KR100602772B1 - 예비결정된 번역후 변형을 갖는 단백질을 생성하기 위한장치 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성할 수 있는 포유동물 세포를 얻고, 선별하고 그리고 동정하기 위한 방법을 제공하고, 여기서, 상기 번역후 변형은 단백질성 분자가 발현되는 포유동물 세포에 의해 이루어진다. 바람직하게는, 상기 예비결정된 번역후 변형은 당화를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 포유동물 세포를 사용하여, 단백질성 분자를 얻고 생성하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 단백질성 분자는 에리트로포이에틴(EPO)를 포함하고, (재조합) EPO의 영향은 단백질에 존재하는 올리고당류의 당화 패턴에 매우 의존한다. 원하는 예비결정된 번역후 변형을 나타내는 번역후 변형 및/또는 단백질을 생성하는 그들의 능력을 기초로 하여 얻어지는 포유동물도 또한 제공한다. 바람직하게는, 상기 포유동물 세포는 '신경- 또는 뇌-형' 특성을 내포하는, 재조합 단백질이 상당한 양으로 생성될 수 있을 정도로 신경 특징 및 특성을 갖는다.
루이스 X 구조, LacdiNac 구조, N-연결 글리칸, 에리트로포이에틴

Description

예비결정된 번역후 변형을 갖는 단백질을 생성하기 위한 장치 및 방법{METHODS AND MEANS FOR PRODUCING PROTEINS WITH PREDETERMINED POST-TRANSLATIONAL MODIFICATIONS}
도 1은 Eprex, P7-EPO(풀 A, B 및 C), 및 P8-EPO(풀 A, B 및 C)의 N-연결된 당의 매스 스펙트럼을 나타내는 도이다. (a) Eprex; (b) P7, 풀 A; (c) P7, 풀 B; (d) P7, 풀 C; (e) P8, 풀 A; (f) P8, 풀 B; 및 (g) P8, 풀 C.
도 2는 PER.C6™-EPO 및 CHO-EPO의 시알산 함량을 나타내는 도이다.
도 3은 PER.C6™-EPO에 존재하는 루이스 x 글리칸 구조를 나타내는 도이다.
도 4는 PER.C6™-EPO 세포 표면에서의 루이스 x 구조 발현을 나타내는 도이다.
도 5는 루이스 x 및 시알릴 루이스 x 구조의 개략적인 묘사를 나타내는 도이다.
도 6는 인 비보 에리스로포이에시스에 대한 PER.C6™-EPO 및 Eprex의 영향을 나타내는 도이다.
도 7a-7b는 MRI를 사용하여, 재관류의 개시후 24시간째에 생성된 ADC 맵(도 7a) 및 T2 맵(도 7b)에 기초한 처리되지 않은 래트(대조군), Eprex 및 PER.C6™-EPO 처리된 래트에서의 경색 용량을 나타내는 도이다.
도 8은 세 마리의 동물에서 Eprex의 150eU 1회 정맥주사 후 표시된 시간-점에서의 Eprex의 농도를 나타내는 도이다.
도 9는 높은 및 낮은 푸코스(fucose) 함량을 선별하기 위한 AAL 칼럼에서 분획된 PER.C6™-EPO의 크래마토그램을 나타내는 도이다.
도 10a-1 ~ 도 10a-2는 AAL 칼럼에서 분획 1-4의 N-연결된 당의 매스 스펙트럼을 나타내는 도이다. 도 10b는 개별적인 실험에서 AAL 칼럼으로부터의 분획 4의 N-연결된 당의 매스 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 11은 HT1080/EPO 클론 033 (A), HT1080/E1A.E1B.EPO 클론 058 (B) 및 026(C)의 사진을 보여주는 도이다. E1A의 그들의 발현은 웨스턴 블랏 분석(D)으로 나타낸다. E1A 발현 클론은 평평한 형태학적인 구조를 갖는다.
도 12는 HT1080/EPO 클론 033 및 HT1080/E1A.E1B 클론 072에 의해 생성된 EPO로부터 배출된 N-글리칸의 HPAEC-PAD 프로파일을 나타내는 도이다. 바닥에서의 선은 비하전된(0), 단일하전된, 이중하전된, 삼중하전된 및 사중하전된(각각, 1-4) 글리칸의 용출을 나타낸다. 클론 072의 덜 적재된 N-연결된 글리칸으로의 이동에 주의.
도 13은 3개의 다른 클론(A), HT1080/EPO 클론 033, HT1080/E1A-EPO 클론 008 및 HT1080/E1A.E1B-EPO 클론 072에 의해 생성된 EPO의 Maldi-MS 분석을 나타내는 도이다. 후자 2개의 클론은 더욱 복잡한 프로파일을 보여준다.
도 14는 HT1080/EPO 클론 033, HT1080/E1A-EPO 클론 008 및 HT1080/E1A.E1B-EPO 클론 072의 N-연결된 글리칸의 단당류 분석으로부터 얻어진 프로파일을 나타내 는 도이다. 나타낸 단당류(Fuc=푸코스, GalN=N-아세틸-갈락토스아민, GlcNac=N-아세틸-글루코사민, Gal=갈락토스, Man=만노스)의 비율은 만노스에 대하여 표준화하였다.
도 15는 α-푸코시다제로 처리되거나(b,d) 또는 처리되지 않은(a,c) HT1080/EPO 클론 033(a,b) 및 HT1080/E1A.E1B-EPO 클론 072(c,d)에 의해 생성된 EPO의 Maldi-MS 분석을 나타내는 도이다. 차이점은 클론 072에서 유도된 EPO의 글리칸 프로파일에서 관찰된다는 것이다. m/z값 ~2039, ~2185 및 ~1892를 갖는 피크의 명확한 변화가 발견되고(c 및 d), 이것은 안테나 데옥시헥소스를 함유하는 제안된 구조의 감소를 나타내는 것이 가능성이 가장 많다.
도 16은 IEF에 의해 분리된 다른 EPO 제조의 다양한 이성체를 나타내는 도이다. EPO-이성체는 몰당 0-14개의 시알산을 함유한다. 하기 샘플을 적용하였다(스트립 당 2000eU): Eprex(A); 뉴라미노다제-처리 Eprex(B); CHO-EPO, 총 생성(C); PER.C6™-EPO, 클론 022(D); frCHO-EPO(E).
도 17은 5000eU/㎏의 Eprex, frCHO-EPO, PER.C6™-EPO, 또는 희석된 완충용액(대조군)이 주입된 래트의 헤마토크리트(HCR, 용량퍼센트)를 나타내는 도이다. EPO 처리 래트는 대조군, frCHO-EPO 및 PER.C6™-EPO에 대하여 현저하게 더 높은 HCR을 드러냈다(p<0.001).
도 18은 5000eU/㎏의 Eprex, frCHO-EPO, PER.C6™-EPO, 또는 희석된 완충용액(대조군)이 주입된 래트의 혈액에서 망상적혈구 퍼센트로 나타내는 도이다. EPO 처리 래트는 대조군에 대하여 현저하게 더 높은 망상적혈구 퍼센트를 드러냈 다(p<0.001). Eprex 및 frCHO-EPO 처리 래트 모두의 망상적혈구 퍼센트는 PER.C6™-EPO에 비교하여 현저하게 더 높았다(p<0.001).
도 19는 5000eU/㎏의 Eprex, frCHO-EPO, PER.C6™-EPO, 또는 희석된 완충용액(대조군)을 주입 후 4일째에 총 망상적혈구 집단의 미숙한 망상적혈구 퍼센트(IFR)를 나타내는 도이다. Eprex 처리 래트는 대조군, frCHO-EPO 및 PERC6-EPO에 대하여 현저하게 더 높은 미숙한 망상적혈구 %를 드러냈다(p<0.001).
