EA008220B1 - Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, и способы ее применения - Google Patents

Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, и способы ее применения Download PDF

Info

Publication number
EA008220B1
EA008220B1 EA200400605A EA200400605A EA008220B1 EA 008220 B1 EA008220 B1 EA 008220B1 EA 200400605 A EA200400605 A EA 200400605A EA 200400605 A EA200400605 A EA 200400605A EA 008220 B1 EA008220 B1 EA 008220B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
structures
cells
erythropoietin
molecule
protein
Prior art date
Application number
EA200400605A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200400605A1 (ru
Inventor
Дирк Ян Элбертус Опстелтен
Йохан Кристиан Каптейн
Петрус Кристианус Йоханнес Йосефус Пассир
Роланд Хендрик Петер Брюс
Абрахам Баут
Original Assignee
Круселл Холланд Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/NL2001/000792 external-priority patent/WO2003050286A1/en
Priority claimed from PCT/NL2002/000257 external-priority patent/WO2003089468A1/en
Application filed by Круселл Холланд Б.В. filed Critical Круселл Холланд Б.В.
Publication of EA200400605A1 publication Critical patent/EA200400605A1/ru
Publication of EA008220B1 publication Critical patent/EA008220B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

Настоящее изобретение относится к композиции, включающей эритропоэтинподобные молекулы, выбранные из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина и одного или нескольких производных эритропоэтина, характеризующейся тем, что среднее число Lewis-X-структур в N-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,2, 2,6, 2,7, 3,6, 4,1, 5,7. Также изобретение относится к указанной композиции, в которой N-связанные гликаны в эритропоэтинподобных молекулах представляют собой преимущественно биантенные структуры. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическому препарату, содержащему указанную композицию, к применению указанной композиции в качестве лекарственного средства и к способу профилактического и/или терапевтического лечения нарушений, предусматривающему введение человеку или животному указанной композиции.

