ES2411007T3 - Remodelación y glicoconjugación de péptidos - Google Patents

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ES2411007T3 ES02795509T ES02795509T ES2411007T3 ES 2411007 T3 ES2411007 T3 ES 2411007T3 ES 02795509 T ES02795509 T ES 02795509T ES 02795509 T ES02795509 T ES 02795509T ES 2411007 T3 ES2411007 T3 ES 2411007T3
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Shawn De Frees
David Zopf
Robert Bayer
Caryn Bowe
David Hakes
Xi Chen
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Novo Nordisk AS
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Abstract

Procedimiento in vitro, sin células para formar un conjugado covalente entre un poli(etilenglicol) y un péptidoglicosilado o sin glicosilar, en el que dicho poli(etilenglicol) está conjugado a dicho péptido mediante un grupo deenlace de glicosilo intacto interpuesto entre y, unido covalentemente, tanto a dicho péptido como a dichopoli(etilenglicol), dicho procedimiento comprende: poner en contacto dicho péptido con una mezcla que comprende al menos un azúcar de nucleótido unidocovalentemente a dicho poli(etilenglicol) y al menos una glicosiltransferasa para la cual dicho azúcar denucleótido es un sustrato en condiciones adecuadas para que dicha al menos una glicosiltransferasa transfieradicho al menos un azúcar de nucleótido unido covalentemente a dicho poli(etilenglicol) a dicho péptido,formando de dicha forma dicho conjugado covalente de dicho péptido.

Description

Remodelación y glicoconjugación de péptidos
Antecedentes de la invención
La mayoría de los péptidos que existen de forma natural contienen restos de hidrato de carbono unidos al péptido mediante enlaces específicos para un número seleccionado de aminoácidos a lo largo de la longitud de la cadena peptídica primaria. Por tanto, muchos péptidos que existen de forma naturalse denominan“glicopéptidos”. La variabilidad del patrón de glicosilación sobre cualquier péptido dado tiene enormes implicaciones para la función de ese péptido. Por ejemplo, la estructura de los glicanos ligados en N sobre un péptido puede afectar diversas características del péptido, que incluyen la susceptibilidad a proteasas, tráfico intracelular, secreción, selección de tejido como diana, semivida biológica y antigenicidad del péptido en una célula u organismo. La alteración de una o más de estas características afecta enormemente la eficacia de un péptido en su entorno natural, y también afecta la eficacia del péptido como agente terapéutico en situaciones en las que el péptido se ha generado para dicho fin.
La estructura del hidrato de carbono unido a la cadena peptídica se conoce como una molécula de “glicano”. La estructura de glicano específica presente sobre un péptido afecta la solubilidad y características de agregación del péptido, el plegamiento de la cadena peptídica primaria y, por tanto, su actividad funcional o enzimática, la resistencia del péptido al ataque proteolítico y el control de la proteólisis que conduce a la conversión de formas inactivas del péptido en formas activas. Y, lo que es más importante, residuos de ácido siálico terminales presentes sobre la molécula de glicano afectan la semivida del péptido en el aparato circulatorio de mamífero. Los péptidos cuyos glicanos no contienen residuos de ácido siálico terminales son rápidamente eliminados de la circulación por el hígado, un evento que invalida cualquier posible beneficio terapéutico del péptido.
Las estructuras de glicano encontradas en los glicopéptidos queexisten de forma natural se dividen normalmente en dos clases, glicanos ligados en N y ligados en O.
Los péptidos expresados en células eucariotas están normalmente N-glicosilados sobre residuos de asparagina en sitios en la estructura primaria del péptido que contienen la secuencia asparagina-X-serina/treonina en la que X puede ser cualquier aminoácido, excepto prolina y ácido aspártico. La porción de hidrato de carbono de tales péptidos se conoce como un glicano ligado en N. Los eventos tempranos de N-glicosilación se producen en el retículo endoplásmico (RE) y son idénticos en mamíferos, plantas, insectos y otros eucariotas superiores. Primero, una cadena de oligosacárido que comprende catorce residuos de azúcar se construye sobre una molécula portadora de lípidos. Como el péptido naciente se traduce y se translocaliza en el RE, la cadena de oligosacárido entera se transfiere al grupo amida del residuo de asparagina en una reacción catalizada por una enzima glicosiltransferasa unida a membrana. El glicano ligado en N se procesa adicionalmente tanto en el RE como en el aparato de Golgi. El procesamiento adicional generalmente implica la eliminación de algunos de los residuos de azúcar y la adición de otros residuos de azúcar en reacciones catalizadas por glicosilasas y glicosiltransferasas específicas para los residuos de azúcar eliminados y añadidos.
Normalmente, las estructuras finales de los glicanos ligados en N dependen del organismo en el que el péptido se produce. Por ejemplo, en general, péptidos producidos en bacterias están completamente sin glicosilar. Péptidos expresados en células de insecto contienen alta manosa, cadenas de oligosacáridos ligados en N de pauci-manosa, entre otros. Los péptidos producidos en cultivo celular de mamífero están normalmente glicosilados de forma diferente dependiendo, por ejemplo, de las especies y condiciones de cultivo celular. Incluso en las mismas especies y bajo las mismas condiciones, algunas veces se encuentra una cierta cantidad de heterogeneidad en la cadena de glicosilo. Además, los péptidos producidos en células vegetales comprenden estructuras de glicano que se diferencian significativamente de aquellas producidas en células animales. El dilema en la materia de la producción de péptidos recombinantes, particularmente cuando los péptidos van a usarse como agentes terapéuticos, es poder generar péptidos que están correctamente glicosilados, es decir, que pueden generan un péptido que tiene una estructura de glicano que se parece, o es idéntica a la presente, sobre la forma que se produce naturalmente del péptido. La mayoría de los péptidos producidos por medios recombinantes comprenden estructuras de glicano que son diferentes de los glicanos que existen de forma natural.
Se ha propuesto una variedad de procedimientos en la materia para personalizar el patrón de glicosilación de un péptido, incluyendo los descritos en los documentos WO 99/22764, WO 98/58964, WO 99/54342 y la patente de EE.UU. nº 5.047.335, entre otros. Esencialmente, muchas de las enzimas requeridas para la glicosilación in vitro de péptidos se han clonado y secuenciado. En algunos casos, estas enzimas se han usado in vitro para añadir azúcares específicos a una molécula de glicano incompleta sobre un péptido. En otros casos, las células se han manipulado genéticamente para expresar una combinación de enzimas y péptidos deseados de forma que la adición de un resto de azúcar deseado a un péptido expresado se produzca dentro de la célula.
También pueden modificarse péptidos mediante la adición de glicanos ligados en O, también llamados glicanos tipo mucina, debido a su prevalencia en el glicopéptido mucinoso. A diferencia de los N-glicanos que están ligados a residuos de asparagina y se forman por transferencia en bloc de oligosacárido a partir de productos intermedios unidos a lípido, los O-glicanos están principalmente ligados a residuos de serina y treonina y se forman por la
adición escalonada de azúcares de azúcares de nucleótido (Tanner y col., Biochim. Biophys. Acta. 906:81-91 (1987); y Hounsell y col., Glycoconj. J. 13:19-26 (1996)). La función del péptido puede afectarse por la estructura de los glicanos ligados en O presentes sobre el mismo. Por ejemplo, la actividad del ligando P-selectina está afectada por la estructura de glicano ligado en O presente sobre la misma. Para una revisión de estructuras de glicano ligado en O véase Schachter y Brockhausen, The Biosynthesis of Branched O-Linked Glycans, 1989, Society for Experimental Biology, pág. 1-26 (Gran Bretaña). Otros patrones de glicosilación se forman ligando glicosilfosfatidilinositol con el grupo carboxilo del extremo carboxilo de la proteína (Takeda y col., Trends Biochem. Sci. 20:367-371 (1995); y Udenfriend y col., Ann. Rev. Biochem. 64:593-591 (1995).
Aunque actualmente existen diversas técnicas para modificar los glicanos ligados en N de péptidos, en la materia existe la necesidad de un procedimiento generalmente aplicable de producción de péptidos que tienen un patrón de glicosilación deseado, es decir, personalizado. Hay una necesidad particular en la técnica de la glicosilación in vitro personalizada de péptidos, pudiendo producirse el péptido resultante a escala industrial. Esta y otras necesidades se satisfacen mediante la presente invención.
La administración de péptidos glicosilados y no glicosilados para generar una respuesta fisiológica particular es muy conocida en las ciencias médicas. Entre los péptidos mejor conocidos utilizados para este fin está la insulina, que se usa para tratar diabetes. También se han usado enzimas por sus beneficios terapéuticos. Un factor importante, que ha limitado el uso de péptidos terapéuticos, es la naturaleza inmunogénica de la mayoría de los péptidos. En un paciente, una respuesta inmunogénica a un péptido administrado puede neutralizar el péptido y/o conducir al desarrollo de una respuesta alérgica en el paciente. Otras deficiencias de los péptidos terapéuticos incluyen potencia inferior a la óptima y rápidas tasas de eliminación. Los problemas inherentes a los péptidos terapéuticos son reconocidos en la materia, y se han investigado diversos procedimientos de eliminación de los problemas. Para proporcionar péptidos terapéuticos solubles, polímeros sintéticos se han unido al esqueleto de péptido.
El poli(etilenglicol) (“PEG”) es un polímero a modo de ejemplo que se ha conjugado con péptidos. Se ha demostrado que el uso de PEG para derivatizar péptidos terapéuticos reduce la inmunogenicidad de los péptidos y prolonga el tiempo de eliminación de la circulación. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.179.337 (Davis y col.) se refiere a péptidos no inmunogénicos tales como enzimas y hormonas peptídicas acopladas a polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol. Se usan entre 10 y 100 moles de polímero por mol de péptido y al menos se mantiene el 15% de la actividad fisiológica.
El documento WO 93/15189 (Veronese y col.) se refiere a un procedimiento para mantener la actividad de enzimas proteolíticas modificadas con polietilenglicol ligando la enzima proteolítica a un inhibidor macromolecularizado. Los conjugados están previstos para aplicaciones médicas.
El principal modo de unión de PEG, y sus derivados, a péptidos es un enlace no específico mediante un residuo de aminoácido de péptido. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.088.538 desvela un conjugado de polímero enzimáticamente activo-enzima de una enzima covalentemente unida a PEG. Similarmente, la patente de EE.UU. nº
4.496.689 desvela un complejo covalentemente unido de inhibidor de !-1 proteasa con un polímero, tal como PEG o metoxipoli(etilenglicol) (“mPEG”). Abuchowski y col. (J. Biol. Chem. 252: 3578 (1977)) desvelan la unión covalente de mPEG a un grupo amina de albúmina de suero bovino. La patente de EE.UU. nº 4.414.147 desvela un procedimiento de hacer el interferón menos hidrófobo conjugándolo con un anhídrido de un ácido dicarboxílico, tal como poli(anhídrido succínico de etileno). El documento PCT WO 87/00056 desvela la conjugación de PEG y polioles poli(oxietilados) con proteínas tales con interferón-∀, interleucina-2 e inmunotoxinas. El documento EP
154.316 desvela y reivindica linfocinas químicamente modificadas tales como IL-2 que contienen PEG unido directamente a al menos un grupo amino primario de la linfocina. La patente de EE.UU. nº 4.055.635 desvela composiciones farmacéuticas de un complejo soluble en agua de una enzima proteolítica ligada covalentemente a una sustancia polimérica, tal como un polisacárido.
Otro modo de unir PEG a péptidos es mediante la oxidación no específica de residuos de glicosilo sobre un péptido. El azúcar oxidado se utiliza como un sitio para unir un resto de PEG a péptido. Por ejemplo, M'Timkulu (documento WO 94/05332) desvela el uso de una hidracina-o amino-PEG para añadir PEG a una glicoproteína. Los restos de glicosilo se oxidan aleatoriamente a los aldehídos correspondientes, que se acoplan posteriormente al amino-PEG.
En cada uno de los procedimientos descritos anteriormente, el poli(etilenglicol) se añade en un modo no específico aleatorio a residuos reactivos sobre un esqueleto de péptido. Para la producción de péptidos terapéuticos es claramente deseable utilizar una estrategia de derivatización que produzca la formación de un producto específicamente marcado, fácilmente caracterizable, esencialmente homogéneo.
Se usan dos clases principales de enzimas en la síntesis de hidratos de carbono, glicosiltransferasas (por ejemplo, sialiltransferasas, oligosacariltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas) y glicosidasas. Las glicosidasas se clasifican adicionalmente como exoglicosidasas (por ejemplo, ∀-manosidasa, ∀-glucosidasa) y endoglicosidasas (por ejemplo, endo-A, endo-M). Cada una de estas clases de enzimas se ha usado satisfactoriamente sintéticamente para preparar hidratos de carbono. Para una revisión general véase Crout y col., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98-111 (1998).
Las glicosiltransferasas modifican las estructuras de oligosacáridos sobre péptidos. Las glicosiltransferasas son eficaces para producir productos específicos con buen control estereoquímico y regioquímico. Las glicosiltransferasas se han usado para preparar oligosacáridos y para modificar estructuras de hidratos de carbono ligados en N y en O terminales, particularmente sobre péptidos producidos en células de mamífero. Por ejemplo, los oligosacáridos terminales de glicopéptidos se han sililado y/o fucosilado completamente para proporcionar estructuras de azúcar más coherentes, que mejoran la farmacodinámica de glicopéptidos y una variedad de otras propiedades biológicas. Por ejemplo, se usa ∀-1,4-galactosiltransferasa para sintetizar lactosamina, una ilustración de la utilidad de glicosiltransferasas en la síntesis de hidratos de carbono (véase, por ejemplo, Wong y col., J. Org. Chem. 47: 5416-5418 (1982)). Además, numerosos procedimientos de síntesis ha hecho uso de !-sialiltransferasas para transferir ácido siálico de ácido citidina-5'-monofosfo-N-acetilneuramínico a 3-OH o 6-OH de galactosa (véase, por ejemplo, Kevin y col., Chem. Eur. J. 2: 1359-1362 (1996)). Se usan fucosiltransferasas en rutas sintéticas para transferir una unidad de fucosa de guanosina-5'-difosfofucosa a un hidroxilo específico de un aceptor de sacárido. Por ejemplo, Ichikawa preparó sialil-Lewis-X mediante un procedimiento que implicaba la fucosilación de lactosamina sialilada con una fucosiltransferasa clonada (Ichikawa y col., J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298 (1992)). Para una discusión de recientes avances en la síntesis de glicoconjugados para uso terapéutico véase Koeller y col., Nature Biotechnology 18: 835-841 (2000). Véanse también las patentes de EE.UU. nº 5.876.980; 6.030.815; 5.728.554; 5.922.577; y el documento WO/9831826.
También pueden usarse glicosidasas para preparar sacáridos. Las glicosidasas normalmente catalizan la hidrólisis de un enlace glucosídico. Sin embargo, bajo condiciones apropiadas, pueden usarse para formar este enlace. La mayoría de las glicosidasas usadas para la síntesis de hidratos de carbono son exoglicosidasas; la transferencia de glicosilo se produce en el extremo no reductor del sustrato. La glicosidasa se une a un donante de glicosilo en un producto intermedio de glicosilo-enzima que es tanto interceptado por agua para dar el producto de hidrólisis, como por un aceptor, para generar un nuevo glicósido u oligosacárido. Una ruta a modo de ejemplo que usa una exoglicosidasa es la síntesis del trisacárido central de todos los ligados en N-glicopéptidos, que incluye el enlace de ∀-manósido, que se forma por la acción de ∀-manosidasa (Singh y col., Chem. Commun. 993-994 (1996)).
En otra aplicación a modo de ejemplo del uso de una glicosidasa para formar un enlace glicosídico se ha preparado una glicosidasa mutante en la que el aminoácido nucleófilo normal dentro del sitio activo se cambia a un aminoácido no nucleófilo. La enzima mutante no hidroliza enlaces glicosídicos, pero todavía puede formarlos. Una glicosidasa mutante tal se usa para preparar oligosacáridos usando un donante de fluoruro de !-glicosilo y una molécula aceptora de glicósido (Withers y col., patente de EE.UU. nº 5.716.812).
Aunque su uso es menos común que el de las exoglicosidasas, también se utilizan endoglicosidasas para preparar hidratos de carbono. Procedimientos basados en el uso de endoglicosidasas tienen la ventaja de que se transfiere un oligosacárido, en vez de un monosacárido. Los fragmentos de oligosacáridos se han añadido a sustratos usando endo-∀-N-acetilglucosaminas tales como endo-F, endo-M (Wang y col., Tetrahedron Lett. 37: 1975-1978); y Haneda y col., Carbohydr. Res. 292: 61-70 (1996)).
Además de su uso en la preparación de hidratos de carbono, las enzimas tratadas anteriormente también se aplican a la síntesis de glicopéptidos. Se ha publicado la síntesis de una glicoforma homogénea de ribonucleasa B (Witte K. y col., J. Am. Chem. Soc. 119: 2114-2118 (1997)). El núcleo de alta manosa de la ribonucleasa B se escindió tratando el glicopéptido con endoglicosidasa H. La escisión se produjo específicamente entre los dos residuos de GlcNAc centrales. Entonces, el tetrasacárido sialil-Lewis X se reconstruyó enzimáticamente sobre el sitio de anclaje de GlcNAc restante sobre la proteína ahora homogénea por el uso secuencial de ∀-1,4-galactosiltransferasa, !-2,3sialiltransferasa y !-1,3-fucosiltransferasa V. Sin embargo, mientras que cada etapa enzimáticamente catalizada avanzó con rendimiento excelente, tales procedimientos no se han adaptado a una escala industrial para la generación de glicopéptidos.
Procedimientos que combinan tanto elementos sintéticos químicos como enzimáticos también se conocen en la técnica. Por ejemplo, Yamamoto y colaboradores (Carbohydr. Res. 305: 415-422 (1998)) informaron de la síntesis quimioenzimática del glicopéptido, péptido T glicosilado, usando una endoglicosidasa. El péptido de Nacetilglucosaminilo se sintetizó por medios puramente químicos. El péptido se elaboró posteriormente enzimáticamente con el oligosacárido del péptido transferrina humano. La porción de sacárido se añadió al péptido tratándolo con una endo-∀-N-acetilglucosaminidasa. El péptido glicosilado resultante fue altamente estable y resistente a la proteólisis cuando se comparó con el péptido T y N-acetilglucosaminil-péptido T.
Se ha explorado el uso de glicosiltransferasas para modificar la estructura de péptidos con grupos indicadores. Por ejemplo, Brossmer y col. (patente de EE.UU. nº 5.405.753) desvelan la formación de un monofosfato de citidina (“MFC”) marcado fluorescentemente derivado de ácido siálico y el uso del glicósido fluorescente en un ensayo para actividad de sialiltransferasa y para el marcado fluorescente de superficies celulares, glicoproteínas y péptidos. Gross y col. (Analyt. Biochem. 186: 127 (1990)) describen un ensayo similar. Bean y col. (patente de EE.UU. nº 5.432.059) desvelan un ensayo para alteraciones de la deficiencia de glicosilación utilizando la reglicosilación de una proteína deficientemente glicosilada. La proteína deficiente es reglicosilada con un glicósido de MFC marcado fluorescentemente. Cada uno de los derivados de ácido siálico fluorescentes está sustituido con el resto fluorescente en tanto la posición 9 como en la amina que normalmente está acetilada en ácido siálico. Los procedimientos
usando los derivados de ácido siálico fluorescentes son ensayos para la presencia de glicosiltransferasas o para glicoproteínas no glicosiladas o inapropiadamente glicosiladas. Los ensayos se realizan en pequeñas cantidades de enzima o glicoproteína en una muestra de origen biológico. En la técnica anterior no se ha desvelado o sugerido la derivatización enzimática de un péptido glicosilado o no glicosilado a una escala preparativa o industrial usando un ácido siálico modificado.
También se han dirigido esfuerzos considerables hacia la modificación de superficies celulares alterando residuos de glicosilo presentados por aquellas superficies. Por ejemplo, Fukuda y colaboradores han desarrollado un procedimiento para unir glicósidos de estructura definida sobre superficies celulares. El procedimiento explota la especificidad de sustrato relajado de una fucosiltransferasa que puede transferir fucosa y análogos de fucosa que llevan diversos sustratos de glicosilo (Tsuboi y col., J. Biol. Chem. 271: 27213 (1996)).
También se han usado procedimientos enzimáticos para activar residuos de glicosilo sobre un glicopéptido hacia la posterior elaboración química. Los residuos de glicosilo se activan normalmente usando galactosa oxidasa, que convierte un residuo de galactosa terminal en el aldehído correspondiente. El aldehído se acopla posteriormente a un grupo modificador que contiene amina. Por ejemplo, Casares y col. (Nature Biotech. 19: 142 (2001)) han unido doxorubicina a los residuos de galactosa oxidados de una quimera de MHCII-péptido recombinante.
También se han modificado residuos de glicosilo para contener grupos cetona. Por ejemplo, Mahal y colaboradores (Science 276: 1125 (1997)) han preparado N-levulinoilmanosamina (“ManLev”), que tiene una funcionalidad cetona en la posición normalmente ocupada por el grupo acetilo en el sustrato natural. Se trataron células con ManLev, incorporando así un grupo cetona sobre la superficie celular. Véanse también Saxon y col., Science 287: 2007 (2000); Hang y col., J. Am. Chem. Soc. 123: 1242 (2001); Yarema y col., J. Biol. Chem. 273: 31168 (1998); y Charter y col., Glycobiology 10: 1049 (2000).
Los procedimientos de modificación de superficies celulares no se han aplicado en ausencia de una célula para modificar un péptido glicosilado o no glicosilado. Además, los procedimientos de modificación de la superficie celular no se utilizan para la incorporación enzimática de resto donante de glicosilo modificado previamente formado en un péptido. Además, ninguno de los procedimientos de modificación de la superficie celular son prácticos para producir péptidos modificados con glicosilo a escala industrial.
A pesar de los esfuerzos dirigidos hacia la elaboración enzimática de estructuras de sacárido, todavía sigue existiendo una necesidad de un procedimiento industrialmente práctico para la modificación de péptidos glicosilados y no glicosilados con grupos modificadores tales como polímeros solubles en agua, restos terapéuticos, biomoléculas y similares. Son de particular interés procedimientos en los que el péptido modificado tiene propiedades mejoradas, que potencian su uso como agente terapéutico o de diagnóstico. La presente invención satisface estas y otras necesidades.
La patente de EE.UU. nº 5.153.265 desvela una proteína CSF-I que está conjugada con un polímero soluble en agua, por ejemplo, polietilenglicol. El polímero puede unirse a la proteína CSF-I haciendo reaccionar PEG-amina, por ejemplo, en vez de la proteína CSF-I oxidada.
Gross y col. (Biochemistry, 1989, 28, 7386-7392) desvelan la transferencia de análogos de ácido siálico a glicanos de glicoproteínas ligadas en N o ligadas en O por sialiltransferasas.
Resumen de la invención
El alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
La invención incluye un procedimiento in vitro sin células de remodelación de un péptido que tiene la fórmula:
en la que
AA es un residuo de aminoácido terminal o interno del péptido; X1-X2 es un sacárido ligado covalentemente al AA, en la que X1 es un primer residuo de glicosilo; y X2 es un segundo residuo de glicosilo ligado covalentemente a X1, en la que X1 y X2 están seleccionados de residuos de monosacarilo y oligosacarilo. El procedimiento comprende:
(a)
eliminar X2 o una unidad de sacarilo del mismo del péptido, formando así un glicano truncado; y
(b)
poner en contacto el glicano truncado con al menos una glicosiltransferasa y al menos un donante de glicosilo en condiciones adecuadas para transferir el al menos un donante de glicosilo al glicano truncado, remodelándose así el péptido.
En un aspecto, el procedimiento comprende además
(c)
eliminar X1, exponiendo así el AA; y
(d)
poner en contacto el AA con al menos una glicosiltransferasa y al menos un donante de glicosilo en condiciones adecuadas para transferir el al menos un donante de glicosilo al AA, remodelándose así el péptido.
En otro aspecto, el procedimiento comprende además:
(e) antes de la etapa (b), eliminar un grupo añadido al sacárido durante la modificación postraduccional. En una realización, el grupo es un miembro seleccionado de fosfato, sulfato, carboxilato y ésteres de los mismos. En otra realización, el péptido tiene la fórmula:
en la que Z es un miembro seleccionado de O, S, NH, y un ligador cruzado.
Al menos uno de los donantes de glicosilo comprende un grupo modificador, y el grupo modificador es un polímero soluble en agua, concretamente un poli(etilenglicol). Preferentemente, el poli(etilenglicol) tiene una distribución de peso molecular que es esencialmente homodispersa.
En esta y varias otras realizaciones, el péptido puede seleccionarse del grupo constituido por factor estimulante de colonias de granulocitos, interferón-alfa, interferón-beta, factor VIIa, factor IX, hormona estimulante del folículo, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, interferón-gamma, inhibidor de alfa-1proteasa, beta-glucosidasa, proteína del activador tisular del plasminógeno, interleucina-2, factor VIII, receptor del factor de necrosis tumoral quimérico, urocinasa, anticuerpo quimérico anti-glicoproteína IIb/IIIa, anticuerpo quimérico anti-HER2, anticuerpo quimérico anti-virus respiratorio sincitial, anticuerpo quimérico anti-CD20, ADNasa, anticuerpo quimérico anti-factor de necrosis tumoral, insulina humana, sAg de la hepatitis B y hormona de crecimiento humana.
También está incluido en la invención un procedimiento in vitro sin células de remodelación de un péptido que tiene la fórmula:
en la que X3, X4, X5, X6, X7 y X17 son residuos de monosacarilo u oligosacarilo independientemente seleccionados; y a, b, c, d, e y x están seleccionados independientemente de los números enteros 0, 1 y 2, con la condición de que al menos un miembro seleccionado de a, b, c, d, e y x sea 1 ó 2. El procedimiento comprende:
(a)
eliminar al menos uno de X3, X4, X5, X6, X7 o X17, o una unidad de sacarilo del mismo, del péptido, formando así un glicano truncado; y
(b)
poner en contacto el glicano truncado con al menos una glicosiltransferasa y al menos un donante de glicosilo en condiciones adecuadas para transferir el al menos un donante de glicosilo al glicano truncado, remodelándose así el péptido.
En un aspecto, la eliminación de la etapa (a) produce un glicano truncado en el que a, b, c, e y x son cada uno 0.
En otro aspecto, X3, X5 y X7 están seleccionados del grupo constituido por (manosa)z y (manosa)z-(X8)y en la que X8 es un resto glicosilo seleccionado de mono-y oligo-sacáridos; y es un número entero seleccionado de 0 y 1; y z es un número entero entre 1 y 20, en la que si z es 3 o mayor, (manosa)z está seleccionada de estructuras lineales y ramificadas.
En otro aspecto más, X4 está seleccionado del grupo constituido por GlcNAc y xilosa. En otro aspecto, en el que X3, X5 y X7 son (manosa)u, en la que u está seleccionado de los números enteros entre 1 y 20, y si u es 3 o mayor,
(manosa)u está seleccionada de estructuras lineales y ramificadas.
Al menos uno de los donantes de glicosilo comprende un grupo modificador, y el grupo modificador es un polímero soluble en agua, concretamente un poli(etilenglicol). Preferentemente, el poli(etilenglicol) tiene una distribución de peso molecular que es esencialmente homodispersa.
Además, el péptido puede seleccionarse del grupo constituido por factor estimulante de colonias de granulocitos, interferón-alfa, interferón-beta, factor VIIa, factor IX, hormona estimulante del folículo, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, interferón-gamma, inhibidor de alfa-1-proteasa, betaglucosidasa, proteína del activador tisular del plasminógeno, interleucina-2, factor VIII, receptor del factor de necrosis tumoral quimérico, urocinasa, anticuerpo quimérico anti-glicoproteína IIb/IIIa, anticuerpo quimérico anti-HER2, anticuerpo quimérico anti-virus respiratorio sincitial, anticuerpo quimérico anti-CD20, ADNasa, anticuerpo quimérico anti-factor de necrosis tumoral, insulina humana, sAg de la hepatitis B y hormona de crecimiento humana.
También está incluido un procedimiento in vitro sin células de remodelación de un péptido que comprende un glicano que tiene la fórmula:
en la que
r, s y t son números enteros independientemente seleccionados de 0 y 1. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido con al menos una glicosiltransferasa y al menos un donante de glicosilo en condiciones adecuadas para transferir el al menos un donante de glicosilo al glicano, remodelándose así el péptido.
Al menos uno de los donantes de glicosilo comprende un grupo modificador, y el grupo modificador es un polímero soluble en agua, concretamente un poli(etilenglicol). Preferentemente, el poli(etilenglicol) tiene una distribución de peso molecular que es esencialmente homodispersa.
Además, el péptido puede seleccionarse del grupo constituido por factor estimulante de colonias de granulocitos, interferón-alfa, interferón-beta, factor VIIa, factor IX, hormona estimulante del folículo, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, interferón-gamma, inhibidor de alfa-1-proteasa, betaglucosidasa, proteína del activador tisular del plasminógeno, interleucina-2, factor VIII, receptor del factor de necrosis tumoral quimérico, urocinasa, anticuerpo quimérico anti-glicoproteína IIb/IIIa, anticuerpo quimérico anti-HER2, anticuerpo quimérico anti-virus respiratorio sincitial, anticuerpo quimérico anti-CD20, ADNasa, anticuerpo quimérico anti-factor de necrosis tumoral, insulina humana, sAg de la hepatitis B y hormona de crecimiento humana.
En otro aspecto más, el péptido tiene la fórmula:
en la que X9 y X10 son residuos de monosacarilo u oligosacarilo independientemente seleccionados; y m, n y f son números enteros seleccionados de 0 y 1.
En otro aspecto, el péptido tiene la fórmula:
en la que X11 y X12 son restos glicosilo independientemente seleccionados; y r y x son números enteros independientemente seleccionados de 0 y 1.
En una realización preferida, X11 y X12 son (manosa)q en la que
q está seleccionado de los números enteros entre 1 y 20, y si q es tres o mayor, (manosa)q está seleccionada de estructuras lineales y ramificadas.
En otro aspecto, el péptido tiene la fórmula:
en la que
10 X13, X14 y X15 son residuos de glicosilo independientemente seleccionados; y g, h, i, j, k y p están seleccionados independientemente de los números enteros 0 y 1, con la condición de que al menos uno de g, h, i, j, k y p sea 1.
En una realización de este aspecto de la invención, X14 y X15 son miembros independientemente seleccionados de GlcNAc y Sia; y i y k están seleccionados independientemente de los números enteros 0 y 1, con la condición de que 15 almenos uno de i y ksea1, y si kes1, g, h y json0.
En otro aspecto de la invención, el péptido tiene la fórmula:
en la que X16 es un miembro seleccionado de:
en la que
s, u y i están seleccionados independientemente de los números enteros 0 y 1.
En una realización de la invención, la eliminación utiliza una glicosidasa.
También está incluido en la invención un procedimiento in vitro sin células de remodelación de un péptido que tiene 25 la fórmula:
en la que AA es un residuo de aminoácido terminal o interno del péptido; X1 es un residuo de glicosilo ligado covalentemente a AA, seleccionado de residuos de monosacarilo y oligosacarilo;
30 y u es un número entero seleccionado de 0 y 1. El procedimiento comprende: poner en contacto el péptido con al menos una glicosiltransferasa y al menos un donante de glicosilo en condiciones adecuadas para transferir el al menos un donante de glicosilo al glicano truncado, en el que el donante de glicosilo comprende un grupo modificador, remodelándose así el péptido.
Al menos uno de los donantes de glicosilo comprende un grupo modificador, y el grupo modificador es un polímero soluble en agua, concretamente un poli(etilenglicol). Preferentemente, el poli(etilenglicol) tiene una distribución de peso molecular que es esencialmente homodispersa.
Además, el péptido puede seleccionarse del grupo constituido por factor estimulante de colonias de granulocitos, interferón-alfa, interferón-beta, factor VIIa, factor IX, hormona estimulante del folículo, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, interferón-gamma, inhibidor de alfa-1-proteasa, betaglucosidasa, proteína del activador tisular del plasminógeno, interleucina-2, factor VIII, receptor del factor de necrosis tumoral quimérico, urocinasa, anticuerpo quimérico anti-glicoproteína IIb/IIIa, anticuerpo quimérico anti-HER2, anticuerpo quimérico anti-virus respiratorio sincitial, anticuerpo quimérico anti-CD20, ADNasa, anticuerpo quimérico anti-factor de necrosis tumoral, insulina humana, sAg de la hepatitis B y hormona de crecimiento humana.
La invención incluye adicionalmente un conjugado covalente entre un péptido y un grupo modificador que altera una propiedad del péptido, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido en un residuo de glicosilo o de aminoácido preseleccionado del péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto.
En un aspecto, el grupo modificador y un precursor de grupo de enlace de glicosilo intacto se unen como una unidad covalentemente unida al péptido mediante la acción de una enzima, convirtiendo la enzima el precursor en el grupo de enlace de glicosilo intacto, formando así el conjugado.
El conjugado covalente de la invención comprende:
un primer grupo modificador covalentemente unido a un primer residuo del péptido mediante un primer grupo de enlace de glicosilo intacto, y un segundo grupo de enlace de glicosilo unido a un segundo residuo del péptido mediante un segundo grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el primer residuo y el segundo residuo son estructuralmente idénticos. En otra realización, el primer residuo y el segundo residuo tienen estructuras diferentes. En una realización adicional, el primer residuo y el segundo residuo son residuos de glicosilo. En otra realización, el primer residuo y el segundo residuo son residuos de aminoácidos.
En otra realización más, el péptido se remodela antes de formar el conjugado. Preferentemente, el péptido se remodela para introducir un resto aceptor para el grupo de enlace de glicosilo intacto.
El grupo modificador es un polímero soluble en agua, concretamente un poli(etilenglicol), que, en otra realización, puede tener una distribución de peso molecular que es esencialmente homodispersa.
En otra realización más, el péptido está seleccionado del grupo constituido por factor estimulante de colonias de granulocitos, interferón-alfa, interferón-beta, factor VIIa, factor IX, hormona estimulante del folículo, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, interferón-gamma, inhibidor de alfa-1-proteasa, betaglucosidasa, proteína del activador tisular del plasminógeno, interleucina-2, factor VIII, receptor del factor de necrosis tumoral quimérico, urocinasa, anticuerpo quimérico anti-glicoproteína IIb/IIIa, anticuerpo quimérico anti-HER2, anticuerpo quimérico anti-virus respiratorio sincitial, anticuerpo quimérico anti-CD20, ADNasa, anticuerpo quimérico anti-factor de necrosis tumoral, insulina humana, sAg de la hepatitis B y hormona de crecimiento humana.
En otra realización, la unidad de enlace de glicosilo intacta es un miembro seleccionado del grupo constituido por un residuo de ácido siálico, un residuo de Gal, un residuo de GlcNAc y un residuo de GalNAc.
También se proporciona en la invención un procedimiento de formación de un conjugado covalente entre un polímero y un péptido glicosilado o no glicosilado, en el que el polímero está conjugado con el péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y ligado covalentemente a tanto el péptido como el polímero. El procedimiento comprende poner en contacto el péptido con una mezcla que comprende un azúcar de nucleótido ligado covalentemente al polímero y una glicosiltransferasa para la que el azúcar de nucleótido es un sustrato en condiciones suficientes para formar el conjugado.
El polímero es un polímero soluble en agua, concretamente un poli(etilenglicol). En otra realización preferida, el grupo de enlace de glicosilo está covalentemente unido a un residuo de glicosilo covalentemente unido al péptido, y en otra realización, el grupo de enlace de glicosilo está covalentemente unido a un residuo de aminoácido del péptido.
En otra realización, el poli(etilenglicol) tiene un grado de polimerización de aproximadamente 1 a aproximadamente 20.000, preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000, o también preferentemente, el polietilenglicol tiene un grado de polimerización de aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000.
En otra realización, la glicosiltransferasa está seleccionada del grupo constituido por sialiltransferasa, galactosiltransferasa, glucosiltransferasa, GalNAc transferasa, GlcNAc transferasa, fucosiltransferasa y manosiltransferasa. En una realización, la glicosiltransferasa se produce recombinantemente, y en otra realización, la glicosiltransferasa es una enzima procariota recombinante, o una enzima eucariota recombinante.
En otra realización más, el azúcar de nucleótido está seleccionado del grupo constituido por UDP-glicósido, MFCglicósido y GDP-glicósido y está seleccionado preferentemente del grupo constituido por UDP-galactosa, UDPgalactosamina, UDP-glucosa, UDP-glucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, UDP-N-acetilglucosamina, GDP
5 manosa, GDP-fucosa, MFC-ácido siálico, MFC-NeuAc.
En otra realización, el péptido es un agente terapéutico.
En otra realización más, el péptido glicosilado se desglicosila parcialmente antes de la puesta en contacto.
En otra realización, el grupo de enlace de glicosilo intacto es un residuo de ácido siálico.
El procedimiento se realiza en un entorno sin células.
10 Y, en otra realización, el conjugado covalente puede aislarse, y preferentemente, el conjugado covalente se aísla por filtración en membrana.
También se proporciona un procedimiento de formación de un conjugado covalente entre un primer péptido glicosilado o no glicosilado, y un segundo péptido glicosilado o no glicosilado, unido conjuntamente por un resto de ligador, en el que
15 el resto de ligador está conjugado con el primer péptido mediante un primer grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y ligado covalentemente a tanto el primer péptido como al resto de ligador, y
el resto de ligador está conjugado con el segundo péptido mediante un segundo grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y ligado covalentemente a tanto el segundo péptido como al resto de ligador. El procedimiento comprende:
20 (a) poner en contacto el primer péptido con un derivado del precursor de resto de ligador que comprende un precursor del primer grupo de enlace de glicosilo intacto y un precursor del segundo grupo de enlace de glicosilo intacto;
(b) poner en contacto la mezcla de (a) con una glicosiltransferasa para la que el precursor del primer grupo de enlace de glicosilo es un sustrato, en condiciones suficientes para convertir el precursor del primer grupo de
25 enlace de glicosilo intacto en el primer grupo de enlace de glicosilo intacto, formando así un primer conjugado entre el precursor de resto de ligador y el primer péptido;
(c) poner en contacto el primer conjugado con el segundo péptido y una glicosiltransferasa para la que el precursor del segundo grupo de glicosilo intacto es un sustrato, en condiciones suficientes para convertir el precursor del segundo grupo de enlace de glicosilo intacto en el segundo grupo de enlace de glicosilo, formando
30 así el conjugado entre el resto de ligador y el primer péptido glicosilado o no glicosilado, y el segundo péptido glicosilado o no glicosilado.
El resto de ligador comprende un polímero soluble en agua, concretamente un poli(etilenglicol).
También se proporciona un procedimiento de formación de un conjugado covalente entre un primer péptido glicosilado o no glicosilado, y un segundo péptido glicosilado o no glicosilado unido conjuntamente por un resto de
35 ligador, en el que el resto de ligador está covalentemente conjugado con el primer péptido, y el resto de ligador está conjugado con el segundo péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y ligado covalentemente a tanto el segundo péptido como al resto de ligador. El procedimiento comprende:
40 (a) poner en contacto el primer péptido con un derivado activado del resto de ligador que comprende; un grupo funcional reactivo de reactividad complementaria a un residuo sobre el primer péptido, y un precursor del grupo de enlace de glicosilo intacto, en condiciones suficientes para formar un enlace covalente entre el grupo funcional reactivo y el residuo, formando así un primer conjugado; y
(b) poner en contacto el primer conjugado con el segundo péptido y una glicosiltransferasa para la que el
45 precursor del grupo de enlace de glicosilo intacto es un sustrato, en condiciones suficientes para convertir el precursor del grupo de enlace de glicosilo intacto en el grupo de enlace de glicosilo intacto, formando así el conjugado entre el primer péptido glicosilado o no glicosilado, y el segundo péptido glicosilado o no glicosilado unido conjuntamente por el resto de ligador.
El resto de ligador comprende un polímero soluble en agua, concretamente un poli(etilenglicol).
50 También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un diluyente farmacéuticamente aceptable y un conjugado covalente entre un polímero y un péptido glicosilado o no glicosilado, en la que el polímero está conjugado con el péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y ligado covalentemente a tanto el péptido como al polímero.
Adicionalmente se desvela una composición para formar un conjugado entre un péptido y un azúcar modificado, comprendiendo la composición: una mezcla de un azúcar modificado, una glicosiltransferasa y un sustrato aceptor de péptido, en la que el azúcar modificado tiene unido covalentemente al mismo un poli(etilenglicol).
La invención también incluye péptidos remodelados usando los procedimientos de la invención y composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos remodelados.
También se desvela un compuesto que tiene la fórmula:
en la que
MS es un azúcar modificado que comprende un azúcar covalentemente unido a un grupo modificador; 10 Nu es un nucleósido; y
b es un número entero de 0 a 2.
En un aspecto se incluye un compuesto que tiene la fórmula:
en la que
15 X, Y, Z, A y B son miembros independientemente seleccionados de S, O y NH; R21, R22, R23, R24 y R25 miembros independientemente seleccionados de H y un polímero; R26 es un miembro seleccionado de H, OH y un polímero; R27 es un miembro seleccionado de COO-y Na+; Nu es un nucleósido; y
20 a es un número entero de 1 a 3.
La invención proporciona además una procedimiento in vitro sin células de remodelación de un péptido que tiene la fórmula:
en la que 25 AA es un residuo de aminoácido terminal o interno del péptido. El procedimiento comprende:
poner en contacto el péptido con al menos una glicosiltransferasa y al menos un donante de glicosilo en condiciones adecuadas para transferir el al menos un donante de glicosilo al residuo de aminoácido, en la que el donante de glicosilo comprende un poli(etilenglicol), remodelándose así el péptido.
En cada una de las realizaciones que se tratan más adelante, los esquemas de remodelación específicos y los 30 péptidos se identifican únicamente para enfatizar realizaciones preferidas de la invención.
Por tanto, la invención incluye un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de G-CSF mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de G-CSF un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que a, b, c y e son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1;
d es 0; y R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido de G-CSF con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que
comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo 5 modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende además:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de G-CSF con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de G-CSF. En otra realización, el procedimiento comprende además: 10 (c) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de G-CSF con una galactosiltransferasa y un donante de
galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido de G-CSF. En otra realización más, el procedimiento comprende además:
(d) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
15 En otra realización, el procedimiento comprende además:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de G-CSF con N-acetilgalactosaminatransferasa y un donante de GalNAc en condiciones apropiadas para transferir GalNAc al péptido de G-CSF.
En otra realización, el procedimiento comprende además:
(f) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de G-CSF con endo-N-acetilgalactosaminidasa que opera 20 sintéticamente y un donante de GalNAc en condiciones apropiadas para transferir GalNAc al péptido de G-CSF.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones específicas, con referencia a la fórmula del péptido de G-CSF presentada anteriormente, a, b, c y e son 0. Alternativamente, a y e son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y b, c y d son 0. Alternativamente, a, b, c, d y e son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1.
25 La invención incluye adicionalmente un conjugado de péptido de G-CSF formado por los procedimientos anteriormente descritos.
También se incluye un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de interferón alfa y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al glicopéptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el glicopéptido un residuo de glicosilo que tiene una fórmula seleccionada de:
en las que a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, aa, bb, cc, dd y ee son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1;
35 e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 0 a 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 0 a 20; v, w, x, y y zson 0; y R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa R' es H, un residuo de glicosilo, un grupo modificador o un glicoconjugado.
El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el glicopéptido con un miembro seleccionado de una glicosiltransferasa, una endoacetilgalactosaminidasa que opera sintéticamente y una trans-sialidasa, y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende además:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del glicopéptido.
En otra realización, el procedimiento comprende además:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
En una realización adicional, el procedimiento comprende además:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una combinación de una glicosidasa y una sialidasa.
En una realización adicional, el procedimiento comprende además:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del glicopéptido.
En otra realización más, el procedimiento también comprende:
(f) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con N-acetilglucosamina transferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al glicopéptido.
Además, el procedimiento también comprende:
(g) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir galactosa al producto.
Por tanto, el procedimiento comprende además:
(h) antes de la etapa (b), poner en contacto el glicopéptido con endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del glicopéptido.
La invención también comprende además:
(i) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una manosidasa en condiciones apropiadas para eliminar manosa del glicopéptido.
Además, el procedimiento comprende además:
(j) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
Según la invención y con respecto a la fórmula del péptido de interferón alfa desvelada anteriormente, a, b, c, d, aa y bb son 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 1 a 4; i, j, k, l, m, r, s, t, u y cc son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y n, o, p, q, v, w, x, y, z, dd y ee son 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, o, p, q, s, u, v, w, x, y, z, cc, dd y ee son 0; e, g, i, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y aa y bb son 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, i, j, k, l, m, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; h es un miembro independientemente seleccionado de los números enteros de 1 a 3; dd, v, w, x e y son 0; y aa y bb son 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, s, u, v, w, x, e y dd son 0; e, g, i, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y aa y bb son 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m y dd son 0; r, s, t, u, v, w, x e y son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y aa y bb son 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; j, k, l, m, v, w, x, e y dd son 0; y aa y bb son 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, i, j, k, l, m, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; h es un miembro independientemente seleccionado de los números enteros de 1 a 3; v, w, x, e y dd son 0; y aa y bb son 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, s, u, v, w, x, e y dd son 0; e, g, i, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y aa y bb son 1. Alternativamente, n, o y p son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; q es 1; y z, cc y ee son 0. Alternativamente, n y q son miembros independientemente seleccionados de 0 y
1; y o, p, z, cc y ee son 0. Alternativamente, n es 0 ó 1; q es 1; y o, p, z, cc y ee son 0. Alternativamente, n, o, p y f son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; q es 1; y z y ee son 0. Alternativamente, n, o, p y q son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y z, cc y ee son 0. Alternativamente, n y q son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y o, p, z, cc y ee son 0. Alternativamente, n, o, p, q, z, cc y ee son 0.
También se proporciona un conjugado de péptido de interferón alfa formado por el procedimiento desvelado.
La invención también incluye un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de interferón beta y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de interferón beta mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de interferón beta un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que a, b, c, d, i, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 100; v, w, xe y son 0; R es un grupo modificador, manosa u oligomanosa; y R' es H o un glicosilo, grupo modificador o grupo glicoconjugado, comprendiendo el procedimiento:
(a) poner en contacto el péptido de interferón beta con un miembro seleccionado de una glicosiltransferasa y una trans-sialidasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende además:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón beta con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de interferón beta.
En otra realización, el procedimiento comprende además:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
En otra realización más, el procedimiento también comprende además:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón beta con una combinación de una glicosidasa y una sialidasa.
In una realización adicional, el procedimiento comprende además:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón beta con una endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de interferón beta.
Por tanto, el procedimiento comprende además:
(f) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón beta con N-acetilglucosamina transferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de interferón beta.
Adicionalmente, el procedimiento también comprende además:
(g) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón beta con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir galactosa al producto.
En otra realización más, el procedimiento comprende además:
(h) antes de la etapa (b), poner en contacto el péptido de interferón beta con endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de interferón beta.
En otra realización más, el procedimiento comprende además:
(i) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón beta con una manosidasa en condiciones apropiadas para eliminar manosa del péptido de interferón beta.
5 Además, el procedimiento comprende además:
(j) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de interferón beta desvelada anteriormente, h
10 es un miembro independientemente seleccionado de los números enteros entre 1 y 3; a, b, c, d, e, f, g, i, j, k, l, m, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; n, v, w, x e y son 0; y q, p son 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y son 0; e, g, i, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y q, p son 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, x e y son 0; q, p son 1; y i está seleccionado independientemente de 0 y 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, I, j, k, l, m, r, s, t, u,
15 v, w, xe y son 0; y p, q son 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, my n son 0; q, p son 1; y r, s, t, u, v, w, x e y son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; j, k, l, m, n, v, w, x e y son 0; y q, p son 1. Alternativamente, en la que a, b, c, d, h, j, k, l, m, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g, son miembros seleccionados de los números enteros entre 0 y 3; n, v, w, x e y son 0; y q, p son 1. Alternativamente, a, b,
20 c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, p y q son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son 1; y n, v, w, xe y son 0.
Adicionalmente está incluido un conjugado de péptido de interferón beta formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención también proporciona un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido del factor VIIa y
25 un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido del factor VIIa mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido del factor VIIa un residuo de glicosilo que tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de:
30 en la que a, b, c, d, i, o, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g, h y n son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 0 a 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 0 a 20; v, w, x e y son 0; y R es un grupo modificador, una manosa, una oligomanosa, sialil-Lewisx o sialil-Lewisa.
35 El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido del factor VIIa con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización preferida, el procedimiento comprende además:
40 (b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido del factor VIIa con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido del factor VIIa.
En otra realización más preferida, el procedimiento comprende:
(c) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido del factor VIIa con una galactosidasa en condiciones apropiadas para eliminar galactosa del péptido del factor VIIa.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido del factor VIIa con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido del factor VIIa.
5 En una realización adicional, el procedimiento comprende:
(e) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
El grupo modificador es un (etilenglicol).
En realizaciones preferidas, y con referencia a la fórmula del péptido del factor VIIa desvelada anteriormente, a, b, c,
10 d, e, g, i, j, l, o, p y q son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; r y t son 1; f, h, k, m, s, u, v, w, x e y son 0; y n está seleccionado de los números enteros de 0 a 4. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, ,o, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; v, w, x e y son 0; y n es un miembro seleccionado de los números enteros de 0 a 4.
Además, se incluye un conjugado del péptido del factor VIIa formado por el procedimiento desvelado en el presente 15 documento.
La invención proporciona adicionalmente un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido del factor IX y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido del factor IX mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido del factor IX un residuo de glicosilo que tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de:
en las que a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, bb, cc, dd, ee, ff y gg son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1;
25 e, f, g, h y aa son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 0 a 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 0 a 20; v, w, x, y y zson 0; R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa. El procedimiento comprende
(a) poner en contacto el péptido del factor IX con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado,
30 que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende además:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido del factor IX con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido del factor IX.
35 En otra realización, el procedimiento comprende además: (c) poner en contacto el producto formado en la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
Adicionalmente, el procedimiento comprende:
(d) poner en contacto el producto de la etapa (b) con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en
condiciones apropiadas para transferir la galactosa al producto.
Además, el procedimiento comprende:
(e) poner en contacto el producto de la etapa (d) con ST3 gal3 y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
En otra realización más, el procedimiento comprende además:
(d) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
El grupo modificador es un polímero, un poli(etilenglicol).
En realizaciones adicionales y con referencia a la fórmula del péptido del factor IX desvelada anteriormente, a, b, c y d son 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 1 a 4; aa, bb, cc, dd, ee, ff, j, k, l, m, i, n, o, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y v, w, x, y, z y gg son 0. Alternativamente, a, b, c, d, n, q están seleccionados independientemente de 0 y 1; aa, e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 1 a 4; bb, cc, dd, ee, ff, j, k, l, m, i, o, p, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y v, w, x, y, z y gg son 0. Alternativamente, a, b, c, d, n, bb, cc, dd y ff son 1; e, f, g, h y aa son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 1 a 4; q, ee, i, j, k, l, m, o, p, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y v, w, x, y, z y gg son 0. Alternativamente, a, b, c, d y q son 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 1 a 4; aa, bb, cc, dd, ee, ff, j, k, l, m, i, n, o, p, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y v, w, x, y, z y gg son 0. Alternativamente, a, b, c, d, q, bb, cc, dd y ff son 1; aa, e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 1 a 4; ee, i, j, k, l, m, o, p, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y v, w, x, y, z y gg son 0.
También está incluido un conjugado del péptido del factor IX formado por el procedimiento anteriormente desvelado.
La invención también proporciona un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de la hormona estimulante del folículo (FSH) y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de FSH mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de FSH un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que a, b, c, d, i, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6; j, k,1 y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 100; v, w, x e y son 0; y R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido de FSH con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de FSH con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de FSH.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de FSH con una galactosidasa en condiciones apropiadas para eliminar galactosa del péptido de FSH.
En una realización adicional, el procedimiento comprende:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de FSH con una combinación de una glicosidasa y una sialidasa.
5 En otra realización mas, el procedimiento comprende:
(f) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de FSH con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido de FSH.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(d) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando 10 así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(e) antes de la etapa (b), poner en contacto el péptido de FSH con una endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de FSH.
En otra realización, el procedimiento comprende:
15 (f) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de FSH con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de FSH.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones adicionales preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de FSH descrita anteriormente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son 1; y v, w, x e y 20 son 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y1; v, w, xe y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m , s, u, v, w, xe y son 0; y e,g, i, q, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l y m son 0; i, q, r, s, t, u, v, w, x e y están seleccionados independientemente de 0 y 1; p es 1; R (ramificado o lineal) es un miembro seleccionado de manosa y oligomanosa. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, r, s, t, u, v, w e y son 0; i es 0
25 ó 1; y q es 1.
También está incluido un conjugado de péptido de FSH formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención proporciona además un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de eritropoyetina (EPO) y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de EPO mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de EPO un residuo de glicosilo que tiene
30 una fórmula que es un miembro seleccionado de:
en las que
35 a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 4; j, k, I y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 20; v, w, x, y y zson 0; y R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa. El procedimiento comprende:
40 (a) poner en contacto el péptido de EPO con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo
modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de EPO con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de EPO.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de EPO con una galactosidasa que opera sintéticamente en condiciones apropiadas para añadir una galactosa al péptido de EPO.
En una realización adicional, el procedimiento comprende:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de EPO con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido de EPO.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(f) poner en contacto el producto de la etapa (e) con ST3 gal3 y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
Adicionalmente, el procedimiento comprende:
(g) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
Por tanto, el procedimiento comprende:
(h) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de EPO con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de EPO.
En otro aspecto, el grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En una realización preferida, y con referencia a la fórmula del péptido de EPO anterior, a, b, c, d, e, f, g, n y q son 1; h es un miembro seleccionado de los números enteros entre 1 y 3; i, j, k, l, m, o, p, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y, v, w, x, y y z son 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, I, m, q, s, u, v, w, x, y y z son 0; y e, g, i, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y v, w, x, y y z son 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, n y q son 1; h es un miembro seleccionado de los números enteros entre 1 y 3; i, j, k, l, m, o, p, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y v, w, x, y y z son 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, o, p, s, u, v, w, x, y y z son 0; y e, g, i, n, q, r y t están seleccionados independientemente de 0 y 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, o, p, s, u, v, w, x, y y z son 0; y e, g, i, q, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1. Alternativamente, q es 1; a, b, c, d, e, f, g, h, i, n, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y j, k, l, m, o, p, v, w, x, y y z son 0.
También está incluido un conjugado de péptido de EPO formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención proporciona además un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de GM-CSF mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de GM-CSF un residuo de glicosilo que tiene una fórmula seleccionada de:
en la que a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, aa, bb y cc son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 100; v, w, xe y son 0; R es un grupo modificador, manosa u oligomanosa; y R' es H o un residuo de glicosilo, o un grupo modificador o un glicoconjugado. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido de GM-CSF con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de GM-CSF con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de GM-CSF.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de GM-CSF con una combinación de una glicosidasa y una sialidasa.
En una realización adicional, el procedimiento comprende:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de GM-CSF con una endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de GM-CSF.
Por tanto, el procedimiento comprende:
(f) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de GM-CSF con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de GM-CSF.
Adicionalmente, el procedimiento comprende:
(g) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de GM-CSF con una manosidasa en condiciones apropiadas para escindir un residuo de manosa del péptido de GM-CSF.
Además, el procedimiento comprende:
(h) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de GM-CSF con ST3 gal3 y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones adicionales preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de GM-CSF descrita anteriormente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, o, p, q, r, s, t, u y aa son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; bb, e, f, g, h y n son 1; y cc, v, w, x, y y z son 0. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, o, p, q, r, s, t, u y aa son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; bb, e, f, g, h y n son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y cc, v, w, x, y y zson 0. Alternativamente, cc, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, o, p, s, u, v, w, x, y y z son 0; y e, g, i, n, q, r, t y aa son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y bb es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, z y cc son 0; q, r, s, t, u, v, w, x, e y aa son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; bb es 1; y R es manosa u oligomanosa. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, o, q, r, s, t, u, aa y bb son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y n, p, v, w, x, y, z y cc son 0.
Adicionalmente está incluido un conjugado de péptido de GM-CSF formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención también incluye un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de interferón gamma y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de interferón gamma mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de interferón gamma un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que a, b, c, d, i, n, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 100; v, w, xe y son 0; R es un grupo modificador, manosa u oligomanosa; y R' es H o un residuo de glicosilo, un glicoconjugado, o un grupo modificador.
El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido de interferón gamma con un miembro seleccionado de una glicosiltransferasa y una galactosidasa que opera sintéticamente y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón gamma con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de interferón gamma.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
En una realización adicional, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón gamma con una combinación de una glicosidasa y una sialidasa.
El procedimiento también comprende:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón gamma con una endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de interferón gamma.
Adicionalmente, el procedimiento comprende:
(f) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón gamma con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de interferón gamma.
Por tanto, el procedimiento comprende:
(g) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de interferón gamma con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir galactosa al producto.
En otra realización, el procedimiento comprende:
5 (h) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
Realizaciones preferidas adicionales incluyen, con referencia a la fórmula del péptido de interferón gamma anterior, en la que a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, p, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h 10 son 1; y n, v, w, x e y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; p, q, e, f, g y h son 1; y n, v, w, x e y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y son 0; y e, g, i, q, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y p es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m y n son 0; q, r, s, t, u, v, w, x e y son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y p es 1; y R es manosa u oligomanosa. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u
15 son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g, h y p son 1; y n, v, w, x e y son 0.
Adicionalmente está incluido un conjugado de péptido de interferón gamma formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención incluye adicionalmente un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de inhibidor de alfa-1 proteasa (A-1-PI) y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al 20 péptido de A-1-PI mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de A-1-PI un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que a, b, c, d, i, n, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1;
25 e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 100; v, w, xe y son 0; R es un grupo modificador, manosa y oligomanosa; y R' es H o un residuo de glicosilo, un glicoconjugado, o un grupo modificador.
30 El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido de A-1-PI con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
35 (b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de A-1-PI con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de A-1-PI.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
40 El procedimiento también comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de A-1-PI con una combinación de una glicosidasa y una sialidasa.
Además, el procedimiento comprende:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de A-1-PI con una endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de A-1-PI.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
5 (f) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de A-1-PI con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de A-1-PI.
Adicionalmente, el procedimiento comprende:
(g) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de A-1-PI con una manosidasa en condiciones apropiadas para eliminar manosa del péptido de A-1-PI.
10 Además, el procedimiento comprende:
(h) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de A-1-PI con un miembro seleccionado de una manosidasa, una xilosidasa, una hexosaminidasa y combinaciones de las mismas en condiciones apropiadas para eliminar un residuo de glicosilo del péptido de A-1-PI.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
15 En otras realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de A-1-PI anterior, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y e, f, g y h son 1; y n, v, w, x e y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y n, v, w, xe y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l,m, n, s, u, v, w, xe y son 0; y e, g, i, q, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1. Alternativamente, n, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l y m son 0; q,
20 r, s, t, u, v, w, x e y son miembros independientemente seleccionados de 0 y l; y p es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, p y q son 0; r, s, t, u, v, w, x e y son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; p, v, w, x e y son 0; y n y q son 1.
También se proporciona un conjugado de péptido del inhibidor de alfa-1 proteasa formado por el procedimiento 25 anteriormente descrito.
También está incluido en la invención un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de betaglucosidasa y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de betaglucosidasa mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de beta-glucosidasa un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que
a, b, c, d, i, n, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1;
e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6;
j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 100; y 35 v, w, xe y son 0;
R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; y
R' es H o un residuo de glicosilo, un glicoconjugado, o un grupo modificador.
El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido de beta-glucosidasa con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo
40 modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de beta-glucosidasa con una sialidasa en condiciones
apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de beta-glucosidasa.
En otra realización, el procedimiento comprende además:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de beta-glucosidasa con una combinación de una glicosidasa y una sialidasa.
En una realización adicional, el procedimiento comprende:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de beta-glucosidasa con una endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de beta-glucosidasa.
Adicionalmente, el procedimiento comprende:
(f) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de beta-glucosidasa con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de beta-glucosidasa.
Además, el procedimiento comprende:
(g) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de beta-glucosidasa con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir galactosa al producto.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de beta-glucosidasa descrita anteriormente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; p, e, f, g y h son 1; y n, v, w, x e y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y n, v, w, x e y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y son 0; e, g, i, q, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y p es 1, o n, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, I y m son 0; q, r, s, t, u, v, w, x e y son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; p es 1; y R es manosa u oligomanosa.
La invención también incluye un conjugado de péptido de beta-glucosidasa formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención proporciona además un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido del activador tisular del plasminógeno (TPA) y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de TPA mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, teniendo el péptido de TPA que tiene una subunidad de glicosilo que comprende la fórmula:
en la que a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, v, w, x e y son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 0 y 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 0 y 100; R es un grupo modificador, manosa u oligomanosa; R' es H o un residuo de glicosilo, un glicoconjugado, o un grupo modificador; y R'' es un grupo glicosilo, un glicoconjugado o un grupo modificador. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido de TPA con un miembro seleccionado de una glicosiltransferasa y una glicosidasa que opera sintéticamente y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende además:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de TPA con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de TPA.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de TPA con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido de TPA.
En una realización adicional, el procedimiento comprende:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de TPA con una combinación de una glicosidasa y una sialidasa.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(f) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(g) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de TPA con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de TPA.
Además, el procedimiento comprende:
(h) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de TPA con una endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de TPA.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(i) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de TPA con un miembro seleccionado de una manosidasa, una xilosidasa, una hexosaminidasa y combinaciones de las mismas en condiciones apropiadas para eliminar un residuo de glicosilo del péptido de TPA.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de TPA descrita anteriormente, a, b, c, d son 1; e, f, g y h son miembros seleccionados de los números enteros entre 1 y 3; i, j, k, l, m, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y n, o, v, w, x e y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, I, m, n, o, s, u, v, w, x e y son 0; e, g, i, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y q y p son 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y n, o, v, w, x e y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g y p son 1; h es un miembro seleccionado de los números enteros entre 1 y 3; j, k, l, m, i, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y n, o, v, w, x e y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y son 0; e, g, i, q, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; o es 1; y R'' es xilosa. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, I, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son 1; y n, o, v, w, x e y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, x e y son 0; i y q son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y p es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, o, r, s, t, u, v, w, xe y son 0; i y q son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; p es 0; y n es 1.
También está incluido un conjugado de péptido de TPA formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención también proporciona un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de interleucina 2 (IL-2) y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de IL-2 mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de IL-2 un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que
a, b, c y e son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; d es 0; y R es un grupo modificador. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido de IL-2 con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que
5 comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende además:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de IL-2 con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de IL-2.
10 En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de IL-2 con una endo-N-acetilgalactosaminidasa que opera sintéticamente en condiciones apropiadas para añadir una GalNAc al péptido de IL-2.
En una realización adicional, el procedimiento comprende:
(d) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando 15 así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
Además, el procedimiento comprende:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de IL-2 con N-acetilgalactosaminatransferasa y un donante de GalNAc en condiciones apropiadas para transferir GalNAc al péptido de IL-2.
Además, el procedimiento comprende:
20 (f) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de IL-2 con galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir galactosa al péptido de IL-2.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de IL-2 descrita anteriormente, a y e son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y b, c y d son 0. Alternativamente, a, b, c, d y e son 0.
25 La invención incluye adicionalmente un conjugado de péptido de IL-2 formado por el procedimiento anteriormente descrito.
También está incluido en la invención un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido del factor VIII y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al glicopéptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el glicopéptido un residuo de glicosilo que tiene una fórmula que
30 es un miembro seleccionado de:
en la que
35 a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u, aa, cc y dd son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 20; v, w, x, y y zson 0; y R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; R' es un miembro seleccionado de H, un residuo de glicosilo, un grupo modificador y un glicoconjugado. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el glicopéptido con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que
comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo 5 modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del glicopéptido. En otra realización, el procedimiento comprende: 10 (c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en
condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto. En una realización adicional, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al glicopéptido.
15 Por tanto, el procedimiento comprende:
(e) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
Además, el procedimiento comprende:
(f)
antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de 20 GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al glicopéptido.
Además, el procedimiento comprende:
(g)
antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del glicopéptido. El procedimiento también comprende: 25 (h) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con ST3 gal3 y un donante de ácido siálico en
condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto. Además, el procedimiento comprende:
(i) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una manosidasa en condiciones apropiadas para eliminar manosa del glicopéptido.
30 El grupo modificador es un miembro poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido del factor VIII descrita anteriormente, e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 1 y 4; a, b, c, d, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t, u, aa y cc son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y v, w, x, y, z y dd son 0.
También se proporciona un conjugado de péptido del factor VIII formado por el procedimiento anteriormente 35 descrito.
Adicionalmente se proporciona en la invención un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de fusión de receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) alfa/IgG y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al glicopéptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el glicopéptido un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t, u, w, ww y z son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 4; n, v, xe y son 0; R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; y R' es un miembro seleccionado de H, un residuo de glicosilo, un grupo modificador y un glicoconjugado. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el glicopéptido con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al glicopéptido.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del glicopéptido.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de fusión de receptor de TNF alfa/IgG presentada anteriormente, a, c, i, j, y l son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, g, q, r, t y z son 1; y b, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y son 0. Alternativamente, e, g, i, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, xe y son 0; y q y z son 1.
También se proporciona un conjugado de péptido de fusión de receptor de TNF alfa/IgG formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención también incluye un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de urocinasa y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de urocinasa mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de urocinasa un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que a, b, c, d, i, n, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 100; v, w, xe y son 0; R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; y R' es H o un residuo de glicosilo, un glicoconjugado, o un grupo modificador.
El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido de urocinasa con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
5 En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de urocinasa con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de urocinasa.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en 10 condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de urocinasa con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido de urocinasa.
En otra realización, el procedimiento comprende:
15 (e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de urocinasa con una combinación de una glicosidasa y una sialidasa.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(f) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
20 Adicionalmente, el procedimiento comprende:
(g) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de urocinasa con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de urocinasa.
Además, el procedimiento comprende:
(h) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de urocinasa con una endoglicanasa en condiciones 25 apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de urocinasa.
El grupo modificador es un miembro de poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de urocinasa descrita anteriormente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son 1; v, w, x e y son 0; y p es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente 30 seleccionados de 0 y 1; n, v, w, xe yson 0; y p es 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, xe yson 0; y e, g, i, q, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y p es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, x eyson 0; i es 0ó 1; y q y p son 1. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h están seleccionados independientemente de 0, 1 ,2, 3 y 4; y n, v, w, xe y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, o, r, s, t, u, v, w, xe y son 0; q es
35 1; y n es 0ó 1.
También se proporciona un conjugado de péptido de urocinasa formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención también incluye un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de anticuerpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al glicopéptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el glicopéptido un residuo de
40 glicosilo que tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de: y
en la que a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, z, aa, bb, cc y ee son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1;
5 e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 0 y 4; n, v, w, x, ey ddson 0; R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; y R' es un miembro seleccionado de H, un residuo de glicosilo, un grupo modificador y un glicoconjugado. El procedimiento comprende:
10 (a) poner en contacto el glicopéptido con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una sialidasa en condiciones apropiadas para 15 eliminar ácido siálico del glicopéptido.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
20 (d) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una galactosidasa que opera sintéticamente en condiciones apropiadas para añadir una galactosa al glicopéptido.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al glicopéptido.
25 Además, el procedimiento comprende:
(f) poner en contacto el producto de la etapa (e) con ST3 gal3 y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
Además, el procedimiento comprende:
(g) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando 30 así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
Por tanto, el procedimiento comprende:
(h) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al glicopéptido.
Además, el procedimiento comprende:
35 (i) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del glicopéptido.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de anticuerpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa descrita anteriormente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m r, s, t y u son miembros independientemente 40 seleccionados de 0 y 1; n, v, w, x e y son 0; y z es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, s, t, u, v, w, x e y son 0; i y r son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y z es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m y n son 0; r, s, t, u, v, w, x e y son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y z es 1. Alternativamente, aa, bb, cc y ee son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y dd es 0. Alternativamente, aa y ee son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y bb, cc y dd son 0.
45 Alternativamente, aa, bb, cc, dd y ee son 0.
También se proporciona un conjugado de péptido de anticuerpo monoclonal anti-glicoproteína IIb/IIIa formado por el procedimiento anteriormente descrito.
Se proporciona adicionalmente en la invención un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de anticuerpo quimérico anti-HER2 y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de anticuerpo quimérico anti-HER2 mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de anticuerpo quimérico anti-HER2 un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que a, b, c, d, i, j, k, l, q, r, s, t, u y z son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 4; n, v, w, x e y son 0; m es 0-20; R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; y R' es un miembro seleccionado de hidrógeno y un residuo de glicosilo, y un grupo modificador, el procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido de anticuerpo quimérico anti-HER2 con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de anticuerpo quimérico anti-HER2 con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido de anticuerpo quimérico anti-HER2.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de anticuerpo quimérico anti-HER2 con endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de anticuerpo quimérico anti-HER2.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de anticuerpo anti-HER2 descrita anteriormente, a, c, y i son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, g, r y t son 1; b, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y son 0; y q y z son 1. Alternativamente, i es 0 ó 1; q y z son 1 ; y a, b, c, d, e, f, g, h, j , k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, xe y son 0. Alternativamente, e, g, i, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x ey son 0; y q y z son 1.
También se proporciona un conjugado de péptido de anticuerpo anti-HER2 formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención proporciona además procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido F de anti-VRS y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido F anti-VRS mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido F anti-VRS un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que a, b, c, d, i, j, k, l, m, p, q, r, s, t, u y z son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros de 0 a 4;
5 n, v, w, xe yson 0; R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; y R' es un miembro seleccionado de H y un residuo de glicosilo, un glicoconjugado y un grupo modificador. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido F anti-VRS con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado,
10 que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido F anti-VRS con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido F anti-VRS.
15 En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) antes de la etapa (b), poner en contacto el péptido F anti-VRS con endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido F anti-VRS.
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido F anti-VRS presentada anteriormente, a, c, e, g y i son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; r y t son 1; b, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y son 0;
20 y z es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, r, s, t, u, v, w, x, y son 0; i y p están seleccionados independientemente de 0 ó 1; q y z son 1; y n es 0. Alternativamente, e, g, i, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; a, b, c, d, f, h, j, k, I, m, n, s, u, v, w, xe y son 0; y q y z son 1.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
También se proporciona un conjugado de péptido F anti-VRS formado por el procedimiento anteriormente descrito.
25 También está incluido en la invención un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido del anticuerpo anti-CD20 y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido del anticuerpo anti-CD20 mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, teniendo el péptido del anticuerpo anti-CD20 una subunidad de glicosilo que comprende la fórmula:
30 en la que a, b, c, d, i, j, k, l, m q, r, s, t, u y z son números enteros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h están seleccionados independientemente de los números enteros de 0 a 4; n, v, w, x e y son 0; R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; y
35 R' es un miembro seleccionado de H, un residuo de glicosilo, un glicoconjugado o un grupo modificador. El procedimiento comprende: (a) poner en contacto el péptido del anticuerpo anti-CD20 con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
5 En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido del anticuerpo anti-CD20 con una galactosiltransferasa y un donante de galactosilo en condiciones apropiadas para la transferencia del donante de galactosilo al péptido del anticuerpo anti-CD20.
En otra realización, el procedimiento comprende:
10 (c) antes de la etapa (b), poner en contacto el péptido del anticuerpo anti-CD20 con endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido del anticuerpo anti-CD20.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido del anticuerpo anti-CD20 con una manosidasa en condiciones apropiadas para eliminar manosa del péptido del anticuerpo anti-CD20.
15 El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En otro aspecto, la glicosiltransferasa es galactosiltransferasa y el donante de glicosilo modificado es un donante de galactosilo modificado.
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido anti-CD20 presentada anteriormente, a, c, e, g y i son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; r, t, q y z son 1; y b, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x e y 20 son 0. Alternativamente, a, c, e, g, i, q, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; b, d, f, h, j, k, l, m, s, u, v, w, x, y son 0; y z es 1. Alternativamente, e, g, i, q, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, xey son 0; y z es 1. Alternativamente, i es0 ó 1; q y z son 1; y a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, x e y son 0. Alternativamente, e, g, i, r, t, v, x y z son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; a, b, c, d, f, h, j, k, I, m, n, s, u, w e y son 0; y z es 1. Alternativamente,
25 a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, r, s, t, u, v, w, xe y son 0; n y q son 1;y ies 0ó 1.
También está incluido un conjugado de péptido del anticuerpo anti-CD20 formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención proporciona adicionalmente un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de ADNasa recombinante y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido 30 de ADNasa recombinante mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido de ADNasa recombinante un residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que a, b, c, d, i, n, p q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1;
35 e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6; j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 100; v, w, x e y son 0; y R es un miembro seleccionado de polímero, un glicoconjugado, una manosa, una oligomanosa y un grupo modificador. El procedimiento comprende:
40 (a) poner en contacto el péptido de ADNasa recombinante con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende: (b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de ADNasa recombinante con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de ADNasa recombinante.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en 5 condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
En una realización adicional, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de ADNasa recombinante con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido de ADNasa recombinante.
10 En todavía otra realización más, el procedimiento comprende:
(e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de ADNasa recombinante con una combinación de una glicosidasa y una sialidasa.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(f) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando 15 así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
El procedimiento también comprende:
(g) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de ADNasa recombinante con Nacetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de ADNasa recombinante.
20 Además, el procedimiento comprende:
(h) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de ADNasa recombinante con una endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido de ADNasa recombinante.
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de ADNasa presentada anteriormente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g, h y p son 1; y n, v, w, x e y
25 son 0. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; p es 1; y n, v, w, xe y son 0. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, s, u, v, w, xe y son 0; y e, g, i, q, r y t son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y p es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, r, s, t, u, v, w, xe y son 0; i es 0ó 1; y p es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l y m son 0; i, q, r, s, t, u, v, x e y están seleccionados independientemente de 0 ó 1; p es 1; y R es manosa u oligomanosa.
30 También se proporciona un conjugado de péptido de ADNasa recombinante formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención incluye adicionalmente un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido anti-factor de necrosis tumoral (TNF) alfa y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido anti-TNF alfa mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el péptido anti-TNF alfa un
35 residuo de glicosilo que tiene la fórmula:
en la que
a, b, c, d, i, n, o, p, q, r, s, t, u y z son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1;
e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6; 40 j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 20;
n, v, w, x e y son 0; y
R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; R' es un glicoconjugado o un grupo modificador. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el péptido anti-TNF alfa con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
5 En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido anti-TNF alfa con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido anti-TNF alfa.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido anti-TNF alfa con endoglicanasa en condiciones 10 apropiadas para escindir un resto glicosilo del péptido anti-TNF alfa.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido anti-TNF alfa presentada anteriormente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, o, p, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; n es 1; y v, w, x, y y z son 0. Alternativamente, a, c, e, g y i son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; r y t son 1; b,
15 d, f, h, j, k, l, m, n, s, u, v, w, x ey; y q y z son 1.
También está incluido un conjugado de péptido anti-TNF alfa formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención también proporciona un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de insulina y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al glicopéptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el glicopéptido un residuo de glicosilo que tiene una fórmula que es un
20 miembro seleccionado de:
en las que
25 a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, z, aa, bb, cc y ee son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados del número entero entre 0 y 4; dd, n, v, w, xey son 0; R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; y R' es un miembro seleccionado de H, un residuo de glicosilo, un grupo modificador y un glicoconjugado. El
30 procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el glicopéptido con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En una realización, el procedimiento comprende:
35 (b) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del glicopéptido.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
40 En otra realización más, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con N-acetilglucosaminatransferasa y un donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al glicopéptido.
En otra realización, el procedimiento comprende:
5 (e) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del glicopéptido.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de insulina presentada anteriormente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; n, v, w, x e y son 0; y z es
10 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, s, t, u, v, w, x e y son 0; i y r son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y z es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m y n son 0; r, s, t, u, v, w, x e y son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y z es 1. Alternativamente, aa, bb, cc y ee son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y dd es 0. Alternativamente, aa y ee son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y bb, cc y dd son 0. Alternativamente, aa, bb, cc, dd y ee son 0.
15 La invención incluye adicionalmente un conjugado de péptido de insulina formado por el procedimiento anteriormente descrito.
Además, en la invención se proporciona un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al péptido de HBsAg mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el
20 péptido de HBsAg un residuo de glicosilo que tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de:
en las que
25 aa, bb, a, b, c, d, i, n, q, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 6; o, p, j, k, l y m son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 100; cc, v, w, xey son 0; R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; y
30 R' es H o un residuo de glicosilo, un glicoconjugado, o un grupo modificador.
El procedimiento comprende :
(a) poner en contacto el péptido de HBsAg con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
35 En una realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de HBsAg con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del péptido de HBsAg.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en 40 condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(d) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de HBsAg con una galactosidasa en condiciones apropiadas para escindir un residuo de glicosilo del péptido de HBsAg.
El procedimiento también comprende:
5 (e) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de HBsAg con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al péptido de HBsAg.
Además, el procedimiento comprende:
(f) poner en contacto el producto de la etapa (d) con ST3 gal3 y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
10 Por tanto, el procedimiento comprende:
(g) poner en contacto el producto de la etapa (a) con un resto que reacciona con el grupo modificador, formando así un conjugado entre el grupo de enlace de glicosilo intacto y el resto.
Por tanto, el procedimiento comprende:
(h) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de HBsAg con N-acetilglucosaminatransferasa y un 15 donante de GlcNAc en condiciones apropiadas para transferir GlcNAc al péptido de HBsAg.
Además, el procedimiento comprende:
(i) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de HBsAg con una manosidasa en condiciones apropiadas para escindir manosa del péptido de HBsAg.
Por tanto, el procedimiento comprende:
20 (j) antes de la etapa (a), poner en contacto el péptido de HBsAg con endoglicanasa en condiciones suficientes para escindir un grupo glicosilo del péptido de HBsAg.
El grupo modificador es un poli(etilenglicol).
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de HBsAg presentada anteriormente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, o, p, q, r, s, t, u y aa son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; bb, e, f, g, h y n son 1; y 25 cc, v, w, x, y y z son 0. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t, u y aa son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h están seleccionados independientemente de 0, 1, 2, 3 ó 4; cc, v, w, x, y y zson 0; y bb es1. Alternativamente, cc, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, v, w, x, y y zson 0; y q, r, s, t, u, v, w, x, e y aa son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y bb es 1. Alternativamente, a, b, c, d, i, j, k, l, m, o, q, r, s, t, u y aa son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; bb, e, f, g, h y n son 1; y n,
30 p cc, v, w, x, y y zson 0. Alternativamente, bb, a, b, c, d, e, f, g, h, i,j, k, l,m, o, p, q, r, s, t,u, v, w, x, y y zson miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; cc es 1; y n es 0 ó 1. Alternativamente, a, b, c, d, f, h, j, k, l, m, o, p, s, u, v, w, x, y, z y cc son 0; bb es 1; e, g, i, n, q, r, t y aa son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, I, m, n, o, p, z y cc son 0; q, r, s, t, u, v, w, x, e y aa son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y bb es 1.
35 También está incluido un conjugado de péptido de HBsAg formado por el procedimiento anteriormente descrito.
La invención proporciona además un procedimiento de formación de un conjugado entre un péptido de la hormona de crecimiento humana (HGH) y un grupo modificador, en el que el grupo modificador está covalentemente unido al glicopéptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto, comprendiendo el glicopéptido un residuo de glicosilo que tiene una fórmula que es un miembro seleccionado de:
y
en las que a, b, c, d, i, j, k, l, m, r, s, t, u, z, aa, bb, cc y ee son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; e, f, g y h son miembros independientemente seleccionados de los números enteros entre 0 y 4;
5 n, v, w, x,eyddson 0; R es un grupo modificador, una manosa o una oligomanosa; y R' es un miembro seleccionado de H, un residuo de glicosilo, un grupo modificador y un glicoconjugado. El procedimiento comprende:
(a) poner en contacto el glicopéptido con una glicosiltransferasa y un donante de glicosilo modificado, que
10 comprende un resto glicosilo que es un sustrato para la glicosiltransferasa covalentemente unido al grupo modificador, en condiciones apropiadas para la formación del grupo de enlace de glicosilo intacto.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(b) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una sialidasa en condiciones apropiadas para eliminar ácido siálico del glicopéptido.
15 En una realización, el procedimiento comprende:
(c) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con endoglicanasa en condiciones apropiadas para escindir un resto glicosilo del glicopéptido.
En otra realización, el procedimiento comprende:
(c) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una galactosiltransferasa y un donante de 20 galactosa en condiciones apropiadas para transferir la galactosa al glicopéptido.
En otra realización más, el procedimiento comprende:
(d) poner en contacto el producto de la etapa (a) con una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico en condiciones apropiadas para transferir ácido siálico al producto.
En otra realización, el procedimiento comprende:
25 (d) antes de la etapa (a), poner en contacto el glicopéptido con una galactosidasa en condiciones apropiadas para escindir un residuo de glicosilo del glicopéptido.
En realizaciones preferidas y con referencia a la fórmula del péptido de HGH presentada anteriormente, a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m, r, s, t y u son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; n, v, w, x e y son 0; y z es 1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, j, k, l, m, n, s, t, u, v, w, x e y son 0; i y r son miembros independientemente
30 seleccionados de 0 y 1; y z es1. Alternativamente, a, b, c, d, e, f, g, h, i,j, k, l, my n son 0; r, s, t, u, v,w, xey son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y z es 1. Alternativamente, aa y ee son miembros independientemente seleccionados de 0 y 1; y bb, cc y dd son 0. Alternativamente, aa, bb, cc, dd y ee son 0. Alternativamente, aa, bb, cc, dd, ee y n son 0.
También está incluido un conjugado de péptido de HGH formado por el procedimiento anteriormente descrito.
35 Breve descripción de los dibujos
Con el fin de que ilustrar la invención, en los dibujos se representan ciertas realizaciones de la invención. Sin embargo, la invención no se limita a las disposiciones y medios precisos de las realizaciones representadas en los dibujos.
La Figura 1, que comprende Figura 1A a Figura 1Z y Figura 1AA a Figura 1CC, es una lista de péptidos útiles en
40 los procedimientos de la invención. La Figura 2 es un esquema que representa un glicano de núcleo de trimanosilo (lado izquierdo) y el procedimiento enzimático para la generación de un glicano que tiene una GlcNAc bisectriz (lado derecho). La Figura 3 es un esquema que representa una estructura de núcleo de trimanosilo elemental y cadenas complejas en diversos grados de terminación. Se muestra la generación enzimática in vitro de una estructura de
45 núcleo de trimanosilo elemental de una estructura de glicano de hidrato de carbono compleja que no contiene un residuo de GlcNAc bisectriz, ya que es la generación de una estructura de glicano a partir de la misma que contiene una GlcNAc bisectriz. Símbolos: cuadrados: GlcNAc; círculos claros: Man; círculos oscuros: Gal; triángulos: NeuAc. La Figura 4 es un esquema para la generación enzimática de una estructura de glicano sialilada (lado derecho)
que empieza con un glicano que tiene un núcleo de trimanosilo y una GlcNAc bisectriz (lado izquierdo). La Figura 5 es un esquema de una estructura de glicano que contiene alta manosa típica (lado izquierdo) y el proceso enzimático para la reducción de esta estructura a una estructura de núcleo de trimanosilo elemental. La Figura 6 es un diagrama de una estructura de glicano ligado en N que contiene fucosa y xilosa normalmente producida en células vegetales. La Figura 7 es un diagrama de una estructura de glicano ligado en N que contiene fucosa normalmente producida en células de insecto. La Figura 8 es un esquema que representa una variedad de rutas para el recorte de una estructura de alta manosa y la síntesis de cadenas de azúcar complejas de la misma. Símbolos: cuadrados: GlcNAc; círculos: Man; diamantes: fucosa; pentágono: xilosa. La Figura 9 es un esquema que representa estrategias in vitro para la síntesis de estructuras complejas a partir de una estructura de núcleo de trimanosilo elemental. Símbolos: cuadrados oscuros: GlcNAc; círculos claros: Man; círculos oscuros: Gal; triángulos oscuros: NeuAc; GnT: N-acetilglucosaminiltransferasa; GalT: galactosiltransferasa; ST: sialiltransferasa. La Figura 10 es un esquema que representa diversas estructuras complejas que pueden sintetizarse a partir de una estructura de núcleo de trimanosilo elemental. Símbolos: cuadrados oscuros: GlcNAc; círculos claros: Man; círculos oscuros: Gal; triángulos oscuros: NeuAc; diamantes: fucosa; FT y FucT: fucosiltransferasa; GalT: galactosiltransferasa; ST: sialiltransferasa; Le: antígeno de Lewis; SLe: antígeno de Lewis sialilado. La Figura 11 es un esquema a modo de ejemplo para preparar glicopéptidos ligados en O que se originan con serina o treonina. La Figura 12 es una serie de diagramas que representa los cuatro tipos de estructura de O-glicano, llamados núcleos 1 a 4. La estructura de núcleo se esboza en líneas de puntos. La Figura 13, que comprende Figura 13A y Figura 13B, es una serie de esquemas que muestran una realización a modo de ejemplo de la invención en la que residuos de hidrato de carbono que comprenden estructuras de hidratos de carbono complejas y/o estructuras de alta manosa son recortados a la estructura biantenaria de la primera generación. Un azúcar modificado que lleva un polímero soluble en agua (WSP) se conjuga entonces con uno o más de los residuos de azúcar expuestos por el procedimiento de recorte. La Figura 14 es un esquema similar al mostrado en la Figura 2, en el que una estructura de alta manosa se “recorta” a la manosa de la que se bifurca la estructura biantenaria y un azúcar modificado que lleva un polímero soluble en agua se conjuga entonces con uno o más de los residuos de azúcar expuestos por el procedimiento de recorte. La Figura 15 es un esquema similar al mostrado en la Figura 2, en el que alta manosa se recorta a la GlcNAc a la que está unida la primera manosa, y un azúcar modificado que lleva un polímero soluble en agua se conjuga entonces con uno o más de los residuos de azúcar expuestos por el procedimiento de recorte. La Figura 16 es un esquema similar al mostrado en la Figura 2, en el que alta manosa se recorta a la primera GlcNAc unida a la Asn del péptido, tras lo cual un polímero soluble en agua se conjuga con uno o más residuos de azúcar que se han añadido posteriormente. La Figura 17, que comprende la Figura 17A y 17B, es un esquema en el que un hidrato de carbono ligado en N se recorta y posteriormente se derivatiza con un resto de azúcar modificado (GlcNAc) que lleva un polímero soluble en agua. La Figura 18, que comprende la Figura 18A y 18B, es un esquema en el que un hidrato de carbono ligado en N se recorta y posteriormente se derivatiza con un resto de ácido siálico que lleva un polímero soluble en agua. La Figura 19 es un esquema en el que un hidrato de carbono ligado en N se recorta y posteriormente se derivatiza con uno o más restos de ácido siálico, y se termina con un ácido siálico derivatizado con un polímero soluble en agua. La Figura 20 es un esquema en el que un sacárido ligado en O se “recorta” y posteriormente se conjuga con un azúcar modificado que lleva un polímero soluble en agua. En el esquema a modo de ejemplo, el resto de hidrato de carbono se “recorta” a la primera generación de la estructura biantenaria. La Figura 21 es un esquema a modo de ejemplo para recortar el resto de hidrato de carbono de un glicopéptido ligado en O para producir una manosa disponible para conjugación con un azúcar modificado que tiene un polímero soluble en agua unido al mismo. La Figura 22, que comprende Figura 22A a Figura 22C, es una serie de esquemas a modo de ejemplo. La Figura 22A es un esquema que ilustra la adición de un azúcar PEGilado, seguido de la adición de un azúcar no modificado. La Figura 22B es un esquema que ilustra la adición de más que un tipo de azúcar modificado sobre un glicano. La Figura 22C es un esquema que ilustra la adición de diferentes azúcares modificados sobre glicanos ligados en O y glicanos ligados en N. La Figura 23 es un diagrama de diversos procedimientos de mejora de la función terapéutica de un péptido por remodelación de glicanos, que incluye conjugación. La Figura 24 es un conjunto de esquemas para la remodelación de glicanos de un péptido terapéutico para tratar enfermedad de Gaucher. La Figura 25 es un esquema para la remodelación de glicanos para generar glicanos que tienen un resto manosa-6-fosfato terminal. La Figura 26 es un diagrama que ilustra las estructuras de la matriz de glicano encontradas en glucocerebrosidasa producida por CHO (Cerezyme™) después de la sialilación. La Figura 27, que comprende las Figuras 27A a 27G, proporciona esquemas a modo de ejemplo para la remodelación de estructuras de glicano sobre factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). La Figura 27A es un diagrama que representa el péptido de G-CSF que indica el residuo de aminoácido al que se une un glicano, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 27B a 27G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 27A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada.
5 La Figura 28, que comprende las Figuras 28A a 28AA, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre interferón-alfa. La Figura 28A es un diagrama que representa el péptido de la isoforma 14c de interferón-alfa que indica el residuo de aminoácido al que se une un glicano, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 28B a 28D son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 28A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 28E es un diagrama que representa el péptido de la isoforma 14c de interferón-alfa que indica el residuo de aminoácido al que se une un glicano, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 28F a 28N son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 28E basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 28O es un diagrama que
15 representa los péptidos de la isoforma 2a o 2b de interferón-alfa que indican el residuo de aminoácido al que se une un glicano, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 28P a 28W son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 28O basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 28X es un diagrama que representa los péptidos de fusión de interferón-alfa-mucina que indica el (los) residuo(s) que se une(n) a glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al (a los) mismo(s). La Figura 28Y a 28AA son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano de los péptidos en la Figura 28X basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 28BB es un diagrama que representa los péptidos de fusión de interferón-alfa-mucina y péptidos de interferón-alfa que indica el (los) residuo(s) que se unen a glicanos
25 contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. La Figura 28CC a 28EE son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano de los péptidos en la Figura 28BB basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 29, que comprende las Figuras 29A a 29S, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre interferón-beta. La Figura 29A es un diagrama que representa el péptido de interferón-beta que indica el residuo de aminoácido al que se une un glicano, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 29B a 29O son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 29A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 29P es un diagrama que representa el péptido de interferón-beta que indica el residuo de aminoácido al que se une un glicano, y una fórmula de glicano a modo
35 de ejemplo unida al mismo. La Figura 29Q a 29S son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 29P basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 30, que comprende las Figuras 30A a 30D, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre factor VII y factor VIIa. La Figura 30A es un diagrama que representa los péptidos de factor VII y factor VIIa A (línea continua) y B (línea discontinua) que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y las fórmulas para los glicanos. La Figura 30B a 30D son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 30A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 31, que comprende las Figuras 31A a 31G, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar
45 estructuras de glicano sobre factor IX. La Figura 31A es un diagrama que representa el péptido del factor IX que indica residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas de los glicanos. La Figura 31B a 31G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 31A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 32, que comprende las Figuras 32A a 32J, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre hormona estimulante del folículo (FSH), que comprende las subunidades ! y ∀. La Figura 32A es un diagrama que representa los péptidos de la hormona estimulante del folículo FSH! y FSH∀ que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas a los mismos. La Figura 32B a 32J son diagramas de etapas de remodelación
55 contempladas del glicano de los péptidos en la Figura 32A basándose en el tipo de célula en la que se expresan los péptidos y las estructuras de glicano remodeladas deseadas. La Figura 33, que comprende las Figuras 33A a 33J, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre eritropoyetina (EPO). La Figura 33A es un diagrama que representa el péptido de EPO que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. La Figura 33B a 33J son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 33A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 34, que comprende las Figuras 34A a 34K, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF). La Figura
65 34A es un diagrama que representa el péptido de GM-CSF que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. La Figura 34B a 34G son diagramas de etapas
de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 34A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 34H es un diagrama que representa el péptido de GM-CSF que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. La Figura 34I a 34K son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 34H basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 35, que comprende las Figuras 35A a 35N, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre interferón-gamma. La Figura 35A es un diagrama que representa un péptido de interferón-gamma que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 35B a 35G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 35A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 35H es un diagrama que representa un péptido de interferón-gamma que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 35I a 35N son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 35H basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 36, que comprende las Figuras 36A a 36O, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre !1-antitripsina (ATT, o inhibidor de !-1 proteasa). La Figura 36A es un diagrama que representa un péptido de AAT que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 36B a 36G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 36A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 36H es un diagrama que representa un péptido de AAT que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 36I a 36K son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 36H basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 36L es un diagrama que representa un péptido de AAT que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 36M a 36O son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 36L basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 37, que comprende las Figuras 37A a 37K, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre glucocerebrosidasa. La Figura 37A es un diagrama que representa el péptido de glucocerebrosidasa que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 37B a 37G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 37A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 37H es un diagrama que representa el péptido de glucocerebrosidasa que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 37I a 37K son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 37H basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 38, que comprende las Figuras 38A a 38W, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre activador de plasminógeno de tipo tejido (TPA). La Figura 38A es un diagrama que representa el péptido de TPA que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. La Figura 38B a 38G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 38A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 38H es un diagrama que representa el péptido de TPA que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. La Figura 38I a 38K son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 38H basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 38L es un diagrama que representa un péptido de TPA mutante que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y la fórmula para los glicanos. La Figura 38M a 38O son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 38L basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 38P es un diagrama que representa un péptido de TPA mutante que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. La Figura 38Q a 38S son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 38P basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 38T es un diagrama que representa un péptido de TPA mutante que indica los residuos que se unen a glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. La Figura 38U a 38W son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 38T basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 39, que comprende las Figuras 39A a 39G, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre interleucina-2 (IL-2). La Figura 39A es un diagrama que representa el péptido de interleucina-2 que indica el residuo de aminoácido al que se une un glicano, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 39B a 39G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 39A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la
estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 40, que comprende las Figuras 40A a 40N, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre factor VIII. La Figura 40A son las fórmulas para los glicanos que se unen a los sitios de glicosilación ligados en N (A y A') y a los sitios ligados en O (B) de péptidos del factor VIII. La Figura 40B a 40F son diagramas de etapas de remodelación contempladas de los péptidos en la Figura 40A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 40G son las fórmulas para los glicanos que se unen a los sitios de glicosilación ligados en N (A y A') y a los sitios ligados en O (B) de péptidos del factor VIII. La Figura 40H a 40M son diagramas de etapas de remodelación contempladas de los péptidos en la Figura 40G basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y las estructuras de glicano remodeladas deseadas. La Figura 41, que comprende las Figuras 41A a 41M, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre urocinasa. La Figura 41A es un diagrama que representa el péptido de urocinasa que indica un residuo que se une a un glicano contemplado para la remodelación, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 41 B a 41G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 41A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 41H es un diagrama que representa el péptido de urocinasa que indica un residuo que se une a un glicano contemplado para la remodelación, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 41I a 41M son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 41H basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 42, que comprende las Figuras 42A a 42K, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre ADNasa humana (ADNasah). La Figura 42A es un diagrama que representa el péptido de ADNasa humana que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 42B a 42G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 42A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 42H es un diagrama que representa el péptido de ADNasa humana que indica residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 42I a 42K son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 42H basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 43, que comprende las Figuras 43A a 43L, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre insulina. La Figura 43A es un diagrama que representa el péptido de insulina mutado para contener un sitio de N-glicosilación y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 43B a 43D son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura INS A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 43E es un diagrama que representa péptidos de fusión de insulina-mucina que indica un residuo(s) que se une(n) a un glicano contemplado para la remodelación, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida a los mismos. La Figura 43F a 43H son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 43E basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 43I es un diagrama que representa los péptidos de fusión de insulina-mucina y péptidos de insulina que indica un residuo(s) que se une(n) a un glicano contemplado para la remodelación y fórmulas para el glicano. La Figura 43J a 43L son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 43I basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 44, que comprende las Figuras 44A a 44K, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre el antígeno M (preS y S) de la proteína de superficie de la hepatitis B (HBsAg). La Figura 44A es un diagrama que representa el péptido del antígeno M que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. La Figura 44B a 44G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 44A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 44H es un diagrama que representa el péptido del antígeno M que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. La Figura 44I a 44K son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 44H basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 45, que comprende las Figuras 45A a 45K, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre hormona de crecimiento humana, que incluye N, V y variantes de las mismas. La Figura 45A es un diagrama que representa el péptido de la hormona de crecimiento humana que indica un residuo que se une a un glicano contemplado para la remodelación, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 45B a 45D son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano del péptido en la Figura 45A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 45E es un diagrama que representa los tres péptidos de fusión que comprenden el péptido de la hormona de crecimiento humana y parte o todo un péptido de mucina y que indica un residuo(s) que se une(n) a un glicano contemplado para la remodelación, y a modo de ejemplo fórmula(s) de glicanos unida(s) a los mismos. La Figura 45F a 45K son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano de los péptidos en la Figura 45E basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada.
La Figura 46, que comprende las Figuras 46A a 46G, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre una proteína de fusión de receptor de TNF-región Fc de IgG (Enbrel™). La Figura 46A es un diagrama que representa un péptido de fusión de receptor de TNF-región Fc de IgG que puede mutarse para contener sitios de N-glicosilación adicionales que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación y fórmulas para los glicanos. El péptido de receptor de TNF se representa en línea gruesa, y las regiones Fc de IgG se representan en línea normal. La Figura 46B a 46G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 46A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 47 proporciona a modo de ejemplo esquemas para remodelar estructuras de glicano sobre un anticuerpo monoclonal anti-HER2 (Herceptin™). La Figura 47A es un diagrama que representa un anticuerpo monoclonal anti-HER2 que ha sido mutado para contener un sitio(S) de N-glicosilación que indica un residuo(s) sobre la cadena pesada del anticuerpo que se une(n) a un glicano contemplado para la remodelación, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 47B a 47D son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano de los péptidos en la Figura 47A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 48, que comprende las Figuras 48A a 48D, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre un anticuerpo monoclonal para la proteína F del virus respiratorio sincitial (Synagis™). La Figura 48A es un diagrama que representa un anticuerpo monoclonal para el péptido de la proteína F que está mutado para contener un sitio(s) de N-glicosilación(s) que indica un residuo(s) que se une(n) a un glicano contemplado para la remodelación, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 48B a 48D son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 48A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 49, que comprende las Figuras 49A a 49D, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre un anticuerpo monoclonal para TNF-! (Remicade™). La Figura 49A es un diagrama que representa un anticuerpo monoclonal para TNF-! que ha sido mutado para contener un sitio(s) de N-glicosilación que indica un residuo que se une a un glicano contemplado para la remodelación, y una fórmula de glicano a modo de ejemplo unida al mismo. La Figura 49B a 49D son diagramas de etapas de remodelación contempladas del péptido en la Figura 49A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 50, que comprende las Figuras 50A a 50D, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre un anticuerpo monoclonal para la glicoproteína IIb/IIIa (Reopro™). La Figura 50A es un diagrama que representa un anticuerpo monoclonal mutante para péptidos de la glicoproteína IIb/IIIa que han sido mutados para contener un sitio(s) de N-glicosilación que indica el (los) residuo(s) que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 50B a 50D son diagramas de etapas de remodelación contempladas basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 50E es un diagrama que representa anticuerpo monoclonal para péptidos de fusión de la glicoproteína IIb/IIIa-mucina que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas a los mismos. La Figura 50F a 50H son diagramas de etapas de remodelación contempladas basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 50I es un diagrama que representa anticuerpo monoclonal para péptidos de fusión de la glicoproteína IIb/IIIa-mucina y anticuerpo monoclonal para péptidos de la glicoproteína IIb/IIIa que indica los residuos que se unen a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas a los mismos. La Figura 50J a 50L son diagramas de etapas de remodelación contempladas basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 51, que comprende las Figuras 51A a 51D, expone esquemas a modo de ejemplo para remodelar estructuras de glicano sobre un anticuerpo monoclonal para CD20 (Rituxan™). La Figura 51A es un diagrama que representa anticuerpo monoclonal para CD20 que ha sido mutado para contener un sitio(s) de Nglicosilación que indica el residuo que se une a glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 51B a 51D son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano de los péptidos en la Figura 51A basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 51 E es un diagrama que representa anticuerpo monoclonal para CD20 que ha sido mutado para contener un sitio(s) de N-glicosilación que indica el (los) residuo(s) que se une(n) a los glicanos contemplados para la remodelación, y fórmulas de glicano a modo de ejemplo unidas al mismo. La Figura 51F a 51G son diagramas de etapas de remodelación contempladas del glicano de los péptidos en la Figura 51E basándose en el tipo de célula en la que se expresa el péptido y la estructura de glicano remodelada deseada. La Figura 52, que comprende las Figuras 51A y 51B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) (SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente). La Figura 53, que comprende las Figuras 53A y 53B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de interferón alfa (IFN-alfa) (SEC ID Nº: 3 y 4, respectivamente). La Figura 54, que comprende las Figuras 54A y 54B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de interferón beta (IFN-beta) (SEC ID Nº: 5 y 6, respectivamente). La Figura 55, que comprende las Figuras 55A y 55B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos
correspondiente a modo de ejemplo del factor VIIa (SEC ID Nº: 7 y 8, respectivamente). La Figura 56, que comprende las Figuras 56A y 56B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo del factor IX (SEC ID Nº: 9 y 10, respectivamente). La Figura 57, que comprende las Figuras 57A mediante 57D, es una secuencia de nucleótidos y de
5 aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de las cadenas alfa y beta de la hormona estimulante del folículo (FSH), respectivamente (SEC ID Nº: 11 a 14, respectivamente). La Figura 58, que comprende las Figuras 58A y 58B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de eritropoyetina (EPO) (SEC ID Nº: 15 y 16, respectivamente). La Figura 59, que comprende las Figuras 59A y 59B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (SEC ID Nº: 17 y 18, respectivamente). La Figura 60, que comprende las Figuras 60A y 60B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de interferón gamma (IFN-gamma) (SEC ID Nº: 19 y 20, respectivamente). La Figura 61, que comprende las Figuras 61 A y 61B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos
15 correspondiente a modo de ejemplo de inhibidor de !-1-proteasa (A-1-PI, o !-antitripsina) (SEC ID Nº: 21 y 22, respectivamente). La Figura 62, que comprende las Figuras 62A-1 a 62A-2, y 62B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de glucocerebrosidasa (SEC ID Nº: 23 y 24, respectivamente). La Figura 63, que comprende las Figuras 63A y 63B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de activador de plasminógeno de tipo tejido (TPA) (SEC ID Nº: 25 y 26, respectivamente). La Figura 64, que comprende las Figuras 64A y 64B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de interleucina-2 (IL-2) (SEC ID Nº: 27 y 28, respectivamente). La Figura 65, que comprende las Figuras 65A-1 a 65A-4 y la Figura 65B-1 a 65B-4, es una secuencia de
25 nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo del factor VIII (SEC ID Nº: 29 y 30, respectivamente). La Figura 66, que comprende las Figuras 66A y 66B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de urocinasa (SEC ID Nº: 33 y 34, respectivamente). La Figura 67, que comprende las Figuras 67A y 67B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de ADNasa recombinante humana (ADNasarh) (SEC ID Nº: 39 y 40, respectivamente). La Figura 68, que comprende las Figuras 68A y 68B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de un anticuerpo monoclonal humanizado para glicoproteína IIb/IIIa (SEC ID Nº: 43 y 44, respectivamente).
35 La Figura 69, que comprende las Figuras 69A y 69B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de proteína S de un virus de la hepatitis B (HBsAg) (SEC ID Nº: 45 y 46, respectivamente). La Figura 70, que comprende las Figuras 70A y 70B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de la hormona de crecimiento humana (HGH) (SEC ID Nº: 47 y 48, respectivamente). La Figura 71, que comprende las Figuras 71A y 71B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo del receptor de factor de necrosis tumoral (TNF-R) de 75 kDa, que comprende una parte de Enbrel™ (fusión de receptor de factor de necrosis tumoral (TNF-R)/IgG) (SEC ID Nº: 31 y 32, respectivamente).
