского банка крови оттаивалась при 30оС в водной бане. 925 г, 1497 г и 2000 г, соответственно, подавались в аппарат колонного типа. Во время добавления и элюирования плазмы поток подавался в количестве примерно 42000 мл/ч, пользуясь шланговым насосом модели "Мастерфлакс" (Buch Holm, Herlev, Denmark), что соответствует примерно 0,89 объема слоя в час. Для элюирования использовался одинаковый буферный раствор, описанный в примере 1. Осуществлялся непрерывный контроль OD280, использовался фармацевтический монитор модели UV-1. Когда OD280 начинала повышаться в свободном объеме, начиналось накопление основной фракции фактора VIII и оно заканчивалось тогда, когда OD280 показывала, что начинает элюироваться большой пик белка. В основной фракции фактора VIII, пользуясь одностадийным коагуляционным анализом, определялись составляющие фракции фактора VIII:C, а белок определялся методом Кижелдаля. Удельная активность вычислялась в виде отношения общего числа единиц фактора VIII:C в основной фракции фактора VIII к общему числу миллиграммов белка в основной фракции фактора VIII. Выход фактора VIII:C вычислялся в процентах как содержание фактора VIII:C в основной фракции фактора VIII по отношению к содержанию фактора VIII:C в добавленной плазме.
Результаты приводятся ниже в табл. 4.
П р и м е р 6. Гель-фильтрация плазмы или выделения фактора VIII в промышленном аппарате колонного типа.
Аппарат колонного типа, имеющий диаметр колонны 29 см, заполнялся Сефарозой 4FF. После выхода на режим при использовании буферного раствора, описанного в примере 1, высота столба геля составляла 53 см. 10 кг замороженной плазмы из Датского банка крови оттаивалось и нагревалось до 30оС, после чего она добавлялась в аппарат колонного типа. Это добавленное количество составляло 28,8% от объема слоя. Во время добавления и элюирования плазма поступала в количестве 30 л/ч, соответствующем 0,86 объемов слоя в час, при этом использовался уравновешивающий буферный раствор. Величина OD280 контролировалась непрерывно при помощи фармацевтического монитора модели UV-1. Во время первой индикации скачка OD280 в свободном объеме осуществлялось накопление основной фракции фактора VIII. Всего было собрано 11,73 кг основной фракции фактора VIII. Затем определялось содержание фактора VIII:C посредством одностадийного коагуляционного анализа, а белок определялся по методу Кджелкаля. В основной фракции фактора VIII было обнаружено всего 8798 иммунизирующих единиц фактора VIII:C и менее чем 2346 мг белка, что составило выход фактора VIII: C порядка 880 иммунизирующих единиц на килограмм плазмы, соответствующий 88% выходу продукта, имеющего удельную активность более чем 3,75 иммунизирующих единиц на миллиграмм протеина.
Основная фракция фактора VIII, полученная в соответствии с предлагаемым способом, может затем подвергаться очистке известковым способом для получения стабильного препарата. Например, очищают повторно растворенный криопреципитат, путем хроматографической очистки и лиофилизации с использованием обычного наполнителя. Препарат повторно составляется с использованием подходящего традиционного наполнителя.
Claims (6)
1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФАКТОРА VIII ИЗ ДРУГИХ БЕЛКОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ, заключающийся в том, что фактор VIII добавляют в колонку, содержащую гель-фильтрующую среду, элюируют с помощью буферного раствора и затем очищают, отличающийся тем, что при выделении фактора VIII из больших объемов плазмы, плазму или оттаявшую свежезамороженную плазму, возможно предварительно обработанную в течение такого периода времени, чтобы не оказать значительного влияния на содержание фактора VIII данной плазмы, подвергают непосредственно гель-фильтрации в условиях группового разделения, при которой объем добавленной плазмы составляет по меньшей мере 5% от объема слоя и скорость потока составляет по меньшей мере 0,15 объема слоя в 1ч, затем фактор VIII элюируют, используя буферный раствор, при скорости потока по меньшей мере 0,3 объема слоя в 1ч, при этом среда для гель-фильтрации состоит из частиц, инертных относительно фактора VIII и имеющих диапазон фракционирования в интервале 1 • 103 - 1 • 108, затем фракцию, содержащую фактор VIII, элюированный в одном общем пике в свободном объеме, причем коагулирующая активность определена коагуляционным или хромогенным анализом, собирают.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда для гель-фильтрации состоит из материала геля, имеющего диапазон фракционирования в интервале 1 • 104 - 8 • 107.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что среда для гель-фильтрации состоит из материала геля, имеющего диапазон фракционирования в интервале 5 • 104 - 4 • 107.
4. Способ по одному из пп. 1 - 3, отличающийся тем, что объем добавленной плазмы составляет 15 - 40% от объема слоя.
