BG61231B1 - A method for isolating factor viii - Google Patents
A method for isolating factor viii Download PDFInfo
- Publication number
- BG61231B1 BG61231B1 BG96316A BG9631692A BG61231B1 BG 61231 B1 BG61231 B1 BG 61231B1 BG 96316 A BG96316 A BG 96316A BG 9631692 A BG9631692 A BG 9631692A BG 61231 B1 BG61231 B1 BG 61231B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- factor viii
- plasma
- volume
- gel filtration
- gel
- Prior art date
Links
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims abstract description 111
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 110
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 110
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 76
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 45
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 16
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 239000004023 fresh frozen plasma Substances 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 19
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 13
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 12
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 7
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108010088880 plasmagel Proteins 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 4
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 4
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 4
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 4
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 4
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 4
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 3
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 3
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 3
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 3
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 3
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 3
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 3
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 229940124135 Factor VIII inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000011993 High Performance Size Exclusion Chromatography Methods 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 238000006887 Ullmann reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001470 plasma protein fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Networks Using Active Elements (AREA)
- Housing For Livestock And Birds (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Настоящото изобретение се отнася до метод за изолиране на биологични съединения, например белтъци, особено кръвосъсирващ фактор VIII, от телесни течности като плазма, използвайки гелфилтрация като първа стъпка на изолация.
НИВО НА ТЕХНИКАТА
Фактор VIII, известен още като антихемофиличен фактор А или AHF, е плазмен протеин, който преципитира в хода на естественото кръвосъсирване.
Фактор VIII циркулира в плазмата на кръвта в изключително ниска концентрация във формата на нековалентен комплекс от два белтъка, имащи фактор VIII съсирваща активност (Фактор VIII:C) и ристоцетин кофакторна активност (von Willebrand Factor /v W F/), като посоченият комплекс е с молекулно тегло 1-20 χ 106 D. Фактор VIII отсъства или е недостатъчен при индивиди, страдащи от нарушено кървене, хемофилия А, засягаща около 5 от 100 000 човека.
Von Willebrand фактор предизвиква активация на тромбоцитите по такъв начин, че агрегацията на активираните тромбоцити се усилва. Този ефект може да бъде определен in vitro чрез тромбоцити, индуцирани с ристоцетин. При болестта на von Willebrand се наблюдава удължено време на кървене, дължащо се на загуба или намалено ниво на биологична активност на von Willebrand фактор.
Хемофилиците, страдащи от хемофилия А, и пациентите, страдащи от тежки случаи на болестта на von Willebrand, понастоящем се лекуват с концентрати, съдържащи фактор VIII:C/vWF, лечение, което значително подобрява характерните особености на живот и допринася за увеличаване продължителността на живот на болните.
Фармацевтични препарати, съдържащи фактор VIII /фактор VII1:C и/или vWF/, могат да бъдат произведени от кръв или кръвна плазма. Препаратите може да се произвеждат по различни известни начини, като всички се характеризират с нисък добив, особено на фактор VIII:C. Общ за почти всички методи е първоначалният етап на пречистване, включващ криопреципитацията. Чрез криопреципитация замразената плазма се размразява до температура 0-4°С, което поражда преципитат, включващ фактор VIII, който може да бъде събран чрез, например, центрофугиране. Независимо, че криопреципитацията е относително проста, неин съществен недостатък е, че при осъществяването й в голям мащаб, например плазмено депо, съдържащо повече от 5 kg, се получава нисък добив на фактор VIII:C (30-45% от съдържанието на плазмата). Това означава, че крайният добив е без оглед на това кои първоначални етапи на пречистване се използват.
Освен това, при производството на препарати на фактор VIII обикновено е включен вирус инактивиращ етап. Вирус инактивиращите етапи повишават значително сигурността срещу вируса на препаратите, но предизвикват в повечето случаи допълнително намаляване добива на фактор VIII:C.
Много ниските добиви на фактор VIII като цяло водят до недостиг на тези препарати и поради това съществува необходимост от нови методи за пречистване на фактор VIII при висок добив, за да се задоволят нуждите от препарата за лечението на хемофилици.
Нови методи за изолиране на фактор VIII директно от плазмата при висок добив са от голям интерес, тъй като до 70% от съдържанието на фактор VIII в кръвта плазмата губи съвсем рано - по време или преди криопреципитацията.
Напоследък има опити да се изолира фактор VIII директно от плазмата, използвайки способността за хроматография (Thromb. Haemost., 61, /2/, 234-237 /1989/), но се получава само по-малко от 60% добив и специфична активност на фактор VIII 1 ME/mg протеин.
Гелфилтрацията, наречена още гелпроникваща хроматография или изключваща по размер хроматография, е процес на контролирана дифузия, който се използва за отделяне на разтворените вещества според техния размер. Разтворените вещества се пропускат през колонка, напълнена с инертни порести гелчастици, имащи размера на порите, изключващи най-големите молекули, докато по-малките молекули дифундират към стационарната фаза в гелчастиците. Така най-големите молекули, напълно изключени от гелчастиците, се отмиват първи със свободен обем, докато по-малките молекули прекарват по-дълго време, преминавайки през колонката, и се отмиват в съответствие с намаляващия им размер с нарастващи количества отмиващи обеми.
Гелфилтрацията може да се извърши по два различни начина.
1. Групов начин за разделяне. Разтворените вещества се разделят в две групи, имащи голяма разлика в размера на молекулите си. Едната група се отмива със свободен обем, а другата - по-късно с много по-голям отмиващ обем, често близък до целия обем на пълнежа. Тази процедура първоначално се използва за разделяне на белтъците от разтворените соли или да обмени буфера и се получава “обезсоляване”. За “обезсоляване” на твърди гелове с малък размер на порите процесът може да се извърши, при използването на големи количества вещество (пробни обеми, съдържащи 20-30% от обема на пълнежа и използвайки висока скорост на потока) около един цял обем от буфера за един час; така капацитетът на колонката ще е по-голям.