도 20은 PNGase F(F로 표시된) 및 엔도글리코시다제 F2(F2로 표시된) 분열 부위를 나타내는 도이다.
도 21은 PNGase F(A)로 및 엔도글리코시다제 F2(B)로 해리된 PER.C6™-EPO 글리칸의 MALDI 스펙트럼을 나타내는 도이다. 하위 스펙트럼의 x-축은 양쪽 스펙트럼에서 상응하는 피크가 직접적으로 서로 겹쳐지게 하는 방식으로 정렬하였다(349 Da 차이, 본문 참조).
도 22는 N-말단 글리칸의 약간의 단당류 연결을 나타내는 도이다.
도 23은 PER.C6™-EPO로부터 해리된 데시알릴화 글리칸을 얻는 개요의 상위 부분을 나타내는 도이다; 하위 부분에서의 값은 갈락토시다제 처리 후 스펙트럼에서 탐지된다. 괄호 사이의 스펙트럼의 퍼센트는 주어진 구조에 반영된 것이다. 도 26의 스펙트럼 참조.
도 24는 갈락토시다제로 인큐베이션된 PER.C6™-EPO에서 해리된 데시알릴화 글리칸을 얻는 개요의 상위부분을 나타내는 도이다; 중간 부분의 값은 소 신장 푸코시다제 처리 후 스펙트럼에서 탐지되고 하위 값은 GlcNAc-ase 인큐베이션 후 얻 어진다. 괄호 사이에서 스펙트럼의 총 퍼센트는 주어진 구조에 반영되었다. 도 26의 스펙트럼 참조.
도 25는 갈락토시다제로 인큐베이션된 PER.C6™-EPO에서 해방된 데시알릴화 글리칸을 얻는 개요의 상위부분을 나타내는 도이다; 중간 부분의 값은 소 신장 푸코시다제 처리 후 스펙트럼에서 탐지되고 하위 값은 GlcNAc-ase 인큐베이션 후 얻어진다. 괄호 사이에서 스펙트럼의 총 퍼센트는 주어진 구조에 반영되었다. 도 26의 스펙트럼 참조.
도 26은 PER.C6™-EPO의 N-연결된 글리칸의 엑소글리코시다제 처리의 MALDI 스펙트럼을 나타내는 도이다.
A.) PNGase F 및 뉴라미니다제로 인큐베이션된 PER.C6™-EPO.
B.) PNGase F, 뉴라미니다제 및 갈락토시다제로 인큐베이션된 PER.C6™-EPO.
C.) PNGase F 및 뉴라미니다제로 인큐베이션되고 갈락토시다제 및 소 신장 푸코시다제로 처리된 PER.C6™-EPO.
D.) PNGase F 및 뉴라미니다제로 인큐베이션되고 갈락토시다제, 소 신장 푸코시다제 및 GlcNAc-ase로 처리된 PER.C6™-EPO.
E.) PNGase F 및 뉴라미니다제로 인큐베이션되고 갈락토시다제 및 아몬드 밀 푸코시다제로 처리된 PER.C6™-EPO.
F.) PNGase F 및 뉴라미니다제로 인큐베이션되고 갈락토시다제, 아몬드 밀 푸코시다제 및 GlcNAc-ase로 처리된 PER.C6™-EPO.
본 발명은 재조합 DNA 기술 분야에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 단백질의 생성에 관한 것이다. 더욱 자세히는 본 발명은 약학적인 조제의 치료상 활성 구성요소로서 사용하기 위한 재조합 단백질의 생성에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질의 재조합 생성을 위하여 창조되고, 선별되고 그리고/또는 동정되는 포유동물 세포주에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 이와 같이 생성된 단백질의 용도에 관한 것이다.
단백질을 생성하기 위한 재조합 세포 발현 시스템은 잘 알려져 있다. 이들 시스템은 박테리아, 효모 및 곰팡이로부터 식물세포까지, 그리고, 곤충 세포로부터 포유동물 세포까지 분류된다. 생성 숙주 및 발현시스템의 선택은 일반적으로 사용의 용이성, 배양 비용, 성장 특성, 생산 수준 및 혈청이 없는 배지에서의 성장능력과 같은 고려사항에 의존한다. 상기 세포 발현 시스템은 또한 중첩(folding), 인산화, γ-카르복실화, 및 γ-수산화와 같은 번역-동시 및 번역-후 변형을 발휘하는 능력에서 다르다는 것이 알려져 있다. 재조합 발현 시스템의 선택이 발현된 단백질의 최종 구조에서 극적인 결과를 가짐에도 불구하고, 번역-후 변형은 일반적으로 주어진 단백질에 대하여 적절한 발현을 선택하는 데에서 결정적인 역할을 하지 않는다.
최근에는 인간 몸에서 인간 단백질의 다른 번역-후 변형 및 기능상 잠재적인 관련의 복잡성에 관하여 밝혀지고 있다. 예를 들면, 상대적으로 최근 결과는 혈액 에서 발생하는 인간 단백질의 다른 글리코실화 경향(이른 바, '혈청-형' 변형)은 뇌에서의 뇌척수액에서 발행하는 것('뇌-형' 변형)과 다르다는 것을 제시한다. 이 차이점은 효과적인 치료법의 고안에서 최고의 중요성을 갖는 핵심 문제일 것이다.
일반적으로 인간 신경 당단백질은 그들의 당화(glycosylation)에 의해 특성화되고, 이것은 문헌에서 '뇌-형' 당화로서 간주되고 있다(Margolis and Margolis 1989; Hoffmann et al. 1994). '혈청-형' 당화 단백질(즉, 혈액에서 순환하는 당단백질)에 대조적으로, 뇌-형 당화 단백질은 특성적으로 락토스아민-형 안테나(antenna)에서 N-아세틸-글루코사민에 첨부된 α1,3-연결 푸코스와 함께 변형되는 것으로 인하여 루이스 x 또는 시알릴 루이스 x 구조를 형성하는 복합체-형 N-연결된 당을 갖는다(도 5). 루이스 x 구조의 두 가지 형태가 있다: 말단 갈락토스 잔기를 갖는 것 및 말단 N-아세틸-갈락토스아민(GalNac) 잔기를 갖는 것. 이들 말단 기는 시알산과 연결된다면, 루이스 x 구조는 시알릴 루이스 x 구조라고 부른다. 혈청-형 및 뇌-형 과당류 사이의 또 다른 차이점은 후자는 종종 말단 N-아세틸-글루코사민 및/또는 말단 갈락토스를 함유하고, 말단 N-아세틸-갈락토스아민 변형을 포함할 수 있지만, 혈청-형 올리고당류는 일반적으로 이러한 구조를 단지 소량만 함유한다. 혈청에서 순환하는 단백질에서 일반적으로 발견되는 올리고당류는 흔히 갈락토실화 구조를 대량으로 함유한다. 이것은 갈락토스가 말초의 N-아세틸-글루코사민에 연결되는 것으로 락토스아민 구조를 형성한다는 것을 의미한다. 당단백질은 이러한 식으로 간 세망내피조직 세포 및 대식세포에 존재하는 N-아세틸-글루코사민 수용체(즉, 말단 N-아세틸-글루코사민을 인식하는 수용체)에 의해 세포내이 입(endocytosis)으로부터 보호된다(Anchord et al. 1978; Stahl et al. 1978). 혈청-형 올리고당류는 또한 일반적으로 아시알로당단백질 수용체를 통하여 당단백질이 제거되지 않도록 보호하는 말단 시알산(또한 흔히 뉴라민산으로 칭함)을 함유한다. 이들 제거 메카니즘은 혈액에서 순환하는 당단백질에 특이적으로 적용되고, 대개는 인간 중추신경계(CNS)에서는 부족하다(Hoffmann et al. 1994).