Description

Настоящее изобретение относится к области технологии рекомбинантных ДНК. Изобретение также относится к получению белков. Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению рекомбинантных белков для использования их в качестве терапевтически активных компонентов фармацевтического препарата. Настоящее изобретение также относится к линиям клеток млекопитающих, идентифицированным, выбранным и/или созданным для получения рекомбинантных белков. Настоящее изобретение относится также к использованию получаемых таким образом белков.
Предпосылки создания изобретения
Системы рекомбинантной клеточной экспрессии для получения белков известны. Указанные системы включают широкий диапазон от бактерий, дрожжей и грибов до клеток растений, и от клеток насекомых до клеток млекопитающих. Выбор организма-хозяина для целей получения желаемого продукта и системы экспрессии зависит в основном от таких факторов, как легкость их применения, стоимость культивирования, параметры роста клеток, уровень продуцирования и способность расти в бессывороточной среде. Известно, что указанные выше системы клеточной экспрессии различаются также по их способности подвергаться модификациям в ходе трансляции и после трансляции, таким как укладка, фосфорилирование, γ-карбоксилирование и γ-гидроксилирование. Несмотря на признание того факта, что выбор системы рекомбинантной экспрессии может оказывать решающее воздействие на окончательную структуру экспрессированных белков, посттрансляционные модификации в целом не играют определяющей роли в выборе соответствующей системы экспрессии для каждого конкретного белка.
В проведенных ранее исследованиях было выявлено множество фактов, свидетельствующих о сложности процесса дифференциальной посттрансляционной модификации белков человека и их потенциальном участии в функциях человеческого организма. Так, например, результаты проведенных относительно недавно исследований позволяют предположить, что характер дифференциального гликозилирования белков человека, имеющего место в крови (так называемые модификации «сывороточного типа»), отличается от характера указанного гликозилирования, имеющего место в цереброспинальной жидкости в мозге (модификации «мозгового типа»). Указанное различие может быть ключевым моментом, имеющим огромное значение для разработки эффективных терапевтических препаратов.
В целом, гликопротеины нервных клеток человека характеризуются наличием гликозилирования, которое в литературе получило название гликозилирование «мозгового типа» (Матдо1щ апб Матдо118 1989; Нойшап с1 а1. 1994). В отличие от гликозилированных белков «сывороточного типа» (т.е. гликопротеинов, циркулирующих в крови), гликозилированные белки мозгового типа содержат характерные Ν-связанные сахара комплексного типа, которые модифицированы а1,3-связанной фукозой, присоединенной к Ν-ацетилглюкозамину в антенне лактозаминового типа, за счет чего образуются структуры Бс\\'15-х или сиалил-Ьетая-Х-структуры (фиг. 5). Имеются два типа структур Бс\\15-Х: один - с концевым галактозным остатком и один - с концевым Ν-ацетилгалактозаминовым остатком (ОаШас). Если указанные концевые группы присоединены к сиаловой кислоте, образуемая структура Ье^щ-х называется сиалил-Бс\\'15-Х-структурой. Другое различие между олигосахаридами сывороточного типа и мозгового типа заключается в том, что последний часто содержит концевой Ν-ацетилглюкозамин и/или концевую галактозу и может включать модификацию концевого Ν-ацетилгалактозамина, тогда как олигосахариды сывороточного типа обычно содержат только небольшие количества таких структур.
Олигосахариды, которые обычно встречаются в белках, циркулирующих в сыворотке, часто содержат высоко галактозилированные структуры. Это означает, что галактоза присоединяется к периферическому Ν-ацетилглюкозамину, образуя лактозаминовую структуру. Гликопротеин при этом защищается от эндоцитоза с помощью Ν-ацетилглюкозаминовых рецепторов (т.е. рецепторов, которые распознают концевой Ν-ацетилглюкозамин), присутствующих в ретикулоэндотелиальных клетках печени и макрофагах (Апсйотб с1 а1. 1978; 81аЫ с1 а1. 1978). Олигосахариды сывороточного типа обычно также содержат концевые сиаловые кислоты (часто называемые также нейраминовой кислотой), которые защищают гликопротеин от клиренса через асиалогликопротеиновый рецептор. Механизмы указанного клиренса специфически работают с гликопротеинами, циркулирующими в крови, и, вероятно, отсутствуют в центральной нервной системе человека (ЦНС) (Нойшап с1 а1. 1994).
Системы рекомбинатной экспрессии для продуцирования белков, включающих модификации «сывороточного типа», доступны в технике, примерами которых являются клетки яичников китайского хомячка (СНО клетки) и клетки почки детенышей хомячков (ВНК клетки). Однако для продуцирования белков с другими модификациями, такими как модификации «мозгового типа», не описано соответствующих удобных систем. В этой связи, имеется потребность в системах экспрессии, которые принимали бы во внимание различия в посттрансляционных модификациях терапевтических белков. В частности, имеется потребность в эффективной системе экспрессии белков, включающих посттрансляционные модификации «мозгового типа».
Белки, которые удовлетворяют таким специфическим требованиям, могут быть полезными при лечении всех видов расстройств, в число которых входят заболевания, связанные с ЦНС, периферической нервной системой и сердечной тканью. Расстройства, поражающие ЦНС, включают различные виды на
- 1 008220 рушений, таких как острое церебральное нарушение, нейродегенеративные заболевания и другие дисфункции, такие как эпилепсия, шизофрения и расстройства настроения. Другие патологические расстройства, которые могут поражать нервные клетки и ткани, связаны с повреждениями, которые могут возникнуть в результате гипоксии, судорожных расстройств, отравления нейротоксинами, рассеянного склероза, гипотензии, остановки сердца, облучения или гипогликемии. Повреждения нервных клеток также могут возникать при проведении хирургических процедур, таких как устранение аневризмы или резекция опухоли.
Примером белка, играющего разные роли, которые, по меньшей мере частично, связаны с различными посттрансляционными модификациями, является гормон, известный как эритропоэтин (ЭП). ЭП, белок, известный своей ролью в дифференциации гемопоэтических стволовых клеток в эритроциты, имеет несколько иных функций, включая функции в нервной ткани. Было высказано предположение о роли ЭП в развитии ЦНС (Оате е! а1. 2001). Белок ЭП был также обнаружен в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) новорожденных и взрослых людей (1ии1 е! а1. 1997; Виет1 е! а1. 2000). ЭП, присутствующий в ЦСЖ, образуется, скорее всего, локально в головном мозге, поскольку он не проходит через интактный гематоэнцефалический барьер (Май е! а1. 1997; Виет1 е! а1. 2000). Регуляция экспрессии ЭП является тканеспецифичной, что еще больше поддерживает гипотезу о том, что ЭП обладает тканеспецифичными функциями, различающимися в головном мозге и костном мозге (Макиба е! а1. 1999; СЫкита е! а1. 2000; 8акак1 е! а1. 2001). В этой связи, было сделано предположение, согласно которому ЭП, кроме гемопоэтической функции, может играть нейротропную роль. Нейротропные факторы определяются как гуморальные молекулы, действующие на нейроны, влияя на их развитие, дифференциацию, поддержание и регенерацию (КошкЫ е! а1. 1993). Результаты ряда исследований показали, что ЭП может действовать как нейротропный фактор (см., например, 8абато!о е! а1. 1998; Вппек е! а1. 2000). Дополнительно к указанным выше эффектам ЭП на эритропоэз и нейропротекцию описаны другие роли ЭРО, например, в эндотелиальных клетках и мышечных клетках. Установлено в данной области, что эффект (рекомбинантного) ЭП зависит в значительной мере от характера олигосахаридных фрагментов, используемых для гликозилирования белка. Ν-связанные олигосахариды ЭП человека чрезвычайно важны для его известной биологической активности по стимуляции эритропоэза (ТакеиеЫ апб КоЬа!а 1991; \Уак1еу е! а1. 1991; Ткиба е! а1. 1990; Мопто!о е! а1. 1996; ТакеиеЫ е! а1. 1989; М|ка1/1 е! а1. 1995).
В случае ЭП можно выделить ЭП сывороточного типа (или ЭП «почечного типа» или «мочевого типа»), который образуется в почке и циркулирует в крови, и ЭП, который образуется в других видах тканей, таких как головной мозг (ЭП мозгового типа). Системы продукции и очистки ЭП сывороточного типа хорошо известны в данной области техники, и рекомбинантный сывороточный тип ЭП получают рутинными методами и успешно используют, например, в случае пациентов, страдающих в связи с низким уровнем эритроцитов в крови. Установлено в данной области техники, что указанный рекомбинантный ЭП удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к стабильности того белка, который может циркулировать в крови в течение периода времени, достаточного для индукции эритропоэза. Обычно для получения ЭП с указанными характеристиками используют системы на основе клеток СНО или ВНК. Однако сывороточный тип ЭП, получаемый на основе такой системы продукции и очистки, относительно бесполезен при лечении заболеваний, связанных с центральной или периферической нервной системой, а также при лечении нарушений, связанных с расстройствами, вызванными ишемией/реперфузией. Это связано с характером его гликозилирования, который не подходит для лечения указанных расстройств, а также из-за того, что он приводит к повышению числа эритроцитов (эритропоэзу) благодаря своей высокой гемопоэтической активности, которая рассматривается как нежелательный побочный эффект в случае таких не гемопоэтических заболеваний (\У|еккпег е! а1., 2001). В этой связи, существует потребность в новых системах продуцирования белков, таких как ЭП, которые имели бы характерные особенности молекулы ЭП, активной в головном мозге или в тканях, участвующих в основанных на селектине нацеливании или транспорте. Кроме того, существует потребность в фармацевтически приемлемых препаратах белков, таких как ЭП, с посттрансляционными модификациями, отличными от гликозилирования сывороточного типа, предпочтительно имеющими гликозирование мозгового типа, и в эффективных системах продукции и очистки для них.
Другой пример белка, который имеет разный характер гликозилирования в разных тканях, позволяющий предположить разную роль различных видов гликозилирования, является трансферрин, который встречается в значительных количествах в виде асиалотрансферрина в ЦСЖ, но не в виде сывороточного варианта (Уап Бук е! а1. 1983; Нойтап е! а1. 1995).
Определенное семейство гликопротеинов, известное как селектины, играет важную роль на начальных стадиях адгезии лейкоцитов к эндотелию при повреждении ишемией/реперфузией. Известны три представителя семейства селектинов: Р-селектин, Е-селектин и Ь-селектин. Селектины содержат лектиновый домен, который распознает сахарные структуры связывающихся с ними гликопротеиновых лигандов. Предполагается определенная роль сиалил-Бейк-Х-модификаций олигосахаридов при их связывании с селектинами (ЕохаИ е! а1. 1992). Ряд исследований выявили важность селектинов и структур сиалил-Беч1К-Х в адгезии лейкоцитов на моделях ишемии/реперфузии. Было, например, показано, что сиалил-Бейк-Х-олигосахарид 81ех-О8 является кардиопротектором на модели ишемии/реперфузии кошки за
- 2 008220 счет снижения некроза сердечной ткани на 83% (Виегке с1 а1. 1994) . Кроме того, в заявке на патент νθ 02/38168 описывается использование селектинсвязывающих белков, включающих сиалил-Ьеетщ-Хструктуры для использования в качестве противовоспалительных средств при лечении различных заболеваний. Однако подходящие системы экспрессии для получения белков, включающих (сиалил)-ЬеМ8Х-гликаны, еще не описаны. В этой связи, имеется потребность в рекомбинантных системах экспрессии белков с заданными структурами гликозилирования, такими как сиалил-ЬеЩк-Х-структуры. В более общем виде, имеется потребность в системах экспрессии для рекомбинантной продукции белков с заданными посттрансляционными модификациями.
Краткое описание таблиц и чертежей
Таблица I. Сводные данные по маркерным белкам, которые могут использоваться для характеристики клеток.
Таблица II. Ткани, взятые в качестве положительного контроля, которые могут использоваться для некоторых из маркерных белков, приведенных в табл. I.
Таблица III. Подробная информация (с указанием поставщика и каталожного номера) об антителах против маркерных белков, которые могут использоваться для характеристики клеточной линии РЕК.С6™.
Таблица IV. Результаты оценки наличия маркерных белков в РЕК.С6™.
Таблица V. Моносахаридный состав Ν-связанных Сахаров в РЕК.С6™-ЭП и Ергех.
Таблица VI. Распределение Μδ-пиков, наблюдаемых для молекулярных ионов десиалилированных Ν-гликанов, высвобождаемых Ν-гликаназой Е из ЭП, образуемого в ЭМЕМ ЭП-продуцирующим клоном Р7 линии РЕК.С6™. Пики со значениями массы (т/ζ), которые также найдены в Ергех, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом.
Таблица VII. Распределение Μδ-пиков, наблюдаемых для молекулярных ионов десиалилированных Ν-гликанов, высвобождаемых Ν-гликаназой Е из ЭП, образуемого в ЭМЕМ ЭП-продуцирующим клоном Р8 линии РЕК.С6™. Пики со значениями массы (т/ζ), которые также найдены в Ергех, подчеркнуты и выделены жирным шрифтом.
Таблица VIII. ЕИТ-активности в клетках СНО и РЕК.С6™.
Таблица IX. Распределение Μδ-пиков, наблюдаемых для молекулярных ионов десиалилированных Ν-гликанов, высвобождаемых Ν-гликаназой Е из ЭП, фракционированного на АЛЬ-колонке для отбора вариантов с высоким и низким содержанием фукозы.
Таблица X. Относительный уровень экспресии Е1А и морфология продуцирующих ЭП клонов Е1А.ЕРО и Е1А.Е1В.ЕРО НТ1080. Уровень экспрессии Е1А оценивали методом Вестерн-блоттинга. Клоны, помеченные знаком «+», отбирали для анализа продукции ЭП.
Таблица XI. Относительный уровень наличия масс-профилей Ν-связанных Сахаров в ЭП, полученном из НТ1080/Еро-клона 033, НТ1080/Е1А-ЕРО клона 008 и НТ1080/Е1А.Е1В-ЕРО клона 072. Для прогнозирования состава сахаров использовали компьютерную программу ЕхРАку. В таблице указано количество гексозаминов, гексоз и дезоксигексоз, присутствующих в антенне гликанов, и прогнозируемые для них структуры.
Фиг. 1. Масс-спектры Ν-связанных сахаров в Эпрекс, Р7-ЭП (пулы А, В и С) и Р8-ЭП (пулы А, В и С). (А): Эпрекс; (В): Р7, пул А; (С): Р7, пул В; (Ό): Р7, пул С; (Е) : Р8, пул А; (Е) : Р8, пул В; и (О) : Р8, пул С.
Фиг. 2. Содержание сиаловой кислоты в РЕК.С6™-ЭП и СНО-ЭП.
Фиг. 3. Гликановые структуры ЬеЩк-Х, имеющиеся в РЕК.С6™-ЭП.
Фиг. 4. Экспрессия структур ЬеЩк-Х на поверхности клеток РЕК.С6™.
Фиг. 5. Схематическое изображение структур Ье^к-Х и сиалил-ЬеМк-Х.
Фиг. 6. Влияние РЕК.С6™-ЭП и эпрекса на эритропоэз ίη νίνο.
Фиг. 7. Объемы некротизированных при инфаркте зон у неподвергшихся лечению крыс (контроль) и крыс, подвергшихся лечению эпрекс и РЕК.С6™-ЭП, вычисленные на основе карт, полученных путем преобразования аналоговых данных в цифровые (фиг. 7А), и карт Т2, полученных через 24 ч (фиг. 7В) с использованием ЯМР-томографии.
Фиг. 8. Концентрация эпрекса в указанные временные точки после однократной в/в инъекции 150 еИ Эпрекса у трех животных.
Фиг. 9. Хроматограмма РЕК.С6™-ЭП, подвергнутого фракционированию на колонке АЛЬ для разделения форм с высоким и низким содержанием фукозы.
Фиг. 10А. Масс-спектр Ν-связанных сахаров из фракций 1-4, полученных с колонки ААЬ. В. Массспектр Ν-связанных сахаров из фракции 4, полученной с колонки ААЬ в независимом эксперименте.
Фиг. 11. Изображения клона 033 НТ1080/ЕРО (А) и клонов 058 (В) и 026 (С) НТ1080/Е1А.Е1В.ЕРО. Показана их экспрессия Е1А при анализе методом Вестерн-блоттинга (Ό). Клоны, экспрессирующие Е1 А, имеют плоскую морфологию.
Фиг. 12. ВЭАОХ-ПАД профиль Ν-гликанов, высвобождаемых из ЭП, продуцируемого клоном 033 НТ1080/ЕРО и клоном 072 НТ1080/Е1А.Е1В. Линии внизу указывают элюцию незаряженных (0), моно
- 3 008220 заряженных, с двойным, тройным и четверным зарядом гликанов (1-4, соответственно). Отмечается сдвиг менее заряженных Ν-связанных гликанов из клона 072.
Фиг. 13. Ма1Ф-М§ анализ ЭП, продуцируемых 3 разными клонами. Клон 033 НТ1080/ЕРО, клон 008 НТ1080/Е1А-ЕРО и клон 072 НТ1080/Е1А.Е1В-ЕРО. Последние 2 клона демонстрируют более сложный профиль.
Фиг. 14. Профили, полученные при моносахаридном анализе Ν-связанных гликанов из клона 033 НТ1080/ЕРО, клона 008 НТ1080/Е1А-ЕРО и клона 072 НТ1080/Е1А.Е1В-ЕРО. Соотношение указанных моносахаридов (Гис = фукоза, Ο;·11Ν = Ν-ацетилгалактозамин, С1с№с = Ν-ацетилглюкозамин, Са1 = галактоза, Мап = манноза) нормализовано по маннозе.
Фиг. 15. Ма1б1-М8-анализ ЭП, продуцируемых клоном 033 НТ1080/ЕРО (А, В) и клоном 072 НТ1080/Е1А.Е1В-ЕРО (С, Ό) при обработке (В, Ό) или без обработки (А, С) α-фукозидазой. Наблюдались различия только в гликановых профилях ЭП, полученного из клона 072. Выявлено четкое различие между пиками со значениями т/ζ, равными примерно 2039, примерно 2185 и примерно 1892 (С и Ό), что, скорее всего, отражает снижение уровня предполагаемых структур, содержащих антенные дезоксигексозы.
Фиг. 16. Различные изоформы разных препаратов ЭП, разделенных методом ИЭФ. Изоформы ЭП содержат 0-14 сиаловых кислот на молекулу. Вносили указанные ниже образцы (200 еИ на полосу): Эпрекс (А); эпрекс после обработки нейраминидазой (В); СНО-ЭП, общий уровень продукции (С); РЕР.С6ТМ-ЭП (Ό), клон 022; ГгСНО-ЭП (Е).
Фиг. 17. Гематокрит (ГКР (НСР) объемный процент) у крыс, которым инъецировали 5000 еИ/кг Эпрекса, ГгСНО-ЭП. РЕКС6™-ЭП или разбавленный буфер (контроль). У крыс, которым вводили Эпрекс, обнаруживались более высокие значения ГКР, чем в контроле, ГгСНО-ЭП и РЕР.С6™-ЭП (р < 0,001).
Фиг. 18. Процентное содержание ретикулоцитов в крови крыс, которым инъецировали 5000 еИ/кг Эпрекса, ГгСНО-ЭП, РЕР.С6™-ЭП или разбавленный буфер (контроль). У крыс, которым вводили ЭП, обнаруживался более высокий процент ретикулоцитов, чем в контроле (р < 0,001). Процент ретикулоцитов у крыс, которым вводили эпрекс и ГгСНО-ЭП, был значительно выше, чем в случае введения РЕР.С6™-ЭП.
Фиг. 19. Процентное содержание незрелых ретикулоцитов (НЗР) в общей популяции ретикулоцитов через четыре дня после инъекции 5000 еИ/кг Эпрекса, ГгСНО-ЕРО, РЕК..С6™-ЕРО или разбавленного буфера (контроль). У крыс, которым вводили Эпрекс, обнаруживался значительно более высокий процент незрелых ретикулоцитов, чем в контроле, в случае введения ГгСНО-ЕРО или РЕК..С6™-ЕРО (р < 0,001).
Фиг. 20. Сайт расщепления РNС-азой Г (отмеченный Г) и эндогликозидазой Г2 (отмеченный Г2).
Фиг. 21. МАРШ-спектр гликанов из РЕР.С6™-ЭП, высвобождаемых РNС-азой Г (А) и эндогликозидазой Г2 (В). Ось х на нижнем спектре ориентирована таким образом, что соответствующие пики на обоих спектрах находятся непосредственно друг над другом (различие в 349 Да, см. текст).
Фиг. 22. Некоторые моносахаридные связи Ν-концевых гликанов.
Фиг. 23. На верхней части схемы приведены десиалилированные гликаны, высвобождаемые из РЕР.С6™-ЭП; значения в нижней части соответствуют спектру, получаемому после обработки галактозидазой. В скобках указан процент спектров, отражающий соответствующие структуры. Спектры приведены на фиг. 26.
Фиг. 24. В верхней части схемы приведены десиалилированные гликаны, высвобождаемые из РЕР.С6™-ЭП после инкубирования с галактозидазой; значения в средней части соответствуют спектру, получаемому после обработки фукозидазой из почки быка, и значения в нижней части получают после инкубации с С1с№1с-азой. В скобках указан процент спектров, отражающий соответствующие структуры. Спектры приведены на фиг. 26.
Фиг. 25. В верхней части схемы приведены десиалилированные гликаны, высвобождаемые из РЕР.С6™-ЭП после инкубирования с галактозидазой; значения в средней части соответствуют спектру, получаемому после обработки фукозидазой из миндальной муки, и значения в нижней части получают после инкубации с С1с№с-азой. В скобках указан процент спектров, отражающий соответствующие структуры. Спектры приведены на фиг. 27.
Фиг. 26. МАРШ-спектры Ν-связанных гликанов из РЕКС6™-ЭП после экзогликозидазной обработки.
A) РЕР.С6™-ЭП после инкубирования с РNС-азой Г и нейраминидазой.
B) РЕР.С6™-ЭП после инкубирования с РNС-азой Г, нейраминидазой и галактозидазой.
C) РЕР.С6™-ЭП после инкубирования с РNС-азой Г и нейраминидазой и последующей обработки галактозидазой и фукозидазой из почки быка.
Ό) РЕР.С6™-ЭП после инкубирования с РNС-азой Г и нейраминидазой и последующей обработки галактозидазой, фукозидазой из почки быка и С1сNАс-азой.
- 4 008220
Е) РЕВ.С6™-ЭП после инкубирования с ΡΝΟ-азой Е и нейраминидазой и последующей обработки галактозидазой и фукозидазой из миндальной муки.
Е) РЕК.С6™-ЭП после инкубирования с ΡΝΟ-азой Е и нейраминидазой и последующей обработки галактозидазой, фукозидазой из миндальной муки и С1сNΑс-азой.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способам идентификации, отбора и получения клеток млекопитающих, которые способны продуцировать белковые молекулы, такие как пептиды и белки, включающие посттрансляционные модификации, где указанные посттрансляционные модификации заданы заранее и осуществляются в клетке млекопитающего, в которой указанные белковые молекулы экспрессируются. Настоящее изобретение также относится к способам получения и продуцирования белковых молекул, таких как эритропоэтин (ЭП), с использованием клеток млекопитающих, получаемых по способам настоящего изобретения, и в клетках млекопитающих, которые были получены на основе их способности продуцировать белки и/или посттрансляционные модификации, которые являются показательными для заранее заданной посттрансляционной модификации, которая является желательной.
Настоящее изобретение относится к способу продуцирования белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, который включает стадии: обеспечения наличия в клетке млекопитающего, полученной по способу согласно настоящему изобретению, нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу, таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; и культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу продуцирования белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, который включает стадии: идентификации клетки млекопитающего, обладающей способностью продуцировать указанную белковую молекулу с указанной заранее заданной посттрансляционной модификацией; обеспечения наличия в указанной клетке млекопитающего нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; и культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу продуцирования белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, включающему стадии: идентификации клетки млекопитающего, обладающей способностью продуцировать указанную белковую молекулу с указанной заранее заданной посттрансляционной модификацией, обеспечения наличия в указанной клетке млекопитающего нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу, таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы; анализа указанных посттрансляционных модификаций в указанной продуцированной таким образом белковой молекуле; и определения того, включает ли указанная посттрансляционная модификация, имеющаяся в данной белковой молекуле, указанную заранее заданную посттрансляционную модификацию.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клеткам млекопитающих, которые имеют характеристики и свойства нервных клеток, так что может быть получено значительное количество рекомбинантных белков, которые обладают свойствами невронального или мозгового типа. Продуцирование рекомбинантных белков, таких как ЭП мозгового типа, несущих специфические заранее заданные посттрансляционные модификации, теперь становится возможным при использовании способов и средств по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится, кроме того, к способам получения белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, включающим стадии: обеспечения наличия в клетке млекопитающего, полученной по способу настоящего изобретения, нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы, и очистки указанной белковой молекулы из культуры клеток млекопитающих.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способам получения белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, причем указанные способы включают стадии: обеспечения наличия в клетке млекопитающего, полученной по способу настоящего изобретения, нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы; анализа указанных посттрансляционных модификаций в указанной продуцированной белковой молекуле; и определения того, включает ли указанная посттрансляционная моди
- 5 008220 фикация, имеющаяся в указанной белковой молекуле, указанную заранее заданную постгрансляционную модификацию.
Предпочтительно, указанные способы получения белковых молекул включают дополнительную стадию очистки указанной белковой молекулы из культуры клеток млекопитающего. Более предпочтительными являются способы получения белковой молекулы в клетке млекопитающего по настоящему изобретению, в рамках которых указанная клетка млекопитающего иммортализуется и/или экспрессирует последовательности аденовируса Е1А.
Иммортализация или включение последовательностей аденовируса Е1А может иметь место до стадии идентификации полученной клетки млекопитающего, но может также иметь место и после идентификации, отбора и/или получения клетки.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам очистки белковых молекул, где указанные белковые молекулы очищают из культуры клеток на основе заранее заданной посттрансляционной модификации, имеющейся в молекуле, причем указанная заранее заданная посттрансляционная модификация осуществляется в клетке млекопитающего, в которой образуется данная молекула.
Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию композиции на основе эритропоэтинподобных молекул, выбранных из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или более мутеинов эритропоэтина, одного или более производных эритропоэтина или объединения одной или более фракций эритропоэтиновых молекул, содержащих разное количество сиаловых остатков, для получения лекарственного средства, используемого для лечения расстройства, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного нарушения и острого нарушения центральной или периферической нервной системы; причем указанная композиция на основе эритропоэтинподобных молекул имеет в расчете на содержание белка меньшую эритропоэтическую активность ίη νίνο, чем эритропоэтинподобные молекулы, используемые в настоящее время для лечения анемии, такие как эпоэтин альфа и эпоэтин бета. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим такие эритропоэтинподобные молекулы. Настоящее изобретение также относится к способам лечения или профилактики указанных расстройств, включающим введение указанных композиций.
В других аспектах настоящее изобретение относится к способу продуцирования в клетке млекопитающего белковых молекул, требующих наличия гликозилированной структуры, выбранной из группы, состоящей из структур, (сиалил)-Ьсет18-Х и/или ΕαοάίΝΛο. содержащих в Ν-связанных гликанах, который характеризуется тем, что указанная клетка экспрессирует нуклеиновую кислоту, кодирующую Е1А из аденовируса, при условии, что когда указанная белковая молекула представляет собой эритропоэтин, такая клетка млекопитающего не является клеткой РЕК..С6™, когда указанная белковая молекула представляет собой гликоделин или протеин С или метаболический ингибитор тканевого фактора, указанная клетка млекопитающего не представляет собой клетку НЕК293, и когда указанная белковая молекула представляет собой матриксную металлопротеазу 1, указанная клетка млекопитающего не является клеткой НТ1080.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения фракции, обогащенной белковой молекулой, имеющей Ν-связанные гликаны, включающие структуры (сиалил)-Бс^15-Х и/или ΕαοάίΝΑο, включающему стадии: (а) рекомбинантной экспрессии указанной белковой молекулы в клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту, кодирующую Е1А из аденовируса; и (Ь) фракционирования продуцированных таким образом белковых молекул с получением в результате фракции, которая обогащена молекулами, имеющими указанные Ν-связанные гликаны, включающие структуры (сиалил)Бс\\'15-Х и/или ΕαοάίΝΑο.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу фракционирования смеси, включающей белковые молекулы, которые содержат структуры Ьсдак-Х, при этом в указанном способе используется связывание указанных молекул с ААЬ-лектином. В других вариантах осуществления изобретение относится к полученным таким образом фракциям.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композициям, включающим эритропоэтинподобные молекулы, выбранные из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или более мутеинов эритропоэтина и одного или более производных эритропоэтина, отличающихся тем, что среднее число структур ЬсМк-Х на Ν-связанных гликанах в расчете на одну эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,2. В других вариантах осуществления изобретения указанное среднее число составляет по меньшей мере примерно 2,6; 2,7; 3,6; 4,1 или 5,7. В другом аспекте композиции или их фракции по настоящему изобретению используют для получения лекарственного средства.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к использованию эритропоэтина, полученного рекомбинантным способом в клетке млекопитающего, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту, кодирующую Е1 А из аденовируса, для получения лекарственного средства, применяемого для лечения расстройства, выбранного из группы, включающей ишемию, реперфузионное повреждение, расстройство, вызванное гипоксией, воспалительное заболевание, нейродегенеративное нарушение и острое нарушение центральной или периферической нервной системы. В другом варианте настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или терапевтического лечения расстройства, выбранного из группы, со
- 6 008220 стоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративных нарушений и острого нарушения центральной или периферической нервной системы; при этом указанный способ включает стадию введения человеку или животному композиции на основе эритропоэтин-подобных молекул, выбранных из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина и одного или нескольких производных эритропоэтина, где указанная композиция на основе эритропоэтин-подобных молекул характеризуется тем, что ее получают рекомбинантным способом в клетке млекопитающего, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую Е1А из аденовируса. В ряде предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанная клетка представляет собой клетку РЕК..С6™.
Подробное описание изобретения
Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что оно предлагает системы рекомбинантной продукции, подходящие для получения белков с необходимой заранее заданной посттрансляционной модификацией. В первом аспекте такие рекомбинантные системы могут быть получены с использованием способов по настоящему изобретению с целью идентификации систем экспрессии, способных осуществлять посттрансляционную модификацию, требуемую для рассматриваемого белка, или желаемое использование рассматриваемого белка. Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу создания систем экспрессии, обладающих способностью осуществлять желательную посттрансляционную модификацию, требуемого белка. Другие аспекты изобретения включают выделенные белки, содержащие введенные таким образом заранее заданные посттрансляционные модификации, способы их использования и фармацевтические композиции, включающие их. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу идентификации клетки млекопитающего, способной продуцировать белковую молекулу, включающую заранее заданную посттрансляционную модификацию, причем указанный способ включает стадии: (а) анализа посттрансляционной модификации в белке, продуцированном указанной клеткой млекопитающего; и (Ь) определение того, включает ли указанный белок указанную заранее заданную посттрансляционную модификацию.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способу отбора клетки млекопитающего, способной продуцировать белковую молекулу, включающую заранее заданную посттрансляционную модификацию, причем указанный способ включает стадии: (а) анализа наличия или отсутствия тканеспецифического маркера или комбинации тканеспецифических маркеров в указанной клетке млекопитающего или на клеточной поверхности указанной клетки млекопитающего, при том что маркер или комбинация указанных маркеров является показателем способности указанной клетки осуществлять соответствующую необходимую заранее заданную посттрансляционную модификацию в белковой молекуле при продуцировании в указанной клетке, с использованием метода рекомбинантной ДНК и клеточной культуры, хорошо известных специалистам в данной области; и (Ь) отбора указанной клетки млекопитающего на основе наличия или отсутствия указанных тканеспецифических маркеров.
В еще одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения клетки млекопитающего из гетерогенной клеточной популяции, причем указанная клетка млекопитающего способна продуцировать белковую молекулу, включающую заранее заданную посттрансляционную модификацию, при этом указанный способ включает стадии: (а) сортировки клеток на основании наличия посттрансляционных модификаций в белках, продуцируемых указанными клетками, в указанной гетерогенной клеточной популяции; и (Ь) отбора клеток, способных продуцировать белки, включающие указанную заранее заданную посттрансляционную модификацию. Такая сортировка может быть осуществлена с использованием известных в данной области способов, включающих, но не ограничивающих, сортировку клеток с использованием флуоресцентно меченых антител, распознающих заранее заданную посттрансляционную модификацию.
В другом варианте настоящее изобретение относится к способу идентификации клетки млекопитающего, способной продуцировать белковую молекулу, включающую заранее заданную посттрансляционную модификацию, причем указанный способ включает стадии: обеспечения наличия в указанной клетке млекопитающего нуклеиновой кислоты, кодирующей нужный белок, способной включать указанные посттрансляционные модификации таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанного белка; анализа посттрансляционной модификации в указанном белке, продуцированном указанной клеткой млекопитающего; и подтверждения наличия указанной посттрансляционной модификации в указанном белке. В соответствии с другим вариантом, настоящее изобретение относится к способу идентификации клетки млекопитающего, способной к продуцированию белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, причем указанный способ включает стадии: обеспечения наличия в указанной клетке млекопитающего нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную белковую молекулу, способную включать посттрансляционные модификации таким образом, что указанная клетка млекопитающего содержит указанную нуклеиновую кислоту в экспрессируемой форме; культивирования указанной клетки млекопитающего в условиях, подходящих для продуцирования указанной белковой молекулы; анализа посттрансляционной модификации в указанной белковой молекуле, продуцированной указанной клеткой