2. Фракциониран начин. Разтворените вещества с подобни молекулни тегла се отделят. Тази процедура често се използва за отделяне на белтъци. С тази цел гелчастиците с по-големи пори и филтрационната среда се избират така, че да се осигури отмиването на белтъците между свободния и отмиващия обем, съответно на цялостния обем на пълнежа. Веществата се отмиват по-плътно, отколкото когато се използват условия за групова сепарация и могат да се припокрият. Високи скорости на потока освен това не са желателни, защото не позволяват ефективно отделяне на белтъци, и натоварването на колонката трябва да е ниско, за да се получи приемливо отделяне на индивидуалните белтъци. Така гелфилтрацията, използвана при фракционирания начин, се препоръчва само за отделяне на белтъци като последна изглаждаща стъпка, където обемът за фракциониране е малък (Jagschies, Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B 3 (10), 1988 and Bio / TechnoL, 4, 95458 (1986).
Правени са опити да се изолира фактор VIII от плазмата, използвайки гелфилтрация (J. Lab. Clin. Med., 72, /6/, 1968, 1007-1008 и J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962). По време на експериментите се установява голямо пречистване, но добивите са само 40-50%. Уста новено е, че чистотата на получената фактор VIII съдържаща фракция е зависима от изходната плазма, тъй като голямо съдържание на липиди и хиломикрони довежда до увеличаване на мътната фракция на фактор VIII, която има по-ниска относителна активност. Забелязано е, че използваната техника на гелфилтрация не позволява да се работи с големи количества плазма, въпреки че предварителни експерименти показват, че гелфилтрация на много по-концентрирана Cohn фракция 1 изглежда възможна. Освен това, Paulssen et al. (Thromb. Diathes, Haemorr., 22, 1969, 577-583) са описали, че фактор VIII може да бъде отделен от другите плазмени протеини чрез използване на гелсреда Sepharose 6В, но че хроматографията, която използва само гелфилтрация, изглежда възможна в голям мащаб, когато отново разтворен криопреципитат се използва като изходен материал.
Патент US 3 637 489 разкрива процес за отделяне на кръвни съставки, използвайки гелфилтрация и порести стъклени гранули. Този процес е предназначен особено за отделяне на имунологично активни вещества от други съставки в серума или плазмата.
Направени са няколко опита да се използва гелфилтрация за пречистване на фактор VIII, но те са концентрирани върху гелфилтрация на частично пречистени фракции на плазма (отново разтворени криопреципитат и по-нататъшно пречистване на тези фракции) . Всички опити се провеждат при използване или на малко натоварване на колонката и/или малки скорости на потока или техните комбинации.
Гелфилтрация като метод за фракциониране на белтъци е известна от 1959 г. и се използва широко в биохимичните лабораторни изследвания като метод за характеризиране и пречистване на белтъци от проби с малки обеми, например по-малко от 1 1. До настоящото изобретение гелфилтрация не е използвана в голям мащаб при плазмено фракциониране за отделяне на белтъци, като се е прилагала единствено за обезсоляване на етанол и соли от албуминови разтвори. В справочниците е посочено, че: “Основната причина гелфилтрацията да не е главна техника при плазменото фракциониране е ниското производство на белтък за обема на колонката” (J. Н. Berglof: “Fractionation by Gel Filtration”, p. 1633
173 in J. M. Curling (Ed.): Methods of Plasma Protein Fractionation”, Academic Press, London, 1980) и “За съжаление, белтъчните маси, които могат да се обработят с колонки с подходящи размери, са малки и разреждането на пробата не може да бъде пренебрегнато. Затова методът не се използва много при плазмено фракциониране” (J. J. Morgenthaler et al.: “Preservation of structure and function during isolation of human proteins”, p. 127-138 in Smit Sibinga et al. (Eds.): “Plasma Fractionation and Blood Transfusion”, Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 1985.
Патент US 4 675 385 разкрива процес за изолиране на фактор VIII просъсирващ белтък от плазмен препарат, включващ фактор VIII, съставки с високо молекулно тегло и съставки с ниско молекулно тегло чрез последователна високоефективна изключваща по размер хроматография чрез приготвяне, на първо време, буферна водна съставка на плазмен препарат и отделяне на съставките с ниско молекулно тегло чрез въвеждане на съставката в хроматографична колонка от порести високоефективни течни хроматографични гранули, които са с размер от 13 до около 35 μ и отмиване на колонката с буфериран воден разтворител. За да се получи добро отделяне, US 4 675 385 препоръчва използването на колонки, имащи размери не по-ниски от между 10 и 40, които намаляват капацитета, но не осигуряват добро разделяне на съставките на фактор VIII от плазмени белтъци с ниско молекулно тегло. Обаче, тази първа изолация не осигурява добро разделяне на белтъци с фактор VIII:C активност от другите белтъчни съставки на плазмения продукт, което се получава само чрез извършване на втората ВЕТХ.
Така, до настоящото изобретение общоприет факт е, че гелфилтрацията не е подходящ метод за отделяне на белтъци при плазмено фракциониране, когато се работи с големи размери, например над 5 1.
Неочаквано е установено, че когато отбрани с гелфилтрация вещества са предназначени за високи скорости на потока, е възможно да се изолира фактор VIII във формата на чиста фракция и при много висок добив директно от плазмата чрез много внимателно механично отделяне, без да се разчита на нормална първоначална криопреципитация.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Настоящата техника е свързана с метод за изолация на фактор VIII във формата на комплекс на фактор VIII:C и vWF от други протеини в кръвната плазма, използвайки гелфилтрацията. Методът съгласно изобретението се осъществява, като изолирана плазма или размразена свежо замразена плазма се подлага на гелфилтрация при условията на групово отделяне, използвайки високи натоварване и скорост на потока, като гелфилтрационната среда се състои от частици, инертни към фактор VIII и имащи граници на фракциониране в интервала от lxlO3 до 1x10*, за предпочитане от 1x10* до 8.107. Границите на фракциониране могат да са, например, в интервала от 5х104 до 4х107.