'혈청-형' 변형을 포함하는 단백질의 생성을 위한 재조합 발현 시스템은 당 기술분야에서 이용가능하고, 예로서 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포 및 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포가 있다. '뇌-형' 변경과 같은 다른 변형을 갖는 단백질의 생성인 경우, 어떤 편리한 방법도 기재되어 있지 않다. 그러므로, 치료 단백질에서 다른 번역-후 변형을 고려하는 발현 시스템이 요구된다. 특히, '뇌-형' 번역-후 변형을 포함하는 단백질에 대한 효율적인 발현 시스템이 요구된다. 이들 특정한 요구를 갖는 단백질은 CNS, 말초신경계 및 심장 조직에 관한 질병 중에서의, 모든 종류의 질환의 치료에서 유익할 수 있다. CNS에 영향을 주는 질환은 급성 뇌손상, 신경변성 질병 및 간질, 정신 분열증 및 기분 장애과 같은 다른 기능 장애와 같은 다른 종류의 고통을 포함한다. 신경세포 및 조직에 고통을 주는 다른 병리학상 질환은 저산소증, 발작질환, 신경독 중독, 다중 경화, 저혈압, 심박 정지, 방사 또는 저혈당증의 결과일 수 있는 상해에 기인한다. 신경 손상은 또한 동맥류 치료 또는 종양 절제와 같은 외과 수술 중에 발생할 수 있다.
번역-후 변형에서의 차이에 적어도 부분적으로 관련된 다른 역할을 갖는 단백질의 예는 에리트로포이에틴(EPO)으로 알려진 호르몬이다. EPO, 조혈 줄기세포를 적혈구와 구별하는 데에서의 역할로 유명한 단백질은 신경 조직에서의 기능을 포함하여, 다른 여러 기능을 갖는다. CNS의 발달에 있어서 EPO의 역할이 제안되었다(Dame et al. 2001). EPO 단백질은 또한 인간의 신생아 및 성인의 뇌척수액(CSF)에서 탐지되고 있다(Juul et al. 1997; Buemi et al. 2000). CSF에서 존재하는 바와 같이 EPO는 온전한 혈액-뇌 방벽을 통과하지 못하므로 뇌에서 국소적으로 생성되는 것으로 나타난다(Marti et al. 1997; Buemi et al. 2000). EPO 발현의 규제는 조직-특이적이고, 이것은 추가로 EPO가 뇌 및 뼈 골수에서 다른 조직-특이 기능을 갖는다는 가설을 뒷받침한다(Masuda et al. 1999; Chikuma et al. 2000; Sasaki et al. 2001). 그러므로, 조혈 기능에 더하여, EPO가 향신경성 역할을 가질 것이라고 가정되고 있다. 향신경성 인자는 신경에서 그들의 발전, 식별, 유지 및 재생에 영향을 주도록 작용하는 체액성 분자로서 정의된다(Konishi et al. 1993). 여러 연구의 결과는 현재 EPO가 향신경성 인자로서 작용할 수 있다는 것을 예증하고 있다(예를 들어, Sadamoto et al. 1998; Brines et al. 2000). 적혈구생성 및 신경보호에서의 EPO의 상기 효과에 더하여, EPO의 다른 역할은 예를 들어, 내피 세포 및 근육 세포에서 기재되어 있다. 당 기술분야에서 (재조합) EPO의 효과가 단백질에서 존재하는 과당류의 당화 경향에 매우 의존한다고 입증되고 있다. 인간 EPO의 N-연결된 과당류는 그것의 잘 알려진 생물학적인 활성: 적혈구생성의 자극으로 매우 중요하다(Takeuchi and Kobata 1991; Wasley et al. 1991; Tsuda et al. 1990; Morimoto et al. 1996; Takeuchi et al. 1989; Misaizu et al. 1995).
EPO의 경우에는, 뇌와 같은 다른 조직에 의해 생성되고 있는 EPO(뇌-형)와 비교하여, 신장에서 생성되고 혈액에서 순환하는 단백질에 대한 혈청형 EPO(또는 '신장-형', 또는 '비뇨기-형' EPO)도 또한 고려될 수 있다. 혈청-형 EPO에 대한 생성 및 정제 시스템은 당 기술분야에서 잘 알려져 있고, 재조합적으로 생성된 혈청-형 EPO는 낮은 적혈구 수준으로 고통받는 환자들에게서 일상적이고 성공적으로 사용된다. 이 재조합 EPO가 적혈구생성의 유도를 보장하는 충분한 시간동안 혈류에서 순환할 수 있는 안정한 단백질의 모든 요구조건을 충족시켜야한다는 것이 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로 세포 시스템을 기초한 CHO 또는 BHK는 이들 특성을 갖는 EPO의 생성에 사용된다. 하지만, 이 생성 및 정제 시스템으로부터 생성된 혈청-형 EPO는 중추 또는 말초 신경계에 관련된 장애의 치료에서뿐만 아니라 허혈/재관류 유도 장애에 관련된 고통의 치료에서 상대적으로 유용하지 않다. 이것은 그것의 당화 형태가 이들 장애의 치료에 적합하지 않기 때문이고 또한, 그것의 강한 조혈 활성에 기인한 적혈구 수의 증가(적혈구생성)를 이끌기 때문이고, 이것은 이들 비-조혈 장애에 관련하여 원하지 않은 역효과로 나타난다(Wiessner et al, 2001). 그러므로, 셀렉틴-기저 수송 또는 표적화를 포함하는 뇌에서 또는 조직에서 활성인 EPO 분자의 독특한 특징을 갖는, 이러한 EPO와 같은 단백질에 대한 새로운 생성 시스템에 대한 요구가 있다. 더욱이, 혈청형 당화와는 다른, 바람직하게는 뇌-형 당화를 갖는 번역후-변형, 및 이들을 제공하기에 효율적인 생성 및 정제 시스템을 갖는, EPO와 같은 단백질의 약제학적으로 수용가능한 제조에 대한 요구가 있다.
다른 당화 형태의 다른 역할을 제시하는, 각각의 조직에서 다른 당화 형태를 갖는 단백질의 또다른 예는 트랜스페린(transferrin)이고, 이것은 혈청에서는 형성하지 않지만 CSF에서 아시알로트랜스페린처럼 상당한 양으로 발생한다(Van Eijk et al. 1983; Hoffmann et al. 1995).