- 7 008220 млекопитающего; и определения того, включает ли посттрансляционная модификация, имеющаяся в указанной белковой молекуле, указанную заранее заданную посттрансляционную модификацию.
Белковые молекулы в контексте настоящего описания относятся, не ограничиваясь приведенным списком, к молекулам, таким как пептиды, полипептиды и белки, а также к мутантам пептидов, полипептидов и белков (молекулам, включающим делеции, точечные мутации, замены и/или химически индуцированные изменения), при условии, что они дают возможность получения заранее заданной посттрансляционной модификации, то есть имеют требуемое количество аминокислотных остатков в правильном сочетании, обеспечивающем возможность указанной модификации (например, они должны включать последовательность Лки-Х-Бег/Тйг в случае добавления желательной структуры Ν-связанного гликана, которая в таком случае может быть присоединена к остатку Αδη). Указанный термин относится также к пептидам, полипептидам и белкам, содержащим маркеры и/или другие протеиновые и непротеиновые метки (например, радиоактивные соединения). Примером такого белка является ЭП человека, который включает, помимо почечного или сывороточного типов, формы других фенотипов, такие как форма мозгового типа. Другие не ограничивающие примеры классов белков, которые обладают определенными характеристиками, которые способны играть важную роль в функционировании белков в некоторых тканях и которые должны (в случае рекомбинантной экспрессии) содержать заранее заданные посттрансляционные модификации для соответствующей функции, включают моноклональные антитела, нейротрофины, цитокины, инсулиноподобные факторы роста, β-ТОР-подобные факторы роста, факторы роста фибробластов, эпидермальные факторы роста, гепарин-связывающие факторы роста, лиганды рецептора тирозинкиназы и другие трофические факторы. Большинство указанных факторов ассоциируются с болезненными синдромами и, в этой связи, большая часть белков может использоваться в рекомбинантной форме для лечения людей, при условии что указанные белки содержат посттрансляционные модификации, необходимые для активности ίη νίνο. Указанные белки должны, в этой связи, продуцироваться системами экспрессии, которые способны обеспечить желательные посттрансляционные модификации. Примерами таких белков служат, не ограничиваясь приведенным списком, трансферрин, гликоделин, фактор роста нервных клеток (ΝΟΡ), нейротропный фактор из головного мозга, нейротропин-3, -4/5 и -6, цилиарный нейротропный фактор, фактор ингибирования лейкоза, кардиотрофин-1, онкостатин-М, некоторые интерлейкины, ОМ-С8Р, С-С8Р. ЮР-1 и -2, ТСР-β. глиальный нейротропный фактор, нейртурин, персефин, миостатин, фактор роста фибробластов-1, -2 и -5, амфирегулин, фактор, индуцирующий активность рецептора ацетилхолина, нетрин-1 и -2, нейрегулин-2 и -3, плейотрофин, мидкин, фактор стволовых клеток (8СР), агрин, С8Р-1, ΡΌΟΡ и сапозин С. Моноклональные антитела, используемые в настоящем изобретении, относятся к человеческим и гуманизированным антителам, к их частям и к их эквивалентам, таким как одноцепочечные фрагменты Ρν (δοΡν), фрагменты РаЬ, участки СОЯ, вариабельные участки, легкие цепи и тяжелые цепи или любой другой формат, пригодный для использовании в качестве специфического лиганда.
В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления предлагаются системы продуцирования, которые способны создавать структуры ЬеЮк-Х и/или ΡαοάίΝΑο в белках, способных включать структуры Ν-связанных гликанов. Согласно настоящему изобретению, такие системы экспрессии могут быть идентифицированы, отобраны или специальным образом сконструированы. Примером такого целевого конструирования является введение в клетку млекопитающего нуклеиновой кислоты, включающей последовательность Е1А аденовируса, так, что указанная последовательность Е1А экспрессируется в указанной клетке млекопитающего. Примерами уже существующих подобных клеток являются НЕК293, РЕЯ.С6™, 911. Хотя указанные клеточные линии сами по себе известны и уже использовались для получения белка (Уап беп №еи\\'еп1тоГ е1 а1., 2000; АО 00/63403; Опппе11 е1 а1., 1994), решающее воздействие Ε1Α на способность вводить структуры ЬеЮк-Х и/или Ρ;·ιο6ίΝΑο в продуцируемые белки до сих пор еще не было признано.
Посттрансляционная модификация в контексте настоящего описания относится к любой модификации, которая присутствует в указанной белковой молекуле. Она также относится к модификациям, которые вводятся во время или после трансляции указанной молекулы с РНК ίη νίνο или ίη νίίτο. Такие модификации включают, не ограничиваясь приведенным списком, гликозилирование, образование складчатой структуры, фосфорилирование, γ-карбоксилирование, γ-гидроксилирование, мультимеризацию, образование сульфидных мостиков и, например, такие формы процессинга, как вырезание или добавление одной или более аминокислот. Заранее заданная посттрансляционная модификация в контексте настоящего изобретения относится к любой посттрансляционной модификации, которая полезна для целей выбранного лечения. Согласно предпочтительному варианту осуществления, заранее заданная посттрансляционная модификация относится к форме модификации, которая делает модифицированный белок особенно полезным для лечения заболеваний специфических тканей, органов, компартментов и/или клеток организма человека или животного. Белковая молекула, содержащая такие заранее заданные посттрансляционные модификации, может в результате не оказывать заметного эффекта (такого как вредные или нежелательные побочные эффекты) на ткань, орган, компартмент и/или клетку, которые отличны от таковых, подлежащих лечению. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобрете
- 8 008220 ния, заранее заданная посттрансляционная модификация дает белок, включающий заранее заданную посттрансляционную модификацию, который более быстро выводится из крови, то есть снижаются нежелательные побочные эффекты. Заранее заданная посттрансляционная модификация будет более полно описана далее, но в целом может быть охарактеризована как желательное состояние, которое требуется для соответствующей и желательной активности белковой молекулы, включающей такую заранее заданную посттрансляционную модификацию, означая, что детальные модификации, присутствующие в интересующей белковой молекуле, необязательно должны быть полностью понятными и/или определенными, главное, чтобы достигалась желаемая активность. Примерами желательных модификаций по типу гликозилирования в О-и/или Ν-гликанах, в зависимости от целей использования, могут служить такие структуры как ЬеМк-Х, сиалил-ЬеМк-Х, ОаШас, ΟΙοΝαο. ΕαοάίΝΛο. а-1,3-связанная фукоза, присоединенная к Ν-ацетилглюкозамину, концевому Ν-ацетилглюкозамину, концевой галактозе, находящемуся посередине Ν-ацетилглюкозамину, сульфатной группе и сиаловой кислоте.
Клетки млекопитающих по настоящему изобретению представляют собой предпочтительно клетки человека или человеческого происхождения для целей продукции белков человека с целью получения белков, которые с наибольшей вероятностью обладают характеристиками клеток организма млекопитающего и предпочтительно человека. Для получения белковых молекул, которые должны обладать посттрансляционными модификациями нервных клеток, предпочтительно использовать клетки, которые обладают невральными характеристиками, такими как белковые маркеры, являющиеся показательными для нервных клеток. Это не исключает того, что не нервные клетки могут быть чрезвычайно полезными для продукции белков, включающих посттрансляционные модификации невронального типа. Это зависит от активности белка, которая, в свою очередь, требует выбрать, идентифицировать или получить клетку, которая способна продуцировать такие посттрансляционные модификации.
Поскольку требуется производить большие количества белков в том случае, когда они применяются для терапевтических целей, предпочтительно, чтобы клетки млекопитающих по настоящему изобретению были иммортализованы. Иммортализация может быть осуществлена многими способами. Примеры способов получения иммортализованных клеток включают активную трансформацию покоящейся клетки в делящуюся клетку путем добавления нуклеиновых кислот, кодирующих трансформирующий и/или иммортализующий белки, или путем химической обработки, посредством которой эндогенные белки становятся трансформирующими, или путем отбора клеток из опухолевого материала. Один предпочтительный способ иммортализации неопухолевых клеток заключается в добавлении участка Е1 аденовируса, как было показано для клеточных линий, таких как 911 и РЕК.Сб™. Известны другие способы иммортализации клеток, такие как трансформация с использованием последовательностей, кодирующих некоторые белки папилломавируса человека (НРУ) (например, из клеток НеЬа). Добавление некоторых вирусных белков, таких как Е1 из аденовируса, также может быть полезно для целей продуцирования рекомбинантных белков, поскольку многие такие белки обладают способностью к активации транскрипции, а также антиапоптозным эффектом. В настоящее время было неожиданно показано, что экспрессия Е1А аденовируса в клетке-хозяине, используемой в качестве экспрессирующей системы по настоящему изобретению, изменяет характеристики системы экспрессии так, что она приобретает способность вносить Ν-связанные структуры гликозилирования, которые включают ЬеМк-Х и/или ΕαοάίΝΑο.
Подходящей клеточной линией для использования в способах получения требуемых белковых молекул, включающих Ν-связанные гликаны, содержащие ЬеМк-Х и/или ΕαεάίΝΑε, является РЕК.Сб™, депонированная под № 96022940 в Европейской коллекции культур животных клеток (Еигореап Со11есΐίοη о£ Ашта1 Се11 СиЙигек) Центра прикладной микробиологии и исследований (Сейег £ог Аррйеб ΜίсгоЫо1оду апб Кекеагсй). Другие подходящие клеточные линии, относящиеся к данному аспекту настоящего изобретения, включают НЕК293, 911 и другие клетки млекопитающих, которые могут быть модифицированы путем введения в одну или несколько указанных клеток или их предшественников нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательности аденовирусной Е1 А в экспрессируемом формате. Необязательно включаются последовательности Е1 В экспрессируемого формата, которые могут быть полезными в связи с антиапоптозным эффектом, свойственным Е1 В, который противодействует потенциальным апоптозным эффектам, возникающим при экспрессии Е1 А.
Способы продуцирования белковых молекул по настоящему изобретению могут также включать дополнительную стадию очистки указанных белковых молекул из культуры клеток млекопитающих. Очистка в контексте настоящего описания может быть проведена путем использования традиционных способов, которые известны в данной области техники, однако предпочтительно использование способов очистки, которые включают стадию, на которой используются посттрансляционные модификации, имеющиеся внутри и/или на указанных белковых молекулах. Еще более предпочтительными являются способы очистки, которые включают стадию, на которой используются заранее заданные посттрансляционные модификации, имеющиеся внутри и/или на указанных белковых молекулах. В случае использования способов аффинной очистки, предпочтительно использовать антитела или другие связующие вещества, такие как лектины, специфичные для определенных углеводных фрагментов, и которые направлены против определенных типов посттрансляционных модификаций. Примерами таких антител служат антитела, направленные против структур (сиалил)-ЬеМ8-Х, структур 1асШХАс или структур ОаШас
- 9 008220
ЬеЩк-Х. Неограничивающими примерами лектинов, используемых согласно указанному аспекту настоящего изобретения, являются АЛЬ и селектины, такие как Е-селектин, Р-селектин и Ь-селектин.
Использование таких связующих соединений позволяет очищать (рекомбинантные) белки так, что при этом высокий процент очищенного белка содержит желательную заранее заданную посттрансляционную модификацию. Еще более предпочтительными являются способы, в рамках которых белковую молекулу очищают до гомогенности. Примеры способов очистки белков из культуры клеток млекопитающих приведены в настоящем изобретении, и они охватывают случаи применения способов аффинной хроматографии для очистки ЭП, гликозилированого по мозговому типу, с использованием антител или лектинов, распознающих структуры ЬеЩк-Х, имеющиеся в Ν-гликанах рекомбинантно полученного продукта.
Настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемой композиции, включающей белковую молекулу, имеющую заранее заданную посттрансляционную модификацию, которую получают по способу настоящего изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители известны специалистам в данной области. В предпочтительном варианте осуществления указанная белковая молекула в указанной фармацевтически приемлемой композиции представляет собой эритропоэтин. Согласно настоящему изобретению, эритропоэтин, продуцируемый в клетках с маркерами неврального белка требует посттрансляционной модификации, которая будет активна в нервной ткани или в нервных клетках. Однако, эти посттрансляционные модификации несравнимы с посттрансляционными модификациями, наблюдаемыми в ЭП, который циркулирует в крови.
Эритропоэтический эффект ЭП, продуцируемого в клетках с маркерами неврального белка, проявляется значительно слабее. В соответствии с настоящим изобретением, в настоящее время имеется достаточно обоснованное предположение о том, что это связано с отсутствием высокого процента сиаловых кислот и/или с наличием характерных особенностей структур мозгового типа, таких как структуры ЬеЩк-Х или концевые галактозиды. Указанное свойство является полезным, поскольку такой ЭП мозгового типа может использоваться в относительно высоких дозировках при лечении расстройств, связанных с нервной тканью, или при лечении повреждений ткани, вызванных ишемией (таких как ишемическая болезнь сердца), и в то же время имеет значительно сниженное воздействие на эритропоэз по сравнению с препаратами ЭП, доступными в настоящее время. Настоящее изобретение относится к рекомбинантному эритропоэтину, включающему по меньшей мере одну посттрансляционную модификацию, выбранную из группы, состоящей из: структуры сиалил-Ье^к-Х, структуры Ьетек-Х, а-1,3-связанной фукозы, присоединенной к Ν-ацетилглюкозамину, структуры ΕαοάίΝΛο. концевой Νацетилглюкозаминовой группы и концевой галактозной группы. Указанный рекомбинантный эритропоэтин может продуцироваться в клетке млекопитающего, получаемой по настоящему изобретению, а также в клетках млекопитающих, известных ранее, но которые ранее не признавались как пригодные для данной цели. Одним из примеров являются клетки РЕВ.Сб™. Настоящее изобретение, в соответствии с еще одним вариантом его осуществления, также относится к использованию клеток РЕКСб™ для продуцирования белковой молекулы, включающей заранее заданную посттрансляционную модификацию, и предпочтительно, чтобы указанная белковая молекула быстро выводилась из кровотока и/или могла использоваться в высокой дозировке. В случае ЭП, образуемого РЕКСб™, могут использоваться высокие дозировки для лечения или профилактики острых нарушений, связанных с гипоксией, при этом ограничиваются нежелательные побочные воздействия на эритропоэз.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения белковые молекулы по настоящему изобретению пригодны для лечения человека или организма человека путем хирургии, терапии или для диагностики. Предпочтительно ЭП-подобные молекулы по настоящему изобретению используют при производстве лекарственного средства для лечения расстройства, вызванного гипоксией, нейродегенеративных поражений или острого нарушения центральной или периферической нервной системы. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные белковые молекулы, такие как ЭП, используют при производстве лекарственного средства для лечения ишемии и/или реперфузионных повреждений. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные белковые молекулы, такие как ЭП, используют при производстве лекарственного средства для лечения иммунного расстройства и/или воспалительного заболевания.
В настоящем описании раскрываются способы и композиции для продуцирования и производства рекомбинантных белков. Настоящее изобретение особенно полезно для целей получения белков, которые должны подвергаться модификации в процессе трансляции и/или посттрансляционным модификациям, таким как гликозилирование и соответствующая складчатость, и относится также к использованию клеток человека, способных продуцировать модификации мозгового типа на белковых молекулах в процессе трансляции и/или после трансляции. Указанные клетки могут, например, использоваться для получения гликопротеинов человека, имеющих особенности, свойственные нервным клеткам, которые могут быть терапевтически полезны в связи с их неврональными особенностями.
Настоящее изобретение также относится к использованию линии клеток человека, имеющих характеристики нервных клеток, которые модифицируют рекомбинантно экспрессируемые белки с получением неврональных свойств, таких как посттрансляционные модификации мозгового типа или невро
- 10 008220 нального типа, такие как гликозилирование, фосфорилирование или образование складчатой структуры. Пример такой клеточной линии, названной РЕК..С6™ (Патент США № 6033908), был создан путем иммортализации эмбриональных клеток сетчатки человека с использованием конструкции, содержащей гены Е1 аденовируса. Ранее было доказано, что клетки РЕК..С6™ особенно подходят для получения рекомбинантных белков человека в связи с высоким выходом белков, таких как ЭП человека, причем при этом могут быть получены полностью сформированные человеческие моноклональные антитела (описано в АО 00/63403). Настоящее изобретение указывает, что рекомбинантные белки, продуцируемые клетками РЕК.С6™, могут приобретать определенные тканеспецифические свойства, такие как характеристики нервных клеток (например, посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование). Такой пример иллюстрируется образованием белка, который содержит олигосахариды так называемого мозгового типа. Показано, что ЭП человека, продуцируемый клетками РЕК..С6™, модифицируется с помощью Ν-связанных Сахаров, которые существенно отличаются от Ν-связанных Сахаров, обнаруженных в мочевом ЭП человека или в рекомбинантном ЭП человека, продуцируемом клетками яичника китайского хомячка (СНО) или клетками почек детенышей хомячка (ВНК). Мочевой ЭП человека и рекомбинантный ЭП человека, продуцируемый в клетках СНО и ВНК, содержит структуры гликозилирования, которые могут быть обозначены как олигосахариды почечного типа или сывороточного типа. В типичном случае, Ν-связанные сахара указанных препаратов ЭП, продуцируемых в клетках СНО и ВНК, очень сильно разветвлены, в высокой степени галактозилированы и в высокой степени сиалилированы, при том, что они не содержат периферической а-1,3-связанной фукозы (Ткиба е! а1., 1988; ТакеисЫ е! а1., 1988; ΝίιηΙζ е! а1., 1993; Аа!коп е! а1., 1994; К.айЬек-№екеи е! а1., 1997).
В настоящем изобретении была определена природа олигосахаридов, связанных с ЭП человека, продуцируемым РЕК..С6™, и было показано, что она существенно отличается от природы олигосахаридов, присутствующих в мочевом ЭП человека и в рекомбинантном ЭП человека, продуцируемом в клетках СНО и ВНК. Во-первых, среднее содержание сиаловой кислоты в олигосахаридах в продуцируемом РЕК..С6™ ЭП человека значительно ниже, чем среднее содержание сиаловой кислоты в мочевом ЭП человека или в рекомбинантном ЭП человека (из клеток СНО или ВНК). Очень низкое содержание сиаловой кислоты в ЭП человека, продуцируемом РЕК..С6™, является показательным для наличия Νсвязанных олигосахаридов, которые содержат концевую галактозу, и/или Ν-ацетилгалактозамин, и/или Ν-ацетилглюкозамин. Во-вторых, Ν-ацетилгалактозамин был обнаружен в значительных количествах в Ν-связанных сахарах в ЭП человека, продуцируемого РЕК..С6™, тогда как Ν-ацетилгалактозамин не был обнаружен в Ν-связанных сахарах мочевого ЭП человека и рекомбинантного ЭП человека, продуцируемого клетками СНО. Было сообщение о наличии лишь следовых количеств Ν-ацетилгалактозамина в Νсвязанных сахарах в нескольких партиях рекомбинантного ЭП человека, продуцируемого в клетках ВНК (ΝίιηΙζ е! а1., 1993). В-третьих, Ν-связанные сахара в ЭП человека, продуцируемого в РЕК..С6™, содержат, как было показано, очень большое количество фукозы. Фракция фукоз соединяется а-1,3-связью с периферическим Ν-ацетилглюкозамином, образуя таким образом так называемую структуру ЬеМк-Х (фиг. 5). Никогда ранее не сообщалось о наличии структур ЬеМк-Х в мочевом ЭП человека или в рекомбинантном ЭП человека, продуцируемом в клетках СНО и ВНК. Структуры (сиалил)-ЕеМ8-Х, присутствующие на ЭП по настоящему изобретению, делают такой ЭП пригодным для связывания с селектинами, и предполагается дальнейшее его применение в кардиопротекции.
В связи с тем, что связанные с белком олигосахариды оказывают громадное воздействие на физикохимические свойства полипептида, такие как третичная структура, растворимость, вязкость и заряд, продуцируемый РЕК..С6™ ЭП человека имеет физико-химические свойства, которые существенно отличаются от таковых у мочевого ЭП человека и рекомбинантного ЭП человека, продуцируемого клетками СНО и ВНК (Тоуоба е! а1., 2000). Так, ЭП человека, продуцируемый РЕК..С6™, явно отличается заметно более низким зарядом, чем у мочевого ЭП человека и рекомбинантного ЭП человека, продуцируемого клетками СНО и ВНК, в связи с более низким содержанием сиаловой кислоты, и он может быть более гидрофобным в связи с очень высоким содержанием фукозы. В результате, среднее значение ИЭТ для ЭП человека, продуцируемого РЕК.С6™, значительно выше, чем среднее значение ИЭТ для мочевого ЭП человека и рекомбинантного ЭП человека, продуцируемого клетками СНО и ВНК. Поскольку имеющиеся в ЭП гликаны, в частности сиаловые кислоты, также оказывают воздействие на связывание с рецептором ЭП, ожидается, что ЭП человека, продуцируемый РЕК..С6™, имеет иную аффинность для рецептора ЭП, чем мочевой ЭП человека и рекомбинантный ЭП человека, продуцируемый клетками СНО и ВНК. Несмотря на то, что получение ЭП с использованием клеток РЕК..С6™ было описано ранее (АО 00/63403), в указанном документе не раскрывается никаких структурных особенностей продуцируемого ЭП. В этой связи полученные в настоящем изобретении данные подтверждают вывод о том, что возможность получения ЭП с использованием клеток РЕР.С6™ делает его пригодным для совершенно нового применения, в особенности там, где эритропоэз рассматривается как (нежелательный) побочный эффект. Разумеется, для других белков также можно получить определенную пользу на основании представленных в настоящем изобретении результатов. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предлагается способ получения требуемого белка, включающего Ν-гликаны, содержащие ЬеМк-Х и/или Ετκ6ίΝΛ^ с
- 11 008220 использованием РЕК.С6™ или любых клеток млекопитающих, экспрессирующих Е1А. Примерами белков, которые могут приобрести полезные свойства благодаря наличию таких структур и, в этой связи, могут быть получены с использованием названных клеток, являются эритропоэтин, трансферрин, гликоделин, такой как гликоделин А (РР14), фактор роста нервных клеток (ΝΟΕ), нейротропный фактор из головного мозга, нейротрофин-3, -4/5 и -6, цилиарный нейротропный фактор, фактор ингибирования лейкоза, кардиотропин-1, онкостатин-М, интерлейкин, СМ-С8Б, С-С8Б, 1СР-1 и -2, ТСР-β, глиальный нейротропный фактор, нейртурин, персефин, миостатин, фактор-1, -2 и -5 роста фибробластов, амфирегулин, фактор, индуцирующий активность рецептора ацетилхолина, нетрин-1 и -2, нейрегулин-2 и -3, плейотропин, мидкин, фактор стволовых клеток (С8Б), агрин, С8Б-1, РЭСР. сапозин С, рецептор-1 растворимого комплемента, альфа-1 кислый гликопротеин, протеины острой фазы, лиганд-1 Е-селектина, ЬАМ-1, карциноэмбриональные антигеноподобные антигены СЭ66, аддресин периферического лимфатического узла, СИ75, СЭ76, СИ45КО, СЭ21, гликопротеиновый лиганд-1 Р-селектина, С1уСАМ-1, гликопротеины муцинового типа, СИ34, подокаликсин, а1-антихимотрипсин, ингибитор αΐ-протеазы, αамилаза, гликопротеины слюнной железы, обогащенные пролином, 8ЕКР-1, интерферон-β, β-следовый протеин, протеин С, урокиназа, гликопротеин из ЗсЫйокоте, гликоделин А, ингибитор метаболизма тканевого фактора, α-фетопротеин, белки беременности человека, такие как гонадотропные гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), человеческий хориогонадотропин (чХГ) или фрагменты, или варианты любого из указанных веществ, которые способны включать указанные структуры гликозилирования. Используемые в настоящем изобретении фрагменты представляют собой части белка и могут быть пептидами из нескольких аминокислот, простирающимися до почти целых белков. Варианты могут представлять собой мутеины, белки слияния, белки или пептиды, сопряженные с другими небелковыми фрагментами, и т.п. Такие фрагменты или варианты по настоящему изобретению должны обладать способностью подвергаться посттрансляционным модификациям.
В других аспектах настоящего изобретения, предлагаются способы получения фракции, обогащенной белковой молекулой, содержащей Ν-связанные гликаны, включающие (сиалил)-Бе\\'15-Х и/или Еасб1№с-структуры, включающие стадии: (а) рекомбинантной экспрессии указанной белковой молекулы в клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту, кодирующую Е1А из аденовируса; и (Ь) фракционирования продуцированных таким образом белковых молекул с получением фракции, которая обогащена молекулами, содержащими указанные Ν-связанные гликаны, включающие структуры (сиалил)ЬеЩк-Х и/или Ьасб1№с. Указанные выше белковые молекулы могут приобретать полезные свойства при реализации указанного аспекта настоящего изобретения. Было описано, что белок С, продуцированный клетками НЕК293 и впоследствии очищенный из них, содержит определенную структуру гликозилирования, включающую структуры СаШАс-Бе\\35-Х (Сгшие11 е1 а1. , 1994), но выделенные и очищенные белки не были, как предполагалось, обогащены сахарами указанного типа, в результате чего данные клетки не были выбраны в качестве клеток-продуцентов, которые экспрессируют Е1А. Достоинством настоящего изобретения является раскрытие того факта, что клетки млекопитающих, экспрессирующие аденовирусный Е1А, могут использоваться для продукции белков с Ν-связанными гликанами, включающими планируемые структуры (сиалил)-Бе\\'15-Х и/или ЕасФИАс, и далее для обогащения указанными структурами определенных фракций. Предпочтительно указанные фракции обогащаются по способу, включающему стадию аффинной очистки, на которой используются желательные гликановые структуры, такие как использование связывания с лектином или с моноклональным антителом, которые взаимодействуют с указанными Ν-связанными гликанами, содержащими структуры (сиалил)-Бе\\'15-Х и/или ЬасФИАс. В настоящем изобретении показано, что использование указанных способов создания ЭП делает возможным получение фракций ЭП с определенными профилями гликозилирования. В этой связи, одним из аспектов настоящего изобретения является предложение композиций, включающих эритропоэтинподобные молекулы, выбранные из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина и одного или нескольких производных эритропоэтина, отличающихся тем, что среднее число структур Бе\\'15-Х на Ν-связанных гликанах в расчете на одну эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,2. В других вариантах осуществления указанное среднее число структур Бе\\'15-Х на Ν-связанных гликанах в расчете на одну эритропоэтин-подобную молекулу составляет, по меньшей мере, примерно 2,6; 2,7; 3,6; 4,1 или 5,7. Такие композиции могут быть ценным инструментом для медицинских применений, раскрытых в настоящем описании.
Кроме того, настоящее изобретение раскрывает использование белков мозгового типа, продуцируемых в нервных клетках человека, для лечения ишемии/реперфузионного повреждения у млекопитающих, особенно у людей. Ишемия/реперфузионное повреждение в контексте настоящего описания определяется как повреждение клеток, которое происходит после реперфузии ранее жизнеспособных ишемических тканей. Ишемическое/реперфузионное повреждение связано, например, но не ограничивается приведенным списком, с тромболитической терапией, коронарной ангиопластикой, перекрестным шунтированием аорты, сердечно-легочным шунтированием, трансплантацией органов или тканей, травмами и шоком.
- 12 008220
Настоящее изобретение относится к использованию продуцируемых в клетках млекопитающих терапевтических белков с олигосахаридами мозгового типа. Указанные олигосахариды мозгового типа включают, в частности, Ьетак-Х-структуры, сиалил-Ьетак-Х-структуры или их производные, содержащие структуру (сиалил)-Ье^18-Х, применяемые для лечения ишемии/реперфузионного повреждения у млекопитающих, таких как люди. Присутствие сиалил-Ье^к-Х-структур на рекомбинантных белках нацеливает данные белки на поврежденный сайт, содержащий ишемию/реперфузию, и в этой связи, их протекторное воздействие в отношении ишемии/реперфузии оказывается более эффективным, чем у белков, не содержащих (сиалил)-Ье^18-Х-структур. Присутствие олигосахаридов мозгового типа на рекомбинантно экспрессированных белках проиллюстрировано в настоящем изобретении эритропоэтином (ЭП), который продуцируется клетками РЕК.Сб™. Указанный конкретный тип ЭП содержит Ьетак-Х-, а также сиалил-Ьетая-Х-структуры. В настоящем изобретении описаны эксперименты, которые показывают улучшенные свойства ЭП мозгового типа (или невронального типа) из клеток РЕК.Сб™ по сравнению с ЭП сывороточного типа (или почечного типа) в отношении кардиопротекторной функции на моделях ίη νίνο ишемии/реперфузионного повреждения сердечной ткани и кровоизлияния.
Другим достоинством настоящего изобретения является то, что продуцируемый клетками РЕК.Сб™ ЭП человека имеет нейротропную активность. Продуцируемый РЕК.Сб™ ЭП придает белку ЭП физикохимические, и/или фармакокинетические, и/или фармакодинамические преимущества при функционировании в качестве нейротропного и/или нейропротекторного средства. Продуцируемый клетками РЕК.Сб™ ЭП имеет большую аффинность в отношении нервных клеток и для рецепторов ЭП на нервных клетках, чем гликозилированный рекомбинантный ЭП человека сывороточного типа с высоким уровнем сиалилирования, продуцируемый клетками СНО и ВНК. Рекомбинантный ЭП человека, продуцируемый в клетках, отличных от нервных (Ποιο е! а1., 1998), имеет более низкую аффинность в отношении рецепторов ЭП на нервных клетках, чем в отношении рецепторов ЭП на эритроидных клеткахпредшественниках (Микаба е! а1., 1993 и 1994).
Нейропротекторная роль ЭП четко открывает новые возможности использования рекомбинантного ЭП человека в нейропротекторной терапии в ответ на воздействие токсичных химических соединений, которые могут быть индуцированы воспалением или гипоксией и/или ишемией, или в случае нейродегенеративных нарушений. И еще важным недостатком является тот факт, что при использовании в качестве нейропротекторного средства рекомбинантный ЭП, присутствующий в кровотоке, может также приводить к повышению массы эритроцитов или гематокрита. А это, в свою очередь, ведет к повышению вязкости крови, что может оказывать пагубное действие, приводя к ишемии мозга (^еккпег е! а1., 2001).
Настоящее изобретение относится к решению проблемы, связанной с тем, что применявшийся в качестве нейропротекторного средства рекомбинантный ЭП человека оказывал нежелательный гематотропный побочный эффект (^еккпег е! а1., 2001). Так, было показано, что продуцируемый клетками РЕК.Сб™ гликозилированный рекомбинантный ЭП человека мозгового типа имеет высокий потенциал в качестве средства для нейрогенеза и/или нейропротекторного средства, поскольку он имеет низкий потенциал по стимуляции эритропоэза.
В соответствии с настоящим изобретением ЭП, продуцируемый в клетке млекопитающего, которая экспрессирует Е1А, такой как продуцируемый клетками РЕК.Сб™ ЭП, может вводиться системно (внутривенно, внутрибрюшинно, внутрикожно) для ингибирования, предупреждения и/или восстановления повреждения нервной ткани, которое, в свою очередь, вызывается, например, острым повреждением головы и мозга или нейродегенеративными расстройствами. Настоящее изобретение также относится к продуктам, которые могут использоваться для модулирования функции тканей, которые могут получить тяжелые повреждения при гипоксии, таких как центральная и периферическая нервная система, ткань сетчатки и сердечная ткань млекопитающих. Такие ткани могут быть поражены заболеванием, но могут также быть нормальными и здоровыми. Расстройства, которые можно лечить с использованием продуктов, предлагаемых по настоящему изобретению, могут возникать в результате повреждений головы, мозга и/или сердца, нейродегенеративных заболеваний, судорожных расстройств, отравления нейротоксинами, гипотензии, остановки сердца, облучения, рассеянного склероза и/или от повреждений, связанных с гипоксией. Гипоксия может быть результатом пренатального или постнатального недостатка кислорода, удушения, эмфиземы, септического шока, остановки сердца, асфикции, утопления, кризиса при серповидно-клеточной анемии, респираторного дистресс-синдрома взрослых, аритмии, азотного наркоза, постхирургической дисфункции распознавания, отравления окисью углерода, вдыхания табачного дыма, хронического обструктивного заболевания легких, анафилактического шока или инсулинового шока. Судорожные расстройства включают, не ограничиваясь приведенным списком, эпилепсию, хроническое судорожное расстройство или конвульсии. В том случае, когда указанные патологии являются результатом нейродегенеративных заболеваний, указанное расстройство может быть связано со слабоумием при СПИДе, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Крейтцфельда-Якоба, кровоизлиянием, церебральным параличом, травмой спинного мозга, травмой головного мозга, связанной с возрастом утратой познавательной функции, амиотрофным латеральным склерозом, алкоголизмом, ишемией сетчатки, глаукомой, общим снижением уровня нейронов, потерей памяти или старением. Другие примеры заболеваний, которые можно лечить продуктами по настоящему изобретению, включают аутизм, депрес
