JP4375813B2 - 高度に精製された第ｖｉｉｉ因子コンプレックス - Google Patents

Description

本発明は、成分第VIII因子（第VIII因子：CまたはFVIII）およびフォンウィルブラントファクター（von Willbrand factor）（ｖWF）からなる高度に精製された（高度精製）コンプレックス、該高度精製コンプレックスを含む安定な医薬調製物、および高度精製第VIII因子：C／ｖWF−コンプレックスの製造方法に関する。
フォンウィルブラントファクターは第１２染色体上の遺伝子によってコードされる、遊離で、そして第１０染色体上の遺伝子によりコードされ、血友病Aでそれぞれ欠陥があるかまたは欠損している第VIII凝固因子との非共有結合コンプレックスとして、濃度５〜１０μｇ／ｍLで血漿中を循環している多重結合糖タンパク質である。
ヘモスタシス（haemostasis）におけるｖWFの最も重要な２つの機能として、
１）受傷した内皮への血小板の付着、およびｖWFが受傷した内皮下（sub-endotehrium）に結合し、この表面と血小板間の架橋ならびに血小板相互の凝集を可能にすることがある。血小板と内皮下間の最初の相互作用は血小板膜の糖タンパク質Ｉｂおよび受傷した内皮のコラーゲン繊維により生じる。ｖＷＦはこれら２つのタンパク質と結合することにより、血小板の第一層の形成に関与する。さらに、血小板相互の架橋には、ｖＷＦと糖タンパク質コンプレックスIIb/IIIaとの結合が関与する。初期ヘモスタシスのこれら役割は主に大重合体が担っている（Eller,Lab.Med.(1994);18:168-176）。
２）FVIIIに対する結合部位により、ｖWFは血漿凝固にも影響する。FVIIIは血漿中にほどんとｖWFとの非共有結合コンプレックスとして存在し、ほぼｖWF１０分子につきFVIII分子を保持している。主としてダイマーおよび小重合体が担体として用いられる。このｖWFとの結合により、FVIIIはタンパク質分解性の不活化の増大に対して保護される（例えば、活性化プロテインCにより）。
さらに、FVIIIは固有の凝固においてその補助因子活性がコンプレックス形成により強化される（Eller,Lab.Med.(1994),18:168-176）。
ｖWFは、本質的または刺激された遊離によりこの血漿タンパク質の主な供給源である血管内皮細胞中で形成されるが、巨核球もそれより少ないが合成する（PNAS 92(1995),2428-2432）。
最初の翻訳産物は２８１３アミノ酸を含む。シグナルペプチド（２２アミノ酸）を分離した後、ダイマー化が生じる。さらなるプロセッシングはゴルジ装置中で生じ、プロペプチド（７４１アミノ酸）の分離下でダイマーが重合する。プロペプチドは、該アミノ末端におけるジスルフィド架橋の形成を触媒することによりダイマーのさらなる連結に重要な役割を果たす。このようにして、５０００００ダルトンのダイマーから２０００万ダルトンまでの大重合体の範囲の種々のサイズのオリゴマーが生じる。タンパク質分解手順に加えて、ｖWFはグリコシル化および硫酸塩化を含む他の翻訳後修飾を受ける（Mancusoら、Haemostaseologie(1989);9:122-129）。
このように、生合成の複雑さにより、種々の異なる役割と特徴を有する種々の異なるｖWF分子が多数存在する。
その結果、フォンウィルブラントファクターは天然の結合パートナーとはまったく異なる結合活性を有するかも知れない。特に、種々のｖWF分子の、糖タンパク質Ｉｂ、コラーゲン、ヘパリン、糖タンパク質IIb/IIIa−コンプレックス、第VIII因子、および内皮下との結合強度は異なるかもしれない。
しかしながら、これは、各ｖWF調製物がそれぞれこれら種々のｖWFタンパク質またはｖWF凝集物の混合物を含むため、第VIII因子に対するその本質的な結合強度といったその特性が不均一であることを意味する。
種々の型のｖWFの発生は、フォンウィルブラント病の病態生理における複雑で種々の表現型の原因にもなっており、これは、ある場合にはフォンウィルブラントファクターの低産生により、または別の場合には過剰産生による。このように、例えば、ｖWFの過剰産生は血栓症傾向の増大をもたらし、ｖWFの低供給は出血傾向の増大または出血時間の増大をもたらすが、これが決定的であるには、フォンウィルブラントファクターの過剰または低産生が常に生じるわけではない。
ｖWFおよびｖWF症候群の特性を区別し、特徴付けるには、多くの分析法を用いる。