셀렉틴으로 명명된 당단백질의 특정 부류는 허혈/재관류 손상에서 내피에 대한 백혈구의 부착의 초기 단계에서 중요한 역할을 수행한다. 셀렉틴 부류에는 세 가지 종류가 있다: P-셀렉틴, E-셀렉틴 및 L-셀렉틴. 셀렉틴들은 그것들에 결합하는 당단백질 리간드의 당구조를 인식하는 렉틴 도메인을 갖는다. 셀렉틴에 대한 결합에서 과당류에서의 시알릴 루이스 x 변형에 중요한 역할이 있다(Foxall et al. 1992). 허혈/재관류의 모형에서 백혈구의 부착에 대한 셀렉틴 및 시알릴 루이스 x 구조의 중요성을 나타내는 여러 연구가 있다. 시알릴 루이스 x 과당류 Slex-OS는 예를 들어 심장 조직 괴사를 83%까지 감소시키는 허혈/재관류의 고양이 모형에서 심장보호적인 것으로 나타난다(Buerke et al. 1994). 더욱이, 특허출원 WO 02/38168호는 다양한 질병의 치료에서 소염제로서의 용도용 시알릴 루이스 x 구조를 포함하는 셀렉틴 결합 단백질의 용도를 개시한다. 하지만, (시알릴) 루이스 x 글리칸을 포함하는 단백질의 제조를 위한 적절한 발현 시스템은 개시하지 않고 있다. 그러므로, (시알릴) 루이스 x 구조와 같은 예비결정된 당화 구조를 필요로 하는 단백질에 대한 재조합 발현 시스템에 대한 요구가 있다. 더욱 일반적으로, 예비결정된 번역후 변형을 필요로 하는 단백질의 재조합 생성용 발현 시스템을 필요로 한다.
본 발명은 번역후 변형을 포함하는 펩티드 및 단백질과 같은, 단백질성 분자를 생성할 수 있는 포유동물 세포를 동정하고, 선별하고 그리고 얻기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 번역후 변형은 단백질성 분자가 발현하는 포유동물 세포에 의해 예비결정되어 발생된다. 또한 본 발명은 원하는 예비결정된 번역후 변형을 나타내는 번역후 변형 및/또는 단백질을 생성하는 그것들의 능력에 기초하여 얻어지고 있는 방법에 따라서 얻어질 수 있는 포유동물 세포에서, 그리고 본 발명의 방법에 따라서 얻어질 수 있는 포유동물 세포를 사용하여 에리스로포이에틴(EPO)와 같은 단백질성 분자를 생성하여 얻는 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성하는 방법을 제공하고, 포유동물 세포가 발현가능한 형태로 핵산을 보유(harbor)하는 것과 같은 방법으로 상기 단백질성 분자를 암호화하는 핵산을 보유하는, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 포유동물 세포를 제공하는 단계; 그리고 상기 단백질성 분자의 생성에 공헌하는 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성하는 방법을 제공하고, 이것은 상기 예비결정된 번역후 변형을 갖는 단백질성 분자를 제공하는 능력을 갖는 포유동물 세포를 동정하는 단계; 상기 포유동물 세포가 발현가능한 형태에서 상기 핵산을 보유하는 것과 같은 방법으로 상기 단백질성 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 상기 포유동물 세포를 제공하는 단계; 그리고 상기 단백질성 분자의 생성에 공헌하는 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 예비결정된 번역후 변형을 갖는 상기 단백질성 분자를 제공하는 능력을 갖는 포유동물 세포를 동정하는 단계; 상기 포유동물 세포가 발현가능한 형태에서 상기 핵산을 보유하는 것과 같은 방법으로 상기 단백질성 분자를 암호화하는 핵산을 갖는 상기 포유동물 세포를 제공하는 단계; 상기 단백질성 분자의 생성에 공헌하는 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계; 이렇게 생성된 상기 단백질성 분자에서 상기 번역후 변형을 분석하는 단계; 그리고 상기 단백질성 분자에 존재하는 상기 번역후 변형이 상기 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 것을 결정하는 단계를 포함한다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 재조합 단백질의 상당한 양이 '신경- 또는 뇌-형' 특성을 갖도록 생성될 수 있는 것과 같은 신경 특징 및 특성을 갖는 포유동물 세포를 제공한다. 특정한 예비결정된 번역후 변형을 수행하는, 뇌-형 EPO와 같은, 재조합 단백질의 생성은 현재 본 발명의 방법 및 수단을 사용하는 것으로 실현가능하다. 더구나, 본 발명은 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 포유동물 세포가 발현가능한 형태에서 상기 핵산을 보유하는 것과 같은 방법으로 상기 단백질성 분자를 암호화하는 핵산을 갖는, 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 포유동물 세포를 제공하는 단계; 상기 단백질성 분자의 생성에 공헌하는 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계 및 포유동물 세포 배양에서 상기 단백질성 분자를 분석하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 포유동물 세포가 발현가능한 형태에서 상기 핵산을 보유하는 것과 같은 방법으로 상기 단백질성 분자를 암호화하는 핵산을 갖는, 본 발명에 따른 방법에 의하여 얻을 수 있는 포유동물 세포를 제공하는 단계; 상기 단백질성 분자의 생성에 공헌하는 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계; 이렇게 생성된 상기 단백질성 분자에서 상기 번역후 변형을 분석하는 단계; 그리고 상기 단백질성 분자에 존재하는 상기 번역후 변형이 상기 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 것을 결정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 단백질성 분자를 생성하기 위한 상기 방법은 포유동물 세포 배양으로부터 상기 단백질성 분자를 정제하는 추가적인 단계를 포함한다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 포유동물 세포에서 단백질성 분자를 생성하기 위한 방법이고, 여기서 상기 포유동물 세포는 불멸화되고 그리고/또는 E1A 아데노바이러스성 서열을 발현한다. E1A 아데노바이러스성 서열의 불멸화 또는 도입은 얻어진 포유동물 세포의 동정화 이전에 발생할 수 있지만, 또한 세포가 동정화되고, 선별되고 그리고/또는 얻어진 후 발생할 수 있다.
게다가, 본 발명은 단백질성 분자를 정제하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 상기 단백질성 분자는 분자에서 존재하는 예비결정된 번역후 변형의 기초 하에서 세포 배양으로부터 정제되고, 상기 예비결정된 번역후 변형은 분자가 생성되는 포 유동물 세포에 의해 이루어진다.
