JPH08112095A - 組換えｉｘ因子から組換えプロｉｘ因子の分離方法 - Google Patents
組換えｉｘ因子から組換えプロｉｘ因子の分離方法Info
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- JPH08112095A JPH08112095A JP7254950A JP25495095A JPH08112095A JP H08112095 A JPH08112095 A JP H08112095A JP 7254950 A JP7254950 A JP 7254950A JP 25495095 A JP25495095 A JP 25495095A JP H08112095 A JPH08112095 A JP H08112095A
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 効率がよく簡便で安全な作法で、組換え活性
ＩＸ因子から組換え不活性プロＩＸ因子を分離できる方
法を提供すること。 【解決手段】 組換えプロＩＸ因子およびＩＸ因子の両
タンパク質の混合物をイオン交換体またはアフィニティ
ーカラムに結合させ、塩濃度および／またはｐＨ値の異
なる緩衝液を用いて溶離すること。
ＩＸ因子から組換え不活性プロＩＸ因子を分離できる方
法を提供すること。 【解決手段】 組換えプロＩＸ因子およびＩＸ因子の両
タンパク質の混合物をイオン交換体またはアフィニティ
ーカラムに結合させ、塩濃度および／またはｐＨ値の異
なる緩衝液を用いて溶離すること。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は組換えＩＸ因子から
組換えプロＩＸ因子を分離する方法に関する。
組換えプロＩＸ因子を分離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】流体である血液が、血餅（すなわちその
形成によって損傷血管をふさぐゼラチン状凝塊）へと変
換するのが、血液凝固という現象である。その現象にお
いて、血漿中に存在する可溶性フィブリノーゲンは、繊
維状かつゼラチン状凝固物質であるフィブリンへと多段
階の反応工程（血液凝固カスケードと呼ばれる反応工
程）を経て変換される。その工程には、ローマ数字を付
して分類される少なくとも１５種の血液凝固因子が関与
し、それぞれの因子は、連鎖反応的に活性化して作動す
る。該血液凝固因子のうち、カルシウムイオン（ＩＶ因
子）、フィブリノーゲン（Ｉ因子）およびプロトロンビ
ン（ＩＩ因子）は常に血液中に循環しており、その他の
因子は組織の損傷によって活性化する（ＩＩＩ因子）か
またはコラーゲンあるいは血小板由来のリン脂質との接
触によって活性化する（ＸＩＩ因子）。これら以外の血
液凝固因子としては、カリクレインなどの幾つかのセリ
ンプロテアーゼ、トロンビン、および活性化ＶＩＩ，Ｉ
Ｘ，ＸおよびＸＩ因子が挙げられる。
形成によって損傷血管をふさぐゼラチン状凝塊）へと変
換するのが、血液凝固という現象である。その現象にお
いて、血漿中に存在する可溶性フィブリノーゲンは、繊
維状かつゼラチン状凝固物質であるフィブリンへと多段
階の反応工程（血液凝固カスケードと呼ばれる反応工
程）を経て変換される。その工程には、ローマ数字を付
して分類される少なくとも１５種の血液凝固因子が関与
し、それぞれの因子は、連鎖反応的に活性化して作動す
る。該血液凝固因子のうち、カルシウムイオン（ＩＶ因
子）、フィブリノーゲン（Ｉ因子）およびプロトロンビ
ン（ＩＩ因子）は常に血液中に循環しており、その他の
因子は組織の損傷によって活性化する（ＩＩＩ因子）か
またはコラーゲンあるいは血小板由来のリン脂質との接
触によって活性化する（ＸＩＩ因子）。これら以外の血
液凝固因子としては、カリクレインなどの幾つかのセリ
ンプロテアーゼ、トロンビン、および活性化ＶＩＩ，Ｉ
Ｘ，ＸおよびＸＩ因子が挙げられる。
【０００３】フォンビルブラント因子（血液凝固ＶＩＩ
Ｉ因子の成分のひとつである）が存在すると、血小板は
損傷した結合組織のコラーゲンに粘着する。粘着した血
小板は形態を変え、凝集塊として成長するが、これに加
えて、その塊の外層膜がさらなる血小板の接着を促進す
る。その後は、その粒状塊物から種々の物質が放出さ
れ、それによって血管の圧迫や、その他の血液凝固因子
の蓄積、活性化が引き起こされる。血友病は、特定の血
液凝固因子の欠損によって血液凝固が妨げられる疾病で
ある。血友病ＡではＶＩＩＩ因子の欠損、血友病Ｂでは
ＩＸ因子の欠損によって出血傾向が高くなる。該因子欠
損によって、正常血液凝固因子の合成が減少するか、あ
るいは血液凝固活性の低い異常因子が形成されるのであ
る。血友病の治療としては、保存血液から製造された濃
縮因子製剤を用いて欠損している血液凝固因子を補う方
法が行われている。
Ｉ因子の成分のひとつである）が存在すると、血小板は
損傷した結合組織のコラーゲンに粘着する。粘着した血
小板は形態を変え、凝集塊として成長するが、これに加
えて、その塊の外層膜がさらなる血小板の接着を促進す
る。その後は、その粒状塊物から種々の物質が放出さ
れ、それによって血管の圧迫や、その他の血液凝固因子
の蓄積、活性化が引き起こされる。血友病は、特定の血
液凝固因子の欠損によって血液凝固が妨げられる疾病で
ある。血友病ＡではＶＩＩＩ因子の欠損、血友病Ｂでは
ＩＸ因子の欠損によって出血傾向が高くなる。該因子欠
損によって、正常血液凝固因子の合成が減少するか、あ
るいは血液凝固活性の低い異常因子が形成されるのであ
る。血友病の治療としては、保存血液から製造された濃
縮因子製剤を用いて欠損している血液凝固因子を補う方
法が行われている。
【０００４】ヒトの血液凝固に関与するタンパク質性因
子の幾つかは、Ｃａ2+などの金属イオンに対する親和性
をもつ。この親和性は、血液凝固因子の機能において絶
対的に欠くことのできないものである。Ｃａ2+との結合
はグルタミン酸残基を介して起こり、それによって種々
の血液凝固因子のＮ末端領域のグルタミン酸残基（Ｇl
u）の幾つかが、ビタミンＫ依存性反応において４−カ
ルボキシ−Ｌ−グルタミン酸（Ｇla）に変換される［チ
ューリンスキー(A.Tulinsky)の「Thromb. Haemost」,６６
（１９９１年），１６〜３１を参照］。これらのＧla残
基は、ついで２価の金属イオンと結合する［フューリー
(B.Furie)およびフューリー(B.C.Furie)の「Cell」,５３
７（１９８８年），５０８〜５１８を参照］。
子の幾つかは、Ｃａ2+などの金属イオンに対する親和性
をもつ。この親和性は、血液凝固因子の機能において絶
対的に欠くことのできないものである。Ｃａ2+との結合
はグルタミン酸残基を介して起こり、それによって種々
の血液凝固因子のＮ末端領域のグルタミン酸残基（Ｇl
u）の幾つかが、ビタミンＫ依存性反応において４−カ
ルボキシ−Ｌ−グルタミン酸（Ｇla）に変換される［チ
ューリンスキー(A.Tulinsky)の「Thromb. Haemost」,６６
（１９９１年），１６〜３１を参照］。これらのＧla残
基は、ついで２価の金属イオンと結合する［フューリー
(B.Furie)およびフューリー(B.C.Furie)の「Cell」,５３
７（１９８８年），５０８〜５１８を参照］。
【０００５】ヒトのビタミンＫ依存性血液凝固因子の生
合成においては、Ｎ末端に特別のプレプロ配列を有する
前駆体分子がまず形成される。該プレプロ配列は、細胞
内での該前駆体タンパク質の輸送に志向性を与えるシグ
ナル配列である。このプレ配列は細胞からタンパク質が
分泌されるときに切断される。プロ配列は、約１５〜１
８個のアミノ酸からなり、グルタミン酸残基の４−カル
ボキシ−Ｌ−グルタミン酸への変換において認識配列と
して働く。連続的カルボキシル化反応の後、該プロ配列
もまた切断される。該プロ配列が切断されないか、ある
いは切断が不完全ならば、活性の低い血液凝固因子のみ
が得られる。ヒト血液凝固ＩＸ因子の分子量は約５５０
００ダルトンである。そのプロ配列は１８個のアミノ酸
からなり、そのために因子の分子量は約２０００ダルト
ン増加する。血漿からＩＸ因子の精製を行う場合、活性
ＩＸ因子がほとんど独占的に得られる。しかし、血漿か
らＩＸ因子の精製は、ＩＸ因子が血漿中に低濃度でしか
存在しないために非常に困難である［５μg／ml;アンダ
ーソン(L.O.Andersson)の「Thrombosis Research」,７
（１９７５年），４５１〜４５９を参照］。したがっ
て、血友病患者の治療には組換えＩＸ因子を利用できる
ようにするのが望ましい。
合成においては、Ｎ末端に特別のプレプロ配列を有する
前駆体分子がまず形成される。該プレプロ配列は、細胞
内での該前駆体タンパク質の輸送に志向性を与えるシグ
ナル配列である。このプレ配列は細胞からタンパク質が
分泌されるときに切断される。プロ配列は、約１５〜１
８個のアミノ酸からなり、グルタミン酸残基の４−カル
ボキシ−Ｌ−グルタミン酸への変換において認識配列と
して働く。連続的カルボキシル化反応の後、該プロ配列
もまた切断される。該プロ配列が切断されないか、ある
いは切断が不完全ならば、活性の低い血液凝固因子のみ
が得られる。ヒト血液凝固ＩＸ因子の分子量は約５５０
００ダルトンである。そのプロ配列は１８個のアミノ酸
からなり、そのために因子の分子量は約２０００ダルト
ン増加する。血漿からＩＸ因子の精製を行う場合、活性
ＩＸ因子がほとんど独占的に得られる。しかし、血漿か
らＩＸ因子の精製は、ＩＸ因子が血漿中に低濃度でしか
存在しないために非常に困難である［５μg／ml;アンダ
ーソン(L.O.Andersson)の「Thrombosis Research」,７
（１９７５年），４５１〜４５９を参照］。したがっ
て、血友病患者の治療には組換えＩＸ因子を利用できる
ようにするのが望ましい。
【０００６】組換え因子の発現に用いたＩＸ因子のＤＮ
Ａ配列にも前記プレプロ配列が含まれている。ＩＸ因子
を完全にプロセシングするために、該発現細胞系が量的
に十分にこれらのプレプロ配列切断し、生理的に活性な
血液凝固因子を分泌することがその系に対して期待され
る。しかし、ＩＸ因子の場合、プロ配列を切断するには
形質転換細胞の固有の潜在力が十分ではないということ
が確定している。したがって、組換えＩＸ因子を生産す
るために種々の努力が行われたが、低活性の産物しか得
られていない［カウフマン(R.J.Kaufman)らの「J. Biol.
Chem.」,２６１（１９８６年），９６２２〜９６２８；
バスビー(S.Busby)らの「Nature」,３１６（１９８５
年），２１７〜２７３；リース（D.J.G.Rees）らの「EMB
O J.」,７（１９８８年），２０５３〜２０６１を参
照］。組換え技術を用いて生産されたプロＩＸ因子とＩ
Ｘ因子の混合物が細胞上清液中に存在することから、低
活性の原因がプロ配列の不完全な切断によるものである
という結論に到達できる。［ミュリエン(P.Meulien)ら
の「Prot.Engineer.」,３（１９９０年），６２９〜６３
３を参照］。
Ａ配列にも前記プレプロ配列が含まれている。ＩＸ因子
を完全にプロセシングするために、該発現細胞系が量的
に十分にこれらのプレプロ配列切断し、生理的に活性な
血液凝固因子を分泌することがその系に対して期待され
る。しかし、ＩＸ因子の場合、プロ配列を切断するには
形質転換細胞の固有の潜在力が十分ではないということ
が確定している。したがって、組換えＩＸ因子を生産す
るために種々の努力が行われたが、低活性の産物しか得
られていない［カウフマン(R.J.Kaufman)らの「J. Biol.
Chem.」,２６１（１９８６年），９６２２〜９６２８；
バスビー(S.Busby)らの「Nature」,３１６（１９８５
年），２１７〜２７３；リース（D.J.G.Rees）らの「EMB
O J.」,７（１９８８年），２０５３〜２０６１を参
照］。組換え技術を用いて生産されたプロＩＸ因子とＩ
Ｘ因子の混合物が細胞上清液中に存在することから、低
活性の原因がプロ配列の不完全な切断によるものである
という結論に到達できる。［ミュリエン(P.Meulien)ら
の「Prot.Engineer.」,３（１９９０年），６２９〜６３
３を参照］。
【０００７】現在までに、生理的に活性な組換えＩＸ因
子を回収するために行われた改良は、プロ配列の遺伝子
操作に手を加えることだけである。かくして、プロ配列
の切断がより効率良く行われるように、ＶＩＩ因子のプ
ロ配列をＩＸ因子のＤＮＡ配列に結合することが企てら
れた［バークナー(K.Berkner)らの「ビタミンＫ研究にお
ける今日の進歩(Current Advances in Vitamin K Resea
rch」,エルセビア(Elsevier)・サイエンス・パブリシン
グ・カンパニ・インコーポレイテッド（１９８８年），
１９９〜２０７を参照］。ミュリエンらの「Prot.Engine
er.」,３（１９９０年），６２９〜６３３では、ＩＸ因
子のプロペプチド切断部位の領域における突然変異の影
響の試験が行われている。そこでは、＋１位置における
点変異の導入（アラニン／チロシン）によって、野生型
のＩＸ因子［ＤＥＡＥ−セフェロデックス（Sepherode
x:登録商標)カラムを用い、生理的ｐＨ範囲で、０.３Ｍ
ＮａＣｌで段階溶出を行って精製した後のＩＸ因子の
特異的活性は４５〜５５％］と比較して、ＩＸ因子の収
量が明らかに増加することが測定され、組換えＩＸ因子
の特異的活性は８５〜１００％であった。
子を回収するために行われた改良は、プロ配列の遺伝子
操作に手を加えることだけである。かくして、プロ配列
の切断がより効率良く行われるように、ＶＩＩ因子のプ
ロ配列をＩＸ因子のＤＮＡ配列に結合することが企てら
れた［バークナー(K.Berkner)らの「ビタミンＫ研究にお
ける今日の進歩(Current Advances in Vitamin K Resea
rch」,エルセビア(Elsevier)・サイエンス・パブリシン
グ・カンパニ・インコーポレイテッド（１９８８年），
１９９〜２０７を参照］。ミュリエンらの「Prot.Engine
er.」,３（１９９０年），６２９〜６３３では、ＩＸ因
子のプロペプチド切断部位の領域における突然変異の影
響の試験が行われている。そこでは、＋１位置における
点変異の導入（アラニン／チロシン）によって、野生型
のＩＸ因子［ＤＥＡＥ−セフェロデックス（Sepherode
x:登録商標)カラムを用い、生理的ｐＨ範囲で、０.３Ｍ
ＮａＣｌで段階溶出を行って精製した後のＩＸ因子の
特異的活性は４５〜５５％］と比較して、ＩＸ因子の収
量が明らかに増加することが測定され、組換えＩＸ因子
の特異的活性は８５〜１００％であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、効率がよく簡便で安全な作法で、組換え活
性ＩＸ因子から組換え不活性プロＩＸ因子を分離できる
方法を開発することである。
する課題は、効率がよく簡便で安全な作法で、組換え活
性ＩＸ因子から組換え不活性プロＩＸ因子を分離できる
方法を開発することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、請求項１に記
載の組換えＩＸ因子から組換えプロＩＸ因子をクロマト
グラフィーを用いて分離する方法に関する。このクロマ
トグラフィーによる分離は、プロＩＸ因子およびＩＸ因
子の両タンパク質の混合物をイオン交換体に結合させ、
塩濃度および／またはｐＨ値の異なる緩衝液を用いて別
々に溶出させることにより行う。また、該クロマトグラ
フィーによる分離は、一方のタンパク質が量的に十分に
結合するカラムを用い、他方のタンパク質を溶出液から
回収することによって行うこともできる。結合した方の
タンパク質はついで別の緩衝液組成物で溶出することが
できる。本発明方法の好ましい具体例を請求項２〜１８
に記載する。
載の組換えＩＸ因子から組換えプロＩＸ因子をクロマト
グラフィーを用いて分離する方法に関する。このクロマ
トグラフィーによる分離は、プロＩＸ因子およびＩＸ因
子の両タンパク質の混合物をイオン交換体に結合させ、
塩濃度および／またはｐＨ値の異なる緩衝液を用いて別
々に溶出させることにより行う。また、該クロマトグラ
フィーによる分離は、一方のタンパク質が量的に十分に
結合するカラムを用い、他方のタンパク質を溶出液から
回収することによって行うこともできる。結合した方の
タンパク質はついで別の緩衝液組成物で溶出することが
できる。本発明方法の好ましい具体例を請求項２〜１８
に記載する。
【００１０】本発明の別の態様は、請求項１９〜２０に
記載のプロＩＸ因子を含まない高純度組換えＩＸ因子で
あり、該ＩＸ因子は本発明方法によって得ることができ
る。好ましい具体例においてＩＸ因子抗原の活性ＩＸ因
子に対する比率は≦１.１である。
記載のプロＩＸ因子を含まない高純度組換えＩＸ因子で
あり、該ＩＸ因子は本発明方法によって得ることができ
る。好ましい具体例においてＩＸ因子抗原の活性ＩＸ因
子に対する比率は≦１.１である。
【００１１】本発明のさらに別の態様は、請求項２２ま
たは２３に記載のＩＸ因子を含まない高純度組換えプロ
ＩＸ因子であり、該プロＩＸ因子はＩＸ因子に対するア
ンタゴニストとして治療用医薬として用いるいることが
でき、該医薬は本発明方法によって得ることができる。
たは２３に記載のＩＸ因子を含まない高純度組換えプロ
ＩＸ因子であり、該プロＩＸ因子はＩＸ因子に対するア
ンタゴニストとして治療用医薬として用いるいることが
でき、該医薬は本発明方法によって得ることができる。
【００１２】本発明のさらに別の態様は、請求項２４に
記載の生理学的に許容しうる担体中に高純度ＩＸ因子を
含むことを特徴とする医薬組成物、ならびに請求項２５
に記載の生理学的に許容しうる担体中に高純度プロＩＸ
因子を含むことを特徴とする医薬組成物である。
記載の生理学的に許容しうる担体中に高純度ＩＸ因子を
含むことを特徴とする医薬組成物、ならびに請求項２５
に記載の生理学的に許容しうる担体中に高純度プロＩＸ
因子を含むことを特徴とする医薬組成物である。
【００１３】細胞培養培地中でＶero細胞（サル腎細
胞）をワクシニアウイルスに感染させた後、通例の方法
に従って組換えＩＸ因子を回収した。Ｖero／ワクシニ
ア発現系および細胞培養条件は、ファルクナー(F.G.Fal
kner)らの「血栓症と鬱血」,６８（１９９２年），１１９
〜１２４；バレット(N.Barrett)らの「AIDS Res.」,５(１
９８９年),１５９〜１７１；およびドーナー(F.Dorner)
らの「エイズワクチンの研究と臨床試験(AIDS Vaccine R
esearch and Clinical Trials)」,マーセル・デッカー
（Marcel Dekker）・インコーポレイテッド，ニューヨ
ーク（１９９０年）に記載されている。組換えＩＸ因子
は、合成ＤＭＥＭ標準培地（ダルベッコ最小必須培地）
において発現する。培養上清液は、遠心分離によって分
離した。アンダーソンの上述引用文献に記載の方法など
の通例の方法により無細胞培養培地から組換えＩＸ因子
を精製した。結果的に、組換えＩＸ因子とプロＩＸ因子
の混合物が得られる。
胞）をワクシニアウイルスに感染させた後、通例の方法
に従って組換えＩＸ因子を回収した。Ｖero／ワクシニ
ア発現系および細胞培養条件は、ファルクナー(F.G.Fal
kner)らの「血栓症と鬱血」,６８（１９９２年），１１９
〜１２４；バレット(N.Barrett)らの「AIDS Res.」,５(１
９８９年),１５９〜１７１；およびドーナー(F.Dorner)
らの「エイズワクチンの研究と臨床試験(AIDS Vaccine R
esearch and Clinical Trials)」,マーセル・デッカー
（Marcel Dekker）・インコーポレイテッド，ニューヨ
ーク（１９９０年）に記載されている。組換えＩＸ因子
は、合成ＤＭＥＭ標準培地（ダルベッコ最小必須培地）
において発現する。培養上清液は、遠心分離によって分
離した。アンダーソンの上述引用文献に記載の方法など
の通例の方法により無細胞培養培地から組換えＩＸ因子
を精製した。結果的に、組換えＩＸ因子とプロＩＸ因子
の混合物が得られる。
【００１４】本発明方法においては、イオン交換体とし
て、天然および合成の親水性ゲルを用いることができ
る。強いアニオン交換基を持つゲルを用いるのが好まし
く、たとえば天然ゲルとしては、ＱＡＥ（ＱＡＥ−セフ
ァデックス（登録商標）：Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−１−プロピル）アミノ−エチル基を導入
して修飾したデキストランゲルからなる強塩基性アニオ
ン交換体）、ＤＥＡＥ（ＤＥＡＥセルロース：ジエチル
アミノエチルセルロース）またはＴＭＡＥ（ＴＭＡＥセ
ルロース：トリエチルアミノエチルセルロース）が挙げ
られる。また、本発明方法においては、イムノアフィニ
ティークロマトグラフィーも適当であり、プロＩＸ因子
のプロペプチドを結合するか、またはＩＸ因子を選択的
に結合する抗体のいずれかを適当なマトリックス上に固
定して用いる。モノクローナルおよびポリクローナル抗
体の両方が適当である。
て、天然および合成の親水性ゲルを用いることができ
る。強いアニオン交換基を持つゲルを用いるのが好まし
く、たとえば天然ゲルとしては、ＱＡＥ（ＱＡＥ−セフ
ァデックス（登録商標）：Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−１−プロピル）アミノ−エチル基を導入
して修飾したデキストランゲルからなる強塩基性アニオ
ン交換体）、ＤＥＡＥ（ＤＥＡＥセルロース：ジエチル
アミノエチルセルロース）またはＴＭＡＥ（ＴＭＡＥセ
ルロース：トリエチルアミノエチルセルロース）が挙げ
られる。また、本発明方法においては、イムノアフィニ
ティークロマトグラフィーも適当であり、プロＩＸ因子
のプロペプチドを結合するか、またはＩＸ因子を選択的
に結合する抗体のいずれかを適当なマトリックス上に固
定して用いる。モノクローナルおよびポリクローナル抗
体の両方が適当である。
【００１５】溶出は、塩濃度またはｐＨ値の異なる緩衝
液あるいはそれらを組み合わせた緩衝液で行うことがで
きる。このような溶離剤としては、５．０〜１０．０の
範囲でｐＨ値が異なる溶液を用いるのが好ましい。塩濃
度の異なる緩衝液を用いた溶出は、１価のカチオンを含
む緩衝液で行うのが好ましく、ＮａＣｌが好ましい。塩
濃度は、１０〜１０００mＭの範囲にあるのが好まし
く、１５０〜４００mＭの範囲が特に好ましい。緩衝液
の組成を変化させることによるイムノアフィニティーカ
ラムからの結合タンパク質の溶出は、無機または有機塩
（ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＫＳＣＮまたは尿素を用いる
のが好ましい）あるいは疎水性剤（エチレングリコール
など）を添加して行う。塩濃度は、５００mＭ〜３．５
Ｍの範囲が好ましく、１．０〜３．５Ｍの範囲が特に好
ましい。疎水性剤の濃度は、０．１〜５０重量％の範囲
が好ましく、０．１〜１０重量％が好ましい。緩衝組成
物の変化は、該緩衝液のｐＨ値を変化させることによっ
て行うこともでき、７以下（５．０以下が好ましい）に
降下させるか、あるいは８．０以上（９．０）に上昇さ
せることが可能である。
液あるいはそれらを組み合わせた緩衝液で行うことがで
きる。このような溶離剤としては、５．０〜１０．０の
範囲でｐＨ値が異なる溶液を用いるのが好ましい。塩濃
度の異なる緩衝液を用いた溶出は、１価のカチオンを含
む緩衝液で行うのが好ましく、ＮａＣｌが好ましい。塩
濃度は、１０〜１０００mＭの範囲にあるのが好まし
く、１５０〜４００mＭの範囲が特に好ましい。緩衝液
の組成を変化させることによるイムノアフィニティーカ
ラムからの結合タンパク質の溶出は、無機または有機塩
（ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＫＳＣＮまたは尿素を用いる
のが好ましい）あるいは疎水性剤（エチレングリコール
など）を添加して行う。塩濃度は、５００mＭ〜３．５
Ｍの範囲が好ましく、１．０〜３．５Ｍの範囲が特に好
ましい。疎水性剤の濃度は、０．１〜５０重量％の範囲
が好ましく、０．１〜１０重量％が好ましい。緩衝組成
物の変化は、該緩衝液のｐＨ値を変化させることによっ
て行うこともでき、７以下（５．０以下が好ましい）に
降下させるか、あるいは８．０以上（９．０）に上昇さ
せることが可能である。
【００１６】本発明方法においては、塩濃度勾配の上昇
および／またはｐＨ勾配の降下によってプロＩＸ因子お
よびＩＸ因子の溶出を行う。プロＩＸ因子は、ＩＸ因子
の溶出よりも低い塩濃度または高いｐＨ値で溶出され
る。本発明に従って得られる活性ＩＸ因子に対するＩＸ
因子−抗原の比率は、１.１より低いかまたは等しいの
が好ましい。本発明に従って、プロＩＸ因子を含まない
（すなわち純度が９５％以上、特に好ましくは９８％以
上）組換えＩＸ因子を、効率よく簡便な作法で得ること
ができる。ＩＸ因子を含まない（すなわち純度が９５％
以上、特に好ましくは９８％以上）組換えプロＩＸ因子
もまた、本発明の効率よく簡便な作法で得ることができ
る。
および／またはｐＨ勾配の降下によってプロＩＸ因子お
よびＩＸ因子の溶出を行う。プロＩＸ因子は、ＩＸ因子
の溶出よりも低い塩濃度または高いｐＨ値で溶出され
る。本発明に従って得られる活性ＩＸ因子に対するＩＸ
因子−抗原の比率は、１.１より低いかまたは等しいの
が好ましい。本発明に従って、プロＩＸ因子を含まない
（すなわち純度が９５％以上、特に好ましくは９８％以
上）組換えＩＸ因子を、効率よく簡便な作法で得ること
ができる。ＩＸ因子を含まない（すなわち純度が９５％
以上、特に好ましくは９８％以上）組換えプロＩＸ因子
もまた、本発明の効率よく簡便な作法で得ることができ
る。
【００１７】このプロＩＸ因子は、ＩＸ因子アンタゴニ
ストとして治療用医薬として用いられる。医薬の製造に
おいては、該分離された高純度ＩＸ因子およびプロＩＸ
因子を含むフラクションを濃縮し、濃縮物として使用す
るのが好ましい。該医薬の製造は、公知かつ通例の作法
で行うことができる。高純度生成物（ＩＸ因子またはプ
ロＩＸ因子）あるいはその濃縮物は、適当な生理学的に
許容しうる担体と混合するのが好ましい。担体として
は、塩化ナトリウム溶液が好ましい。該医薬組成物は、
通例かつ一般的な鬱血治療用の投与剤形として製剤する
ことができるが、注入剤が好ましい。プロＩＸ因子の用
途は、カルシウムイオンおよびリン脂質の両方に対して
等しく結合する能力に基づくものであり、該能力はＩＸ
因子およびプロＩＸ因子の両方に存在するＧlaおよびＥ
ＧＦ領域が媒介するものである。したがって、ＩＸ因子
に対するアンタゴニストとしてカルシウムやリン脂質と
結合することにより、それらに対するＩＸ因子の結合を
競合的に阻害するので、プロＩＸ因子はＩＸ因子の生理
的効果を弱めることになる。
ストとして治療用医薬として用いられる。医薬の製造に
おいては、該分離された高純度ＩＸ因子およびプロＩＸ
因子を含むフラクションを濃縮し、濃縮物として使用す
るのが好ましい。該医薬の製造は、公知かつ通例の作法
で行うことができる。高純度生成物（ＩＸ因子またはプ
ロＩＸ因子）あるいはその濃縮物は、適当な生理学的に
許容しうる担体と混合するのが好ましい。担体として
は、塩化ナトリウム溶液が好ましい。該医薬組成物は、
通例かつ一般的な鬱血治療用の投与剤形として製剤する
ことができるが、注入剤が好ましい。プロＩＸ因子の用
途は、カルシウムイオンおよびリン脂質の両方に対して
等しく結合する能力に基づくものであり、該能力はＩＸ
因子およびプロＩＸ因子の両方に存在するＧlaおよびＥ
ＧＦ領域が媒介するものである。したがって、ＩＸ因子
に対するアンタゴニストとしてカルシウムやリン脂質と
結合することにより、それらに対するＩＸ因子の結合を
競合的に阻害するので、プロＩＸ因子はＩＸ因子の生理
的効果を弱めることになる。
【００１８】これは、何らかの医療上の指示のために血
液凝固カスケード反応を選択的に遮断しなければならな
い場合に非常に重要である。ヘパリンまたはクマリンな
どの常套の抗凝固剤は、所望の抗凝固作用以外に強い副
作用を有している。さらに、それらは半減期が短いた
め、頻繁に投与する必要がある。近来、遺伝子的に変質
した血液凝固因子（たとえばＶＩＩ因子やＸ因子など）
の抗凝固剤としての用途が論議されている。また、ＩＸ
因子のＥＧＦドメインをコードし、ＩＸ因子が内皮細胞
の受容体へ結合するのを妨げるペプチドがＩＸ因子の阻
害用に特記されている（ＵＳ−Ａ−４８８５２７７を参
照）。このように、高純度組換えプロＩＸ因子のＩＸ因
子アンタゴニストとしての使用ならびにＩＸ因子に対す
る拮抗作用をもつ医薬組成物の製造における高純度組換
えプロＩＸ因子の使用もまた本発明に含まれる。
液凝固カスケード反応を選択的に遮断しなければならな
い場合に非常に重要である。ヘパリンまたはクマリンな
どの常套の抗凝固剤は、所望の抗凝固作用以外に強い副
作用を有している。さらに、それらは半減期が短いた
め、頻繁に投与する必要がある。近来、遺伝子的に変質
した血液凝固因子（たとえばＶＩＩ因子やＸ因子など）
の抗凝固剤としての用途が論議されている。また、ＩＸ
因子のＥＧＦドメインをコードし、ＩＸ因子が内皮細胞
の受容体へ結合するのを妨げるペプチドがＩＸ因子の阻
害用に特記されている（ＵＳ−Ａ−４８８５２７７を参
照）。このように、高純度組換えプロＩＸ因子のＩＸ因
子アンタゴニストとしての使用ならびにＩＸ因子に対す
る拮抗作用をもつ医薬組成物の製造における高純度組換
えプロＩＸ因子の使用もまた本発明に含まれる。
【００１９】次に挙げる実施例において本発明をより詳
しく説明するが、これらの実施例は本発明に限定を加え
るものではない。
しく説明するが、これらの実施例は本発明に限定を加え
るものではない。
【００２０】
【発明の実施の形態】実施例１では、直線塩勾配法によ
るイオン交換カラムにおいてＩＸ因子からプロＩＸ因子
の分離を行う。実施例２では、アニオン交換カラムの段
階溶出法によるＩＸ因子からプロＩＸ因子の分離を行
う。実施例３では、ｐＨ勾配法によるプロＩＸ因子とＩ
Ｘ因子の分離を行う。実施例４では、イムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーによるプロＩＸ因子とＩＸ因子
の分離を行う。
るイオン交換カラムにおいてＩＸ因子からプロＩＸ因子
の分離を行う。実施例２では、アニオン交換カラムの段
階溶出法によるＩＸ因子からプロＩＸ因子の分離を行
う。実施例３では、ｐＨ勾配法によるプロＩＸ因子とＩ
Ｘ因子の分離を行う。実施例４では、イムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーによるプロＩＸ因子とＩＸ因子
の分離を行う。
【００２１】
【実施例】実施例１ 直線溶出による組換えＩＸ因子から組換えプロＩＸ因子
の分離 実験装置： カラム：Ｍono−Ｑ５／５ＨＲ、容量１ml（ファルマシ
ア(Pharmacia)製） 担体：ファルマシアＦＰＬＣ ＬＣＣ−５００ 緩衝液Ａ：５０mＭトリス/２０mＭクエン酸塩,ｐＨ７.
４,１５０mＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：５０mＭトリス/２０mＭクエン酸塩,ｐＨ７.
４,３００mＭ ＮａＣｌ アニオン交換体を再生し、緩衝液Ａで平衡化した。続い
て、前述のＶero/ワクシニア発現系で産生された組換え
ＩＸ因子／プロＩＸ因子の混合物５mlを１ml/分の速度
でカラムに流した。緩衝液Ａを同じ流速で流して洗浄し
て、カラムに結合しない物質を除去する。ついで緩衝液
Ａと緩衝液Ｂとの混合による１５０mＭ〜３００mＭのＮ
ａＣｌ直線勾配を用いて、５０mlの溶出液を得た。２ml
ずつのフラクションを集めた。クロマトグラフィー中、
２８０nmにおけるタンパク質の吸光度を通例の方法で追
跡した。タンパク質濃度をブラッドフォード法［ブラッ
ドフォード（M.Bradford)の「Anal.Biochem.」,７２（１
９７６年），２４８〜２５４］で測定し、ＩＸ因子の活
性を市販の凝固試験キット［Factor IX coagulation,イ
ムノＡＧ製］を用いて検定した。ＩＸ因子−抗原の濃度
をＥＬＩＳＡ［ダイアグノスチカ・スタゴ（Diagnostic
a Stago）］で測定した。
の分離 実験装置： カラム：Ｍono−Ｑ５／５ＨＲ、容量１ml（ファルマシ
ア(Pharmacia)製） 担体：ファルマシアＦＰＬＣ ＬＣＣ−５００ 緩衝液Ａ：５０mＭトリス/２０mＭクエン酸塩,ｐＨ７.
４,１５０mＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：５０mＭトリス/２０mＭクエン酸塩,ｐＨ７.
４,３００mＭ ＮａＣｌ アニオン交換体を再生し、緩衝液Ａで平衡化した。続い
て、前述のＶero/ワクシニア発現系で産生された組換え
ＩＸ因子／プロＩＸ因子の混合物５mlを１ml/分の速度
でカラムに流した。緩衝液Ａを同じ流速で流して洗浄し
て、カラムに結合しない物質を除去する。ついで緩衝液
Ａと緩衝液Ｂとの混合による１５０mＭ〜３００mＭのＮ
ａＣｌ直線勾配を用いて、５０mlの溶出液を得た。２ml
ずつのフラクションを集めた。クロマトグラフィー中、
２８０nmにおけるタンパク質の吸光度を通例の方法で追
跡した。タンパク質濃度をブラッドフォード法［ブラッ
ドフォード（M.Bradford)の「Anal.Biochem.」,７２（１
９７６年），２４８〜２５４］で測定し、ＩＸ因子の活
性を市販の凝固試験キット［Factor IX coagulation,イ
ムノＡＧ製］を用いて検定した。ＩＸ因子−抗原の濃度
をＥＬＩＳＡ［ダイアグノスチカ・スタゴ（Diagnostic
a Stago）］で測定した。
【００２２】図１に、実施例１で得られたクロマトグラ
フィーのプロフィールを示す。図１から、ＩＸ因子−抗
原が２つの別々の溶出範囲（フラクション２２〜２８お
よびフラクション２９〜３５）でカラムから溶出される
ことがわかった。変性電気泳動［レムリ（U.K.Laemml
i）の「Ｎature」,２２７（１９７０年），６８０〜６８
５を参照］から、フラクション２２〜２８のＩＸ因子−
抗原は、フラクション２９〜３５のＩＸ因子−抗原より
も分子量が約２０００多いことがわかった（図２を参
照）。溶出フラクションの凝固活性プロフィールから、
生理的に活性なＩＸ因子はフラクション２９〜３５にお
いてのみ得られることがわかった（下記表１を参照）。
フィーのプロフィールを示す。図１から、ＩＸ因子−抗
原が２つの別々の溶出範囲（フラクション２２〜２８お
よびフラクション２９〜３５）でカラムから溶出される
ことがわかった。変性電気泳動［レムリ（U.K.Laemml
i）の「Ｎature」,２２７（１９７０年），６８０〜６８
５を参照］から、フラクション２２〜２８のＩＸ因子−
抗原は、フラクション２９〜３５のＩＸ因子−抗原より
も分子量が約２０００多いことがわかった（図２を参
照）。溶出フラクションの凝固活性プロフィールから、
生理的に活性なＩＸ因子はフラクション２９〜３５にお
いてのみ得られることがわかった（下記表１を参照）。
【００２３】
【表１】 直線アニオン交換クロマトグラフィーによるＩＸ因子からプロＩＸ因子の分離 （表中、F-IX＝ＩＸ因子、Ag＝抗原活性、C=凝固活性） 物質 容量(ml) F-IX:Ag(U) F-IX:C(U) F-IX:Ag/F-IX:C proF-IX/F-IX混合物 ５ ２８.０ １７.０ １.７ フラクション22-28 １４ ７.３ １.０ ７.３ フラクション29-35 １４ １０.８ ９.５ １.１
【００２４】実施例２ 段階溶出による組換えＩＸ因子から組換えプロＩＸ因子
の分離 実験装置： カラム：Ｍono−Ｑ５／５ＨＲ、容量１ml（ファルマシ
ア製） 担体：ファルマシアＦＰＬＣ ＬＣＣ−５００ 緩衝液Ａ：５０mＭトリス/２０mＭクエン酸塩,ｐＨ８.
５,２２０mＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：５０mＭトリス/２０mＭクエン酸塩,ｐＨ８.
５,３００mＭ ＮａＣｌ 実施例１と同様に、出発物質として、前述のＶero/ワク
シニア発現系で産生された組換えプロＩＸ因子とＩＸ因
子の混合物を用いる。イオン交換カラムを再生し、緩衝
液Ａで平衡化する。続いて、９０mlのＩＸ因子／プロＩ
Ｘ因子混合物を１ml/分の速度でカラムに流した。つい
でカラムを緩衝液Ａで洗浄した。ついでカラムに結合し
たタンパク質を緩衝液Ｂで溶出させた。２mlのフラクシ
ョンを集めた。実施例１の記載に準じて、タンパク質お
よび／またはＩＸ因子−抗原濃度ならびに凝固試験を行
った。
の分離 実験装置： カラム：Ｍono−Ｑ５／５ＨＲ、容量１ml（ファルマシ
ア製） 担体：ファルマシアＦＰＬＣ ＬＣＣ−５００ 緩衝液Ａ：５０mＭトリス/２０mＭクエン酸塩,ｐＨ８.
５,２２０mＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：５０mＭトリス/２０mＭクエン酸塩,ｐＨ８.
５,３００mＭ ＮａＣｌ 実施例１と同様に、出発物質として、前述のＶero/ワク
シニア発現系で産生された組換えプロＩＸ因子とＩＸ因
子の混合物を用いる。イオン交換カラムを再生し、緩衝
液Ａで平衡化する。続いて、９０mlのＩＸ因子／プロＩ
Ｘ因子混合物を１ml/分の速度でカラムに流した。つい
でカラムを緩衝液Ａで洗浄した。ついでカラムに結合し
たタンパク質を緩衝液Ｂで溶出させた。２mlのフラクシ
ョンを集めた。実施例１の記載に準じて、タンパク質お
よび／またはＩＸ因子−抗原濃度ならびに凝固試験を行
った。
【００２５】図３に、実施例２で得られたクロマトグラ
フィーのプロフィールを示す。図３から、ＩＸ因子−抗
原が、緩衝液Ａの溶出液（溶出容量１００ml〜１１０m
l）および緩衝液Ｂの溶出液（溶出容量１１１ml〜１２
５ml）において測定できることがわかった。しかし、溶
出フラクションの凝固試験において、緩衝液Ｂの溶出液
には生理的に活性なＩＸ因子は認められなかった（下記
表２を参照）。変性電気泳動［レムリ，前述］から、緩
衝液Ａの溶出液中のＩＸ因子−抗原は、緩衝液Ｂの溶出
液中のＩＸ因子−抗原よりも分子量が約２０００多いこ
とがわかった（図４を参照）。
フィーのプロフィールを示す。図３から、ＩＸ因子−抗
原が、緩衝液Ａの溶出液（溶出容量１００ml〜１１０m
l）および緩衝液Ｂの溶出液（溶出容量１１１ml〜１２
５ml）において測定できることがわかった。しかし、溶
出フラクションの凝固試験において、緩衝液Ｂの溶出液
には生理的に活性なＩＸ因子は認められなかった（下記
表２を参照）。変性電気泳動［レムリ，前述］から、緩
衝液Ａの溶出液中のＩＸ因子−抗原は、緩衝液Ｂの溶出
液中のＩＸ因子−抗原よりも分子量が約２０００多いこ
とがわかった（図４を参照）。
【００２６】
【表２】 段階アニオン交換クロマトグラフィーによるＩＸ因子からプロＩＸ因子の分離 物質 容量(ml) F-IX:Ag(U) F-IX:C(U) F-IX:Ag/F-IX:C proF-IX/F-IX混合物 ９０ ８１.０ ４５.０ １.８ 緩衝液Ａ １０ ３１.０ １.０ ３１.０ 緩衝液Ｂ １０ ４５.０ ４０.０ １.１
【００２７】実施例３ ｐＨ依存の溶出による組換えＩＸ因子から組換えプロＩ
Ｘ因子の分離 実験装置： カラム：Ｍono−Ｑ５／５ＨＲ、容量１ml（ファルマシ
ア製） 担体：ファルマシアＦＰＬＣ ＬＣＣ−５００ 緩衝液Ａ：５０mＭトリス/ＨＣｌ緩衝液,ｐＨ８.０,１
５０mＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：５０mＭトリス/ＨＣｌ緩衝液,ｐＨ６.０,１
５０mＭ ＮａＣｌ 組換えプロＩＸ因子とＩＸ因子の混合物は、実施例１の
記載に準じて用意した。アニオン交換体を再生し、緩衝
液Ａで平衡化した。続いて、組換えＩＸ因子／プロＩＸ
因子の混合物４５mlを１ml/分の速度でカラムに流し
た。ついで緩衝液Ａと緩衝液Ｂとの混合によるｐＨ８．
０〜６．０ｐＨ降下勾配を用い、カラムを溶離した。２
mlずつのフラクションを集めた。クロマトグラフィー
後、タンパク質濃度をブラッドフォード法［前述］で測
定した。ＩＸ因子の活性を市販の凝固試験キット［Fact
or IX coagulation,イムノＡＧ製］を用いて検定した。
ＩＸ因子−抗原の濃度をＥＬＩＳＡ［ダイアグノスチカ
・スタゴ（Diagnostica Stago）］で測定した。結果か
ら、ＩＸ因子−抗原は、ｐＨ７．０〜７．４およびｐＨ
６．０〜６．７で測定しうることがわかった。しかし、
溶出フラクションについてさらに他の試験を行った結
果、生理的に活性なＩＸ因子はｐＨ６．０〜６．７にお
いてのみ得られることがわかった。ＩＸ因子からプロＩ
Ｘ因子の分離の測定値を下記表３に示す。
Ｘ因子の分離 実験装置： カラム：Ｍono−Ｑ５／５ＨＲ、容量１ml（ファルマシ
ア製） 担体：ファルマシアＦＰＬＣ ＬＣＣ−５００ 緩衝液Ａ：５０mＭトリス/ＨＣｌ緩衝液,ｐＨ８.０,１
５０mＭ ＮａＣｌ 緩衝液Ｂ：５０mＭトリス/ＨＣｌ緩衝液,ｐＨ６.０,１
５０mＭ ＮａＣｌ 組換えプロＩＸ因子とＩＸ因子の混合物は、実施例１の
記載に準じて用意した。アニオン交換体を再生し、緩衝
液Ａで平衡化した。続いて、組換えＩＸ因子／プロＩＸ
因子の混合物４５mlを１ml/分の速度でカラムに流し
た。ついで緩衝液Ａと緩衝液Ｂとの混合によるｐＨ８．
０〜６．０ｐＨ降下勾配を用い、カラムを溶離した。２
mlずつのフラクションを集めた。クロマトグラフィー
後、タンパク質濃度をブラッドフォード法［前述］で測
定した。ＩＸ因子の活性を市販の凝固試験キット［Fact
or IX coagulation,イムノＡＧ製］を用いて検定した。
ＩＸ因子−抗原の濃度をＥＬＩＳＡ［ダイアグノスチカ
・スタゴ（Diagnostica Stago）］で測定した。結果か
ら、ＩＸ因子−抗原は、ｐＨ７．０〜７．４およびｐＨ
６．０〜６．７で測定しうることがわかった。しかし、
溶出フラクションについてさらに他の試験を行った結
果、生理的に活性なＩＸ因子はｐＨ６．０〜６．７にお
いてのみ得られることがわかった。ＩＸ因子からプロＩ
Ｘ因子の分離の測定値を下記表３に示す。
【００２８】
【表３】 ｐＨ依存性アニオン交換クロマトグラフィーによるＩＸ因子からプロＩＸ因子の 分離 物質 容量(ml) F-IX:Ag(U) F-IX:C(U) F-IX:Ag/F-IX:C proF-IX/F-IX混合物 ４５ ６５ ４０ １.６ 溶出液pH7.0-7.4 １０ ２８ ４ ７.０ 溶出液pH6.0-6.7 １２ ３３ ３０ １.１
【００２９】実施例４ イムノアフィニティークロマトグラフィーによる組換え
ＩＸ因子から組換えプ ロＩＸ因子の分離 実験装置： カラム：抗−プロ配列−ＩＸ因子−セファロース、容量
３ml 機器：ファルマシアＦＰＬＣ ＬＣＣ−５００ 緩衝液Ａ：２０mＭトリス/ＨＣｌ緩衝液,ｐＨ７.４ 緩衝液Ｂ：２０mＭトリス/ＨＣｌ緩衝液,ｐＨ７.４,３
Ｍ ＫＳＣＮ 組換えプロＩＸ因子とＩＸ因子の混合物は、実施例１の
記載に準じて用意した。精製プロペプチドでヤギを免疫
感作することにより、プロＩＸ因子を結合する抗血清を
単離した。このポリクローナル抗体を、添付説明書（フ
ァルマシア）にしたがって臭化シアン活性化セファロー
スに連結した。ガラス製カラムにイムノアフィニティー
ゲルを充填し、緩衝液Ａで平衡化した。続いて、組換え
ＩＸ因子／プロＩＸ因子の混合物３３mlを１ml/分の速
度でカラムに流した。ついでカラムを緩衝液Ａで洗浄し
た。ついでカラムに結合したタンパク質を緩衝液Ｂで溶
出させた。２mlずつのフラクションを集めた。クロマト
グラフィー後、タンパク質濃度をブラッドフォード法
［前述］で測定した。ＩＸ因子−抗原の濃度をＥＬＩＳ
Ａ［ダイアグノスチカ・スタゴ（Diagnostica Stag
o）］で測定した。ＩＸ因子の活性を市販の凝固試験キ
ット［Factor IX coagulation,イムノＡＧ製］を用いて
検定した。
ＩＸ因子から組換えプ ロＩＸ因子の分離 実験装置： カラム：抗−プロ配列−ＩＸ因子−セファロース、容量
３ml 機器：ファルマシアＦＰＬＣ ＬＣＣ−５００ 緩衝液Ａ：２０mＭトリス/ＨＣｌ緩衝液,ｐＨ７.４ 緩衝液Ｂ：２０mＭトリス/ＨＣｌ緩衝液,ｐＨ７.４,３
Ｍ ＫＳＣＮ 組換えプロＩＸ因子とＩＸ因子の混合物は、実施例１の
記載に準じて用意した。精製プロペプチドでヤギを免疫
感作することにより、プロＩＸ因子を結合する抗血清を
単離した。このポリクローナル抗体を、添付説明書（フ
ァルマシア）にしたがって臭化シアン活性化セファロー
スに連結した。ガラス製カラムにイムノアフィニティー
ゲルを充填し、緩衝液Ａで平衡化した。続いて、組換え
ＩＸ因子／プロＩＸ因子の混合物３３mlを１ml/分の速
度でカラムに流した。ついでカラムを緩衝液Ａで洗浄し
た。ついでカラムに結合したタンパク質を緩衝液Ｂで溶
出させた。２mlずつのフラクションを集めた。クロマト
グラフィー後、タンパク質濃度をブラッドフォード法
［前述］で測定した。ＩＸ因子−抗原の濃度をＥＬＩＳ
Ａ［ダイアグノスチカ・スタゴ（Diagnostica Stag
o）］で測定した。ＩＸ因子の活性を市販の凝固試験キ
ット［Factor IX coagulation,イムノＡＧ製］を用いて
検定した。
【００３０】試験結果から、ＩＸ因子−抗原は、非結合
性溶出液（すなわち緩衝液Ａ）および緩衝液Ｂにおいて
測定しうることがわかった。しかし、溶出フラクション
についてさらに他の試験を行った結果、生理的に活性な
ＩＸ因子は非結合性フラクション（緩衝液Ａ）において
のみ得られることがわかった。プロＩＸ因子は抗体によ
ってカラムに結合し、塩濃度増加法によって緩衝液Ｂに
最初に溶出される。ＩＸ因子からプロＩＸ因子の分離の
測定値を下記表４に示す。
性溶出液（すなわち緩衝液Ａ）および緩衝液Ｂにおいて
測定しうることがわかった。しかし、溶出フラクション
についてさらに他の試験を行った結果、生理的に活性な
ＩＸ因子は非結合性フラクション（緩衝液Ａ）において
のみ得られることがわかった。プロＩＸ因子は抗体によ
ってカラムに結合し、塩濃度増加法によって緩衝液Ｂに
最初に溶出される。ＩＸ因子からプロＩＸ因子の分離の
測定値を下記表４に示す。
【００３１】
【表４】 イムノアフィニティークロマトグラフィーによるＩＸ因子からプロＩＸ因子の分 離 物質 容量(ml) F-IX:Ag(U) F-IX:C(U) F-IX:Ag/F-IX:C proF-IX/F-IX混合物 ３３ １５０ ９０ １.６ 緩衝液Ａ ３５ ９１ ８０ １.１ 緩衝液Ｂ １０ ５０ ３ １７.０
【図１】 ＩＸ因子／プロＩＸ因子の直線クロマトグラ
フィーである［Ａ：タンパク質の吸光度；Ｂ：抗原濃度
とＩＸ因子の血液凝固活性］。
フィーである［Ａ：タンパク質の吸光度；Ｂ：抗原濃度
とＩＸ因子の血液凝固活性］。
【図２】 直線クロマトグラフィーで得られた精製物フ
ラクションからのＩＸ因子／プロＩＸ因子の変性電気泳
動の分析結果を示す図面代用写真である。
ラクションからのＩＸ因子／プロＩＸ因子の変性電気泳
動の分析結果を示す図面代用写真である。
【図３】 ＩＸ因子／プロＩＸ因子の段階クロマトグラ
フィーである。
フィーである。
【図４】 段階クロマトグラフィーで得られたＩＸ因子
／プロＩＸ因子の変性電気泳動の分析結果を示す図面代
用写真である［Ａ：ＩＸ因子／プロＩＸ因子混合物；
Ｂ：プロＩＸ因子；Ｃ：ＩＸ因子］。
／プロＩＸ因子の変性電気泳動の分析結果を示す図面代
用写真である［Ａ：ＩＸ因子／プロＩＸ因子混合物；
Ｂ：プロＩＸ因子；Ｃ：ＩＸ因子］。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/43 ＡＣＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 フリードリッヒ・ドルナー オーストリア、アー−1230ヴィーン、ペー ターリニガッセ17番 (72)発明者 ヨハン・アイブル オーストリア、アー−1180ヴィーン、グス タフ・ツェルマークガッセ２番
Claims (27)
- 【請求項１】 クロマトグラフィーを用いた組換えＩＸ
因子から組換えプロＩＸ因子の分離方法。 - 【請求項２】 プロＩＸ因子およびＩＸ因子の両タンパ
ク質の混合物をイオン交換体に結合させ、塩濃度および
／またはｐＨ値の異なる緩衝液を用いて別々に溶出させ
ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 イオン交換体として、アニオン交換体を
用いることを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 ＱＡＥ（第４級アミノエチル）、ＤＥＡ
Ｅ（ジエチルアミノエチル）またはＴＭＡＥ（トリメチ
ルアミノエチル）型のアニオン交換体を用いることを特
徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 塩濃度勾配の上昇および／またはｐＨ勾
配の降下によってプロＩＸ因子およびＩＸ因子を溶出さ
せること特徴とする請求項２〜４のいずれかひとつに記
載の方法。 - 【請求項６】 溶出緩衝液として、ｐＨ値が５．０〜１
０．０の緩衝液を用いることを特徴とする請求項２〜５
のいずれかひとつに記載の方法。 - 【請求項７】 溶出緩衝液として、１価のカチオンの塩
を含む緩衝液を用いることを特徴とする請求項２〜６の
いずれかひとつに記載の方法。 - 【請求項８】 溶出緩衝液の塩濃度が１０ｍＭ〜１００
０ｍＭの範囲であることを特徴とする請求項２〜７のい
ずれかひとつに記載の方法。 - 【請求項９】 プロＩＸ因子の溶出が、ＩＸ因子の溶出
よりも低い塩濃度または高いｐＨ値で行われることを特
徴とする請求項２〜８のいずれかひとつに記載の方法。 - 【請求項１０】 ２つのタンパク質の一方をクロマトグ
ラフィーカラムに結合させ、他方を溶出し、ついで緩衝
液の組成を変化させることによって結合タンパク質を溶
出させることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 無機塩または有機塩（好ましくはＮａ
Ｃｌ、ＭｇＣｌ2、ＫＳＣＮまたは尿素）を含むか、ま
たは疎水性剤（好ましくはエチレングリコール）を含む
緩衝液を用いて結合したタンパク質を溶出させることを
特徴とする請求項２〜１０のいずれかひとつに記載の方
法。 - 【請求項１２】 結合タンパク質を溶出させる塩濃度が
５００ｍＭ〜３．５Ｍの範囲であるか、または疎水性剤
の濃度が０．１〜５０重量％の範囲、好ましくは０．１
〜１０重量％の範囲であることを特徴とする請求項１、
１０および１１のいずれかひとつに記載の方法。 - 【請求項１３】 緩衝液のｐＨ値を変化させることによ
って結合タンパク質を溶出させることを特徴とする請求
項１および１０のいずれかひとつに記載の方法。 - 【請求項１４】 溶出緩衝液のｐＨ値が７．０以下（好
ましくは５．０以下）または８．０以上（好ましくは
９．０）であることを特徴とする請求項１、１０および
１３のいずれかひとつに記載の方法。 - 【請求項１５】 イムノアフィニティーカラムが、プロ
ＩＸ因子のプロペプチドまたはＩＸ因子のいずれかを認
識する結合モノクローナル抗体または結合ポリクローナ
ル抗体を含むことを特徴とする請求項１および１０〜１
４のいずれかひとつに記載の方法。 - 【請求項１６】 イムノアフィニティーカラムが、プロ
ＩＸ因子のプロペプチドを認識する結合モノクローナル
抗体または結合ポリクローナル抗体を含むことを特徴と
する請求項１および１０〜１５のいずれかひとつに記載
の方法。 - 【請求項１７】 プロＩＸ因子がカラムに結合し、純粋
なＩＸ因子が溶出液中に存在することを特徴とする請求
項１および１０〜１６のいずれかひとつに記載の方法。 - 【請求項１８】 塩濃度の上昇、疎水性剤の添加または
ｐＨ値の変化によってプロＩＸ因子をカラムから溶出さ
せることを特徴とする請求項１および１０〜１７のいず
れかひとつに記載の方法。 - 【請求項１９】 プロＩＸ因子を含まず、純度が少なく
とも９５％であり、請求項１〜１８のいずれかひとつに
記載の方法によって得られる高純度組換えＩＸ因子。 - 【請求項２０】 純度が少なくとも９８％である請求項
１９に記載の高純度組換えＩＸ因子。 - 【請求項２１】 活性ＩＸ因子に対するＩＸ因子−抗原
の比率が１.１より低いかまたは等しいものである請求
項１９または２０に記載の高純度組換えＩＸ因子。 - 【請求項２２】 ＩＸ因子を含まず、純度が少なくとも
９５％であり、請求項１〜１８のいずれかひとつに記載
の方法によって得られる高純度組換えプロＩＸ因子。 - 【請求項２３】 純度が少なくとも９８％である請求項
２２に記載の高純度組換えプロＩＸ因子。 - 【請求項２４】 生理学的に許容しうる担体中に、請求
項１９〜２１のいずれかひとつに記載の高純度ＩＸ因子
を含むことを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項２５】 生理学的に許容しうる担体中に、請求
項２２〜２３のいずれかひとつに記載の高純度プロＩＸ
因子を含むことを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項２６】 ＩＸ因子アンタゴニストとして用いる
高純度組換えプロＩＸ因子。 - 【請求項２７】 ＩＸ因子に対する拮抗作用を有する医
薬の製造に用いる高純度組換えプロＩＸ因子。
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|---|---|---|---|
| DE4435520A DE4435520A1 (de) | 1994-10-04 | 1994-10-04 | Verfahren zur Trennung von rekombinantem pro-Faktor IX von rekombinantem Faktor IX |
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08112095A true JPH08112095A (ja) | 1996-05-07 |
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Family Applications (1)
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