すなわち、診断目的にはリストセチン補助因子活性測定法が必須である。そのためには、抗生物質リストセチンの存在下における血小板凝集が、ｖWF症候群患者で低下しているかまたはまったくみられないかをアッセイする（Macfarlaneら、Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica 1775;34:306-308）。
さらに、ｖWFのコラーゲン結合活性はｖWF症候群を区別するのに用いることができる（Thomasら、Haemastaseologie(1994),14:133-139）。
ｖWFとFVIII間の結合解離定数はVlotら（Blood 83(11)(1995);3150-3157）の方法に従って決定することができる。
ｖWFの分子構造は、１．２％アガロースゲル中のSDS電気泳動により多量体構造を分析することにより決定される（Ruggeriら、Blood(1981),57:1140-1143）。
ｖWF抗原の総量を測定するには、種々の市販のＥＬＩＳＡ試験キットを用いる。
最適FVIII/ｖWFコンプレックスの調製は、あらゆる不要なタンパク質の存在による望ましくない副作用の危険性があるため、まず、望ましくない付随タンパク質がない安定な生成物を得ることを目指すべきである。
すなわち、FVIIIを安定化するのに必要でない濃度のｖWFは、血友病患者の負担となる。
特に血漿プールからフォンウィルブラント調製物を製造するのに用いる方法の過程において、従来、種々の型のフォンウィルブラントファクターが存在することによる不均一な組成物の危険性を排除することは可能ではなく、先行技術文献において、例えば、あるリガンドへの結合活性に関して一様な特性を有するｖWF調製物を得ることは今まで可能ではなかった。
血漿や寒冷沈降物から種々の抗ｖWFモノクローナル抗体により第VIIIコンプレックスを精製することが知られている（Thromb.Haemostas.57(1987),102-105）。そのためには、ｐH６．５の種々の緩衝液におけるFVIII／ｖWFコンプレックスの安定性も試験した（その中にはグリコール、アミノ酸、カオトロピック物質、アミン、他の塩または有機溶媒および／または界面活性剤を含む緩衝液を含む）。例えば,３M尿素のような高濃度のカオトロピック物質を含む緩衝溶液にリシンを添加することにより、第VIII因子：C／ｖWF：Agは変性作用から保護される。２０％v/vエチレングリコール＋１M KJとインキュベーションした後の第VIII因子：CおよびｖWF R.cor.の活性は、例えば、それぞれ７２％および４８％に達し、３M尿素処理後にそれぞれ８８％および７７％に達した。
１M KJ＋１Mリシン＋２０ｍMイミダゾール＋５ｍM CaCl₂（ｐH６．５）で溶出した最終産物中の第VIII因子：Cの特異活性は４５I.U.／ｍｇ総タンパク質であり、ｖWFのそれは６０I.U.／ｍｇであった。
Al(OH)₃で吸着し、抗ｖWFモノクローナル抗体を用いてウイルス不活化法を実施した後の、寒冷沈降物から第VIII因子／ｖWF−コンプレックスのクロマトグラフィーによる精製も報告されている（Biotechnol.Blood Prot.227(1993),109-114）。吸着したコンプレックスの溶出はｐH6.5でカオトロピック物質KJ（１M）を加えることにより行なう。第VIII因子：C／ｖWF:AG比は０．８であり、第VIII因子：Cの比活性は３８I.U.／ｍｇであった。
最後に、ｖＷＦに対する特異ペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより不均一な生物学的液状物から第VIII因子コンプレックスを精製することがEP-0295645-A2に記載されている。そのために、該コンプレックスをｐH勾配または高イオン強度の緩衝液を用いて溶出した（EP-0295645-A2の実施例５参照）。
EP0416983 A1には、陰イオン交換クロマトグラフィーによって調整する第VIII因子／ｖWF−コンプレックスを含む調製物が記載されている。WO86／01718 A1によれば、第VIII因子／ｖWF−コンプレックス調製物はモノクローナル抗体によるクロマトグラフィーで得られる。
先行技術文献のこれらすべての第VIII因子／ｖWF−コンプレックスに共通しているのは、製剤が高度に豊富化され、精製されているにも関わらずｖWFの第VIII因子：Cに対する結合が均質である製剤を提供することができず、比活性の高い天然の第VIII因子／ｖWF−複合体が存在しなかったことである。
このように、本発明は、それぞれ、第VIII因子に対するｖWFの結合特性に関して一様な構造を有し、特に十分に耐えるかまたは安定な第VIII因子／ｖWF−コンプレックスを含む第VIII因子／ｖWF−調製物を提供することを目的とする。