게다가, 본 발명은 에리스로포이에틴, 에리스로포이에틴의 하나 이상의 뮤테인(mutein), 에리스로포이에틴의 하나 이상의 유도체, 또는 허혈, 재관류 손상, 저산소증-유도 장애, 염증성 질병, 신경변성 장애, 및 중추- 및 말초 신경계에 대한 급성 손상으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위해, 다양한 등급으로 시알릴화된 에리스로포이에틴 분자의 하나 이상의 분획의 집합으로 이루어진 군으로부터 선택된 에리스로포이에틴형 분자의 조성물의 용도를 제공하고, 여기서 에리스로포이에틴형 분자의 상기 조성물은 단백질 함량 기저에서, 에포에틴 알파 및 에포에틴 베타와 같이 빈혈의 치료를 위해 현재에 사용되는 에리스로포이에틴형 분자보다 낮은 인 비보(in vivo) 에리스로포이에틴 활성을 갖는다. 또한 본 발명은 상기 질환을 예방하거나 또는 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 N-연결된 글리칸 구조을 함유하는 (시알릴)루이스 X 및/또는 LacdiNac으로 이루어진 군으로부터 선택된 당화 구조를 필요로 하는 단백질성 분자를 포유동물 세포에서 생성하기 위한 방법을 제공하고, 상기 세포는 상기 단백질성 분자가 에리스로포이에틴인 경우에 상기 포유동물 세포가 PER.C6™이고, 상기 단백질성 분자가 글리코델린 또는 프로테인 C 또는 조직 요소 경로 억제제인 경우에 상기 포유동물 세포는 HEK293 세포가 아니고 상기 단백질성 분자가 매트릭스 메탈로프로테아제 1인 경우에 상기 포유동물 세포가 HT1080 세포가 아닌 것을 조건으로 하여, 아데노바이러스로부터 E1A를 암호화하는 핵산을 발현하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 관점은 (시알릴)루이스 X 및/또는 LacdiNac 구조를 포함하는 N-연결된 글리칸을 갖는 단백질성 분자가 농축된(enriched) 분획을 제공하기 위한 방법을 제공하는 것이고, a) 아데노바이러스에서 E1A를 암호화하는 핵산을 발현하는 세포에서 상기 단백질성 분자를 재조합적으로 발현하는 단계; 및 b) 이렇게 생성된 단백질성 분자를 분획하고, 그것으로 인하여 (시알릴)루이스 X 및/또는 LacdiNac 구조를 포함하는 상기 N-연결된 글리칸을 갖는 분자가 농축된 분획을 얻는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 관점은 에리스로포이에틴, 에리스로포이에틴의 하나 이상의 뮤테인, 및 에리스로포이에틴의 하나 이상의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 에리스로포이에틴형 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이고, 에리스로포이에틴형 분자 당 N-연결된 글리칸에서 루이스-X 구조의 평균 개수(average number)가 약 2.2 이상인 것을 특징으로 한다. 다른 구현예에서는, 상기 평균 개수가 약 2.6, 2.7, 3.6, 4.1 또는 5.7 이상이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물 또는 분획은 약제의 제조용으로 사용된다. 본 발명의 또 다른 관점은 허혈, 재관류 손상, 저산소증-유도 장애, 염증성 질병, 신경변성 장애, 및 중추- 및 말초 신경계에 대한 급성 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 아데노바이러스에서 E1A을 암호화하는 핵산을 발현하는 포유동물 세포에서 재조합적으로 생성가능한 에리스로포이에틴의 용도이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 허혈, 재관류 손상, 저산소증-유도 장애, 염증성 질병, 신경변성 장애, 및 중추- 및 말초 신경계에 대한 급성 손상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하는 것이고, 상기 방법은 에리스로포이에틴, 에리스로포이에틴의 하나 이상의 뮤테인, 에리스로포이에틴의 하나 이상의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 에리스로포이에틴형 분자의 조성물을 인간 또는 동물 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 에리스로포이에틴 분자의 조성물은 아데노바이러스로부터 E1A를 암호화하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포에서 재조합적으로 생성가능한 것을 특징으로 한다. 예의 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 PER.C6™세포이다.
상세한 설명
본 발명의 이점은 예비결정된 번역후 변형을 필요로 하는 단백질의 생성에 적합한 재조합 생성시스템을 제공하는 것이다. 첫번째 관점에서, 이러한 재조합 시스템은 당해 단백질을 위해 또는 당해 단백질의 의도된 용도를 위해 필요한 번역후 변형을 적용할 수 있는 발현 시스템을 동정하기 위하여 본 발명에 따른 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 두번째 관점에서, 본 발명은 필요로 하는 단백질의 원하는 번역후 변형을 적용할 수 있는 능력을 갖는 발현시스템을 만드는 방법을 제공한다. 본 발명의 추가적인 관점은 이렇게 생성된 예비결정된 번역후 변형을 갖는 단리된 단백질, 사용방법, 및 상기를 포함하는 약제학적인 조성물을 포함한다. 그러므로, 본 발명은 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성할 수 있는 포유동물 세포를 동정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 포유동물 세포에 의해 생성된 단백질에서 번역후 변형을 분석하는 단계; b) 상기 단백질이 상기 예비결정된 번역후 변형을 포함하는가를 결정하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성할 수 있는 포유동물을 선별하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 포유동물 세포에서 또는 상기 포유동물 세포의 세포 표면에서 조직 특이 마커 또는 조직 특이 마커의 조합의 존재 또는 부재를 분석하는 단계로, 마커 또는 상기 마커의 조합은 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA 및 세포 배양의 기술을 사용하여 상기 세포에서 생성되는 때에, 필요로 하는 단백질성 분자에 예비결정된 번역후 변형을 적용하는 상기 세포의 능력을 나타낸다; 및 b) 상기 조직 특이 마커의 존재 또는 부재의 기초 하에서 상기 포유동물 세포를 선별하는 단계.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 이종의 세포 집단(population)으로부터 포유동물 세포을 얻기 위한 방법을 제공하고, 상기 포유동물 세포는 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성할 수 있고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: a) 상기 이종성 세포 집단에서의 상기 세포에서 생성된 단백질에서 번역후 변형의 기초 하에 세포를 분류하는 단계; 및 b) 상기 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질을 생성할 수 있는 세포를 선별하는 단계. 이러한 분류는 예비결정된 번역후 변형을 인식하는 형광으로 표지된 항체를 사용하는 세포의 분류에 제한하지 않고, 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성할 수 있는 포유동물 세포를 동정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 상기 포유동물 세포가 발현가능한 형태에서 상기 핵 산을 보유하는 방법으로, 필요로 하는 그리고 번역후 변형될 수 있는 단백질을 암호화하는 핵산을 갖는 상기 포유동물 세포를 제공하는 단계; 상기 단백질의 생성에 공헌하는 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계; 상기 포유동물 세포에 의해 생성된 상기 단백질에서 번역후 변형을 분석하는 단계; 및 상기 단백질에서 상기 번역후 변형의 존재를 확인하는 단계. 또 다른 구현예에 따라서, 본 발명은 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성할 수 있는 포유동물 세포를 동정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: 상기 포유동물 세포가 발현가능한 형태에서 상기 핵산을 보유하는 방법으로, 번역후 변형을 포함할 수 있는 상기 단백질성 분자를 암호화하는 핵산을 갖는 상기 포유동물 세포를 제공하는 단계; 상기 단백질성 분자의 생성에 공헌하는 조건 하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계; 상기 포유동물 세포에 의하여 생성된 상기 단백질성 분자에 번역후 변형을 분석하는 단계; 및 상기 단백질성 분자에 나타나는 상기 번역후 변형이 상기 예비결정된 번역후 변형을 포함하는가를 결정하는 단계.
여기서 사용된 바와 같이, 단백질성 분자는, 한정되지는 않지만, 예비결정된 번역후 변형될 수 있는 것들로, 즉 변형에 익숙한 오른쪽 항목에서 요구되는 아미노산 잔기를 갖는(예를 들면, 원하는 N-연결 글리칸 구조를 첨가하는 경우에서 Asn-X-Ser/Thr 서열을 포함하는 것들이고, 이 항목에서 Asn 잔기에 적용될 수 있는 것들이다), 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질와 같은 분자 뿐만 아니라 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질의 돌연변이체(결실, 점 돌연변이, 교환 및/또는 화학적으로 유도된 변경을 포함하는 분자)를 간주한다. 또한, 태그 및/또는 다른 단백질성 및 비- 단백질성 표지를 갖추는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질에 간주한다(예를 들어, 방사능 화합물). 이러한 단백질의 예로는 인간 EPO이고, 이외에도 신장-또는 혈청-형, 뇌-형과 같은 다른 표현형을 갖는다. (재조합적으로 발현되는 경우에)적합한 기능을 위해 예비결정된 번역후 변형을 보유하고 어떤 조직에서 단백질의 기능성에서 중요한 역할을 수행할 것 같은 어떤 특성을 갖는 단백질의 종류의 비제한적인, 다른 예로는 모노클로날 항체, 뉴트로핀, 시토킨, 인슐린-유사 성장 인자. TGF-β유사 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 헤파린 결합 성장 인자, 티로신 키나제 수용체 리간드 및 다른 영양 인자를 포함한다. 이들 인자의 대부분은 질병 증후군에 관련되고, 그러므로 대부분의 단백질은 인간의 치료에서 재조합 형태로 사용될 수 있고, 단백질이 인 비보에서 활성이 되기에 필요한 번역후 변형을 보유하도록 한다. 그러므로, 이들 단백질은 원하는 번역후 변형을 제공할 수 있는 발현시스템에서 생성되어야 한다. 이러한 단백질의 예로는, 여기에 한정되지는 않지만, 트랜스페린, 글리코델린, 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유도 향신경성 인자, 뉴로트로핀-3, -4/5 및 -6, 모양체 향신경성 인자, 백혈병 억제 인자, 카디오트로핀-1, 온코스타틴-M, 여러개의 인터루킨, GM-CSF, G-CSF, IGF-1 및 -2, TGF-β, 신경교-유도 향신경성 인자, 뉴투린(neurturin), 페르세핀, 미오스타틴, 섬유아세포 성장 인자-1, -2 및 -5, 암피레굴린, 활성 유도 아세틸콜린 수용체, 네트린-1 및 -2, 뉴레굴린-2 및 -3, 플레이오트로핀, 미드킨, 줄기세포 인자(SCF), 아그린, CSF-1, PDGF 및 사포신 C가 있다. 여기서 사용된 모노클로날 항체는 인간 및 인간화 항체, 그의 일부분 및 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, Fab 단편, CDR 영역, 변수 영 역, 경사슬 및 중사슬 또는 특이 리간드로 사용하기에 적합한 다른 포맷(format)과 같은 상당물로 간주된다.