5. Способ по одному из пп. 1 - 4, отличающийся тем, что скорость потока составляет 0,5 - 2,0 объема слоя в 1 ч.
6. Способ по одному из пп. 1 - 5, отличающийся тем, что для получения стабильного препарата полученный фактор VIII затем подвергают очистке способом, аналогичным обычной очистке повторно растворенного криопреципитата, например хроматографической очисткой и лиофилизацией с использованием обычных наполнителей.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK562189A DK162233C (da) | 1989-11-09 | 1989-11-09 | Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii |
DK5621/89 | 1989-11-09 | ||
PCT/DK1990/000279 WO1991007438A1 (en) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | A method for isolating factor viii |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2055593C1 true RU2055593C1 (ru) | 1996-03-10 |
Family
ID=8144000
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU905052211A RU2055593C1 (ru) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | Способ выделения фактора viii из других белков в плазме крови |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5245014A (ru) |
EP (1) | EP0524172B1 (ru) |
JP (1) | JP2509407B2 (ru) |
CN (1) | CN1044121C (ru) |
AT (1) | ATE118508T1 (ru) |
AU (1) | AU631471B2 (ru) |
BG (1) | BG61231B1 (ru) |
CA (1) | CA2073012C (ru) |
CZ (1) | CZ537190A3 (ru) |
DE (1) | DE69017050T2 (ru) |
DK (1) | DK162233C (ru) |
ES (1) | ES2068404T3 (ru) |
FI (1) | FI103510B (ru) |
HU (1) | HU214905B (ru) |
IE (1) | IE66836B1 (ru) |
IL (1) | IL96277A (ru) |
NO (1) | NO180741C (ru) |
NZ (1) | NZ236004A (ru) |
PL (1) | PL164894B1 (ru) |
PT (1) | PT95830B (ru) |
RU (1) | RU2055593C1 (ru) |
SK (1) | SK537190A3 (ru) |
UA (1) | UA29421C2 (ru) |
WO (1) | WO1991007438A1 (ru) |
YU (1) | YU47524B (ru) |
ZA (1) | ZA908599B (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2445974C2 (ru) * | 2010-04-26 | 2012-03-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр ГНЦ РАМН | Способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека |
RU2731720C2 (ru) * | 2010-03-30 | 2020-09-08 | Октафарма Аг | Способ очистки витамин к-зависимых белков, таких как коагуляционный фактор vii |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0399321B1 (en) * | 1989-05-24 | 1993-06-23 | Miles Inc. | Gel filtration of heat treated factor viii |
US5888974A (en) * | 1992-04-07 | 1999-03-30 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
US6180371B1 (en) | 1996-06-26 | 2001-01-30 | Emory University | Modified factor VIII |
US5859204A (en) * | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
US6458563B1 (en) | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
US7560107B2 (en) | 1996-06-26 | 2009-07-14 | Emory University | Modified factor VIII |
US6531577B1 (en) * | 1997-12-15 | 2003-03-11 | Hemasure Denmark A/S | von Willebrand factor (vWF)-containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations |
US6290527B1 (en) * | 1998-07-03 | 2001-09-18 | Nippon Telegraph And Telephone Corp. | Nippon telegraph and telephone corporation |
CZ307715B6 (cs) | 1999-02-22 | 2019-03-06 | University Of Connecticut | Způsob lyofilizace vodné farmaceutické formulace faktoru VIII prosté albuminu |
JP2002348300A (ja) * | 1999-04-12 | 2002-12-04 | Fujimori Kogyo Co Ltd | 血液凝固第viii因子および血液凝固第viii因子/フォン・ビルブラント因子複合体の精製方法 |
AUPR638801A0 (en) * | 2001-07-13 | 2001-08-09 | Life Therapeutics Limited | Factor viii separation |
ES2449044T3 (es) | 2004-05-03 | 2014-03-18 | Emory University | Procedimiento de administración de fVIII sin dominio B porcino |
US20080176789A1 (en) * | 2004-08-27 | 2008-07-24 | Novc Nordisk Healthcare A/G | Purification of Factor Xlll Polypeptides From Biological Materials |
US20060226086A1 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Robinson Thomas C | Centrifuge for blood processing systems |
TR201900207T4 (tr) | 2008-11-07 | 2019-02-21 | Baxalta GmbH | Faktör VIII Formülasyonları |
SG190136A1 (en) | 2010-11-05 | 2013-07-31 | Baxter Int | A new variant of antihemophilic factor viii having increased specific activity |
EP2652491B1 (en) | 2010-12-15 | 2017-11-29 | Baxalta GmbH | Eluate collection using conductivity gradient |
CN103506080A (zh) * | 2012-06-19 | 2014-01-15 | 汪志友 | 一种用于分离纯化凝血因子viii的介质及其制备方法 |
EP2902787B1 (en) * | 2012-09-28 | 2018-03-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for evaluating blood coagulation reaction |
US9663553B2 (en) * | 2014-01-29 | 2017-05-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, immunoglobulins, clotting factor VIII and clotting factor IX) from human plasma |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