45 La Figura 72, que comprende las Figuras 72A y 72B, es una secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de las cadenas ligeras y pesadas, respectivamente, de Herceptin™ (anticuerpo monoclonal (MAb) para Her-2, receptor de factor de crecimiento epidérmico humano) (SEC ID Nº: 35 y 36, respectivamente). La Figura 73, que comprende las Figuras 73A y 73B, es una secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente, de Synagis™ (MAb para péptido F del virus respiratorio sincitial) (SEC ID Nº: 37 y 38, respectivamente). La Figura 74, que comprende las Figuras 74A y 74B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de las regiones variables no humanas de Remicade™ (MAb para TNF!) (SEC ID Nº: 41 y 42, respectivamente). La Figura 75, que comprende las Figuras 75A y 75B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos
55 correspondiente a modo de ejemplo de la porción Fc de IgG humana (SEC ID Nº: 49 y 50, respectivamente). La Figura 76 es una secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de la cadena ligera de la región variable madura de un anticuerpo murino anti-glicoproteína IIb/IIIa (SEC ID Nº: 52). La Figura 77 es una secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de la cadena pesada de la región variable madura de un anticuerpo murino anti-glicoproteína IIb/IIIa (SEC ID Nº: 54). La Figura 78 es una secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de la cadena ligera de la región variable de una IgG humana (SEC ID Nº: 51). La Figura 79 es una secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de la cadena pesada de la región variable de una IgG humana (SEC ID Nº: 53). La Figura 80 es una secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de una cadena ligera de una IgG humana
65 (SEC ID Nº: 55). La Figura 81 es una secuencia de aminoácidos a modo de ejemplo de una cadena pesada de una IgG humana
(SEC ID Nº: 56). La Figura 82, que comprende las Figuras 82A y 82B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de la región variable de la cadena ligera madura de un anticuerpo murino anti-CD20 (SEC ID Nº: 59 y 60, respectivamente). La Figura 83, que comprende las Figuras 83A y 83B, es una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente a modo de ejemplo de la región variable de la cadena pesada madura de un anticuerpo murino anti-CD20 (SEC ID Nº: 61 y 62, respectivamente). La Figura 84, que comprende las Figuras 84A a 84E, es la secuencia de nucleótidos del vector de expresión para anticuerpos quiméricos en tándem TCAE 8 (SEC ID Nº: 57). La Figura 85, que comprende las Figuras 85A a 85E, es la secuencia de nucleótidos del vector de expresión para anticuerpos quiméricos en tándem TCAE 8 que contiene los dominios ligeros y pesados del anticuerpo murino anti-CD20 (SEC ID Nº: 58). La Figura 86 es una imagen de un gel de acrilamida que representa los resultados de análisis de FACE de la pre-y post-sialilación de TP10. La especie BiNA0 no tiene residuos de ácido siálico. La especie BiNA1 tiene un residuo de ácido siálico. La especie BiNA2 tiene dos residuos de ácido siálico. Bi = biantenaria; AN = ácido neuramínico. La Figura 87 es una gráfica que representa la concentración en plasma en μg/ml con el tiempo de TP10 pre-y post-sialilación inyectado en ratas. La Figura 88 es una gráfica que representa el área bajo la curva de la concentración en plasma-tiempo (ABC) en μg/h/ml para TP10 pre-y post sialilado. La Figura 89 es una imagen de un gel de acrilamida que representa los resultados de análisis de FACE de la pre-y post-fucosilación de TP10. La especie BiNA2F2 tiene dos residuos de ácido neuramínico (AN) y dos residuos de fucosa (F). La Figura 90 es una gráfica que representa la unión in vitro de TP20 (sCR1sLex) glicosilado in vitro (diamantes) e in vivo en células CHO de Lec11 (cuadrados). La Figura 91 es una gráfica que representa el análisis por HPLC 2-AA de glicoformas de la GlcNAc-ilación de EPO. La Figura 92, que comprende las Figuras 92A y 92B, es dos gráficas que representan el espectro de MALDI-TOF de ARNasaB (Figura 92A) y el perfil de HPLC de los oligosacáridos escindidos de ARNasaB por Nglicanasa (Figura 92B). La mayoría de sitios de N-glicosilación del péptido se modifican con oligosacáridos de alta manosa constituidos por 5 a 9 residuos de manosa. La Figura 93 es un esquema que representa la conversión de N-glicanos de alta manosa en N-glicanos híbridos. La enzima 1 es !1,2-manosidasa, de Trichoderma reesei o Aspergillus saitoi. La enzima 2 es GnT-I (∀-1,2-Nacetilglucosaminiltransferasa I). La enzima 3 es GalT-I (∀1,4-galactosiltransferasa 1). La enzima 4 es !2,3sialiltransferasa o !2,6-sialiltransferasa. La Figura 94, que comprende las Figuras 94A y 94B, es dos gráficas que representa el espectro de MALDI-TOF de ARNasaB tratada con una !1,2-manosidasa de T. reesei recombinante (Figura 94A) y el perfil de HPLC de los oligosacáridos escindidos por N-glicanasa de la ARNasaB modificada (Figura 94B). La Figura 95 es una gráfica que representa el espectro de MALDI-TOF de ARNasaB tratada con una !1,2manosidasa comercialmente disponible purificada de A. saitoi (Glyko & CalBioChem). La Figura 96 es una gráfica que representa el espectro de MALDI-TOF de ARNasaB modificada tratando el producto mostrado en la Figura 94 con una GnT-I recombinante (GlcNAc transferasa-I). La Figura 97 es una gráfica que representa el espectro de MALDI-TOF de ARNasaB modificada tratando el producto mostrado en la Figura 96 con una GalT 1 recombinante (galactosiltransferasa 1). La Figura 98 es una gráfica que representa el espectro de MALDI-TOF de ARNasaB modificada tratando el producto mostrado en la Figura 97 con una ST3 gal III recombinante (!2,3-sialiltransferasa III) usando MFC-AS como donante para la transferasa. La Figura 99 es una gráfica que representa el espectro de MALDI-TOF de ARNasaB modificada tratando el producto mostrado en la Figura 97 con una ST3 gal III recombinante (!2,3-sialiltransferasa III) usando MFC-AS-PEG (10 kDa) como donante para la transferasa. La Figura 100 es una serie de esquemas que representa la conversión de N-glicanos de alta manosa en Nglicanos complejos. La enzima 1 es !1,2-manosidasa de Trichoderma reesei o Aspergillus saitoi. La enzima 2 es GnT-I. La enzima 3 es GAlT 1. La enzima 4 es !2,3-sialiltransferasa o !2,5-sialiltransferasa. La enzima 5 es !-manosidasa II. La enzima 6 es !-manosidasa. La enzima 7 es GnT-II. La enzima 8 es !1,6-manosidasa. La enzima 9 es !1,3-manosidasa. La Figura 101 es un diagrama del enlace catalizado por N-acetilglucosaminiltransferasa I a VI (GnT I-VI). R = GlcNAc∀1,4GlcNAc-Asn-X. La Figura 102, que comprende las Figuras 102A y 102B, son gráficas que representan el análisis de HPLC 2-AA de dos lotes de EPO a los que se ha añadido N-acetilglucosamina. La Figura 102A representa el análisis del lote A y la Figura 102B representa el análisis del lote B. La Figura 103 es una gráfica que representa el análisis de HPLC 2-AA de los productos la reacción introduciendo una tercera rama de glicano en EPO con GnT-V. La Figura 104 es una gráfica que representa un espectro de MALDI-TOF de los glicanos de la preparación de EPO después del tratamiento con GnT-I, GnT-II, GnT-III, GnT-IV y GalT1, con grupos donantes apropiados. La Figura 105 es una imagen de un gel de isoelectroenfoque (IEF) que representa los productos de la reacción
de desialilación de FSH de pituitaria humana. Los carriles 1 y 4 son patrones de isoelectroenfoque (IEF). El carril 2 es FSH nativa. El carril 3 es FSH desialilada. La Figura 106 es una imagen de un gel de SDS-PAGE de los productos de las reacciones para hacer la PEGsialilación de FSHr. Los carriles 1 y 8 son patrones de peso molecular SeeBlue+2. El carril 2 es 15 μg de FSH nativa. El carril 3 es 15 μg de asialo-FSH (AS-FSH). El carril 4 es 15 μg de los productos de la reacción de AS-FSH con MFC-AS. El carril 5 es 15 μg de los productos de la reacción de AS-FSH con MFC-AS-PEG (1 kDa). El carril 6 es 15 μg de los productos de la reacción de AS-FSH con MFC-AS-PEG (5 kDa). El carril 7 es 15 μg de los productos de la reacción de AS-FSH con MFC-AS-PEG (10 kDa). La Figura 107 es una imagen de un gel de isoelectroenfoque de los productos de las reacciones para hacer la PEG-sialilación de FSH. Los carriles 1 y 8 son patrones de IEF. El carril 2 es 15 μg de FSH nativa. El carril 3 es 15 μg de asialo-FSH (AS-FSH). El carril 4 es 15 μg de los productos de la reacción de AS-FSH con MFC-AS. El carril 5 es 15 μg de los productos de la reacción de AS-FSH con MFC-AS-PEG (1 kDa). El carril 6 es 15 μg de los productos de la reacción de AS-FSH con MFC-AS-PEG (5 kDa). El carril 7 es 15 μg de los productos de la reacción de AS-FSH con MFC-AS-PEG (10 kDa). La Figura 108 es una imagen de un gel de SDS-PAGE de FSH no recombinante nativa producida en células de la pituitaria humana. Los carriles 1, 2 y 5 son patrones de peso molecular SeeBlue™+2. Los carriles 3 y 4 son FSH nativa a 5 μg y 25 μg, respectivamente. La Figura 109 es una imagen de un gel de isoelectroenfoque (pH 3-7) que representa los productos de la reacción de asialilación de FSHr. Los carriles 1 y 4 son patrones de IEF. El carril 2 es FSHr nativa. El carril 3 es asialo-FSHr. La Figura 110 es una imagen de un gel de SDS-PAGE que representa los resultados de la PEG-sialilación de asialo-FSHr. El carril 1 es FSHr nativa. El carril 2 es asialo-FSH. El carril 3 es los productos de la reacción de asialo-FSH y MFC-AS. Los carriles 4-7 son los productos de la reacción entre asialo-FSH y MFC-AS-PEG 0,5 mM (10 kDa) a 2 h, 5 h, 24 h y 48 h, respectivamente. El carril 8 es los productos de la reacción entre asialo-FSH y MFC-AS-PEG 1,0 mM (10 kDa) a 48 h. El carril 9 es los productos de la reacción entre asialo-FSH y MFC-AS-PEG 1,0 mM (1 kDa) a 48 h. La Figura 111 es una imagen de un gel de isoelectroenfoque que muestra los productos de PEG-sialilación de asialo-FSHr con MFC-AS-PEG (1 kDa). El carril 1 es FSHr nativa. El carril 2 es asialo-FSHr. El carril 3 es los productos de la reacción de asialo-FSHr y MFC-AS a 24 h. Los carriles 4-7 son los productos de la reacción de asialo-FSHr y MFC-AS-PEG 0,5 mM (1 kDa) a 2 h, 5 h, 24 h y 48 h, respectivamente. El carril 8 es blanco. Los carriles 9 y 10 son los productos de la reacción a 48 h de asialo-FSHr y MFC-AS-PEG (10 kDa) a 0,5 mM y 1,0 mM, respectivamente. La Figura 112 es una gráfica de la farmacocinética de FSHr y FSHr-AS-PEG (1 kDa y 10 kDa). Esta gráfica ilustra la relación entre el tiempo que un compuesto de FSHr está en la corriente sanguínea de la rata y la concentración media del compuesto de FSHr en la sangre para FSHr glicoPEGilada con respecto a FSHr no PEGilada. La Figura 113 es una gráfica de los resultados del bioensayo de FSH usando células Sertoli. Esta gráfica ilustra la relación entre la concentración de FSH en el medio de incubación de células Sertoli y la cantidad de 17∀estradiol liberado de las células de Sertoli. La Figura 114 es una imagen de un gel de SDS-PAGE: patrón (carril 1); transferrina nativa (carril 2); asialotransferrina (carril 3); asialotransferrina y MFC-AS (carril 4); carriles 5 y 6, asialotransferrina y MFC-AS-PEG (1 kDa) a 0,5 mM y 5 mM, respectivamente; carriles 7 y 8, asialotransferrina y MFC-AS-PEG (5 kDa) a 0,5 mM y 5 mM, respectivamente; carriles 9 y 10, asialotransferrina y MFC-AS-PEG (10 kDa) a 0,5 mM y 5 mM, respectivamente. La Figura 115 es una imagen de un gel de IEF: transferrina nativa (carril 1); asialotransferrina (carril 2); asialotransferrina y MFC-AS, 24 h (carril 3); asialotransferrina y MFC-AS, 96 h (carril 4); carriles 5 y 6, asialotransferrina y MFC-AS-PEG (1 kDa) a 24 h y 96 h, respectivamente; carriles 7 y 8, asialotransferrina y MFC-AS-PEG (5 kDa) a 24 h y 96 h, respectivamente; carriles 9 y 10, asialotransferrina y MFC-AS-PEG (10 kDa) a 24 h y 96 h, respectivamente. La Figura 116 es una imagen de un gel de isoelectroenfoque (pH 3-7) de asialo-factor VIIa. El carril 1 es factor VIIar; los carriles 2-5 son asialo-factor VIIa. La Figura 117 es una gráfica de un espectro de MALDI de factor VIIa. La Figura 118 es una gráfica de un espectro de MALDI de factor VIIa-PEG (1 kDa). La Figura 119 es una gráfica que representa un espectro de MALDI del factor VIIa-PEG (10 kDa). La Figura 120 es una imagen de un gel de SDS-PAGE del factor VIIa PEGilado. El carril 1 es asialo-factor VIIa. El carril 2 es el producto de la reacción de asialo-factor VIIa y MFC-AS-PEG (1 kDa) con ST3 gal3 después de 48 h. El carril 3 es el producto de la reacción de asialo-factor VIIa y MFC-AS-PEG (1 kDa) con ST3 gal3 después de 48 h. El carril 4 es el producto de la reacción de asialo-factor VIIa y MFC-AS-PEG (10 kDa) con ST3 gal3 a 96 h. La Figura 121 es una imagen de un gel de IEF que representa el pI de los productos del procedimiento de desialilación. Los carriles 1 y 5 son patrones de IEF. El carril 2 es proteína del factor IX. El carril 3 es proteína del factor IXr. El carril 4 es la reacción de desialilación de proteína de factor IXr a 20 h. La Figura 122 es una imagen de un gel de SDS-PAGE que representa el peso molecular de factor IX conjugado con tanto AS-PEG (1 kDa) como AS-PEG (10 kDa) después de la reacción con MFC-AS-PEG. Los carriles 1 y 6 son patrones de peso molecular SeeBlue +2. El carril 2 es F-IXr. El carril 3 es F-IXr desialilado. El carril 4 es factor IXr conjugado con AS-PEG (1 kDa). El carril 5 es factor IXr conjugado con AS-PEG (10 kDa).
La Figura 123 es una imagen de un gel de SDS-PAGE que representa los productos de reacción de sialilación directa de factor IX y encapuchado de ácido siálico de factor IX-AS-PEG. El carril 1 es patrones de proteína, el carril 2 es blanco; el carril 3 es factor IXr; el carril 4 es factor IXr-AS-PEG encapuchado con AS (10 kDa); el carril 5 es factor IXr-AS-PEG (10 kDa); el carril 6 es ST3 gal1; el carril 7 es ST3 gal3; los carriles 8, 9, 10 son factor IXr-AS-PEG(10 kDa) sin tratamiento con sialidasa previo. La Figura 124 es una gráfica que representa un espectro de MALDI de los glicanos de EPO nativa. La Figura 125 es una imagen de un gel de SDS-PAGE de los productos de reacciones de PEGilación usando MFC-NAN-PEG (1 kDa) y MFC-NAN-PEG (10 kDa). La Figura 126 es una gráfica que representa los resultados del bioensayo in vitro de EPO PEGilada. Los diamantes representan los datos de EPO sialilada que no tiene moléculas de PEG. Los cuadrados representan los datos obtenidos usando EPO con PEG (kDa). Los triángulos representan los datos obtenidos usando EPO con PEG (10 kDa).
Descripción detallada de la invención
La presente invención incluye procedimientos y composiciones para la adición y/o deleción in vitro sin células de azúcares a o de una molécula de péptido en un modo tal que se proporcione una molécula de glicopéptido que tiene un patrón de glicosilación personalizado o deseado específico, en el que el glicopéptido se produce a una escala industrial. En una realización preferida de la invención, el glicopéptido así producido ha unido al mismo un azúcar modificado que se ha añadido al péptido mediante una reacción enzimática. Una característica clave de la invención es tomar un péptido producido por cualquier tipo de célula y generar una estructura de glicano de núcleo sobre el péptido, tras lo cual la estructura de glicano se remodela luego in vitro para generar un glicopéptido que tiene un patrón de glicosilación adecuado para uso terapéutico en un mamífero. Más específicamente, según la presente invención es posible preparar una molécula de glicopéptido que tiene una molécula de azúcar modificado u otro compuesto conjugado a la misma, de forma que la molécula conjugada confiera una propiedad beneficiosa sobre el péptido. Según la presente invención, la molécula conjugada se añade al péptido enzimáticamente debido a que la adición basada en enzimas de moléculas conjugadas a péptidos tiene la ventaja de regioselectividad y estereoselectividad. Por tanto, es posible usar los procedimientos y composiciones proporcionados en el presente documento para remodelar un péptido para conferir al péptido una estructura de glicano deseada que tiene preferentemente un azúcar modificado unido al mismo. También es posible usar los procedimientos y composiciones de la invención para generar moléculas de péptido que tienen estructuras de glicano deseadas y o modificadas a una escala industrial, proveyendo así por primera vez a la materia de una solución práctica para la eficiente producción de péptidos terapéuticos mejorados.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen generalmente el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular, química orgánica y química de los ácidos nucleicos e hibridación son aquellos muy conocidos y comúnmente empleados en la materia. Técnicas convencionales se usan para la síntesis de ácidos nucleicos y de péptidos. Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente según procedimientos convencionales en la materia y diversas referencias generales (por ejemplo, Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), que se proporcionan en el presente documento. La nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio usados en la química analítica y síntesis orgánicas descritas más adelante son aquellos muy conocidos y comúnmente empleados en la materia. Técnicas convencionales o modificaciones de las mismas se usan para síntesis químicas y analizadores químicos.
Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del sujeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.
El término “anticuerpo,” como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que puede unirse específicamente a un epítope específico sobre un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son normalmente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos en la presente invención pueden existir en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, además de anticuerpos monocatenarios y anticuerpos humanizados (Harlow y col., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow y col., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird y col., 1988, Science 242:423426).
Por el término “anticuerpo sintético”, como se usa en el presente documento, se indica un anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago como se describe en el presente documento. El término también debe interpretarse que significa un anticuerpo que ha sido
generado por la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en la que el ADN o secuencia de aminoácidos ha sido obtenida usando tecnología de secuencias de ADN sintético o de aminoácidos que está disponible y es muy conocida en la técnica.
Como se usa en el presente documento, una molécula biológica “funcional” es una molécula biológica en una forma en la que presenta una propiedad por la que se caracteriza. Una enzima funcional, por ejemplo, es una que presenta la actividad catalítica característica por la que se caracteriza la enzima.
Como se usa en el presente documento, la estructura
es el punto de conexión entre un aminoácido en la cadena peptídica y la estructura de glicano.
Oligosacáridos “ligados en N” son aquellos oligosacáridos que están ligados a un esqueleto de péptido mediante asparagina, a modo de un enlace asparagina-N-acetilglucosamina. Los oligosacáridos ligados en N también se llaman “N-glicanos”. Todos los oligosacáridos ligados en N tienen un núcleo de pentasacárido común de Man3GlcNAc2. Se diferencian en la presencia de, y en el número de, ramas (también llamadas antenas) de azúcares periféricos tales como N-acetilglucosamina, galactosa, N-acetilgalactosamina, fucosa y ácido siálico. Opcionalmente, esta estructura también puede contener una molécula de fucosa y/o una molécula de xilosa de núcleo.
Una “estructura de núcleo de trimanosilo elemental” se refiere a un resto de glicano que comprende únicamente una estructura de núcleo de trimanosilo, sin azúcares adicionales unidos a la misma. Si el término “elemental” no se incluye en la descripción de la “estructura de núcleo de trimanosilo”, entonces el glicano comprende la estructura de núcleo de trimanosilo con azúcares adicionales unidos a la misma. Opcionalmente, esta estructura también puede contener una molécula de fucosa y/o una molécula de xilosa de núcleo.
El término “glicopéptido de núcleo de trimanosilo elemental” se usa en el presente documento para referirse a un glicopéptido que tiene estructuras de glicano constituidas principalmente por una estructura de núcleo de trimanosilo elemental. Opcionalmente, esta estructura también puede contener una molécula de fucosa y/o una molécula de xilosa de núcleo.
Oligosacáridos “ligados en O” son aquellos oligosacáridos que están ligados a un esqueleto de péptido mediante treonina o serina.
Todos los oligosacáridos descritos en el presente documento se describen con el nombre o abreviatura para el sacárido no reductor (es decir, Gal), seguido de la configuración del enlace glicosídico (! o ∀), el enlace de anillo (1 ó 2), la posición de anillo del sacárido reductor que participa en el enlace (2, 3, 4, 6 u 8), y luego el nombre o abreviatura del sacárido reductor (es decir, GlcNAc). Cada sacárido es preferentemente una piranosa. Para una revisión de nomenclatura de glicobiología convencional véase Essentials of Glycobiology, Varki y col. eds., 1999, CSHL Press.
El término “ácido siálico” se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia del ácido siálico es ácido N-acetil-neuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3,5didesoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1-ónico (frecuentemente abreviado Neu5Ac, NeuAc o NANA). Un segundo miembro de la familia es ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc), en que el grupo N-acetilo de NeuAc está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia del ácido siálico es ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano y col. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori y col., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). También están incluidos ácidos siálicos 9-sustituidos tales como 9-O-acil C1-C6-Neu5Ac como 9-O-lactil-Neu5Ac o 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para una revisión de la familia del ácido siálico véase, por ejemplo, Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, Nueva York (1992)). La síntesis y uso de compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación se desvela en la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de octubre de 1992.
Un péptido que tiene “glicosilación deseada”, como se usa en el presente documento, es un péptido que comprende una o más moléculas de oligosacárido que se requieren para la actividad biológica eficiente del péptido.
Una “enfermedad” es un estado de salud de un animal en el que el animal no puede mantener la homeostasis, y en el que si la enfermedad no mejora, la salud del animal continúa entonces deteriorándose.
El “área bajo la curva” o “ABC”, como se usa en el presente documento en el contexto de administrar un fármaco de péptido a un paciente, se define como el área total bajo la curva que describe la concentración de fármaco en la circulación sistémica en el paciente en función del tiempo de cero a infinito.
El término “semivida” o “t ½”, como se usa en el presente documento en el contexto de administrar un fármaco de péptido a un paciente, se define como el tiempo requerido para que la concentración en plasma de un fármaco en un paciente se reduzca a la mitad. Puede haber más de una semivida asociada al fármaco de péptido que depende de múltiples mecanismos de eliminación, redistribución, y otros mecanismos muy conocidos en la técnica. 5 Normalmente, las semividas alfa y beta se definen de forma que la fase alfa está asociada con la redistribución y la fase beta está asociada con la eliminación. Sin embargo, con fármacos de proteína que, en general, están confinados a la circulación sanguínea, puede haber al menos dos semividas de eliminación. Para algunos péptidos glicosilados, la rápida eliminación de la fase beta puede mediarse por receptores sobre macrófagos, o células endoteliales que reconocen galactosa terminal, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, manosa o fucosa. La eliminación de fase beta más lenta puede producirse mediante filtración glomerular renal para moléculas con un radio eficaz < 2 nm (aproximadamente 68 kD) y/o captación y metabolismo específico o no específico en tejidos. La glicoPEGilación puede encapuchar azúcares terminales (por ejemplo, galactosa o N-acetilgalactosamina) y así bloquear la rápida eliminación de la fase alfa mediante receptores que reconocen estos azúcares. También puede conferir un radio eficaz más grande y así disminuir el volumen de distribución y captación de tejido, prolongando así
15 la fase beta tardía. Por tanto, el impacto preciso de la glicoPEGilación sobre las semividas de fase alfa y fase beta variará dependiendo del tamaño, estado de glicosilación, y otros parámetros como es muy conocido en la técnica. Más explicación de “semivida” se encuentra en Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin y RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Ámsterdam, pág 101 -120).
El término “tiempo de residencia”, como se usa en el presente documento en el contexto de la administración de un fármaco de péptido a un paciente, se define como el tiempo promedio que el fármaco permanece en el cuerpo del paciente después de dosificarse.
Un “ácido nucleico aislado” se refiere a un segmento o fragmento de ácido nucleico que se ha separado de las secuencias que lo flanquean en un estado que se produce naturalmente, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento, por ejemplo, las secuencias
25 adyacentes al fragmento en un genoma en que se produce naturalmente. El término también se aplica a ácidos nucleicos que se han purificado sustancialmente de otros componentes que acompañan naturalmente al ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ADN o proteínas que lo acompañan naturalmente en la célula. Por tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus autónomamente replicante, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, como un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido por PCR o digestión con enzima de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un ácido nucleico híbrido que codifica secuencia de péptidos adicional.
Un “polinucleótido” significa una única hebra o hebras paralelas o antiparalelas de un ácido nucleico. Por tanto, un polinucleótido puede ser tanto un ácido nucleico monocatenario como bicatenario.
35 El término “ácido nucleico” normalmente se refiere a polinucleótidos grandes. El término “oligonucleótido” normalmente se refiere a polinucleótidos cortos, generalmente no más de aproximadamente 50 nucleótidos.
En el presente documento se usa notación convencional para describir secuencias de polinucleótidos: el extremo a mano izquierda de una secuencia de polinucleótidos monocatenaria es el extremo 5'; la dirección a mano izquierda de una secuencia de polinucleótidos bicatenaria se denomina la dirección 5'. La dirección de adición de 5' a 3' de nucleótidos a transcritos de ARN nacientes se denomina la dirección de transcripción. La hebra de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina la “hebra codificante”; secuencias sobre la cadena de ADN que se localizan 5' con respecto a un punto de referencia sobre el ADN se denominan “secuencias en la dirección 5'”; secuencias sobre la hebra de ADN con respecto a un punto de referencia sobre el ADN se denominan “secuencias en la dirección 3'”.
45 “Que codifica” se refiere a la propiedad inherente de secuencias de nucleótidos específicas en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir de moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen tanto una secuencia de nucleótidos definida (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) como una secuencia de aminoácidos definida y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Por tanto, una secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína si la transcripción y traducción de ARNm correspondiente al ácido nucleico produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Puede denominarse que tanto la hebra codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y se proporciona normalmente en los listados de secuencias, como la hebra no codificante, usada como molde para la transcripción de un gen o ADNc, codifican la proteína u otro producto de ese ácido nucleico o ADNc.
A menos que se especifique de otro modo, una “secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de
55 aminoácidos” incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones.
“Homólogo”, como se usa en el presente documento, se refiere a la similitud de secuencias de subunidad entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo, dos moléculas de ADN o
dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas de péptido. Si una posición de subunidad en cualquiera de las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas, por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias de compuesto son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas el 50%, si el 90% de las posiciones, por ejemplo, 9 de 10, son coincidentes u homólogas, las dos secuencias comparten el 90% de homología. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN 3'ATTGCC5' y 3'TATGGC comparten el 50% de homología.
Como se usa en el presente documento, “homología” se usa sinónimamente con “identidad”.
La determinación de la identidad en porcentaje entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos puede llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, un algoritmo matemático útil para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268), modificado como en Karlin y Altschul (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877). Este algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul y col. (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410) y puede accederse, por ejemplo, en el sitio de la malla mundial del Centro nacional para información biotecnológica (NCBI) que tiene el localizador universal de recursos “http://www.ncbi.nlm.nih.govBLAST/”. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST (designado “blastn” en el sitio web de NCBI), usando los siguientes parámetros: penalización por hueco = 5; penalización por extensión de hueco = 2; penalización por desapareamiento = 3; recompensa por coincidencia = 1; valor esperado 10,0; y tamaño de palabra = 11 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico descrito en el presente documento. Las búsquedas de proteínas con BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST (designado “blastn” en el sitio web de NCBI) o el programa NCBI “blastp”, usando los siguientes parámetros: valor esperado 10,0, matriz de puntuación BLOSUM62 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína descrita en el presente documento. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, Gapped BLAST puede utilizarse como se describe en Altschul y col. (1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Alternativamente, PSI-Blast o PHI-Blast pueden usarse para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas (ídem) y relaciones entre moléculas que comparten un patrón común. Si se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST, PSI-Blast y PHI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
La identidad en porcentaje entre dos secuencias puede determinarse usando técnicas similares a aquellas descritas anteriormente, con o sin permitir huecos. En el cálculo de la identidad en porcentaje, normalmente se cuentan coincidencias exactas.
Una “unidad de expresión de ácido nucleico heterólogo” que codifica un péptido se define como un ácido nucleico que tiene una secuencia codificante para un péptido de interés operativamente ligado a una o más secuencias de control de la expresión, tales como promotores y/o secuencias represoras en las que al menos una de las secuencias es heteróloga, es decir, no se encuentra normalmente en la célula huésped.
Describiendo dos polinucleótidos como “operativamente ligados” se indica que un resto de ácido nucleico monocatenario o bicatenario comprende los dos polinucleótidos dispuestos dentro del resto de ácido nucleico en tal forma que al menos uno de los dos polinucleótidos pueda ejercer un efecto fisiológico por el cual se caracteriza con respecto al otro. A modo de ejemplo, un promotor operativamente ligado a la región codificante de un ácido nucleico puede promover la transcripción de la región codificante.
Como se usa en el presente documento, el término “secuencia promotora/reguladora” significa una secuencia de ácidos nucleicos que se requiere para la expresión de un producto génico operativamente ligado a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora del núcleo y en otros casos esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que expresa el producto génico en un modo específico para tejido.
Un “promotor constitutivo” es un promotor que acciona la expresión de un gen con el que está operativamente ligado, de una manera constante en una célula. A modo de ejemplo, promotores que accionan la expresión de genes de mantenimiento celulares se consideran que son promotores constitutivos.
Un promotor “inducible” es una secuencia de nucleótidos que, cuando está operativamente ligada a un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula viva sustancialmente solo cuando un inductor que se corresponde con el promotor está presente en la célula.
Un promotor “específico para tejido” es una secuencia de nucleótidos que, cuando está operativamente ligada a un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula viva sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor.
Un “vector” es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede usarse para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. En la técnica se conocen numerosos vectores que
incluyen polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados a compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por tanto, el término “vector” incluye un plásmido autónomamente replicante o un virus. El término también debe interpretarse que incluye compuestos de no plásmido y no víricos que facilitan la transferencia de ácido nucleico en células tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, y liposomas. Ejemplos de vectores víricos incluyen vectores adenovíricos, vectores de virus adenoasociados y vectores retrovíricos.
“Vector de expresión” se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión operativamente ligadas a una secuencia de nucleótidos que va a expresarse. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden suministrarse por célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Vectores de expresión incluyen todos aquellos conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus que incorporan el polinucleótido recombinante.
Una célula “genéticamente manipulada” o “recombinante” es una célula que tiene una o más modificaciones al material genético de la célula. Se observa que tales modificaciones incluyen inserciones de material genético, deleciones de material genético e inserción de material genético que es extracromosómicamente tanto si tal material se mantiene establemente como si no.
Un “péptido” es un oligopéptido, polipéptido, péptido, proteína o glicoproteína. El uso del término “péptido” en el presente documento incluye un péptido que tiene una molécula de azúcar unida al mismo cuando una molécula de azúcar está unida al mismo.
Como se usa en el presente documento, “forma nativa” significa la forma del péptido cuando es producida por las células y/u organismos en los que se encuentra en la naturaleza. Si el péptido se produce por una pluralidad de células y/u organismos, el péptido puede tener una variedad de formas nativas.
“Péptido” se refiere a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y se unen juntos mediante enlaces amida, denominado alternativamente un péptido. Adicionalmente también están incluidos aminoácidos no naturales, por ejemplo, ∀-alanina, fenilglicina y homoarginina. Los aminoácidos que no están codificados por ácidos nucleicos también pueden usarse en la presente invención. Además, los aminoácidos que han sido modificados para incluir grupos reactivos, sitios de glicosilación, polímeros, restos terapéuticos y biomoléculas también pueden usarse en la invención. Todos los aminoácidos usados en la presente invención pueden ser tanto el isómero D como L de los mismos. Generalmente se prefiere el isómero L. Además, también son útiles otros peptidomiméticos en la presente invención. Como se usa en el presente documento, “péptido” se refiere a tanto péptidos glicosilados como sin glicosilar. También se incluyen péptidos que están incompletamente glicosilados por un sistema que expresa el péptido. Para una revisión general véase Spatola, A. F., en CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDS AND PROTEIN, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, pág. 267 (1983).
El término “conjugado de péptido” se refiere a especies de la invención en las que un péptido está conjugado con un azúcar modificado como se expone en el presente documento.
El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos que existen de forma natural y sintéticos, además de análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácido que funcionan de un modo similar a los aminoácidos que existen de forma natural. Aminoácidos que existen de forma natural son aquellos codificados por el código genético, además de aquellos aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina, #-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce naturalmente, es decir, un carbono ! que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfonio de metionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos de péptido modificados, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce naturalmente. Miméticos de aminoácidos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de un modo similar a un aminoácido que se produce naturalmente.
Como se usa en el presente documento, los aminoácidos se representan por el nombre completo de los mismos, por el código de tres letras correspondiente al mismo, o por el código de una letra correspondiente al mismo, como se indica en la siguiente Tabla 1:
Tabla 1: Aminoácidos, y los códigos de tres letras y de una letra
Nombre completo Código de tres letras Código de una letra Ácido aspártico Asp D Ácido glutámico Glu E Lisina Lys K Arginina Arg R Histidina His H
40 (continuación)
Nombre completo Código de tres letras Código de una letra Tirosina Tyr Y Cisteína Cys C Asparagina Asn N Glutamina Gln Q Serina Ser S Treonina Th T Glicina Gly G Alanina Ala A Valina Val V Leucina Leu L Isoleucina Ile I Metionina Met M Prolina Pro P Fenilalanina Phe F Triptófano Trp W
La presente invención también proporciona análogos de proteínas o péptidos que comprenden una proteína como se ha identificado anteriormente. Los análogos pueden diferenciarse de proteínas o péptidos que existen de forma natural por diferencias de secuencias de aminoácidos conservativas o por modificaciones que no afectan la secuencia, o por ambos. Por ejemplo, pueden hacerse cambios de aminoácidos conservativos que, aunque alteren la secuencia primaria de la proteína o péptido, no alteran normalmente su función. Las sustituciones de aminoácidos conservativas normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos:
glicina, alanina;
valina, isoleucina, leucina;
ácido aspártico, ácido glutámico;
asparagina, glutamina;
serina, treonina;
lisina, arginina;
fenilalanina, tirosina.
Las modificaciones (que normalmente no alteran la secuencia primaria) incluyen derivatización química in vivo, o in vitro, de péptidos, por ejemplo, acetilación o carboxilación. También se incluyen modificaciones de glicosilación, por ejemplo, aquellas hechas modificando los patrones de glicosilación de un péptido durante su síntesis y procesamiento o en más etapas de procesamiento; por ejemplo, exponiendo el péptido a enzimas que afectan la glicosilación, por ejemplo, enzimas de glicosilación o desglicosilación de mamífero. También están englobadas secuencias que tienen residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.
Se apreciará, por supuesto, que los péptidos pueden incorporar residuos de aminoácidos que se modifican sin afectar la actividad. Por ejemplo, los extremos pueden derivatizarse para incluir grupos de bloqueo, es decir, sustituyentes químicos adecuados para proteger y/o estabilizar los extremos N y C de “degradación no deseable”, un término que pretende englobar cualquier tipo de rotura enzimática, química o bioquímica del compuesto en sus extremos que es probable que afecte la función del compuesto, es decir, degradación secuencial del compuesto en un extremo terminal del mismo.
Grupos de bloqueo incluyen grupos protectores convencionalmente usados en la materia de la química de los péptidos que no afectarán adversamente las actividades in vivo del péptido. Por ejemplo, pueden introducirse grupos de bloqueo del extremo N adecuados por alquilación o acilación del extremo N. Ejemplos de grupos de bloqueo del extremo N adecuados incluyen grupos alquilo C1-C5 ramificados o sin ramificar, grupos acilo tales como formilo y grupos acetilo, además de formas sustituidas de los mismos, tales como los grupos acetamidometilo (Acm), Fmoc o Boc. Análogos de desamino de aminoácidos también son grupos de bloqueo del extremo N útiles y pueden tanto acoplarse al extremo N del péptido como usarse en lugar del residuo extremo N. Grupos de bloqueo del extremo C adecuados, en los que el grupo carboxilo del extremo C está tanto incorporado como no, incluyen ésteres, cetonas o amidas. Grupos alquilo formadores de éster o cetona, particularmente grupos alquilo inferior tales como metilo, etilo y propilo, y grupos amino formadores de amida, tales como aminas primarias (-NH2), y grupos mono-y dialquilamino, tales como metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamina y metiletilamino, son ejemplos de grupos de bloqueo del extremo C. Análogos de aminoácidos descarboxilados tales como agmatina también son grupos de bloqueo del extremo C útiles y pueden tanto acoplarse al residuo del extremo C del péptido como usarse en su lugar. Además, se apreciará que los grupos amino y carboxilo libres en los extremos pueden eliminarse completamente del péptido para dar formas desamino y descarboxiladas del mismo sin afectar la actividad del péptido.
También pueden incorporarse otras modificaciones sin afectar adversamente la actividad y éstas incluyen sustitución de uno o más de los aminoácidos en la forma isomérica L natural con aminoácidos en la forma isomérica D. Por
5 tanto, el péptido puede incluir uno o más residuos de D-aminoácido, o puede comprender aminoácidos que están todos en la forma D. También se contemplan formas retro-inversas de péptidos según la presente invención, por ejemplo, péptidos invertidos en los que todos los aminoácidos están sustituidos con formas de D-aminoácido.
También se contemplan sales de adición de ácido de la presente invención en equivalentes funcionales. Por tanto, para su uso en la invención es adecuado un péptido según la presente invención tratado con un ácido inorgánico tal
10 como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico y fosfórico, o un ácido orgánico tal como acético, propiónico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, malónico, succínico, maleico, fumárico, tartárico, cítrico, benzoico, cinámico, mandélico, metanosulfónico, etanosulfónico, p-toluenosulfónico y salicílico, para proporcionar una sal soluble en agua del péptido.
También se incluyen péptidos que han sido modificados usando técnicas biológicas moleculares comunes de
15 manera que mejore su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como agente terapéutico. Análogos de tales péptidos incluyen aquellos que contienen residuos distintos de los L-aminoácidos que existen de forma natural, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos que no existen de forma natural. Los péptidos de la invención no se limitan a productos de cualquiera de los procedimientos a modo de ejemplo específicos enumerados en el presente documento.
20 Como se usa en el presente documento, el término “MALDI” es una abreviatura de desorción/ionización láser asistida por matriz. Durante la ionización, AS-PEG (ácido siálico-poli(etilenglicol)) puede eliminarse parcialmente de la estructura de N-glicano de la glicoproteína.
Como se usa en el presente documento, el término “glicosiltransferasa” se refiere a cualquier enzima/proteína que tenga la capacidad para transferir un azúcar donante a un resto aceptor.
25 Como se usa en el presente documento, el término “azúcar modificado” se refiere a un hidrato de carbono que se produce naturalmente o que no se produce naturalmente que se añade enzimáticamente sobre un aminoácido o un residuo de glicosilo de un péptido en un procedimiento de la invención. El azúcar modificado está seleccionado de nucleótidos de azúcar (mono-, di-y trifosfatos).
El “azúcar modificado” se funcionaliza covalentemente con un “grupo modificador”, que es un poli(etilenglicol). El
30 sitio de la funcionalización con el grupo modificador está seleccionado de forma que no prevenga que el “azúcar modificado” se añada enzimáticamente a un péptido.
El término “soluble en agua” se refiere a restos que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. Procedimientos para detectar y/o cuantificar la solubilidad en agua son muy conocidos en la técnica. Polímeros solubles en agua a modo de ejemplo incluyen péptidos, sacáridos, poli(éteres), poli(aminas) y poli(ácidos
35 carboxílicos). Los péptidos pueden tener secuencias mixtas o estar compuestos de un único aminoácido, por ejemplo poli(lisina). Similarmente, los sacáridos pueden ser de secuencia mixta o estar compuestos de una única unidad de sacárido, por ejemplo, dextrano, amilosa, quitosano y poli(ácido siálico). Un poli(éter) a modo de ejemplo es poli(etilenglicol). La poli(etilenimina) es una poliamina a modo de ejemplo, y el ácido poli(aspártico) es un poli(ácido carboxílico) representativo.
40 La expresión “grupo de unión a glucosilo”, como se usa en el presente documento, se refiere a un residuo glucosilo al que se une covalentemente un agente (p. ej., polímero hidrosoluble, resto terapéutico, biomolécula). En los procedimientos de la invención, el “grupo de unión a glucosilo” pasa a estar unido covalentemente a un péptido glucosilado o no glucosilado, de modo que une el agente a un resto aminoácido y/o glucosilo sobre el péptido. Un “grupo de unión a glucosilo” normalmente deriva de un “azúcar modificado” mediante la unión enzimática del “azúcar
45 modificado” a un resto aminoácido y/o glucosilo del péptido. Un “grupo de unión a glucosilo intacto” se refiere a un grupo de unión que deriva de un resto glucosilo en el que el monómero sacárido individual que se une al conjugado no se degrada, por ejemplo se oxida, por ejemplo mediante metaperyodato sódico. “Grupos de unión a glucosilo intactos” de la invención pueden proceder de un oligosacáridos natural mediante la adición de unidad(es) de glucosilo o eliminación de una o más unidades de glucosilo de una estructura de sacárido parental.
50 Las expresiones “resto dirigido” y “agente dirigido”, como se usa en el presente documento, hacen referencia a especies que localizarán en un tejido o región concreto del cuerpo. La localización está mediada por un reconocimiento específico de determinantes moleculares, el tamaño molecular del agente o conjugado dirigido, las interacciones iónicas, las interacciones hidrofóbicas y similares. Los expertos en la técnica conocen otros mecanismos de dirigir un agente a un tejido o región concretos.
55 Como se usa en el presente documento, “resto terapéutico” significa cualquier agente útil para tratamiento, incluidos antibióticos, agentes antiinflamatorios, fármacos antitumorales, citotoxinas y agentes radioactivos. “Resto terapéutico” incluye profármacos de agentes bioactivos, constructos en los que más de un resto terapéutico está unido a un vehículo, por ejemplo agentes multivalentes. Resto terapéutico también incluye péptidos y constructos que incluyen péptidos. Ejemplos de péptidos incluyen los divulgados en la Figura 1 y las Tablas 5 y 6, en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, “fármaco antitumoral” significa cualquier agente útil para combatir el cáncer,
5 incluidas citotoxinas y agentes tales como antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas, antibióticos, agentes antimitóticos, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides, interferones y agentes radiactivos. Asimismo, dentro del alcance de la expresión "fármaco antitumoral" abarca conjugados de péptidos con actividad antitumoral, por ejemplo TNF-α. Conjugados incluyen, entre otros, los formados entre una proteína terapéutica y una glucoproteína de la invención. Un conjugado representativo es el formado entre PSGL-1 y TNF-α.
10 Como se usa en el presente documento, “una citotoxina o agente citotóxico” significa cualquier agente que sea perjudicial para las células. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihIdroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramIcina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. Otras toxinas
15 incluyen, por ejemplo, ricino, CC-1065 y análogos, las duocarmicinas. Otras toxinas más incluyen la toxina diftérica y el veneno de serpiente (p. ej., veneno de cobra).
Como se usa en el presente documento, “un agente radiactivo” incluye cualquier radioisótopo que es eficaz en el diagnóstico o destrucción de un tumor. Ejemplos incluyen indio-111, cobalto-60 y tecnecio. Además, elementos radiactivos naturales tales como uranio, radio y torio, que normalmente representan mezclas de radioisótopos, son
20 ejemplos adecuados de un agente radiactivo. Los iones metálicos normalmente están quelados con un resto quelante orgánico.
En la técnica se conocen muchos grupos quelantes útiles, éteres de corona y criptandos y se pueden incorporar en los compuestos de la invención (p. e., EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA, etc., y sus análogos de fosfonato tales como DTPP, EDTP, HDTP, NTP, etc.). Véase, por ejemplo, Pitt y col., "The Design of Chelating Agents for the
25 Treatment of Iron Overload," en, INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE; Martell, Ed.; American Chemical Society, Washington, D.C., 1980, pág. 279-312; Lindoy, THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES; Cambridge University Press, Cambridge, 1989; Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY; Springer-Verlag, New York, 1989, y referencias contenidas en las mismas.
Además, los expertos en la técnica disponen de una serie de vías que permiten la unión de agentes quelantes,
30 éteres de corona y ciclodextrinas a otras moléculas. Véase, por ejemplo, Meares y col., "Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides." en, MODIFICATION OF PROTEINS: FOOD, NUTRITIONAL, AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS;" Feeney, y col., Eds., American Chemical Society, Washington, D.C., 1982, pág. 370-387; Kasina y col., Bioconjugate Chem., 9: 108-117 (1998); Song y col., Bioconjugate Chem., 8: 249-255 (1997).
Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquier material que
35 cuando se combina con el conjugado conserva la actividad de la actividad del conjugado y es no reactiva con el sistema inmunitario del sujeto. Ejemplos incluyen entre otros, cualquier vehículo farmacéutico convencional tal como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes. Otros vehículos pueden incluir también soluciones estériles, comprimidos, incluidos comprimidos recubiertos, y cápsulas. Normalmente, dichos vehículos contienen excipientes tales como almidón,
40 leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales de los mismos, estearato de magnesio o de calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Dichos vehículos pueden también incluir aditivos aromatizantes y colorantes u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos.
Como se usa en el presente documento, “administrar” significa administración oral, administración como supositorio,
45 contacto tópico, administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal o subcutánea, administración intratecal o la implantación de un dispositivo de liberación lenta, por ejemplo una mini-bomba osmótica, al sujeto.
El término “aislado” se refiere a un material que carece sustancialmente o esencialmente de componentes, que se usan para producir el material. Para los conjugados peptídicos de la invención, el término “aislado” se refiere a un 50 material que carece sustancialmente o esencialmente de componentes, que normalmente acompaña al material en la mezcla usada para preparar el conjugado peptídico. “Aislado” y “puro” se usan de forma intercambiable. Normalmente, conjugados peptídicos aislados de la invención tienen un nivel de pureza que preferentemente se expresa como un intervalo. El extremo inferior del intervalo de pureza para los conjugados peptídicos es de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 % o aproximadamente 80 % y el extremo superior del intervalo de
55 pureza es de aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o más de aproximadamente 90 %.
Cuando los conjugados peptídicos tienen una pureza superior a aproximadamente el 90 %, sus purezas también se expresan, preferentemente, como un intervalo. El extremo inferior del intervalo de pureza es de aproximadamente 90
%, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 96 % o aproximadamente 98 %. El extremo superior del intervalo de pureza es de aproximadamente 92 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 100 %.
La pureza se determina mediante cualquier método de análisis reconocido en la técnica (p. ej., intensidad de la banda en un gel teñido con plata, electroforesis en gel de poliacrilamida, HPLC o un medio similar).
“Esencialmente cada miembro de la población”, como se usa en el presente documento, describe una característica de una población de conjugados peptídicos de la invención en la que un porcentaje seleccionado de los azúcares modificados añadidos a un péptido se añaden a múltiples sitios aceptores idénticos sobre el péptido. “Esencialmente cada miembro de la población” se refiere a la “homogeneidad” de los sitios sobre el péptido conjugado a un azúcar modificado y se refiere a conjugados de la invención, que tienen una homogeneidad de al menos aproximadamente 80 %, preferentemente al menos aproximadamente 90 % y, más preferentemente, de al menos aproximadamente 95 %.
“Homogeneidad” se refiere a la consistencia estructural en una población de restos aceptores a los que están conjugados los azúcares modificados. Por tanto, en un conjugado peptídico de la invención en el que cada resto de azúcar modificado está conjugado a un sitio aceptor que tiene la misma estructura que el sitio aceptor al que está conjugado los demás azúcares modificados, se dice que el conjugado peptídico tiene una homogeneidad de aproximadamente el 100 %. Normalmente, la homogeneidad se expresa como un intervalo. El extremo inferior del intervalo de homogeneidad para los conjugados peptídicos es de aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %
o aproximadamente 80 % y el extremo superior del intervalo de pureza es de aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 % o más de aproximadamente 90 %.
Cuando los conjugados peptídicos tienen una homogeneidad superior o igual a aproximadamente el 90 %, sus purezas también se expresan, preferentemente, como un intervalo. El extremo inferior del intervalo de homogeneidad es de aproximadamente 90 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 96 % o aproximadamente 98 %. El extremo superior del intervalo de homogeneidad es de aproximadamente 92 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 100 %. La pureza de lo conjugados peptídicos normalmente se determina mediante uno o más procedimientos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM), espectrometría de tiempo vuelo-desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOFF) y electroforesis capilar.
“Glucoforma sustancialmente uniforme” o un “patrón de glucosilación sustancialmente uniforme” cuando hace referencia a una especie glucopeptídica, hace referencia al porcentaje de restos aceptores que están glucosilados mediante la glucosiltransferasa de interés (p. ej. fucosiltransferasa). Por ejemplo, en el caso de una α1,2 fucosiltransferasa existe un patrón de fucosilación sustancialmente uniforme si sustancialmente todo (como se define más adelante) el Galβ1,4-GlcNAc-R y los análogos sialilados del mismo están fucosilados en un conjugado peptídico de la invención. Un experto en la técnica entenderá que el material de partida puede contener restos aceptores glucosilados (p. ej., restos de Galβ1,4-GlcNAc-R fucosilados). Por tanto, el porcentaje calculado de glucosilación incluirá restos aceptores que están glucosilados mediante los procedimientos de la invención, así como los restos aceptores ya glucosilados en el material de partida.
El término “sustancialmente” en las definiciones anteriores de “sustancialmente uniforme” generalmente significa al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 70 %, o, más preferentemente, al menos aproximadamente 90 %, y todavía más preferentemente al menos aproximadamente 95 % de los restos aceptores para una glucosiltransferasa concreta están glucosilados.
Descripción de la invención
I. Procedimiento para remodelar las cadenas de glicano
La presente invención incluye procedimientos y composiciones para la adición y/o deleción in Vitro de azúcares a o desde una molécula de glucopéptido de un modo tal que proporciona una molécula peptídica que tiene un patrón de glucosilación adaptado o deseado específico, preferentemente que incluye la adición al mismo de un azúcar modificado. Una característica clave de la invención es tomar un péptido producido por cualquier tipo de célula y generar una estructura de glicano central sobre el péptido, tras lo cual la estructura de glicano se elimina in vitro para generar un péptido que tiene un patrón de glucosilación adecuado para uso terapéutico en un mamífero.
La importancia del patrón de glucosilación de un péptido es bien conocida en la técnica, así como las limitaciones de los presentes procedimientos in vivo para la producción de péptidos glucosilados adecuadamente, en particular cuando estos péptidos se producen usando metodología de ADN recombinante. Además, hasta la presente invención no ha sido posible generar glucopéptidos que tengan una estructura de glicano deseada sobre los mismos, en los que el péptido se pueda producir a escala industrial.
En la presente invención, un péptido producido por una célula se trata enzimáticamente in vitro mediante la adición sistemática de las enzimas y sustraeos adecuados, de modo que se elimina los restos de azúcar que no deben estar presentes sobre el péptido, y se añaden los restos de azúcar, que opcionalmente incluyen azúcares modificados, que se deben añadir al péptido, de un modo que proporcionan un glucopéptido que tiene una “glucosilación deseada”, como se define en otros lugares en el presente documento.
A. Procedimiento para remodelar glicanos unidos a N
En un aspecto, la presente invenció aprovecha el hecho de que la mayoría de los péptidos de interés comercial o
5 farmacéutico comprenden una estructura común de cinco azúcares denominada en el presente documento núcleo de trimanosilo, que está unida a través de N a asparagina en la secuencia Asn-X-Ser/Thr sobre una cadena peptídica. El núcleo de trimanosilo elemental consiste esencialmente en dos residuos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y tres residuos de manosa (Man) unidos a un péptido, es decir comprende estos cinco residuos de azúcar y sin azúcares adicionales, a excepción de que opcionalmente puede incluir un residuo de fucosa. La primera
10 GlcNAc está unida al grupo amida de la asparagina y la segunda GlcNAc está unida a la primera mediante un enlace β1,4. Un residuo de manosa se une a la segunda GlcNAc mediante un enlace β1,4 y dos residuos de manosa se unen a esta manosa mediante un enlace α1,3 y un enlace α1,6, respectivamente. En al figura 2, lado izquierdo, se muestra una representación esquemática de una estructura central de trimanosilo. Aunque es el caso en el que las estructuras de glicano sobre la mayoría de los péptidos comprenden otros azúcares además del núcleo de
15 trimanosilo, la estructura central de trimanosilo representa una característica esencial de los glicanos unidos por N sobre los péptidos de mamífero.
La presente invención incluye la generación de un péptido que tiene una estructura central de trimanosilo como elemento fundamental de la estructura de las moléculas de glicano contenidas en el mismo. Dada la variedad de los sistemas celulares usados para producir péptidos, sean los propios sistemas naturales o impliquen metodología de
20 ADN recombinante, la presente invención proporciona procedimientos mediante los cuales una molécula de glicano en un péptido producido en cualquier tipo de célula se puede reducir a una estructura central de trimanosilo. Una vez que se ha generado la estructura central de trimanosilo elemental, es posible usar los procedimientos descritos en el presente documento para generar in Vitro una estructura de glicano deseada sobre el péptido que confiere al péptido una o más propiedades que potencien la eficacia terapéutica del péptido.
25 Debe quedar claro, a partir del debate en el presente documento, que la expresión “núcleo de trimanosilo” se usa para describir la estructura de glicano mostrada en la Figura 2, lado izquierdo. Los glucopéptidos que tienen una estructura central de trimanosilo pueden también tener azúcares adicionales añadidos y, en su mayor parte, tienen estructuras adicionales añadidas con independencia de si los azúcares dan lugar a un péptido que tiene una estructura de glicano deseada. La expresión “estructura central de trimanosilo elemental” se define en otros lugares
30 en el presente documento. Cuando el término "elemental” no se incluye en la descripción de la “estructura central de trimanosilo”, el glicano comprende la estructura central de trimanosilo con azúcares adicionales añadidos a la misma.
La expresión “glucopéptido central de trimanosilo elemental” se usa en el presente documento para hacer referencia a un glucopéptido que tiene estructuras de glicano compuestas principalmente por una estructura central de
35 trimanosilo elemental. No obstante, también puede contener, opcionalmente, un residuo de fucosa añadido. Como se trata en el presente documento, los glicopéptidos centrales de trimanosilo elemental son un material de partida óptimo y, por tanto, preferido, para los procedimientos de remodelado de glicano de la invención.
Otro material de partida óptimo para el procedimiento de remodelado de glicano de la invención es una estructura de glicano que tiene un núcleo de trimanosilo en el que se añaden uno o dos residuos adicionales de GlcNAc a cada 40 uno de los residuos de manosa en α1,3 y α1,6 (véase, por ejemplo, la estructura sobre la segunda línea de la Figura 3, la segunda estructura desde la izquierda de la figura). Esta estructura se denomina en el presente documento "Man3GlcNAc4." Opcionalmente, esta estructura puede contener también una molécula de fucosa central. Una vez que se ha generado la estructura de Man3GlcNAc4, es posible usar los procedimientos descritos en el presente documento para generar in vitro una estructura de glicano deseada sobre el glucopéptido que confiere al
45 glucopéptido una o más propiedades que potencien la eficacia terapéutica del péptido.
En su forma nativa, los glicopéptidos unidos a N de la invención, y en particular los glucopéptidos de mamífero y humanos útiles en la presente invención, están glucosilados en N con una estructura central de trimanosilo y uno o más azúcares unidos a la misma.
Los términos “glucopéptido” y “glucopolipéptido” se usan de forma sinónima en el presente documento para hacer
50 referencia a cadenas peptídicas que tienen restos de azúcar unidos a las mismas. En el presente documento no se hace distinción para diferenciar glucopolipéptidos o glucopéptidos pequeños de glucopolipéptidos o glucopéptidos grandes. Por tanto, las moléculas de hormonas que tienen muy pocos aminoácidos en su cadena peptídica (p. ej., a menudo solo tres aminoácidos) y otros péptidos mucho más grandes están incluidas en los términos generales "glucopolipéptido” y “glucopéptido”, siempre que tengan restos de azúcares unidos a las mismas. No obstante, el
55 uso del término ”péptido” no impide que el péptido sea un glucopéptido.
Un ejemplo de un glucopéptido unido a N que tiene una glucosilación deseada es un péptido que tiene un glicano unido a N que tiene un núcleo de trimanosilo con al menos un residuo de GlcNAc unido al mismo. Este residuo se añade al núcleo de trimanosilo usando la N-acetil-glucosaminiltransferasa I (GnT-I). Si se añade un segundo residuo de GlcNAc se usa la N-acetil-glucosaminiltransferasa II (GnT-II). Opcionalmente se pueden añadir residuos de GlcNAc adicionales con la GnT-IV y/o la GnT-V, y un tercer residuo GlcNAc bisectada se puede unir a la β1,4 manosa del núcleo de trimanosilo usando la N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT-III). Opcionalmente, esta estructura se puede extender mediante tratamiento con la β1,4 galactosiltransferasa para añadir un residuo de
5 galactosa a cada GlcNAc no bisectada, e incluso más opcionalmente, usando las enzimas α2,3 o α2,6sialiltransferasa, los residuos de ácido siálico se pueden añadir a cada residuo de galactosa. La adición de una GlcNAc bisectada al glicano no se requiere para la posterior adición de residuos de galactosa y ácido siálico; no obstante, con respecto a la afinidad por el sustrato de las enzimas GnT-III de rata y humana, la presencia de uno o más de los residuos de galactosa sobre el glicano impide la adición de la GlcNAc bisectada porque el glicano que contiene galactosa no es un sustrato de estas formas de GnT-III. Por tanto, en los casos en los que se desea la presencia de la GlcNAc bisectada y se usan estas formas de GnT-III, es importante que si el glicano contiene residuos de galactosa y/o ácido siálico añadidos, se eliminen antes de la adición de la GlcNAc bisectada. Otras formas de GnT-III pueden no requerir este orden específico de sustratos para su actividad.
Ejemplos de estructuras de glicano que representan los diversos aspectos de los péptidos que tienen "la
15 glucosilación deseada" se muestran en las figuras que se proporcionan en el presente documento. Los procedimientos precisos para la generación in vitro de un péptido que tiene la “glucosilación deseada” se describen en otros lugares del presente documento. No obstante, la invención no debe interpretarse de ningún modo como que está únicamente limitada a una estructura cualquiera de glicano divulgada en el presente documento. En su lugar, la invención se debe interpretar que incluye todas y cada una de las estructuras de glicano que se pueden fabricar usando la metodología proporcionada en el presente documento.
En algunos casos, un núcleo de trimanosilo elemental solo puede constituir la glucosilación deseada de un péptido. Por ejemplo, se ha demostrado que un péptido que solo tiene un núcleo de trimanosilo está implicado en la enfermedad de Gaucher (Mistry y col., 1966, Lancet 348: 1555-1559; Bijsterbosch y col., 1996, Eur. J. Biochem. 237:344-349) .
25 De acuerdo con la presente invención se hacen evidentes los siguientes procedimientos para la generación de péptidos que tienen una glucosilación deseada.
a) Comenzando con un glucopéptido que tiene una o más moléculas de glicano que tienen como característica común una estructura central de trimanosilo y al menos una o más de una mezcla heterogénea u homogénea de uno o más azúcares añadidos, es posible aumentar la proporción de glucopéptidos que tienen una estructura central de trimanosilo elemental como la única estructura de glicano o que tienen Man3GlcNAc4 como la única estructura de glicano. Esto se consigue in Vitro mediante la adición sistemática al glucopéptido de un número adecuado de enzimas en una secuencia adecuada que escinden la mezcla heterogénea u homogénea de azúcares sobre la estructura de glicano hasta que se reduce a un núcleo de trimanosilo elemental o una estructura de Man3GlcNAc4. Ejemplos específicos de cómo se consigue esto dependerán de diversos factores,
35 incluidos, en gran parte, el tipo de célula en la que se produce el péptido y, por tanto, el grado de complejidad de la(s) estructura(s) de glicano presente(s) en el péptido producido inicialmente por la célula. Ejemplos de cómo se puede reducir una estructura de glicano compleja a un núcleo de trimanosilo elemental o una estructura de Man3GlcNAc4 se presentan en la Figura 3, que se describe con detalle en otros lugares del presente documento. b) es posible generar un péptido que tenga una estructura central de trimanosilo elemental como la única estructura de glicano sobre el péptido aislando una célula natural cuya maquinaria de glucosilación produce dicho péptido. Después, el ADN que codifica un péptido de elección se transfecta a la célula en la que el ADN se transcribe, se traduce y se glicosila de un modo tal que el péptido de elección tiene una estructura central de trimanosilo elemental como la única estructura de glicano del mismo. Por ejemplo, una célula que carece de una
45 enzima GnT-I funcional producirá varios tipos de glucopéptidos. En algunos casos, estos serán glucopéptidos que no tienen azúcares adicionales añadidos al núcleo de trimanosilo. No obstante, en otros casos, los péptidos producidos pueden tener dos residuos de manosa adicionales unidos al núcleo de trimanosilo, lo que tiene como resultado un Man5 glicano. Este es también un material de partida deseado para el procedimiento de remodelado de la presente invención. Ejemplos específicos de la generación de dichas estructuras de glicano se describen en el presente documento. c) Como alternativa, es posible someter a ingeniería genética a una célula para conferir una maquinaria de glucosilación específica de un modo tal que se produce un péptido que tiene un núcleo de trimanosilo elemental
o estructura de Man3GlcNAc4 como la única estructura de glicano sobre el péptido. Después, el ADN que codifica un péptido de elección se transfecta a la célula en la que el ADN se transcribe, se traduce y se glicosila
55 de un modo tal que el péptido de elección tiene un mayor número de glicanos que comprenden únicamente una estructura central de trimanosilo elemental. Por ejemplo, ciertos tipos de células que se han sometido a ingeniería genética para que carezcan de GnT-I, pueden producir un glicano que tiene una estructura central de trimanosilo elemental o, dependiendo de la célula, pueden producir un glicano que tiene un núcleo de trimanosilo más dos residuos adicionales de manosa unidos (Man5). Cuando la célula produce una estructura de glicano Man5, la célula se puede someter más a ingeniería genética para expresar manosidasa 2, que escinde los dos residuos de manosa adicionales para generar el núcleo de trimanosilo. Como alternativa, el Man5 glicano puede incubarse in vitro con manosidasa 3 para tener el mismo efecto. d) es fácilmente evidente a partir de la discusión en b) y c) que no es necesario que las células produzcan
únicamente péptidos que tengan un núcleo de trimanosilo elemental o estructuras Man3GlcNAc4 unidos a los mismos. En su lugar, a menos que las células descritas en b) y c) produzcan péptidos que tengan estructuras centrales de trimanosilo elemental 100 % (es decir que no tienen azúcares adicionales unidas a los mismos) o 100 % de estructuras Man3GlcNAc4, las células, de hecho, producen una mezcla heterogénea de péptidos que tienen, en combinación, estructuras centrales de trimanosilo elemental o estructuras Man3GlcNAc4 como la única estructura de glicano además de estas estructuras que tienen azúcares adicionales unidas a los mismos. La proporción de péptidos que tienen un núcleo de trimanosilo o una estructura de Man3GlcNAc4 que tiene azúcares adicionales unidos a los mismos, frente a los que tienen una estructura, variará en función de la célula que los produzca. La complejidad de los glicanos (es decir, cuál y cómo muchos azúcares se unen al núcleo de trimanosilo) también variará en función de la célula que los produzca. e) Una vez que un glucopéptido que tiene un núcleo de trimanosilo elemental o un núcleo de trimanosilo con uno o dos residuos de dos GlcNAc unidos se produce mediante a), b) o c) anteriores, de acuerdo con la presente invención, in vitro se añaden moléculas de azúcar adicionales a la estructura central de trimanosilo para generar un péptido que tiene la glucosilación deseada (es decir, un péptido que tiene una estructura de glicano adaptada in vitro). f) No obstante, cuando es el caso en el que se produce un péptido que tiene un núcleo de trimanosilo elemental
o una estructura de Man3GlcNAc4 con algunos pero no todos los azúcares deseados unidos al mismo, solo es necesario añadir cualquier azúcar deseado restante sin reducir la estructura de glicano al núcleo de trimanosilo elemental o la estructura de Man3GlcNAc4. Por tanto, en algunos casos, un péptido que tiene una estructura de glicano que tiene una estructura central de trimanosilo con azúcares adicionales unidos al mismo será un sustrato adecuado para el remodelado.
Aislamiento de un glucopéptido central de trimanosilo elemental
Los glucopéptidos con el núcleo de trimanosilo elemental o Man3GlcNAc4 de la invención se pueden aislar y purificar, en caso necesario, usando técnicas bien conocidas en la técnica de la purificación de péptidos. Las técnicas adecuadas incluyen técnicas cromatográficas, técnicas de enfoque isoeléctrico y técnicas de ultrafiltración. Usando cualquiera de estas técnicas se puede preparar una composición de la invención en la que los glucopéptidos de la invención se aíslan de otros péptidos y de otros componentes que normalmente se encuentran dentro del medio de cultivo celular. El grado de purificación puede ser de, por ejemplo, el 90 % con respecto a otros péptidos o del 95 %, o incluso superior, por ejemplo del 98 %. Véase, por ejemplo, Deutscher y col. (ed., 1990, Guide to Peptide Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego).
La heterogeneidad de los glicanos unidos a N presentes en los glucopéptidos producidos mediante la metodología de la técnica anterior normalmente solo permite el aislamiento de una pequeña porción de los glucopéptidos diana que se puede modificar para producir los glucopéptidos deseados. En los presentes procedimientos, se pueden producir grandes cantidades de glucopéptidos centrales de trimanosilo elemental y otros glucopéptidos deseados, incluidos glicanos Man3GlcNAc4, que después se pueden modificar para generar grandes cantidades de péptidos que tienen la glucosilación deseada.
El enriquecimiento específico de cualquier tipo concreto de glicano unido a un péptido se puede conseguir usando lectinas que tengan una afinidad por el glicano deseado. Dichas técnicas son bien conocidas en la materia de glucobiología.
Una característica clave de la invención que se describe con mayor detalle más adelante es que una vez que se genera una estructura de glicano central en cualquier péptido, la estructura de glicano se remodela in vitro para generar un péptido que tiene una glucosilación deseada que tiene mejor uso terapéutico en un mamífero. El mamífero puede ser cualquier tipo de mamífero adecuado y es, preferentemente, un ser humano.
Los diversos escenarios y los procedimientos y composiciones precisas para generar péptidos con la glucosilación deseada se harán evidentes a partir de la divulgación siguiente.
El objetivo último de la producción de los péptidos para uso terapéutico en mamíferos es que los péptidos deberán comprender estructuras de glicano que facilitan más que impiden el beneficio terapéutico del péptido. Como se divulga a lo largo de la presente especificación, los péptidos producidos en las células se pueden tratar un Vitro con diversas enzimas que catalizan la escisión de los azúcares que no deben estar presentes en el glicano y la adición de azúcares que deben estar presentes en el glicano, de modo que se genera un péptido que tiene la glucosilación deseada y, por tanto, adecuado para el uso terapéutico en mamíferos. La generación de las diferentes glucoformas de los péptidos en las células se ha descrito anteriormente. Ahora se describen diversos mecanismos para la generación de péptidos que tienen la glucosilación deseada, en los que el material de partida, es decir el péptido producido por una célula, puede diferir de un tipo de célula a otro. Como será evidente a partir de la presente divulgación, no es necesario que el material de partida sea uniforme con respecto a su composición en glicano. No obstante, es preferible que el material de partida se enriquezca para ciertas glucoformas con el fin de que se produzcan grandes cantidades del producto final, es decir, los péptidos correctamente glucosilados.
En una realización preferida de acuerdo con la presente invención, los acontecimientos de degradación y de síntesis que dan lugar a un péptido que tiene la glucosilación deseada implican en algún momento la generación de una estructura central de trimanosilo elemental o una estructura de Man3GlcNAc4 sobre el péptido.
La presente invención también proporciona medios de adición a un péptido de uno o más residuos de glucosilo seleccionados, tras lo cual un azúcar modificado se conjuga con al menos uno de los residuos de glucosilo seleccionados del péptido. La presente realización es útil cuando, por ejemplo, se desea conjugar el azúcar modificado a un residuo glucosilo seleccionado que no está presente en un péptido o que no está presente en la cantidad deseada. Por tanto, antes de acoplar un azúcar modificado a un péptido, el residuo glucosilo seleccionado se conjuga con el péptido mediante acoplamiento enzimático o químico. En otra realización, el patrón de glucosilación de un péptido se altera antes de la conjugación del azúcar modificado mediante la eliminación de un residuo carbohidrato del péptido. Véase, por ejemplo, el documento WO 98/31826.
La adición o eliminación de cualquier resto carbohidrato presente en el péptido se consigue química o enzimáticamente, La desglucosilación química se realiza, preferentemente, mediante la exposición de la variante peptídica al compuesto ácido trifluorometanosulfónico o a un compuesto equivalente. Este tratamiento tiene como resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares a excepción del azúcar de unión (N-acetilgucosamina o Nacetilgalactosamina), al tiempo que deja intacto al péptido. La desglucosilación química se describe en Hakimuddin y col., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 y en Edge y col., 1981, Anal. Biochem. 118: 131. La escisión enzimática de los restos carbohidrato sobre variantes peptídicas se puede conseguir mediante el uso de diversas endo y exoglucosidasas como describen Thotakura y col., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350.
La adición química de los restos glucosilo se lleva a cabo mediante cualquier procedimiento reconocido en la técnica. La adición enzimática de restos de azúcar se consigue, preferentemente, usando una modificación de los procedimientos expuestos en el presente documento, sustituyendo las unidades de glucosilo nativas por los azúcares modificados usados en la invención. Otros procedimientos de añadir restos de azúcar se divulgan en las patentes de EE.UU. Nº 5.876.980. 6.030.815. 5.728.554 y 5.922.577.
Puntos de unión ejemplares para determinados residuos glucosilo incluyen (a) sitios para N-y O-glucosilación; (b) restos glucosilo terminales que son aceptores para una glucosiltransferasa; (c) arginina, asparagina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (r) grupos sulfhidrilo libres tales como los de la cisteína; (f) grupos hidroxilo libres tales como los de la serina, treonina o hidroxiprolina; (g) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano;
o (h) el grupo amida de la glutamina. Ejemplos de procedimientos de uso en la presente invención se describen en el documento WO 87/05330, publicado el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pág. 259-306 (1981).
Tratando específicamente con los ejemplos mostrados en varias de las figuras proporcionadas en el presente documento se presenta una descripción de la secuencia de las reacciones enzimáticas in vitro para la producción de estructuras de glicano deseadas sobre los péptidos. Las condiciones precisas de la reacción para cada una de las conversiones enzimáticas divulgadas más adelante son bien conocidas para los expertos en la técnica de glucobiología y, por tanto, no se repiten en el presente documento. Para una revisión de las condiciones de la reacción para estos tipos de reacciones véase Sadler y col.,1982, Methods in Enzymology 83:458-514 y las referencias citadas en el mismo.
En la Figura 2 se muestra la estructura de un glicano central de trimanosilo elemental en el lado izquierdo. Es posible convertir esta estructura en una estructura de glicano completa que tenga una GlcNAc bisectada incubando la estructura central de trimanosilo elemental en presencia de la GnT-I, seguida de la GnT-II y seguridad después de la GnT-III, y un donante de azúcar que comprende UDP-GlcNAc, en la que GlcNAc se añade secuencialmente a la estructura central de trimanosilo elemental para generar un núcleo de trimanosilo que tiene una GlcNAc bisectada.
En la Figura 4 se muestra la conversión de una GlcNAc bisectada que contiene glicano central de trimanosilo en una estructura de glicano compleja que comprende galactosa y ácido N-acetilneuramínico. La GlcNAc bisectada que contiene glicano central de trimanosilo se incuba primero con galatosiltransferasa y UDP-Gal como molécula donante, en la que dos residuos de galactosa se añaden a los residuos de GlcNAc periféricos sobre la molécula. Después, la enzima NeuAc-transferasa se usa para añadir dos residuos de NeuAc uno a cada uno de los residuos de galactosa.
En la Figura 5 se muestra la conversión de una estructura de glicano rica en manosa en un glicano central de trimanosilo elemental. El glicano rico en manosa (Man9) se incuba secuencialmente en presencia de la manosidasa 1 para generar una estructura de Man5 y, después, en presencia de manosidasa 3, en la que todos menos tres residuos de manosa se eliminan del glicano. Como alternativa, la incubación de la estructura de Man9 se puede recortar para dar otra vez la estructura central de trimanosilo únicamente mediante incubación en presencia de manosidasa 3. De acuerdo con los esquemas presentados en las Figuras 2 y 4 anteriores es posible la conversión de este glicano central de trimanosilo elemental en una molécula de glicano compleja.
En la Figura 6 se muestra una estructura compleja típica de glicano unido a N producida en células vegetales. Es importante destacar que cuando las células vegetales son deficientes en la actividad enzimática GnT-I no se puede
añadir xilosa y fucosa al glicano. Por tanto, el uso de células defectivas en GnT-I proporciona una ventaja concreta en la presente invención en cuanto a que estas células producen péptidos que tienen un núcleo de trimanosilo elemental sobre el cual se pueden añadir azúcares adicionales sin realizar ninguna reacción de “recorte”. De un modo similar, en los casos en los que la estructura producida en una célula vegetal puede ser de la variedad Man5 de glicano, su no hay GnT-I en estas células no se puede añadir xilosa y fucosa a la estructura. En este caso, la estructura de Man5 se puede recortar a un núcleo de trimanosilo elemental (Man3) usando manosidasa 3. De acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento, ahora es posible añadir restos de azúcar deseados al núcleo de trimanosilo para generar una estructura de glicano deseada.
En la Figura 7 se muestra una estructura compleja típica de glicano unido a N producida en células de insecto. Como es evidente también puede haber azúcares adicionales tales como, por ejemplo, fucosa. Además, aunque no se muestra aquí, las células de insecto pueden producir glicanos ricos en manosa que tienen nueve residuos de manosa y pueden tener azúcares adicionales añadidos. También es el caso en células de insecto que células defectivas en GnT-I evitan la adición de residuos de fucosa al glicano. Por tanto, la producción de un péptido en células de insecto se consigue, preferentemente, en una célula defectiva en GnT-I. El glicano producido de este podo se puede recortar in vitro, en caso necesario, usando cualquiera de los procedimientos y esquemas descritos en el presente documento y se pueden añadir azúcares adicionales in vitro usando también los procedimientos y esquemas proporcionados en el presente documento.
En la Figura 3 se muestran estructuras de glicano en varias etapas de finalización. Específicamente, se muestra la generación enzimática in vitro de una estructura central de trimanosilo elemental de una estructura de glicano de carbohidrato completa que no contiene un residuo de GlcNAc bisectada. También se muestra la generación de una estructura de glicano a partir de la misma que contiene una GlcNAc bisectada. Se muestran varias estructuras de glicano intermedias que se pueden producir. Estas estructuras pueden producirse en células o se pueden producir en las reacciones de recorte in vitro descritas en el presente documento. Se pueden añadir restos de azúcar in vitro a la estructura central de trimanosilo elemental o a cualquier estructura intermedia adecuada con el fin de producir un glicano deseado.
En la Figura 8 se muestra una serie de posibles reacciones in vitro que se pueden realizar para recortar y añadir sobre glicanos que comienzan con una estructura rica en manosa. Por ejemplo, un glicano Man9 se puede recortar usando manosidasa 1 para generar un glicano Man5 o se puede recortar hasta un núcleo de trimanosilo usando manosidasa 3 o una o más manosidasas microbianas. Después se pueden usar GnT-I y o GnT-II para transferir residuos de GlcNAc adicionales sobre el glicano. Además, se muestra la situación que no se produciría cuando la molécula de glicano se produce en una célula que no tiene GnT-I (véase el recuadro sombreado). Por ejemplo, solo se puede añadir fucosa y xilosa a un glicano cuando la GnT-I está activa y facilita la transferencia de una GlcNAc a la molécula.
La Figura 9 representa estrategias bien conocidas para la síntesis de estructuras de glicano biantenales, triantenales e incluso tetraantenales comenzando con la estructura central de trimanosilo. De acuerdo con los procedimientos de la invención, es posible sintetizar cada una de estas estructuras in vitro usando las enzimas y condiciones de reacción adecuadas bien conocidas en la técnica de glucobiología.
En la Figura 10 se muestra un esquema para la síntesis de estructuras de carbohidratos todavía más complejas comenzando con una estructura central de trimanosilo. Por ejemplo, se muestra un esquema para la producción in vitro de estructuras antigénicas x de Lewis y a de Lewis que pueden o no estar sialiladas. Dichas estructuras, cuando están presentes en un péptido, pueden conferir al péptido ventajas inmunológicas para regular por aumento
o regular por disminución la respuesta inmunitaria. Además, dichas estructuras son útiles para dirigir el péptido a células específicas, en cuanto a que estos tipos de estructuras están implicadas en la unión a péptidos de adhesión celular y similares.
La Figura 11 es un esquema ejemplar para preparar una matriz de péptidos unidos a O que se originan con serina o treonina.
La Figura 12 es una serie de diagramas que representan los cuatro tipos de estructura de glicano unida a O denominadas núcleos 1 a través de 4. La estructura central se subraya con líneas discontinuas. Los azúcares que también se pueden incluir en esta estructura incluyen residuos de ácido siálico añadidos a los residuos de galactosa y residuos de fucosa añadidos a los residuos de GlcNAc.
Por tanto, en realizaciones preferidas, la presente invención proporciona un procedimiento de fabricar un glucopéptido glucosilado unido a N proporcionando un glucopéptido aislado y purificado al que está unido un núcleo de trimanosilo elemental o una estructura de Man3GlcNAc4, poniendo en contacto el glucopéptido con una enzima glucosiltransferasa y una molécula donante que tiene un resto glucosilo en condiciones adecuadas para transferir el resto glucosilo al glucopéptido. La adaptación de un glucopéptido central de trimanosilo o glucopéptido Man3GlcNAc4 para producir un péptido que tiene un patrón de glucosilación deseado se consigue después mediante la adición secuencial de los restos de azúcar deseados usando técnicas bien conocidas en la materia.
Determinación de la estructura primaria del glicano
Cuando una célula produce glucopéptido unido a N, como se indica en otros ligares del presente documento, puede comprender una mezcla heterogénea de estructuras de glicano que se debe reducir a un núcleo de trimanosilo común generalmente elemental o a una estructura de Man3GlcNAc4, antes de añadir otros restos de azúcar al mismo. Con el fin de determinar exactamente qué azúcares se deben eliminar de cualquier estructura de glicano 5 concreta, en ocasiones es necesario identificar la estructura primaria del glicano. En la materia se conocen bien técnicas para determinar la estructura primaria del glicano y se describen con detalle en, por ejemplo, Montreuil, "Structure and Biosynthesis of Glycopeptides" en Polysaccharides in Medicinal Applications, pág. 273-327, 1996, Eds. Severian Damitriu, Marcel Dekker, NY. Por tanto, es sencillo para un experto en la materia de glucobiología aislar una población de péptidos producidos por una célula y determinar la o las estructuras de los glicanos unidos a 10 los mismos. Por ejemplo, se dispone de procedimientos eficientes para (i) romper los enlaces glucosídicos mediante escisión química tal como hidrólisis, acetólisis, hidrazinólisis, o mediante desaminación nitrosa; (ii) metilación completa seguida de hidrólisis o metanólisis y mediante cromatografía de gases-líquidos y espectroscopia de masas de los monosacáridos parcialmente metilados; y (iii) la definición de enlaces anoméricos entre monosacáridos usando exoglucosidasas, que también proporcionan información sobre la estructura primaria del glicano mediante
15 degradación secuencia. En concreto, las técnicas de espectroscopia de masas y de espectrometría por resonancia magnética nuclear (RMN), especialmente RMN de campo alto, se han usado con éxito para determinar la estructura primaria del glicano.
Los kits y el equipo para el análisis de los carbohidratos también están disponibles comercialmente. En Glyko, Inc. (Novato, CA) se dispone de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforo (FACE®). En el análisis FACE se 20 liberan glucoconjugados del péptido con Endo H o N-glucanasa (PNGasa F) para los glicanos unidos a N o hidrazina para los glicanos unidos a Ser/Thr. Después, el glicano se marca en el extremo reductor con un fluoróforo de un modo no discriminante por estructura. Los glicanos marcados con el fluoróforo se separan después en geles de poliacrilamida en base a la proporción carga/masa del sacárido, además del volumen hidrodinámico. Se toman imágenes del gel con luz UV y la composición de los glicanos se determina mediante la distancia de migración en
25 comparación con los patrones. Los oligosacáridos se pueden secuenciar de este modo analizando los desplazamientos de migración debidos a la eliminación secuencial de los sacáridos mediante digestión con exoglucosidasa.
Realización ejemplar
El remodelado de la glucosilación unida a N se ilustra mejor con referencia a la Fórmula 1:
en la que X3, X4, X5, X6, X7 and X17 son residuos monosacáridos u oligosacáridos (seleccionados de forma independiente); y a, b, c, d, e y x son 0, 1 o 2 ((seleccionados de forma independiente), con la condición de que al menos un miembro seleccionado de a, b, c, d, e y x son 1 o 2.
La Fórmula 1 describe la estructura de glicano que comprende el núcleo de trimanosilo que está unido,
35 preferentemente de forma covalente, a un residuo de asparagina sobre una estructura peptídica. Sistemas de expresión preferidos expresarán y secretarán péptidos exógenos con glicanos unidos a N que comprenden el núcleo de trimanosilo. Usando el método de remodelado de la invención, las estructuras de glicano en estos péptidos se pueden remodelar de forma conveniente en cualquier estructura de glicano deseada. Ejemplos de condiciones de reacción se encuentran a lo largo de los ejemplos y en la literatura.
40 En realizaciones preferidas, las estructuras de glicano se remodelan de un modo tal que la estructura descrita en la Fórmula 1 tenga determinantes específicos. La estructura del glicano se puede elegir para potenciar la actividad biológica del péptido, dar al péptido una nueva actividad biológica, eliminar la actividad biológica del péptido o mejor aproximación al patrón de glucosilación del péptido nativo, entre otros.
En la primera realización preferida, los glicanos unidos a N del péptido se remodelan para que se aproximen mejor al
45 patrón de glucosilación de las proteínas humanas nativas. En esta realización, la estructura del glicano descrito en la Fórmula 1 se remodela para tener los restos siguientes:
X3 y X5 = |-GlcNAc-Gal-SA;
a y c = 1;
d = 0 o 1;
b, e y x = 0.
Esta realización es particularmente ventajosa para los péptidos humanos expresados en sistemas de expresión celular heterólogos. Remodelando las estructuras de glicano unidas a N a esta configuración, el péptido se puede hacer menos inmunogénico en un paciente humano y/o más estable, entre otros.
En la segunda realización preferida, los glicanos unidos a N del péptido se remodelan de modo que tengan un residuo de GlcNAc bisectada sobre el núcleo de trimanosilo. En esta realización, la estructura del glicano descrito en la Fórmula 1 se remodela para tener los restos siguientes:
X3 y X5 are |-GlcNAc-Gal-SA;
a y c = 1;
X4 es GlcNAc;
b=1;
d = 0 o 1;
e y x = 0.
Esta realización es particularmente ventajosa para moléculas de anticuerpo recombinantes expresadas en sistemas de celulares heterólogos. Cuando la molécula de anticuerpo incluye una citotoxicidad celular mediada por Fc, se sabe que la presencia de oligosacáridos bisectados unidos al dominio Fc aumentó espectacularmente la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
En una tercera realización preferida, los glicanos unidos a N del péptido se remodelan de modo que tengan un resto X de Lewis sialilado. En esta realización, la estructura del glicano descrito en la Fórmula 1 se remodela para tener los restos siguientes:
X3 y X5 son
a,c,d = 1;
b, e y x= 0;
X6= fucosa.
Esta realización es particularmente ventajosa cuando se pretende dirigir el péptido que se está remodelando a moléculas de selectina y células que exhiben las mismas.
En una cuarta realización preferida, los glicanos unidos a N del péptido se remodelan para tener un resto conjugado.
El resto conjugado puede ser una molécula de PEG, otro péptido, una molécula pequeña tal como un fármaco, entre otros. En esta realización, la estructura del glicano descrito en la Fórmula 1 se remodela para tener los restos siguientes:
X3 y X5 son |-GlcNAc-Gal-SA-R;
a y c = 1 o 2;
d = 0 o 1;
b, d, e y x = 0;
en la que R= grupo conjugado
El resto conjugado puede ser una molécula de PEG, otro péptido, una molécula pequeña tal como un fármaco, entre otros. Por tanto, esta realización es útil para conjugar el péptido a las moléculas de PEG que ralentizarán la eliminación del péptido de la circulación sanguínea del paciente, a péptidos que se dirigirán ambos péptidos a un tejido o célula específico o a otro péptido de uso terapéutico complementario.
Para un experto en la técnica quedará claro que la invención no está limitada a las moléculas de glicano preferidas descritas anteriormente. Las realizaciones preferidas son únicamente unas pocas de las muchas moléculas de glicano útiles que se pueden elaborar mediante el procedimiento de remodelado de la invención. Los expertos en la técnica conocerán cómo diseñar otros glicanos útiles.
En los primeras realizaciones ejemplares, el péptido se expresa en una célula CHO (línea celular de ovario de hámster chino) de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Cuando un péptido con sitios consenso de glicano unido a N se expresa y secreta en células CHO, los glicanos unidos a N tendrán las estructuras representadas en la fila superior de la Figura 3. Aunque todas estas estructuras pueden estar presentes, las estructuras con mucho más frecuentes son las dos del lado derecho. En los términos de la Fórmula 1,
X3 y X5 son |-GlcNAc-Gal-(SA);
a y c = 1;
b, d, e y x = 0.
Por tanto, en una realización ejemplar, los glicanos unidos a N de los péptidos expresados en las células CHO se remodelan en el glicano humanizado preferido poniendo en contacto los péptidos con una glucosiltransferasa que es específica de una molécula aceptora de galactosa y una molécula donante de ácido siálico. Este procedimiento se ilustra en la Figura 3 y el Ejemplo 2. En otra realización ejemplar, los glicanos unidos a N de un péptido expresado y secretado por las células CHO se remodelan para que sean las estructuras PEGiladas preferidas. El péptido se pone en contacto primero con una glucosidasa específica de ácido siálico para eliminar el resto SA terminal y, después, se pone en contacto con una glucosiltransferasa específica de un resto aceptor de galactosa y un resto aceptor de ácido siálico, en presencia de moléculas donantes de nucleótido de ácido siálico-PEG. Opcionalmente, el péptido se puede poner en contacto después con una glucosiltransferasa específica de un resto aceptor de galactosa y un resto aceptor de ácido siálico en presencia de moléculas donantes de nucleótido-ácido siálico para garantizar completar el la protección en los extremos del SA de todas las moléculas de glicano.
En otras realizaciones ejemplares, el péptido se expresa en células de insecto, tal como la línea celular SF-9, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Cuando un péptido con sitios consenso de glicano unido a N se expresa y secreta en células SF-9, los glicanos unidos a N tendrán a menudo las estructuras representadas en la fila superior de la Figura 7. En los términos de Fórmula 1:
X3 y X5 son |-GlcNAc;
a y c = 0 o 1;
b = 0;
X6 es fucosa,
d = 0, 1 o 2; y
e y x = 0.
El núcleo de trimanosa está presente en la gran mayoría de los glicanos unidos a N fabricados por células de insecto y, en ocasiones también está presente una GlcNAc antenal y/o residuo(s) de fucosa. En una realización ejemplar, los glicanos unidos a N de un péptido expresado y secretado en células de insecto se remodelan en el glicano humanizado preferido poniendo en contacto primero los glicanos con una glucosidasa específica de moléculas de fucosa, después poniendo en contacto los glicanos con una glucosiltransferasa específica de la molécula aceptora de manosa en cada antena del núcleo de trimanosa, una molécula donante de GlcNAc en presencia de moléculas de nucleótido-GlcNAc, después poniendo en contacto los glicanos con una glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de GlcNAc, una molécula donante de Gal, en presencia de moléculas de nucleótido-Gal y, después, poniendo en contacto los glicanos con una glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de galactosa, una molécula donante de ácido siálico en presencia de moléculas de nucleótido-SA. Un experto en la técnica apreciará que las moléculas de fucosa, si existen, se pueden eliminar en cualquier momento durante el procedimiento. En otra realización ejemplar, el glicano humanizado del ejemplo anterior se remodela además en el glicano de x de Lewins sialilado poniendo en contacto el glicano además con una glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de GlcNAc, una molécula donante de fucosa en presencia de moléculas de nucleótidofucosa. Este procedimiento se ilustra en la Figura 10 y el Ejemplo 3.
En otras realizaciones ejemplares, el péptido se expresa en levaduras, tal como Saccharomyces cerevisiae, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Cuando un péptido con sitios consenso de glicano unido a N se expresa y secreta en Saccharomyces cerevisiae, los glicanos unidos a N tendrán las estructuras representadas a la izquierda en la Figura 5. Los glicanos unidos a N siempre tendrán el núcleo de trimanosilo, que a menudo se elaborarán con manosa o polisacáridos relacionados de hasta 1.000 residuos. En los términos de la Fórmula 1:
X3 y X5 = |-Man -Man -(Man)0-1000;
a y c = 1 o 2;
b, d, e y x = 0.
En una realización ejemplar, los glicanos unidos a N de un péptido expresado y secretado por células de levadura se remodelan en el núcleo de trimanosa elemental poniendo en contacto primero los glicanos con una glucosidasa específica de moléculas de α2 manosa, después poniendo en contacto con una glucosidasa específica de moléculas de α6 manosa. Este procedimiento se ilustra en la Figura 5 y el Ejemplo 6. En otra realización ejemplar, los glicanos unidos a N se remodelan además para hacer un glicano adecuado para un anticuerpo recombinante con función de toxicidad celular mediada por Fc poniendo en contacto los glicanos centrales de trimanosa elemental con una glucosiltransferasa específica de la molécula aceptora de manosa en cada antena del núcleo de trimanosa, una molécula donante de GlcNAc en presencia de moléculas de nucleótido-GlcNAc, después poniendo en contacto los glicanos con una glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de manosa en medio del núcleo de trimanosa, una molécula donante de GlcNAc en presencia de moléculas de nucleótido-GlcNAc; después, poniendo en contacto los glicanos con una glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de GlcNAc, una molécula donante de Gal en presencia de moléculas de nucleótido-Gal y, después, poniendo en contacto los glicanos con glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de galactosa, una molécula donante de ácido siálico en presencia de moléculas de nucleótido-SA. Este procedimiento se ilustra en las Figuras 2, 3 y 4.
En otra realización ejemplar, el péptido se expresa en células bacterianas, en particular células de E. coli, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Cuando un péptido con sitios consenso de glicanos unidos a N se expresa en células de E. coli, los sitios consenso unidos a N no estarán glucosilados. En una realización ejemplar se construye una molécula de glicano humanizada a partir de la estructura peptídica poniendo en contacto los péptidos con una glucosiltransferasa específica de un sitio consenso unido a N y una molécula donante de GlcNAc en presencia de nucleótido-GlcNAc; y después poniendo en contacto secuencialmente los glicanos en crecimiento con glucosiltransferasas específicas de los restos aceptores y donantes en presencia del resto donante requerido hasta que se completa la estructura de glicano deseada. Cuando un péptido con glicanos unidos a N se expresa en células eucariotas pero sin las secuencias líder adecuadas que dirigen el péptido naciente al aparato de Golgi, es probable que el péptido maduro no esté glucosilado. En este caso también, se puede proporcionar glucosilación unida a N al péptido elaborando a partir del sitio consenso unido a N del péptido como se ha mencionado anteriormente. Cuando una proteína está modificada químicamente con un resto de azúcar, se puede generar como se ha mencionado anteriormente.
Con estos ejemplos se pretende ilustrar la invención y no limitarla. Un experto en la técnica apreciará que las etapas tomadas en cada ejemplo pueden poder realizarse, en algunas circunstancias, en un orden diferente para obtener el mismo resultado. Un experto en la técnica también entenderá que un conjunto diferente de etapas también pueden producir el mismo glicano resultante. El glicano remodelado preferido no es, de ningún modo, específico del sistema de expresión en el que el péptido se expresa. Los glicanos remodelados son solo ilustrativos y un experto en la técnica sabrá cómo tomar los principios a partir de estos ejemplos y aplicarlos a los péptidos producidos en diferentes sistemas de expresión para hacer glicanos no descritos específicamente en el presente documento.
B. Procedimiento para remodelar glicanos unidos a O
La O-glucosilación se caracteriza por la unión de varios monosacáridos en un enlace O-glucosídico a hidroxiaminoácidos. La O-glucosilación es una amplia modificación postraduccional en los reinos animal y vegetal.
La complejidad estructural de los glicanos unidos con O a proteínas supera considerablemente la de los glicanos unidos a N. Los residuos de serina o treonina de un péptido recién traducido pasan a estar modificados en virtud de una peptidil GalNAc transferasa en los compartimentos cis a trans del Golgi. El sitio de la I-glucosilación no solo está determinado por la especificidad de secuencia de la glucosiltransferasa, sino también la regulación epigenética mediada por competición entre diferentes sitios de sustrato y por competición con otras glucosiltransferasas responsables para formar el glicano.
El glicano unido a O se ha definido arbitrariamente como que tiene tres regiones: el núcleo, la región estructural y la región periférica. La región “central” de un glicano unido a O es los dos o tres azúcares más internos de la cadena de glicano proximales al péptido. La región estructural contribuye principalmente a la longitud de la cadena de glicano formada mediante elongación uniforme. La región periférica exhibe un elevado grado de complejidad estructural. La complejidad estructural de los glicanos unidos a O comienza con la estructura del núcleo. En la mayoría de los casos, el primer residuo de azúcar añadido al sitio consenso del glicano unido a O es GalNAc; no obstante, el azúcar puede también ser GlcNAc, glucosa, manosa, galactosa o fucosa, entre otros. La Figura 11 es un diagrama de algunas de las estructuras del núcleo de glicano unido a O conocidas y las enzimas responsables de su síntesis in vivo.
En células de mamífero se encuentran al menos ocho estructuras centrales unidas a O diferentes, todas en base a un residuo núcleo-α-GalNAc. Las cuatro estructuras centrales representadas en la Figura 12 son las más frecuentes. El núcleo 1 y el núcleo 2 son las estructuras más abundantes en células de mamífero y el núcleo 3 y el núcleo 4 se encuentran en los sistemas de expresión características de órgano más restringidos. Los glicanos unidos a O se revisan en Montreuil, Structure and Synthesis of Glycopeptides, en Polysaccharides en Medicinal Applications, pág. 273-327, 1996, Eds. Severian Damitriu, Marcel Dekker, NY, and in Schachter and Brockhausen, The Biosynthesis of Branched O-Linked Glycans, 1989, Society for Experimental Biology, pág. 1-26 (Gran Bretaña).
En la presente divulgación será evidente que la estructura glicano de los péptidos glucosilados en O se puede remodelar usando técnicas similares a las descritas para glicanos unidos a N. Los O-glicanos difieren de los Nglicanos en que están unidos a un residuo de serina o treonina en lugar de a un residuo de asparagina. Como se describe en el presente documento con respecto al remodelado de N-glicano, se pueden usar las enzimas hidrolíticas para escindir los restos de azúcar indeseados en un glicano unido a O y se pueden añadir los azúcares deseados adicionales para generar una estructura de glicano unido a O adaptado sobre el péptido (véanse las Figuras 11 y 12).
La etapa inicial en la glucosilación-O en células de mamífero es la unión de N-acetilgalactosamina (GalNAc) usando cualquiera de una familia de al menos once α-N-acetilgalactosaminiltransferasas conocidas, cada una de las cuales tiene una especificidad por el péptido aceptor restringida. En general, el péptido aceptor reconocido por cada enzima constituye una secuencia de al menos diez aminoácidos. Los péptidos que contienen la secuencia de aminoácidos reconocida por una GalNAc-transferasa concreta se convierten en O-glucosilados en el sitio aceptor si se expresan en una célula que expresa la enzima y si se localizan adecuadamente en el aparato de Golgi en el que también hay UDP-GalNAc.
No obstante, en el caso de las proteínas recombinantes, la unión inicial de la GalNAc puede no tener lugar. La enzima α-N-acetylgalactosaminiltransferasa nativa de la célula de expresión puede tener una especificidad por la secuencia consenso que difiere de la del péptido recombinante que se está expresando.
El péptido recombinante deseado se puede expresar en una célula bacteriana, tal como E. coli, que no sintetiza cadenas de glicano. En estos casos, es ventajoso añadir el resto de GalNAc inicial in vitro. El resto de GalNAc se puede introducir in vitro sobre el péptido una vez que el péptido recombinante se ha recuperado en forma soluble, poniendo en contacto el péptido con la GalNAc transferasa adecuada en presencia de UDP-GalNAc.
En una realización puede estar presente una secuencia adicional de aminoácidos que constituyen un aceptor eficaz para transferir un azúcar unida a O. Dicha secuencia de aminoácidos está codificada por una secuencia de ADN condensada en marco con la secuencia de codificación del péptido o, como alternativa, se puede introducir por medios químicos. Por otro lado, el péptido puede carecer de cadenas de glicano. Como alternativa, el péptido puede tener cadenas de glicano unido a N y/o a O pero requieren un sitio de glucosilación adicional cuando se desea un sustituyente de glicano adicional.
En una realización ejemplar, la secuencia de aminoácidos de PTTTK-COOH, que es la secuencia aceptora natural de GalNAc en la mucina MUC-1 humana, se añade como cola de fusión. La proteína de fusión se expresa después en E. coli y se purifica. Después, el péptido se pone en contacto con GalNAc-transferasas T3 o T6 humanas recombinantes en presencia de UDP-GalNAc para transferir un residuo de GalNAc sobre el péptido in vitro.
Esta cadena de glicano sobre el péptido se puede además alargar usando los procedimientos descritos con referencia a los glicanos unidos a N o unidos a O en el presente documento. Como alternativa, la reacción de la GalNAc transferasa se puede llevar a cabo en presencia de UDP-GalNAc al que PEG está sustituido covalentemente en las posiciones O-3, 4 o 6 o en la posición N-2. La glucoconjugación se describe con detalle en otros lugares del presente documento. Cualquier antigenicidad introducida en el péptido por la nueva secuencia peptídica puede enmascararse de forma conveniente mediante PEGilación del glicano asociado. La técnica de fusión del sitio aceptor se puede usar para introducir no solo un resto PEG sino para introducir otro glicano o restos que no son glicanos, incluyendo toxinas, antiinfecciosos, agentes citotóxicos, quelantes para radionucleótidos, y glicanos con otras funcionalidades, tales como dirigidos a tejidos.
Realizaciones ejemplares
El remodelado de la glucosilación unida a O se ilustra mejor con referencia a la Fórmula 2:
La Fórmula 2 describe una estructura de glicano que comprende una GalNAc que está unida, preferentemente de forma covalente, a un residuo de serina o treonina sobre una estructura peptídica. Aunque esta estructura se usa para ilustrar las formas más frecuentes de glicanos unidos a O, no debe interpretarse que limitan la invención únicamente a estos glicanos unidos a O. Otras Formas de glicanos unidos a O se ilustran en la Figura 11. Sistemas de expresión preferidos útiles en la presente invención expresan y secretan péptidos exógenos que tienen glicanos unidos a O que comprenden el residuo GalNAc. Usando los procedimientos de remodelado de la invención, las estructuras de glicano en estos péptidos se pueden remodelar de forma conveniente para generar cualquier estructura de glicano deseada. Un experto en la técnica apreciará que los glicanos unidos a O se pueden remodelar usando los mismos principios, enzimas y condiciones de reacción que los disponibles en la técnica una vez armada con la presente divulgación. Ejemplos de condiciones de reacción se encuentran a lo largo de los ejemplos.
En realizaciones preferidas, las estructuras de glicano se remodelan de un modo tal que la estructura descrita en la Fórmula 2 tenga restos específicos. La estructura del glicano se puede elegir para potenciar la actividad biológica del péptido, conferir al péptido una nueva actividad biológica, eliminar o alterar una actividad biológica del péptido o aproximar mejor al patrón de glucosilación del péptido nativo, entre otros.
En la primera realización preferida, los glicanos unidos a O del péptido se remodelan para que se aproximen mejor al patrón de glucosilación de las proteínas humanas nativas. En esta realización, la estructura del glicano descrito en la Fórmula 2 se remodela para tener los restos siguientes:
X2 es |-SA; o |-SA-SA;
f y n = 0 o 1;
X10 es SA;
m =0.
Esta realización es particularmente ventajosa para los péptidos humanos expresados en sistemas de expresión celular heterólogos. Remodelando las estructuras de glicano unidas a O a esta configuración, el péptido se puede hacer menos inmunogénico en un paciente humano y/o más estable.
En la otra realización preferida, los glicanos unidos a O del péptido se remodelan de modo que muestran un antígeno X de Lewis sialilado. En esta realización, la estructura del glicano descrito en la Fórmula 2 se remodela para tener los restos siguientes:
X2 es |-SA;
X10 es Fuc o |-GlcNAc(Fuc)-Gal-SA;
f y n = 1;
m =0.
Esta realización es particularmente ventajosa cuando el péptido que se está remodelando es más eficaz cuando está dirigido a una molécula de selectina y a células que exhiben las mismas.
En otra realización preferida más, los glicanos unidos a O del péptido se remodelan para que contengan un resto conjugado. El resto conjugado puede ser una molécula de PEG, otro péptido, una molécula pequeña tal como un fármaco, entre otros. En esta realización, la estructura del glicano descrito en la Fórmula 2 se remodela para tener los restos siguientes:
X2 es |-SA-R;
f = 1;
n y m = 0;
en la que R es el grupo conjugado.
Esta realización es útil para conjugar el péptido a las moléculas de PEG que ralentizarán la eliminación del péptido de la circulación sanguínea del paciente, a péptidos que se dirigirán ambos péptidos a un tejido o célula específico o a otro péptido de uso terapéutico complementario.
Para un experto en la técnica quedará claro que la invención no está limitada a las moléculas de glicano preferidas descritas anteriormente. Las realizaciones preferidas son únicamente unas pocas de las muchas moléculas de glicano útiles que se pueden elaborar mediante los procedimientos de remodelado de la invención. Los expertos en la técnica conocerán cómo diseñar otros glicanos útiles una vez armados con la presente invención.
En esta primera realización ejemplar, el péptido se expresa en células CHO (línea celular de hámster chino) de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Cuando un péptido con sitios consenso de glicano unido a O se expresa y secreta en células CHO, la mayoría de los glicanos unidos a O tendrán a menudo la estructura en los términos de Fórmula 2:
X2 = |-SA;
f = 1;
m y n = 0.
Por tanto, la mayoría de los glicanos en células CHO no requieren remodelado con el fin de ser aceptables para usar en un paciente humano. En una realización ejemplar, los glicanos unidos a O de un péptido expresado y secretado por una célula CHO se remodelan de modo que contengan una estructura X de Lewis sialilada poniendo en contacto los glicanos con una glucosiltransferasa específica del resto aceptor de GalNAc y el resto donante de fucosa en presencia de nucleótido-fucosa. Este procedimiento se ilustra en los glicanos unidos a N en la Figura 10 y el Ejemplo
3.
En otras realizaciones ejemplares, el péptido se expresa en células de insecto, tal como SF9, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Cuando un péptido con sitios consenso de glicano unido a O se expresa y secreta en la mayoría de las células SF9, la mayoría de los glicanos unidos a O tendrán la estructura, en los términos de Fórmula 2:
X2 = H;
f = 0 o 1;
n y m=0.
Véase, por ejemplo, Marchal y col., (2001, Biol. Chem. 382:151-159). En una realización ejemplar, el glicano unido a O sobre un péptido expresado en una célula de insecto se remodela a un glicano humanizado poniendo en contacto los glicanos con una glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de GalNAc y una molécula donante de galactosa en presencia de nucleótido-Gal; y, después, poner en contacto los glicanos con una glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de Gal y una molécula donante de SA en presencia de nucleótido-SA. En otra realización ejemplar, los glicanos unidos a O se remodelan después a partir de la forma humanizada en la forma x de Lewins sialilado poniendo en contacto además los glicanos con una glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de GlcNAc, una molécula donante de fucosa en presencia de moléculas de nucleótido-fucosa.
En otra realización ejemplar más, el péptido se expresa en células fúngicas, en particular células de O (línea celular de hámster chino) de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Cuando un péptido con sitios consenso de glicano unido a O se expresa y secreta en células S. cerevisiae de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Cuando un péptido con sitios consenso de glicanos unidos a O se expresa y secreta en células de . cerevisiae, la mayoría de los glicanos unidos a O tienen la estructura:
| -AA-Man-Man1-2.
Véase Genmill y Trimble (1999, Biochim. Biophys. Acta 1426:227-237). Con el fin de remodelar estos glicanos unidos a O para uso en seres humanos, es preferible que el glicano se escinda a nivel del aminoácido y se reconstruya a partir de ahí-
En una realización ejemplar, el glicano es el glicano unido a O sobre un péptido expresado en una célula fúngica y se remodela en un glicano humanizado poniendo en contacto el glicano con una endoglucosilasa específica de un enlace aminoácido GalNAc y, después, poniendo en contacto el glicano con una glucosiltransferasa específica de un sitio consenso unido a O y una molécula donante de GalNAc en presencia de nucleótido-GalNAc; poniendo en contacto el glicano con una glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de GalNAc y una molécula donante de galactosa en presencia de nucleótido-Gal; y, después, poniendo en contacto los glicanos con una glucosiltransferasa específica de una molécula aceptora de Gal y una molécula donante de SA en presencia de nucleótido-SA.
Como alternativa, en otra realización ejemplar, el glicano es el glicano unido a O en un péptido expresado en una célula fúngica y se remodela en un glicano humanizado poniendo en contacto el glicano con una proteína O-manosa β-1,2-N-acetilglucosaminiltransferasa (POMGnTI) en presencia de GlcNAc-nucleótido; poniendo en contacto después el glicano con una galactosiltransferasa en presencia de nucleótido-Gal; y, después, poniendo en contacto el glicano con una sialiltransferasa en presencia de nucleótido-SA.
En otra realización ejemplar, el péptido se expresa en células bacterianas, en particular células de E. coli, de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Cuando un péptido con un sitio consenso de glicanos unido a O se expresa en células de E. coli, el sitio consenso unido a O no estarán glucosilados. En este caso, la molécula de glicano deseada se debe elaborar a partir de la estructura peptídica de un modo similar al que se ha descrito para la expresión en S. cerevisiae anteriormente. Además, cuando un péptido que tiene un glicano unido a O se expresa en una célula eucariota sin las secuencias líder adecuadas que dirigen el péptido naciente al aparato de Golgi, es probable que el péptido maduro no esté glucosilado. En este caso también, se puede añadir al péptido una estructura de glucosilo unido a O elaborando el glicano directamente a partir del sitio consenso unido a O del péptido. Además, cuando una proteína está modificada químicamente con un resto de azúcar, también se puede remodelar como se ha mencionado anteriormente.
Con estos ejemplos se pretende ilustrar la invención y no limitarla en modo alguno. Un experto en la técnica apreciará que las etapas tomadas en cada ejemplo pueden poder realizarse, en algunas circunstancias, en un orden diferente para alcanzar el mismo resultado. Un experto en la técnica también entenderá que un conjunto diferente de etapas también pueden producir el mismo glicano resultante. Además, el glicano remodelado preferido no es, de ningún modo, específico del sistema de expresión en el que el péptido se expresa. Los glicanos remodelados son solo ilustrativos y un experto en la técnica sabrá cómo tomar los principios a partir de estos ejemplos y aplicarlos a los péptidos producidos en diferentes sistemas de expresión para hacer glicanos no descritos específicamente en el presente documento.
C. Glucoconjugación en general
La invención proporciona procedimientos de preparar un conjugado de un péptido glucosilado o no glucosilado. Los conjugados de la invención se forman entre péptidos y poli(etilenglicol). También se divulgan conjugados que incluyen dos o más péptidos unidos entre sí mediante una rama ligadora, es decir conjugados multifuncionales. Los conjugados multifuncionales pueden incluir dos o más copias del mismo péptido o un conjunto de diversos péptidos con diferentes estructuras y/o propiedades.
Los conjugados de la invención se forman mediante la unión enzimática de un azúcar modificado al péptido glucosilado o no glucosilado. El azúcar modificado, cuando se interpone entre el péptido y el grupo modificador en el azúcar se convierte en lo que en el presente documento se denomina “grupo de unión a glucosilo intacto". Usando la selectividad exquisita de las enzimas, tal como las glucosiltransferasas, el presente procedimiento proporciona péptidos portadores de un grupo deseado en una o más localizaciones específicas. Por tanto, de acuerdo con la presente invención, un azúcar modificado se une directamente a un locus seleccionado sobre la cadena peptídica o, como alternativa, el azúcar modificado se cuelga sobre un resto carbohidrato de un péptido. Los péptidos en los que los azúcares modificados están unidos a un carbohidrato peptídico y directamente a un residuo de aminoácido de la
5 estructura peptídica también están dentro del alcance de la presente invención.
En contraste a las estrategia de elaboración de péptidos químicas y enzimáticas, los procedimientos de la invención hacen posible unir péptidos y glucopéptidos que tienen un patrón de derivación sustancialmente homogéneo; las enzimas usadas en la invención son, en general, selectivas de un residuo de aminoácido concreto o una combinación de residuos de aminoácido del péptido. Los procedimientos son también prácticos para la producción a 10 gran escala de péptidos modificados y glucopéptidos. Por tanto, los procedimientos de la invención proporcionan un medio práctico para la preparación a gran escala de péptidos que tienen patrones de derivación sustancialmente uniformes preseleccionados. Los procedimientos son particularmente bien adecuados para la modificación de péptidos terapéuticos, incluidos los péptidos que se glucosilan de forma incompleta durante la producción en células en cultivo celular (p. ej., células de mamífero, células de insecto, células vegetales, células fúngicas, células de
15 levaduras o células procariotas) o plantas o animales transgénicos.
Los procedimientos de la invención también proporcionan conjugados de péptidos glucosilados y no glucosilados con mayor semivida terapéutica debido a, por ejemplo, una menor tasa de eliminación o menor tasa de captación por el sistema inmunitario o retículo-endotelial (RES). Además, los procedimientos de la invención proporcionan un medio para enmascarar determinantes antigénicos en péptidos, de modo que se reduce o elimina una respuesta
20 inmunitaria del huésped contra el péptido. La unión selectiva de los agentes de direccionamiento también se puede usar para dirigir un péptido a un tejido concreto o receptor de superficie celular que sea específico del agente dirigido concreto. Además, se proporciona una clase de péptidos que están modificados específicamente con un resto terapéutico.
1. Los conjugados
25 En un primer aspecto, la presente invención proporciona un conjugado entre un péptido y un resto seleccionado, o sea poli(etilenglicol). El enlace entre el péptido y el resto seleccionado incluye un grupo de unión a glucosilo intacto interpuesto entre el péptido y el resto seleccionado. Como se trata en el presente documento, el resto seleccionado es esencialmente cualquier especie que se puede unir a una unidad sacárida que tiene como resultado un “azúcar modificado” que es reconocido por una enzima transferasa adecuada que cuelga el azúcar modificado sobre el
30 péptido. El componente sacárido del azúcar modificado, cuando se interpone entre el péptido y un resto seleccionado se convierte en un “grupo de unión a glucosilo intacto”. El grupo de unión a glucosilo se forma a partir de cualquier mono u oligosacáridos que, tras modificar con un resto seleccionado, es un sustrato de una transferasa adecuada.
Normalmente, los conjugados corresponden a la estructura general.
en la que los símbolos a, b, c, d y s representan un número entero positivo distinto de cero y t es 0 o un número entero positivo. El “agente” es un agente terapéutico, una gente bioactivo, un marcador detectable, resto hidrosoluble o similar. El “agente” puede ser un péptido, por ejemplo una enzima, anticuerpo, antígeno etc. El ligador puede ser cualquiera de una amplia gama de grupos de unión, más adelante. Como alternativa, el ligador puede ser
40 un enlace sencillo o un “ligador de orden cero”. La identidad del péptido es sin limitaciones. Ejemplos de péptidos se proporcionan en la Figura 1.
De acuerdo con la presente invención, el resto seleccionado es un polímero hidrosoluble, o sea poli(etilenglicol). El polímero hidrosoluble está unido covalentemente al péptido a través de un grupo de unión a glucosilo intacto. El grupo de unión a glucosilo está unido covalentemente a un residuo aminoácido o un residuo glucosilo del péptido.
45 Como alternativa, el grupo de unión a glucosilo está unido a una o más unidades de glucosilo de un glucopéptido. La invención también proporciona conjugados en los que el grupo de unión a glucosilo está unido a un residuo aminoácido y a un residuo glucosilo.
Además de proporcionar conjugados que se forman a través de un grupo de unión a glucosilo intacto añadido enzimáticamente, la presente invención proporciona conjugados que son altamente homogéneos en sus patrones de 50 sustitución. Usando los procedimientos de la invención es posible formar conjugados peptídicos en los que esencialmente todos los restos de azúcar modificados en una población de conjugados de la invención están unidos
a múltiples copias de un residuo aminoácido o glucosilo estructuralmente ídéntico. Por tanto, en un segundo aspecto, la invención proporciona un conjugado peptídico que tiene una población de restos polímeros hidrosolubles que están unidos covalentemente al péptido a través de un grupo de unión a glucosilo intacto. En un conjugado preferido de la invención, esencialmente cada miembro de la población está unido mediante el grupo de unión a glucosilo a un residuo glucosilo del péptido y cada residuo glucosilo del péptido al que está unido el grupo de unión a glucosilo tiene la misma estructura.
También se proporciona un conjugado peptídico que tiene una población de restos polímeros hidrosolubles unidos covalentemente al péptido a través de un grupo de unión a glucosilo intacto. En una realización preferida, esencialmente cada miembro de la población de restos polímeros hidrosolubles está unido a un residuo de aminoácido del péptido a través de un grupo de unión a glucosilo intacto y cada residuo de aminoácido que tiene un grupo de unión a glucosilo intacto unido al mismo tiene la misma estructura.
También se divulgan conjugados análogos a los descritos anteriormente en los que el péptido está conjugado a un resto terapéutico, resto diagnóstico, resto de direccionamiento, resto toxina o similar mediante un grupo de unión a glucosilo intacto. Cada uno de los restos citados anteriormente puede ser una molécula pequeña, polímero natural
(p. ej., péptidos) o polímero sintético.
En una realización ejemplar, la interleucina-2 (IL-2) está conjugada a la transferrina mediante un ligador bifuncional que incluye un grupo de unión a glucosilo intacto en cada extremo del resto PEG (Esquema 1). Por ejemplo, une extremo del ligador PEF está funcionalizado con un ligador de ácido siálico intacto que está unido a la transferrina y el otro está funcionalizado con un ligador GalNAc intacto que está unido a la IIL-2.
En otra realización ejemplar, EPO se conjuga a la transferrina.. En otra realización ejemplar, EPO se conjuga al factor de crecimiento neurotrópico derivado de la glía (GDNF). En estas realizaciones, cada conjugación se consigue mediante ligador bifuncional que incluye un grupo de unión a glucosilo intacto en cada extremo del resto PEG, como se ha mencionado anteriormente. La transferrina transfiere la proteína a través de la barrera hematoencefálica.
Como se establece en las Figuras adjuntas, los conjugados de la invención pueden incluir grupos de unión a glucosilo intactos que son mono o multivalentes (p. ej., estructuras antenales), véase las Figuras 13-21. Los conjugados de la invención también incluyen grupos de unión a glucosilo que son glicanos unidos a O que se originan de serina o treonina (Figura 10). Por tanto, los conjugados de la invención incluyen ambas especies en las que un resto seleccionado está unido a aun péptido a través de un grupo de unión a glucosilo monovalente. También se incluyen dentro de la invención conjugados en los que más de un resto seleccionado está unido a un péptido a través de un grupo de unión multivalente. Una o más proteínas se pueden conjugar juntas para aprovechar sus propiedades biofísicas y biológicas.
En otra realización más, la invención proporciona conjugados que se localizan de forma selectiva en un tejido concreto debido a la presencia de un agente de direccionamiento como componente del conjugado. En una realización ejemplar, el agente de direccionamiento es una proteína. Proteínas ejemplares incluyen transferrina (cerebro, acumulación de sangre), suero humano-glucoproteína-(HS) (hueso, cerebro, acumulación de sangre), anticuerpos (cerebro, tejido con antígeno específico de anticuerpo, acumulación de sangre), factores de coagulación V-XII (tejido dañado, coágulos, cáncer, acumulación de sangre), proteínas séricas, por ejemplo glucoproteína αácida, fetuína, α-fetoproteína (cerebro, acumulación de sangre), β2-glucoproteína (hígado, pacas de aterosclerosis, cerebro, acumulación de sangre), G-CSF, GM-CSF, M-CSF, y EPO (estimulación inmunitaria, cánceres, acumulación de sangre, sobreproducción de glóbulos rojos, neuroprotección) y albúmina (incremento de la semivida).
Además de los conjugados tratados anteriormente, la presente invención proporciona procedimientos para preparar estos y otros conjugados. Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de formar un conjugado covalente entre un resto seleccionado y un péptido. Adicionalmente, la invención proporciona procedimientos para dirigir conjugados de la invención a un tejido o región concretos del cuerpo.
En realizaciones ejemplares, el conjugado se forma entre un polímero hidrosoluble, o sea poli(etilenglicol), y un péptido glucosilado o no glucosilado. El polímero, resto terapéutico o biomolécula está conjugado al péptido a través de un grupo de unión a glucosilo intacto que se interpone entre el péptido y el grupo modificador y se une covalentemente (es decir, poli(etilenglicol). El procedimiento incluye poner en contacto el péptido con una mezcla que contiene un azúcar modificado y una glucosiltransferasa para la cual el azúcar modificado es un sustrato. La reacción se lleva a cabo en condiciones suficientes para formar un enlace covalente entre el azúcar modificado y el péptido. El resto azúcar del azúcar modificado se selecciona de azúcares nucleotídicos.
En una realización, la invención proporciona un procedimiento para unir dos o más péptidos a través de un grupo de unión. El grupo de unión es de cualquier estructura útil y se puede seleccionar de estructuras de cadena lineal o de cadena ramificada. Preferentemente, cada extremo del ligador, que está unido a un péptido, incluye un azúcar modificado (es decir, un grupo de unión a glucosilo intacto naciente).
En un procedimiento ejemplar de la invención, dos péptidos se unen entre sí a través de un resto ligador que incluye un ligador de PEF. El constructo se adapta a la estructura general establecida en el recuadro anterior. Como se ha descrito en el presente documento, el constructo de la invención incluye dos grupos de unión a glucosilo intactos (es decir, s + t = 1). El centro en un ligador PEG que incluye do grupos glucosilo es a efectos de claridad y no debe interpretarse como limitante de la identidad de las ramas ligadoras de uso en esta realización de la invención.
Por tanto, un resto PEG está funcionalizado en un primer extremo con una primera unidad de glucosilo y un segundo
5 extremo con una segunda unidad de glucosilo. La primera y la segunda unidad de glucosilo son, preferentemente, sustratos para diferentes transferasas, lo que permite la unión ortogonal de los péptidos primero y segundo a la primera y la segunda unidad de glucosilo, Respectivamente. En la práctica, el ligador (glucosil)1-PEG-(glucosil)2 se pone en contacto con el primer péptido y una primera transferasa para la cual la primera unidad de glucosilo es un sustrato, formando de este modo el (péptido)1-(glucosil)1-PEG-(glucosil)2. Después, opcionalmente, la primera
10 transferasa y/o péptido sin reaccionar se eliminan de la mezcla de reacción. El segundo péptido y una segunda transferasa para la que la segunda unidad de glucosilo es un sustrato se añaden al conjugado (péptido)1-(glucosil)1PEG-(glucosil)2, formando el (péptido)1-(glucosil)1-PEG-(glucosil)2-(péptido)2. Los expertos en la técnica apreciarán que el procedimiento indicado anteriormente también es aplicable a la formación de conjugados entre más de dos péptidos mediante, por ejemplo, el uso de un PEG ramificado, dendrímero, poli(aminoácido), polisacárido o similar.
15 Como se ha indicado anteriormente, en una realización ejemplar, la interleucina-2 (IL-2) está conjugada a la transferrina mediante un ligador bifuncional que incluye un grupo de unión a glucosilo intacto en cada extremo del resto PEG (Esquema 1). El conjugado de IL-2 tiene una semivida in vivo que aumenta sobre la de la IL-2 sola en virtud del mayor tamaño molecular del conjugado. Además, la conjugación de la IL-2 a la transferrina sirve para dirigir selectivamente el conjugado al cerebro. Por ejemplo, un extremo del ligador PEG se funcionaliza con un CMP
20 ácido siálico y el otro se funcionaliza con un UDP-GalNAc. El ligador se combina con IL-2 en presencia de una GalNAc transferasa, lo que tiene como resultado la unión de la GalNAc de la rama ligadora a un residuo de serina y/o treonina en la IL-2.
En otra realización ejemplar, la transferrina se conjuga con un ácido nucleico para usar en terapia génica.
Esquema 1
Los procedimientos descritos anteriormente se pueden llevar a cabo a través de tantos ciclos como se desee y no están limitados a formar un conjugado entre dos péptidos con un único ligador. Además, los expertos en la técnica apreciarán que las reacciones que funcionalizan los grupos de unión a glucosilo intactos en los extremos del ligador PEG (u otros) con el péptido se pueden producir de forma simultánea en el mismo vaso de reacción o se pueden
30 llevar a cabo de un modo escalonado. Cuando las reacciones se llevan a cabo de un modo escalonado, el conjugado producido en cada etapa se purifica opcionalmente entre uno o más componentes de la reacción (p. ej., enzimas, péptidos).
Una realización ejemplar más se expone en el Esquema 2. El Esquema 2 muestra un procedimiento de preparar un conjugado que dirige una proteína seleccionada, por ejemplo EPO, al hueso e incrementa la semivida en circulación
35 de la proteína seleccionada.
Esquema 2
El uso de derivados reactivos de PEG (u otros ligadores) para unir uno o más restos peptídicos al ligador está dentro del alcance de la presente invención. La invención no está limitada por la identidad del análogo de PEG reactivo. Muchos derivados activados de poli(etilenglicol) están disponibles comercialmente y en la literatura. Dentro de la capacidades de un experto entra elegir y sintetizar en caso necesario un derivado de PEG activado adecuado con el que preparar un sustrato útil en la presente invención. Véase, Abuchowski y col., Cancer Biochem. Biophys., 7: 175186 (1984); Abuchowski y col., J. Biol. Chem., 252: 3582-3586 (1977); Jackson y col, Anal. Biochem., 165: 114-127 (1987); Koide y col., Biochem Biophys. Res. Commun., 111: 659-667 (1983)), tresilato (Nilsson y col., Methods Enzymol., 104: 56-69 (1984); Delgado y col., Biotechnol. Appl. Biochem., 12: 119-128 (11990)); ésteres activos derivados de N-hidroxisuccinimida (Buckmann y col., Makromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981); Joppich y col., Makromol. Chem., 180: 1381-1384 (1979); Abuchowski y col., Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984); Katre y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 1487-1491 (1987); Kitamura y col., Cancer Res., 51: 4310-4315 (1991); Boccu y col., Z. Naturforsch., 38C: 94-99 (1983), carbonatos (Zalipsky y col., POLY(ETHYLENE GLYCOL) CHEMISTRY: BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, Harris, Ed., Plenum Press, New York, 1992, pág. 347-370; Zalipsky y col., Biotechnol. Appl. Biochem., 15: 100-114 (1992); Veronese y col., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141152 (1985)), formiatos de imidazolilo (Beauchamp y col., Anal. Biochem., 131: 25-33 (1983); Berger y col., Blood, 71: 1641-1647 (1988)), 4-ditiopiridinas (Woghiren y col., Bioconjugate Chem., 4: 314-318 (1993)), isocianatos (Byun y col., ASAIO Journal, M649-M-653 (1992)) y epóxidos (patente de EE.UU, Nº 4.806.595, concedida a Noishiki y col. (1989). Oreos grupos de unión incluyen el enlace uretano entre grupos amino y PEG activado. Véase, Veronese, y col., Appl. Biochem. Biotechnol., 11: 141-152 (1985).
En otra realización ejemplar en la que se usa un derivado de PEG reactivo, la invención proporciona un procedimiento para extender la semivida en la circulación sanguínea de un péptido seleccionado, en esencia dirigir el péptido a la acumulación de sangre, conjugando el péptido con un polímero sintético o natural de un tamaño suficiente para retrasar la filtración de la proteína por el glomérulo (p. ej., albúmina). Esta realización de la invención se ilustra en el Esquema 3 en el que la eritropoyetina (EPO) se conjuga con albúmina a través de un ligador PEG usando una combinación de modificación química y enzimática.
Esquema 3
Por tanto, como se muestra en el Esquema 3, un residuo aminoácido de la albúmina se modifica con un derivado de PEG reactivo, tal como X-PEG-(CMP-ácido siálico), en el que X es un grupo activador (p. ej. éster activo, isotiocianato, etc.). El derivado de PEG y EPO se combinan y ponen en contacto con una transferasa para la cual CMP-ácido siálico es un sustrato. En una realización ilustrativa adicional, una ε-amina de lisina se hace reaccionar con el éster N-hidroxisuccinimida del ligador de PEG para formar el conjugado de albúmina. El CMP-ácido siálico del ligador se conjuga enzimáticamente a un residuo adecuado sobre la EPO, por ejemplo Gal, de modo que se forma el conjugado. Los expertos apreciarán que el procedimiento descrito anteriormente no está limitado a las parejas de reacción expuestas. Además, el procedimiento se puede poner en práctica para formar conjugados que incluyan más de dos restos proteicos mediante, por ejemplo, el uso de un ligador ramificado que tenga más de dos extremos.
2. Azúcares modificados
Las especies donantes de glucosilo modificado (“azúcares modificados”) se seleccionan de nucleótidos de azúcar modificados. Cualquier estructura de carbohidrato deseada se puede añadir a un péptido usando los procedimientos de la invención. Normalmente, la estructura será un monosacárido, pero la presente invención no está limitada al uso de azúcares monosacáridos modificados; también son útiles los oligosacáridos y los polisacáridos.
El grupo modificador se une a un resto azúcar por medios enzimáticos, medios químicos o una combinación de los mismos, de modo que se produce un azúcar modificado. Los azúcares se sustituyen en cualquier posición que permita la unión del resto modificador, aunque debe seguir permitiendo que el azúcar funcione como sustrato de la enzima usada para ligar el azúcar modificado al péptido. En una realización preferida, cuando el ácido siálico es el azúcar, el ácido siálico está sustituido con el grupo modificador en la posición 9 en la cadena lateral de piruvilo o en la posición 5 en el resto amina que normalmente está acetilado en el ácido siálico.
De acuerdo con la presente invención se usa un nucleótido con azúcar modificado para añadir el azúcar modificado al péptido. Nucleótidos ejemplares con azúcar que se usan en la presente invención en su forma modificada incluyen nucleótidos mono, di o trifosfatos o análogos de los mismos. En una realización preferida, el nucleótido con azúcar modificado se selecciona de un UDP-glucósido, CMP-glucósido o GDP-glucósido. Incluso más preferentemente, el nucleótido con azúcar modificado se selecciona de UDP-galactosa, UDP-galactosamina, UDP-glucosa, UDPglucosamina, GDP-manosa, GDP-fucosa, CMP-ácido siálico o CMP-NeuAc. Los derivados de N-acetilamina de los nucleótidos con azúcar también son útiles en el procedimiento de la invención.
La invención también proporciona procedimientos para sintetizar un péptido modificado usando un azúcar modificado, por ejemplo galactosa, fucosa y ácido siálico modificados. Cuando se usa un ácido siálico modificado, en estos procedimientos se pueden usar una sialiltransferasa o una transialidasa (sólo para el ácido siálico unido en α-2,3).
También se divulgan realizaciones en las que el azúcar modificado es un azúcar activado. Los azúcares modificados activados que son útiles en la presente invención normalmente son glucósidos que se han alterado sintéticamente para incluir un grupo saliente activado. Como se usa en el presente documento, la expresión “grupo saliente activado" hace referencia a los restos que se desplazan fácilmente en reacciones de sustitución nucleofílica reguladas por enzimas. En la técnica se conocen muchos azúcares activados. Véase, por ejemplo, Vocadlo y col.., en CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY, Vol. 2, Ernst y co., Ed., Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Germain, 2000; Kodama y col., Tetrahedron Lett. 34: 6419 (1993); Lougheed, y col., J. Biol. Chem. 274: 37717 (1999)).
Ejemplos de grupos activadores (grupos salientes) incluyen flúor, cloro, bromo, éster de tosilato, éster de mesilato y éster de triflato. Grupos salientes activados preferidos son os que no estorban estéricamente de forma significativa la transferencia enzimática del glucósido al aceptor. En consecuencia, realizaciones preferidas de derivados de glucósido activados incluyen fluoruros de glucosilo y mesilatos de glucosilo, siendo los fluoruros de glucosilo particularmente preferidos. Entre los fluoruros de glucosilo, los más preferidos son fluoruro de α-galactosilo, fluoruro de α-manosilo, fluoruro de α-glucosilo, fluoruro de α-fucosilo, fluoruro de α-xilosilo, fluoruro de α-sialilo, fluoruro de αN-acetilglucosaminilo, fluoruro de α-N-acetilgalactosaminilo, fluoruro de β-galactosilo, fluoruro de β-manosilo, fluoruro de β-glucosilo, fluoruro de β-fucosilo, fluoruro de β-xilosilo, fluoruro de β-sialilo, fluoruro de β-Nacetilglucosaminilo y fluoruro de β-N-acetilgalactosaminilo.
A modo de ilustración, se pueden preparar fluoruros de glucosilo a partir del azúcar libre acetilando primero el azúcar y después tratándolo con HF/piridina. Esto genera el anómero termodinámicamente más estable del fluoruros de glucosilo protegido (acetilado), es decir el fluoruro de α-glucosilo). Si se desea el anómero menos estable (es decir, el fluoruro de β-glucosilo), se puede preparar convirtiendo el azúcar peracetilado con HBr/HOAc o con HCl para generar el bromuro o cloruro anomérico. Este intermedio se hace reaccionar con una sal de fluoruro tal como fluoruro de plata para generar el fluoruro de glucosilo. Los fluoruros de glucosilo acetilados se pueden desproteger mediante reacción con una base suave (catalítica) en metanol (p. ej., NaOMe/MeOH). Además, muchos fluoruros de glucosilo están disponibles comercialmente.
Otros derivados de glucosilo activados se pueden preparar usando procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los mesilatos de glucosilo se pueden preparar mediante tratamiento de la forma hemiacetal completamente bencilado del azúcar con cloruro de mesilo, seguido de hidrogenación catalítica para eliminar los grupos bencilo.
En otra realización ejemplar, el azúcar modificado es un oligosacárido que tiene una estructura antenal. En una realización preferida, uno o más de los extremos de la antena portan el resto modificador. Cuando más de un resto modificador está unido a un oligosacáridos que tiene una estructura antenal, el oligosacáridos es útil para “amplificar” el resto modificador; cada unidad de oligosacáridos conjugada con el péptido une múltiples copias del grupo modificador al péptido. La estructura general de un quilato típico de la invención como se expone en la figura anterior abarca especies multivalentes que son el resultado de preparar un conjugado de la invención usando una estructura antenal. En la técnica se conocen muchas estructuras de sacárido antenales y el presente procedimiento se puede poner en práctica con ellas sin limitaciones.
Ejemplos de grupos modificadores se tratan a continuación. Los grupos modificadores se pueden seleccionar de una
o más propiedades deseables. Ejemplos de propiedades incluyen mayor farmacocinética, mayor farmacodinamia, mejor biodistribución, que proporciona una especie polivalente, mejor solubilidad en agua, mayor o menor lipofilicidad y direccionamiento tisular.
D.
Conjugados peptídicos
a) Polímeros hidrosolubles
La hidrofilicidad de un péptido seleccionado se potencia mediante conjugación con moléculas polares, tales como moléculas que contienen amina, éster, hidroxilo y polihidroxilo. Ejemplos representativos incluyen polilisina, polietilenimina, poli(etilenglicol) y poli(propilenglicol). Polímeros hidrosolubles preferidos son, esencialmente, no fluorescentes o emiten una cantidad tan mínima de fluorescencia que son inadecuados para usar como marcadores fluorescentes en un ensayo. Se pueden usar polímeros que no sean azúcares naturales. Además, también se contempla el uso de un azúcar de otro modo natural que está modificado por la unión covalente de otra entidad (p. ej., poli(Etilenglicol), poli(propilenglicol), poli(aspartato), biomolécula, resto terapéutico, resto diagnóstico etc.). En otra realización ejemplar, un resto de azúcar terapéutico se conjuga con una rama ligadora y la rama ligadora-azúcar se conjuga después con un péptido a través de un procedimiento de la invención.
En la literatura se describen procedimientos y químicas para la activación de polímeros y sacáridos hidrosolubles, así como procedimientos para conjugar sacáridos y polímeros a varias especies. Procedimientos de uso habitual para la activación de polímeros incluyen activación de grupos funcionales con bromuro de cianógeno, peryodato, glutaraldehído, biepóxidos, epiclorohidrina, divinilsulfona, carbodiimida, haluros de sulfonilo, triclorotriazina etc. (véase, R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTALS AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson y col., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., y col., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).
En la técnica se conocen vías para preparar moléculas de PEG reactivo y formar conjugados usando las moléculas reactivas. Por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.672.662 divulga un conjugado hidrosoluble y aislable de un éster activo de un polímero ácido seleccionado de poli(óxidos de alquileno) lineales o ramificados, poli(polioles oxietilados), poli(alcoholes olefínicos) y poli(acrilomorfolina), en los que el polímero tiene aproximadamente 44 o más unidades recurrentes.
La patente de EE.UU. Nº 6,376,604 establece un procedimiento para preparar un éster de 1-benzotriazoilcarbonato hidrosoluble de un polímero hidrosoluble y no peptídico haciendo reaccionar un hidroxilo terminal del polímero con carbonato de di(1-benzotriazoílo) en un disolvente orgánico. El éster activo se usa para formar conjugados con un agente biológicamente activo, tal como una proteína o péptido.
El documento WO 99/45964 describe un conjugado que comprende un agente biológicamente activo y un polímero hidrosoluble activado que comprende un armazón polimérico que tiene al menos un extremo unido al armazón polimérico a través de un enlace estable, en el que al menos un extremo comprende un resto ramificado que tiene grupos reactivos proximales unidos al resto ramificado, en el que el agente biológicamente activo está unido a al menos uno de los grupos reactivos proximales. Otros poli(etilenglicoles) ramificados se describen en el documento WO 96/21469, la patente de EE.UU. Nº 5.932.462 describe un conjugado formado con una molécula de PEG ramificada que incluye un extremo ramificado que incluye grupos funcionales reactivos. Los grupos reactivos libres están disponibles para reaccionar con una especie biológicamente activa, tal como una proteína o péptido, formando conjugados entre el poli(etilenglicol) y la especie biológicamente activa. La patente de EE.UU. Nº 5.446.090 describe un ligador PEG bifuncional y su uso en la formación de conjugados que tienen un péptido en cada uno de los extremos del ligador PEG.
Los conjugados que incluyen enlaces PEG degradables se describen en los documentos WO 99/34833 y WO 99/14259, así como en la patente de EE.UU. Nº 6.348.558. Dichos enlaces degradables son aplicables en la presente invención.
Aunque tanto los derivados de PEG reactivo como los conjugados formados usando los derivados se conocen en la técnica, hasta la presente invención no se ha reconocido que se podía formar un conjugado entre PEG (u otro polímero) y otra especie, tal como un péptido o glucopéptido, a través de un grupo de unión a glucosilo intacto.
Los expertos en la técnica conocen muchos polímeros hidrosolubles. La expresión polímeros hidrosoluble abarca especies tales como sacáridos (p. ej., dextrano, amilasa, ácido hialurónico, ácido poli(siálico), heparanos, heparinas etc.), poli(aminoácidos), ácidos nucleicos, polímeros sintéticos (p. ej., ácido poli(acrílico), poli(éteres), por ejemplo poli(etilenglicol), péptidos y proteínas.
Procedimientos para activación de polímeros también se pueden encontrar en el documento WO 94/17039, la patente de EE.UU. Nº 5.324.844, los documentos WO 94/18247, WO 94/04193, la patente de EE.UU. Nº 5.219.564, la patente de EE.UU. Nº 5.122.614, el documento WO 90/13540, la patente de EE.UU. Nº 5.281.698, y más en el
5 documento WO 93/15189, y, para la conjugación entre polímeros y enzimas activados, por ejemplo el factor de coagulación VIII (documento WO 94/15625), hemoglobina (documento WO 94/09027), la molécula transportadora de oxígeno (patente de EE.UU. Nº 4.412.989), ribonucleasa y superóxido dismutasa (Veronese y col., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)).
Polímeros hidrosolubles preferidos son aquellos en los que una proporción sustancial de las moléculas de polímero
10 en una muestra del polímero tienen aproximadamente el mismo peso molecular; dichos polímeros son “homodispersos”.
La presente invención se ilustra además por referencia a un conjugad de poli(etilenglicol). Se dispone de varias revisiones y monografías sobre la funcionalización y conjugación de PEG. Véase por ejemplo, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong y col., Enzyme
15 Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado y col., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); y Bhadra y col., Pharmazie, 57:5-29 (2002).
Moléculas de poli(etilenglicol) adecuadas para usar en la invención incluyen las descritas por la siguiente Fórmula 3:
Fórmula 3
20 R= H, alquilo, bencilo, arilo, acetal, OHC-, H2N-CH2CH2-, HS-CH2CH2-,
-
azúcar-nucleótido, proteína, metilo, etilo;
X, Y, W, U (seleccionados de forma independiente) = O, S, NH, N-R’;
R’, R"’ (seleccionados de forma independiente) = alquilo, bencilo, arilo, alquilo, arilo, piridilo, arilo sustituido, 25 arilalquilo, acilarilo;
n = 1 a 2.000;
m, q, p (seleccionados de forma independiente) = 0 a 20
o = 0 a 20; Z = HO, NH2, halógeno, S-R"’, ésteres activados,
-azúcar-nucleótido, proteína, imidazol, HOBT, tetrazol, haluro; y V = HO, NH2, halógeno, S-R"’, ésteres activados, amidas activadas, -azúcar-nucleótido, proteína.
En realizaciones preferidas, la molécula de poli(etilenglicol) se selecciona de las siguientes:
El poli(etilenglicol) útil en la formación del conjugado de la invención es lineal o ramificado. Moléculas de poli(etilenglicol) adecuadas para usar en la invención incluyen las descritas por la siguiente Fórmula:
Fórmula 4
R’, R", R’" (seleccionados de forma independiente) = H, alquilo, bencilo, arilo, acetal, OHC-, H2N-CH2CH2-, HS-CH2CH2-, -(CH2)qCY-Z,
10 -azúcar-nucleótido, proteína, metilo, etilo, heteroarilo, acilalquilo, acilarilo, acilalquilarilo; X,Y, W, A, B (seleccionados de forma independiente) = O, S, NH, N-R’, (CH2)1; n, p (seleccionados de forma independiente) = 1 a 2.000 m, q, o (seleccionados de forma independiente) = 0 a 20; Z = HO, NH2, halógeno, S-R"’, ésteres activados,
-azúcar-nucleótido, proteína; V = HO, NH2, halógeno, S-R"’, ésteres activados, amidas activadas, -azúcar-nucleótido, proteína. La semivida in vivo, el área debajo de la curva y/o el tiempo de residencia de los péptidos terapéuticos también se pueden potenciar con polímeros hidrosolubles tales como polietilenglicol (PEG) u polipropilenglicol (PPG). Por
20 ejemplo, la modificación química de proteínas con PEG (PEGilación) aumenta su tamaño molecular y disminuye su accesibilidad en superficie y del grupo funcional, cada uno de los cuales dependen del tamaño del PEG unido a la proteína. Esto tiene como resultado una mejora de las semividas en plasma y de la estabilidad proteolítica y una disminución de la inmunogenicidad y la captación hepática (Chaffee y col., J. Clin. Invest. 89: 1643-1651 (1992); Pyatak y col., Res. Commun. Chem. Pathol Pharmacol. 29: 113-127 (1980)). Se ha notificado que la PEGilación de
25 la interleucina-2 aumenta su potencia antitumoral in vivo (Katre y col.,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 1487-1491 (1987)) y la PEGilación de un F(ab’)2 derivado del anticuerpo monoclonal A7 ha mejorado su localización tumoral (Kitamura y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 28: 1387-1394 (1990)).
En una realización preferida, la semivida in vivo de un péptido derivado de un polímero hidrosoluble mediante un procedimiento de la invención ha aumentado con respecto a la semivida in vivo del péptido no derivado. En otra realización preferida, el área bajo la curva de un péptido derivado de un polímero hidrosoluble usando un procedimiento de la invención ha aumentado con respecto al área bajo la curva del péptido no derivado. En otra realización preferida, el tiempo de residencia de un péptido derivado de un polímero hidrosoluble usando un procedimiento de la invención ha aumentado con respecto al tiempo de residencia del péptido no derivado. Las técnicas para determinar la semivida in vivo, el área bajo la curva y el tiempo de residencia son bien conocidas en la materia. Descripciones de estas técnicas se pueden encontrar en J.G. Wagner, 1993, Pharmacokinetics for the Pharmaceutical Scientist, Technomic Publishing Company, Inc. Lancaster PA.
El incremento de la semivida in vivo del péptido se expresa mejor como un intervalo del porcentaje de incremento en esta cantidad. El extremo inferior del intervalo del porcentaje de incremento es de aproximadamente 40 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 100 % o aproximadamente 150 % o aproximadamente 200 %. El extremo superior del intervalo es de aproximadamente 60 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 100 %, aproximadamente 150 % o más de aproximadamente 250 %.
En una realización ejemplar, la presente invención proporciona una hormona estimulante del folículo PEGilada (Ejemplos 9 y 10). En otra realización ejemplar, la invención proporciona una transferrina PEGilada (Ejemplo 13).
Otros polímeros hidrosolubles ejemplares de uso en la invención incluyen poli(óxidos de alquileno), poli (polioles oxietilados), poli(alcoholes olefínicos) y poli(acrilomorfolina), dextrano, almidón, poli(aminoácidos) etc.
b) Polímeros insolubles en agua
Los conjugados de la invención pueden incluir también uno o más polímeros insolubles en agua. Esta realización de la invención se ilustra mediante el uso del conjugado como vehículo con el cual liberar un péptido terapéutico de un modo controlado. En la técnica se conocen sistemas de liberación de fármacos poliméricos. Véase, por ejemplo, Dunn y col., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991. Los expertos en la técnica apreciarán que sustancialmente cualquier sistema de liberación de fármacos conocido es aplicable a los conjugados de la presente invención.
Polímeros insolubles en agua representativos incluyen polifosfazina, alcoholes de polivinilo, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, poliacrilamidas, polialquilenglicoles, óxidos de polialquileno, tereftalatos de polialquileno, éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilo, polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli (acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo) polietileno, polipropileno, poli(etilenglicol), polióxido de etileno, poli (tereftalato de etileno), poli(acetato de vinilo), cloruro de polivinilo, poliestireno, polivinilpirrolidona, pluronics y polivinilofenol y copolímeros de los mismos.
Polímeros naturales modificados sintéticamente de uso en conjugados de la invención incluyen alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa y nitrocelulosas. Miembros particularmente preferidos de las clases amplias de polímeros naturales modificados sintéticamente incluyen metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, acetato de celulosa, propionato de celulosa, acetato butirato de celulosa, acetato ftalato de celulosa, carboximetilcelulosa, triacetato de celulosa, sal de sodio de sulfato de celulosa y polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos y ácido algínico.
Estos y los otros polímeros tratados en el presente documento se pueden obtener fácilmente a partir de fuentes comerciales tales como Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO.), Polysciences (Warrenton, PA.), Aldrich (Milwaukee, WI.), Fluka (Ronkonkoma, NY), y BioRad (Richmond, CA), o sintetizarse a partir de monómeros obtenidos de estos suministradores usando técnicas estándar.
Polímeros biodegradables representativos de uso en los conjugados de la invención incluyen poliláctidos, poliglicólidos y copolímeros de los mismos, poli(tereftalato de etileno), ácido poli(butírico), ácido poli(valérico), poli(láctida-cocaprolactona), poli(láctiuda-coglicólido), polianhídridos, poliortoésteres, mezclas y copolímeros de los mismos. De particular uso son las composición que forman geles, como las que incluyen colágeno y pluronics.
Los polímeros de uso en la invención incluyen polímeros “híbridos” que incluyen materiales insolubles en agua que tienen dentro de al menos una porción de su estructura una molécula bioreabsorbible. Un ejemplo de dicho polímero es uno que incluye un copolímero insoluble en agua, que tiene una región bioreabsorbible, una región hidrófila y una pluralidad de grupos funcionales reticulables por cadena polimérica.
Para los fines de la presente invención, “materiales insolubles en agua” incluye materiales que son sustancialmente insolubles en agua o ambientes que contienen agua. Por tanto, aunque ciertas regiones o segmentos del copolímero pueden ser hidrófilas o incluso hidrosolubles, la molécula polimérica, como un nodo, no se disuelve en agua en ningún grado sustancial.
Para los fines de la presente invención, la expresión “molécula bioreabsorbible” incluye una región que es capaz de metabolizarse o degradarse y reabsorberse y/o eliminarse por vías de excreción normales del cuerpo. Dichos metabolitos o productos de degradación son, preferentemente, sustancialmente no tóxicos para el cuerpo.
La región bioreabsorbible puede ser hidrófoba o hidrófila, siempre que la composición copolimérica como un todo no se haga hidrosoluble. Por tanto, la región bioreabsorbible se selecciona en base a la preferencia de que el polímero, como un todo, permanezca insoluble en agua. En consecuencia, las propiedades relativas, es decir los tipos de grupos funcionales contenidos y las proporciones relativas de la región bioreabsorbible y la región hidrófila se seleccionan para garantizar que las composiciones bioreabsorbibles útiles siguen siendo insolubles en agua.
Polímeros reabsorbibles ejemplares incluyen, por ejemplo, copolímeros de bloque reabsorbibles producidos de forma sintética de poli(ácido α-hidroxi-carboxílico)/poli(alquileno, (véase Cohn y col., patente de EE.UU. Nº 4.826.945). Estos copolímeros no están reticulados y son hidrosolubles, de modo que el cuerpo puede excretar las composiciones de copolímeros de bloque degradadas. Véase Younes y col., J Biomed. Mater. Res. 21: 1301-1316 (1987); y Cohn y col., JBiomed. Mater. Res. 22: 993-1009 (1988).
Polímeros bioreabsorbibles preferidos en el presente documento incluyen uno o más componentes seleccionados de poli(ésteres), poli(hidroxiácidos), poli(lactonas), poli(amidas), poli(éster-amidas), poli(aminoácidos), poli(anhídridos), poli(ortoésteres), poli(carbonatos), poli(fosfazinas), poli(fosfoésteres), poli(tioésteres), polisacáridos y mezclas de los mismos. Todavía más preferentemente, el polímero bioreabsorbible incluye un componente de poli(hidroxiácido). De los poli(hidroxiácidos) se prefieren ácido poliláctico, ácido poliglicólico, ácido policaproico, ácido polibutírico, ácido polivalérico y copolímeros y mezclas de los mismos.
Además de formar fragmentos que se absorben in vivo (“bioreabsorbidos”), los recubrimientos poliméricos preferidos para usar en los procedimientos de la invención también pueden formar un fragmento excretable y/o metabolizable.
En la presente invención también se pueden usar copolímeros de mayor orden. Por ejemplo, Casey y col., patente de EE.UU. Nº 4.438.253, concedida el 20 de marzo de 1984, divulga copolímeros de tri-bloque producidos a partir de la transesterificación de poli(ácido glicólico) y un poli(alquilenglicol) terminado en hidroxilo. Dichas composiciones se divulgan para usar como suturas monofilamento reabsorbibles. La flexibilidad de dichas composiciones se controla mediante la incorporación de un ortocarbonato aromático, tal como ortocarbonato de tetra-p-tolilo en la estructura del copolímero.
También se pueden utilizar otros recubrimientos basados en ácidos láctico y/o glicólico. Por ejemplo, Spinu, patente de EE.UU. Nº 5.202.413, concedida el 13 de abril de 1993, divulga copolímeros de multi-bloque biodegradables que tienen bloques ordenados secuencialmente de poliláctida y/o poliglicólido producidos mediante polimerización con abertura de anillo de láctida y/o glicólido sobre un diol oligomérico o un residuo de diamina, seguido de la extensión de la cadena con un compuesto difuncional, tal como un diisocianato, diacilcloruro o diclorosilano.
Las regiones bioreabsorbibles de los recubrimientos útiles en la presente invención se pueden denominar hidrolíticamente y/o enzimáticamente escindibles. Para los fines de la presente invención, “hidrolíticamente escindible" hace referencia a la susceptibilidad del copolímero, especialmente de la regiones bioreabsorbible, a la hidrólisis en agua o a un ambiente que contiene agua. De un modo similar, “enzimáticamente escindible” como se usa en el presente documento hace referencia a la susceptibilidad del copolímero, especialmente de la región bioreabsorbible, a ser escindida por enzimas endógenas o exógenas.
Cuando se introducen en el cuerpo, la región hidrofílica se puede procesar en fragmentos excretables y/o metabolizables. Por tanto, la región hidrofílica puede incluir, por ejemplo, poliéteres, óxidos de polialquileno, polioles, poli(vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poli(alquiloxazolinas), polisacáridos, carbohidratos, péptidos, proteínas y copolímeros y mezclas de los mismos. Además, la región hidrofílica puede ser también, por ejemplo, un óxido de poli(alquileno). Dichos óxidos de poli(alquileno) pueden incluir, por ejemplo, óxido de poli(etileno), óxido de poli(propileno) y mezclas y copolímeros de los mismos.
Los polímeros que son componentes de hidrogeles también son útiles en la presente invención. Los hidrogeles son materiales poliméricos que son capaces de absorber cantidades relativamente grandes de agua. Ejemplos de compuestos formadores de hidrogeles incluyen ácidos poliacrílicos, carboximetilcelulosa sódica, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, gelatina, carragenina y otros polisacáridos, ácido hidroxietilenmetacrílico (HEMA), así como derivados de los mismos. Se pueden producir hidrogeles estables, biodegradables y bioreabsorbibles. Además, las composiciones de hidrogeles pueden incluir subunidades que exhiban una o más de estas propiedades.
Se conocen composiciones de hidrogeles biocompatibles cuya integridad se puede controlar mediante reticulación y actualmente se prefieren para usar en los procedimientos de la invención. Por ejemplo, Hubbell y col., patentes de EE.UU. Nº 5.410.016, concedida el 25 de abril de 1995 y 5.529.914, concedida el 25 de junio de 1996, divulgan sistemas hidrosolubles que son copolímeros de bloque reticulados que tienen un segmento de bloque central hidrosoluble en medio de dos extensiones hidrolíticamente lábiles. Dichos copolímeros se protegen en sus extremos adicionalmente con funcionalidades de acrilato fotopolimerizables. Cuando se reticulan, estos sistemas se convierten en hidrogeles. El bloque central hidrosoluble de dichos copolímeros puede incluir poli(etilenglicol), mientras que las extensiones hidrolíticamente lábiles pueden ser un poli(α-hidroxiácido), tal como ácido poliglicólico o ácido poliláctico. Véase Sawhney y col., Macromolecules 26: 581-587 (1993).
En otra forma de realización preferida, el gel es un gel termoreversible. Actualmente se prefieren geles termoreversibles que incluyen componentes, tales como pluronics, colágeno, gelatina, ácido hialurónico, polisacáridos, hidrogel de poliuretano, hidrogel de poliuretano-urea y combinaciones de los mismos.
En otra realización ejemplar, el conjugado de la invenció incluye un componente de un liposoma. Los liposomas se pueden preparar se acuerdo con procedimientos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo como se describe en Eppstein y col., patente de EE.UU. Nº 4.522,811, concedida el 11 de junio de 1985. Por ejemplo, se pueden preparar formulaciones en liposomas disolviendo lípido(s) adecuados, (tales como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidol colina y colesterol) en un disolvente inorgánico que después se evapora, dejando tras de sí una película fina de lípido seco sobre la superficie del envase. Después, en el envase se introduce una solución acuosa del compuesto activo o su sal farmacéuticamente aceptable. Después, el envase se agita a mano para liberar el material lipídico de los laterales del envase y para dispersar los agregados lipídicos, de modo que se forma la suspensión liposómica.
Las micropartículas citadas anteriormente y los procedimientos de preparar las micropartículas se ofrecen a modo de ejemplo y no se pretende que definan el alcance de las micropartículas de uso en la presente invención. Será evidente para los expertos en la técnica que en la presente invención se puede usar una matriz de nanopartículas.
c) Biomoléculas
En otra forma de realización preferida, el azúcar modificado es portador de una biomolécula. En realizaciones adicionales preferidas, la biomolécula es una proteína funcional, enzima, antígeno, anticuerpo, péptido, ácido nucleico (p. ej., nucleótidos sencillos o nuceósidos, oligonucleótidos, polinucleótidos u ácidos nucleicos de una o más cadenas), lectina, receptor o una combinación de los mismos.
Algunas biomoléculas preferidas son, esencialmente, no fluorescentes o emiten una cantidad tan mínima de fluorescencia que son inadecuados para usar como marcadores fluorescentes en un ensayo. Otras biomoléculas pueden ser fluorescentes. El uso de un azúcar de otro modo natural que está modificado por la unión covalente de otra entidad (p. ej., PEG, biomolécula, resto terapéutico, resto diagnóstico etc.) es adecuado. En una realización ejemplar, un resto de azúcar, que es una biomolécula, se conjuga con una rama ligadora y el casete ligador-azúcar se conjuga después con un péptido a través de un procedimiento de la invención.
Las biomoléculas útiles en la práctica de la presente invención pueden derivar de cualquier fuente. Las biomoléculas se pueden aislar de fuentes naturales o se pueden producir mediante procedimientos sintéticos. Los péptidos pueden ser péptidos naturales o péptidos mutados. Las mutaciones se pueden efectuar mediante mutagénesis química, mutagénesis dirigida a sitio u otros medios de inducir mutaciones conocidas para los expertos en la técnica. Los péptidos útiles en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, enzimas, antígenos, anticuerpos y receptores. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, bien intactos o fragmentos. Los péptidos son, opcionalmente, los productos de un programa de evolución dirigida.
Los péptidos y ácidos nucleicos tanto naturales como sintéticos son de utilidad en la presente invención, estas moléculas se pueden unir a un componente residuo de azúcar o a un agente de reticulación por cualquier grupo reactivo disponible. Por ejemplo, los péptidos se pueden unir a través de un grupo amina, carboxilo, sulfhidrilo o hidroxilo reactivo. El grupo reactivo puede residir en un extremo del péptido o en un sitio interno de la cadena peptídica. Los ácidos nucleicos se pueden unir a través de un grupo reactivo sobre una base (p. ej, amina exocíclica= o un grupo hidroxilo disponible sobre un resto de azúcar (p-ej., 3' o 5'-hidroxilo). Las cadenas peptídicas
o de ácidos nucleicos se pueden derivar además en uno o más sitios para permitir la unión de grupos reactivos adecuados a la cadena. Véase Chrisey y col. Nucleic Acids Res. 24: 3031-3039 (1996).
En una realización preferida adicional, la biomolécula se selecciona para dirigir el péptido modificado mediante los procedimientos de la invención a un tejido específico, de modo que se potencia la liberación del péptido en ese tejido respecto a la cantidad de péptido no derivado que se libera en el tejido. En una realización más preferida adicional, la cantidad del péptido derivado liberado en un ejido específico en un periodo de tiempo seleccionado se potencia mediante derivación en al menos aproximadamente un 20 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 40 % y más preferentemente al menos aproximadamente un 100 %. Actualmente, las biomoléculas preferidas para aplicaciones dirigidas incluyen anticuerpos, hormonas y ligandos para receptores de superficie celular.
En una forma de realización preferida en el presente documento, el grupo modificador es una proteína. En una realización ejemplar, la proteína es un interferón. Los interferones son glicoproteínas antivirales que, en seres humanos, son secretados por fibroblastos primarios humanos tras la inducción con virus o con ARN bicatenario. Los interferones son de interés como terapéuticos, por ejemplo antivirales y tratamiento de la esclerosis múltiple. Para referencias sobre el interferón-β, véase, por ejemplo, Yu, y col., J Neuroimmunol., 64(1):91-100 (1996); Schmidt, J.,
J. Neurosci. Res., 65(1):59-67 (2001); Wender, y col., Folia Neuropathol., 39(2):91-93 (2001); Martin, y col., Springer Semin.. Immunopathol., 18(1):1-24 (1996); Takane, y col., J. Pharmacol. Exp. Ther., 294(2):746-752 (2000); Sburlati, y col., Biotechnol. Prog., 14:189-192 (1998); Dodd, y col.,, Biochimica et Biophysica Acta, 787:183-187 (1984); Edelbaum, y col.,, J. Interferon Res., 12:449-453 (1992); Conradt, y col.,, J. Biol. Chem., 262(30):14600-14605 (1987); Civas, y col.,, Eur. J. Biochem., 173:311-316 (1988); Demolder, y col.,, J. Biotechnol., 32:179-189 (1994); Sedmak, y col.,, J. Interferon Res., 9(Suppl 1):S61-S65 (1989); Kagawa, y col.,, J. Biol. Chem., 263(33):17508-17515 (1988); Hershenson, y col.,, U.S. Patent No. 4,894,330; Jayaram, y col.,, J. Interferon Res., 3(2):177-180 (1983); Menge, y col.,, Develop. Biol. Standard., 66:391-401 (1987); Vonk, y col.,, J. Interferon Res., 3(2):169-175 (1983); and Adolf, y col.,, J. Interferon Res., 10:255-267 (1990). Para referencias rel3evantes al interferón-α, véase, Asano, y col.,, Eur. J. Cancer, 27(Suppl 4):S21-S25 (1991); Nagy, y col.,, Anticancer Research, 8(3):467-470 (1988); Dron, y col.,, J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 3(1):13-19 (1989); Habib, y col.,, Am. Surg., 67(3):257-260 (3/2001); y Sugyiama, y col.,, Eur. J. Biochem., 217:921-927 (1993).
En un conjugado de interferón ejemplar, el interferón β está conjugado con un segundo péptido a través de una rama ligadora. La rama ligadora incluye un grupo de unión al glucosilo intacto a través del cual se une al segundo péptido mediante un procedimiento de la invención. La rama ligadora incluye también opcionalmente un grupo de unión al glucosilo intacto a través del cual se une al interferón.
En otra realización ejemplar, la invención proporciona un conjugado de la hormona estimulante del folículo (FSH). La FSH es una hormona glucoproteica. Véase, por ejemplo, Saneyoshi, y col. Biol. Reprod , 65:1686-1690 (2001); Hakola, y col.,, J. Endocrinol., 158:441-448 (1998); Stanton, y col.,, Mol. Cell. Endocrinol., 125:133-141 (1996); Walton, y col.,, J. Clin. Endocrinol. Metab., 86(8):3675-3685 (08/2001); Ulloa-Aguirre, y col.,, Endocrine, 11(3):205215 (12/1999); Castro-Fernández, y col.,I, J. Clin. Endocrinol. Matab., 85(12):4603-4610 (2000); Prevost, Rebecca R., Pharmacotherapy, 18(5): 1001-1010 (1998); Linskens, y col., The FASEB Journal, 13:639-645 (04/1999); Butnev, y col., Biol. Reprod., 58:458-469 (1998); Muyan, y col., Mol. Endo., 12(5):766-772 (1998); Min, y col., Endo. J., 43(5):585-593 (1996); Boime, y col., Recent Progress in Hormone Research, 34:271-289 (1999);y Rafferty, y col.,J. Endo.,145:527-533 (1995). El conjugado de FSH se puede formar de un modo similar al descrito para el interferón.
En otra realización ejemplar más, el conjugado incluye eritropoyetina (EPO). Se sabe que la EPO participa en la respuesta a la hipoxia para estimular la producción de glóbulos rojos. Para las referencias pertinentes, véase Cerami y col., Seminars in Oncology, 28(2)(Suppl 8):66-70 (04/2001). Un conjugado de EPO ejemplar se forma de un modo análogo al conjugado del interferón.
En una realización ejemplar más, la invención proporciona un conjugado del factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF). El G-CSF es una glicoproteína que estimula la proliferación, diferenciación y activación de las células progenitoras neutropoyéticas en neutrófilos funcionalmente maduros. Se sabe que el G-CSF inyectado se elimina rápidamente del cuerpo. Véase, por ejemplo, Nohynek, y col., Cancer Chemother. Pharmacol., 39:259-266 (1997); Lord, y col., Clinical Cancer Research, 7(7):2085-2090 (07/2001); Rotondaro, y col., Molecular Biotechnology, 11(2):117-128 (1999); y Bönig, y col., Bone Marrow Transplantation, 28:259-264 (2001). Un conjugado ejemplar del G-CSF se prepara como se ha tratado anteriormente para el conjugado de los interferones. Un experto en la técnica apreciará que muchas otras proteínas se pueden conjugar al interferón usando los procedimientos y composiciones de la invención, incluidos los péptidos indicados en la Tabla 6 (que se presentan en otros lugares del presente documento) y la Figura 1, y en las Figuras 27-51, en las que se presentan esquemas de modificación individuales.
En una realización ejemplar adicional, se proporciona un conjugado con biotina. Por tanto, por ejemplo, un péptido biotinilado de forma selectiva se elabora mediante la unión de un resto avidina o estreptavidina portador de uno o más grupos modificadores.
En una realización preferida adicional, la biomolécula se selecciona para dirigir el péptido modificado mediante los procedimientos de la invención a un compartimento intracelular específico, de modo que se potencia la liberación del péptido en dicho compartimento intracelular respecto a la cantidad de péptido no derivado que se libera en el tejido. En una realización preferida adicional más, la cantidad del péptido derivado liberado en compartimento intracelular específico en un periodo de tiempo seleccionado se potencia mediante derivación en al menos aproximadamente un 20 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 40 % y más preferentemente al menos aproximadamente un 100 %. En otra realización particularmente preferida, la biomolécula está unida al péptido mediante un ligador escindible que se puede hidrolizar una vez internalizado. Actualmente, las biomoléculas preferidas para aplicaciones dirigidas intracelulares incluyen transferrina, lactotransferrina (lactoferrina), melanotransferrina (p97), ceruloplasmina y transportado de cationes divalentes. Los enlaces contemplados incluyen proteína-azúcar-ligador-azúcar-proteína, proteína-azúcar-ligador-proteína y formas multivalentes de los mismos, y proteína-azúcar-ligador-fármaco, en la que el fármaco incluye moléculas pequeñas, péptidos, lípidos, entre otros.
La liberación específica de sitio y orientada a la diana de agentes terapéuticos es deseable con el fin de tratar una amplia variedad de enfermedades humanas, tales como diferentes tipos de neoplasias malignas y ciertos trastornos neurológicos. Dichos procedimientos se acompañan de menos efectos secundarios y una eficacia mayor del fármaco. Varios principios dependen del diseño de estos sistemas de liberación. Para una revisión, véase Garnett, Advanced Drug Delivery Reviews, 53:171-216, 2001).
Una consideración importante a la hora de diseñar un sistema de liberación de fármaco a tejidos diana específicamente. El descubrimiento de los antígenos de superficie tumoral ha hecho posible desarrollar abordajes terapéuticos en los que se apunta específicamente a las células tumorales que muestran antígenos de superficie definible y las mata. Existen tres clases principales de anticuerpos monoclonales terapéuticos (MAb) que han mostrado eficacia en ensayos clínicos humanos en el tratamiento de neoplasias malignas. (1) MAb sin conjugar, que induce directamente la inhibición del crecimiento y/o apoptosis o activa indirectamente los mecanismos de defensa del huésped para que actúe la citotoxicidad antitumoral; (2) MAb conjugado con fármaco que libera preferentemente una potente toxina citotóxica en las células tumorales y, por tanto, minimiza la citotoxicidad sistémica asociada habitualmente con quimioterapia convencional y (3) MAb conjugado con radioisótopos, que libera una dosis esterilizante de radiación en el tumor. Véase, la revisión de Reff y col., Cancer Control 9:152-166 (2002).
Con el fin de dar a los Mab el poder de matar células malignas, los Mab pueden conectarse con a una toxina que puede obtenerse de una planta, bacteria u hongo, para formar proteínas quiméricas denominadas inmunotoxinas. Las toxinas vegetales de uso habitual se dividen en dos clases: (1) holotoxinas (o proteínas de inactivación del ribosoma de clase II), tales como ricina, abrina, lectinas de muérdago y modeccina, y (2) hemotixinas (proteínas de inactivación del ribosoma de clase I), tales como la proteína antiviral de la hierba camín, saporina, briodina 1, bouganina y gelonina. Las toxinas bacterianas de uso habitual incluyen la toxina diftérica (DT) y la exotoxina de pseudomonas (PE). Kreitman, Current Pharmaceutical Biotechnology 2:313-325 (2001).
Las inmunotoxinas convencionales contienen un Mab conjugado químicamente a una toxina que está mutada o modificada químicamente para minimizar la unión a las células normales. Ejemplos incluyen anti-ricina bloqueada en B4, que está dirigido al CD5, y la RFB2-cadena A de ricina desglucosilada, que está dirigida al CD22. Las inmunotoxinas recombinantes desarrolladas más recientemente son proteínas quiméricas que consisten en la región variable de un anticuerpo dirigido contra un antígeno tumoral condensado con una toxina proteica usando tecnología de ADN recombinante. Con frecuencia, la toxina también está modificada genéticamente para eliminar los sitios de unión al tejido normal pero manteniendo su citotoxicidad. Un gran número de antígenos de diferenciación, receptores sobreexpresados o antígenos específicos del cáncer como dianas para las inmunotoxinas, por ejemplo CD19, CD22, CD20, el receptor de la IL-2 (CD25), CD33, el receptor de la IL-4, el receptor del EGF y sus mutantes, ErB2, carbohidrato de Lewis, mesotelina, el receptor de la transferrina, el receptor del GM-CSF, Ras, Bcr-Abl y c-Kit, para el tratamiento de varias neoplasias malignas, incluidas cánceres hematopoyéticos, glioma y cánceres de mama, de colon, de ovarios, de vejiga urinaria y gastrointestinal. Véase, por ejemplo, Brinkmann y col., Expert Opin. Biol. Ther. 1:693-702 (2001); Perentesis and Sievers, Hematology/Oncology Clinics of North America 15:677-701 (2001).
Los Mab conjugados con radioisótopos se usan como otro medio de tratar las neoplasias malignas humanas, en particular las neoplasias malignas hematopoyéticas, con un nivel elevado de especificidad y eficacia. Los isótopos más usados para tratamientos son los emisores de alta energía, tales como 131I y 90Y. Recientemente, el Mab humanizado anti-CD33 marcado con 213Bi también se ha analizado en ensayos clínicos con humanos en fase I. Reff y col., ant.
Se han usado numerosos Mab para fines terapéuticos. Por ejemplo, el uso de rituximab (Rituxan™), un Mab anticd20 quimérico recombinante, para tratar ciertas neoplasias malignas hematopoyéticas fue autorizado por la FDA en 1997. Otros MAb aprobados desde entonces para usos terapéuticos en el tratamiento de cánceres humanos incluyen: alemtuzumab (Campath-1H™), un anticuerpo de rata humanizado contra CD52; y gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg™), un Mab anti-CD33 de ratón humanizado conjugado con caliequeamicina. Asimismo, actualmente la FDA está examinando la seguridad y eficacia de varios otros Mab para los fines de liberación específica de sitio de agentes citotóxicos o radiación, por ejemplo Zevalin™ radiomarcada y Bexxar™. Reff y col., ant.
Una segunda consideración importante en el diseño de un sistema de liberación de fármacos es la accesibilidad de un tejido diana a un agente terapéutico. Esto es un tema de preocupación en el caso del tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central (SNC), en la que la barrera hematoencefálica impide la difusión de macromoléculas. Se han desarrollado varios abordajes para sortear la barrera hematoencefálica para liberar de forma eficaz agentes terapéuticos en el SNC.
La comprensión del mecanismo de transporte de hierro desde el plasma al cerebro proporciona una útil herramienta para atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). El hierro, transportado en el plasma por la transferrina, es un componente esencial de casi todos los tipos de células. El cerebro necesita hierro para los procesos metabólicos y recibe hierro a través de los receptores de la transferrina localizados en las células endoteliales capilares del cerebro a través de transcitosis y endocitosis mediadas por el receptor. Moos y Morgan, Cellular and Molecular Neurobiology 20:77-95 (2000). Se han establecido sistemas de liberación en base a la interacción transferrina-receptor de transferrina para la liberación eficiente de péptidos, proteínas y liposomas en el cerebro. Por ejemplo, los péptidos se pueden acoplar a un Mab dirigido contra el receptor de transferrina para conseguir una mayor captación por el cerebro, Moos y Morgan, ant. De un modo similar, cuando se acoplan a un Mab dirigido contra el receptor de transferrina, se potencia el transporte del factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) a través de la barrera hematoencefálica. Song y col., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 301:605-610 (2002); Wu y co., Journal of Drug Targeting 10:239-245 (2002). Además, se ha comunicado un sistema de liberación liposómico para el transporte eficaz del fármaco quimioterapéutico, doxorubicina, en el glioma C6, en el que la transferrina estaba unida a los extremos distantes de las cadenas de PEG liposómico. Eavarone y col., J. Biomed. Mater. Res. 51:10-14 (2000). Una serie de patentes de EE.UU. también están relacionadas con procedimientos de liberación que sortean la barrera hematoencefálica en base a la interacción transferrina-receptor de transferrina. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5,154,924; 5,182,107; 5,527,527; 5,833,988; 6,015,555.
Existen otras parejas de conjugación adecuadas para un agente farmacéutico para sortear la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, las patentes de EE.UU. números 5,672,683, 5,977,307 y el documento WO 95/02421 se refieren a un procedimiento de liberar un agente neurofarmacéutico a través de la barrera hematoencefálica, en el que el agente se administra en forma de una proteína de fusión con un ligando que es reactivo con un receptor de células endoteliales capilares cerebrales; el documento WO 99/00150 describe un sistema de liberación de fármacos en el que el transporte de un fármaco a través de la barrera hematoencefálica se facilita mediante conjugación con un Mab dirigido contra el receptor humano de la insulina; el documento WO 89/10134 describe un péptido quimérico que incluye un péptido capaz de atravesar la barrera hematoencefálica a una velocidad relativamente alta y un neuropéptido hidrófilo incapaz de transcitosis, como medio de introducir neuropéptidos hidrófilos en el cerebro; el documento WO 01/60411 A1 proporciona una composición farmacéutica que puede transportar fácilmente un ingrediente farmacéuticamente activo en el cerebro. El ingrediente activo se une a una proteína específica de hibernación que se usa como conjugado y se administra con una hormona tiroidea o una sustancia que estimula la producción de hormona tiroidea. Además, se ha explorado una vía alternativa de liberación de fármaco para atravesar la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, se ha demostrado que la liberación intranasal de agentes terapéuticos sin la necesidad de conjugar es un prometedor método de liberación alternativo (Frey, 2002, Drug Delivery Technology, 2(5):46-49).
Además de facilitar el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica, la interacción transferrinareceptor de transferrina también es útil para dirigir específicamente a determinadas células tumorales, ya que muchas células tumorales sobreexpresan el receptor de la transferrina sobre su superficie, Esta estrategia se ha usado para liberar macromoléculas bioactivas en células K562 a través de un conjugado con transferrina (et al., The Journal ofBiological Chemistry 266:4309-4314 (1991)), y para liberar insulina en células Caco-2 de tipo entericito a través de un conjugado con transferrina (Shah y Shen, Journal of Pharmaceutical Sciences 85: 1306-1311 (1996)).
Además, a medida que se sabe más sobre las funciones de varias proteínas transportadoras de hierro, como el receptor de la lactotransferrina, melanotransferrina, ceruloplasmina y el transportador de cationes divalentes y su patrón de expresión, se ha encontrado que algunas de las proteínas implicadas en el mecanismo del transporte del hierro (p. ej., melanotransferrina) o sus fragmentos tienen una eficacia similar en lo que respecta a la ayuda al transporte de agentes terapéuticos a través de la barrera hematoencefálica o para llegar a tejidos específicos (documentos WO 02/13843 A2, WO 02/13873 A2). Para una revisión sobre el uso de la transferrina y proteínas relacionadas implicadas en la captación de hierro como conjugados en la liberación de fármacos, véase Li y Qian, Medical Research Reviews 22:225-250 (2002).
El concepto de liberación específica de tejido de agentes terapéuticos va más allá de la interacción entre la transferrina y el receptor de la transferrina o sus proteínas relacionadas. Por ejemplo, se ha descrito un sistema de liberación específico en el hueso en el que las proteínas se conjugan con un aminobisfosfonato que busca el hueso para mejorar la liberación de proteínas a tejido mineralizado. Uludag y Yang, Biotechnol. Prog. 18:604-611 (2002). Para una revisión sobre este tema, véase Vyas y col., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier System 18:1-76 (2001).
Se pueden usar varios ligadores en el proceso de generar bioconjugados con el fin de liberar específicamente agentes terapéuticos. Ligadores adecuados incluyen reactivos de reticulación homo y heterobifuncionales, que pueden ser escindibles mediante, por ejemplo, disociación catalizada por ácido, o no ser escindibles (véase, por ejemplo, Srinivasachar and Neville, Biochemistry 28: 2501-2509 (1989); Wellhoner y col., The Journal of Biological Chemistry 266:4309-4314 (1991)). La interacción entre muchos patrones de unión conocidos, tales como biotina y avidina/estreptavidina, también se puede usar como medio para unir un agente terapéutico y una pareja de conjugado que garantiza la liberación específica y eficaz del agente terapéutico. Usando los procedimientos de la invención, las proteínas se pueden usar para liberar moléculas en compartimentos intracelulares como conjugados. Para el direccionamiento intracelular de compuestos terapéuticos conjugados se pueden usar proteínas, péptidos, hormonas, citoquinas, moléculas pequeñas o similares que se unen a receptores de superficie celular específicos que se internalizan tras la unión del ligando. Normalmente, el complejo receptor-ligando se internaliza en vesículas intracelulares que se liberan en compartimentos celulares específicos, incluidos el núcleo, las mitocondrias, el aparato de Golgi, el RE, los lisosomas y los endosomas, en función de la localización intracelular a la que está dirigida el receptor. Conjugando el ligando del receptor con la molécula deseada, el fármaco será transportado por el complejo receptor-ligando y liberado en los compartimentos intracelulares a los que normalmente está dirigido el receptor. Por tanto, el fármaco puede liberarse en una localización intracelular específica de la célula en la que es necesaria tratar una enfermedad.
Se pueden usar muchas proteínas para dirigir agentes terapéuticos a tejidos y órganos específicos. Estas proteínas incluyen factores de crecimiento (EPO, HGH, EGF, factor de crecimiento neural, FGF, entre otros), citoquinas (GM-CSF, G-CSF, la familia de los interferones, interleucinas, entre otros), hormonas (FSH, LH, las familias de esteroides, estrógenos, corticosteroides, insulina, entre otros), proteínas séricas (albúmina, lipoproteínas, fetoproteína, proteínas séricas humanas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos) y vitaminas (folato, vitamina C, vitamina A, entre otros). Se dispone de agentes de direccionamiento que son específicos de receptores de la mayoría de los tipos celulares.
Configuraciones de enlaces contempladas incluyen, entre otras, proteína-azúcar-ligador-azúcar-proteína, proteínaazúcar-ligador-proteína y formas multivalentes de la misma, proteína-azúcar-ligador-proteína y formas multivalentes de la misma, proteína-azúcar-ligador-agente terapéutico en la que el agente terapéutico incluye moléculas pequeñas, péptidos y lípidos. En algunas realizaciones se usa un ligador hidrolizable que se puede hidrolizar una vez internalizado. Se puede usar un ligador lábil a ácidos para aprovechar cuando el conjugado proteico se internaliza en los endosomas o lisosomas que tienen un pH ácido. Una vez internalizado en el endosoma o el lisosoma, el ligador se hidroliza y el agente terapéutico se libera del agente de direccionamiento.
En una realización ejemplar, la transferrina se conjuga a través de un ligador con una enzima deseada para dirigirla a una célula que presente receptores de transferrina en un paciente. El paciente podría, por ejemplo, requerir tratamiento de sustitución enzimático para dicha enzima concreta. En realizaciones particularmente preferidas, la enzima es una de la que carece un paciente con una enfermedad del almacenamiento lisosómico (véase la Tabla 4). Una vez en la circulación, el conjugado transferrina-enzima se une a los receptores de transferrina y se internaliza en los endosomas precoces (Xing y col., 1998, Biochem. J. 336:667; Liy col.,2002, Trends in Pharmcol. Sci. 23:206; Suhaila y col., 1998, J. Biol. Chem. 273:14355). Otros agentes de direccionamiento contemplados relacionados con la transferrina incluyen lactotransferrina (lactoferrina), melanotransferrina (p97), ceruloplasmina y transportado de cationes divalentes.
En otra realización ejemplar, los conjugados transferrina-distrofina entrarían en los endosomas mediante la vía de la transferrina. Una vez allí, la distrofina se libera debido a un ligador hidrolizable que después se puede pasar al compartimento intracelular cuando sea necesario. Esta realización se puede usar para tratar a un paciente con distrofia muscular suplementando un gen de distrofina defectuoso genéticamente y/o su proteína con el péptido distrofina funcional conectado a la transferrina.
E. Restos terapéuticos
También se divulga un azúcar modificado que incluye un resto terapéutico. Los expertos en la técnica apreciarán que existe un solapamiento entre la categoría de restos terapéuticos y biomoléculas; muchas biomoléculas tienen propiedades o potencial terapéuticos.
Los restos terapéuticos pueden ser agentes ya aceptados para uso clínico o pueden ser fármacos cuyo uso es experimental o cuya actividad o mecanismo de acción están en investigación. Los restos terapéuticos pueden tener una acción demostrada en un estado de enfermedad dado o pude que exista la hipótesis de que muestran una acción deseable en un estado de enfermedad dado. En una realización preferida, los restos terapéuticos son compuestos que se están sometiendo a detección selectiva según su capacidad para interaccionar con un tejido de elección. Los restos terapéuticos, que son útiles en la práctica de la presente invención, incluyen fármacos de un amplio abanico de clases farmacológicas que tienen diversas actividades farmacológicas. En algunas realizaciones se prefiere usar restos terapéuticos que no son azúcares. Una excepción a esta preferencia es el uso de un azúcar de otro modo natural que está modificado por la unión covalente de otra entidad, tal como PEG, biomolécula, resto terapéutico y resto diagnóstico. En otra realización ejemplar, un resto de azúcar terapéutico se conjuga con una rama ligadora y el casete de la rama ligadora-azúcar se conjuga después con un péptido a través de un procedimiento de la invención.
Procedimientos para conjugar agentes terapéuticos y diagnósticos con otras varias especies son bien conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; and Dunn y col., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991.
En una realización ejemplar, el resto terapéutico está unido al azúcar modificado mediante un enlace que se rompe en determinadas condiciones. Ejemplos de condiciones incluyen un pH (p. ej. del estómago, el intestino, las vacuolas de endocitosis), la presencia de una enzima activa (p. ej., esterasa, proteasa, reductasa, oxidasas), luz y calor determinados. En la técnica se conocen muchos grupos escindibles. Véase, por ejemplo, Jung y col., Biochem. Biophys. Acta 761: 152-162 (1983); Joshi y col., J. Biol. Chem. 265: 14518-14525 (1990); Zarling y col., J. Immunol.
124: 913-920 (1980); Bouizar y col., Eur. J. Biochem. 155: 141-147 (1986); Park y col., J Biol. Chem. 261: 205-210 (1986); Browning y col., J. Immunol. 143: 1859-1867 (1989).
Clases de restos terapéuticos útiles incluyen, por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Los AINE pueden seleccionarse de, por ejemplo, las siguientes categorías: (p. ej., derivados de ácido propiónico, derivados de ácido acético, derivados de ácido dinámico, derivados de ácido bifenilcarboxílico y oxicams); fármacos antiinflamatorios esteroideos que incluyen hidrocortisona; adyuvantes; fármacos antihistamínicos (p. ej., clorfeniramina, triprolidina); fármacos antitusivos (p. ej., dextrometorfano, codeína, caramifeno y carbetapentano); fármacos antipruríticos (p. ej., metdialazina y trimeprazina); fármacos anticolinérgicos (p. ej., escopolamina, atropina, homatropina, levodopa); fármacos antieméticos y antináuseas (p. ej., ciclizina, meclizina, clorpromazina, buclizina); fármacos anoréxicos (p. ej., benzfetamina, fenetermina, clorfenetermina, fenfluramina); fármacos estimulantes del sistema nervioso central (p. ej., anfetamina, metanfetamina, dextroanfetamina y metilfenidato); fármacos antiarrítmicos (p. ej., propanolol, procainamida, disopiramida, quinidina, encainida); fármacos bloqueantes βadrenérgicos (p. ej., metoprolol, acebutolol, betaxolol, labetalol y timolol); fármacos cardiotónicos (p. ej., milrinona, amrinona y dobutamina); fármacos antihipertensores (p. ej., enalaprilo, clonidina, hidralazina, minoxidilo, guanadrel, guanetidina);fármacos diuréticos (p. ej., amilorida e hidroclorotiazida); fármacos vasodilatadores (p. ej., diltiazem, amiodarona, isoxsuprina, nilidrina, tolazolina y verapamilo); fármacos vasoconstrictores (p. ej., dihidroergotamina, ergotamina y metilsergida); fármacos antiulcerosos (p. ej., ranitidina y cimetidina); fármacos anestésicos (p. ej., lidocaína, bupivacaína, cloroprocaína, dibucaína); fármacos antidepresivos (p. ej., imipramina, desipramina, amitriptilina, nortriptilina); fármacos tranquilizantes y sedantes (p. ej., clordiazepóxido, benaciticina, benzquinamida, flurazepam, hidroxizina, loxapina y promazia); fármacos antispicóticos (p. ej., clorprotixeno, flufenazina, haloperidol, molindona, tioridazina y trifluoperazina); fármacos antimicrobianos (antibacterianos, antifúngicos, antiprotozoos y antivirales).
Clases de restos terapéuticos útiles incluyen adyuvantes. Los adyuvantes pueden seleccionarse por ejemplo de conjugados de hemocianina de lapa californiana, lipopéptido derivado de micoplasma MALP-2, monofosforilo lípido A, subunidad B de la toxina del cólera, toxina termolábil de Escherichia coli, epítopo universal de linfocitos T colaboradores del toxoide del tétanos, interleucina-12, oligodesoxinucleótidos CpG, bromuro de dimetildioctadecilamonio, ciclodextrina, escualeno, sales de aluminio, vesículas de membrana externa del meningococo (VME), montanida ISA, TiterMax™ (disponible en Sigma, St. Louis MO), absorción de nitrocelulosa, complejos estimulantes inmunitarios tales como Quil A, Gerbu™ adyuvante (Gerbu Biotechnik, Kirchwald, Germany), treonil muramil dipéptido, limosina alfa, bupivacaína, GM-CSF, adyuvante incompleto de Freund, MTP-PE/MF59 (Ciba/Geigy, Basilea, Suiza), polifosfazeno, saponina derivada del árbol Quillaja saponaria, y formulación adyuvante de Syntex (Biocine, Emeryville, CA), entre otros bien conocidos en la técnica.
Los fármacos antimicrobianos que se prefieren para incorporar en la presente composición incluyen, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de fármacos β-lactámicos, fármacos quinolonas, ciprofloxacino, norfloxacino, tetraciclina, eritromicina, amikacina, triclosan, doxiciclina, capreomicina, clorhexidina, clortetraciclina, oxitetraciclina, clindamicin, etambutol, hexamidina isotionato, metronidazol, pentamidina, gentamicina, kanamicina, linaomicina, metaciclina, metenamina, minociclina, neomicina, netilmicina, paromomicina, estreptomicina, tobramicina, miconazol y amantadina.
Otros restos farmacológicos de uso en la práctica de la presente invención incluyen fármacos antineoplásicos (p. ej., antiandrógenos (p.ej., leuprolida o flutamida), agentes citocidas (p. ej., adriamicina, doxorubicina, taxol, ciclofosfamida, busulfan, cisplatino, β-2-interferón) anti-estrógenos (p. ej., tamoxifeno), antimetabolitos (p. ej., fluorouracilo, metotrexato, mercaptopurina, tioguanina). También incluidos en esta clase están los agentes basados en radioisótopos para diagnóstico y tratamiento, y toxinas conjugadas tales como ricina, geldanamicina, mitansina, CC-1065, C-1027, las duocarmicinas, caliqueamicina y estructuras relacionadas y análogos de los mismos.
El resto terapéutico también puede ser una hormona (p. ej., medroxiprogesterona, estradiol, leuprolida, megestrol, octreotida o somatostatina); fármacos relajantes musculares (p. ej., cinnamedrina, ciclobenzaprina, flavoxato, orfenadrina, papaverina, mebeverina, idaverina, ritodrina, difenoxilato, dantroleno y azumolen); fármacos antiespasmódicos; fármacos activos en hueso (p. ej., difosfonato y fosfonoalquilfosfinato fármacos compuestos); fármacos moduladores endocrinos (p. ej., anticonceptivos (p. ej., etinodiol, etinilestradiol, noretindrona, mestranol, desogestrel, medroxiprogesterona), moduladores de la diabetes (p. ej., gliburida o clorpropamida), anabólicos tales como testolactona o estanozolol, pirógenos (p. ej., metiltestosterona, testosterona o fluoximesterona), antidiuréticos
(p. ej., desmopresina) y calcitoninas).
También de uso en la presente invención son los estrógenos (p. ej., dietilestilbesterol), glucocorticoides (p. ej., triamcinolone, betametasone, etc.) y progesteronas, tales como noretindrona, etinodiol, noretindrona, levonorgestrel; agentes tiroideos (p. ej., liotironina o levotiroxina) o agentes anti-tiroides (p. ej., metimazol); también se pueden usar fármacos antihiperprolactinémicos (p. ej., cabergolina); supresores hormonales (p. ej., danazol o goserelina), oxitócicos (p. ej., metilergonovina u oxitocina) y prostagliínas tales como mioprostol, alprostadilo o dinoprostona.
Ortros grupos modificadores útiles incluyen fármacos inmunomoduladores (p. ej,. antihistamínicos, estabilizantes de los mastocitos, tales como lodoxamida y/o cromolin, esteroides (p. ej., triamcinolona, beclometazona, cortisona, dexametasona, prednisolona, metilprednisolona, beclometasona, o clobetasol), antagonistas de la histamina H2 (p. ej.,famotidina, cimetidina, ranitidina), inmunosupresores (p.ej., azatioprina, ciclosporina), etc. También sin útiles los grupos con actividad antiinflamatoria tales sulindac, etodolac, ketoprofeno yketorolaco. Otras fármacos de uso junto con la presente invención serán evidentes para el experto en la técnica.
F. Preparación de azúcares modificados
Los azúcares modificados útiles en la formación de conjugados de la invención se traten en el presente documento. La discusión se centra en la preparación de azúcares modificados que incluyen un resto poli(etilen glicol). Los expertos apreciarán que los procedimientos expuestos en el presente documento son ampliamente aplicables a la preparación de azúcares modificados, por lo que la discusión no debe interpretarse como limitante del alcance de la invención.
En general, el resto de azúcar y el grupo modificador están unidos entre sí a través del uso de grupos reactivos, que normalmente se transforman mediante el proceso de unión en un nuevo gruupo funcional orgánico o especie no reactiva. Los grupos funcionales reactivos de azúcar se localizan en cualquier posición del resto de azúcar. Los grupos reactivos y las clases de reacciones útiles en la práctica de la presente invención son generalmente las que se conocen bien en la técnica de la química de bioconjugados. Las clases de reacciones actualmente favorecidas disponibles con restos de azúcar reactivos son los que proceden en condiciones relativamente suaves. Estas incluyen sustituciones nucleofílicas (p. ej., reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, ésteres activos), sustituciones electrófilas (p. ej., reacciones de enamina) y adiciones a enlaces múltiples carbono-carbono y carbonoheteroátomo (p. ej., reacción de Michael, reacción de Diels-Alder). Estas y otras reacciones útiles se tratan en, por ejemplo, Smith y March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 5th Ed., John Wiley & Sons, New York, 2001; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; and Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.
Grupos funcionales reactivos útiles pendientes de un núcleo de azúcar o grupo modificador incluyen:
(a)
grupos carboxilo y varios derivados de los mismos, incluidos, entre otros, éteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxibenzotriazol, haluros de acilo, imidazoles de acilo, tioésteres, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de alquilo, alquenilo, alquinilo y aromáticos;
(b)
grupos hidroxilo que se pueden convertir en, por ejemplo, ésteres, éteres, aldehídos etc.
(c)
grupos haloalquilo, en los que el haluro se puede desplazar después con un grupo nucleofílico tal como, por ejemplo, una amina, un anión carboxilato, anión tiol, carbaanión o un ion alcóxido, de modo que tiene como resultado la unión covalente de un grupo nuevo en el grupo funcional del átomo de halógeno;
(d)
grupos dienofilo, que son capaces de participar en reacciones de Diels-Alder tales como, por ejemplo grupos maleimido;
(e)
grupos aldehído y cetona, de modo que es posible la derivación posterior mediante la formación de derivados de carbonilo tales como, por ejemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas u oximas, o mediante mecanismos tales como adición de Grignard o adición de alquil-litio.
(f)
grupos de haluro de sulfonilo para la posterior reacción con aminas, por ejemplo para formar sulfonamidas;
(g)
grupos tiol, que se pueden convertir en, por ejemplo, disulfuros o reaccionar con haluros de alquilo y de acilo;
(h)
grupos amina o sulfhidrilo que pueden ser, por ejemplo, acilados, alquilados u oxidados;
(i)
alquenos, que pueden sufrir, por ejemplo, cicloadiciones, acilación, adición de Michael etc., y
(j)
epóxidos que pueden reaccionar con, por ejemplo, aminas y compuestos hidroxilo.
Los grupos funcionales reactivos se pueden elegir de un modo tal que no participen ni interfieran en las reacciones necesarias para ensamblar el núcleo de azúcar reactivo o el grupo modificador. Como alternativa, un grupo funcional reactivo se puede proteger de participar en la reacción mediante la presencia de un grupo protector. Los expertos en la técnica entenderán cómo proteger un grupo funcional concreto de un modo tal que no interfiera en un conjunto seleccionado de condiciones de reacción. Para ejemplos de grupos protectores útiles, véase, por ejemplo, Greene y col., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, John Wiley & Sons, New York, 1991.
En la discusión siguiente, se exponen una serie de ejemplos específicos de azúcares modificados que son útiles en la práctica de la presente invención. En las realizaciones ejemplares se usa un derivado de ácido siálico como núcleo del azúcar al que se une el grupo modificador. El centro de la discusión sobre derivados de ácido siálico es son con fines aclaratorios únicamente y no debe interpretarse como limitantes del ámbito de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden activar u derivar diversos restos de azúcar de un modo análogo al expuesto usando ácido siálico como ejemplo. Por ejemplo se dispone de numerosos procedimientos para modifiar galactosa, glucosa, N-acetilgalactosamina y fucosa, por nombrar algunos sustratos de azcúar, que se modifican con facilidad mediante procedimientos reconocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Elhalabi y col., Curr. Med. Chem.
6: 93 (1999); y Schafer y col., J. Org. Chem. 65: 24 (2000).
En una realización ejemplar, el péptido que se modifica mediante un procedimiento de la invención es un péptido que se produce en células de mamífero (p. ej., células CHO) o en un animal transgénico y, por tanto, contiene cadenas de oligosacáridos unidos a N y/o unidos a O, que están sialiladas de forma incompleta. Las cadenas de oligosacáridos del glucopéptido que carece de un ácido siálico y que contiene un residuo de galactosa terminal se pueden PEGilar, PPGilar o modificar de otro modo con un ácido siálico modificado.
En el esquema 4, el glucósido manosamina1 se trata con el éster activo de un derivado de aminoácido protegido (p. ej., glicina), que convierte el residuo de amino azúcar en el correspondiente aducto de amida de aminoácido protegido. El aducto se trata con una aldolasa para formar el ácido siálico 2. El compuesto 2 se convierte en el correspondiente derivado de CMP mediante la acción de la CMP-SA sintetasa, seguido de hidrogenación catalítica del derivado de MCP para producir el compuesto 3. La amina introducida mediante la formación del aducto de glicina se usa como un locus de unión de PEG o PPG haciendo reaccionar el compuesto 3 con un derivado de PEG o PPG activado (p. ej., PEG-C(O)NHS, PPG-C(O)NHS), produciendo 4 o 5, respectivamente.
Esquema 4
La tabla 2 expone ejemplos representativos de monofosfatos de azúcar que se derivan con un resto PEG o PPG. Determinados de los compuestos de la Tabla 2 se preparan mediante el procedimiento del esquema 1. Otros derivados se preparan mediante procedimientos reconocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Keppler y col., Glycobiology, 11: 11R (2001); y Charter y col., Glycobiology 10: 1049 (2000)). Otros análogos de PEG y PEG reactivos a amina están disponibles comercialmente o se pueden preparar mediante procedimientos fácilmente accesibles para los expertos en la técnica.
Tabla 2. Ejemplos de monofosfatos de azúcar que se derivan con un resto PEG o PPG
Los fosfatos de azúcar modificado de uso en la práctica de la presente invención se pueden sustituir en otras posiciones, además de las indicadas anteriormente. Sustituciones preferidas actualmente de ácido siálico se exponen en la Fórmula 5.
Fórmula 5
en la que X es un grupo ligador que se selecciona, preferentemente, de -O-, -N(H)-, -S, CH2-, y N(R)2, en las que cada R es un miembro seleccionado de forma independiente de R1-R5. Los símbolos Y, Z, A y B representan cada
5 uno un grupo que se selecciona del grupo expuesto anteriormente para la identidad de X. X, Y, Z, A y B se seleccionan cada uno de forma independiente y, por tanto, pueden ser iguales o diferentes. Los símbolos R1, R2, R3, R4 y R5 representan H, polímeros, un polímero hidrosoluble, resto terapéutico, biomolécula u otro resto. El símbolo R6 representa H, OH, o un polímero. Como alternativa, estos símbolos representan un ligador que está unido a un polímero, polímero hidrosoluble, resto terapéutico, biomolécula u otro resto.
10 En otra realización ejemplar, una manosamina simultáneamente se acila y se activa para una sustitución nucleofílica mediante el uso de anhídrido cloroacético como se indica en el Esquema 5.
Esquema 5
El glicano derivado de cloro resultante se pone en contacto con piruvato en presencia de una aldolasa, formando un
15 ácido siálico derivado de cloro. El azúcar del nucleótido correspondiente se prepara mediante el contacto del derivado de ácido siálico con trifosfatos nucleotídicos adecuados y una sintetasa. El grupo de cloro del resto de ácido siálico se desplaza después con un derivado de PEG nucleofílico, tal como tio-PEG.
En una realización ejemplar adicional, como se muestra en el Esquema 6, se acila una manosamina con un bis-HOPT dicarboxilato, produciendo el correspondiente ácido amidoalquilcarbosílico, que después se convierte en un
20 derivado de ácido siálico. El derivado de ácido siálico se convierte en un azúcar de nucleótido y el ácido carboxílico se activa y reacciona con un derivado de PEG nucleofílico, tal como amino-PEG.
Esquema 6
En otra realización ejemplar expuesta en el Esquema 7, un ácido neuramínico protegido con amina y con carboxilo se activa convirtiendo el grupo hidroxilo primario en el correspondiente éster de p-toluenosulfonato y el éster metílico se escinde. El ácido neuramínico activado se convierte en el correspondiente azúcar de nucleótido y el grupo activador se desplaza mediante una especie de PEG nucleofílica, tal como tio-PEG.
Esquema 7
En otra realización ejemplar adicional, como se expone en el Esquema 8, el resto hidroxilo primario de un derivado 10 de ácido neuramínico protegido con amina y con carboxilo se alquila usando un PEG electrofílico, tal como cloro-PEG. Después se escinde el éster metílico y el PEG-azúcar se convierte en un azúcar de nucleótido.
Esquema 8
Los glicanos distintos al ácido siálico pueden derivarse con PEG usando los procedimientos expuestos en el presente documento. Por tanto, el esquema 9 proporciona una vía sintética ejemplar a un azúcar de nucleótido de galactosa PEGilada. El grupo hidroxilo primario de la galactosa se activa como el correspondiente éster de toluenosulfonato, que después se convierte en un azúcar del nucleótido.
Esquema 9
El esquema 10 establece una vía ejemplar para preparar un derivado de galactosa-PEG que se basa en un resto de galactosa-6-amina. Por tanto, la galactosamina se convierte en un azúcar de nucleótido y el resto amina de galactosamina se funcionaliza con un derivado activo de PEG.
Esquema 10
El esquema 11 proporciona otra vía ejemplar de los derivados de galactosa. El punto de partida para el Esquema 11 es la galactosa-2-amina, que se convierte en un azúcar de nucleótido. El resto amina del azúcar de nucleótido es el lugar para unir un derivado de PEG, tal como metoxi-PEG ((mPEG) ácido carboxílico.
Esquema 11
Restos ejemplares unidos a los conjugados divulgados en el presente documento incluyen derivados de PEG (p. ej., acil-alquil-PPG, alquil-acil-PPG carbamoil-PPG, aril-PPG), ácido poliaspártico, poliglutamato, polilisina, restos terapéuticos, restos diagnósticos, manosa-6-fosfato, heparina, heparán, SLex, manosa, manosa-6-fosfato, Sialil Lewis X, FGF, VFGF, proteínas (p.ej., transferrina), condroitina, queratan, dermatan, dextrano, dextrano modificado, amilosa, bisfosfato, poli-SA, ácido hialurónico, queritan, albúmina, integrinas, oligosacáridos antenales y péptidos. Procedimientos para conjugar los diversos grupos modificadores con un resto sacárido son fácilmente accesibles a los expertos en la técnica (POLY (ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY : BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., Plenum Pub. Corp., 1992; POLY (ETHYLENE GLYCOL) CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS, J. Milton Harris, Ed., ACS Symposium Series No. 680, American Chemical Society, 1997; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; and Dunn y col., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).
Purificación de azúcares, azúcares de nucleótidos y derivados
Los azúcares de nucleótidos y derivados producidos por los procedimientos anteriores se pueden usar sin purificar. No obstante, normalmente se prefiere recuperar el producto. Se pueden usar técnicas estándar bien conocidas para la recuperación de sacáridos glucosilados, tales como cromatografía en capa fina o gruesa, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico o filtración por membrana. Se prefiere usar filtración por membrana, más preferentemente usando una membrana osmótica inversa o una o más técnicas de cromatografía en columna para la recuperación como se trata en lo sucesivo en el presente documento y en la literatura citada en el presente documento. Por ejemplo, la filtración por membrana, en la que las membranas tienen un valor de corte de peso molecular de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 10.000, se puede usar para eliminar proteínas para reactivos que tienen un peso molecular inferior a 10.000 Da. La filtración por membrana u ósmosis inversa se pueden usar para eliminar las sales y/o purificar los sacáridos del producto (véase, por ejemplo, el documento WO 98/15581). Las membranas con nanofiltros son una clase de membranas para ósmosis inversa por las que pasan sales monovalentes pero retienen las sales polivalentes y los solutos son carga mayores de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.000 Daltos, dependiendo de la membrana usada. Por tanto, en una aplicación típica, los sacáridos preparados mediante los procedimientos de la presente invención quedarán retenidos en la membrana y las sales contaminantes pasarán.
G. Grupos de reticulación
La preparación del azúcar modificado para usar en los procedimientos de la presente invención incluye la unión de un grupo modificador a un residuo de azúcar y la formación de un aducto estable, que es un sustrato de una glucosiltransferasa. Por tanto, a menudo se prefiere usar un agente de reticulación para conjugar el grupo modificador y el azúcar. Compuestos bifuncionales ejemplares que se pueden usar para unir grupos modificadores a los restos carbohidrato incluyen poli(etilenglicoles) bifuncionales, poliamidas, poliéteres y poliésteres. En la literatura se conocen los abordajes generales para la unión de carbohidratos a otros moléculas. Véase, por ejemplo, Lee y col., Biochemistry 28: 1856 (1989); Bhatia y col., Anal. Biochem. 178: 408 (1989); Janda y col., J Am. Chem. Soc. 112: 8886 (1990) y Bednarski y col., el documento WO 92/18135. En la siguiente discusión, los grupos reactivos se tratan como que comienzan en el resto de azúcar del azúcar modificado naciente. El centro del debate se proporciona con fines ilustrativos. Los expertos en la técnica apreciarán que la discusión es relevante para los grupos reactivos en el grupo modificador también.
Una estrategia ejemplar implica la incorporación de un sulfhidrilo protegido sobre el azúcar usando el reticulador heterobifuncional SPDP (n-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato y desproteger después el sulfhidrilo para la formación de un puente disulfuro con otro sulfhidrilo en el grupo modificador.
Si el SPDP afecta perjudicialmente a la capacidad del azúcar modificado para actuar como sustrato de la glucosiltransferasa, se usa uno de una serie de reticuladores tales como 2-iminotiolano o N-succinimidil-Sacetiltioacetato (SATA) para formar un puente disulfuro. El 2--iminotiolano reacciona con aminas primarias, que incorporan un sulfhidrilo no protegido sobre la molécula que contiene la amina. SATA también reacciona con aminas primarias, pero incorpora un sulfhidrilo protegido, que después se desacetila usando hidroxilamina para producir un sulfhidrilo libre. En cada caso, el sulfhidrilo incorporado es libre de reaccionar con otros sulfhidrilos o sulfhidrilo protegido, como SPDP, formando el puente disulfuro requerido.
La estrategia descrita anteriormente es ejemplar y no limitante de los ligadores de uso en la invención. Se dispone de otros reticuladores que se pueden usar en diferentes estrategias para reticular el grupo modificador del péptido. Por ejemplo, TPCH(S-(2-tiopiridil)-L-cisteína hidrazina y TPMPH ((S-(2-tiopiridilo) mercapto-propionohidrazida) reaccionan con restos de carbohidratos que se han oxidado previamente mediante tratamiento suave con peryodato, formando de este modo un enlace hidrazona entre la porción hidrazina del reticulador y los aldehídos generados con peryodato. TPCH y TPMPH introducen un grupo sulfhidrilo protegido con 2-piridiltiona sobre el azúcar, que se puede desproteger con DTT y después usar para conjugar, formando así puentes disulfuro entre los componentes.
Si el puente disulfuro es inadecuado para producir azúcares modificados estables se pueden usar otros reticuladores que incorporan enlaces más estables entre componentes. Los reticuladores heterobifuncionales GMBS (N-gamamalimidobutiriloxi)succinimida) y SMCC (succinimidil 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano) reaccionan con aminas primarias e introducen de este modo un grupo maleimida en el componente. El grupo maleimida puede reaccionar después con los sulfhidrilos del otro componente, que se pueden introducir mediante los reticuladores mencionados anteriormente, formando de este modo un enlace tioéter estable entre los componentes. Si la hidrancia estérica entre componentes interfiere con la actividad de cualquiera de los componentes o la capacidad del azúcar modificado para actuar como sustrato de la glucosiltransferasa, se pueden usar reticuladores que introduzcan largos brazos espaciadores entre los componentes e incluyen derivados de algunos de los reticuladores mencionados anteriormente (es decir, SPDP). Por tanto, existen abundantes reticuladores adecuados que son útiles; cada uno de los cuales se selecciona en función del efecto que tiene sobre el conjugado peptídico óptimo y la producción de azúcar modificado.
Se usa una variedad reactivos para modificar los componentes del azúcar modificado con reticulaciones químicas intramoleculares (para revisiones de los reactivos de reticulación y procedimientos de reticulación véase: Wold, F., Meth. Enzymol. 25: 623-651, 1972; Weetall, H. H., and Cooney, D. A., In: ENZYMES AS DRUGS. (Holcenberg, y Roberts, eds.) pp. 395-442, Wiley, New York, 1981; Ji, T. H., Meth. Enzymol. 91: 580-609, 1983; Mattson et al., Mol. Biol. Rep. 17: 167-183, 1993). Los reactivos de reticulación preferidos derivan de varios reactivos de reticulación de longitud cero, homobifuncionales y heterobifuncionales. Los reactivos de reticulación de longitud cero incluyen conjugación directa de dos grupos químicos intrínsecos sin introducción de material extrínseco. Los agentes que catalizan la formación de un puente disulfuro pertenecen a esta categoría. Otro ejemplo son los reactivos que inducen la condensación de un carboxilo y un grupo amino primario para formar un enlace amida, tales como carbodiimidas, etilcloroformiato, reactivo de Woodward K (2-etil-5-fenilisoxazolio-3’-sulfonato) y carbonildiimidazo. Además de estos reactivos químicos, la enzima transglutaminasa (glutamil-péptido γ-glutamiltransferasa; EC 2.3.2.13) se puede usar como reactivo de reticulación de longitud cero. Esta enzima cataliza las reacciones de transferencia de acilo en los grupos carboxamida de los residuos glutaminilo unidos a proteína, normalmente con un grupo amino primario como sustrato, Reactivos homo y heterobifuncionales preferidos contienen dos sitios idénticos
o dos diferentes, respectivamente, que pueden ser reactivos para grupos amino, sulfhidrilo, guanidino, indol o no específicos.
2. Sitios específicos preferidos de reactivos de reticulación
a. Grupos reactivos con amino
En una realización preferida, los sitios del reticulador son grupos reactivos con amino. Ejemplos no limitantes de grupos reactivos con amino incluyen ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS), imidoésteres, isocianatos, acilhaluros, arilazidas, ésteres de p-nitrofenilo, aldehídos y cloruros de sulfonilo.
Los ésteres de NHS reaccionan preferentemente con los grupos amino primarios (incluidos los aromáticos) de un componente de azúcar modificado. Se sabe que los grupos imidazol de las histidinas compiten con las aminas primarias por la reacción , pero los productos de reacción son inestables y se hidrolizan fácilmente. La reacción implica el ataque nucleofílico de una amina sobre el carboxilo del ácido de un éster NHS para formar una amida, liberando la N-hidroxisuccinimida. Por tanto, la carga positiva del grupo amino original se pierde.
Los imidoésteres son los reactivos de acilación más específicos para la reacción con los grupos amina de los componentes de azúcar modificados. A un pH entre 7 y 10, los imidoésteres solo reaccionan con aminas primarias. Las aminas primarias atacan los imidatos nucleofílicamente pare producir un intermedio que rompe la amidina a un pH alto o a un nuevo imidato a un pH bajo. El nuevo imidato puede reaccionar con otra amina primaria, por tanto reticulando dos grupos amino, un caso de un imidato supuestamente monofuncional que reacciona bifuncionalmente. El producto principal de la reacción con las aminas primarias es una amidina que es una base más fuerte que la amina original. Por tanto, la carga positiva del grupo amino original se retiene.
Los isocianatos (e isotiocianatos) reaccionan con las aminas primarias de los componentes de azúcar modificado para formar enlaces estables. Sus reacciones con grupos sulfhidrilo, imidazol y tirosilo dan productos relativamente inestables.
Las acilazidas también se usan como reactivos específicos de amino en los que las aminas nucelofílicas del componente de afinidad atacan los grupos carboxilo ácidos en condiciones ligeramente alcalinas, por ejemplo a pH 8,5.
Los arilhaluros tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno reaccionan preferentemente con los grupos amino y los grupos fenólicos de tirosina de los componentes de azúcar modificado pero también con los grupos sulfhidrilo e imidazol.
Los ésteres de p-nitrofenilo de ácidos mono y dicarboxílicos también son grupos reactivos con amino útiles. Aunque la especificidad del reactivo no es muy alta, los grupos α-y ε-amino parecen reaccionar más rápidamente.
Los aldehídos, como el glutaraldehído, reaccionan con las aminas primarias del azúcar modificado. Aunque se forman bases de Schiff inestables tras la reacción de los grupos amino con los aldehídos de los aldehídos, el glutaraldehído puede modificar el azúcar modificado con reticulaciones estables. A pH 6-8, el pH de las condiciones de reticulación típicas, los polímeros cíclicos sufren una deshidratación para formar polímeros de α-β aldehídos insaturados. No obstante, las bases de Schiff son estables cuando se conjugan con otro doble enlace. La interacción resonante de ambos dobles enlaces evita la hidrólisis del enlace de Schiff. Además, las aminas a concentraciones locales altas pueden atacar los dobles enlaces etilénicos para formar un producto de adición de Michael estable.
Los cloruros de sulfonilo aromáticos reaccionan con diversos sitios de los componentes del azúcar modificado, pero la reacción con los grupos amino es la más importante, que tiene como resultado un enlace sulfonamida estable.
b. Grupos reactivos con sulfhidrilo
En otra forma de realización preferida, los sitios son grupos reactivos con sulfhidrilo. Ejemplos no limitantes útiles de grupos reactivos con sulfhidrilo incluyen maleimidas, haluros de alquilo, disulfuros de piridilo y tioftalimidas.
Las maleimidas reaccionan, preferentemente, con el grupo sulfhidrilo de los componentes de azúcar modificado para formar enlaces tioéter estables. También reaccionan a una velocidad mucho más lenta con grupos amina primarias y los grupos imidazol de las histidinas. No obstante, a pH 7 el grupo maleimida se puede considerar en el grupo específico de sulfhidrilo, ya que a este pH la velocidad de la reacción de los tioles simples es 1.000 veces mayor que la de la correspondiente amina.
Los haluros de alquilo reaccionan con grupos sulfhidrilo, imidazoles y amino. A un pH de neutro a ligeramente alcalino, los haluros de alquilo reaccionan principalmente con los grupos sulfhidrilo para formar enlaces tioéter estables. A un pH mayor, la reacción con los grupos amino se ve favorecida.
Los disulfuros de piridilo reaccionan con tres sulfhidrilos mediante intercambio de disulfuro para dar disulfuros mixtos. Como resultado, los disulfuros de piridilo son los grupos reactivos con sulfhidrilo más específicos.
Las tioftalimidas reaccionan con los grupos sulfhidrilo libres para formar disulfuros.
c. Residuo reactivo con carboxilo
En otra realización, las carbodiimidas solubles en agua y disolvente orgánico se usan como reactivos reactivos a carboxilo. Estos compuestos reaccionan con los grupos carboxilo libres formando una seudourea que después se puede acoplar a las aminas disponibles dando un enlace amida. Los procedimientos para modificar un grupo carboxilo con carbodiimida son bien conocidos en la técnica (véase, Yamada y col., Biochemistry 20: 4836-4842, 1981).
3. Sitios no específicos preferidos en reactivos de reticulación
Además del uso de restos reactivos específicos de sitio, la presente invención contempla el uso de grupos reactivos no específicos para unir el azúcar al grupo modificador.
Reticuladores ejemplares no específicos incluyen grupos fotoactivables completamente inertes en la oscuridad que se convierten en especies reactivas tras la absorción de un fotón de la energía adecuada. En una realización preferida, los grupos fotoactivables se seleccionan de precursores de nútrenos generados tras el calentamiento o fotólisis de las azidas. Los nitrenos deficientes en electrones son extremadamente reactivos y pueden reaccionar con diversos enlaces químicos, incluyendo N-H, O-H, C-H, and C=C. Aunque se pueden usar tres tipos de azidas (derivados arilo, alquilo y acilo), las arialzidas son actualmente las preferidas. La reactividad de las arilazidas tras la fotólisis es mejor con enlaces N-H y O-H que con C-H. Los arilnitrenos deficientes en electrones expanden el anillo rápidamente para formar deshidroazepinas, que tienden a reaccionar con nucleófilos en lugar de formar productos de inserción C-H. La reactividad de las arilazidas se puede aumentar mediante la presencia de sustituyentes aceptores de electrones tales como grupos nitro o hidroxilo en el anillo. Dichos sustituyentes empujan la máxima absorción de arilazidas a una longitud de onda más larga. Las arilazidas insustituidas tienen un máximo de absorción en el intervalo de 260-280 nm, mientras que el hidroxi y las nitroarilazidas absorben significativamente la luz más allá de 305 nm. Por tanto, los hidroxi y las nitroarilazidas son más preferibles ya que permiten usar condiciones de fotólisis menos dañinas para el componente de afinidad que las arilazidas insustituidas.
En otra realización preferida, los grupos fotoactivables se seleccionan de arilazidas fluoradas. Los productos de la fotólisis de las arilazidas fluoradas son arilnitrenos, todos los cuales sufren las reacciones características de este grupo, incluida la inserción del enlace C-H, con una eficiencia elevada (Keana y col., J Org. Chem. 55: 3640-3647, 1990).
En otra realización, los grupos fotoactivables se seleccionan de residuos de benzofenona. Los reactivos de benzofenona normalmente dan rendimientos de reticulación mayores que los reactivos de arilazida.
En otra realización preferida, los grupos fotoactivables se seleccionan de compuestos diazo que forman un carbeno deficiente en electrones tras fotólisis. Estos carbenos sufren diversas reacciones, incluida la inserción en enlaces C-H, la adición a dobles enlaces (incluidos sistemas aromáticos), atracción de hidrógenos y coordinación con los centros nucleofílicos para dar iones de carbono.
En otra realización más, los grupos fotoactivables se seleccionan de diazopiruvatos. Por ejemplo, el éster de pnitrofenilo del diazopiruvato de p-nitrofenilo reacciona con aminas alifáticas para dar amidas de ácido diazopirúvico que sufren fotólisis ultravioleta para formar aldehídos. El componente de afinidad modificado con diazopiruvato fotolisado reaccionará como el formaldehído o el glutaraldehído formando reticulaciones.
4. Reactivo homobifuncional
a. Reticuladores homobifuncionales reactivos con aminas primarias
La síntesis, propiedades y aplicaciones de reticuladores reactivos con amina se describen comercialmente en la literatura (para revisiones de procedimientos y reactivos de reticulación, véase anteriormente). Muchos de los reactivos están disponibles (p. ej., Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
Ejemplos no limitantes preferidos de ésteres de NHS homobifuncionales incluyen glutamato de disuccinimidilo (DSG), suberato de disuccinimidilo (DSS), suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS), tartarato de disuccinimidilo (DST), tartarato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST), bis-2-(succinimidoxicarboniloxi)etilsulfona (BSOCOES), bis-2(sulfosuccinimidoxi-carboniloxi)etilsulfona (sulfo-BSOCOES), glicolbis(succinimidilsuccinato) de etileno (EGS), glicolbis(succinimidilsuccinato) de etileno (EGS), ditiobis(succinimidilpropionato) (DSP) y ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato) (sulfo-DSP). Ejemplos no limitantes preferidos de imidoésteres homobifuncionales incluyen malonimidato de dimetilo (DMM), succinimidato de dimetilo (DMSC), adipimato de dimetilo (DMS), pimelimmidato de dimetilo (DMP), suberimidato de dimetilo (DMS), dimetil-3,3’-oxidipropionimidato (DODP), dimetil3,3’-metilendioxi)dipropionimidato (DMDP), dimetil-3’-(dimetilendioxi)dipropionimidato (DDDP), dimetil-3,3’(tetrametilendioxi)-dipropionimidato (DTDP) y dimetil-3,3’-ditiobispropionimidato (DTBP).
Ejemplos no limitantes preferidos de isotiocianatos homobifuncionales incluyen: p-fenilendiisotiocianato (DITC) y estilbeno de ácido 4,4’-diisotiociano-2,2’-disulfónico (DIDS).
Ejemplos no limitantes preferidos de isocianatos homobifuncionales incluyen xilenodiisocianato, tolueno-2,4diisocianato, tolueno-2-isocianato-4-isotiocianato, 3-metoxidifenilmetano-4,4’-diisocianato, 2.2’-dicarboxi-4,4’azofenildiisocianato y hexametilendiisocianato.
Ejemplos no limitantes preferidos de arilhaluros homobifuncionales incluyen 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB) y 4,4’-difluoro-3,3’-dinitrofenil-sulfona.
Ejemplos no limitantes preferidos de reactivos de aldehído alifáticos homobifuncionales incluyen glioxal, malodialdehído y glutaraldehído.
Ejemplos no limitantes preferidos de reactivos de acilación homobifuncionales incluyen ésteres de nitrofenilo de ácidos dicarboxílicos.
Ejemplos no limitantes preferidos de cloruros de sulfonilo aromáticos homobifuncionales incluyen cloruro de fenol2,4-disulfonilo y cloruro de α-naftol-2,4-disulfonilo.
Ejemplos no limitantes preferidos de reactivos homobifuncionales reactivos con amino adicionales incluyen eritritolbiscarbonato que reacciona con aminas para dar biscarbamatos.
b. Reactivos reticuladores homobifuncionales con grupos sulfhidrilo libres
La síntesis, propiedades y aplicaciones de dichos reactivos se describen en la literaria (para revisiones de procedimientos y reactivos de reticulación, véase anteriormente). Muchos de los reactivos están disponibles comercialmente (p. ej., Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
Ejemplos no limitantes preferidos de maleimidas homobifuncionales incluyen bismaleimidohexano (BMH), N,N’-(1,3fenileno) bismaleimida, N;N’-(1,2-fenileno)bismaleimida, azofenildimaleimida y bis(N-maleimidometil)éter.
Ejemplos no limitantes preferidos de disulfuros de piridilo homobifuncionales incluyen 1,4-di-3’-(2’piridilditio)propionamidobutano (DPDPB)
Ejemplos no limitantes preferidos de haluros de alquilo homobifuncionales incluyen 2,2’-dicarboxi-4,4’diyodoacetamidoazobenceno, ácido α,α’-diyodo-p-xilenosulfónico, ácido α,α’-dibromo-p-xilenosulfónico, N,N’-bis(bbromoetil)bencilamina, N,N’-di(bromoacetil)fenilhidrazina y 1,2-di(bromoacetil)amino-3-fenilpropano.
c. Reticuladores fotoactivables homobifuncionales
La síntesis, propiedades y aplicaciones de dichos reactivos se describen en la literaria (para revisiones de procedimientos y reactivos de reticulación, véase anteriormente). Algunos de los reactivos están dsponibles comercialmente (p. ej., Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
Ejemplos no limitantes preferidos de reticuladores fotoactivables homobifuncionales incluyen bis-(3-(4azidosalicilamido)etildisulfuro (BASED), di-N-(2-nitro-4-azidofenil)-cistamina-S,S-dióxido (DNCO) y 4,4’ditiobisfenilazida.
5. Reactivos heterobifuncionales
a. Reactivos heterobifuncionales reactivos a amino con un resto de piridildisulfuro
La síntesis, propiedades y aplicaciones de dichos reactivos se describen en la literaria (para revisiones de procedimientos y reactivos de reticulación, véase anteriormente). Muchos de los reactivos están dsponibles comercialmente (p. ej., Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
Ejemplos no limitantes preferidos de reactivos heterofuncionales con un resto de disulfuro de piridilo y un éster de NHS reactivo con amino incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil 6-3-(2-piridilditio) propionamidohexanoato (LC-SPDP), sulfosuccinimidil 6-3-(2-piridilditio)propionamidohexanoato (sulfo-LCSPDP), 4succinimidiloxicarbonil-oc-metil-a-(2-piridilditio)tolueno (SMPT) y sulfosuccinimidil 6-α-metil-α-(2piridilditio)toluamidohexanoato (sulfo-LC-SMPT).
b. Reactivos heterobifuncionales reactivos a amino con un resto de maleimida
La síntesis, propiedades y aplicaciones de dichos reactivos se describen en la literatura. Ejemplos no limitantes preferidos de reactivos heterobifuncionales con un resto de maleimida y un éster de NHS reactivo a amino incluyen succinimidil maleimidilacetato (AMAS), succinimidil 3-maleimidilpropionato (BMPS), éster de N-γmaleimidobutiriloxisuccinimida (GMBS). éster de N-γ-maleimidobutiriloxisulfo succinimida (sulfo-GMBS) succinimidil 6-maleimidilhexanoato (EMCS), succinimidil 3-maleimidilbenzoato (SMB), éster de m-maleimidobenzoil-Nhidroxisuccinimida (MBS), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS), succinimidil 4-(Nmaleimidometil)-ciclohexane-1-carboxilato (SMCC), sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexane-1-carboxilato (sulfo-SMCC), succinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato (SMPB) y sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato (sulfo-SMPB).
c. Reactivos heterobifuncionales reactivos a amino con un resto de haluro de alquilo
La síntesis, propiedades y aplicaciones de dichos reactivos se describen en la literatura. Ejemplos no limitantes preferidos de reactivos heterobifuncionales con un resto de haluro de alquilo y un éster de NHS reactivo a amino incluyen N-succinimidil-(4-yodoacetil)aminobenzoato (SIAB), sulfosuccinimidil-(4-yodoacetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB), succinimidil-6-(yodoacetil)aminohexanoato (SIAX), succinimidil-6-(6-((yodoacetil)amino)hexanoilamino)hexanoato (SIAXX), succinimidil-6-(((4-(yodoacetil)-amino)-metil)-ciclohexano-1carbonilo)aminohexanoato (SIACX) y succinimidil-4 ((yodoacetil)-amino)metil ciclohexano-1-carboxilato (SIAC).
Un ejemplo preferido de un reactivo heterobifuncional con un éster de NHS reactivo a amino y un resto de dipluro de alquilo es N-hidroxisuccinimidil-2,3-dibromopropionato (SDBP). El SDBP introduce reticulaciones intramoleculares en el componente de afinidad conjugando sus grupos amino. La reactividad del resto de dibromopropionilo hacia los grupos de amina primaria se controla mediante la temperatura de la reacción (McKenzie y col., Protein Chem. 7: 581-592 (1988)).
Ejemplos no limitantes preferidos de reactivos heterobifuncionales con un resto de haluro de alquilo y un resto de éster de p-nitrofenilo reactivo a amino incluyen yodoacetato de p-nitrofenilo (NPIA).
Los expertos en la técnica conocen otros agentes de reticulación. Véase, por ejemplo, Pomato y col., patente de EE.UU. Nº 5.965.106. Está dentro de las capacidades de un experto en la técnica elegir un agente de reticulación adecuado para una aplicación concreta.d. Grupos de unión escindibles
En otra realización más, el grupo ligador se proporciona con un grupo que se puede escindir para liberar el grupo modificador del residuo de azúcar. En la técnica se conocen muchos grupos escindibles. Véase, por ejemplo, Jung y col., Biochem. Biophys. Acta 761: 152-162 (1983); Joshi y col., J. Biol. Chem. 265: 14518-14525 (1990); Zarling y col., J. Immunol. 124: 913-920 (1980); Bouizar y col., Eur. J. Biochem. 155: 141-147 (1986); Park y col., J Biol. Chem. 261: 205-210 (1986); Browning y col., J. Immunol. 143: 1859-1867 (1989). Además, se dispone de un amplio abanico de grupos ligadores bifuncionales (tanto homo como heteriobifuncionales) escindibles comercialmente en suministradores tales como Pierce.
Restos escindibles ejemplares se pueden escindir usando luz, calor o reactivos tales como tioles, hidroxilamina, bases y peryodato. Además, ciertos grupos preferidos se escinden un vivo en respuesta a la endocitosis (p. ej., cisaconitilo, véase Shen y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102: 1048 (1991)).Grupos escindibles preferidos comprenden un resto escindible que es un miembro seleccionado del grupo que consiste en grupos disulfuro, éster, imida, carbonato, nitrobencilo, fenacilo y benzoína.e. Conjugación de azúcares modificados a péptidos
Los azúcares modificados se conjugan con un péptido glucosilado o no glucosilado usando una enzima adecuada para mediar en la conjugación. Preferentemente, las concentraciones del o los azúcares donantes modificados, enzima(s) y péptido(s) aceptores se seleccionan de un modo tal que la glucopsilación procede hasta que el aceptor se consume. Las consideraciones que se tratan más adelante, aunque se exponen en el contexto de una sialiltransferasa, generalmente son aplicables a otras reacciones de la glucosiltransferasa.
Se conocen una serie de procedimientos de usar glucosiltransferasas para sintetizar estructuras de oligosacáridos deseadas y en general aplicables a la presente invención. Procedimientos ejemplares se describen en, por ejemplo, el documento WO 96/32491, Ito y col., Pure Appl. Chem. 65: 753 (1993) y las patentes de EE.UU. n1 5.352.670,
5.374.541 y 5.545.553.
La presente invención se pone en práctica usando una única glucosiltransferasa o una combinación de glucosiltransferasas. Por ejemplo, se puede usar una combinación de una sialiltransferasa y una galactosiltransferasa. En dichas realizaciones que usan más de una enzima, las enzimas y sustratos se combinan, preferentemente, en una mezcla de reacción inicial, o las enzimas y reactivos para una segunda reacción enzimática se añaden al medio de reacción una vez que la reacción enzimática está completa o casi completa. Realizando dos reacciones enzimáticas en secuencia en un único vaso, los rendimientos globales mejoran sobre los procedimientos en los que se aísla una especie intermedia. Además, se reduce la limpieza y la eliminación de los disolventes y subproductos sobrantes.
En una realización preferida, cada una de las enzimas primera y segunda es una glucosiltransferasa. En otra forma de realización preferida una enzima es una endoglucosidasa. En otra forma de realización preferida una enzima es una exoglucosidasa. En una realización preferida adicional se usan más de dos enzimas para ensamblar la glucoproteína modificada de la invención. Las enzimas se usan para alterar una estructura de sacárido en el péptido en cualquier punto antes o después de la adición del azúcar modificado al péptido.
En otra realización, al menos dos de las enzimas son glucosiltransferasas y el último azúcar añadido a la estructura de sacárido del péptido es un azúcar no modificado. En su lugar, el azúcar modificado está interno en la estructura del glicano y, por tanto, no tiene que ser el último azúcar en el glicano. En una realización ejemplar, la galactosiltransferasa puede catalizar la transferencia de Gal-PEG desde UDP-Gal-PEG al glicano, seguido de incubación en presencia de ST3Ga13 y CMP-SA, que sirve para añadir un ácido no modificado “de protecció terminal” al glicano (Figura 22A).
En otra realización, al menos dos de las enzimas son glucosiltransferasas y al menos dos azúcares modificados se añaden a las estructuras de glicano en el péptido. De este modo se pueden añadir dos o más glucoconjugados dierentes a uno o más glicanos en un péptido. Este procedimiento genera estructuras de glicano que tienen dos o más azúcares modificados funcionalmente diferentes. En una realización ejemplar, la incubación del péptido con GnT-I,II y UDP-GlcNAc-PEG sirve para añadir una molécula de a GlcNAc-PEG al glicano; la incubación con galatosiltransferasa y UDP-Gal sirve para añadir un residuo de Gal al mismo y la incubación con ST3Gal3 y CMPSA-Man-6-Fosfato sirve para añadir una molécula de SA-manosa-6-fosfato al glicano. Esta serie de reacciones tiene como resultado una cadena de glicano que tiene las características funcionales de un glicano PEGilado así como actividad dirigida de manosa-6-fosfato (Figura 22B).
En otra realización, al menos dos de las enzimasusadas en la reacción son glucosiltransferasas y, de nuevo, se añaden azúcares modificados diferentes a los glicanos unidos a N o unidos a O en el péptido. Esta realización es útil cuando se van a añadir dos azúcares modificados diferentesa los glicanos de un péptido, pero cuando es importante para separar espacialmente unos de otros los azúcares modificados en el péptido. Por ejemplo, si los azúcares modificados comprenden moléculas voluminosas, incluidos PEG y otras moléculas como una molécula ligadora, puede ser preferible este procedimiento. Los azúcares modificados se pueden añadir de forma simultánea a las estructuras de glicano sobre un péptido o se pueden añadir secuencialmente, En una realización ejemplar, la incubación con ST3Gal3 y CMP-SA-PEG sirve para añadir ácido siálico-PEG a los glicanos unidos a N, mientras que la incubación con ST3Gal1 and CMP-SA-bis-fosfonato sirve para añadir ácido siálico-bis-fosfonato a los glicanos unidos a O (Figura 22C).
En otra realización, el procedimiento usa una o más exo o endoglucosidasa. La glucosidasa normalmente es un mutante que se ha sometido a ingeniería para formar enlaces glucosilo en lugar de romperlos. La glicanasa mutante, en ocasiones denominada glucosintasa, normalmente incluye una sustitución de un residuo aminoácido por un residuo de aminoácido ácido en el sitio activo. Por ejemplo, cuando la endoglicanasa es endo-H, los residuos del sitio activo sustituido normalmente serán Asp en la posición 130, Glu en la posición 132 o una combinación de los mismos. Los aminoácidos se sustituyen en general con serina, alanina, asparagina o glutamina. Las exoglucosidasas tales como la transialidasa también son útiles.
La enzima mutante cataliza la reacción, normalmente mediante una etapa de síntesis que es análoga a la reacción inversa de la etapa de hidrólisis con engoglicanasa. En estas realizaciones, la molécula donante de glucosilo (p. ej., una estructura de oligo o monosacárido deseado) contiene un grupo saliente y la reacción procede con la adición de la molécula donante a un residuo de GlcNAc sobre la proteína. Por ejemplo, el grupo saliente puede ser un halógeno, tal como flúor. En otras realizaciones el grupo saliente es un resto Asn o Asn-péptido. En otras realizaciones más, el residuo GlcNAc en la molécula donante de glucosilo está modificado. Por ejemplo, el residuo GlcNAc puede comprender un resto de 1,2-oxazolina.
En una realización preferida, cada una de las enzimas usadas para producir un conjugado de la invención está presente en una cantidad catalítica. La cantidad catalítica de una enzima concreta varía de acuerdo con la concentración del sustrato de dicha enzima, así como con las condiciones de la reacción, tales como la temperatura, el tiempo y el valor del pH Medios para determinar la cantidad catalítica de una enzima dada en concentraciones de sustrato y condiciones de reacción preseleccionadas son bien conocidos para los expertos en la técnica.
La temperatura a la cual se lleva a cabo un proceso descrito anteriormente puede variar desde justo encima de la congelación a la temperatura a la cual la enzima más sensible se desnaturaliza. La temperatura preferida varía de aproximadamente 0 ºC a aproximadamente de 55 ºC y, más preferentemente, de aproximadamente 30 C a aproximadamente 37 ºC. En otra realización ejemplar, uno o más componentes del presente procedimiento se llevan a cabo a una temperatura elevada usando una enzima termofílica.
La mezcla de reacción se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para que el aceptor se glucosile, formando de este modo el conjugado deseado. Algunos de los conjugados a menudo se pueden detectar tras unas pocas horas obteniéndose cantidades recuperables en 24 horas o menos. Los expertos en la técnica entienden que la velocidad de la reacción depende de una serie de factores variables (p. ej., la concentración de la enzima la concentración del donante, la concentración del aceptor, la temperatura, el volumen del disolvente), que se optimizan para un sistema seleccionado.
La presente invención también proporciona la producción a escala industrial de péptidos modificados. Como se usa en el presente documento, una escala industrial generalmente produce al menos un gramo de conjugado terminado purificado.
En el siguiente debate, la invención se ejemplifica mediante la conjugación de los restos de ácido siálico modificados a un péptido glucosilado. El ácido siálico modificado ejemplar está marcado con PEG. El centro del siguiente debate es sobre el uso de ácido siálico modificado con PEG y péptidos glucosilados. Un experto entiende que el debate es, generalmente, aplicable a las adiciones de restos de glucosilo modificados aparte del ácido siálico. Además, el debate es igualmente aplicable a la modificación de una unidad de glucosilo con agentes distintos al PEG, incluidos otros polímeros hidrosolubles, restos terapéuticos y biomoléculas.
Se puede usar un abordaje enzimático para la introducción selectiva de carbohidratos PEGilados o PPGilados sobre un péptido o glucopéptido. El procedimiento usa azúcares modificados que contienen PEG, PPG o un grupo funcional reactivo enmascarado y se combina con la glucosiltransferasa o glucosintasa adecuada. Seleccionando la glucosiltransferasa que producirá el enlace carbohidrato deseado y usando el azúcar modificado como sustrato donante, el PEG o el PPG se pueden introducir directamente sobre el armazón peptídico, sobre los residuos de azúcar existentes de un glucopéptido o sobre los residuos de azúcar que se han añadido a un péptido.
Un aceptor para la sialiltransferasa está presente en el péptido que se va a modificar mediante los procedimientos de la presente invención bien como una estructura natural o como una colocada en ese lugar de forma recombinante, enzimática o química. Los aceptores adecuados incluyen, por ejemplo, aceptores de galactosilo tales como Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,4GalNAc, Galβ1,3GalNAc, lacto-Ntetraosa, Galβ1,3GlcNAc, Galβ1,3Ara, Galβ1,6GlcNAc, Galβ1,4Glc (lactosa), y otros aceptores conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Paulson y col., J. Biol. Chem. 253 5617-5624 (1978)).
En una realización, un aceptor para la sialiltransferasa está presente sobre el péptido que se va a modificar tras la síntesis in vivo del péptido. Dichos péptidos se pueden sialilar usando los procedimientos reivindicados sin la modificación previa del patrón de glucosilación del péptido. Como alternativa, los procedimientos de la invención se pueden usar para sialilar un péptido que no incluye un aceptor adecuado; uno primero modifica el péptido para incluir un aceptor por procedimientos conocidos para los expertos en la técnica. En una realización ejemplar se añade un residuo GalNAc mediante la acción de una GalNAc transferasa.
En una realización ejemplar, el aceptor de galactosilo se ensambla uniendo un residuo de galactosa a un aceptor adecuado unido al péptido, por ejemplo una GlcNAc. El procedimiento incluye incubar el péptido que se va a modificar con una mezcla de reacción que contiene una cantidad adecuada de una galactosiltransferasa (p. ej., galβ1,3 o galβ1,4), y un donante de galactosilo adecuado (p. ej., UDP-galactosa). La reacción se deja proceder sustancialmente hasta finalizar o, como alternativa, la reacción se detiene cuando se añade una cantidad preseleccionada del residuo de galactosa. Otros procedimientos de ensamblar un aceptor de sacárido seleccionado serán evidentes para el experto en la técnica.
En otra realización más, los oligosacáridos unidos a péptido se “recortan” primero todo o en parte para exponer un aceptor a la sialiltransferasa o un resto al cual se pueden añadir uno o más residuos adecuados para obtener un aceptor adecuado. Enzimas tales como glucosiltransferasas y endoglucosidasas (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.716.812) son útiles para las reacciones de unión y recorte. Un debate detallado del “recorte” y remodelado de los glicanos unidos a N y unidos a O se proporciona en otros lugares del presente documento.
En el siguiente debate, el procedimiento de la invención se ejemplifica mediante el uso de azúcares modificados que tiene un polímero hidrosoluble unido a ellos. El centro del debate se proporciona con fines ilustrativos. Los expertos apreciarán que el debate es igualmente relevante para las realizaciones en las que el azúcar modificado porta un resto terapéutico, biomolécula o similar.
Una realización ejemplar de la invención en la que un residuo de carbohidrato se “recorta” antes de la adición del azúcar modificado se expone en la Figura 13, que expone un esquema en el que la manosa alta se recorta a la estructura biantenal de primera generación. Un azúcar modificado porta un polímero hidrosluble se conjuga con uno
o más de los residuos de azúcar expuestos por el “recorte”. En un ejemplo, se añade un polímero hidrosoluble a través de un resto de GlcNAc conjugado al polímero hidrosoluble. La GlcNAc modificada está unida a uno o ambos residuos de manosa terminales de la estructura biantenal. Como alternativa, se puede añadir una GlcNAc no modificada a uno o los dos extremos de las especies ramificadas.
En otra realización ejemplar, se añade un polímero hidrosoluble a uno o los dos residuos terminales de manosa de la estructura biantenal mediante un azúcar modificado que tiene un residuo galactosa, que está conjugado con un residuo GlcNAc añadido a los residuos de manosa terminales. Como alternativa, se puede añadir una Gal no modificada a uno o los dos extremos de los residuos GlcNAc.
En otro ejemplo más, se añade un polímero hidrosoluble sobre un residuo Gal usando un ácido siálico modificado.
Otra realización ejemplar se expone en la Figura 14, que muestra un esquema similar al mostrado en la Figura 13 en el que la estructura de alta manosa se “recorta” a la manosa de la cual sale la estructura biantenal. En un ejemplo, se añade un polímero hidrosoluble a través de una GlcNAc modificada con el polímero. Como alternativa, a la manosa se añade una GlcNAc no modificada, seguida de una Gal con un polímero hidrosoluble unido. En otra realización más, residuos de GlcNAc y Gal no modificados se añaden de forma secuencial a la manosa, seguidos de un resto de ácido siálico modificado con un polímero hidrosoluble.
La Figura 15 expone una realización ejemplar adicional usando un esquema similar al mostrado en la Figura 13 en el que la estructura de alta manosa se “recorta” a la GlcNAc a la cual está unida la primera manosa. La GlcNAc está conjugada a un residuo de Gal portador de un polímero hidrosoluble. Como alternativa, a la GlcNAc, se añade una Gal no modificada, seguida de la adición de un ácido siálico modificado con un azúcar hidrosoluble. En otro ejemplo más, la GlcNAc terminal se conjugha con Gal y la GlcNAc se fucosila después con una fucosa modificada portadora de un polímero hidrosoluble.
La Figura 16 es un esquema similar al mostrado en la Figura 13 en el que la estructura de alta manosa se recorta”a la primera GlcNAc unida a la Asn del péptido. En un ejemplo, la GlcNAc del residuo GlcNAc-(Fuc) está conjugada con una GlcNAc portadora de un polímero hidrosoluble.
En otro ejemplo, la GlcNAc del residuo GlcNAc-(Fuc) está modificada con Gal, que es portadora de un polímero hidrosoluble. En otra realización más, la GlcNAc está modificada con Gal, seguida de conjugación al Gal de un ácido siálico modificado con polímero hidrosoluble.
Otras realizaciones ejemplares se exponen en las Figuras 17-21. Una ilustración de la matriz de los tipos de reacción con los que la presente invención se puede poner en práctica se proporciona en cada una de las figuras mencionadas anteriormente.
Los ejemplos expuestos anteriormente proporcionan una ilustración de la potencia de los procedimientos expuestos en el presente documento. Usando los procedimientos de la invención es posible “recortar” y crear un residuo de
5 carbohidrato de sustancialmente cualquier estructura deseada. El azúcar modificado se puede añadir a los extremos del resto de carbohidrato como se ha indicado anteriormente o puede ser un intermedio entre el núcleo peptídico y el extremo del carbohidrato.
En una realización ejemplar se elimina un ácido siálico existente de un glucopéptido usando una sialidasa, de modo que desenmascara todos o casi todos los residuos de galactosilo subyacentes. Como alternativa, un péptido o
10 glucopéptido se marca con residuos de galactosa o un residuo de oligosacáridos que termina en una unidad de galactosa. Tras la exposición o la adición de los residuos de galactosa se usa una sialiltransferasa adecuada para añadir un ácido siálico modificado. El enfoque se resume en el Esquema 12.
Esquema 12
15 En otro abordaje adicional, resumido en el Esquema 13, una funcionalidad reactiva enmascarada está presente en el ácido siálico. El grupo reactivo enmascarado no está, preferentemente, afectado por las condiciones usadas para unir el ácido siálico modificado al péptido. Tras la unión covalente del ácido siálico modificado al péptido, el enmascaramiento se elimina y el péptido se conjuga con un agente tal como PEG, PPG, un resto terapéutico, biomolécula u otro agente. El agente se conjuga con el péptido de un modo específico mediante su reacción con el
20 grupo reactivo no enmascarado del residuo de azúcar modificado.
Esquema 13
Cualquier azúcar modificado se puede usar con su glucosiltransferasa adecuada dependiendo de los azúcares terminales de las cadenas laterales del oligosacáridos del glucopéptido (Tabla 3). Como se ha tratado anteriormente, el azúcar terminal del glucopéptido requerido para la introducción de la estructura PEGilada o PPGilada se puede introducir de forma natural durante la expresión o se puede producir después de la expresión usando la o las glucosidasas, glucosiltransferasas o mezcla de glucosidasas y glucosiltransferasas adecuadas.
Tabla 3 En una realización ejemplar adicional, la UDP-galactosa-PEG reacciona con β1,4-galactosiltransferasa de leche bovina de modo que transfiere la galactosa modificada a la estructura de N-acetilglucosamina terminal adecuada. Los residuos de GlcNAc terminales sobre el glucopéptido se pueden producir durante la expresión, como puede
5 pasar en los sistemas de expresión de mamíferos, insectos, plantas u hongos, pero también se pueden producir tratando el glucopéptido con una sialidasa y/o glucosidasa y/o glucosiltransferasa, según sea necesario.
En otra realización ejemplar se usa una GlcNAc transferasa, como GnTI-V, para transferir PEGilada-Glc-Nc a un residuo de manosa en un glucopéptido. En otra realización de ejmplo adicional, las estructuras de glucano unidas a N y/o unidas a O se eliminan enzimáticamente de un glucopéptido para exponer un aminoácido o un residuo
10 glucosilo terminal que después de conjuga con el azúcar modificado. Por ejemplo, se usa una endoglucanasa para eliminar las estructuras unidas a N de un glucopéptido para exponer una GlcNAc terminal como GlcNAc unida a Asn en el glucopéptido. UDP-Gal-PEG y la galactosiltransferasa adecuada se usan para introducir la funcionalidad galactosa-PEGo –PPG en la GlcNAc expuesta.
En una realización alternativa, el azúcar modificado se añade directamente al armazón peptídico usando una
15 glucosiltransferasa conocida para transferir residuos de azúcar al armazón peptídico. Esta realización de ejemlo se expone en el Esquema 14. glucosiltransferasas ejemplar útiles en la práctica de la presente invención incluyen GalNAc transferasas limitadas (Gal-NAc T1-14), GlcNAc transferasas, fucosiltransferasas, glucosiltransferasas, xilosiltransferasas y manosiltransferasas. El uso de este abordaje permite la adición directa de azúcares modificados a péptidos que carecen de cualquier carbohidrato o, como alternativa, sobre los glucopéptidos existentes. En ambos
20 casos, la adición del azúcar modificado se produce en posiciones específicas en el armazón peptídico como se define mediante la especificidad de sustrato de la glucosiltransferasa y no de un modo aleatorio como se produce durante la modificación del armazón peptídico de una proteína usando procedimientos químicos. Se puede introducir una matriz de agentes en las proteínas o glucopéptidos que carecen de la secuencia peptídica del sustrato de la glucosiltransferasa sometiendo a ingeniería la secuencia de aminoácidos adecuada en la cadena peptídica.
25 Esquema 14
En cada una de las realizaciones ejemplares anteriores se puede usar una o más etapas adicionales de modificación química o enzimática tras la conjugación del azúcar modificado al péptido. En una realización ejemplar se usa una enzima (p. ej., la fucosiltransferasa) para colgar una unidad de glucosilo (p. ej., fucosa) sobre el azúcar 30 modificado terminal unido al péptido. En otro ejemplo se usa una reacción enzimática para “proteger” sitios a los que el azúcar modificado no se ha podido conjugar. Como alternativa se usa una reacción química para alterar la estructura del azúcar modificado conjugado. Por ejemplo, el azúcar modificado conjugado se hace reaccionar con agentes que estabilizan o desestabilizan su unión con el componente peptídico al que está unido el azúcar modificado. En otro ejemplo, un componente del azúcar modificado se desprotege tras su conjugación con el
35 péptido. Un experto apreciará que hay una serie de procedimientos enzimáticos y químicos que son útiles en los procedimientos de la invención en una etapa posterior a la conjugación del azúcar modificado con el péptido. La elaboración posterior del conjugado azúcar modificado – péptido entra dentro del alcance de la invención.
Direccionamiento peptídico con manosa 6-fosfato
En una realización ejemplar, el péptido se deriva con al menos un resto de manosa-6-fosfato. El resto de manosa-6fosfato dirige el péptido a un lisosoma de una célula y es útil para, por ejemplo, dirigir proteínas terapéuticas a lisosomas para el tratamiento de las enfermedades del almacenamiento en lisosomas.
Las enfermedades del almacenamiento en lisosomas son un grupo de más de 40 trastornos que son el resultado de defectos en genes que codifican enzimas que degradan los productos de deshecho de glucoplípidos o polisacáridos dentro de los lisosomas de las células. Los productos enzimáticos, por ejemplo azúcares y lípidos se reciclan después en productos nuevos. Cada uno de estos trastornos es el resultado de un rasgo recesivo autosómico hereditario o ligado al cromosoma X que afecta a los niveles de enzimas en el lisosoma. En general no hay una actividad biológica ni funcional de las enzimas afectadas en las células y tejidos de los individuos afectados. La Tabla 4 proporciona una lista de las enfermedades del almacenamiento representativas y del defecto enzimático asociado con las enfermedades. En estas enfermedades, la deficiencia de la función enzimática crea un depósito sistémico progresivo de sustratos de lípidos o carbohidratos en los lisosomas de las células del cuerpo, lo que en última instancia causa pérdida de función orgánica y la muerte. La etiología genética, las manifestaciones clínicas, la biología molecular y la posibilidad de las enfermedades de almacenamiento lisosómico se detallan en Scriver y col., eds., THE METABOLIC AND MOLECULAR BASIS OF INHERITED DISEASE, 7.sup. Ed., Vol. II, McGraw Hill, (1995).
Tabla 4: Enfermendades del almacenamiento lisosómico y defectos enzimátivos asociados
Enfermedad Defecto enzimático Enfermedad de Pompe α-glucosidasa ácida (matasa ácida) MPSI* (enfermedad de Hurler) α-L-iduronidasa MPSII (enfermedad de Hunter) iduronato sulfatasa MPSIII (Sanfilippo) heparán N-sulfatasa MPS IV (Morquio A) galactosa-6-sulfatasa MPS IV (Morquio B) β-galactosidasa ácida MPS VII (enfermedad de Sly) β-glucoronidasa Enfermedad de células I N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa Enfermedad de Schindler α-N-acetilgalactosaminidasa (α-galactosidasa B) Enfermedad de Wolman Lipasa ácida
Enfermedad de almacenamiento Lipasa ácida de ésteres de colesterol Enfermedad de Farber Ceramidasa ácida lisosomal Enfermedad de Niemann-Pick esfingomielinasa ácida Enfermedad de Gaucher glucocerebrosidasa Enfermedad de Krabbe galactosilceramidasa Enfermedad de Fabry α-galactosidasa A GM1 gangliosidosis β-galactosidasa ácida Galactosialidosis β-galactosidasa y neuraminidasa Enfermedad de Tay-Sach hexosaminidasa A . Enfermedad de Sandhoff hexosaminidasa A y B
*MPS = mucopolisacaridosis
De duve sugirió primero que la sustitución de la enzima lisosómica ausente con una enzima exógena biológicamente activa podría ser un abordaje viable al tratamiento de las enfermedades de almacenamiento lisosómico (De Duve, Fed. Proc. 23: 1045 (1964). Desde entonces, en varios estudios se ha sugerido que el tratamiento de sustitución enzimático puede ser beneficioso para tratar varias enfermedades de almacenamiento lisosómico . El mejor éxito se ha mostrado en individuos con al enfermedad de Gaucher de tipo 1, que han sido tratados con la enzima exógena (β-glucocerebrosidasa), preparada a partir de placenta (Ceredase™) o. más recientemente, de forma recombinante (Cerezyme™) Se ha sugerido que la sustitución enzimática puede también ser beneficiosa para tratar la enfermedad de Fabry, así como otras enfermedades de almacenamiento lisosómico. Véase, por ejemplo, Dawson y col., Ped. Res. 7(8): 684-690 (1973) (in vitro) y Mapes y col. Science 169: 987 (1970) (in vivo). Se han notificado ensayos clínicos de tratamiento de sustitución enzimática para pacientes de Fabry usando perfusiones de plasma normal (Mapes y col., Science 169: 987-989 (1970)), α-galactosidasa A purificada de placenta (Brady y col., N Eng. J. Med.
279: 1163 (1973)); o α-galactosidasa A purificada de bazo o plasma (Desnick y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76: 5326-5330 (1979)) y han demostrado la eficacia bioquímica de la sustitución enzimática directa para la enfermedad de Fabry. Estos estudios indican el potencial de eliminación, o de reducir significativamente, el almacenamiento patológico de glucolípidos mediante la repetida sustitución de la enzima. Por ejemplo, en un estudio (Desnick y col., ant.), la inyección intravenosa de la enzima purificada tuvo como resultado una reducción temporal de los niveles de plasma del sustrato lipídico almacenado, globotriasilceramida.
En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de procedimientos para proporcionar cantidades suficientes de enzimas lisosomales biológicamente activas, tales como la α-galactosidasa a, a las células deficientes en la misma. Recientemente se han intentado abordajes recombinantes para abordar estas necesidades, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº . 5.658.567; 5.580.757; Bishop y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 83: 4859-4863 (1986); Medin y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 93: 7917-7922 (1996); Novo, F. J., Gene Therapy. 4: 488-492 (1997); Ohshima y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 94: 2540-2544 (1997); y Sugimoto y col., Human Gene Therapy 6: 905915, (1995). A través de la dirección mediada por la manosa-6-fosfato de péptidos terapéuticos a los lisosomas, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para liberar cantidades suficientes de péptidos lisosomales biológicamente activos a las células deficientes.
Por tanto, en una realización ejemplar, la presente invención proporciona un péptiudo de acuerdo con la Tabla 6 que se obtiene con manosa-6-fosfato (Figura 23 y Figura 24). El péptido se puede preparar de forma recombinante o química. Además, el péptido puede tener la secuencia natural completa o puede estar modificado por, por ejemplo, truncamiento, extensión o puede incluir sustituciones o deleciones. Ejemplos de proteínas que se remodelan usando un procedimiento de la presente invención incluyen la glucocerebrosidasa, la β-glucosidasa, la α-galactosidasa A, la α-glucosidasa ácida (maltasa ácida). Péptidos modificados representativos que están en uso clínico incluyen Ceredase™, Cerezyme™, y Fabryzyme™. Un grupo glucosilo en péptidos modificados y clínicamente relevantes también se puede alterar usando un procedimiento de la invención. La manosa-6-fosfato está unida al péptido a través de un grupo de unión a glucosilo. En una realización ejemplar, el grupo de unión a glucosilo deriva de ácido siálico. Ejemplos de grupos de unión a glucosilo derivados de ácido siálico se exponen en la Tabla 2, en los que uno
o más de los restos “R” son manosa-6-fosfato o un grupo espaciador que tiene uno o más restos de manosa-6fosfato unidos al mismo. El resto de ácido siálico modificado es, preferentemente, e residuo terminal de un oligosacáridos unido a la superficie del péptido (Figura 25).
Además de la manosa-6-fosfato, los péptidos de la invención pueden derivarse adicionalmente con un resto tal como un polímero hidrosoluble, un resto terapéutico o un resto de direccionamiento adicional. Los procedimientos para unir estos y otros grupos se indican en el presente documento. En una realización ejemplar, el grupo distinto a manosa-6-fosfato se une al péptido a través de un derivado de ácido siálico derivado de acuerdo con la Tabla 2, en la que uno o más de los restos “R” son un grupo distinto a manosa-6-fosfato.
En una realización ejemplar, se prepara un resto de ácido siálico modificado con una rama ligadora a base de glicina protegida con Cbz. El correspondiente azúcar del nucleótido se prepara y el grupo Cbz se elimina mediante hidrogenación catalítica. El azúcar del nucleótido resultante tiene una amina reactiva disponible que se pone en contacto con un derivado de manosa-6-fosfato activado, proporcionando un azúcar del nucleótido derivado de manosa-6-fosfato que es útil en la práctica de los procedimientos de la invención.
Como se muestra en el siguiente esquema (esquema 15), un derivado de manosa-6-fosfato activado ejemplar se forma convirtiendo un fosfotriéster protegido con 2-bromo-bencilo en el triflato correspondiente, in situ, y haciendo reaccionar el triflato con un ligador que tiene un resto que contiene oxígeno reactivo, formando un enlace éter entre el azúcar y el ligador. Loas grupos protectores bencilo se eliminan mediante hidrogenación catalítica y el éster metílico del ligador se hidroliza, proporcionando el correspondiente ácido carboxílico. El ácido carboxílico se activa por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Un procedimiento de activación ejemplar reside en la conversión del ácido carboxílico en el éster N-hidroxisuccinimida.
Esquema 15
En otra realización ejemplar, como se muestra en el siguiente esquema (Esquema 16), un ácido siálico N-acetilado se convierte en una amina mediante manipulación del resto piruvilo. Por tanto, el hidroxilo primario se convierte en un éster sulfonato y reacciona con azida sódica. La azida se reduce catalíticamente en la correspondiente amina. El azúcar se convierte después en su análogo nucleotídico y se acopla, a través del grupo amina, a la manosa-6fosfato derivada de la rama ligadora preparada como se ha tratado anteriormente.
Esquema 16
Los péptidos útiles para tratar enfermedades del almacenamiento lisosómico se pueden obtener con otros restos de direccionamiento, incluidos, entre otros, transferrina (para liberar el péptido a través de la barrera hematoencefálica y a los endosomas), carnitina (para liberar el péptido en las células musculares) y fosfonatos, por ejemplo bisfosfonatos (para dirigir el péptido al hueso y a otros tejidos calciferosos). El reto dirigido y el péptido terapéutico se conjugan por cualquier procedimiento tratado en el presente documento o conocido de otro modo en la técnica.
En una realización ejemplar, el agente direccionador y el péptido terapéutico se acoplan a través de un resto ligador. En esta realización, al menos uno del péptido terapéutico o el agente direccionador se acopla al resto ligador a través de un grupo de unión a glucosilo de acuerdo con el procedimiento de la invención. En una realización ejemplar, el resto ligador incluye un poli(éter) tal como poli(etilenglicol). En otra realización ejemplar, el resto ligador incluye al menos un enlace que se degrada in vivo, liberando el péptido terapéutico del agente direccionador, a lo que sigue la liberación del conjugado en el tejido o región del cuerpo al que se ha dirigido
En otra realización ejemplar más, la distribución in vivo del resto terapéutico se altera alternado una glucoforma del resto terapéutico sin conjugar el péptido terapéutico con un resto direccionador. Por ejemplo, el péptido terapéutico se puede alejar de la captación por el sistema reticuloendotelial protegiendo un resto de galactosa terminal de un grupo glucosilo con ácido siálico (o un derivado del mismo) (Figuras 23 y 26), La sialización para cubrir la Gal terminal evita la captación del péptido por los receptores de la asialoglucoproteína hepática (ASGP) y puede extender la semivida del péptido en comparación con los péptidos que solo tienen cadenas de glicano complejas, en ausencia de sialilación.
II. Péptidos /Glucopéptidos de la invención
En una realización, la presente invención proporciona una composición que comprende múltiples copias de un solo péptido que tiene un núcleo de trimanosilo elemental como la estructura de glicano primaria unida al mismo. En realizaciones preferidas, el péptido puede ser una molécula terapéutica. La forma natural del péptido puede comprender glicanos unidos a N complejos o puede ser un glicano rico en manosa. El péptido puede ser un péptido de mamífero y es, preferentemente, un péptido de ser humano. En algunas realizaciones, el péptido se selecciona del grupo que consiste en una inmunoglobulina, eritropoyetina, péptido activador de tipo tisular y otros (véase la Figura 1).
Péptidos ejemplares cuyos glicanos se pueden remodelar usando los procedimientos de la invención se indican en la Figura 1.
Tabla 5. Péptidos preferidos para remodelado de glicano
Hormonas y factores de crecimiento Receptores y receptores quiméricos G-CSF CD4 GM-CSF Receptor del factor de necrosis tumoral (TNF-R) TPO Fusión TNF-R:IgG Fc EPO Alfa-CD20 Variantes de EPO PSGL-1 FSH Complemento HGH GlyCAM o su quimera Insulina N-CAM o su quimera alfa-TNF Anticuerpos Monoclonales (Inmunoglobulinas) Leptina MAb-anti-RSV Enzimas e inhibidores MAb-anti-receptor de IL-2 TPA MAb-anti-CEA Variantes de TPA MAb-anti-glucoproteína IIb/IIIa Uroquinasa MAb-anti-EGF Factores VII, VIII, IX, X MAb-anti-Her2 DNasa MAb-CD20 Glucocerebrosidasa MAb-alfa-CD3 Hirudina MAb-TNFá á1 antitripsina (inhibidor de á1 proteasa MAb-CD4 ) MAb-PSGL-1 Antitrombina III Mab-anti proteína F d l virus respiratorio sincitial á-glucosidasa ácida (maltasa ácida) á galactosidasa A Células á-L-iduronidasa Glóbulos rojos Uroquinasa Glóbulos blancos (p. ej., linfocitos T, linfocitos B, Citoquinas y citoquinas quiméricas células dendríticas, macrófagos, células NK, Interleucina-1 (IL-1), 1B, 2, 3, 4 neutrófilos, monocitos) Interferón-alfa (IFN-alpha) Células madre IFN-alfa-2b Otras IFN-beta Antígeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg) IFN-gamma Toxina diftérica quimérica-IL-2
35 Tabla 6. Péptidos más preferidos para remodelado de glicano
Factor estimulante de las colonias de granulocitos
Interleucina-2 (IL-2)
(G-CSF)
Factor VIII
Interferón α
hrDNasa
Interferón β
Insulina
Factor de coagulación VII
Proteína de superficie de la Hepatitis B (HbsAg)
Factor de coagulación IX
Hormona de crecimiento humana (HGH)
Hormona estimulante de los folículos(FSH)
Uroquinasa
Eritropoyetina (EPO)
Fusión del receptor de TN -IgG Fc (Enbrel™)
Factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos
MAb-Her-2 (Herceptin™)
(GM-CSF)
MAb-proteína F del virus sincital
Interferón γ S
respiratorio (Synagis™)
Inhibidor de la α1 proteasa (α1 antitripsina)
MAb-CD20 (Rituxan™)
Activador del plasminógeno tisular (TPA)
MAb-TNFα (Remicade™)
Glucocerebrosidasa (Cerezyme™)
MAb-Glucoproteína IIb/IIIa (Reopro™)
Una lista más detallada de péptidos útiles en la invención y su fuente se proporciona en la Figura 1.
Otros péptidos ejemplares que se modifican mediante los procedimientos de la invención incluyen miembros de la familia de las inmunoglobulinas (p. ej., anticuerpos, moléculas del MHC, receptores de linfocitos T), receptores intercelulares (p. ej., integrinas, receptores de hormonas o factores de crecimiento, lectinas y citoquinas (p. ej., interleucinas). Ejemplos adicionales incluyen el activador del plasminógeno tisular (TPA), renina, factores de coagulación como el factor VIII y el factor IX, bombesina, trombina, factor de crecimiento hematopoyético, factores estimulantes de las colonias, antígenos virales, péptidos del complemento, α1-antitripsina, eritropoyetina, ligando 1 del glucopéptido de la selectina P (PSGL-1), factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos, antitrombina III, interleucinas, interferones, péptidos A y C, fibrinógeno, herceptin™, leptina, glucosidasas, entre muchos otros. La lista de péptidos es un ejemplo y no debe considerarse exclusiva. En su lugar, es evidente a partir de la divulgación proporcionada en el presente documento que los procedimientos de la invención son aplicables a cualquier péptido con una estructura de glicano deseada.
Los procedimientos de la invención también son útiles para modificar péptidos quiméricos, incluidos péptidos quiméricos que incluyen un resto derivado de una inmunoglobulina, tal como IgG.
Los péptidos modificados por los procedimientos de la invención pueden ser péptidos sintéticos o silvestres o pueden ser péptidos mutados, producidos mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio. Normalmente, la glucosilación de péptidos está unida a N o unida a O. Un enlace a N ejemplar es la unión del azúcar modificado a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto hidrocarburo a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un péptido crea un posible sitio de glucosilación. Como se describe en el presente documento, glucosilación unida a O se refiere a la unión de un azúcar (p. ej., N-acetilgalactosamina, galactosa, manosa, GlcNAc, glucosa, fucosa o xilosa) a una cadena lateral hidroxi de un ácido hidroxilamino, preferentemente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina
o 5-hidroxilisina.
Varias realizaciones ejemplares de la invención se tratan más adelante. Aunque varias de estas realizaciones usan péptidos que tienen nombres comerciales y otros péptidos específicos como péptido ejemplar, estos ejemplos no están confinados a ningún péptido específico. Las realizaciones ejemplares siguientes se contempla que incluyen todos los equivalentes peptídicos y variantes de cualquier péptido. Dichas variantes incluyen añadir y delecionar sitios de glucosilación unida a N y unida a O y las proteínas de fusión con sitios de glucosilación añadidos. Un experto en la técnica apreciará que las realizaciones siguientes y los procedimientos básicos divulgados en las mismas se pueden aplicar a muchos péptidos con igual éxito.
En una realización ejemplar, la presente invención proporciona procedimientos para modificar el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF). Las Figuras 27A a 27G exponen algunos ejemplos de cómo se consigue usando la metodología divulgada en el presente documento. En la Figura 27B, un péptido G-CSF que se expresa en un sistema de células de mamífero se recorta usando sialidasa. Los residuos expuestos de este modo se modifican mediante la adición de un resto ácido siálico-poli(etilenglicol) (Resto PEG), usando un donante adecuado y ST3Gal1. La Figura 27C expone un ejemplo de esquema para modificar un péptido G-CSF que se expresa en una célula de insecto. El péptido se modifica añadiendo un resto galactosa usando un donante adecuado del mismo y una glucosiltransferasa. Los residuos de galactosa se funcionalizan con PEG mediante un derivado de ácido siálico-PEG a través de la acción de ST3Gal1. En la Figura 27D, el G-CSF expresado en las bacterias se pone en contacto con un donante de N-acetilgalatosamina y una acetilgalactosamina transferasa. El péptido se funcionaliza con PEG, usando un donante de ácido siálico PEGilado y una sialiltransferasa, En la Figura 27 E, la célula de mamífero que expresó G-CSF se pone en contacto con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactivo al donante de ácido siálico. Tras la adición a un residuo de glucosilo en el glicano en el péptido, la cetona se deriva con un resto, tal como una hidrazina-o amina-PEG. En la Figura 27F, el CSF expresado en las bacterias se remodela poniendo en contacto el péptido con una enzima endo-GalNAc en condiciones en las que funcione de un modo sintético y no hidrolítico, añadiendo una molécula de PEG-Gal-GalNAc a partir de un derivado activado del mismo. La Figura 27G proporciona otra vía de remodelar el CSF expresado en bacterias. El polipéptido deriva con un residuo de N-acetilgalactosamina PEGilada poniendo den contacto del polipéptido con una N-acetilgalactosamina transferasa y un donante adecuado de acetilgalactosamina PEGilada.
En otra realización ejemplar, la invención proporciona procedimientos para modificar el interferón α-14C (IFNα14C), como se muestra en las Figuras 28A a 28N. Las diversas formas de IFNα se divulgan en el presente documento. En la Figura 28B, el IFNα14C expresado en células de mamífero se trata primero con sialidasa para recortar las unidades de ácido siálico que tiene y, después, la molécula se PEGila usando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 28C, se añade primero N-acetilglucosamina al IFNα14C que se ha expresado en células de insecto o fúngicas, en las que la reacción se realiza mediante la acción de GnT-I y/o II o usando un donante de N-acetilglucosamina. Después, el polipéptido se PEGila usando una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa. En la Figura 28D, el IFNα14C expresado en levadura se trata primero con Endo-H para recortar las unidades de glucosilo que tiene. Las moléculas se galactosilan usando una galactosiltransferasa y un donante de galactosa y después se PEGila usando ST3Ga13 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 28F, el IFNα14C producido por las células de mamífero se modifica en un resto PEG usando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG En la Figura 28G, el IFNα14C expresado en células de insecto o fúngicas primero se ha añadido Nacetilglucosamina usando una o más de GnT I, II, IV, y V y un donante de N-acetilglucosamina. La proteína se galactosila después usando un donante adecuado y una galactosiltransferasa. Después, el IFNα14C se PEGila usando ST3Gal3 y un donante de PEG-ácido siálico. En la Figura 28H, el IFNα14C expresado en levadura se trata primero con manosidasas para recortar los grupos manosilo. Después se añade N-acetilglucosamina usando un de N-acetilglucosamina y una o más de GnT I, II, IV, y V. El IFNα14C se galactosila después usando un donante adecuado y una galatosiltransferasa. Después, el polipéptido se PEGila usando ST3Gal3 y un donante de PEGácido siálico. En la Figura 28I, el IFNα14C expresado en células NSO se modifica protegiendo los residuos terminales adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactivo al donante de ácido siálico. Tras la adición a un residuo de glucosilo del péptido, la cetona se deriva con un resto, tal como una hidrazina-o amina-PEG. En la Figura 28J, el IFNα14C expresado en células de mamífero se PEGila usando un donante de PEG-ácido siálico y α 2,8-sialiltransferasa. En la Figura 28K, el IFNα14C producido por células de mamífero se trata primero con sialidasa para recortar las unidades de ácido siálico terminales y, después, la molécula se PEGila usando trans-sialidasa y un complejo de ácido siálico PEGilado-lactosa. En la Figura 28L, el IFNα14C expresado en células de mamífero se sialila usando un donante de ácido siálico y α 2,8sialiltransferasa. En la Figura 28M, al IFNα14C expresado en células de insecto o fúngicas primero se ha añadido Nacetilglucosamina usando un donante adecuado y GnT I y/o II. Después, la molécula se pone en contacto con una galatosiltransferasa y un donante de galactosa que se deriva con un ácido siálico reactivo a través de un ligador, de modo que el polipéptido está unido al ácido síálico reactivo mediante el ligador y el residuo de galactosa. Después, el polipéptido se pone en contacto con ST3Gal3 y transferrina y, de este modo, queda conectado con la transferrina a través del residuo de ácido siálico. En la Figura 28N, el IFNα14C expresado en células de insecto o fúngicas se trata primero con endoglucanasa para recortar los grupos glucosilo y después se pone en contacto con una galatosiltransferasa y un donante de galactosa que se deriva con un ácido siálico reactivo a través de un ligador, de modo que el polipéptido está unido al ácido síálico reactivo mediante el ligador y el residuo de galactosa. Después, la molécula se pone en contacto con ST3Gal3 y transferrina y, de este modo, queda conectado con la transferrina a través del residuo de ácido siálico.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar el interferón α-2a o 2b (IFNα), tal como se muestra en las Figuras 28O a 28EE. En la Figura 28P, el IFNα producido en células de mamíferos se trata en primer lugar con sialidasa para acortar las unidades de glicosilo, y a continuación se PEGila utilizando ST3GaI3 y un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 28Q, IFNα expresado en células de insecto se galactosila en primer lugar utilizando un donante adecuado y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal1 y un donante de ácido siálico PEGilado. La Figura 28R ofrece otro procedimiento para remodelar el IFNα expresado en bacterias: se añade N-acetilgalactosamina PEGilada a la proteína utilizando un donante adecuado y N-acetilgalactosamina transferasa. En la Figura 28S, el IFNα expresado en células de mamíferos se ha modificado protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina o amina PEG. En la Figura 28T, IFNα expresado en bacterias se PEGila utilizando una enzima endo-N-acetilgalactosamidasa modificada que funciona de manera sintética en vez de hidrolítica, y utilizando un donante de N-acetilgalactosamina derivatizado con un resto PEG. En la Figura 28U, se añade en primer lugar N-acetilgalactosamina a IFNα utilizando un donante adecuado y N-acetilgalactosamina transferasa, y a continuación se PEGila utilizando una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico PEGilado. En Figura 28V, IFNα expresado en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, y a continuación se PEGila utilizando un donante adecuado y ST3Gal1 y/o ST3Gal3. En la Figura 28W, IFNα expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico. A continuación el polipéptido se pone en contacto con ST3Gal1 y dos restos de ácido siálico reactivos que se unen mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une a un ácido siálico reactivo mediante el enlazador y el segundo resto de ácido siálico. El polipéptido se pone en contacto posteriormente con ST3gal3 y transferrina, y de esta manera, queda unido a la transferrina mediante el resto de ácido siálico. En la Figura 28Y, IFNα expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal1 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 28AA, IFNα expresado de forma bacteriana se añade en primer lugar a N-acetilgalactosamina utilizando un donante adecuado y N-acetilgalactosamina transferasa. A continuación la proteína se PEGila utilizando una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 28CC, IFNα expresado en bacterias se modifica en otro procedimiento: se añade N-acetilgalactosamina PEGilada a la proteína mediante la N-acetilgalactosamina transferasa utilizando un donante de N-acetilgalactosamina PEGilada. En la Figura 28DD, IFNα expresado en bacterias se remodela en otro esquema más. El polipéptido se pone en contacto en primer lugar con N-acetilgalactosamina transferasa y un donante de N-acetilgalactosamina que se derivatiza con un ácido siálico reactivo mediante un enlazador, de tal manera que IFNα se une al ácido siálico reactivo mediante el enlazador y la N-acetilgalactosamina. A continuación IFNα se pone en contacto con ST3Gal3 y asialo-transferrina de tal manera que quede unida a la transferrina mediante un resto de ácido siálico. A continuación, IFNα se protege terminalmente con restos de ácido siálico utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. Se da a conocer un procedimiento adicional para modificar IFNα expresado de forma bacteriana en la Figura 28EE, en el que IFNα se expone en primer lugar a NHS-CO-enlazador-SA-CMP y a continuación se pone en contacto con un ácido siálico reactivo mediante el enlazador. Este se conjuga posteriormente con transferrina utilizando St3Gal3 y transferrina.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar el interferón β (IFNβ) tal como se muestra en las Figuras 29A a 29S. En la Figura 29B, IFN-β expresado en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos. A continuación, se PEGila la proteína utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. La figura 29C es un esquema para modificar el IFNβ producido por células de insecto. En primer lugar, se añade N-acetilglucosamina a IFN-β utilizando un donante adecuado y GnT-I y/o –II. A continuación, la proteína se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa. Finalmente, IFN-β se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 29D, IFN-β expresado en levadura se trata en primer lugar con Endo-H para acortar sus cadenas de glicosilo, y a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 29E, IFN-β producido por células de mamíferos se modifica mediante PEGilación utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico ya derivatizado con un resto de PEG. En la Figura 29F, al IFN-β expresado en células de insecto se añade en primer lugar Nacetilglucosamina mediante uno o más de GnT I, II, IV, y V utilizando un donante de N-acetilglucosamina, y a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 29G, el IFN-β expresado en levaduras se trata en primer lugar con manosidasas para acortar las unidades de manosilo, a continuación se añade Nacetilglucosamina mediante un donante de N-acetilglucosamina y uno o más de GnT I, II, IV, y V. La proteína se galactosida adicionalmente utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa y después se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 29H, el IFN-β expresado en células de mamífero se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina-PEG o amina-PEG. En la Figura 29I, IFN-β expresado en un sistema de mamífero se PEGila utilizando un donante de ácido siálico-PEG y α2,8sialiltransferasa. En la Figura 29J, IFN-β expresado por células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar sus restos de ácido siálico de los extremos, y a continuación se PEGila utilizando trans-sialidasa y un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 29K, IFN-β expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos. A continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 29L, IFN-β expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa y galactosidasa para acortar las cadenas de glicosilo, galactosidándose a continuación utilizando un donante de galactosa y una α-galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 o una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 29M, IFN-β expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar las unidades de glicosilo. Este se PEGila a continuación utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 29N, IFN-β expresado en células de mamífero se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina-PEG o amina-PEG. En la Figura 29O, IFN-β expresado en células de mamífero se sialila utilizando un donante de ácido siálico y una α 2,8-sialiltransferasa. En la Figura 29Q, al IFN-β producido por células de insecto se añade en primer lugar N-acetilglucosamina y uno o más de GnT I, II, IV, y V, y se PEGila adicionalmente utilizando un donante de PEG-galactosa y una galactosiltransferasa. En la Figura 29R, IFN-β expresado en levadura se trata en primer lugar con endoglicanasa para acortar los grupos glicosilo, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 29S, IFN-β expresado en un sistema de mamífero se pone en contacto en primer lugar con ST3Gal3 y dos restos de ácido siálico reactivos unidos mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une a un ácido siálico reactivo mediante el enlazador y el segundo resto de ácido siálico. El polipéptido se pone en contacto a continuación con ST3Gal3 y transferrina desialilada, y de esta manera queda unido a la transferrina mediante el resto de ácido siálico. A continuación, IFN-β se sialila adicionalmente utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar el Factor VII o VIIa, tal como se muestra en las Figuras 30A a 30D. En la Figura 30B, el Factor VII o VIIa producido por un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. Figura 30C, el Factor VII o VIIa expresado por células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. Además, el polipéptido se sialila con ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. La Figura 30D ofrece otro esquema de modificación para el factor VII o VIIa producido por células de mamífero; el polipéptido se trata en primer lugar con sialidasa y galactosidasa para acortar sus restos de ácido siálico y galactosa, a continuación se galactosila utilizando una galactosiltransferasa y un donante de galactosa, y a continuación de PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar el Factor IX, algunos ejemplos de los cuales se incluyen en las Figuras 31A a 31G. En la Figura 31B, el factor IX producido por células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos, y a continuación se PEGila con ST3Gal3 utilizando un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 31C, el Factor IX expresado por células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos, este se PEGila a continuación utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y se sialila adicionalmente utilizando ST3Gal1 y un donante de ácido siálico. Se puede encontrar otro esquema para la remodelación de células de mamífero producidas mediante el Factor IX en la Figura 31D. El polipéptido se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, se sialila adicionalmente utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3, y a continuación se PEGila utilizando un donante de ácido siálico PEGilado y ST3Gal1. En la Figura 31E, el Factor IX que se ha expresado en un sistema de mamífero se PEGila mediante el procedimiento de sialilación catalizado por ST3Gal3 utilizando un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 31F, el factor IX expresado en células de mamífero se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina -PEG o amina-PEG. La Figura 31G proporciona un procedimiento adicional de modificación del Factor IX. El polipéptido, producido por células de mamífero, se PEGila utilizando un donante de ácido siálico-PEG y una α 2,8sialiltransferasa.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para la modificación de la hormona estimuladora del Folículo (FSH). Las Figuras 32A a 32J presentan algunos ejemplos. En la Figura 32 B, FSH se expresa en un sistema de mamífero y se modifica mediante el tratamiento de la sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos, seguido por PEGilación utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 32C, la FSH expresada en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. La Figura 32D proporciona un esquema para la modificación de la FSH expresada en un sistema de mamífero. El polipéptido se trata con sialidasa y galactosidasa para acortar sus restos de ácido siálico y galactosa, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 32E, la FSH expresada en células de mamífero se modifica en el siguiente procedimiento. La FSH se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. La Figura 32F ofrece otro ejemplo de modificación de la FSH producida por células de mamífero. El polipéptido se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina-PEG o amina-PEG. En la Figura 32G, la FSH expresada en un sistema de mamífero se modifica en otro procedimiento: el polipéptido se remodela con la adición de ácido siálico utilizando un donante de ácido siálico y una α 2,8-sialiltransferasa. En la Figura 32H, la FSH se expresa en células de insecto y se modifica en el siguiente procedimiento: Se añade en primer lugar Nacetilglucosamina a la FSH utilizando un donante de N-acetilglucosamina adecuado y uno o más de GnT I, II, IV, y V; a continuación, la FSH se PEGila utilizando un donante de PEG-galactosa y una galactosiltransferasa. La Figura 32I representa gráficamente un esquema de modificación de la FSH producida por levadura. De acuerdo con este esquema, la FSH se trata en primer lugar con endoglicanasa para acortar los grupos glicosilo, se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila con ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 32J, la FSH expresada por células de mamífero se pone en contacto en primer lugar con ST3Gal3 y dos restos de ácido siálico reactivos mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une a un ácido siálico reactivo mediante el enlazador y un segundo resto de ácido siálico. El polipéptido se pone en contacto a continuación con ST3Gal1 y gonadotropina coriónica (CG) desialilada producida en CHO y de esta manera queda unida con la CG mediante el segundo resto de ácido siálico. A continuación, la FSH se sialila utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3 y/o ST3Gal1.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar la eritropoyetina (EPO), las Figuras 33A a 33J muestran algunos ejemplos que son relevantes para la remodelación de péptidos EPO naturales y mutantes. En la Figura 33B, la EPO expresada en diversos sistemas de mamíferos se remodela poniendo en contacto la proteína expresada con una sialidasa para eliminar los restos de ácido siálico de los extremos. El péptido resultante se pone en contacto con una sialitransferasa y un ácido siálico-CMP que se derivatiza con un resto de PEG. En la Figura 33C, la EPO que se expresa en células de insecto se remodela con Nacetilglucosamina, utilizando GnT I y/o GnT II. A continuación se añade galactosa al péptido, utilizando galactosiltransferasa. Se añade el grupo PEG al péptido remodelado poniendo en contacto este con una sialiltransferasa y un ácido siálico CMP que se derivatiza con un resto de PEG. En la Figura 33D, la EPO que se expresa en un sistema de células de mamífero se remodela eliminando restos de ácido siálico de los extremos mediante la acción de una sialidasa. Se añade galactosa a los extremos recientemente expuestos, utilizando una galactosiltransferasa y un donante de galactosa. Los restos de galactosa de los extremos de las unidades de glicosilo unidas a N se “protegen por sus extremos” con ácido siálico, utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. Los restos de galactosa de los extremos se funcionalizan con un ácido siálico que soporta un resto de PEG, utilizando un donante de ácido siálico y un ST3Gal1 adecuados. En la Figura 33E, la EPO que se expresa en un sistema de células de mamífero se remodela funcionalizando los restos de glicosilo unidos a N con un resto de ácido siálico derivatizado con PEG. El péptido se pone en contacto con ST3Gal3 y un donante de ácido siálico modificado adecuadamente. En la Figura 33F, la EPO que se expresa en un sistema de células de insecto se remodela añadiendo uno o más restos de N-acetilglucosamina de los extremos poniendo en contacto el péptido con un donante de n-acetilglucosamina y de uno o más GnTI, GnTII, y GnTV. A continuación se PEGila el péptido poniendo en contacto este con un donante de galactosa PEGilado y una galactosiltransferasa. En la Figura 33G, la EPO que se expresa en un sistema de células de insecto se remodela mediante la adición de restos de N-acetilglucosamina de los extremos, utilizando un donante de N-acetilglucosamina adecuado y uno o más de GnTI, GnTII, y GnTV. Se utiliza una galactosidasa que se ha preparado para funcionar de manera sintética en lugar de hidrolítica para añadir un donante de galactosa PEGilado activado a los restos de N-acetilglucosamina. En la Figura 33H, una EPO mutante expresada en células de mamífero se remodela protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como una hidrazina-PEG o amina-PEG. La Figura 33I muestra una ruta de remodelación a modo de ejemplo de una EPO mutante que se expresa en un sistema de células de mamífero. Se añade PEG al resto de glicosilo utilizando un ácido siálico modificado con PEG y una α 2,8-sialiltransferasa. La Figura 33J muestra otra ruta de remodelación a modo de ejemplo de una EPO mutante que se expresa en un sistema de células de mamífero. Se añade el ácido siálico al resto de glicosilo con un donante de ácido siálico y una α 2,8 sialiltransferasa.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), tal como se muestra en las Figuras 34A a 34K. En la Figura 34B, GM-CSF expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 34C, GM-CSF expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG y a continuación se sialila adicionalmente utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal1 y/o ST3Gal3. En la Figura 34D, GM-CSF expresado en células NSO se trata en primer lugar con sialidasa y !∃galactosidasa para acortar los restos de glicosilo, y a continuación se sialila utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 34E, GM-CSF expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y a continuación se sialila adicionalmente utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 34F, GM-CSF expresado en células de mamífero se modifica protegiendo adecuadamente los restos de los extremos con un donante de ácido siálico modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras adición a un resto glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina-PEG o amina – PEG. En la Figura 34G, GM-CSF expresado en células de mamífero se sialila utilizando un donante de ácido siálico y una α 2,8-sialiltransferasa. En la Figura 34I, GM-CSF expresado en células de insecto se modifica mediante la adición de N-acetilglucosamina utilizando un donante adecuado y uno o más de GnT I, II, IV, y V, seguido por la adición de galactosa PEGilada utilizando un donante adecuado y una galactosiltransferasa. En la Figura 34J GM-CSF expresado en levadura se trata en primer lugar con endoglicanasa y/o manosidasa para acortar las unidades de glicosilo, y se PEGila posteriormente utilizando una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa. En la Figura 34K, GM-CSF expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, y posteriormente se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. A continuación, el polipéptido se pone en contacto con ST3Gal1 y dos restos de ácido siálico unidos mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une a un ácido siálico reactivo mediante el enlazador y un segundo resto de ácido siálico. El polipéptido se pone en contacto de forma adicional con ST3Gal3 y transferrina, y de esta manera queda unido a la transferrina.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para la modificación del interferón gamma (IFN#). Las Figuras 35A a 35N contienen algunos ejemplos. En la Figura 35B, IFN# expresado en una variedad de células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos, y se PEGila posteriormente utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 35C, IFN# expresado en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos. A continuación, el polipéptido se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y se sialila adicionalmente con DT3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 35D, IFN# expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa y α-galactosidasa para acortar los restos de ácido siálico y galactosa. El polipéptido se galactosila a continuación utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa. A continuación, IFN# se PEGila utilizando un donante de ácido siálico-PEG y ST3Gal3. En la Figura 35E, IFN# que se expresa en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos. A continuación, el polipéptido se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y se sialila adicionalmente con St3Gal3 y un donante de ácido siálico. La Figura 35F describe otro procedimiento para modificar IFN# expresado en un sistema de mamífero. La proteína se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina-PEG o amina-PEG. En la Figura 35G, IFN# expresado en células de mamífero se remodela mediante la adición de ácido siálico utilizando un donante de ácido siálico y una α 2,8-sialiltransferasa. En la Figura 35I, IFN# expresado en células de insecto o fúngicas se modifica mediante la adición de N-acetilglucosamina utilizando un donante adecuado y uno o más de GnT I, II, IV, y V. La proteína se modifica adicionalmente mediante la adición de restos de PEG utilizando un donante de galactosa PEGilada y una galactosiltransferasa. La Figura 35J ofrece un procedimiento para modificar IFN# expresado en levadura. El polipéptido se trata en primer lugar con endoglicanasa para acortar las cadenas de sacáridos, y a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa. A continuación, IFN# se PEGila utilizando un donante de ácido siálico PEGilado y ST3Gal3. En la Figura 35K, IFN# producido por células de mamífero se modifica como sigue; el polipéptido se pone en contacto en primer lugar con ST3Gal3 y un donante de ácido siálico que se derivatiza con una galactosa reactiva mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une a la galactosa reactiva mediante el enlazador y un resto de ácido siálico. A continuación, el polipéptido se pone en contacto con una galactosiltransferasa y transferrina pretratada con endoglicanasa, y de esta manera queda unido a la transferrina mediante el resto de galactosa. En el esquema ilustrado por la Figura 35L, IFN#, que se expresa en un sistema de mamífero, se modifica mediante la acción de ST3Gal3. El ácido siálico PEGilado se transfiere desde un donante adecuado a IFN#. La Figura 35M es un ejemplo de modificación de IFN# expresado en células de insecto o fúngicas, en el que la PEGilación del polipéptido se consigue transfiriendo N-acetilglucosamina PEGilada desde un donante a IFN# utilizando GnT I y/o II. En la Figura 35N, IFN# expresado en un sistema de mamífero se remodela con la adición de ácido siálico PEGilado utilizando un donante adecuado y una α 2,8-sialiltransferasa.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar la α1 anti-tripsina (inhibidor de la α1-proteasa). Se pueden encontrar algunos de dichos ejemplos en las Figuras 36A a 36O. En la Figura 36B, la α1 anti-tripsina expresada en una variedad de células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico. A continuación se añaden restos de ácido siálico PEGilados utilizando un donante adecuado, tal como CMP-SA-PEG, y una sialiltransferasa, tal como ST3gal3. La Figura 36C demuestra otro esquema para la modificación de la α1 anti-tripsina. La α1 anti-tripsina expresada en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico. A continuación, se añaden restos de ácido siálico derivatizado con PEG utilizando un donante adecuado y una sialiltransferasa, tal como ST3Gal3. Posteriormente, la molécula se modifica adicionalmente mediante la adición de restos de ácido siálico utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3. En la Figura 36D, la α1 anti-tripsina expresada se trata en primer lugar con sialidasa y α-galactosidasa para acortar los restos de ácido de los extremos y la galactosa enlazada a α. El polipéptido a continuación se galactosila utilizando galactosiltransferasa y un donante de galactosa adecuado. Además, se añade ácido siálico derivatizado con PEG mediante la acción de ST3Gal3 utilizando un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 36E, la α1 anti-tripsina expresada en un sistema de mamífero tiene los restos de ácido siálico de los extremos acortados utilizando sialidasa. A continuación se añade PEG a los restos de glicosilo unidos a N mediante la acción de ST3Gal3, que media en la transferencia del ácido siálico PEGilado procedente de un donante, tal como CMP-SA-PEG, a la α1 anti-tripsina. Posteriormente se unen más restos de ácido siálico utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3. La Figura 36F ilustra otro procedimiento mediante el cual se remodela la α1 anti-tripsina. La α1 anti-tripsina expresada en células de mamífero se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuado con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina-PEG o amina-PEG. En la Figura 36G, se da a conocer otro procedimiento más de modificación de la α1 anti-tripsina. La α1 anti-tripsina obtenida a partir de un sistema de expresión de mamífero se remodela con la adición de ácido siálico utilizando un donante de ácido siálico y una α 2,8-sialiltransferasa. En la Figura 36I, la α1 anti-tripsina se expresa en células de insecto o de levadura, y se remodela mediante la adición de restos de N-acetilglucosamina de los extremos por medio de la puesta en contacto del polipéptido con UDP-N-acetilglucosamina y uno o más de GnT I, II, IV, o V. A continuación, el polipéptido se modifica con restos de PEG utilizando un donante de galactosa PEGilada y una galactosiltransferasa. En la Figura 36J, la α1 anti-tripsina expresada en células de levadura se trata en primer lugar con endoglicanasa para acortar las cadenas de glicosilo. Este se galactosila a continuación con una galactosiltransferasa y un donante de galactosa. A continuación, el polipéptido se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 36K, la α1 anti-tripsina se expresa en un sistema de mamífero. El polipéptido se pone en contacto en primer lugar con ST3Gal3 y un donante de ácido siálico que se derivatiza con una galactosa reactiva mediante un enlazador, con el fin de que el polipéptido se una a la galactosa reactiva mediante el enlazador y el resto de ácido siálico. El polipéptido se pone en contacto a continuación con una galactosiltransferasa y transferrina pretratada con endoglicanasa, y de esta manera queda unido a la transferrina mediante el resto de galactosa. En la Figura 36M, la α1 anti-tripsina expresada en levadura se trata en primer lugar con endoglicanasa para acortar sus grupos glicosilo. A continuación, se PEGila la proteína utilizando una galactosiltransferasa y un donante de galactosa con un resto de PEG. En la Figura 36N, la α1 anti-tripsina expresada en células vegetales se trata con hexosaminidasa, manosidasa, y xilosidasa para acortar sus cadenas de glicosilo, y se modifica posteriormente con N-acetilglucosamina derivatizada con un resto de PEG, utilizando una N-acetilglucosamina transferasa y un donante adecuado. En la Figura 36O, la α1 anti-tripsina expresada en células de mamífero se modifica añadiendo restos de ácido siálico PEGilado utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico derivatizado con PEG.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar la glucocerebrosidasa (β-glucosidasa, Cerezyme™ o Ceredase™), tal como se muestra en las Figuras 37A a 37K. En la Figura 37B, Cerezyme™ expresada en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 37C Cerezyme™ expresada en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, a continuación se une el grupo manosa-6-fosfato utilizando ST3Gal3 y un ácido siálico reactivo derivatizado con manosa-6-fosfato, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 37D, Cerezyme™ expresada en células NSO se trata en primer lugar con sialidasa y galactosidasa para acortar los grupos glicosilo, y a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una α-galactosiltransferasa. A continuación, se añade un resto de manosa-6-fosfato a la molécula utilizando ST3Gal3 y un ácido siálico reactivo derivatizado con manosa-6-fosfato. En la Figura 37E, Cerezyme™ expresada en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 37F, Cerezyme™ expresada en células de mamífero se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como uno o más grupos de manosa-6-fosfaato. En la Figura 37G, la Cerezyme™ expresada en células de mamífero se sialila utilizando un donante de ácido siálico y ! 2,8 sialiltransferasa. En la Figura 37I, a la Cerezyme™ expresada en células de insecto se añade en primer lugar Nacetilglucosamina utilizando un donante adecuado y uno o más de GnT I, II, IV, y V, y a continuación se PEGila utilizando una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa. En la Figura 37J, Cerezyme™ expresada en levadura se trata en primer lugar con endoglicanasa para acortar los grupos glicosilo, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 37K, Cerezyme™ expresada en células de mamífero se pone en contacto en primer lugar con ST3Gal3 y dos restos de ácido siálico reactivos unidos mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une a un ácido siálico reactivo mediante el enlazador y el segundo resto de ácido siálico. El polipéptido se pone en contacto a continuación con ST3Gal3 y transferrina desialilada, y de esta manera queda unido a la transferrina. A continuación el polipéptido se sialila utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar el activador del plasminógeno de tipo tisular (TPA) y su mutante. En las Figuras 38A a 38W se presentan algunos esquemas de modificación específicos. La Figura 38B ilustra un procedimiento de modificación. Después de expresar el TPA por células de mamífero, este se trata con una o más de manosidasa(s) y sialidasa para acortar los restos de manosilo y/o ácido siálico. A continuación se añade la N-acetilglucosamina terminal poniendo en contacto el polipéptido con un donante adecuado de N-acetilglucosamina y uno o más de GnT I, II, IV, y V. Se galactosila adicionalmente el TPA utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa. A continuación, se une PEG a la molécula por medio de sialilación catalizada por ST3Gal3 y utilizando un donante de ácido siálico derivatizado con un resto de PEG. En la Figura 38C, el TPA se expresa en células de insecto o fúngicas. La modificación incluye las etapas de adición de N-acetilglucosamina utilizando un donante adecuado de N-acetilglucosamina y GnT I y/o II; la galactosilación utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa; y la unión de PEG por medio de sialilación utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico derivatizado con PEG. En la Figura 38D, el TPA se expresa en levadura y se trata posteriormente con endoglicanasa para acortar las cadenas de sacáridos. El polipéptido se PEGila adicionalmente mediante la acción de una galactosiltransferasa, que cataliza la transferencia de una PEG-galactosa desde un donante al TPA en la Figura 38E, el TPA se expresa en células de insecto o levadura. A continuación, el polipéptido se trata con α-y β-manosidasas para acortar los restos de manosilo de los extremos. Además, los restos de PEG se unen a la molécula mediante la transferencia de PEG-galactosa desde un donante adecuado al TPA, que está mediada por una galactosiltransferasa. La Figura 38F proporciona un procedimiento diferente para la modificación del TPA obtenido a partir de un sistema de insecto o levadura: el polipéptido se remodela mediante la adición de N-acetilglucosamina utilizando un donante de N-acetilglucosamina y GnT I y/o II, seguido por PEGilación utilizando una galactosiltransferasa y un donante de galactosa PEGilado. La Figura 38G ofrece otro esquema para la remodelación del TPA expresado en células de insecto o levadura. Se añade la N-acetilglucosamina terminal utilizando un donante de N-acetilglucosamina y GnT I y/o II. Una galactosidasa que se ha modificado para funcionar de una manera sintética en lugar de hidrolítica, se utiliza para añadir galactosa PEGilada procedente de un donante adecuado a los restos de N-acetilglucosamina. En la Figura 38I, el TPA expresado en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa y galactosidasa para acortar los restos de ácido siálico y galactosa. El polipéptido se modifica adicionalmente protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina -PEG o amina-PEG. En la Figura 38J, el TPA que se expresa en un sistema de mamífero, se remodela siguiendo este esquema; en primer lugar, el polipéptido se trata con α-y β-manosidasas para acortar los restos de manosilo de los extremos; a continuación, los restos de ácido siálico se unen a los restos de galactosilo de los extremos utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3; además, el TPA se PEGila mediante la transferencia de galactosa PEGilada desde un donante a un resto de N-acetilglucosaminilo catalizado por la galactosiltransferasa. En la Figura 38K, el TPA se expresa en un sistema vegetal. El procedimiento de modificación en este ejemplo es como sigue: el TPA se trata en primer lugar con hexosaminidasa, manosidasa, y xilosidasa para acortar sus grupos glicosilo; a continuación se añade N-acetilglucosamina PEGilada al TPA utilizando un donante adecuado y una N-acetilglucosamina transferasa. En la Figura 38M, se remodela un TPA mutante (TNK TPA), expresado en células de mamífero. Los restos de ácido siálico de los extremos se acortan en primer lugar utilizando sialidasa; a continuación se utiliza ST3Gal3 para transferir el ácido siálico PEGilado desde un donante al TNK TPA, de tal manera que se PEGila el polipéptido. En la figura 38N, TNK TPA expresado en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos. A continuación se PEGila la proteína utilizando CMP-SA-PEG como un donante y ST3Gal3, y se sialila adicionalmente utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3. En la Figura 38O, TNK TPA expresado en células NSO se trata en primer lugar con sialidasa y α galactosidasa para acortar los restos de ácido siálico y galactosa de los extremos. A continuación se galactosila el TNK TPA utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa. La última etapa en este esquema de remodelación es la transferencia de ácido siálico derivatizado con un resto de PEG procedente de un donante para TNK TPA utilizando sialiltransferasa o ST3Gal3. En la Figura 38Q, TNK TPA se expresa en un sistema de mamífero y se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos. A continuación se PEGila la proteína utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. A continuación, se sialila la proteína utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3. En la Figura 38R, TNK TPA expresado en un sistema de mamífero se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina-PEG o amina-PEG. En la Figura 38S, TNK TPA expresado en células de mamífero se modifica mediante un procedimiento diferente: el polipéptido se remodela con la adición de ácido siálico utilizando un donante de ácido siálico y una α 2,8-sialiltransferasa. En la Figura 38U, el TNK TPA expresado en células de insecto se remodela mediante la adición de N-acetilglucosamina utilizando un donante adecuado y uno o más de GnT I, II, IV, y V. La proteína se modifica adicionalmente mediante la adición de restos de PGE utilizando un donante de galactosa PEGilado y una galactosiltransferasa. En la Figura 38V, el TNK TPA se expresa en levadura. El polipéptido se trata en primer lugar con endoglicanasa para acortar sus cadenas de glicosilo y a continuación se PEGila utilizando un donante de galactosa derivatizado con PEG y una galactosiltransferasa. En la Figura 38W, se produce TNK TPA en un sistema de mamífero. El polipéptido se pone en contacto en primer lugar con ST3Gal3 y un donante de ácido siálico que se derivatiza con una galactosa reactiva mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une a la galactosa reactiva mediante el enlazador y un resto de ácido siálico. A continuación, el polipéptido se pone en contacto con una galactosiltransferasa y una quimera de IG dirigida contra TNF producida en CHO, y de esta manera se une a la quimera mediante el resto de galactosa.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar la interleuquina-2 (IL2). Las Figuras 39A a 39G proporcionan algunos ejemplos. La Figura 39B proporciona un esquema de modificación en dos etapas: La IL-2 producida por células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar sus restos de ácido siálico de los extremos, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 39C, la IL-2 expresada en células de insecto se modifica en primer lugar mediante galactosilación utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa. Posteriormente, la IL-2 se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 39D, se modifica la IL-2 expresada en bacterias con N-acetilgalactosamina utilizando un donante adecuado y una N-acetilgalactosamina transferasa, seguido por una etapa de PEGilación con un donante de ácido siálico-PEG y una sialiltransferasa. La Figura 39E ofrece otro esquema de modificación de la IL-2 producida por un sistema de mamífero. El polipéptido se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina-PEG o amina-PEG. La Figura 39F ilustra un ejemplo de remodelación de la IL-2 expresada por E. coli. El polipéptido se PEGila utilizando un complejo de N-acetilgalactosamina reactiva derivatizada con un grupo de PEG, y una enzima que se modifica de tal manera que funciona como una enzima sintética más bien que una hidrolítica. En la Figura 39G, la IL-2 expresada por bacterias se modifica mediante la adición de una N-acetilgalactosamina PEGilada utilizando un donante adecuado y una N-acetilgalactosamina transferasa.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar el Factor VIII, tal como se muestra en las Figuras 40A a 40N. En la Figura 40B, el factor VII expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 40C, el Factor VIII expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante adecuado, y a continuación se sialila adicionalmente utilizando ST3Gal1 y un donante de ácido siálico.
En la Figura 40E, el Factor VIII producido por células de mamífero se modifica mediante una única etapa de PEGilación, utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. La Figura 40F ofrece otro ejemplo de modificación del Factor VIII que se expresa por células de mamífero. La proteína se PEGila utilizando ST3Gal1 y un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 40G, el Factor VIII expresado por células de mamífero se remodela utilizando el otro esquema siguiente. Se PEGila utilizando una α 2,8 sialiltransferasa y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 40I, el Factor VIII producido por células de mamífero se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como una hidrazina-PEG o amina-PEG. En la Figura 40J, el factor VIII expresado por células de mamífero se trata en primer lugar con Endo-H para acortar los grupos glicosilo. A continuación se PEGila utilizando una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa. En la Figura 40K, el factor VIII expresado en un sistema de mamífero se sialila en primer lugar utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico, a continuación se trata con Endo-H para acortar los grupos glicosilo, y a continuación se PEGila con una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa. En la Figura 40L, el Factor VIII expresado en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con manosidasas para acortar los restos de manosilo de los extremos, se añade a continuación un grupo N-acetilglucosamina utilizando un donante adecuado y GnT I y/o II, y se PEGila a continuación utilizando una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa. En la Figura 40M, el factor VIII expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con manosidasas para acortar las unidades de manosilo, a continuación se añade un grupo N-acetilglucosamina utilizando una N-acetilglucosamina transferasa y un donante adecuado. Se galactosila adicionalmente utilizando una galactosiltransferasa y un donante de galactosa, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 40N, el Factor VIII se produce por células de mamífero y se modifica como sigue: se trata en primer lugar con manosidasas para acortar los grupos manosilo de los extremos. A continuación se añade un grupo N-acetilglucosamina PEGilado utilizando GnTI y un donante adecuado de N-acetilglucosamina PEGilada.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar la uroquinasa, tal como se muestra en las Figuras 41A a 41M. En la Figura 41B, la uroquinasa expresada en células de mamíferos se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, y se PEGila a continuación utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 41C, la uroquinasa expresada en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 41D, la uroquinasa expresada en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa y galactosidasa para acortar las cadenas de glicosilo, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una α-galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 o una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 41E, la uroquinasa expresada en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar restos de ácido siálico, a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y a continuación se sialila adicionalmente utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 41 F, la uroquinasa expresada en células de mamífero se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como una hidrazina -PEG o amina-PEG. En la Figura 41 G, la uroquinasa expresada en células de mamífero se sialila utilizando un donante de ácido siálico y una α 2,8-sialiltransferasa. En la Figura 41I, la uroquinasa expresada en células de insecto se modifica en las siguientes etapas: en primer lugar, se añade N-acetilglucosamina al polipéptido utilizando un donante adecuado de N-acetilglucosamina y uno o más de GnT I, II, IV, y V, a continuación se añade galactosa PEGilada, utilizando una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa. En la Figura 41J, la uroquinasa expresada en levadura se trata en primer lugar con endoglicanasa para acortar los grupos glicosilo, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 Y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 41K, la uroquinasa expresada en células de mamífero se pone en contacto en primer lugar con ST3Gal3 y dos restos de ácido siálico reactivos que se unen mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une a un ácido siálico reactivo mediante el enlazador y un segundo resto de ácido siálico. A continuación, el polipéptido se pone en contacto con ST3Gal1 y una uroquinasa desialilada producida en células de mamífero, y de esta manera llega a unirse con una segunda molécula de uroquinasa. A continuación, la molécula completa se sialila adicionalmente utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal1 y/o ST3Gal3. En la Figura 41L, la uroquinasa aislada se trata en primer lugar con sulfohidrolasa para eliminar grupos sulfato, y a continuación se PEGila utilizando una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 41M, la uroquinasa aislada se trata en primer lugar con sulfohidrolasa y hexosaminidasa para eliminar grupos sulfato y grupos hexosamina, y a continuación se PEGila utilizando una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar la ADNasa I, tal como se muestra en las Figuras 42A a 42K. La ADNasa I se expresa en un sistema de mamífero y se modifica en las siguientes etapas: en primer lugar, la proteína se trata con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, a continuación se PEGila la proteína con ST3Gal3 utilizando un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 42C, la ADNasa I expresada en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, a continuación se PEGila con ST3Gal3 utilizando un donante de ácido siálico-PEG, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 42D, la ADNasa I expresada en un sistema de mamífero se expone en primer lugar a sialidasa y galactosidasa para acortar los grupos glicosilo, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una α-galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 o sialiltransferasa y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 42E, la ADNasa I expresada en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico. A continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG, y a continuación se sialila con ST3Gal3 utilizando un donante de ácido siálico. En la Figura 42F, la ADNasa I expresada en células de mamífero se modifica protegiendo en los extremos los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina -PEG o amina-PEG. En la Figura 42G, la ADNasa I expresada en células de mamífero se sialila utilizando un donante de ácido siálico y una α 2,8-sialiltransferasa. En la Figura 42I, a la ADNasa I expresada en células de insecto se añade en primer lugar N-acetilglucosamina utilizando un donante adecuado y uno o más de GnT I, II, IV, y V. A continuación, se PEGila la proteína utilizando una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa. En la Figura 42J, la ADNasa I expresada en levadura se trata en primer lugar con endoglicanasa para acortar las unidades de glicosilo, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 Y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 42K, la ADNasa I expresada en células de mamífero se pone en contacto en primer lugar con ST3Gal3 y dos restos de ácido siálico reactivos unidos mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une a un ácido siálico reactivo mediante el enlazador y un segundo resto de ácido siálico. A continuación, el polipéptido se pone en contacto con ST3Gal1 y se desialila el inhibidor de la α-1 proteasa, y de esta manera llega a unirse con el inhibidor mediante el resto de ácido siálico. A continuación, el polipéptido se sialila adicionalmente utilizando un donante adecuado y ST3Gal1 y/o ST3Gal3.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar la insulina que está mutada para contener un sitio de N glicosilación, tal como se muestra en las Figuras 43A a 43L. En la Figura 43B, la insulina expresada en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 43C, la insulina expresada en células de insecto se modifica mediante la adición de N-acetilglucosamina PEGilada utilizando un donante adecuado y GnT i y/o II. En la Figura 43D, la insulina expresada en levadura se trata en primer lugar con Endo-H para acortar los grupos glicosilo, y a continuación se PEGila utilizando una galactosiltransferasa. En la Figura 43F, la insulina expresada en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 43G, la insulina expresada en células de insecto se modifica por la adición de galactosa PEGilada usando un donante adecuado y una galactosiltransferasa. En la Figura 43H, a la insulina expresada en bacterias se añade en primer lugar N-acetilgalactosamina utilizando un donante adecuado de ácido siálico-PEG. EN la Figura 43J, la insulina expresada en bacterias se modifica mediante un procedimiento diferente: se añade N-acetilgalactosamina PEGilada a la proteína utilizando un donante adecuado y una N-acetilgalactosamina transferasa. En la Figura 43K, la insulina expresada en bacterias se modifica siguiendo otro esquema: el polipéptido se pone en contacto en primer lugar con N-acetilgalactosamina transferasa y una N-acetilgalactosamina reactiva que se derivatiza con un ácido siálico reactivo mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une con un ácido siálico reactivo mediante el enlazador y la N-acetilgalactosamina. A continuación, el polipéptido se pone en contacto con ST3Gal3 y asialo-transferrina, y por tanto, queda unido a la transferrina. A continuación, el polipéptido se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 43L, la insulina expresada en bacterias se modifica utilizando otro procedimiento más: el polipéptido se expone en primer lugar a NHS-CO-enlazador-SA-CMP y llega a unirse al resto de ácido siálico reactivo mediante el enlazador. A continuación se conjuga el polipéptido con la transferrina utilizando ST3Gal3 y asialo-transferrina. A continuación, el polipéptido se sialila adicionalmente utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar el antígeno de la hepatitis B (antígeno M-preS2 y S), tal como se muestra en las Figuras 44A a 44K. En la Figura 44B, el antígeno M se expresa en un sistema de mamífero y se modifica mediante el tratamiento inicial de sialidasa para acortar los restos de ácido siálico y la posterior conjugación con el lípido A, utilizando ST3Gal3 y un ácido siálico reactivo unido al lípido A mediante un enlazador. En la Figura 44C, el antígeno M expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos, a continuación se conjuga con la toxina del tétano mediante un enlazador utilizando ST3Gal1 y un resto de ácido siálico reactivo unido a la toxina mediante el enlazador, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 44D, el antígeno M expresado en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con una galactosidasa para acortar los restos de glicosilo, y a continuación se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. A continuación, al polipéptido derivatizado con ácido siálico se añade KLH utilizando ST3Gal1 y un donante adecuado. En la Figura 44E, el antígeno M expresado en levadura se trata en primer lugar con manosidasa para acortar los restos de manosilo, y a continuación se conjuga con una toxina de difteria utilizando GnT I y un donante de Nacetilglucosamina unido a la toxina de la difteria. En la Figura 44F, el antígeno M expresado en células de mamífero se modifica protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo del péptido, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina -PEG o amina-PEG. En la Figura 44G, el antígeno M obtenido a partir de un sistema de mamífero se remodela mediante sialilación utilizando un donante de ácido siálico y una poli α 2,8-sialiltransferasa. En la Figura 44I, el antígeno M expresado en células de insecto se conjuga con una proteína de Neisseria utilizando GnT II y un donante adecuado de N-acetilglucosamina unido a la proteína de Neisseria. En la Figura 44J, el antígeno M expresado en levadura se trata en primer lugar con endoglicanasa para acortar sus cadenas de glicosilo, y a continuación se conjuga con una proteína de Miseria utilizando una galactosiltransferasa y un donante adecuado de galactosa unido a la proteína de Miseria. La Figura 44K es otro ejemplo de modificación del antígeno M expresado en levadura. El polipéptido se trata en primer lugar con manosidasas para acortar los restos de manosilo de los extremos, y a continuación se añade Nacetilglucosamina utilizando GnT I y/o II. Posteriormente, el polipéptido se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se protege en los extremos con restos de ácido siálico utilizando una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar la hormona del crecimiento humana (N, V, y sus variantes), tal como se muestra en las Figuras 45A a 45K. En la figura 45B la hormona del crecimiento humana tanto mutada para contener un sitio unido a N como una isoforma que se produce naturalmente que tiene un lado unido a N (es decir, la enzima placental) producida por células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico de los extremos y posteriormente se PEGila con ST3Gal3 utilizando un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 45C, la hormona del crecimiento humana expresada en células de insecto se modifica mediante la adición de N-acetilglucosamina PEGilada utilizando GnT I y/o II y un donante adecuado de N-acetilglucosamina PEGilada. En la Figura 45D, la hormona del crecimiento humana se expresa en levadura, tratada con Endo-H para acortar los grupos glicosilo, y se PEGila adicionalmente con una galactosiltransferasa utilizando un donante de galactosa PEGilado. En la Figura 45F, la proteína de fusión de la hormona del crecimiento humana-mucina expresada en un sistema de mamífero se modifica mediante el tratamiento inicial de sialidasa para acortar los restos de ácido siálico y la posterior PEGilación utilizando un donante de ácido siálico-PEG y ST3Gal1. En la Figura 45G, la proteína de fusión de la hormona de crecimiento humanamucina expresada en células de insecto se remodela mediante PEGilación con una galactosiltransferasa y utilizando un donante de galactosa PEGilada. En la Figura 45H, la proteína de fusión de la hormona de crecimiento humanamucina se produce en bacterias. Se añade en primer lugar N-acetilgalactosamina a la proteína de fusión mediante la acción de una N-acetilgalactosamina transferasa utilizando un donante de N-acetilgalactosamina, seguido por PEGilación de la proteína de fusión utilizando un donante de ácido siálico-PEG y una sialiltransferasa. La Figura 45I describe otro esquema de modificación de la proteína de fusión de la hormona de crecimiento humana-mucina expresada de forma bacteriana: la proteína de fusión se PEGila mediante la acción de la N-acetilgalactosamina transferasa utilizando un donante de N-acetilgalactosamina PEGilada. La Figura 45J proporciona un esquema de remodelación adicional para la proteína de fusión de la hormona del crecimiento humana-mucina. La proteína de fusión se pone en contacto en primer lugar con N-acetilgalactosamina transferasa y un donante de Nacetilgalactosamina que se derivatiza con un ácido siálico reactivo mediante un enlazador, de tal manera que la proteína de fusión se une al ácido siálico reactivo mediante un enlazador y N-acetilgalactosamina. A continuación se pone en contacto la proteína de fusión con una sialiltransferasa y asialo-transferrina, y de esta manera queda unido a la transferrina mediante el resto de ácido siálico. A continuación, la proteína de fusión se protege en los extremos con restos de ácido siálico utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico. En la Figura 45K, se proporciona otro esquema más par la modificación de la hormona del crecimiento humana (N) producida en bacterias. El polipéptido se pone en contacto en primer lugar con NHS-CO-enlazador-SA-CMP y llega a acoplarse con el ácido siálico reactivo mediante el enlazador. A continuación, el polipéptido se pone en contacto con ST3Gal3 y asialo-transferrina y llega a unirse a la transferrina mediante el resto de ácido siálico. A continuación, el polipéptido se sialila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para remodelar la proteína de fusión de la IgG del receptor de TNF (TNFR-IgG, o EnbrelTM) que se muestra en las Figuras 46A a G. la Figura 46B ilustra un procedimiento de modificación en el que TNFR-IgG expresada en un sistema de mamífero se sialila en primer lugar con un donante de ácido siálico y una sialiltransferasa, ST3Gal1; a continuación, la proteína de fusión se galactosila con un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, a continuación, la proteína de fusión se PEGila mediante la acción de ST3Gal3 y un donante de ácido siálico derivatizado con PEG. En la Figura 46C, TNFR-IgG expresada en células de mamífero se trata inicialmente con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico. Posteriormente, los restos de PEG se unen a TNFR-IgG por medio de ácido siálico PEGilado transferente de un donante a la proteína de fusión en una reacción catalizada por ST3gal1. En la Figura 46D, TNFR-IgG se expresa en un sistema de mamífero y se modifica mediante la adición de PEG a través del procedimiento de galactosilación, que está mediado por una galactosiltransferasa que utiliza un donante de PEG-galactosa. En la Figura 46E, TNFR-IgG se expresa en un sistema de mamífero. La primera etapa en la remodelación de la proteína de fusión es la adición de restos de ácido siálico unidos a O utilizando un donante de ácido siálico y una sialiltransferasa, ST3Gal1. Posteriormente, se añade galactosa PEGilada a la proteína de fusión utilizando una galactosiltransferasa y un donante adecuado de galactosa con resto PEG. En la Figura 46F, TNFR-IgG expresada en células de mamífero se modifica en primer lugar protegiendo los extremos de los restos de los extremos adecuados con un donante de ácido siálico que está modificado con ácido levulínico, añadiendo una cetona reactiva al donante de ácido siálico. Tras la adición a un resto de glicosilo de la proteína de fusión, la cetona se derivatiza con un resto tal como hidrazina -PEG
o amina-PEG. En la figura 46G, TNFR-IgG expresada en células de mamífero se remodela mediante la 2,8sialiltransferasa, que cataliza la reacción en la que el ácido siálico PEGilado se transfiere a l proteína de fusión a partir de un donante de ácido siálico con resto PEG.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para generar conjugados de HerceptinTM, tal como se muestra en las Figuras 47A a 47D. En la Figura 47B, HerceptinTM se expresa en un sistema de mamífero y se galactosila en primer lugar utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa. A continuación, HerceptinTM se conjuga con una toxina mediante un ácido siálico mediante la acción de ST3Gal3 utilizando un complejo de ácido siálico-toxina reactivo. En la figura 47C, HerceptinTM producida tanto en células de mamífero como fúngicas se conjuga con una toxina mediante el procedimiento de galactosilación, utilizando una galactosiltransferasa y un complejo de galactosa-toxina reactivo. La Figura 47D contiene otro esquema de preparación de los conjugados de HerceptinTM: HerceptinTM producida en hongos se trata en primer lugar con Endo-H para acortar los grupos glicosilo, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se conjuga con un radioisótopo por medio de sialilación, utilizando ST3Gal3 y un complejo de ácido siálico-radioisótopo reactivo.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para preparar conjugados de SynagisTM, tal como se muestra en las figuras 48A a 48D. En la Figura 48B, SynagisTM expresado en células de mamífero se galactosila en primer lugar utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 48C, SynagisTM expresado en células de mamífero o fúngicas se PEGila utilizando una galactosiltransferasa y un donante de PEGgalactosa. En la Figura 48D, SynagisTM expresado se trata en primer lugar con Endo-H para acortar los grupos glicosilo, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para generar conjugados de RemicadeTM, tal como se muestra en las Figuras 49A a 49D. En la Figura 49B, RemicadeTM expresado en un sistema de mamífero se galactosila en primer lugar utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 49C, RemicadeTM expresado en un sistema de mamífero se modifica mediante la adición de galactosa PEGilada utilizando un donante adecuado y una galactosiltransferasa. En la Figura 49D, RemicadeTM expresado en hongos se trata en primer lugar con Endo-H para acortar las cadenas de glicosilo, a continuación se galactosila utilizando un donante de galactosa y una galactosiltransferasa, y a continuación se conjuga con un radioisótopo utilizando ST3Gal3 y un ácido siálico reactivo derivatizado con el radioisótopo.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para modificar Reopro, que está mutado para contener un sitio de N glicosilación. Las Figuras 50A a 50L contienen dichos ejemplos. En la Figura 50B, Reopro expresado en un sistema de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico, y a continuación se PEGila utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 50C, Reopro expresado en células de insecto se modifica mediante la adición de N-acetilglucosamina PEGilada utilizando un donante adecuado y GnT I y/o II. En la Figura 50D, Reopro expresado en levadura se trata en primer lugar con Endo-H para acortar los grupos glicosilo. Posteriormente, se PEGila la proteína utilizando una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa. En la Figura 50F, Reopro expresado en células de mamífero se trata en primer lugar con sialidasa para acortar los restos de ácido siálico y a continuación se PEGila con ST3Gal1 utilizando un donante de ácido siálico PEGilado. En la Figura 50G, Reopro expresado en células de insecto se modifica mediante PEGilación utilizando una galactosiltransferasa y un donante de PEG-galactosa. En la Figura 50H, a Reopro expresado en bacterias se añade en primer lugar N-acetilgalactosamina utilizando N-acetilgalactosamina transferasa y un donante adecuado. A continuación, se PEGila la proteína utilizando una sialiltransferasa y un donante de ácido siálico-PEG. En la Figura 50J, Reopro expresado en bacterias se modifica en un esquema diferente: se PEGila mediante la acción de la N-acetilgalactosamina transferasa, utilizando un donante de la N-acetilgalactosamina PEGilada. En la Figura 50K, Reopro expresado de forma bacteriana se modifica en otro procedimiento más: en primer lugar, el polipéptido se pone en contacto con N-acetilgalactosamina transferasa y un donante de Nacetilgalactosamina que se derivatiza con un ácido siálico reactivo mediante un enlazador, de tal manera que el polipéptido se une al ácido siálico reactivo mediante el enlazador y la N-acetilgalactosamina. A continuación, el polipéptido se pone en contacto con ST3Gal3 y asialo-transferrina y de esta manera queda unido a la transferrina mediante el resto de ácido siálico. A continuación, el polipéptido se protege en los extremos con restos de ácido siálico utilizando un donante adecuado y ST3Gal3. La Figura 50L ofrece un esquema adicional de modificación de Reopro expresado de forma bacteriana. El polipéptido se expone en primer lugar a NHS-CO-enlazador-SA-CPM y llega a unirse con el ácido siálico reactivo mediante el enlazador. A continuación, el polipéptido se pone en contacto con ST3Gal3 y asialo-transferrina y de esta manera queda unido a la transferrina mediante el resto de ácido siálico. A continuación, el polipéptido se protege en los extremos con restos de ácido siálico utilizando un donante adecuado y ST3Gal3.
En otra realización a modo de ejemplo, la invención proporciona procedimientos para producir conjugados de RituxanTM. Las figuras 51 A a 51G presentan algunos ejemplos. En la Figura 51 B, RituxanTM expresado en diversos sistemas de mamíferos se galactosila en primer lugar utilizando un donante de galactosa adecuado y una galactosiltransferasa. A continuación, el péptido se funcionaliza con un ácido siálico derivatizado con un resto de toxina, utilizando un donante de ácido siálico y ST3Gal3. En la Figura 51C, RituxanTM expresado en células de mamífero o células fúngicas se galactosila utilizando una galactosiltransferasa y un donante de galactosa, que proporciona la galactosa peptídica que contiene un resto de fármaco. La Figura 51D proporciona otro ejemplo de remodelación de RituxanTM expresado en un sistema fúngico. Los grupos glicosilo del polipéptido se acortan en primer lugar utilizando Endo-H. A continuación se añade galactosa utilizando una galactosiltransferasa y un donante de galactosa. Posteriormente, se conjuga un radioisótopo con la molécula mediante un donante del ácido siálico complejado con el radioisótopo y una sialiltransferasa, ST3Gal3. En la Figura 51F, RituxanTM se expresa en un sistema de mamífero y se galactosila en primer lugar utilizando una galactosiltransferasa y un donante de galactosa adecuado; el ácido siálico con un resto de PEG se une a continuación a la molécula utilizando ST3Gal3 y un donante de ácido siálico PEGilado. Tal como se muestra en la Figura 51G, RituxanTM expresado en hongos, levaduras, o células de mamífero se puede modificar también en el siguiente procedimiento: en primer lugar, el polipéptido se trata con α-y β-manosidasas para eliminar los restos de manosilo de los extremos; a continuación se une GlcNAc a la molécula utilizando GnT-I, II y un donante de GlcNAc, a continuación se une el radioisótopo por medio de galactosilación utilizando una galactosiltransferasa y un donante de galactosa que se acopla a un resto quelante capaz de unirse a un radioisótopo.
A. Creación o eliminación de sitios de glicosilación unidos a N
La presente invención contempla el uso de péptidos en los que el(los) sitio(s) de la(s) cadena(s) de glicano del péptido se ha(n) alterado con respecto al péptido natural. Normalmente, las cadenas de glicano unidas a N se unen a la estructura del péptido primario en los restos de la asparagina en los que el resto de la asparagina está comprendido en una secuencia de aminoácidos que se reconoce por una glicosiltransferasa unida a membrana en el retículo endoplásmico (ER). Normalmente, el sitio de reconocimiento en la estructura peptídica primaria es la secuencia asparagina-X-serina/treonina en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina y ácido aspártico. Aunque este sitio de reconocimiento es típico, la invención abarca además péptidos que tienen cadenas de glicano unidas a N y otros sitios de reconocimiento en los que se añaden cadenas unidas a N utilizando glicosiltransferasas naturales o recombinantes.
Puesto que se conoce el sitio de reconocimiento para la glicosilación unida a N de un péptido, está comprendido en el alcance del conocimiento de las personas expertas en la técnica crear secuencias peptídicas primarias mutadas en las que se elimina un sitio natural de reconocimiento de la glicosilación unido a N, o de forma alternativa o adicional, se crean uno o más sitios de reconocimiento de la N-glicosilación adicionales. De manera más sencilla, se puede eliminar un resto de asparagina procedente de la secuencia primaria del péptido, eliminando de esta forma el sitio de unión de un glicano, eliminando de esta manera un glicano procedente del péptido maduro. Por ejemplo, se puede genomanipular un sitio de reconocimiento natural con la secuencia de asparagina-serina-serina para conseguir la secuencia leucina-serina-serina, eliminando de esta manera un sitio de glicosilación unido a N en esta posición.
Además, se puede eliminar un sitio de glicosilación unido a N alterando los restos del sitio de reconocimiento de tal manera que incluso aunque el resto de asparagina esté presente, están ausentes uno o más de los restos de reconocimiento adicionales. Por ejemplo, una secuencia natural de asparagina-serina-serina puede estar mutada a asparagina-serina-lisina, eliminando de esta manera un sitio de N-glicosilación en esta posición. En el caso de los sitios de glicosilación unidos a N que comprenden restos diferentes de los sitios de reconocimiento típicos descritos anteriormente, el técnico experto puede determinar la secuencia y los restos requeridos para el reconocimiento por la glicosiltransferasa adecuada, y a continuación mutar al menos un resto de tal manera que la glicosiltransferasa adecuada ya no reconozca este sitio. En otras palabras, está comprendido en el conocimiento del experto en la técnica manipular la secuencia primaria de un péptido de tal manera que tanto se creen como se eliminen sitios de glicosilación, o ambos, generando de esta forma un péptido que tiene un modelo de glicosilación alterado. La invención no debe considerarse por tanto como limitada a cualquier secuencia peptídica primaria proporcionada en el presente documento como la única secuencia para la remodelación del glicano, sino en su lugar, debe tomarse de forma que incluya cualquiera y todas las secuencias peptídicas adecuadas para la remodelación del glicano.
Para crear un péptido mutante, la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia primaria del péptido se altera de tal manera que los codones naturales que codifican los restos de aminoácidos naturales se mutan para generar un codón que codifica otro resto de aminoácido. Son comunes en la materia las técnicas para alterar la secuencia del ácido nucleico y se describen, por ejemplo, en cualquier manual de biología molecular bien conocido.
Además, el ácido nucleico que codifica una estructura peptídica primaria se puede sintetizar in vitro, utilizando técnicas normalizadas. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico se puede sintetizar en una “máquina génica” utilizando protocolos tales como el procedimiento de la fosforamidita. Si se requiere sintetizar químicamente ADN bicatenario para una aplicación tal como la síntesis de un ácido nucleico o de uno de sus fragmentos, entonces cada hebra complementaria se sintetiza por separado. La producción de ácidos nucleicos cortos (60 a 80 pares de bases) es técnicamente sencilla y se puede llevar a cabo sintetizando las hebras complementarias y a continuación hibridándolas. Para la producción de ácidos nucleicos más largos (> 300 pares de bases), se pueden requerir estrategias especiales, debido a que la eficacia del acoplamiento de cada ciclo durante la síntesis química del ADN rara vez es del 100%. Para superar este problema, se ensamblan genes sintéticos (bicatenarios) en forma modular a partir de fragmentos monocatenarios que tienen de 20 a 100 nucleótidos de longitud. Para revisiones sobre las síntesis de nucleótidos, véanse, por ejemplo, Glick y Pasternak (Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, 1994, ASM Press), Itakura y col. (1984, Annu. Rev. Biochem. 53: 323), y Climie y col. (1990, Pro. Nat’l Acad. Sci. USA 87: 633).
Adicionalmente, se pueden realizar cambios en la secuencia del ácido nucleico que codifica el péptido mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento. Como se apreciará, esta técnica emplea normalmente un vector de fago que existe en forma tanto monocatenaria como bicatenaria. Los vectores típicos en la mutagénesis dirigida al emplazamiento incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos están fácilmente disponibles y los expertos en la técnica conocen generalmente bien su uso. Se emplean también de forma rutinaria plásmidos bicatenarios en la mutagénesis dirigida al emplazamiento que elimina la etapa de transferir el ácido nucleico de interés desde un plásmido a un fago.
En general, la mutagénesis dirigida al emplazamiento se lleva a cabo en primer lugar obteniendo un vector monocatenario o fundiendo las dos hebras de un vector bicatenario que incluye en el interior de su secuencia una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado. Un cebador de oligonucleótido que soporta la secuencia mutada deseada se prepara por lo general de forma sintética. A continuación, este cebador se hibrida con el vector monocatenario, y se somete a enzimas de polimerización del ADN tales como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, a fin de completar la síntesis de la hebra que soporta la mutación. De esta manera, se forma un heteroduplete en el que una hebra codifica la secuencia no mutada original y la segunda hebra soporta la mutación deseada. Este vector heteroduplete se utiliza a continuación para transformar o transfectar las células adecuadas, tales como las células de E. coli, y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que soportan la disposición de la secuencia mutada. Kunkel y col. (1987, Kunkel y col., Methods Enzymol. 154: 367-382) diseñaron un esquema de selección genética para enriquecer los clones que incorporan el oligonucleótido mutagénico. De forma alternativa, el uso de la PCRTM con enzimas termoestables comercialmente disponibles tales como la polimerasa Taq se puede emplear para incorporar un cebador de oligonucleótido mutagénico en un fragmento de ADN amplificado que se puede clonar a continuación en un vector de clonación o expresión adecuado. Los procedimientos de la mutagénesis mediada por la PCRTM de Tomic y col. (1990, Nucl. Acids Res., 12: 1656) y Upender y col. (1995, Biotechniques, 18: 29-31) proporcionan dos ejemplos de dichos protocolos. Se puede utilizar también una PCRTM que emplea una ligasa termoestable además de una polimerasa termoestable para incorporar un oligonucleótido mutagénico fosforilado en un fragmento de ADN amplificado que se puede clonar a continuación en un vector de clonación o de expresión adecuado. El procedimiento de mutagénesis descrito por (1994, Biotechniques 16:410-412) proporciona un ejemplo de uno de dichos protocolos.
No todas las secuencias Asn-X-Ser/Thr están N-glicosiladas, lo que sugiere que el contexto en el que se presenta el motivo es importante. En otra solución, se crean bibliotecas de péptidos mutantes que tienen novedosos sitios consenso unidos a N con el fin de identificar novedosos sitios unidos a N que están glicosilados in vivo y son beneficiosos para la actividad, la estabilidad u otras características del péptido.
Tal como se ha señalado anteriormente, la secuencia consenso para la adición de cadenas de glicano unidas a N en glicoproteínas es Asn-X-ser/Thr en la que X puede ser cualquier aminoácido. La secuencia de nucleótidos que codifica las dos posiciones del aminoácido en el lado carboxiterminal de la Asn puede estar mutada para codificar un resto de Ser y/o Thr utilizando procedimientos normalizados conocidos por las personas normalmente expertas en la técnica. Tal como se ha indicado anteriormente, no todos los sitios Asn-x-ser/Thr se modifican por la adición de glicanos. Por tanto, cada proteína mutada recombinante debe expresarse en un sistema de expresión fúngico, de levadura o animal o de mamífero y analizarse para establecer la adición de una cadena de glicano unida a N. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas para la caracterización de los sitios de glicosilación. Además, se puede determinar la función biológica de la glicoproteína mutada recombinante utilizando ensayos normalizados para la proteína concreta que se está examinando. De esta manera es una cuestión sencilla manipular la secuencia primaria de un péptido e identificar los sitios de glicosilación novedosos contenidos en el mismo, y determinar adicionalmente el efecto del novedoso sitio sobre la actividad biológica del péptido.
En una realización alternativa, la secuencia de nucleótidos que codifica las dos posiciones del aminoácido en el lado aminoterminal de los restos Ser/Thr puede mutarse para codificar una Asn utilizando los procedimientos normalizados conocidos por las personas normalmente expertas en la técnica. Se han descrito anteriormente los procedimientos para determinar si se ha creado un novedoso sitio de glicosilación y el efecto de este sitio sobre la actividad biológica del péptido
B. Creación o eliminación de sitios de glicosilación unidos a O
La adición de un sitio de glicosilación unido a O a un péptido se lleva a cabo de forma conveniente alterando la secuencia de aminoácidos primaria del péptido de tal manera que contenga uno o más sitios de glicosilación unidos a O adicionales en comparación con la secuencia de aminoácidos primaria inicial del péptido. La adición de un sitio de glicosilación unido a O se puede llevar también a cabo mediante la incorporación al péptido de una o más especies de aminoácidos en el péptido que comprende un grupo –OH, preferiblemente restos de serina o treonina, en el interior de la secuencia del péptido, de tal manera que el grupo OH sea accesible y esté disponible para la glicosilación unida a O. Similar a la discusión de la alteración de los sitios de glicosilación unidos a N en un péptido, la secuencia de aminoácidos primaria del péptido se altera preferiblemente en los nucleótidos. Se pueden alterar los nucleótidos específicos en la secuencia de ADN que codifica el péptido de tal manera que una secuencia de aminoácidos deseada sea codificada por la secuencia. Se realiza(n) una(s) mutación(es) en el ADN preferiblemente utilizando los procedimientos conocidos en la técnica, tales como las técnicas de síntesis del ADN mediante el procedimiento de la fosforamidita y la mutagénesis dirigida al emplazamiento descrita anteriormente.
De forma alternativa, la secuencia de nucleótidos que codifica un presunto sitio para la adición de glicano unido a O se puede añadir a la molécula de ADN en una o algunas copias en cualquiera de los extremos 5’ o 3’ de la molécula. La secuencia de ADN alterada se expresa a continuación en uno cualquiera de un sistema de expresión fúngico, de levadura o animal o de mamífero y se analiza para establecer la adición de la secuencia al péptido y si esta secuencia es un sitio de glicosilación unido a N funcional o no. De manera breve, se introduce una secuencia aceptora de un péptido sintético tanto en el extremo 5’ como en el extremo 3’ de la molécula del nucleótido. En principio, la adición de este tipo de molécula es menos perturbadora que la glicoproteína resultante cuando se expresa en un sistema de expresión adecuado. A continuación, el ADN alterado se expresa en células CHO u otro sistema de expresión adecuado y las proteínas expresadas se examinan por tanto para la presencia de un sitio de glicosilación unido a O. además, se puede determinar la presencia o ausencia de cadenas de glicano.
En otro enfoque más, se pueden encontrar sitios ventajosos para nuevos sitios unidos a O en un péptido creando bibliotecas del péptido que contiene diversos sitios unidos a O nuevos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos consenso para la adición de N-acetilgalactosamina mediante una N-acetilgalactosaminiltransferasa depende de la transferasa específica utilizada. Se puede realizar un barrido de la secuencia de aminoácidos de un péptido para identificar los grupos de aminoácidos contiguos que se pueden mutar para generar sitios potenciales para la adición de cadenas de glicano unidas a O. Se pueden generar estas mutaciones utilizando los procedimientos normalizados conocidos por las personas normalmente expertas en la técnica tal como se ha descrito anteriormente. Con el fin de determinar si cualquier sitio de glicosilación descubierto se encuentra realmente glicosilado, cada péptido mutado recombinante se expresa a continuación en un sistema de expresión adecuado y se analiza posteriormente para la adición del sitio y/o la presencia de una cadena de glicano unida a O.
C. Síntesis química de péptidos
Aunque la estructura primaria de los péptidos útiles en la invención se puede generar de forma más eficaz en un sistema de expresión basado en células, está comprendido en el alcance de la presente invención que los péptidos se puedan generar sintéticamente. Es bien conocida en la técnica la síntesis química de péptidos e incluye, sin limitación, la síntesis en fase sólida por etapas y la condensación fragmentaria tanto en disolución como en fase sólida. Un síntesis en fase sólida por etapas clásica implica unir de forma covalente un aminoácido correspondiente al aminoácido situado en el extremo carboxilo de la cadena peptídica deseada a un soporte sólido y extender la cadena peptídica hacia el extremo amino mediante el acoplamiento por etapas de los derivados de aminoácidos activados que tienen grupos carboxilo activados. Tras la finalización del ensamblaje de la cadena peptídica completamente protegida unida a la fase sólida, la unión covalente de la fase sólida-péptido se escinde mediante la química adecuada y se retiran los grupos protectores para dar como resultado el péptido del producto. Véase, R. Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis: The Synthesis of a Tetrapeptide, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963). Cuánto más larga es la cadena peptídica, más estimulante es obtener productos bien definidos de elevada pureza. Debido a la producción de mezclas complejas, la solución de síntesis en fase sólida por etapas tiene limitaciones de tamaño. En general, los péptidos bien definidos de 100 restos de aminoácidos contiguos o más no se preparan de forma rutinaria mediante la síntesis en fase sólida por etapas.
El procedimiento de condensación de segmentos implica la preparación de varios segmentos peptídicos mediante el procedimiento en fase sólida por etapas, seguido por la escisión a partir de la fase sólida y la purificación de estos segmentos protegidos máximamente. Los segmentos protegidos se condensan uno por uno al primer segmento, que se une a la fase sólida.
Los péptidos útiles en la presente invención se pueden sintetizar mediante síntesis en fase sólida exclusiva, procedimientos en fase sólida parciales, condensación fragmentaria o síntesis clásica en solución. Estos procedimientos de síntesis son bien conocidos de los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart y col., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2ª Edición), (Pierce Chemical Co.
1984), Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton y col., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields y Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), y Lloyd-Williams y co., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Peptides (CRC Press, Inc. 1997)). Están también normalizadas las variaciones en las estrategias de síntesis química total tales como la “ligadura química natural” y la “ligadura peptídica expresada” (véanse, por ejemplo, Dawson y col., Science 266: 776 (1994); Hackeng y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol.
287:
34 (1997), Muir y col, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998), y Severinov y Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)). También útiles son los procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida desarrollados por Gryphon Sciences, South San Francisco, CA. Véanse las Patentes de los Estados Unidos Nos 6.326.468, 6.217.873, 6.174.530, y 6.001.364.
D.
Modificaciones posteriores a la traducción
Una persona normalmente experta en la técnica apreciará que los péptidos pueden experimentar una modificación posterior a la traducción además de la adición a los anteriores de glicanos unidos a N y/o unidos a O. Se contempla que los péptidos que tienen modificaciones posteriores a la traducción diferentes a la glicosilación se pueden utilizar como péptidos de la invención, siempre que la actividad biológica deseada o la función del péptido se mantengan o mejore. Dichas modificaciones posteriores a la traducción pueden ser modificaciones naturales llevadas a cabo normalmente in vivo, o modificaciones realizadas mediante genomanipulación del péptido llevadas a cabo in vitro. Las modificaciones conocidas contempladas incluyen la acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de resto heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de retículas covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gammacarboxilación, glicosilación, formación de anclaje a GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenilación, sulfatación, adición de aminoácidos a péptidos mediada por ARN de transferencia tal como arginilación, y ubiquitinación. Las enzimas que se pueden utilizar para llevar a cabo muchas de esta modificaciones son bien conocidas en la técnica, y están comercialmente disponibles de compañías tales como Boehringer Mannheim (Indianápolis, IN) y Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), entre otras.
Los expertos en la técnica conocen bien dichas modificaciones que se han descrito con gran detalle en la bibliografía específica. Algunas modificaciones particularmente comunes, glicosilación, unión lipídica, sulfatación, gammacarboxilación o restos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación de ADP, por ejemplo, se describen en los textos más básicos, tales como Peptides--Structure and Molecular Properties, 2ª Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993). Muchas revisiones detalladas están disponibles sobre este sujeto, tales como la de Wold, F., Post-translational Covalent Modification of Peptides, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York 1-12 (1983); Seifter y col. (Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990)) y Rattan y col. (Ann. N.Y. Acad. Sci.
663: 48-62 (1992)).
También se pueden introducir en la molécula in vitro modificaciones covalentes de un péptido haciendo reaccionar restos de aminoácidos diana del péptido con un agente orgánico derivatizante que sea capaz de reaccionar con cadenas secundarias seleccionadas o restos de aminoácidos de los extremos. Los restos más comúnmente derivatizados son cisteinilo, histidilo, lisinilo, arginilo, tirosilo, glutaminilo, asparaginilo y restos amino de los extremos. Hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos serilo y treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de lisina, histidina, y cadenas secundarias de histidina, acetilación de la amina N-terminal y amidación de los grupos carboxílicos C de los extremos. Dichos restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la absorción y la vida media biológica. Los restos pueden también eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable del péptido.
Además, es útil la derivatización con agentes bifuncionales para reticular el péptido a matrices de soportes insolubles en agua o a otros vehículos macromoleculares. Los agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen glutaraldehído, ésteres de n-hidroxisuccinimida, imidoésteres homobifuncionales, 1,1-bis(-diazoloacetil)-2feniletano, y maleimidas bifuncionales. Los agentes derivatizantes tales como metil-3-[9p-azidofenil)] ditiopropioimidato dan como resultado intermedios fotoactivables que son capaces de formar retículas en presencia de luz. De forma alternativa, se pueden emplear matrices reactivas insolubles en agua tales como hidratos de carbono activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos 3.969.287 y 3.691.016 para l inmovilización de péptidos.
E. Péptidos de fusión /péptidos
Los péptidos útiles en la presente invención pueden comprender péptidos de fusión. Los péptidos de fusión son particularmente ventajosos cuando se desea combinar características biológicas y/o funcionales de dos péptidos en una molécula peptídica. Dichos péptidos de fusión pueden presentar combinaciones de actividad y función biológicas que no se encuentran en la naturaleza para crear moléculas novedosas y útiles de aplicaciones terapéuticas e industriales. Las actividades biológicas de interés incluyen la actividad enzimática, la actividad del receptor y/o el ligando, motivos inmunógenos, y dominios estructurales.
Dichos péptidos de fusión son bien conocidos en la técnica, y los procedimientos de creación son bien conocidos de los expertos en la técnica. Por ejemplo, se ha preparado un péptido de fusión humano del interferón α humano en el que el péptido resultante tiene los beneficios terapéuticos del interferón α combinados con una vida larga en circulación de la albúmina, creando de esta forma una composición terapéutica que permite una frecuencia de dosificación reducida y unos efectos secundarios en pacientes potencialmente reducidos. Véanse, Albuferon™ de Human Genome Sciences, Inc. y la Patente de los Estados Unidos Nº 5.766.883. Otros péptidos de fusión incluyen las moléculas de anticuerpo que se describen en otra parte en el presente documento.
F. Generación de moléculas “biológicamente activas” más pequeñas
Los péptidos utilizados en la invención pueden ser variantes de péptidos naturales, en las que se utiliza un fragmento del péptido natural en lugar del péptido natural de longitud completa. Además, se contemplan pre-propéptidos y pre-péptidos. Los péptidos variantes pueden ser de un tamaño más pequeño que el péptido natural, y pueden comprender uno o más dominios de un péptido más grande. Puede ser ventajosa la selección de dominios peptídicos específicos cuando se desea que el péptido tenga la actividad biológica de determinados dominios, pero no se desea que el péptido tenga la actividad biológica de otros dominios. Se incluyen también truncamientos del péptido y eliminaciones internas que pueden potenciar el efecto terapéutico deseado del péptido. Se contempla que cualquiera de dichas formas de un péptido sea útil en la presente invención con la condición que se preserve la actividad biológica deseada del péptido.
Versiones más cortas de los péptidos pueden tener ventajas únicas que no se encuentran en el péptido natural. En el caso de la albúmina humana, se ha encontrado que la forma truncada que comprende tan poco como el 63% del péptido de la albúmina natural es ventajosa como expansor del volumen plasmático. Se considera que el péptido truncado de la albúmina es mejor que el péptido natural para este fin terapéutico debido a que se requiere una dosis del péptido individual de la mitad a dos tercios de la albúmina de suero humano natural, o de la albúmina de suero humano recombinante para conseguir el efecto osmótico coloidal equivalente. Véase la Patente de los estados unidos nº 5.380.712.
Se han encontrado también péptidos “biológicamente activos” más pequeños que tienen actividad terapéutica potenciada en comparación con el péptido natural. El potencial terapéutico de la IL-2 está limitado por diversos efectos secundarios dominados por el síndrome de extravasación vascular. Se ha encontrado que una versión sintetizada químicamente más corta del péptido que consiste en los restos 1-30 que corresponden a la hélice α completa se pliega adecuadamente y contiene la actividad biológica de la IL-2 natural sin los efectos secundarios colaterales.
G. generación de péptidos novedosos
El péptido de la invención puede ser un derivado de una secuencia primaria de un péptido natural, o puede genomanipularse utilizando cualquiera de los muchos medios conocidos por los expertos en la técnica. Dichos péptidos genomanipulados pueden diseñarse y/o seleccionarse debido a las propiedades potenciadas o novedosas en comparación con el péptido natural. Por ejemplo, los péptidos pueden genomanipularse para tener velocidades de reacción enzimáticas aumentadas, afinidad de unión aumentada o disminuida par un sustrato o ligando, afinidad de unión aumentada o disminuida para un receptor, especificidad alterada para un sustrato, ligando, receptor u otra molécula de enlace, estabilidad aumentada o disminuida in vitro y/o in vivo, o inmunogenicidad aumentada o disminuida en un animal.
H. mutaciones
1. Mutación de diseño lógico
Los péptidos útiles en los procedimientos de la invención se pueden mutar con el fin de potenciar una actividad o función biológica deseada, para disminuir una propiedad indeseable del péptido, y/o añadir actividades o funciones novedosas para el péptido. Se puede utilizar un “diseño lógico del péptido” para generar péptidos alterados. Una vez que se conoce la secuencia y la estructura del aminoácido del péptido y se planifica una mutación deseada, las mutaciones se pueden preparar de la forma más conveniente para el ácido nucleico y el codón correspondiente que codifica el resto de aminoácido que se desea mutar. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente cómo debe alterarse la secuencia del ácido nucleico basándose en el código genético universal y el conocimiento de las preferencias del codón en el sistema de expresión de elección. Se puede realizar una mutación en un codón para cambiar el resto de aminoácido que se polimerizará en el péptido durante la traducción. De forma alternativa, un codón puede estar mutado de tal manera que el resto de aminoácido codificado correspondiente sea el mismo, pero la elección sea más adecuada para el sistema de expresión del péptido deseado. Por ejemplo, se pueden sustituir los restos cis por otros aminoácidos para eliminar los enlaces de disulfuro del péptido maduro, pueden mutarse los dominios catalíticos para alterar la actividad biológica, y en general, se pueden genomanipular las isoformas del péptido. Dichas mutaciones pueden ser mutaciones puntuales, eliminaciones, inserciones y truncamientos, entre otras.
Son bien conocidas en la materia las técnicas para mutar aminoácidos específicos en un péptido. La técnica de la mutagénesis dirigida al emplazamiento, discutida anteriormente, es muy adecuada para la mutación dirigida de codones. El procedimiento de mutagénesis mediada por oligonucleótidos se discute también en detalle en Sambrook y col. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, comenzando en la página 15.51). se pueden realizar eliminaciones, inserciones y truncamientos sistemáticos utilizando la mutagénesis de inserción del enlazador, la digestión con la nucleasa Bal31, y la mutagénesis de barrido del enlazador, entre otros procedimientos bien conocidos de los expertos en la técnica (Sambrook y col., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York).
Se ha utilizado satisfactoriamente el diseño lógico del péptido para aumentar la estabilidad de las enzimas con respecto a la termoinactivación y a la oxidación. Por ejemplo, se ha mejorado la estabilidad de una enzima mediante la eliminación de restos de asparagina en la α-amilasa (Declerck y col., 2000, J. Mol. Biol. 301: 1041-1057), la introducción de elementos estructurales más rígidos tales como prolina en la α-amilasa (Igarashi y col., 1999, Biosci. Biotechnol. Biochem. 63: 1535-1540) y la D-xilosa isomerasa (Zhu y col., 1999, Peptide Eng. 12: 635-638). Además, la introducción de contactos hidrófobos adicionales estabiliza la 3-isopropilmalto deshidrogenasa (Akanuma y col., 1999, Eur. J. Biochem. 260: 499-504) y la formiato deshidrogenasa obtenidas de Pseudomonas sp. (Rojkova y col., 1999, FEBS Lett. 445: 183-188). Los mecanismos que retrasan el efecto estabilizante de estas mutaciones son generalmente aplicables a muchos péptidos. Se contempla que estas y similares mutaciones sean útiles con respecto a los péptidos remodelados en los procedimientos de la presente invención
2. Técnicas de mutagénesis aleatorias
Se pueden generar péptidos novedosos útiles en los procedimientos de la invención utilizando técnicas que introducen mutaciones aleatorias en la secuencia de codificación del ácido nucleico: A continuación, el ácido nucleico se expresa en un sistema de expresión deseado, y se evalúa el péptido resultante para establecer las propiedades de interés. Son bien conocidas en la materia las técnicas para introducir mutaciones aleatorias en las secuencias de ADN que incluyen mutagénesis mediante la PCR, mutagénesis de saturación, y soluciones de oligonucleótidos degenerados. Véanse Sambrook y Russell (2001, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY) y Ausubel y col. (2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
En la mutagénesis mediante la PCR se utiliza la fidelidad reducida de la polimerasa Taq para introducir mutaciones aleatorias en un fragmento de ADN clonado (Leung y co., 1989, Technique 1: 11-15). Este es un procedimiento muy poderoso y relativamente rápido para introducir mutaciones aleatorias en una secuencia de ADN. La región de ADN que se va a mutagenizar se amplifica utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en condiciones que reducen la fidelidad de la síntesis de ADN mediante la ADN polimerasa Taq utilizando, por ejemplo, una relación dGTP/dATP alterada y añadiendo Mn2+ a la reacción de la PCR. El combinado de fragmentos de ADN amplificados se inserta en vectores de clonación adecuados para proporcionar bibliotecas de mutantes aleatorios.
La mutagénesis por saturación permite la rápida introducción de un gran número de sustituciones de bases individuales en fragmentos de ADN clonados (Mayers y col., 1985, Science 229: 242). Esta técnica incluye la generación de mutaciones, por ejemplo, mediante tratamiento o irradiación química de ADN monocatenario in vitro, y la síntesis de una hebra de ADN complementario. Se puede modular la frecuencia de la mutación modulando la severidad del tratamiento, y se pueden obtener esencialmente todas las sustituciones de bases posibles. Debido a que este procedimiento no implica una selección genética de los fragmentos de mutantes, se obtienen sustituciones neutras, así como aquellas que alteran la función. La distribución de mutaciones puntuales no está sesgada hacia elementos de secuencias conservados.
Se puede generar también una biblioteca de homólogos de ácidos nucleicos a partir de un conjunto de secuencias de oligonucleótidos degenerados. Se puede llevar a cabo la síntesis química de secuencias de oligonucleótidos degenerados en un sintetizador automático de ADN, y se pueden unir a continuación los genes sintéticos en un vector de expresión adecuado. Se conoce en la técnica la síntesis de oligonucleótidos degenerados (véanse, por ejemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y col. (1981) Recombinant DNA, Proc 3er Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp. 273-289; Itakura y col. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura y col. (1984) Science 198: 1056; Ike y col. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477. Se han empleado dichas técnicas en la evolución dirigida de otros péptidos (véanse, por ejemplo, Scott y col. (1990) Science 249: 386-390; Roberts y col. (1992) PNAS 89: 2429-2433; Devlin y col. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla y col. (1990) PNAS 87: 6378-6382; así como las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.223.409, 5.198.346, y 5.096.815).
a. Evolución dirigida
Se pueden generar también péptidos útiles en los procedimientos de la invención utilizando técnicas de “evolución dirigida”. A diferencia de las técnicas de mutagénesis dirigida al emplazamiento en las que se requiere el conocimiento de la estructura del péptido, en la actualidad existen estrategias para generar bibliotecas de mutaciones a partir de las cuales se puede obtener péptidos con propiedades mejoradas sin conocimiento de las características estructurales del péptido. Estas estrategias se conocen generalmente como tecnologías de “evolución dirigida” y son diferentes de los procedimientos de mutagénesis aleatoria tradicionales que implican someter la secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de interés a ciclos repetitivos de mutación, cribado y amplificación.
En algunas técnicas de “evolución dirigida”, la diversidad de los ácidos nucleicos obtenidos se genera mediante procedimientos de mutación que crean de forma aleatoria mutaciones puntuales en la secuencia de ácido nucleico. Las técnicas de mutación puntuales incluyen “la PCR propensa a error TM” (Caldwell y Joyce, 1994; PCR Methods Appl. 2: 28-33; y Ke y Madison, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3371-3372), la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos repetidos (Reidhaar-Olson y col., 1991, Methods Enzymol. 208: 564-586), y cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados de mutagénesis aleatoria.
Otro procedimiento para crear diversidad mediante el cual puede actuar la evolución dirigida es el uso de genes mutadores. El ácido nucleico de interés se cultiva en una cepa de células mutadoras, cuyo genoma codifica normalmente los genes de reparación del ADN defectuoso (Patente de los Estados Unidos Nº 6.365.410; Selifonova y col., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 3645-3649; Long-McGie y col., 2000, Biotech. Bioeng. 68: 121-125; véase, Genencor International Inc., Palo Alto CA).
La consecución de diversidad utilizando técnicas de evolución dirigida se puede también llevar a cabo usando la mutagénesis de saturación junto con cebadores degenerados (Gene Site Saturation Mutagenesis™, Diversa Corp., San Diego, CA). En este tipo de mutagénesis de saturación se utilizan cebadores degenerados diseñados para cubrir la longitud de la secuencia de ácido nucleico que se va a diversificar para cebar la polimerasa en las reacciones de la PCR. De esta manera, cada codón de una secuencia de codificación de un aminoácido puede mutarse para codificar cada uno de los diecinueve aminoácidos usuales restantes. Se puede utilizar también esta técnica para introducir mutaciones, eliminaciones e inserciones en las regiones específicas de una secuencia de codificación de un ácido nucleico dejando a la vez sin tocar el resto de la molécula del ácido nucleico. Los procedimientos de la técnica de saturación de genes son bien conocidos en la técnica, y pueden encontrarse en la Patente de los estados unidos 6.171.820.
b. Transposición de ADN
Se pueden generar también péptidos novedosos útiles en los procedimientos de la invención utilizando las técnicas de transposición de genes, transposición de motivos, transposición de exones, y/o transposición de codones (denominadas en su conjunto “transposición de ADN”). Las técnicas de transposición del ADN también se pueden emplear para modular las actividades de péptidos útiles en la invención y se pueden utilizar para generar péptidos que tengan la actividad alterada. Véanse, generalmente, las Patentes de los Estados Unidos Nos 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; y 5.837.458, y Stemmer y col. (1994, Nature 370(6488): 389-391); Crameri y col. (1998, Nature 391 (6664): 288-291); Zhang y col. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(9): 4504-4509); Stemmer y col. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (22): 10747-10751), Patten y col. (1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 72433); Harayama, (1998, Trends Biotechnol. 16 (2): 76-82); Hansson, y col., (1999, J. Mol. Biol. 287: 265-76); y Lorenzo y Blasco (1998, Biotechniques 24(2): 308-13).
La transposición del ADN implica el ensamblaje de dos o más segmentos de ADN mediante recombinación homóloga o específica del emplazamiento para generar la variación en la secuencia del polinucleótido. Se ha utilizado la transposición del ADN para generar variaciones novedosas en las proteínas del virus de tipo 1 de la inmunodeficiencia humana (Pekrun y col., 2002, J. Virol. 76(6): 2924-35), triazina hidrolasas (Raillard y col. 2001, Chem Biol 8(9): 891-898), proteínas del virus de la leucemia de murino (MLV) (Powell y col. 2000, Nat Biotechnol 18(12): 1279-1282), e indolglicerol fosfato sintasa (Merz y col. 2000, Biochemistry 39(5): 880-889).
La técnica de la transposición del ADN fue desarrollada con el fin de generar diversidad biomolecular imitando la recombinación natural permitiendo la recombinación homóloga in vitro del ADN (Stemmler, 1994, Nature 370: 389391; y Stemmler, 1994, PNAS 91: 10747-10751). Generalmente, en este procedimiento, una población de genes relacionados se fragmenta y se somete a ciclos repetitivos de desnaturalización, rehibridación, seguidas por la extensión de los salientes 5’ mediante la polimerasa Taq. Con cada ciclo, la longitud de los fragmentos aumenta, y se produce la recombinación del ADN cuando los fragmentos que se originan a partir de diferentes genes se hibridan entre sí. La fragmentación inicial del ADN se lleva a cabo usualmente mediante digestión de la nucleasa, utilizando normalmente ADNasa (véanse las referencias a Stemmler, anteriormente), pero también se lleva a cabo mediante la síntesis interrumpida de la PCR (patente de los Estados Unidos 5.965.408; véase, Diversa Corp., San Diego, CA). Los procedimientos de transposición del ADN tienen ventajas sobre los procedimientos de mutaciones puntuales aleatorias en que se consigue la recombinación directa de mutaciones beneficiosas generadas por cada ciclo de transposición y existe por tanto una autoselección de fenotipos mejorados de péptidos.
Las técnicas de transposición del ADN son bien conocidas de los expertos en la técnica. Se encuentran explicaciones detalladas de dicha tecnología en Stemmler, 1994, Nature 370: 389-391 y Stemmler, 1994, PNAS 91: 10747-10751. La técnica de transposición del ADN se describe también en las patentes de los Estados Unidos 6.180.406, 6.165.793, 6.132.970, 6.117.679, 6.096.548, 5.837.458, 5.834.252, 5.830.721, 5.811.238, y 5.605.793.
La técnica proporciona también modificaciones incluso más recientes de la técnica básica de transposición del ADN. En un ejemplo, la transposición de exones, exones o combinaciones de exones que codifican dominios específicos de péptidos se amplifican utilizando oligonucleótidos quiméricos. A continuación se recombinan las moléculas amplificadas autocebando el ensamblaje de la PCR (Kolkman y Stemmler, 2001, Nat. Biotech. 19: 423-428). En otro ejemplo, utilizando la técnica de quimeragénesis aleatoria en la construcción de bibliotecas mediante moldes transitorios (RACHITT) se han hibridado fragmentos de ADN parental monocatenario sobre moldes monocatenarios de longitud completa (Coco y col., 2001, Nat. Biotechnol. 19: 354-359). En otro ejemplo más, el procedimiento de extensión por etapas (StEP), se emplea la termociclación con ciclos de hibridación/extensión muy abreviados para interrumpir repetidamente la polimerización del ADN a partir de moldes flanqueantes (Zhao y col., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 258-261). En la técnica conocida como CLERY, se combina la transposición de la familia in vitro con la recombinación homóloga in vivo en levadura (Abecassis y col., 2000, Nucleic Acids Res. 28: E88). Para maximizar la recombinación intergénica, el ADN monocatenario procedente de hebras complementarias de cada uno de los ácidos nucleicos se digiere con ADNasa y se hibrida (Kikuchi y col., 2000, Gene 243: 133-137). Los extremos enromados de dos ácidos nucleicos truncados de longitudes variables que están unidos mediante una secuencia que se puede escindir se ligan a continuación para generar la fusión génica sin recombinación homóloga (Sieber y col., 2001, Nat Biotechnol. 19: 456-460; Lutz y col., 2001, Nucleic Acids Res. 29: E16; Ostermeier y col., 1999, Nat. Biotechnol. 17: 1205-1209; Lutz y Benkovic, 2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11: 319-324). Se ha potenciado también la recombinación entre ácidos nucleicos con poca homología de secuencias en común utilizando extremos enromados mediados por exonucleasas de fragmentos de ADN y ligadura de los fragmentos juntos para recombinarlos (Patente de los Estados Unidos Nº 6.361.974). La invención contempla el uso de todas y cada una de las variaciones descritas anteriormente como un medio de potenciar las propiedades biológicas de cualquiera de los péptidos y/o enzimas en los procedimientos de la invención.
Además de los protocolos publicados que detallan las técnicas de evolución dirigida y de transposición de genes, ahora están disponibles servicios comerciales que llevan a cabo los procedimientos de transposición génica y de selección en los péptidos de elección. Maxygen (Redwood City, CA) ofrece servicios comerciales para generar bibliotecas personalizadas de ADN transpuesto. Además, esta compañía llevará a cabo procedimiento personalizados de evolución dirigida que incluyen la transposición génica y la selección de una familia de péptidos de elección.
Optigenix, Inc. (Newark, DE) ofrece el servicio relacionado de transposición de plásmidos. Optigenix utiliza familias de genes para obtener mutantes de los anteriores que tienen nuevas propiedades. El ácido nucleico de interés se clona en un plásmido en un sistema de expresión de Aspergillus. A continuación se introduce el ADN de la familia relacionada en el sistema de expresión y se produce la recombinación de las regiones conservadas de la familia en el hospedador. A continuación se expresa el ADN mutante resultante y se criba el péptido producido a partir del anterior para la presencia de las propiedades deseadas y la ausencia de propiedades no deseadas.
c. Procedimientos de cribado
Tras cada ciclo repetitivo de “evolución”, los péptidos deseados expresados mediante genes mutados se criban según las características de interés. Los genes “candidatos” se amplifican a continuación y se combinan para el siguiente ciclo de transposición del ADN. El procedimiento de cribado utilizado es muy dependiente del péptido que está “evolucionando” y las características de interés. Características tales como la estabilidad del péptido, la actividad biológica, la antigenicidad, entre otras, se pueden seleccionar utilizando procedimientos que son bien conocidos en la técnica, Se describen en otra parte en el presente documento ensayos individuales para la actividad biológica de los péptidos preferidos útiles en los procedimientos de la invención.
d. Combinaciones de técnicas
El técnico experto apreciará que las anteriores técnicas de mutación y selección se pueden combinar entre sí y con procedimientos adicionales para generar la molécula peptídica mejor posible útil en los procedimientos de la invención. De esta manera, la invención no se limita a un procedimiento específico para la generación de péptidos, y debe considerarse que abarca todas y cada una de las metodologías descritas en el presente documento. Por ejemplo, se puede llevar a cabo inicialmente un procedimiento para introducir mutaciones puntuales en una secuencia de ácido nucleico, seguido por ciclos repetitivos de transposición, selección y amplificación del ADN. Se puede utilizar la introducción inicial de mutaciones puntuales para introducir diversidad en una población de genes de la que carece de esta, y el siguiente ciclo de transposición y cribado del ADN seleccionará y recombinará mutaciones puntuales ventajosas.
III.
Glicosidasas y glicotransferasas
A.
Glicosidasas
Las glicosidasas son glicotransferasas que utilizan agua como molécula aceptora, y como tales, son normalmente enzimas glicósido-hidrolíticas. Se pueden usar las glicosidasas para la formación de enlaces glicosídicos in vitro controlando la termodinámica o la cinética de la mezcla de reacción. Incluso con condiciones modificadas de reacción, fuertes, puede ser difícil trabajar con las reacciones de las glicosidasas, y las glicosidasas tienden a dar bajos rendimientos sintéticos como resultado de la reacción reversible de la transglicosilasa y la reacción hidrolítica competente.
Una glicosidasa puede funcionar reteniendo la estereoquímica al romper el enlace durante la hidrólisis o invirtiendo la estereoquímica al romper el enlace durante la hidrólisis, clasificándose la glicosidasa tanto como glicosidasa “retenedora” como glicosidasa “inversora”, respectivamente. Las glicosidasas retenedoras tienen dos restos críticos de ácido carboxílico presentes en el sitio activo, actuando un carboxilato como catalizador ácido/base y el otro como nucleófilo, mientras que en las glicosidasas inversoras, un ácido carboxílico funciona como ácido y el otro funciona como base.
Son bien conocidos en la técnica los procedimientos para determinar la actividad y la especificidad del enlace de cualquier glicosidasa, incluyendo un protocolo de HPLC simplificado (Jacob y Scudder, 1994, Methods in Enzymol.
230: 280-300). En Glycobiology, A Practical Approach, (1993, Fukuda y Kobata eds., Oxford University Press Inc., Nueva York) se encuentra una discusión general de glicosidasas y tratamiento con glicosidasa.
Las glicosidasas útiles en la invención incluyen sialidasa, galactosidasa, endoglucanasa, manosidasa (es decir, α y β, ManI, ManII y ManIII), xilosidasa, fucosidasa, β-glucosidasa de Agrobacterium sp, manosidasa 2A de Cellulomonas fimi, glicosidasa de Humicola insolens, glicosidasa de Sulfolobus solfataricus y glicosidasa de Bacillus licheniformis.
La elección de las fucosidasas para uso en la invención depende el enlace de la fucosa con otras moléculas. Son bien conocidas por los expertos en la técnica las especificidades de muchas α-fucosidasas útiles en los procedimientos de la invención, y están comercialmente disponibles muchas variedades de fucosidasas (Glyko, Novato, CA; PROzyme, San Leandro, CA; Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA; entre otras). Las αfucosidasas de interés incluyen α-fucosidasas procedentes de Turbo cornutus, Charonia lampas, Bacillus fulminans, Aspergillus niger, Clostridium perfringens, riñón de bovino (Glyko), hígado de pollo (Tyagarajan y col., 1996, Glycobiology 6: 83-93) y α-fucosidasa II procedente de Xanthomonas manihotis (Glyko, PROzyme). La fucosidasa de hígado de pollo es particularmente útil para la eliminación de la fucosa del núcleo procedente de glicanos unidos a N.
B. Glicosiltransferasas
Las glicosiltransferasas catalizan la adición de azúcares activados (azúcares NDP donantes), por etapas, a una proteína, glicopéptido, lípido o glicolípido o al extremo no reductor de un oligosacárido en crecimiento. Los glicopéptidos unidos a N se sintetizan mediante una transferasa y un donante del oligosacárido DOl-PP-NAG2Glc3Man9 unido a lípido en una transferencia en bloque seguida por el acortamiento del núcleo. En este caso, la naturaleza del sacárido “nuclear” es algo diferente de las posteriores uniones. Se conocen en la técnica un número muy grande de glicosiltransferasas.
La glicosiltransferasa que se va a usar en la presente invención puede ser cualquiera lo suficientemente larga para que puede utilizar el azúcar modificado como un donante de azúcar. Los ejemplos de dichas enzimas incluyen la glicosiltransferasa de la ruta de Leloir, tal como galactosiltransferasa, N-acetilglucosaminiltransferasa, Nacetilgalactosaminiltransferasa, fucosiltransferasa, sialiltransferasa, manosiltransferasa, xilosiltransferasa y glucuroniltransferasa.
Para la síntesis de sacáridos enzimáticos que implican reacciones de la glicosiltransferasa, la glicosiltransferasa se puede clonar o aislar a partir de cualquier fuente. Se conocen muchas glicosiltransferasas clonadas, así como sus secuencias de polinucleótidos (véase, por ejemplo Taniguchi y col., 2002, Handbook of glycosyltransferases and related genes, Springer, Tokio.
Las secuencias de aminoácidos de la glicosiltransferasa y las secuencias de nucleótidos que codifican las glicosiltransferasas a partir de las cuales se pueden deducir las secuencias de aminoácidos se encuentran en diversas bases de datos públicamente disponibles, que incluyen GenBank, Swiss-Prot, EMBL, y otras.
Las glicosiltransferasas que se pueden emplear en los procedimientos de la invención incluyen galactosiltransferasas, fucosiltransferasas, glucosiltransferasas, N-acetilgalactosaminiltransferasas, Nacetilglucosaminiltransferasas, gluconiltransferasas, sialiltransferasas, manosiltransferasas, transferasas de ácido glucurónico, transferasas de ácido galacturónico, y oligosacariltransferasas. Las glicotransferasas adecuadas incluyen aquellas obtenidas a partir de eucariotas, así como a partir de procariotas.
Se puede obtener el ADN que codifica las glicosiltransferasas mediante síntesis química, cribando transcritos inversos de células o cultivos de líneas celulares adecuados, cribando bibliotecas genómicas procedentes de células adecuadas, o mediante las combinaciones de estos procedimientos. Se puede llevar a cabo el cribado del ARNm o del ADN genómico utilizando sondas de oligonucleótidos generadas a partir de la secuencia de ácido nucleico de la glicosiltransferasa. Se pueden marcar las sondas con una sonda detectable, tal como un grupo fluorescente, un átomo radioactivo o un grupo quimioluminiscente de acuerdo con procedimientos conocidos y utilizarse en ensayos de hibridación convencionales. Como alternativa, se pueden obtener las secuencias de ácidos nucleicos de las glicosiltransferasas mediante el uso del procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), produciéndose los cebadores de oligonucleótidos de la PCR a partir de la secuencia de ácido nucleico de las glicosiltransferasas. Véanse la Patente de los Estados unidos Nº 4.683.195 de Mullis y col. Y la Patente de los estados Unidos Nº 4.683.202 de Mullis.
Las enzimas glicosiltransferasas se pueden sintetizar en una célula hospedadora transformada con un vector que contiene el ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa. Un vector es una construcción de ADN que se puede replicar. Los vectores se utilizan tanto para amplificar el ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa como para expresar el ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa. Un vector de expresión es una construcción de ADN que se puede replicar en la que una secuencia de ADN que codifica la enzima glicosiltransferasa se une de manera operable a secuencias control adecuadas capaces de efectuar la expresión de la enzima glicosiltransferasa en un hospedador adecuado. La necesidad de dichas secuencias control variará dependiendo del hospedador seleccionado y del procedimiento de transformación escogido. Generalmente, las secuencias control incluyen un promotor de la transcripción, una secuencia operadora opcional para el control de la transcripción, una secuencia que codifica los sitios de unión al ARNm ribosómico adecuados, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. Los vectores de la amplificación no requieren la expresión de los dominios control. Todo lo que se necesita es la capacidad de replicarse en un hospedador, conferida usualmente por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.
1. Fucosiltransferasas
En algunas realizaciones, una glicosiltransferasa utilizada en el procedimiento de la invención es una fucosiltransferasa. Los expertos en la técnica conocen las fucosiltransferasas. Las fucosiltransferasas a modo de ejemplo incluyen enzimas, que transfieren la L-fucosa a partir de GDP-fucosa a una posición hidroxi de un azúcar aceptor. Las fucosiltransferasas que transfieren desde azúcares no nucleótidos a un aceptor son también de uso en la presente invención.
En algunas realizaciones, el azúcar aceptor es, por ejemplo, el grupo Galβ(1→3,4)GlcNAcβ-en un glicósido de oligosacárido. Las fucosiltransferasas adecuadas para esta reacción incluyen la Galβ(1→3,4)GlcNAcβ1-α(1→3,4) fucosiltransferasa (FTIII E.C. Nº. 2.4.1.65), que se caracterizó en primer lugar procedente de leche humana (véase, Palcic, y col., Carbohydrate Res. 190: 1-11 (1989); Prieels, y col., J. Biol. Chem. 256: 10456-10463 (1981); y Nunez, y col., Can. J. Chem. 59: 2086-2095 (1981)) y la Galβ(1→4)GlcNAcβ-αfucosiltransferasa (FTIV, FTV, FTVI) que se encuentran en suero humano. Se ha caracterizado también FTVII (E.C. Nº. 2.4.1.65), una sialil α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ fucosiltransferasa (véanse, Dumas, y col., Bioorg. Med. Letters 1: 425-428 (1991) y Kukowska-Latallo, y col., Genes and Development 4: 1288-1303 (1990)). Otras fucosiltransferasas a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, α1,2 fucosiltransferasa (E.C. Nº. 2.4.1.69). Se puede llevar a cabo la fucosilación enzimática mediante los procedimientos descritos en Mollicone, y col., Eur. J. Biochem. 191: 169-176 (1990) o en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.374.655.
2. Galactosiltransferasas
En otro grupo de realizaciones, la glicosiltransferasa es una galactosiltransferasa. Las galactosiltransferasas a modo de ejemplo incluyen α(1,3) galactosiltransferasas (E.C. No. 2.4.1.151, véanse, por ejemplo., Dabkowski y col., Transplant Proc. 25: 2921 (1993) y Yamamoto y col. Nature 345: 229-233 (1990), bovina (GenBank j 04989, Joziasse y col., J. Biol. Chem. 264: 14290-14297 (1989)), de murino (GenBank m26925; Larsen y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989)), de porcino (GenBank L36152; Strahan y col., Immunogenetics 41: 101-105 (1995)). Otra α1,3 galactosiltransferasa adecuada es la que está implicada en la síntesis del antígeno B del grupo sanguíneo (EC 2.4.1.37, Yamamoto y col., J Biol. Chem. 265: 1146-1151 (1990) (humana)).
Adecuadas también para el uso en los procedimientos de la invención están las β(1,4) galactosiltransferasas, que incluyen, por ejemplo EC 2.4.1.90 (LacNAc sintetasa) y EC 2.4.1.22 (lactosa sintetasa) (bovina (D’Agostaro y col., Eur. J. Biochem. 183: 211-217 (1989)), humana (Masri y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 157: 657-663 (1988)), de murino (Nakazawa y col., J. Biochem. 104: 165-168 (1988)), así como E.C. 2.4.1.38 y la ceramida galactosiltransferasa (EC 2.4.1.45, Stahl y col., J. Neurosci. Res. 38: 234-242 (1994)). Otras galactosiltransferasas adecuadas incluyen, por ejemplo, α1,2 galactosiltransferasas (procedentes, por ejemplo, de Schizosaccharomyces pombe, Chapell y col., Mol. Biol. Cell 5: 519-528 (1994)). Para las galactosiltransferasas adicionales adecuadas, véanse Taniguchi y col. (2002, Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes, Springer, Tokio), Guo y col. (2001, Glycobiology, 11(10): 813-820), y Breton y col. (1998, J Biochem. 123: 1000-1009).
Es bien conocida la producción de proteínas tales como la enzima GalNAc TI-XIV a partir de genes clonados mediante genomanipulación. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos nº 4.761.371. Un procedimiento implica la recogida de suficientes muestras, a continuación se determina la secuencia de aminoácidos mediante secuenciación del extremo N. A continuación se usa esta información para aislar un clon de ADNc que codifica una transferasa de longitud completa (unida a membrana) que, tras su expresión en la línea Sf9 de células de insecto, da como resultado la síntesis de una enzima completamente activa. A continuación se determina la especificidad del aceptor de la enzima utilizando un análisis semicuantitativo de los aminoácidos que rodean los sitios de glicosilación conocidos en 16 proteínas diferentes seguido por los estudios de glicosilación in vitro de péptidos sintéticos. Este trabajo ha demostrado que determinados restos de aminoácidos están representados en exceso en segmentos peptídicos glicosilados y que los restos situados en posiciones específicas que rodean los restos de serina y treonina glicosilados pueden tener una importante influencia sobre la eficacia aceptora de los diferentes restos de aminoácidos.
3. Sialiltransferasas
Las sialiltransferasas son otro tipo de glicosiltransferasa que es útil en las células recombinantes y las mezclas de reacción de la invención. Los ejemplos de sialiltransferasas que son adecuadas para el uso en la presente invención incluyen ST3Gal III (por ejemplo, una ST3Gal III de rata o ser humano), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, ST6GalNAc II, y ST6GalNAc III (la nomenclatura de las sialiltransferasas utilizadas en el presente documento es la que se ha descrito en Tsuji y col., Glycobiology 6: v-xiv (1996)). Una α(2,3)sialiltransferasa a modo de ejemplo denominada α(2,3)sialiltransferasa (EC 2.4.99.6) transfiere ácido siálico al extremo Gal no reductor de un disacárido o glicósido Galβ1→3Glc. Véanse, Van den Eijnden y col., J. Biol. Chem. 256: 3159 (1981), Weinstein y col., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982) y Wen y col., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992). Otra α2,3sialiltransferasa (EC 2.4.99.4) a modo de ejemplo transfiere ácido siálico al extremo Gal no reductor del disacárido o glicósido. Véanse, Rearick y col., J. Biol. Chem. 254: 4444 (1979) y Gillespie y col., J. Biol. Chem. 267: 21004 (1992). Las enzimas adicionales a modo de ejemplo incluyen Gal-β-1,4-GlcNAc α-2,6 sialiltransferasa (Véase, Kurosawa y col. Eur. J. Biochem. 219: 375-381 (1994)).
De forma preferible para la glicosilación de los hidratos de carbono de los glicopéptidos, la sialiltransferasa será capaz de transferir ácido siálico a la secuencia Galβ1,4GlcNAc-, Galβ1,3GlcNAc-, o Galβ1,3GalNAc-, las penúltimas secuencias más comunes subyacentes al ácido siálico terminal en las estructuras de hidratos de carbono completamente sililadas (véase la Tabla 7). Las 2,8-sialiltransferasas capaces de transferir ácido siálico a α2,3Galβ1,4GlcNAc son también útiles en los procedimientos de la invención.
Tabla 7. Sialiltransferasas que utilizan la secuencia de Galβ1,4GlcNAc como sustrato aceptor
Sialiltransferasa
Fuente Secuencia(s) formada(s) Ref.
ST6Gal I
Mamífero NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc 1
ST3Gal III
Mamífero NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc 1
NeuAcα2,3Galβ1,3GlcNAc-
ST3GaI IV
Mamífero NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc 1
NeuAcα2,3Galβ1,3GlcNAc-
ST6GaI II
Mamífero NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc-
ST6Gal II
Photobacterium NeuAcα2,6Galβ1,4GlcNAc 2
ST3GaI V
N. meningitides NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAc 3
N. gonorrhoeae
1) Goochee y col., Bio/Technology 9: 1347-1355 (1991)
2) Yamamoto y col., J. Biochem. 120: 104-110 (1996)
3) Gilbert y col., J. Biol. Chem. 271: 28271-28276 (1996)
Un ejemplo de una sialiltransferasa que es útil en los procedimientos reivindicados es ST3gal III, que se denomina también α(2,3)sialiltransferasa (EC 2.4.99.6). Esta enzima cataliza la transferencia de ácido siálico al Gal de un Galβ1,3GlcNAc o de un glicósido Galβ1,4GlcNAc (véase, por ejemplo, Wen y col., J. Biol. Chem. 267: 21011 (1992); Van den Eijnden y col., J. Biol. Chem. 256: 3159 (1991)) y es responsable de la sialilación de los oligosacáridos unidos a asparagina en glicopéptidos. El ácido siálico se une a Gal con la formación de un enlace α entre los dos sacáridos. La unión (el enlace) entre los sacáridos se realiza entre la posición 2 de NeuAC y la posición 3 de Gal. Esta enzima particular se puede aislar del hígado de rata (Weinstein y col., J. Biol. Chem. 257: 13845 (1982)); el ADNc humano (Sasaki y col. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa y Paulson (1994) J. Biol. Chem.
269: 1394-1401) y las secuencias de ADN genómico (Kitagawa y col. (1996) J. Biol. Chem. 271: 931-938) son conocidas, lo que facilita la producción de esta enzima mediante la expresión recombinante. En una realización preferida, los procedimientos de sialilación reivindicados usan una ST3Gal III de rata.
Otras sialiltransferasas a modo de ejemplo de uso en la presente invención incluyen aquellas aisladas de Campylobacter jejuni, que incluyen la α(2,3). Véase, por ejemplo, el documento WO99/49051.
Otras sialiltransferasas, incluyendo las relacionadas en la Tabla 7, son también útiles en un procedimiento para la sialilación de glicopéptidos comercialmente importantes económico y eficaz a gran escala. Como una sencilla prueba para encontrar la utilidad de estas otras enzimas, diversas cantidades de cada enzima (1-100 ml/mg de proteína) se hacen reaccionar con asialo-α1 AGP (a 1-10 mg/ml) para comparar la capacidad de la sialiltransferasa de interés para sialilar glicopéptidos con respecto tanto a ST6Gal I, ST3Gal III de bovino o a ambas sialiltransferasas. De forma alternativa, se pueden usar diferente glicopéptidos o glicopéptidos, u oligosacáridos unidos a N liberados enzimáticamente desde la estructura peptídica en lugar de asialo-α1 AGP para esta evaluación. Las sialiltransferasas con la capacidad para sialilar oligosacáridos de glicopéptidos unidos a N más eficazmente que ST6al I son útiles en un procedimiento a gran escala para la sialilación del péptido (tal como se ilustra para ST3Gal III en la presente divulgación).
4. Otras glicosiltransferasas
Un experto en la técnica entenderá que se pueden sustituir otras glicosiltransferasas en ciclos de transferasa similares, tal como se ha descrito en detalle para la sialiltransferasa. En particular, las glicosiltransferasas pueden ser también, por ejemplo, glucosiltransferasas, por ejemplo, Alg8 (Stagljov y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5977 (1994)) o Alg5 (Heesen y col., Eur. J. Biochem. 224: 71 (1994)).
Las N-acetilgalactosaminiltransferasas son también de uso en la práctica de la presente invención. Las Nacetilgalactosaminiltransferasas adecuadas incluyen α(1,3) N-acetilgalactosaminiltransferasa, β(1,4) Nacetilgalactosaminiltransferasas (Nagata y col., J. Biol. Chem. 267: 12082-12089 (1992) y Smith y col., J. Biol Chem.
269: 15162 (1994)) y la N-acetilgalactosaminiltransferasa peptídica (Homa y col., J. Biol. Chem. 268: 12609 (1993)). Las N-acetilglucosaminiltransferasas adecuadas incluyen GnTI (2.4.1.101, Hull y col., BBRC 176: 608 (1991)), GnTII, GnTIII (Ihara y col., J. Biochem. 113: 692 (1993)), GnTIV, GnTV (Shoreibah y col., J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993)) y GnTVI, N-acetilglucosaminiltransferasa unida a O (Bierhuizen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9326 (1992)), N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa (Rajput y col., Biochem J. 285: 985 (1992), y la hialuronano sintasa.
Las manosiltransferasas son de utilidad para transferir restos de manosa modificados. Las manosiltransferasas incluyen α(1,2) manosiltransferasa, α(1,3) manosiltransferasa, α(1,6) manosiltransferasa, β(1,4) manosiltransferasa, Dol-P-Man sintasa, OCh1, y Pmt1 (véase, Kornfeld y col., Annu. Rev. Biochem. 54: 631-664 (1985)).
Son también útiles en la presente invención las xilosiltransferasas. Véase, por ejemplo, Rodgers, y col., Biochem. J., 288:817-822 (1992); y Elbain, y col., Patente de los Estados Unidos Nº 6.168.937.
Se describen otros ciclos de glicosiltransferasa adecuados en Ichikawa y col., JACS 114: 9283 (1992), Wong y col.,
J. Org. Chem. 57: 4343 (1992), e Ichikawa y col. en CARBOHYDRATES AND CARBOHYDRATE POLYMERS. Yaltami, ed. (ATL Press, 1993).
Las glicosiltransferasas procariotas son también útiles en la práctica de la invención. Dichas glicosiltransferasas incluyen las enzimas implicadas en la síntesis de lipooligosacáridos (LOS), que se producen por muchas bacterias gram negativas. Los LOS tienen normalmente secuencias de glicano en los extremos que imitan los glicoconjugados que se encuentran sobre la superficie de las células epiteliales humanas o en las secreciones del hospedador (Preston y col., Critical Reviews in Microbiology 23(3): 139-180 (1996)). Dichas enzimas incluyen las proteínas de los operones rfa de especies tales como E. coli y Salmonella typhimurium, que incluyen una β1,6 galactosiltransferasa y una β1,3 galactosiltransferasa (véanse, por ejemplo., EMBL Nos de Acceso. M80599 y M86935 (E. coli); EMBL Nº de Acceso. S56361 (S. typhimurium)), una glucosiltransferasa (Swiss-Prot Nº de Acceso. P25740 (E. coli), una β1,2glucosiltransferasa (rfaJ)(Swiss-Prot nº de Acceso P27129 (E. coli) y Swiss-Prot Nº de Acceso P19817 (S. typhimurium)), y una β1,2-N-acetilglucosaminiltransferasa (rfaK)(EMBL nº de Acceso U00039 (E. coli). Otras glicosiltransferasas cuyas secuencias de aminoácidos son conocidas incluyen las que están codificadas por operones tales como rfaB, que se han caracterizado en organismos tales como Klebsiella pneumoniae, E. coli, Salmonella typhimurium, Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica, Mycobacterium leprosum, y el operón rh1 de Pseudomonas aeruginosa.
Son también adecuadas también para el uso en la presente invención las glicosiltransferasas que están implicadas en la producción de estructuras que contienen lacto-N-neotetraosa D-galactosil-β-1,4-N-acetil-D-glucosaminil-β-1,3D-galactosil-β-1,4-D-glucosa, y la secuencia de trisacáridos del grupo sanguíneo Pk, D-galactosil-α-1,4-D-galactosilβ-1,4-D-glucosa, que se han identificado en los LOS de los patógenos mucosales Miseria gonnorhoeae y N. meningitidis (Scholten y col., J. Med. Microbiol. 41: 236-243 (1994)). Se han identificado los genes de N. meningitidis y N. gonorrhoeae que codifican las glicosiltransferasas implicadas en la biosíntesis de estas estructuras para los inmunotipos L3 y L1 de N. meningitidis (Jennings y col., Mol. Microbiol. 18: 729-740 (1995)) y el mutante F62 de N. gonorrhoeae (Gotshlich, J. Exp. Med. 180: 2181-2190 (1994)). En N. meningitidis, un locus que consta de tres genes, IgtA, IgtB e lgE, codifica las enzimas glicosiltransferasas requeridas para la adición de los últimos tres azúcares a la cadena de la lacto-N-neotetraosa (Wakarchuk y col., J. Biol. Chem. 271: 19166-73 (1996)). Recientemente se ha demostrado la actividad enzimática del producto de los genes lgtB e lgtA, proporcionando la primera evidencia directa de su función glicosiltransferasa propuesta (Wakarchuk y col., J. Biol. Chem. 271(45): 28271-276 (1996)). En N. gonorrhoeae existen dos genes adicionales, lgtD que añade β-D-GalNAc en la posición de la galactosa terminal de la estructura de la lacto-N-neotetraosa, e lgtC que añade una α-D-Gal terminal al elemento lactosa de un LOS truncado, creando de esta manera la estructura del antígeno del grupo sanguíneo Pk (Gotshlich (1994), más arriba.). En N. meningitidis, un inmunotipo L1 independiente expresa también el antígeno del grupo sanguíneo Pk y se ha demostrado que transporta un gen Igtc (Jennings y col., (1995), más arriba.). Se describen también las glicosiltransferasas de Miseria y los genes asociados en el documento USPN 5.545.553 (Gotschlich). Se han caracterizado los genes de la α1,2-fucosiltransferasa y la α1,3-fucosiltransferasa de Helicobacter pylori (Martin y col., J. Biol. Chem. 272: 21349-21356 (1997)). También, de uso en la presente invención son las glicosiltransferasas de Campylobacter jejuni (véase, Taniguchi y col., 2002, Handbook of glycosyltransferases and related genes, Springer, Tokio).
B. Sulfotransferasas
La invención proporciona también procedimientos para producir péptidos que incluyen moléculas sulfatadas, incluyendo, por ejemplo, polisacáridos sulfatados tales como heparina, sulfato de heparán, carragenato, y los compuestos relacionados. Las Sulfotransferasas adecuadas incluyen, por ejemplo, condroitin-6-sulfotransferasa (ADNc de pollo descrito por Fukuta y col., J. Biol. Chem. 270: 18575-18580 (1995); Nº de Acceso del GenBank D49915), glicosaminoglicano N-acetilglucosamina N-desacetilasa/N-sulfotransferasa 1 (Dixon y col., Genomics 26: 239-241 (1995); UL18918), y glicosaminoglicano N-acetilglucosamina N-desacetilasa/N-sulfotransferasa 2 (ADNc de murino descrito en Orellana y col., J. Biol. Chem. 269: 2270-2276 (1994) y Eriksson y col., J. Biol. Chem. 269: 10438-10443 (1994); ADNc humano descrito en el Nº de Acceso al GenBank U2304).
C. Glicosiltransferasas unidas a célula
En otra realización, las enzimas utilizadas en el procedimiento de la invención son glicosiltransferasas unidas a células. Aunque se conocen muchas glicosiltransferasas solubles (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 5.032.519), las glicosiltransferasas se encuentran por lo general en una forma unida a membrana cuando se asocian con células. Se considera que muchas de las enzimas unidas a membrana estudiadas hasta el momento son proteínas intrínsecas, esto es, no se liberan de las membranas por sonicación y requieren detergentes para su solubilización. Se han identificado glicosiltransferasas superficiales sobre las superficies de células de vertebrados e invertebrados, y también se ha reconocido que estas transferasas superficiales mantienen la actividad catalítica en condiciones fisiológicas. Sin embargo, la función más reconocida de las glicosiltransferasas superficiales celulares es para el reconocimiento intercelular (Roth, 1990, Molecular Approaches to Supracellular Phenomena,).
Se han desarrollado procedimientos para alterar las glicosiltransferasas expresadas por células. Por ejemplo, Larsen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8227-8231 (1989), notifican una solución genética para aislar secuencias de ADNc clonadas que determinan la expresión de estructuras de oligosacáridos superficiales celulares y sus glicosiltransferasas análogas. Se ha transfectado una biblioteca de ADNc generada a partir de ARNm aislado de una línea de células de murino conocida que expresa UDP-galactosa: β.-D-galactosil-1,4-N-acetil-D-glucosaminida α-1,3galactosiltransferasa en células COS-1. A continuación se han cultivado las células transfectadas y se han evaluado para la actividad de la α 1-3 galactosiltransferasa.
Francisco y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2713-2717 (1992), dan a conocer un procedimiento para anclar βlactamasa a la superficie externa de Escherichia coli. Una fusión tripartita que consiste en (i) una secuencia señal de una proteína de la membrana externa, (ii) una sección extensora de la membrana de una proteína de la membrana externa, y (iii) se produce una secuencia de la β-lactamasa madura completa dando como resultado una molécula de β-lactamasa unida a una superficie activa. Sin embargo, el procedimiento de Francisco se limita solo a sistemas de células procariotas y como reconocen los autores, requiere la fusión tripartita completa para un funcionamiento adecuado.
D. Enzimas de fusión
En otras realizaciones a modo de ejemplo, los procedimientos de la invención utilizan péptidos de fusión que tienen más de una actividad enzimática que está implicada en la síntesis de un conjugado glicopeptídico deseado. Los péptidos de fusión pueden estar compuestos de, por ejemplo, un dominio catalíticamente activo de una glicosiltransferasa que se une a un dominio catalíticamente activo de una enzima auxiliar. El dominio catalítico de la enzima auxiliar puede, por ejemplo, catalizar una etapa en la formación de un azúcar de nucleótido que es un donante de la glicosiltransferasa, o catalizar una reacción implicada en un ciclo de glicosiltransferasa. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una glicosiltransferasa puede unirse, en su estructura, a un polinucleótido que codifica una enzima implicada en una síntesis del azúcar de un nucleótido. El péptido de fusión resultante puede a continuación catalizar no solo la síntesis del azúcar de nucleótido, sino también la transferencia de un resto de azúcar a la molécula aceptora. El péptido de fusión puede estar unido a dos o más enzimas del ciclo en una secuencia de nucleótido que se puede expresar. En otras realizaciones, el péptido de fusión incluye los dominios catalíticamente activos de dos o más glicosiltransferasas. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº
5.641.668. Los glicopéptidos modificados de la presente invención se pueden diseñar y fabricar fácilmente utilizando diversos péptidos de fusión adecuados (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT/CA98/01180, que se ha publicado como documento WO 99/31224 el 24 de junio de 1999).
E. Enzimas inmovilizadas
Además de las enzimas unidas a células, la presente invención proporciona también el uso de enzimas que están inmovilizadas sobre un soporte sólido y/o soluble. En una realización a modo de ejemplo, se proporciona una glicosiltransferasa que está conjugada a un PEG mediante un enlazador de glicosilo intacto de acuerdo con los procedimientos de la invención. El conjugado PEG-enlazador-enzima está opcionalmente unido a un soporte sólido. El uso de enzimas soportadas en un sólido en los procedimientos de la invención simplifica las tareas de mezclar la reacción y de purificar el producto de reacción, y permite también la fácil recuperación de la enzima. El conjugado de glicosiltransferasa se utiliza en los procedimientos de la invención. Serán evidentes para los expertos en la técnica otras combinaciones de enzimas y soportes.
F. Mutagénesis de glicosiltransferasas
Las novedosas formas de las glicosiltransferasas, sialiltransferasas, sulfotransferasas, y cualquier otra enzima utilizada en el procedimiento de la invención se pueden crear utilizando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, así como otros bien conocidos por los expertos en la técnica. De particular interés son las transferasas con especificidad aceptora alterada y/o especificidad donante. De interés también son las enzimas con mayores tasas de conversión y mayor estabilidad entre otras.
Las técnicas de mutagénesis de diseño lógico se pueden utilizar cuando se conoce la secuencia del péptido. Puesto que se conocen las secuencias y muchas de las estructuras terciarias de las transferasas y las glucosidasas utilizadas en la invención, estas enzimas son ideales para el diseño lógico de mutantes. Por ejemplo, el sitio catalítico de la enzima puede estar mutado para alterar la especificidad donante y/o aceptora de la enzima.
Los extensos datos estructurales terciarios en las glicosiltransferasas y las glicosidasa hidrolasas pueden dar idea de las mutaciones de estas enzimas que implican intercambios de dominios. Las glicosiltransferasas y glicosidasa hidrolasas son enzimas modulares (véase, Bourne y Henrissat, 2001, Current Opinion in Structural Biology 11:593600). Las glicosiltransferasas se dividen en dos familias básicas según su estructura: GT-A y GT-B. Las glicosiltransferasas de la familia GT-A comprenden dos dominios disimilares, uno implicado en la unión del nucleótido y el otro en la unión del aceptor. De esta manera, se podría fusionar de forma conveniente la secuencia de ADN que codifica el dominio de un gen en marco con un dominio de un segundo gen para crear un nuevo gen que codifica una proteína con una nueva especificidad aceptora7donante. Dichos intercambios de dominios podrían incluir adicionalmente los módulos de hidratos de carbono y otros dominios accesorios.
Se pueden usar también técnicas de mutación aleatoria y/o evolución dirigida, tal como se ha descrito anteriormente, para crear novedosas formas de las glicosiltransferasas y glicosidasas utilizadas en la invención.
IV.
Sistemas de expresión in vitro e in vivo
A.
Células para la producción de glicopéptidos
La acción de las glucosiltransferasas es clave para la glicosilación de los péptidos, de esta manera, la diferencia en la expresión de un conjunto de glicosiltransferasas en cualquier tipo de célula dado afecta el modelo de glicosilación de cualquier péptido dado producido en esta célula. Para una revisión de la glicosilación de péptidos dependiente de célula hospedadora, véase Kabata y Takasaki, "Structure and Biosynthesis of Cell Surface Carbohydrates," en Cell Surface Carbohydrates and Cell Development, 1991, pp. 1-24, Eds. Minoru Fukuda, CRC Press, Boca Raton, FL.
De acuerdo con la presente divulgación, el tipo de célula en la que el péptido se produce solo es relevante en lo que respecta al grado de remodelación requerido para generar un péptido que tenga la glicosilación deseada. Por ejemplo, el número y la secuencia de las reacciones de digestión enzimáticas y el número y la secuencia de las reacciones sintéticas enzimáticas que se requieren para generar in vitro un péptido que tenga la glicosilación deseada variarán dependiendo de la estructura del glicano en el péptido producido por un tipo de célula concreto. Aunque la invención no debe considerarse en forma alguna limitada a la producción de péptidos procedentes de cualquier tipo de célula concreto incluyendo cualquier tipo de célula dado a conocer en el presente documento, se presenta ahora una discusión de algunos sistemas celulares que establecen la potencia de la presente invención y su dependencia del tipo de célula que la que se generan los péptidos.
En general, y para expresar un péptido a partir del ácido nucleico que lo codifica, el ácido nucleico debe incorporarse a un casete de expresión, que comprende un elemento promotor, un elemento terminador, y la secuencia de codificación del péptido unido de manera operable entre los dos. A continuación el casete de expresión se une de manera operable a un vector. Con este fin, se pueden emplear adápteros o enlazadores para unir los fragmentos del nucleótido o pueden estar implicadas otras manipulaciones para proporcionar los sitios de restricción convenientes, la eliminación de nucleótidos superfluos, la eliminación de sitios de restricción, o similares. Con este fin, puede estar implicada la mutagénesis in vitro, la reparación del cebador, la restricción, la hibridación, las resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones. Un vector lanzadera tiene los elementos genéticos necesarios para la replicación en una célula. Algunos vectores pueden replicarse solamente en procariotas, o pueden replicarse en procariotas y eucariotas. Dicho vector de expresión plásmido se mantendrá en uno o más sistemas de replicación, preferiblemente dos sistemas de replicación, que permiten el mantenimiento estable en el interior de una célula hospedadora de levadura para los fines de la expresión, y en el interior de un hospedador procariota para los fines de la clonación. Muchos vectores con características diversas están comercialmente disponibles en la actualidad. Los vectores son normalmente plásmidos o fagos, pero pueden ser también cósmidos o minicromosomas. De forma conveniente, muchos vectores comercialmente disponibles tendrán el promotor y el terminador del casete de expresión ya presente, y un sitio multienlazador en el que puede insertarse la secuencia de codificación del péptido de interés. El vector lanzadera que contiene el casete de expresión se transforma a continuación en E. coli donde se replica durante la división celular para generar una preparación de vector que es suficiente para transformar las células hospedadoras de la presente invención del sistema de expresión escogido. La anterior metodología es bien conocida por los expertos en la técnica, y los protocolos por los cuales se lleva a cabo se pueden encontrar en Sambrook y col. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York).
El vector, una vez purificado de las células en las que se amplifica, se transforma a continuación en las células del sistema de expresión. El protocolo de transformación depende del tipo de célula y de la naturaleza del vector. Se hacen crecer transformantes en un medio nutriente adecuado, y cuando es adecuado, se mantienen bajo presión selectiva para asegurar la retención del ADN endógeno. Cuando la expresión es inducible, se puede permitir el crecimiento de la levadura hospedadora para dar como resultado una elevada densidad de células, y a continuación se induce la expresión. El péptido heterólogo secretado maduro se puede cosechar mediante cualquier medio convencional, y purificarse mediante cromatografía, electroforesis, diálisis y, extracción disolvente-disolvente.
Son bien conocidas en la materia las técnicas de clonación molecular. Además, las técnicas para los procedimientos de clonación molecular se pueden encontrar en Sambrook y col. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Glover y col., (1985, DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II); Gait y col., (1985, Oligonucleotide Synthesis); Hames y Higgins (1985, Nucleic Acid Hybridization ); Hames y Higgins (1984, Transcription And Translation); Freshney y col., (1986, Animal Cell Culture); Perbal, (1986, Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press); Perbal,(1984, A Practical Guide To Molecular Cloning); Ausubel y col. (2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.).
B. Hongos y levaduras
Los péptidos producidos en levaduras se glicosilan y las estructuras de glicano presentes en los mismos son principalmente estructuras con un alto contenido en manosa. En el caso de los N-glicanos, las estructuras de glicano producidas en levaduras pueden contener como mucho nueve o más restos de manosa que pueden contener o no azúcares adicionales añadidos a los anteriores. En la Figura 5, lado de la izquierda se muestra un ejemplo del tipo de glicano en los péptidos producidos por células de levadura. Sin tener en cuenta el número de restos de manosa y el tipo y la complejidad de los azúcares adicionales añadidos a los anteriores, los N-glicanos como componentes de los péptidos producidos en células de levadura comprenden una estructura de un núcleo de trimanosilo tal como se muestra en la Figura 5. Cuando la estructura de glicano de un péptido producido en las células de levadura es una estructura con un alto contenido en manosa, es un tema sencillo para la persona normalmente experta eliminar, in vitro, utilizando las enzimas manosidasas disponibles, todos los restos de manosa procedentes de la molécula excepto aquellos que comprenden el núcleo de trimanosilo del glicano, generando de esta forma un péptido que tiene una estructura elemental de núcleo de trimanosilo unida a la anterior. Ahora, utilizando las técnicas disponibles en la materia, y provistos con la presente divulgación, es un tema sencillo añadir enzimáticamente, in vitro, restos de azúcar adicionales a la estructura elemental del núcleo de trimanosilo para generar un péptido que tenga una estructura de glicano deseada unida a la anterior. De forma similar, cuando el péptido producido por la célula de levadura comprende una estructura con un alto contenido de manosa además de otros azúcares complejos unidos a la anterior, es un tema sencillo escindir enzimáticamente todos los azúcares adicionales, incluyendo los restos extra de manosa, para llegar a una estructura elemental de núcleo de trimanosilo. Una vez que se produce la estructura elemental de núcleo de trimanosilo, es posible la generación de un péptido que tenga una glicosilación deseada siguiendo las directrices proporcionadas en el presente documento.
Por “levadura”, se entiende levaduras ascoesporógenas (Endomicetales), levaduras basidioesporógenas, y levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos (Blastomicetos). Las levaduras ascoesporógenas se dividen en dos familias Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae. La última está comprendida por cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoideae (por ejemplo., género Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae, y Saccharomycoideae (por ejemplo, genera Pichia, Kluyveromyces, y Saccharomyces). Las levaduras basidioesporógenas incluyen los géneros Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, y Filobasidiella. Las levaduras que pertenecen a los hongos imperfectos se dividen en dos familias, Sporobolomycetaceae (por ejemplo, géneros Sporobolomyces, Bullera) y Cryptococcaceae (por ejemplo, género Candida). De particular interés para la presente invención son las especies comprendidas en los géneros Saccharomyces, Pichia, Aspergillus, Trichoderma, Kluyveromyces, de forma especial K. lactis y K. drosophilum, Candida, Hansenula, Schizpsaccaromyces, Yarrowia, y Chrysoporium. Debido a que la clasificación de levaduras puede cambiar en el futuro, para los fines de la presente invención, las levaduras deben definirse tal como se describe en Skinner y col., eds. 1980) Biology and Activities of Yeast (Soc. App. Bacteriol. Symp. Serie Nº. 9).
Además de lo anterior, las personas normalmente expertas en la técnica están presumiblemente familiarizadas con la biología de las levaduras y la manipulación de la genética de las levaduras. Véanse, por ejemplo, Bacila y col., eds. (1978, Biochemistry and Genetics of Yeast, Academic Press, New York); y Rose y Harrison. (1987, The Yeasts (2ª ed.) Academic Press, Londres). Son bien conocidos en la técnica los procedimientos para introducir ADN exógeno en levaduras hospedadoras. Existe una amplia variedad de procedimientos para la transformación de levaduras. Hinnen y col (1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1919-1933); Beggs, (1978, Nature 275(5676):104109); y Stinchcomb y col., (Publicación EPO Nº 45.573 enseñan la transformación de esferoplastos), Becker y Gaurante, (1991, Methods Enzymol. 194:182-187) enseñan la electroporación, Gietz y col. (2002, Methods Enzymol.
350: 87-96) y Mount y col. (1996, Methods Mol Biol. 53:139-145) enseñan el acetato de litio. Para una revisión de los sistemas de transformación de levaduras no de Saccharomyces, véase Wang y col. (Crit Rev Biotechnol. 2001;21(3): 177-218). Para los procedimientos generales sobre la genomanipulación de levaduras, véase Barr y col., (1989, Yeast genetic engineering, Butterworths, Boston).
Además de las levaduras naturales y de las células fúngicas, existen también cepas de levaduras y hongos que se han mutado y/o seleccionado para potenciar el nivel de expresión del gen exógeno, y la pureza, el procesamiento posterior a la traducción del péptido resultante, y la recuperación y la pureza del péptido maduro. Puede dirigirse también la expresión de un péptido exógeno hacia la ruta secretora de la célula, tal como se ilustra mediante la expresión de la insulina (véase (Kjeldsen, 2000, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 277-286, y las referencias citadas en el anterior). En general, para dar lugar a que se secrete el péptido exógeno a partir de la célula de levadura, se pueden utilizar las señales de secreción derivadas de los genes de levaduras, tal como aquellos genes de la toxina asesina (Stark y Boyd, 1986, EMBO J. 5: 1995-2002) o de la feromona alfa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30: 933; Brake y col., 1988, Yeast 4: S436).
Con respecto a los hongos filamentosos en general, se pueden encontrar los procedimientos para la manipulación genética en Kinghorn y Turner (1992, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Nueva York). Se pueden encontrar directrices sobre vectores adecuados en Martinelli y Kinghorn (1994, Aspergillus: 50 años, Elsevier, Amsterdam).
1. Saccharomyces
En Saccharomyces, los vectores de levaduras adecuados para el uso que producen un péptido incluyen YRp7 (Struhl y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1978), YEp13 (Broach y col., Gene 8: 121-133, 1979), vectores POT (Kawasaki y col, Patente de los Estados Unidos Nº 4.931.373), pJDB249 y pJDB219 (Beggs, Nature
275: 104-108, 1978) y sus derivados. Los promotores preferidos para el uso en levaduras incluyen promotores para la expresión del gen glicolítico en levaduras (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255: 12073-12080, 1980; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982; Kawasaki, Patente de los Estados Unidos Nº 4.599.311) o los genes de la alcohol deshidrogenasa (Young y col., en Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender y col., (eds.), p. 355, Plenum, Nueva York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201, 1983), y el promotor de la ADH2-4G (Russell y col., Nature 304: 652-654, 1983; Irani y Kilgore, Solicitud de patente de los Estados Unidos con Nº de serie 07/784.653, documento CA 1.304.020 y documento EP 284 044). Las unidades de expresión pueden incluir también un terminador de la transcripción. Un terminador de la transcripción preferido es el terminador TPI1 (Alber y Kawasaki, ibid.).
Los ejemplos de vectores lanzadera de levaduras-bacterias incluyen Yep24 (Botstein y col. (1979) Gene 8: 17-24; pC1 (Brake y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642-4646), e Yrp17 (Stnichomb y col. (1982) J. Mol. Biol. 158:157). Adicionalmente un vector de expresión plásmido puede ser un plásmido de un alto o bajo número de copias, el número de copias varía generalmente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 200. En el caso de vectores de levaduras con un alto número de copias, será generalmente al menos de 10, preferiblemente al menos 20, y usualmente no excederá de al menos 150 copias del vector en un único hospedador. Dependiendo del péptido heterólogo seleccionado, puede ser deseable tanto un alto como un bajo número de copias, dependiendo del efecto del vector y del péptido recombinante sobre el hospedador. Véase, por ejemplo, Brake y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642-4646. Las construcciones de ADN de la presente invención se pueden integrar también en el genoma de la levadura mediante un vector de integración. Se conocen en la técnica ejemplos de dichos vectores. Véase, por ejemplo, Botstein y col. (1979) Gene 8:17-24.
La selección de una levadura adecuada y de otros microorganismos hospedadores para la práctica de la presente invención está comprendida en el conocimiento del experto en la técnica. De particular interés son las especies de Saccharomyces S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis, y S. oviformis. Cuando se seleccionan las células hospedadoras de levadura para la expresión de un péptido deseado, las células hospedadoras de levaduras pueden incluir aquellas que muestran, entre otras, una buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica, y vigor global. Las levaduras y otros microorganismos están generalmente disponibles de una variedad de fuentes, que incluyen el Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California, Berkeley, Calif.; y la American Type Culture Collection, Manassas VA. Para una revisión, véase Strathern y col., eds. (1981, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).Son bien conocidos en la técnica los procedimientos para introducir ADN exógeno en levaduras hospedadoras.
2. Pichia
El uso de Pichia methanolica como célula hospedadora para la producción de péptidos recombinantes se da a conocer en las Solicitudes PCT WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para uso en P. methanolica transformante se preparan comúnmente como plásmidos circulares bicatenarios, que se linealizan de forma preferible antes de la transformación. Para la producción de péptidos en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador en el plásmido sean el de un gen de P. methanolica, tal como un gen para la utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen los procedentes de los genes de la dihidroxiacetona sintasa (DHAS), formiato deshidrogenasa (FMD), y catalasa (CAT), así como los dados a conocer en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.252.726. Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma hospedador, se prefiere tener el segmento de expresión completo del plásmido flanqueado en ambos extremos por secuencias de ADN hospedador. Un marcador seleccionable preferido para uso en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, que codifica la fosforibosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), que permite a las células hospedadoras ade2 crecer en ausencia de adenina. Para los procedimientos industriales a gran escala, en los que es deseable minimizar el uso de metanol, se prefieren las células hospedadoras en las que se eliminan ambos genes de utilización del metanol (AUG1 y AUG2). Se utiliza la electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un péptido de interés en células de P. methanolica. Se prefiere transformar las células de P. methanolica mediante electroporación utilizando un campo eléctrico alternante cuya intensidad disminuye de manera exponencial que tiene una fuerza del campo de entre 2,5 a 4,5 kV/cm, preferiblemente de aproximadamente 3,75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) de entre 1 a 40 milisegundos, lo más preferible de aproximadamente 20 milisegundos. Para una revisión del uso de Pichia pastoris para la producción a gran escala de fragmentos de anticuerpo, véase Fischer y col., (1999, Biotechnol Appl Biochem. 30 (Pt 2):117-120).
3. Aspergillus
Son bien conocidos en la técnica los procedimientos para expresar péptidos en Aspergillus spp., que incluyen, pero no se limitan a aquellos descritos en Carrez y col., 1990, Gene 94: 147-154; Contreras, 1991, Bio/Technology 9: 378-381; Yelton y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474; Tilburn y col., 1983, Gene 26: 205-221; Kelly
y. Hynes, 1985, EMBO J. 4: 475-479; Ballance y col., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 112: 284-289; Buxton y col., 1985, Gene 37: 207-214, y la Patente de los Estados Unidos Nº 4.935.349. Se encuentran ejemplos de promotores útiles en Aspergillus en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.252.726. Se encuentran cepas de Aspergillus útiles para la expresión de péptidos en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.935.349. La producción comercial de péptidos exógenos está disponible de Novoenzymes para Aspergillus niger y Aspergillus oryzae.
4. Trichoderma
Trichoderma tiene determinadas ventajas sobre otras especies de células hospedadoras recombinantes para la expresión de los péptidos deseados. Es fácil hacer crecer este organismo en grandes cantidades y tiene la capacidad de glicosilar y secretar eficazmente rendimientos elevados de péptidos de mamífero recombinantes en el medio, haciendo el aislamiento del péptido relativamente fácil. Además, el modelo de glicosilación en los péptidos expresados es más similar al de los péptidos humanos que los péptidos expresados en otros sistemas. Sin embargo, sigue existiendo diferencias en las estructuras de glicanos en los péptidos expresados a partir de estas células. Por ejemplo, los restos de ácido siálico de los extremos son importantes para la función terapéutica de un péptido en un sistema de mamífero, debido a que la presencia de estos restos al extremo de la estructura de glicano impide el aclaramiento peptídico a partir del torrente sanguíneo de mamífero. El mecanismo que retrasa el aumento de la vida media biológica de las moléculas sialiladas se cree que está basado en su reconocimiento disminuido por las lecitinas (Drickamer, 1988, J. Biol. Chem. 263: 9557-9560). Sin embargo, en general, las células fúngicas no añaden restos de ácido siálico de los extremos a los glicanos en los péptidos, y los péptidos sintetizados en las células fúngicas son por tanto asiálicos. De acuerdo con la presente invención, se puede remediar esta deficiencia utilizando los procedimientos de remodelación del glicano in vitro de la invención descritos en detalle en otra parte en el presente documento.
Las especies de Trichoderma útiles como hospedadores para la producción de péptidos que se van a remodelar incluyen T. reesei, tal como QM6a, ALKO2442 o CBS383.78 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, PO Box 273, 3740 AG Baarn, Países bajos, o, ATCC13631 (American Type Culture Collection, Manassas VA, 10852, USA, tipo); T. viride (tal como CBS189.79 (det. W. Gams); T. longibrachiatum, tal como CBS816.68 (tipo); T. pseudokoningii (tal como MUCL19358; Mycotheque de l’Universite Catholique de Louvain); T. saturnisporum CBS330.70 (tipo); T. harzianum CBS316.31 (det. W. Gams); T. virgalum (T. pseudokoningii) ATCC24961. Lo más preferible, el hospedador es T. reesei y de forma más preferible, son las cepas QM9414 de T. reesei (ATCC 26921), RUT-C-30 (ATCC 56765), y mutantes muy productivos tales como VTT-D-79125, que se deriva de QM9414 (Nevalainen, Technical Research Centre of Finland Publications 26, (1985), Espoo, Finlandia).
La transformación de Trichoderma con ADN se lleva a cabo utilizando cualquier técnica conocida en la materia, que incluye la que se enseña en la patente europea Nº EP0244234, Harkki (1989, Bio/Technology 7: 596-601) y Uusitalo (1991, J. Biotech. 17: 35-50). El cultivo de Trichoderma está respaldado por una extensa experiencia previa en técnicas de fermentación a escala industrial; por ejemplo, véase Finkelstein, 1992, Biotechnology of Filamentous Fungi: Technology and Products, Butterworth-Heinemann, editores, Stoneham, Mass.
5. Kluyveromyces
Las levaduras pertenecen al género Kluyveromyces se han utilizado como organismos hospedadores para la producción de péptidos recombinantes. Los péptidos producidos por este género de levadura son, en concreto, quimosina (Patente Europea 96 430), taumatina (Patente Europea 96 910), albúmina, interleuquina-1β, TPA, TIMP (Patente Europea 361 991) y derivados de albúmina que tienen una función terapéutica (Patente Europea 413 622). Las especies de particular interés en el género Kluyveromyces incluyen k. lactis.
Los procedimientos para expresar péptidos recombinantes en Kluyveromyces spp, son bien conocidos en la técnica. Los vectores para la expresión y la secreción de péptidos recombinantes humanos en Kluyveromyces son conocidos en la técnica (Yeh, J. Cell. Biochem. Suppl. 14C:68, Abst. H402; Fleer, 1990, Yeast 6 (Volumen Especial):S449) que son procedimientos para la transformación y la expresión de péptidos recombinantes (Ito y col., 1983, J. Bacteriol. 153:163-168; van den Berg, 1990, Bio/Technology 8: 135-139; Patente de los Estados Unidos Nº 5.633.146, Documentos WO8304050A1, EP0096910, EP0241435, EP0301670, EP0361991). Para una revisión de la manipulación génica del ADN linear de Kluyveromyces lactis mediante referenciación genética e intercambio plásmido véase Schaffarth y col. (FEMS Microbol Lett. 178(2):201-210, 1999).
6. Chrysoporium
El género fúngico Chrysoporium se ha utilizado recientemente para la expresión de péptidos recombinantes extraños. Una descripción de los procedimientos por los cuales el experto en la técnica puede usar Chrysoporium se puede utilizar para péptidos extraños se encuentra en el documento WO 00/20555). Las especies particularmente adecuadas para el sistema de expresión incluyen, C. botryoides, C carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, F. fastidium, C. filiforme, C. gerogiae, C. globiferum, C. globiferum var. articulatum, C. globiferum var. niveum, C. hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovianum,
C. lignorum, C. lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. medium, C. medium var. spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium var. roseum, C. minor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var. crescens,
C. pilosum, C. peodomerderium, C. pyriformis, C. queenslandicum, C. sigleri, C. sulfureum, C. synchronum, C. tropicum, C. undulatum, C. vallenarense, C. vespertilium, y C. zonatum.
7. Otros
En la Patente Europea 394 538 se dan a conocer procedimientos para transformar Schwanniomyces. Los procedimientos para transformar Acremonium chrysogenium se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.162.228. Se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.486.533 los procedimientos para trasformar Neurospora. Se conoce también un sistema de expresión específico de Schizosaccharomyces pombe (Patente europea Nº 385 391) Los procedimientos generales para expresar péptidos en la levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe se pueden encontrar en Giga-Hama y Kumagai (1997, Foreign gene expression in fission yeast: Schizosaccharomyces pombe, Springer, Berlín).
C. Sistemas de mamífero
Como se menciona anteriormente, las células de mamífero producen normalmente una mezcla heterogénea de estructuras de N-glicano que varían con respecto al número y la disposición de azúcares adicionales unidos al núcleo de trimanosilo. Normalmente, las células de mamífero producen péptidos que tienen una estructura de glicano compleja, Tal como la que se muestra en la Figura 4, lado de la derecha. Utilizando los procedimientos de la presente invención, un péptido producido en una célula de mamífero puede remodelarse in vitro para generar un péptido que tenga la glicosilación deseada identificando en primer lugar la estructura de glicano y determinando a continuación qué azúcares deben eliminarse con el fin de remodelar la estructura de glicano. Tal como se ha discutido en el presente documento, los azúcares que se van a eliminar determinarán qué enzimas de escisión se utilizarán y de esta manera, las etapas precisas del procedimiento de remodelación variarán dependiendo de la estructura de glicano primaria utilizada como el sustrato inicial. En la Figura 3 se muestra un esquema de ejemplo para remodelar una estructura de glicano comúnmente producida en células de mamífero. Se ha caracterizado bien la ruta biosintética de N-glicano en células de mamífero (revisado en Moremen, 1994, Glycobiology 4:113-125). Se han identificado muchas de las enzimas necesarias para la síntesis de glicano, y se han aislado líneas de células mutantes defectivas en esta ruta enzimática que incluyen las líneas de células de ovario de hámster chino (CHO) Lec23 (defectivas en alfa-glucosidasa I) y Lec18 (GlcNAc-TVIII novedosa). El modelo de glicosilación de los péptidos producidos por estas células mutantes está alterado con respecto a las células CHO normales. Tal como se discute en el presente documento, los defectos de la glicosilación en estas y otras células mutantes pueden aprovecharse con el fin de producir un péptido que carece de una estructura compleja de glicano. Por ejemplo, los péptidos producidos por células Lec23 carecen de restos de ácido siálico, y por tanto requieren menos manipulación enzimática con el fin de reducir la estructura de glicano a un núcleo de trimanosilo elemental o a Man3GlcNAc4. De esta manera, los péptidos producidos en estas células pueden servir como sustratos preferidos para la remodelación del glicano. Una persona normalmente experta en la técnica podría aislar o identificar otras líneas de células defectivas para la glicosilación basándose en procedimientos conocidos, por ejemplo, el procedimiento descrito en Stanley y col., 1990, Somatic Cell Mol. Genet., 16: 211-223. El uso de líneas de células defectivas para la glicosilación, unas identificadas y otras todavía sin identificar, se incluye en la invención a fin de generar sustratos peptídicos preferidos para los procedimientos de remodelación descritos en el presente documento.
Son numerosos los vectores de expresión útiles para expresar péptidos exógenos en células de mamíferos, y son bien conocidos de los expertos en la técnica. Muchos vectores de expresión de mamíferos están ahora comercialmente disponibles de compañías, incluyendo Novagen, Inc (Madison, WI), Gene Therapy Systems (San Diego, CA), Promega (Madison, WI), ClonTech Inc. (Palo Alto, CA), y Stratagene (La Jolla, CA), entre otras.
Existen algunas líneas de células de mamíferos que son particularmente adecuadas para expresar péptidos exógenos. Normalmente, las líneas de células de mamíferos originadas a partir de células tumorales que se han llegado a inmortalizar, es decir, que se pueden replicar en cultivo esencialmente de forma indefinida. Estas líneas de células incluyen, CHO (Ovario de hámster chino, por ejemplo, CHO-K1, ATCC Nº. CCL 61) y sus variantes, NS0 (mieloma de ratón), BNK, BHK 570 (ATCC Nº CRL 10314), BHK (ATCC Nº CRL 1632), Per.C6™ (células humanas inmortalizadas, Crucell N.V., Leiden, Países Bajos), COS-1 (ATCC Nº CRL 1650), COS-7 (ATCC Nº CRL 1651), HEK 293, células L de ratón, Líneas celulares de linfocitos T, células BW5147 y MDCK (riñón canino Madin-Darby), HeLa (ser humano), A549 (carcinoma de pulmón humano), 293 (ATCC Nº CRL 1573; Graham y col., 1977, Gen. Virol. 36 :59-72), BGMK (riñón de mono verde Buffalo), Hep-2 (carcinoma epidermoide de laringe humana), LLC-MK2 (Riñón de Mono Verde Africano), McCoy, NCI-H292 (carcinoma tubular mucoepidermoide pulmonar humano), RD (rabdomiosarcoma), Vero (riñón de Mono verde Africano), HEL (pulmón embriónico humano), Pulmón Fetal Humano-Chang, MRC5 (pulmón embriónico humano), MRHF (prepucio humano), y WI-38 (pulmón embriónico humano, y WI-38 (pulmón embriónico humano). En algunos casos, las células en las que se expresa el péptido terapéutico pueden ser células derivadas del paciente que se va a tratar, o pueden derivarse de otro mamífero relacionado o no relacionado. Por ejemplo, se pueden aislar células de fibroblastos procedentes de tejido de la piel de un mamífero, y cultivarse y transformarse in vitro. Esta tecnología está comercialmente disponible de Transkaryotic Therapies, Inc. (Cambridge, MA). Casi todas las líneas celulares actualmente utilizadas están disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y BioWhittaker (Walkersville, Maryland).
Las células de mamífero pueden transformarse con ADN utilizando cualquiera de las diversas técnicas que son bien conocidas en la materia. Dichas técnicas incluyen, transformación con fosfato de calcio (Chen y Okayama, 1988 ; Graham Y van der Eb, 1973; Corsaro y Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7:603), transfección con dextranodietilaminoetilo (DEAE) (Fujita y col., 1986; Lopata y col., 1984; Selden y col., 1986), electroporación (Neumann y col., 1982, ; Potter, 1988, ; Potter y col., 1984, ; Wong y Neuman, 1982 ), transfección de reactivo lípido catiónico (Elroy-Stein y Moss, 1990; Feigner y col., 1987; Rose y col., 1991; Whitt y col., 1990; Hawley-Nelson y col., 1993, Focus 15: 73; Ciccarone y col., 1993, Focus 15: 80), retroviral (Cepko y col., 1984; Miller y Baltimore, 1986; Pear y col., 1993; Austin y Cepko, 1990; Bodine y col., 1991; Fekete y Cepko, 1993; Lemischka y col., 1986; Turner y col., 1990; Williams y col., 1984; Miller y Rosman, 1989, BioTechniques 7: 980-90; Wang y Finer, 1996, Nature Med. 2:714-6), polibreno (Chaney y col, 1986; Kawai y Nishizawa, 1984), microinyección (Capecchi, 1980), y fusión de protoplastos (Rassoulzadegan y col., 1982; Sandri-Goldin y col., 1981; Schaffer, 1980), entre otros. En general, véase Sambrook y col. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York) y Ausubel y col. (2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York) para las técnicas de transformación
Recientemente, el sistema de baculovirus, popular para la transformación de células de insecto, se ha adaptado para la transformación estable de células de mamífero (véase, para la revisión, Koat y Condreay, 2002, Trends Biotechnol. 20: 173-180, y las referencias citadas en el anterior). Se da a conocer la producción de péptidos recombinantes en células de mamífero cultivadas, por ejemplo, en las Patentes de los estados unidos Nos 4.713.339, 4.784.950; 4.579.821; y 4.656.134. Varias compañías ofrecen servicios de transformación y cultivo de células de mamíferos, incluyendo Cell Trends, Inc., (Middletown, MD). Las técnicas para el cultivo de células de mamífero son bien conocidas en la técnica, y también se pueden encontrar en la publicación de Hauser y col. (Mammalian Cell Biotechnology, Walter de Gruyer, Inc.,Hawthorne, NY 1997) y Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, así como las referencias ciatadas en el presente documento.
D. Insecto
Las células de insecto, y en particular, las células de insecto cultivadas, expresan péptidos que tienen estructuras de glicano unidas a N que se sialilan raramente y comprenden normalmente residuos de manosa que pueden tener o no restos de fucosa adicionales unidos a los anteriores. En la Figura 7 se muestran ejemplos de tipos de estructuras de glicano presentes en péptidos producidas en células de insecto cultivadas y glicanos de manosa de los mismos.
Ha llegado a establecerse particularmente bien la expresión mediada por baculovirus en células de insecto para la producción de péptidos recombinantes (Altmann y col., 1999, Glycoconjugate J. 16: 109-123). Con respecto al plegado del péptido y al procesamiento posterior a la traducción, las células de insecto son solo secundarias a las líneas celulares de mamíferos. Sin embargo, tal como se ha señalado anteriormente, la N-glicosilación de los péptidos en células de insecto difiere en muchos aspectos de la N-glicosilación en células de mamífero particularmente en que las células de insecto generan con frecuencia estructuras de glicano truncadas que comprenden oligosacáridos que contienen exactamente tres o algunas veces solo dos restos de manosa. Estas estructuras pueden sustituirse adicionalmente con restos de fucosa.
De acuerdo con la presente invención, un péptido producido en una célula de insecto se puede remodelar in vitro para generar un péptido con la glicosilación deseada eliminando opcionalmente en primer lugar cualquier resto de fucosa sustituido utilizando una enzima fucosidasa adecuada. En los casos en los que el péptido comprende una estructura elemental de núcleo de trimanosilo tras la eliminación de los restos de fucosa, todo lo que se requiere a continuación es la adición in vitro de los azúcares adecuados a la estructura del núcleo de trimanosilo para generar un péptido que tenga la glicosilación deseada. En los casos donde el péptido puede contener solo dos restos de manosa en la estructura de glicano tras la eliminación de cualquier resto de fucosa, se puede añadir un tercer resto de manosa utilizando una enzima manosiltransferasa y una molécula donante adecuada tal como GDP-manosa, y posteriormente se añaden los restos adecuados para generar un péptido que tenga la glicosilación deseada.
Son bien conocidos en la técnica los protocolos para el uso de baculovirus para transformar células de insecto. Se han publicado algunos libros que proporcionan los procedimientos para el uso del sistema de baculovirus para expresar péptidos en células de insecto. Estos libros incluyen, pero no se limitan a, Richardson (Baculovirus Expression Protocols, 1998, Methods in Molecular Biology, Vol 39, Humana Pr), O’Reilly y co. (1994, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Univ Press), y King y Possee (1992, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall). Además, existen también publicaciones tales como Lucklow (1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4:564-572) y Miller (1993, Curr. Opin. Genet. Dev. 3: 97-101).
Se han presentado también muchas patentes relacionadas con los sistemas de expresión en baculovirus de proteínas extrañas. Estas patentes incluyen, la patente de los Estados Unidos Nº. 6.210.966 (Culture medium for insect cells lacking glutamine an contains ammonium salt [Medio de cultivo para células de insecto que carece de glutamina y contiene sal de amonio]), Patente de los Estados Unidos Nº 6.090.584 ((Use of BVACs (BaculoVirus Artificial Chromosomes) to produce recombinant peptides [Uso de BVAC (Cromosomas Artificiales de BaculoVirus) para producir péptidos recombinantes]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.871.986 ((Use of a baculovirus to express a recombinant nucleic acid in a mammalian cell [Uso de un baculovirus para expresar un ácido nucleico recombinante en una célula de mamífero]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.759.809 (Methods of expressing peptides in insect cells and methods of killing insects [Procedimientos para expresar péptidos en células de insecto y procedimientos para matar insectos]), Patente de los Estados unidos Nº 5.753.220 (Cysteine protease gene defective baculovirus, process for its production, and process for the production of economic peptide by using the same [Baculovirus defectivo en el gen de la cisteína proteasa, procedimiento para su producción, y procedimiento para la producción económica de péptidos utilizando los mismos]), Patente de los Estados Unidos. 5.750.383 (Baculovirus cloning system [Sistema de clonación de baculovirus]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.731.182 (Non-mammalian DNA virus to express a recombinant nucleic acid in a mammalian cel [Virus de ADN no de mamífero para expresar un ácido nucleico recombinante en una célula de mamífero]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.728.580 (Methods and culture media for inducing single cell suspension in insect cell lines [Procedimientos y medios de cultivo para inducir una suspensión de células individuales en líneas celulares de insecto]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.583.023 (Modified baculovirus, its preparation process and its application as a gene expression vector [Baculovirus modificados, su procedimiento de preparación y su aplicación como un vector de expresión génica]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.571.709 (Modified baculovirus and baculovirus expression vectors [Baculovirus modificados y vectores de expresión de baculovirus]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.521.299 (Oligonucleotides for detection of baculovirus infection [Oligonucleótidos para la detección de la infección por baculovirus]), Patente de los Estados Unidos Nº 5,516,657 ((Baculovirus vectors for expression of secretory and membranebound peptides [Vectores de baculovirus para la expresión de péptidos secretores y unidos a membrana]), Patente de los Estados Unidos 5.475.090 (Gene encoding a peptide which enhances virus infection of host insects [Gen que codifica un péptido que potencia la infección por virus de insectos hospedadores]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.472.858 (Production of recombinant peptides in insect larvae [Producción de péptidos recombinantes en larvas de insectos]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.348.886 (Method of producing recombinant eukaryotic viruses in bacteria [Procedimiento para producir virus eucariotas recombinantes en bacterias]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.322.774 (Prokaryotic leader sequence in recombinant baculovirus expression system [Secuencia líder procariota en un sistema de expresión de baculovirus recombinante]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.278.050 (Method to improve the efficiency of processing and secretion of recombinant genes in insect systems [Procedimiento para mejorar la eficacia de procesamiento y la secreción de genes recombinantes en sistemas de insectos]), Patente de los estados unidos Nº 5.244.805 (Baculovirus expression vectors [Vectores de expresión de baculovirus]), Patente de los estados Unidos Nº
5.229.293 (Recombinant baculovirus [Baculovirus recombinante]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.194.376 (Baculovirus expression system capable of producing recombinant peptides at high levels [Sistema de expresión de baculovirus capaz de producir péptidos recombinantes a altos niveles]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.179.007 (Method and vector for the purification of recombinant peptides [Procedimiento y vector para la purificación de péptidos recombinantes]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.169.784 (Baculovirus dual promoter expression vector [Vector de expresión del promotor doble de baculovirus]), Patente de los Estados unidos Nº 5.162.222 (Use of baculovirus early promoters for expression of recombinant nucleic acids in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses [Uso de promotores tempranos de baculovirus en la expresión de ácidos nucleicos recombinantes en células de insecto transformadas de forma estable o baculovirus recombinantes]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.155.037 (Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of recombinant nucleic acids in insect systems [Secuencias señal de insectos útiles para mejorar la eficacia del procesamiento y la secreción de ácidos nucleicos recombinantes en sistemas de insectos]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.147.788 (Baculovirus vectors and methods of use [Vectores de baculovirus y procedimientos de uso]), Patente de los Estados Unidos Nº 5.110.729 (Method of producing peptides using baculovirus vectors in cultured cells [Procedimiento para la producción de péptidos utilizando vectores de baculovirus en células cultivadas]), Patente de los Estados Unidos Nº. 5.077.214 ((Use of baculovirus early promoters for expression of recombinant genes in stably transformed insect cells [Uso de promotores tempranos de baculovirus para la expresión de genes recombinantes en células de insecto transformadas de manera estable]), Patente de los Estados Unidos Nº
5.023.328 (Lepidopteran AKH signal sequence [Secuencia señal de AKH de Lepidópteros]), y Patentes de los Estados Unidos Nos 4.879.236 y 4.745.051 (Method for producing a recombinant baculovirus expression vector [Procedimiento para producir un vector de expresión de baculovirus recombinante]).
Se están usando en la actualidad varias líneas celulares procedentes de insectos de varias especies diferentes para la expresión de péptidos, y estas líneas son bien conocidas de los expertos en la técnica. Las líneas celulares de insecto de interés incluyen, pero no se limitan a, células de insecto de dípteros y lepidópteros en general, Sf9 y sus variantes (palomilla del maíz de Spodoptera frugiperda), Estigmene acrea, Trichoplusia ni, Bombyx mori, Malacosoma disstri, líneas kc1 y SL2 de Drosophila entre otras, y mosquito.
E. Plantas
Las células vegetales como productoras de péptidos presentan un conjunto diferente de características. Mientras que los glicanos unidos a N producidos en plantas comprenden una estructura de núcleo de trimanosilo, esta estructura de pentasacárido puede comprender algunos azúcares diferentes adicionales tal como se muestra en Figura 6. Por ejemplo, en un caso, la estructura de núcleo de trimanosilo está sustituida por un resto de xilosa unido a β1,2 y un resto de fucosa unido a α1,3. Además, las células vegetales pueden producir también una estructura Man5GlcNAc2. Los péptidos producidos en células vegetales son frecuentemente muy antigénicos como resultado de la presencia del núcleo de α1,3 fucosa y xilosa en la estructura de glicano y se aclaran rápidamente a partir del torrente sanguíneo cuando se introducen en un mamífero debido a la ausencia de restos de ácido siálico de los extremos. Por tanto, a no ser que estos péptidos se remodelen utilizando los procedimientos proporcionados en el presente documento, se consideran por lo general inadecuados como agentes terapéuticos en mamíferos. Aunque se ha encontrado que algunos anticuerpos monoclonales expresados en células vegetales no son inmunógenos en ratones, es probable que las cadenas de glicano no sean inmunógenas debido a que se pueden soterrar en la región Fc en estos anticuerpos (Chargelegue y col., 2000, Transgenic Res. 9(3): 187-194).
Siguiendo las directrices proporcionadas en el presente documento, es ahora posible generar un péptido producido en una célula vegetal en el que un número creciente de estructuras de glicano presentes en el anterior comprenden una estructura elemental de núcleo de trimanosilo, o una estructura Man3GlcNAc4. Esto se lleva a cabo escindiendo cualquier azúcar adicional in vitro utilizando una combinación de glicosidasas adecuadas, que incluyen fucosidasas, hasta que se llega a la estructura elemental de núcleo de trimanosilo o a la estructura de Man3GlcNAc4. Estas reacciones de escisión deben incluir también la eliminación de cualquier resto de fucosa o xilosa de las estructuras a fin de disminuir la antigenicidad del péptido final cuando se introduce en un mamífero. Se conocen en la técnica células vegetales que tienen mutaciones que inhiben la adición de restos de fucosa y xilosa a la estructura del núcleo de trimanosilo (von Schaewen y col., 1993, Plant Physiology 102: 1109-1118). Se contempla por la invención el uso de estas células para producir péptidos que tienen glicanos que carecen de fucosa y xilosa. Tras la producción del núcleo elemental de trimanosilo o de la estructura de Man3GlcNAc4, se pueden añadir a continuación azúcares adicionales al anterior hasta llegar a un péptido que tenga la glicosilación deseada que sea por tanto adecuado para el uso terapéutico en un mamífero.
Las plantas transgénicas son consideradas por muchos autores que son el sistema de expresión de elección para péptidos farmacéuticos. Potencialmente, las plantas pueden proporcionar una fuente más barata de péptidos recombinantes. Se ha estimado que los costes de producción de los péptidos recombinantes en plantas podrían ser entre 10 y 50 veces inferiores que los de los mismos péptidos en E. coli. Aunque existen ligeras diferencias en la utilización de codones en vegetales en comparación con animales, estas se pueden compensar ajustando las secuencias de ADN recombinante (véanse, Kusnadi y col., 1997, Biotechnol. Bioeng. 56: 473-484; Khoudi y col., 1999, Biotechnol. Bioeng. 135-143; Hood y col., 1999, Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147). Además, la síntesis de péptidos, la secreción y la modificación posteriores a la traducción son muy similares en plantas y animales, con solo pequeñas diferencias en la glicosilación en plantas (véase, Fischer y col., 2000, J. Biol. Regul. Homest. Agents 14: 83-92). A continuación, los productos procedentes de plantas transgénicas es menos probable que resulten contaminados por patógenos animales, toxinas microbianas y secuencias oncogénicas.
Es bien conocida en la técnica la expresión de péptidos recombinantes en células vegetales. Además de las plantas transgénicas, los péptidos se pueden producir también en cultivos celulares de plantas transgénicas (Lee y col., 1997, Mol. Cell. 7: 783-787), y plantas no transgénicas inoculadas con virus vegetales recombinantes. Se han publicado algunos libros que describen protocolos para la transformación genética de células vegetales: Potrykus (1995, Gene transfer to plants, Springer, Nueva York), Nickoloff (1995, Plant cell electroporation and electrofusion protocols, Humana Press, Totowa, Nueva York) y Draper (1988, Plant genetic transformation, Oxford Press, Boston).
Se utilizan en la actualidad varios procedimientos para transformar de manera estable células vegetales con material genético recombinante. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, transformación en Agrobacterium Bechtold y Pelletier, 1998; Escudero y Hohn, 1997; Hansen y Chilton, 1999; Touraev y col., 1997), biolísticos (microproyectiles) (Finer y col., 1999; Hansen y Chilton, 1999; Shilito, 1999), electroporación de protoplastos (Fromm y col., 1985, Ou-Lee y col., 1986; Rhodes y col., 1988; Saunders y col., 1989; Trick y col., 1997), tratamiento con polietilenglicol (Shilito, 1999; Trick y col., 1997), microinyección en plantas (Leduc y col., 1996; Zhou y col., 1983), inhibición de semillas (Trick y col., 1997), haz de láser (1996), y limaduras de carburo de silicio (Thompson y col., 1995; Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nº. 20020100077).
Muchos tipos de plantas son adecuados para la transformación y expresión de péptidos exógenos. Las plantas de particular interés para expresar los péptidos que se van a usar en el procedimiento de remodelación de la invención Arabidopsis thalliana, colza (Brassica spp.; Ruiz y Blumwald, 2002, Planta 214: 965-969)), soja (Glycine max), girasol (Helianthus unnuus), aceite de palma (Elaeis guineeis), maní (cacahuete, Arachis hypogaea; Deng y col.,
2001, Cell. Res. 11:156-160), coco (Cocus nucifera), ricino (Ricinus communis), cártamo (Carthamus tinctorius), mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba), coriandro, (Coriandrum sativum), calabaza (Cucurbita maxima; Spencer y Snow, 2001, Heredity 86(Pt 6):694-702), lino/linaza (Linum usitatissimum; Lamblin y col., 2001, Physiol Plant 112:223-232), nuez de Brasil (Bertholletia excelsa), jojoba (Simmondsia chinensis), maíz (Zea mays; Hood y col., 1999, Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147; Hood y col., 1997, Mol. Breed. 3: 291-306; Petolino y col., 2000, Transgenic Research 9:1-9), alfalfa (Khoudi y col., 1999, Biotechnol. Bioeng. 64: 135-143), tabaco (Nicotiana tabacum; Wright y col., Transgenic Res. 10:177-181; Frigerio y col., 2000, Plant Physiol. 123: 1483-1493; Cramer y col., 1996, Ann. New York Acad. Sci. 792:62-8-71; Cabanes-Macheteau y col., 1999, Glycobiology 9:365-372; Ruggiero y col., 2000, FEBS Lett. 469: 132-136), canola (Bai y col., 2001, Biotechnol. Prog. 17: 168-174; Zhang y col., 2000, J. Anim. Sci.
78: 2868-2878)), patata (Tacket y col., 1998, J. Infect. Dis. 182: 302-305; Richter y col., 2000, Nat. Biotechnol. 18: 1167-1171; Chong y col., 2000, Transgenic Res. 9:71-78), alfalfa (Wigdorovitz y col., 1999, Virology 255: 347-353), Guisante (Pisum sativum; Perrin y col., 2000, Mol. Breed. 6: 345-352), arroz (Oryza sativa ; Stoger y col., 2000, Plant Mol. Biol. 42:583-590), algodón (Gossypium hirsutum; Kornyeyev y col., 2001, Physiol Plant 113: 323-331), cebada (Hordeum vulgare; Petersen y col., 2002, Plant Mol Biol 49:45-58); trigo (Triticum spp.; Pellegrineschi y col., 2002, Genome 45:421-430) y judía (Vicia spp.; Saalbach y col., 1994, Mol Gen Genet 242: 226-236).
Si se desea la expression del ácido nucleico recombinante en una planta completa en lugar de en células cultivadas, las células vegetales se transforman en primer lugar con el ADN que codifica el péptido, tras lo cual, la planta se regenera. Esto implica procedimientos de cultivo de tejidos que se optimizan normalmente para cada especie de planta. Se conocen bien ya en la técnica para muchas especies los protocolos para regenerar plantas. Además, un experto en la técnica puede desarrollar protocolos para otras especies utilizando la experimentación rutinaria. Están disponibles numerosos manuales de laboratorio que describen procedimientos para la regeneración de plantas, incluyendo Smith (2000, Plant tissue culture: techniques and experiments, Academic Press, San Diego), Bhojwani y Razdan (1996, Plant tissue culture: theory and practice, Elsevier Science Pub., Amsterdam), Islam (1996, Plant tissue culture, Oxford & IBH Pub. Co., New Delhi, India), Dodds y. Roberts ( 1995, Experiments in plant tissue culture, Nueva York : Cambridge University Press, Cambridge Inglaterra), Bhojwani (Plant tissue culture: applications and limitations, Elsevier, Amsterdam, 1990), Trigiano y Gray (2000, Plant tissue culture concepts and laboratory exercises, CRC Press, Boca Raton, Fla), y Lindsey (1991, Plant tissue culture manual: fundamentals and applications, Kluwer Academic, Boston).
Aunque la purificación de péptidos recombinantes a partir de plantas puede ser potencialmente costosa, se han desarrollado algunos sistemas que minimizan estos costes. Un procedimiento dirige el péptido sintetizado al endospermo de la semilla desde el cual este puede extraerse fácilmente (Wright y col., 2001, Transgenic Res. 10:177-181, Guda y col., 2000, Plant Cell Res. 19: 257-262; y la Patente de los Estados Unidos Nº 5.767.379). Una solución alternativa es la extracción simultánea del péptido recombinante con productos vegetales convencionales tales como almidón, harina o aceite. En el aceite de colza, un péptido de fusión de oleosina-hurudina cuando se expresa en la planta, se une al cuerpo oleoso de la semilla, y se puede extraer de la semilla de la planta junto con el aceite (Parmenter, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 1167-1180; Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.650.554, 5.792.922,
5.948.682 y 6.288.304, y la Solicitud de los Estados Unidos 2002/0037303). En una variación sobre esta solución, la oleosina se fusiona a un péptido para la expresión simultánea exógena del péptido de interés (Patente de los estados Unidos Nº 5.856.452).
La expresión de péptidos recombinantes en plástidos vegetales, tales como el cloroplasto, genera péptidos que no tienen estructuras de glicano unidas a los anteriores, de manera similar a lo que sucede en los procariotas. Sin embargo, el rendimiento de dichos péptidos es muy grande cuando se expresa en estos orgánulos de las células vegetales, y de esta manera, este tipo de sistema de expresión puede tener ventajas sobre otros sistemas. Para una revisión general de la tecnología de expresión de plástidos de péptidos exógenos en plantas superiores, véase Hager y Beck (2000, Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 302-310, y las referencias citadas en los anteriores. La expresión de plástidos ha sido particularmente satisfactoria en tabaco (véase, por ejemplo, Staub y col., 2000, Nat. Biotechnol. 18: 333-338).
F. Animales transgénicos
Se puede llevar a cabo la introducción de un ADN recombinante en el huevo fertilizado de un animal (por ejemplo, un mamífero) utilizando cualquier tipo de técnica normalizada en la tecnología de animales transgénicos. Véase, por ejemplo, Hogan y col., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986; y Patente de los Estados Unidos Nº 5.811.634. De forma más común, el ADN recombinante se introduce en el embrión por medio de una inyección pronuclear (Gordon y col., 1980, PNAS 77: 7380-7384; Gordon y Ruddle, 1981, Science 214: 1244-1246; Brinster y col., 1981, Cell 27: 223-231; Costantini y Lacy, 1981, Nature 294: 92-94). La microinyección tiene la ventaja de ser aplicable a una amplia variedad de especies. Se puede transformar también el preimplante de embriones con retrovirus (Jaenisch y Mintz, 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71: 1250-1254; Jaenisch y col., 1976, Hamatol Bluttransfus. 19: 341-356; Stuhlmann y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 7151-7155). La transformación mediada por retrovirus tiene la ventaja de añadir copias individuales del ácido nucleico recombinante a la célula, pero produce un grado elevado de mosaicismo. De forma más reciente, se han utilizado técnicas mediadas por embriocitoblastos (Gossler y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 9065-9069), transferencia de segmentos cromosómicos completos (Lavitrano y col., 1989, Cell 57: 717-723), y transfección de gametos junto con fertilización in vitro (Lavitrano y col., 1989, Cell 57: 717723). Se han publicado algunos manuales de procedimientos de laboratorio que dan a conocer estas técnicas Cid-Arregui y García-Carrancá (1998, Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols, Springer, Berlín), Clarke (2002, Transgenesis Techniques: Principles and Protocols, Humana Press, Totowa, NJ), y Pinkert (1994, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, San Diego).
Una vez que se introduce el ADN recombinante en el huevo, el huevo se incuba durante un corto periodo de tiempo y a continuación se transfiere a un animal pseudoembarazado de la misma especie a partir de la cual se obtuvo el huevo (Hogan y col., más arriba). En el caso de mamíferos, se inyectan normalmente 125 huevos por experimento, aproximadamente dos tercios de los cuales sobrevivirán al procedimiento. Se transfieren veinte huevos viables a un mamífero pseudoembarazado, cuatro de diez de los cuales se desarrollaran en progenie viva. Normalmente, 10-30% de la progenie (en el caso de ratones) transporta el ADN recombinante.
Aunque se puede utilizar el animal completo como un sistema de expresión para los péptidos de la invención, en una realización preferida, el péptido exógeno se acumula en productos del animal, a partir de los cuales se puede cosechar, sin lesionar al animal. En las realizaciones preferidas, el péptido exógeno se acumula en leche, huevos, pelo, sangre y orina.
Si el péptido recombinante está previsto para su acumulación en la leche del animal, los mamíferos adecuados son rumiantes, ungulados, mamíferos domesticados, y animales de granja. Los animales particularmente preferidos son cabras, ovejas, camellos, vacas, cerdos, caballos, bueyes, y llamas. Son bien conocidos los procedimientos para generar vacas transgénicas que acumulan un péptido recombinante en su leche; véanse Newton (1999, J. Immunol. Methods 231: 159-167), Ebert y col. (1991, Biotechnology 9: 835-838), y Patentes de los Estados Unidos Nos 6.210.736, 5.849.992, 5.843.705, 5.827.690, 6.222.094. La generación de animales transgénicos que producen un péptido recombinante deseado se encuentra comercialmente disponible de GTC Biotherapeutics, Framingham, MA.
Si el péptido recombinante se ha de acumular en huevos, entre las aves apropiadas se incluyen pollos, gansos, pavos. Otros animales de interés incluyen otras especies de aves, reptiles y anfibios. La introducción de ADN recombinante en pollos mediante transformación retroviral es bien conocida en la tácnica: Thoraval y col. (Transgenic Research 4; 369-376, 1995) Bosselman (Science 234: 533-535, 1989), Petropoulos y col (J. Virol. 66; 3391-3397, 1992), Patente US n. 5.162,251. También se ha conseguido la tranformación exitosa de pollos con ADN recombinante, en la cual se introduce ADN en células blastodermales y las células blastodermales son introducidas en embriones: Brazolot y col. (Mol Reprod. Dev. 30: 304-312, 1991), Fraser y col. (Int. J. Dev. Biol. 37:381-385, 1993) y Petitte y col. (Development 108:185-189, 1990) Se ha desarrollado tecnología de alto rendimiento para evaluar si los pollos transgénicos expresan el péptdo deseado (Harvey ycol., Poult Sci. 81:202-212, 2002, Patente US n. 6,423,488). Usando transformación retroviral de gallinas con ADN recombinante, se acumuló beta-lactamasa exógena en clara de huevos de gallina (Harvey y col. 2002, Nat. Biotechnol 20(4):396-399, 2002). La producción de gallinas productoras de péptidos exógenos en huevos está comercialmente disponible en AviGenics, Inc. Athens, Ga.
G. Bacterias
Los péptidos expresados de forma recombinante producidos en bacterias no están generalmente glicosilados. Sin embargo, son cada vez más evidentes los sistemas de bacterias capaces de glicosilar péptidos, y por tanto, es probable que se puedan producir péptidos recombinantes glicosilados en bacterias en el futuro.
Se conocen en la técnica numerosos sistemas de expresión bacteriana. Las especies bacterianas preferidas incluyen E. coli y especies de Bacillus.
Es bien conocida en la técnica la expresión de péptidos recombinantes en E. coli. Se encuentran protocolos de sistemas de expresión basados en E. coli en la Solicitud de los Estados Unidos Nº 20020064835, las Patentes de los Estados Unidos Nos 6.245.539, 5.606.031, 5.420.027, 5.151.511, y el documento RE33.653, entre otros. Los procedimientos para transformar bacterias incluyen cloruro de calcio (Cohen y col., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 69: 2110-2114; Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166:557-580; Mandel y Higa, 1970, J. Mol. Biol. 53: 159-162) y electroporación (Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), y aquellos descritos en Sambrook y col., 2001 (más arriba). Para una revisión de los protocolos de laboratorio sobre transformación microbiana y sistemas de expresión, véase Saunders y Saunders (1987, Microbial Genetics Applied to Biotechnology : Principles and Techniques of Gene Transfer and Manipulation, Croom Helm, London), Pühler (1993, Genetic Engineering of Microorganisms, Weinheim, Nueva York), Lee y co., (1999, Metabolic Engineering, Marcel Dekker, Nueva York), Adolph (1996, Microbial Genome Methods, CRC Press, Boca Raton), y Birren y Lai (1996, Nonmammalian Genomic Analysis : A Practical Guide, Academic Press, San Diego),
Para una revisión general sobre la bibliografía de la expresión de péptidos en E. coli, véase (2001, Mol. Biotechnol.
19:
251-267). Algunas compañías ofrecen ahora cepas bacterianas seleccionadas para la expresión de péptidos de mamíferos, tales como las cepas Rosetta TM de E. coli (Novagen, inc., Madison, WI; con un aumento de expresión de codones eucarióticos no utilizados normalmente en células bacterianas, y una potenciación en la formación del enlace disulfuro
H.
Genomanipulación celular
Será evidente a partir de la presente divulgación que cuánto más uniforme sea el material de partida producido por una célula, más eficaz será la generación in vitro de grandes cantidades de péptidos que tengan la glicosilación deseada. De esta manera, la genomanipulación de las células hospedadoras para producir péptidos uniformemente glicosilados como material de partida de las reacciones enzimáticas in vitro dadas a conocer en el presente documento proporciona una significativa ventaja sobre el uso de un material de partida de péptidos que tengan un conjunto heterogéneo de estructuras de glicano unidas al anterior. Un material de partida de péptido preferido para uso en la presente invención es un péptido que tiene principalmente moléculas de glicano que consisten únicamente en una estructura elemental de núcleo de trimanosilo. Otro material de partida preferido es Man3GlcNAc4. Tras el procedimiento de remodelación, los péptidos preferidos proporcionarán un aumento de la cantidad mayor de péptidos que tengan la glicosilación deseada, y de esta manera, una eficacia clínica mejorada. Sin embargo, otro material de partida de glicano es también adecuado para el uso en los procedimientos descritos en el presente documento, en que por ejemplo, se puede reducir fácilmente, in vitro, un alto contenido de glicanos de manosa a estructuras elementales de núcleos de trimanosilo utilizando una serie de manosidasas. Tal como se describe en otra parte en el presente documento, también se puede usar otro material de partida de glicano, con la condición de que sea posible escindir todos los restos de azúcar extraños de tal manera que se genera una estructura elemental de núcleo de trimanosilo o Man3GlcNAc4. De esta manera, el fin de usar células genomanipuladas para la producción de los péptidos de la presente invención es generar péptidos que tengan una estructura de glicano tan uniforme como sea posible unida a la anterior, en la que la estructura de glicano se puede remodelar in vitro para generar un péptido que tenga la glicosilación deseada. Esto dará como resultado una drástica reducción en los costes de producción de estos péptidos. Debido a que los glicopéptidos producidos utilizando esta metodología tendrán predominantemente la misma estructura de glicano unida a N, el protocolo de modificación posterior a la producción puede normalizarse y optimizarse para producir una mayor consistencia entre los lotes del producto final. Como resultado, los productos finales de la cadena completados pueden ser menos heterogéneos que aquellos que se encuentran actualmente disponibles. Los productos tendrán una vida media biológica y bioactividad aumentadas en comparación con los productos de la técnica anterior. De forma alternativa, si se desea, se puede utilizar la invención para introducir una heterogeneidad limitada y específica, por ejemplo, seleccionando las condiciones de reacción que dan como resultado la adición diferencial de restos de azúcares.
De forma preferible, aunque no como requerimiento rígido, la célula genomanipulada es aquella que produce péptidos que tienen estructuras de glicano comprendidas principalmente por una estructura elemental de núcleo de trimanosilo o Man3GlcNAc4. Como mínimo, la proporción de estas estructuras preferidas producidas por la célula genomanipulada debe ser suficiente para dar como resultado un péptido que tenga una glicosilación deseada tras el protocolo de remodelación.
En general, se puede modificar cualquier tipo de célula eucariota para que se convierta en una célula hospedadora de la presente invención. En primer lugar, se determina el modelo de glicosilación de los glicopéptidos endógenos y recombinantes producidos por el organismo con el fin de identificar adiciones/eliminaciones adecuadas de actividades enzimáticas que den como resultado la producción de glicopéptidos elementales de núcleos de trimanosilo o glicopéptidos de Man3GlcNAc4. Esto implicará normalmente actividades de eliminación que utilizan glicopéptidos de trimanosilo como sustratos para la reacción de la glicosiltransferasa y actividades enzimáticas de inserción que degradan los glicanos unidos a N más complejos para producir cadenas más cortas. Además, las células genomanipuladas pueden producir altas contenidos de glicanos de manosa, que pueden escindirse mediante la manosidasa para producir las estructuras de glicano de partida deseadas. La manosidasa puede ser activa in vivo en la célula (es decir, la célula puede genomanipularse para producirla), o se puede utilizar en las reacciones producción posteriores in vitro.
Son bien conocidas las técnicas para modificar genéticamente las células hospedadoras para alterar el perfil de glicosilación de los péptidos expresados. Véanse, por ejemplo, Altmann y col. (1999, Glycoconjugate J. 16: 109123), Ailor y col. (2000, Glycobiology 10(8): 837-847), Jarvis y col., (Conferencia In vitrogen, marzo de, 1999, resumen), Hollister y Jarvis, (2001, Glycobiology 11(1): 1-9), y Palacpac y col., (1999, PNAS USA 96: 4697), Jarvis y col., (1998. Curr. Opin. Biotechnol. 9: 528-533), Gerngross (Publicación de Patente de los Estados Unidos Nº. 20020137134), todos los cuales dan a conocer las técnicas para “asimilar a sistemas de expresión de mamíferos” sistemas de expresión de células de insecto o vegetales transfectando células de insecto o vegetales con genes de la glicosiltransferasa.
Existen también técnicas para alterar genéticamente el perfil de la glicosilación de los péptidos expresados en E. coli. E. coli se ha genomanipulado con diversas glicosiltransferasas procedentes de la bacteria Miseria meningitidis y Azorhizobium para producir oligosacáridos in vivo (Bettler y col., 1999, Glycoconj. J. 16: 205-212). Una E. coli que se ha genomanipulado para expresar en exceso el gen IgtA de la β1,3 N acetil glucoaminiltransferasa de Miseria meningitidis glicosilará eficazmente la lactosa exógena (Priem y col., 2002, Glycobiology 12: 235-240).
También se han genomanipulado células de hongos para producir glicosiltransferasas exógenas (Yoshida y col., 1999, Glycobiology, 9(1):53-58; Kalsner y col., 1995, Glycoconj. J. 12:360-370; Schwientek y Ernst, 1994, Gene 145 (2):299-303; Chiba y col., 1995, Biochem J. 308:405-409).
De esta manera, en un aspecto, la presente invención proporciona una célula que glicosila una población de glicopéptidos de tal manera que una proporción de los glicopétidos producidos de esta forma tiene un núcleo elemental de trimanosilo o una estructura Man3GlcNAc4. De forma preferible, la célula produce un péptido que tiene una estructura de glicano comprendida únicamente por un núcleo elemental de trimanosilo. Como mínimo, la proporción de péptidos que tienen un núcleo elemental de trimanosilo o una estructura Man3GlcNAc4 es suficiente para dar como resultado péptidos que tengan una glicosilación deseada tras el procedimiento de remodelación. La célula ha introducido en sí misma una o más unidades de expresión de ácidos nucleicos heterólogos, cada una de las cuales puede comprender uno o más glicanos complejos unidos a N o puede ser simplemente un glicano con un alto contenido de manosa.
La célula puede ser cualquier tipo de célula y es preferiblemente una célula eucariota. La célula puede ser una célula de mamífero tal como de ser humano, ratón, rata, conejo, hámster u otro tipo de célula de mamífero. Cuando la célula es una célula de mamífero, la célula de mamífero puede derivarse o estar incluida en un mamífero transgénico no humano en el que la célula en el mamífero codifica el glicopéptido deseado y una variedad de enzimas glicosilantes y glicosidasa según sea necesario para la producción de las moléculas de glicopéptido deseadas. Además, la célula puede ser una célula de hongo, preferiblemente, una célula de levadura, o la célula puede ser una célula de insecto o de planta. De forma similar, cuando la célula es una célula vegetal, la célula vegetal puede derivarse o estar incluida en una planta transgénica, en la que la planta codifica el glicopéptido deseado y una variedad de enzimas glicosilantes y glicosidasa, según sea necesario para la producción de las moléculas de glicopéptido deseadas.
En algunas realizaciones, la célula hospedadora puede ser una célula eucariota que expresa una o más enzimas glicosiltransferasa heterólogas y/o una o más enzimas glicosidasas heterólogas, en las que la expresión de un glicopéptido recombinante en la célula hospedadora da como resultado la producción de un glicopéptido recombinante que tienen una estructura elemental de trimanosilo como la estructura primaria de glicano unida al anterior
En algunas realizaciones, la enzima glicosiltransferasa heteróloga útil en la célula se puede seleccionar de un grupo que consiste en cualquier enzima glicosiltransferasa conocida incluida por ejemplo, en la lista de familias de glicosiltransferasas disponible en Taniguchi y col. (2002, Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes, Springer, Nueva York).
En otras realizaciones, se puede seleccionar la enzima glicosilasa heteróloga de un grupo que consiste en manosidasa 1, manosidasa 2, manosidasa 3, y otras manosidasa, que incluyen, pero no se limitan a, manosidasas microbianas. Se proporciona en otra parte en el presente documento una divulgación adicional con respecto a las enzimas útiles en la presente invención.
En otras realizaciones adicionales, la célula hospedadora puede ser una célula eucariota en la que se han activado una o más enzimas de glicosilación endógenas y una o más enzimas glicosidasa endógenas de tal manera que la expresión de un glicopéptido recombinante en la célula hospedadora da como resultado la producción de un glicopéptido recombinante que tiene una estructura elemental de trimanosilo como la estructura primaria de glicano unida al anterior.
En las realizaciones adicionales, la célula hospedadora puede expresar enzimas glicosiltransferasa heterólogas y/o enzimas glicosidasa aunque, al mismo tiempo, una o más enzimas glicosiltransferasa endógenas y/o enzimas glicosidasa estén inactivadas. Las enzimas glicosiltransferasa endógenas y/o las enzimas glicosidasa pueden inactivarse utilizando cualquier técnica conocida por los expertos en la materia, incluyendo, pero sin limitarse a, técnicas de sentido contrario y técnicas que implican la inserción de ácidos nucleicos en el genoma de la célula hospedadora. En algunas realizaciones, se pueden seleccionar las enzimas endógenas de un grupo que consiste en GnT-I, una selección de manosidasas, xilosiltransferasa, núcleo de α1,3 fucosiltransferasa, y serina/treonina Omanosiltransferasas.
De forma alternativa, se puede aprovechar un sistema de expresión que glicosila naturalmente péptidos de tal manera que los glicanos unidos a N son predominantemente de tipo núcleo de trimanosilo, o del tipo Man3GlcNAc4. Un ejemplo de un tipo de célula que produce núcleos de trimanosilo es el de las células Sf9. Se pueden identificar otros de tales sistemas de expresión analizando glicopéptidos que se expresan de forma natural o recombinante en células y seleccionando aquellos que presentan características de glicosilación deseadas. La invención debe construirse para incluir cualquiera y todas las mencionadas células para la producción de los péptidos de la presente invención.
V. Purificación de péptidos glicoconjugados y/o remodelados con glicano
Si la glicoproteína modificada se produce intracelularmente o se secreta, como primera etapa, los residuos de material particulado, ya sean las células hospedadoras o fragmentos lisados, se eliminan por ejemplo mediante centrifugación o ultrafiltración; opcionalmente, la proteína se puede concentrar con un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, seguido por la separación de la variante del péptido de otras impurezas mediante una o más etapas seleccionadas entre cromatografía de inmunoafinidad, fraccionamiento en columna de intercambio iónico (por ejemplo, en dietilaminoetilo (DEAE) o matrices que contienen grupos carboximetilo o sulfopropilo). Cromatografía en Blue-Sefarosa, CN Blue-Sefarosa, MONO-Q, MONO-S, lentil lectina-Sefarosa, WGASefarosa, Con A-Sefarosa, Éter Toyopearl, Butil Toyopearl, fenil Toyopearl, o proteína A Sefarosa, Cromatografía en SDS-PAGE, cromatografía en gel de sílice, cromatofocalización, HPLC en fase inversa (RP-HPLC), filtración en gel utilizando, por ejemplo, un tamiz molecular de Sephadex o cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía en columnas que se unen selectivamente al péptido, y etanol, pH o precipitación con sulfato de amonio, filtración en membrana y diversas técnicas.
Los péptidos modificados producidos en el cultivo se aíslan normalmente mediante extracción inicial de células, enzimas, etc., seguida por una o más concentraciones, desalación, intercambio iónico en disolución acuosa, o etapas de cromatografía de exclusión por tamaño. Adicionalmente, la glicoproteína modificada puede purificarse mediante cromatografía de afinidad. A continuación, se puede emplear HPLC para las etapas finales de la purificación.
Se puede incluir un inhibidor de la proteasa, por ejemplo, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) en cualquiera de las anteriores etapas para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de los contaminantes accidentales.
En otra realización, los sobrenadantes del sistema que producen el péptido modificado de la invención se concentran en primer lugar utilizando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras la etapa de concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender un ligando para el péptido, una lectina o una molécula de anticuerpo unida a un soporte adecuado. De forma alternativa, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos DEAE colgantes. Las matrices adecuadas incluyen acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa, u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. De forma alternativa, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren particularmente grupos sulfopropilo.
A continuación, se puede utilizar una o más etapas de RP-HPLC que emplean medios de RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes para purificar adicionalmente una composición de un péptido variante. Se pueden emplear alguna o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una glicoproteína modificada homogénea.
El péptido modificado de la invención resultante de una fermentación a gran escala se puede purificar mediante procedimientos análogos a los dados a conocer por Urdal y col., J Chromatog. 296: 171 (1984). Esta referencia describe dos etapas de RP-HPLC secuenciales para la purificación de la IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC preparativa. De forma alternativa, se pueden utilizar técnicas tales como la cromatografía de afinidad para purificar la glicoproteína modificada
VI. Péptidos preferidos y ácidos nucleicos que codifican los péptidos preferidos
La presente invención incluye ácidos nucleicos aislados que codifican diversos péptidos y proteínas, y moléculas similares o sus fragmentos. Dichos péptidos incluyen el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), el interferón alfa humano (IFN-alfa), el interferón beta humano (IFN-beta), el Factor VII humano (Factor VII), el Factor IX humano (Factor IX), la hormona estimuladora del folículo humana (FSH), la eritropoyetina humana (EPO), el factor estimulador de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), el interferón gamma humano (IFN-gamma), el inhibidor de la proteasa alfa-1 humana (conocido también como alfa-1-antitripsina o inhibidor de la alfa-1-tripsina; A-I-PI), la glucocerebridasa, el activador de tipo tisular humano (TPA), la interleuquina-2 humana (IL-2), Factor VIII humano (Factor VIII), un receptor del factor de necrosis tumoral de 75 kDa fusionado a una porción Fc de la inmunoglobulina IgG humana, conocida comercialmente como ENBREL™ o ETANERCEPT™ (TNFR quimérico), la uroquinasa humana (uroquinasa), un fragmento Fab del anticuerpo monoclonal quimérico humano/de ratón que se une de forma específica a la glicoproteína IIb/IIIa y el receptor alfav beta3 de la vitronectina, conocido comercialmente como REOPRO™ o ABCIXIMAB (antiglicoproteína IIb/IIIa quimérica) un anticuerpo monoclonal quimérico de ratón/ser humano que se une de forma específica a HER2, conocido comercialmente como HERCEPTIN TM (dirigido contra HER-2 quimérico), un anticuerpo quimérico humano/de ratón que se une de forma específica al sitio antigénico A o a la proteína F o al virus sincitial respiratorio comercialmente conocido como SYNAGIS™ o PALIVIZUMAB (dirigido contra RSV quimérico) un anticuerpo monoclonal humano/de ratón quimérico que se une de forma específica a las células CD20 o a los linfocitos B humanos, comercialmente conocido RITUXAN™ o RITUXAMAB (dirigido contra CD20 quimérico), una ADNasa recombinante humana (ADNasa), un anticuerpo monoclonal humano/de ratón quimérico que se une de forma específica al factor de necrosis tumoral humano, comercialmente conocido como REMICADE™ o INFLIXIMAB (dirigido contra TNF quimérico), insulina humana, el antígeno superficial de un virus de la hepatitis B (subtipo adw; HBsAg), y la hormona del crecimiento humana (HGH).
El ácido nucleico aislado de la invención debe construirse de forma que incluya una secuencia de ARN o una secuencia de ADN que codifica cualquiera de los anteriores péptidos identificados de la invención, y cualquiera de sus formas modificadas, incluyendo las modificaciones químicas del ADN o del ARN que convierten la secuencia de nucleótidos en más estable cuando está exenta de células o cuando está asociada a una célula. Como ejemplo no limitante, se sabe que los oligonucleótidos que contienen al menos una modificación de fosforotioato confieren al oligonucleótido una resistencia mejorada a las nucleasas. Los ejemplos específicos de oligonucleótidos modificados incluyen aquellos que contienen fosforotioato, fosfotriéster, metil fosfonato, enlaces entre alquil azúcares o cicloalquil azúcares de cadena corta, o enlaces entre azúcares heteroaromáticos o heterocíclicos de cadena corta (“estructura”). Además, se pueden utilizar también oligonucleótidos que tengan estructuras de esqueleto de morfolino (Patente de los Estados Unidos Nº 5.034.506) o estructuras de esqueleto de poliamida (Nielsen y col., 1991, Science 254: 1497).
Se pueden usar también modificaciones químicas de nucleótidos para aumentar la eficacia con la que una secuencia de nucleótido es capturada por una célula o la eficacia con la que se expresa en una célula. Se contemplan cualquiera y todas las combinaciones de modificaciones de las secuencias de nucleótidos en la presente invención.
La presente invención no debe considerarse como limitada únicamente a las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos dadas a conocer en el presente documento. Tal como se describe con más detalle en otra parte en el presente documento, una vez provistos con la presente invención, será fácilmente evidente para un experto en la técnica que se pueden obtener otros ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la presente invención siguiendo los procedimientos descritos en el presente documento (por ejemplo, mutagénesis dirigida al emplazamiento, y mutaciones de cambio de marco), y procedimientos que son bien conocidos en la técnica.
Se incluyen también ácidos nucleicos aislados que codifican fragmentos de péptidos en los que los fragmentos de péptidos retienen la actividad biológica deseada del péptido. Además, aunque se dan a conocer en el presente documento los ácidos nucleicos a modo de ejemplo que codifican los péptidos preferidos en relación con las SEC ID
Nos
específicas, la invención no debe considerarse en forma alguna como limitada a cualquier ácido nucleico específico dado a conocer en el presente documento. En su lugar, debe considerarse que la invención incluye todas y cada una de las moléculas de ácido nucleico que tengan un porcentaje de identidad suficiente con las secuencias dadas a conocer en el presente documento de tal manera que estos ácidos nucleicos codifican también un péptido que tiene la actividad biológica deseada dada a conocer en el presente documento. Se contemplan también los ácidos nucleicos aislados que sean más cortos que los ácidos nucleicos de longitud completa, en los que se retiene embargo la actividad biológica del péptido codificado. Los procedimientos para determinar el porcentaje de identidad entre un ácido nucleico y otro se dan a conocer en otra parte en el presente documento dado que son ensayos para la determinación de la actividad biológica de cualquier péptido preferido específico.
También se dan a conocer también en otra parte en el presente documento cualesquiera otro tipo de procedimientos que se pueden utilizar para la generación de derivados, mutantes, o formas variantes de los péptidos de la presente invención que utilizan la metodología de ADN recombinante bien conocida en la técnica tal como, por ejemplo, la descrita en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nueva York). Son bien conocidos en la técnica los procedimientos para la introducción de cambios de aminoácidos en el péptido o el polipéptido alterando la secuencia de ADN que codifica el péptido, y se describen también en Sambrook y col. (1989, supra); Ausubel y col. (1997, más arriba).
La invención incluye un ácido nucleico que codifica un G-CSF, IFN-alfa, IFN-beta, Factor VII, Factor IX, FSH, EPO, GM-CSF, IFN-gamma, A-1-PI, glucocerebrosidasa, TPA, IL-2, Factor VIII, TNFR quimérico, uroquinasa, antiglicoproteína IIb/IIa quimérica, anticuerpo quimérico dirigido contra HER2, anticuerpo quimérico dirigido contra-RSV, anticuerpo quimérico dirigido contra CD20, ADNasa, anticuerpo quimérico dirigido contra TNF, insulina humana, HBsAg, y HGH, en el que un ácido nucleico que codifica un péptido etiqueta se une de forma covalente al anterior. Esto es, la invención abarca un ácido nucleico quimérico en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido etiqueta se une de forma covalente al ácido nucleico que codifica un péptido de la presente invención. Dichos péptidos etiqueta son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP), myc, myc-piruvato quinasa (myc-PK), His6, proteína de unión a maltosa (MBP), y polipéptido etiqueta de la hemaglutinina del virus de la gripe, un polipéptido con la etiqueta flag (FLAG) y un polipéptido etiqueta de la glutatión-S-transferasa (GST). Sin embargo, la etiqueta no debe considerarse en forma alguna limitada a los ácidos nucleicos que codifican los péptidos etiqueta anteriormente relacionados. En su lugar, cualquier secuencia que codifica un péptido que puede funcionar de una manera sustancialmente similar a estos péptidos etiqueta se debe considerar como incluida en la presente invención.
El ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido etiqueta se puede utilizar para localizar un péptido de la presente invención en una célula, un tejido, y/o un organismo completo (por ejemplo, un embrión de mamífero), detectar un péptido de la presente invención secretado a partir de una célula, y estudiar el(los) papel(es) del péptido en una célula. Además, la adición de un péptido etiqueta facilita el aislamiento y la purificación del péptido “etiquetado” de tal manera que se pueden producir los péptidos de la invención y purificarse fácilmente.
La invención incluye los siguientes péptidos aislados preferidos: G-CSF, IFN-alfa, IFN-beta, Factor VII, Factor IX, FSH, EPO, GM-CSF, IFN-gamma, A-1-PI, glucocerebrosidasa, TPA, IL-2, Factor VIII, TNFR quimérico, uroquinasa, quimérica anticuerpo dirigido contra la glicoproteína IIb/IIIa, anticuerpo quimérico dirigido contra HER2, anticuerpo quimérico dirigido contra RSV, anticuerpo quimérico dirigido contra CD20, ADNasa, anticuerpo quimérico dirigido contra TNF, insulina humana, HBsAg, y HGH.
Se debe considerar también que la presente invención abarca “derivados”, “mutantes”, y “variantes” de los péptidos de la invención (o del ADN que codifica los mismos) cuyos derivados, mutantes, y variantes son péptidos que están alterados en uno o más aminoácidos (o, cuando se hace referencia a la secuencia de nucleótidos que codifica los mismos, están alterados en uno o más pares de bases) de tal manera que el péptido resultante (o ADN) no es idéntico a las secuencias enumeradas en el presente documento, pero tiene la misma propiedad biológica que los péptidos dados a conocer en el presente documento, en que el péptido tiene las propiedades biológicas/bioquímicas de G-CSF, IFN-alfa, IFN-beta, Factor VII, Factor IX, FSH, EPO, GM-CSF, IFN-gamma, A-1-PI, glucocerebrosidasa, TPA, IL-2, Factor VIII, TNFR quimérico, uroquinasa, anticuerpo quimérico dirigido contra la glicoproteína IIb/IIIa, anticuerpo quimérico dirigido contra HER2, anticuerpo quimérico dirigido contra RSV, anticuerpo quimérico dirigido contra CD20, ADNasa, anticuerpo quimérico dirigido contra TNF, insulina humana, HBsAg, y HGH.
Se incluyen además fragmentos de péptidos que retienen la actividad biológica deseada del péptido sin tener en cuenta la longitud del péptido. Se encuentra comprendido en el conocimiento del experto en la técnica el cómo aislar formas de longitud inferiores a la completa a partir de cualquiera de los péptidos útiles en la invención, y para determinar, utilizando los ensayos proporcionados en el presente documento, qué fragmentos aislados retienen una actividad biológica deseada y son por tanto péptidos útiles en la invención.
Debe considerarse que una propiedad biológica de una proteína de la presente invención incluye, pero sin limitación, la capacidad del péptido para funcionar en el ensayo biológico y en los entornos descritos en el presente documento, tales como la reducción de la inflamación, la estimulación de una respuesta inmune, la coagulación de la sangre, aumento de la salida hematopoyética, inhibición de la proteasa, modulación del sistema inmune, unión a un antígeno, crecimiento, alivio del tratamiento de una enfermedad, y escisión del ADN.
A. G-CSF
La presente invención abarca un procedimiento para la modificación de la estructura de glicano en G-CSF. G-CSF es bien conocida en la técnica como una citoquina producida por linfocitos T activados, macrófagos, células endoteliales, y fibroblastos estromales. G-CSF actúa principalmente sobre la médula ósea para aumentar la producción de leucocitos inflamatorios, y funciona además como una hormona endocrina para iniciar la recuperación de los neutrófilos consumidos durante las funciones inflamatorias. G-CSF tiene también aplicaciones clínicas en la sustitución de la médula ósea tras quimioterapia.
Aunque G-CSF ha mostrado ser un compuesto importante y útil para aplicaciones terapéuticas en mamíferos, especialmente en seres humanos, los actuales procedimientos para la producción de G-CSF a partir de células recombinantes dan como resultado un producto que tiene una vida biológica relativamente corta, un modelo de glicosilación impreciso que podría conducir potencialmente a la inmunogenicidad, una pérdida de función, y una creciente necesidad de dosis más grandes y más frecuentes a fin de conseguir el mismo efecto.
G-CSF se ha aislado y clonado, las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del mismo se han presentado como SEC ID Nº: y SEC ID Nº: 2, respectivamente (Figura 52A y 52B, respectivamente). La presente invención abarca un procedimiento para modificar G-CSF, particularmente en lo que se refiere a la capacidad de G-CSF de funcionar como una molécula biológica potente y funcional. El técnico experto, cuando se provee de la siguiente divulgación y las enseñanzas del presente documento, entenderá fácilmente que la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para la modificación de G-CSF
La presente invención abarca además variantes de G-CSF que son bien conocidas en la técnica. A modo de ejemplo, pero que en modo alguno es limitante de la presente invención, se ha descrito una variante de G-CSF en la patente de los Estados Unidos Nº 6.166.183, en la que se describe que G-CSF comprende el complemento natural de restos de lisina y está unida adicionalmente a una o dos moléculas de polietilenglicol. De forma adicional, las Patentes de los Estados Unidos Nos 6.004.548, 5.580.755, 5.582.823, y 5.676.941 describen una variante de G-CSF en la que uno o más de los restos de cisteína en las posiciones 17, 36, 42, 64, y 74 están sustituidos por alanina o serina de forma alternativa. La patente de los Estados Unidos Nº 5.416.195 describe una molécula G-CSF en la que la cisteína en la posición 17, el ácido aspártico en la posición 27, y las serinas en la posición 65 y 66 están sustituidas por serina, serina, prolina, y prolina, respectivamente. Son bien conocidas en la técnica otras variantes, y se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados unidos nº 5.399.345.
Se puede evaluar la expresión y la actividad de una molécula de G-CSF modificada de la presente invención utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, y que se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.810.643. A modo de ejemplo, se puede medir la actividad utilizando ensayos de captación de timidina radiomarcada. De forma breve, médula ósea humana procedente de donantes sanos se somete a cortes de densidad con Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharmacia, Piscataway, NJ) y las células de baja densidad se suspenden en medio de Iscove (GIBCO; La Jolla, CA) que contiene suero bovino fetal al 10%, glutamina y antibióticos. Se incubaron aproximadamente 2 x 104 células de médula ósea humana tanto con medio control como con el G-CSF de la presente invención en placas de fondo plano de 96 pocillos a aproximadamente 37º C en CO2 al 5% en aire durante aproximadamente 2 días. A continuación los cultivos se sometieron a pulsos durante aproximadamente 4 horas con 0,5 μci/pocillo de 3H-timidina (New England Nuclear, Boston, Mass.) y se midió la captación tal como se describe, por ejemplo en Ventua, y col. (1983, Blood 61:781). Un aumento en la incorporación de 3H-timidina en
1a 1b 2a 2b 2c 4a 4b 7a 7b 7c 8a 8b 8c 10a 10b 14a 14b 14c 17a 17b 17c 17d
células de médula ósea humana en comparación con células de médula ósea tratadas con un compuesto control es una indicación de un compuesto de G-CSF activo y viable.
B. IFN alfa e IFN beta
La presente invención abarca además un procedimiento para la remodelación y la modificación de IFN alfa e IFN beta. IFN alfa es parte de una familia de aproximadamente veinte péptidos de aproximadamente 18 kDa de peso. IFN alfa e IFN beta, denominados en su conjunto como los interferones de Tipo I, se unen al mismo receptor celular y estimulan respuestas similares. Los IFN del Tipo I inhiben la replicación vírica, aumentan el potencial lítico de las células NK, modulan la expresión de la molécula MHC, e inhiben la proliferación celular, entre otras cosas. Se han utilizado los IFN de Tipo I como terapia para infecciones víricas, particularmente para los virus de la hepatitis, y como terapia para la esclerosis múltiple.
Las composiciones actuales de IFN de Tipo I son, tal como se ha descrito anteriormente, compuestos útiles para la modulación de respuestas inmunológicas anómalas y como terapia para una variedad de enfermedades. Sin embargo, se ven impedidas debido a una disminución de la potencia y la función, y tienen una vida limitada en el cuerpo en comparación con las citoquinas naturales que comprenden el complemento natural de la glicosilación.
El nucleótido y la secuencia de aminoácidos prototipos para el IFN alfa se muestran en el presente documento como la SEC ID Nº: 3 y las SEC ID Nº: 4, respectivamente (Figura 53A y 53B, respectivamente). IFN beta comprende un único producto génico de aproximadamente 20 kDa, el ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos del cual se presentan en el presente documento como la SEC ID Nº: 5 y la SEC ID Nº: 6 (Figura 54A y 54B, respectivamente). La presente invención no está limitada al nucleótido y a las secuencias de aminoácidos del presente documento. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que existen muchas variantes de IFN alfa, tanto naturales, como derivados genomanipulados. De forma similar, se ha modificado IFN beta para intentar conseguir un perfil terapéutico más beneficioso. Son bien conocidos en la técnica los ejemplos de IFN de Tipo I modificados (véase la Tabla 8) y se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 6.323.006, en la que la cisteína-60 está sustituida por tirosina, las Patentes de los Estados unidos Nos 4.737.462, 4.588.585, 5.545.723, y 6.127.332 en las que se describe un IFN beta con una variedad de aminoácidos. De forma adicional, las Patentes de los Estados Unidos Nos 4.966.843, 5.376.567, 5.795.779 describen IFN alfa-61 e IFN alfa-76. Las patentes de los Estados Unidos Nos 4.748.233 y 4.695.543 describen IFN alpf gx-1, mientras que la patente de los estados Unidos Nº 4.975.276 describe IFN alfa-54. Además, las Patentes de los Estados Unidos Nos 4.695.623, 4.897.471, 5.661.009, y 5.541.293 describen todas una secuencia consenso de IFN alfa para representar todas las variantes conocidas hasta la fecha de llenado. Aunque esta lista de IFN de tipo I y de sus variantes no se considera de ninguna forma completa, un experto en la técnica entenderá fácilmente que la presente invención abarca derivados de moléculas de IFN beta e IFN alfa, y sus variantes conocidas o que se encuentran por descubrir en un futuro,
Tabla 8. Isoformas del interferón alfa
Tipo α AA característico
A114 V114
K23-H34 R23-H34 R23-R34
A51-E114 T51-V114 M132-K159-G161 M132-Q159-R161 T132-K159-G161 V98-L99-C100-D101-R161 S98-C99-V100-M101-R161
S98-C99-V100-M101-D161Δ(162-166)
S8-L89 T8-I89 F152-Q159-R161
F152-K159-G161 L152-Q159-R161 P34-S55-I161 H34-S55-I161 H34-S55-R161 H34-P55-R161
M96
21a
L96
21b
Son bien conocidos en la técnica los procedimientos para expresar IFN en células recombinantes, y se llevan a cabo fácilmente utilizando las técnicas descritas en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos Nº 4.966.843, y en Sambrook y col. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nueva York). El técnico experto conocerá bien los ensayos para determinar la actividad biológica de un IFN de Tipo I modificado por la presente invención. Por ejemplo, el ensayo descrito por Rubinstein y col., (1981, Journal of Virology 37: 755-758) se utiliza comúnmente para determinar el efecto de un IFN de Tipo I midiendo los efectos citopáticos de la infección vírica sobre una población de células. Este procedimiento es solo uno de muchos conocidos en la técnica para evaluar la función biológica de un IFN Tipo.
C. Factor VIIa
La presente invención abarca adicionalmente un procedimiento para la remodelación y la modificación del Factor VII: La ruta de coagulación de la sangre es una reacción compleja que comprende muchos acontecimientos. Un acontecimiento intermedio en esta ruta es el Factor VII, una proenzima que participa en la ruta extrínseca de la coagulación de la sangre convirtiendo (tras su activación al Factor VIIa) el Factor X en Xa en presencia del Factor tisular e iones de calcio. El Factor Xa convierte a su vez a continuación la protrombina en trombina, en presencia del Factor Va, iones de calcio y fosfolípidos. La activación del Factor X a Factor Xa es un acontecimiento compartido por las rutas intrínseca y extrínseca de coagulación de la sangre, y por tanto, se puede utilizar el Factor VIIa para el tratamiento de pacientes con deficiencias o inhibidores del Factor VIII. Existen también evidencias que sugieren que el Factor VIIa puede participar en la ruta intrínseca así como aumentar por tanto la prominencia y la importancia del papel del Factor VII en la coagulación de la sangre.
El factor VII es una glicoproteína monocatenaria con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa. En esta forma, el factor circula en la sangre como un zimógeno inactivo. La activación del Factor VII a VIIa puede estar catalizada por algunas proteasas plasmáticas diferentes, tales como como el Factor XIIa. La activación del Factor VII da como resultado la formación de una cadena pesada y una cadena ligera que se mantienen juntas por al menos un enlace disulfuro. Además, se han descrito moléculas del Factor VII modificadas que no se pueden convertir en Factor VIIa, y son útiles como remedios contra la coagulación, tales como en el caso de coágulos sanguíneos y trombosis. Dada la importancia del Factor VII en la ruta de coagulación de la sangre, y su uso como tratamiento para los niveles crecientes y decrecientes de la coagulación, es evidente que una molécula que tenga una vida media biológica más larga, una potencia creciente, y en general, un perfil terapéutico más similar al Factor VII natural que se sintetiza y secreta en el ser humano sano sería beneficiosa y útil como tratamiento para los trastornos de coagulación de la sangre.
Se ha clonado y secuenciado el Factor VII, y se presentan en el presente documento las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos como la SEC ID Nº: 7 y la SEC ID Nº: 8 (Figura 55A y 55B, respectivamente). La presente invención no debe considerarse en forma alguna como limitada a las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del Factor VII que se muestran en el presente documento. Se describen variantes del Factor VII en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos 4.784.950 y 5.580.560 en las que lisina-38, lisina-32, arginina--290, arginina341, isoleucina-42, tirosina-278, y tirosina-332 están sustituidas por una variedad de aminoácidos. Además, las patentes de los Estados Unidos Nos 5.861.374, 6.039.944, 5.833.982, 5.788.965, 6.183.743, 5.997.864, y 5.817.788 describen variantes del Factor VII que no se escinden para formar el Factor VIIa. El técnico experto reconocerá que son bien conocidos la ruta de coagulación de la sangre y el papel del Factor VII en la anterior, y por tanto muchas variantes que se producen de forma natural y mediante genomanipulación, que se han descrito anteriormente, se incluyen en la presente invención.
Son bien conocidos en la técnica los procedimientos para la expresión y para determinar la actividad del Factor VII, y se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.784.950. De forma breve, se puede llevar a cabo la expresión del Factor VII, o de sus variantes en una variedad de sistemas procariotas y eucariotas, incluyendo E. coli, células CHO, células BHK, células de insecto utilizando un sistema de expresión de baculovirus, todos los cuales son bien conocidos en la técnica.
Se pueden llevar a cabo ensayos para establecer la actividad de un Factor VII modificado preparado de acuerdo con los procedimientos de la presente invención utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Como ejemplo no limitante, Quick y col. (Hemorragic Disease and Thrombosis, 2ª ed., Leat Febiger, Filadelfia, 1966), describen un ensayo de coagulación en una etapa útil para la determinación de la actividad biológica de una molécula del Factor VII preparada de acuerdo con los procedimientos de la invención.
D. Factor IX
La presente invención abarca además un procedimiento para remodelar y/o modificar el Factor IX. Tal como se ha descrito anteriormente, el Factor IX es fundamental en la cascada de coagulación de la sangre. Una deficiencia de Factor IX en el cuerpo caracteriza un tipo de hemofilia (tipo B). El tratamiento de esta enfermedad está limitado normalmente a la transfusión intravenosa de concentrados de proteínas plasmáticas humanas del Factor IX. Sin embargo, además de las desventajas prácticas de tiempo y los elevados costes, la transfusión de concentrados sanguíneos implica el riesgo de transmisión de hepatitis vírica, síndrome de inmunodeficiencia adquirida o enfermedades tromboembólicas al receptor.
Aunque se ha demostrado que el propio Factor IX es un compuesto importante y útil para aplicaciones terapéuticas, los procedimientos actuales para la producción del Factor IX a partir de células recombinantes (Patente de los Estados Unidos Nº 4.770.999) dan como resultado un producto con una vida biológica más bien corta, un modelo de glicosilación impreciso que podría conducir potencialmente a la inmunogenicidad, pérdida de la función, un aumento en la necesidad de dosis más grandes y más frecuentes a fin de conseguir el mismo efecto.
Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos del factor IX se muestran en el presente documento como SEC ID Nº: 9 y SEC ID Nº: 10 (Figura 56A y 56b, respectivamente). La presente invención no está limitada de ninguna manera a las secuencias que se muestran en el presente documento. Son bien conocidas en la técnica las variantes del Factor IX, tal como se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos 4.770.999, 5.521.070 en las que una tirosina está sustituida por una alanina en la primera posición, la Patente de los Estados Unidos Nº 6.037.452, en la que el Factor IX está unido a un grupo de óxido de alquileno, y la Patente de los Estados Unidos Nº 6.046.380, en la que el ADN que codifica el Factor IX está modificado en al menos un sitio de corte y empalme. Tal como se demuestra en el presente documento, son bien conocidas en la técnica las variantes del Factor IX, y la presente divulgación abarca aquellas variantes conocidas o que se van a desarrollar o a descubrir en el futuro.
Los procedimientos para determinar la actividad de un Factor IX modificado preparado de acuerdo con los procedimientos de la presente invención se pueden llevar a cabo utilizando los procedimientos descritos anteriormente, o de forma adicional, utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, tal como un ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activado en una etapa tal como se describe, por ejemplo en, Biggs (1972, Human Blood Coagulation Haemostasis and Thrombosis (Ed. 1), Oxford, Blackwell, Scientific, pg. 614). De forma breve, para evaluar la actividad biológica de la molécula de un Factor IX desarrollada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención, se puede llevar a cabo el ensayo con volúmenes iguales del reactivo de tromboplastina parcial activado, plasma deficiente en factor IX aislado de un paciente con hemofilia B utilizando las técnicas de la flebotomía estéril bien conocidas en la materia, y plasma combinado normal como patrón, o la muestra. En este ensayo, una unidad de afinidad se define como la cantidad presente en un mililitro de plasma combinado normal. Además, se puede llevar a cabo un ensayo basado en la actividad biológica sobre la capacidad del Factor IX para reducir el tiempo de coagulación del plasma de pacientes deficientes en Factor IX a normales, tal como se describe en, por ejemplo, Proctor y Rapaport (1961, Amer. J. Clin. Path. 36: 212).
E. FSH
La presente invención incluye además un procedimiento para remodelar y/o modificar FSH. La función reproductora humana está controlada en parte por una familia de hormonas heterodiméricas de glicoproteína humana que tienen una subunidad alfa de la glicoproteína de 92 aminoácidos común, pero que difieren en sus subunidades beta específicas de hormona. La familia incluye la hormona estimuladora del folículo (FSH), la hormona luteneizante (LH), la hormona estimuladora del tiroides o tirotropina (TSH), y la gonadotropina coriónica humana (hCG). La FSH y la LH humanas se utilizan de forma terapéutica para regular diversos aspectos del metabolismo pertinentes para la reproducción en el individuo femenino humano. Por ejemplo, la FSH parcialmente purificada a partir de orina se utiliza clínicamente para estimular la maduración folicular en la mujer anovulatoria con síndrome anovulatorio o deficiencia en fase lútea. La hormona luteneizante (LH) y la FSH se utilizan en combinación para estimular el desarrollo de folículos en el ovario para la fertilización in vitro. El papel de la FSH en el ciclo reproductor es suficientemente bien conocido para permitir el uso terapéutico, pero ha encontrado dificultades debido, en parte, a la heterogeneidad y a la impureza de la preparación procedente de fuentes naturales. La heterogeneidad es debida a las variaciones en el modelo de glicosilación.
La FSH es una herramienta valiosa en la fertilización in vitro y a la estimulación de la fertilización in vivo, pero tal como se ha indicado anteriormente se ha impedido su eficacia clínica por la inconsistencia en la glicosilación de la proteína. Por tanto, parece evidente que un procedimiento para remodelar la FSH será de gran beneficio para las ciencias reproductivas.
FSH se ha clonado y secuenciado, cuyas secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos se presentan en el presente documento como SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, respectivamente (subunidad alfa) y SEC ID Nº: 13 y SEC ID Nº: 14, respectivamente (subunidad beta) (Figuras 57A y 57B, respectivamente). El experto en la materia observará fácilmente que la presente invención no está limitada a las secuencias representadas en el presente documento, ya que las variantes de FSH son bien conocidas en la técnica. Como un ejemplo no limitante, la Patente de Estados Unidos Nº 5.639.640 describe la subunidad beta que comprende dos secuencias diferentes de aminoácidos y la Patente de Estados Unidos Nº 5.338.835 describe una subunidad beta que comprende una secuencia adicional de aminoácidos de aproximadamente veintisiete aminoácidos derivados de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana. Por lo tanto, la presente invención comprende variantes de FSH, tanto naturales como diseñadas por la mano humana, y bien conocidas en la técnica.
Los procedimientos para expresar FSH en las células, tanto procarióticas como eucarióticas, son bien conocidos en la técnica y se describen en numerosas ocasiones en la literatura (Patentes de Estados Unidos Nº 4.840.896, Nº 4.923.805, Nº 5.156.957). Además, los procedimientos para evaluar la actividad biológica de una molécula de FSH remodelada de la presente invención son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.589.402, en la que se describen procedimientos para determinar el efecto de FSH en la fertilidad, producción de huevos, y tasas de embarazo tanto en primates no humanos como en seres humanos.
F. EPO
La presente invención comprende adicionalmente un procedimiento para remodelar y/o modificar EPO. EPO es una glicoproteína ácida de aproximadamente 34 kDa y se puede presentar en tres formas naturales: alfa, beta, y asialo. Las formas alfa y beta difieren ligeramente en los componentes de los hidratos de carbono pero tienen la misma potencia, actividad biológica y peso molecular. La forma asialo es una forma alfa o beta con el ácido siálico terminal retirado. EPO está presente en concentraciones muy bajas en el plasma cuando el organismo está en un estado saludable en el que los tejidos reciben suficiente oxigenación a partir del número existente de eritrocitos. Esta concentración normal es suficiente para estimular el reemplazo de los glóbulos rojos que normalmente se pierden a través del envejecimiento. La cantidad de eritropoyetina en la circulación aumenta en condiciones de hipoxia cuando se reduce el transporte de oxígeno por los glóbulos en la circulación. La hipoxia puede estar causada por la pérdida de grandes cantidades de sangre durante la hemorragia, destrucción de glóbulos rojos por sobreexposición a la radiación, reducción de la captación de oxígeno debido a altitudes elevadas o inconsciencia prolongada, o diversas formas de anemia. Por lo tanto, EPO es un compuesto útil para el suministro de glóbulos rojos después de la terapia de radiación, anemia, y otras condiciones que amenazan la supervivencia.
Teniendo en cuenta la importancia de EPO en la ayuda en la recuperación de una diversidad de enfermedades y trastornos, la presente invención es útil para la producción de EPO con un componente sacárido natural, y por lo tanto más eficaz. EPO, tal y como se sintetiza actualmente, carece de todo el complemento de glicosilación, y por lo tanto se debe administrar más frecuentemente y en dosis más elevadas debido a su corta vida en el organismo.
EPO se ha clonado y secuenciado, y las secuencias de nucleótidos y aminoácidos están presentes en el presente documento como SEC ID Nº: 15 y SEC ID Nº: 16, respectivamente (Figuras 58A y 58B, respectivamente). Un experto en la materia entenderá fácilmente que las secuencias expuestas en el presente documento son solamente un ejemplo de las secuencias que codifican y que comprenden EPO. Como un ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.187.564 describe una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de dos o más péptidos de EPO, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.048.971 y Nº 5.614.184 describen moléculas de EPO mutante que tienen sustituciones de aminoácidos en las posiciones 101, 103, 104, y 108. La Patente de Estados Unidos Nº 5.106.954 describe una molécula de EPO truncada, y la Patente de Estados Unidos Nº 5.888.772 describe un análogo de EPO con sustituciones en las posiciones 33, 139, y 166. Por lo tanto, el experto en la materia observará que la presente invención incluye EPO y derivados y variantes de EPO tal como están bien documentados en la literatura y en la técnica en conjunto.
Adicionalmente, los procedimientos de expresión de EPO en una célula son bien conocidos en la técnica. Como se ejemplifica en las Patente de Estados Unidos Nº 4.703.008, Nº 5.688.679, y Nº 6.376.218, entre otras, EPO se puede expresar en sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos. Los procedimientos para ensayar la actividad biológica de EPO son igualmente bien conocidos en la técnica. Como un ejemplo, el ensayo de Krystal (Krystal, 1983, Exp. Hematol. 11: 649-660) se puede usar para determinar la actividad de EPO preparada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención. En resumen, el ensayo mide el efecto de la eritropoyetina en células intactas de bazo de ratón. Los ratones se tratan con fenilhidrazina para estimular la producción de células precursoras de glóbulos rojos sensibles a la eritropoyetina. Después del tratamiento, los bazos se retiran, las células intactas de bazo se aíslan y se incuban con diversas cantidades de eritropoyetina de tipo silvestre o las proteínas eritropoyetina descritas en el presente documento. Después de una noche de incubación, se añade 3H-timidina y se mide su incorporación en el ADN celular. La cantidad de incorporación de 3H-timidina es indicativa de producción de glóbulos rojos estimulada por eritropoyetina mediante la interacción de la eritropoyetina con su receptor celular. La concentración de la proteína eritropoyetina de la presente invención, así como la concentración de eritropoyetina de tipo silvestre, se cuantifica mediante procedimientos de radioinmunoensayo competitivos bien conocidos en la técnica. Las actividades específicas se calculan como unidades internacionales medidas en el ensayo de Krystal dividido por microgramos medido como proteína inmunoprecipitable por radioinmunoensayo.
G. GM-CSF
La presente invención incluye un procedimiento para la modificación de GM-CSF. GM-CSF es bien conocido en la técnica en forma de una citoquina producida por linfocitos activados, macrófagos, células endoteliales, y fibroblastos estromales. GM-CSF actúa principalmente sobre la médula ósea para aumentar la producción de leucocitos inflamatorios, y funciones adicionales como una hormona endocrina para iniciar la reposición de los neutrófilos consumidos durante las funciones inflamatorias. Además, GM-CSF es un factor de activación de macrófagos y promueve la diferenciación de las células de Lagerhans en las células dendríticas. Como G-CSF, GM=CSF también tiene aplicaciones clínicas en el reemplazo de la médula ósea después de la quimioterapia.
Mientras que G-CSF se ha demostrado en sí mismo como un compuesto importante y útil para aplicaciones terapéuticas, los presentes procedimientos para la producción de G-CSF a partir de células recombinantes dan como resultado un producto con una vida biológica bastante corta, un patrón de glicosilación inadecuado que podría conducir potencialmente a la inmunogenicidad, pérdida de función, una mayor necesidad de dosis tanto mayores como más frecuentes para conseguir el mismo efecto.
GM-CSF se ha aislado y clonado, cuyas secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos se presentan como SEC ID Nº: 17 y SEC ID Nº: 18, respectivamente (Figuras 59A y 59B, respectivamente). La presente invención incluye un procedimiento para modificar GM-CSF, particularmente en lo que se refiere a la capacidad de GM-CSF para funcionar como una molécula biológica potente y funcional. El experto en la materia, cuando está preparado con la presente divulgación y con las enseñanzas del presente documento, entenderá fácilmente que la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para la modificación de GM-CSF.
La presente invención incluye adicionalmente variantes de GM-CSF, que son bien conocidas en la técnica. Como un ejemplo, pero que no pretende de ninguna manera limitar la presente invención, se ha descrito una variante de GM-CSF en el documento WO 86/06358, en el que la proteína se modifica por una estructura cuaternaria alternativa. Además, la Patente de Estados Unidos Nº 6.287.557 describe una secuencia de ácidos nucleicos de GM-CSF ligada al genoma de un virus del herpes para aplicaciones de terapia genética. Adicionalmente, la Publicación de Patente Europea Nº 0288809 (que corresponde a la Publicación de Patente PCT Nº WO 87/02060) presenta una proteína de fusión que comprende IL-2 y GM-CSF. La secuencia de IL-2 puede estar en el extremo terminal de N o de C del GM-CSF de modo que después de la escisión ácida de la proteína de fusión, se puede generar el GM-CSF que tiene modificaciones de la secuencia terminal en N o en C. Por lo tanto, en la técnica son bien conocidos derivados, mutantes y variantes de GM-CSF, y se incluyen dentro de los procedimientos de la presente invención.
La expresión y la actividad de una molécula de GM-CSF modificada de la presente invención se puede ensayar usando procedimientos bien conocidos en la técnica, y como se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.810.643. Como un ejemplo, se puede medir la actividad usando ensayos de captación de timidina radiomarcada. En resumen, la médula ósea humana de donantes sanos se somete a un corte de densidad con Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharmacia, Piscataway, NJ) y las células de baja densidad se suspenden en medio de Iscove (GIBCO, La Jolla, CA) que contiene suero bovino fetal al 10%, glutamina y antibióticos. Aproximadamente 2 x 104 células de médula ósea humana se incuban con medio de control o con el GM-CSF de la presente invención en placas de fondo plano de 96 pocillos a aproximadamente 37 ºC en CO2 al 5% en aire durante aproximadamente 2 días. Los cultivos después se pulsan durante aproximadamente 4 horas con 0,5 μCi/pocillo de 3H-timidina (New England Nuclear, Boston, Mass.) y la absorción se mide como se describe, por ejemplo, en Ventua, y col. (1983, Blood 61: 781). Un aumento en la incorporación de 3H-timidina en las células de médula ósea humana en comparación con las células de médula ósea tratadas con un compuesto de control es una indicación de un compuesto de GM-CSF activo y viable.
H. IFN-gamma
Es un objeto de la presente invención incluir un procedimiento de modificación y/o remodelación de IFN-gamma. IFN-gamma, conocido de otro modo como interferón de Tipo II, en contraste con IFN alfa y IFN beta, es una glicoproteína homodimérica que comprende dos subunidades de aproximadamente 21-24 kDa. La variación del tamaño se debe a los patrones variables de glicosilación, normalmente no replicados cuando se produce de forma recombinante en diversos sistemas de expresión conocidos en la técnica. IFN-gamma es un activador potente de los macrófagos, aumenta la expresión de la molécula MHC de clase I, y en menor medida, un agente estimulador de la molécula MHC de clase II. Además, IFN-gamma promueve la diferenciación de los linfocitos T y el cambio de isotipo en los linfocitos B. IFN-gamma también está bien documentado como un estimulador de neutrófilos, células NK, y respuestas a anticuerpos que conducen a la eliminación mediada por fagocitos. Se ha propuesto IFN-gamma como un tratamiento a usar en conjunto con la infección mediante patógenos intracelulares, tales como tuberculosis y leishmania, y también como un agente terapéutico antiproliferativo, útil en condiciones con proliferación celular anormal como una evidencia, tales como diversos cánceres y otras neoplasias.
IFN-gamma ha demostrado potente actividad inmunológica, pero debido a variaciones en la glicosilación a partir de los sistemas usados actualmente para expresar IFN-gamma, la potencia, eficacia, vida media biológica, y otros factores importantes de un agente terapéutico han sido variables en el mejor de los casos. La presente invención incluye procedimientos para corregir este defecto fundamental.
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de IFN-gamma se presentan en el presente documento como SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20, respectivamente (Figuras 60A y 60B, respectivamente). Se entenderá fácilmente que las secuencias expuestas en el presente documento no son limitantes, de ninguna manera, de la presente invención. En contraste, las variantes, derivados y mutantes de IFN-gamma son bien conocidos por el experto en la materia. Como un ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.083.724 describe una IFN-gamma aviar recombinante y la Patente de Estados Unidos Nº 5.770.191 describe variantes del término C de IFN-gamma humano. Además, la Patente de Estados Unidos Nº 4.758.656 describe nuevos derivados de IFN-gamma, y procedimientos para sintetizarlos en diversos sistemas de expresión. Por lo tanto, la presente invención no está limitada a las secuencias de IFN-gamma desveladas en cualquier parte del presente documento, pero incluye todos los derivados, variantes y muteínas bien conocidos en la técnica.
Los sistemas de expresión para IFN-gamma son igualmente bien conocidos en la técnica, e incluyen sistemas procarióticos y eucarióticos, así como preparaciones celulares de plantas e insectos, cuyos procedimientos son conocidos por el experto en la materia. Como un ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.758.656 describe un sistema para expresar derivados de IFN-gamma en E. coli, mientras que la Patente de Estados Unidos Nº 4.889.803 describe un sistema de expresión que usa células de ovario de hámster chino y un promotor de SV40.
Los ensayos para la actividad biológica de una IFN-gamma remodelada preparada de acuerdo con los procedimientos desvelados en el presente documento serán bien conocidos por un experto en la materia. Los ensayos biológicos para la expresión de IFN-gamma se pueden encontrar, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.807.744. En resumen, IFN-gamma se añade a los cultivos de células CD34++CD38-(100 células por pocillo) estimuladas mediante combinaciones de citoquina para inducir la proliferación de células CD34++CD38-, tales como IL-3, ligando c-kit e IL-1, IL-6 o G-CSF. La proliferación celular, y la generación de células que forman colonias secundarias se verán profundamente inhibidas en una forma dependiente de la dosis, produciéndose una inhibición casi completa a 5000 U/mililitro de IFN-gamma. Como un ensayo de confirmación del efecto inhibidor de IFNgamma, se puede realizar la adición de anticuerpos de IFN-gamma como un control.
I. Inhibidor de alfa-proteasa (α-antitripsina)
La presente invención incluye adicionalmente un procedimiento para remodelar el inhibidor de la alfa-proteasa (inhibidor de A-1-PI, α-1-antitripsina o α-1-tripsina), también conocido como alfa-antitripsina. A-1-PI es una glicoproteína que tiene un peso molecular de 53 kDa. A-1-PI desempeña un papel en el control de la destrucción de los tejidos mediante serina proteasas endógenas, y es el inhibidor más pronunciado de la serina proteasa en el plasma sanguíneo. En particular, A-1-PI inhibe diversas elastasas incluyendo la elastasa de los neutrófilos. La elastasa es una proteasa que degrada los tejidos, y puede ser particularmente problemática cuando su actividad no está regulada en el tejido pulmonar. Esta proteasa funciona degradando las proteínas extrañas. Sin embargo, cuando API no está presente en cantidades suficientes para regular la actividad de la elastasa, la elastasa degrada el tejido pulmonar. Con el tiempo, este desequilibrio da como resultado un daño crónico del tejido pulmonar y enfisema. De hecho, se ha mostrado que una deficiencia genética de A-1-PI está asociada con el desarrollo prematuro del enfisema pulmonar. El suministro de A-1-PI se ha usado satisfactoriamente para el tratamiento de esta forma de enfisema. Además, una deficiencia de A-1-PI también puede contribuir al empeoramiento de otras enfermedades tales como fibrosis quística y artritis, en las que los leucocitos se mueven en los pulmones o en las articulaciones para luchar contra la infección.
Por lo tanto, A-1-PI se podría usar posiblemente para tratar enfermedades en las que un desequilibrio entre inhibidor y proteasa o proteasas, especialmente la elastasa de los neutrófilos, está causando el avance de un estado de enfermedad. La actividad antiviral también se ha atribuido a A-1-PI. Teniendo en cuenta esto, se deduce lógicamente que la presente invención es útil para la producción de A-1-PI que es segura, eficaz, y potente en la atmósfera siempre cambiante de los pulmones.
A-1-PI se ha clonado y secuenciado, y se expone en SEC ID Nº: 21 y SEC ID Nº: 22 (Figuras 61A y 61B, respectivamente). Como lo entiende un experto en la materia, existen variantes naturales y modificadas de A-1-PI, y se incluyen en la presente invención. Como un ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.723.316 describe derivados de A-1-PI que tienen sustituciones de aminoácidos en las posiciones 356-361 y comprende adicionalmente una extensión N-terminal de aproximadamente tres aminoácidos. La Patente de Estados Unidos Nº
5.674.708 describe análogos de A-1-PI con sustituciones de aminoácidos en la posición 358 en la secuencia primaria de sus aminoácidos. El experto en la materia observará rápidamente que la presente invención incluye variantes, derivados, y mutantes de A-1-PI conocidos o por descubrir.
Los procedimientos para la expresión y la determinación de la actividad de una A-1-PI remodelada producida de acuerdo con los procedimientos de la presente invención son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.674.708 y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.723.316. En resumen, la actividad biológica se puede determinar usando ensayos para la actividad de antiquimotripsina midiendo la inhibición de la hidrólisis catalizada por quimotripsina del sustrato N-suc-Ala-Ala--Pro--Phe-p-nitroanilida (0,1 ml de una solución 10 mM en DMSO al 90%), como se describe, por ejemplo, en DelMar y col. (1979, Anal. Biochem. 99: 316). Un ensayo típico de quimotripsina contiene, en 1,0 mililitro: tampón Tris-Cl 100 mM, pH 8,3, Triton X-100 al 0,005% (v/v), quimotripsina pancreática bovina (18 kmmol) y A-1-PI de la presente invención. La mezcla del ensayo se incuba previamente a temperatura ambiente durante 5 minutos, se añade sustrato (0,01 ml de una solución 10 mM en DMSO al 90%) y se determina la actividad de la quimotripsina restante mediante la tasa de cambio en la absorbancia a 410 nm causada por la liberación de p-nitroanilina. Las medidas de la absorbancia óptica se realizan a 25 ºC usando un espectrofotómetro equipado con un compartimento para muestras a temperatura controlada.
J. Glucocerebrosidasa
La invención descrita en el presente documento incluye adicionalmente un procedimiento para la modificación de la glucocerebrosidasa. La glucocerebrosidasa es una enzima de glicoproteína lisosomal que cataliza la hidrólisis del glicolípido glucocerebrósido a glucosa y ceramidas. Las variantes de glucocerebrosidasa se comercializan como Cerezyme™ y Ceredase™, y es un agente terapéutico aprobado para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher. Ceredase™ es una forma derivada de placenta de la glucocerebrosidasa con estructuras completas unidas a N. Cerezyme™ es una variante recombinante de la glucocerebrosidasa que tiene 497 aminoácidos de longitud y se expresa en las células CHO. Los 4 glicanos unidos a N de Cerezyme se han modificado para terminar en el núcleo de trimanosa.
La glucocerebrosidasa se produce actualmente en cultivos de células recombinantes de mamífero, y por lo tanto refleja los patrones de glicosilación de esas células, normalmente células de roedores tales como células de ovario de hámster chino o células renales de cría de hámster, que difieren radicalmente de las de los patrones de glicosilación humanos, conduciendo a, entre otras cosas, inmunogenicidad y falta de potencia.
Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de glucocerebrosidasa se exponen en el presente documento como SEC ID Nº: 23 y 24 (Figuras 62A y 62B, respectivamente). Sin embargo, como observará el experto en la materia, las secuencias representadas en el presente documento son secuencias prototípicas, y no limitan la invención. De hecho, las variantes de glucocerebrosidasa son bien conocidas, y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.015.703 que describe una mayor producción de análogos de glucocerebrosidasa y variantes de los mismos. Además, la Patente de Estados Unidos Nº 6.087.131 describe la clonación y la secuenciación de otra variante más de glucocerebrosidasa. La intención de la presente invención es incluir estos y otros derivados, variantes, y mutantes conocidos o a descubrir en el futuro.
Los procedimientos para la expresión de glucocerebrosidasa son bien conocidos en la técnica que usa técnicas estándar, y se describen en detalle, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.015.703. Los ensayos para la eficacia biológica de una molécula de glucocerebrosidasa preparada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención son bien conocidos de forma similar en la técnica, y un modelo de la enfermedad de Gaucher en ratón para su evaluación y uso de un agente terapéutico de glucocerebrosidasa se describe, por ejemplo, en Marshall y col. (2002, Mol. Ther. 6: 179).
K. TPA
La presente invención incluye adicionalmente un procedimiento para la remodelación del activador de tipo tejido (TPA). TPA activa el plasminógeno para formar plasmina que disuelve la fibrina, el componente principal del sustrato de proteína de los trombos. Las preparaciones de TPA se desarrollaron en forma de agentes trombolíticos que tienen una selectividad muy elevada hacia el trombo en el tratamiento trombolítico de la trombosis que produce infarto de miocardio e infarto cerebral.
Además, se han producido diversos TPA modificados por ingeniería genética con el fin de obtener mayor afinidad a fibrina y mayor vida media en la sangre que la del TPA natural. Los TPA modificados producidos a partir de procariotas no están glicosilados a diferencia del TPA natural. Los TPA son proteínas que generalmente son extremadamente difíciles de solubilizar en agua. En particular, los TPA modificados son más difíciles de solubilizar en agua que el TPA natural, haciendo muy difícil la preparación de los TPA modificados. Los TPA modificados son de este modo difíciles de disolver en agua en el momento de la administración a un paciente. Sin embargo, los TPA modificados tienen diversas ventajas, tales como una mayor afinidad por la fibrina y mayor vida media en la sangre. Es el objeto de la presente invención aumentar la solubilidad de los TPA modificados.
Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de TPA se describen en el presente documento como SEC ID Nº: 25 y SEC ID Nº: 26, respectivamente (Figuras 63A y 63B, respectivamente). Como se ha descrito anteriormente, se han construido variantes de TPA y se han usado en aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.770.425 describió variantes de TPA en las que algunos de todos los dominios de fibrina se han eliminado. Además, la Patente de Estados Unidos Nº 5.736.134 describe TPA en el que se desvelan modificaciones del aminoácido en la posición 276. El experto en la materia, cuando está preparado con la presente divulgación y con las enseñanzas del presente documento, observará fácilmente que la presente invención comprende las secuencias de TPA expuestas en el presente documento, así como las variantes bien conocidas por alguien versado en la literatura.
La expresión de TPA a partir de una secuencia de ácidos nucleicos que codifican la misma es bien conocida en la técnica, y se describe, en detalle, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.753.486. Los ensayos para determinar las propiedades biológicas de una molécula de TPA preparada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención son bien conocidos de forma similar en la técnica. En resumen, como se desvela en cualquier parte del presente documento, se puede ensayar la capacidad de una molécula de TPA sintetizada para lisar fibrina en presencia de concentraciones saturantes de plasminógeno, de acuerdo con el procedimiento de Carlsen y col. (1988, Anal. Biochem. 168: 428). El ensayo de lisis del coágulo in vitro mide la actividad de los activadores de tipo tejido mediante turbidimetría usando un analizador microcentrífugo. Una mezcla de trombina y TPA se centrifuga en una mezcla de fibrinógeno y plasminógeno para iniciar la formación de coágulos y la posterior disolución de los coágulos. El perfil resultante de absorbancia frente al tiempo se analiza para determinar el punto final del ensayo. Las actividades de las variantes de TPA se comparan con una curva estándar de TPA. El tampón usado a lo largo del ensayo es fosfato sódico 0,06 M, a pH 7,4 que contiene TWEEN 80 al 0,01% (v/v) y azida sódica al 0,01% (p/v).
La trombina humana está en una concentración de aproximadamente 33 unidades/ml. El fibrinógeno (proteína coagulable a 2,0 mg/ml) se enfría en hielo húmedo para precipitar la fibronectina y después se filtra por gravedad. El Glu-plasminógeno está en una concentración de 1 mg/ml. La temperatura de la cámara de analizador se ajusta a 37 ºC. El cargador se ajusta para dispensar 20 microlitros de TPA (aproximadamente de 500 nanogramos/mililitro a aproximadamente 1,5 microgramos por mililitro) como la muestra para la curva convencional, o 20 microlitros de la variante de los TPA a una concentración para provocar la lisis dentro del intervalo de la curva convencional. Veinte microlitros de trombina como reactivo secundario, y 200 microlitros de una mezcla de fibrinógeno:plasminógeno a
50:1
(v/v) como reactivo primario. Se usa al programa de absorbancia/tiempo con un tiempo de incubación de 5 min, filtro de 340 nanómetros y lecturas a intervalos de 90 segundos.
L.
IL-2
La presente invención incluye adicionalmente un procedimiento para la remodelación y la modificación de IL-2. IL-2 es el factor de crecimiento principal de los linfocitos T y aumenta las respuestas inmunes humorales y celulares mediante la estimulación de los linfocitos T citotóxicos CD8 y las células NK. IL-2 por lo tanto es fundamental en los mecanismos de defensa frente a tumores e infecciones víricas. IL-2 también se usa en terapia frente al melanoma metastásico y al adenocarcinoma renal; y se ha usado en ensayos clínicos en muchas formas de cáncer. Además, también se usado IL-2 en pacientes infectados por VIH cuando lleva a un aumento significativo en los recuentos de células CD4.
Dado el éxito que ha demostrado IL-2 en la dirección y el tratamiento de enfermedades que amenazan la vida tales como diversos cánceres y SIDA, se deduce que los procedimientos de la presente invención serían útiles para el desarrollo de una molécula de IL-2 que tenga una mayor vida media biológica, potencia aumentada, y en general, perfil terapéutico más similar al de IL-2 de tipo silvestre ya que se sintetiza secretado en el ser humano sano.
IL-2 se ha clonado y secuenciado, y las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos se presentan en el presente documento como SEC ID Nº: 27 y SEC ID Nº: 28 (Figuras 64A y 64B, respectivamente). La presente invención no se debería interpretar de ningún modo como limitante de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de IL-2 expuestas en el presente documento. Las variantes de IL-2 se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.348.193, en la que la asparagina en la posición 88 está sustituida por arginina, y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.206.344, en la que se describe un polímero que comprende variantes de IL-2 con diversas sustituciones de aminoácidos. La presente invención incluye estas variantes de IL-2 y otras bien conocidas en la técnica.
Los procedimientos para la expresión y para determinar la actividad de IL-2 son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.417.970. En resumen, la expresión de IL-2, o variantes del mismo, se pueden conseguir en una diversidad de sistemas tanto procarióticos como eucarióticos, que incluyen E. coli, células CHO, células BHK, células de insectos que usan un sistema de expresión de baculovirus, todos los cuales son bien conocidos en la técnica.
Los ensayos para la actividad de un IL-2 modificado preparado de acuerdo con los procedimientos de la presente invención pueden transcurrir como sigue a continuación. Los linfocitos de sangre periférica se pueden separar de los eritrocitos y de los granulocitos por centrifugación en un gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) mediante el procedimiento descrito, por ejemplo, en A. Boyum y col. (Methods in Enzymology, 1984, Vol. 108, página 88, Academic Press, Inc.). Los linfocitos se lavan posteriormente aproximadamente tres veces en medio de cultivo que consiste en RPMI 1640 (Gibco-BRL, La Jolla, CA) más suero humano AB al 10% (CTS Purpan, Toulouse, Francia) inactivado por calor (1 hora a 56 ºC), piruvato sódico 2 mM, HEPES 5 mM, L-glutamina 4 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 0,25 μg/ml de anfotericina B (medio completo). Las células adhesivas (monocitos y macrófagos) se eliminan por adhesión al plástico y el resto de las células se suspenden en medio completo a una concentración de aproximadamente 5 a 10 x 105 células por mililitro y se siembran en matraces de cultivo a una densidad de aproximadamente 1-2 x 105 células por centímetro cuadrado. Los matraces se incuban después a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5% durante aproximadamente 1 hora, después de lo cual los linfocitos no adhesivos se recuperan por aspiración después de una agitación suave de los matraces de cultivo.
Los linfocitos no adhesivos se lavan una vez y se cultivan a una concentración de aproximadamente 105 células por mililitro en medio completo en presencia del IL-2 de la presente invención durante aproximadamente 48 horas en una incubadora como se ha descrito anteriormente. Las células después se lavan una vez.
La actividad citotóxica de las células se evalúa después de aproximadamente 4 horas de contacto con las células diana de la línea linfoide T humana C8166-45/C63 (células HT1) resistente a la citotoxicidad de las células NK, como se describe en Salahuddin y col. (1983, Virology 129: 51-64, 1984, Science 223, 703-707). 6 x 105 células HT1 se marcan con radiación con aproximadamente 200 μCi de 51Cr (cromato sódico, Amersham, Arlington Heights, IL) a 37 ºC durante aproximadamente 1 hora en medio completo sin suero, y después se lavan varias veces. Las células diana y las células eficaces se distribuyen en placas para microtitulación de fondo redondo con relaciones variables de células eficaces para las células diana (50:1, 10:1, 1:1). Las placas para microtitulación se centrifugan y, después de la incubación como se ha descrito anteriormente, el sobrenadante de cada pocillo se recupera y se mide la radiactividad usando un contador gamma. La citotoxicidad se determina a partir de la cantidad de 51Cr liberado por las células diana muertas. La citotoxicidad no específica se determina a partir de la cantidad de radiactividad liberada espontáneamente de las células diana en ausencia de células eficaces.
El presente procedimiento es sólo uno de los muchos bien conocidos en la técnica para medir la citotoxicidad de las células efectoras, y no se debería interpretar como una limitación de la presente invención.
M. Factor VIII
La presente invención incluye adicionalmente un procedimiento para la remodelación y la modificación del Factor
VIII. Como se ha descrito anteriormente para el Factor VII y el Factor IX, el Factor VIII es un componente crítico de la secuencia de la coagulación sanguínea. El Factor Humano VIII (factor antihemofílico; FVIII:C) es una proteína plasmática humana que consiste en 2 péptidos (peso molecular de la cadena ligera de 80 kDa y peso molecular de la cadena pesada variable de 90 a 220 kDa, dependiendo del estado de glicosilación). Se trata de un cofactor esencial en la secuencia de la coagulación y es necesario para la conversión del Factor X en su forma activa (Factor Xa). El factor VIII circula en el plasma como un complejo no covalente con el factor de von Willebrand (también conocido como FVIII:RP), un dímero de un péptido de 2050 aminoácidos (Véase, Patente de Estados Unidos Nº 6.307.032). Las concentraciones en sangre del Factor VIII inferiores a un 20% de lo normal causan un trastorno hemorrágico denominado hemofilia A. Los niveles en sangre del Factor VIII inferiores a un 1% dan como resultado un trastorno de sangrado grave, siendo el síntoma más común las hemorragias articulares espontáneas.
Al igual que otros factores de coagulación de la sangre, el Factor VIII es un agente terapéutico con un gran potencial para el tratamiento de diversos trastornos hemorrágicos, tales como la hemofilia A y la hemofilia B. Debido a la glicosilación de la cadena pesada, los procedimientos actuales para la preparación del Factor VIII a partir de células recombinantes da como resultado un producto que no es tan eficaz como el Factor VIII natural. Los procedimientos de purificación del plasma humano dan como resultado una composición en bruto que es menos eficaz y más difícil de preparar que el Factor VIII recombinante. La presente invención busca mejorar esta situación.
Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del Factor VIII se presentan en el presente documento como SEC ID Nº: 29 y SEC ID Nº: 30, respectivamente (Figuras 65A y 65B, respectivamente). La técnica está repleta de variantes del Factor VIII, como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.668.108, en la que el ácido aspártico en la posición 1241 se reemplaza con un ácido glutámico con los cambios del ácido nucleico adjunto también. La Patente de Estados Unidos Nº 5.149.637 describe variantes del Factor VIII que comprenden la fracción C-terminal, ya sea glicosilada o sin glicosilar, y la Patente de Estados Unidos Nº 5.661.008 describe una variante del Factor VIII que comprende los aminoácidos 1-740 unidos a los aminoácidos 1649 a 2332 mediante al menos 3 restos de aminoácidos. Por lo tanto, variantes, derivados, modificaciones y complejos del Factor VIII son bien conocidos en la técnica, y están incluidos en la presente invención.
Los sistemas de expresión para la producción del Factor VIII son bien conocidos en la técnica, e incluyen células procarióticas y eucarióticas, como se ejemplifica en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.633.150, Nº 5.804.420, y Nº 5.422.250.
Para determinar la actividad biológica de una molécula de Factor VIII sintetizada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención, el experto en la materia observará que los ensayos descritos en el presente documento para la evaluación del Factor VII y del Factor IX son aplicables al Factor VIII.
N. Uroquinasa
La presente invención también incluye un procedimiento para la remodelación y/o la modificación de la uroquinasa. La uroquinasa es una serina proteasa que activa el plasminógeno a plasmina. La proteína se sintetiza en una diversidad de tejidos que incluyen endotelio y riñón, y se excreta en cantidades traza en la orina. La uroquinasa purificada existe en dos formas activas, una forma de alto peso molecular (HUK; aproximadamente 50 kDa) y una forma de bajo peso molecular (LUK; aproximadamente 30 kDa). Se ha demostrado que LUK se deriva de HUK mediante una proteólisis después de la lisina 135, liberando los primeros 135 aminoácidos de HUK. La sabiduría convencional ha sostenido que HUK o LUK se deben convertir en formas proteolíticamente activas mediante la hidrólisis proteolítica de un único precursor de la cadena, también denominado prouroquinasa, entre la lisina 158 y la isoleucina 159 para generar una forma activada de dos cadenas (que sigue correspondiendo con HUK o LUC). Las especies de uroquinasa proteolíticamente activas resultantes de este recorte hidrolítico contienen dos cadenas de aminoácidos unidas entre sí mediante un único enlace disulfuro. Las dos cadenas formadas mediante el recorte de activación se denominan las cadenas A o A1 (HUK o LUK, respectivamente), y la cadena B que comprende el dominio de proteasa de la molécula.
Se ha mostrado que la uroquinasa es un agente trombolítico eficaz. Sin embargo, ya que se produce naturalmente en cantidades traza, el coste de la enzima es elevado para una dosificación eficaz. La uroquinasa se ha producido en cultivo celular recombinante, y el ADN que codifica la uroquinasa se conoce junto con vectores adecuados y microorganismos huésped. Las composiciones actuales que comprenden uroquinasa y los procedimientos para producir uroquinasa de forma recombinante se ven obstaculizados por un producto que tiene patrones de glicosilación deficientes, y dada la complejidad de los sucesos de escisión proteolítica de que rodean a la activación de la uroquinasa, esta glicosilación aberrante conduce a un producto menos eficaz y menos potente.
La secuencia de los nucleótidos que codifican la cadena primaria de aminoácidos de la uroquinasa se representa en la SEC ID Nº: 33 y en la SEC ID Nº: 34 (Figuras 66A y 66B, respectivamente). Las variantes de uroquinasa son bien conocidas en la técnica, y por lo tanto, la presente invención no se limita a las secuencias expuestas en el presente documento. De hecho, el experto en la materia observará fácilmente que las variantes de uroquinasa descritas, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.219.569, Nº 5.648.253, y Nº 4.892.826, existen como restos funcionales, y por lo tanto están incluidas en la presente invención.
La expresión y la evaluación de una molécula de uroquinasa preparada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención son igualmente bien conocidas en la técnica. Como un ejemplo no limitante, la expresión de la uroquinasa en diversos sistemas se detalla en la Patente de Estados Unidos Nº 5.219.569. Un ensayo para determinar la actividad y la funcionalidad de una uroquinasa preparada de acuerdo con los procedimientos expuestos en el presente documento se describen en toda la literatura, y son similares a los ensayos para otros ensayos relacionados con los plasminógenos y la fibrina expuestos completamente en otros lugares. Un ejemplo de un ensayo para determinar la actividad de una molécula de uroquinasa sintetizada como se describe en el presente documento puede ser como se describe, por ejemplo, en Ploug, y col. (1957, Biochim. Biophys. Acta 24: 278-282), usando placas de fibrina que comprenden un 1,25% de agarosa, 4,1 mg/ml de fibrinógeno humano, 0,3 unidades/ml de trombina y 0,5 μg/ml de inhibidor de tripsina de soja.
O. DNasa humana
La presente invención incluye adicionalmente un procedimiento para la remodelación y/o la modificación de DNasa humana recombinante. La DNasa I humana se ha ensayado como un agente terapéutico y se mostró que disminuye la viscosidad del moco de la fibrosis quística in vitro. Se ha determinado que la mucosidad purulenta contiene aproximadamente 10-13 mg/ml de ADN, un polímero iónico pronosticado como que afecta a las propiedades reológicas de los fluidos de las vías respiratorias. En consecuencia, la DNasa I pancreática bovina, una enzima que degrada el ADN, se ensayó como un agente mucolítico hace muchos años, pero no entró en la práctica clínica, debido a los efectos secundarios inducidos por la antigenicidad y/o proteasas contaminantes. La DNasa humana recombinante se usa actualmente como un agente terapéutico para aliviar los síntomas de enfermedades tales como fibrosis quística.
De forma similar a la DNasa derivada de fuentes bovinas, la DNasa humana recombinante plantea algunos problemas, principalmente debido a la eficacia reducida debido a la inadecuada glicosilación impartida por los sistemas de expresión en mamíferos que se usan actualmente. La presente invención describe un procedimiento para la remodelación de DNasa, lo que lleva a un aumento de la eficacia y a mejores resultados terapéuticos.
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la DNasa humana se presentan en el presente documento como SEC ID Nº: 39 y SEC ID Nº: 40 (Figuras 67A y 67B, respectivamente). Las variantes del péptido que comprende DNasa son bien conocidas en la técnica. Como un ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.348.343 describe una DNasa humana con múltiples sustituciones de aminoácidos en toda la estructura primaria. Además, la Patente de Estados Unidos Nº 6.391.607 describe una variante hiperactiva de DNasa con múltiples sustituciones de los aminoácidos en las posiciones 9, 14, 74, 75, y 205. Los presentes ejemplos, y otros bien conocidos en la técnica
o por descubrir en el futuro se incluyen en la presente invención.
Los sistemas de expresión para producir un péptido de DNasa son bien conocidos por el experto en la materia, y se han descrito en sistemas procarióticos y eucarióticos. Por ejemplo, la Publicación de Patente PCT Nº WO 90/07572 describe estos procedimientos con detalle considerable.
Los ensayos para determinar la actividad biológica de una molécula de DNasa desarrollada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención son bien conocidos en la técnica. Como un ejemplo, pero que de ninguna manera pretende ser limitante de la presente invención, en el presente documento se presenta un ensayo para determinar la actividad hidrolítica del ADN de la DNasa I humana. En resumen, se usan dos ensayos diferentes de digestión de plásmidos. El primer ensayo ("ensayo de digestión del ADN superenrollado") mide la conversión del ADN plásmido bicatenario superenrollado en las formas relajada (mellada), lineal, y degradada. El segundo ensayo ("ensayo de digestión del ADN lineal") midió la conversión del ADN plásmido bicatenario lineal en formas degradadas. Específicamente, la DNasa preparada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención se añade a 160 microlitros de una solución que comprende 25 microgramos por mililitro de ADN plásmido superenrollado o ADN plásmido linealizado digerido con EcoRI en HEPES 25 mM, pH 7,1, 100 μg/ml de albúmina de suero bovino, MgCl2 1 mM, CaCl2 2,5 mM, NaCl 150 mM, y las muestras se incuban a temperatura ambiente. En diversos momentos, se retiran alícuotas de las mezclas de reacción y se inactivan mediante la adición de EDTA 25 mM, junto con xileno cianol, azul de bromofenol, y glicerol. La integridad del ADN plásmido en las muestras inactivadas se analiza por electroforesis de las muestras en geles de agarosa. Después de la electroforesis, los geles se tiñen con una solución de bromuro de etidio y el ADN en los geles se visualiza mediante luz ultravioleta. Las cantidades relativas de las formas superenrollada, relajada, y lineal del ADN plásmido se determinan mediante el barrido de los geles con una cámara fluorescente (tal como el Modelo FluorImager 575 de Molecular Dynamics) y la cuantificación de la cantidad de ADN en las bandas del gel que corresponden a la diferentes formas.
P. Insulina La invención incluye adicionalmente un procedimiento para la remodelación de insulina. La insulina es bien conocida como el tratamiento más eficaz para la diabetes de tipo I, en la que las células beta de los islotes del páncreas no producen insulina para la regulación de los niveles de glucosa en sangre. Las ramificaciones de la diabetes y la glucosa en sangre no controlada incluyen problemas circulatorios y en los pies, y ceguera, por no mencionar una diversidad de otras complicaciones que resultan de o que se ven empeoradas por la diabetes.
Antes de la clonación y de la secuenciación de la insulina humana, se usó la insulina porcina como un tratamiento para la diabetes. La insulina se produce actualmente de forma recombinante, pero la secuencia del aminoácido 51, corta de la molécula madura es una estructura compleja que comprende múltiples enlaces de sulfuro. Los procedimientos actuales para producir insulina de forma recombinante dan como resultado un producto que carece de similitud con la proteína nativa tal como se produce en los sujetos no diabéticos sanos. La presente invención busca la reparación de este defecto.
La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de la insulina humana se representa en la SEC ID Nº: 43 y en la SEC ID Nº: 44, respectivamente (Figuras 68A y 68B, respectivamente). Las variantes de la insulina son abundantes a lo largo de toda la técnica. La Patente de Estados Unidos Nº 6.337.194 describe análogos de proteínas de fusión de insulina, la Patente Estados Unidos Nº 6.323.311 describe derivados de insulina que comprenden un anhídrido cíclico de un ácido dicarboxílico, y la Patente de Estados Unidos Nº 6.251.856 describe un derivado de insulina que comprende múltiples sustituciones de aminoácidos y un grupo lipofílico. El experto en la materia observará que los siguientes ejemplos de derivados de insulina de ninguna manera son exhaustivos, sino que simplemente representan una pequeña muestra de los bien conocidos en la técnica. Por lo tanto, la presente invención comprende derivados de insulina conocidos o por descubrir.
Los sistemas de expresión para la producción de insulina son bien conocidos en la técnica, y se pueden conseguir usando técnicas de biología molecular como se describe, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York).
Los ensayos para determinar la funcionalidad de una molécula de insulina preparada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención son igualmente bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un modelo in vivo de la disminución de glucosa se puede usar para evaluar la actividad biológica de la insulina sintetizada usando los procedimientos de la presente invención. Es útil para este fin un modelo de rata. Los animales se mantienen en ayunas durante una noche (16 horas) antes del experimento, y después se anestesian con pentobarbital sódico administrado por vía intraperitoneal u otro anestésico adecuado, tal como ketamina. Cada animal recibe una inyección i.v. (vena de la cola) del derivado de insulina en particular (20 μg/ml kg). Las muestras de sangre se toman de la vena yugular 15 y 5 minutos antes de la inyección y 15, 30, 60, 90, 120, 180, y 240 minutos después de la inyección. Los niveles de glucosa en sangre se miden con un medidor de glucosa en sangre, disponible en una diversidad de proveedores comerciales.
Q. Vacunas contra Hepatitis B (HBsAg)
La presente invención comprende adicionalmente un procedimiento para la remodelación del antígeno usado en las vacunas contra la hepatitis B (HbsAg o Hepatitis B sAg). HBsAg es un antígeno de superficie producido de forma recombinante de la proteína S de la hepatitis B, y se usa para obtener una respuesta inmune al virus de la hepatitis B, un virus cada vez más peligroso que da como resultado, entre otras cosas, enfermedades hepáticas que incluyen cirrosis y carcinoma, y da como resultado más de 1 millón de muertes anualmente en el mundo. Actualmente, la vacuna HBsAg se administra tres veces durante un intervalo de seis meses para obtener una respuesta inmune protectora y neutralizadora.
HBsAg se produce actualmente en cepas de levadura, y por lo tanto refleja los patrones de glicosilación nativa a un hongo. La presente invención proporciona un procedimiento para remodelar HBsAg, dando como resultado, entre otras cosas, mejora de la inmunogenicidad y anticuerpos con afinidad mejorada para el virus.
Las secuencias de la proteína S a partir de una cadena de ácidos nucleicos y de aminoácidos primarios del virus de la Hepatitis B (HBsAg) se describen en el presente documento como SEC ID Nº: 45 y SEC ID Nº: 46 (Figuras 69A y 69B, respectivamente). El nucleótido tiene 1203 bases de longitud. El aminoácido tiene 400 restos de longitud. Los últimos 226 restos de aminoácidos son el antígeno S pequeño, que se usa en la vacuna de GlaxoSmithKline y en la vacuna de Merck. Cincuenta y cinco aminoácidos cadena arriba desde el antígeno S pequeño son el codón de inicio de Pre-S. Las regiones Pre-S + S son el antígeno S medio, que se usa en la vacuna de Aventis Pasteur. Desde el primer codón de inicio al codón de inicio pre-S se compone el resto de la proteína S, y se denomina proteína S grande. Esto no es más que un ejemplo del HBsAg usado en vacunas, y se conocen bien otros subtipos, como se ejemplifica en las referencias del GenBank: Nº AF415222, Nº AF415221, Nº AF415220, y Nº AF415219. Las secuencias presentadas en el presente documento simplemente son ejemplos de HBsAg conocidos en la técnica. Se han aislado antígenos similares a partir de otras cepas del virus de la hepatitis B, y se puede haber evaluado o no la antigenicidad y el potencial como candidatos a vacunas. La presente invención incluye por lo tanto antígenos de superficie de la proteína S para la vacuna de la hepatitis B conocidos o por descubrir.
La expresión de un HBsAg en un sistema de expresión es un procedimiento de rutina para un experto en la materia, y se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.851.823. Los ensayos para determinar la inmunogenicidad de una vacuna son bien conocidos en la técnica, y comprenden diversos ensayos para la producción de anticuerpos de neutralización, y usan técnicas tales como ELISA, ensayos de neutralización, transferencias de Western e inmunoprecipitación. En resumen, se describe un ELISA de tipo sándwich para la detección de anticuerpos anti-HBsAg eficaces. El ensayo de HBsAg con Enzygnost (Aventis Behring, King of Prussia, PA) se usa para dichos procedimientos. Los pocillos se recubren con anti-HBs. Se añaden a los pocillos plasma de suero o proteína purificada y controles apropiados y se incuban. Después del lavado, los anticuerpos marcados con peroxidasa a HBsAg se hacen reaccionar con los determinantes antigénicos restantes. Los anticuerpos de tipo enzima sin unir se retiran mediante lavado y se determina la actividad de la enzima en fase sólida mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. La reacción catalizada enzimáticamente de peróxido de hidrógeno y cromógeno se detiene mediante la adición de ácido sulfúrico diluido. La intensidad del color es proporcional a la concentración de HBsAg de la muestra y se obtiene por comparación fotométrica de la intensidad del color de las muestras desconocidas con las intensidades del color de los sueros del control positivo y negativo adjuntos.
R. Hormona de Crecimiento Humano
La presente invención incluye adicionalmente un procedimiento para la remodelación de la hormona de crecimiento humano (HGH). La isoforma de HGH que se secreta en la pituitaria humana, consiste en 191 aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 21.500. La isoforma de HGH que se produce en la placenta es una forma glicosilada. HGH participa en gran parte de la regulación del crecimiento y del desarrollo humano normal, incluyendo el crecimiento lineal (somatogénesis), lactancia, activación de macrófagos, y los efectos de tipo insulina y diabetogénicos, entre otros.
HGH es una hormona compleja, y sus efectos varían como resultado de las interacciones con diversos receptores celulares. Mientras que las composiciones que comprenden HGH se han usado en el ámbito clínico, especialmente para tratar el enanismo, la eficacia está limitada por la estructura de glicosilación de la HGH producida de forma recombinante.
La secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos de HGH se exponen en cualquier parte del presente documento como SEC ID Nº: 47 y SEC ID Nº: 48 (Figuras 70A y 70B, respectivamente). El experto en la materia observará que variantes, derivados, y mutantes de HGH son bien conocidos. Se pueden encontrar ejemplos en la Patente de Estados Unidos Nº 6.143.523, en la que los restos de aminoácidos en las posiciones 10, 14, 18, 21, 167, 171, 174, 176 Y 179 están sustituidos, y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.962.411 se describen variantes de empalme de HGH . La presente invención incluye estas variantes de HGH conocidas en la técnica o por descubrir.
Los procedimientos para la expresión de HGH en células recombinantes se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.795.745. Los procedimientos para la expresión de HGH, entre otros, en procariotas, eucariotas, sistemas de células de insectos, plantas, y sistemas de traducción in vitro son bien conocidos en la técnica.
Una molécula de HGH producida usando los procedimientos de la presente invención se puede someter a ensayo para la actividad usando una diversidad de procedimientos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.734.024 describe un procedimiento para determinar la funcionalidad biológica de un HGH expresado.
S. Anticuerpos
La presente invención comprende adicionalmente un procedimiento para la remodelación de diversas preparaciones de anticuerpos quiméricos, que incluyen, TNFR quimérico, anti-glicoproteína IIb/IIIa quimérica, anti-HER2 quimérico, anti-RSV quimérico, anti-CD20 quimérico, y anti-TNF quimérico. Las preparaciones de anticuerpos quiméricos comprenden una porción de Fc humano a partir de un anticuerpo IgG y las regiones variables de un anticuerpo monoclonal específico para un antígeno. Otras preparaciones comprenden un receptor, por ejemplo el receptor de TNF de 75 kDa, condensado con una porción de Fc de IgG humano. Estas moléculas incluyen adicionalmente fragmentos de Fab que comprenden cadenas ligeras y pesadas de seres humanos y de ratones. Un TNFR quimérico es útil en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide. La antiglicoproteína IIb/IIIa quimérica es útil en el tratamiento de anomalías cardíacas, coagulación de la sangre, y alteraciones de la función plaquetaria. Un anticuerpo quimérico anti-HER2 es útil como un tratamiento para el cáncer de mama, anti-RSV quimérico es útil para el tratamiento del virus respiratorio sincitial, anti-CD20 quimérico es útil para el tratamiento del linfoma no Hodgkin, y se usa anti-TNF quimérico para el tratamiento de la enfermedad de Crohn.
Mientras que estos anticuerpos quiméricos han demostrado ser útiles en el tratamiento de diversas enfermedades, la administración tiene que ser bastante frecuente y en dosis bastante elevadas debido a la vida media relativamente corta de una proteína recombinante producida en células de roedores. Si bien la mayoría del anticuerpo quimérico es humano, y por lo tanto, se considera como "auto" por el sistema inmune, se degradan y se destruyen debido a los patrones de glicosilación no nativos. La presente invención propone solucionar este problema, aumentando en gran medida la eficacia de estos nuevos medicamentos.
Anticuerpos y Procedimientos para su Generación
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que es capaz de unirse específicamente a un epítopo específico en un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son típicamente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos de la presente invención pueden existir en una diversidad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, así como anticuerpos de cadena única y anticuerpos humanizados (Harlow y col., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow y col., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos de América 85: 5879-5883; Bird y col., 1988, Science
242: 423-426).
Por el término "anticuerpo sintético" como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un bacteriófago como se describe en el presente documento. Se debería interpretar que el término se refiere a un anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa un péptido de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en el que se ha obtenido la secuencia de ADN o de aminoácidos usando tecnología de ADN sintético o de secuencia de aminoácidos que está disponible y es bien conocida en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la longitud completa o fragmentos peptídicos de un péptido o péptidos se pueden preparar usando cualquier procedimiento de preparación de anticuerpos monoclonales bien conocido, tales como los que se describen, por ejemplo, en Harlow y col. (1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) y en Tuszynski y col. (1988, Blood, 72: 109-115). Las cantidades del péptido deseado también se pueden sintetizar usando tecnología de síntesis química. Como alternativa, el ADN que codifica el péptido deseado se puede clonar y expresar a partir de una secuencia promotora apropiada en células adecuadas para la generación de grandes cantidades de péptido. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el péptido se generan a partir de ratones inmunizados con el péptido usando procedimientos convencionales como se hace referencia en el presente documento.
El ácido nucleico que codifica el anticuerpo monoclonal obtenido usando los procedimientos descritos en el presente documento se puede clonar y secuenciar usando la tecnología que está disponible en la técnica, y se describe, por ejemplo, en Wright y col. (1992, Critical Rev. in Immunol. 12 (3, 4): 125-168) y en las referencias citadas en el mismo. Además, el anticuerpo de la invención se puede "humanizar" usando la tecnología descrita en Wright y col., (anteriormente) y en las referencias citadas en el mismo, y en Gu y col. (1997, Thrombosis and Hematocyst 77 (4): 755-759).
Para generar una biblioteca de anticuerpos de fagos, se obtiene primero una biblioteca de DNAc a partir de ARNm que se aísla de las células, por ejemplo, el hibridoma, que expresa el péptido deseado a expresar en la superficie del fago, por ejemplo, el anticuerpo deseado. Las copias de ADNc del ARNm se producen usando la transcriptasa inversa. El ADNc que especifica los fragmentos de inmunoglobulina se obtiene por PCR y el ADN resultante se clona en un vector bacteriófago adecuado para generar una biblioteca de bacteriófagos que comprende los genes de la inmunoglobulina que especifican el ADN. Los procedimientos para preparar una biblioteca de bacteriófagos que comprende ADN heterólogo son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y Russell (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).
Los bacteriófagos que codifican el anticuerpo deseado, se pueden diseñar de tal manera que el péptido se muestra en la superficie del mismo de tal manera que esté disponible para la unión a su correspondiente péptido de unión, por ejemplo, el antígeno contra el que se dirige el anticuerpo. De este modo, cuando el bacteriófago que expresa un anticuerpo específico se incuba en presencia de una célula que expresa el antígeno correspondiente, el bacteriófago se unirá a la célula. Los bacteriófagos que no expresan el anticuerpo no se unirán a la célula. Dichas técnicas de tomas panorámicas son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Wright y col., (anterior).
Procedimientos tales como los que se han descrito anteriormente, se han desarrollado para la producción de anticuerpos humanos que usan bacteriófagos de presentación de M13 (Burton y col., 1994, Adv. Immunol. 57: 191280). Básicamente, se genera una biblioteca de ADNc a partir del ARNm obtenido de una población de células que producen anticuerpos. El ARNm codifica genes reorganizados de inmunoglobulina y, por tanto, el ADNc codifica lo mismo. El ADNc amplificado se clona en vectores de expresión de M13 creando una biblioteca de fagos que expresan fragmentos de anticuerpos humanos en su superficie. Los fagos que presentan el anticuerpo de interés se seleccionan mediante la unión al antígeno y se propagan en bacterias para producir inmunoglobulina humana soluble. De este modo, en contraste con la síntesis convencional de anticuerpos monoclonales, este procedimiento inmortaliza el ADN que codifica la inmunoglobulina humana en lugar de las células que expresan la inmunoglobulina humana.
Glicanos de remodelación de moléculas de anticuerpos La glicosilación específica de una clase de péptidos, es decir, las inmunoglobulinas, tiene un efecto particularmente importante sobre la actividad biológica de estos péptidos. No se debería interpretar la invención como limitada exclusivamente a las inmunoglobulinas de la clase IgG, sino que también se debería interpretar que incluye las inmunoglobulinas de las clases de anticuerpos IgA, IgE e IgM.
Adicionalmente, no se debería interpretar que la invención se limita exclusivamente a cualquier tipo de estructura tradicional de anticuerpos. Más bien, se debería interpretar que la invención incluye todos los tipos de moléculas de anticuerpos, que incluyen, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, etc.
Una molécula de inmunoglobulina típica comprende una porción efectora y una porción de unión a antígeno. Para una revisión de las inmunoglobulinas, véase Harlow y col., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York, y Harlow y col., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. La porción efectora de la molécula de inmunoglobulina reside en la porción Fc de la molécula y es responsable, en parte, de una unión eficaz de la inmunoglobulina a su receptor celular afín. La glicosilación inadecuada de moléculas de inmunoglobulina particularmente en el dominio CH2 de la porción Fc de la molécula, afecta a la actividad biológica de la inmunoglobulina.
Más específicamente con respecto a la inmunoglobulina IgG, la función efectora de IgG está regulada en gran parte por si o no la IgG contiene un resto de N-acetilglucosamina (GlcNAc) unido en la posición 4-O de la manosa ramificada del núcleo de trimanosilo del N-glicano en la Asparagina 297 (Asn) en el dominio CH2 de la molécula de IgG. Este resto se conoce como una "GlcNAc bisectriz." El fin de añadir GlcNAc bisectriz a las cadenas de N-glicano de una molécula de IgG natural o recombinante o a un constructo quimérico que contiene IgG-Fc es optimizar la función efectora inmune de Fc de la porción Fc de la molécula. Dichas funciones efectoras pueden incluir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y otros efectos biológicos que necesitan una unión eficaz a los receptores FcγR, y la unión al componente C 1 del complemento. Se ha descrito la importancia de la GlcNAc bisectriz para conseguir una función efectora inmune máxima de las moléculas de IgG (Lifely y col., 1995, Glycobiology 5 (8): 813-822; Jeffris y col., 1990, Biochem. J. 268 (3): 529-537).
Los glicanos encontrados en el sitio de N-glicosilación en Asn 297 en el dominio CH2 de las moléculas de IgG se han caracterizado estructuralmente para las moléculas de IgG encontradas circulando en el plasma de sangre humana y animal, la IgG producida por células de mieloma, células de hibridoma, y una diversidad de líneas celulares de mamíferos y de insectos inmortalizadas transfectadas. En todos los casos el N-glicano es una cadena de alta manosa o una cadena biantenaria completa (Man3, GlcNAc4, GAL2, NeuAc2, Fuc1) o incompleta de forma variable o sin GlcNAc bisectriz (Raju y col., 2000, Glycobiology 10 (5): 477-486; Jeffris y col., 1998, Immunological. Rev. 163L59-76; Lerouge y col., 1998, Plant Mol. Biol. 38: 31-48; James y col., 1995, Biotechnology 13: 592-596).
La presente invención proporciona una molécula de inmunoglobulina glicosilada adaptada in vitro. La molécula de inmunoglobulina puede ser cualquier molécula de inmunoglobulina, que incluye pero no se limita a, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo sintético, un anticuerpo quimérico, y un anticuerpo humanizado. Los procedimientos específicos para la generación de moléculas de anticuerpo y su caracterización se desvelan en cualquier parte en el presente documento. Preferentemente, la inmunoglobulina es IgG, y más preferentemente, la IgG es una IgG humanizada o humana, lo más preferentemente, IgG1.
La presente invención contempla específicamente el uso de β1,4-manosil-glicopéptido β1,4-Nacetilglucosaminiltransferasa, GnT-III: EC2.4.1.144 como un reactivo in vitro para unir glicosídicamente la Nacetilglucosamina (GlcNAc) en la posición 4-O de la manosa ramificada del núcleo de trimanosilo del N-glicano en Asn 297 en el dominio CH2 de una molécula de IgG. Sin embargo, como se observará a partir de la divulgación que se proporciona en el presente documento, no se debería interpretar que la invención incluye únicamente el uso de esta enzima para proporcionar una GlcNAc bisectriz a una molécula de inmunoglobulina. Más bien, se ha descubierto que es posible modular el patrón de glicosilación de una molécula de anticuerpo de modo que la molécula de anticuerpo presenta actividad biológica potenciada, es decir, función efectora, además de la mejora potencial de otras propiedades, por ejemplo, la estabilidad.
En la presente invención se proporciona un procedimiento general para la eliminación de moléculas de fucosa del glicano unido al N de la Asn(297) con el fin de potenciar la unión a Fc-gammaRIIIA, y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos potenciada (véase, Shields y col., 2002, J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). El procedimiento implica poner en contacto la molécula de anticuerpo con una fucosidasa apropiada para la unión de la molécula o moléculas de fucosa en el glicano o glicanos del anticuerpo. Como alternativa, el anticuerpo recombinante se puede expresar en células que expresan fucosiltransferasas, tal como la variante Lec 13 de las células CHO. La eliminación de fucosa a partir del glicano o glicanos del anticuerpo se puede hacer solo, o en conjunto con otros procedimientos para remodelar los glicanos, tal como añadir una GlcNAc bisectriz. La expresión de anticuerpos en células que carecen de GnT-I también puede dar como resultado glicanos de Fc que carecen de núcleo de fucosa, que se pueden modificar adicionalmente mediante la presente invención.
En la presente invención se proporciona un procedimiento general para introducir una GlcNAc bisectriz con el fin de potenciar la función efectora inmune de Fc en cualquier preparación de moléculas de IgG que contienen oligosacáridos unidos a N en el dominio CH2, típicamente en Asn 297. El procedimiento requiere que la población de moléculas de IgG se lleve a un estado de glicosilación de tal manera que la cadena del glicano sea un aceptor de GnT-III. Esto se consigue en una cualquiera de tres maneras: 1) mediante selección o manipulación genética de un sistema de expresión del huésped que secreta la IgG con cadenas de N-glicanos que son sustratos para GnT-III; 2) mediante tratamiento de una población de glicoformas de IgG con exoglicosidasas de tal manera que la estructura o las estructuras del glicano restante después del tratamiento con exoglicosidasa sea un aceptor de GnT-III, 3) alguna combinación de la selección de huésped y tratamiento con exoglicosidasa como en 1) y 2) mencionados anteriormente, más sucesivas adiciones de GlcNAc mediante GnT-I y GnT-II para crear un aceptor para GnT-III.
Por ejemplo, la IgG obtenida a partir de plasma de pollo contiene principalmente cadenas de alta manosa y requeriría digestión con una o más α-manosidasas para crear un sustrato para la adición de GlcNAc a la rama α1,3 Manosa del núcleo de trimanosilo mediante GnT-I. Este sustrato podría ser el núcleo de trimanosilo fundamental, Man3GlcNAc2. El tratamiento de esta estructura de núcleo secuencialmente con GnT-I seguido de GnT-II seguido de GnT-III usando UDP-GlcNAc como un donador de azúcar crearía Man3GlcNAc5 como se muestra en la Figura 2. Opcionalmente, esta estructura después se puede extender mediante el tratamiento con β1,4 galactosiltransferasa. Si fuera necesario, el oligosacárido galactosilado se puede ampliar adicionalmente usando α2,3-o α2,6sialiltransferasa para conseguir una estructura biantenaria completada. Usando este procedimiento se pueden remodelar las cadenas biantenarias de glicano según sea necesario para la función efectora inmune de Fc óptima de cualquier IgG terapéutica en fase de desarrollo (Figura 4).
Como alternativa, las moléculas de IgG que se encuentran en el plasma de la mayoría de los animales o la IgG que se secreta como un producto recombinante por la mayoría de las células animales o por animales transgénicos incluyen típicamente un espectro de glicoformas biantenarias que incluye formas completas (NeuAc2, GAL2, GlcNAc4, Man3, ±Fuc1) (Figura 4) y variablemente incompletas, con o sin GlcNAc bisectriz (Raju y col., 2000, Glycobiology 10 (5): 477-486; Jeffris y col., 1998, Immunological Rev. 163: 59-76). Para asegurar que el GlcNAc bisectriz está presente en toda la población de moléculas de inmunoglobulina producidas de esta manera, la mezcla de moléculas se puede tratar con las siguientes exoglicosidasas, sucesivamente o en una mezcla: neuraminidasa, βgalactosidasa, β-glucosaminidasa, α-fucosidasa. El núcleo de trimanosilo resultante se puede remodelar después usando glicosiltransferasas como se ha indicado anteriormente.
Además, se ha caracterizado la IgG secretada por animales transgénicos o almacenada como "planticuerpos" mediante plantas transgénicas. Una molécula de IgG producida en una planta transgénica que tiene N-glicanos que contienen xilosa unida a β1,2 y/o fucosa unida a α1,3 se puede tratar con exoglicosidasas para eliminar esos restos, además de las exoglicosidasas que se han descrito anteriormente para crear el núcleo de trimanosilo o una estructura de Man3GlcNAc4, y después se tratan con glicosiltransferasas para remodelar el N-glicano como se ha descrito anteriormente.
El nuevo aspecto primario de la presente invención es la aplicación de las glicosiltransferasas apropiadas, con o sin tratamiento previo con exoglicosidasa, aplicadas en la secuencia correcta para optimizar la función efectora del anticuerpo. En una realización ejemplar, una GlcNAc bisectriz se introduce en los glicanos de las moléculas de IgG o de otros constructos quiméricos de IgG-Fc en los que se necesita GlcNAc bisectriz. En otra realización ejemplar, se retira la fucosa núcleo a partir de los glicanos de moléculas de IgG o de otros constructos quiméricos de IgG-Fc.
Receptor de TNF-proteína de fusión de IgG Fc
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del receptor de TNF humano de 75 kDa se exponen en el presente documento como SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32, respectivamente (Figuras 71A y 71B, respectivamente). Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables ligera y pesada del anti-HER2 quimérico se exponen como SEC ID Nº: 35 y SEC ID Nº: 36, respectivamente (Figuras 72A y 72B, respectivamente). Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables ligera y pesada del anti-VRS quimérico se describen como SEC ID Nº: 38 y SEC ID Nº: 37, respectivamente (Figuras 73A y 73B, respectivamente). Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables no humanas de anti-TNF se exponen en el presente documento como SEC ID Nº: 41 y SEC ID Nº: 42, respectivamente (Figuras 74A y 74B, respectivamente). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la porción Fc de la IgG humana se exponen como SEC ID Nº: 49 y SEC ID Nº: 50 (Figuras 75A y 75B, respectivamente).
MAb anti-glicoproteína IIb/IIIa
Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de anticuerpos murinos de anti-glicoproteína IIb/IIIa se exponen en la SEC ID Nº: 52 (cadena ligera variable madura murina, Figura 76) y SEC ID Nº: 54 (cadena pesada variable madura murina, Figura 77). Estas secuencias murinas se pueden combinar con las secuencias de aminoácidos de IgG humana SEC ID Nº: 51 (cadena ligera variable madura humana, Figura 78), SEC ID Nº: 53 (cadena pesada variable madura humana, Figura 79), SEC ID Nº: 55 (cadena ligera humana, Figura 80) y SEC ID Nº: 56 (cadena pesada humana, Figura 81) de acuerdo con los procedimientos encontrados en la Patente de Estados Unidos Nº 5.777.085 para crear un anticuerpo murino humanizado quimérico de anti-glicoproteína IIb/IIIa. Otros anticuerpos humanizados de anti-glucoproteína IIb/IIIa se encuentran en la Patente de Estados Unidos Nº
5.877.006. Una línea celular que expresa la anti-glicoproteína IIb/IIIa MAb 7E3 se puede obtener en el mercado en la ATCC (Manassas, VA) con número de referencia HB-8832.
MAb anti-CD20
Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de un anticuerpo anti-CD20 quimérico se describen en la SEC ID Nº: 59 (secuencia de ácidos nucleicos de cadena ligera de la región variable murina, Figura 82A), SEC ID Nº: 60 (secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera murina, Figura 82B), SEC ID Nº: 61 (secuencia de ácidos nucleicos de cadena pesada variable murina, Figura 83A) y SEC ID Nº: 62 (secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la región variable murina, Figura 83B). Para humanizar un anticuerpo murino, se puede usar convenientemente el TCAE 8 (SEC ID Nº: 57, Figuras 84A -84E), que contiene los dominios continuos de la IgG humana pesada y ligera. Mediante la clonación del ADN que codifica la región variable murina anterior en el vector TCAE 8 de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en la Patente de Estados Unidos Nº 5.736.137, se crea un vector (SEC ID Nº: 58, Figuras 85A -85E) que cuando se transforma en una línea celular de mamíferos, expresa un anticuerpo anti-CD20 quimérico. Otros anticuerpos anti-CD20 humanizados se encuentran en la Patente de Estados Unidos Nº 6.120.767. Una línea celular que expresa el AcM C273 anti-CD20 se puede obtener comercialmente de la ATCC (Manassas, VA) con número de referencia HB-9303.
El experto en la materia observará fácilmente que las secuencias expuestas en el presente documento no son exhaustivas, sino que más bien son ejemplos de las regiones variables, receptores, y otros restos de unión de anticuerpos quiméricos. Además, los procedimientos para construir anticuerpos quiméricos o "humanizados" son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.329.511 y en la Patente de Estados Unidos Nº 6.210.671. Junto con la presente divulgación y los procedimientos bien conocidos a lo largo de la técnica, el experto en la materia observará que la presente invención no se limita a las secuencias desveladas en el presente documento.
La expresión de un anticuerpo quimérico es bien conocida en la técnica, y se describe en detalle, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.329.511. Los sistemas de expresión pueden ser procarióticos, y eucarióticos. Además, la expresión de anticuerpos quiméricos células de insectos que usan un sistema de expresión de baculovirus se describen en Putlitz y col. (1990, Bio/Technology 8: 651-654). Adicionalmente, son bien conocidos en la técnica los procedimientos de expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión o quimérica, y se describen, por ejemplo, en Sambrook y col. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y en Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nueva York).
La determinación de la función y la actividad biológica del anticuerpo quimérico producido de acuerdo con los procedimientos de la presente invención es una operación básica de forma similar para un experto en la materia. Los procedimientos para determinar la afinidad de un anticuerpo mediante ensayos de competición se detallan en Berzofsky (J. A. Berzofsky e I. J. Berkower, 1984, en Fundamental Immunology (ed. W. E. Paul), Raven Press (Nueva York), 595). En resumen, la afinidad del anticuerpo quimérico se compara con la del anticuerpo monoclonal a partir del que se derivó usando un anticuerpo monoclonal radio-yodado.
VII. Composiciones Farmacéuticas
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica. La composición farmacéutica incluye un diluyente farmacéuticamente aceptable y un conjugado covalente entre un polímero, resto terapéutico o biomolécula soluble en agua de origen no natural y un péptido glicosilado o sin glicosilar. El polímero, resto terapéutico o biomolécula se conjuga con el péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y unido covalentemente tanto al péptido como al polímero, resto terapéutico o biomolécula.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para su uso en una diversidad de sistemas de administración de fármacos. Las formulaciones adecuadas para su uso en la presente invención se encuentran en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadelfia, PA, 17ª ed. (1985). Para una breve revisión de los procedimientos para la administración de fármacos, véase, Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para cualquier manera de administración apropiada, incluyendo por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo comprende preferentemente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, se pueden usar cualquiera de los vehículos mencionados anteriormente o un vehículo sólido, tales como, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, y carbonato de magnesio. También se pueden usar microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato, poliglicolato) como vehículos para las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se desvelan, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.897.268 y Nº 5.075.109.
Comúnmente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa. De este modo, la invención proporciona composiciones para su administración parenteral que comprenden el compuesto disuelto o suspendido en un vehículo aceptable, preferentemente un vehículo acuoso, por ejemplo, agua, agua tamponada, solución salina y PBS. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como el ajuste del pH y agentes de tamponamiento, agentes para el ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y detergentes.
Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales, o se pueden filtrar de forma estéril. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para su uso como tal, o liofilizadas, siendo la preparación liofilizada combinada con un vehículo acuoso estéril antes de su administración. El pH de las preparaciones típicamente estará entre 3 y 11, más preferentemente de 5 a 9 y lo más preferentemente entre 7 y 8.
En algunas realizaciones, los péptidos de la invención se pueden incorporar en liposomas formados a partir de lípidos convencionales formadores de vesículas. Una diversidad de procedimientos está disponible para preparar liposomas, como se describe, por ejemplo, en Szoka y col., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), Patentes de Estados Unidos Nº 4.235.871, Nº 4.501.728 y Nº 4.837.028. La dirección de liposomas que usan una diversidad de agentes de direccionamiento (por ejemplo, los galactósidos de sialilo de la invención) es bien conocida en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.957.773 y Nº 4.603.044).
Se pueden usar procedimientos convencionales para el acoplamiento de agentes de direccionamiento a liposomas. Estos procedimientos generalmente implican la incorporación en liposomas de componentes lipídicos, tales como fosfatidiletanolamina, que se pueden activar para la unión de agentes de direccionamiento, o compuestos lipofílicos derivatizados, tales como los péptidos derivatizados con lípidos de la invención.
Los mecanismos de direccionamiento generalmente necesitan que los agentes de direccionamiento se puedan colocar en la superficie del liposoma de tal manera que los restos diana estén disponibles para la interacción con la diana, por ejemplo, un receptor de superficie celular. Los hidratos de carbono de la invención se pueden unir a una molécula de lípido antes de que se forme el liposoma usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, alquilación o acilación de un grupo hidroxilo presente en el hidrato de carbono con un haluro de alquilo de cadena larga o con un ácido graso, respectivamente). Como alternativa, el liposoma se puede formar de tal manera que una porción del conector se incorpora primero en la membrana en el momento de la formación de la membrana. La porción del conector debe tener una porción lipofílica, que está firmemente embebida y anclada en la membrana. También debe tener una porción reactiva, que está químicamente disponible en la superficie acuosa del liposoma. La porción reactiva está seleccionada de modo que será químicamente adecuada para formar un enlace químico estable con un agente de direccionamiento o con un hidrato de carbono, que se añade posteriormente. En algunos casos, es posible unir el agente diana a la molécula del conector directamente, pero en la mayoría de los casos es más adecuado usar una tercera molécula que actúe como un puente químico, uniendo de este modo la molécula conectora que está en la membrana con el agente diana o con el hidrato de carbono que está extendido, tridimensionalmente, fuera de la superficie de la vesícula. Los intervalos de dosificación para la administración de los péptidos de la invención son aquéllos lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado en los que los síntomas de la respuesta inmune muestran algún grado de inhibición. La dosificación no debería ser demasiado elevada como para causar efectos secundarios. Generalmente, la dosificación variará con la edad, condición, sexo y extensión de la enfermedad en el animal y lo puede determinar alguien experto en la materia. La dosificación la puede ajustar el médico individual en el caso de cualquier contraindicación.
Se pueden usar procedimientos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción. Las preparaciones de liberación controlada se pueden conseguir mediante el uso de polímeros para conjugar, formar complejos o adsorber el péptido. La administración controlada se puede ejercer mediante la selección de macromoléculas apropiadas (por ejemplo, poliésteres, poliamino carboximetilcelulosa, y sulfato de protamina) y mediante la concentración de macromoléculas así como los procedimientos de incorporación para controlar la liberación. Otro procedimiento posible para controlar la duración de la acción mediante preparaciones de liberación controlada es incorporar el péptido en partículas de un material polimérico tal como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli (ácido láctico) o copolímeros de vinilacetato de etileno.
Para proteger los péptidos de la unión con proteínas plasmáticas, es preferente que los péptidos estén atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en sistemas coloidales de administración de fármacos, por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas o en macroemulsiones. Dichas enseñanzas se desvelan en Remington’s Pharmaceutical Sciences (16ª Ed., A. Oslo, ed., Mack, Easton, Pa., 1980).
Los péptidos de la invención son muy adecuados para su uso en sistemas de administración de fármacos dirigibles tales como polímeros sintéticos o naturales en forma de complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas,
o perlas, y sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas, liposomas, y eritrocitos liberados. Estos sistemas se conocen colectivamente como sistemas coloidales de administración de fármacos. Típicamente, dichas partículas coloidales que contienen los péptidos dispersos tienen un diámetro de aproximadamente 50 nm-2 μm. El tamaño de las partículas coloidales les permite su administración por vía intravenosa tal como por inyección, o en forma de un aerosol. Los materiales usados en la preparación de sistemas coloidales son típicamente esterilizables mediante esterilización por filtración, no tóxicos, y biodegradables, por ejemplo albúmina, etilcelulosa, caseína, gelatina, lecitina, fosfolípidos, y aceite de soja. Los sistemas coloidales poliméricos se preparan mediante un procedimiento similar a la coacervación de microencapsulación.
En una realización ejemplar, los péptidos son componentes de un liposoma, usado como un sistema de administración dirigida. Cuando los fosfolípidos se dispersan suavemente en medios acuosos, se hinchan, se hidratan, y forman espontáneamente vesículas multilaminares de bicapas concéntricas con fases de medios acuosos que separan la bicapa lipídica. Dichos sistemas normalmente se denominan liposomas multilaminares o vesículas multilaminares (MLV) y tienen diámetros que varían de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 4 μm. Cuando se sonican las MLV, se forman pequeñas vesículas unilaminares (SUVS) con diámetros en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nm, que contienen una solución acuosa en el núcleo de la SUV.
Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, y fosfatidiletanolamina. Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, en los que el resto lipídico contiene 14-18 átomos de carbono, particularmente 16-18 átomos de carbono, y están saturados. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, y distearoilfosfatidilcolina de huevo.
En la preparación de liposomas que contienen los péptidos de la invención, se deberían considerar variables tales como la eficacia de encapsulación del péptido, labilidad del péptido, homogeneidad y tamaño de la población resultante de liposomas, relación de péptido a lípido, inestabilidad a la permeabilidad de la preparación, y aceptabilidad farmacéutica de la formulación. Szoka, y col, Annual Review of Biophysics and Bioengineering, 9: 467 (1980); Deamer, y col., en LIPOSOMES, Marcel Dekker, Nueva York, 1983, 27: Hope, y col., Chem. Phys. Lipids, 40: 89 (1986)).
El sistema de administración dirigida que contiene los péptidos de la invención se puede administrar a un huésped en una diversidad de formas, particularmente a un huésped mamífero, tal como por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravascular, por vía tópica, por vía intracavitaria, por vía transdérmica, por vía intranasal, y por inhalación. La concentración de los péptidos variará con la aplicación en particular, la naturaleza de la enfermedad, la frecuencia de administración, o similares. El péptido de sistema encapsulado para su administración dirigida se puede proporcionar en una formulación que comprende otros compuestos apropiados y un medio acuoso fisiológicamente aceptable, por ejemplo, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, o similares.
Los compuestos preparados mediante los procedimientos de la invención también pueden encontrar uso como reactivos para diagnóstico. Por ejemplo, se pueden usar compuestos marcados para localizar zonas de inflamación
o metástasis tumoral en un paciente sospechoso de padecer una inflamación. Para este uso, los compuestos se pueden marcar con 125I, 14C, o tritio.
Ejemplos Experimentales
La invención se describe ahora con referencia a los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se proporcionan solamente con fines de ilustración y la invención no se debería interpretar de ninguna manera como limitada a estos Ejemplos, sino que más bien se debería interpretar que incluye cualquiera y todas las variaciones que sean evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento.
A. Glicosilación
Los materiales y los procedimientos usados en los experimentos presentados en este Ejemplo se describen a continuación.
1. Sialilación y Fucosilación de TP10
Este ejemplo expone la preparación de TP10 con restos de sialil Lewis X y el análisis de la actividad biológica potenciada.
La interrupción del flujo sanguíneo al cerebro, incluso durante un breve periodo de tiempo, puede desencadenar episodios inflamatorios dentro de la microvasculatura cerebral que puede empeorar el daño tisular cerebral. El daño al tejido que se acumula se amplifica mediante la activación de las cascadas tanto de inflamación como de coagulación. En un modelo murino de apoplejía, el aumento de la expresión de P-selectina e ICAM-1 promueve el reclutamiento de leucocitos. sCR1 es una forma recombinante del dominio extracelular del Receptor 1 del Complemento (CR-1). sCR-1 es un potente inhibidor de la activación del complemento. sCR1sLeX (CD20) es una forma alternativamente glicosilada de sCR1 que se glicosila alternativamente para mostrar antígeno de LewisX sialilado. Anteriormente, se encontró que sCR-1sLeX, que se expresó y se glicosiló in vivo en células CHO Lec11 sometidas a ingeniería genética, localizaba correctamente los microvasos cerebrales isquémicos y las neuronas que expresan Clq, inhibiendo de este modo los neutrófilos y la acumulación de plaquetas y reduciendo los volúmenes del infarto cerebral (Huang y col., 1999, Science 285: 595-599). En Este ejemplo, sCR1sLeX que se preparó in vitro mediante la remodelación de glicanos, exhibió actividad biológica potenciada similar a la de sCRsLeX glicosilado in vivo.
El péptido TP10 se expresó en células CHO DUK B11. Esta línea celular CHO produce el péptido TP10 con la glicosilación típica de las células CHO, con muchos, pero no todos los glicanos protegidos con ácido siálico.
Sialilación de 66 mg de TP10. TP10 (2,5 mg/ml), CMPSA (5 mM), y ST3Gal3 (0,1 U/ml) se incubaron a 32 ºC en Tris 50 mM, NaCl 0,15M, azida sódica al 0,05%, pH 7,2 durante 48 horas. El ácido siálico CMP radiomarcado se añadió a una pequeña alícuota para controlar la incorporación. TP10 se separó a partir de azúcar de nucleótidos por HPLC SEC. Las muestras analizadas a las 24 horas y 48 horas demostraron que la reacción se completó después
5 de 24 horas. La mezcla de reacción se congeló después. Los productos de reacción se sometieron a análisis por Electroforesis de Hidratos de Carbono Asistida por Fluoróforos (FACE®; Glyko, Inc, Novato CA) (Figura 86).
Estudios farmacocinéticos. Se adquirieron ratas con una cánula en la vena yugular. Se administraron 10 mg/kg de péptido TP 10 de sialilación previa o de sialilación posterior mediante una inyección en la vena de la cola a tres ratas para cada tratamiento (n = 3). Se tomaron catorce muestras de sangre de 0 a 50 horas. La concentración en la
10 sangre del péptido TP10 de sialilación posterior fue mayor que la que la del TP10 de sialilación previa en cada punto temporal pasadas 0 horas (Figura 87). La adición de ácido siálico duplicó el área bajo la curva de concentración de plasma-tiempo (AUC) de la curva farmacocinética en comparación con el material de partida (Figura 88).
Fucosilación de TP10 sialilado. 10 ml (25 mg de TP10) de la mezcla de sialilación anterior se descongelaron, y se añadió GDP-fucosa a 5 mM, MnCl2 a 5 mM, y FTVI (fucosiltransferasa VI) a 0,05 U/ml. La reacción se incubó a 32 15 ºC durante 48 horas. Los productos de reacción se sometieron a análisis por Electroforesis de Hidratos de Carbono Asistida por Fluoróforos (FACE®; Glyko, Inc, Novato CA) (Figura 89). A una pequeña alícuota, se añadió GDP-fucosa radiomarcada para controlar la incorporación. TP10 se separó a partir de azúcar de nucleótidos por HPLC SEC. Las muestras analizadas a las 24 horas y 48 horas demostraron que la reacción se completó a las 24 horas. Un ensayo in vitro que mide la unión a E-selectina indica que la adición de fucosa puede producir un ligando de E-selectina
20 biológicamente activo (Figura 90).
2. Sialilación de Glicoproteínas Recombinantes
Este ejemplo expone la preparación de formas sialiladas de varios péptidos recombinantes.
Sialilación de Glicoproteínas Recombinantes Usando ST3Gal III. Se examinó la capacidad de varias glicoproteínas para ser sialiladas mediante ST3Gal III recombinante de rata. Para cada una de estas glicoproteínas,
25 la sialilación será una etapa valiosa del procedimiento en el desarrollo de las respectivas glicoproteínas como productos comerciales.
Condiciones de Reacción. Las condiciones de reacción fueron como se resumen en la Tabla 9. Las reacciones de sialiltransferasa se realizaron durante 24 horas a una temperatura entre temperatura ambiente y 37 ºC. Se estableció el grado de sialilación mediante la determinación de la cantidad de 14C-NeuAc incorporada en los oligosacáridos
30 unidos a glicoproteína. Véase la Tabla 9 para las condiciones de reacción para cada proteína.
Tabla 9. Condiciones de reacción.
Proteína Fuente Proteína Total Conc. Proteína ST (mU/ml) ST/Proteína CMP-NeuAc de (mg) (mg/ml) (mU/mg) "ciclo" 1
ATIII Genzima 8,6 4,3 210 48 ciclo Transgenics
ATIII Genzima 860
53 12
ciclo Transgenics
Asialo-fetuína Sigma 0,4
20 13 10 mM
asialo-AAAT PPL 0,4
0,5
20 20 20 mM
1 "Ciclo" se refiere a la generación de CMP-NeuAc "in situ" que usa enzimáticamente condiciones convencionales
como se describe en la memoria descriptiva (NeuAc 20 mM y CMP2 mM). El tampón fue HEPES 0,1 M, pH 7,5.
Los resultados presentados en la Tabla 10 demuestran que se consiguió un grado notable de sialilación en cada caso, a pesar de los bajos niveles de enzima usada. Básicamente, se obtuvo la sialilación completa, en base a la estimación de la galactosa terminal disponible. La Tabla 10 muestra los resultados de las reacciones de sialilación. La cantidad de enzima usada por cada mg de proteína (mU/mg) como una base de comparación para los diversos
35 estudios. En varios de los ejemplos que se muestran, solamente se necesitaron 7-13 mU de ST3Gal III por cada mg de proteína para dar básicamente la sialilación completa después de 24 horas.
Tabla 10. Resultados analíticos
Proteína Fuente Gal Terminal1 NeuAc Incorp. 2 % de Rxn3 Otra mol/mol mol/mol caracterización
ATIII4 Genzima 102 104 117
Ninguna Transgenics
ATIII4 Genzima 102
1.3
SDS-geles: pureza de Transgenics
la proteína FAC: glicoformas de hidratos de carbono
Asialo-fetuína Sigma 802
116 Ninguna
asialo-AAAT5 PPL 7 7,0 100 SDS-geles: pureza de
la proteína 1 Contenido de Gal (expuesto) terminal en los oligosacáridos unidos a N determinado por el proveedor, o a partir de los valores de las literaturas (fetuína, asialo-AAAT).2 NeuAc incorporada determinada mediante la incorporación de 14C-NeuAc después de la separación a partir de precursores libres radiomarcados por filtración en gel.3 El % de Rxn se refiere a un % de finalización de la reacción en base al contenido de Gal terminal como un máximo teórico. 4 Antitrombina III. 5 α1 Antitripsina.
Estos resultados están en marcado contraste con los indicados en estudios detallados con ST6Gal I bovina en los que menos de 50 mU/mg de proteína dieran menos de un 50% de sialilación, y 1070 mU/mg de proteína dieron aproximadamente un 85-90% de sialilación en 24 horas. Paulson y col. (1977) J. Biol. Chem. 252: 2363-2371; Paulson y col. (1978) J. Biol. Chem. 253: 5617-5624. Un estudio de sialiltransferasas α2,3 y α2,6 de rata por otro
5 grupo reveló que la sialilación completa de asialo-AGP necesitaba concentraciones de enzima de 150-250 mU/mg de proteína (Weinstein y col. (1982) J. Biol. Chem. 257: 13845-13853). Estos estudios anteriores tomados en conjunto sugieren que la sialiltransferasa ST6Gal I necesita una cantidad mayor que 50 mU/mg y hasta 150 mU/mg para conseguir la sialilación completa.
Este ejemplo demuestra que la sialilación de las glicoproteínas recombinantes que usan sialiltransferasa ST3 Gal III
10 necesita mucha menos enzima de lo esperado. Para una reacción a escala de un kilogramo, se necesitarían aproximadamente 7.000 unidades de sialiltransferasa ST3Gal III, en lugar de las 100.000-150.000 unidades que indicaban los estudios anteriores. La purificación de estas enzimas a partir de fuentes naturales es prohibitiva, con rendimientos de sólo 1-10 unidades para una preparación a gran escala después de 1-2 meses de trabajo. Suponiendo que las sialiltransferasas tanto ST6Gal I como ST3Gal III se producen como sialil-transferasas
15 recombinantes, consiguiendo los mismos niveles de expresión de las dos enzimas, se necesitaría una escala de fermentación 14-21 veces mayor (o superior) para la sialiltransferasa ST6Gal I con respecto a la sialiltransferasa ST3Gal III. Para la sialiltransferasa ST6Gal I, se han indicado niveles de expresión de 0,3 U/I en levaduras (Borsig y col. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 210: 14-20). Se han conseguido niveles de expresión de 1000 U/litro de sialiltransferasa ST3 Gal III en Aspergillus niger. A los niveles actuales de expresión se necesitarían 300-450.000
20 litros de fermentación de levadura para producir suficiente enzima para la sialilación de 1 kg de la glicoproteína usando la sialiltransferasa ST6Gal I. En contraste, se necesitarían menos de 10 litros de fermentación de Aspergillus niger para la sialilación de 1 kg de glicoproteína usando la sialiltransferasa ST3Gal III. Por lo tanto, la capacidad de fermentación necesaria para producir la sialiltransferasa ST3Gal III para una reacción de sialilación a gran escala sería 10-100 veces menor que la necesaria para producir la ST6Gal I; el coste de producción de la sialiltransferasa
25 se reduciría proporcionalmente.
3. Fucosilación para crear Sialil Lewis X
Este ejemplo expone la preparación de Activador del Plasminógeno de tipo Tisular (TPA) con antígeno de sialil Lewis X unido a N.
Sialilación. TPA expresado en células de mamíferos a menudo contiene una mayoría de los glicanos que terminan
30 en ácido siálico, pero para asegurar la sialilación completa, sería beneficioso realizar primero una sialilación in vitro. Se incuba TPA en un tampón adecuado (más preferentemente a pH entre 5,5 y 9, por ejemplo solución salina tamponada con Tris, pH 7,2) con ácido CMP siálico y sialiltransferasa durante un tiempo suficiente para convertir cualquier glicano que carece de ácido siálico en las especies sialiladas. Las condiciones típicas serían 1 mg/ml de TPA, ácido CMP siálico 3 mM, 0,02 U/ml de ST3Gal3, 32 ºC durante 24 horas. El crecimiento microbiano se puede
35 detener por filtración estéril o mediante la inclusión de azida sódica al 0,02%. La concentración de TPA está más preferentemente en el intervalo de 0,1 mg/ml hasta el límite de solubilidad del péptido. La concentración de CMP-AS debería ser suficiente para que haya exceso sobre los sitios disponibles, y puede variar de 50 μM hasta 50 mM, y la temperatura de 2 ºC hasta 40 ºC. El tiempo necesario para completar la reacción dependerá de la temperatura, las cantidades relativas de enzima a sustrato aceptor, la concentración de sustrato donador, y el pH. Otras sialiltransferasas que pueden ser capaces de añadir ácido siálico en la unión 2,3 incluyen ST3Gal4; también se podrían usar transferasas microbianas.
Fucosilación. Las condiciones típicas para la fucosilación serían 1 mg/ml de TPA, GDP-fucosa 3 mM, 0,02 U/ml de FTVI, MnCl2 5 mM, 32 ºC durante 24 h en solución salina tamponada con Tris. El crecimiento microbiano se puede detener por filtración estéril o mediante la inclusión de azida sódica al 0,02%. La concentración de TPA está más preferentemente en el intervalo de 0,1 mg/ml hasta el límite de solubilidad del péptido. La concentración de GDPfucosa debería ser suficiente para que haya exceso en los sitios disponibles, y podría variar desde 50 μM hasta 50 mm, y la temperatura de 2 ºC hasta 40 ºC. El tiempo necesario para completar la reacción dependerá de la temperatura, las cantidades relativas de enzima a sustrato aceptor, la concentración de sustrato donador, y el pH. Otras fucosiltransferasas que pueden ser capaces de preparar sialil Lewis x incluyen FTVII, FTV, FTIII, así como que también se podrían usar transferasas microbianas.
4. Reducción de la estructura del núcleo de alta manosa a tri-manosa: Activador del plasminógeno de tipo Tejido producido en CHO
Este ejemplo expone la preparación de Activador del Plasminógeno de tipo Tejido con un núcleo de trimanosa por reducción a partir de un glicano de alta manosa.
El activador del plasminógeno de tipo tejido (TPA) se produce actualmente en células de ovario de hámster chino (CHO) y contiene una baja cantidad de oligosacárido unido a N de alta manosa. Las manosas se pueden se pueden reducir usando una diversidad de manosidasas específicas. La primera etapa es generar Man5GlcNAc2(Fuc0-1) a partir de Man9GlcNAc2(Fuc0-1). Esto se puede hacer usando manosidasa I. Después se usa GlcNAcT1 (GlcNAc transferasa I) para preparar GlcNAc1Man5GlcNAc2(Fuc0-1) o se usa Manosidasa III para preparar Man3GlcNAc2(Fuc0-1). A partir de Man3GlcNAc2(Fuc0-1), se puede producir GlcNAclMan3-GlcNAc2(Fuc0-1) usando GlcNAcT1 o a partir de GlcNAc1Man5GlcNAc2(Fuc0-1), se puede producir GlcNAc1Man3GlcNAc2 (Fuc0-1) usando Manosidasa II. Después, GlcNAc1Man3GlcNAc2(Fuc0-1) se convierte en GlcNAc2Man-3GlcNAc2(Fuc0-1) usando GlcNAcTransferasa II (GlcNAcTII). Los dos restos de GlcNAc terminal después se galactosilan usando GalTI y después se sialilan con AS-PEG usando ST3GalIII.
A la inversa, se puede producir TPA en sistemas de levaduras o fúngicos. Se necesitaría un procesamiento similar para el material derivado de hongos.
5. Adición de GlcNAc a EPO
Este ejemplo expone la adición de un resto de GlcNAc sobre un núcleo de tri-manosilo.
Adición de GlcNAc a EPO. EPO se expresó en células de insecto SF-9 y se purificó (Protein Sciences, Meriden, CT). La conversión de un 100% a partir de la glicoforma de tri-manosilo de Epo al "núcleo de tri-manosilo + 2 GlcNAc" (Pico 1, P1 en la Figura 91) se consiguió en 24 horas de incubación a 32 ºC con 100 mU/ml de GlcNAcT-I y 100 mU/ml de GlcNAcT-II en las siguientes concentraciones finales de reacción:
MES 100 mM a pH 6,5, o Tris 100 mM a pH 7,5
UDP-GlcNAc 5 mM
MnCl2 20 mM
100 mU/ml de GlcNAcT-I
100 mU/ml de GlcNAcT-II
1 mg/ml de EPO (purificada, expresada en células Sf9, adquirida en Protein Sciences).
Análisis de glicoformas. El presente ensayo es una ligera modificación en K-R Anumula y ST Dhume, Glycobiology 8 (1998) 685-69. N-glicanos liberados por N-glicanasa (PNGasa) se marcaron reductoramente con ácido antranílico. Los N-glicanos aminados reductoramente se inyectaron en una amino columna Shodex Asahipak NH2P-50 4D (4,6 mm x 150 mm). Se usaron dos disolventes para la separación: A) ácido acético al 5% (v/v), tetrahidrofurano al 1%, y trietilamina al 3% en agua, y B) ácido acético al 2% y tetrahidrofurano al 1% en acetonitrilo. La columna después se eluyó isocráticamente con B al 70% durante 2,5 minutos, seguido de un gradiente lineal durante un periodo de 97,5 minutos yendo de B del 70 al 5% y una elución isocrática final con B al 5% durante 15 minutos. Los picos eluidos se detectaron usando detección por fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 230 nm y de emisión de 420 nm.
En estas condiciones, el núcleo de trimanosilo presentaba un tiempo de retención de 22,3 minutos, y el producto de la reacción de GnT presenta un tiempo de retención de 26,3 minutos. El material de partida fue exclusivamente núcleo de trimanosilo con núcleo de GlcNAc (Figura 91).
6. Remodelación de N-glicanos de alta manosa para hibridar y formar complejos de N-glicanos: RNasa pancreática bovina
Este ejemplo expone la preparación de RNasa de páncreas bovino con N-glicanos híbridos o complejos. Los glicanos de alta manosa unidos a la RNasa se digieren enzimáticamente y se elaboran para crear glicanos híbridos unidos a N. Adicionalmente, los glicanos unidos a N de alta manosa de la RNasa se digieren enzimáticamente y se elaboran con más detalle para crear glicanos complejos unidos a N.
Las estructuras de alta manosa de oligosacáridos unidos a N en glicopéptidos se pueden modificar a formas híbridas
o complejas usando la combinación de α-manosidasas y glicosiltransferasas. Este ejemplo resume los resultados de dichos esfuerzos usando un N-Glicano sencillo como un sustrato modelo.
La ribonucleasa B (RNasa B) purificada a partir de páncreas bovino (Sigma) es un glicopéptido que consiste en 124 restos de aminoácido. Tiene un único sitio de N-glicosilación potencial modificado con estructuras de alta manosa. Debido a su simplicidad y su bajo peso molecular (13,7 kDa a 15,5 kDa), la ribonucleasa B es un buen candidato para demostrar la viabilidad de la remodelación de N-Glicano a partir de estructuras de alta manosa para hibridar para formar complejos de oligosacáridos unidos a N. El espectro de MALDI-TOF de la RNasaB y el perfil por HPLC para los oligosacáridos escindidos a partir de RNasaB mediante N-Glicanasa (Figura 92) indicaron que, aparte de una pequeña porción del péptido no modificada, la mayoría de los sitios de N-glicosilación del péptido se modifican con oligosacáridos de alta manosa que consisten en 5 a 9 restos de manosa.
Conversión de N-Glicanos de alta manosa en N-Glicanos híbridos. N-Glicanos de alta manosa se convirtieron en N-Glicanos híbridos usando la combinación de α 1,2-manosidasa, GlcNAcT-I (β-1,2-N-acetil glucosaminil transferasa), GalT-I (β1,4-galactosiltransfeasa) y α2,3-sialiltransferasa /o α2,6-sialiltransferasa como se muestra en la Figura 93.
Como un ejemplo, las estructuras de alta manosa en la RNasaB se convirtieron satisfactoriamente en estructuras híbridas.
Man5GlcNAc2-R se obtuvo a partir de Man5-9GlcNAc2-R catalizada mediante una sola α1,2-manosidasa clonada a partir de Trichoderma reesei (Figura 94). La RNasa B (1 g, aproximadamente 67 μmol) se incubó a 30 ºC durante 45 h con 15 mU de la α1,2-manosidasa de T. reesei recombinante en tampón MES (50 mM, pH 6,5) en un volumen total de 10 ml. Las estructuras Man6-9GlcNAc2-proteína se han convertido satisfactoriamente en Man5GlcNAc2-proteína con alta eficacia mediante la manosidasa recombinante.
Como alternativa, Man5GlcNAc2-R se obtuvo a partir de Man5-9GlcNAc2-R catalizada mediante una sola α1,2manosidasa purificada a partir de Aspergillus saitoi (Figura 95). RNasa B (40 μg, aproximadamente 2,7 nmol) se incubó a 37 ºC durante 42,5 h con 25 μU de la α1,2-manosidasa de A. saitoi comercial (Glyko o CalBioChem) en tampón NaOAC (100 mM, pH 5,0) en un volumen total de 20 μl. Las estructuras de Man6-9GlcNAc2-proteína se convirtieron satisfactoriamente en Man5GlcNAc2-proteína mediante la manosidasa disponible en el mercado. Sin embargo, un nuevo pico que corresponde con la GlcNAc-proteína aparece en el espectro, indicando la posible contaminación de la endoglicosidasa H en la preparación. Aunque se necesitaron varias alfa-manosidasas de mamífero para conseguir esta etapa, la α1,2-manosidasa fúngica fue muy eficaz para retirar todos los restos de manosa unidos en α1,2.
A continuación, GlcNAcT-I añadió un resto de GlcNAc a la Man5GlcNAc2-R (Figura 96). La mezcla de reacción después de la reacción de la α1,2-manosidasa de T. reesei que contenía RNasa B (600 μg, aproximadamente 40 nmol) se incubó con GlcNAcT-I recombinante no purificada (34 mU) en tampón MES (50 mM, pH 6,5) que contenía MnCl2 (20 mM) y UDP-GlcNAc (5 mM) en un volumen total de 400 μl. a 37 ºC durante 42 h. Un resto de GlcNAc se añadió cuantitativamente a Man5GlcNAc2-proteína mediante la GlcNAcT-I recombinante.
Después se añadió en resto de Gal usando GalT 1 (Figura 97). La mezcla de reacción después de la reacción de GnT-I que contenía RNasa B (120 μg, aproximadamente 8 nmol) se incubó a 37 ºC durante 20 h con 3,3 mU de la GalT-1 recombinante en tampón Tris-HCl (100 mM, pH 7,3) que contenía UDP-Gal (7,5 mM) y MnCl2 (20 mM) en un volumen total de 100 μl. Se añadió un resto de Gal a aproximadamente un 98% de la GlcNAc-Man5GlcNAc2-proteína mediante la GalT 1 recombinante.
La siguiente etapa fue la adición de un ácido siálico usando una α2,3-sialiltransferasa o una α2,6-sialiltransferasa (Figura 98). Como un ejemplo, se usó ST3Gal III, una α2,3-sialiltransferasa. La mezcla de reacción después de la reacción de la GalT-1 que contenía RNasa B (13 μg, aproximadamente 0,87 nmol) se incubó a 37 ºC durante 16 h con 8,9 mU de ST3Gal III recombinante en tampón Tris-HCl (100 mM, pH 7,3) que contenía CMP-Ácido siálico (5 mM) y MnCl2 (20 mM) en un volumen total de 20 μl. Se añadió un resto de ácido siálico a aproximadamente un 90% de la Gal-GlcNAc-Man5GlcNAc2-proteína mediante ST3Gal III recombinante usando CMP-AS como el donador. El rendimiento se puede mejorar adicionalmente ajustando las condiciones de reacción.
Por conveniencia, no fue necesaria etapa de purificación o de diálisis después de cada reacción que se ha descrito anteriormente. De forma más interesante, GalT 1 y ST3Gal III se pueden combinar en una reacción en un solo recipiente. Se obtuvieron rendimientos similares en comparación con las reacciones separadas. La mezcla de reacción después de la reacción de GlcNAcT-I que contenía RNasa B (60 μg, aproximadamente 4 nmol) se incubó a 37º C durante 20 h con 1,7 mU de GalT 1 recombinante, 9,8 mU de ST3Gal III recombinante en tampón Tris-HCl (100 mM, pH 7,3) que contenía UDP-Gal (7,5 mM), CMP-ácido siálico (5 mM) y MnCl2 (20 mM) en un volumen total de 60 μl.
Como se muestra en la Figura 99, AS-PEG (10 kDa) se añadió satisfactoriamente a la RNasa B. La mezcla de reacción después de la reacción de GalT-1 que contenía RNasa B (6,7 μg, aproximadamente 0,45 nmol) se dializó frente a H2O durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubó a 37 ºC durante 15,5 horas con 55 mU de la ST3Gal III recombinante en tampón Tris-HCl (50 mM, pH 7,3) que contenía CMP-AS-PEG (10 KDa) (0,25 mM) y MnCl2 (20 mM) en un volumen total de 20 μl. Los restos de ácido siálico modificado con PEG se añadieron satisfactoriamente al Gal-GlcNAc-Man5GlcNAc2-péptido mediante la ST3Gal III recombinante. El rendimiento se puede mejorar adicionalmente ajustando las condiciones de reacción.
Conversión de N-Glicanos de alta manosa en N-Glicanos complejos. Para conseguir esta conversión, se obtiene un compuesto intermedio de GlcNAcβ1,2Man3GlcNAc2-péptido. Como se muestra en la Figura 100, existen al menos cuatro rutas factibles para realizar la reacción a partir de Man5GlcNAc2-péptido hasta este compuesto intermedio:
Ruta I: El Man5GlcNAc2-péptido producido mediante la α 1,2 manosidasa fúngica es un sustrato de GlcNAc transferasa I (GlcNAcT-I, enzima 2) que añade una GlcNAc. Los restos de manosa terminal unidos a α1,3-y α1,6del GlcNAcMan5GlcNAc2-péptido se retiran mediante α-manosidasa II de Golgi (ManII, enzima 5). Esta ruta es una parte de la secuencia natural para el procesamiento de oligosacáridos unidos a N realizada en organismos superiores.
Ruta II: Dos restos de manosa se retiran primero mediante una α-manosidasa (enzima 6), después se añade una GlcNAc mediante GlcNAcT-1 (enzima 2). Aparte de su aceptor natural Man5GlcNAc2-R, GlcNAcT-I también puede reconocer a Man3GlcNAc2-R como su sustrato y añadir una GlcNAc a la estructura del núcleo de manosa para formar GlcNAcMan3GlcNAc2-péptido.
Ruta III: La manosa unida a α1,6 se retira mediante una α1,6-manosidasa, seguido de la adición de GlcNAc mediante GlcNAcT-1 y retirada de la manosa terminal unida a α1,3 mediante una α1,3-manosidasa. A partir de los datos experimentales obtenidos, GlcNAcT-I puede reconocer este Man4GlcNAc2-péptido como aceptor y añadir un resto de GlcNAc para formar GlcNAcMan4GlcNAc2-péptido.
Ruta IV: De forma similar a la Ruta III, la manosa unida a α1,3 se retira mediante una α1,3-manosidasa, seguido de reacción de GlcNAcT-I. Después la manosa terminal unida a α1,6 se puede retirar mediante una α1,6-manosidasa.
Después de la función de GlcNAcT-I (responsable de la adición de la GlcNAc unida a β1,2 a la α1,3-manosa en el núcleo de manosa) y GlcNAcT-II (responsable de la adición de una segunda GlcNAc unida a β1,2 a la α1,6-manosa en el núcleo de manosa), el GlcNAc2Man3GlcNAc2-péptido se puede procesar mediante GalT 1 y sialiltransferasa para formar N-Glicanos biantenarios complejos. Otras GlcNAc transferasas tales como GlcNAcT-IV, GlcNAcT-V, y/o GlcNAcT-VI (Figura 100 y Figura 101) también pueden glicosilar el GlcNAc2Man3GlcNAc2-péptido. La glicosilación adicional mediante GalT 1 y sialiltransferasas formarán N-glicanos poliantenarios complejos. La enzima GlcNAcT-III cataliza la inserción de una GlcNAc bisectriz, previniendo de este modo las acciones de ManII, GlcNAcT-II, GlcNAcT-IV y GlcNAcT-V.
7. Preparación de EPO con glicanos complejos poliantenarios.
Este ejemplo expone la preparación de EPO biantenaria, PEGilada, y EPO sialilada, triantenaria a partir de EPO expresada en células de insectos.
La eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) a partir del sistema de expresión de baculovirus/Sf9 (Protein Sciences Corp., Meriden, CT) se sometió a análisis de glicanos y los glicanos resultantes mostraron que eran el núcleo principal de trimanosilo con núcleo de fucosa, con un pequeño porcentaje de glicanos que también tenían una única GlcNAc ( EPO 1).
Adición de N-acetilglucosamina con GnT-I y GnT-II. Dos lotes de rhEPO (1 mg/ml) se incubaron con GnT-I y GnT-II, UDP-glcNAc 5 mM; MnCl2 20 mM, y azida sódica al 0,02% en MES 100 mM a pH 6,5 a 32 ºC durante 24h. El lote A contenía 20 mg de EPO, y 100 mU/ml de GnT-I y 60 mU/ml de GnT-II. El lote B contenía 41 mg de EPO, y 41 mU/ml de GnT-1 + 50 mU/ml de GnT-II. Después de la reacción, la muestra se desaló mediante filtración con gel (columnas PD 10, Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ).
Glicanos de EPO analizados mediante establecimiento de perfiles por 2-AA HPLC. Este ensayo es una ligera modificación en Anumula y Dhume, Glycobiology 8 (1998) 685-69. Los N-glicanos aminados reductoramente se inyectaron en una amino columna Shodex Asahipak NH2P-50 4D (4,6 mm x 150 mm). Se usaron dos disolventes para la separación, A) ácido acético al 5% (v/v), tetrahidrofurano al 1%, y trietilamina al 3% en agua y B) ácido acético al 2% y tetrahidrofurano al 1% en acetonitrilo. La columna después se eluyó isocráticamente con B al 70% durante 2,5 min, seguido de un gradiente lineal durante un periodo de 100 min yendo del 70 al 5% de B, y una elución isocrática final con B al 5% durante 20 min. Se detectaron los picos eluidos usando detección por fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 230 nm y de emisión de 420 nm. Los glicanos unidos a N no-sialilados entran en el intervalo de LC de 23-34 min, monosialilados de 34-42 min, disialilados de 42-52 min, trisialilados de 55-65 min y tetrasialilados de 68 -78 min.
El establecimiento de perfiles de glicanos por 2AA HPLC reveló que el lote A se convirtió en un 92% en una estructura biantenaria con dos GlcNAc (el equilibrio tenía un único GlcNAc. El lote B mostró un 97% de conversión al producto deseado (Figuras 102A y 102B ).
Introducción de una tercera rama antenaria con GnT-V. EPO (1 mg/ml del lote B) a partir del producto de las reacciones de GnT-I y GnT-II, después de desalar en columnas PD-10 y posterior concentración, se incubó con 10 mU/ml de GnT-V y UDP-GlcNAc 5 mM en MES 100 mM a pH 6,5 que contenía MnCl2 5 mM y azida sódica al 0,02% a 32 ºC durante 24 h. El análisis por 2AA HPLC demostró que la conversión se produjo con una eficacia de un 92% (Figura 103).
Después de desalar (PD-10) y concentrar, se añadió galactosa con rGalTI: EPO (1 mg/ml) se incubó con 0,1 U/ml de GalT1, UDP-galactosa 5 mM, MnCl2 5 mM a 32 ºC durante 24 h.
Análisis MALDI de N-glicanos aminados reductoramente a partir de EPO. Una pequeña alícuota de los Nglicanos liberados por PNGasa a partir de EPO que se había marcado reductoramente con ácido antranílico Se dializó durante 45 min en un filtro de membrana MF-Millipore (0,025 μm de poro, 47 mm de diámetro), que estaba flotando en agua. La alícuota dializada se secó en una concentradora speedvac, se volvió a disolver en una pequeña cantidad de agua, y se mezcló con una solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (10 g/l) disuelto en agua/acetonitrilo (50:50). La mezcla se secó sobre el objetivo y se analizó usando un espectrómetro de masas DE-Pro MALDI-TOF de Applied Biosystems funcionando en modo lineal/ión negativo. Los oligosacáridos se asignaron en base a la relación de masa a carga observada y en la literatura precedente.
El análisis de los glicanos liberados por MALDI mostró que la galactosa se añadió cuantitativamente a todos los sitios disponibles (Figura 104). La EPO galactosilada a partir de lo anterior se purificó después mediante filtración en gel en una columna Superdex 1,6/60 en Tris 50 mM, NaCl 0,15 M, pH 6.
Sialilación. Después de concentración y desalación (PD-10), 10 mg de EPO galactosilada (1 mg/ml) se incubó con ST3Gal3 (0,05 U/ml), y CMP-AS (3 mM) en Tris50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 que contenía azida sódica al 0,02%. Una alícuota separada contenía CMP-AS radiomarcado. La marca resultante incorporada y la marca libre se separaron por cromatografía de exclusión por tamaño isocrática/HPLC a 0,5 ml/min en MeOH al 45%, TFA al 0,1% (columna de 7,8 mm x 30 cm, tamaño de partícula de 5 μm, TSK G2000SWXL, Toso Haas, Ansys Technologies Lake Forest, CA). Usando este procedimiento, se incorporaron un 12% de las cuentas (360 micromolar, a EPO 33 micromolar, o aproximadamente 10,9 moles/mol). Incorporación teórica (3 sitios unidos a N, tri-antenario) es aproximadamente 9 moles/mol. Estos tienen correspondencia dentro de los límites del procedimiento. En una reacción idéntica con ST6Gal1 en lugar de ST3Gal3, se incorporó un 5,7% de la radiomarca en la EPO galactosilada, o aproximadamente un 48% en comparación con ST3Gal3.
B. GlicoPEGilación
8. Preparación de CMP-AS-PEG
Este ejemplo expone la preparación de CMP-AS-PEG.
Preparación de 2-(benciloxicarboxamido)-glicilamida-2-desoxi-D-manopiranosa. Se añadió éster de Nbenciloxicarbonil-glicil-N-hidroxisuccinimida (3,125 g, 10,2 mmol) a una solución que contenía D-manosamina-HCl (2 g, 9,3 mmol) y trietilamina (1,42 ml, 10,2 mmol) disuelta en MeOH (10 ml) y H2O (6 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y se concentró usando evaporación rotatoria. La cromatografía (sílice, McOH/CH2Cl2 al 10%) produjo 1,71 g (rendimiento de un 50%) de producto en forma de un sólido de color blanco: Rf = 0,62 (sílice; CHCl3:MeOH:H2O, 6/4/1); RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) δ 3,24-3,27 (m, 2H), 3,44 (t, 1H), 3,55 (t, 1H), 3,63-3,66 (m, 1H), 3,76-3,90 (m, 6H), 3,91 (s, 2H), 4,0 (dd, 2 H), 4,28 (d, 1H, J = 4,4), 4,41 (d, 1H, J = 3,2), 5,03 (s, 1H), 5,10 (m, 3H), 7,29-7,38 (m, 10H).
Preparación de 5-(N-benciloxicarboxamido)glicilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galacto-2-nonulopirano suronato. 2-(N-Benciloxicarboxamido) glicilamida-2-desoxi-D-manopiranosa (1,59 g, 4,3 mmol) se disolvió en una solución de HEPES 0,1 M (12 ml, pH 7,5) y piruvato sódico (4,73 g, 43 mmol). Ácido neuranímico aldolasa (540 U de enzima en 45 ml de solución tamponada con fosfato 10 mM que contenía NaCl 0,1 M a pH 6,9) y la mezcla de reacción se calentó a 37 ºC durante 24 h. La mezcla de reacción después se centrifugó y el sobrenadante se cromatografió (sílice C18, gradiente de H2O (100%) a MeOH al 30%/agua). Las fracciones apropiadas se combinaron, se concentraron y el residuo se cromatografió (sílice, gradiente de MeOH al 10%/CH2Cl2 a CH2Cl2/MeOH/H2O a 6/4/1). Las fracciones apropiadas se recogieron, se concentraron y el residuo se volvió a suspender en agua. Después de liofilización, se obtuvo el producto (1,67 g, rendimiento de un 87%) en forma de un sólido de color blanco: Rf = 0,26 (sílice, CHCl3/MeOH/H2O a 6/4/1); RMN 1H (D2O, 500 MHz) δ 1,82 (t, 1H), 2,20 (m, 1H), 3,49 (d, 1H), 3,59 (dd, 1H), 3,67-3,86 (m, 2H), 3,87 (s, 2H), 8,89-4,05 (m, 3H), 5,16 (s, 2H), 7,45 (m, 5H).
Preparación de 5-glicilamido-3,5.didesoxi-D-glicero-D-galacto.2.nonulopiranosuronato. 5-(NBenciloxicarboxamido)glicilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato (1,66 g, 3,6 mmol) se disolvió en 20 ml de agua/metanol al 50%. El matraz se evacuó repetidamente y se colocó en atmósfera de argón y después se añadió Pd al 10%/C (0,225 g). Tras la evacuación repetida, después se añadió hidrógeno (aproximadamente 1 atm) al matraz y la mezcla de reacción se agitó durante 18 h. La mezcla de reacción se filtró a través de celite, se concentró por evaporación rotatoria y se liofilizó para producir 1,24 g (rendimiento de un 100%) de producto en forma de un sólido de color blanco: Rf = 0,25 (sílice, IPA/H2O/NH4OH a 7/2/1); RMN 1H (D2O, 500 MHz) δ 1,83 (t, 1H, J = 9,9), 2,23 (dd, 1H, J = 12,9, 4,69), 3,51-3,70 (m, 2H), 3,61 (s, 2H), 3,75-3,84 (m, 2H), 3,954,06 (m, 3H).
Preparación de citidina-5’-monofosforil-[5-(N-fluorenilmetoxi-carboxamido)glicilamido-3,5-didesoxi-β-Dglicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato]. Una solución que contiene 5-glicilamido-3,5-didesoxi-D-glicero-Dgalacto-2-nonulopiranosuronato (0,55 g, 1,70 mmol) disuelto en 20 ml de H2O se añadió a una solución de Tris (1,38 g, 11,4 mmol), MgCl2 1 M (1,1 ml) y BSA (55 mg). El pH de la solución se ajustó a 8,8 con NaOH 1 M (2 ml) y se añadió CTP-2Na+ (2,23 g, 4,2 mmol). El pH de la mezcla de reacción se controló con un controlador de pH que administraba NaOH 1 M según la necesidad para mantener un pH 8,8. La proteína de fusión (sialiltransferasa/CMPácido neuramínico sintetasa) se añadió a la solución y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 2 días, se añadió una cantidad adicional de proteína de fusión y la reacción se agitó un periodo adicional de 40 horas. La mezcla de reacción se precipitó en EtOH y el precipitado se lavó 5 veces con EtOH frío para producir 2,3 gramos de un sólido de color blanco. Aproximadamente 1,0 g del producto en bruto se disolvió en 1,4 dioxano (4 ml), H2O (4 ml) y NaHCO3 saturado (3 ml) y se añadió gota a gota una solución de FMOC-Cl (308 mg, 1,2 mmol) disuelta en 2 ml de dioxano. Después de agitar durante 16 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se concentró a aproximadamente 6 ml por evaporación rotatoria y se purificó usando cromatografía (sílice C18, gradiente de H2O al 100% a MeOH al 30%/H2O). Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron. El residuo se disolvió en agua y liofilizó para producir 253 mg de un sólido de color blanco: Rf = 0,50 (sílice, IPA/H2O/NH4OH a 7/2/1); RMN 1H (D2O, 500 MHz) δ 1,64 (dt, 1H, J = 12,0, 6,0), 2,50 (dd, 1H, J = 13 .2, 4,9), 3,38 (d, J = 9,67, 1H), 3,60 (dd, J = 11,65, 6,64, 1H), 3,79 (d, J = 4,11, 1H), 3,87 (dd, J = 12,24, 1,0, 1H), 3,97 (m, 2H), 4,07 (td, J = 10,75, 4,84, 1H), 4,17 (dd, J = 10,68, 1,0, 1H), 4,25 (s, 2H), 4,32 (t, J =4,4, 1H), 4,37 (t, J = 5,8 1H), 4,64,7 (m, oscurecido por el pico de disolvente), 5,95 (d, J = 4, 1H), 6,03 (d, J = 7,4, 1H), 7,43-7,53 (m, 3H), 7,74 (m, 2H), 7,94 (c, J = 7, 3H). MS (ES); calc. Para C35H42N5O18P ([M-H]-), 851,7; encontrado 850,0.
Preparación de citidina-5’-monofosforil-(5-glicilamido-3,5-didesoxi-β-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosuronato). Se añadió diisopropilamina (83 uL, 0,587 μmol) a una solución de citidina-5’-monofosforil[5-(N-fluorenil-metoxicarboxamido)glicilamido-3,5-didesoxi-β-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato] (100 mg, 0,117 mmol) disuelto en agua (3 ml) y metanol (1 ml). La mezcla de reacción se agitó 16 h a temperatura ambiente y el metanol de la reacción se retiró de la mezcla de reacción por evaporación rotatoria. La mezcla de reacción en bruto se filtró a través de una columna de gel de sílice C 18 usando agua y el eluyente se recogió y se liofilizó para producir (87 mg, 100%) de producto en forma de un sólido de color blanco: Rf = 0,21 (sílice, IPA/H2O/NH4OH a 7/2/1); RMN 1H (D2O, 500 MHz) δ 1,66 (td, 1H, J =5,3), 2,50 (dd, 1H, J = 13,2,4,6), 3,43 (d, J = 9,58, 1H), 3,63 (dd, J = 11,9, 6,44, 1H), 3,88 (dd, J = 11,8, 1,0, 1H), 3,95 (td, J = 9,0, 2,3, 1H), 4,10 (t, J = 10,42, 1H), 4,12 (td, J = 10,34, 4,66, 1H), 4,18 (d, J = 10,36, 1H), 4,24 (m, 2H), 4,31 (t, J = 4,64, 1H), 4,35 (t, 1H), 6,00 (d, J = 4,37, 1H), 6,13 (d, J = 7,71, 1H), 7,98 (d, J = 7,64, 1H). MS (ES); calc. para C21H32N5O11P ([M-H]-), 629,47; encontrado 627,9.
Preparación de citidina-5’-monofosforil-[5-(N-metoxi-polioxietileno-(1 KDa)-3-oxipropionamido)-glicilamido3,5-didesoxi-β-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato]. Se añadió hexafluorofosfato de benciltriazol-1-iloxitris(dimetilamino)-fosfonio (BOP, 21 mg, 48 μmol) a una solución de ácido metoxipolioxietileno-(peso molecular medio de 1 KDa)-3-oxipropiónico (48 mg, 48 μmol) disuelto en DMF anhidra (700 μl) y trietilamina (13 μl, 95 μmol). Después de 30 min, se añadió una solución que contenía citidina-5’-monofosforil-(5-glicilamido-3,5-didesoxi-β-Dglicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato) (30 mg, 48 μmol), agua (400 μl) y trietilamina (13 μl, 95 μmol). Esta solución se agitó 20 min a temperatura ambiente y después se cromatografió (sílice C 18, gradiente de metanol/agua). Las fracciones apropiadas se recogieron, se concentraron, el residuo se disolvió en agua y se liofilizó para producir 40 mg (rendimiento de un 50%) de un sólido de color blanco: Rf = 0,36 (sílice, IPA/H2O/NH4OH a 7/2/1); RMN 1H (D2O, 500 MHz) δ 1,66 (td, 1H, J = 5,3), 2,50 (dd, 1H, J = 13,2, 4,6), 2,64 (t, J = 5,99, 3H) 3,43 (d, J = 9,58, 1H), 3,63 (m, 1H), 3,71 (s, 70H), 3,79 (m, oscurecido por un pico a 3,71), 3,82 (t, J = 6,19, 1H) 3,88 (dd, J = 11,8, 1,0, 1H), 3,95 (td, J = 9,0, 2,3, 1H), 3,98 (t, J = 5,06, 1H), 4,12 (td, J = 10,34, 4,66, 1H), 4,18 (d, J = 10,36, 1H), 4,23 (d, J = 4,85, 2H), 4,31 (t, J = 4,64, 1H), 4,35 (t, 1H), 6,00 (d, J = 4,55, 1H), 6,13 (d, J = 7,56, 1H), 7,98 (d, J = 7,54, 1H). MS (MALDI), observado [M-H]; 1594,5, 1638,5, 1682,4, 1726,4, 1770,3, 1814,4, 1858,2, 1881,5, 1903,5, 1947,3.
Preparación de citidina-5’-monofosforil-[5-(N-metoxi-polioxietileno-(10 KDa)-oxicarboxamido)-glicilamido-3,5didesoxi-β-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato]. Se añadió citidina-5’-monofosforil-(5-glicilamido-3,5didesoxi-β-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato) (2,5 mg, 4 μmol) y agua (180 μl) a una solución de éster de (Metoxipolioxietileno-(10 KDa, peso molecular medio)-oxicarbonil-(N-oxibenzotriazol) (40 mg, 4 μmol) en DMF anhidra (800 μl) que contiene trietilamina (1,1 μl, 8 μmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Después, la mezcla de reacción se diluyó con agua (8 ml) y se purificó por cromatografía ultrarrápida de fase inversa (C 18 sílice, gradiente de metanol/agua). Las fracciones apropiadas se combinaron, se concentraron, el residuo se disolvió en agua y se liofilizó produciendo 20 mg (rendimiento de un 46%) de producto en forma de un sólido de color blanco: Rf = 0,35 (sílice, IPA/H2O/NH4OH a 7/2/1); RMN 1H (D2O, 500 MHz) δ 1,66 (td, 1H), 2,50 (dd, 1H), 2,64 (t, 3H) 3,55-3,7 (m, oscurecido por un pico a 3,71), 3,71 (s, 488H), 3,72-4,0 (m, oscurecido por un pico a 3,71), 4,23 (m, 3H), 4,31 (t, 1H), 4,35 (t, 1H), 6,00 (d, J = 4,77, 1H), 6,12 (d, J = 7,52, 1H), 7,98 (d, J = 7,89, 1H). MS (MALDI), observado [M-CMP+Na]; 10780.
9. GlicoPEGilación de FSH derivada de pituitaria humana
Este ejemplo ilustra el ensamblaje de un conjugado de la invención. La Hormona Estimuladora de los Folículos (FSH) se desialila y después se conjuga con CMP-(ácido siálico)-PEG.
Desialilación de Hormona Estimuladora de los Folículos. Hormona Estimuladora de los Folículos (FSH) (Pituitaria Humana, Calbiochem Nº de Cat. 869001), 1 mg, se disolvió en 500 μl de Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, CaCl2 5 mM. Esta solución, 375 μl, se transfirió a un tubo de plástico pequeño y se le añadieron 263 mU de Neuraminidasa II (Vibrio cholerae). La mezcla de reacción se agitó suavemente durante 15 horas a 32 ºC. La mezcla de reacción se añadió a conjugado de ácido N-(p-aminofenil) oxámico-agarosa, 600 μl, equilibrado previamente con Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM y NaN3 al 0,05% y se hizo girar suavemente durante 6,5 horas a 4 ºC. La suspensión se centrifugó durante 2 minutos a 14.000 rpm y se recogió el sobrenadante. Las perlas se lavaron 5 veces con 0,5 ml del tampón y todos los sobrenadantes se combinaron. La solución enzimática se dializó (7000 MWCO) durante 15 horas a 4 ºC con 2 l de una solución que contenía Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05%, y después dos veces durante 4 horas a 4 ºC en Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05%. La solución se concentró a 2 μg/μl mediante Speed Vac y se almacenó -20 ºC. Las muestras de reacción se analizaron mediante geles de IEF (pH 3-7) (Invitrogen) (Figura 105).
Preparación de AS-FSH derivada de pituitaria humana y PEG-AS-Hormona Estimuladora de los Folículos.
FSH desialilada (100 μg, 50 μl) y CMP-ácido siálico o CMP-AS-PEG (1 kDa o 10 kDa) (0,05 umol) se disolvieron en 13,5 μl de H2O (ajustado a pH 8 con NaOH) en tubos de plástico de 0,5 ml. Los tubos se agitaron vorticialmente brevemente y se añadieron 40 mU de ST3Gal3 (36,5 μl) (volumen total de 100 μl). Los tubos se agitaron vorticialmente de nuevo y se agitaron suavemente durante 24 horas a 32 ºC. Las reacciones se detuvieron por congelación a -80 ºC. Las masas de reacción de 15 μg se analizaron por SDS-PAGE (Figura 106), geles de IEF (Figura 107) y MALDI-TOF. También se analizó la FSH nativa por SDS-PAGE (Figura 108).
Análisis de SDS PAGE e IEF en Geles de los Productos de Reacción. Geles de 1 mm de Tris-Glicina al 8-16% de Novex para análisis de SDS PAGE se adquirieron en Invitrogen. 7,5 μl (15 μg) de muestras de reacción de FSH se diluyeron con 5 μl de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, tampón NaN3 al 0,05%, se mezclaron con 15 μl de tampón de carga de muestras y 1 μl de μ-mercaptoetanol 9 M y se calentó durante 6 minutos a 85 ºC. Los geles se realizaron según las indicaciones de Invitrogen y se tiñeron con Tinte Azul Coloidal (Invitrogen).
Muestras de FSH (15 μg) se diluyeron con 5 μl de tampón Tris y se mezclaron con 15 μl de tampón de carga de muestras (Figura 105). Después las muestras se aplicaron a Geles de Enfoque Isoeléctrico (pH 3-7) (Invitrogen) (Figura 108). Los geles se realizaron y se fijaron según las indicaciones de Invitrogen y después se tiñeron con Tinte Azul Coloidal.
10. GlicoPEGilación de FSH recombinante producida recombinantemente en células CHO
Este ejemplo ilustra el ensamblaje de un conjugado de la invención. FSH disialilada se conjugó con CMP-(ácido siálico)-PEG.
Preparación de Asialo-Hormona Estimuladora de los Folículos recombinante. La Hormona Estimuladora de los Folículos recombinante (rFSH) producida a partir de CHO se usó en estos estudios. Las 7.500 IU de Gonal-F se disolvieron en 8 ml de agua. La solución de FSH se dializó en Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, CaCl2 5 mM y se concentró a 500 μl en un filtro centrífugo Centricon Plus 20. Una porción de esta solución (400 μl) (~ 0,8 mg de FSH) se transfirió a un tubo de plástico pequeño y se le añadieron 275 mU de Neuraminidasa II (Vibrio cholerae). La mezcla de reacción se mezcló durante 16 horas a 32 ºC. La mezcla de reacción se añadió a conjugado de ácido N(p-aminofenil)oxámico-agarosa lavado previamente (800 μl) y se hizo girar suavemente durante 24 horas a 4 ºC. La mezcla se centrifugó a 10.000 rpm y se recogió el sobrenadante. Las perlas se lavaron 3 veces con 0,6 ml de tampón Tris-EDTA, una vez con 0,4 ml de tampón Tris-EDTA y una vez con 0,2 ml del tampón Tris-EDTA y todos los sobrenadantes se combinaron. El sobrenadante se dializó a 4 ºC frente a 2 l de Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05% y después dos veces más frente a Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05%. La solución dializada se concentró después a 420 μl en un filtro centrífugo Centricon Plus 20 y se almacenó a -20 ºC.
Las muestras de rFSH nativa y desialilada se analizaron por SDS-PAGE e IEF (Figura 109). Los geles de 1 mm de Tris-Glicina al 8-16% de Novex se adquirieron en Invitrogen. Las muestras (7,5 μl, 15 μg) se diluyeron con 5 μl de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, tampón NaN3 al 0,05%, se mezclaron con 15 μl de tampón de carga de muestras y 1 μl de β-mercaptoetanol 9 M y calentó durante 6 minutos a 85 ºC. Los geles se realizaron según las indicaciones de Invitrogen y se tiñeron con Tinte Azul Coloidal (Invitrogen). Los Geles de Enfoque Isoeléctrico (pH 37) se adquirieron en Invitrogen. Las muestras (7,5 μl, 15 μg) se diluyeron con 5 μl de tampón Tris y se mezclaron con 15 μl tampón de carga de muestras. Los geles se cargaron, se desarrollaron y se fijaron según las indicaciones de Invitrogen. Los geles se tiñeron con Tinte Azul Coloidal. Las muestras de FSH nativa y desialilada también se dializaron frente a agua y se analizaron por MALDI-TOF.
Sialil-PEGilación de Hormona Estimuladora de los Folículos recombinante. FSH desialilada (100 μg, 54 μl) y CMP-AS-PEG (1 kDa o 10 kDa) (0,05 μmol) se disolvieron en 28 μl Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2 en tubos de plástico de 0,5 ml. Los tubos se agitaron vorticialmente brevemente y se añadieron 20 mU de ST3Gal3 (volumen total de 100 μl). Los tubos se agitaron vorticialmente de nuevo, se mezcló suavemente durante 24 horas a 32 ºC y las reacciones se detuvieron por congelación a -80 ºC. Las muestras de esta reacción se analizaron como se ha descrito anteriormente por geles de SDS-PAGE (Figura 110), geles de IEF (Figura 111) y MALDI-TOF MS.
También se realizó MALDI en la rFSH PEGilada. Durante la ionización, AS-PEG se elimina partir de la estructura del N-glicano de la glicoproteína. La FSH nativa dio un pico a 13928; AS-rFSH (13282); r-FSH resialilada (13332); PEG100-rFSH (13515; 14960 (1); 16455 (2); 17796 (3); 19321 (4)); y PEG 10000 (23560 (1); 24790 (2); 45670 (3); y 56760 (4)).
11. Estudio Farmacocinético de FSH GlicoPEGilada
Este ejemplo expone el ensayo de las propiedades farmacocinéticas de la Hormona Estimuladora de los Folículos (FSH) glicoPEGilada preparada de acuerdo con los procedimientos de la invención en comparación con la FSH no PEGilada.
FSH, FSH-AS-PEG (1 KDa) y FSH-AS-PEG (10 KDa) se radioionizaron usando condiciones convencionales (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL) y se formularon en solución salina tamponada con fosfato que contenía BSA al 0,1%. Después de dilución en tampón de fosfato hasta la concentración apropiada, cada una de las proteínas FSH del ensayo (0,4 μg, cada una) se inyectó por vía intravenosa en ratas hembra de Sprague Dawley (250-300 g de peso corporal) y se extrajo sangre en los puntos temporales de 0 a 80 horas. Se analizó la radiactividad en las muestras de sangre usando un contador gamma y se analizó la farmacocinética usando procedimientos convencionales (Figura 112). FSH se aclaró a partir de la sangre mucho más rápidamente que FSH-PEG (1 KDa), que a su vez era transparente en cierto modo más rápidamente que FSH-PEG (10 KDa).
12. Bioensayo para péptidos de FSH
Este ejemplo expone un bioensayo para la actividad de la Hormona Estimuladora de los Folículos (FSH) en base a células de Sertoli cultivadas. Este ensayo es útil para determinar la bioactividad de FSH después de la remodelación de glicanos, incluyendo la glicoconjugación.
Este bioensayo se basa en la relación dosis-respuesta que existe entre la cantidad de estradiol producido cuando la FSH, pero no la hormona lutenizante (LH), se añade a células de Sertoli cultivadas obtenidas a partir de ratas viejas inmaduras. La testosterona exógena se convierte en 17β-estradiol en presencia de FSH.
Ratas Sprague-Dawley con siete a 10 días se usaron para obtener células de Sertoli. Después de sacrificarlas, los testículos se desencapsularon y el tejido se dispersó por incubación en colagenasa (1 mg/ml), tripsina (1 mg/ml), hialuronidasa (1 mg/ml) y DNasas (5 μg/ml) durante 5 a 10 min. Los fragmentos de túbulos se asentaron en el fondo del matraz y se lavaron en PBS (1x). Los fragmentos de túbulos se volvieron a incubar durante 20 min con un medio que contenía las mismas enzimas: colagenasa (1 mg/ml), tripsina (1 mg/ml), hialuronidasa (1 mg/ml) y DNasas (5 μg/ml).
Los fragmentos de túbulos se homogeneizaron y se sembraron en una placa de 24 pocillos en un medio sin suero. Se dispersaron 5 x 105 células por pocillo. Después de 48 h de incubación a 37 ºC y CO2 al 5%, se añadió medio recién preparado a las células. Composición del medio sin suero: DMEM (1 vol), mezcla de nutrientes F10 de Ham (1 vol), insulina 1 μg/ml, Transferrina 5 μg/ml, EGF 10 ng/ml, T4 20 pg/ml, Hidrocortisona 10-8 M, Ácido retinoico 10-6
M.
El experimento de estimulación consiste en una incubación de 24 horas con FSH convencional o con muestras a 37 ºC y CO2 al 5%. El coeficiente de variación medio dentro de los ensayos es de un 9% y el coeficiente de variación media entre los ensayos es de un 11%.
El Kit DE2000 para calcular 17B-estradiol por Elisa (R&D Systems, Minneapolis, MN) se usó para cuantificar el nivel de estradiol después de incubación con FSH, FSH-AS-PEG (1 KDa) y FSH-AS-PEG (10 KDa).
El procedimiento fue como sigue a continuación: 100 μl de Estradiol Convencional (proporcionado con el kit y preparado según las instrucciones con el kit) o una muestra se pipeteó en pocillos de la placa o las placas para Elisa para 17B-estradiol; se añadieron a cada pocillo 50 μl de Conjugado de 17B-estradiol (proporcionado con el kit, preparado según las instrucciones con el kit); se añadieron a cada pocillo 50 μl de solución de Anticuerpos de 17Bestradiol (proporcionada con el kit, preparado según las instrucciones con el kit); las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente a 200 rpm; el líquido se aspiró de cada pocillo; los pocillos se lavaron 4 veces usando la solución de lavado; todo el líquido se retiró de los pocillos; 200 μl de sustrato de pNPP (proporcionado con el kit, preparado según las instrucciones con el kit) se añadieron a todos los pocillos y se incubó durante 45 min; se añadieron 50 μl de solución de Parada (proporcionada con el kit, preparado según las instrucciones con el kit) y las placas se leyeron a 405 nm (Figura 113). Mientras que FSH-PEG (10 KDa) presentaba una estimulación discreta de las células de Sertoli, a 1 μg/ml, FSH-PEG (1 KDa) estimuló las células de Sertoli hasta un 50% más que la FSH sin PEGilar.
13. GlicoPEGilación de Transferrina
Este ejemplo expone la preparación de asialotransferrina y su sialilación con PEG-CMP-ácido siálico.
Preparación de Asialo-transferrina. Holo-Transferrina derivada de ser humano, (10 mg) se disolvió en 500 μl de NaOAc 50 mM, CaCl2 5 mM, pH 5,5. A esta solución se añadieron 500 mU de Neuraminidasa II (Vibrio cholerae) y la mezcla de reacción se agitó suavemente durante 20,5 horas a 37 ºC. La mezcla de reacción se añadió al conjugado lavado previamente de ácido N-(p-aminofenil) oxámico-agarosa (600 μl) y las perlas lavadas se hicieron girar suavemente durante 24 horas a 4 ºC. La mezcla se centrifugó a 10.000 rpm y se recogió el sobrenadante. La mezcla de reacción se ajustó a EDTA 5 mM mediante la adición de 100 μl de EDTA 30 mM a las perlas lavadas, que se hicieron girar suavemente durante 20 horas a 4 ºC. La suspensión se centrifugó Durante 2 minutos a 10.000 rpm y se recogió el sobrenadante. Las perlas se lavaron 5 veces con 0,35 ml de NaOAc 50 mM, CaCl2 5 mM, EDTA 5 mM, pH 5,5 y todos los sobrenadantes se combinaron. La solución enzimática y dializó dos veces a 4 ºC en Tris-HCl 15 mM, NaCl 1 M, pH 7,4. Se retiraron 0,3 ml de la solución de transferrina (3,3 ml en total) y se dializó dos veces frente a agua. El resto se dializó dos veces más a 4 ºC frente a solución salina tamponada con fosfato. La solución dializada se almacenó a -20 ºC. Las muestras de proteínas se analizaron por IEF Electroforesis. Las muestras (9 μl, 25 μg) se diluyeron con 16 μl de tampón Tris y se mezclaron con 25 μl del tampón de carga de muestras y se aplicó a Geles de Enfoque Isoeléctrico (pH 3-7). Los geles se desarrollaron y se fijaron usando procedimientos convencionales. Los geles se tiñeron con Tinte Azul Coloidal.
Sialil-PEGilación de asialo-Transferrina. Transferrina desialilada (250 μg) y CMP-ácido siálico o CMP-AS-PEG (1 kDa o 10 kDa) (0,05 μmol) se disolvieron en 69 μl de Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2 en tubos de plástico de 1,5 ml. Los tubos se agitaron vorticialmente brevemente y se añadieron 100 mU de ST3Gal3 (90 μl) (volumen total de 250 μl). Los tubos se agitaron vorticialmente de nuevo y se mezcló suavemente durante 24 horas a 32 ºC. Las reacciones se detuvieron por congelación a -80 ºC. Se usaron geles de 1 mm de Tris-Glicina al 8-16% de Novex para el análisis SDS PAGE (Figura 114). Las muestras (25 μl, 25 μg) se mezclaron con 25 μl de tampón de carga de muestras y 0,4 μl de β-mercaptoetanol y se calentó durante 6 minutos a 85 ºC. Los geles se desarrollaron usando condiciones convencionales y se tiñeron con Tinte Azul Coloidal. Los geles para IEF también se realizaron como se ha descrito anteriormente (Figura 115). Las muestras también se dializaron frente a agua y se analizaron por MALDI-TOF.
Resultados. También se realizó MALDI. Transferrina nativa (78729); asialotransferrina (78197); transferrina resialilada (79626/80703); con AS-PEG 1k (79037 (1); 80961 (2); 82535 (3); 84778 (4)); con AS-PEG 5k (90003 (2); 96117 (3); 96117 (4)); con AS-PEG 10k (100336 (2); 111421 (3); 122510(4)).
14. GlicoPEGilación de Factor VIIa Recombinante producido en células BHK
Este ejemplo expone la PEGilación del Factor VIIa recombinante producida en células CHO.
Preparación de Asialo-Factor VIIa. El Factor VIIa recombinante se produjo en células BHK (células renales de cría de hámster). El Factor VIIa (14,2 mg) se disolvió a 1 mg/ml en solución tampón (pH 7,4, Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M, CaCl2 0,001 M, NaN3 al 0,05%) y se incubó con 300 mU/ml de conjugado de sialidasa (Vibrio cholera)-agarosa durante 3 días a 32 ºC. Para controlar la reacción, se diluyó una pequeña alícuota de la reacción con el tampón apropiado y se realizó un gel para IEF de acuerdo con los procedimientos de Invitrogen (Figura 116). La mezcla se centrifugó a 3.500 rpm y se recogió el sobrenadante. La resina se lavó tres veces (3 x 2 ml) con la solución tampón anterior (pH 7,4, Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%) y los lavados combinados se concentraron en un Centricon-Plus-20. La solución restante se cambió de tampón con Tris 0,05 M (pH 7,4), NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05% hasta un volumen final de 14,4 ml.
Preparación de Factor VIIa-AS-PEG (1 KDa y 10 KDa). La solución de desialilación del rFactor VIIa se dividió en dos muestras iguales de 7,2 ml. A cada muestra se añadió CMP-AS-5-PEG (1 KDa) (7,4 mg) o CMP-AS-5-PEG (10 KDa) (7,4 mg). Se añadió ST3Ga13 (1,58 U) a ambos tubos y las mezclas de reacción se incubaron a 32 ºC durante 96 h. La reacción se controló por gel para SDS-PAGE usando los reactivos y las condiciones descritos por Invitrogen. Cuando la reacción se completó, la mezcla de reacción se purificó usando una columna preparativa Toso Haas TSK-Gel-3000 usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. Las fracciones combinadas que contenían el producto se concentraron a 4 ºC en filtros centrífugos Centricon-Plus-20 (Millipore, Bedford, MA) y la solución concentrada se volvió a formular para producir 1,97 mg (ensayo de proteínas del ácido bicinconínico, ensayo BCA, Sigma-Aldrich, St. Louis MO) de Factor VIIa-PEG. El producto de la reacción se analizó usando análisis de SDS-PAGE y de IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos suministrados por Invitrogen. Las muestras se dializaron frente a agua y se analizaron por MALDI-TOF. La Figura 117 muestra los resultados por MALDI para el Factor VIIa nativo. La Figura 118 contiene los resultados por MALDI para el Factor VIIa PEGilado con PEG de 1 KDa en los que el Factor VIIa PEGilado con PEG de 1 KDa es evidente. La Figura 119 contiene los resultados por MALDI para el Factor VIIa PEGilado con PEG de 10 KDa en los que es evidente un pico para el Factor VIIa PEGilado con PEG de 10 KDa. La Figura 120 representa el análisis de SDS-PAGE de todos los productos de reacción, en el que es evidente una banda para el Factor VIII-AS-PEG (10-KDa).
15. GlicoPEGilación del Factor IX producido en células CHO Este ejemplo expone la preparación de asialoFactor IX y su sialilación con PEG-CMP-ácido siálico.
Desialilación del rFactor IX. Una forma recombinante del Factor IX de Coagulación (rFactor IX) se preparó en células CHO. 6000 IU de rFactor IX se disolvieron en un total de 12 ml de USP H2O. Esta solución se transfirió a un filtro centrífugo PL-10, Centricon Plus 20, con otros 6 ml de USP H2O. La solución se concentró a 2 ml y después se diluyó con 15 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, CaCl2 5 mM, NaN3 al 0,05% y después se volvió a concentrar. La dilución/concentración se repitió 4 veces para cambiar eficazmente el tampón hasta un volumen final de 3,0 ml. De esta solución, se transfirieron 2,9 ml (aproximadamente 29 mg de rFactor IX) a un tubo de plástico pequeño y se le añadieron 530 mU de conjugado de α2-3,6,8-Neuraminidasa-agarosa (Vibrio cholerae, Calbiochem, 450 μl). La mezcla de reacción se hizo girar suavemente durante 26,5 horas a 32 ºC. La mezcla se centrifugó 2 minutos a 10.000 rpm y se recogió el sobrenadante. Las perlas de agarosa (que contenían neuraminidasa) se lavaron 6 veces con 0,5 ml de Tris-HCl 50 mM a pH 7,12, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05%. Los lavados y los sobrenadantes combinados se centrifugaron de nuevo durante 2 minutos a 10.000 rpm para retirar cualquier resina de agarosa residual. La solución de proteínas desialilada, combinada se diluyó a 19 ml con el mismo tampón y se concentró por debajo de ~ 2 ml en un filtro centrífugo PL-10 Centricon Plus 20. La solución se diluyó dos veces con 15 ml de Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05% y se volvió concentrar hasta 2 ml. La solución final de rFactor IX desialilado se diluyó hasta un volumen final de 3 ml (~10 mg/ml) con el Tampón Tris. Las muestras de rFactor IX nativo y desialilado se analizaron por IEF-Electroforesis. Los Geles de Enfoque Isoeléctrico (pH 3-7) se desarrollaron usando muestras de 1,5 μl (15 μg) diluidas primero con 10 μl de tampón Tris y mezcladas con 12 μl de tampón de carga de muestras. Los geles se cargaron, se desarrollaron y se fijaron usando procedimientos convencionales. Los geles se tiñeron con Tinte Azul Coloidal (Figura 121), mostrando una banda para el Factor IX desialidado.
Preparación de PEG (1 kDa y 10 kDa)-AS-Factor IX. rFactor-IX desialidado (29 mg, 3 ml) se dividió en dos muestras de 1,5 ml (14,5 mg) en dos tubos para centrífuga de 15 ml. Cada solución se diluyó con 12,67 ml de Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05% y se añadió CMP-AS-PEG-lk o 10k (7,25 μmol). Los tubos se invirtieron suavemente para mezclar y se añadieron 2,9 U de ST3Gal3 (326 μl) (volumen total 14,5 ml). Los tubos se invirtieron de nuevo y se hicieron girar suavemente durante 65 horas a 32 ºC. Las reacciones se detuvieron por congelación a -20 ºC. Se analizaron muestras de 10 μg de las reacciones por SDS-PAGE. Las proteínas PEGiladas se purificaron en una columna Toso Haas Biosep G3000SW (21,5 x 30 cm, 13 um) para HPLC con Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco, pH 7,1 (Gibco), 6 ml/min. La reacción y la purificación se controlaron usando SDS Page y geles para IEF. Se cargaron geles de 1 mm deTris-Glicina al 4-20% de Novex con 10 μl (10 μg) de muestras después de dilución con 2 μl de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, tampón NaN3 al 0,05% y se mezcló con 12 μl de tampón de carga de muestras y 1 μl de DTT 0,5 M y se calentó durante 6 minutos a 85 ºC. Los geles se tiñeron con Tinte Azul Coloidal (Figura 122) mostrando una banda para PEG (1 kDa y 10 kDa)-AS-Factor
IX.
16. Sialil-GlicoPEGilación Directa de Factor-IX
Este ejemplo expone la preparación de sialil-glicoPEGilación de péptidos sin tratamiento anterior con sialidasa. Aquí, el Factor-IX es el péptido ejemplar.
Sialil-PEGilación Directa (10 KDa) de Factor-IX. Se disolvió Factor IX (1100 IU) en 5 ml de histidina 20 mM, tampón de glicina 520 mM que contenía sacarosa al 2%, NaN3 al 0,05%, y polisorbato 80 al 0,01%, pH 5,0. El CMP-AS-PEG (10 KDa) (27,8 mg, 3,5 μmol) se añadió después a esta solución, la mezcla de reacción se invirtió suavemente para mezclar y se añadieron 1,4 U de ST3Ga13. La mezcla de reacción se hizo girar suavemente durante 19 horas a 32 ºC y la reacción se detuvo por congelación. La mezcla de reacción se analizó por geles para SDS-PAGE usando las condiciones de desarrollo y tinción (Azul Coloidal) descritas por Invitrogen. Brevemente, se mezclaron muestras (10 μl) con 12 μl de tampón de carga de muestras y 2 μl de DTT 0,5 M y se calentó durante 6 minutos a 85 ºC (Figura 123, líneas 8, 9 y 10). El producto se purificó en una columna 10/20 Superdex 200 (Amersham, Uppsala, Suecia) con Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco, pH 7,1 (Gibco), 6 ml/min. Figura (Figura 123 contiene una banda (línea 5) del Factor-IX PEGilado purificado por HPLC.
17. Protección con ácido siálico de Factor IX GlicoPEGilado
Este ejemplo expone el procedimiento para la protección con ácido siálico de péptidos sialil-glicoPEGilados. Aquí, el Factor-IX es el péptido ejemplar.
Protección con ácido siálico de Glicanos de Factor-IX-AS-PEG (10 KDa) unidos a N y unidos a O. Se concentró r-Factor-IX-PEG purificado (10 KDa) (2,4 mg) en un filtro centrífugo PL-10 Centricon® Plus 20 (Millipore Corp., Bedford, MA) y el tampón se cambió por Tris-HCl 50 mM a pH 7,2, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05% hasta un volumen final de 1,85 ml. La solución de proteínas se diluyó con 372 μl del mismo tampón Tris y se añadieron 7,4 mg de CMP-AS (12 μmol) en forma de un sólido. La solución se invirtió suavemente para mezclar y se añadieron 0,1 U de ST3Gal1 y 0,1 U de ST3Gal3. La mezcla de reacción se hizo girar suavemente durante 42 horas a 32 ºC.
Una muestra de 10 μg de la reacción se analizó por SDS-PAGE. Se desarrollaron geles de 1 mm de Tris-Glicina al 4-12% de Novex y se tiñeron usando Azul Coloidal tal como lo describe Invitrogen. En resumen, muestras de 10 μl (10 μg), se mezclaron con 12 μl de tampón de carga de muestras y 1 μl de DTT 0,5 M y se calentó durante 6 minutos a 85 ºC (Figura 123, línea 4).
18. GlicoPEGilación de Proteínas expresadas en Sistemas de Mamíferos o de Insectos: EPO, Interferón α e Interferón β
Este ejemplo expone la preparación de péptidos PEGilados que se expresan en sistemas de mamíferos y de insectos.
Preparación de aceptor a partir de sistemas de expresión en mamíferos. Los péptidos a glicoPEGilar usando CMP-ácido siálico PEG necesitan tener glicanos que terminen en galactosa. La mayoría de péptidos procedentes de sistemas de expresión en mamíferos tendrán ácido siálico terminal que primero necesita ser retirado.
Digestión con sialidasa. El péptido se desialida usando una sialidasa. Un procedimiento típico implica la incubación de una solución de 1 mg/ml del péptido en solución salina tamponada con Tris, pH 7,2, con CaCl2 5 mM añadido, con 0,2 U/ml de sialidasa inmovilizada a partir de Vibrio cholera (Calbiochem) a 32 ºC durante 24 horas. El crecimiento microbiano se puede detener por filtración estéril o por la inclusión de azida sódica al 0,02%. La resina después se retira por centrifugación o por filtración, y después se lava para recuperar el péptido atrapado. En este punto, se puede añadir EDTA a la solución para inhibir cualquier sialidasa que se haya lixiviado a partir de la resina.
Preparación a partir de sistemas de expresión en insectos. EPO, interferón-alfa, e interferón-beta también se pueden expresar en sistemas no mamíferos tales como levadura, plantas, o células de insectos. Los péptidos a glicoPEGilar usando CMP-ácido siálico PEG necesitan tener glicanos que terminen en galactosa. La mayoría de los N-glicanos en péptidos expresados en células de insectos, por ejemplo, son el núcleo de trimanosilo. Estos glicanos se construyen primero en glicanos que terminan en galactosa antes de que sean aceptores para la sialiltransferasa.
Construcción de glicanos aceptores a partir de núcleo de trimanosilo. Péptido (1 mg/ml) en solución salina tamponada con Tris, pH 7,2, que contiene MnCl2 5 mM, UDP-glcNAc 5 mM, 0,05 U/ml de GLCNACT I, 0,05 U/ml de GLCNACT II, se incuba a 32 ºC durante 24 horas o hasta que la reacción está básicamente completa. El crecimiento microbiano se puede detener por filtración estéril o por la inclusión de azida sódica al 0,02%. Después de intercambio de tampón para retirar UDP y otras moléculas pequeñas, cada uno de UDP-galactosa y MnCl2 se añaden a 5 mM, galactosiltransferasa se añade a 0,05 U/ml, y se incuba a 32 ºC durante 24 H o hasta que la reacción esté básicamente completa. El crecimiento microbiano se puede detener por filtración estéril o por la inclusión de azida sódica al 0,02%. Los péptidos entonces están listos para la glicoPEGilación.
Construcción de glicanos unidos a O. Una estrategia similar se puede usar para que el interferón alfa produzca enzimáticamente el O-glicano Gal-GalNAc deseado. Si fuera necesario, GalNAc unida a serina o a treonina se puede añadir al péptido usando péptido GalNAc transferasas adecuadas (por ejemplo, GalNAc T1, GalNAc T2, T3, T4, etc.) y UDP-GalNAc. Además, si fuera necesario, se puede añadir galactosa usando galactosiltransferasa y UDP-galactosa.
GlicoPEGilación usando sialiltransferasa. Los glicopéptidos (1 mg/ml) que soportan galactosa terminal en solución salina tamponada con Tris + azida sódica al 0,02% se incuban con CMP-AS-PEG (0,75 mM) y 0,4 U/ml de sialiltransferasa (ST3Gal3 o ST3Gal4 para N-glicanos en EPO e interferón beta; ST3Gal4, o ST3Gal1 para Oglicanos en interferón alfa) a 32 ºC durante 24 horas. Otras transferasas que pueden funcionar incluyen la 2,6 sialiltransferasa a partir de Photobacterium damsella. La concentración del péptido aceptor está más preferentemente en el intervalo de 0,1 mg/ml hasta el límite de solubilidad del péptido. La concentración de CMP-AS-PEG debería ser suficiente para que hubiera un exceso sobre los sitios disponibles, pero no tan alto como para causar problemas de solubilidad del péptido debido al PEG, y puede variar de 50 pM hasta 5 mM, y la temperatura puede variar de 2 ºC hasta 40 ºC. El tiempo requerido para completar la reacción dependerá de la temperatura, las cantidades relativas de enzima a sustrato aceptor, la concentración de sustrato donador, y el pH.
19. GlicoPEGilación de EPO producida en células de insectos
Este ejemplo expone la preparación de EPO biantenaria PEGilada a partir de EPO expresada en células de insecto.
La eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) a partir del sistema de expresión de baculovirus/Sf9 (Protein Sciences Corp., Meriden, CT) se sometió a análisis de glicanos y los glicanos resultantes mostraron ser principalmente núcleo de trimanosilo con núcleo de fucosa, con un pequeño porcentaje de glicanos que también presentan una única GlcNAc (Figura 124).
Adición de N-acetilglucosamina con GnT-I y GnT-II. Dos lotes de rhEPO (1 mg/ml) se incubaron con GnT-I y GnT-II, UDP-glcNAc 5 mM, MnCl2 20 mM, y azida sódica al 0,02% en MES 100 mM a pH 6,5 a 32 ºC durante 24 h. El lote A contenía 20 mg de EPO, y 100 mU/ml de GnT-I y 60 mU/ml de GnT-II. El lote B contenía 41 mg de EPO, y 41 mU/ml de GnTI + 50 mU/ml de GnT-II. Después de la reacción, la muestra se desaló por filtración en gel (columnas PD10, Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ).
El establecimiento de perfiles de glicanos por 2AA HPLC reveló que el lote A se convirtió en un 92% en una estructura biantenaria con dos GlcNAc (el equilibrio tiene una única glcNAc. El lote B mostró una conversión de un 97% en el producto deseado (Figuras 102A y 102B.).
Galactosilación del lote A de EPO. EPO (~16 mg del lote A) se trató con GnTII para completar la adición de GlcNAc. La reacción se realizó en Tris 50 mM a pH 7,2 que contenía NaCl 150 mM, EPO mg/ml, UDP-GlcNAc 1 mM, MnCl2 5 mM, azida sódica al 0,02% y 0,02 U/ml de GnTII a 32 ºC durante 4 h. Después se efectuó la galactosilación de EPO mediante la adición de UDP-galactosa a 3 mM y GalT1 a 0,5 U/ml y la incubación continuó a 32 ºC durante 48 h.
La EPO galactosilada después se purificó por filtración en gel en una columna Superdex 1,6/60 en Tris 50 mM, NaCl 0,15 M, pH 6. El pico que contiene EPO se analizó después por 2AA HPLC. En base a los datos por HPLC ~85% de los glicanos contiene dos galactosas y ~15% de los glicanos no presenta ninguna galactosa después de la reacción de galactosilación.
Sialilación de EPO galactosilada. La sialilación de EPO galactosilada se realizó en Tris 100 mM a pH que contenía NaCl 150 mM, 0,5 mg/ml de EPO, 200 mU/ml de ST3Ga13 y CMP-NAN 0,5 mM o CMP-NAN-PEG (1 KDa) o CMP-NAN-PEG (10 KDa) durante 48 horas a 32 ºC. Casi todos los glicanos que tienen dos restos de galactosa se sialilaron totalmente (2 ácidos siálicos / glicano) después de la reacción de sialilación con CMP-NAN. El análisis por MALDI-TOF confirmó los datos por HPLC.
PEGilación de EPO galactosilada. Para las reacciones de PEGilación que usan CMP-NAN-PEG (1 KDa) y CMP-NAN-PEG (10 KDa), se analizó una alícuota de la mezcla de reacción por SDS-PAGE (Figura 125). El peso molecular del péptido de EPO aumentó con la adición de cada azúcar, y aumentó más radicalmente en el peso molecular después de las reacciones de PEGilación.
Bioensayo de EPO in vitro. El bioensayo de EPO in vitro (adaptado a partir de Hammerling y col, 1996, J. Pharm. Biomed. Anal. 14: 1455-1469) se basa en la respuesta de la línea celular TF-1 a niveles múltiples de EPO. Las células TF-1 proporcionan un buen sistema para investigar la proliferación y la diferenciación de células progenitoras mieloides. Esta línea celular fue establecida por T. Kitamura y col. en Octubre de 1987 a partir de la muestra de aspiración de médula ósea heparinizada a partir de un varón Japonés de 35 años con pancitopenia grave. Estas células son totalmente dependientes de la Interleuquina 3 o del factor estimulador de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF).
La línea celular TF-1 (ATCC, Nº de Cat. CRL-2003) se cultivó en RPMI + FBS al 10% + GM-CSF (12 ng/ml) y se incubó a 37 ºC con CO2 al 5%. Las células estuvieron en suspensión a una concentración de 5000 células/ml de medios, y se dispensaron 200 μl en una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron con diversas concentraciones de EPO (de 0,1 μg/ml a 10 μg/ml) durante 48 horas. Un Ensayo de Viabilidad de MTT se realizó mediante la adición de 25 μl de MTT a 5 mg/ml (SIGMA M5655), incubando la placa a 37 ºC durante 20 min a 4 horas, añadiendo 100 μl de solución de isopropanol/HCl (100 ml de isopropanol + 333 μl de HCl 6 N), leyendo la DO a 570 nm, y a 630 nm o a 690 nm, y restando las lecturas a 630 nm o a 690 nm a partir de las lecturas a 570 nm.