При предпочетеното включване обемът на добавената плазма е поне 5% от обема на пълнежа. Сумата на добавената плазма е за предпочитане 15-40% от обема на пълнежа.
За предпочитане е при осъществяване на метода да се използва скорост на потока поне 0,3 от обемите на пълнежа за час, като най-добре е 0,5-2 от обема на пълнежа за час.
За целите на настоящата техника се използва гелфилтрационна среда, в състояние на ригидност, което позволява бързо отмиване. Освен това, гелът трябва да е химично и имунологично инертен към фактор VIII по време на гелфилтрацията. Експериментално е показано, че методът на представеното изобретение може да се осъществи, използвайки търговски гелове, като Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S-400, Sephacryl S-500, Fractogel TSK HW65 (F) и Matrex Gellufin CGL 2000, като всички са подходящи за целите на изобретението. Такива гелове обикновено са с размер на частиците (мокри) в интервала от около 32 gm до около 200 gm.
Съгласно една част, включена в метода съгласно изобретението, замразена плазма се размразява и след като се осигури пълно разтваряне на фактор VIII, размразената плазма се добавя, за предпочитане, веднага към колонката. Желателно е да не се позволява прекомерно покачване на температурата, за да се избегне прекадено екстензивно разпадане на фактор VIII. Плазмата може да бъде предварително обработена чрез добавяне, например, на хепарин, цитрат, сукроза, аминокиселини, соли или други стабилизатори и оптимално филтрирана, центрофугирана, концентрирана чрез ултрафилтрация, пре-преципитация, използвайки обикновени преципитиращи вещества, или предварително обработена по друг начин преди добавянето й към колонката, толкова време, че всяко избрано предварително обработване да не предизвиква съществено влияние върху съдържанието на фактор VIII в плазмата. Методът за изобретението неочаквано показа много висок добив на фактор VIII. Обикновено над 70% от съдържанието на фактор VIII от плазмата се възстановява и методът дава възможност за много чисти продукти със специфична активност на 1 до около 4 МЕ фактор VIII:C/mg протеин. Това може частично да се отдаде на факта, че прилагайки метода на изобретението, фактор VIII се отделя и от протеолитичните ензими, което може нормално да предизвика нарушение на фактор VIII:C много рано в процеса на изолиране.
Методът съгласно изобретението позволява обработването на големи количества плазма при условия, където плазмата се прилага, използвайки високи натоварвания и скорости на потока при гелфилтрацията, което поражда много голямо възстановяване на фактор VIII при много голяма чистота. Така се предлага много ефикасен метод, който има промишлено приложение.
Фракция/и/, съдържащи фактор VIII от гелфилтрация или комбинирани фракции от повече гелфилтрации могат да бъдат тогава концентрирани и по-нататък пречистени, с използването на известни техники, такива като ултрафилтрация, преципитация, йонообмен, афинитетна хроматография или подобни.
Оставащите плазмени протеини, такива като албумин, имуноглобулини, протромбинов комплекс, антитромбин III и други, също могат да бъдат изолирани от по-късните фракции на гелфилтрацията, използвайки такива известни техники като преципитация с алкохол, PEGпреципитации, хроматография или подобни.
Определянето на фактор VIII:C активността може да се извърши чрез едностепенен, или двустепенен тест. Установен факт е, че едностепенният и двустепенният тест могат да доведат до различно определяне на активността на фактор VIII:C в една проба. Освен това, известно е, че повторното определяне, използвайки същият тест или същата проба, може да породи отклонения в определянето на активността на фактор VIII:C.
Терминът плазма означава тук вид кръв, от която са отделени всички кръвни телца и тромбоцити, например чрез центрофугиране.
Фактор VIII:Ag означава фактор VIII свързан антиген и vWF-Ag von Willebrand фактор свързан антиген.
Обемът на пълнежа се определя като обем на напълнената гелсреда и интерстициалната течност. Свободен обем се нарича обемът на буфера между гелчастиците и отмиващ обем е обемът на буфера, който се използва за отмиване на специфични вещества. Изразът товар на колонката обозначава обема на веществото, добавено към пълнежа, изчислен като процент на обема на пълнежа. Изразът граници на фракциониране е предназначен за обозначаване границите на молекулните тегла на (глобуларните) протеини или по-големите молекули, за които гелвещество се препоръчва от производителя.
Методът съгласно изобретението е илюстриран със следващите чертежи и примери. Примерите поясняват изобретението, без да го ограничават.
ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ
Настоящото изобретение е илюстрирано чрез приложените фигури, от които:
фигура 1 показва графика, илюстрираща отмиването на фактор VIII чрез гелфилтрация съгласно настоящото изобретение, определено чрез различни тестове;
фигура 2 илюстрира реда на отмиване на различни плазмени протеини чрез гелфилтация съгласно изобретението.
Експериментална част
Пример 1. Гелфилтрация на плазма за изолиране на фактор VIII.
Колонка с 0 2,6 cm е напълнена със Sepharose CL-4B до максимална височина от 60 cm.
