PT95830B - Processo para o isolamento do factor viii sob a forma de uma fraccao pura directamente de plasma mediante filtracao em gel - Google Patents
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Description
PROCESSO PARA O ISOLAMENTO DO FACTOR VIII SOB A
FORMA DE UMA FRACÇÃO PURA DIRECTAMENTE DE PLASMA
MEDIANTE FILTRAÇÃO EM GEL
NOVO NORDISK A/S
A presente invenção refere-se a ura método para se isolarem compostos biológicos, tais como proteínas , especialmente o facto VIII de coagulação, a partir dos fluídos orgânicos, tal como o plasma, utilizando a filtração em gel como um primeiro passo de isolamento.
ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO factor VIII, também conhecido como o factor anti-hemofílico A ou AHF é uma proteína plasmátiea que participa no curso intrínseco da coagulação sanguínea.
factor VIII circula no plasma sanguíneo numa concentração extremamente baixa, sob a forma de um complexo não covalente de duas proteínas que possuem, respectivamente, a actividade coagulante do Factor VIII (Factor VIII : C) e actividade de co-faetor ristocetina (Factor de von Willebrand (vWF)), possuindo o referido complexo um peso molecular de 1-20 x 10θ D.
Factor VIII : C encontra-se ausente ou defeituoso em indivíduos que padecem do distúrbio hemorrágico, Hemofilia A, que afecta de 5 a 100 000 em cada indivíduo factor de von Willebrand liga-se às plaquetas activadas de tal modo que potência a agregação das plaquetas activadas. Pode efectuar-se este efeito, in vitro, pela agregação de plaquetas induzidas por ristocetina Em simultâneo com a doença de von Willebrand pode observar-se um prolongado tempo de hemorragia, devido à carência ou aos níveis reduzidos de actividade biológica do Factor de Wil^ lebrand.
Os hemofílicos que sofrem de hemofilia A e os pacientes que sofrem de casos graves da doença de van Willebrand, são actualmente tratados com concentrados que en globam o Factor VIII : C/vWF, um tratamento que melhora as suas condições de vida e que se caracteriza por uma capacidade económica considerável e, que contribuiu para um tempo de vida mais prolongado destes pacientes.
Podem prcduzir-se as preparações farmacêuticas que contêm o Factor VIII (Factor VIII : C e/ou vWF) a partir do sangue ou do plama sanguíneo. Pode efectuar-se a produção de tais preparações de acordo com diversos procedimentos conhecidos, todos caracterizados pelo baixo ren dimento, especialmente o Factor VIII : C. É comum a fase ini ciai de todos os métodos, um passo inicial de purificação que consiste numa crioprecipitação. Por crioprecipitação, descongela-se o plasma congelado a uma temperatura compreendida entre 0°-4°c, que origina um precipitado que engloba o Factor VIII, que pode ser recolhido, por exemplo, por centrifugação. Apesar da crioprecipitação ser relativamente simples,
-3possui uma grande desvantagem, devido ao facto de que, quando utilizada em larga escala, isto é agregados de plasma que con sistam em mais do que 5 kg, proporcionam uma baixa produção de Factor VIII : C (30-45 $ do teor plasmático), o que sig nifica que o rendimento final é baixo em relação a outros pa£ sos de purificação que se utilizam a jusante.
Para além disso, incluiu-se um passo de inactivação de um virus, durante a produção das preparações do Factor VIII. Os passos de inactivação do virus aumentam, consideravelmente a segurança contra os virus das preparações mas originam, na maioria dos casos, uma redução consequente de produção do Factor VIII : C.
Os rendimentos totais muito baixos de Fac tor VIII conduziram a uma carência dessas preparações em diver_ sos locais e, por isso, existe uma necessidade de novos métodos para se purificar o Factor VIII com elevado rendimento para se satisfazer a procura de Factor VIII para o tratamento de hemofílicos.
Revestir-se-iam de grande interesse novos métodos para se isolar o Factor VIII directamente a partir do plasma, com elevado rendimento, uma vez que mais de 70 $ do teor de Factor VIII do plasma se perde quer precocemente,quer durante ou antes da crioprecipitação.
Recentemente, tentou isolar-se o Faetor VIII directamente do plasma utilizando uma cromatografia de
-4afinidade (Thromb. Haemost., 61, (2), 234-237 (1989)) mas apenas se obteve um rendimento inferior a 60 $ e uma actividade específica de 1 IU de Factor VlII/mg de proteína da fracção isolada contendo o factor VIII.
f A filtração através de gel, também designada por cromatografia de permeabilização ou cromatografia por exclusão de tamanho, consiste num processo controlado de difusão que se utiliza para se separar solutos de acordo com as suas dimensões. Fazem-se passar estes solutos através de uma coluna cheia com partículas de gel porosas, inertes, que possuem poros com dimensões que excluem as moléculas maiores enquanto que as moléculas menores se difundem na fase estacionária no interior das partículas de gel. Deste modo,sendo as moléculas maiores totalmente excluídas das partículas de gel, eluem-se em primeiro lugar com o volume vazio enquanto as moléculas menores gastam um período de tempo mais longo a atravessar a coluna e eluem-se de acordo com dimensões decres_ centes à medida que aumentam os volumes de eluição.