La Figura 126 contiene los resultados obtenidos cuando EPO sialilada, y EPO glicoPEGilada con PEG de 1 KDa o 10 KDa se sometió a un ensayo de bioactividad de EPO in vitro. La EPO glicoPEGilada con PEG de 1 KDa presentaba casi la misma actividad que la EPO sin glicoPEGilar cuando ambas estaban a una concentración de aproximadamente 5 μg/ml. La EPO glicoPEGilada con PEG de 10 KDa presentaba aproximadamente la mitad de la actividad de la EPO sin glicoPEGilar cuando ambas estaban a una concentración de aproximadamente 5 μg/ml.
20. GlicoPEGilación de Interferón α producido en células CHO
Preparación de Asialo-Interferón α. El interferón alfa producido a partir de células CHO se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris 50 mM, Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, CaCl2 5 mM y se concentra a 500 μl en un filtro centrífugo Centricon Plus 20. La solución se incuba con 300 mU/ml de Neuraminidasa II (Vibrio cholerae) durante 16 horas a 32 ºC. Para controlar la reacción, se diluye una pequeña alícuota de la reacción con el tampón apropiado y una realización en gel para IEF. La mezcla de reacción se añade después a conjugado de ácido N-(paminofenil)oxámico-agarosa lavado previamente (800 μl/ml de volumen de reacción) y las perlas lavadas se hicieron girar suavemente durante 24 horas a 4 ºC. La mezcla se centrifuga a 10.000 rpm y se recogió el sobrenadante. Las perlas se lavan 3 veces con tampón Tris-EDTA, una vez con 0,4 ml de tampón Tris-EDTA y una vez con 0,2 ml del tampón Tris-EDTA y todos los sobrenadantes se combinaron. El sobrenadante se dializa a 4 ºC frente a Tris -HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05% y después dos veces más frente a Tris -HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05%. La solución dializada se concentra después usando un filtro centrífugo Plus 20 Centricon y se almacena -20 ºC. Las condiciones para el gel para IEF se desarrollan de acuerdo con los procedimientos y reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras de G-CSF nativo y desialidado se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de Interferón-alfa-(alfa2,3)-Sialil-PEG. Interferón-alfa desialidado se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-PEG 1 mM y 0,1 U/ml de ST3Gal1 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-PEG, una pequeña alícuota de la reacción presentaba CMP-AS-PEG-ligando fluorescente añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre mediante filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca fluorescente en el péptido se cuantifica usando un detector de fluorescencia en línea. Después de 2 días, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras de Interferón-alfa nativo y desialidado se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de Interferón-alfa-(alfa2,8)-Sialil-PEG. El Interferón-alfa producido en CHO, que contiene un glicano unido a O alfa2,3-sialilado, se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM , NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-PEG 1 mM y0,1 U/ml de CST-II a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-PEG, una pequeña alícuota de la reacción presenta CMP-AS-PEG-ligando fluorescente añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca fluorescente en el péptido se cuantifica usando un detector de fluorescencia en línea. Después de 2 días, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras de Interferón-alfa nativo y PEGilado se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de Interferón-alfa-(alfa2,6)-Sialil-PEG. Interferón-alfa, que contiene solamente GalNAc unida a O, se disolvió a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-PEG 1 mM y 0,1 U/ml de ST6GalNAcI o II a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-PEG, una pequeña alícuota de la reacción presentaba CMP-AS-PEG-ligando fluorescente añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca fluorescente en el péptido se cuantifica usando un detector de fluorescencia en línea. Después de 2 días, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis de SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras de Interferón-alfa nativo y PEGilado se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
21. GlicoPEGilación de G-CSF producido en células CHO
Preparación de Asialo-Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos (G-CSF). G-CSF producido en células CHO se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris 50 mM, Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, CaCl2 5 mM y se concentra a 500 μl en un filtro centrífugo Centricon Plus 20. La solución se incuba con 300 mU/ml de Neuraminidasa II (Vibrio cholerae) durante 16 horas a 32 ºC. Para controlar la reacción, una pequeña alícuota de la reacción se diluye con el tampón apropiado y se desarrolla un gel para IEF. La mezcla de reacción se añade después a conjugado de ácido N-(p-aminofenil)oxámico-agarosa lavado previamente (800 μl/ml de volumen de reacción) y las perlas lavadas se hacen girar suavemente durante 24 horas a 4 ºC. La mezcla se centrifuga a 10.000 rpm y se recogió el sobrenadante. Las perlas se lavan 3 veces con tampón Tris-EDTA, una vez con 0,4 ml de tampón Tris-EDTA y una vez con 0,2 ml del tampón Tris-EDTA y todos los sobrenadantes se combinan. El sobrenadante se dializa a 4 ºC frente a Tris -HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05% y después dos veces más frente a Tris -HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05%. La solución dializada se concentra después usando un filtro centrífugo Centricon Plus 20 y se almacena a -20 ºC. las condiciones para el gel para IEF se desarrollaron de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras de G-CSF nativo y desialidado se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de G-CSF-(alfa2,3)-Sialil-PEG. G-CSF desialidado se disolvió a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-PEG 1 mM y 0,1 U/ml de ST3Gal1 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-PEG, una pequeña alícuota de la reacción presentaba CMP-AS-PEG-ligando fluorescente añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca fluorescente en el péptido se cuantifica usando un detector de fluorescencia en línea. Después de 2 días, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras de G-CSF nativo y PEGilado se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de G-CSF-(alfa2,8)-Sialil-PEG. G-CSF producido en células CHO, que contienen un glicano unido a O alfa2,3-sialilado, se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-PEG 1 mM y 0,1 U/ml de CST-II a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-PEG, una pequeña alícuota de la reacción presenta CMP-AS-PEG-ligando fluorescente añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca fluorescente en el péptido se cuantifica usando un detector de fluorescencia en línea. Después de 2 días, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras de G-CSF nativo y PEGilado se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de G-CSF-(alfa2,6)-Sialil-PEG. G-CSF, que contiene solamente GalNAc unida a O, se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-PEG 1 mM y 0,1 U/ml de ST6GalNAcI o II a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-PEG, una pequeña alícuota de la reacción presenta CMP-AS-PEG-ligando fluorescente añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca fluorescente en el péptido se cuantifica usando un detector de fluorescencia en línea. Después de 2 días, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando Análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. La muestras de G-CSF nativo y PEGilado se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
22.
GlicoPEGilación Glicanos de EPO unidos a O producidos en Células CHO
Preparación de EPO-AS-PEG unido a O (10 KDa). Asialo-EPO, producida originalmente en células CHO, se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-AS 5 mM y 0,1 U/ml de ST3Ga13 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico en los glicanos unidos a N, una pequeña alícuota de la reacción presentaba CMP-AS-14C añadido; el péptido se separa por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G2000SW usando metanol, agua y el producto detectado usando un detector de radiación. Cuando la reacción es completa, la solución se concentra usando un filtro Centricon-20. Se intercambia el tampón en la solución restante con Tris 0,05 M (pH 7,2), NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05% hasta un volumen final de 7,2 ml hasta que el CMP-AS ya no se puede detectar. El retenido después se vuelve a suspender en Tris 0,05 M (pH 7,2), NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05% a 2,5 mg/ml de proteína. La solución se incuba con CMP-AS-PEG 1 mM (10 KDa) y ST3Gal1, para glicosilar el sitio unido a O, a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-PEG, una pequeña alícuota de la reacción se separa por filtración en gel usando una columna analítica Toso Haas TSK-gel-3000 eluyendo con PBS a pH 7,0 y analizando por detección de UV. Cuando la reacción se completa, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas TSK-gel3000 usando tampón de PBS (pH 7,0) recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
23.
GlicoPEGilación de un anticuerpo
Este ejemplo expone los procedimientos para PEGilar los glicanos unidos a O de una molécula de anticuerpo. Aquí, se usa Enbrel™ como un ejemplo, sin embargo un experto en la materia observará que este procedimiento se puede usar con muchas moléculas de anticuerpos.
Preparación de Enbrel™-AS-PEG (10 KDa). Enbrel™ (TNF-receptor-IgG1-quimera), con los glicanos unidos a O sialilados antes de la PEGilación o no, se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, MnCl2 5 mM, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con UDP-galactosa 5 mM y 0,1 U/ml de galactosiltransferasa a 32 ºC durante 2 días para proteger los glicanos de la región Fc con galactosa. Para controlar la incorporación de galactosa, una pequeña alícuota de la reacción presenta ligando de 14C-galactosa-UDP añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G2000SW en metanol y agua. La incorporación de la marca radiactiva en el péptido se cuantifica usando un detector de radiación en línea.
Cuando la reacción se completa, la solución se incuba con CMP-ácido siálico-engarce-PEG 1 mM (10 KDa) y 0,1 U/ml de ST3Ga13 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-engarce-PEG, el péptido se separa por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). Cuando la reacción está completa, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas TSK-Gel-3000 usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. Las fracciones que contienen el producto se combinan, se concentran, se intercambia el tampón y después se liofilizan. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
24. GlicoPEGilación de anticuerpo Remicade™
Este ejemplo expone el procedimiento para glicoPEGilar una molécula de anticuerpo recombinante mediante la introducción de moléculas de PEG a los glicanos de la región Fc. Aquí, Remicade™, una proteína de fusión de la región Fc con TNF-R:IgG, es el péptido ejemplar.
Preparación de Remicade™-Gal-PEG (10 KDa). Remicade™ se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, MnCl2 5 mM, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con UDP-galactosa-PEG 1 mM (10 KDa) y 0,1 U/ml de galactosiltransferasa a 32 ºC durante 2 días para introducir el PEG en los glicanos de la región Fc. Para controlar la incorporación de galactosa, una pequeña alícuota de la reacción presenta ligando 14C-galactosa-UDP añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca radiactiva en el péptido se cuantifica usando un detector de radiación en línea.
Cuando la reacción es completa, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas TSKGel-3000 usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. Las fracciones que contienen el producto se combinan, se concentran, se intercambia el tampón y después se liofilizan. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
25. Generación y PEGilación de estructuras de GlcNAc-ASN: TPA producido en Levaduras
Este ejemplo expone la preparación de estructuras de GlcNAc-Asn PEGilada en un péptido tal como TPA expresado en levaduras.
Se espera que la expresión en levaduras de como resultado un TPA que contiene una única estructura de tipo manano unida a N. Esta glicoproteína recombinante se trata primero con endoglicosidasa H para generar estructuras de GlcNAc en los restos de asparagina (Asn) en el péptido.
Las estructuras de GlcNAc-Asn en la cadena principal de péptido/proteína se modifican después con galactosa o galactosa-PEG usando UDP-galactosa o UDP-galactosa-6-PEG, respectivamente, y una galactosiltransferasa tal como GalT1. En un caso, la galactosa-PEG es el resto terminal. En el segundo caso, la galactosa se modifica adicionalmente con AS-PEG usando un donador de CMP-AS-PEG y una sialiltransferasa tal como ST3Ga1III. En otra realización, las estructuras de GlcNAc-Asn en la cadena principal de péptido/proteína pueden estar galactosiladas y sialiladas como se ha descrito anteriormente, y después sialiladas adicionalmente usando CMP-AS-PEG y una α2,8-sialiltransferasa, tal como la enzima codificada por el gen cst-II de Campylobacter jejuni.
26. Generación y PEGilación de Estructuras de GlcNAc-ASN: GM-CSF producidas en Saccharomyces
Este ejemplo expone la preparación de Activador del tipo Tejido con estructuras PEGiladas de GlcNAc-Asn.
Se espera que GM-CSF recombinante expresado en levaduras contenga 2 glicanos unidos a N y 2 glicanos unidos a
O. Los glicanos unidos a N deberían ser del tipo manano ramificado. Esta glicoproteína recombinante se trata con una endoglicosidasa a partir del grupo que consiste en endoglicosidasa H, endoglicosidasa-F1, endoglicosidasa-F2, endoglicosidasa-F3, endoglicosidasa-M solas o en combinación con las manosidasas I, II y III para generar núcleos de GlcNAc en los restos de asparagina (Asn) en la cadena principal de péptido/proteína.
Las estructuras de GlcNAc-Asn en la cadena principal de péptido/proteína se modifican después con galactosa o galactosa-PEG usando UDP-galactosa o UDP-galactosa-6-PEG, respectivamente, y una galactosiltransferasa tal como GalT1. En un caso, la galactosa-PEG es el resto terminal. En el segundo caso, la galactosa se modifica adicionalmente con AS-PEG usando un donador de CMP-AS-PEG y una sialiltransferasa tal como ST3GalIII. En otra realización las estructuras de GlcNAc-Asn en la cadena principal de péptido/proteína pueden estar galactosiladas y sialiladas como se ha descrito anteriormente, y después sialiladas adicionalmente usando CMP-AS-PEG y una α2,8sialiltranferasa tal como la enzima codificada por el gen cst-II de Campylobacter jejuni.
C. Glico-Conjugación de Moléculas Pequeñas
27. Síntesis de CMP-AS-Levulinato
Este ejemplo expone el procedimiento para la síntesis de CMP-AS-levulinato.
Preparación de 2-levulinamido-2-desoxi-D-manopiranosa. Cloroformiato de isobutilo (100 μl, 0,77 mmol) se añadió gota a gota a una solución de ácido levulínico (86 μl, 0,84 mmol), THF anhidro (3 ml) y trietilamina (127 μl, 0,91 mmol). Esta solución se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente y se añadió después gota a gota a una solución que contenía hidrocloruro de D-manosamina (151 mg, 0,7 mmol), trietilamina (127 μl, 0,91 mmol), THF (2 ml) y agua (2 ml). La mezcla de reacción se agitó 15 horas y después se concentró a sequedad por evaporación rotatoria. Se usó cromatografía (sílice, gradiente de la etapa de MeOH/CH2Cl2 al 5-15%) para aislar el producto produciendo 0,156 g (rendimiento de un 73%) de un sólido de color blanco: Rf = 0,41 (sílice, CHCl3/MeOH/agua a 6/4/1); RMN 1H (D2O, 500 MHz) δ 2,23 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,57 (td, J = 6,54, 3,68, 2H), 2,63 (t, J = 6,71, 2H), 2,862,90 (m, 4H), 3,42 (m, 1H), 3,53 (t, J = 9,76, 1H), 3,64 (t, J = 9,43, 1H), 3,80-3,91 (m, 4H), 4,04 (dd, J = 9,79, 4,71, 1H), 4,31 (dd, J = 4,63,1,14, 1H), 4,45 (dd, J = 4,16,1,13, 1H), 5,02 (d, J = 1,29, 1H), 5,11 (s, J = 1,30, 1H), MS (ES); calculado para C11H19NO7, 277,27; encontrado [M+1] 277,9.
Preparación de 5-levulinamido-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato. Se añadieron piruvato sódico (0,616 g, 5,6 mmol) y ácido N-acetilneuramínico aldolasa (50 U) a una solución de 2-levulinamido-2-desoxi-Dmanopiranosa (0,156 g, 0,56 mmol) en HEPES 0,1 M (pH 7,5). La mezcla de reacción se calentó a 37 ºC durante 20 horas y después se congeló. La mezcla de reacción se filtró después a través de sílice C 18, se congeló y se liofilizó. El sólido en bruto se purificó usando cromatografía ultrarrápida (sílice, usando primero MeOH/CH2Cl2 al 10-40% y después CH2Cl2/Me-OH/H2O a 6/4/0,5). Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron produciendo 45 mg (rendimiento de un 80%) de un sólido de color blanco: Rf = 0,15 (sílice, CHCl3/MeOH/agua a 6/4/1); RMN 1H (D2O, 500 MHz) δ 1,82 (t, J = 11,9, 1H), 2,21 (dd, J = 13,76, 4,84, 1H), 2,23 (s, 3H), 2,57 (c aparente, J = 6,6, 2H), 2,86-2,95 (m, 2H), 3,15-3,18 (m, 1H), 3,28-3,61 (complejo, 1H), 3,60 (dd, J = 11,91, 6,66, 1H), 3,75 (td, J = 6,65, 2,62, 1H), 3,84 (dd, J = 11,89, 2,65, 1H), 3,88-4,01 (complejo, 2H), 4,04 (td, J = 11,18,4,67, 1H), MS (ES); calculado para C14H23NO10, 365,33; encontrado ([M-1]-), 363,97.
Preparación de citidina-5’-monofosforil-(5-levulinamido-3,5-didesoxi-β-D-glicero-D-galacto-2nonulopiranosuronato). Se disolvió 5-Levulinamido-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galacto-2-nonulopiranosuronato (50 mg, 137 μmol) en 2 ml de tampón HEPES 100 mM a pH 7,5 y se añadió MnCl2 1 M (300 μl, 300 μmol). Se disolvió CTP-2Na+ (79 mg, 1,5 μmol) en 5 ml de tampón HEPES y se añadió al azúcar. Se añadió la enzima de fusión de sialiltransferasa/CMP-ácido neuramínico sintetasa (11 U) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 45 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de un filtro MWCO 10.000 y el filtrado, que contenía el producto de la reacción, se usó directamente sin purificación adicional: Rf = 0,35 (sílice, IPA/agua/NH4OH a 7/2/1).
28. Glucocerebrosidasa-manosa-6-fosfato producida en células CHO
Este ejemplo expone el procedimiento para glicoconjugar manosa-6-fosfato a un péptido producido en células CHO tal como glucocerebrosidasa.
Preparación de asialo-glucoceramidasa. La glucocerebrosidasa producida en células CHO se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris 50 mM, Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, y se incuba con 300 mU/ml de conjugado de sialidasaagarosa durante 16 horas a 32 ºC. Para controlar la reacción, una pequeña alícuota de la reacción se diluye con el tampón apropiado y un gel para IEF y se realiza SDS-PAGE de acuerdo con los procedimientos de Invitrogen. La mezcla se centrifuga a 10.000 rpm y el sobrenadante se recoge. Las perlas se lavan 3 veces con tampón Tris-EDTA, una vez con 0,4 ml de tampón Tris-EDTA, y una vez con 0,2 ml del tampón Tris-EDTA. Todos los sobrenadantes se combinan. El sobrenadante se dializa a 4 ºC frente a Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05% y después dos veces más frente a Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05%. La solución dializada después se concentra usando un filtro centrífugo Centricon Plus 20. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de Glucocerebrosidasa-AS-engarce-Manosa-6-fosfato (procedimiento 1). Asialoglucocerebrosidasa a partir de lo mencionado anteriormente se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-engarce-Man-6-fosfato 1 mM y 0,1 U/ml de ST3Ga13 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-engarce-Man-6-fosfato, una pequeña alícuota de la reacción presentaba CMP-SA-PEG-ligando fluorescente añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de una marca libre mediante filtración en gel en una columna analítica Toso Haas TSKGel-3000 usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca fluorescente en el péptido se cuantifica usando un detector de fluorescencia en línea. Cuando la reacción es completa, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas TSK-Gel-3000 usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de Glucocerebrosidasa-SA-engarce-Manosa-6-fosfato (procedimiento 2). Glucocerebrosidasa, producida en CHO pero sialilada de forma incompleta, se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-engarce-Man-6-fosfato 1 mM y 0,1 U/ml de ST3Ga13 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-engarce-Man-6-fosfato, una pequeña alícuota de la reacción presentaba CMP-SA-PEG-ligando fluorescente añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de una marca libre mediante filtración en gel en una columna analítica Toso Haas TSKGel-3000 usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca fluorescente en el péptido se cuantifica usando un detector de fluorescencia en línea. Cuando la reacción es completa, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas TSK-Gel-3000 usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
29. Glicoconjugación de mitramicina a un anticuerpo
Este ejemplo expone los procedimientos para glicoconjugar una molécula pequeña, tal como mitramicina a glicanos de la región Fc de una molécula de anticuerpo producida en células de mamífero. Aquí, se usa el anticuerpo Herceptin™, pero un experto en la materia observará que el procedimiento se puede usar con otros muchos anticuerpos.
Preparación de Herceptin™-Gal-engarce-mitramicina. Herceptin™ se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, 5 mM MnCl2, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con UDP-galactosa-engarce-mitramicina 1 mM y 0,1 U/ml de galactosiltransferasa a 32 ºC durante 2 días para introducir la mitramicina en los glicanos de la región Fc. Para controlar la incorporación de galactosa, una pequeña alícuota de la reacción presenta ligando de14C-galactosa-UDP añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca radiactiva en el péptido se cuantifica usando un detector de radiación en línea.
Cuando la reacción es completa, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas TSKGel-3000 usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. Las fracciones que contienen el producto se combinan, se concentran, se intercambia el tampón y después se liofilizan. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
30. Glicoconjugación de geldanamicina a un anticuerpo
Este ejemplo expone la glicoconjugación de una molécula pequeña, tal como geldanamicina, a los glicanos de la región Fc de un anticuerpo producido en células CHO, tal como Rituxan™. Aquí, se usa el anticuerpo Rituxan™, pero un experto en la materia observará que el procedimiento se puede usar con otros muchos anticuerpos.
Preparación de Rituxan™-Gal-engarce-geldanamicina. Rituxan™ se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, MnCl2 5 mM, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con UDP-galactosa-engarce-geldanamicina 1 mM y 0,1 U/ml de galactosiltransferasa a 32 ºC durante 2 días para introducir la geldanamicina en los glicanos de la región Fc. Para controlar la incorporación de galactosa, una pequeña alícuota de la reacción presenta ligando 14Cgalactosa-UDP añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca radiactiva en el péptido se cuantifica usando un detector de radiación en línea.
Cuando la reacción es completa, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas TSKGel-3000 usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. Las fracciones que contienen el producto se combinan, se concentran, se intercambia el tampón y después se liofilizan. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
D. Glicoconjugación de péptidos
31. Transferrina-GDNF
Este ejemplo expone los procedimientos para la glicoconjugación de proteínas, y en particular, la transferrina se glicoconjuga a GDNF. Transferrina-AS-Engarce-Gal-UDP se prepara a partir de transferrina. El resto de galactosa se retira a partir de glicanos de GNDF, y Transferrina-AS-Engarce-Gal-UDP se conjuga a glicanos de GNDF usando una galactosil-transferasa.
Preparación de agalacto-GDNF. GDNF producido en células NSO (células de mieloma murino NSO) se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris 50 mM, Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, y se incuba con 300 mU/ml de conjugado de betagalactosidasa-agarosa durante 16 horas a 32 ºC. Para controlar la reacción una pequeña alícuota de la reacción se diluye con el tampón apropiado y se realiza un gel para IEF de acuerdo con los procedimientos de Invitrogen. La mezcla se centrifuga a 10.000 rpm y el sobrenadante se recoge. El sobrenadante se dializa a 4 ºC frente a Tris -HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05% y después dos veces más frente a Tris -HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05%. La solución dializada después se concentra usando un filtro centrífugo Centricon Plus 20 y se almacena a -20 ºC. las condiciones para el gel para IEF se desarrollan de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de Transferrina-AS-Engarce-Gal-UDP. Asialo-transferrina se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-engarce-Gal-UDP (cantidad molar para añadir 1 equivalente molar de azúcar de nucleótido a transferrina) y 0,1 U/ml de ST3Ga13 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico, una pequeña alícuota de la reacción presenta ligando de 14C-AS-UDP añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca radiactiva en el péptido se cuantifica usando un detector de radiación en línea.
La solución se incuba con CMP-ácido siálico 5 mM y 0,1 U/ml de ST3Ga13 (para proteger cualquier glicano de transferrina sin reaccionar) a 32 ºC durante 2 días. La incorporación en el péptido se cuantifica usando un detector de UV en línea. Después de 2 días, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de Transferrina-AS-Engarce-Gal-GDNF. La transferrina-AS-Engarce-Gal-UDP preparada como se ha descrito anteriormente se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, MnCl2 5 mM, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con 2,5 mg/ml de agalacto-GDNF y 0,1 U/ml de galactosiltransferasa a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de galactosa, una pequeña alícuota de la reacción presenta ligando de 14Cgalactosa-UDP añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). La incorporación de la marca radiactiva en el péptido se cuantifica usando un detector de radiación en línea.
Cuando la reacción es completa, la solución se incuba con UDP-Gal 5 mM y 0,1 U/ml de galactosiltransferasa (para proteger cualquier glicano de transferrina sin reaccionar) a 32 ºC durante 2 días seguido de la adición de CMP-AS 5 mM y 0,1 U/ml de ST3Ga13. Después de 2 días adicionales, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
32. Glucocerebrosidasa-transferrina
Este ejemplo expone los procedimientos para la glicoconjugación de proteínas, y en particular, la transferrina se glicoconjuga a glucocerebrosidasa. Las estructuras de GlcNAc-ASN se crean en glucoceraminidasa, y Transferrina-AS-Engarce-Gal-UDP se conjuga a estructuras de GlcNAc-ASN de GNDF usando galactosiltransferasa.
Preparación de GlcNAc-glucocerebrosidasa (Cerezyme™). Cerezyme™ (glucocerebrosidasa) producida en células CHO se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris 50 mM, Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, y se incuba con 300 mU/ml de conjugado de Endo-H-agarosa durante 16 horas a 32 ºC. Para controlar la reacción, una pequeña alícuota de la reacción se diluye con el tampón apropiado y un gel para IEF y se realiza SDS-PAGE de acuerdo con los procedimientos de Invitrogen. La mezcla se centrifuga a 10.000 rpm y el sobrenadante se recoge. Las perlas se lavan 3 veces con tampón Tris-EDTA, una vez con 0,4 ml de tampón Tris-EDTA y una vez con 0,2 ml del tampón Tris -EDTA y todos los sobrenadantes se combinan. El sobrenadante se dializa a 4 ºC frente a Tris -HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05% y después dos veces más frente a Tris -HCl 50 mM al pH 7,4, NaCl 1 M, NaN3 al 0,05%. La solución dializada se concentra después usando a filtro centrífugo Centricon Plus 20. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de Transferrina-AS-Engarce-Gal-glucocerebrosidasa. Transferrina-AS-Engarce-Gal-UDP a partir de lo mencionado anteriormente se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, MnCl2 5 mM, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con 2,5 mg/ml de GlcNAc-glucocerebrosidasa y 0,1 U/ml de galactosiltransferasa a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de glucocerebrosidasa, el péptido se separa por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y el producto se detecta por absorción de UV. La mezcla de reacción después se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) recogiendo fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
33. EPO-Transferrina
Este ejemplo expone los procedimientos para la glicoconjugación de proteínas a glicanos unidos a O, y en particular, la transferrina se glicoconjuga a EPO. El resto de ácido siálico se retira a partir de glicano de EPO unido a O, y se prepara EPO-AS-engarce-AS-CMP. EPO-AS-engarce-AS-CMP se glicoconjuga a asialotransferrina con ST3Ga13.
Preparación de asialo-EPO unida a O. EPO (eritropoyetina) producida en células CHO se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris 50 mM, Tris-HCl 50 mM a pH 7,4, NaCl 0,15 M, y se incuba con 300 mU/ml de conjugado de sialidasa (Vibrio cholera)-agarosa durante 16 horas a 32 ºC. Para controlar la reacción una pequeña alícuota de la reacción se diluye con el tampón apropiado y un gel para IEF desarrollado de acuerdo con los procedimientos de Invitrogen. La mezcla se centrifuga a 10.000 rpm y el sobrenadante se recoge. El sobrenadante se concentra a una concentración de EPO de aproximadamente 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico 5 mM y 0,1 U/ml de ST3Ga13 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico, una pequeña alícuota de la reacción presentaba CMP-AS-ligando fluorescente añadido; la marca incorporada en el péptido se separa a partir de la marca libre por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1). Cuando la reacción es completa, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS
Preparación de EPO-AS-engarce-AS-CMP. Los 2,5 mg/ml de asialo-EPO unida a O en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con CMP-ácido siálico-engarce-AS-CMP 1 mM y 0,1 U/ml de ST3Gal1 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de ácido siálico-engarce-AS-CMP, el péptido se separa por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1).
Después de 2 días, la mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
Preparación de Transferrina-AS-Engarce-AS-EPO. EPO-AS-Engarce-AS-CMP a partir de lo mencionado anteriormente se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con 2,5 mg/ml de asialo-transferrina y 0,1 U/ml de ST3Ga13 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de transferrina, el péptido se separa por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y el producto se detecta por absorción de UV. Cuando la reacción es completa, la solución se incuba con CMP-AS 5 mM y 0,1 U/ml de ST3Ga13 (para proteger cualquier glicano de transferrina sin reaccionar) a 32 ºC durante 2 días. La mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
34. EPO-GDNF
Este ejemplo expone los procedimentos para la glicoconjugación de proteínas, y en particular, la preparación de EPO-AS-Engarce-AS-GDNF.
Preparación de EPO-AS-Engarce-AS-GDNF. EPO-AS-Engarce-AS-CMP a partir de lo mencionado anteriormente se disuelve a 2,5 mg/ml en Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15 M, NaN3 al 0,05%, pH 7,2. La solución se incuba con 2,5 mg/ml de GDNF (producida en NSO) y 0,1 U/ml de ST3Gal3 a 32 ºC durante 2 días. Para controlar la incorporación de GDNF, el péptido se separa por filtración en gel en una columna analítica Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) y el producto se detecta por absorción de UV. Cuando la reacción es completa, la solución se incuba con CMP-AS 5 mM y 0,1 U/ml de ST3Ga13 (para proteger cualquier glicano de GDNF sin reaccionar) a 32 ºC durante 2 días. La mezcla de reacción se purifica usando una columna preparativa Toso Haas G3000SW usando tampón de PBS (pH 7,1) recogiendo las fracciones en base a la absorción de UV. El producto de la reacción se analiza usando análisis por SDS-PAGE y IEF de acuerdo con los procedimientos y los reactivos proporcionados por Invitrogen. Las muestras se dializan frente a agua y se analizan por MALDI-TOF MS.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Neose Technologies, Inc. DeFrees, Shawn Zopf, David Bayer, Robert Bowe, Caryn Hakes, David Chen, Xi
<120> REMODELACIÓN Y GLICOCONJUGACIÓN DE PÉPTIDOS
<130> 0408WO
<150> US 60/328.523
<151>
<150> US 60/344.692
<151>
<150> US 60/334.233
<151>
<150> US 60/334,301
<151>
<150> US 60/387,292
<151> 2002-06-07
<150> US 60/391.777
<151>
<150> US 60/396.594
<151>
<150> US 60/404.249
<151>
<150> US 60/407.527
<151> 28-8-2002 5
<160> 62
<170> PatentIn versión 3.1
<210> 1 10 <211> 525
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 174
<212> PRT 20 <213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 1733
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
5 <210> 5
<211> 757
<212> ADN
<213> Homo sapiens
10 <400> 5
<210> 6
<211> 187
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6 <210> 7
<211> 1332
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 7 <210> 8
<211> 444
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 1437
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 9 <210> 10
<211> 462
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 603
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 11 <210> 12
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 390
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14 10 <211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14 15
<210> 15
<211> 1342
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15
<400> 16
<210> 17
<211> 435
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 17 <210> 18
<211> 144
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 501
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 19
<210> 20
<211> 166
<212>
PRT 10 <213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 1352
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 418
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 2004
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
<211> 536
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 1726
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 562
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
<210> 27
<211> 825
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 27
<210> 28
<211> 156
<212>
PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 28
<210> 29
<211> 7931
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 2351
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 1471
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 31
<210> 32
<211> 461
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
<210> 33
<211> 1475
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 431
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 35
<210> 36
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 36
<210> 37
<211> 120
<212>
PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 37
<210> 38
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 38
<210> 39
<211> 1039
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 39
<210> 40
<211> 282
<212>
PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 678
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 41
<210> 42
<211> 226
<212>
PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 42
<210> 43
<211> 450
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44 5 <211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44 10
<210> 45
<211> 1203
<212> ADN
<213> Hepatitis B virus
<400> 45
<210> 46
<211> 400
<212> PRT
<213> virus de la Hepatitis B
<400> 46
<210> 47
<211> 799
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 47 <210> 48
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48 <210> 49
<211> 963
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 49 <210> 50
<211> 320
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50 <210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51 <210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 52
<210> 53
<211> 119
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 53
<210> 54
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 54 <210> 55
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55 <210> 56
<211> 448
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
<210> 57
<211> 8540
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 57
<210> 58
<211> 9209
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 58
<210> 59
<211> 384
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 59
10 <210> 60
<211> 128
<212> PRT
<213> Mus musculus
15 <400> 60
<210> 61
<211> 420
<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 61
10 <210> 62
<211> 140
<212> PRT
<213> Mus musculus
15 <400> 62

Claims (48)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento in vitro, sin células para formar un conjugado covalente entre un poli(etilenglicol) y un péptido glicosilado o sin glicosilar, en el que dicho poli(etilenglicol) está conjugado a dicho péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y, unido covalentemente, tanto a dicho péptido como a dicho
    5 poli(etilenglicol), dicho procedimiento comprende:
    poner en contacto dicho péptido con una mezcla que comprende al menos un azúcar de nucleótido unido covalentemente a dicho poli(etilenglicol) y al menos una glicosiltransferasa para la cual dicho azúcar de nucleótido es un sustrato en condiciones adecuadas para que dicha al menos una glicosiltransferasa transfiera dicho al menos un azúcar de nucleótido unido covalentemente a dicho poli(etilenglicol) a dicho péptido,
    10 formando de dicha forma dicho conjugado covalente de dicho péptido.
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho grupo de enlace de glicosilo intacto es un resto de ácido siálico.
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
    15 en la que AA es un resto de aminoácido terminal o interno de dicho péptido.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
    y en la que
    20 AA es un resto de aminoácido terminal o interno de dicho péptido; X1 es un resto de glicosilo unido covalentemente a dicho AA, seleccionado entre restos de monosacarilo y oligosacarilo; y u es un número entero seleccionado entre 0 y 1.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
    en la que AA es un resto de aminoácido terminal o interno de dicho péptido; X1-X2 es un sacárido unido covalentemente a dicho AA, en el que X1 es un primer resto de glicosilo; y
    30 X2 es un segundo resto de glicosilo unido covalentemente a X1, en el que X1 yX2 están seleccionados entre restos de monosacarilo y oligosacarilo; y en el que antes dicha puesta en contacto, dicho procedimiento comprende la etapa de retirar X2 o una subunidad de sacarilo del mismo de dicho péptido.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente, antes de dicha puesta en contacto, retirar 35 un grupo añadido al sacárido de dicho péptido glicosilado durante la modificación post-translacional.
  7. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho grupo es un miembro seleccionado entre fosfato, sulfato, carboxilato y ésteres del mismo.
  8. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicha retirada usa una glicosidasa.
  9. 9.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
    en la que Z es un miembro seleccionado entre O, S, NH, y un agente de reticulación.
  10. 10. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
    en la que X9 y X10 están seleccionados independientemente entre restos de monosacarilo y oligosacarilo; y m, n y f son números enteros seleccionados entre 0 y 1.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
    en la que X11 y X12 son restos de glicosilo seleccionados independientemente; y 10 r y x son números enteros seleccionados independientemente entre 0 y 1.
  12. 12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que X11 yX12 son (manosa)q, en la que q está seleccionado entre los números enteros 1 a 20, y cuando q es tres o mayor, (manosa)q está seleccionada entre estructuras lineales y ramificadas.
    15 13. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
    en la que
    X13, X14, y X15 son restos de glicosilo seleccionados independientemente; y
    g, h, i, j, k, y p están seleccionados independientemente entre los números enteros 0 y 1, con la condición de que al 20 menos uno de g, h, i, j, k y p sea 1.
  13. 14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que X14 y X15 son miembros seleccionados independientemente entre GlcNAc y Sia; e i y k están seleccionados independientemente entre los números enteros 0 y 1, con la condición de que al menos uno de i y k sea 1, y si k es 1, g, h, y j sean 0.
  14. 15. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
    en la que X16 es un miembro seleccionado entre:
    en los que s, u e i están seleccionados independientemente entre los números enteros 0 y 1.
  15. 16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
    10 en la que r, s, y t son números enteros seleccionados independientemente entre 0 y 1.
  16. 17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho péptido tiene la fórmula:
    en la que
    15 X3, X4, X5, X6, X7, y X17 están seleccionados independientemente entre restos de monosacarilo y oligosacarilo; a, b, c, d, e y x están seleccionados independientemente entre los números enteros 0, 1 y 2, con la condición de que al menos un miembro seleccionado entre a, b, c, d, e y x sea 1 o 2, y en el que antes de dicha puesta en contacto, dicho procedimiento comprende adicionalmente la retirada de al menos uno de X3, X4, X5, X6, X7, y X17 o una subunidad de sacarilo de los mismos de dicho péptido.
  17. 18.
    El procedimiento de la reivindicación 17, en el que después de dicha retirada, a, b, c, e y x son cada uno 0.
  18. 19.
    El procedimiento de la reivindicación 17, en el que X3, X5, y X7, están seleccionados entre el grupo que consiste en (manosa), y (manosa)z-(X8)y en el que X8 es un resto de glicosilo seleccionado entre mono-y oligo-sacáridos; y es un número entero seleccionado entre 0 y 1; y z es un número entero entre 1 y 20, en el que cuando z es 3 o mayor, (manosa)z está seleccionada entre estructuras lineales y ramificadas.
  19. 20.
    El procedimiento de la reivindicación 17, en el que X4 está seleccionado entre el grupo que consiste en GlcNAc y xilosa.
  20. 21.
    El procedimiento de la reivindicación 17, en el que X3, X5, y X7 son (manosa)u, en el que u está seleccionado entre los números enteros 1 a 20, y cuando u es 3 o mayor, (manosa)u está seleccionada entre estructuras lineales y ramificadas.
  21. 22.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho grupo de enlace de glicosilo está unido covalentemente al resto de glicosilo unido covalentemente a dicho péptido.
  22. 23.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho grupo de enlace de glicosilo está unido covalentemente a un resto de aminoácido de dicho péptido.
  23. 24.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha glicosiltransferasa está seleccionada entre el grupo que consiste en sialitransferasa, galactosiltransferasa, glucosiltransferasa, GalNAc transferasa, GlcNAc transferasa, fucosiltransferasa, y manosiltransferasa.
  24. 25.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha glicosiltransferasa es producida recombinantemente.
  25. 26.
    El procedimiento de la reivindicación 25, en el que dicha glicosiltransferasa es una enzima procariótica recombinante.
  26. 27.
    El procedimiento de la reivindicación 25, en el que dicha glicosiltransferasa es una enzima eucariótica recombinante.
  27. 28.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho péptido es un agente terapéutico.
  28. 29.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho conjugado covalente está aislado.
  29. 30.
    El procedimiento de la reivindicación 29, en el que dicho conjugado covalente se aísla mediante filtración de membrana.
  30. 31.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho poli(etilenglicol) tiene un grado de polimerización de 1 a 20.000.
  31. 32.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho poli(etilenglicol) es una estructura ramificada.
  32. 33.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho poli(etilenglicol) tiene una masa de 1 kDa a 10 kDa.
  33. 34.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en el que dicho poli(etilenglicol) tiene un grado de polimerización de 1 a 20.000, y adicionalmente en el que dicho poli(etilenglicol) es una estructura lineal.
  34. 35.
    El procedimiento de la reivindicación 34, en el que dicho poli(etilenglicol) tiene un grado de polimerización de 1 a
  35. 5.000.
  36. 36. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que dicho poli(etilenglicol) tiene un grado de polimerización de 1 a
    1.000.
  37. 37.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en el que dicho poli(etilenglicol) tiene un peso molecular que es básicamente homodisperso.
  38. 38.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho poli(etilenglicol) es un miembro seleccionado entre poli(etilenglicol) lineal y poli(etilenglicol) ramificado.
  39. 39.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho poli(etilenglicol) es metoxipoli(etilenglicol).
  40. 40.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicha glicosiltransferasa es una oligosacariltransferasa.
  41. 41.
    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, en el que dicha glicosiltransferasa está seleccionada entre el grupo que consiste en ST3Gal3, ST3Gal1, ST6GalNAcI, y una sialiltransferasa aislada de Camphylobacter jejuni.
  42. 42.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que, después de dicha formación de dicho conjugado covalente, dicho péptido es puesto en contacto con un donador de ácido siálico y una sialiltransferasa en condiciones adecuadas para que dicha sialiltransferasa transfiera un resto de ácido siálico en dicho péptido, transfiriendo de dicha forma un resto de ácido siálico sobre dicho péptido.
  43. 43.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho péptido está seleccionado entre el grupo que consiste en factor de estimulación de la colonia de granulocitos, interferón-alfa, interferón-beta, Factor VIIa, Factor IX, hormona estimuladora de los folículos, eritropoyetina, factor de estimulación de la colonia de macrófagos y granulocitos, interferón-gamma, inhibidor de la alfa-1-proteasa, beta-glucosidasa, proteína activadora del plasminógeno tisular, interleuquina-2, Factor VIII, receptor quimérico del factor de necrosis tumoral, uroquinasa, anticuerpo quimérico anti-glicoproteína IIb/IIIa, anticuerpo quimérico anti-HER2, anticuerpo quimérico anti-virus sincitial respiratorio, anticuerpo quimérico anti-CD20, DNasa, anticuerpo quimérico del factor de necrosis antitumoral, insulina humana, sAg de la hepatitis B, hormona del crecimiento humano, BMP-2, factor del crecimiento de fibroblastos, y NT-3.
  44. 44.
    Un conjugado covalente de un péptido entre un poli(etilenglicol) y un péptido glicosilado o sin glicosilar obtenible mediante el procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho poli(etilenglicol) está conjugado a dicho péptido mediante un grupo de enlace de glicosilo intacto interpuesto entre y unido covalentemente tanto a dicho péptido como a dicho poli(etilenglicol), en el que dicho grupo de enlace de glicosilo intacto es un resto de glicosilo que no está oxidado.
  45. 45.
    Una composición farmacéutica que comprende el conjugado covalente de la reivindicación 44.
  46. 46.
    Conjugado covalente de la reivindicación 44 para su uso en un procedimiento para aumentar un factor de coagulación en un mamífero que padece hemofilia, en el que dicho péptido está seleccionado entre un péptido del Factor VIII y un péptido del Factor IX.
  47. 47.
    Conjugado covalente de la reivindicación 44 para su uso en un procedimiento para suministrar glóbulos rojos en un mamífero que padece anemia, en el que dicho péptido es un péptido de eritropoyetina.
  48. 48.
    Conjugado covalente de la reivindicación 44 para su uso en un procedimiento para interferir con la replicación viral en un mamífero que padece hepatitis, en el que dicho péptido es un péptido de interferón alfa.
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Families Citing this family (330)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5545553A (en) * 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
JP2003518075A (ja) 1999-12-24 2003-06-03 ジェネンテック・インコーポレーテッド 生理活性化合物の消失半減期延長のための方法及び組成物
EP2275557A1 (en) 2000-04-12 2011-01-19 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7625756B2 (en) 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US7863020B2 (en) 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7598055B2 (en) 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7723296B2 (en) 2001-01-18 2010-05-25 Genzyme Corporation Methods for introducing mannose-6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins and its application thereof
US7507413B2 (en) * 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2004017810A2 (en) 2002-08-20 2004-03-04 Biotie Therapies Corp. Tumor specific oligosaccharide epitopes and use thereof
US7112410B1 (en) 2001-08-29 2006-09-26 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor TR21 and methods based thereon
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7399613B2 (en) * 2001-10-10 2008-07-15 Neose Technologies, Inc. Sialic acid nucleotide sugars
ES2411007T3 (es) 2001-10-10 2013-07-04 Novo Nordisk A/S Remodelación y glicoconjugación de péptidos
US7439043B2 (en) * 2001-10-10 2008-10-21 Neose Technologies, Inc. Galactosyl nucleotide sugars
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
EP1440157B1 (en) 2001-10-29 2012-01-25 Crucell Holland B.V. Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications
US7473680B2 (en) * 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
EP2990417A1 (en) * 2001-12-21 2016-03-02 Human Genome Sciences, Inc. Albumin insulin fusion protein
EP2399586A1 (en) 2002-01-11 2011-12-28 Jefferies, Dr., Wilfred Use of P97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
US7598354B2 (en) * 2002-08-01 2009-10-06 National Research Council Of Canada Campylobacter glycans and glycopeptides
US7611700B2 (en) * 2002-09-09 2009-11-03 Hanall Pharmaceuticals, Co., Ltd. Protease resistant modified interferon alpha polypeptides
ATE409048T1 (de) 2002-10-08 2008-10-15 Fresenius Kabi De Gmbh Pharmazeutisch aktive oligosaccharid-conjugate
SG160203A1 (en) 2002-10-16 2010-04-29 Scripps Research Inst Glycoprotein synthesis
JP4699028B2 (ja) * 2002-11-08 2011-06-08 ザ ブライアム アンド ウィミンズ ホスピタル インコーポレーテッド 血小板の生存を延長するための組成物および方法
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
AU2004221824B2 (en) 2003-03-14 2009-08-27 Ratiopharm Gmbh Branched water-soluble polymers and their conjugates
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
WO2006127896A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
WO2004091499A2 (en) * 2003-04-09 2004-10-28 Neose Technologies, Inc. Intracellular formation of peptide conjugates
US20050008580A1 (en) * 2003-04-09 2005-01-13 Wyeth Hemophilia treatment by inhalation of coagulation factors
CA2522345A1 (en) * 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
ES2380093T3 (es) 2003-05-09 2012-05-08 Biogenerix Ag Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
US8338373B2 (en) * 2003-10-24 2012-12-25 Nora Therapeutics, Inc. Method for reducing the risk of spontaneous abortion in a human female subject
EP2441465B1 (en) * 2003-10-24 2014-01-15 Nora Therapeutics, Inc. Compositions and methods for healthy pregnancy
US20090226397A1 (en) 2003-10-24 2009-09-10 Nora Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing the likelihood of implantation failure or miscarriage in recipients of artificial insemination
US7507573B2 (en) 2003-11-14 2009-03-24 Vib, Vzw Modification of protein glycosylation in methylotrophic yeast
WO2005051429A2 (en) * 2003-11-19 2005-06-09 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Targeted conjugates with a modified saccharide linker
WO2005072371A2 (en) * 2004-01-26 2005-08-11 Neose Technologies, Inc. Branched polymeric sugars and nucleotides thereof
JP4719686B2 (ja) * 2003-11-24 2011-07-06 バイオジェネリックス アーゲー ＧｌｙｃｏＰＥＧ化エリスロポエチン
US20080305992A1 (en) * 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
CN1890257A (zh) 2003-12-01 2007-01-03 诺和诺德医疗保健公司 液体因子ⅶ组合物的病毒过滤
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
BRPI0417342A (pt) * 2003-12-03 2007-04-17 Neose Technologies Inc fator estimulante de colÈnia de granulócitos glicopeguilado
US20080318850A1 (en) * 2003-12-03 2008-12-25 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated Factor Ix
CA2549413A1 (en) * 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
KR20140093711A (ko) 2003-12-19 2014-07-28 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 인자 ｖｉｉ 폴리펩티드의 안정화된 조성물
BRPI0506741A (pt) 2004-01-08 2007-05-15 Neose Technologies Inc glicosilação de peptìdeos ligados a o
NZ548308A (en) * 2004-01-26 2010-11-26 Biogenerix Ag Branched polymeric sugars and nucleotides thereof
BRPI0507169A (pt) * 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
AU2005211725B2 (en) * 2004-02-09 2010-07-15 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AR048098A1 (es) * 2004-03-15 2006-03-29 Wyeth Corp Conjugados de caliqueamicina
EP1744786A2 (en) * 2004-03-23 2007-01-24 Amgen Inc. Chemically modified protein compositions and methods
MXPA06012676A (es) 2004-05-04 2007-04-02 Novo Nordisk Healthcare Ag Glucoformas o-enlazadas de polipeptidos y metodos de fabricacion de los mismos.
US20050287639A1 (en) 2004-05-17 2005-12-29 California Institute Of Technology Methods of incorporating amino acid analogs into proteins
KR101100059B1 (ko) * 2004-06-30 2011-12-29 넥타르 테라퓨틱스 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체
AU2014280936B2 (en) * 2004-06-30 2016-12-15 Nektar Therapeutics Polymer-factor ix moiety conjugates
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
US20090292110A1 (en) * 2004-07-23 2009-11-26 Defrees Shawn Enzymatic modification of glycopeptides
US20120225044A9 (en) * 2004-09-07 2012-09-06 Zymequest, Inc. Compositions and methods for prolonging survival of platelets
US8052667B2 (en) * 2004-09-07 2011-11-08 Velico Medical, Inc. Apparatus for prolonging survival of platelets
EP1799249A2 (en) * 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
KR20070073886A (ko) * 2004-10-05 2007-07-10 제넨테크, 인크. 독성이 감소된 치료제
AU2005295467B2 (en) * 2004-10-15 2011-07-07 Velico Medical, Inc. Compositions and methods for prolonging survival of platelets
US20080064059A1 (en) 2004-10-20 2008-03-13 Scripps Research Institute In Vivo Site-Specific Incorporation of N-Acetyl-Galactosamine Amino Acids in Eubacteria
EP3061461A1 (en) * 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2006066258A2 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Neose Technologies, Inc. Lipoconjugation of peptides
EP2360171A1 (en) 2004-12-23 2011-08-24 Novo Nordisk Health Care AG Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin K-dependent protein of interest
US20100009902A1 (en) * 2005-01-06 2010-01-14 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation Using Saccharyl Fragments
NZ556436A (en) * 2005-01-10 2010-11-26 Biogenerix Ag Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
JP2008527980A (ja) * 2005-01-25 2008-07-31 アポロ ライフ サイエンシズ リミテッド 分子およびそのキメラ分子
EP1861423A4 (en) * 2005-02-15 2010-01-27 Apollo Life Sciences Ltd MOLECULES AND CHIMESE MOLECULES THEREOF
KR20070110902A (ko) * 2005-03-11 2007-11-20 프레제니우스 카비 도이치란트 게엠베하 비활성 출발 물질로부터 생물활성 당단백질의 생산
KR20080021590A (ko) * 2005-03-24 2008-03-07 네오스 테크놀로지스, 인크. 가용성이고 활성인 진핵생물 글리코실트랜스퍼라제의원핵생물 유기체 내에서의 발현
JP2008538181A (ja) * 2005-03-30 2008-10-16 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 昆虫細胞系において増殖させたペプチドを生産するための製造方法
EP1876441B1 (en) * 2005-03-31 2010-10-06 The Noguchi Institute Analysis method for biological sample and screening method for disease marker
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
JP5628476B2 (ja) 2005-04-28 2014-11-19 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 抗体コンジュゲート
WO2006127910A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
US20110003744A1 (en) * 2005-05-25 2011-01-06 Novo Nordisk A/S Glycopegylated Erythropoietin Formulations
EP2360170A3 (en) 2005-06-17 2012-03-28 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprinsing at least one non-native cysteine
US7696318B2 (en) 2005-07-13 2010-04-13 Novo Nordisk Health Care Ag Host cell protein knock-out cells for production of therapeutic proteins
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
CN102719508A (zh) * 2005-08-19 2012-10-10 诺和诺德公司 糖基聚乙二醇化的因子vii和因子viia
AU2006283560B2 (en) * 2005-08-19 2011-12-08 Centocor, Inc. Proteolysis resistant antibody preparations
EP1924689B1 (en) 2005-09-01 2014-08-13 Novo Nordisk Health Care AG Hydrophobic interaction chromatography purification of factor vii polypeptides
JP5690047B2 (ja) 2005-09-14 2015-03-25 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー ヒト凝固第ｖｉｉ因子ポリペプチド
EP1937294A4 (en) * 2005-10-21 2009-11-04 Synageva Biopharma Corp GLYCOLIC AND GLYCOSYLATED THERAPEUTIC PROTEINS DERIVED FROM POULTRY
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US8247530B2 (en) * 2005-11-08 2012-08-21 Palatin Technologies, Inc. N-alkylated cyclic peptide melanocortin agonists
ES2804129T3 (es) * 2005-11-23 2021-02-03 Ventana Med Syst Inc Conjugado anticuerpo-enzima
EP1816201A1 (en) * 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
EP2623610B1 (en) † 2006-02-10 2015-04-29 Life Technologies Corporation Labeling and detection of post translationally modified proteins
CA2647632C (en) 2006-03-27 2017-06-27 University Of Maryland Biotechnology Institute Glycoprotein synthesis and remodeling by enzymatic transglycosylation
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
CA2647314A1 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
WO2007117685A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an anti-tnf-alpha antibody
JP2009534034A (ja) 2006-04-19 2009-09-24 ノヴォ ノルディスク アクティーゼルスカブ 原核微生物におけるｏ−グリコシル化治療用タンパク質の発現
AU2007248680C1 (en) 2006-05-02 2014-01-23 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
CA2654055A1 (en) 2006-06-07 2007-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2655246A1 (en) * 2006-06-09 2007-12-21 University Of Maryland, Baltimore Glycosylation engineered antibody therapy
AR078117A1 (es) 2006-06-20 2011-10-19 Protech Pharma S A Una muteina recombinante del interferon alfa humano glicosilado, un gen que codifica para dicha muteina, un metodo de produccion de dicho gen, un metodo para obtener una celula eucariota productora de dicha muteina, un metodo para producir dicha muteina, un procedimiento para purificar dicha muteina
US9187532B2 (en) 2006-07-21 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences
JP2009544680A (ja) * 2006-07-25 2009-12-17 リポクセン テクノロジーズ リミテッド ポリサッカライドによるタンパク質のｎ末端誘導体化
WO2008057683A2 (en) * 2006-10-03 2008-05-15 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
CN101600448B (zh) * 2006-10-04 2015-11-25 诺和诺德公司 甘油连接的peg化的糖和糖肽
WO2008073620A2 (en) * 2006-11-02 2008-06-19 Neose Technologies, Inc. Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines
CN101678079B (zh) 2006-11-28 2013-12-25 韩诺生物制约株式会社 修饰的促红细胞生成素多肽及其治疗用途
JP5876208B2 (ja) 2006-12-15 2016-03-02 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 延長されたｉｎｖｉｖｏ半減期を有する第ＶＩＩａ因子−（ポリ）シアル酸結合体
WO2008089339A2 (en) * 2007-01-18 2008-07-24 Genzyme Corporation Oligosaccharide conjugates for cellular targeting
IL243117B2 (en) 2007-01-18 2023-03-01 Genzyme Corp Oligosaccharides containing an amino group and their conjugates
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
ES2385114T3 (es) * 2007-03-30 2012-07-18 Ambrx, Inc. Polipéptidos de FGF-21 modificados y sus usos
BRPI0809670A8 (pt) 2007-04-03 2018-12-18 Biogenerix Ag métodos para aumentar a produção de célula tronco, para aumentar o número de granulócitos em um indivíduo, para prevenir, tratar e aliviar a mielossupressão que resulta de uma terapia contra o câncer, para tratar uma condição em um indivíduo, para tratar neutropenia e trombocitopenia em um mamífero, para expandir células tronco hematopoiéticas em cultura, para aumentar a hematopoiese em um indivíduo, para aumentar o número de célulars progenitoras hematopoiéticas em um indivíduo, e para fornecer enxerto estável da medula óssea, e, forma de dosagem oral.
WO2008124706A2 (en) 2007-04-06 2008-10-16 Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University Devices and methods for target molecule characterization
US20090053167A1 (en) * 2007-05-14 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. C-, S- and N-glycosylation of peptides
MX2009013259A (es) * 2007-06-12 2010-01-25 Novo Nordisk As Proceso mejorado para la produccion de azucares de nucleotidos.
AU2008275911A1 (en) * 2007-07-19 2009-01-22 Arizona Board of Regents, a body corporate acting for and on behalf of Arizona State University Self- anchoring MEMS intrafascicular neural electrode
BRPI0815416A2 (pt) * 2007-08-15 2014-10-21 Amunix Inc Composições e métodos para modificar propriedades de polipeptídeos biologicamente ativos
PL2197919T3 (pl) 2007-08-27 2014-09-30 Ratiopharm Gmbh Ciekły preparat koniugatu G-CSF
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
EP2222329A1 (en) * 2007-11-09 2010-09-01 Baxter International Inc. Modified recombinant factor viii and von willebrand factor and methods of use
JP5571576B2 (ja) * 2008-01-07 2014-08-13 シナジェバ・バイオファーマ・コーポレイション トリにおけるグリコシル化
JP5647899B2 (ja) * 2008-01-08 2015-01-07 ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化
RU2573587C2 (ru) 2008-02-27 2016-01-20 Ново Нордиск А/С Конъюгированные молекулы фактора viii
US8628649B2 (en) 2008-03-18 2014-01-14 Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University Nanopore and carbon nanotube based DNA sequencer and a serial recognition sequencer
WO2009117517A2 (en) 2008-03-18 2009-09-24 Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University Nanopore and carbon nanotube based dna sequencer
KR20110033242A (ko) * 2008-06-25 2011-03-30 바이엘 헬스케어 엘엘씨 면역원성이 감소된, 인자 ⅷ 뮤테인
JP5986745B2 (ja) 2008-07-15 2016-09-06 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｐｔｆｅ様のアルミニウム・コート・ガラススライド上のグリカンアレイおよび関連する方法
US8968540B2 (en) 2008-10-06 2015-03-03 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Trans-base tunnel reader for sequencing
HUE044381T2 (hu) 2008-12-16 2019-10-28 Genzyme Corp Szintetikus intermedierek oligoszacharid-fehérje konjugátumok elõállításához
SG193837A1 (en) * 2009-01-28 2013-10-30 Smartcells Inc Conjugate based systems for controlled drug delivery
PL2393828T3 (pl) 2009-02-03 2017-06-30 Amunix Operating Inc. Wydłużone rekombinowane polipeptydy i zawierające je kompozycje
US20110046060A1 (en) * 2009-08-24 2011-02-24 Amunix Operating, Inc., Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
WO2010096394A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Redwood Biosciences, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
EP2410846B1 (en) 2009-03-25 2016-09-07 Seneb Biosciences, Inc. Glycolipids as treatment for disease
EP2417155B1 (en) 2009-04-06 2013-06-19 Novo Nordisk A/S Targeted delivery of factor viii proteins to platelets
WO2010146362A2 (en) * 2009-06-16 2010-12-23 The University Of Bath Materials and methods relating to glycosylation
JP5909755B2 (ja) 2009-07-27 2016-04-27 リポクセン テクノロジーズ リミテッド 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
EP3093029A1 (en) 2009-07-27 2016-11-16 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
SG178141A1 (en) 2009-07-27 2012-03-29 Baxter Int Blood coagulation protein conjugates
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
WO2011018515A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Novo Nordisk Health Care Ag Method of purifying pegylated proteins
GB0915403D0 (en) * 2009-09-04 2009-10-07 London School Hygiene & Tropical Medicine Protein glycosylation
WO2011045704A1 (en) 2009-10-12 2011-04-21 Pfizer Inc. Cancer treatment
US8697844B2 (en) 2009-11-24 2014-04-15 Novo Nordisk A/S Method of purifying pegylated proteins
US10087236B2 (en) * 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
JP2013512674A (ja) * 2009-12-02 2013-04-18 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させるための組成物および方法
US20130040888A1 (en) 2010-02-16 2013-02-14 Novo Nordisk A/S Factor VIII Molecules With Reduced VWF Binding
EP2977055A1 (en) 2010-02-16 2016-01-27 Novo Nordisk A/S Factor viii fusion protein
AU2011223627B2 (en) 2010-03-04 2015-06-18 Pfenex Inc. Method for producing soluble recombinant interferon protein without denaturing
NZ603033A (en) 2010-04-01 2014-06-27 Pfenex Inc Methods for g-csf production in a pseudomonas host cell
WO2011130332A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Academia Sinica Glycan arrays for high throughput screening of viruses
US8962345B2 (en) * 2010-05-21 2015-02-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Commerce Method of characterizing glycans attached to glycoproteins
CN103080135B (zh) 2010-06-30 2017-06-13 诺沃—诺迪斯克有限公司 能够特异性结合组织因子途径抑制剂的抗体
NZ605348A (en) 2010-07-09 2015-01-30 Biogen Idec Hemophilia Inc Factor ix polypeptides and methods of use thereof
WO2012007324A2 (en) 2010-07-15 2012-01-19 Novo Nordisk A/S Stabilized factor viii variants
US9074015B2 (en) 2010-07-28 2015-07-07 Smartcells, Inc. Recombinantly expressed insulin polypeptides and uses thereof
JP2013535198A (ja) 2010-07-30 2013-09-12 グリコド 哺乳類のグリコシル化経路を有する酵母人工染色体
ES2534936T3 (es) 2010-08-02 2015-04-30 Ratiopharm Gmbh Método para producir y purificar una sialiltransferasa soluble activa
JP6173911B2 (ja) 2010-09-10 2017-08-09 メディミューン リミテド 抗体誘導体
CN103209992A (zh) 2010-09-15 2013-07-17 诺沃—诺迪斯克有限公司 具有减少的细胞摄取的因子viii变体
EP2619228A1 (en) 2010-09-22 2013-07-31 Novo Nordisk A/S Therapeutic factor viii antibodies
RU2604490C2 (ru) 2010-11-05 2016-12-10 Займворкс Инк. ДИЗАЙН УСТОЙЧИВОГО ГЕТЕРОДИМЕРНОГО АНТИТЕЛА С МУТАЦИЯМИ В Fc ДОМЕНЕ
RU2013131911A (ru) 2010-12-16 2015-01-27 Ново Нордиск А/С Водный раствор фактора viii
DK2654794T3 (da) 2010-12-22 2020-06-08 Baxalta GmbH Materialer og fremgangsmåder til konjugering af et vandopløseligt fedtsyrederivat til et protein
MX2013006234A (es) * 2011-01-06 2013-08-01 Univ Johns Hopkins Metodo para la produccion de glicoproteinas recombinantes con semivida en circulacion incrementada en celulas de mamifero.
CN103415621A (zh) 2011-01-14 2013-11-27 雷德伍德生物科技股份有限公司 醛标记免疫球蛋白多肽及其使用方法
CA2827732A1 (en) * 2011-02-25 2012-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Yeast strain for the production of proteins with modified o-glycosylation
KR20140043720A (ko) 2011-03-01 2014-04-10 노보 노르디스크 에이/에스 길항성 ｄｒ3 리간드
RU2013142015A (ru) 2011-03-02 2015-04-10 Ново Нордиск А/С Нацеливание факторов свертывания крови на рецептор tlt-1 на поверхности активированных тромбоцитов
JP6101638B2 (ja) 2011-03-03 2017-03-22 ザイムワークス，インコーポレイテッド 多価ヘテロマルチマー足場設計及び構築物
JP2014509864A (ja) 2011-03-23 2014-04-24 グリコド Ｇｄｐ−フコースを産生可能な酵母組換え細胞
US20140178368A1 (en) 2011-04-19 2014-06-26 Leslie Lynne SHARP Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
KR20240110072A (ko) 2011-05-18 2024-07-12 메더리스 다이어비티즈, 엘엘씨 인슐린 저항성에 대한 개선된 펩티드 제약
WO2012158962A2 (en) 2011-05-18 2012-11-22 Eumederis Pharmaceuticals, Inc. Improved peptide pharmaceuticals
AU2012264696A1 (en) 2011-05-31 2013-12-12 Probiogen Ag Methods for preparation of fucose-linked site specific conjugates of proteins with toxins, adjuvants, detection labels and pharmacokinetic half life extenders
WO2012170938A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for increasing serum half-life
PT2717898T (pt) 2011-06-10 2019-05-20 Bioverativ Therapeutics Inc Compostos pró-coagulantes e processos para a sua utilização
US9150846B2 (en) 2011-07-05 2015-10-06 Bioasis Technologies, Inc. P97-antibody conjugates and methods of use
DK2739649T3 (en) 2011-08-05 2018-01-08 Bioasis Technologies Inc P97 FRAGMENTS WITH TRANSFER ACTIVITY
AR087433A1 (es) * 2011-08-08 2014-03-26 Merck Sharp & Dohme Analogos de insulina n-glicosilados
CN104093735B (zh) 2011-09-23 2018-07-06 诺沃—诺迪斯克有限公司 新的胰高血糖素类似物
CN109134642A (zh) * 2011-10-01 2019-01-04 株式会社糖锁工学研究所 加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物
WO2013058582A2 (ko) * 2011-10-18 2013-04-25 한국생명공학연구원 당전이 효소를 이용한 안사마이신 배당체의 제조방법
KR101456174B1 (ko) * 2011-10-18 2014-11-03 한국생명공학연구원 용해도가 증가된 비―퀴논 젤다나마이신 당전이 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이의 열충격 단백질(Ｈｓｐ90) 에이티피아제(ＡＴＰａｓｅ) 활성 저해용 약학적 조성물
US9034829B1 (en) * 2011-10-27 2015-05-19 Northwestern University pH-sensitive polymer-drug conjugates for targeted delivery of therapeutics
EP2773671B1 (en) 2011-11-04 2021-09-15 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the fc domain
WO2013123457A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
CN119192402A (zh) 2012-02-15 2024-12-27 比奥贝拉蒂治疗公司 因子viii组合物及其制备和使用方法
US10265388B2 (en) 2012-02-21 2019-04-23 Cytonics Corporation Systems, compositions, and methods for transplantation
US10130714B2 (en) 2012-04-14 2018-11-20 Academia Sinica Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity
WO2013160005A1 (en) 2012-04-24 2013-10-31 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition suitable for treatment of haemophilia
JP2015515482A (ja) 2012-04-24 2015-05-28 ノヴォ ノルディスク アー／エス 血友病の治療に適する化合物
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
CN102786030B (zh) * 2012-07-06 2014-03-12 江苏大学 一种通过溶剂处理制备多肽纳米薄膜的方法
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
AU2013296557B2 (en) 2012-07-31 2019-04-18 Bioasis Technologies Inc. Dephosphorylated lysosomal storage disease proteins and methods of use thereof
JP6302909B2 (ja) 2012-08-18 2018-03-28 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ シアリダーゼの同定および画像化のための細胞透過性プローブ
SG10201702387YA (en) 2012-09-24 2017-04-27 Medimmune Ltd Cell lines
WO2014057068A1 (en) 2012-10-10 2014-04-17 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid pharmaceutical composition of factor vii polypeptide
US9274430B2 (en) 2012-10-10 2016-03-01 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Systems and devices for molecule sensing and method of manufacturing thereof
JP2015532307A (ja) 2012-10-15 2015-11-09 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 凝固因子ｖｉｉポリペプチド
CN104661685A (zh) 2012-10-15 2015-05-27 诺和诺德保健Ag（股份有限公司） 因子vii缀合物
JP6525456B2 (ja) * 2012-11-20 2019-06-05 メデリス ダイアビーティーズ，エルエルシー インスリン抵抗性のための改善されたペプチド製剤
WO2014081864A1 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Eumederis Pharmaceuticals, Inc. Improved peptide pharmaceuticals
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
EP2925345B1 (en) 2012-12-03 2018-09-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Method for making o-glycosylated carboxy terminal portion (ctp) peptide-based insulin and insulin analogues
CN103044509B (zh) * 2013-01-05 2015-04-01 宁辉 γ-胞嘧啶核苷-5’-三磷酸二钠结晶化合物、其制备方法及其药物组合物
MX2015010428A (es) * 2013-02-13 2016-04-13 Lab Francais Du Fractionnement Anticuerpos anti-her2 altamente galactosilados y sus usos.
US10174110B2 (en) 2013-02-13 2019-01-08 Laboratoire Français Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Highly galactosylated anti-TNF-α antibodies and uses thereof
WO2014140927A2 (en) 2013-02-13 2014-09-18 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Proteins with modified glycosylation and methods of production thereof
RU2708314C2 (ru) * 2013-03-11 2019-12-05 Джензим Корпорейшн Гипергликозилированные связывающие полипептиды
EP2970433B1 (en) 2013-03-13 2019-09-18 Bioasis Technologies Inc. Fragments of p97 and uses thereof
ES2926773T3 (es) 2013-03-15 2022-10-28 Novo Nordisk As Anticuerpos capaces de unirse específicamente a dos epítopos en el inhibidor de la ruta del factor tisular
WO2014170496A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Novo Nordisk A/S Stable, protracted glp-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
PL2991683T3 (pl) 2013-05-02 2020-03-31 Glykos Finland Oy Koniugaty glikoproteiny lub glikanu z toksycznym ładunkiem
WO2014182970A1 (en) * 2013-05-08 2014-11-13 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
EP2996772B1 (en) 2013-05-13 2018-12-19 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of neurodegeneration
EP3013365B1 (en) 2013-06-26 2019-06-05 Academia Sinica Rm2 antigens and use thereof
WO2014210564A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 Academia Sinica Glycan conjugates and use thereof
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
EP3038635A4 (en) 2013-08-28 2017-04-05 Cytonics Corporation Systems, compositions, and methods for transplantation and treating conditions
CN105682666B (zh) 2013-09-06 2021-06-01 中央研究院 使用醣脂激活人类iNKT细胞
US9884125B2 (en) 2013-10-04 2018-02-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Glucose-responsive insulin conjugates
US9987373B2 (en) 2013-10-14 2018-06-05 Synaffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
WO2015057065A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Synaffix B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
BR112016008039A2 (pt) 2013-10-15 2017-10-17 Novo Nordisk Healthcare Ag polipeptídeos do fator vii da coagulação
WO2015057622A1 (en) 2013-10-16 2015-04-23 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Sialylated glycoproteins
JP2017507118A (ja) 2014-01-16 2017-03-16 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ がんの処置および検出のための組成物および方法
US10150818B2 (en) 2014-01-16 2018-12-11 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US11168085B2 (en) 2014-01-24 2021-11-09 Synaffix B.V. Process for the cycloaddition of a hetero(aryl) 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
WO2015112016A1 (en) 2014-01-24 2015-07-30 Synaffix B.V. Process for the cycloaddition of a halogenated 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
EP3097200A1 (en) * 2014-01-24 2016-11-30 SynAffix B.V. Process for the attachment of a galnac moiety comprising a (hetero)aryl group to a glcnac moiety, and product obtained thereby
EP3102608B1 (en) 2014-02-03 2019-09-18 Bioasis Technologies Inc. P97 fusion proteins
AR099340A1 (es) * 2014-02-12 2016-07-13 Novo Nordisk As Conjugados del factor de coagulación ix
EP3107562B1 (en) 2014-02-19 2019-09-18 Bioasis Technologies Inc. P97-ids fusion proteins
US10188739B2 (en) 2014-02-27 2019-01-29 Xenetic Biosciences, Inc. Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain
EP3129067B1 (en) 2014-03-19 2023-01-04 Genzyme Corporation Site-specific glycoengineering of targeting moieties
CN106415244B (zh) 2014-03-27 2020-04-24 中央研究院 反应性标记化合物及其用途
CA2944539A1 (en) 2014-04-08 2015-10-15 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
JP6750148B2 (ja) * 2014-04-25 2020-09-02 公益財団法人野口研究所 糖鎖切断抗体の製造方法及び均一糖鎖抗体
JP6847664B2 (ja) 2014-05-01 2021-03-24 バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド Ｐ９７−ポリヌクレオチド複合体
US20150344585A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Anti-cd20 glycoantibodies and uses thereof
TWI717319B (zh) 2014-05-27 2021-02-01 中央研究院 得自類桿菌屬之岩藻糖苷酶及其用途
US10118969B2 (en) 2014-05-27 2018-11-06 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
TWI679020B (zh) 2014-05-27 2019-12-11 中央研究院 抗ｈｅｒ２醣抗體及其用途
US9856306B2 (en) 2014-05-28 2018-01-02 Spitfire Pharma, Inc. Peptide pharmaceuticals for insulin resistance
TWI732738B (zh) 2014-05-28 2021-07-11 中央研究院 抗TNF-α醣抗體及其用途
US10570184B2 (en) 2014-06-04 2020-02-25 Novo Nordisk A/S GLP-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
DK3160513T3 (da) 2014-06-30 2020-04-06 Glykos Finland Oy Saccharidderivat af en toksisk payload og antistofkonjugater deraf
CN106714817A (zh) * 2014-07-10 2017-05-24 中央研究院 多药物递送系统及其用途
BR112017002090B1 (pt) 2014-08-04 2021-06-01 Csl Limited Composição aquosa de fator viii de coagulação e método de estabilizar uma molécula de fviii
TWI745275B (zh) 2014-09-08 2021-11-11 中央研究院 使用醣脂激活人類ｉＮＫＴ細胞
CN108025083B (zh) * 2014-10-09 2021-09-03 建新公司 糖工程化的抗体药物缀合物
SG11201702824UA (en) 2014-10-24 2017-05-30 Bristol Myers Squibb Co Modified fgf-21 polypeptides and uses thereof
US10889631B2 (en) 2014-11-20 2021-01-12 Cytonics Corporation Therapeutic variant alpha-2-macroglobulin compositions
WO2016091268A2 (en) 2014-12-12 2016-06-16 University Of Copenhagen N-glycosylation
EP3835312A1 (en) 2014-12-31 2021-06-16 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Combination tumor immunotherapy
US9975965B2 (en) 2015-01-16 2018-05-22 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
CA2972072A1 (en) 2015-01-24 2016-07-28 Academia Sinica Novel glycan conjugates and methods of use thereof
CN107406493B (zh) 2015-03-06 2021-08-13 康诺贝林伦瑙有限公司 具有改善的半衰期的经修饰的血管性血友病因子
FR3038517B1 (fr) 2015-07-06 2020-02-28 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Utilisation de fragments fc modifies en immunotherapie
CA2994547A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
WO2017118704A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with low npr-c binding
WO2017118693A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs with large carrier moieties
SMT202200466T1 (it) 2016-01-08 2023-01-13 Ascendis Pharma Growth Disorders As Profarmaci di cnp con legame a supporto in corrispondenza del raggruppamento ciclico
CA3008017C (en) * 2016-01-08 2024-01-02 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with reduced side-effects
EP3400022A1 (en) 2016-01-08 2018-11-14 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with low initial npr-b activity
NZ743487A (en) 2016-01-08 2023-02-24 Ascendis Pharma Growth Disorders As Controlled-release cnp agonists with increased nep stability
CN105505884B (zh) * 2016-01-26 2017-10-03 郑州师范学院 进行抗体表达和组装的重组系统及应用
TW201808978A (zh) 2016-03-08 2018-03-16 中央研究院 N-聚醣及其陣列之模組化合成方法
MA45473A (fr) * 2016-04-04 2019-02-13 Shire Human Genetic Therapies Inhibiteur de c1 estérase conjugué et ses utilisations
EP3448885A4 (en) 2016-04-26 2020-01-08 R.P. Scherer Technologies, LLC ANTIBODY CONJUGATES AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
MY194619A (en) 2016-06-02 2022-12-07 Abbvie Inc Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
EP3500594A4 (en) 2016-08-22 2020-03-11 Cho Pharma Inc. ANTIBODIES, BINDING FRAGMENTS AND METHOD FOR USE
IL321464A (en) 2016-09-29 2025-08-01 Ascendis Pharma Growth Disorders As Combination therapy with controlled-release cnp agonists
US12161696B2 (en) 2016-12-02 2024-12-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
JP6852397B2 (ja) * 2016-12-28 2021-03-31 株式会社島津製作所 分析用試料の調製方法および分析方法
TWI673363B (zh) * 2016-12-29 2019-10-01 財團法人生物技術開發中心 製備醣蛋白-藥物共軛物之方法
WO2018148419A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Bristol-Myers Squibb Company Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
FI3583120T3 (fi) 2017-02-17 2023-01-13 Muunneltuja transferriinireseptoria sitovia polypeptidejä
JP2020511499A (ja) 2017-03-20 2020-04-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 赤血球生成刺激タンパク質のインビトロでの糖鎖改変のための方法
CN111051512A (zh) 2017-07-11 2020-04-21 辛索克斯公司 非天然核苷酸的掺入及其方法
SG11202000939PA (en) 2017-08-03 2020-02-27 Synthorx Inc Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases
ES2930534T3 (es) 2017-09-04 2022-12-16 89Bio Ltd Conjugados de péptidos de FGF-21 mutantes y usos de los mismos
PH12020550661A1 (en) 2017-11-21 2021-04-19 Univ Leland Stanford Junior Partial agonists of interleukin-2
BR112020010694A2 (pt) 2017-12-01 2020-11-10 Abbvie Inc. agonista de receptor de glicocorticoides e imunoconjugados do mesmo
EP3735295B1 (en) 2018-01-03 2024-08-21 Mederis Diabetes, LLC Improved peptide pharmaceuticals for treatment of nash and other disorders
EP3752194A4 (en) 2018-02-13 2022-03-16 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TUMOR IMMUNOTHERAPY
IL277680B2 (en) 2018-04-09 2025-08-01 Checkmate Pharmaceuticals Inc Packaging oligonucleotides into virus-like particles
TW202015723A (zh) 2018-05-18 2020-05-01 美商百歐維拉提夫治療公司 治療ａ型血友病的方法
WO2019232283A1 (en) * 2018-05-30 2019-12-05 Purdue Research Foundation Targeting anabolic drugs for accelerated fracture repair
CN113301925A (zh) 2018-12-19 2021-08-24 小利兰·斯坦福大学理事会 用于溶酶体靶向的双官能分子以及相关的组合物和方法
AU2020218203A1 (en) 2019-02-06 2021-08-26 Synthorx, Inc. IL-2 conjugates and methods of use thereof
US12377133B2 (en) 2019-02-11 2025-08-05 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Dry pharmaceutical formulations of CNP conjugates
AU2020300820A1 (en) 2019-07-04 2022-03-03 CSL Behring Lengnau AG A truncated von willebrand factor (vWF) for increasing the in vitro stability of coagulation factor VIII
WO2021094344A1 (en) 2019-11-11 2021-05-20 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii
AU2020411480B2 (en) 2019-12-23 2023-12-21 Denali Therapeutics Inc. Progranulin variants
JP7303391B2 (ja) 2020-01-14 2023-07-04 シンセカイン インコーポレイテッド バイアス型ｉｌ２ムテイン、方法、および組成物
US12122845B2 (en) * 2020-08-07 2024-10-22 Eutilex Co., Ltd. Anti-HER2/anti-4-1BB bispecific antibodies and uses thereof
US20230235082A1 (en) * 2020-08-21 2023-07-27 Glyco-Therapy Biotechnology Co., Ltd. Site-specific antibody conjugates and the methods for preparation of the same
WO2022079211A1 (en) * 2020-10-16 2022-04-21 Adc Therapeutics Sa Glycoconjugates
EP4228703A1 (en) * 2020-10-16 2023-08-23 University of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoconjugates
US12171806B2 (en) 2021-09-28 2024-12-24 Spitfire Pharma Llc Therapeutic regimens and methods for lowering blood glucose and/or body weight using GLP-1R and GCGR balanced agonists
WO2022136705A1 (en) * 2020-12-24 2022-06-30 Synaffix B.V. Glycan-conjugated antibodies binding to fc-gamma receptor
KR20230128534A (ko) * 2021-02-22 2023-09-05 상하이 인스티튜트 오브 마테리아 메디카 차이니즈 아카데미 오브 싸이언시즈 이당류 링커, 이당류-소분자 약물 접합체 및 당쇄 부위특이적 항체-약물 접합체, 그 제조 방법 및 용도
CN113429443B (zh) * 2021-07-08 2023-07-25 江南大学 一种双唾液酸-甘露寡糖复合物及其合成方法
JP2024524614A (ja) 2021-07-14 2024-07-05 ライシア セラピューティクス， インコーポレイテッド Ａｓｇｐｒ細胞表面受容体結合化合物及びコンジュゲート
WO2023122616A1 (en) * 2021-12-20 2023-06-29 89Bio, Inc. Chemical synthesis of cytidine-5'-monophospho-n-glycyl-sialic acid
EP4285934A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 CER Groupe Modified trimannose-oligosacharides, bisected n-glycans comprising said trimannose core and method for obtaining them
KR20250052370A (ko) 2022-06-24 2025-04-18 89바이오 인코포레이티드 중증 고중성지방혈증용 조성물 및 치료 방법
KR20250126089A (ko) * 2022-12-29 2025-08-22 허니베어 바이오사이언시스 인코포레이티드 당단백질 변형 방법

Family Cites Families (296)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
GB1479268A (en) * 1973-07-05 1977-07-13 Beecham Group Ltd Pharmaceutical compositions
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2433883C2 (de) * 1973-07-20 1986-03-27 Research Corp., New York, N.Y. Verwendung von physiologisch aktiven Polypeptiden
CH596313A5 (es) 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
US4385260A (en) 1975-09-09 1983-05-24 Beckman Instruments, Inc. Bargraph display
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4342832A (en) 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
IL63270A0 (en) 1980-08-05 1981-10-30 Univ Leland Stanford Junior Eukaryotic autonomously replicating segment
US4414147A (en) 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4975276A (en) 1982-01-15 1990-12-04 Cetus Corporation Interferon-alpha 54
US4695543A (en) 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
US4748233A (en) 1982-03-23 1988-05-31 Bristol-Myers Company Alpha-interferon Gx-1
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
WO1983004050A1 (en) 1982-05-19 1983-11-24 Gist-Brocades N.V. Cloning system for kluyveromyces species
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US5151511A (en) 1982-09-16 1992-09-29 Amgen Inc. DNA encoding avian growth hormones
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4966843A (en) 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
US4438253A (en) 1982-11-12 1984-03-20 American Cyanamid Company Poly(glycolic acid)/poly(alkylene glycol) block copolymers and method of manufacturing the same
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US5639639A (en) 1983-11-02 1997-06-17 Genzyme Corporation Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof
US5156957A (en) 1983-11-02 1992-10-20 Genzyme Corporation Follicle stimulating hormone
US4840896A (en) 1983-11-02 1989-06-20 Integrated Genetics, Inc. Heteropolymeric protein
US4923805A (en) 1983-11-02 1990-05-08 Integrated Genetics, Inc. Fsh
US4758656A (en) 1983-12-26 1988-07-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel human interferon-gamma polypeptide derivative
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
IL71691A (en) 1984-04-27 1991-04-15 Yeda Res & Dev Production of interferon-ypsilon
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4589402A (en) 1984-07-26 1986-05-20 Serono Laboratories, Inc. Method of in vitro fertilization
US4970300A (en) * 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
US4761371A (en) 1985-02-12 1988-08-02 Genentech, Inc. Insulin receptor
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
AU5864086A (en) 1985-04-22 1986-11-18 Genetics Institute Inc. High yield production of active factor ix
WO1986006358A1 (fr) 1985-04-30 1986-11-06 Büro Patent Ag Installation et procede d'amenee automatique de pots remplis et d'evacuation automatique de pots vides dans un metier a filer
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JPS6238172A (ja) 1985-08-12 1987-02-19 株式会社　高研 抗血栓性医用材料の製造方法
US6004548A (en) 1985-08-23 1999-12-21 Amgen, Inc. Analogs of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4810643A (en) 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
JPS62236497A (ja) 1985-09-17 1987-10-16 Chugai Pharmaceut Co Ltd 顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白質の製造方法
JPS63502795A (ja) 1985-10-03 1988-10-20 バイオジェン インコーポレイテッド 顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子‐様ポリペプチド、ｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子並びに微生物細胞中でヒト顆粒球−マクロファ−ジコロニ−刺激因子−様ポリペプチドを高収量で生産する方法
IL80529A0 (en) 1985-11-14 1987-02-27 Daiichi Seiyaku Co Method of producing peptides
DE3712985A1 (de) 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US4925796A (en) 1986-03-07 1990-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
IT1203758B (it) 1986-03-27 1989-02-23 Univ Roma Vettori di clonazione e di espressione di geni eterologhi in lieviti e lieviti trasformati con tali vettori
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4894330A (en) 1986-12-23 1990-01-16 Cetus Corporation Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4857505A (en) * 1987-03-09 1989-08-15 American Cyanamid Company Sustained release compositions for parenteral administration and their use
DK175243B1 (da) 1987-03-23 2004-07-19 Zymogenetics Inc Ekspressionsvektor, der er i stand til at styre ekspression af heterologe gener eller cDNA i gær, gærværtscelle samt fremgangsmåde til öget produktion af proteiner i gærværtsceller
US5149637A (en) 1987-04-06 1992-09-22 Scripps Clinic & Research Foundation Recombinant Factor VIIIC fragments
DE3712564A1 (de) * 1987-04-14 1988-11-24 Bioferon Biochem Substanz Verfahren zur konstruktion einer animalen zellinie fuer die herstellung von humanem interferon-beta
IL82834A (en) 1987-06-09 1990-11-05 Yissum Res Dev Co Biodegradable polymeric materials based on polyether glycols,processes for the preparation thereof and surgical artiicles made therefrom
HU208553B (en) 1987-07-28 1993-11-29 Gist Brocades Nv Process for producing polypeptides, plasmides coding them and transformed kluyveromyces
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
US5252726A (en) 1987-09-04 1993-10-12 Novo Nordisk A/S Promoters for use in aspergillus
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8810808D0 (en) 1988-05-06 1988-06-08 Wellcome Found Vectors
JP2511494B2 (ja) 1988-05-12 1996-06-26 善治 松浦 日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質の製造法
US5770198A (en) 1988-05-18 1998-06-23 The Research Foundation Of The State Of New York Platelet-specific chimeric 7E3 immunoglobulin
FR2631974B1 (fr) 1988-05-31 1992-12-11 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede de preparation et son application en tant que vecteur d'expression de genes
FR2649991B2 (fr) 1988-08-05 1994-03-04 Rhone Poulenc Sante Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5162215A (en) 1988-09-22 1992-11-10 Amgen Inc. Method of gene transfer into chickens and other avian species
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
US5534617A (en) 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
FR2638643B1 (fr) 1988-11-09 1991-04-12 Transgene Sa Sequence d'adn codant pour le facteur ix humain ou une proteine analogue, vecteur d'expression, cellules transformees, procede de preparation du facteur ix et produits obtenus correspondants
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
US6166183A (en) 1992-11-30 2000-12-26 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
EP0853121B1 (en) 1988-12-23 2007-03-28 Genentech, Inc. Human DNase
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US4957773A (en) 1989-02-13 1990-09-18 Syracuse University Deposition of boron-containing films from decaborane
US5475090A (en) 1989-02-21 1995-12-12 Boyce Thompson Institute For Plant Research Gene coded for a polypeptide which enhances virus infection of host insects
US5338835A (en) 1989-02-21 1994-08-16 Washington University CTP-extended form of FSH
US5194376A (en) 1989-02-28 1993-03-16 University Of Ottawa Baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
DE3906540A1 (de) 1989-03-02 1990-09-13 Behringwerke Ag Expressionsvektoren zur synthese von proteinen in der spalthefe schizosaccharomyces pombe
US5179023A (en) 1989-03-24 1993-01-12 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant α-galactosidase a therapy for Fabry disease
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ATE181732T1 (de) 1989-04-19 1999-07-15 Novo Nordisk As Aktive karbonate von polyalkylenoxyden zur modifizierung von polypeptiden
DE68927344T2 (de) 1989-04-28 1997-02-20 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Hefezellen der Gattung-Schwanniomyces
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
US5244805A (en) 1989-05-17 1993-09-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Baculovirus expression vectors
US5077214A (en) 1989-07-07 1991-12-31 The Texas A&M University System Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells
US5162222A (en) 1989-07-07 1992-11-10 Guarino Linda A Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses
US5179007A (en) 1989-07-07 1993-01-12 The Texas A & M University System Method and vector for the purification of foreign proteins
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5023328A (en) 1989-08-04 1991-06-11 The Texas A&M University System Lepidopteran AKH signal sequence
US5155037A (en) 1989-08-04 1992-10-13 The Texas A&M University System Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems
US5182107A (en) 1989-09-07 1993-01-26 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US5672683A (en) 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
US5527527A (en) 1989-09-07 1996-06-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US5154924A (en) 1989-09-07 1992-10-13 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
US5032519A (en) 1989-10-24 1991-07-16 The Regents Of The Univ. Of California Method for producing secretable glycosyltransferases and other Golgi processing enzymes
US5580560A (en) 1989-11-13 1996-12-03 Novo Nordisk A/S Modified factor VII/VIIa
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
FR2657884B1 (fr) 1990-02-05 1994-09-02 Tm Innovation Procede pour la preparation du facteur viii humain et d'analogues du facteur viii.
DE4009630C2 (de) * 1990-03-26 1995-09-28 Reinhard Prof Dr Dr Brossmer CMP-aktivierte fluoreszierende Sialinsäuren sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
JP2975632B2 (ja) * 1990-03-30 1999-11-10 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン修飾プロテイン
US5606031A (en) 1990-04-06 1997-02-25 Lile; Jack Production and purification of biologically active recombinant neurotrophic protein in bacteria
GB9107846D0 (en) 1990-04-30 1991-05-29 Ici Plc Polypeptides
US5951972A (en) * 1990-05-04 1999-09-14 American Cyanamid Company Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues
US5399345A (en) 1990-05-08 1995-03-21 Boehringer Mannheim, Gmbh Muteins of the granulocyte colony stimulating factor
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
DK0538300T3 (da) * 1990-07-10 1994-10-10 Boehringer Ingelheim Int O-Glycosyleret IFN-alfa
FR2664905B1 (fr) 1990-07-18 1994-08-12 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede d'obtention, et vecteurs d'expression obtenus a partir dudit baculovirus.
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
US5529914A (en) 1990-10-15 1996-06-25 The Board Of Regents The Univeristy Of Texas System Gels for encapsulation of biological materials
US5410016A (en) 1990-10-15 1995-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers
GB9023111D0 (en) 1990-10-24 1990-12-05 Wellcome Found Expression system
US5401650A (en) 1990-10-24 1995-03-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A
WO1992008790A1 (en) * 1990-11-14 1992-05-29 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
US5420027A (en) 1991-01-10 1995-05-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the expression of biologically active fusion proteins comprising a eukaryotic cytochrome P450 fused to a reductase in bacteria
US5948682A (en) 1991-02-22 1999-09-07 Sembiosys Genetics Inc. Preparation of heterologous proteins on oil bodies
US5650554A (en) 1991-02-22 1997-07-22 Sembiosys Genetics Inc. Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants
US6288304B1 (en) 1991-02-22 2001-09-11 Sembiosys Genetics Inc. Expression of somatotropin in plant seeds
US5833982A (en) 1991-02-28 1998-11-10 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US5788965A (en) 1991-02-28 1998-08-04 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
US5997864A (en) 1995-06-07 1999-12-07 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
US5861374A (en) 1991-02-28 1999-01-19 Novo Nordisk A/S Modified Factor VII
US5817788A (en) 1991-02-28 1998-10-06 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US5661008A (en) 1991-03-15 1997-08-26 Kabi Pharmacia Ab Recombinant human factor VIII derivatives
JP3476455B2 (ja) 1991-03-18 2003-12-10 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート ＮｅｕＡｃα２、６Ｇａｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃ及びシアリルＬｅｘの合成法
US5278299A (en) * 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
US5212075A (en) 1991-04-15 1993-05-18 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for introducing effectors to pathogens and cells
US5472858A (en) 1991-06-04 1995-12-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Production of recombinant proteins in insect larvae
US5352670A (en) 1991-06-10 1994-10-04 Alberta Research Council Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides
US5374655A (en) 1991-06-10 1994-12-20 Alberta Research Council Methods for the synthesis of monofucosylated oligosaccharides terminating in di-N-acetyllactosaminyl structures
KR950014915B1 (ko) 1991-06-19 1995-12-18 주식회사녹십자 탈시알로당단백-포함화합물
US5352570A (en) 1991-06-28 1994-10-04 Eastman Kodak Company Method and photographic material and process comprising a benzotriazole compound
WO1993000109A1 (en) * 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5633146A (en) 1991-07-02 1997-05-27 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Method for producing recombinant proteins and host cells used therein
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
DK8892D0 (da) 1992-01-23 1992-01-23 Symbicom Ab Humant proteingen
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
US6039944A (en) 1992-02-28 2000-03-21 Zymogenetics, Inc. Modified Factor VII
US5965106A (en) 1992-03-04 1999-10-12 Perimmune Holdings, Inc. In vivo binding pair pretargeting
DE69332538T2 (de) 1992-04-02 2003-11-06 Sembiosys Genetics, Inc. Cis elemente des ölkörperproteins als regulationische signale
US6037452A (en) 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
US5516657A (en) 1992-05-11 1996-05-14 Cambridge Biotech Corporation Baculovirus vectors for expression of secretory and membrane-bound proteins
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
EP0664710A4 (en) * 1992-08-07 1998-09-30 Progenics Pharm Inc CD4-GAMMA2 AND CD4-IgG2 NON-PEPTIDYL CONJUGATE IMMUNOCONJUGATES AND USES THEREOF.
AU5006993A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5348886A (en) 1992-09-04 1994-09-20 Monsanto Company Method of producing recombinant eukaryotic viruses in bacteria
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO1994012646A1 (en) 1992-11-27 1994-06-09 Ciba-Geigy Ag Proteins having glycosyltransferase activity
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
AU6029594A (en) 1993-01-15 1994-08-15 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5202413A (en) 1993-02-16 1993-04-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alternating (ABA)N polylactide block copolymers
AUPN154295A0 (en) 1995-03-06 1995-03-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Nucleic acid molecule encoding a protein with avian gamma-interferon activity
US5374541A (en) 1993-05-04 1994-12-20 The Scripps Research Institute Combined use of β-galactosidase and sialyltransferase coupled with in situ regeneration of CMP-sialic acid for one pot synthesis of oligosaccharides
US6174530B1 (en) 1993-05-05 2001-01-16 Gryphon Sciences Homogeneous polyoxime compositions and their preparation by parallel assembly
US6001364A (en) 1993-05-05 1999-12-14 Gryphon Sciences Hetero-polyoxime compounds and their preparation by parallel assembly
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5621039A (en) 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
EP0785988A1 (en) * 1993-07-15 1997-07-30 Neose Pharmaceuticals, Inc Method of synthesizing saccharide compositions
DE4325317C2 (de) * 1993-07-29 1998-05-20 Univ Dresden Tech Verfahren zur radioaktiven Markierung von Immunglobulinen
JPH0770195A (ja) * 1993-08-23 1995-03-14 Yutaka Mizushima 糖修飾インターフェロン
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU1377395A (en) 1993-12-23 1995-07-10 University Technologies International Inc. Methods of expressing proteins in insect cells and methods of killing insects
US5597709A (en) 1994-01-27 1997-01-28 Human Genome Sciences, Inc. Human growth hormone splice variants hGHV-2(88) and hGHV-3(53)
US5369017A (en) * 1994-02-04 1994-11-29 The Scripps Research Institute Process for solid phase glycopeptide synthesis
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6165793A (en) 1996-03-25 2000-12-26 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
JP3090586B2 (ja) 1994-03-15 2000-09-25 片倉工業株式会社 システインプロテアーゼ遺伝子欠損バキュロウイルスおよびその製造法並びにこれを利用する有用タンパク質の製造法
US5545723A (en) 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US5432059A (en) 1994-04-01 1995-07-11 Specialty Laboratories, Inc. Assay for glycosylation deficiency disorders
GB9408717D0 (en) 1994-05-03 1994-06-22 Biotech & Biolog Scien Res DNA sequences
DE69526395D1 (de) 1994-08-13 2002-05-23 Roche Diagnostics Gmbh Verwendung von Interferon-gamma zur Vermeidung der Proliferation und Differenzierung der primitiven Hämapoietischen Vorläuferzellen
US5871986A (en) 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5545553A (en) 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US6010871A (en) * 1994-09-29 2000-01-04 Ajinomoto Co., Inc. Modification of peptide and protein
US5521299A (en) 1994-11-22 1996-05-28 National Science Council Oligonucleotides for detection of baculovirus infection
US5834251A (en) 1994-12-30 1998-11-10 Alko Group Ltd. Methods of modifying carbohydrate moieties
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
IL116730A0 (en) * 1995-01-13 1996-05-14 Amgen Inc Chemically modified interferon
AU711121B2 (en) 1995-02-21 1999-10-07 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral preparations, vectors, immunogens, and vaccines
US5843705A (en) 1995-02-21 1998-12-01 Genzyme Transgenic Corporation Transgenically produced antithrombin III
GB9506249D0 (en) 1995-03-27 1995-05-17 Karobio Ab Media for insect cell cultures
US5876980A (en) 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US5728554A (en) 1995-04-11 1998-03-17 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
US6030815A (en) 1995-04-11 2000-02-29 Neose Technologies, Inc. Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US5922577A (en) 1995-04-11 1999-07-13 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
CA2227326A1 (en) * 1995-05-15 1996-11-21 Philip Dehazya Carbohydrate-mediated coupling of peptides to immunoglobulins
US6015555A (en) 1995-05-19 2000-01-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US5770191A (en) 1995-05-24 1998-06-23 University Of Florida Active C-terminal peptides of interferon--gamma and their use
AU6255096A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The Pegylated modified proteins
US5858752A (en) * 1995-06-07 1999-01-12 The General Hospital Corporation Fucosyltransferase genes and uses thereof
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5811634A (en) 1995-09-12 1998-09-22 Thomas G. O'Brien Transgenic mammal encoding ornithine decarboxylase
DK0851925T3 (da) * 1995-09-21 2005-11-28 Genentech Inc Humane Væksthormonvarianter
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US5767379A (en) 1995-11-06 1998-06-16 John Howard Commercial production of avidin in plants
CA2237039A1 (en) 1995-11-09 1997-05-15 Zymogenetics, Inc. Production of gad65 in methylotrophic yeast
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6171820B1 (en) 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US5716812A (en) 1995-12-12 1998-02-10 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides, and the products formed thereby
US5728580A (en) 1996-02-20 1998-03-17 Cornell Research Foundation, Inc. Methods and culture media for inducing single cell suspension in insect cell lines
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
AT403765B (de) 1996-04-12 1998-05-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung einer präparation enthaltend einen hochgereinigten komplex
US5734024A (en) 1996-04-19 1998-03-31 Boris Y. Zaslavsky Method for determining the biological activity of recombinant human growth hormone
US5750383A (en) 1996-05-14 1998-05-12 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Baculovirus cloning system
AU708572B2 (en) 1996-07-17 1999-08-05 Zymogenetics Inc. Preparation of (pichia methanolica) auxotrophic mutants
AU718510B2 (en) 1996-07-17 2000-04-13 Zymogenetics Inc. Transformation of pichia methanolica
US5682823A (en) 1996-08-23 1997-11-04 Bethlehem Steel Corporation Removable insulated cover and method for transporting hot oversized steel ingots
US20020064546A1 (en) 1996-09-13 2002-05-30 J. Milton Harris Degradable poly(ethylene glycol) hydrogels with controlled half-life and precursors therefor
AU735695B2 (en) 1996-10-10 2001-07-12 Neose Technologies, Inc. Carbohydrate purification using ultrafiltration, reverse osmosis and nanofiltration
US5856452A (en) 1996-12-16 1999-01-05 Sembiosys Genetics Inc. Oil bodies and associated proteins as affinity matrices
BR9606270A (pt) 1996-12-18 1998-09-22 Univ Minas Gerais Processo para a produção da proteína do interferon beta-cis humano recombinante e proteína de interferon beta-cis humano recombinante
US6399336B1 (en) 1997-01-16 2002-06-04 Neose Technologies, Inc. Practical in vitro sialylation of recombinant glycoproteins
US5945314A (en) 1997-03-31 1999-08-31 Abbott Laboratories Process for synthesizing oligosaccharides
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
US6183738B1 (en) * 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
US7585645B2 (en) 1997-05-27 2009-09-08 Sembiosys Genetics Inc. Thioredoxin and thioredoxin reductase containing oil body based products
ES2235336T3 (es) 1997-06-13 2005-07-01 Gryphon Therapeutics, Inc. Ligacion quimica nativa en fase solida de peptidos desprotegidos o protegidos en la cisteina n-terminal en solucion acuosa.
US6210736B1 (en) 1997-06-17 2001-04-03 Genzyme Transgenics Corporation Transgenically produced prolactin
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
WO1999000150A2 (en) 1997-06-27 1999-01-07 Regents Of The University Of California Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor
US6090584A (en) 1997-08-21 2000-07-18 University Technologies International Inc. Baculovirus artificial chromosomes and methods of use
GB9722604D0 (en) * 1997-10-28 1997-12-24 Cancer Res Campaign Tech Heparin-binding growth factor derivatives
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
WO1999029835A1 (en) 1997-12-08 1999-06-17 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas PURIFIED β1,2-XYLOSYLTRANSFERASE AND USES THEREOF
US7244601B2 (en) 1997-12-15 2007-07-17 National Research Council Of Canada Fusion proteins for use in enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6362276B1 (en) 1998-01-07 2002-03-26 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Degradable heterobifunctional poly(ethylene glycol) acrylates and gels and conjugates derived therefrom
AU2559799A (en) * 1998-01-22 1999-08-09 Genentech Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and humanized anti-il-8 monoclonal antibodies and uses of same
AR014491A1 (es) 1998-01-29 2001-02-28 Dow Agrosciences Llc Metodo para obtener plantas transgenicas fertiles de gossypium hirsutum.
ATE268609T1 (de) 1998-03-12 2004-06-15 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
US6689604B1 (en) 1998-03-20 2004-02-10 National Research Council Of Canada Lipopolysaccharide α-2,3 sialyltransferase of Campylobacter jejuni and its uses
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
CN1230546C (zh) 1998-10-06 2005-12-07 马克·阿龙·埃马尔法尔布 丝状真菌宿主领域的转化系统
US6245539B1 (en) 1998-10-06 2001-06-12 Board Of Trustees Operating Michigan State University Human asparaginyl-tRNA synthetase DNA
EA004789B9 (ru) * 1998-10-16 2017-05-31 Байоджен, Инк. Полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона и их использование
US6374295B2 (en) * 1998-10-29 2002-04-16 Nortel Networks Limited Active server management
DE19852729A1 (de) * 1998-11-16 2000-05-18 Werner Reutter Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung
GB9825105D0 (en) * 1998-11-16 1999-01-13 Andaris Ltd Pharamaceutical conjugates
AU773845B2 (en) * 1998-11-18 2004-06-10 Neose Technologies, Inc. Low cost manufacture of oligosaccharides
MXPA01005515A (es) 1998-12-01 2003-07-14 Protein Design Labs Inc Anticuerpos humanizados para gamma-interferon.
CZ300546B6 (cs) * 1999-01-29 2009-06-10 Amgen, Inc. Fyziologicky aktivní konjugát, prostredek a zpusob prípravy
US6365410B1 (en) 1999-05-19 2002-04-02 Genencor International, Inc. Directed evolution of microorganisms
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
WO2001005434A2 (en) * 1999-07-20 2001-01-25 Amgen Inc. Hyaluronic acid-protein conjugates
US6348558B1 (en) 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
EP2070968A3 (en) 1999-12-22 2013-07-24 Nektar Therapeutics Method for the Preparation of 1-Benzotriazolyl Carbonate Esters of Poly(ethylene glycol)
AU2352201A (en) 1999-12-30 2001-07-16 Maxygen Aps Improved lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators
EP2133098A1 (en) * 2000-01-10 2009-12-16 Maxygen Holdings Ltd G-CSF conjugates
US6423488B1 (en) 2000-01-15 2002-07-23 Avigenics, Inc High throughput screening assay for detecting a DNA sequence
PL206148B1 (pl) * 2000-02-11 2010-07-30 Bayer HealthCare LLCBayer HealthCare LLC Koniugat polipeptydowy, polipeptyd, sekwencja nukleotydowa, wektor ekspresyjny, komórka gospodarz, sposób wytwarzania koniugatu polipeptydowego, środek farmaceutyczny i zastosowanie koniugatu polipeptydowego
WO2001060411A1 (en) 2000-02-18 2001-08-23 Kanagawa Academy Of Science And Technology Pharmaceutical composition, reagent and method for intracerebral delivery of pharmaceutically active ingredient or labeling substance
US7029872B2 (en) 2000-06-28 2006-04-18 Glycofi, Inc Methods for producing modified glycoproteins
JP2004504016A (ja) 2000-06-30 2004-02-12 マキシゲン・エイピーエス ペプチド拡張されたグリコシル化ポリペプチド
WO2002004512A2 (en) 2000-07-10 2002-01-17 Diosynth Rtp, Inc. Purification of human troponin i
AU2001285020A1 (en) 2000-08-17 2002-02-25 Synapse Technologies, Inc. P97-active agent conjugates and their methods of use
WO2002013843A2 (en) 2000-08-17 2002-02-21 University Of British Columbia Chemotherapeutic agents conjugated to p97 and their methods of use in treating neurological tumours
WO2002074806A2 (en) 2001-02-27 2002-09-26 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
ES2411007T3 (es) 2001-10-10 2013-07-04 Novo Nordisk A/S Remodelación y glicoconjugación de péptidos
JP3894776B2 (ja) 2001-11-09 2007-03-22 富士通メディアデバイス株式会社 吐出装置および吐出方法
ATE503498T1 (de) * 2002-06-21 2011-04-15 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylierte glykoformen von faktor vii
WO2004091499A2 (en) * 2003-04-09 2004-10-28 Neose Technologies, Inc. Intracellular formation of peptide conjugates
JP4251399B2 (ja) * 2004-05-21 2009-04-08 独立行政法人産業技術総合研究所 Ｏ結合型糖鎖が付加されたペプチドのスクリーニング方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2042196A3 (en) 2009-07-22
CN105131104A (zh) 2015-12-09
BE2014C004I2 (es) 2021-11-22
EP2305312A3 (en) 2011-06-15
ES2556338T3 (es) 2016-01-15
FR14C0007I2 (fr) 2015-01-02
BRPI0213207B1 (pt) 2021-06-15
PT2279753E (pt) 2016-01-15
IL210257A0 (en) 2011-03-31
JP5376912B2 (ja) 2013-12-25
EP2279755A3 (en) 2011-06-15
CA2462930C (en) 2012-07-10
ZA200402673B (en) 2007-03-28
BR0213207A (pt) 2006-10-31
FR17C1053I2 (fr) 2019-01-11
AU2009202405B2 (en) 2011-09-22
CN102180944A (zh) 2011-09-14
EP1578771A2 (en) 2005-09-28
EP2279753B1 (en) 2015-09-16
ES2564688T3 (es) 2016-03-28
IL210257A (en) 2015-07-30
HK1154498A1 (en) 2012-04-27
NL300912I2 (nl) 2018-09-27
EP2279753A3 (en) 2011-10-12
LU92359I2 (fr) 2014-03-24
EP2305314A3 (en) 2011-09-14
EP2305312B1 (en) 2015-03-04
JP5232352B2 (ja) 2013-07-10
CN1635901A (zh) 2005-07-06
HK1080090A1 (en) 2006-04-21
JP5258809B2 (ja) 2013-08-07
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EP2305313A2 (en) 2011-04-06
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CN1635901B (zh) 2012-03-28
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JP2005521635A (ja) 2005-07-21
EP2292271A3 (en) 2011-09-14
EP2305311A3 (en) 2011-07-20
EP2322229A2 (en) 2011-05-18
DK2322229T3 (en) 2017-03-27
US7416858B2 (en) 2008-08-26
WO2003031464A2 (en) 2003-04-17
EP2305312A2 (en) 2011-04-06
FR14C0007I1 (fr) 2014-02-28
CN101724075B (zh) 2014-04-30

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