- 13 008220 сию, тревожные расстройства, расстройства настроения, гиперактивность со снижением внимания (ΑΌΗΌ) и расстройство познавательной способности.
ЭП из клеток РЕК..С6™ может пассивно проходить через гематоэнцефалический барьер в случае дисфункции гематоэнцефалического барьера. В том случае, когда гематоэнцефалический барьер является неповрежденным, ЭП из клеток РЕК..С6™, как полагают, активно транспортируется через гематоэнцефалический барьер посредством рецептора ЭП. Ряд исследований позволяет предположить, что ЭП сам по себе способен проходить через гематоэнцефалический барьер при введении высоких доз рекомбинантного ЭП (\УО 00/61164). Другой предполагаемый путь, посредством которого рекомбинантный ЭП из клеток РЕК..С6™ может пересечь гематоэнцефалический барьер, связан с взаимодействием гликановых структур (сиалил)-Бс\\'15-Х. имеющихся на ЭП, продуцируемом РЕР.С6™. с молекулами Еселектина, имеющимися на эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга человека (Ьои с1 а1., 1996). Взаимодействие между Е-селектином и ЭП может облегчать перенос ЭП через эндотелиальный барьер головного мозга, поскольку Е-селектин также участвует в миграции Т-лимфоцитов в ЦНС (\Уопд с1 а1., 1999). Если это необходимо для оптимальной нейропротекции, продуцируемый клетками РЕК..С6™ ЭП может вводиться в значительно более высокой дозе, чем ЭП сывороточного типа, поскольку продуцируемый РЕК..С6™ ЭП будет индуцировать эритропоэз значительно менее эффективно, так что пагубный эффект повышения гематокрита будет понижен или даже будет совсем отсутствовать.
В другом аспекте настоящего изобретения ЭП, продуцируемый в клетке млекопитающего, которая экспрессирует Е1А, такой как ЭП из РЕК..С6™, может вводиться внутриоболочечно инфузией или с помощью введенного желудочкового катетера или посредством поясничной инъекции с целью ингибирования или предотвращения повреждения нервной ткани. И вновь преимущество использования ЭП мозгового типа над ЭП сывороточного типа заключается в том, что не будет наблюдаться нежелательных побочных эффектов в отношении эритропоэза в случае просачивания в кровоток при дисфункции гематоэнцефалического барьера, связанной, например, с кровоизлиянием.
В настоящем изобретении установлено, что неопределенно долго растущие трансформированные клетки, которые вырастают до очень высокой плотности в бессывороточных условиях и которые обладают характеристиками нервных клеток, такие как РЕК..С6™, чрезвычайно полезны для целей продуцирования факторов, функционирование которых зависит от указанных характеристик. Это, в свою очередь, также создает возможность продуцировать факторы, которые не обладают неврональными характеристиками или связанными с нервными клетками функциями, но которые, тем не менее, имеют преимущества, связанные с посттрансляционными модификациями, производимыми в таких клетках. Можно показать, что некоторые факторы также играют роль в отношении ткани, не являющейся нервной, но которая также требует участия структур гликозилирования, включающих, например, структуры Ьсетщ-Х или фукозные остатки, описанные для ЭП в настоящем изобретении, и наличие которых может быть обеспечено средствами и способами по настоящему изобретению. Примеры факторов, которые могут продуцироваться с помощью РЕК..С6™ и которые имеют преимущества, определяемые наличием неврональных характеристик у клеток РЕК..С6™, включают, не ограничиваясь приведенным списком, эритропоэтин мозгового типа, трансферрин и различные факторы из числа указанных выше. В настоящем изобретении показано, что весьма вероятно, что продукция других рекомбинантных нейротропных гликопротеинов будет также улучшена за счет модификаций мозгового типа, которые имеют место в таких клетках.
В соответствии с настоящим изобретением, неожиданно было обнаружено, что эритропоэтинподобные молекулы, имеющие в среднем сниженное число остатков сиаловой кислоты в расчете на белковый скелет, все еще эффективны при лечении и/или профилактике различных заболеваний. Это открывает совершено новые пути использования ЭП и ЭП-подобных молекул, которые, как считалось ранее, менее полезны или вообще не могут использоваться, и которые включают, не ограничиваясь приведенным списком, фракции ЭП с низким содержанием сиалиловых остатков партий ЭП, получаемых в системах рекомбинантных клеток млекопитающих, которые отбрасывают при фракционировании из-за низкого уровня сиалилирования и/или связанной с ним низкой эритропоэтической активности. Таким образом, в настоящем изобретении показано, что ЭП с низким содержанием сиаловой кислоты примерно также полезен для снижения размера некротической зоны на модели экспериментально индуцированного кровоизлияния у крыс, как и ЭП с более высоким содержанием сиаловой кислоты. В данной области техники хорошо установлено, что высокое содержание сиаловой кислоты в ЭП коррелирует с более длительным периодом полувыведения данного соединения из кровотока и с повышенным эритропоэтическим потенциалом ίη νίνο (Ткиба с1 а1., 1990; Мопшо1о с1 а1., 1996).
В этой связи, настоящее изобретение в целом относится к использованию композиции эритропоэтин-подобных молекул, выбранных из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина, одного или нескольких производных эритропоэтина и композиции из одной или нескольких фракций эритропоэтиновых молекул с различной степенью сиалилирования, при получении лекарственного средства для лечения расстройства, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного поражения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного расстройства и острого поражения центральной или периферической нервной системы,
- 14 008220 где указанная композиция эритропоэтинподобных молекул имеет в расчете на содержание белка более низкую эритропоэтическую активность ίη νΐνο, чем у альфа-эпоэтина и у бета-эпоэтина. Варианты осуществления настоящего изобретения включают композиции и их использование, где указанная эритропоэтическая активность ίη νΐνο у них по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% ниже, чем у альфа-эпоэтина (Эпрекс (Ергех)) или бета-эпоэтина. Эритропоэтин-подобные молекулы в контексте настоящего описания включают молекулы, которые имеют белковый скелет, идентичный известным в настоящее время формам ЭП, например мутеины ЭП, производные ЭП или молекулы ЭП, различающиеся по гликозилированию белкового скелета в качественном и/или количественном отношении. Мутеины в контексте настоящего описания означают эритропоэтин-подобные молекулы, которые имеют одну или несколько мутаций в белковом скелете, полученных путем делеции, добавки, замещения и/или транслокации аминокислот, связанных с белковым скелетом альфа-эпоэтина, и включают природные аллельные варианты, а также генетически, и/или химически, и/или энзиматически полученные варианты. Такие молекулы должны быть способны проявлять функциональную активность ЭП. Их получают с использованием стандартных методик молекулярной биологии, хорошо известных специалистам в данной области техники. Производные в контексте настоящего описания означают эритропоэтинподобную молекулу, которую получают из эритропоэтина или альфа-эпоэтина или из любого другого функционального мутеина альфа-эпоэтина посредством его химической или энзиматической модификации. Эритропоэтическая активность в контексте настоящего описания означает стимулирующий эффект ЭП на продукцию эритроцитов у человека или животного, которая измеряется по повышению величины гематокрита в определенной временной точке после введения человеку или животному эритропоэтин-подобных молекул (см., например, пример 9) или путем измерения концентрации гемоглобина. Указанные методы хорошо известны специалистам в данной области техники. Альфа-эпоэтин представляет собой рекомбинантную форму ЭП человека, имеющуюся в настоящее время на рынке в виде препарата Эпрекс-™, и является близким или идентичным (с точки зрения аминокислотного и углеводного состава) эритропоэтину человека, выделенному из мочи пациентов с анемией. Режим лечения, проводимого с целью увеличения эритропоэза, хорошо установлен. В основном, дозировки ЭП даются в МЕ (международные единицы), которые относятся к активности ЭП в эритропоэзе. Такие значения МЕ коррелируют с содержанием белка ЭП, но не определяются функционально, и в этой связи, уровень корреляции может варьировать между различными партиями. По определению, 1 МЕ соответствует 8-10 нг. альфа-эпоэтина. Для целей пояснения настоящего изобретения эритропоэтическая активность эритропоэтин-подобных молекул указывается на основе содержания белка с тем, чтобы избавиться от различных переменных, которые применяются при определении МЕ. Специалисту в данной области техники понятно, что, хотя значения МЕ обычно приводят для коммерческих препаратов ЭП, концентрация молекул ЭП в таких препаратах может быть легко определена стандартными методами. Это позволяет определить относительную удельную активность, например величину МЕ/г (см., например, ЕР 0428267). Несколько тестов ίη νΐνο и ίη νίίΓο, полезных для данной цели, описаны также в работе ЗЮгппд е! а1., 1992. Примеры других форм ЭП, имеющихся в настоящее время на рынке, включают Прокрит (Ргосп!) или Эпоген (Ηρο^η) (оба являются альфаэпоэтином) и Аранесп (Ληικφ) (альфа-дарбэпоэтин, ЭП с дополнительными сайтами Νгликозилирования, служащими для повышения периода полувыведения и эритропоэтической активности). Хотя эритропоэтическая активность может в некоторой степени варьировать между различными коммерческими препаратами альфа-эпоэтина и бета-эпоэтина, имеющимися на рынке, они в целом оптимизированы с целью достижения высокой эритропоэтической активности. Настоящее изобретение описывает использование ЭП-подобных молекул или ЭП-форм, которые имеют пониженную гемопоэтическую или эритропоэтическую активность, снижая или элиминируя за счет этого побочные эффекты, связанные с повышенным эритропоэзом, когда они нежелательны.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения композиция эритропоэтин-подобных молекул отличается средним числом остатков сиаловой кислоты на эритропоэтинподобную молекулу, которое по меньшей мере на 10% ниже, чем среднее число остатков сиаловой кислоты на эритропоэтиновую молекулу в альфа-эпоэтине. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения, указанное среднее число остатков сиаловой кислоты может быть выбрано на уровне по меньшей мере на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% ниже, чем среднее число остатков сиаловой кислоты на белковый скелет ЭП в альфа-эпоэтине. Указанное среднее число остатков сиаловой кислоты в эритропоэтинподобной молекуле предпочтительно лежит в интервале от 0 до 90% от среднего числа остатков сиаловой кислоты на молекулу ЭП в альфа-эпоэтине, хотя точное процентное соотношение может варьировать от расстройства к расстройству, и иногда - от пациента к пациенту, так как некоторые сочетания пациент - расстройство в меньшей степени чувствительны к высоким величинам гематокрита, чем другие. Альтернативно, число остатков сиаловой кислоты может быть описано, например, значением 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 остатков сиаловой кислоты на ЭП-подобную молекулу. Поскольку приведенные значения представляют собой среднюю величину, вычисленную для композиции, которая состоит из ЭП-подобных молекул с различной степенью сиалилирования, возможны варианты нецелых значений указанных выше величин, которые определяют молекулы по настоящему изобретению. Оптимальный диапазон может быть определен эмпирически, что не слишком обременяет
- 15 008220 специалистов в данной области техники. Среднее число остатков сиаловой кислоты на молекулу или среднее содержание сиаловой кислоты в ЭП может быть определено по известным процедурам, такие методики хорошо известны специалистам в данной области техники. Одна возможная процедура описана в ЕР 0428267. Вкратце методика состоит в том, что остатки сиаловой кислоты отщепляют от ЭПподобных молекул путем гидролиза с использованием 0,35М серной кислоты при 80°С в течение 30 мин, после чего полученный раствор перед анализом нейтрализуют гидроксидом натрия. Альтернативно, сиаловые кислоты удаляют энзиматическим расщеплением по стандартным методикам. Количество ЭП оценивают с использованием хорошо известных процедур, например, с помощью коммерчески доступных наборов для анализа белка (например, по методу Брэдфорда, Вютаф и с использованием стандартных кривых, построенных на основе рекомбинантного ЭП человека в качестве стандарта, при длине волны 280 нм, методом ИФТФА, РИА и им подобных. Содержание сиаловых кислот может быть определено по методике 1оиг41ап с( а1., (1971). Альтернативно, содержание сиаловых кислот может быть проанализировано с помощью анионообменной хроматографии высокого разрешения по известным специалистам методикам (например, Анализ сиаловых кислот с использованием анионообменной хроматографии высокого разрешения. Заявка № ΤΝ41, Όίοηβχ). Содержание сиаловых кислот может быть выражено в виде молей сиаловой кислоты на моль ЭП или в виде среднего числа остатков сиаловой кислоты на ЭПподобной молекуле. Показание среднего числа остатков сиаловой кислоты на ЭП-подобной молекуле может быть получено при изоэлектрическом фокусировании (см. пример 4), которое измеряет ИЭТ (р1).
Можно рассмотреть несколько путей получения эритропоэтин-подобных молекул со сниженным средним числом остатков сиаловой кислоты на эритропоэтин-подобную молекулу. Указанные пути включают, не ограничиваясь приведенным списком, обработку ЭП-подобных молекул, например, полученных рекомбинантно в любой подходящей линии клеток-хозяев, с использованием ферментов, которые отщепляют сиаловую кислоту, в частности таких как нейраминидазы, или ферментов, которые отщепляют большее количество заместителей (включая сиаловую кислоту) из гликозилированных структур, таких как, например, Ν-гликаназа Р (удаляет целиком Ν-гликан), эндогликозидаза Р2 (удаляет биантенные структуры), эндогликозидаза Р3 (удаляет би- и три-антенные структуры) и т.п., или обработку ЭП-подобных молекул химическими соединениями, которые включают, не ограничиваясь ими, кислоты, что приводит к снижению среднего числа остатков сиаловой кислоты на ЭП-подобную молекулу. В частности, высокосиалилированная фракция ЭП может быть таким образом десиалилирована и использована по настоящему изобретению. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения ЭПподобные молекулы со сниженным средним содержанием молекул сиаловой кислоты получают путем очистки или отделения таких форм из смеси, содержащей и ЭП с повышенным, и ЭП со сниженным содержанием сиаловой кислоты. Используемые в настоящее время системы продукции приводят, в целом, к получению таких смесей, и ЭП, предназначенный для целей эритропоэза, получают путем очистки форм с высоким средним числом остатков сиаловой кислоты. Настоящее изобретение описывает использование других фракций, получаемых в ходе указанного процесса, то есть форм ЭП со сниженным числом остатков сиаловой кислоты. Очистка или отделение таких фракций могут быть проведены с использованием установленных методик, известных специалистам в данной области техники, таких как ионообменная, аффинная очистка и т. п. Эритропоэтин-подобные молекулы по настоящему изобретению предпочтительно получают рекомбинантно. Такое получение может быть осуществлено в любой подходящей системе экспрессии, которые включают, не ограничиваясь указанным, клетки яичника китайского хомячка, клетки почки детенышей хомячка, клетки человека, такие как НеЬа, НЕК293 или РЕК..С6™. Возможно также осуществлять экспрессию в клетках низших эукариот, таких как клетки насекомых или дрожжей. Продуцирование ЭП-подобных молекул со сниженным содержанием сиаловой кислоты может быть осуществлено в системе клеток, дефицитных по сиалилированию, у которых в естественном состоянии отсутствуют ферменты сиалилирования, такие как некоторые прокариотические клетки-хозяева, или могут быть получены путем мутагенеза или генетической модификации клеток-хозяев, способных продуцировать сиалилированные белки. Способы и средства продукции рекомбинантных белков хорошо описаны и известны специалистам в данной области техники, и для специалиста в данной области техники очевидно, что можно использовать разные источники ЭП-подобного белка, не отходя от объема настоящего изобретения. В одном аспекте настоящего изобретения ЭП-подобные молекулы получают по способам настоящего изобретения, что приводит к получение молекул с заранее заданной посттрансляционной модификацией. В другом аспекте настоящего изобретения композиции, включающие эритропоэтин-подобные молекулы, характеризуются наличием эритропоэтинподобных молекул, которые при парентеральном введении человеку или животному выводятся из кровотока быстрее, чем альфа-эпоэтин и бета-эпоэтин. Клиренс из кровотока может быть измерен с использованием хорошо известных методик, например, путем измерения периода полувыведения белка из крови по методике, такой как описана в примере 18. У здоровых волонтеров период полувыведения альфа-эпоэтина из кровотока после повторных внутривенных инъекций составляет примерно 4 ч. Период полувыведения составляет примерно 5 ч у пациентов с хронической почечной недостаточностью и примерно 6 ч у детей, как следует из литературных данных. С использованием методики примера 8 авторы настоящего изобретения измеряли период полувыведения, равный 180 мин, для альфа-эпоэтина (Эпрекса). Для специалиста в данной области оче
- 16 008220 видно, что указанный способ может использоваться для определения периода полувыведения композиции по настоящему изобретению, и указанный период полувыведения может быть выражен в часах или в процентах от периода полувыведения стандартного ЭП (Эпрекса). Аналогичные эксперименты могут быть осуществлены на людях с целью определения периода полувыведения у людей.
Эритропоэтинподобные молекулы со сниженным уровнем содержания тетра-антенных структур относительно би-антенных структур будут также иметь укороченный период полувыведения из плазмы (Μίδαίζιι с1 а1., 1995; ТакеисЫ с1 а1., 1989). Возможно получать ЭП в клеточных линиях, которые позволяют получать такие сниженные соотношения, или, альтернативно, указанные формы очищают из форм, содержащих большее число тетра-антенных структур. Такие композиции, содержащие относительно больше би-антенных структур, также являются полезными согласно настоящему изобретению. Очевидно, также, что одним из достоинств настоящего изобретения является, то, что можно достичь более высоких максимальных концентраций эритропоэтинподобных молекул в кровотоке по сравнению с используемыми в настоящее время ЭП формами, такими как Эпрекс, Прокрит, (Ергех, Ргосгй), ΝΕ8Ρ. Если для упомянутого лечения желательны высокие концентрации ЭП-подобных молекул, этого можно достичь введением высоких доз композиций по настоящему изобретению, например, в виде фармацевтических препаратов, содержащих такие высокие дозы. Введение аналогичных по содержанию белка доз используемых в настоящее время ЭП-подобных молекул привело бы к повышенному эритропоэзу, который является нежелательным побочным эффектом при данных видах лечения.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим указанные эритропоэтинподобные молекулы, и к способам лечения или профилактики расстройств, выбранных из указанных групп, а также к композициям эритропоэтинподобных молекул для профилактического и/или терапевтического лечения человека или животного.
Примеры
Пример 1. Изучение экспрессии маркерных белков в клетках РЕК.С6™
Клетки, которые были трансформированы Е1-участком человеческого аденовируса типа 5, что дало клеточную линию РЕК.С6™ (депонированную в ЕСАСС под № 96022940), получали из сетчатки человека. Сетчатка в целом включает множество различных типов клеток (по меньшей мере 55 различных подтипов нервных клеток), включая нервные и фибробластоподобные клетки (Маз1апб 2001). Для того, чтобы отследить клеточное происхождение РЕК.С6™, проводили исследование для определения экспрессии маркерных белков внутри или на клетках. Указанные маркеры известны в данной области техники и являются характерными для определенных типов клеток и/или тканей. Маркерные белки приведены в табл. I.
Экспрессию маркерного белка анализировали с использованием антител, направленных против маркерных белков. В каждом эксперименте отрицательный контроль (клетки РЕК.С6™, не инкубированные с антителом) и положительный контроль брали параллельно. Указанные позитивные контроли представляют собой срезы тканей человека, в отношении которых известно, что они экспрессируют маркерный белок (табл. II).
Клетки РЕК.С6™ культивировали на стеклянных пластинках в камере для среды (Ъйё Тесйпо1од1е8, №.тс ЬаЬ-Тек, СкатЬег Зкбе, стерилизация облучением, 2 камеры для среды, номер по каталогу 154464А). Клетки РЕК.С6™ высевали до 65-70% слияния (по 2 ячейки на камеру для культивирования) и культивировали в течение 24 ч при 37°С (10% СО2, влажность 95%). Затем среду отсасывали и стеклянные пластинки с клетками промывали стерильным ФСБ, удаляли из камеры для среды и высушивали на воздухе. Клетки фиксировали на стеклянных пластинках путем инкубирования в ацетоне в течение 2 мин. После высушивания на воздухе слайды заворачивали в алюминиевую фольгу и замораживали при температуре ниже -18°С до использования.
Ткани положительного контроля получали из банков тканевых слайдов, приготовленных для обычного использования в отделении патологии Асабеннс Но§рйа1 Егактик ИпАегайу (Роттердам, Нидерланды). Готовили замороженные срезы (5 мкм) и фиксировали их в ацетоне по обычным методикам.
Первичные антитела, их соответствующие маркерные белки, поставщики антител и каталожные номера приведены в табл. III. Разведения, также подробно описанные в табл. III, готовили в фосфатносолевом буфере (ФСБ), содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина. Инкубирование слайдов с первичными антителами проводили в течение 30 мин при комнатной температуре, промывали их ФСБ и инкубировали со вторичными антителами. Указанные вторичные антитела представляли собой либо козьи антитела против иммуноглобулинов кролика (ΌΑΚΟ Е0432; разведение 1:50) либо козьи антитела против иммуноглобулинов мыши (ΌΑΚΟ Е0433; разведение 1:50), в зависимости от природы используемого первичного антитела. Вторичные антитела конъюгировали с биотином. После промывания ФСБ полученные слайды инкубировали с комплексом стрептавидин-авидин/биотин, конъюгированным со щелочной фосфатазой (ΌΑΚΟ, К0376). После инкубации в течение 30 мин образцы промывали раствором Трис/НС1 с рН 8,0 и обрабатывали фуксин-хромогенным субстратом (ΌΑΚΟ Κ0624) в темной комнате в течение 30 мин. Затем слайды промывали в течение 2 мин водопроводной водой и проводили контрокрашивание гематоксилином в соответствии с обычными методиками, хорошо известными специалистам в данной области. Затем слайды просматривали под микроскопом и анализировали на наличие экспрессии маркерного белка (отрицательный или положительный результат). Результаты представлены в табл. IV. В случае окрашивания нейрофиламентов (положительное), не все клетки РЕК.С6™ окрашива
- 17 008220 лись положительно в результате того, что они находились на различных стадиях клеточного цикла или фазы созревания клеточной популяции. Это является нормальным результатом при окрашивании нейрофиламентов.
Из полученных данных был сделан вывод, что клетки РЕК.С6™ имеют неврональное происхождение, поскольку клетки положительно окрашивались виментином, синаптофизином, нейрофиламентом, СЕАР и Ν-САМ.
Пример 2. Моносахаридный состав Ν-гликанов ЭП из клеток РЕК.С6™ по сравнению с Νгликанами Эпрекса (Ергех)
Первым этапом характеристики Ν-гликановых структур, продуцируемых РЕК.С6™, является измерение молярного соотношения различных моносахаридов. Анализ моносахаридов проводили с использованием высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (НРАЕС-РАЭ). Для данного анализа были выбраны образцы ЭП, образованного в процессе роста РЕК.С6™-клонов Р7, Р8 и С25 на среде ЭМЕМ и/или ШН (клоны Р7 и Р8 описаны в \УО 00/63403, а С25 получен непосредственно в соответствии с указанными методами, использующими ген устойчивости к неомицину в качестве селективного маркера [плазмида рЕРО2001/№о]). Параллельно проводили анализ препарата Эпрекс (Ергех; 1ап§еп Сйад), который представляет собой коммерчески доступный рекомбинантный эритропоэтин, продуцируемый клетками СНО, и в данном случае использовался в качестве эталона.
Образцы ЭП из РЕК.С6™ очищали аффинной хроматографией на колонке, заполненной шариками С4 Сефарозы (заполненный объем 4 мл, (АтегаЕат РЕаттааа Вю1есЕ)), связанной с моноклональными мышиными антителами против ЭП (1дС1). Связанные молекулы ЭП элюировали 0,1М глицин-НС1, рН 2,7 и полученные в результате фракции сразу же нейтрализовали добавлением натрий/калий фосфатного буфера с рН 8,0. После этого объединяли фракции, содержащие ЭП, и буфер заменяли на 20 мМ ТрисНС1, содержащий 0,1% (об./об.) Твин 20, с использованием колонок для обессоливания Н1ргер 26/10 (АтегаЕат РЕагташа Вю1есЕ).
Для анализа гликанов очищенные образцы ЭП диализовали в течение ночи против деионизированной воды качества МПН-0 и высушивали в вакуумном испарителе 8реебуас. Высушенные образцы ЭП (в количестве от 39 до 105 мкг) растворяли в буфере для инкубации (в разбавлении 1:1 С3 профилирующим буфером, С1уко). После добавления додецилсульфата натрия (ДСН) и бета-меркаптоэтанола до конечной концентрации 0,1% (вес./об.) и 0,3% (об./об.) соответственно, образцы денатурировали в течение 5 мин при 100°С. Затем добавляли №шбе1 Р-40 (ВОН) до конечной концентрации 0,75% (об./об.) и ЭП подвергали дегликозилированию в течение ночи при 37°С с использованием Ν-гликаназы Е (мЕ, С1уко). После дегликозилирования высвободившиеся Ν-гликаны отделяли от белков, солей и детергентов с использованием 8РЕ-колонок (А11!есЕ) с графитным черным углем (СагЬодгарЕ) в соответствии с методикой Раскег е! а1., (1998).
Очищенные Ν-гликановые цепи подвергали гидролизу в 2М трифторуксусной кислоте (ТФУ) при 100°С в течение 4 ч. После гидролиза моносахариды сушили в вакуумном испарителе 8реебуас, промывали водой и снова высушивали в вакуумном испарителе 8реебуас. Высушенные моносахариды растворяли в 26 мкл деионизированной воды качества МПН-О. После добавления 6 мкл раствора дезоксиглюкозы (100 нмоль/мл), которую использовали в качестве внутреннего стандарта, образцы (24,5 мкл) помещали в систему НРАЕС-РАЭ ВюЬС с колонками СагЬоРас РА1 (Оюпех) диаметром 2 мм. Изократическую элюцию с колонки вели в 16 мМ №1ОН (Вакег) со скоростью потока 0,25 мл/мин. Состав моносахаридов рассчитывали путем сравнения профиля с профилем, полученным со смесью стандартных моносахаридов, которая состоит из фукозы, дезоксиглюкозы, галактозамина, глюкозамина, галактозы и маннозы.
Данные анализа моносахаридов показали, что состояние гликозилирования ЭП из РЕИ.С6™ значительно отличается от такового в препарате Эпрекс (Ергех) (табл. V). Соотношение указанных моносахаридов (Мап = манноза; Еис = фукоза; СаШАс = Ν-ацетилгалактозамин; С1сНАс = Ν-ацетилглюкозамин; Са1 = галактоза) нормализовали до 3 Мап. В скобках приведены удвоенные значения. Образцы ЭП из РЕИ.С6™ содержат значительное количество СаШАс, тогда как Ν-связанные сахара в Эпрекс не содержат указанного остатка. Это свидетельствует, что ЭП из РЕИ.С6™ содержит так называемые ^асб^NАсструктуры (например, 6а1NАсβ1-461сNАс). Другой особенностью ЭП из РЕКС6™, как видно из табл. V, является относительно большое количество остатков фукозы. Это в значительной степени свидетельствует о наличии Ьетая-структур в Ν-гликанах ЭП из РЕИ.С6™. В противоположность этому, известно, что эпрекс не содержит Ьетая-структур. Следовательно, количество фукозы, найденной в эпрекс, может быть полностью связано с фукозилированием Ν-гликанового ядра. Следует отметить, что данные анализа моносахаридов также показывают, что условия культивирования влияют на состояние гликозилирования ЭП в РЕКС6™. Из этого не следует вывода о том, что только условия культивирования определяют заранее заданные посттрансляционные модификации, имеющиеся на продуцированных белках. Разумеется, клеточные линии должны быть способны модифицировать посттрансляционные модификации белков, продуцируемых такими клеточными линиями, благодаря наличию определенных специфических гликозилирующих ферментов, таких как трансферазы. Условия культивирования могут лишь выявлять дополнительные активности. Так, например, когда ЭП-продуцирующие клоны культивировались (в суспензии)
- 18 008220 в среде ДЕН Ехсе11 525, Ν-связанные гликаны ЭП, как было показано, содержат более высокие уровни ΟΙοΝΑο, СаШАс Са1 и Гис по сравнению с Ν-связанными сахарами в ЭП, полученном из клеток, культивируемых (в прикрепленном слое) в среде ΌΜΕΜ (табл. V). Этот эффект особенно очевиден в случае клона Р8. Повышенный уровень С1сNΑс позволяет предположить, что разветвление Ν-связанных Сахаров повышается и/или что Ν-связанные сахара содержат больше лактозаминовых повторов, когда клетки культивируют в среде ДЕН. Увеличение Ν-ацетилглюкозаминилирования и (Ν-ацетил)галактозилирования, в свою очередь, приводит к увеличению числа акцепторных сайтов для фукозы, что позволяет объяснить повышение содержания фукозы.
Пример 3. Масс-спектрометрический анализ, выявляющий структурные различия между Νгликанами из ЭП РЕЕ.С6™ и Эпрекс (Ергех)
Для получения более детальной информации о структуре Ν-гликанов, продуцируемых РЕЕ.С6™, было решено проанализировать полные сахарные цепи ЭП из РЕЕ.С6™ методом ΜΑΕΌΙ-Μ8. Для данного анализа использовали очищенные методом аффинной хроматографии образцы ЭП, образованного полученными из РЕЕ.С6™ клонами Р7 и Р8 на среде ^ΜΕΜ, которые затем фракционировали методом анионообменной хроматографии (как описано ниже). Образцы ЭП РЕЕ.С6™, очищенные методом аффинной хроматографии, как описано в примере 2, в которых буфер был впоследствии заменен на ФСБ, подвергали анионообменной хроматографии с использованием колонки ШТгар с сефарозой О НР (Атег8Йат Рйагтааа Вю!есй). Три подфракции ЭП были получены при использовании ступенчатого градиента в 20 мМ Трис-НС1/20 мкМ Си8О4, начиная с 45 мМ №101 (фракция 1), продолжая при 75 мМ №1С1 (фракция 2) и заканчивая 135 мМ №1С1 (фракция 3). Каждая ступень градиента длилась 10 мин при скорости потока 1 мл/мин. Фракции 1 из четырех протоков объединяли в пул А, фракции 2 - в пул В и фракции 3 в пул С. Полученные в результате пулы А, В и С затем обессоливали с использованием колонок для обессоливания Н1Ргер 2 6/10 (Атегайат Рйагташа Вю!есй). Ν-связанные гликаны высвобождали из пулов ЭП путем обработки Ν-гликаназой Г и подвергали десиалилированию путем обработки нейраминидазой. Параллельно в качестве стандарта анализировали эпрекс. На фиг. 1А-С приведены репрезентативные масс-спектры различных образцов ЭП: Эпрекс и очищенные и фракционированные пулы А, В и С, собранные с колонок для анионообменной хроматографии. Образцы ЭП из РЕЕ.С6™, полученные из культур указанных клонов на среде ΌΜ^Μ, обрабатывали гликаназой Г и нейраминидазой и затем анализировали методом ΜΑΕΌΙ-Μ8. Символы (приведенные на спектре Эпрекс) обозначают: закрашенные квадратики обозначают ΟΙοΝΑο; незакрашенные кружки обозначают Μηη: закрашенные кружки обозначают Са1; незакрашенные треугольники обозначают Гис. Масс-профиль Ν-связанных сахаров из Эпрекс (фиг. 1А) соответствует опубликованным ранее данным и указывает на то, что тетра-антенные сахара, содержащие и не содержащие лактозаминовых повторов, преобладают в данном препарате ЭП. Хотя Эпрекс и ЭП из РЕЕ.С6™ содержат сахарные структуры аналогичной массы (фиг. 1В-С), профиль сахарных структур в последнем является значительно более сложным, и это позволяет предполагать, что данные сахара проявляют более высокий уровень гетерогенности.
Для прогнозирования состава сахаров на основе наблюдаемой массы была использована компьютерная программа ΕxРΑ8у (таблица VI и VII). В каждом пуле было также показано относительно большое содержание различных олигосахаридов. Приведенные данные показывают, что большая часть Νсвязанных олигосахаридов, полученных из ЭП РЕЕ.С6™, содержит множественные остатки фукозы (таблица VI и VII, см. уровень бНех-остатков). Некоторые гликаны были даже четырежды фукозилированными. Следовательно, полученные данные соответствуют результатам проведенного авторами анализа моносахаридов и дают серьезные основания полагать, что ЭП из РЕЕ.С6™ является гиперфукозилированным и, в этой связи, наиболее вероятно в значительной мере снабжен Ν-гликанами, имеющими так называемые Б-е\\'15-структуры.
Олигосахариды с (сиалилированными) Ье^щ-Х эпитопами известны как основные последовательности, распознаваемые селектинами, опосредующими адгезии по типу клетка-клетка при воспалительных и иммунных реакциях (Уагк1 е! а1., 1999), и являются характерным признаком для мозговых гликопротеинов (ΜηΓβοΙίδ апб ΜηΓβοΙίδ. 1989). В этой связи, было показано, что различные гликопротеины, несущие указанные Еетак-Х-структуры, обладают терапевтическим потенциалом, связанным с их противовоспалительной и иммуносупрессорной активностью. Авторами настоящего изобретения было показано, что сигнал в масс-спектре не всегда может быть однозначно присвоен определенной сахарной структуре: например, остатки типа С1сNΑс и Са1NΑс имеют одинаковую массу. Поскольку анализ моносахаридов ЭП из. РЕЕ.С6™ выявил наличие Са1NΑс в Ν-связанных сахарах, можно предполагать, что некоторые из пиков соответствуют Ν-гликанам с так называемыми ^асά^NΑс (например, Са1NΑсβ14С1сNΑс)-структурами. Так например, пики со значениями т/ζ, равными ~2038 и ~2185 (табл. VI и VII), наиболее вероятно представляют Ν-гликаны с ^асά^NΑс-мотивами. В ином случае, указанные пики могли бы представлять тетра-антенные структуры, которые заканчиваются С1сNΑс в связи с отсутствием Са1 или ΟιΓΝΑ^ Хотя такие структуры могут существовать в связи с неполным гликозилированием, наличие остатка фукозы на проксимальном конце означает, что сахар содержит остаток Са1 или ΟιΤΝΑ^
- 19 008220 который является необходимым для формирования мотива, который распознается фукозилтрансферазой (РИТ), которая катализирует формирование Ье\\'Ь-структуры.
Относительная встречаемость различных Сахаров варьирует между препаратами ЭП, полученными из двух независимых клонов РЕВ.Сб™, что следует из различий в относительной высоте соответствующих пиков. В частности, предполагаемые би-антенные сахара с Ьасб|ХЛс-мотивами (фиг. 1; табл. VI и VII, сигналы со значениями т/ζ, равными ~2038 и ~2185) представляют собой основные сахара в образцах ЭП, полученных из Р8, в то время как в образцах из Р7 указанные структуры представлены значительно менее обильно. У последнего клона пик со значением т/ζ, равным ~2541, предположительно соответствующий полностью галактозилированному тетра-антенному гликану, был наиболее обильно представленной структурой. Указанные данные соответствуют результатам авторского анализа моносахаридов, которые показали, что при росте на среде БМЕМ клон Р8 продуцирует ЭП, несущий гликан с меньшей степенью ветвления, чем у гликанов, полученных из Р7-ЭП (табл. V).