Pode efectuar-se a filtração em gel, de acordo com dois procedimentos diferentes:
1. Modo de Separação em Grupo
No modo de separação em grupo, separam-se os solutos em dois grupos que possuem uma grande diferença nos seus tamanhos moleculares, sendo um dos grupos eluído com um volume vazio e o outro grupo eluído posteriormente com um volume de eluição muito maior, aproximando-se muitas vezes do chamado volume de leito; utiliza-se em pri-5meiro lugar,este procedimento para se separarem as proteínas dos sais dissolvidos ou para trocar o tampão e isto designa-se por dessalinização. Para se efectuar a dessalinização” utilizam-se geles rígidos que possuem poros de tamanho diminuto e pode efectuar-se o processo utilizando grandes quantidades de material (vo lumes de amostras que constituem 20-30 1° do volume do leito) e utilizando um débito elevado (cerca de um volu_ me de leito de tampão por hora); deste modo a coluna possuirá uma grande capacidade.
2. Modo de Fraccionamento
No modo de fraccionamento, separam-se os solutos que pos. suem um peso molecular idêntico; utiliza-se muitas vezes este procedimento para se separarem as proteínas.
Com esta finalidade, utilizam-se partículas de gel que possuem poros mais largos e escolhe-se o meio de filtração em gel, de modo a assegurar que as proteínas sejam eluídas entre o volume vazio e um volume de eluição correspondente ao volume de leito total. As substâncias são eluídas mais estreitamente do que quando se utiliza ram as condições de separação em grupo e podem sobrepor-se. Para além disso não são desejáveis débitos mais ele vados devido ao facto de não permitirem uma separação eficaz das proteinas e deve manter-se a carga da coluna baixa tendo em vista a obtenção de uma separação razoável
-6das proteínas individuais. Deste modo, a filtração em gel, que se utiliza no modo de fraccionamento só é reco mendável para a separação das proteínas como um último passo de aperfeiçoamento quando o volume que se preten de fraccionar é pequeno (Jagschies, Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3 (10), 1988 e Bio/Technol. , 4-, p. 954-58 ( 1986)).
Tentou-se isolar o Factor VIII a partir do plasma utilizando filtração em gel (J. Lab. Clin. Med.; 72, (6), 1968, p. 1007-1008 e J.Clin. Invest.'·; 48; 1969; p. 957-962). Verificou-se um elevado nível de purificação durante os ensaios mas os rendimentos foram de apenas 40-50 Descobriu-se que a pureza da fracção resultante que continha o Factor VIII dependia do plasma de partida, assim como um grande teor de lípidos e de quilomicrons que deu origem a uma fracção de Factor VIII turva que possuia uma actividade específica baixa. Verificou-se que a técnica de filtração em gel utilizada não permitia a manipulação de grandes quantidades de plasma apesar das experiências preliminares indicaram que era possível a filtração em gel da fracção de Cohn I mais concentrada.
Para além disso, Paulssen e outros, (Thromb. Diasthes. Haemorr.; 22, 1969; p. 577-583) descobriram que o Factor VIII podia ser separado das outras proteínas plasmáticas utilizando o meio de gel Sepharose 6B, mas que a oromatografia utilizando a filtração em gel apenas
-7parecia possível quando se efectuava em larga escala, quando se utilizava um crioprecipitado redissolvido como material de partida.
A patente de invenção norte-americana N- 3 637 489, divulga um processo para a separação de componentes sanguíneos utilizando a filtração em gel e utilizandopérolas de vidro poroso. Este processo destina-se especialL mente à separação dos materiais imunológicamente activos dos outros constituintes séricos ou plasmáticos.
Desde então, fizeram-se diversas tentativas para utilizar a filtração em gel para se purificar o Factor VIII, mas essas tentativas concentraram-se na filtração em gel de fracções de plasma parcialmente purificadas (crioprecipitado redissolvido e posterior purificação das suas fracções). Efectuaram-se todas as tentativas utilizando pequenas cargas nas colunas e/ou pequenos débitos ou combinações dos mesmos.
Desde 1959 que se conhece a filtração em gel como um método para o fraccionamento de proteínas este método é amplamente utilizado nos laboratórios de investigação bioquímica, como um método para a caracterização de pro teínas e para a purificação de proteínas a partir de amostras com pequenos volumes, por exemplo, inferiores a 1 litro. A filtração em gel não foi utilizada, até à presente invenção, na separação de proteínas por fraccionamento, em larga escala, tendo sido apenas utilizada para a dessalinização de
-8etanol e de sais de soluções de albumina. Deste modo, tal como se afirma nos livros da especialidade: a principal razão porque a filtração em gel não se torna a principal técnica do fraccionamento do plasma reside na baixa produção de proteínas por volume de coluna” (J. H. Berglõf : Fractionation by Gel filtration, p. 163 - 173 em J. M. Curling (Ed.): Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press, London, 1980) e infelizmente, as massas proteicas que podem ser manipuladas por colunas de tamanho razoável são pequenas e não se pode negligenciar a diluição da amostra. Contudo, não se utiliza muito o método no fraccionamento plasmático” (J.J. Morgenthaler e outros: Preservation of Struture and function during isolation of human plasma proteins, p. 127—138 em Smit Sibinga e outros (Eds.): Plasma Fraeionation and Blood Transfusion, Martin Nijhoff Publishers, Boston, 1985).