하나의 특정 구현예에 따라서, 생성시스템은 N-연결된 글리칸 구조를 수용할 수 있는 단백질에서 루이스 X 구조 및/또는 LacdiNAc를 적용할 수 있도록 제공된다. 본 발명에 따르면, 이러한 발현시스템은 동정화되고, 선별되거나 또는 특이적으로 고안될 수 있다. 이러한 목적의 고안의 예로는 아데노바이러스의 E1A 서열을 포함하는 핵산의 포유동물 세포로 도입하는 것이 있고, 상기 E1A 서열은 상기 포유동물 세포에서 발현되는 것이다. 이미 존재하는 이러한 세포의 예는 HEK293, PER.C6™, 911이다. 이들 세포주가 본질적으로 알려져 있고 단백질 생성에서 사용되었을지라도(Van den Nieuwenhof et al, 2000; WO 00/63403; Grinnell et al, 1994), 거기에서 생성되는 단백질에 대하여 루이스 X 및/또는 LacdiNAc 구조를 응용하는 능력에서 E1A의 결정적인 효과는 지금까지 이해되지 않고 있다.
여기서 사용된 번역후 변형은 상기 단백질성에 존재하는 변형으로 간주한다. 그것은 인 비보 또는 인 비트로(in vitro)에서 RNA로부터 상기 분자의 번역 도중에 또는 이어서 도입되는 변형으로 간주한다. 이러한 변형은, 여기에 한정하지는 않지만, 당화(glycosylation), 중첩, 포스포릴화, γ-카르복실화, γ-수산화, 다중체화(multimerization), 술피도 브리지 및 예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 절단 또는 첨가와 같은 공정 사건을 포함한다. 여기서 사용된 바와 같이 예비결정된 번역후 변형은 선별된 치료에 유용한 번역후 변형으로 간주된다. 바람직한 구현예에 따르면, 예비결정된 번역후 변형은 인간 또는 동물 신체의 특정 조직, 기관, 구획 및/또는 세포의 장애를 치료하기에 특히 유용한 변형된 단백질을 만드는 변형의 한 형태로 간주된다. 이러한 예비결정된 번역후 변형을 수행하는 단백질성 분자는 결과적으로는, 치료되어야 할 조직, 기관, 구획 및/또는 세포 이외의 (해로운 또는 다른 원치 않는 부작용과 같은) 상당한 효과가 없을 수 있다. 하나의 구현예에 따라서, 예비결정된 번역후 변형은 예를 들면, 불리한 부작용을 감소하기 위하여, 더욱 빠르게 혈액으로부터 깨끗하게 되는 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질을 야기할 수 있다. 예비결정된 번역후 변형은 이미 상세하게 완전히 이해될 수 있지만, 일반적으로 이러한 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자의 적절하고 원하는 활성이 충족되는 원하는 상태가 된 것으로 간주되고, 관심의 단백질성 분자에 존재하는 상세한 변형은 필수적으로 완전히 이해되고 그리고/또는 정의되어야 할뿐만 아니라 원하는 활성도 있어야 한다는 것을 의미한다. 의도된 용도에 의존하는, O-및/또는 N-글리칸에서 원하는 당화 변형의 예로 루이스 X, 시알릴 루이스 X, GlcNac, GalNac, LacdiNAc, N-아세틸-글루코사민에 첨부된 α1,3-결합 푸코스, 말단 N-아세틸-글루코사민, 말단 갈락토스, 바이섹트(bisecting) N-아세틸-글루코사민, 설페이트기, 및 시알산과 같은 구조들이 있다.
본 발명의 포유동물 세포는 포유동물- 및 바람직하게는 인간-특성을 가장 잘 수반할 것 같은 단백질을 생성하기 위한 인간 단백질을 생성하기 위하여, 인간 또는 인간 계통인 것이 바람직하다. 신경계의 번역후 변형을 가져야만 하는 단백질성 분자를 생성하기 위하여, 신경 세포의 지표인 단백질 마커와 같은, 신경 특성을 갖는 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 이것은 비-신경계 세포가 신경형 번역후 변 형을 포함하는 단백질을 생성하는 데에 지극히 유용할 수 있다는 것을 배제하는 것은 아니다. 그것은 이러한 번역후 변형을 생성할 수 있는 세포를 선별하고, 동정하거나 또는 얻기에 필요한 단백질 활성에 의존한다.
이들이 치료 장치에서 적용되는 경우에 많은 양의 단백질을 생성하도록 요구되므로, 본 발명의 포유동물 세포는 불멸화되는 것이 바람직하다. 블멸화는 많은 방법으로 이루질 수 있다. 불멸화된 세포를 얻기 위한 방법의 예는 형질변환하는 및/또는 불멸화하는 단백질을 암호화하는 핵산의 추가에 의해, 또는 내성 단백질이 형질변환되는 것을 통한 화학적 처리를 통해, 휴면 중인 세포를 분화되는 세포로 활성적으로 형질변환하는 것, 또는 종양 소재로부터 세포를 가져오는 것 등이다. 비-종양성 세포를 불멸화하기 위한 하나의 바람직한 방법은 911 및 PER.C6™와 같은 세포주에서 보여주는 바와 같이 아데노바이러스의 E1 영역의 첨가에 의한 것이다. 불멸화 세포의 다른 방법은 특정 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질을 암호화하는 서열을 사용하는 형질변환과 같이, 알려져 있다(예를 들어, HeLa 세포). 많은 이러한 단백질은 번역-활성화하는 특징 뿐만 아니라, 항-세포자멸사성 효과를 가지므로, 아데노바이러스로부터의 E1과 같이, 특정 바이러스 단백질의 첨가는 재조합 단백질의 생성에 이로울 수 있다. 현재 놀랍게도, 본 발명에 따른 발현 시스템으로서 사용된 숙주세포에서 아데노바이러스의 E1A의 발현은 발현시스템의 특성을 변화시키는 것으로 루이스 X 및/또는 LacdiNAc를 포함하는 N-결합 당화 구조를 적용하는 능력을 얻는다.