本発明によれば、この目的は、それぞれ第VIII：CとｖWのコンプレックス、およびコンプレックス化していない（非コンプレックス化）第VIII因子：CおよびｖWFを分別的に溶出するアフィニティークロマトグラフィーにより第VIII因子：CとｖWFを含む出発物質を精製することにより得られる、比活性が少なくとも７０、好ましくは１００〜３００U第VIII因子：C／ｍｇのフォンウィルブラントファクターおよび第VIII因子を成分に含む高度に精製されたコンプレックスを含む調製物により達成される。非コンプレックス化、すなわち、それぞれ過剰な第VIII因子：Cおよびフォンウィルブラントファクターは、特に、コンプレックス化および非コンプレックス化ファクターが別の分画に得られる分別的に溶出によるイムノアフィニティークロマトグラフィーにより分離される。
それぞれ非コンプレックス化第VIII因子：Cおよびフォンウィルブラントファクターの革新的分離工程により、特に第VIII因子に対する親和性に欠陥を有するフォンウィルブラントファクターが意図的に分離され、最初に、第VIII因子に対する親和性が明確なｖWFの分画を含む、均質な天然の第VIII因子／ｖWF−コンプレックスを得る。
驚くべきことに、本発明のコンプレックスは、イムノアフィニティークロマトグラフィー時のカオトロピック環境中で安定である。伝導度が３０ｍSまでの、好ましくは４０ｍSまでの媒質中においても該コンプレックスの解離はみられなかった。このように、抗ｖWFカラムからの第VIII因子およびｖWFの安定なコンプレックスは等張溶液の２〜３倍の比較的高いイオン強度でも溶出し、回収することができる。
本発明のコンプレックスにおいて、好ましくはｖWFはｖWF抗原に基づいて０．２〜０．６の範囲のコラーゲン結合活性を有する（血漿単位／血漿単位）。
好ましくは、本発明のコンプレックスは、２つの成分、コンプレックスならびに別々の第VIII因子：CまたはｖWFを含む出発物質を精製し、イムノアフィニティー担体から分画で溶出することにより得られる。
イムノアフィニティークロマトグラフィーはストリンジェント条件下でも第VIII因子またはｖWFに対する親和性または親和力（avidity）を保持する抗体を用いて実施され、このような条件下でも得られた第VIII因子／ｖＷＦ−コンプレックスは安定であることが好ましいため、溶離剤には、比較的高濃度のカオトロピック物質またはカオトロピックに活性な塩も含まれよう。
抗体は、例えば、１M NaSCNまたは０．５M塩酸グアニジンでも、または１００％飽和硫酸アンモニウムでも結合特性に有害な影響を与えずに抗原と結合するものが選ばれる。それぞれ１．５M NaSCNまたは０．７５M塩酸グアニジン、８０％エチレングリコールまたは０．７５M尿素でもまだ５０％の抗原が結合している。好ましくは、イムノアフィニティークロマトグラフィーに用いる抗体は、結合試験において、多くとも３０ｎｇ／ｍL、好ましくは多くとも１５ｎｇ／ｍＬの希釈溶液からでも固定化抗原と結合する強力な抗体である（抗体／抗原比１：５〜１：２０に相当する）。
特に、含まれるｖＷＦの第VIII因子との結合特性の点から均質であるいう本発明のコンプレックスのすばらしい特性により、該コンプレックスは第VIII因子および／またはｖWFを投与するための医薬調製物を製造するのに特に適している。本発明のコンプレックスは血漿より少なくとも５０００倍、好ましくは７１００倍〜２１４００倍豊富化された濃霧度で含むことができることが示されている。このように、本発明のある態様は、それぞれ非コンプレックス化ｖWFおよび第VIII因子：Cを実質的に含まない、高いコンプレックス結合強度を有する、血漿より少なくとも５０００倍、好ましくは７１００倍〜２１４００倍豊富化された濃度の高度に精製された本発明のコンプレックスを含む安定な医薬調製物である。このようにして、過剰なｖWFや他のタンパク質が患者に負担を与えることなく、第VIII因子／ｖWF−コンプレックスの生物活性が確実に維持される。本発明の調製物はすばらしい生物学的容認性をも特徴とする。
それぞれ非コンプレックス化ｖWFおよび／または第VIII因子：Cがない（を含まない）とは、総タンパク質含有量に基づいて遊離ｖWFまたは第VIII因子：Cが医薬調製物中に５％以下、好ましくは１％以下しかみいだせないことをいう。それぞれ非コンプレックス化ｖWF:Aｇまたは第VIII因子：Cをそれぞれ検出することができない調製物が特に好ましい。