Na patente de invenção norte-americana N2. 4 675 385, descreve-se um processo para isolar a proteína procoagulante do Factor VIII, a partir de uma preparação de plasma que compreendia o Faetor VIII, constituintes de elevado peso molecular e constituintes de reduzido peso molecular, por cromatografia sequencial de exclusão de tamanho, de elevado ren dimento, preparando num primeiro passo, uma composição aquosa, tratada com tampão de uma preparação de plasma e separando os constituintes de peso molecular reduzido, introduzindo a com posição numa coluna de cromatografia de pérolas porosas de cro matografia líquida de elevado rendimento que possuíam um tama-9nho compreendido entre cerca de 13 micra e cerca de 35 micra e eluindo a coluna com uma solução aquosa tamponada eluente. No sentido de se obter uma boa separação, a patente de invenção norte-americana N^ 4 675 3Ô5 indica a utilização de colunas que possuem uma proporção visível não inferior a, aproximadamente 10 e 40 o que reduz a capacidade mas não assegura uma boa separação dos constituintes do Factor VIII a partir das proteínas plasmáticas de reduzido peso molecular. Contudo, este primeiro isolamento não assegura uma boa separação das proteínas que apresentam actividade de Factor VIII das outras proteínas constituintes da preparação plasmática que apenas se obteve efectuando uma segunda CLER.
Deste modo, até à presente invenção,considerava-se como um facto aceite que a filtração em gel não constitui um método adequado para a separação de proteínas no fraccionamento plasmático, quando se manipulam grandes volumes , como por exemplo, no caso anteriormente referido, mais de 5 litros.
Descobriu-se, agora, de modo surpreendente , que quando se seleccionam materiais para filtração em gel, que sejam concebidos para débitos elevados, é possí_ vel isolar o Factor VIII sob a forma de uma fracção pura, com um rendimento muito elevado, directamente a partir do plasma por separação mecânica muito cuidadosa sem necessidade de se confiar na normal crioprecipitação inicial.
BREVE DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método para isolar o Factor VIII sob a forma de um complexo de Factor VIII : C e vWF a partir de outras proteínas do pias ma sanguínio, utilizando a filtração em gel.
método da presente invenção caracteriza-se pelo facto de se submeter o plasma isolado ou o plasma congelado recentemente descongelado a uma filtração em gel em condições de separação em grupos utilizando a uma carga elevada e um débito elevado, sendo o meio de filtração em gel constituído por partículas que são inertes para o Factor VIII e que possui uma amplitude de fraccionamento compreendio g da no intervalo que vai de 1 χ 30ΰ a 1 x 10 e, de um modo 4 7 preferencial entre 1 x 10 a o x 10 . A variação de fraccionamento pode encontrar-se compreendida, por exemplo, no intervalo de 5 x 10^ a 4 x 10?.
Num aspecto preferencial, o volume de plasma adicionado é de, pelo menos, 5 % do volume de leito. A quantidade de plasma adicionada encontra-se de preferência compreendida entre 15-40 $ do volume do leito.
Efectua-se de um modo preferencial o método da presente invenção, utilizando um débito de, pelo menos 0,3 volumes do leito por hora, e de um modo ainda mais preferencial, a um débito de 0,5-2 volumes do leito por hora.
Para os fins da presente invenção, utili za-se um meio de filtração em gel que possua a rigidez que permita uma rápida eluição. Para além disso, o gel deve ser química e imunologicamentre inerte para o Factor VIII, duran te a filtração em gel. Os ensaios indicaram que se pode levar a efeito o método da presente invenção utilizando geles comerciais tais como Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S-400, Sephacryl S-500, Fractogel TSK HW-65(F) e Matrex Cellufine CGL 2000, sendo todos eles adequados para a finalidade da pre sente invenção.
Tais geles possuem geralmente um tamanho de partícula (húmida) compreendido no intervalo entre cerca de 32 /im e cerca de 200 /im.
De acordo com um dos aspectos do método da presente invenção, descongela-se o plasma congelado e assegura-se que todo o Factor VIII foi dissolvido após o que se adiciona de preferência, o plasma descongelado à coluna imediatamente após ter-se dissolvido todo o Factor VIII. De preferência não se deixa elevar demasiado a temperatura, para se evitar uma degradação demasiado extensa do Factor. VIII.Pode tratar-se previamente o plasma adicionando, por exemplo, por adição de heparina, citrato, sacarose, aminoácidos, sais ou outros agentes estabilizantes e, eventualmente, filtrando, centrifugando, concentrando por ultrafiltração, precipitação prévia utilizando agentes de precipitação habituais, ou tratando previamente de outra maneira antes de se adicionar o mesmo â coluna embora nenhum dos eventuais tratamentos prévios tenha uma influência significativa no teor de Factor VIII do plasma.
método da presente invenção demonstrou, de um modo surpreendente, proporcionar um rendimento muito elevado do Factor VIII. De um modo característico, cerca de 70 $ do teor de Factor VIII do plasma é recuperado no produto e o método origina produtos muito puros que possuem uma actividade especifica de 1 a cerca de 4 UI de Factor VIII:C/mg de proteína. Isto pode dever-se ao facto de que utilizando o método da presente invenção 0 Factor VIII também se separa dos enzimas proteolíticos que podem, normalmente originar uma ruptura do Factor VIII:C numa fase precoce do processo de isolamento .
método da presente invenção possibilita 0 tratamento de grandes quantidades de plasma em condições em que se aplica o plasma utilizando cargas elevadas e débitos elevados na filtração em gel originando uma recuperação muito elevada do Factor VIII num elevado grau de pureza. Deste modo, apresenta-se um método que possui uma aplicabilidade industrial muito eficaz.
Depois, pode concentrar-se a(s) fracção (fracções) contendo 0 Factor VIII, a partir de mais filtrações em gel, podendo depois purificar-se utilizando técnicas conhecidas, como a ultrafiltração, precipitações, permuta de iões, cromatografia de afinidade ou similares.
As proteínas restantes, tais como a albu mina, imunoglobulinas, o complexo protrombina, antitrombina III e outras, também pode ser isolados a partir das últimas fracções de filtração em gel, utilizando técnicas conhecidas tais como a precipitação com álcool, precipitações PEG, cromatografia e similares.
Pode efectuar-se a determinação da actividade do Factor VIII : C, utilizando ou um ensaio de fase dupla ou um ensaio de uma só fase. Constitui um facto confirmado que os ensaios em duas fases ou em uma fase podem dar ori_ gem a determinações diferentes da actividade do Factor VIII: :C, numa amostra. Para além disso, sabe-se que determinações repetidas, utilizando o mesmo ensaio, na mesma amostra, podem originar variações na determinação da actividade do Factor VIII : C.
Tal como aqui se utiliza, o termo plasma significa sangue do qual se determinam todos os corpúsculos sanguineos e plaquetas, por exemplo, por centrifugação.
Factor VIII : Ag refere-se ao antigeno associado ao Factor VIII e vWF-Ag refere-se ao antigeno associado ao Factor de Willebrand.
Define-se volume de leito como o volu me dos meios de gel empacotado e o líquido intersticial.
Volume vazio define-se como o volume de tampão entre as par tículas de gel e, volume de eluição consiste no volume de tampão utilizado para se eluir um material específico. Utili za-se a expressão carga da coluna para designar o volume de material adicionado ao leito, calculado como uma percentagem do volume de leito. Com a expressão gama de fraccionamento pretende-se designar a gama dos pesos moleculares de (globulinas) proteínas ou moléculas maiores para as quais o gel se encontra recomendado pelo fornecedor.
método da presente invenção é ainda exposto no que se refere aos gráficos e exemplos que se fornecem apenas a título ilustrativo e não devem ser realizados com a finalidade de limitar de algum modo o âmbito da presente in venção que se encontra definido nas reivindicações em anexo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS GRÁFICOS
A presente invenção é ainda ilustrada por referência aos gráficos que a acompanham, nos quais,
A fig. 1 representa um gráfico que ilustra a eluição do Factor VIII por filtração em gel, de acordo com a presente invenção, determinado por diferentes ensaios,
A fig. 2 ilustra o sentido de eluição de diversas proteínas plasmáticas, por filtração em gel, de acor do com a presente invenção.
PARTE EXPERIMENTAL
Exemplo 1
Filtração do Plasma em Gel Para se Isolar o Factor VIII.
Encheu-se uma coluna com o diâmetro de 2,6 cm com Sepharose CL-4B até uma altura final de 60 em.
Descongelou-se para 252C, em banho maria, plasma congelado de um bando de sangue dinamarquês.
Apés ter-se adicionado 1 UI de Heparina/ /ml, adicionou-se à coluna, 50 ml (16 % do volume do leito) de plasma, utilizando um débito de 100 ml/hora, após o que se elui a coluna utilizando um débito forçado de 200 ml/hora de tampão correspondente a 0,63 do volume de leito por hora.
Efectuou-se o equilíbrio da coluna e a eluição utilizando um tampão de citrato 0,02M NaCl 0,15, a um pH de 7,4. Adicionou-se para além disso,ao tampão, 2,55ml de CaCl2 1M, por litro, produzindo-se uma concentração do ião de ealcio livre (Ca ) de eerea de 7 x 10 M. Verificou-se a concentração do ião de cálcio livre utilizando um eléctrodo selectivo de cálcio de Ingold GmbH (Frankfurt/ /Main, RFA). Recolheram-e as fracções e determinou-se,para cada fracção, ϋθ2θθ, Factor VIII : C (utilizando o ensaio de coagulação de uma fase e o ensaio cromogénico de duas fases), Factor VIII : Ag, albumina, IgG, fabrinogénio, IgM, alfa-2-macroglobulina, Factor IX, Factor X, proteína C e antitrombina III. A proteína medida por ϋΟ^θ eluiu-se com um pequeno pico num volume vazio (fracções 10 a 18), seguido de um pico muito alargado (fracções 19-50, ver fig. 1). Eluiu-se 82 % da actividade do factor VIII : C, tal como determinado pelo ensaio de fase dupla e 91 $ da actividade do Factor VIII ί C, tal como se determinou pelo ensaio de coagulação de uma fase, num pico agregado com o volume vazio (fracção principal de Factor VIII) conjuntamente com o pequeno pico proteico anterior. A porção restante de factor VIII eluiu-se num pico de extremidade alargada, subsequentemente menor imediatamente a seguir à fracção principal do Factor VIII (fracções 19-26). Eluiu-se o Factor VIII:Ag e vWF : Ag conjuntamente com o factor VIII : C, possuindo o pico extremidades um pouco alargadas.