루이스 X 및/또는 LacdiNAc-을 함유하는 N-결합 글리칸을 필요로 하는 단백 질성 분자를 생성하기 위하여 방법에 대하여 적합한 세포주는 PER.C6™이고, Center for Applied Microbiology and Research의 European Collection of Animal Cell Cultures에 제96022940호로 기탁되었다. 이러한 관점에 따른 다른 적합한 세포주는 발현가능한 포맷에서 아데노바이러스의 E1A 서열을 함유하는 핵산을 갖는, HEK293, 911 및 하나이상의 세포 또는 그것의 원종(ancestor)으로 도입되는 것에 의해 변형될 수 있는 다른 포유동물 세포를 포함한다. 임의로, 발현가능한 포맷에서 E1B 서열이 포함되고, 이는 E1A 발현의 잠재적인 세포자멸사성 영향에 대항하기 위하여, E1B에 의해 발휘되는 항-세포자멸사 효과때문에 이로울 수 있다.
본 발명에 따른 단백질성 분자를 생성하기 위한 방법은 추가로 포유동물 세포 배양으로부터 상기 단백질성 분자를 정제하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 여기서 사용된 정제는 당업자에게 잘 알려진 통상의 방법을 사용하여 수행할 수 있지만, 상기 단백질성 분자에 존재하는 번역후 변형이 사용되는 단계를 포함하는 정제 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 단백질성 분자에 존재하는 예비결정된 번역후 변형이 사용되는 단계를 포함하는 정제 방법이다. 친화성 정제 방법이 적용되는 경우에는, 특정 탄수화물 모이어티(moiety)에 특이적인 렉틴과 같은 그리고 번역후 변형의 예의 형태에 대한 것인, 항체 또는 다른 결합제를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 항체의 예는 (시알릴) 루이스 x 구조, lacdiNac 구조 또는 GalNac 루이스 x 구조에 대한 항체이다. 본 발명의 관점에 따른 유용한 렉틴의 비제한적인 예는 AAL 및 E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴과 같은 셀렉틴류이다. 이러한 결합제를 사용하는 것은 (재조합) 단백질을 정제하기 위한 것을 가능하 게 하여, 높은 퍼센트의 정제된 단백질이 원하는 예비결정된 번역후 변형을 수행한다. 더욱 바람직하게는 단백질성 분자가 동질성으로 정제되는 방법이 있다. 포유동물 세포 배양으로부터 단백질의 정제를 위한 방법은 본 발명에서 제공되고, 예를 들어, 재조합적으로 생성된 생성물의 N-글리칸에 존재하는 루이스 x 구조를 인식하는 항체 또는 렉틴을 사용하는 것으로 뇌형 당화된 EPO의 정제를 위한 친화도 크로마토그래피 방법을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 따라서 얻을 수 있는, 예비결정된 번역후 변형을 갖는 단백질성 분자를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 제공한다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자들에게 잘 알려진 것들이다. 바람직한 구현예에서, 상기 약제학적으로 허용가능한 조성물에서 상기 단백질성 분자는 에리트로포이에틴이다. 본 발명에 따라서, 신경 단백질 마커를 갖는 세포에서 생성된 에리트로포이에틴은 신경 조직 또는 신경 세포에서 활성인 번역후 변형을 획득한다. 하지만, 상기 번역후 변형은 혈액에서 순환하는 EPO에서 보여지는 번역후 변형과 유사하지 않다. 신경의 단백질 마커를 갖는 세포에서 생성된 EPO의 에리트로포이에틴 영향은 현저하게 더 낮다. 본 발명에 따르면, 이는 높은 퍼센트의 시알산의 부재, 및/또는 루이스 x 구조 및 말단 갈락토사이드와 같은 뇌형 특징의 존재때문이라는 것이 현재 강력하게 제안되고 있다. 이러한 뇌형 EPO가 신경 조직에 관련된 질환의 치료에서 또는 허혈에 의해 손상된 조직(허혈성 심장과 같은)의 치료에서 상대적으로 높은 투여량으로 사용될 수 있는 반면, 동시에 현재 이용가능한 EPO 제재에 비하여 적혈구 생성에 대하여 현저하게 감소된 영 향을 갖는다는 점 때문에, 이는 장점이 된다. 본 발명은 하기로 이루어진 군에서 선별된 하나 이상의 번역후 변형을 포함하는 재조합 에리트로포이에틴을 제공한다: 시알릴 루이스 x 구조, 루이스 x 구조, N-아세틸-글루코사민에 첨부된 α1,3-연결 푸코스, LacdiNAc 구조, 말단 N-아세틸-글루코사민군 및 말단 갈락토스군. 상기 재조합 에리트로포이에틴은 본 발명에 따라서 획득가능한 포유동물 세포에서 뿐만 아니라 이미 알려진 그러나 이 목적에 적합하다고 인식되지는 않은 포유동물 세포에서 생성가능하다. 하나의 예는 PER.C6™이다. 하나의 구현예에서와 같이 본 발명은 추가로 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자의 생성을 위한 PER.C6™의 용도를 제공하고, 여기서 상기 단백질성 분자가 혈액에서 빠르게 없어지고 그리고/또는 높은 투여량에서 사용되는 것이 바람직하다. PER.C6™에서 생성가능한, EPO의 경우에, 높은 투여량은 적혈구생성의 불리한 역효과를 제한하는 동안에, 저산소증에 관련된 급성 손상을 억제하거나 치료하도록 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명의 단백질성 분자는 외과수술, 치료 또는 진단에 의한 인간 또는 인간 신체의 치료에 적합하다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 EPO유사 분자는 저산소증-유도 장애, 신경변성 고통, 또는 중추- 또는 말초-신경계에 대한 급성 손상의 치료용 약제의 제조에서 사용된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, EPO와 같은 상기 단백질성 분자는 허혈 및/또는 재관류 손상의 치료용 약제의 제조에서 사용된다. 하나의 다른 구현예에서, EPO와 같은 상기 단백질성 분자는 면역 장애 및/또는 염증성 질병의 치료용 약제의 제조에서 사용된다.
방법 및 조성물은 재조합 단백질의 제조 및 생성을 위해 여기서 개시된다. 본 발명은 당화 및 적절한 중첩과 같이 동시번역의 및/또는 번역후 변형을 획득하는 단백질의 생성에 특히 유용하고, 추가로 단백질성 분자에서 뇌형 동시번역 및/또는 번역후 변형을 생성할 수 있는 인간 세포의 용도에 관련된 것이다. 이들 세포는 예를 들면, 그들의 신경 특징에 기인하여, 치료학적으로 이로울 수 있는 신경 특징을 갖는 인간 당단백질의 생성을 위하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 당화, 포스포릴화 또는 중첩과 같은 '뇌형' 또는 '신경형' 번역후 변형과 같이 신경 특성을 갖는 재조합적으로 발현된 단백질을 변형하는 신경 특질을 갖는 인간 세포주의 용도를 제공한다. PER.C6™(미국 특허 제 6,033,908호)로 명명된 이러한 세포주의 예로는 아데노바이러스 E1 유전자를 보유하는 구조물을 사용하여 인간 배아 망막 세포의 불멸화에 의해 생성되었다. 이전에, PER.C6™세포는 인간 EPO 및 완전한 인간 모노클로날 항체와 같이 단백질의 높은 수율이 얻어질 수 있으므로, 재조합 인간 단백질의 생성에 특히 적합하다고 증명되고 있다(WO 00/63403에서 개시됨). 본 발명은 PER.C6™세포에 의해 생성된 재조합 단백질이 신경 특질과 같은 예의 조직-특이한 특성을 얻을 수 있다고 개시한다(예를 들어, 당화와 같은 번역후 변형). 이것은 이른바 뇌형 올리고당류를 보유하는 단백질의 생성에 의하여 예시된다. PER.C6™세포에 의해 생성된 인간 EPO가 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포에 의하여 생성된 인간 비뇨기 EPO 또는 재조합 인간 EPO에서 발견된 N-연결된 당으로 변형된다는 것을 보여준다. CHO 및 BHK 세포에서 생성된 인간 비뇨기 EPO 및 재조합 인간 EPO는 '신장형' 또는 '혈청형' 올리고당류로 간주될 수 있는 당화 구조를 함유한다. 전형적으 로, 이들 CHO- 및 BHK-EPO 제조의 N-연결된 당은 고도로 분지화(branching)되고, 고도로 갈락토실화되고, 그리고 고도로 시알릴화되는 반면에, 그들은 말초의 α1,3-연결된 푸코스를 결핍한다(Tsuda et al. 1998; Takeuchi et al. 1988; Nimtz et al. 1993; Watson et al. 1994; Rahbek-Nielsen et al. 1997).