それぞれ非コンプレックス化ｖWFまたは第VIII因子の検出は、それぞれ一定量の遊離ｖWFまたは第VIII因子をロードするイムノアフィニティー物質上で本発明のコンプレックスを再度クロマトグラフィーにかけ、該コンプレックスを前記の方法のごとく再吸着させ、溶出する。再クロマトグラフィー後に得られた物質は、出発物質と同比の第VIII因子：CとｖWF:Agを含み、いかなる相対的損失もみられない。非コンプレックス−結合第VIII因子およびｖWFを検出するためのさらなる試験は、該コンプレックスの固定化第VIII因子：C抗体またはｖWF抗体との結合であり、吸着後にそれぞれ非結合ｖWFまたは第VIII因子：Cの実質的な部分が検出されないことである（すなわち、５％以下）。
本発明の医薬調製物はその作用範囲に関して高い信頼性があるのを特徴とし、既知の第VIII因子：C／ｖWF−コンプレックス調製物に比べて、それぞれ、遊離第VIII因子：Cや容易に解離する第VIII因子：Cの部分が小さいため、第VIII因子の分解または活性化の危険性は著しく低下している。
本発明のコンプレックスを含む医薬調製物は、第VIII因子／ｖWF調製物に用いる適切な医薬的活性成分、緩衝液、補助物質、または添加物を含んでよいことはもちろんである。第VIII因子／ｖWF−コンプレックスの優れた安定性により、後者は、アルブミン、糖、特にトレハロースまたはショ糖といった普通の安定化剤をさらに用いることなく安定な医薬調製物に加工することができよう。
ｐHが中性の溶液においても、本発明の医薬調製物は液体低温凍結調製物の液体調製物として提供するのに十分安定である。各凍結乾燥調製物の再構成においては、該コンプレックスの組成物がほとんど変化していないことも示すことができる。
該調製物中のそれぞれ投与すべき用量または濃度は、先行技術文献記載の第VIII因子／ｖWF調製物の投与方法に基づき当業者が容易に決定することもできる。
第VIII因子および／またはｖWFは、該コンプレックス中に第VIII因子のｖWFに対する高い結合親和性が保持されている限りにおいて、天然のタンパク質またはその誘導体、例えば、欠失、置換または挿入により突然変異したタンパク質もしくは化学誘導体もしくは断片として本発明の調製物中に含まれていてよい。
本発明の対象物は、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより第VIII因子：CおよびｖWFを含む出発物質を精製し、第VIII因子：CとｖWFのコンプレックス、および非コンプレックス化第VIII因子およびｖWFをそれぞれ分別的に溶出することを含む本発明のコンプレックスを製造することができる方法でもある。該コンプレックスから非コンプレックス化ファクターを意図的に分別溶出することにより、初めて特異結合強度が均一なフォンウィルブラントファクター調製物または第VIII因子／ｖWF−コンプレックスを得ることが可能となった。
好ましくは、ｖWFに対する抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィーに用いる。この方法では、本質的に種々のｖWF分子またはｖWF単位を分別することを目的とする精製方法を、種々の天然のフォンウィルブラント分子にも十分用いることができる。
本発明の方法と詳細な態様では、モノクローナル抗体を抗体として用いる。均一性に関して、モノクローナル抗体はポリクローナル抗血清より好ましい。
アフィニティークロマトグラフィーにおける革新的コンプレックスの好ましい溶出緩衝液は、チオシアネートおよび／またはアンモニウム塩を、好ましくは２Ｍを超えない濃度で、最も好ましくは０．０５Ｍから１．５Ｍの範囲で含む緩衝液である。この第一溶出緩衝液は、好ましくはエチレングリコール、グリセロール、またはポリアルキレングリコールを含んでいてよい。
非コンプレックス化第VIII因子：CまたはｖWFはそれぞれ好ましくは、カオトロピック物質、特にチオシアネート、および／またはアンモニウム塩、および／またはアルカリ塩および／またはエチレングリコール、グリセロールまたはポリアルキレングリコールを含む緩衝液で溶出され、均質な調製物としても回収される。そのために、該緩衝液は第一溶出緩衝液より増加した濃度または伝導度、特にそれぞれ２０％以上、好ましくは５０％〜１００％高い濃度または伝導度を有する。
すなわち、本発明のさらなる対象物は、第VIII因子：Cに比べて結合能またはコンプレックス化能が低下し、本発明の方法によって回収することができるフォンウィルブラント調製物にある。
高度精製コンプレックスおよび革新的非コンプレックス化第VIII因子：CまたはｖWF調製物はそれぞれ、所望により、さらなるクロマトグラフィー工程、好ましくはイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、特に固定化ヘパリンによるアフィニティークロマトグラフィー、または金属イオンキレートクロマトグラフィーによりさらに精製し、既知の適切な方法で医薬調製物および診断用調製物に加工することができよう。