Eluiram-se todas as outras proteínas plasmáticas que se pretendia determinar na fracção após a fracção principal do Factor VIII, conjuntamente com um pico
| proteico maior e mais largo . (ver | fig. | 2). | As ] | proteínas |
| plasmáticas que se separam do factor | VIII | : C possuíam os | ||
| seguintes pesos moleculares: | ||||
| Antitrombina III: | 65 | .000 | D | |
| Proteína C: | 62 | 000 | D | |
| Factor X: | 59 | 000 | D | |
| Factor IX: | 57 | 000 | D | |
| Alfa-2-macroglobulina | 718 | 000 | D | |
| IgM: | 900 | 000 | D | |
| Fibrinagénio: | 340 | 000 | D | |
| IgG: | 150 | 000 | D | |
| Albumina: | 67 | ,000 | D |
Efectuou-se a determinação da actividade do Factor VII : C utilizando o ensaio cromogénico de duas fases, utilizando o método do substrato cromogénico (KABI coatest Factor VIII), utilizando-se no método original tubos de ensaio a 372C o que se modificou para se utilizarem placas de microtitulação com utilização reduzida de reagentes. Utilizou-se uma amostra ou modelo de 50 microlitros, que após ter-se misturado com 75 microlitros de uma solução de fosfolípidos, Factor IXa, Factor X e CaC12 se incubou a 37-C, durante 15 minutos, após o que se adicionou 50 microlitros de substrato. Após nova incubação durante um período de mais 20 minutos a 37—C, parou-se bruscamente a reacção, adicionando 50 microlitros de ácido cítrico 1 M. Fez-se a leitura do desenvolvimento da cor a 405 nm, sendo a referência a 492 nm.
Efectuou-se a determinação do Factor VIII : C utilizando o ensaio de fase única, utilizando o método de TTPA (Tempo de Tromboplastina Parcialmente Activada). Pipetou-se para dentro de cuvetes uma amostra ou modelo de 100 microlitros após o que se adicionou 100 microlitros de plasma deficiente (plasma com deficiência de Factor VIII, General Diagnostic) e conservou-se a temperatura estacionária a 372C, durante 15 minutos. Após a adição de 100 microlitros de CaCl2 0,03 M determinou-se 0 período de tempo que decorria até se verificar a coagulação da solução .
Para determinações quantitativas produziram-se eurvas de calibração com base numa série de diluições de um modelo interno calibrado contra o modelo WHD (3modelo int. de FVIII, Plasma Humano, 3,9 Ul/ml). 0 ensaio de fase dupla, tal como aqui ae. descreve, possui um limite dedetecção inferior (cerca de 10 vezes) ao ensaio de fase única. Quando se adiciona heparina é vantajoso utilizar-se o ensaio de fase dupla, uma vez que qualquer possível influência de heparina no ensaio pode ser eliminada mais facilmente por diluição.
Determinou-se o factor VIII : Ag utilizando um ensaio ELISA em que se utilizaram anticorpos de um paciente com inibição do Factor VIII, como um material de revestimento em placas de microtitulação (Nunc, Kamstrup, 4000 Roskilde, Dinamarca e utilizando fragmentos (FÍAB')^ marcados com peroxidase a partir do mesmo doente inibidor para se determinar o factor VIII (Thromb. Haemost.;
(3); 1985; p. 346-350). Produziram-se as curvas normalizadas utilizando plasma normal agregado e calibrado contra um modelo WHO (12 IRP, estabelecido em 1982).
Também se determinou vWF : Ag utilizando um ensaio ELISA, mas utilizando como material de revestimento um anti- VWF humano, de coélho (DAKO, Dinamarca) e anti -vWF huamno de coelho marcado com peroxidase (DAKO, Dinamarca) para a determinação do vWF que se ligou. Produziram-se curvas normalizadas utilizando o mesmo plasma nor mal, tal como se utilizou para o ensaio ELISA para o Factor
VIII : Ag.
Determinou-se o factor IX utilizando um ensaio de coagulação de fase única de modo idêntico ao do Factor VIII : C utilizando apenas plasma com deficiência de Factor IX. Determinou-se a IgG utilizando uma imunodifusão radial (Immunochemistry”; 2; 1965; p. 235-254) e determinou-se a albumina, o fibrinogénio, a alfa-2-macroglobulina, o Factor X, a proteína C e a anti-trombina III, utilizando uma imunoelectroforese a grande velocidade (Anal Biochem; 15; 1966; p.45 - 52). Determinou-se ο DO^g^ utilizando um espectrofotómetro (spectronic 601 de Milton Roy Company) e determinaram-se as proteínas utilizando Kjel^ dahl, de acordo com pH. Eur. 2^ Ed., I, V. 3.5.2. sem precipitação com TCA. Calculou-se a actividade específica das fracções purificadas como a proporção de concentração do Factor VIII : C em relação a DO^g^ ou determinou-se a concentração de proteínas utilizando Kjeldahl. Quando se utiliza DC^gg para se calcular a actividade específica, os resultados dos diferentes ensaios, não são directamente comparáveis, salvo quando se utiliza o mesmo plasma de partida, como a fracção que contém o Factor VIII que é muitas vezes turva, ver os resultados de Ratnoff e outros (J. Clin. Invest.; 48, 1969; p. 957 - 962).
Os diversos meios de filtração de gel que se utilizaram nos ensaios provieram das seguintes fontes :
Sepharose CL-6B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose 6FF, Sepharose 4FF, Sephacrys S-400, e Sephacrys S-500 provieram todas elas de Pharmacia (Hilleród, Denmark), Biogel A-5m, Fine proveio de BioRad (Bie & Berntsen, Ródovre, Denmark), Fractogel TSK HW-65(F) proveio de Merck (Struers, Ródovre, Denmark) e Matrex Cellufine GCL 2000 proveio de Amicon (Helsing borg, Sweden).
Exemplo 2
Filtração em Gel de Plasma para se
Isolar o Factor VIII Utilizando Diversos Meios de Filtração em Gel.
Encheu-se uma coluna com o diâmetro de 2,6 cm com diversos meios para filtração em gel, que possui am diversas amplitudes de fraccionamento e diversas estrutu ras. Em; todos os casos, a altura final do leito cheio foi de 60 cm. Descongelou-se o plasma, tal como se descreveu no exemplo 1 e adicionou-se 1 UI de heparina por ml. Para cada um dos meios de filtração em gel, carregou-se a coluna com 50 ml de plasma (16 % de volume do leito. Efectuou-se o carregamento da coluna e a eluição com tampão, tal como se descreveu no exemplo 1. 0 débito, foi, em todos ps casos, tal como se estabeleceu no exemplo 1, com a excepção do ensaio em que se utilizou Biogel A-5m, em que se diminui o débito para 50 ml/hora devido ao aumen to da contra-pressão. Recolheram-se as fracções e determinou-se, para cada fracção, D^280 e o Factor VIII : C, utilizando Coatest. Calculou-se a actividade específica da fracção principal do factor VIII com a proporção de Factor VIII : C/ml para DO^gg· Repetiram-se os ensaios n vezes utilizando diferentes plasmas para cada uma das cargas e calcularam-se os valores médios de rendimento e actividade específica. Seleccionou-se a fracção principal do Factor VIII de modo idêntico ao descrito no exemplo 1 e considerou-se o rendimento como o teor de Factor VIII : C na fracção principal de Factor VIII com a percentagem dos teores de Factor VIII : C do palsma adicionado.
A gama de fraccionamento e as dimensões das partículas para os diversos meios isoladores e os valores médios calculados encontram-se indicados no quadro que se segue .
QUADRO I
| meio de filtração em gel | Amplitude de fraccio- namento MW | Número de Percen | Activi dade es pecífica | Diâmetro de partículas húmidas em /um | |
| en- saios n | tagem | ||||
| A | A fi 1x10-4x10 | 3 | 95 | ,0,16 | 40-165 |
| B | 6x104-2x107 | I 4 l | 82 | I 0,88 I | I I 40-165 |
| C | 7x105-4x107 | I 3 I | 68 | I 0,24 I | 60-200 |
| D | 4 6 1x10-4x10 | 1 l2 | 96 | I 0,71 J | I 40-165 |
Quadro I (Cont.)
| Meio de | Amplitude de | Número | Pereen Activi- | Diâmetro de | |
| filtra- | fracciona- | de | tagem | dade es | partículas |
| ção em | mento | ensaios | em | pecí- | húmidas |
| gel | MW | n | peso | fica | em /um |
| E | n ii 6x10-2x10 | 3 | 86 | 1 ,35 | 40-165 |
| F | 6x104-8x107 | 3 I | 91 | 0,28 | 40-105 |
| G | 4 6 1x10-5x10 | I 1 I | 71 | 0,12 | -1 40-80 |
| H | 4 6 5x10-5x10° | I 2 I | 84 | I 0,18 | 32-63 |
| I | 4 6 1x10-3x10° | 1 2 | 92 | 0,18 | | 45-105 |
| J | 1x10^-8x10^ | 3 L | 101 | 0,75 | 40-105 |
Exemplo 3
Filtração em Gel de Plasma para Isolar o
Factor VIII Utilizando Diversas Cargas de Coluna
Encheu-se uma coluna com o diâmetro de 2,6 cm com Sepharose 4FF, até a uma altura final de 60 cm. Descongelou-se o plasma, tal eomo se descreveu no exemplo 1. Após descongelamento, ajustou-se o pH do plasma para 7,0 utilizando HCl 0,5 M. Adicionou-se 1 UI de heparina por ml e, filtrou-se o plasma através de um filtro de nylon de 10 mi
- 23 crómetros. Adicionou-se à coluna, respectivamente, 30 ml, ml, 50 ml, 60 ml e 70 ml de plasma. Efectuou-se a adição, débito e eluição utilizando tampão, tal como se descreveu no exemplo 1, tendo o tampão sido ajustado para pH 7,0. Recolheram-se as fracções e determinou-se, para cada fracção, a DO^qq e o Factor VIII : C, utilizando Coatest Factor VIII como a razão entre o Factor VIII : C/ml e ϋθ2θθ. Repetiram-se três vezes os ensaios utilizando três plasmas diferentes para cada uma das cargas e calcularam-se os valores médios (X). 0 volume da fracção principal de Factor VIII (ml) é o volume da fracção contendo o Factor VIII que pode ser recolhida antes de se eluir o largo pico de proteína (DO^gg) e, seleeciona-se de modo idêntico ao descrito no exemplo 1. Determina-se o rendimento tal como o teor de Factor VIII : C na fracção principal de Factor VIII, como uma percentagem de teor de Factor VIII : C do plasma adicionado.