Замразена плазма от Датска кръвна банка е размразена до 25°С на водна баня. След добавяне на 1 МЕ хепарин/ml, 50 ml /16% от обема на пълнежа/ се добавя плазма към колонката, използвайки поток от 100 ml/h, след което колонката се отмива с 200 ml/h буфер, съответстващ на 0,63 обем на пълнежа за час. Еквилибрация на колонката и отмиването се извършват, като се използва буфер, 0,02 М цитрат, 0,15 М NaCl, pH 7,4. Към буфера се добавя 2,55 ml 1М СаС12/1, което дава свободни калциеви йони (Са2+) в концентрация от около 7x105 М. Концентрацията на свободните калциеви йони се проверява чрез използването на калциев селективен електрод от Ingold GmbH (Frankfurt/Main, FRG). Фракциите се събират и за всяка фракция OD280' фактор VIII:C се използват както едностепенният коагулационен, така и двустепенният хромогенен тест. Определят се фактор VIII :Ag, албумин, IgG, фибриноген, IgM, α-2-макроглобулин, фактор IX, протеин С и антитромбин III. Протеин, измерен чрез OD280, се отмива с ниска върхова стойност (пик) при свободен обем (фракции 19-50, фиг.1). 82% от фактор VIII:C активността се определя чрез двустепенен и 91 % от фактор VIII:C активността се определя чрез едностепенен коагулационен тест и се отмива при един пик на агрегация със свободен обем (фактор VIII-главна фракция) заедно с найранния малък протеинов пик. Остатъкът от фактор VIII се отмива при последващи малки крайни върхови стойности, непосредствено след главната фракция на фактор VIII (фракция 1926). Фактор VIII:Ag и vWF:Ag се отмиват заедно с фактор VIII:C, но има малко по-широки следващи крайни върхови стойности.
Всички други плазмени протеини се определят и се отмиват във фракция след фактор VIII-главна фракция заедно с широката граница на протеиновия пик (фиг.2). Плазмените протеини, като се отделят от фактор VIII:C, са със следващите молекулни тегла:
| Антитромбин III: | 65,000 D |
| Протеин С: | 62,000 D |
| Фактор X: | 59,000 D |
| Фактор IX: | 57,000 D |
| α-2-макроглобулин: | 718,000 D |
| IgM: | 900,000 D |
| Фибриноген: | 340,000 D |
| IgG: | 150,000 D |
| Албумин: | 67,000 D |
Определянето на активността на фактор VIII:С чрез двустепенния хромогенен тест се из вършва по метода на хромогенния субстрат (KABI Coatest фактор VIII). Оригиналният метод, използващ епруветки при 37°С, е модифициран да се извършва с пластинки на микротитъра с намалено използване на реактивите. Прилага се 50 микролитрова проба или стандарт, която след смесване със 75 μΐ от разтвор на фосфолипид, фактор 1Ха, фактор X и СаС12 се инкубира при 37°С за 15 min, след което се добавят 50 ml от субстрата. След още 20 min инкубация при 37°С, реакцията се погасява чрез добавяне на 50 μΙ 1 М лимонена киселина. Появява се червено оцветяване при 405 nm, а по данни от литературата - при 492 nm.
Определянето на активността на фактор VIII:C чрез едностепенния тест се извършва по АРТТ-метода (Активирано частично тромбопластиново време). 100 μΐ проба или стандарт се отмерват с пипетка в кювети, след което се добавят 100 μΐ непълноценна плазма (плазма с дефицит на фактор VIII, общо диагностична), и разтворът се поставя в термостат при 37°С за 5 min. След добавяне на 100 μΐ 0,03 М СаС12, се определя времето до съсирване на разтвора.
За количествени определения се изготвят криви на калибриране, основани на серии на разреждане на вътрешен стандарт, който е калибриран според стандарт на СЗО (III международен стандарт на фактор VIII, човешка плазма, 3,9 ME/ml). Двустепенният тест, както е описан тук, има по-ниска граница на определяне (около 10 пъти), отколкото едностепенния тест. Когато се добавя хепарин, използването на двустепенния тест има предимство, тъй като всяко възможно влияние на хепарина върху теста може да бъде отстранено по-лесно чрез разреждане.
Фактор VIII:Ag се определя чрез ELISA, използвайки антитела от пациент-инхибитор на фактор VIII, като обвиващ материал върху пластинки на микротитьра (Nunc, Kamstrup, 4000 Roskilde, Denmark) и използвайки пероксидазин F(AB’)2 фрагменти от същия пациент-инхибитор за определяне на пределния фактор VIII (Thromb. Haemost., 53 /3/, 1985, 346-350). Изготвят се стандартни криви, използвайки нормално плазмено депо, калибрирано според стандарт на СЗО (1я IRP, публикуван 1982 г.). vWF:Ag също се определя чрез ELISA, но използвайки заешки античовешки vWF (DAKO, Дания) като обвиващ материал и пероксидазно белязан заешки античовешки vWF (DAKO, Дания) за определяне на пределния vWF. Изготвят се стандартни криви, със същата нормална плазма за фактор VIII:Ag ELISA.
Фактор IX се определя чрез едностепенен тест за коагулация по аналогичен начин както при фактор VIILC, използвайки фактор IX непълноценна плазма. IgG се определя чрез радиална имунодифузия (Immunochemistry, 2, 1965, 235-254), а албумин, фибриноген, а-2макроглобулин, фактор X, протеин С и антитромбин III се определят чрез ракетна имуноелектрофореза (Anal. Biochem., 15, 1966, 4552). OD2g0 се определя чрез спектрофотометьр (Spectronic 601 от Milton Roy Company), а протеин се определя чрез Kjeldahl съгласно Ph. Eur. 2 nd. Ed., 1. V. 352 без преципитация с ТСА. Специфична активност на пречистените фракции се изчислява като съотношение на концентрацията на фактор VIII:C или към OD280, или към концентрацията на протеин, определен чрез Kjeldahl. Когато за изчисление на специфичната активност се използва ODM0, резултатите от различните експерименти не са пряко сравними, освен при използването на същата изходна плазма, тъй като фракцията, съдържаща фактор VIII често е мътна, виж резултатите на Ratnoff et al. (J. Clin. Invest., 48, 1969, 957-962).
Различните среди за гелфилтрация, използвани в експериментите, са от следните източници: Sepharose CL-6B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose 6FF, Sepharose 4FF, Sephacryl S-400 и Sephacryl S-500 са от аптека (Hillerod, Denmark), Biogel A-5m, Fine е от Biorad (Bie & Besntsen, Rodovre, Denmark) Fractogel TSK HW-65 /F/ е от Merck (Struers, Rodovre, Denmark) и Matrex Gellufine GCL 2000 е от Amicon (Helsingborg, Sweden).
Пример 2. Гелфилтрация на плазма за изолиране на фактор VIII при използването на различни среди за гелфилтрация.
Колонка с 0 2,6 cm е напълнена с различни среди за гелфилтрация, които имат различни сфера на фракциониране и структура. Във всички случаи крайната височина на пълнежа на колонката е 60 cm. Плазмата се размразява, както е описано в пример 1, и се добавя 1 МЕ хепарин на ml. За всяка гелфилтрационна среда колонката се натоварва с 50 ml плазма (16% от обема на пълнежа). Натоварването на колонката и отмиването на буфера се извършва, както е описано в пример 1. Скоростта на потока във всички случаи е същата, както е показано в пример 1, освен за експеримента, използващ Biogel A-5m, където скоростта на потока е по-ниска до 50 ml/h вследствие повишеното налягане в участък от кръвното русло при нарушен отток на кръвта. Събират се фракции и за всяка от тях се определят OD2g0 и фактор VIII чрез коатест. Специфичната активност на фактор VIIl-главна фракция се изчислява като съотношение на фактор VIII:C/ml към OD2g0. Експериментите се повтарят η пъти с различни плазми за всяко натоварване и се изчисляват средните стойности на добива и специфичната активност. Фактор VIII-главната фракция се отделя по същия начин, както е описано в пример 1, а добивът се показва като съдържание на фактор VIII:C във фактор VIII-главната фракция във вид на процент на съдържанието на фактор VIILC от добавената плазма.
Границите на фракциониране и размерът на частиците за различните среди и изчислените средни стойности са показани в таблица 1.
Таблица 1
| Гелфилтрационна среда | Граници на фракциониране MW | Номер на експ. η | Добив В % | Спец, активност | Диаметър на частиците в μπι |
| А | 1х104 - 4х106 | 3 | 95 | 0,16 | 40-165 |
| В | 6х104 - 2x10’ | 4 | 82 | 0,88 | 40-165 |
| С | 7x10s - 4х107 | 3 | 68 | 0,24 | 60-200 |
| D | 1х104 - 4х106 | 3 | 96 | 0,71 | 40-165 |
| Е | 6х104- 2х107 | 3 | 86 | 1,35 | 40-165 |
| F | 6х104- 8x10’ | 3 | 91 | 0,28 | 40-105 |
| G | 1х104 - 5х106 | 1 | 71 | 0,12 | 40-80 |
| Н | 5х104 - 5х106 | 2 | 84 | 0,18 | 32-63 |
| 1 | 1х104 - ЗхЮ6 | 2 | 92 | 0,18 | 45-105 |
| J | 1х104 - 8х106 | 3 | 101 | 0,75 | 40-105 |
A: Sepharose CL-6B; B: Sepharose CL-4B; C: Sepharose CL-2B; D: Sepharose 6FF; E: Sepharose 4FF; F: Sephacryl S-500; G: Biogel A-5m Fine; H: Fractogel TSK HW-65 (F); I: Mafrex Gellufine GCL 2000; J: Sephacryl S-400
Пример 3. Гелфилтрация на плазма за изолиране на фактор VIII с различни натоварвания на колонката.
Колонка с 0 2,6 cm е напълнена със Sepharose - 4FF до пределна височина от 60 cm. Плазмата се размразява, както е описано в пример 1. След размразяването, pH на плазмата се нагласява до 7,0, използвайки 0,5 М HCI, 1 МЕ хепарин на ml се добавя и плазмата се филтрира през 10 микрометров найлонов филтър. Към колонката се добавя 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml и 70 ml плазма. Добавянето, потокът и отмиването с използване на буфер се извършва, както в пример 1, въпреки че буферът се нагласява до pH 7,0. Фракциите се събират и за всяка от тях се определя OD2g0 и фактор VIII:C с коатест. Специфичната активност на фактор VIII-глав15 ната фракция се изчислява като съотношение на фактор VIII:C/ml към ODM0. Експериментите се повтарят три пъти, използвайки различни плазми за всяко натоварване и се изчисляват средните стойности /х/. Обемът на фактор VIIIглавната фракция (ml) е обемът на фракция, съдържаща фактор VIII, която може да бъде събрана преди отмиването на широката граница на протеиновия пик (OD2g0) и се отделя по същия начин както е описано в пример 1. Добивът е представен като съдържание на фактор VIII:C във фракция на фактор VIII като процент на съдържанието на фактор VIII: С от добавената плазма.
Изчислените цифри са представени в таблица 2.
Таблица 2
| Добавено количество плазма, ml в % от пореден обем на порция от пълнежа | Фактор VIII главна фракция, ml | Добив, % | Специфична активност | ||
| 1 | 70 | 88 | 0,81 | ||
| 2 | 70 | 95 | 0,81 | ||
| 30 | 9,4 | 3 | 70 | 90 | 0,63 |
| X | 70 | 91 | 0,54 | ||
| 1 | 70 | 76 | 0,68 | ||
| 2 | 70 | 85 | 0,17 | ||
| 40 | 12,6 | 3 | 70 | 93 | 0,61 |
| X | 70 | 85 | 0,49 | ||
| 1 | 80 | 91 | 0,57 | ||
| 2 | 80 | 90 | 0,20 | ||
| 50 | 15,7 | 3 | 80 | 85 | 0,53 |
| X | 80 | 89 | 0,43 |
| 1 | 80 | 79 | 0,81 | ||
| 2 | 80 | 85 | 0,16 | ||
| 60 | 18,8 | 3 | 90 | 95 | 0,61 |
| X | 83 | 86 | 0,53 | ||
| 1 | 80 | 85 | 0,82 | ||
| 2 | 100 | 90 | 0,21 | ||
| 70 | 22,0 | 3 | 100 | 93 | 0,53 |
| X | 93 | 89 | 0,52 |
Пример 4. Гелфилтрация на плазма за изолиране на фактор VIII, използвайки различни скорости на отмиване.
Към същата колонка като в пример 3 се добавя 50 ml размразена плазма както е описано по-горе. След размразяването, pH на плазмата се нагласява до 7,0 с 0,5 М HCI, 1 МЕ хепарин/ml и плазмата се филтрира през 10 микрометров найлонов филтър. Проверява се използването на три различни порции на скорости на плазмения поток, съответно 100, 200 и 300 ml/h. Същата скорост на потока се използ15 ва при добавянето на плазмата и последващото отмиване. Отмиването се извършва с буфер, както е описано в пример 3. Фракциите се събират и за всяка от тях се определя OD2g0 и фактор VII1:C с коатест. Специфичната активност и добивът на фактор VIII-главна фракция се изчислява, както в пример 3. Средните стойности /х/ на обема на фактор VIII-главната фракция, добивът и специфичната активност се изчисляват. Резултатите са представени в таблица 3.
Таблица 3
| Поток ml/h обем на пълнежа за час | Плазма № на порцията | Фактор VIII главна фракция, ml | Добив, % | Специфична активност |
| 1 | 80 | 89 | 0,75 | |
| 2 | 80 | 88 | 0,17 | |
| 100 0,31 | 3 | 80 | 80 | 0,65 |
| X | 80 | 86 | 0,52 | |
| 1 | 80 | 84 | 0,99 | |
| 2 | 80 | 88 | 0,18 | |
| 200 0,63 | 3 | 80 | 89 | 0,79 |
| X | 80 | 87 | 0,65 | |
| 1 | 70 | 85 | 0,72 | |
| 2 | 80 | 96 | 0,18 | |
| 300 0,94 | 3 | 80 | 83 | 0,44 |
| X | 77 | 88 | 0,45 |
Пример 5. Гелфилтрация на плазма за изолиране на фактор VIII, използвайки различно 50 натоварване на колонката.
Колонка с 010 cm е напълнена със Sepharose
4FF до пределна височина от 60 cm. Замразена плазма от Датската кръвна банка се размразява до 30°С на водна баня. Към колонката се добавя съответно 925 g, 1497 g и 2000 g. По време на добавянето и отмиването на плазмата с използването на Masterflex шлангова помпа (Buch & Holm, Herlev, Denmark) се поддържа поток от около 4200 ml/h, съответно на около 0,89 от обема на пълнежа за час. За отмива- 5 нето се използва същият буфер, както е описано в пример 1. OD280 се записва постоянно, използвайки фармацевтичен монитор UV-1. Когато OD280 започва да се покачва до свободен обем, се събира фактор VIII-главна фракция и тя се определя, когато OD280 показва, че широкият протеинов пик започва да се отмива. Съдържанието на фактор VII1:C във фактор
VIII-главната фракция се определя с едностепенния тест на съсирване, а протеин се определя чрез Kjeldahl. Специфичната активност се изчислява като съотношение на общото число единици на фактор VIII:C във фактор VIIIглавната фракция към общия брой милиграми протеин във фактор VIII-главната фракция. Добивът на фактор VIII:C се изчислява като съдържание на фактор VIII:C във фактор VIIIглавната фракция в процент от съдържанието на фактор V1II:C, добавен в плазмата.
Резултатите са представени в таблица 4.
Таблица 4
| Добавеното количество плазма | Фактор VIII главна фракция, g | Добив, % | Специфична активност ME/mg | |
| в g | % от обема на пълнежа | |||
| 925 | 19,6 | 1192 | 74 | 2,50 |
| 1497 | 31,8 | 1860 | 73 | 2,24 |
| 2000 | 42,4 | 2200 | 81 | 1,08 |
Пример 6. Гелфилтрация на плазма за изолиране на фактор VIII, използвайки колонка с промишлен размер.
Колонка с 0 29 cm е напълнена със Sepharose 4FF. След еквилибриране със същия буфер, както е описано в пример 1, височината на гела е 53 cm. 10 kg замразена плазма от Датска кръвна банка се размразяват и затоплят до 30°С, след което се добавят към колонката. Добавеното количество съставлява 28,8% от обема на пълнежа. По време на добавянето и отмиването с еквилибриращ буфер, се поддържа поток от 301/h, съответстващ на 0,86 от обема на пълнежа, чрез използването на Masterflex шлангова помпа. OD280 се записва постоянно с помощта на Pharmacia Monitor UV-1, а при първото отбелязване на покачване в OD280 до свободен обем, фактор VIII-главната фракция се събира. Общо 11,73 kg фактор VIII-главна фракция се събира. Тогава се определят съдържанието на фактор VIII:C чрез едностепенния тест на съсирване и протеина чрез Kjeldahl. Общо 8798 МЕ фактор VIII:C по-малко от 2346 mg протеин се откриват във фактор VIII-глав ната фракция, давайки добив на фактор VIII:C от 880 ME/kg плазма, съответстващ на 88% добив във формата на вещество със специфична активност повече от 3,75 ME/mg протеин.
Фактор VIII-главната фракция, получен съгласно метода на изобретението, може да бъде по-нататък пречистен по аналогичен начин на общоприетото пречистване на повторно разтворени криопреципитати, включващо, например следващо хроматографично пречистване и лиофилизация, използвайки обикновени пълнители за образуване на стабилен препарат.
Claims (6)
1. Метод за изолиране на фактор VIII от други протеини на кръвната плазма, като се използва гелфилтрационна среда, характеризиращ се с това, че изолирана плазма или размразена свежо замразена плазма, която в даден случай е обработена предварително, което не оказва съществено влияние на съдържанието на фактор VIII от плазмата, се подлага пряко на гелфилтрация при условия на групово отделяне, при което обемът на добавената плазма е поне 5% от обема на слоя и пропускливостта е поне 0,3 обема от слоя за час, и гелфилтрационната среда се състои от инертни спрямо фактор VIII частици с грани- 5 ци на фракциониране в интервала от 1,103 до 1.10’ и главната фракция на фактор VIII се събира.
2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че гелфилтрационната среда се състои от гел с граница на фракциониране в интервала 1.104 до 8.107.
3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че гелфилтрационната среда се състои от гел с граница на фракциониране в интервала от 5.104 до 4.107.
4. Метод съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че обемът на добавената плазма е 15-40% от обема на гелния слой на пълнежа.
5. Метод съгласно претенции от 1 до 4, характеризиращ се с това, че пропускливостта е 0,5-2 обема от гелния слой за час.
6. Метод съгласно претенции от 1 до 5, характеризиращ се с това, че полученият фактор VIII се пречиства по аналогичен начин на общоприетото пречистване на отново разтворен криопреципитат, съдържащ например по- нататъшно хроматографично пречистване и лиофилизация, използвайки обикновен пълнител за образуване на стабилно вещество.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK562189A DK162233C (da) | 1989-11-09 | 1989-11-09 | Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii |
| PCT/DK1990/000279 WO1991007438A1 (en) | 1989-11-09 | 1990-11-05 | A method for isolating factor viii |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG96316A BG96316A (bg) | 1993-12-24 |
| BG61231B1 true BG61231B1 (en) | 1997-03-31 |
Family
ID=8144000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG96316A BG61231B1 (en) | 1989-11-09 | 1992-05-08 | A method for isolating factor viii |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5245014A (bg) |
| EP (1) | EP0524172B1 (bg) |
| JP (1) | JP2509407B2 (bg) |
| CN (1) | CN1044121C (bg) |
| AT (1) | ATE118508T1 (bg) |
| AU (1) | AU631471B2 (bg) |
| BG (1) | BG61231B1 (bg) |
| CA (1) | CA2073012C (bg) |
| CZ (1) | CZ537190A3 (bg) |
| DE (1) | DE69017050T2 (bg) |
| DK (1) | DK162233C (bg) |
| ES (1) | ES2068404T3 (bg) |
| FI (1) | FI103510B1 (bg) |
| HU (1) | HU214905B (bg) |
| IE (1) | IE66836B1 (bg) |
| IL (1) | IL96277A (bg) |
| NO (1) | NO180741C (bg) |
| NZ (1) | NZ236004A (bg) |
| PL (1) | PL164894B1 (bg) |
| PT (1) | PT95830B (bg) |
| RU (1) | RU2055593C1 (bg) |
| SK (1) | SK537190A3 (bg) |
| UA (1) | UA29421C2 (bg) |
| WO (1) | WO1991007438A1 (bg) |
| YU (1) | YU47524B (bg) |
| ZA (1) | ZA908599B (bg) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2042138T3 (es) * | 1989-05-24 | 1993-12-01 | Miles Inc. | Filtracion en gel del factor viii tratado termicamente. |
| US5859204A (en) * | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6180371B1 (en) | 1996-06-26 | 2001-01-30 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5888974A (en) * | 1992-04-07 | 1999-03-30 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
| US7560107B2 (en) | 1996-06-26 | 2009-07-14 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6458563B1 (en) | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6531577B1 (en) * | 1997-12-15 | 2003-03-11 | Hemasure Denmark A/S | von Willebrand factor (vWF)-containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations |
| US6290527B1 (en) * | 1998-07-03 | 2001-09-18 | Nippon Telegraph And Telephone Corp. | Nippon telegraph and telephone corporation |
| US6586573B1 (en) | 1999-02-22 | 2003-07-01 | Baxter International Inc. | Albumin-free Factor VIII formulations |
| JP2002348300A (ja) * | 1999-04-12 | 2002-12-04 | Fujimori Kogyo Co Ltd | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子および血液凝固第ｖｉｉｉ因子／フォン・ビルブラント因子複合体の精製方法 |
| AUPR638801A0 (en) * | 2001-07-13 | 2001-08-09 | Life Therapeutics Limited | Factor viii separation |
| ES2449044T3 (es) | 2004-05-03 | 2014-03-18 | Emory University | Procedimiento de administración de fVIII sin dominio B porcino |
| CN101010333B (zh) * | 2004-08-27 | 2013-08-14 | 诺和诺德医疗保健公司 | 从生物材料中纯化凝血因子xⅲ多肽 |
| US20060226086A1 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Robinson Thomas C | Centrifuge for blood processing systems |
| AU2009313325B2 (en) * | 2008-11-07 | 2014-05-01 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Factor VIII formulations |
| BR112012024550B1 (pt) * | 2010-03-30 | 2020-12-08 | Octapharma Ag | processo de produção de uma proteína dependente de vitamina k livre de príons em uma sequência de purificação que emprega cromatografia |
| RU2445974C2 (ru) * | 2010-04-26 | 2012-03-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр ГНЦ РАМН | Способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека |
| KR101948337B1 (ko) | 2010-11-05 | 2019-02-14 | 박스알타 인코퍼레이티드 | 증가된 특이 활성도를 갖는 항혈우병 인자 ｖｉｉｉ의 신규 변이체 |
| CA2821711C (en) | 2010-12-15 | 2017-10-10 | Baxter International Inc. | Eluate collection using conductivity gradient |
| CN103506080A (zh) * | 2012-06-19 | 2014-01-15 | 汪志友 | 一种用于分离纯化凝血因子viii的介质及其制备方法 |
| CA2886326C (en) * | 2012-09-28 | 2021-11-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for evaluating blood coagulation reaction |
| US9663553B2 (en) | 2014-01-29 | 2017-05-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, immunoglobulins, clotting factor VIII and clotting factor IX) from human plasma |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
| US4543210A (en) * | 1984-10-04 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate |
| DK525384D0 (da) * | 1984-11-05 | 1984-11-05 | Nordisk Insulinlab | Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat |
| US4847362A (en) * | 1985-02-01 | 1989-07-11 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4675385A (en) * | 1985-03-27 | 1987-06-23 | Alpha Therapeutic Corporation | Isolation of human plasma procoagulant protein factor VIII from biological factors |
| US4758657A (en) * | 1985-07-11 | 1988-07-19 | Armour Pharmaceutical Company | Method of purifying Factor VIII:C |
| AT391808B (de) * | 1986-11-03 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf)-haeltigen fraktion |
| ATE112287T1 (de) * | 1987-12-21 | 1994-10-15 | Miles Inc | Faktor viii- gelfiltration. |
| WO1989009784A1 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-19 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Production of heat-stable factor viii concentrate |
| ES2042138T3 (es) * | 1989-05-24 | 1993-12-01 | Miles Inc. | Filtracion en gel del factor viii tratado termicamente. |
-
1989
- 1989-11-09 DK DK562189A patent/DK162233C/da not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-10-26 ZA ZA908599A patent/ZA908599B/xx unknown
- 1990-11-01 CZ CS905371A patent/CZ537190A3/cs unknown
- 1990-11-01 SK SK5371-90A patent/SK537190A3/sk unknown
- 1990-11-05 HU HU9201551A patent/HU214905B/hu unknown
- 1990-11-05 AT AT90917201T patent/ATE118508T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-05 UA UA94020494A patent/UA29421C2/uk unknown
- 1990-11-05 DE DE69017050T patent/DE69017050T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-05 AU AU67470/90A patent/AU631471B2/en not_active Ceased
- 1990-11-05 CA CA002073012A patent/CA2073012C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 JP JP3500067A patent/JP2509407B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 EP EP90917201A patent/EP0524172B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 WO PCT/DK1990/000279 patent/WO1991007438A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-05 RU SU905052211A patent/RU2055593C1/ru active
- 1990-11-05 ES ES90917201T patent/ES2068404T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-07 US US07/610,480 patent/US5245014A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-07 NZ NZ236004A patent/NZ236004A/xx unknown
- 1990-11-07 YU YU210590A patent/YU47524B/sh unknown
- 1990-11-08 IE IE402290A patent/IE66836B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 PT PT95830A patent/PT95830B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 IL IL9627790A patent/IL96277A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-09 PL PL90287703A patent/PL164894B1/pl unknown
- 1990-11-09 CN CN90109030A patent/CN1044121C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-08 BG BG96316A patent/BG61231B1/bg unknown
- 1992-05-08 FI FI922105A patent/FI103510B1/fi active
- 1992-05-08 NO NO921839A patent/NO180741C/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG61231B1 (en) | A method for isolating factor viii | |
| Nilsson et al. | Characteristics of various factor VIII concentrates used in treatment of haemophilia A | |
| Furlan et al. | Acquired deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura | |
| CA2201714C (en) | Method for isolation of highly pure von willebrand factor | |
| US4341764A (en) | Method of preparing fibronectin and antihemophilic factor | |
| Kass et al. | Studies on the purification of antihemophilic factor (factor viii): i. precipitation of antihemophilic factor by concanavalin A | |
| Saba | Prevention of liver reticuloendothelial systemic host defense failure after surgery by intravenous opsonic glycoprotein therapy | |
| Kamitsuji et al. | Activity of blood coagulation factor XIII as a prognostic indicator in patients with Henoch-Schönlein purpura: efficacy of factor XIII substitution | |
| US5892005A (en) | High molecular and low molecular fractions of von willebrand factor | |
| Facon et al. | Acquired type II von Willebrand's disease associated with adrenal cortical carcinoma | |
| Goudemand et al. | Acquired type II von Willebrand's disease: demonstration of a complexed inhibitor of the von Willebrand factor‐platelet interaction and response to treatment | |
| JPH09221432A (ja) | フォンビルブラント因子を含む医薬調製物 | |
| JPH0424360B2 (bg) | ||
| US4455300A (en) | Fibronectin compositions | |
| Almasio et al. | Characterization of the molecular forms of fibronectin in fulminant hepatic failure | |
| Bouma et al. | Factor VIII Related Antigen in Normal Blood Platelets and in Platelets of Patients with von Willebrand’s Disease | |
| JPH10504310A (ja) | 生物学的に活性な化合物で患者を治療する方法 | |
| JP2004123566A (ja) | ヒト血漿由来血液凝固第ｘｉｉｉ因子製剤およびその製造方法 | |
| Salem et al. | Investigation of a coagulation accelerating factor (CAF) in glomerulonephritis | |
| HRP930277A2 (en) | A method for isolating biologically active compounds | |
| Koller et al. | Physiology and Pathology of Blood Coagulation | |
| Koller et al. | Physiology and Pathology of Blood Coagulation A Review of the Literature of 1963 (First Series) | |
| Seegers et al. | Wayne State University College of Medicine, Detroit |