JP2509407B2 - 生物学的に活性な化合物の単離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、蛋白質、特に凝固因子VIIIの如き生物学的
化合物を、血漿の如き体液から第１の単離工程としてゲ
ル濾過を用いて単離する方法に関する。

背景技術 抗血友病因子Ａ又はAHFとして知られている因子VIII
は、血液凝固の本質的経過に関係する血漿蛋白質であ
る。

因子VIIIは、因子VIII凝固活性（因子VIII:C）および
リストセチン補因子活性（フォンウレブランド因子（vW
F））をそれぞれ有する２種の蛋白質の非共有複合体
（この複合体は分子量１〜20×10⁶Ｄを有する）の形態
で極めて低濃度で血漿中を循環する。

因子VIII:Cは、100,000人の内的５人が患っている、
出血疾患血友病Ａの個人において存在しないか、又は欠
陥がある。

ウオンウレブランド因子は、活性化血小板の凝集が増
大するような方法で活性化血小板に結合する。この効果
は、リストセチン誘発血小板の凝集により試験管内で検
知できる。ウオンウレブランド疾患と共に、出血時間の
延びは、ウオンウレブランド因子の欠乏又は生物学的活
性レベルの減少に起因するように思われる。

血友病Ａを患う血友病者およびウオンウレブランド疾
患の激しい症状を患う患者は、今日因子VIII:C/vWFを含
むコンセントレートで治療を受けており、その治療は患
者の寿命および経済的能力を相当に改善しており、そし
て患者の寿命の延命に寄与している。

因子VIII（因子VIII:Cおよび／又はvWF）を含有する
医薬製剤は、血液又は血漿から調製できる。このような
製剤の製造は、種々の公知方法で行うことができ、これ
らの全ての低収率の特に因子VIII:Cに特徴を有する。殆
ど全てに共通の方法は、寒冷沈降方法を含む初期の精製
工程である。寒冷沈降方法により、凍結血漿は０°〜４
℃の温度で解け、これは因子VIIIを含む沈殿物を生じさ
せ、該因子VIIIは例えば遠心分離により採取される。寒
冷沈降方法は比較的簡単であるが、本質的に欠点を有す
る。何故なら、大規模で、すなわち5kg以上の血漿のプ
ールを用いた場合、低収率の因子VIII:C（血漿濃度の30
〜45％）をもたらし、このことは最終収率が、下流精製
工程が用いられるにもかかわらず低いことを意味する。

更に、一般にウイルス不活化工程は、因子VIII製剤の
製造中に含まれている。ウィルス不活化工程は、ウィル
スに対し製剤の安全性を相当に増加させているが、しか
し、大抵の場合、更に因子VIII:Cの収率の減少をもたら
す。

因子VIIIの全体の低収率は、幾つかの場所でこれらの
製造の不足を導いている。従って、血友病の治療に対し
因子VIIIの要求に応えるため、高収率で因子VIIIを精製
する新しい方法が必要とされる。

血漿から高収率で直接因子VIIIを単離する新規な方法
は、非常に興味がある。と言うのは血漿中因子VIIIの濃
度の70％までが、寒冷沈降方法において又はその前にす
みやかに失われるからである。

近年、アフィニティクロマトグラフィーを用い血漿か
ら因子VIIIを直接単離することが試みられた（Thromb.H
aemosh.,61,（２）、234〜237（1989））。しかし、60
％未満の収率であり、更に単離された因子VIII含有分画
の1mg蛋白質当たり1IU因子VIIIの比活性が得られるのみ
であった。

ゲル濾過、又ゲル浸透クロマトグラフィー又はサイズ
排除クロマトグラフィーは、拡散制御プロセスであり、
このプロセスはそれらのサイズに応じて溶出液を分離す
るために用いられる。溶出液を、最大分子を排除する孔
径を有する不活性多孔質ゲル粒子で充てんされたカラム
を通すが、一方、より以上な分子はゲル粒子の内側の静
的相に拡散する。従って、ゲル粒子から完全に排除され
た最大の分子は、まず「空隙量」を有して溶出され、一
方より小さな分子は、カラムを通過するのにより長い時
間費しそして「溶出量」の増加に伴いサイズの減少に従
って溶出される。