Apresentam-se os cálculos no quadro II a seguir.
QUADRO II
| Quantidade de Plasma | Fracção Principal do Factor VIII em ml | Rendi- mesto em Percen- tagem | Actividade Específica | ||
| em ml | adicionado | ||||
| em $ do volume do leito | Porção No. | ||||
| 1 | 70 | 88 | 0,81 | ||
| 2 | 70 | 95 | 0,18 |
QUADRO II (Cont.)
| Quantidade de Plasma | Fracção Principal do Factor VIII em ml | Rendimento em Percentagem | Actividade Específica | ||
| em ml | Adicionado | ||||
| em $ do volume do leito | Porção No. | ||||
| 30 | 9,4 | 3 | 70 | 90 | 0,63 |
| X | 70 | 91 | 0,54 | ||
| 1 | 70 | 76 | 0,68 | ||
| 2 | 70 | 85 | 0,17 | ||
| 40 | 12,6 | 3 | 70 | 93 | 0,61 |
| X | 70 | 85 | 0,49 | ||
| 1 | 80 | 91 | 0,57 | ||
| 2 | 80 | 90 | 0,20 | ||
| 50 | 15,7 | 3 | 80 | 85 | 0,53 |
| X | 80 | 89 | 0,43 | ||
| 1 | 80 | 79 | 0,81 | ||
| 2 | 80 | 85 | 0,16 | ||
| 60 | 18,8 | 3 | 90 | 95 | 0,61 |
| X | 83 | 86 | 0,53 | ||
| 1 | 80 | 85 | 0,82 | ||
| 2 | 100 | 90 | 0,21 | ||
| 70 | 22,0 | 3 | 100 | 93 | 0,53 |
| X | 93 | 89 | 0,52 |
Exemplo 4
Filtração em Gel de Plasma para se Isolar o Factor VIII Utilizando Diversas Proporções de Eluição.
Adicionou-se, à mesma coluna que se utilizou no exemplo 3, 50 ml de plasma descongelado, tal como se descreveu anteriormente. Após o descongelamento, ajustou-se o pH plasmátieo para 7,0 utilizando HC1 0,5 M, adicionou-se 1 UI de heparina/ml e filtrou-se o plasma através de um filtro de nylon de 10 miorómetros. Utilizando três fluxos diferentes de plasma, examinaram-se, respectivamente, os débitos de 100, 200 e 300 ml/hora. Utilizou-se o mesmo débito durante a adição de plasma e a eluição subsequente. Efectuou-se a eluição utilizando o mesmo tampão, tal como se descreveu no exemplo 3· Recolheram-se as fracções e, para cada fr.ac ção, determinou-se a e o Factor VIII : C utilizando
Coatest. Calculou-se a actividade específica e o rendimento na fracçao principal de Factor VIII, tal como se referiu no exemplo 3· Calcularam-se os valores médios (X) do volume da fracção principal de Factor VIII, rendimento e actividade específica. Indicam-se os resultados no quadro III, a seguir.
QUADRO III
| ml/hora | Volume do leito/hora | Porção de Plasma No. | Fracção Principal de Factor VIII ml | Rendimen to em percen- tagem | Actividade específica |
| 1 | 80 | 89 | 0,75 | ||
| 2 | 80 | 88 | 0,17 | ||
| 100 | 0,31 | 3 | 80 | 80 | 0,65 |
| X | 80 | 86 | 0,52 | ||
| 1 | 80 | 84 | 0,99 | ||
| 2 | 80 | 88 | 0,18 | ||
| 200 | 0,63 | 3 | 80 | 89 | 0,79 |
| X | 80 | 87 | 0,65 | ||
| 1 | 70 | 85 | 0,72 | ||
| 2 | 80 | 96 | 0,18 | ||
| 300 | 0,94 | 3 | 80 | 83 | 0,44 |
| X | 77 | 88 | 0,45 |
Exemplo 5
Filtração em Gel de Plasma, para se Isolar o Factor VIII, Utilizando Diversas Cargas na Coluna
27Enchem-se uma coluna oom o diâmetro de 19 cm, com Sepharose 4FF, até a uma altura final de 60 cm. Descongelou-se em banho maria, a 302C, plasma congelado de um banco de sangue dinamarquês. Adicionou-se à coluna, respectivamente, 925 gramas, 1497 gramas e 2000 gramas. Conservou-se o débito a cerca de 4200 ml/hora durante a adição e a eluição do plasma utilizando uma bomba de tubo Masterflex (Buch e Holm, Herlev, Dinamarca) o que correspondia a cerca de 0,89 volumes de leito por hora. Para se efectuar a eluição utilizou-se 0 mesmo tampão que se descreveu no Exemplo 1. Monitorizou-se D0280 continuamente utilizando um monitor UV-1 Pharmacia. Quando DO^gQ comeÇ°u a fazer surgir um volume vazio, iniciou-se a recolha da fracção principal de Fac_ tor VIII, que terminou quando DO indicou o grande pico de
280 proteína que começou a eluir-se. Determinou-se o teor de Fac tor VIII : C na fracção principal de Factor VIII utilizando um ensaio de coagulação de fase única e determinaram-se as pro teínas utilizando 0 método Kjeldahl. Calculou-se a actividade específica como a razão entre o número total de unidades de Factor VIII : C na fracção principal de Factor VIII e o número total de miligramas de proteína na fracção principal de Factor VIII. Calculou-se o rendimento em Factor VIII : C como o teor de Factor VIII : C na fracção principal de Factor VIII: :C, no plasma adicionado.