US4543210A (en) * | 1984-10-04 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate |
DK525384D0 (da) * | 1984-11-05 | 1984-11-05 | Nordisk Insulinlab | Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat |
US4847362A (en) * | 1985-02-01 | 1989-07-11 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
US4675385A (en) * | 1985-03-27 | 1987-06-23 | Alpha Therapeutic Corporation | Isolation of human plasma procoagulant protein factor VIII from biological factors |
US4758657A (en) * | 1985-07-11 | 1988-07-19 | Armour Pharmaceutical Company | Method of purifying Factor VIII:C |
AT391808B (de) * | 1986-11-03 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf)-haeltigen fraktion |
ATE112287T1 (de) * | 1987-12-21 | 1994-10-15 | Miles Inc | Faktor viii- gelfiltration. |
WO1989009784A1 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-19 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Production of heat-stable factor viii concentrate |
EP0399321B1 (en) * | 1989-05-24 | 1993-06-23 | Miles Inc. | Gel filtration of heat treated factor viii |
-
1989
- 1989-11-09 DK DK562189A patent/DK162233C/da not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-10-26 ZA ZA908599A patent/ZA908599B/xx unknown
- 1990-11-01 SK SK5371-90A patent/SK537190A3/sk unknown
- 1990-11-01 CZ CS905371A patent/CZ537190A3/cs unknown
- 1990-11-05 AU AU67470/90A patent/AU631471B2/en not_active Ceased
- 1990-11-05 HU HU9201551A patent/HU214905B/hu unknown
- 1990-11-05 DE DE69017050T patent/DE69017050T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-05 WO PCT/DK1990/000279 patent/WO1991007438A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-05 ES ES90917201T patent/ES2068404T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 EP EP90917201A patent/EP0524172B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 CA CA002073012A patent/CA2073012C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 AT AT90917201T patent/ATE118508T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-05 RU SU905052211A patent/RU2055593C1/ru active
- 1990-11-05 UA UA94020494A patent/UA29421C2/ru unknown
- 1990-11-05 JP JP3500067A patent/JP2509407B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-07 YU YU210590A patent/YU47524B/sh unknown
- 1990-11-07 NZ NZ236004A patent/NZ236004A/xx unknown
- 1990-11-07 US US07/610,480 patent/US5245014A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-08 PT PT95830A patent/PT95830B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 IL IL9627790A patent/IL96277A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 IE IE402290A patent/IE66836B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-09 PL PL90287703A patent/PL164894B1/pl unknown
- 1990-11-09 CN CN90109030A patent/CN1044121C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-08 FI FI922105A patent/FI103510B/fi active
- 1992-05-08 BG BG96316A patent/BG61231B1/bg unknown
- 1992-05-08 NO NO921839A patent/NO180741C/no not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Патент США, N 4675385, кл. A 61K 37/547, 1987. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2731720C2 (ru) * | 2010-03-30 | 2020-09-08 | Октафарма Аг | Способ очистки витамин к-зависимых белков, таких как коагуляционный фактор vii |
RU2445974C2 (ru) * | 2010-04-26 | 2012-03-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр ГНЦ РАМН | Способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2055593C1 (ru) | Способ выделения фактора viii из других белков в плазме крови | |
FI106721B (fi) | Menetelmä ihmisen standardisoidun, korkean puhtauden omaavan von Willebrand -tekijän konsentraatin valmistamiseksi | |
US4341764A (en) | Method of preparing fibronectin and antihemophilic factor | |
EP0144957B1 (en) | Process for purifying factor viii:c | |
US5892005A (en) | High molecular and low molecular fractions of von willebrand factor | |
US6465624B1 (en) | Purification of von-Willebrand factor by cation exchanger chromatography | |
JP2009161547A (ja) | 高度に精製された第viii因子コンプレックス | |
CA2189947C (en) | Use of von willebrand factor and pharmaceutical formulation | |
JPH0424360B2 (ru) | ||
US6683159B2 (en) | Methods for producing factor VIII proteins | |
US4675385A (en) | Isolation of human plasma procoagulant protein factor VIII from biological factors | |
JPH08112095A (ja) | 組換えix因子から組換えプロix因子の分離方法 | |
US20220380439A1 (en) | Purification of fviii from plasma using silicon oxide adsorption | |
HRP930277A2 (en) | A method for isolating biologically active compounds | |
MXPA00008770A (en) | Improved methods for producing factor viii proteins |