Пример 4. Сравнение содержания сиаловой кислоты в РЕВ.Сб-ЭП и СНО-ЭП
Содержание сиаловой кислоты в РЕВ.Сб™-ЭП анализировали и сравнивали с эритропоэтином, выделенным из клеток яичника китайского хомячка (СНО-ЕРО), с помощью изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) с использованием полосок 1Р6 (АтегкЬат Р1агтас1а Вю1есЬ), которые имеют линейный градиент рН в диапазоне 3-10. После фокусирования изоформы ЭП подвергали пассивному блоттингу на нитроцеллюлозу и проявляли с использованием ЭП-специфичных антител и ЕСЬ (фиг. 2). ЭП, образованный четырьмя различными клонами РЕКСб™ (линии С, Ό, Е и Р) и тремя различными клонами СНО, стабильно экспрессирующими ЭП (линии С, Н и I), анализировали методом изоэлектрического фокусирования для определения содержания сиаловой кислоты. Продуцирующие ЭП клеточные линии СНО и РЕВ.Сб™ получали в основном по методикам, описанным в νΟ 00/б3403, с использованием гена устойчивости к неомицину в качестве селективного маркера. На каждую полоску наносили тысячу еИ (единица ЕЫ8А) РЕВ.Сб™-ЭП и 500 еИ СНО-ЭП. Для идентификации различных изоформ ЭП использовали пятьсот МЕ препарата Эпрекс (линия А) и Эпрекса, обработанного нейраминидазой (частично десиалилированного) (линия В). После фокусирования ЭП подвергали блоттингу на нитроцеллюлозный фильтр и проявляли с использованием моноклонального антитела против ЭП и ЕСЬ. Образец Эпрекса, представляющего собой коммерчески доступный ЭП, является препаратом, содержащим высоко сиалилированные изоформы, и использовался в качестве маркера.
Полученные результаты показали, что клетки СНО способны продуцировать изоформы ЭП, содержащие по меньшей мере до 12 остатков сиаловой кислоты на молекулу (линии С4), подтверждая данные, полученные Мопто1о е1 а1., (199б). В противоположность этому, несмотря на то, что некоторые изоформы с содержанием 8-10 сиаловых кислот также продуцировались РЕКСб™, такие формы были представлены в небольшом количестве и обнаруживались лишь после длительной экспозиции на пленке (линии С-Р) . Следовательно, может быть сделан вывод о том, что РЕКСб™-ЭП сиалилирован в значительно меньшей степени, чем СНО-ЭП.
Пример 5. α-1,3-, а-1,б- и а-1,2-фукозилтрансферазная активность в клетках РЕКСб™
Потенциал гликозилирования клетки в значительной мере определяется обширностью набора гликозилтрансфераз, участвующих в ступенчатом биосинтезе Ν- и О-связанных сахаров. Активность указанных гликозилтрансфераз варьирует между клеточными линиями, и в этой связи, гликопротеины, продуцируемые различными клеточными линиями, имеют различные гликаны. В свете приведенных в настоящем описании данных, которые демонстрируют, что гликаны РЕВ.Сб™-ЭП высоко фукозилированы, активность различных фукозилтрансфераз (РИТ), участвующих в синтезе Ν-связаных сахаров, анализировали с использованием методик, в основном известных специалистам в данной области техники (νηη бе η №еи\\'еп1юГ е1 а1., 2000). В настоящем исследовании авторы изучали активности а-1,б-РИТ, которая участвует в фукозилировании ядра Ν-гликанов, а-1,2-РИТ, которая опосредует кэппинг концевыми остатками галактозы, что приводит к получению так называемых Ье\тЬ-Х-эпитопов и а-1,3-РИТ, что приводит к образованию Ье\\35-Х-структур. Для сравнения авторы также проанализировали соответствующие активности РИТ, присутствующие в клетках СНО.
Активности указанных РИТ в клеточных экстрактах РЕВ.Сб™ и СНО измеряли с использованием теста на активность гликозилтрансферазы. Указанный тест позволяет оценить реакцию, катализируемую гликозилтрансферазой, между сахаридом (в данном случае фукозой) и сахарным субстратом. Измеряли также активность Са1Т, рассматривая ее в качестве внутреннего контроля. Приведенные величины отражают среднее значение результатов двух экспериментов. Все величины, и в частности величины, полученные для РЕВ.Сб™, были в 2-3 раза ниже во втором эксперименте. Следует отметить, что активности выражали в расчете на мг белка (присутствующего в клеточном экстракте). Поскольку клетки РЕВ.Сб™ значительно крупнее, чем клетки СНО, различия между активностями РИТ и Са1Т в клетках СНО и РЕВ.Сб™ могут быть больше или меньше, чем это кажется. Результаты тестов по определению активности гликозилтрансфераз приведены в табл. VIII, и они указывают на то, что РЕВ.Сб™, так же, как и СНО, обладают значительной активностью а-1,б-РИТ, что позволяет полагать, что обе клеточных линии могут продуцировать гликановые цепочки, фукозилированные по ядру. Активность а-1,3-РИТ была, однако,
- 20 008220 значительной лишь в клетках РЕК.С6™, в то время как она с трудом обнаруживалась в клетках СНО. Ни одна из клеточных линий не демонстрировала активности а-1,2-ЕИТ. Взятые вместе указанные данные демонстрируют разницу, имеющуюся между гликозилирующим потенциалом СНО и РЕК.С6™, и объясняют, почему РЕК.С6™-ЭП содержит больше фукоз, чем ЭП, полученный из СНО (Эпрекс).
Пример 6. Гликаны с Бе\\зк-Х эпитопами, присутствующие в РЕК.С6™-ЭП
В связи с тем, что РЕК.С6™ обладают α-1,3-, но не а-1,2-фукозилтрансферазной активностью, очень вероятно, что РЕК.С6™ продуцируют Ν-гликановые цепочки, которые содержат Ьейк-Х-эпитопы вместо эпитопов Ьейк Υ. Авторы подтвердили это предположение путем проведения эксперимента с мечением РЕК.С6™-ЭП мышиными моноклональными антителами (против Бе\\зк-Х-структур 1дМ человека; С.'а1Ьюе11ет). которые специфически распознают Ьейк-Х-структуры, с использованием Вестернблоттинга. Равные количества РЕК.С6™-ЭП (полученного из клона Р7, который в данном случае указан как Р7.100) и препарата Эпрекс, необработанных (-) и обработанных (+) НС1, разгоняли в ДСНполиакриламидном геле и подвергали блоттингу на нитроцеллюлозную мембрану с использованием методик, известных специалистам в данной области техники. Для обнаружения эпитопов Бе\\зк-Х использовали моноклональные антитела (против мышиного 1дМ; Са1ЬюсЫет) и ЕСЬ (АтегкЫат РЫатташа Вю!есЫ) . Как можно видеть на фиг. 3, лишь РЕК.С6™-ЭП мог быть помечен антителами, специфичными для эпитопа Бе\\зк-Х. Указана локализация маркера молекулярной массы (52, 35 и 29 кДа). Поскольку α-1,3фукозная связь является кислотолабильной, сигнал был потерян после обработки НС1.
Пример 7. Экспрессия Бе\\зк-Х -структур на клеточной поверхности клеток РЕК.С6™
Для выяснения вопроса о том, присутствуют ли обычно структуры Бе\\зк-Х в клетках РЕК.С6™, авторы метили поверхность клеток СНО и нормальных (то есть, не продуцирующих ЭП) клеток РЕК.С6™ антителами, специфичными для Бе\\зк-Х (Са1ЬюсЫет). Клетки инкубировали с первичными антителами (мАТ α Ьейк-Х в рабочей концентрации 0,16 мкг/мл и мАТ α сиалил-Ьейк-Х в рабочей концентрации 5 мкг/мл). В качестве вторичных антител использовали ИТС-конъюгированные анти-1дМ. Меченые клетки анализировали методом флуоресцентной сортировки (ЕАС8). Пунктирная линия обозначает сигнал от клеток, инкубированных только со вторичными антителами (отрицательный контроль). Результаты, приведенные на фиг. 4, показывают, что клетки РЕК.С6™ сильно метятся антителами, в отличие от клеток СНО, которые не способны образовывать указанные структуры. Следует отметить, что авторы неоднократно наблюдали, что клетки РЕК.С6™ демонстрируют гетерогенную картину окрашивания с использованием антител к структурам Бе\\зк-Х. Мечение антителами, специфичными для структур сиалил-Бе\\зкХ (Са1ЬюсЫет), давало умеренно положительный сигнал только при использовании очень высокой концентрации антител.
Пример 8. Ингибирование апоптоза с помощью РЕК.С6™-ЭП (мозгового типа) ίη νίΙΐΌ в клетках ΝΓ2 и в клетках 11ΝΈ культивируемых в условиях гипоксии
ЭП, продуцируемый РЕК.С6™ (мозгового типа), и ЭП сывороточного типа сравнивали по их активности ίη νίΙΐΌ в отношении защиты кортикальных нервных клеток крысы, мыши и человека от гибели клеток в условиях гипоксии и недостатка глюкозы. Для этого культуры нервных клеток получают из эмбрионов крысы, как описано другими авторами (Коте!/ е! а1., 1994; №щауата е! а1., 1999; \У1Ше е! а1., 1996). Для оценки эффектов ЭП мозгового типа, продуцируемого РЕК.С6™, и ЭП сывороточного типа клетки поддерживают в модульных инкубационных камерах в инкубаторах с водяной рубашкой в течение 48 ч при температуре 37°С на бессывороточной среде с 30 мМ глюкозы в увлажненной газовой смеси 95% воздуха/5% СО2 (нормоксия) или на бессывороточной среде без глюкозы в увлажненной газовой смеси 95% Ν2/5% СО2 (гипоксия и недостаток по глюкозе), в отсутствие или в присутствии 30 пМ очищенного ЭП мозгового типа, продуцируемого РЕК.С6™, или 30 пМ препарата Эпрекс. Клеточные культуры подвергают гипоксии и голоданию по глюкозе в течение по меньшей мере 24 ч и затем возвращают в условия нормоксии на 24 ч. Цитотоксичность оценивают по флуоресценции Аламарового синего, которая позволяет оценить жизнеспособность клеток как функцию метаболической активности.
По другому способу культуры нервных клеток в течение 24 ч подвергают воздействию 1 мМ Ьглютамата или α-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты (АМПК) в условиях нормоксии, в отсутствие или в присутствии различных концентраций очищенного ЭП, продуцируемого РЕК.С6™, или препарата Эпрекс. Цитотоксичность анализируют по флуоресценции Аламарового синего, которая позволяет оценить жизнеспособность клеток как функцию метаболической активности. Ожидается, что жизнеспособность клеток, обработанных РЕК.С6™-ЭП, будет аналогична жизнеспособности клеток, обработанных препаратом Эпрекс.
Пример 9. Активность РЕК.С6™-ЭП (мозгового типа) по стимуляции эритропоэза у крыс по сравнению с ЭП сывороточного типа
Способность рекомбинантного ЭП человека стимулировать продукцию эритроцитов может быть оценена на модели грызунов, описанной ВагЬопе е! а1., (1994). В соответствии с указанной моделью, повышение числа ретикулоцитов используют как меру биологической активности препарата рекомбинантного ЭП человека. Ретикулоциты являются предшественниками эритроцитов, и их продукция в ответ на
- 21 008220
ЭП может использоваться как мера потенциала ЭП в плане стимуляции образования эритроцитов. Повышенная продукция эритроцитов, в свою очередь, ведет к более высокой величине гематокрита.
Активности РЕК.С6™-ЭП и препарата Эпрекс сравнивали в шести группах по три крысы линии \ν;·ΐβ/Κί). Различные дозы РЕК.С6™-ЭП (Р7-ЭП), Эпрекса и буфера для разведения в качестве отрицательного контроля инъецировали внутривенно в вену полового члена в день 0, 1 и 2. РЕК.С6™-ЭП вводили в дозе 5, 25 или 125 еИ (единица Е^I§А=ИФТФА) , определяемой с помощью коммерчески доступного ЭП-специфичного набора Κ&Ό ЕБка Кй, а препарат Эпрекс вводили в дозе 1 или 5 еИ. Все препараты ЭП разводили до соответствующей концентрации с использованием ФСБ с 0,05% Твин 80 в общем объеме 500 мкл. На день 3 посредством пункции языка отбирали образец крови с ЭДТА объемом 250 мкл. В тот же день определяли процент ретикулоцитов в общей популяции эритроцитов.
Как видно на фиг. 6 (стрелки указывают процент ретикулоцитов, присутствующих в общей популяции эритроцитов), ежедневное введение 1 еИ препарата Эпрекс крысам в течение трехдневного периода вызывало значительное повышение числа ретикулоцитов на четвертый день по сравнению с числом ретикулоцитов у крыс, получавших только буфер для разведения. Число ретикулоцитов еще больше повышалось при пятикратном увеличении дозы Эпрекс. Число ретикулоцитов возрастало явно в меньшей степени при использовании эквивалентных количеств РЕК.С6™-ЭП. Аналогичное повышение числа ретикулоцитов наблюдалось при введении 1 еИ Эпрекс и 25 еИ РЕК.С6™-ЭП, что является показателем того, что РЕК.С6™-ЭП по меньшей мере в 25 раз менее активен в плане стимуляции продукции эритроцитов, чем Эпрекс. Различие между потенциалом Эпрекс и РЕК.С6™-ЭП в плане стимуляции продукции эритроцитов было еще сильнее выражено при более высоких дозах (то есть, 5еИ Эпрекс и 125 еИ РЕК.С6™ЭП).
Пример 10. Эффект РЕК.С6™-ЭП на церебральную ишемию после экспериментальной субарахноидальной геморрагии
Для того, чтобы продемонстрировать, что РЕК.С6™-ЭП более эффективен как нейропротектор в отношении церебральной ишемии, чем сывороточный тип ЭП, авторы сравнили эффекты системного введения ЭП мозгового типа, продуцируемого РЕК.С6™, и ЭП сывороточного типа на модели кроликов с острой церебральной ишемией, индуцированной субарахноидальной геморрагией. Для этого провели исследования на 32 животных, которых разделили на 4 группы (η=8).
Группа 1 - субарахноидальная геморрагия;
Группа 2 - субарахноидальная геморрагия плюс плацебо;
Группа 3 - субарахноидальная геморрагия плюс рекомбинантный ЭП человека сывороточного типа; Группа 4 - субарахноидальная геморрагия плюс рекомбинантный ЭП, продуцируемый РЕК.С6™. Экспериментальную субарахноидальную геморрагию воспроизводят посредством чрескожной инъекции аутологичной крови в смета тадпа (мозжечково-мозговую цистерну) после анестезии животного. После инъекции кроликов выдерживают в течение 15 мин в лежачем положении на брюхе для образования брюшных сгустков крови. Животным в группах 2, 3 и 4 инъецируют, соответственно, буфер для разведений, Эпрекс и очищенный ЭП мозгового типа, продуцируемый РЕК.С6™, через 5 мин после индукции субарахноидальной геморрагии, и затем повторяют их введение через 8, 16 и 24 ч. Все инъекции проводят внутрибрюшинно. Буфер для разведений состоит из водного раствора сывороточного альбумина (2,5 мг/мл), хлорида натрия (5,84 мг/мл) и безводной лимонной кислоты (0,057 мг/мл). Опытных животных подвергают эвтаназии через 24 ч после индукции субарахноидальной геморрагии и удаляют у них мозг. После этого из мозга с использованием микротома с замораживанием готовят корональные срезы толщиной 10-25 мкм, начиная от теменной части и, продолжая двигаться назад, до мозжечка включительно (Чгекщй апб МасЬеоб, 1993). Для визуализации и оценки числа поврежденных ишемией нейронов срезы окрашивают гематоксилином и эозином. Количество эозинофильных нейрональных профилей, содержащих пикнотические ядра, в поле микроскопа с высоким разрешением (100х) определяют в пяти выбранных случайным образом областях боковой коры, полученных с нескольких уровней корональных срезов, расположенных позади темени. Ожидается, что животные, которым вводили РЕК.С6™-ЭП, будут иметь меньшее число поврежденных нейронов, чем животные, которым ничего не вводили или вводили плацебо.
Пример 11. Экспрессия рецептора эритропоэтина в неонатальных кардиомиоцитах крыс после гипоксии/реоксигенации
Из желудочков однодневных крыс линии 8ргадие-Оает1еу получали первичные культуры неонатальных крысиных кардиомиоцитов, как было описано ранее (81тркоп апб δηνίοη, 1982). Гипоксию создали путем инкубации кардиомиоцитов в воздухонепроницаемой камере из плексигласа с газовой смесью 5% СО2/95% Ν2 и с содержанием О2 <1% при температуре 37°С в течение 2 ч с использованием установки Сак Рак Р1ик (ВВЬ). Посредством замены среды на среду, насыщенную газовой смесью из 95% воздуха и 5% СО2, клетки переводили в условия нормотоксической атмосферы (реоксигенация).
Кардиомиоциты дважды промывали охлажденным на льду ФСБ и выделяли суммарную РНК с использованием Тризола (Τηζοί, СГВСО), экстрагировали ее хлороформом и осаждали изопропиловым спиртом. Для проведения Нозерн-анализа 15 мкг препарата суммарной РНК разделяли в 1,5% формальдегид/МОР8-агарозном геле, подвергали блоттингу на нитроцеллюлозу и гибридизовали с 32Р-меченым
- 22 008220 зондом для рецептора ЭП (фрагмент кДНК размером ±400 пн (пар нуклеотидов)). Гибридизацию проводили в течение ночи при 65°С в фосфатном буфере с рН 7,2 и завершали двумя промывками в 2х88С при комнатной температуре, 2 промывками в 0,2х88С/0,1% ДСН при 65°С и 2 промывками в 2х88С при комнатной температуре. Сигналы гибридизации визуализировали путем экспозиции обработанной мембраны с рентгеновской пленкой (Кодак). Уровни экспрессии корректировали по уровням САРИН-мРНК.
Пример 12. Эффект РЕЯ.С6™-ЭП мозгового типа и ЭП сывороточного типа (Эпрекс) на апоптоз неонатальных кардиомиоцитов крыс, культивируемых в условиях гипоксии
Первичные культуры неонатальных кардиомиоцитов крыс получали из желудочков однодневных крыс линии 8ргадие-Оа^1еу, как было описано ранее (Ξίιηρδοη ;тб δηνίοη, 1982). Гипоксию создавали путем инкубации кардиомиоцитов в воздухонепроницаемой камере из плексигласа с газовой смесью 5% СО2/95% Ν2 и с содержанием О2 <1% при температуре 37°С в течение 2 ч с использованием установки Сак Рак Р1ик (ВВЬ). Посредством замены среды на среду, насыщенную газовой смесью из 95% воздуха и 5% СО2, клетки переводили в условия нормотоксической атмосферы (реоксигенация). Результаты эксперимента оценивали в четырех группах:
Α) - кардиомиоциты, культивируемые в условиях нормоксии (95% воздуха/5% С02);
B) - кардиомиоциты, культивируемые в условиях гипоксии/реоксигенации в присутствии 30 пМ очищенного ЭП, продуцируемого РЕЯ.С6™;
C) - кардиомиоциты, культивируемые в условиях гипоксии/реоксигенации в присутствии 30 пМ очищенного препарата Эпрекс; и
Ό) - кардиомиоциты, культивируемые в условиях гипоксии/реоксигенации в отсутствие ЭП.
Все эксперименты проводили в тройной повторности. Апоптоз оценивали с помощью морфологического анализа, лэддеринга ДНК и по наличию терминальных концевых меток в виде разрывов фосфодиэфирной связи в биТР, опосредованных дезоксирибонуклеотидтрансферазой (ТОЙЕЕ). Для проведения морфологического анализа монослойные культуры миоцитов фиксировали и окрашивали красителем Η(κο1ΐΜ 33324.
Морфологические особенности апоптоза (сморщивание клеток, конденсация и фрагментация хроматина) отслеживали с помощью флуоресцентной микроскопии. Просматривали по крайней мере 400 клеток в 12 случайным образом выбранных полях на каждой чашке.
Для выявления лэддеринга ДНК (характерного для апоптоза) кардиомиоциты лизировали в лизирующем буфере и подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле. Полученный гель окрашивали этидийбромидом и фрагменты ДНК визуализировали в ультрафиолетовом свете. Выявление апоптозных кардиомиоцитов ίη δίΐιι проводили с использование метода ТОЙЕЕ с использованием набора для выявления гибели клеток ίη δίΐιι (ВοеЬ^^ηде^ МаηηЬе^т).
Пример 13. Эффект РЕЯ.С6™-ЭП и сывороточного ЭП на размеры инфарктной зоны на крысиной модели ишемии/реперфузии миокарда
Взрослых самцов крыс линии 8ргадие-Оа^1еу (весом от 300 до 400 г) анестезировали с помощью пентобарбитала натрия (20 мг/кг, в/б) и кетамина-НС1 (60 мг/кг, в/б). К яремной вене и трахее присоединяли канюли и проводили вентилирование, поддерживая 100% уровень кислорода, с помощью вентилятора для грызунов, приспособленного для поддержания уровня выдыхаемого СО2 в пределах от 3,5 до 5%. Проводили левую торакотомию и шов располагали на расстоянии 3-4 мм от начала левой венечной артерии. За 5 мин до ишемии животные случайным образом получали различные концентрации РЕЯ.С6™-ЭП, ЭП сывороточного типа или физиологический раствор (η=6 для каждой группы). Ишемию (30 мин) инициировали путем затягивания шва вокруг венечной артерии и завершали последующей реперфузией в течение 4 ч. Крыс с симулированной операцией готовили идентично, за исключением того, что шов не затягивали (η=6).
После реперфузии определяли размеры инфарктной зоны с помощью дифференциального окрашивания запатентованным сине-фиолетовым красителем (5%) и хлоридом трифенилтетразолия (ТТС). Затем вновь перетягивали венечную лигатуру и делали внутривенную инъекцию запатентованного синефиолетового красителя для окрашивания нормально перфузированных участков сердца. Затем сердце удаляли, и промывали его в ванночке с охлажденным на льду физраствором перед удалением предсердия, крупных сосудов и правого желудочка. Левый желудочек разрезали на тонкие секции и неокрашенные зоны риска (ААЯ) отделяли от нормально перфузированных синих секций, разрезали на кусочки по 1-2 мм3 и инкубировали с ТТС. С помощью препаровальной лупы некротические зоны (ΑΝ, бледно окрашенные) отделяли от ТТС-положительных (окрашенных в кирпично-красный цвет) зон. Затем все зоны миокарда взвешивали по отдельности и подсчитывали размеры инфарктных зон.
Пример 14. Выделение и фракционирование гликоформ РЕЯ.С6™-ЭП, содержащих большое количество а-1,3-связанной фукозы
Использовали специфичный для фукозы лектин из А1еипа ηιιπιηΐίη (ААБ) для предпочтительной очистки гликоформ РЕЯ.С6™-ЭП с высоким содержанием ЕеЮк-Х и/или сйалил-БеЮк-Х. ЭП, который секретируется в культуральную среду ЭП-продуцирующими клетками РЕЯ.С6™, вначале отделяли от клеточных обломков и других контаминирующих веществ аффинной хроматографией на колонке с ис
- 23 008220 пользованием моноклональных антител, специфичных для ЭП человека (см. пример 2). После этого примерно 270 мкг (или 27000 еИ) очищенного ЭП подвергали второй хроматографической процедуре, при которой молекулы ЭП связывали на колонке, содержащей иммобилизированный ААЬ, при скорости потока 0,1 мл/мин (ААЬ-колонка Нбгар на 1 мл, Вю Меб ЬаЬк). Гликоформы ЭП, несущие фукозу, элюировали с колонки с использованием Ь-фукозы (Б1дта) в качестве конкурента за связывание с ААЬ. Получали четыре субфракции ЭП при применении ступенчатого градиента фукозы в ФСБ (С1Ьсо, содержащем 154 мМ №С1; 1,05 мМ КН2РО4 и 3,0 мМ №2НРО4; рН 7,4), начиная с 60 мкМ фукозы (фракция 1), затем при 200 мкМ фукозы (фракция 2), затем при 400 мкМ фукозы (фракция 3) и в заключение при 1000 мкМ фукозы (фракция 4). Первая стадия градиента длилась 10 мин, а другие стадии градиента длились 5 мин при скорости потока 0,5 мл/мин. Сигнал УФ при 214 нМ на хроматограмме показывает, что материал элюируется с колонки в каждой фракции (см. фиг. 9). Собирали порции по 0,5 мл и объединяли фракции из двух или трех пиков (см. фиг. 9).
Буфер в указанных фракциях заменяли с использованием микроконденсатора 10 кДа-микрокон (МбБроге) на 20 мМ фосфат, и фракции концентрировали на таком же микроконденсаторе до объема 2030 мкл. Ν-связанные гликаны высвобождали из пулов ЭП обработкой Ν-гликаназой Р и подвергали десиалилированию при обработке нейраминидазой. Репрезентативные спектры МАЬЭ1-ТОР МБ различных образцов ЭП показаны на фиг. 10А. Относительное обогащение каждого пула различными олигосахаридами также приведено (см. табл. IX) . Полученные результаты показывают, что фракции, элюируемые с ААЬ-колонки позже, содержат относительно больше фукозных остатков. Так, например, фракции, элюируемые с колонки позже, обогащены гликанами, дающими пики при 2507,9 и 2978,1 Да, которые содержат 3 или 4 фукозных остатка, тогда как гликаны с массой 1891,7 и 2215,8, которые содержат всего лишь 1 фукозный остаток, относительно мало представлены в указанных фракциях. Исходя из этого видно, что указанные фракции обогащены Ν-гликанами, содержащими так называемые ЬеМк-Х-структуры. Среднее число ЬеМк-Х-структур на молекулу ЭП в Ν-связанных гликанах, которые высвобождали с использованием РНС-азы Р и обнаруживали методом МАЬЭ1-ТОР МБ, составляло в данным эксперименте: 2,2 для фракции 1; 2,7 для фракции 2; 3,6 для фракции 3; 4,1 для фракции 4. Исходный материал содержал 2,6 структур ЬеМк-Х на молекулу ЭП. В независимом эксперименте с клоном С25 была получена фракция 4 (спектр показан на фиг. 10В), которая еще больше обогащена структурами ЬеМк-Х, имея в Νсвязанных гликанах 5,7 структур ЬеМк-Х на молекулу ЭП. Указанный метод позволяет очищать эритропоэтин из культуральной среды с использованием специфических характеристик посттрансляционных модификаций, таких как наличие структур ЬеМк-Х, произведенных клетками, в которых продуцируется данный белок. Это, однако, не говорит о том, что не могут использоваться другие способы для соответствующей очистки белка с (заданными) посттрансляционными модификациями.
Материал, элюируемый во фракции 4, представляет собой новую форму ЭП; он содержит преимущественно Ν-связанные гликаны с массой примерно 2185 кДа, что, в свою очередь, соответствует комплексному би-антенному Ν-связанному сахару с наличием СаШАс-ЬеМк-Х-структур в обеих антеннах. Фракция 4 содержала примерно 8% от общего количество ЭП, который был элюирован во фракциях 1-4. Это указывает на то, что новая форма ЭП с преимущественным содержанием биантенных СаШАс-ЬеМкХ-структур отражает низкое содержание такой формы ЭП, которая может быть обогащена с использованием описанного выше способа.
Пример 15. Выделение и фракционирование гликоформ РЕК.С6™-ЭП с высоким содержанием Басб|НАс
Гликоформы РЕК.С6™-ЭП, несущие так называемые олигосахаридные структуры ^асб^NΑс, специфически выделяли с использованием моноклональных антител против указанных Басб|НАс-структур. Мышиные моноклональные антитела, такие как 99-2А5-В, 100-2Н5-А, 114-2Н12-С, 259-2А1 и 273-3Р2 (Уап Ветоойеге е! а1., 2000), специфически распознающие структуры ^асб^NΑс, очищают и связывают с гранулами СИВг-активированной сефарозы 4В в соответствии с процедурой, известной специалистам в данной области техники. РЕК.С6™-ЭП, который секретируется в культуральную среду продуцирующими ЭП человека клетками РЕК.С6™, вначале предварительно отделяют от клеточных остатков и других контаминирующих веществ посредством аффинной хроматографии на колонке с использованием моноклональных антител, специфичных для ЭП человека. После этого предварительно очищенный ЭП подвергают повторной хроматографической процедуре, при которой молекулы ЭП, несущие Басб|НАсструктуры, связываются на колонке, содержащей иммобилизованные Басб|НАс-специфичные моноклональные антитела. Гликоформы ЭП, которые лишены ^асб^NΑс-структур, не связываются на данной колонке и собираются в проходящем объеме. Гликоформы ЭП, несущие ^асб^NΑс-структуры, элюируются с колонки при низком рН или с использованием СаШАс или синтетических Басб|НАс-олигосахаридов в качестве конкурентов за связывание с Ьасб1№с-специфичными антителами. Гликоформы ЭП, несущие относительно высокий процент ^асб^NΑс-структур, отдельно элюируют с колонки ступенчато или постепенно повышающейся концентрацией СаТЫАс или Басб|НАс. Гликоформы ЭП с относительно высоким процентом содержания Басб|НАс-структур элюируются при более высокой концентрации СаШАс или ^асб^NΑс, чем гликоформы ЭП, обладающие относительно низким процентом содержания Ьасб1NΑс-структур. Согласно описанному выше способу, указанный способ позволяет также очищать эритро
- 24 008220 поэтин из культуральной среды с использованием специфических характеристик посттрансляционных модификаций, таких как наличие структур Ьеущ-Х и касШНАс, произведенных клетками, в которых продуцируется данный белок.
Пример 16. Выделение и фракционирование гликоформ РЕР.С6™-ЭП с высоким содержанием Са1НАс-Ре\\'15-Х
Гликоформы РЕР.С6™-ЭП, несущие так называемые баШАс-ЬеуЦ-Х олигосахаридные структуры, специфически выделяли с использованием моноклональных антител против указанных СаШАс-ЬеуЦ-Хструктур. Мышиные моноклональные антитела, такие как 114-5В1-А, 176-3А7, 290-2Э9-А и 290-4А8 (Уап Кетоойеге е1 а1., 2000), специфически распознающие структуры СаШАс-ЬеуЦ-Х, очищают и связывают с гранулами СИВт-активированной сефарозы 4В в соответствии с процедурой, известной специалистам в данной области техники. РЕК.С6™-ЭП, который секретируется в культуральную среду продуцирующими ЭП человека клетками РЕР.С6™, вначале предварительно отделяют от клеточных остатков и других контаминанирующих веществ посредством аффинной хроматографии на колонке с использованием моноклональных антител, специфичных для ЭП человека. После этого предварительно очищенный ЭП подвергают повторной хроматографической процедуре, при которой молекулы ЭП, несущие СаШАсЬеЮк-Х-структуры, связываются на колонке, содержащей иммобилизованные СаШАс-Ьеущ-Хспецифичные моноклональные антитела. Гликоформы ЭП, которые лишены СаШАс-Ьеущ-Х-структур, не связываются антителами, закрепленными на данной колонке, и собираются в проходящем объеме. Связавшиеся гликоформы ЭП, несущие СаШАс-Ьеущ-Х-структуры, элюируются с колонки при низком рН или с использованием синтетического СаШАс-ЬеЮк-Х в качестве конкурента за связывание с Са1НАс-Ре\у15-Х-специфичными антителами. Гликоформы ЭП, несущие относительно высокий процент СаШАс-Ьеущ-Х-структур, могут быть отдельно элюированы с колонки ступенчато или постепенно повышающейся концентрацией конкурента СаШАс-ЬеуЦ-Х.
Гликоформы ЭП с относительно высоким процентом содержания СаШАс-Ьеущ-Х-структур элюируются при более высокой концентрации СаШАс-Ьеущ-Х, чем гликоформы ЭП, обладающие относительно низким процентом содержания СаШАс-ЬеуЦ-Х-структур. И вновь, в соответствии с описанными выше способами, данный метод позволяет также очищать ЭП из культуральной среды с использованием специфических характеристик посттрансляционных модификаций, таких как структуры Ьеущ-Х, ЬасЛNАс или СаШАс-Ьеущ-Х, произведенных клетками, в которых продуцируется данный белок. Это, однако, не означает, что другие модификации с (заранее заданными) посттрансляционными модификациями не могут использоваться для соответствующей очистки указанного белка.
Специалистам в данной области очевидно, что несмотря на то, что данное описание проиллюстрировано подробными примерами, относящимися к ЭП, настоящее изобретение не ограничивается продукцией и/или очисткой ЭП с характеристиками мозгового типа. Различные другие терапевтические и/или диагностические пептиды и белки (человека), которые могут найти применение при лечении заболеваний мозга и других частей центральной и периферической нервной системы и/или ишемических/реперфузионных повреждений тканей, могут быть получены с использованием средств и способов по настоящему изобретению.
Пример 17. ЭП с низким содержанием сиаловой кислоты имеет такую же активность, как ЭП с высоким содержанием сиаловой кислоты в плане снижения размера зоны инфаркта после окклюзии средней церебральной артерии у крыс
Эффект РЕР.С6™-ЭП и препарата Эпрекс на размер инфаркта мозга, который экспериментально индуцируется окклюзией средней церебральной артерии (СЦА), исследовали на самцах крыс линии Г344/1со весом 200-250 г с использованием способа, аналогичному способу, описанному 8пеп е1 а1., (2001). Правую сонную артерию животных подвергали постоянной окклюзии, тогда как СЦА подвергали обратимой окклюзии в течение 60 мин с использованием металлического зажима. Очищенный РЕР.С6™ЭП со средним содержанием сиаловой кислоты <6 сиаловых кислот на молекулу или Эпрекс (1апзепС11ад; коммерчески доступный ЭП) со средним содержанием сиаловой кислоты > 9 сиаловых кислот на молекулу вводили внутривенно за 5 мин до начала окклюзии СЦА в дозе 5000 еИ (ЕБ18А ι.ιπίΐδ; единицы ИФТФА) на кг веса тела. Следует отметить, что содержание сиаловой кислоты в препарате РЕР.С6™-ЭП варьировало в диапазоне 0-9 сиаловых кислот на молекулу, в то время как Эпрекс содержал более 8 сиаловых кислот на молекулу. По истечении 60-минутного периода окклюзию завершали удалением металлического зажима, опоясывающего СЦА. Реперфузию наблюдали под микроскопом после удаления зажима. Через 24 ч осматривали мозг живых крыс с использованием ЯМР-томографии для выявления вероятного коэффициента диффузии (АЭС) и Т2-картирования. Указанные карты использовали для количественной оценки объемов инфаркта (фиг. 7А и 7В).
Результаты, представленные на фиг. 7А и 7В, показывают, что крысы, которым вводили препараты РЕР.С6™-ЭП и Эпрекс, демонстрировали сходное снижение зоны инфаркта по сравнению с животными, которым препараты не вводились. Так как препарат РЕР.С6™-ЭП имеет значительно более низкое содержание сиаловой кислоты, чем препарат Эпрекс, данный результат показывает, что высокое содержание сиаловой кислоты не является обязательным для нейропротекторной активности ЭП ш νίνο.
- 25 008220
Пример 18. Определение периода полувыведения ЭП у крыс
Для определения периода полувыведения препарата Эпрекс ίη νίνο самцам крыс линии \Уад/Ку вводили внутривенной инъекцией 150 еИ препарата Эпрекс, разведенного в ФСБ/0,05% Твин-80 до конечного объема 500 мкл. Непосредственно перед введением указанного субстрата отбирали 200 мкл ЭДТА-образца крови в качестве отрицательного контроля, используя методику, описанную в ЬаЬ. Лштак 34, 372. В моменты времени !=5, 15, 30, б0, 120, 180, 240, 300, 3б0, 420, 480 и 540 мин после инъекции отбирали ЭДТА-образцы крови животных объемом 200 мкл с использованием той же методики. После отбора последнего образца крови животных забивали. Полученные образцы центрифугировали при 7б0 д в течение 15 мин при комнатной температуре в пределах 30 мин с момента отбора образца. Образцы полученной плазмы исследовали методом ЭП-специфичного ИФТФА (К&П) для определения концентрации ЭП в каждом образце.
Как показано на фиг. 8, снижение концентрации препарата Эпрекс в плазме описывается двухфазной кривой, соответствующей фазе распределения и фазе клиренса. На основании таких результатов можно считать установленным, что Эпрекс имеет период полувыведения примерно 180 мин в фазе клиренса. Период полувыведения РЕК.Сб™-ЭП измеряют с использованием такой же процедуры.
Пример 19. Эффект экспрессии Е1А на гликозилирование ЭП в клетках НТ1080
Клетки НТ1080 стабильно трансфицировали векторами экспрессии, кодирующими гены аденовирусного Е1А типа 5 (ρ^ΒΙΑ^ο) или Е1А+Е1В (р1д.Е1А.Е1В; обе плазмиды описаны в патенте США 5994128), для определения влияния экспрессии генов аденовирусного Е1А типа 5 и/или Е1А+Е1В на гликозилирование. Для осуществления гликозилирования маркерного белка клетки совместно трансфицировали вектором экспрессии, кодирующим ЭП (ρЕР02001/ηеο). Контрольные клетки НТ1080 трансфицировали только вектором экспрессии ЭП.
Трансфекцию проводили с помощью липофектамина (ΌΦοο). когда клетки достигали состояния 7090% слияния, используя 1,0 мкг ρЕ1Α.ηеο или рЕ1А.Е1В и 1,0 мкг рЕРО2001.пео на чашку площадью 7,85 см2. Среду заменяли на 2, 3, 7, 10 и 13 день селективной средой, содержащей ЭМЕМ, 1% НОАК (необязательные аминокислоты, 1№Йгодеп), 250 мкг/мл генетицина (ΌΦοο) и 10% ФСБ. Предварительные эксперименты со стабильно Е1 А-трансфицированными клетками НТ1080 выявили, что экспрессия Е1 А приводит к изменению морфологии клеток. В соответствии с наблюдениями, описанными Епксй е! а1., (1991), авторы настоящего изобретения показали, что стабильная экспрессия гена Е1А индуцирует гладкую морфологию. На основе этой информации авторы провели грубый отбор Е1А-экспрессирующих клонов путем выбора гладких клонов. Указанные клоны отбирали на 14 день и культивировали на 24луночных планшетах с селективной средой в условиях 37°С/10% СО2.
