FI103510B - Menetelmä tekijän VIII eristämiseksi - Google Patents

Description

103510

Menetelmä tekijän VIII eristämiseksi - Förfarande for isolering av faktor VIII

Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään biologisten yhdisteiden, kuten prote-5 iinien, erityisesti hyytymistekijän VIII, eristämiseksi ruumiinnesteistä, kuten plasmasta, käyttämällä geelisuodatusta ensimmäisenä eristysvaiheena.

Tekijä Vili, joka tunnetaan myös verenvuototautia estävänä tekijänä A tai AHF, on plasmaproteiini, joka osallistuu veren hyytymisen sisäsyntyisyyteen. Tekijä VIII 10 kiertää veriplasmassa äärimmäisen alhaisessa pitoisuudessa kahden proteiinin ei-kovalenttisen yhdistelmän muodossa, jossa on tekijä VIII hyydyttävää toimintaa (tekijä VIII:C) ja ristosetiini-kofaktoritoimintaa (von Willebrand Factor (vWF)) vastaavasti, sanotun yhdistelmän molekyylipainon ollessa 1-20 x 106 D.

15 Noin viideltä sadasta tuhannesta henkilöstä, jotka sairastavat verenvuorotautia hemofilia A, puuttuu tekijä VIII:C tai se on viallinen.

von Willebrand -tekijä sitoutuu aktivoituneisiin verihiutaleisiin sellaisella tavalla, että aktivoituneiden verihiutaleiden aggregoituminen tehostuu. Tämä vaikutus voi-20 daan havaita in vitro aggregoimalla ristosetiini-indusoidut verihiutaleet, von Willeb-randin sairauden ohessa havaitaan pidentynyt verenvuotoaika, joka johtuu von Willebrand -tekijän biologisen aktiivisuuden puutteesta tai laskeneesta tasosta.

Verenvuototautisia, jotka sairastavat hemofilia Aita, ja potilaita, jotka sairastavat 25 von Willebrandin taudin vaikeaa lajia, hoidetaan nykyisin konsentraateilla, jotka käsittävät tekijän VIII:C/vWF, joka on hoito, joka on pidentänyt potilaiden elämänlaatua ja taloudellista tilaa huomattavasti sekä on pidentänyt näiden potilaiden elinaikaa.

30 Tekijää VIII (tekijä VIII:C ja/tai vWF) sisältävät farmaseuttiset valmisteet voidaan valmistaa verestä tai veriplasmasta. Tällaisten valmisteiden valmistaminen voidaan suorittaa erilaisilla tunnetuilla tavoilla, joille kaikille on tunnusomaista erityisesti tekijän VIII:C alhaiset saannot. Lähes kaikille menetelmille on tunnusomaista alku-puhdistusvaihe, joka käsittää kryopresipitoinnin. Kryopresipitoinnilla jäädytetty 35 plasma sulatetaan lämpötilassa 0-4 °C, mikä tuottaa presipitaatin, joka käsittää tekijän VIII, joka voidaan kerätä esimerkiksi sentrifugoimalla. Vaikkakin kryopresipi-tointi on suhteellisen yksinkertaista, sen oleellisena haittana on se, että kun sitä käytetään laajassa mittakaavassa, so. plasmapoolit, jotka käsittävät yli 5 kg, se tuot- 2 103510 taa alhaisen tekijä VIII:C-saannon (30-45 % plasman painosta), mikä tarkoittaa, että lopullinen saanto on alhainen riippumatta siitä, mitä seuraavia puhdistusvaiheita käytetään.

5 Lisäksi tekijä VIII -valmisteiden tuottamiseen on sisällytetty tavallisesti virusten inaktivointivaihe. Virusten inaktivointivaiheet ovat lisänneet merkittävästi turvallisuutta valmisteiden virussisällön suhteen mutta ne laskevat useimmissa tapauksissa lisää tekijän VIII:C saantoa.

10 Tekijän VIII erittäin alhainen kokonaissaanto on johtanut näiden valmisteiden puutteeseen useilla alueilla ja siksi tarvitaan uusia menetelmiä tekijän VIII puhdistamiseksi suurena saantona tekijän VIII kysynnän tyydyttämiseksi hemofiliaa potevien hoidossa.

15 Uudet menetelmät tekijän VIII erottamiseksi suoraan plasmasta suurena saantona olisivat erittäin mielenkiintoisia, koska 70 % plasman tekijä VIII -pitoisuudesta katoaa jo kryopresipitaatiossa tai ennen sitä.

Äskettäin on yritetty eristää tekijä VIII suoraan plasmasta käyttämällä affiniteet-20 tikromatografiaa (Thromb. Haemost., 61, (2), 234-237 (1989)) mutta saatiin vain alle 60 %:n saanto ja spesifinen aktiivisuus 1IU tekijää VIII/mg proteiinia eristetystä tekijää VHI-sisältävästä fraktiosta.

Geelisuodatus, jota myös nimitetään geelinläpäisykromatografiaksi tai kokoeks- • · · — 25 kluusiokromatografiaksi, on diffuusiokontrolloitu menetelmä, jota käytetään liuot- teiden erottamiseen niiden koon mukaan. Liuotteet viedään kolonnin läpi, johon on pakattu inerttejä huokoisia geelipartikkeleita, joiden huokoskoko sulkee pois suurimmat molekyylit, kun taas pienemmät molekyylit hajaantuvat stationaariseen faasiin geelipartikkelien sisään. Täten suuremmat molekyylit, jotka suljetaan täydelli-30 sesti pois geelipartikkeleista, eluoidaan ensin "välisijatilavuudella", kun taas pienemmät molekyylit kulkevat pitemmän aikaan kolonnissa ja eluoituvat pienenevän koon mukaan nousevilla "eluointitilavuuksilla".