Indicam-se os resultados no quadro IV, a seguir.
QUADRO IV
| Quantidade de plasma adicionado | Fracção principal de Factor VIII em gramas | Rendi- mento em percen- tagem | — ί Actividade específica UI/mg | |
| em gramas | 55 de volume vazio | |||
| 925 | 19,6 | 1192 | 74 | 2,50 |
| 1497 | 31 ,8 | 1860 | 73 | 2,24 |
| 2000 | 42,4 | 2200 | 81 | 1 ,08 |
Exemplo 6
Filtração em Gel de Plasma para se Isolar o Factor VIII, Utilizando uma Coluna de Tamanho Industrial
Encheu-se uma coluna com o diâmetro de 29 cm com Sepharose 4FF. Após ter-se equilibrado utilizando o mesmo tampão descrito no exemplo 1, a altura de gel era de 53 cm. Descongelou-se 10 quilogramas de plasma congelado, de um banco de sangue dinamarquês e aqueceu-se até 30^C, após o que se adicionou à coluna. A quantidade adicionada constituía 28,8 $ de volume do leito. Utilizando uma bomba de tubo Masterflex, manteve-se um débito de 30 litros por hora o que correspondia a 0,86 volumes de leito por hora, durante a adição e a eluição, utilizando um tampão de equilí
280 brio. Monitorizou-se continuamente a DO utilizando um
- 29 monitor UV-1 Pharmacia e, na altura em que se obteve a pri_ meira indicação de uma subida de DO^gg Para 0 v°lume vazio, recolheu-se a fracção principal do Factor VIII. Recolheu-se a fracção principal de Factor VIII, num total de 11,73 quilo gramas. Depois determinou-se o teor de Factor VIII : C utilizando o ensaio de coagulação de fase única, e determinaram-se as proteínas utilizando Kjeldahl. Descobriu-se, na totalidade 8798 UI de Factor VIII : C e uma quantidade de pro teínas inferior a 2346 miligramas, na fracção principal de Factor VIII o que proporcionou um rendimento de Factor VIII : C de 880 UI/ quilograma de plasma, o que corresponde a um rendimento de 88 $ sob a forma de um produto que possui uma actividade espeeífica superior a 3,75 Ul/miligrama de proteína.
Pode purificar-se, posteriormente, a fracção principal de Factor VIII, obtida de acordo com 0 método da presente invenção, de modo idêntico ao da purificação convencional de um crioprecipitado redissolvido, por exemplo, por purificação cromatográfica subsequente e liofilização utilizando os excipientes habituais para a formação de uma preparação estável. Reconstituiu-se a preparação antes de se utilizar, com um veículo convencional adequado.
Claims (8)
- REIVINDICAÇÕES1, - Processo para o isolamento do Factor VIII a partir de outras, proteínas no plasma sanguíneo utilizando um meio de filtração em gel, caracterizado pelo facto de se submeter o plasma sanguíneo a uma filtração em gel. sob condições de separa ção de grupos utilizando uma carga elevada e uma elevada veloci dade de fluxo, sendo o meio de filtração em gel constituído por partículas inertes ao Factor VIII e cujo fraccionamento ssta compreendido no intervalo de 1 x 10 atê 1- x.10 .
- 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri » * — sado pelo facto de o meio de filtração em gel ser constituído por nm material gelificado cujo intervalo de fraccionamento es- 4 7 ta compreendido entre 1 x 10' e 3 x 10 .
- 3. - Processo de acordo com·a reivindicação 2, caracteri zado pelo facto de o meio de filtração em gel ser constituído por um material gelifiçado cujo intervalo de fraccionamento es- 4 7 ta compreendido entre i x 10 e4x!0 .
- 4. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo.facto de o volume de plasma adicionado ser igual a pelo menos 5 % do. volume do leito.
- 5Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteri i —· zado· pelo. facto de o volume de plasma adicionado' ser- igual a 15 a 40 % do volume do leito..
- 6. - Processo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de a velocidade de fluxo ser igual- a.pelo menos· 0,3 volume de. leito por hora.
- 7. - Processo- de acordo com a reivindicação δ, caracteri zado pelo .facto de. a velocidade de. fluxo- ser igual a 0,5 a 2 vo lumes de leito por hora.
- 8..- Processo para, a preparação, de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo.facto de se incorporar na respectiva formulação o Factor VIII quando isolado pelo processo de acordo com qualquer das. reivindicações 1 a 7.
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