ЭП-продуцирующие клетки отбирали на основании присутствия ЭП в среде, когда клетки достигали состояния, близкого к слиянию. ЭП измеряли с использованием ЭП-специфичного ИФТФА (ΟιιηηΙίк1пе® 1УЭ йитап ЕРО-ЕЫБА, К&Э кук!етк). ЭП-продуцирующие культуры увеличивали в масштабе и анализировали на экспрессию Е1А. Для этого клетки лизировали в лизисном буфере (1% №40, 0,5% дезоксихолевой кислоты, 0,5% ДСН, 150 мМ ЫаС1, 20 мМ Трис-НС1, рН 7,5), с добавкой одной таблетки полного мининабора ингибиторов протеиназ (Кцсйе ΟιηβΩοκΙιοκ) на 10 мл. Лизаты осветляли центрифугированием в течение 10 мин при 14000 д. Равные количества (по содержанию белка) осветленного лизата клеток подвергали электрофорезу в восстанавливающих условиях с использованием 10% БисТрис геля (ЫцРАСЕ, 1пуйгодеп). Затем белки переносили на РЭУЕ-мембрану (Р-IттοЬ^1οη) с использованием системы ЫиРАСЕ (1пуйгодеп) для транс-блоттинга. Блотты блокировали в течение 1 ч или в течение ночи при комнатной температуре с добавлением 5% Протифара (ΓΓοΙίΤηΓ (ЫЩпша)) в ТВБТ, после чего проводили инкубацию с моноклональными мышиными 1дС2 против человеческого Е1А (клон М73, Бап!а Сги/), разведенными 1:400 в 5% Протифар/ТВБТ, в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4°С. Блотты промывали ТВБТ и инкубировали с конъюгированными с пероксидазой козьими антителами к мышиному 1дС (Вюгаб), разведенными 1:1000 в 5% Протифар/ТВБТ, в течение 45 мин при комнатной температуре. После промывания с использованием ТВБТ блотты окрашивали с использованием системы ЕСЬ-плюс (Атегкйат Рйагташа Вю!есй). 55% ЭП-положительных клонов Е1А и б8% ЭП-положительных клонов Е1А.Е1В демонстрировали явную экспрессию Е1А (таблица Х). Клоны НТ1080/Е1А-ЭП и НТ1080/Е1А.Е1В-ЭП, которые в высокой степени экспрессировали Е1А, демонстрировали гладкую морфологию (см., например, фиг. 11).
ЭП для анализа гликанов получали с помощью клонов НТ1080/ЭП, НТ1080/Е1А-ЭП и НТ1080/Е1А.Е1В-ЭП. Для этого клон 008 НТ1080/Е1А.ЭП, клон 072 НТ1080/Е1А.Е1В.ЭП и клон 033 НТ1080/ЭП (табл. Х) высевали в матрасы на 175 см2 на стадии пассажа номер (пн) 7. Через 24 ч, когда клетки достигали уровня слияния б0-80%, селективную среду заменяли на среду для продуцирования (ОМЕМ, 1 % НОАК). Указанную среду отбирали через 3 дня, а клетки лизировали лизирующим буфером. ЭП очищали из среды по методике примера 2.
Ν-связанные гликаны из различных препаратов ЭП высвобождали обработкой Ν-гликаназой Е и затем анализировали высокоэффективной анионообменной хроматографией с импульсным амперометрическим детектированием (ВЭАОХ-ИАД; Дионекс (НРАЕС-РАЭ; Эюпех)). В этой хроматографической системе полученные из ЭП гликановые цепочки разделяют в щелочных условиях на основании их заря
- 2б 008220 да. Как показано на фиг. 12, гликаны, полученные из ЭП, продуцируемого клетками НТ1080/Е1А-ЭП, менее заряжены, чем гликаны из ЭП, продуцируемого контрольными клетками НТ1080/ЭП, что указывает на то, что ЭП, продуцируемый последними клетками, является значительно более сиалилированным, чем ЭП, продуцируемый Е1А-экспрессирующими клетками. Более детальная информация по структуре указанных Ν-гликанов была получена при анализе методом МЛБШ-МЗ сахарных цепей из препаратов ЭП. Ν-связанные гликаны высвобождали из препаратов ЭП посредством обработки Ν-гликаназой Е и подвергали десиалилированию посредством обработки нейраминидазой. Масс-спектры различных репрезентативных препаратов ЭП представлены на фиг. 13. Для прогнозирования состава сахаров на основании полученных масс-спектров (табл. XI) использовали программное обеспечение ΟΙλΌοΙΠοά (\ν\ν\ν^χρα5ν.Οι/Ιοο15/β1\Όοιηοά).
Приведенные данные показывают, что масс-спектры гликанов из ЭП, продуцируемого контрольными клетками НТ1080/ЭП, отличается от таковых из ЭП, продуцируемого клетками НТ1080/Е1А-ЭП и НТ1080/Е1А.Е1В-ЭП. Указанные масс-спектры показали, что ЭП, продуцируемый последними клетками, обладает относительно меньшим количеством гексоз и относительно большим количеством дезоксигексоз по сравнению с ЭП, продуцируемым контрольными клетками. Кроме того, гликановые структуры с относительно низкой массой, содержащие относительно большое количество гексозаминов и дезоксигексоз, были обнаружены в ЭП, продуцируемом клетками НТ1080/Е1А-ЭП и НТ1080/Е1А.Е1В-ЭП. Некоторые из них отсутствовали в ЭП, продуцируемом контрольными клетками. Масс-профили гликанов из ЭП, продуцируемого клетками НТ1080, экспрессирующими Е1А и Е1А+Е1В, аналогичны таковым для гликанов из ЭП, продуцируемого клетками РЕК.С6™ (см. пример 3), что позволяет предположить, что гликаны из ЭП, продуцируемого первыми клетками, содержат структуры ЬеМк-Х и ЬасФНЛс, и что эти структуры лишены концевых галактоз.
Для подтверждения того, что ЭП, продуцируемый клетками НТ1080, экспрессирующими Е1А и Е1А+Е1В, содержит больше фукоз и СаШЛс, чем ЭП, продуцируемый контрольными клетками НТ1080, был проведен анализ моносахаридов. Для этого Ν-связанные гликаны высвобождали из препаратов ЭП посредством обработки Ν-гликаназой Е и нейраминидазой и затем проводили их гидролиз и анализ методом ВЭАОХ-ИАД. На фиг. 14 показаны профили моносахаридов из гликанов ЭП, нормализованные по содержанию маннозы. Приведенные данные показывают, что Ν-связанные гликаны из ЭП, продуцируемого клетками, экспрессирующими Е1 А и Е1 А+Е1 В, действительно обладают относительно высокими количествами фукозы и Са1ХЛс.
Масс-спектры и данные по моносахаридам являются сильным основанием для заключения, что ЭП, продуцируемый клетками, экспрессирующими Е1 А и Е1А+Е1 В, содержит множественные остатки фукозы. Для подтверждения этих данных препараты ЭП обрабатывали альфа-фукозидазой (миндальная мука), расщепляющей концевые альфа-1,3- и альфа-1-4 остатки фукозы. После этого образцы анализировали методом МЛБЭ1-М8 и результаты сравнивали с результатами, полученными для препаратов ЭП, которые не подвергались обработке альфа-фукозидазой. На фиг. 15 показано, что после обработки альфафукозидазой пики, которые отражают Ν-гликаны с антенными фукозами, уменьшаются, а пики, которые получены из указанных структур, возрастают. Например, пики со значениями т/ζ ~ 2038 и ~2184 уменьшаются, в то время как пик ~1892 возрастает.
В целом, приведенные данные показывают, что экспрессия аденовирусного Е1 А, одного или в сочетании с Е1 В, может менять профиль гликозилирования клеток. Данные о том, что экспрессия одного Е1 А достаточна для такого изменения, указывают на то, что именно Е1А ответственен за такое изменение. Изменения в гликозилировании в типичном случае включают образование структур ЬеМк-Х, БасШХЛс и баШЛс-ЬеМк-Х. Многие клетки НТ1080, экспрессирующие Е1А и Е1А+Е1В, были охарактеризованы, при этом большая часть указанных клеток продуцировала гликаны, которые обладают указанными характерными гликановыми структурами. Показано также, что насыщенность указанными структурами варьировала по сравнению с гликановыми структурами, которые продуцируются родительскими клетками НТ1080 (данные не приведены). Насыщенность указанными гликановыми структурами в значительной мере коррелировала с уровнем экспрессии Е1 А. Это указывает на то, что степень, в которой профиль гликозилирования подвержен влиянию Е1А, находится в большой зависимости от уровня экспрессии гена Е1 А.
Пример 20. Сравнение гемопоэтической активности РЕК.С6™-ЭП и СНО-ЭП в высокой дозе
Гемопоэтическую активность РЕК.С6™-ЭП определяли у крыс и сравнивали с таковой у ЭП, полученного из клеток яичника китайского хомячка (СНО-ЭП). Были выбраны два препарата СНО-ЭП: (1) Эпрекс (Ιαη^η С11ад), который представляет собой коммерчески доступный рекомбинантный СНО-ЭП с высоким содержанием сиаловой кислоты и (2) 1гСНО-ЭП, препарат СНО-ЭП с более низким (аналогичным таковому у РЕК.С6™-ЭП) содержанием сиаловой кислоты (см. фиг. 16), который получали путем продуцирования ЭП клетками СНО с последующей очисткой указанных слабо сиалилированных изоформ методами хроматографии, описанными в примерах 2 и 3 и в документе ЕР 0428267.
Исследование проводили с четырьмя группами из шести крыс линии \УЛС/Щ|. Однократную дозу в 5000 еИ (ЕЫБЛ ишЩ; единицы ИФТФА, определяемые с помощью коммерчески доступного ЭП
- 27 008220 специфичного набора для ИФТФА (ЭП-8рес1йс Β&Ό ЕШа Κι!)) на кг веса тела препаратов Эпрекс, ЙСНО-ЭП и РЕЙ.С6™-ЭП или буфер для разведений (в качестве контроля) вводили внутривенно в вену полового члена. Все препараты ЭП разводили до требуемой концентрации буфером для разведений (ФСБ; 0,03% Твин-80; 0,5% глицин) до общего объема 500 мкл. Через четыре дня методом пункции языка отбирали по 250 мкл ЭДТА-образцов крови. В тот же день проводили анализ отобранных образцов крови на величину гематокрита и процентное содержание ретикулоцитов в общей популяции эритроцитов с использованием автоматического гематоцитометра.
Определяли уровень гематокрита и выражали его в виде объемного процента осадка эритроцитов, получаемого после центрифугирования крови (фиг. 17). Приведенные результаты показывают, что РЕЙ.С6™-ЭП и ЙСНО-ЭП не индуцировали гематокрит, тогда как Эпрекс делал это.
Как показано на фиг. 18, ЭП индуцировал значительное увеличение количества ретикулоцитов по сравнению с крысами, которые получали только буфер для разведений. Эпрекс и ЙСНО-ЭП демонстрировали похожую стимуляцию; указанная стимуляция значительно выше (р<0,001), чем у животных, которым инъецировали РЕЙ.С6™-ЭП.
Оценка содержания РНК в ретикулоцитах позволила определить степень их зрелости. На фиг. 19 показана незрелая фракция ретикулоцитов (НРФ). Крысы, получавшие Эпрекс, демонстрировали значительно более высокий процент незрелых ретикулоцитов по сравнению с контрольными крысами. Это указывает на то, что образование ретикулоцитов, стимулированное препаратом Эпрекс, все еще имеет место после четырех дней с момента его инъекции. Этот эффект менее выражен или совсем отсутствует у крыс, которым вводили ЙСНО-ЭП и РЕЙ.С6™-ЭП, соответственно (фиг. 19).
В целом, приведенные данные показывают, что все три препарата ЭП индуцируют образование ретикулоцитов; кроме того, продолжительность такого эффекта была наиболее длительной у препарата Эпрекс и наиболее короткой у РЕЙ.С6™-ЭП, тогда как ЙСНО-ЭП демонстрировал промежуточный эффект. Это свидетельствует о том, что низкий гемопоэтический эффект РЕЙ.С6™-ЭП связан не только с низким содержанием сиаловой кислоты, но также и с другими особенностями структуры гликанов.
Пример 21. Детальный анализ структуры Ν-гликанов из РЕЙ.С6™-ЭП
Масс-сигналы, полученные при масс-спектрометрии, не всегда можно однозначно присвоить определенной сахарной структуре в связи с тем фактом, что могут существовать различные изомерные структуры. Для получения дополнительной информации о структуре Ν-связанных гликанов в РЕЙ.С6™-ЭП была осуществлена эндо- и экзогликозидазная обработка препаратов РЕЙ.С6™-ЭП.
Вначале использовали обработку эндогликозидазой Р2. Этот фермент осуществляет расщепление между остатками С1сКЛс в триманнозильном ядре Ν-связанных гликанов с высоким содержанием маннозы или би-антенных комплексов (фиг. 20). В отличие от РКС-азы Р, эндогликозидаза Р2 не расщепляет три- и тетра-антенные гликаны и может, в этой связи, быть использована для выявления различий между би- и три-/тетра-антенными гликановыми структурами. На фиг. 21 представлены МЛЬБ 1-спектры РЕЙ.С6™-ЭП, обработанного РNС-азой Р или эндопротеиназой Р2. При сравнении полученных спектров следует иметь в виду, что гликаны, высвобождаемые эндогликозидазой Р2, имеют меньший размер, чем гликаны, высвобождаемые РКС-азой Р. Это определяется различием в остатках С1сКЛс и фукозы (349 Да) и связано с различием сайтов расщепления указанных ферментов (см. фиг. 20).
Все структуры, наблюдаемые при расщеплении РКС-азой Р, при значении т/ζ >2185 представляют собой три- или тетра-антенные структуры, поскольку ни один из указанных гликанов не наблюдается при расщеплении эндогликозидазой Р2. Большинство структур с меньшими массами, то есть со значениями т/ζ 1485, 1648, 1689, 1835, 1851, 1997, 2038 и 2185, имеют соответствующие пики при расщеплении эндогликозидазой Р2 и являются би-антенными. Возможно, что присутствуют также и некоторые изомерные три- и тетра-антенные структуры, но их не так много, поскольку соотношение пиков в обоих спектрах, как видно на фиг. 21, в значительной мере сопоставимо. Спектр после расщепления эндогликозидазой Р2 не содержит пиков, соответствующих величине т/ζ 1892 и 2054, присутствующих в спектре после расщепления РКС-азой Р. Это доказывает, что указанные пики отражают гликаны, которые не являются би-антенными, а являются тетра-антенными без или с одним галактозным остатком, соответственно. Указанные данные подтверждают, что РЕЙ.С6™-ЭП содержит гликаны с концевым С1сКЛс.
Далее, были использованы экзогликозидазы для дальнейшего исследования Ν-гликановых структур. Гликаны высвобождали из РЕЙ.С6™-ЭП с помощью РКС-азы Р и подвергали десиалилированию с использованием нейраминидазы.
В дальнейшем образцы обрабатывали различными сочетаниями приведенных ниже экзогликозидаз:
1) β-галактозидаза, которая расщепляет невосстановленный, концевой Са1р1-4С1сКЛс (и Саф14Са1ЫЛс и при более высоких соотношениях фермента Саф 1-3 связки).
2) . α-Фукозидаза из почки быка, которая расщепляет α1-2,3,4 и 6-связанную фукозу из Ν- и Огликанов. Она расщепляет α1-6 связанную фукозу в триманнозильном ядре Ν-связанных гликанов более эффективно, чем другие α-фукозные связки.
3) α-Фукозидаза из миндальной муки, которая расщепляет невосстановленные, концевые α1-3 или α1-4 фукозидазные остатки.
- 28 008220
4) β-Ν-ацетилглюкозаминидаза (С1сЫАс-аза), которая расщепляет невосстановленный, концевой β1-2, 3, 4, 6-связанный Ν-ацетилглюкозамин из сложных углеводов. Она не расщепляет Νацетилгалактозаминовые остатки.
Типы химических связей, ожидаемые в гликанах РЕК-С6™-ЭП, показаны на фиг. 22. Одновременно проводили инкубацию с галактозидазой и фукозидазой, то есть во время обработки фукозидазой присутствовала также активная галактозидаза. Далее проводили обработку С1сЫАс-азой, когда галактозидаза и фукозидаза теряли свою активность.
На фиг. 23 представлены результаты обработки галактозидазой. На данной фигуре показаны значения т/ζ и относительные интенсивности всех пиков в спектре, которые имеют относительную интенсивность (то есть высоту пика, деленную на суммарную высоту всех пиков) 5% или выше. Показаны также предполагаемые гликановые структуры. Пики, которые соответствуют галактозилированным структурам, сдвинуты после галактозидазной обработки, хотя и не полностью. Было обнаружено, что галактозидаза не высвобождает галактозу, когда фукоза присутствует на соседнем остатке ΟΙοΝΑο. Некоторые три-антенные гликаны, по всей видимости, появляются после галактозидазной обработки (т/ζ 1689) . Это вызвано загрязнением С1сЫАс-азы, которое, как было показано с использованием стандартных гликанов, присутствует в препарате галактозидазы (данные не приведены).
Гликаны, обработанные гликозидазой, подвергали затем обработке фукозидазой (фиг. 24 и 26). В случае фукозидазы из почки быка это приводит к сдвигу на 146 Да всех пиков в спектре. Это связано с массой фукозного остатка. Поскольку указанная фукозидаза предпочтительно расщепляет α1-6связанные фукозные остатки и, в этой связи, все пики теряют только одну единицу в 146 Да, это указывает на то, что все гликаны содержат в ядре фукозу.
Пул гликанов, обработанных галактозидазой, который затем инкубировали с фукозидазой из миндальной муки, дал относительно простой спектр (фиг. 25 и 26). Все фукозные остатки удалялись из антенн, оставляя только простые (ядерные) фукозилированные гликаны. Оставшиеся концевые галактозные остатки также удалялись, поскольку галактозидаза все еще была активна во время инкубирования с фукозидазой. После обработки дефукозилированных гликанов С1сЫАс-азой оставалось только четыре пика. Основной пик наблюдался при значении т/ζ 1079 и соответствует фукозилированному триманнозильному ядру. Пики со значениями т/ζ 1485 и т/ζ 1891 подтверждают наличие остатка СаШАс в антенне, поскольку указанный остаток не удаляется С1сНАс-азой. Пик со значением т/ζ 1444 подтверждает присутствие лактозаминовых повторов: галактоза должна быть защищена ΟΙοΝΑο во время обработки галактозидазой.
Список литературы
Апскогб ΌΤ, Вто! РЕ, Ве11 СЕ апб 81у \У8 (1978) Нитап Ье1а-д1исигошбаке: ίη νίνο с1еагапсе апб ίη νίνο ир!аке Ьу а д1усорто1ет гесодшбоп кук!ет оп ге11си1оепбо(Ье11а1 се11к. Се11 15:269
ВагЬопе АС. Арапсю В, Апбегкоп ЭХУ. №11ага)ап ί апб КксЫе ΌΜ (1994) Не11си1осу1е теакигетеШк ак а Ьюаккау кот ету1кторо1е1т. 1 Ркагт Вютеб Апа1 12:515-522
Вппек МЬ, Сйе/ζί Р, Кеепап 8, Адпе11о Ό, Эе Ьапего11е ИС, Сегат1 С, Ιίτί ЬМ апб Сегат1 А (2000) Егу1кторо1ебп сгоккек Не Ь1ооб-Ьгат Ьатег !о рго(ес( адатк! ехрептеп(а1 Ьгат йцигу. Ргос Ма!1 Асаб 8с1 И8А 97:10526-10531
Виет1 М, А11едга А, Сопса Р, Р1оссап Р, Э'АуеИа Ό, А1о1к1 С, Са1ара1 С, 1асорто С апб Рпкта Ν (2000) 1п(гауепои5 гесотЬтап! егу1кторо1ебп боек по! 1еаб Ю ап тстеаке ш сетеЬтокрта1 к1шб ету1кторо1е1т сопсегИгайоп. №ркто1 Э|а1 Тгапкр1ап1 15:422-423
Виегке Ν, ХУеупск А8, Ζΐκπβ Ζ, Сае!а РСА, Роггек! Μί апб Ьекет АМ (1994) 81а1у1 ЬеМкх-соп1а1шпд оЬдокасскапбе айепиа(ек туосагб1а1 тереткикюп тщгу ш са!к. ί СЬп 1пх-ек1 93:1140-1148
СЫкита М, Макиба 8, КоЬауакЫ Т, Ыадао М апб 8акак1 В (2000) Пккие-кресШс теди1абоп ок егу!кгоро1е11п ргобисйоп ш !ке типпе к1бпеу, Ьга1п, апб и1егик. Ат ί Ркукю1 Епбосппо1 Ме!аЬо1 279:Е1242-Е1248
Эате С, .Тии1 8Е апб Скпк!епкеп КО (2001) Тке Ью1оду ок егу1кгоро1ейп т 1ке сеп!га1 пегхоик кук(ет апб 11к пеитойорЫс апб пеиторто!^!^ ро!еп11а1. Вю1 №опа(е 79:228-235
Роха11 С8, \Уа1коп 8К, Оо\уЬепко Ώ, Репте С, Ьакку ЬА е! а1. (1992) Тке 1кгее тетЬегк ок !ке ке1есйп гесерЮг катбу ^есοдη^ζе а соттоп сагЬокубга(е ерйоре: !ке к1а1у1 ЬеМкх оЬдокасскапбе. ί Се11 Вю1 117:895-902
Со!о М, Ака1 К, Мигакат1 А, НакЫтоЮ С, Ткиба Е, Иеба М, Ка^аткЫ С, ТакакакЫ Ν, 1кЫто1о А, СЫЬа Н апб 8акак1 К (1988) Ргобисйоп ок гесотЬтап! егу1кгоро1ейп ш таттаЬап се11к: кок1-се11 берепбепсу ок !ке Ью1одюа1 йсРуНу ок Ле с1опеб д1усорго!ет. Вю/Тескпо1оду 6:67-71
Спппе11 ВУ, Негтапп КВ, Уап 8В (1994) Нитап Рго1ет С 1пк1Ь11к ке1есйп-тебк11еб се11 абкекюп: го1е ок ипк.|ие ГисокукНеб окдокасскапбе. С1усоЬю1 4: 221-225.
Нокктапп А, ΝίιηΙζ М, \Уигк1ег и апб Сопгаб! Н8 (1994) СатЬокубга1е к1гпс1пгек ок [Эгасе рго1ет кгот китап сегеЬгокрта1 Птб: е^Ненсе ког Ьгатбуре Ы-д1усоку1а1юп. ί Ыеигоскет 63:2185-2196
Нокктапп А, ΝίιηΙζ М, СеМакк К апб Сопгаб! Н8 (1995) Ьгатбуре Ы-д1усоку1абоп ок ак1а1о4гапккетп кгот Ьитап сегеЬгокрта1 к1шб. РЕВ8 Ьей 359:164-168
- 29 008220
1ге1апб АР апб МасЬеоб А8 (1993) А теБйоб Бог Ппбтд кБегеоБахБс соогбБпаБек Бгот ЬгаБп кесББопк. Б №игоксБ МеБйобк 49:93-96
БоигбБап СА, Эеап Ь апб Кокетап 8 (1971) . Тйе кБаИс асБбк. Х1. А регБобаБе-гекогсБпо1 теБйоб Бог Бйе с.|иапБ1БаБ1уе екББтаББоп оБ Бгее кБайс асБбк апб 1Не1г д1усокБбек.
Бии1 8Е, Нагсит Б, Ь1 Υ апб СйпкБепкеп КО (1997) ЕгуБйгороБеББп 1к ргекепБ ш Не сегеЬгокрша1 Птб оБ пеопаБек. Б РебгБаБг 130:428-430
КопБкйБ Υ, Сйш Ό-Н, НБгоке Н, КипБкйББа Т апб ТаЬап Т (1993) ТгорйБс еББесБ оБ егуБйгороБеББп апб оБйег йетаБороБеББс БасБогк оп сепБга1 сйойпегдБс пеигопк Бп уББго апб ш у1уо. Вгаш Кек 609:29-35
Коге1х В, Уоп В Айегп К, Аапд Ν, ЬикББд Н8 апб СгеепЬегд ОА (1994) Рге- апб рокБкупарББс тоби1аБогк оБ ехсББаБогу пеигоБгапктБккюп: сотрагаББуе еББесБк оп йурохБа/йурод1усетБа Бп согББса1 сийигек. ВгаБп Кек 643:334-337
Ьои Б, Оауег Б-М, Сгаи СЕ апб Вигдег Ό (1996) ОБгесБ се11/се11 сопБасБ \\Ббй кББти1аБеб Т 1утрйосуБек Бпбисек Бйе ехргеккюп оБ се11 абйекБоп то1еси1ек апб суБокБпек Ьу йитап ЬгаБп тБсгоуакси1аг епбоБйейа1 се11к. Еиг Б 1ттипо1 26:3107-3113
Магдо1Бк КИ апб Магдойк КК (1989) №игоЬБо1оду оБ д1усосоп)идаБек. Р1епит Ргекк, Νο\ν Υо^к
МагББ НН, Сакктапп М, Аепдег КН, КуБеББкоуа I, МогдапББ-Кокктапп С, Кокктапп Т, Тгеп1х О апб Ваиег С (1997) ОеБесББоп оБ егуБйгороБеББп Бп йитап Нсщог: БпБгБпкБс егуБйгороБеББп 1п Бйе ЬгаБп. К1бпеу 1пБ 51:416-418
Мак1апб КН (2001) Тйе БипбатепБа1 р1ап оБ Бйе геББпа. №11 ЫеигоксБ 4:877-886
Макиба 8, Ыадао М апб 8акак1 К (1999) ЕгуБйгороБеББс, пеигоБгорйБс, апб апдюдешс БипсББопк оБ егуБйгороБеББп апб геди1аББоп оБ егуБйгороБеББп ргобисББоп. 1пБ Б НетаБо1 70:1-6
М1ка1/и Т, МаБкик1 8, 8БгБск1апб ТА, ТакеисйБ М, КоЬаБа А апб ТакакакБ 8 (1995) Ко1е оБ апБеппагу кБгисБиге оБ Ν-бпкеб кидаг сйаБпк 1п гепа1 йапбйпд оБ гесотЬБпапБ йитап егуБйгороБеББп. В1ооб 86:4097-4104
МогБтоБо К, Ткиба Е, 8аБб АА, ИсйБба Е, НаБакеуата 8, Иеба М апб Науака\га Т (1996) В1о1одБса1 апб рйукБсосйетБса1 сйагасБегБ/аББоп оБ гесотЬБпапБ йитап егуБйгороБеББпк БгасББопаБеб Ьу Мопо О со1итп сйготаБодгарйу апб БйеБг тобБВсаББоп νίΐΗ кБа1у1БгапкБегаке. С1усосоп)идаБе Б 13:1013-1020
Ыадауата Т, 8Бпог АО, 8Бтоп КР, Сйеп Б, Сгайат 8, ББп К апб. СгеепЬегд ОА (1999) СаппаЬБпоБбк апб пеигоргоБесББоп Бгот д1оЬа1 апб Боса1 сегеЬга1 БксйетБа апб Бп у1Бго. Б №игоксБ 19:2987-2995 №ιηΙζ М, МагББп А, Агау V, К1орре1 К-О, АидикББп Б апб СопгабБ Н8 (1993) 8БгисБигек оБ кБа1у1аБеб ойдокассйагБбек оБ йитап егуБйгороБеББп ехргеккеб Бп гесотЬБпапБ ВНК-21 се11к. Еиг Б В1осйет 213:39-56
КайЬек-№е1кеп Н, КоеркБогББ Р, КеБксй1 Н, Аоζηу М, Ко11 Н апб Наке1Ьеск А (1997) С1усорерББбе ргоБ1йпд оБ йитап игБпагу егуБйгороБеББп Ьу таБгБх-аккБкБеб 1акег беко^рБ^оη/^оη^ζаБ^оη такк кресБготеБгу. Б Макк 8ресБгот 32:948-958
8абатоБо Υ, 1даке К, 8акапака М, 8аБо К, ОБкика Н, 8акак1 8, Макиба 8 апб 8акак1 К (1998) ЕгуБйгороБеББп ргеуепБк р1асе пауБдаББоп бБкаЬБйБу апб согББса1 БпБагсББоп Бп гаБк νίΐΗ регтапепБ осс1икБоп оБ Бйе тБбб1е сегеЬга1 агБегу. В1осйет В1орйук Кек Соттип 253:26-32
8акак1 К, Макиба 8 апб №1дао М (2001) Р1еБоБгорБс БипсББопк апб ББккие-кресБйс ехргеккБоп оБ егуйБгороБеББп. №\гк РйукБо1 8сБ 16:110-113
8Бтркоп Р апб 8ауБоп 8 (1982) ОБББегепББаББоп оБ гаБ туосуБек Бп кБпд1е се11 сийигек \\Ббй апб \\ББйоиБ ргоШегаББпд поптуосагбБа1 се11к СБгс Кек 50:101-116
8Бгеп А-Ь, ЕгаБейБ М, ВгБпек М, Соетапк С, Сакадгапбе 8, Ρό\\όζι.ι1< Р, Кеепап 8, С1еББег С, Ракциай С, СароЬБапсо А, МеппБпБ Т, Неитапп К, СегатБ А, ЕйгепгеБсй Н апб ^κζζί Р (2001) ЕгуБйгороБеББп ргеуепБк пеигопа1 арорБокБк аББег сегеЬга1 БксйетБа апб теБаЬойс кБгекк. Ргос №1Б1 Асаб 8сБ И8А 98:4044-4049
8Бай1 РО, Кобтап Б8, М111ег МБ апб 8сй1екБпдег РН (1978) ЕуБбепсе Бог гесерБог-тебБаБеб ЬБпбБпд оБ д1усоргоБеБпк, д1усосоп)идаБек, апб 1укокота1 д1усокБбакек Ьу а1уео1аг тасгорйадек. Ргос №1Б1 Асаб 8сБ И8А 75:1399
8Ботпд РЬ апб СаБпек Оак КЕ (1992) Тйе БпБетаББопа1 кБапбагб Бог гесотЬБпапБ ΟΝΛ-бепуеб егуБйгороБеББп: со11аЬогаББуе кБибу оБ Боиг гесотЬБпапБ ОЫА-бегБуеб егуБйгороБеББпк апб Б\го йБдй1у ригБББеб йитап игБпагу егуБйгороБеББпк. Б. ЕпбосгБпо1. 134: 459-484
ТакеисйБ М, ТакакакБ 8, М^уаζак^ Н, КаБо Т, НокйБ 8, КосйБЬе Ν апб КоЬаБа А (1988) СотрагаББуе кБибу оБ Бйе акрагадБпе-йпкеб кидаг сйаБпк оБ йитап егуБйгороБеББпк ршгйеб Бгот игБпе апб Бйе сийиге тебБит оБ гесотЬБпапБ СйБпеке йаткБег оуагу се11к. Б В1о1 Сйет 263:3657-3663
ТакеисйБ М, 1поие Ν, 8БгБск1апб ТА, КиЬоБа М, Ааба М, 8йт^и К, НокйБ 8, КоζиБкит^ Н, ТакакакБ 8, апб КоЬаБа А (1989) Ке1аББопкйБр ЬеБ\\'ееп кидаг сйаБп кБгисБиге апб ЬБо1одБса1 асББуББу оБ гесотЬБпапБ йитап егуБйгороБеББп ргобисеб Бп СйБпеке йаткБег оуагу се11к. Ргос №1Б1 Асаб 8сБ И8А 86:7819-7822
ТакеисйБ М апб КоЬоБа А (1991) 8БгисБигек апб БипсББопа1 го1ек оБ Бйе кидаг сйаБпк оБ йитап егуБйгороБеББпк. С1усоЬБо1 1:337-346
Тоуоба Т, 1БаБ Т, Агака^а Т, Аок1 КН апб Υатадисй^ Н (2000) 8БаЬ^1^ζаБ^оη оБ йитап гесотЬБпапБ егуБйгороБеББп Бйгоидй БпБегасББопк \\Ббй Бйе йБдй1у Ьгапсйеб №д1усапк. Барап В1осйет 8ос 128:731-737
Ткиба Е, СоБо М, МигакатБ А, АкаБ К, Иеба М, Ка^апБкйБ С, ТакайакйБ Ν, 8акак1 К, СйБЬа Н, 1кйБйага Н, МогБ М, Терта 8, Епбо 8 апб АгаБа Υ (1968) СотрагаББуе кБгисБига1 кБибу оБ Ν-Кпкеб ойдокассйагБбек оБ игБпагу апб гесотЬБпапБ егуБйгороБеББпк. ВБосйетБкБгу 7:5646-5654
- 30 008220
Ткиба Е, КатеашкЫ 6, Иеба М, Макиба 8 апб 8акак1 К (1990) ТПе го1е оГ саЛойубга!е ίη гесотЬшап! Питап егуЛгоро1е!т. Еиг ί Вюсйет 188:405-411
Уап беп Ы1еитеепйоГ 1М, Ко1к!1пеп Η, Еак!оп ВЬ, Ко1к!1пеп К, Катагатеп М, Мотк НК, Уап О1е I, 8ерра1а М, Эе11 Α апб Уап беп Еупбеп ΌΗ (2000) КесотЫпап! §1усобе1т саггушд Ле кате !уре оГ д1усап к1гис1игек ак согИгасерЛ'е д1усобе1ш-А сап Ье ргобисеб т Питап к1бпеу 293 се11к Ьи1 по! ш СЫпеке Натк1ег омагу се11к. Еиг 1 Вюсйет 267:4753-62
Уап Еук Н6, Уап Ыоог! ^Ъ, ЭиЬе1ааг М-Ь апб Уап бег Неи1 С (1983) ТПе ткгойекгодепейу оГ Питан кегит (гапкГегппк т Ью1од1са1 Г1шбк. С1т СЫт Ас!а 132:167-172
Уап Веетоог!еге А, Нокке СН, Уап Эат 61, Уап О1е I, Оее1бег АМ апб Уап беп Еупбеп ΌΗ (2000) Уапоик к!адек оГ 8сЫк!окота ехргекк Бетей X, Ьасб1ЫАс, 6аШАсв1-4 (Еиса1-2Еиса1-3)61сЫАс сагЬойубга!е ерйорек: бе1есЕоп \νίΛ топос1опа1 апПЬоб1ек Ла! аге сНагасЮпхеб Ьу епхутаЕсаПу купЛем/еб пеод1усорго!етк. 61усоЬ1о1 10:601-609 \Уак1еу ЬС, Т1топу 6, МигЛа Р, 81оибет1ге 1, Эотег А1, Саго 1, Кпедег М апб КаиГтап В1 (1991) ТПе 1трог!апсе оГ Ыапб О-Нпкеб ойдокассйапбек Гог Ле ЫокупЛекк апб т νίίΐΌ апб т νί\Ό Ью1од1са1 ас!М!1ек оГ егуЛгоро1е!ш. В1ооб 77:2624-2632 \Уа1коп Е, ВЫбе А апб Уап На1Ьеек Н (1994) 8!гис!иге бе!егтЛа!юп оГ Ле т!ас! та)ог к1а1у1а!еб оНдокассйапбе сйатк оГ гесотЬшап! Питап егуЛгоро1е!ш ехргеккеб т СЫпеке Патк!ег омагу се11к. 61усоЬю1 4:227-237 \У1Ше М1, О|Сарпо М1 апб бгеепЬегд ЭА (1996) Аккекктеп! оГ пеигопа1 м1аЬ111!у те1Л А1атаг Ь1ие ш согйса1 апб дгапи1е се11 си1!игек. 1 Ыеигокс1 МеЛ 70:195-200 \У|еккпег С, А11едпш РВ, Ека!обгат1к Ό, 1етее11 ИВ, 8!а11тасП Т апб бакктапп М (2001) Лсгеакеб сегеЬга1 1п£агс! мо1итек т ро1уд1оЬийс тке оуегехргекктд егуЛгоро1е!т. 1 СегеЬ В1ооб Иоте Ме!аЬ 21:857864 \Уопд Ό, Ргатеуа В апб 0огоут1-2|к К (1999) 1п νίΙΐΌ абйекюп апб пндгаЕоп оГ Т 1утрПосу!ек асгокк топо1ауегк оГ Питап Ьгат т1сгоуекке1 епбоЛе11а1 се11к: геди1а!юп Ьу 1САМ-1, УСАМ-1, Е-ке1ес!юп апб РЕСАМ-1. 1 ЫеигораЛ Ехр №иго1оду 58:138-152
- 31 008220
Таблица I
Маркерный белок Описание
Пан-кератин Обнаружение почти всех цитокератинов. Метит кератинизированный и роговичный эпидермис, многослойный плоский эпителий внутренних органов, многослойный эпителий, гиперпролиферативные кератиноциты и простой эпителий.
ЕМА Антиген эпителиальной мембраны. Метит нормальный и опухолевый эпителий.
3100 ЕЕ-полоса типа Са2+ -связывающих белков. Экспрессируется в нейрональных тканях и других тканях.
Виментин Цитоскелетные промежуточные филаменты (= структурный белок). Это основной маркёр клеток, происходящих из мезенхимы. Экспрессируется при развитии скелетной мышцы.
Десмин Цитоскелетные промежуточные филаменты (= структурный белок). Экспрессируются при развитии скелетной мышцы.
г.м.-актин. Актин гладкомышечной клетки. Окрашивает гладкомышечные клетки и миоэпителиальные клетки.
Синаптофизин Реагирует с нейроэндокринными клетками.
Хромогранин Кислые гликопротеины, которые широко экспрессируются в секреторных гранулах эндокринной, нейроэндокринной и нервной ткани.
Ν3Ε Нейрон-специфичная энолаза. Метит клетки невронального и нейроэндокринного происхождения
Нейрофиламент Реагирует с фосфорилированным нейрофиламентным белком и метит неврональные процессы и периферические нервы, а также симпатические ганглиозные клетки и мозговой слой надпочечников.
(6ЕАР) (поликон) Глиальный фибриальный кислый белок. СЕАР специфически обнаружен в астроглиях, которые отличаются высокой реактивностью на неврологические инсульты. Астроглиоз обнаруживается как результат механической травмы, СПИД-связанной деменции и перед инфекцией и сопровождается повышением экспрессии СЕАР. Иммуногистохимический маркер локализации доброкачественного астроцита и опухолевых клеток глиального происхождения в центральной нервной системе.
СО-31 Реагирует с РЕСАМ-1. Имеется в тромбоцитах, моноцитах, гранулоцитах, лимфоцитах, эндотелиальных клетках.
СЭ-34 Распознает О-гликозилированный трансмембранный гликопротеин. Экспрессируется в гемопоэтических стволовых клетках, васкулярных ЭК, эмбриональных фибробластах, некоторых клетках фетальной нервной ткани у взрослых.
Ν-САМ Молекулы адгезии нервных клеток. Ν-САМ участвует во взаимодействии клеткаклетка в процессе роста.
- 32 008220
Таблица II
Маркерный белок • Контрольная ткань
Пан-кератин Карцинома толстого кишечника
ЕМА Карцинома толстого кишечника
3100 Поджелудочная железа
Виментин Миндалина
Десмин Толстый кишечник
Г .м.-актин Миндалина
Синаптофизин Поджелудочная железа
Хромогранин Поджелудочная железа
Ν3Ε Поджелудочная железа
Нейрофиламент Толстый кишечник
СТАР (поликон) Мозг
СО-31 Толстый кишечник
СО-34 Миндалина
Ν-САМ (СО56) Толстый кишечник
Таблица III
Маркерный белок Поставщик Антитело Номер по каталогу Разбавление антитела
Пан-кератин Входепех 1дС1 мыши мио71-ис 1:200
ЕМА Оако 1дС2а мыши М0613 1:50
С Ί П Л П-Ч 1^/-4 ΐΖ-г-чх-ч тттжтл 7ПО1 1 1 . о л л л
υιυ ν л. о ίΐ V X X х·ϋυυν
Виментин Входепех 1дС1 мыши ми074-ис 1:3200
Десмин ЗапЫо 1дС мыши ΜΟΝ 3001 1:50
Г.м.-актин Входепех 1дС2а мыши ми128-ис 1:150
Синаптофизин Оако 1дС1 мыши М0776 1:50
Хромогранин Входепех 1дС1 мыши ми12б-ис 1:150
Ν3Ε Оако 1дС1 мыши М0873 1:250
Нейрофиламент ЗапЫо 1дС мыши ΜΟΝ3004 1:300
СЕАР (поликон) Оако 1дС1 мыши М0761 1:200
СО-31 Оако 1дС1 мыши М0823 1:60
СО-34 Входепех 1дС1 мыши ми23б-ис 1:20
Ν-САМ (СО56) Иеотагкегз 1дС1 мыши М3.204.Р 1:10
- 33 008220
Таблица IV
Маркерный белок Оценка реакции
Пан-кератин Отрицательная
ЕМА Отрицательная
3100 Отрицательная
Виментин Положительная
Десмин Отрицательная
Г.м.-актин Отрицательная
Синаптофизин Положительная
Хромогранин Отрицательная
Ν3Ε Отрицательная
Нейрофиламент Положительная
СТАР (поликон) Положительная
СО-31 Отрицательная
СО-34 Отрицательная
Ν-САМ (СО56) Положительная
Таблица V
Клон и условия культивироваНИЯ Молярное моносахарид м-
Мал Гис
Ρ8-ΏΜΕΜ 3 0,5 (0,9)
Р8-ЛШ 3 1,5 (1,4)
Ρ7-ϋΜΕΜ 3 1,5 (1,4)
Р7-ДКН 3 1,8 (1,7)
С25-ОМЕМ 3 2,0
Эпрекс 3 0,7
: соотношение нейтральных [ов, нормализованное по трем [аннозным остаткам
Са1ЫАс ΘΙοΝΑο Са1
0,4 (0,4) 2,2 (2,7) 1,7 (1,3)
0,7 (0,8) 6,1 (6,4) 3,5 (3,9)
0,4 (0,3) 5,5 (6,1) 2,3 (3,3)
0,4 (0,4) 6,1 (6,8) 3,6 (4,2)
1,0 6,0 2,2
- 5,4 4,1
- 34 008220
Таблица VI
Р7 Масса (т/ζ) Процентное содержание от общего количества Соотношение Нех:ΗβχΝΑο:бНех
Пул А Пул В Пул С
1809,64 2,34 2, 99 2,44 5:4:1
1850,67 2,57 5,31 2,49 4:5:1
1891,69 5, 06 10,39 1, 31 3:6:1
1955,70 - 1,95 2,16 5:4:2
1996,72 6,37 7,96 6,38 4:5:2
2037,75 6,33 5,16 5,39 3:6:2
2053,74 3,70 4,11 1, 98 5:5:1
2142,78 2,19 3, 68 2,45 4:5:3
2174,77 6,53 3, 63 8,04 6:5:1
О Ί О О О Ί Г гп С по О ΕΊ О . (2 . О
2.10 О1 и ? о у О ! О 1 г О ! У · О · У
2199,80 3,78 4,65 1, 58 4:6:2
2215,80 4,13 4,95 4,15 5:6:1
2256,82 - 1,30 - 4:7:1
2320,83 2,34 2,04 3,29 6:5:2
2361,86 4,35 3,30 3,23 5:6:2
2377,85 3,77 3,79 2,86 6:6:1
2507,91 1,62 2,32 1,32 5:6:3
2523,91 2,09 2,60 1, 61 6:6:2
2539,90 11,89 4,81 19,32 7:6:1
2580,93 3,32 1,53 1, 69 6:7:1
2612,94 - - 1,78 6:5:3
2669,97 1, 95 2,34 - 6:6:3
2685,96 6,21 3,11 5,81 7:6:2
2726,99 1, 62 1,38 1,36 6:7:2
2832,02 3, 64 1,55 3,08 7:6:3
2905,04 1,79 - 2,45 8:7:1
2978,08 2,23 1, 65 - 7:6:4
- 35 008220
Таблица VII
Р8 Масса (ш/ζ) Процентное содержание от общего количества Соотношение Нех: НехИАс: с!Нех
Пул А Пул В Пул С
1809,64 - 1,03 - 5:4:1
1850,67 3,36 2,05 - 4:5:1
1891,69 5,11 2,11 3,04 3:6:1
1955,70 1,46 1,22 1,08 5:4:2
1996,72 5,05 4,61 6,54 4:5:2
2012,72 1,34 1,38 1,35 5:5:1
2037,75 14,62 14,34 12,48 3:6:2
2053,74 3, 73 2,76 4,29 4:6:1
2142,78 2,57 1,97 2,06 4:5:3
2158,78 1,43 1, 91 - 5:5:2
2174,77 2,40 2,53 5, 58 6:5:1
2183,81 16,91 15,79 14,90 3:6:3
2199,80 1,74 3,18 4,90 4:6:2
2215,80 4,23 4,20 3,08 5:6:1
2256,82 2,08 3,04 2,17 4:7:1
2320,83 1,67 1,88 2,23 6:5:2
2361,86 3,25 2,25 3,02 5:6:2
2377,85 1,50 1,84 2,73 6:6:1
2402,88 2,05 2,20 4,26 4:7:2
2418,88 0,97 1,54 - 5:7:1
2466,89 1,03 - - 6:5:3
2507,91 2,04 2,48 - 5:6:3
2523,91 1,58 1,73 1,47 6:6:2
2539,90 2,48 4,79 9, 56 7:6:1
2548,94 1,26 1,14 0, 66 4:7:3
2580,93 1,87 2,07 2,48 6:7:1
2685,96 2,74 3,39 4,30 7:6:2
2726,99 2,55 3,12 - 6:7:2
2768,01 1,35 - - 5:8:2
2832,02 2,14 3,06 1,91 7:6:3
2873,05 1,70 1, 81 1, 63 6:7:3
2889,04 1,14 0,67 - 7:7:2
2978,08 0,89 0, 99 2,39 7:6:4
3019,10 1,09 1,26 - 6:7:4
Таблица VIII Активности РТ (нмоль/час/мг белка)
а1,2 ГТ а1,3 ГТ а1,6 ГТ Са1Т
СНО < 0,01 0, 03 4,31 12,5
РЕК.С6 < 0,01 0, 65 3, 62 3,41
- 3б 008220
Таблица IX
Масса (т/ζ) Нех НехЫАс с1Нех Фракция 1 Фракция 2 Фракция 3 Фракция 4
1631,6 3 4 2 Νϋ Νϋ Νϋ 1,16
1688,6 3 5 1 3,22 3,09 2,22 2,82
1793,7 4 4 2 1,29 1,15 Νϋ 0,83
1809,6 5 4 1 Νϋ 1,50 2,10 2,82
1834,7 3 5 2 1,71 1,77 1,73 1,41
1891,7 3 6 1 10,98 7,96 5,19 4,31
1955,7 5 4 2 0,86 3,36 0,87 1,33
1996,7 4 5 2 2,40 2,65 2, 47 2,32
2037,8 3 6 2 4,03 4,86 4,82 3,65
2053,7 5 5 1 6,43 . 5,39 3,89 2,65
2101,8 5 4 3 1,29 1,55 Νϋ ϋΝ
2142,8 4 5 3 1,71 2,03 1,36 2,98
2174,8 6 5 1 1,29 1, 95 1,36 0,00
2183,8 3 6 3 8,57 11,05 16,44 22,54
2199,8 4 6 2 4,54 5,04 4,94 3,81
2215,8 5 6 1 5,66 4,60 2, 84 2,32
2256,8 4 7 1 1, 97 1,77 0,87 1,33
2320,8 6 5 2 1,03 1,27 0, 87 1,49
2361,9 5 6 2 4,46 4,86 4,39 3,31
2377,9 6 6 1 5,23 2,21 2,10 1,66
2507,9 5 6 3 1,65 1, 68 3,71 5,47
2523,9 6 6 2 3,43 2,21 2,22 1,82
2539,9 7 6 1 10,72 6,19 4, 94 4,47
2580,9 6 7 1 2,14 2,21 1,85 1,16
2670,0 6 6 3 0,86 1, 68 2,47 2,82
2686,0 7 6 2 6,69 6, 90 5, 93 3,81
2727,0 6 7 2 2,70 3,36 2,72 1,82
2832,0 7 6 3 2,83 4,60 6,43 3,81
2873,1 6 7 3 1,29 1,55 4,57 2,98
2978,1 7 6 4 1,03 1,55 3,58 3,73
3019,1 6 7 4 Νϋ Νϋ 2,47 2,90
3124,1 7 6 5 Νϋ Νϋ 0,62 2,49
- 37 008220
Таблица X
Клон 004 Морфология Гладкая Экспрессия Е1А ++
0 008* Гладкая ++
(11 М 025 Гладкая +++
рС 028 Ма ттрнькчла тлт.тты
и 034 ' Гладкая ±-
л X 0 056 Гладкая+исходная родительская морфология -
X ώ 062 Гладкая +++
066 Гладкая ++
076 Исходная родительская морфология -
О 002 Гладкая ++
ы 003 Гладкая+исходная родительская морфология ++
И
н м 005 Гладкая ++
023 Гладкая +++
м 025 Гладкая+исходная родительская морфология -
3 X 0 026 Гладкая +++
с; ьг 028 Гладкая+исходная родительская морфология +
031 Гладкая +
033 Гладкая +++
035 Исходная родительская морфология -
049 Гладкая ++
051 Гладкая+исходная родительская морфология +
057 Гладкая, неровная морфология +
058 Гладкая ++
062 Гладкая ++
067 Гладкая ++
072* Гладкая, неровная морфология ++
076 Гладкая +++
077 Гладкая +++
Таблица XI
[М+Ыа} + 1647,6 1909,6 1991,7 1996,7 2037,9 2174,8 2193,8 2215,0 2361,9
ΗβχΝΑο Нех сШех 2 1 2 2 4 3 1 1 4 1 3 3 4 2 4 2 4 2 1
Предполагаемая структура
Клон 033 11%
Клон 008 2» 2% 1% 4» 4% 8% 4% 3%
Клон 072 1% 6% 2% 9% 4% 8% 2% 2%
Другая возможная структура •ь·» ••ст
- 38 008220
[М+Ыа] + 2377,9 2402,9 2539,9 .2580,9 2686,0 2727,0 2832,0 2873,1 2905,0
НехЫАс 4 ? 4 5 4 5 4 5 5
Нех 3 4 3 4 3 4 3 5
с1Нех 1 1 2 2
Предполагаемая структура &·* &·* ф»·4
Клон 033 3% 78% 4% 4%
Клон 008 3% 28% 6« 14% 6% 8% 3% 3%
Клон 072 3% 26% 11% 9% 7% 6% 3% 2%
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (25)

1. Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, выбранные из группы, состоящей из эритропоэтина, одного или нескольких мутеинов эритропоэтина и одного или нескольких производных эритропоэтина, характеризующаяся тем, что среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,2.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.
4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.
5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.
6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.
7. Композиция по любому из пп.1-6, где Ν-связанные гликаны в эритропоэтинподобных молекулах представляют собой преимущественно биантенные структуры.
8. Фармацевтический препарат, включающий композицию по п.1.
9. Применение композиции по п.1 в качестве лекарственного средства для лечения нарушения, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного нарушения и острого поражения центральной или периферической нервной системы.
10. Способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушения, выбранного из группы, состоящей из ишемии, реперфузионного повреждения, расстройства, вызванного гипоксией, воспалительного заболевания, нейродегенеративного нарушения и острого поражения центральной или периферической нервной системы, предусматривающий стадию введения человеку или животному композиции по п.1.
11. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.
12. Применение по п.9, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.
13. Способ по п.10, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,6.
14. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.
15. Применение по п.9, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.
16. Способ по п.10, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 2,7.
17. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.
18. Применение по п.9, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.
19. Способ по п.10, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 3,6.
20. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.
21. Применение по п.9, где среднее число Еете18-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.
- 39 008220
22. Способ по п.10, где среднее число Ьемяз-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 4,1.
23. Фармацевтический препарат по п.8, где среднее число Ье^з-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.
24. Применение по п.9, где среднее число Ьемяз-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.
25. Способ по п.10, где среднее число Ьемяз-Х-структур в Ν-связанных гликанах на эритропоэтинподобную молекулу составляет по меньшей мере примерно 5,7.
EA200400605A 2001-10-29 2002-10-29 Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, и способы ее применения EA008220B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/NL2001/000792 WO2003050286A1 (en) 2001-10-29 2001-10-29 Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications
PCT/NL2002/000257 WO2003089468A1 (en) 2002-04-19 2002-04-19 Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications
PCT/NL2002/000686 WO2003038100A1 (en) 2001-10-29 2002-10-29 Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200400605A1 EA200400605A1 (ru) 2004-08-26
EA008220B1 true EA008220B1 (ru) 2007-04-27