ゲル濾過は、２種の異なる方法で行なわれる。

1.グループ分離モード グループ分離モードにおいて、溶質は分子径の大きな
相違を有する二つのグループに分離される。一つのグル
ープは、空隙量を伴って溶出され、他のグループはしば
しば全「ベッド（床）量」に近いより多量の溶出量を伴
って後に溶出される。この手順は、主に溶解している塩
から蛋白質を分離するため、又は緩衝液を交換するため
に主に用いられており、「脱塩」として呼ばれる。「脱
塩」に対し小孔径を有する硬いゲルが用いられ、プロセ
スは、多量の材料（ベッド量の20〜30％を構成するサン
プル量）を用いかつ高流速（１時間当たり緩衝液の約１
ベッド量）を用いて行なわれる。従って、カラムの容量
は大きいものとなろう。

2.分別モード 分別モードにおいて、近似分子量を有する溶質が分離
される；この手順は、しばしば蛋白質の分離に用いられ
る。この目的に対し、より大きな径のゲル粒子が用いら
れ、そしてゲル濾過媒質が、次の内容が確保されるよう
に選ばれる。すなわち、蛋白質が空隙量を全ベッド量に
相当する溶出量間で溶出される。物質は、グループ分離
条件を用いる場合よりもより接近して溶出され、更に重
なる可能性がある。更に高流速は、望まれない。と言う
のは、これは蛋白質の有効な分離を考慮しておらず、更
にカラム装入量は個々の蛋白質を合理的に分離するため
低く保たねばならないからである。従って、分別モード
で用いられるゲル濾過は、分別されるべき量が少ない最
後の仕上げ工程として蛋白質の分離に対してのみ堆賞さ
れてきている（ヤグシーズ、Ullmanns Encyclopedis of
Industrial Chemistry,vol B 3（10）、1988およびBio
/Technil.,4,954〜58（1986））。

ゲル濾過を用いて血漿から因子VIIIを単離する試みが
なされた（J.Lab.Clin.Mod.,72,（６）,1968,1007−100
8およびJ.Clin.Invest.,48,1969,957−962）。実験中、
優れた精製が見出されたが、収率はわずか約40〜50％で
あった。得られた因子VIII含有分画は、出発血漿に依存
していることが見出された。と言うのは、多量の脂質お
よびキロミクロンが、より低い比活性を有する濁った因
子VIII分画を生じさせるからである。以下の内容が注目
された。すなわち、用いたゲル濾過技術は、多量の血漿
の取扱いを許容しないと云うことである。しかし、予備
的実験では、はるかに多くの濃コーン（Cohn）分画のゲ
ル濾過は可能であるように思われる。

更に、ポールセン等（Thromb.Diathes.Haemorr.22,19
69,577〜583）は以下の内容を見出した。すなわち、因
子VIIIは、ゲル媒質セファロース6Bを用いて他の血漿か
ら分離されるであろうが、しかしゲル濾過を用いてクロ
マトグラフィーは、再溶解した凍結沈殿物を出発物質を
して用いる場合、大規模で可能であると思われた。

米国特許3,637,489は、ゲル濾過を用いかつ孔質ガラ
スビーズを用いる血液成分の分離方法を開示している。
該方法は、特に血清もしくは血漿中の他の成分から免疫
学的に活性な分質の分離を特に意図している。

因子VIIIを精製するためにゲル濾過を用いる幾つかの
試みがなされて以来、血漿の部分精製分画（再溶解した
凍結沈殿物および更にその精製分画）のゲル濾過に試み
が集中している。小装入量のカラムおよび／又は小流速
又はそれらの組合せを用いた全ての試みがなされた。

蛋白質分別方法としのてゲル濾過は、1959年以来公知
であり、蛋白質の特徴化方法又は小量のサンプルから蛋
白質の精製方法として生物化学的研究において広く用い
られている。血漿分画中の蛋白質分離に対し、ゲル濾過
は本発明までは大規模には行なわれていなかった。ただ
アルブミン溶液からエタノールと塩の脱塩に用いられて
いた。従って、参考文献には次のように記載されてい
る：「血漿分別においてゲル濾過が主要に技術になって
いない主な理由は、カラム容量当たり蛋白質の低スルー
プットである（J.H.ベルグローフ：「Fractionation b
y Gel Filtration」、163〜173頁、J.M.カーリング
（編）：「Methods of Plasme Prolein Fractionatio
n」アカテミックプレス、ロンドン、1980）および「不
幸にも、合理的に決められた大きさのカラムによって取
り扱うことのできる蛋白質量は少なく、かつサンプルの
希釈は無視できない。該方法は、従って、血漿分別には
多く用いられない」（J.J.モーゲンターラー等：「ヒト
血漿の単離中、構造と機能の保存」、127〜138頁、スミ
ットシビンガ等（編）：「Plasma Fractionation and B
ood Transfunction」、マーチナスニジョフ出版社、ボ
ストン、1985）。

米国特許4,675,385は、第１の工程において、血漿製
剤の緩衝水性組成物を調製し、次いで組成物を、約13ミ
クロン〜約35ミクロンの寸法を有する多孔質高速液体ク
ロマトグラフィービーズのクロマトカラムに導入し次い
で緩衝水性溶離液で溶出することによる連続的高速サイ
ズ排除クロマトグラフィーにより、因子VIII高分子量成
分および低分子量成分を有する血漿調製品から因子VIII
プロ凝固蛋白質の単離を開示している。良好な分離の得
るため、米国特許4,675,385は、容量を減少させるが低
分子量の血漿蛋白質から因子VIII成分の良好な分離を確
保しない40〜80よりもより少なくないアスペクト比を有
するカラムの使用を開示している。しかし、この第１の
単離は、第２のHPLCを行うことによってのみ得られる血
漿調製品の他の蛋白質成分から因子VIII:C活性を示す蛋
白質の良好な分離は確保しない。かくして、本発明ま
で、以下ように一般的に受け入れられていた。すなわ
ち、ゲル濾過はより多量、例えば5l以上を取扱う場合、
血漿分別において蛋白質の分離に対し適当な方法でな
い。

驚くべきことに以下の事実が見出された。すなわち、
高速が望まれているゲル濾過物質を選択する場合、通常
の最初の凍結沈殿方法に依存する必要なく極めて穏やか
な機械的分離により、血漿から極めて高収率でかつ純粋
な形態で因子VIIIを直接を単離することが可能となっ
た。

発明の簡単な説明 本発明は、ゲル濾過を用い血漿中の他の蛋白質から因
子VIII:CおよびvWF複合体の形態で因子VIIIを単離する
方法に関する。

本発明方法は、単離された血漿又は凍結血漿を新たに
解かしたものを高装入および高流速を用いたグループ分
離条件下でゲル濾過に委ねることを特徴とし、ゲル濾過
媒質は、因子VIIIに不活性でありかつ１×10³〜１×1
0⁸、より好ましくは１×10⁴〜８×10⁷の間隔の分別範囲
を有する粒子から構成されている。分別範囲は、例えば
５×10⁴〜４×10⁷の間隔内にある。

好ましい態様において、加えられる血漿の量は、ベッ
ド量の少なくとも５％である。加えられる血漿の量は、
好ましくはベッド床の15〜40％である。

本発明方法は、好ましくは１時間当たり、少なくとも
0.3ベッド量、最も好ましくは１時間当たり0.5〜２ベッ
ド量の流速を用いて行なわれる。

本発明の目的に対し、速やかな溶出を許容する硬さを
有するゲル濾過媒質を用いる。更に、ゲルは、ゲル濾過
中因子VIIIに対し化学的かつ免疫学的に不活性でなけれ
ばならない。実験によれば、本発明方法はセファロース
CL−4B、セファロースCL−6B、セファロース4FF、セフ
ァロース6FF、セファクリルＳ−400、セファクリルＳ−
500、フラクトゲルTSK HM−65（Ｆ）およびマトレック
スセルフィンCGL2000の如き商業的ゲルを用いて行うこ
とができ、これらは全て本発明の目的に対し適当であ
る。このようなゲルは、一般に約32μｍ〜約200μｍの
範囲の粒径（ウェット）を有する。

本発明方法の一つの態様によれば、凍結血漿は溶解さ
れ、そして全ての因子VIIIは溶解されており、しかる後
溶解血漿は好ましくは全ての因子VIIIが溶解した後直ち
にカラムに添加されることが確保される。温度は、好ま
しくは因子VIIIの広範な分解を避けるため高すぎないよ
うにする。血漿は、例えばヘパリン、シトレート、スク
ロース、アミノ酸、他の安定化剤を添加することにより
予備処理され、所望により濾過され、遠心分離され、限
外濾過により濃縮され、通常の沈殿剤を用いて予備沈殿
されるか又は他の所望の予備処理が血漿の因子VIIIの内
容物に著るしい影響を有しない限りカラウにそれを添加
する前に同等の方法で予備処理される。

驚くべきことに、本発明方法は、極めて高収率の因子
VIIIを与える。典型的には、血漿の因子VIIIの内容物の
70％超が生成物中に回収され、そして該方法は蛋白質1m
g当たり１〜約4IU因子VIII:Cの比活性を有する極めて純
粋な生成物をもたらす。このことは特に次の事実に起因
する。すなわち、本発明方法を用いることにより因子VI
IIは、単離過程において極めて初期に因子VIII:Cの分解
を通常引きおこす蛋白分解酵素からも分離される。

本発明方法は、高純度での因子VIIIを極めて高度に回
収するようにしたゲル濾過において高装入および高流速
を用いて血漿を適用する条件のもとの多量の血漿の処理
を可能とする。

ゲル濾過からの因子VIII含有分画又は更にゲル濾過し
て一緒にした分画は、次いで濃縮され、更に自体公知技
術、例えば限外濾過、沈殿イオン交換、アフィニィティ
クロマトグラフィー等を用いて精製される。

残りの血漿蛋白質、例えばアルブミン、イミノグロブ
リン、プロトロンビン複合体、アンチトロンビンIIIお
よび他のものは又は、自体公知の技術、例えば、アルコ
ールを用いる沈殿、PEG−沈殿、クロマトグラフィー等
を用いてゲル濾過の後の分画から単離できる。

因子VIII:C−活性の決定は、２工程分析又は１工程分
析を用いて行うことができる。１工程および２工程分析
でサンプル中の因子VIII:C活性が異なることは確立され
た事実である。更に、同サンプルに対し同分析を用いた
くりかえし測定は、因子:C活性の決定に変化をもたらす
ことも知られている。

本発明中、表現「血漿」は、全ての血球および血小板
が、例えば遠心分離により除去された血液を意味する。

「因子VIII:Ag」は抗原に対する因子VIIIを示し、更に
「VWF−Ag」は抗原に関するウオンウレブランド因子を
示す。「ベッド量」は、充てんゲル媒質および間隙液体
の量として定義される。「空隙量」はゲル粒子間の緩衝
液の量として定義され、更に「溶出量」は特定物質を溶
出させるために用いた緩衝液の量である。表現「カラム
装入量」はベッドに添加される量を示すために用いら
れ、ベッド量の％として計算される。表現「分画範囲」
は、ゲル物質が供給者により堆償されている（球状の）
蛋白質又はより大きな分子の分子量の範囲を決定するこ
とを意図する。

本発明方法を、以下に図面および本発明の態様を説明
する実施例を参照しつつ更に説明する。

実施例は、例示目的のためであり、本発明を何ら制限
するものではない。

図面の簡単な説明 本発明を添別の図面により更に説明する。

第１図は、種々の分析により測定される本発明に従っ
たゲル濾過による因子VIIIの溶出を示すグラフであり、
そして 第２図は本発明方法に従ったゲル濾過による種々の血
漿蛋白質の溶出の順位を示す。

実験部分 実施例１ 血漿から因子VIIIを単離するゲル濾過 直径2.6cmのカラムにセファロースCL−4Bを充てんし
最終高さ60cmとした。

デンマーク血液銀行からの凍結血漿を水浴上25℃まで
溶解した。1IUヘパリン/mlを添加後、血漿50ml（ベッド
量の16％）を流速100ml/hrでカラムに添加し、しかる
後、１時間当たり0.63ベッド量に相当する強制流速200m
l/hr緩衝液を用いてカラムを溶出させた。カラムの平衡
化および溶出は、緩衝液、0.02Mのシトレート、0.15Mの
NaCl、pH7.4を用いて行なわれた。更に緩衝液に、1ml当
たり0.1MのCaCl₂2.25mlを添加し、これは約７×10^-5Ｍ
の遊離カルシウムイオン（Ca²⁺）濃度を与える。

インゴルドGmbH（フランクフルト／マイン、FRG）製
造のカルシウム選択的電極を用いて遊離カルシウムイオ
ン濃度をチェックした。分画を集め、各分画に対し、OD
₂₈₀、因子VIII:C（１工程凝固分析および２工程金色分
析の双方を用いる）、因子VIII:Ag、アルブミン、IgG、
フィブリノーゲン、IgM、α−２−メルカプトグロブリ
ン、因子IX、因子Ｘ、蛋白質Ｃおよび抗トロンビンIII
を測定した。OD₂₈₀により測定した蛋白質は、空隙量で
小さなピークをもって溶出され（分画10〜18）、次いで
極めて大きな幅広いピークをもって溶出された（分画19
〜50、第１図参照）。２工程分析により測定される如く
82％の因子VIII:Cおよび１工程凝固分析により測定され
る如く91％の因子VIII:C活性は、空隙量（因子VIII−主
分画）の集合ピークおよび最も早い小さな蛋白質ピーク
で溶出された。因子VIIIの残りは直ちに小量の連続ピー
ク−テールで溶出された。因子VIII:AgおよびvWF:Ag
は、因子VIII:Cと共に溶出されたが幾分幅広い連続ピー
ク−テールを有していた。決定された全ての他の血漿蛋
白質は、因子VIII−主分画後、大きな幅広い蛋白質ピー
ク（図２参照）と共に溶出された。因子VIII:Cから分離
される血漿蛋白質は、その分子量を有していた。

アンチトロンビンIII: 65,000D 蛋白質C: 62,000D 因子X: 59,000D 因子IX: 57,000D α−２−マクログロブリン： 718,000D IgM: 900,000D フィブリノーゲン 340,000D IgG: 150,000D アルブミン： 67,000D ２工程クロマトグラフィー分析を用いる因子VIII:C−
活性の決定は、発色基質法（KABIコーテスト因子VIII）
を用いて行なわれ、37℃で試験管を用いるもとの方法
は、試剤を減少量でミクロタイタープレートを用いて行
うために修正された。後にリン脂質、因子IXa、因子Ｘ
およびCaCl₂の溶液75μｌと混合する、50μｌのサンプ
ル又は標準物を37℃で15分間インキュベートし、しかる
後50μｌの基質を添加する。更に20分後、37℃でインキ
ュベーションし、50μｌの1Mクエン酸を添加して反応物
を急冷する。発色を405nmで読みとるが、対照は492nmで
ある。

１工程分析を用い因子VIII:C活性の決定は、APTT−法
（活性化部分トロンビンプラスチンタイム）を用いて行
なう。100μｌのサンプル又は標準をピペットで採集し
てキュベットに入れ、しかる後100μｌの欠乏血漿（因
子VIII欠乏血漿、ジュネラルダイアゴノスチック）を添
加し、溶液を37℃で５分間一定温度に調節する。100ミ
クロタイターの0.03MCaCl₂を添加後、溶液の凝固までの
時間を決定する。

４個の定量的測定に対し、WHO標準（FVIIIの第３回国
際標準、ヒト血漿、3.9IU/ml）に対して較正された国際
標準に基づく較正曲線を作成する。本発明で記載する如
く２工程分析は、１工程分析よりもより小さい（約10
倍）の検出限界を有している。ヘパリンを添加する場
合、２工程分析を用いることは有利であり、分析に対す
るヘパリンの何らの影響は、希釈によりより容易に除去
されるであろう。

ミクロタイタープレート（ヌンク、カムストラップ、
4000ロスキルデ、デンマーク）へのコーティング材料と
して因子VIIIインヒビター患者からの抗体を用い更に結
合因子VIII（Thromb.Haemost.,53（３）、1985、346〜3
50）を測定するため同一インヒビター患者からのペルオ
キダーゼ、ラベル化Ｆ（AB′）₂フラグメントを用い、E
LISAを用いて測定した。WHO標準（第１図）IRP,1982年
確立）に対して較正されたプールした標準血漿を用い、
標準曲線を作成した。

vWF:Agも又、ELISAを用いて測定したが、しかし、コ
ーティング材料として家兎抗−ヒトvWF（ダコ、デンマ
ーク）を用い更に結合vWFを測定するためペルオキシダ
ーゼラベル化家兎抗ヒトvWF（デコ、デンマーク）を用
いた。因子VIII:Ag ELISAに関し、同ヒト血漿を用い標
準曲線を作成した。

因子IXを、因子VIII:Cと同様の方法で１工程凝固分析
を用いて測定したが、但し、因子IX欠乏血漿を用いた。
IgGを、放射免疫拡散（免疫化学、2,1965,235〜254）を
用いて測定し、次いでアルブミン、フィブリノーゲン、
α−２−マクログロブリン、因子Ｘ、蛋白質Ｃおよび抗
トロンビンを、ロケット免疫電気泳動（Anal.Biochem.1
5,1966,45〜52）を測定した。OD₂₈₀、を分光光度計（ミ
ルトロロイカンパニー製のSpectronic601）を用いて測
定し、次いでケルダールを用いた蛋白質を、TCAによる
沈殿なしでph.Eur.第２版、I,V.3.5.2に従い測定した。
精製分画の比活性を、OD₂₈₀に対するか又はケールダー
ルを用いて測地した如く蛋白質の濃度に対する因子VII
I:C濃度の割合として計算した。比活性の計算に対しOD
₂₈₀を用いる場合、もしも同じ出発血漿を用いないなら
得られた結果は直接比較できない。何故なら因子VIIIを
含有する分画がしばしば濁っているからである（J.Cli
n.Invest.48,1969,957−962）。

実験で用いられる種々のゲル濾過媒質は、次の会社か
らのものである： セファロースCL−6B、セファロースCL−4B、セファロ
ースCL−2B、セファロース6FF、セファロース4FF、セフ
ァククルＳ−400、およびセフアクリルＳ−500は、全て
ファルマシア（ヒルラルド、デンマーク）製造のもので
あり、バイオゲルＡ−5m、ファインはバイオラッド（バ
イアンドバルンセン、ルードレ、デンマーク国）製造の
ものであり、フラクトゲルTSK HW−65（Ｆ）は、マー
ク（ストルーエル、ルドレ、デンマーク国）製造のもの
であり、更にマトレックスセルファインGCL2000は、ア
ミコン（ヘルシンキ、スフェーデン）製造のものであ
る。

例２ 種々のゲル濾過媒質を用い因子VIIIを分解するための
血漿のゲル濾過 直径2.6cmのカラムを、異なる分画範囲および異なる
構造を有する種々のゲル濾過媒質を用いて充てんした。
全ての場合に、充てん床の最終高さは60cmであった。例
１における如く血漿を解かし次いで1ml当たり1IUのヘパ
リンを添加した。ゲル濾過媒質の各々に対し、50mlの血
漿を装入した（床容量の16％）。カラムの装入および緩
衝液による溶出は、例１に記載する如く行った。流速は
バイオゲルＡ−5mを用いての実験を除き、全ての場合例
１におけると同様であったが、そのバイオゲルＡ−5mを
用いる場合、流速は増加した床出力のため5ml/時に減少
した。分画を集め、次いでコーテストを用い、各分画に
対しOD₂₈₀および因子VIII:Cを測定した。因子VIII−主
分画の比活性を、OD₂₈₀に対する因子VIII:C/mlの割合と
して計算した。実験は、各装入に対し異なる血漿を用い
ｎ回くりかえし、収率および比活性の平均値を計算し
た。因子−主分画を例１に記載の如く選択し、次いで収
率を、因子VIII−主分画中の因子VIII:Cの含量として添
加された血漿の因子VIII:Cの含量の％として報告する。

種々の媒質および較正平均値に対する分画範囲および
粒径を以下の表Ｉに示す。

例３ 種々のカラム装入を用い因子VIIIを分離するための血
漿のゲル濾過 直径2.6cmのカラムに、セファロース4FFを充てんし最
終高さ60cmとした。例１における如く血漿を解かした。
解けた後、血漿のpHを、0.5MHClを用いて7.0に調節し、
1ml当たり1IUヘパリンを添加し、次いで血漿を10μｍの
ナイロンフィルターを用いて濾過した。カラムに、それ
ぞれ30ml、40ml、50ml、60ml、および70mlの血漿を添加
した。添加、流れおよび緩衝液を用いた溶出を例１に記
載の如く行ったが、緩衝液をpH7.0に調節した。分画を
集め、次いで各分画に対し、コーテストを用いOD₂₈₀お
よび因子VIII:Cを測定した。各装入に対し、３種の異な
る血漿を用い実験を３回くり返し、次いで平均値（ｘ）
を計算した。因子VIII主分画（ml）の量は、因子VIII含
有分画の量であり、この因子VIIIは大きな巾広い蛋白質
ピーク（OD₂₈₀）に溶出されそして例１で記載の如く選
択される前に集めることができる。収率は、因子VIII主
分画中の因子VIII:Cの含量として、添加された血漿の因
子VIII:Cの含量の％として報告される。

計算した数値を表２に示す。

例４ 種々の溶出速度を用い因子VIIIを単離するための血漿
のゲル濾過 例３で用いたカラムと同じカラムに前記の如く解かさ
れる50mlの血漿を添加した。解けた後、血漿のpHを、0.
5MHClを用いて7.0に調節し、1IUヘパリン/mlを添加し、
次いで血漿を10μｍのナイロンフィルターを通して濾過
した。３種の異なる血漿流速100,200および300ml/時を
それぞれ用いた。同じ流速を血漿の添加中およびその後
の溶出中に用いた。分画を集め、各分画に対しコーテス
トを用いOD₂₈₀および因子VIII:Cを測定した。因子VIII
主分画における比活性および収率を例３における如く計
算した。因子VIII主分画の量の平均値（ｘ）、収率およ
び比活性を計算した。結果を以下の表３に示す。

例５ 種々のカラム装入を用い因子VIIIを単離するための血
漿のゲル濾過 直径10cmのカラムにセファロース4FFを充てんし最終
高さ60cmとした。デンマーク国の血液銀行からの凍結血
漿を30℃の水溶で解かした。925g、1497gおよび2000gを
それぞれカラムに添加した。毎時約0.89床容量に相当す
るマスターフレックスホースポンプ（ブッケアンドホー
ム、ヘルレブ、デンマーク国）を用い、血漿の添加およ
び溶出中流速を約4200ml/時に保持した。溶出に対し、
例１に記載の如き同じ緩衝液を用いた。ファルマシアモ
ニターUV−１を用いOD₂₈₀を連続的に監視した。OD₂₈₀が
空隙容量で増大し始める時、因子VIII主分画の採取を開
始し、次いでOD₂₈₀が大きい蛋白質ピークが溶離した時
採取を終了した。VIII主分画において、１工程の凝固分
析を用い、因子VIII:C含量を測定し、次いでケルダール
を用い蛋白質を測定した。比活性を、因子VIII−主分画
巾蛋白質のmgの合計数に対する因子VIII−主分画におけ
る因子VIII:C単位の合計数の割合として計算した。因子
VIII:Cの収率を、添加した血漿巾の因子VIII:Cの含量％
における因子主分画における因子VIII:Cの含量として計
算した。

結果を表IVに示す。

例６ 工業的大きさのカラムを用い因子VIIIを単離するため
の血漿のゲル濾過： 直径29cmのカラムでセファロース4FFで充てんした。
例１で記載したと同様の緩衝液を用いて平衡化した後、
ゲル高さは53cmであったデンマーク国血液銀行からの凍
結血漿を10kgを解かし、30℃に加熱し、しかる後カラム
にこれを添加した。マスターフレックスホースポンプを
用い、毎時0.86床量に相当する１時間当たり30lの流速
を、平衡化緩衝液を用い添加中および溶出中保持した。
OD₂₈₀を、ファレマシアモニターUV−１を用い連続的に
監視した。空隙容量でOD₂₈₀中、最初の上昇があらわれ
た時、因子VIII主分画を集めた。次いで、１工程凝固を
用い、因子VIII:Cの含量を測定し、次いで蛋白質をケル
ダーールを用いて測定した。合計で8798IU因子VIII:Cお
よび2346g未満の蛋白質が、因子VIII主分画内に見出さ
れ、1mgの蛋白質当たり3.75IU以上の比活性を有する生
成物の形態で88％の収率に相当する880IU/kg血漿の因子
VIII:Cの収率を与えた。

本発明方法に従って得られる因子VIII主分画は、例え
ば更にクロマトグラフィー精製および通常の賦形剤を用
いた凍結乾燥を用いて含んでなる再溶解凍結沈殿物の通
常の精製法に準じた方法で更に精製して安定な製剤を形
成することができる。製剤は、好都な通常のビヒクルを
用い使用前に再構成される。

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ゲル濾過媒質を用い血漿中の他の蛋白質か
   ら因子VIIIを分離する方法であって、予備処理されてい
   ない単離血漿もしくは凍結血漿を新たに解かした血漿を
   ゲル濾過に直接委ね、主として因子VIIIを含む第一分画
   とその他のタンパク質を含む第二分画とを分離し、ここ
   において、添加される血漿の容量が床量の少なくとも1
   2.6％であり、更に流速が毎時少なくとも0.3床量であ
   り、ゲル濾過媒質が因子VIIIに対し不活性でありかつ、
   １×10³〜１×10⁸の間隔の分画範囲内を有する粒径から
   構成され、次いで主として因子VIIIを含む分画を採取す
   る、前記方法。
2. 【請求項２】ゲル濾過媒質が、１×10⁴〜８×10⁷の間隔
   の分画範囲を有するゲル物質から構成される、請求の範
   囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】ゲル濾過媒質が、５×10⁴〜４×10⁷の間隔
   の分画範囲を有するゲル物質から構成される、請求の範
   囲第２項記載の方法。
4. 【請求項４】添加される血漿の量が、床量の15〜40％で
   ある、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】流速が、毎時0.5〜２床量である、請求の
   範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】得られた因子VIIIを、例えば更にクロマト
   グラフィー精製および通常の賦形剤を用いた凍結乾燥を
   用いて含んでなる再溶解凍結沈殿物の限外濾過、沈殿、
   イオン交換又はアフィニティクロマトグラフィー方法で
   更に精製して安定な製剤を形成する請求の範囲第１〜５
   項のいずれかに記載の方法。