Geelisuodatus voidaan suorittaa kahdella erilaisella tavalla: 35 3 103510 1. Ryhmäerotustapa

Ryhmäerotustavassa liuotteet erotetaan kahteen ryhmään, joiden molekyylikoossa on suuri ero, toisen ryhmän ollessa eluoitu välisijatilavuudella ja toisen ryhmän ol-5 lessa eluoitu myöhemmin paljon suuremmalla eluointitilavuudella, joka on usein lähellä "pakatun kolonnin kokonaistilavuutta"; tätä menetelmää käytetään ensisijaisesti proteiinien erottamiseen liuenneista suoloista tai puskurin vaihtamiseen ja sitä nimitetään "suolanpoistoksi". "Suolan poistamiseksi" käytetään jäykkiä geelejä, joiden huokoskoko on pieni, ja menetelmä voidaan suorittaa käyttämällä suuria määriä 10 materiaalia (näytetilavuudet ovat 20-30 % pakatun kolonnin tilavuudesta) ja käyttämällä suuria virtausnopeuksia (noin yksi pakatun kolonnin tilavuus puskuria tunnissa), jolloin kolonnin kapasiteetti on suuri.

2. Fraktionointitapa 15

Fraktionointitavassa erotetaan liuotteet, joiden molekyylipaino on erilainen; tämä menetelmää käytetään usein proteiinien erottamiseen. Tähän käytetään geelipartik-keita, joissa on suurempia huokosia, ja geelisuodatusväliaine valitaan siten, että varmistetaan se, että proteiinit eluoidaan välisijatilavuuden ja eluointitilavuuden, jo-20 ka vastaa pakatun kolonnin kokonaistilavuutta, välissä. Substanssit eluoidaan paljon tarkemmin kuin käyttämällä ryhmäerotusolosuhteita ja ne voivat limittyä. Suuret virtausnopeudet eivät ole toivottuja, koska tämä ei mahdollista proteiinien tehokasta erottamista ja kolonnin panostus täytyy pitää alhaisena, jotta saadaan yksittäisten proteiinien järkevä erotus. Täten geelisuodatusta, jota käytetään fraktionointitavassa, 25 on suositeltu vain proteiinien erottamiseen viimeisenä siloitusvaiheena, jossa frak-tionoitava tilavuus on pieni (Jagschies, Ullmanns Encyklopedia of Industrial Chemistry, voi B3(10), 1988 ja Bio/Technol., 4, 954-58 (1986)).

Tekijää VIII on yritetty eristää plasmasta käyttämällä geelisuodatusta (J. Lab. Clin. 30 Med., 72, (6), 1968, 1007-1008 ja J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962). Kokeissa havaittiin hyvä puhdistuminen mutta saannot olivat vain noin 40-50 %. Saadun tekijää VIII sisältävän fraktion puhtauden havaittiin olevan riippuvainen lähtöplasmasta, sillä suuri lipidi- ja kylomikronipitoisuus tuotti samean tekijä VIII -fraktion, jossa on pienempi spesifinen aktiivisuus. On huomattava, että käytetty geelinsuodatustek-35 nilkka ei salli suurien plasmamäärien käsittelemistä, vaikka esitutkimukset osoittivat, että paljon konsentroidumman Cohn-fraktio I:n geelisuodatus näytti mahdolliselta.

4 103510

Lisäksi Paulssen et ai. (Thromb. Diathes. Haemorr., 22, 1969, 577-583) havaitsivat, että tekijä VIII voidaan erottaa muista plasmaproteiineista käyttämällä geeliväliaine-Sepharose 6B:tä mutta tämä kromatografia käyttämällä geelisuodatusta näytti mahdolliselta vain suuressa mittakaavassa, kun uudelleenliuotettua kryopresipitaattia 5 käytettiin lähtömateriaalina.

US-patentissa 3 637 489 selostetaan menetelmä verikomponenttien erottamiseksi käyttämällä geelisuodatusta ja käyttämällä huokoisia lasipallosia. Menetelmä on tarkoitettu erityisesti immunologisesti aktiivisten materiaalien erottamiseen muista 10 konstituenteista seerumissa tai plasmassa.

On suoritettu lukuisia yrityksiä geelisuodatuksen käyttämiseksi tekijän VIII puhdistamiseen, mutta yritykset ovat keskittyneet osittain puhdistettujen plasmafraktioiden geelisuodatukseen (uudelleenliuotetttu kryopresipitaatti ja siitä edelleen puhdistetut 15 fraktiot). Kaikki yritykset on suoritettu käyttämällä joko pieniä pylvään panostuksia ja/tai pieniä virtausnopeuksia tai niiden yhdistelmiä.

Geelisuodatus on tunnettu proteiinien fraktionointimenetelmänä jo vuodesta 1959 ja sitä käytetään laajasti biokemiallisissa tutkimuslaboratorioissa proteiinien karakteri-20 sointimenetelmänä ja menetelmänä proteiinien puhdistamiseksi näytteistä, joiden tilavuudet ovat pieniä, esim. alle 1 litran. Geelisuodatusta ei ole käytetty tähän keksintöön mennessä suuressa mittakaavassa plasman fraktionointiin proteiinien erottamiseksi ainoan käytön oltua etanolin ja suolojen suolanpoisto albumiiniliuoksista. Täten kuten viitekirjoissa todetaan: "Pääsyy, miksi geelisuodatuksesta ei ole tullut 25 pääteknikkaa plasman fraktionoinnissa, on vähäinen proteiinin läpimeno kolonnin tilavuutta kohti" (J.H. Berglöf: "Fractionation by Gel Filtration", s. 163-173, J.M. Curling (toim.): "Methods of Plasma Protein Fractionation", Academic Press, London, 1980) ja "Valitettavasti proteiinimassat, joita voidaan käsitellä kohtuullisen kokoisissa kolonneissa, ovat pieniä ja näytteen laimennusta ei voida laiminlyödä. Siksi 30 menetelmää ei paljon käytetä plasman fraktionoinnissa" (J.J. Morgenthaler et ai.: "Preservation of structure and function during isolation of human plasma proteins", s. 127-138, Smit Sibinga et al. (toim): Plasma Fractionation and Blood Transfusion", Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 1985).

35 US-patentissa 4 675 385 selostetaan menetelmä tekijä VIII -esihyydyttävän proteiinin eristämiseksi plasmavalmisteesta, joka käsittää tekijän VIII, suuren molekyyli-painon konstituentit ja alhaisen molekyylipainon konstituentit, jaksoittaisella suuren j 103510 suorituskyvyn ekskluusiokromatografialla valmistamalla ensimmäisessä vaihessa plasmavalmisteen puskuroitu vesipitoinen koostumus ja erottamalla alhaisen mole-kyylipainon konstituentit viemällä koostumus huokoisen suuren suorituskyvyn nes-tekromatografiapallosten kromatografiakolonniin pallosten koon ollessa noin 5 13 mikronista noin 35 mikroniin ja eluoimalla kolonni puskuroidulla vesipitoisella eluentilla. Hyvän erottamisen saavuttamiseksi US-patentti 4 675 385 opettaa kolonnien käytön, joissa sivusuhde ei ole alle 10-40, mikä vähentää kapasiteettiä, muttei varmista tekijä VIII -konstituenttien hyvää erottumista alhaisen molekyyli-painon plasmaproteiineista. Kuitenkaan tämä ensimmäinen eristäminen ei takaa 10 proteiinien, joissa esiintyy tekijä VIII:C-aktiivisuutta, hyvää erottumista toisista plasmavalmisteen konstituenteista, joka valmiste saadaan vain suorittamalla toinen HPLC.

Täten tähän keksintöön mennessä on hyväksytty tosiasia, että geelisuodatus ei ole 15 sopiva menetelmä proteiinien erottamiseen plasman fraktionoinnissa, kun käsitellään suuria tilavuuksia, esim. yli 5 litraa.

Nyt on yllättäen havaittu, että kun valitaan geelisuodatusmateriaalit, jotka on suunniteltu suurille virtausnopeuksille, on tekijän VIII erottaminen mahdollista puhtaan 20 fraktion muodossa ja hyvin suurena saantona suoraan plasmasta hyvin vähäisellä mekaanisella erottamisella ilman että on turvauduttava normaaliin alkukryopresipi-tointiin.

Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään tekijän VIII erottamiseksi tekijän 25 VIII:C ja vWF:n yhdistelmän muodossa muista veriplasmassa olevista proteiineista käyttämällä geelisuodatusta.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että eristetty plasma tai sulatettu äskettäin jäädytetty plasma alistetaan geelisuodatukseen ryhmässä erotusolo-30 suhteita, joissa käytetään suurta panostusta ja suurta virtausnopeutta geelisuodatus-väliaineen koostuessa partikkeleista, jotka ovat inerttejä tekijään VIII ja niiden frak-tionointialue on välillä 1x10 -8x10 . Fraktionointialue voi vaihdella esim. välillä 5x104-4x107.

35 Edullisessa suoritusmuodossa lisätyn plasman tilavuus on vähintään 5 % pakatun kolonnin tilavuudesta. Lisätyn plasman määrä on edullisesti 15-40 % pakatun kolonnin tilavuudesta.

6 103510

Keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan edullisesti käyttämällä virtausnopeutta vähintään 0,3 pakatun kolonnin tilavuutta tunnissa, edullisimmin 0,5-2 pakatun kolonnin tilavuutta tunnissa.

5 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Esillä olevassa keksinnössä käytetään geelisuodatusväliainetta, jossa on jäykkyys, joka sallii nopean eluaation. Lisäksi geelin tulee olla kemiallisesti ja immunologi-sesti inertti tekijään VIII geelisuodatuksen aikana. Kokeet ovat osoittaneet, että 10 esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa käyttämällä kaupallisia geelejä, kuten Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S-400, Sephacryl S-500, Fractogel TSK HW-65(F) ja Matrex Cel-lufine CGL 2000, jotka kaikki ovat sopivia esillä olevan keksinnön tarkoitukseen. Tällaisten geelien partikkelikoko (märkä) on tavallisesti välillä noin 32 pm - noin 15 200 pm.

Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän erään suoritusmuodon mukaisesti jäädytetty plasma sulatetaan ja varmistetaan, että kaikki tekijä VIII on liuennut, minkä jälkeen sulatettu plasma lisätään edullisesti kolonniin välittömästi sen jäl-20 keen, kun kaikki tekijä VIII on liuennut. Lämpötilan ei anneta edullisesti nousta liian korkeaksi, jotta vältetään tekijän VIII liian laaja hajoaminen. Plasma voidaan esi-käsitellä lisäämällä esim. hepariinia, sitraattia, sakkaroosia, aminohappoja, suoloja tai muita stabilointiaineita ja suodattaa, sentrifugoida, konsentroida ultrasuo-datuksella, esipresipitoida käyttämällä tavallisia presipitointiaineita tai esikäsitellä 25 muulla tavalla ennen sen lisäämistä kolonniin kunhan optionaalinen esikäsittely ei vaikuta merkittävästi plasman tekijä VIII -pitoisuuteen.

On osoittautunut, että keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan erittäin suuri tekijän VIII saanto. Tavallisesti yli 70 % plasman tekijä VIII -pitoisuudesta palautuu 30 tuotteeseen ja menetelmä tuottaa erittäin puhtaita tuotteita, joiden spesifinen aktiivi suus on 1 - noin 4 IU tekijää VIII:C/mg proteiinia. Tämä voi osittain johtua seikasta, että käytettäessä keksinnön mukaista menetelmää tekijä VIII erottuu proteolyyttisis-tä entsyymeistä, jotka normaalisti aiheuttavat tekijän VIII:C hajoamisen hyvin varhain eristysprosessissa.

35

Keksinnön mukainen menetelmä mahdollistaa suurten plasmamäärien käsittelyn olosuhteissa, joissa plasmaa käytetään suurina panostuksina ja suurina virtausnope- i 7 103510 uksina geelisuodatuksessa, joka tuottaa tekijän VIII erittäin suuren talteenoton erittäin puhtaana. Täten taijotaan erittäin tehokasta menetelmää, jolla on teollista käyttöä.

5 Geelisuodatuksesta peräisin oleva (olevat) tekijää VIII sisältävä (sisältävät) fraktio (fraktiot) tai useammista geelisuodatuksista peräisin olevat yhdistetyt fraktiot voidaan sitten konsentroida ja puhdistaa käyttämällä itsessään tunnettuja tekniikoita, kuten ultrasuodatus, presipitoinnit, ioninvaihto, affiniteettikromatografia tai niiden kaltaiset.

10 Jäljelle jäävät plasmaproteiinit, kuten albumiini, immunoglobuliinit, protrombiini-kompleksi, antitrombiini III ja muut voidaan myös eristää geelisuodatuksen myöhemmistä fraktioista käyttämällä itsessään tunnettuja tekniikoita, kuten alkoholilla presipitointi, PEG-presipitoinnit, kromatografia tai niiden kaltaiset.

15

Tekijä VIII:C-aktiivisuuden määrittäminen voidaan suorittaa käyttämällä joko kaksivaiheista testiä tai yksivaiheista testiä. On todistettu tosiasia, että yksivaiheiset ja kaksivaiheiset testit voivat johtaa tekijä VIII:C-aktiivisuuden erilaisiin määrityksiin näytteessä. Lisäksi tiedetään, että toistetut määrittelyt käyttäen samaa testiä samassa 20 näytteessä voivat tuottaa vaihteluita tekijä VIII:C-aktiivisuuden määrittelyssä.

Tässä käytettynä ilmaus "plasma" tarkoittaa verta, josta on poistettu kaikki verisolut ja verihiutaleet esimerkiksi sentrifiigoimalla.

25 "Tekijä VIII:Ag" tarkoittaa tekijän VIE kaltaista antigeeniä ja "vWF:Ag" von Wil lebrand -tekijän kaltaista antigeeniä. "Pakatun kolonnin tilavuus" on määritetty pakatun geeliväliaineen ja välisijatilavuuden tilavuudeksi. "Välisijatilavuus" on määritetty geelipartikkelien välisen puskurin tilavuudeksi ja "eluointitilavuus" on spesifisen materiaalin eluoimiseen käytetyn puskurin tilavuus. Ilmausta "kolonnin täyte" 30 on käytetty kerrokseen lisätyn materiaalin tilavuuden ilmaisemiseen laskettuna pro-.: senttinä pakatun kolonnin tilavuudesta. Ilmauksen "fraktionointialue" on tarkoitettu tarkoittavan (globulaaristen) proteiinien tai suurempien molekyylien molekyylipai-nojen aluetta, jolle toimittaja on suositellut geelimateriaalia.

35 Esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää selostetaan edelleen viitaten piirustuksiin ja esimerkkeihin, jotka selventävät keksinnön suoritusmuotoja. Esimerkit on 8 103510 annettu vain keksinnön valaisemiseksi eikä niitä ole tehty keksinnön piirin rajoittamiseksi, joka on määritetty oheistetuissa patenttivaatimuksissa.

Esillä olevaa keksintöä valaistaan lisäksi viitaten oheisiin piirustuksiin, joissa 5 kuvio 1 esittää käyrää, joka esittää tekijän VIII eluoitumisen geelisuodatuksella esillä olevan keksinnön mukaisesti ja joka on määritetty erilaisilla testeillä, ja kuvio 2 esittää erilaisten plasmaproteiinien eluointijärjestyksen geelisuodattamal-10 la tämän keksinnön mukaisesti.

Esimerkki 1

Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi 15 Halkaisijaltaan 2,6 cm:n kolonniin pakattiin Sepharose CL-4B:tä lopulliseen 60 cm:n korkeuteen.

Eräästä tanskalaisesta veripankista peräisin oleva jäätynyt plasma sulatettiin 25 °C:een vesikylvyssä. 1 IU hepariinia/ml lisäämisen jälkeen 50 ml plasmaa (16 % 20 pakatun kolonnin tilavuudesta) lisättiin kolonniin käyttäen virtausta 100 ml/h, minkä jälkeen kolonni eluoitiin käyttämällä 200 ml/h puskurin pakotettua virtausta, joka vastaa 0,63 pakatun kolonnin tilavuutta tunnissa. Kolonnin tasapainottaminen ja eluointi suoritettiin käyttämällä puskuria 0,02 M sitraattia, 0,15 M NaCl, pH 7,4. Puskuriin lisättiin lisäksi 2,55 ml 1 M CaCl2 litraa kohti, mikä tuottaa vapaan kai-25 siumionin (Ca ) konsentraation noin 7 x 10' M. Vapaan kalsiumionin konsentraatio tarkistettiin käyttämällä kalsiumselektiivistä elektrodia, joka oli Ingold GmbH:sta (Frankfurt/Main, Saksa). Fraktiot kerättiin ja jokaiselle fraktiolle määritettiin OD28o, tekijä VIII:C (käyttämällä sekä yksivaiheista hyytymistestiä sekä kaksivaiheista kro-mogeenistä testiä), tekijä VIII:Ag, albumiini, IgG, fibrinogeeni, IgM, alfa-2-makro-30 globuliini, tekijä IX, tekijä X, proteiini C ja antitrombiini III. Proteiini mitattuna OD280:lla, eluoitiin pienenä huippuna välisijatilavuudessa (fraktiot 10-18), mitä seurasi erittäin suuri leveä huippu (fraktiot 19-50, vrt. kuvio 1). 82 % tekijä VIII:C-aktiivisuudesta määritettynä kaksivaiheisella ja 91 % tekijä VIII:C-aktiivisuudesta määritettynä yksivaiheisella hyytymistestillä eluoitui yhdessä kasaumahuipussa, jos-35 sa on välisijatilavuus (tekijän VIII pääfraktio) yhdessä aikaisemman pienen proteii-nihuipun kanssa. Loput tekijästä VIII eluoitui pienessä seuraavassa huippuhännässä välittömästi tekijän VIII pääfraktion jälkeen (fraktiot 19-26). Tekijä VIII:Ag ja 9 103510 vWF:Ag eluoituivat yhdessä tekijän VIII:C kanssa, mutta niissä oli hieman laajemmat niitä seuraavat huippuhännät. Kaikki muut määritetyt plasmaproteiinit eluoituivat fraktiossa, joka on tekijän VIII pääfraktion jälkeen yhdessä suuren leveän huipun kanssa (katso kuvio 2). Tekijästä VIII:C erotettujen plasmaproteiinien molekyy-5 lipainot ovat seuraavat:

Antitrombiini ΙΠ 65000 D

Proteiini C 62000 D

Tekijä X 59000 D

10 Tekijä IX 57000 D

Alfa-2-makroglobuliini 718000 D

IgM 900000 D

Fibrinogeeni 340000 D

IgG 150000 D

15 Albumiini 67000 D

Tekijä VIII:C-aktiivisuuden määrittely käyttäen kaksivaiheista kromogeenistä testiä suoritettiin käyttämällä kromogeenistä substraattimenetelmää (KABI, Coatest Factor VIII), alkuperäisessä menetelmässä käytetään testiputkia 37 °C:ssa ja se on oli mo-20 difioitu suoritettavaksi käyttämällä mikrotiitterilevyjä käyttäen vähemmän reagens-seja. Käytetään 50 mikrolitran näytettä tai standardia, jota inkuboidaan sen jälkeen kun siihen on sekoitettu 75 mikrolitraa fosfolipidiliuosta, tekijää IXa, tekijää X ja CaCh, 37 °C:ssa 15 minuuttia, minkä jälkeen lisätään 50 mikrolitraa substraattia. 20 minuutin lisäinkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen reaktio sammutetaan lisäämällä 25 50 mikrolitraa 1 M sitruunahappoa. Värin kehittyminen luetaan 405 nm:ssä vertai lun ollessa 492 nm:ssä.

Tekijä VIII:C-aktiivisuuden määrittely käyttäen yksivaiheista testiä suoritettiin käyttämällä APTT-menetelmää (Activated Partial Thromboplastin Time). 100 mik-30 rolitraa näytettä tai standardia pipetoidaan kulhoihin, minkä jälkeen lisätään . 100 mikrolitraa puutteista plasmaa (tekijä VHI-puutteinen plasma, General Diag nostic) ja liuosta lämpösäädettiin 37 °C:ssa 5 minuuttia. 100 mikrolitran 0,03 M CaCb lisäämisen jälkeen määritettiin aika, jossa liuos hyytyi.

35 Kvantitatiivisia määritettyjä varten tuotettiin kalibraatiokäyrät, jotka perustuvat vasten WHO-standardia (3rd Int. Standard of FVIII, Human plasma, 3,9 IU/ml) kalibroidun ominaisstandardin laimennussarjoihin. Tässä kuvatussa kaksivaiheisessa 10 103510 testissä on alempi (noin 10 kertaa) havaintoraja kuin yksivaiheisessa testissä. Lisättäessä hepariinia on edullista käyttää kaksivaiheista testiä, koska silloin voidaan poistaa kaikki mahdolliset hepariinin vaikutukset testiin helpommin laimentamalla.

5 Tekijä VIII:Ag määritettiin ELISAa käyttämällä käyttäen tekijä VIII -inhibiittori-potilaasta peräisin olevia vasta-aineita mikrotiitterilevyjen päällystysaineina (Nunc, Kamstrup, 4000 Roskilde, Tanska) ja käyttämällä samasta inhibiittoripotilaasta peräisin olevia peroksidaasilla merkittyjä F(AB')2-fragmentteja sitoutuneen tekijän VIII määrittämiseen (Thromb. Haemost., 53(3), 1985, 346-350). Standardikäyrät 10 valmistettiin käyttämällä yhdistettyä normaalia plasmaa, joka oli kalibroitu vasten WHO-standardia (1st IRP, established 1982).

vWF:Ag määritettiin myös käyttämällä ELISAa mutta käyttämällä kanin antihu-maania vWG (DAKO, Tanska) päällystysmateriaalina ja peroksidaasilla merkittyä 15 kanin antihumaania vWF (DAKO, Tanska) sitoutuneen vWF:n määrittämiseen. Standardikäyrät valmistettiin käyttämällä samaa normaalia plasmaa kuin tekijä VIII:Ag:n ELISAn osalta.

Tekijä IX määritettiin käyttämällä yksivaiheista hyytymistestiä samalla tavoin kuin 20 tekijässä VIII:C käyttäen vain tekijä IX -puutteista plasmaa. IgG määritettiin käyttämällä säteisimmunodiffuusiota (Immunochemistry, 2, 1965, 235-254) ja albumiini, fibrinogeeni, alfa-2-makroglobuIiini, tekijä X, proteiini C ja antitrombiini III havaittiin käyttämällä raketti-immunoelektroforeesia (Anal. Biochem., 15, 1966, 45.52). OD28o määritettiin käyttämällä spektrofotometriä (Spectronic 601, Milton 25 Roy Company) ja proteiini käyttäen Kjeldahlia määritettiin Ph. Eur. 2. painos, I, V.3.5.2 mukaisesti presipitoimatta TCA:lla. Puhdistettujen fraktioiden spesifinen aktiivisuus laskettiin tekijän VIII:C-konsentraation suhteena joko OD28o:aan tai proteiinin konsentraatioon määritettynä Kjeldahlia käyttäen. Käytettäessä OD28o spesifisen aktiivisuuden laskemiseen eivät erilaisten kokeiden tulokset ole suoraan 30 verrattavissa, jollei käytetä samaa lähtöplasmaa, koska tekijää VIII sisältävä plasma on usein sameaa, katso Ratnoff et al.:n tulokset (J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962).

Erilaiset kokeissa käytetyt geelisuodatusväliaineet olivat seuraavista lähteistä: 35 Sepharose CL-6B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose 6FF, Sepharose 4FF, Sephacryl S-400 ja Sephacryl S-500 olivat kaikki Pharmaciasta (Hiller<j>d, Tanska), Biogel A-5m, Fine oli BioRadista (Bie & Bemtsen, R<|>dovre, Tanska), „ 103510

Fractogel TSK HW-65(F) oli Merckiltä (Struers, R<|>dovre, Tanska) ja Matrex Cel-lufine GCL 2000 oli Amiconista (Helsingborg, Ruotsi).

Esimerkki 2 5

Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi käyttämällä erilaisia geeli-suodatusväliaineita

Halkaisijaltaan 2,6 cm:n kolonniin pakattiin erilaisia geelisuodatusväliaineita, joilla 10 on erilainen fraktionointialue ja erilainen rakenne. Kaikissa tapauksissa pakatun kerroksen lopullinen korkeus oli 60 cm. Plasma sulatettiin kuten esimerkissä 1 kuvataan ja 1 IU hepariinia lisättiin. Jokaista geelisuodatusta varten kolonniin panostettiin 50 ml plasmaa (16 % pakatun kolonnin tilavuudesta). Kolonnin panostus ja puskurilla eluointi suoritettiin, kuten esimerkissä 1 kuvataan. Virtausnopeus oli kaikissa 15 tapauksissa sama paitsi kokeessa, jossa käytettiin Biogel A-5m, jossa virtausnopeus laskettiin 50 ml:aan/h nousseesta vastapaineesta johtuen. Fraktiot kerättiin ja jokaisesta fraktiosta määritettiin OD28o ja tekijä VIII:C käyttämällä Coatestiä. Tekijän VIII pääfraktion spesifinen aktiivisuus laskettiin tekijän VIII:C/ml suhteena OD28o:een. Kokeet toistettiin n kertaa käyttäen erilaisia plasmoja kutakin panostusta 20 kohti ja saannon keskiarvot ja spesifinen aktiivisuus laskettiin. Tekijän VIII pääfraktio valittiin samalla tavalla kuin esimerkissä 1 kuvataan ja saanto on annettu tekijän VIII:C pitoisuutena tekijän VOI pääfraktiossa lisätyn plasman tekijän VIII:C pitoisuusprosenttina.

* · · 25 Fraktionointialue ja partikkelikoko erilaisten väliaineiden osalta ja lasketut keskiarvot on annettu seuraavassa taulukossa I.

12 103510

Taulukko I

Geelisuodatus- Fraktionoin- Kokeiden Saanto- Spesifinen Partikkelien väliaine alue MW määrä n % aktiivisuus halk. märkä, pm A 1x104-4x106 3 95 0,16 40-165 B 6x104-2x107 4 82 0,88 40-165 C 7x105-4x107 3 68 0,24 60-200 D 1x104-4x106 3 96 0,71 40-165 E 6x104-2x107 3 86 1,35 40-165 F 6x104-8x107 3 91 0,28 40-105 G 1x104-5x106 1 71 0,12 40-80 H 5x104-5x106 2 84 0,18 32-63 I 1x104-3x106 2 92 0,18 45-105 J 1x104-8x106 3 101 0,75 40-105 A: Sepharose CL-6B; B: Sepharose CL-4B; C: Sepharose CL-2B; D: Sepharose 5 6FF; E: Sepharose 4FF; F: Sephacryl S-500; G: Biogel A-5m, Fine; H:, Fractogel TSK HW-65(F); I: Matrex Cellufme GCL 2000; J: Sephacryl S-400.

Esimerkki 3 10

Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi käyttämällä erilaisia kolonnin _____ panostuksia

Halkaisijaltaan 2,6 cm kolonniin pakattiin Sepharose 4FF lopulliseen korkeuteen 15 60 cm. Plasma sulatettiin, kuten esimerkissä 1 kuvataan. Sulattamisen jälkeen plas

man pH säädettiin 7,0:aan käyttämällä 0,5 M HC1, 1 IU hepariinia ml kohti lisättiin ja plasma suodatettiin 10 mikrometrin nailonsuodattimen läpi. Kolonniin lisättiin 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml ja 70 ml plasmaa vastaavasti. Lisääminen, virtaus ja puskurilla eluointi suoritettiin, kuten esimerkissä 1 kuvataan, joskin puskuri säädettiin 20 7,0:aan. Fraktiot kerättiin ja jokaisesta fraktiosta määritettiin OD280 ja tekijä VIII:C

käyttämällä Coatestiä. Tekijän VIII pääfraktion spesifinen aktiivisuus laskettiin tekijän VIII:C/ml suhteena OD2go:een. Kokeet toistettiin kolme kertaa käyttäen erilaisia plasmoja kutakin panostusta kohti ja keskiarvot (X) laskettiin. Tekijän VIII pääfrak-* tion tilavuus (ml) on tekijää VIII sisältävän fraktion tilavuus, joka voidaan kerätä en- ,3 103510 nen kuin suuri leveä proteiinihuippu (OD280) eluoidaan ja se valitaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1 kuvataan. Saanto on annettu tekijän VIII:C pitoisuutena tekijän VIII pääfraktiossa lisätyn plasman tekijän VIII:C pitoisuusprosenttina.

5 Lasketut arvot on annettu seuraavassa taulukossa II.

Taulukko II

Lisätyn plasman määrä Tekijän VIII Saanto pro- Spesif. aktiivi- pääfraktio sentteinä suus millilitroina miina % pakatun osa kolonnin tilav. no.

1 70 88 0,81 2 70 95 0,18 30 9,4 3 70 90 0,63 x 70 91 0,54 1 70 76 0,68 2 70 85 0,17 40 12,6 3 70 93 0,61 x 70 85 0,49 1 80 91 0,57 2 80 90 0,20 50 15,7 3 80 85 0,53 x 80 89 0,43 1 80 79 0,81 2 80 85 0,16 60 18,8 3 90 95 0,61 x 83 86 0,53 1 80 85 0,82 2 100 90 0,21 70 22,0 3 100 93 0,53 x 93 89 0,52 m 103510

Esimerkki 4

Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi käyttämällä erilaisia eluoin-tiarvoja 5

Samaan kolonniinn kuin esimerkissä 3 käytettiin, lisättiin 50 ml plasmaa, joka sulatettiin kuten edelllä. Sulattamisen jälkeen plasman pH säädettiin 7,0:aan käyttämällä 0,5 M HC1, 1 IU hepariinia ml kohti lisättiin ja plasma suodatettiin 10 mikrometrin nailonsuodattimen läpi. Käyttämällä kolmea erilaista annosta plasmaa virtausnopeu-10 det 100, 200 ja 300 ml/h tutkittiin vastaavasti. Plasman lisäyksen ja sitä seuraavan eluoinnin aikana käytettiin samaa virtausta. Eluointi suoritettiin käyttämällä samaa puskuria kuin esimerkissä 3 kuvataan. Fraktiot kerättiin ja jokaisesta fraktiosta määritettiin OD280 ja tekijä VIII:C käyttämällä Coatestiä. Tekijän VIII pääfraktion spesifinen aktiivisuus ja saanto kuten esimerkissä 3. Tekijän VIII pääfraktion tila-15 vuuden keskiarvot (X), saanto ja spesifinen aktiivisuus laskettiin. Tulokset on annettu seuraavassa taulukossa III.

Taulukko III

Virtaus Plasman Tekijän VIII Saanto pro- Spesifi aktiivi- osa no. pääfraktio sentteinä suus millilitroina ml/h pakatun kolonnin tilav.

1 80 89 0,75 2 80 88 0,17 100 0,31 3 80 80 0,65 x 80 86 0,52 1 80 84 0,99 2 80 88 0,18 200 0,63 3 80 89 0,79 x 80 87 0,65 1 70 85 0,72 2 80 96 0,18 300 0,94 3 80 83 0,44 x 77 88 0,45 20

Esimerkki S

15 103510

Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi käyttämällä erilaisia kolonnin panostuksia 5

Halkaisijaltaan 10 cm kolonniin pakattiin Sepharose 4FF lopulliseen korkeuteen 60 cm. Eräästä tanskalaisesta veripankista peräisin oleva jäädytetty plasma sulatettiin 30 °C:ssa vesikylvyssä. Kolonniin lisättiin 925 g, 1427 g ja 2000 g plasmaa vastaavasti. Virtausta pidettiin noin 4200 ml/h plasman lisäämisen ja eluoinnin ai-10 kana käyttäen Masterflex-letkupumppua (Buch & Holm, Herlev, Tanska), mikä vastaa noin 0,89 pakatun kolonnin tilavuutta tunnissa. Eluointiin käytettiin samaa puskuria kuin esimerkissä 1. OD2go:tä tarkkailtiin jatkuvasti käyttämällä Pharmacia Monitor UV-l:tä. Kim OD28o alkoi nousta välisijatilavuuteen, aloitettiin tekijän VIII pääfraktion kerääminen ja se lopetettiin, kun OD28o osoitti, että suuri proteii-15 nihuippu alkoi olla eluoitunut. Tekijän VIII pääfraktiossa olevat tekijä VIII:C-pitoisuudet määritettiin käyttämällä yksivaiheista hyytymistestiä ja proteiini määritettiin käyttämällä Kjeldahlia. Spesifinen aktiivisuus laskettiin tekijä Vlll-pääfrak-tiossa olevien tekijä VHI.C-yksikköjen kokonaisluvun suhteena tekijän VIII pääfraktiossa olevan proteiinin milligrammojen kokonaismäärään. Tekijän VIII:C 20 saanto laskettiin tekijän VIII pääfraktiossa olevan tekijän VIII:C pitoisuuksina lisätyssä plasmassa olevan tekijän VIILC pitoisuuksien prosentteina.

Tulokset on annettu taulukossa IV.

25 Taulukko IV

Lisätyn plasman määrä Tekijän VIII Saanto pro- Spesifi aktiivi- pääfraktio sentteinä suus IU/mg grammoina grammoina % panostetun •« kolonnin tilavuudesta 925 19,6 1192 74 2,50 1497 31,8 1860 73 2,24 2000 42,4 2200 81 1,08

Esimerkki 6 16 103510

Plasman geelisuodattaminen tekijän VIII eristämiseksi käyttämällä teollisuusko-koista kolonnia 5

Halkaisijaltaan 29 cm:n kolonniin pakattiin Sepharose 4FF. Sen jälkeen kun oli tasapainotettu samalla puskurilla kuin esimerkissä 1, geelikorkeus oli 53 cm. 10 kg eräästä tanskalaisesta veripankista peräisin olevaa jäädytettyä plasmaa sulatettiin ja se kuumennettiin 30 °C:een, minkä jälkeen se lisättiin kolonniin. Lisätty määrä oli 10 28,8 % pakatun kolonnin tilavuudesta. Virtausta 30 ml/h, joka vastaa 0,86 pakatun kolonnin tilavuutta, ylläpidettiin käyttäen Masterflex-letkupumppua lisäämisen ja eluoinnin aikana käyttäen tasapainotuspuskuria. OD28o:tä tarkkailtiin jatkuvasti käyttämällä Pharmacia Monitor UV-l:tä ja silloin kuin osoitettiin ensimmäinen OD280:n nousu välisijatilavuuteen, kerättiin tekijän VIII pääfraktio. Kaiken kaikki-15 aan kerättiin 11,73 kg tekijän VIII pääfraktiota. Sitten määritettiin tekijä VIII:C-pitoisuudet käyttämällä yksivaiheista hyytymistestiä ja proteiini määritettiin käyttämällä Kjeldahlia. Tekijän VIII fraktiosta havaittiin kaiken kaikkiaan 8798 IU tekijää VIII:C ja alle 2346 milligrammaa proteiinia, mikä tuottaa tekijän VIII:C saannon 880 IU/kg plasmaa, mikä vastaa 88 % saantoa tuotteen muodossa, jonka 20 spesifinen aktiivisuus on yli 3,75 IU/mg proteiinia.

Keksinnön mukaisella menetelmällä saatu tekijän VIII fraktio voidaan puhdistaa lisäksi tavalla, joka on analoginen uudelleen liuotetun kryopresipitaatin konventionaalisen puhdistuksen kanssa ja käsittää esimerkiksi lisäkromatografrapuhdistuksen « · · 25 ja lyofilisoinnin käyttäen tavallisia täyteaineita vakaan valmisteen muodostamiseksi. Valmiste rekonstruoidaan ennen käyttämistä käyttäen sopivaa konventionaalista apuainetta.

i

Claims (6)

17 103510

1. Menetelmä tekijän VIII eristämiseksi muista veren plasmassa olevista proteiineista käyttämällä geelisuodatusväliainetta, tunnettu siitä, että eristetty plasma 5 tai sulatettu äskettäin jäädytetty plasma, joka on esikäsitelty optionaalisesti, kunhan optionaalisella esikäsittelyllä ei ole mitään merkittävää vaikutusta plasman tekijä Vili -pitoisuuksiin, alistetaan suoraan geelisuodatukseen ryhmäerotusolosuh-teissa, jolloin lisätyn plasman tilavuus on vähintään 5 % pakatun kolonnin tilavuudesta ja jolloin virtausnopeus on vähintään 0,3 pakatun kolonnin tilavuutta 10 tunnissa geelisuodatusväliaineen ollessa koostettu partikkeleista, jotka ovat inertte-jä tekijälle VIII ja joiden fraktionointialue on välillä Ixl03-lxl08, ja tekijän VIII pääfr aktio kerätään.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geelisuoda-15 tusväliaine koostuu geelimateriaalista, jonka fraktionointialue on välillä lxlO4- 8x107.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geelisuoda-tusväliaine koostuu geelimateriaalista, jonka fraktionointialue on välillä 5xl04- 20 4xl07.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätyn plasman tilavuus on 15-40 % pakatun kolonnin tilavuudesta.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virtausnopeus on 0,5-2 pakatun kolonnin tilavuutta tunnissa.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu tekijä VIII puhdistetaan lisäksi tavalla, joka on analoginen uudelleen liuote-30 tun kryopresipitaatin konventionaalisen puhdistamisen kanssa analoginen ja käsit-tää esimerkiksi lisäkromatografiapuhdistamisen ja lyofilisoinnin käyttämällä tavallisia täyteaineita stabiilin valmisteen muodostamiseksi.