原則として医薬調製物を製造するには、ウイルスを不活化または除去する方法、好ましくは加熱処理および／または物理的または化学的処理を提供する必要がある。適切な方法はEP-0159311、EP0519901、およびWO94/13329に記載されている。本発明のコンプレックスは安定性が高いので、好ましくはこのウイルス不活化方法は高度に精製されたコンプレックスに対して行われる。
本発明の方法の好ましい態様によれば、出発物質は、血漿、例えば寒冷沈降物またはアルコール沈殿物のような血漿分画、細胞培養上清、および医薬調製物からなる群から選ばれる。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、以下の実施例は限定ではない。
実施例１：（現時点で出願人が考える最良の本発明の実施形態）
寒冷沈降物５００gを、３０℃で溶解緩衝液により１＋４に溶解する。次いで、０．４５μmフィルター（例えば、Millipore Durapore）に通して溶液を透明にする。０．５L抗vWFゲル（IMMUNOTECH,フランス）を詰めたカラムをカラム体積（CV）の約１０倍量の平衡緩衝液により調製し、透明にした寒冷沈降物溶液を０．５cm／分でカラムに通す。その後、害となる不純物質を５〜１０CVの平衡緩衝液（流速１cm／分）（場合により、>２５０ｍMの、NaCl濃度を増加させた緩衝液でもよい）で洗い流す。次いで、第VIII因子／vWF−コンプレックスが溶出緩衝液１により約１：１の割合で溶出される。溶出緩衝液２による溶出により、第VIII因子をほぼ完全に含まないvWFが得られる。２回目の溶出段階は同時にカラムの洗浄にもなり、その後の迅速な平衡化を可能にする。

実施例２：
新鮮な凍結血漿１LをT>25℃で解凍した後、平衡緩衝液で１＋２に希釈する。０．４５μmフィルターに通して溶液を透明にする。５０ｍL抗vWFゲル（IMMUNOTECH）を詰めたカラムを約５CVの平衡緩衝液により調製した後、透明にした血漿溶液を１cm／分の流速で通す。望ましくない不純物質を１０〜２０CVの平衡緩衝液＋２５０mM NaClで洗い流す。第１の溶出により、第VIII因子／vWF−コンプレックス；第２の溶出により、第VIII因子活性を含まないvWFが得られる。次いで、迅速にカラムを再び平衡化できる。

Claims (6)

1. イムノアフィニティークロマトグラフィーによる第ＶＩＩＩ因子：Ｃおよびフォンウィルブランドファクター（ｖＷＦ）を含む出発物質の精製方法であって、
   出発物質をｖＷＦに対する抗体（ここで、該抗体はｖＷＦと抗体／抗原比１：５〜１：２０で結合することができる強力な抗体である）であるイムノアフィニティークロマトグラフィー物質と接触させ、
   平衡緩衝液で洗浄して不純物質を除去し、
   第ＶＩＩＩ因子／ｖＷＦコンプレックスを、チオシアネートおよび／またはアンモニウム塩を、０．３Ｍ〜１．５Ｍの濃度で含む溶出用緩衝液（ここで、該溶出用緩衝液の伝導度は４０ｍＳ以下である）で溶出することにより高度精製第ＶＩＩＩ因子／ｖＷＦコンプレックスを得、
   さらに、非コンプレックス化ｖＷＦを、先の溶出用緩衝液に比べてそれぞれ濃度と伝導度が５０％〜１００％増加したさらなる溶出用緩衝液を用いて溶出する（ここで、溶出される該ｖＷＦは高度精製ｖＷＦとして得られる）ことを特徴とする方法。
2. モノクローナル抗体を抗体として用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 高度精製コンプレックスがエチレングリコール、グリセロール、またはポリアルキレングリコールをさらに含む溶出用緩衝液で溶出されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 該高度精製コンプレックスがさらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび金属イオンキレートクロマトグラフィーからなる群から選ばれるクロマトグラフィー工程により精製されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 加熱処理を含むウイルスを不活化および除去する各処理工程を、高度精製コンプレックスに対して行なうことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 血漿、血漿分画、細胞培養上清、および医薬調整物からなる群のメンバーを出発物質として用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。