Family

ID=26642018

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400605A EA008220B1 (ru) 2001-10-29 2002-10-29 Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, и способы ее применения
EA200602163A EA012340B1 (ru) 2001-10-29 2002-10-29 Способ получения гликозилированной белковой молекулы, содержащей структуру lewis x, и/или сиалил-lewis x, и/или lacdinac

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200602163A EA012340B1 (ru) 2001-10-29 2002-10-29 Способ получения гликозилированной белковой молекулы, содержащей структуру lewis x, и/или сиалил-lewis x, и/или lacdinac

Country Status (14)

Country Link
US (3) US7304031B2 (ru)
EP (2) EP2292770B1 (ru)
JP (1) JP4583029B2 (ru)
CN (1) CN100347306C (ru)
AT (1) ATE542904T1 (ru)
AU (1) AU2002335585B2 (ru)
BR (1) BR0213402A (ru)
CA (2) CA2465007C (ru)
DK (1) DK1440157T3 (ru)
EA (2) EA008220B1 (ru)
ES (1) ES2381104T3 (ru)
IL (3) IL161674A (ru)
NO (1) NO20042209L (ru)
WO (1) WO2003038100A1 (ru)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE278794T1 (de) 1995-06-15 2004-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US8236561B2 (en) 1999-04-15 2012-08-07 Crucell Holland B.V. Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells
US7604960B2 (en) 1999-04-15 2009-10-20 Crucell Holland B.V. Transient protein expression methods
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
WO2003048348A2 (en) 2001-12-07 2003-06-12 Crucell Holland B.V. Production of viruses, viral isolates and vaccines
US20050164386A1 (en) * 1999-04-15 2005-07-28 Uytdehaag Alphonsus G. Overexpression of enzymes involved in post-translational protein modifications in human cells
US7297680B2 (en) * 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US7527961B2 (en) 1999-11-26 2009-05-05 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7192759B1 (en) 1999-11-26 2007-03-20 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US7521220B2 (en) 1999-11-26 2009-04-21 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
US20030072737A1 (en) 2000-12-29 2003-04-17 Michael Brines Tissue protective cytokines for the protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues and organs
US7767643B2 (en) 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
CA2465007C (en) * 2001-10-29 2012-01-17 Crucell Holland B.V. Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications
US8524477B2 (en) * 2002-10-29 2013-09-03 Crucell Holland B.V. Methods to obtain recombinant proteins with increased sialylation from cells that express adenovirus E1A protein, and proteins obtained thereby
NZ549776A (en) * 2004-03-17 2009-07-31 Crucell Holland Bv Assay for the separation and quantification of hemagglutinin antigens
CA2595676A1 (en) * 2005-01-25 2006-08-03 Apollo Life Sciences Limited Molecules and chimeric molecules thereof
US20100040581A1 (en) * 2005-06-01 2010-02-18 Niigata Tlo Corporation Epo derivative-containing therapeutic agents for blood-related diseases
AR053416A1 (es) * 2005-11-10 2007-05-09 Protech Pharma S A Combinacion de glicoisoformas para el tratamiento o prevencion de la septicemia, linea celular transgenica productora de glicoformas de eritropoyetina, composicion farmaceutica que comprende a dicha combinacion, procedimientos para obtener la linea celular, procedimiento para producir dicha combinac
AU2006316838B2 (en) * 2005-11-15 2012-04-12 Glycofi, Inc Production of glycoproteins with reduced O-glycosylation
US7642078B2 (en) 2005-12-28 2010-01-05 Crucell Holland B.V. Methods to obtain recombinant proteins with increased sialylation from cells that express adenovirus E1A protein, and proteins obtained thereby
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US7553940B2 (en) * 2006-02-03 2009-06-30 Modigene Inc Long-acting EPO polypeptides and derivatives thereof and methods thereof
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
WO2007098548A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-07 Apollo Life Sciences Limited A molecule and chimeric molecules thereof
CA2654154A1 (en) 2006-06-07 2007-12-13 The University Of Tokushima Treatment of ischemic diseases using erythropoietin
EP2057997A4 (en) 2006-08-22 2012-11-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd MEANS FOR THE PREVENTION AND / OR TREATMENT OF PERIPHERAL NEUROPATHY
AR065613A1 (es) 2007-03-09 2009-06-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes de proteccion para organos transplantados
BRPI0810065A2 (pt) 2007-04-16 2020-01-14 Momenta Pharmaceuticals Inc caracterização de n-glicanos usando exoglicosidases
TWI488640B (zh) 2008-04-16 2015-06-21 Ferring Int Ct Sa 藥學製劑
US8138092B2 (en) 2009-01-09 2012-03-20 Lam Research Corporation Spacer formation for array double patterning
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
TWI604850B (zh) 2009-10-05 2017-11-11 菲瑞茵國際中心股份有限公司 藥學製劑
JP6087338B2 (ja) 2011-03-31 2017-03-01 フェリング ベスローテン フェンノートシャップ 医薬製剤
EP2773964A4 (en) * 2011-11-03 2015-06-24 Stc Biolog Inc METHOD FOR DETERMINING THE PHARMACOLOGICAL PROPERTIES OF RECOMBINANT PROTEINS
MY167814A (en) 2012-04-19 2018-09-26 Opko Biologics Ltd Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
KR102341581B1 (ko) 2012-11-20 2021-12-21 옵코 바이오로직스 리미티드 생식샘자극 호르몬 카복시 말단 펩타이드들과 부착하여 폴리펩타이드들의 유체역학적 부피를 증가시키는 방법
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US20180180626A1 (en) * 2014-07-01 2018-06-28 Stc Biologics, Inc. A method for development of recombinant proteins with fingerprint like similarity to the reference product
WO2016203482A2 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20190177385A1 (en) * 2016-07-12 2019-06-13 Hexal Ag Glycoprotein with reduced acetylation rate of sialic acid residues
JP7046173B2 (ja) * 2017-10-11 2022-04-01 エランコ・ユーエス・インコーポレイテッド ブタｇ－ｃｓｆ変異体とその使用
CN111514279B (zh) * 2020-06-16 2023-07-18 温州医科大学附属第二医院（温州医科大学附属育英儿童医院） 神经营养因子3在制备治疗男性性腺功能减退症的药物中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5789247A (en) * 1994-04-01 1998-08-04 Ballay; Annick Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector
WO1998044141A2 (en) * 1997-03-27 1998-10-08 The University Of British Columbia Insect expression vectors
WO2000063403A2 (en) * 1999-04-15 2000-10-26 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell using sequences encoding adenovirus e1 protein

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991005867A1 (en) 1989-10-13 1991-05-02 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
ATE278794T1 (de) 1995-06-15 2004-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
CA2221819A1 (en) 1997-03-27 1998-09-27 Thomas A. Gigliatti Insect expression vectors
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
EA004766B1 (ru) 1999-04-13 2004-08-26 Дзе Кеннет С. Уоррен Инститьют, Инк. Модуляция функции возбуждаемых тканей за счет периферического введения эритропоэтина
US6855544B1 (en) * 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
US7297680B2 (en) * 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US20050164386A1 (en) * 1999-04-15 2005-07-28 Uytdehaag Alphonsus G. Overexpression of enzymes involved in post-translational protein modifications in human cells
US6913922B1 (en) * 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
FI109811B (fi) * 2000-09-26 2002-10-15 Medicel Oy Menetelmä GDP-L-fukoosin valmistamiseksi ja menetelmässä käytettäviä välineitä
DE10056136A1 (de) 2000-11-07 2002-05-16 Nemod New Modalities Verwendung von Schwangerschaftsproteinen, Liposomen, nativen Muzin-Fragmenten und Mimikry-Verbindungen zur Behandlung und Prophylaxe von entzündlichen Erkrankungen, zur Verhinderung der Metastasierung und zur Prophylaxe von Tumorerkrankungen
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
ES2411007T3 (es) * 2001-10-10 2013-07-04 Novo Nordisk A/S Remodelación y glicoconjugación de péptidos
CA2465007C (en) * 2001-10-29 2012-01-17 Crucell Holland B.V. Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications
ATE514717T1 (de) * 2002-07-18 2011-07-15 Merus B V Rekombinante produktion von antikörpermischungen
NZ549776A (en) * 2004-03-17 2009-07-31 Crucell Holland Bv Assay for the separation and quantification of hemagglutinin antigens
US7183371B2 (en) * 2004-11-01 2007-02-27 General Electric Company Method for making polycarbonate
US20080139608A1 (en) * 2006-12-06 2008-06-12 Universiteit Leiden 2,6,8, Trisubstituted 1-deazapurines and their different uses

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5789247A (en) * 1994-04-01 1998-08-04 Ballay; Annick Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector
WO1998044141A2 (en) * 1997-03-27 1998-10-08 The University Of British Columbia Insect expression vectors
WO2000063403A2 (en) * 1999-04-15 2000-10-26 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell using sequences encoding adenovirus e1 protein

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CRONAN J. E.: "BIOTINATION OF PROTEINS IN-VIVO A POST-TRANSLATIONAL MODIFICATION TO LABEL PURIFY AND STUDY PROTEINS", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOGICAL CHEMISTS, BALTIMORE, MD, US, vol. 265, no. 18, 25 June 1990 (1990-06-25), pages 10327-10333, XP002179397 ISSN: 0021-9258 the whole document *
PAZUR JOHN H. ET AL.: "Oligosaccharides as immunodeterminants of erythropoietin for two sets of anticarbohydrate antibodies.," JOURNAL OF PROTEIN CHEMISTRY, vol. 19, no. 8, November 2000 (2000-11), pages 631-635, XP002210661 ISSN: 0277-8033 the whole document *
STOCKWELL B. R. ET AL.: "HIGH-THROUGHPUT SCREENING OF SMALL MOLECULES IN MINIATURIZED MAMMALIAN CELL-BASED ASSAYS INVOLVING POST-TRANSLATIONAL MODIFICATIONS", CHEMISTRY AND BIOLOGY, CURRENT BIOLOGY, LONDON, GB, vol. 6, no. 2, February 1999 (1999-02), pages 71-83, XP000865522 ISSN: 1074-5521, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2465007A1 (en) 2003-05-08
US7785833B2 (en) 2010-08-31
DK1440157T3 (da) 2012-05-07
CN100347306C (zh) 2007-11-07
BR0213402A (pt) 2004-10-13
WO2003038100A1 (en) 2003-05-08
IL201673A (en) 2013-10-31
EP1440157B1 (en) 2012-01-25
EP1440157A1 (en) 2004-07-28
EA012340B1 (ru) 2009-10-30
US20080032922A1 (en) 2008-02-07
CN1578838A (zh) 2005-02-09
JP2005507426A (ja) 2005-03-17
IL201674A (en) 2013-10-31
EP2292770A3 (en) 2012-12-19
JP4583029B2 (ja) 2010-11-17
EP2292770A2 (en) 2011-03-09
US20070117742A1 (en) 2007-05-24
US7696157B2 (en) 2010-04-13
EA200602163A1 (ru) 2007-04-27
EP2292770B1 (en) 2014-11-26
IL161674A (en) 2014-06-30
US20050164917A1 (en) 2005-07-28
AU2002335585B2 (en) 2007-08-16
NO20042209L (no) 2004-07-28
US7304031B2 (en) 2007-12-04
ES2381104T3 (es) 2012-05-23
CA2465007C (en) 2012-01-17
EA200400605A1 (ru) 2004-08-26
ATE542904T1 (de) 2012-02-15
CA2756610C (en) 2015-08-25
CA2756610A1 (en) 2003-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA008220B1 (ru) Композиция, включающая эритропоэтинподобные молекулы, и способы ее применения
AU2002335585A1 (en) Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications
US20120142589A1 (en) Tissue-protective cytokines for the protection, restoration and enhancement of responsive cells, tissues and organs
SK497290A3 (en) Isoforms of erythropoietin, preparation method thereof and pharmaceutical compositions containing same
EA018037B1 (ru) Способ повышения уровней эритроцитов
EA010200B1 (ru) Рекомбинантные тканезащитные цитокины и кодирующие их нуклеиновые кислоты для защиты, восстановления и усиления чувствительных клеток, тканей и органов
UA47428C2 (ru) Способ контроля количества сиаловой кислоты, способ получения химерного гликопротеина (варианты), препарат, содержащий химерный гликопротеин (варианты), терапевтическая композиция
CA2129423A1 (en) Hepatic growth factor receptor
WO2005097155A1 (ja) 神経突起伸長誘導剤
KR100602772B1 (ko) 예비결정된 번역후 변형을 갖는 단백질을 생성하기 위한장치 및 방법
BR112021012973A2 (pt) Métodos de produção de ustequinumabe
US20140219988A1 (en) Rrecombinant human saposin b protein containing phosphorylated glucose ring and use thereof
WO2003089468A1 (en) Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications
JP2022546837A (ja) ヒト組換えヒポシアル酸付加エリスロポエチン、その精製方法及び処置用途
NZ532438A (en) Methods for producing proteinaceous molecules in a mammalian cell comprising a predetermined post-translational modification
BR112021005968A2 (pt) Eritropoietina humana modificada

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU