JP2004123566A - ヒト血漿由来血液凝固第ｘｉｉｉ因子製剤およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、ヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分から、アナフィラトキシンとして知られている活性化補体Ｃ３ａ等を効率的に除去する方法および実質的にアナフィラトキシンを含まないヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤を提供しようとするものである。
【解決手段】ヒト血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性担体により処理しその後さらに必要により陰イオン交換体による処理を行うことにより、血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分からのアナフィラトキシンを効率的に除去することができる。
【選択図】なし
【解決手段】ヒト血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性担体により処理しその後さらに必要により陰イオン交換体による処理を行うことにより、血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分からのアナフィラトキシンを効率的に除去することができる。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分から活性化補体を除去する方法および活性化補体を実質的に含まない血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト血漿中に存在する血液凝固第ＸＩＩＩ因子は、フィブリン安定化因子として知られている分子量３２万の血漿蛋白であり、ａサブユニットおよびｂサブユニットがそれぞれ２量体を形成し、ａサブユニットの２量体であるａ２とｂサブユニットの２量体であるｂ２が結合したａ２ｂ２というという４量体で構成されており、活性の発現には活性体に転換されその作用を発現する。このａサブユニットの２量体であるａ２は実質的なフィブリン安定化因子として作用する活性部位を有し、ｂサブユニットの２量体ｂ２がａサブユニットの２量体ａ２の血漿中での安定化に関与していると考えられている。この血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性化体の前駆体ａ２ｂ２の４量体は、トロンビンの存在下でａサブユニットがａ’サブユニットとなり、ａ’２ｂ２の４量体となる。その後、カルシウムイオンの存在下でａ’２の２量体となり、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性化体として活性を発現する。
【０００３】
血液凝固第ＸＩＩＩ因子は血小板膜上あるいは胎盤からも生成されるものであるが、これらは膜上にａ２ダイマー（分子量１６万）として存在しているものであり、このａ２ダイマーがトロンビンの存在下にａ’２ダイマーとなって活性を発現する。この点において血漿中の血液凝固第ＸＩＩＩ因子が４量体として存在するのとは、対照的である。
【０００４】
血漿由来の血漿蛋白質製剤の製造工程にはウイルスを始め、種々の夾雑物を除去又は不活化するための工程を組み込むことが必要である。
ウイルス不活化の方法としては、液状または乾燥状態での加熱処理によりウイルスを不活化する方法（非特許文献１、特許文献１）、界面活性剤と有機溶媒を用いて脂質膜を有するウイルスを不活化する方法（特許文献２）等が知られている。また、ウイルスを除去する方法としては、一定の孔径サイズをもったウイルス除去膜で除去する方法（特許文献３）、陽イオン交換体処理により除去する方法などが知られている。
【０００５】
ヒト血液より分離されたヒト血漿から血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤を分離、精製する工程において、加熱処理時に血液凝固因子を安定化する方法（特許文献４）も開示されている。
特許文献５には、脂質性のエンベローブを有するウイルスの夾雑可能性のある蛋白質を疎水性担体によって処理し、脂質性のエンベローブを有するウイルスを除去する製造方法が示されている。
一方、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の精製に関して下記のような精製方法が開示されている。
【０００６】
特許文献６には、血液凝固因子を含む溶液を疎水性リガンドに接触させることにより夾雑するフィブリノーゲンを効率よく除去する精製法が開示されている。
特許文献７には、ヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子および夾雑物を含有する水溶液から、ヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤を疎水性クロマトグラフィーで処理してその吸着画分を回収することを特徴とするヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤の製造方法が開示されている。しかしながら当該発明は胎盤からの血液凝固第ＸＩＩＩ因子ａ２の精製に関するもので、血漿中よりａ２ｂ２の４量体を精製するものではない。
【０００７】
特許文献８には、胎盤由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子を精製する方法が開示され、疎水性クロマトグラフィーにて吸着分離する工程、さらに、ハイドロキシアパタイトあるいは陰イオン交換樹脂に吸着させて精製することが示されている。しかしながら、この方法もａ２の２量体である血液凝固第ＸＩＩＩ因子に関するものである。
近年、ヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤としては、ヒト血漿由来、胎盤由来（特許文献８）、遺伝子組換え体（特許文献９）などが知られている。
しかし胎盤由来のものは、胎盤を提供したドナー毎にウイルスのチェックを行うことが難しく、ウイルスに対する安全性確保の観点より、過去に市販されていたが現在では国内では市販されていない。さらに胎盤に由来する血液凝固第ＸＩＩＩ因子はａサブユニットの２量体のものであり、４量体の血液凝固第ＸＩＩＩ因子に関するものではない。
【０００８】
また、遺伝子組換え技術によるものも、現在では未だ臨床応用には至っておらす、工業的に安価に製造され現実に市販に至っているものは存在しない。
一方、ヒト血液由来の製剤は供血者毎にＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなどの臨床上問題とされるウイルスについて、採血時にドナーの血液毎にウイルスのチェックが血液センターで実施され、更に前述のウイルス不活化処理が確実に実行されている結果、ウイルス安全性について十分な対策が講じられている。このため、本邦では献血血漿より血漿分画製剤が製造され供給されており、その安全性は十分に確保されている。
【０００９】
血液凝固第ＸＩＩＩ因子は、単独の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤として先天性血液凝固第ＸＩＩＩ因子の欠乏患者や外科手術時の縫合不全あるいはシェーンライン・ヘノッホ紫斑病などに用いられている。また、血液凝固第ＸＩＩＩ因子はフィブリノーゲンよりトロンビンによりフィブリンへと変換されたフィブリンモノマーを架橋して安定なフィブリン塊へと転換させる性質を利用して、トロンビンとフィブリノーゲンよりなる生理的接着剤に配合され、外科手術時の臓器、組織の接着あるいは止血を目的として臨床で用いられている。
【００１０】
外科手術時等の生体侵襲の強い状況下では、炎症反応を抑制することが極めて重要である。そこで、本発明者らは、第ＸＩＩＩ因子製剤に炎症を助長するような因子が他に含まれていないか精査したところ、製剤、加熱処理を施した血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分においても、無視し得ない量のアナフィラトキシンとして知られている活性化補体が含まれていることが判明した。しかしながら、現在までに血液凝固第ＸＩＩＩ因子の精製法あるいはその製剤において活性化補体あるいはアナフィラトキシンに着目して、その除去が検討されたことはなかった。
【００１１】
【特許文献１】
特開２００２−１１２７６５号公報
【特許文献２】
特開昭６０−５１１１６号公報
【特許文献３】
特開２００２−１１４７９９号公報
【特許文献４】
特公昭６２−５４２８６号公報
【特許文献５】
特開平２−２０９８１４号公報
【特許文献６】
特開平２−３６１９９号公報
【特許文献７】
特開平２−２４７１９９号公報
【特許文献８】
特開平６−１０５６８３号公報
【特許文献９】
特表平７−５０６４７９号公報
【非特許文献１】
Ｍｕｒｒａｙら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３１巻（５）， ３４１〜３５８（１９５５）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ヒト血液由来の補体成分、特にＣ３の活性型でありアナフィラトキシンとして知られているＣ３ａが市販の血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤に夾雑していることを確認した。また、本発明者らは、活性化補体が血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤に夾雑しており、精製の工程において、その除去効果を検討し、特に血漿中に多く存在している補体成分Ｃ３の活性型Ｃ３ａに注目し、検討を行ったところ、原料血漿に由来する補体成分が精製工程中に補体の活性化（ｃｏｌｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）として知られている臨床検査時のサンプルの低温保管による補体の活性化が血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤の精製工程のおいても引き起こされる危険性のあることを考慮して検討を進め、特に活性化補体の中でもアナフィラトキシンが夾雑していることを見出した。アナフィラトキシンの中でも夾雑量の多いＣ３ａに注目し、ウイルスの不活性化の加熱処理時においても不活性化されずアナフィラトキシンＣ３ａがそのアナフィラトキシン活性を保持したまま夾雑してくることをも見出した。
【００１３】
本発明は、ヒト血漿由来のヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分から、活性化補体として知られ動物に投与した際にアナフィラキシー様反応を惹起することが知られているアナフィラトキシンである活性化補体Ｃ３ａ等を効率的に除去する方法および実質的に活性化補体を含まないヒト血漿由来のヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤を提供しようとするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決する為に種々の研究を重ねた結果、活性化補体が夾雑する可能性があるヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性坦体による処理によって活性化補体を効率的に除去できることを見いだし、更に研究を進めて、疎水性坦体による処理、それに続く陰イオン交換体による処理によりアナフィラトキシンとして知られている活性化補体Ｃ３ａを効率的に除去できることを見いだし、更に検討を重ねて発明を完成した。
【００１５】
また、本発明者らは、血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分に夾雑が懸念されるウイルスの加熱処理によるウイルス不活化時に安定化剤として加えられる糖、アミノ酸などを疎水性担体で処理することで事前に限外濾過処理等によりアミノ酸、糖などの安定化剤を除去することなくそのまま適用でき、且つ、熱処理により発生した熱変成血液凝固第ＸＩＩＩ因子をも除去でき、製造工程が簡便化できることも見いだし、本発明の完成に至ったものである。
特にウイルス不活化のための加熱処理時に補体成分Ｃ３ａの活性が保持されていることから、加熱処理した後の血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性担体で処理することが効果的であることも見い出した。
【００１６】
すなわち本発明は、
（１）ヒト血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性担体により処理する血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分から活性化補体を除去する方法、
（２）疎水性担体処理後さらに陰イオン交換体による処理を行う（１）記載の方法、
（３）血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分がウイルス不活化のために加熱処理されたものである（１）または（２）記載の方法、
（４）活性化補体がアナフィラトキシンである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５）アナフィラトキシンがＣ３ａである（４）記載の方法、
（６）活性化補体を実質的に含まないヒト血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤、
（７）活性化補体がアナフィラトキシンである（６）記載の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤、
（８）アナフィラトキシンがＣ３ａである（７）記載の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤、
（９）アナフィラトキシンの含量が血液凝固ＸＩＩＩ因子の単位数当たり５０ｎｇ以下である（８）記載の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤、
である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
（１）血液凝固第ＸＩＩＩ因子を含む血漿画分
本発明が適用される血液凝固第ＸＩＩＩ因子を含む血漿画分は、公知のいずれの方法によって得られたものでも利用できる。例えば、血漿のコーン分画によるエタノール分画Ｉペーストを５０〜６０℃で３〜３０分加熱し、脱フィブリノーゲン処理を行いグリシンおよび塩化ナトリウムを添加して血液凝固第ＸＩＩＩ因子を選択的に沈澱させて得る方法（特許第２６７８１９３号）により得ることができる。より具体的な方法としてはたとえば次の方法があげられる。まず、コーン低温エタノール分画の画分Ｉを採取し、０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、ミキサーで画分を充分に撹拌して溶解させる。この溶液を遠心分離器により３０００ｇ、２０℃で１５分間遠心分離し上清を得る。この上清に、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）をゆっくりと加え、撹拌後２０℃で１時間放置する。この溶液を再び遠心分離器でにて３０００ｇ、１０℃で１５分遠心分離し、沈殿物を濾取する。この沈澱を０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、５６℃、３分間加熱処理して熱変性物を遠心分離して上清を得る。この上清に終濃度として１．８Ｍグリシンと２Ｍ塩化ナトリウムを添加して沈澱画分より血液凝固第ＸＩＩＩ因子を含む溶液を得ることができる。
血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有溶液における蛋白、即ち第ＸＩＩＩ因子の濃度は特に限定されないが、通常０．０１〜３０．０重量％、好ましくは０．０３〜１０．０重量％、特に好ましくは、０．０５〜３．０重量％である。蛋白溶液のｐＨは、通常５．０〜１０．０、好ましくは６．０〜８．５である。
【００１８】
本発明に用いる血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分は加熱処理にウイルス不活化を行ったものが効果的である。加熱処理時に変性あるいは失活した血液凝固第ＸＩＩＩ因子は、疎水性担体への吸着が未変性のものと比べて弱く、カラムの溶出条件を適当にすることによって未変性血液凝固第ＸＩＩＩ因子のみを取り出すことが可能である。さらに加熱処理時に加えた糖、アミノ酸などの安定化剤を事前に除去することなく、加熱処理した画分をそのまま疎水性担体で処理することが可能である。
【００１９】
本発明に用いる疎水性担体は、如何なるものでも利用できるが、例えばブチル基、プロピル基等のアルキル基、フェニル基等のアリル基を有するものが例示される。より好適には、疎水性クロマトグラフィーを用いることが好ましく、例えばフェニルセルロースＦＦ、ブチルセルロファイン（チッソ社製）、オクチルセファロース（ファルマシア社製）、エチルトヨパール（東ソー製）等が用いられる。処理条件としては、前処理として、疎水性担体に対して前処理が行われていることが好ましい。当該前処理としては、通常、緩衝液による処理が例示される。前処理緩衝液としては、具体的にはクエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が例示され、より具体的には前記緩衝液にて０．０１〜０．５Ｍ、特に好ましくは０．０５〜０．２Ｍの濃度で、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８にて前もって平衡化された疎水性担体が使用される。血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分は上記の緩衝液にて調製し、平衡化処理した疎水性担体に負荷する。次いで、前記緩衝液にて０．００１〜０．２Ｍ、特に好ましくは０．０１〜０．１Ｍの濃度でｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８にて洗浄する。
【００２０】
その後、塩濃度０．０００１〜０．１Ｍ、好ましくは０．００１〜０．０５Ｍ、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８の緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等で疎水性坦体に吸着した血液凝固第ＸＩＩＩ因子を溶出し、回収する。なお、溶出条件は具体的なカラムの種類等の条件に応じて適宜設定することができる。また、本発明の疎水性担体による処理はバッチ法、カラム法のいずれの方法にても行うことができるが、カラム法を用いることが特に好ましい。
【００２１】
回収された蛋白質は、必要に応じて、さらに陰イオン交換体処理により活性化補体をさらに除去することが好ましい。かかる精製方法としては、例えばアニオン交換クロマト処理等が例示される。より具体的には、陰イオン交換基を有する不溶性担体であれば如何なるものでも使用できるが、ジエチルアミノエチル基を有する不溶性担体、ＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア製）ＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー製）などの弱陰イオン交換体であっても、Ｑ−セファロース（ファルマシア製）、ＱＡＥ−トヨパール（東ソー製）などの強陰イオン交換体であっても利用できるが、特にジエチルアミノエチル基を有する不溶性担体を用いることが好ましい。
【００２２】
カラム法で実施する場合、処理条件としては、前処理として、前記不溶性担体に対して前処理が行われていることが好ましい。当該前処理としては、通常、緩衝液による処理が例示される。前処理緩衝液としては、具体的には食塩水、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が例示され、より具体的には前記緩衝液にて０．０２〜１Ｍ、特に好ましくは０．１〜０．５Ｍの濃度で、ｐＨ５〜９、好ましくは、ｐＨ６〜８にて前もって活性化された不溶性担体が使用される。次いで、前記緩衝液にて０．０００１〜０．１Ｍ、特に好ましくは０．００１〜０．０１Ｍの濃度で、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８にて前もって平衡化された不溶性担体が使用される。次いで、疎水性担体に施された血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を平衡化処理した不溶性担体に負荷する。次いで、前記緩衝液にて０．０００１〜０．１Ｍ、特に好ましくは０．００１〜０．０１Ｍの濃度で、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８にて洗浄する。その後、塩濃度０．０１〜０．２Ｍ、好ましくは０．０５〜０．１Ｍ、ｐＨ５〜９好ましくはｐＨ６〜８の緩衝液、例えば食塩水、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等で前記不溶性担体に吸着した血液凝固第ＸＩＩＩ因子を溶出し、回収する。なお、溶出条件は具体的なカラムの種類等の条件に応じて適宜設定することができる。
【００２３】
このようにして処理された血液凝固第ＸＩＩＩ因子は、常套手段により製剤化され、血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤に調製される。例えば、糖、アミノ酸等の安定化剤を加え、場合によっては界面活性剤を添加して調製した後に、凍結乾燥して、凍結乾燥組成物とすることができる。
また、組織の接着、止血を目的として使用するために、フィブリノーゲン、トロンビン等の成分と混合して生理的接着剤の構成成分として任意に製剤化することも可能である。
【００２４】
本発明で除去される活性化補体は、原料血漿に由来するもので、血液採血後の低温保存による補体の活性化（ｃｏｌｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｏｎ）によるもの、あるいは血漿より種々の精製工程中に活性化されたものも含めそれ自体では不活性な補体成分の活性成分の活性型のものをいう。活性化補体は食作用促進、アナフィラキシー、白血球遊走、免疫複合体の可溶化、Ｂ細胞の活性化などの作用を有するものである。
【００２５】
本発明で除去されるアナフィラトキシンとは、ヒト血漿中に存在する血漿タンパク質である補体に由来するもので、その活性型である活性化補体のうち、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａは生物活性が著明で、動物に靜注すると、アナフィラキシー様症状が見られることからアナフィラトキシンと呼ばれており、これらの３つの活性型を示すものである。特に血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤にはアナフィラトキシンＣ３ａの夾雑量が多く、前駆体であるＣ３の除去も重要であり、Ｃ３についても疎水性担体処理および／又は陰イオン交換体処理により効率的に除去できることも見出している。中でもＣ３の分解断片であるＣ３ａが精製された血液凝固第ＸＩＩＩ因子の電気泳動による分析で夾雑してくることを見出した。
【００２６】
Ｃ３は分子量１２万のα鎖、７．５万のβ鎖がＳ−Ｓ結合で架橋された構造をとり、Ｃ３転換酵素の基質として、Ｃ３ａ（分子量８，０００）とＣ３ｂ（分子量１８万）に分解される。この分解されたＣ３ａはポリペプチドでアナフィラトキシンであり、平滑筋収縮作用、血管透過性の亢進、肥満細胞からのヒスタミン放出作用などの局所炎症を強力に助長することが知られている。
【００２７】
また、Ｃ３ａは白血球に対する走化能を持ちアナフィラキシー様反応を引き起こす。この為、本発明はＣ３および活性型であるＣ３ａを実質的に除去することを目的としている。実質的に活性化補体を含まないとは、血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有製剤の適用時の溶液状態にした際に、検出される活性化補体の含有量が、正常ヒト血漿における基準値に示される濃度範囲の上限以下であることをいう。実質的にアナフィラトキシンを含まないとは、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａの夾雑量が前記適用時における状態でＣ３ａが２００ｎｇ／ｍｌ以下、Ｃ４ａが２００ｎｇ／ｍｌ以下、Ｃ５ａが１０ｎｇ／ｍｌ以下であることを示すものとする。なお、活性化補体Ｃ３ａの基準値は５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、Ｃ４ａの基準値は５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、Ｃ５ａの基準値は１０ｎｇ／ｍｌ以下である。アナフィラトキシンＣ３ａを含まないとは、Ｃ３ａをＲＩＡ（２抗体法）による測定方法（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３ａ ｄｅｓ Ａｒｇ［１２５Ｉ］ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ［ｋｉｔ］、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により測定した場合に、検出されないか、検出されたとしても、例えば血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤の投与時の製剤中濃度として２００ｎｇ／ｍｌ以下であることを意味し、血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有組成物の血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性単位（１倍）あたり、Ｃ３ａのレベルとして５０ｎｇ以下、より好ましくは１０ｎｇ以下、特に好適には５ｎｇ以下であることを意味する。血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性は、血液凝固試験用標準ヒト血漿（デイドベーリングマールブルグ社製）を標準としてダンシルカタベリン法（Ｔｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．， ３６， ｐ１２３〜１３１（１９８４））、クロット溶解法（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２３６巻、２６２５〜２６３３（１９６１））などの方法により測定することができる。
【００２８】
Ｃ４ａ、Ｃ５ａの測定は、臨床検査等で用いられる従来公知のいずれの方法も使用できるが、例えばＣ４ａ測定キット、Ｃ５ａ測定キット（ＲＩＡ法：Ａｍｅｒｓｃｈａｍ社製）などが利用できる。
また、活性化補体の測定は、電気泳動法によっても行うことができ、補体成分の移動度のバンドの有無により、当該活性化補体が実質的に除去されていることを確認することもできる。
さらに安全性を高めるために、ウイルスの除去膜処理と組み合わせることで実質的にウイルスも含め夾雑が危惧される物質を含まない第ＸＩＩＩ因子の精製および製剤化が可能となる。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例および試験例をあげて本発明を具体的に説明する。
実施例１
コーン低温エタノール分画の画分Ｉを約１Ｋｇ採取し、これに５リットルの０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、ミキサーにて画分Ｉを十分に攪拌しながら溶解した。この溶液を遠心分離器により３０００ｇ、２０℃で１５分間遠心分離し上清を得た。この上清に、２．５リットルの１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）をゆっくりと添加攪拌し、２０℃で１時間放置した。この溶液を再び３０００ｇ、１０℃で１５分間遠心分離して沈殿物を採取した。この沈殿物に３リットルの０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて溶解し、５６℃、３分間加熱処理を行い、遠心分離器により３０００ｇ、２０℃で１５分間遠心分離して上清を得ることで熱変性物を分離した。
この上清に蔗糖およびグリシンを３０％重量および１．５Ｍとなるように添加し、６０℃１０時間の加熱処理を行い、以下の工程に使用した。
【００３０】
実施例２
実施例１で得たサンプルを０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した疎水性担体（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ）グラマトグラフィに負荷し、同平衡化緩衝液にて洗浄し、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し吸着画分を得た。
【００３１】
実施例３
実施例２で得たサンプルを０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陰イオン交換体（ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ；ファルマシア社製）に負荷し、０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出した画分１リットルを限外濾過膜を用いて濃縮し、約１２０倍／ｍｌとなるように第ＸＩＩＩ因子の力価を調整した。得られた溶液に塩化ナトリウムを０．１Ｍ、アルブミンを０．８％となるように添加した後、０．２μｍの平均孔径を有するフィルター（商品名：ミリパック、ミリポア社製）で予備濾過を施した試料１５．０ｍｌをデッドエンド法により平均孔径３５ｎｍのウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、０．０１ｍ２ 旭化成（株）製）で濾過した。試料を濾過した後０．０１Ｍクエン酸緩衝液（０．１ｍＭ塩化ナトリウム含有、ｐＨ７．５）１００ｍｌを通過させ、濾液として得られた溶液と試料の濾液とを混合した。
【００３２】
実施例４
実施例３で得た溶液を最終濃度としてブドウ糖０．５重量％、塩化ナトリウム０．８５重量％となるように安定化剤を添加した後、４ｍｌを１０本のバイアルに充填し、凍結乾燥した後に窒素雰囲気下で密栓を行い血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有製剤を作成した。
【００３３】
試験例１
実施例１、実施例２、実施例３および実施例４で得たサンプルのＣ３ａの含有量および血液凝固第ＸＩＩＩ因子の力価を測定し、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性単位あたりのＣ３ａの夾雑量を測定し表１に結果を示した。実施例４で得られたサンプルは注射用水４ｍｌにて溶解して測定を行った。
血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性は、血液凝固試験用標準ヒト血漿（デイドベーリングマールブルグ社）を標準としてダンシルカタベリン法（Ｔｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， ３６， １２３〜１３１ （１９８４） ）によって測定し、２８０ｎｍにおける吸光度Ａ２８０の値で徐して血液凝固第ＸＩＩＩ因子の比活性（活性（倍）／Ａ２８０）で示した。
Ｃ３ａ量は、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の単位（１倍）あたりのＣ３ａの量として示す。
Ｃ３ａ残存（％）は、実施例１で夾雑しているＣ３ａ量を基準として、以下の工程での残存を百分率で示した。また、前後の減少率は各実施例の処理前のサンプルと処理後のサンプルのＣ３ａの減少率で示した。
Ｃ３ａ量（ｎｇ）＝（Ｃ３ａ（ｎｇ／ｍｌ）／血液凝固第ＸＩＩＩ因子活性（倍／ｍｌ））
【００３４】
【表１】
〔表１〕から明らかなように疎水性担体処理および陰イオン交換体処理は、アナフィラトキシンＣ３ａの除去効率が非常に高く、疎水性担体と陰イオン交換体処理の組み合わせにより補体成分が非常に効率的に除去できた。
なお、実施例３の工程におけるウイルス除去膜工程による補体Ｃ３ａの除去効果はほとんど認められないことを別途確認している。
【００３５】
試験例２
Ｃ３の除去率を評価する為、疎水性担体処理前後および陰イオン交換体処理前後のＣ３の値を測定し、それぞれの工程前後での除去率をＣ３の重量の百分率で示した。
Ｃ３は、ラテックス凝集免疫法（坪田ら、医用電子と生体工学２２：ｐ２６７〜２７３、１９８４年）にて、ＬＸ試薬“栄研”Ｃ３、ＬＸ−緩衝液（栄研化学社製）を用いて、全自動免疫化学分析装置ＬＸ６０００（エイアンドディー社製）で測定した。
【００３６】
【表２】
〔表２〕より明らかな通り、Ｃ３は、疎水性担体処理および陰イオン交換体処理により有意に減少することが示され、疎水性担体処理および陰イオン交換体処理は、Ｃ３ａの除去に加え、Ｃ３ａの前駆体であるＣ３量も有意に低下させることが示された。
これは、これらの処理工程後の工程あるいは生体に投与された後に、製剤に由来したＣ３よりＣ３ａへの転換量を減少できる可能性があることを示すものである。
【００３７】
試験例３
実施例４で作成した凍結乾燥製剤に注射用蒸留水を添加して製剤を調整し、Ｃ３ａの濃度を測定した。また、市販のＡ社製の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤を添付の溶解液で溶解して製剤を調製後、同様にＣ３ａ濃度を測定した。また、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性単位あたりのＣ３ａ量を表３右欄に示した。
上記の測定結果を下記に示す。
【００３８】
【表３】
［表３］から明らかな通り、本発明により得られた血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤は、アナフィラトキシンＣ３ａの夾雑が非常に低いものを得ることができた。
なお、健常人における血漿中のＣ３ａ濃度は、５０〜２００ｎｇ／ｍｌである。
【００３９】
試験例４
実施例１で得たサンプルを実施例３の条件で陰イオン交換体処理を行ったところ、加熱処理時の安定化剤の夾雑により、血液凝固第ＸＩＩＩ因子が陰イオン交換体に吸着する量が低下し、著しい回収率の低下を認めた。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒト血漿由来の活性化補体として知られている補体成分が夾雑する血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性坦体による処理によって補体成分を効率的に除去することができる。この疎水性坦体による処理に続く陰イオン交換体による処理により更に高度にＣ３ａを除去することができる。
また、血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分に夾雑が懸念されるウイルスの加熱処理によるウイルス不活化時に安定化剤として加えられる糖、アミノ酸などを疎水性担体で処理することで事前に限外濾過処理等によりアミノ酸、糖などの安定化剤を除去することなくそのまま適用でき、且つ、熱処理により発生した熱変性血液凝固第ＸＩＩＩ因子をも除去でき製造工程の簡便化も達成できる。
【発明の属する技術分野】
本発明は血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分から活性化補体を除去する方法および活性化補体を実質的に含まない血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト血漿中に存在する血液凝固第ＸＩＩＩ因子は、フィブリン安定化因子として知られている分子量３２万の血漿蛋白であり、ａサブユニットおよびｂサブユニットがそれぞれ２量体を形成し、ａサブユニットの２量体であるａ２とｂサブユニットの２量体であるｂ２が結合したａ２ｂ２というという４量体で構成されており、活性の発現には活性体に転換されその作用を発現する。このａサブユニットの２量体であるａ２は実質的なフィブリン安定化因子として作用する活性部位を有し、ｂサブユニットの２量体ｂ２がａサブユニットの２量体ａ２の血漿中での安定化に関与していると考えられている。この血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性化体の前駆体ａ２ｂ２の４量体は、トロンビンの存在下でａサブユニットがａ’サブユニットとなり、ａ’２ｂ２の４量体となる。その後、カルシウムイオンの存在下でａ’２の２量体となり、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性化体として活性を発現する。
【０００３】
血液凝固第ＸＩＩＩ因子は血小板膜上あるいは胎盤からも生成されるものであるが、これらは膜上にａ２ダイマー（分子量１６万）として存在しているものであり、このａ２ダイマーがトロンビンの存在下にａ’２ダイマーとなって活性を発現する。この点において血漿中の血液凝固第ＸＩＩＩ因子が４量体として存在するのとは、対照的である。
【０００４】
血漿由来の血漿蛋白質製剤の製造工程にはウイルスを始め、種々の夾雑物を除去又は不活化するための工程を組み込むことが必要である。
ウイルス不活化の方法としては、液状または乾燥状態での加熱処理によりウイルスを不活化する方法（非特許文献１、特許文献１）、界面活性剤と有機溶媒を用いて脂質膜を有するウイルスを不活化する方法（特許文献２）等が知られている。また、ウイルスを除去する方法としては、一定の孔径サイズをもったウイルス除去膜で除去する方法（特許文献３）、陽イオン交換体処理により除去する方法などが知られている。
【０００５】
ヒト血液より分離されたヒト血漿から血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤を分離、精製する工程において、加熱処理時に血液凝固因子を安定化する方法（特許文献４）も開示されている。
特許文献５には、脂質性のエンベローブを有するウイルスの夾雑可能性のある蛋白質を疎水性担体によって処理し、脂質性のエンベローブを有するウイルスを除去する製造方法が示されている。
一方、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の精製に関して下記のような精製方法が開示されている。
【０００６】
特許文献６には、血液凝固因子を含む溶液を疎水性リガンドに接触させることにより夾雑するフィブリノーゲンを効率よく除去する精製法が開示されている。
特許文献７には、ヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子および夾雑物を含有する水溶液から、ヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤を疎水性クロマトグラフィーで処理してその吸着画分を回収することを特徴とするヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤の製造方法が開示されている。しかしながら当該発明は胎盤からの血液凝固第ＸＩＩＩ因子ａ２の精製に関するもので、血漿中よりａ２ｂ２の４量体を精製するものではない。
【０００７】
特許文献８には、胎盤由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子を精製する方法が開示され、疎水性クロマトグラフィーにて吸着分離する工程、さらに、ハイドロキシアパタイトあるいは陰イオン交換樹脂に吸着させて精製することが示されている。しかしながら、この方法もａ２の２量体である血液凝固第ＸＩＩＩ因子に関するものである。
近年、ヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤としては、ヒト血漿由来、胎盤由来（特許文献８）、遺伝子組換え体（特許文献９）などが知られている。
しかし胎盤由来のものは、胎盤を提供したドナー毎にウイルスのチェックを行うことが難しく、ウイルスに対する安全性確保の観点より、過去に市販されていたが現在では国内では市販されていない。さらに胎盤に由来する血液凝固第ＸＩＩＩ因子はａサブユニットの２量体のものであり、４量体の血液凝固第ＸＩＩＩ因子に関するものではない。
【０００８】
また、遺伝子組換え技術によるものも、現在では未だ臨床応用には至っておらす、工業的に安価に製造され現実に市販に至っているものは存在しない。
一方、ヒト血液由来の製剤は供血者毎にＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなどの臨床上問題とされるウイルスについて、採血時にドナーの血液毎にウイルスのチェックが血液センターで実施され、更に前述のウイルス不活化処理が確実に実行されている結果、ウイルス安全性について十分な対策が講じられている。このため、本邦では献血血漿より血漿分画製剤が製造され供給されており、その安全性は十分に確保されている。
【０００９】
血液凝固第ＸＩＩＩ因子は、単独の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤として先天性血液凝固第ＸＩＩＩ因子の欠乏患者や外科手術時の縫合不全あるいはシェーンライン・ヘノッホ紫斑病などに用いられている。また、血液凝固第ＸＩＩＩ因子はフィブリノーゲンよりトロンビンによりフィブリンへと変換されたフィブリンモノマーを架橋して安定なフィブリン塊へと転換させる性質を利用して、トロンビンとフィブリノーゲンよりなる生理的接着剤に配合され、外科手術時の臓器、組織の接着あるいは止血を目的として臨床で用いられている。
【００１０】
外科手術時等の生体侵襲の強い状況下では、炎症反応を抑制することが極めて重要である。そこで、本発明者らは、第ＸＩＩＩ因子製剤に炎症を助長するような因子が他に含まれていないか精査したところ、製剤、加熱処理を施した血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分においても、無視し得ない量のアナフィラトキシンとして知られている活性化補体が含まれていることが判明した。しかしながら、現在までに血液凝固第ＸＩＩＩ因子の精製法あるいはその製剤において活性化補体あるいはアナフィラトキシンに着目して、その除去が検討されたことはなかった。
【００１１】
【特許文献１】
特開２００２−１１２７６５号公報
【特許文献２】
特開昭６０−５１１１６号公報
【特許文献３】
特開２００２−１１４７９９号公報
【特許文献４】
特公昭６２−５４２８６号公報
【特許文献５】
特開平２−２０９８１４号公報
【特許文献６】
特開平２−３６１９９号公報
【特許文献７】
特開平２−２４７１９９号公報
【特許文献８】
特開平６−１０５６８３号公報
【特許文献９】
特表平７−５０６４７９号公報
【非特許文献１】
Ｍｕｒｒａｙら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３１巻（５）， ３４１〜３５８（１９５５）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ヒト血液由来の補体成分、特にＣ３の活性型でありアナフィラトキシンとして知られているＣ３ａが市販の血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤に夾雑していることを確認した。また、本発明者らは、活性化補体が血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤に夾雑しており、精製の工程において、その除去効果を検討し、特に血漿中に多く存在している補体成分Ｃ３の活性型Ｃ３ａに注目し、検討を行ったところ、原料血漿に由来する補体成分が精製工程中に補体の活性化（ｃｏｌｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）として知られている臨床検査時のサンプルの低温保管による補体の活性化が血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤の精製工程のおいても引き起こされる危険性のあることを考慮して検討を進め、特に活性化補体の中でもアナフィラトキシンが夾雑していることを見出した。アナフィラトキシンの中でも夾雑量の多いＣ３ａに注目し、ウイルスの不活性化の加熱処理時においても不活性化されずアナフィラトキシンＣ３ａがそのアナフィラトキシン活性を保持したまま夾雑してくることをも見出した。
【００１３】
本発明は、ヒト血漿由来のヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分から、活性化補体として知られ動物に投与した際にアナフィラキシー様反応を惹起することが知られているアナフィラトキシンである活性化補体Ｃ３ａ等を効率的に除去する方法および実質的に活性化補体を含まないヒト血漿由来のヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤を提供しようとするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決する為に種々の研究を重ねた結果、活性化補体が夾雑する可能性があるヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性坦体による処理によって活性化補体を効率的に除去できることを見いだし、更に研究を進めて、疎水性坦体による処理、それに続く陰イオン交換体による処理によりアナフィラトキシンとして知られている活性化補体Ｃ３ａを効率的に除去できることを見いだし、更に検討を重ねて発明を完成した。
【００１５】
また、本発明者らは、血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分に夾雑が懸念されるウイルスの加熱処理によるウイルス不活化時に安定化剤として加えられる糖、アミノ酸などを疎水性担体で処理することで事前に限外濾過処理等によりアミノ酸、糖などの安定化剤を除去することなくそのまま適用でき、且つ、熱処理により発生した熱変成血液凝固第ＸＩＩＩ因子をも除去でき、製造工程が簡便化できることも見いだし、本発明の完成に至ったものである。
特にウイルス不活化のための加熱処理時に補体成分Ｃ３ａの活性が保持されていることから、加熱処理した後の血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性担体で処理することが効果的であることも見い出した。
【００１６】
すなわち本発明は、
（１）ヒト血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性担体により処理する血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分から活性化補体を除去する方法、
（２）疎水性担体処理後さらに陰イオン交換体による処理を行う（１）記載の方法、
（３）血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分がウイルス不活化のために加熱処理されたものである（１）または（２）記載の方法、
（４）活性化補体がアナフィラトキシンである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５）アナフィラトキシンがＣ３ａである（４）記載の方法、
（６）活性化補体を実質的に含まないヒト血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤、
（７）活性化補体がアナフィラトキシンである（６）記載の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤、
（８）アナフィラトキシンがＣ３ａである（７）記載の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤、
（９）アナフィラトキシンの含量が血液凝固ＸＩＩＩ因子の単位数当たり５０ｎｇ以下である（８）記載の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤、
である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
（１）血液凝固第ＸＩＩＩ因子を含む血漿画分
本発明が適用される血液凝固第ＸＩＩＩ因子を含む血漿画分は、公知のいずれの方法によって得られたものでも利用できる。例えば、血漿のコーン分画によるエタノール分画Ｉペーストを５０〜６０℃で３〜３０分加熱し、脱フィブリノーゲン処理を行いグリシンおよび塩化ナトリウムを添加して血液凝固第ＸＩＩＩ因子を選択的に沈澱させて得る方法（特許第２６７８１９３号）により得ることができる。より具体的な方法としてはたとえば次の方法があげられる。まず、コーン低温エタノール分画の画分Ｉを採取し、０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、ミキサーで画分を充分に撹拌して溶解させる。この溶液を遠心分離器により３０００ｇ、２０℃で１５分間遠心分離し上清を得る。この上清に、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）をゆっくりと加え、撹拌後２０℃で１時間放置する。この溶液を再び遠心分離器でにて３０００ｇ、１０℃で１５分遠心分離し、沈殿物を濾取する。この沈澱を０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、５６℃、３分間加熱処理して熱変性物を遠心分離して上清を得る。この上清に終濃度として１．８Ｍグリシンと２Ｍ塩化ナトリウムを添加して沈澱画分より血液凝固第ＸＩＩＩ因子を含む溶液を得ることができる。
血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有溶液における蛋白、即ち第ＸＩＩＩ因子の濃度は特に限定されないが、通常０．０１〜３０．０重量％、好ましくは０．０３〜１０．０重量％、特に好ましくは、０．０５〜３．０重量％である。蛋白溶液のｐＨは、通常５．０〜１０．０、好ましくは６．０〜８．５である。
【００１８】
本発明に用いる血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分は加熱処理にウイルス不活化を行ったものが効果的である。加熱処理時に変性あるいは失活した血液凝固第ＸＩＩＩ因子は、疎水性担体への吸着が未変性のものと比べて弱く、カラムの溶出条件を適当にすることによって未変性血液凝固第ＸＩＩＩ因子のみを取り出すことが可能である。さらに加熱処理時に加えた糖、アミノ酸などの安定化剤を事前に除去することなく、加熱処理した画分をそのまま疎水性担体で処理することが可能である。
【００１９】
本発明に用いる疎水性担体は、如何なるものでも利用できるが、例えばブチル基、プロピル基等のアルキル基、フェニル基等のアリル基を有するものが例示される。より好適には、疎水性クロマトグラフィーを用いることが好ましく、例えばフェニルセルロースＦＦ、ブチルセルロファイン（チッソ社製）、オクチルセファロース（ファルマシア社製）、エチルトヨパール（東ソー製）等が用いられる。処理条件としては、前処理として、疎水性担体に対して前処理が行われていることが好ましい。当該前処理としては、通常、緩衝液による処理が例示される。前処理緩衝液としては、具体的にはクエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が例示され、より具体的には前記緩衝液にて０．０１〜０．５Ｍ、特に好ましくは０．０５〜０．２Ｍの濃度で、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８にて前もって平衡化された疎水性担体が使用される。血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分は上記の緩衝液にて調製し、平衡化処理した疎水性担体に負荷する。次いで、前記緩衝液にて０．００１〜０．２Ｍ、特に好ましくは０．０１〜０．１Ｍの濃度でｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８にて洗浄する。
【００２０】
その後、塩濃度０．０００１〜０．１Ｍ、好ましくは０．００１〜０．０５Ｍ、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８の緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等で疎水性坦体に吸着した血液凝固第ＸＩＩＩ因子を溶出し、回収する。なお、溶出条件は具体的なカラムの種類等の条件に応じて適宜設定することができる。また、本発明の疎水性担体による処理はバッチ法、カラム法のいずれの方法にても行うことができるが、カラム法を用いることが特に好ましい。
【００２１】
回収された蛋白質は、必要に応じて、さらに陰イオン交換体処理により活性化補体をさらに除去することが好ましい。かかる精製方法としては、例えばアニオン交換クロマト処理等が例示される。より具体的には、陰イオン交換基を有する不溶性担体であれば如何なるものでも使用できるが、ジエチルアミノエチル基を有する不溶性担体、ＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア製）ＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー製）などの弱陰イオン交換体であっても、Ｑ−セファロース（ファルマシア製）、ＱＡＥ−トヨパール（東ソー製）などの強陰イオン交換体であっても利用できるが、特にジエチルアミノエチル基を有する不溶性担体を用いることが好ましい。
【００２２】
カラム法で実施する場合、処理条件としては、前処理として、前記不溶性担体に対して前処理が行われていることが好ましい。当該前処理としては、通常、緩衝液による処理が例示される。前処理緩衝液としては、具体的には食塩水、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が例示され、より具体的には前記緩衝液にて０．０２〜１Ｍ、特に好ましくは０．１〜０．５Ｍの濃度で、ｐＨ５〜９、好ましくは、ｐＨ６〜８にて前もって活性化された不溶性担体が使用される。次いで、前記緩衝液にて０．０００１〜０．１Ｍ、特に好ましくは０．００１〜０．０１Ｍの濃度で、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８にて前もって平衡化された不溶性担体が使用される。次いで、疎水性担体に施された血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を平衡化処理した不溶性担体に負荷する。次いで、前記緩衝液にて０．０００１〜０．１Ｍ、特に好ましくは０．００１〜０．０１Ｍの濃度で、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８にて洗浄する。その後、塩濃度０．０１〜０．２Ｍ、好ましくは０．０５〜０．１Ｍ、ｐＨ５〜９好ましくはｐＨ６〜８の緩衝液、例えば食塩水、クエン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等で前記不溶性担体に吸着した血液凝固第ＸＩＩＩ因子を溶出し、回収する。なお、溶出条件は具体的なカラムの種類等の条件に応じて適宜設定することができる。
【００２３】
このようにして処理された血液凝固第ＸＩＩＩ因子は、常套手段により製剤化され、血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤に調製される。例えば、糖、アミノ酸等の安定化剤を加え、場合によっては界面活性剤を添加して調製した後に、凍結乾燥して、凍結乾燥組成物とすることができる。
また、組織の接着、止血を目的として使用するために、フィブリノーゲン、トロンビン等の成分と混合して生理的接着剤の構成成分として任意に製剤化することも可能である。
【００２４】
本発明で除去される活性化補体は、原料血漿に由来するもので、血液採血後の低温保存による補体の活性化（ｃｏｌｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｏｎ）によるもの、あるいは血漿より種々の精製工程中に活性化されたものも含めそれ自体では不活性な補体成分の活性成分の活性型のものをいう。活性化補体は食作用促進、アナフィラキシー、白血球遊走、免疫複合体の可溶化、Ｂ細胞の活性化などの作用を有するものである。
【００２５】
本発明で除去されるアナフィラトキシンとは、ヒト血漿中に存在する血漿タンパク質である補体に由来するもので、その活性型である活性化補体のうち、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａは生物活性が著明で、動物に靜注すると、アナフィラキシー様症状が見られることからアナフィラトキシンと呼ばれており、これらの３つの活性型を示すものである。特に血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤にはアナフィラトキシンＣ３ａの夾雑量が多く、前駆体であるＣ３の除去も重要であり、Ｃ３についても疎水性担体処理および／又は陰イオン交換体処理により効率的に除去できることも見出している。中でもＣ３の分解断片であるＣ３ａが精製された血液凝固第ＸＩＩＩ因子の電気泳動による分析で夾雑してくることを見出した。
【００２６】
Ｃ３は分子量１２万のα鎖、７．５万のβ鎖がＳ−Ｓ結合で架橋された構造をとり、Ｃ３転換酵素の基質として、Ｃ３ａ（分子量８，０００）とＣ３ｂ（分子量１８万）に分解される。この分解されたＣ３ａはポリペプチドでアナフィラトキシンであり、平滑筋収縮作用、血管透過性の亢進、肥満細胞からのヒスタミン放出作用などの局所炎症を強力に助長することが知られている。
【００２７】
また、Ｃ３ａは白血球に対する走化能を持ちアナフィラキシー様反応を引き起こす。この為、本発明はＣ３および活性型であるＣ３ａを実質的に除去することを目的としている。実質的に活性化補体を含まないとは、血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有製剤の適用時の溶液状態にした際に、検出される活性化補体の含有量が、正常ヒト血漿における基準値に示される濃度範囲の上限以下であることをいう。実質的にアナフィラトキシンを含まないとは、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａの夾雑量が前記適用時における状態でＣ３ａが２００ｎｇ／ｍｌ以下、Ｃ４ａが２００ｎｇ／ｍｌ以下、Ｃ５ａが１０ｎｇ／ｍｌ以下であることを示すものとする。なお、活性化補体Ｃ３ａの基準値は５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、Ｃ４ａの基準値は５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、Ｃ５ａの基準値は１０ｎｇ／ｍｌ以下である。アナフィラトキシンＣ３ａを含まないとは、Ｃ３ａをＲＩＡ（２抗体法）による測定方法（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３ａ ｄｅｓ Ａｒｇ［１２５Ｉ］ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ ［ｋｉｔ］、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により測定した場合に、検出されないか、検出されたとしても、例えば血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤の投与時の製剤中濃度として２００ｎｇ／ｍｌ以下であることを意味し、血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有組成物の血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性単位（１倍）あたり、Ｃ３ａのレベルとして５０ｎｇ以下、より好ましくは１０ｎｇ以下、特に好適には５ｎｇ以下であることを意味する。血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性は、血液凝固試験用標準ヒト血漿（デイドベーリングマールブルグ社製）を標準としてダンシルカタベリン法（Ｔｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．， ３６， ｐ１２３〜１３１（１９８４））、クロット溶解法（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２３６巻、２６２５〜２６３３（１９６１））などの方法により測定することができる。
【００２８】
Ｃ４ａ、Ｃ５ａの測定は、臨床検査等で用いられる従来公知のいずれの方法も使用できるが、例えばＣ４ａ測定キット、Ｃ５ａ測定キット（ＲＩＡ法：Ａｍｅｒｓｃｈａｍ社製）などが利用できる。
また、活性化補体の測定は、電気泳動法によっても行うことができ、補体成分の移動度のバンドの有無により、当該活性化補体が実質的に除去されていることを確認することもできる。
さらに安全性を高めるために、ウイルスの除去膜処理と組み合わせることで実質的にウイルスも含め夾雑が危惧される物質を含まない第ＸＩＩＩ因子の精製および製剤化が可能となる。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例および試験例をあげて本発明を具体的に説明する。
実施例１
コーン低温エタノール分画の画分Ｉを約１Ｋｇ採取し、これに５リットルの０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、ミキサーにて画分Ｉを十分に攪拌しながら溶解した。この溶液を遠心分離器により３０００ｇ、２０℃で１５分間遠心分離し上清を得た。この上清に、２．５リットルの１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）をゆっくりと添加攪拌し、２０℃で１時間放置した。この溶液を再び３０００ｇ、１０℃で１５分間遠心分離して沈殿物を採取した。この沈殿物に３リットルの０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて溶解し、５６℃、３分間加熱処理を行い、遠心分離器により３０００ｇ、２０℃で１５分間遠心分離して上清を得ることで熱変性物を分離した。
この上清に蔗糖およびグリシンを３０％重量および１．５Ｍとなるように添加し、６０℃１０時間の加熱処理を行い、以下の工程に使用した。
【００３０】
実施例２
実施例１で得たサンプルを０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した疎水性担体（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ）グラマトグラフィに負荷し、同平衡化緩衝液にて洗浄し、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し吸着画分を得た。
【００３１】
実施例３
実施例２で得たサンプルを０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陰イオン交換体（ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ；ファルマシア社製）に負荷し、０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出した画分１リットルを限外濾過膜を用いて濃縮し、約１２０倍／ｍｌとなるように第ＸＩＩＩ因子の力価を調整した。得られた溶液に塩化ナトリウムを０．１Ｍ、アルブミンを０．８％となるように添加した後、０．２μｍの平均孔径を有するフィルター（商品名：ミリパック、ミリポア社製）で予備濾過を施した試料１５．０ｍｌをデッドエンド法により平均孔径３５ｎｍのウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、０．０１ｍ２ 旭化成（株）製）で濾過した。試料を濾過した後０．０１Ｍクエン酸緩衝液（０．１ｍＭ塩化ナトリウム含有、ｐＨ７．５）１００ｍｌを通過させ、濾液として得られた溶液と試料の濾液とを混合した。
【００３２】
実施例４
実施例３で得た溶液を最終濃度としてブドウ糖０．５重量％、塩化ナトリウム０．８５重量％となるように安定化剤を添加した後、４ｍｌを１０本のバイアルに充填し、凍結乾燥した後に窒素雰囲気下で密栓を行い血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有製剤を作成した。
【００３３】
試験例１
実施例１、実施例２、実施例３および実施例４で得たサンプルのＣ３ａの含有量および血液凝固第ＸＩＩＩ因子の力価を測定し、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性単位あたりのＣ３ａの夾雑量を測定し表１に結果を示した。実施例４で得られたサンプルは注射用水４ｍｌにて溶解して測定を行った。
血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性は、血液凝固試験用標準ヒト血漿（デイドベーリングマールブルグ社）を標準としてダンシルカタベリン法（Ｔｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， ３６， １２３〜１３１ （１９８４） ）によって測定し、２８０ｎｍにおける吸光度Ａ２８０の値で徐して血液凝固第ＸＩＩＩ因子の比活性（活性（倍）／Ａ２８０）で示した。
Ｃ３ａ量は、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の単位（１倍）あたりのＣ３ａの量として示す。
Ｃ３ａ残存（％）は、実施例１で夾雑しているＣ３ａ量を基準として、以下の工程での残存を百分率で示した。また、前後の減少率は各実施例の処理前のサンプルと処理後のサンプルのＣ３ａの減少率で示した。
Ｃ３ａ量（ｎｇ）＝（Ｃ３ａ（ｎｇ／ｍｌ）／血液凝固第ＸＩＩＩ因子活性（倍／ｍｌ））
【００３４】
【表１】
なお、実施例３の工程におけるウイルス除去膜工程による補体Ｃ３ａの除去効果はほとんど認められないことを別途確認している。
【００３５】
試験例２
Ｃ３の除去率を評価する為、疎水性担体処理前後および陰イオン交換体処理前後のＣ３の値を測定し、それぞれの工程前後での除去率をＣ３の重量の百分率で示した。
Ｃ３は、ラテックス凝集免疫法（坪田ら、医用電子と生体工学２２：ｐ２６７〜２７３、１９８４年）にて、ＬＸ試薬“栄研”Ｃ３、ＬＸ−緩衝液（栄研化学社製）を用いて、全自動免疫化学分析装置ＬＸ６０００（エイアンドディー社製）で測定した。
【００３６】
【表２】
これは、これらの処理工程後の工程あるいは生体に投与された後に、製剤に由来したＣ３よりＣ３ａへの転換量を減少できる可能性があることを示すものである。
【００３７】
試験例３
実施例４で作成した凍結乾燥製剤に注射用蒸留水を添加して製剤を調整し、Ｃ３ａの濃度を測定した。また、市販のＡ社製の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤を添付の溶解液で溶解して製剤を調製後、同様にＣ３ａ濃度を測定した。また、血液凝固第ＸＩＩＩ因子の活性単位あたりのＣ３ａ量を表３右欄に示した。
上記の測定結果を下記に示す。
【００３８】
【表３】
なお、健常人における血漿中のＣ３ａ濃度は、５０〜２００ｎｇ／ｍｌである。
【００３９】
試験例４
実施例１で得たサンプルを実施例３の条件で陰イオン交換体処理を行ったところ、加熱処理時の安定化剤の夾雑により、血液凝固第ＸＩＩＩ因子が陰イオン交換体に吸着する量が低下し、著しい回収率の低下を認めた。
【００４０】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒト血漿由来の活性化補体として知られている補体成分が夾雑する血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性坦体による処理によって補体成分を効率的に除去することができる。この疎水性坦体による処理に続く陰イオン交換体による処理により更に高度にＣ３ａを除去することができる。
また、血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分に夾雑が懸念されるウイルスの加熱処理によるウイルス不活化時に安定化剤として加えられる糖、アミノ酸などを疎水性担体で処理することで事前に限外濾過処理等によりアミノ酸、糖などの安定化剤を除去することなくそのまま適用でき、且つ、熱処理により発生した熱変性血液凝固第ＸＩＩＩ因子をも除去でき製造工程の簡便化も達成できる。
Claims (9)
- ヒト血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分を疎水性担体により処理する血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分から活性化補体を除去する方法。
- 疎水性担体処理後さらに陰イオン交換体による処理を行う請求項１記載の方法。
- 血液凝固第ＸＩＩＩ因子含有画分がウイルス不活化のために加熱処理されたものである請求項１または２記載の方法。
- 活性化補体がアナフィラトキシンである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- アナフィラトキシンがＣ３ａである請求項４記載の方法。
- 活性化補体を実質的に含まないヒト血漿由来の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤。
- 活性化補体がアナフィラトキシンである請求項６記載の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤。
- アナフィラトキシンがＣ３ａである請求項７記載の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤。
- アナフィラトキシンの含量が血液凝固ＸＩＩＩ因子の単位数当たり５０ｎｇ以下である請求項８記載の血液凝固第ＸＩＩＩ因子製剤。
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