여기서, PER.C6™에서 생성된 인간 EPO에 연결된 올리고당류의 성질이 밝혀져 있고, 인간 비뇨기 EPO 및 CHO 및 BHK 세포에서 생성된 재조합 인간 EPO에서 존재하는 올리고당류와는 현저하게 다른 것을 보여준다. 첫째로, PER.C6™-생성 인간 EPO의 올리고당류의 평균 시알산 함량이 인간 비뇨기 EPO 또는 (CHO 및 BHK로부터의) 재조합 인간 EPO의 평균 시알산 함량보다 현저하게 낮다. PER.C6™-생성 인간 EPO에서 매우 낮은 시알산 함량은 갈락토스 및/또는 N-아세틸-갈락토스아민 및/또는 N-아세틸-갈락토스아민을 종결하는 것을 포함하는 N-연결 올리고당류의 존재를 암시한다. 둘째로, N-아세틸-갈락토스아민은 PER.C6™-생성 인간 EPO의 N-연결 당에서 상당한 양으로 발견되는 반면에, N-아세틸-갈락토스아민은 인간 비뇨기 EPO 및 CHO 세포에 의해 생성된 재조합 인간 EPO의 N-연결 당에서 발견되지 않는다. N-아세틸 갈락토스아민의 흔적량만이 BHK 세포에서 생성된 재조합 인간 EPO의 몇개의 배치(batch)에서의 N-연결 당에서 발생한다고 보고되고 있다(Nimtz et al. 1993). 셋째로, PER.C6™세포에서 생성된 인간 EPO의 N-연결 당은 매우 높은 양의 푸코스를 함유하는 것이 밝혀졌다. 푸코스의 분획은 말초의 N-아세틸-글루코사민에 α1,3-연결되고 그것으로 인하여, 소위 루이스 x 구조(도 5)를 형성한다. 루이스 x 구조는 인간 비뇨기 EPO 또는 CHO 및 BHK 세포에서 생성된 재조합 인간 EPO에서 발 생하는 것으로 보고된 적이 없다. 본 발명에 따른 EPO에서의 (시알릭) 루이스 x 구조는 이 EPO가 셀렉틴에 결합하기에 적합하고 심장보호에서 추가 응용이 고찰된다는 것을 나타낸다.
단백질 연결 올리고당류가 삼차원 형태, 용해도, 점성도 및 전하와 같은 폴리펩티드의 물리화학적인 특성에서 중대한 영향을 갖고, PER.C6™-생성 인간 EPO는 인간 비뇨기 EPO 및 CHO 및 BHK 세포에 의해 생성된 재조합 인간 EPO로부터 현저하게 다른 물리화학적인 특성을 갖는다(Toyoda et al. 2000). 명백히, PER.C6™생성 인간 EPO는 인간 비뇨기 EPO 및 낮은 시알산 함량에 기인한 CHO 및 BHK 세포에 의해 생성된 재조합 인간 EPO보다 덜 하전되고, 매우 높은 푸코스 함량에 기인하여 더욱 소수성일 수 있다. 그 결과로, PER.C6™-생성 인간 EPO의 평균 pI는 인간 비뇨기 EPO 및 CHO 및 BHK 세포에 의해 재조합 인간 EPO의 평균 pI보다 현저하게 더 높다. EPO의 글리칸, 특히 시알산도 EPO 수용체에로의 결합에서 영향을 갖기 때문에, PER.C6™-생성 인간 EPO가 인간 비뇨기 EPO 및 CHO 및 BHK 세포에 의해 재조합 인간 EPO보다 EPO 수용체에 대한 다른 친화도를 갖는 것으로 기대된다. PER.C6™세포에서 EPO의 생성이 이전에 개시되었을지라도(WO 00/63403), 생성된 EPO의 구조상 세부사항 중 어느 것도 그 이후로 개시된 적이 없다. 그러므로 여기서 얻어진 통찰력은 PER.C6™에서 EPO의 생성이 완전히 새로운 응용, 특히 적혈구생성이 (원하지 않는) 부작용으로 보여지는 경우에 적합하다는 결론을 정당화한다. 물론, 다른 단백질은 여기서 제공된 새로운 통찰력으로부터 이로울 수 있다. 본 발명의 또 하나의 관점에 따라서, PER.C6™ 또는 E1A를 발현하는 포유동물 세포를 사용하여, 루이 스 x 및/또는 N-글리칸을 함유하는 LacdiNAc을 필요로 하는 단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 이러한 구조로부터 이로울 수 있고 상기 세포에서 적절하게 세포에서 생성될 수 있는 단백질의 예로는 에리트로포이에틴, 트랜스페린, 글리코데인 A(PP14)와 같은 글리코데인, 신경성장인자(NGF), 뇌-유도 향신경성 인자, 뉴로트로핀-3,-4/5 및 -6, 섬모 향신경성 인자, 백혈병 억제 인자, 카디오트로핀-1, 온코스타틴-M, 인터루킨, GM-CSF, G-CSF, IGF-1 및 -2, TGF-β, 신경교-유도 향신경성 인자, 뉴투린, 페르세핀, 미오스타틴, 섬유아세포 성장 인자-1, -2 및 -5, 암피레글린, 활성 유도 아세틸콜린 수용체, 네트린-1 및 -2, 뉴레굴린-2 및 -3, 플레이오트로핀, 미드킨, 줄기세포 인자(SCF), 아그린, CSF-1, PDGF, 사포신 C, 가용성 보체 수용체-1, 알파-1 산 당단백질, 급성-기(phase) 단백질, E-셀렉틴 리간드-1, LAM-1, 암배아성 항원-유사 CD66 항원, 말초 림프절 아드레신, CD75, CD76, CD45RO, CD21, P-셀렉틴 당단백질 리간드-1, GlyCAM-1, 뮤신-형 당단백질, CD34, 포도칼리신, α1-안티키모트립신, α1-프로테아제 억제제, α-아밀라제, 타액 프롤린-농축 당단백질, SERP-1, 인터페론-β, β-흔적(trace) 단백질, 프로테인 C, 유로키나제, 주혈흡충(schistosome) 당단백질, 글리코델린 A, 조직 인자 경로 억제제, α-페토프로테인, 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모 성선자극 호르몬(hCG)와 같은 성선 자극성 호르몬과 같은 인간 임신 단백질, 또는 상기 당단백질 구조를 수용할 수 있는 이들의 단편 또는 변이체가 있다. 여기서 사용된 바와 같은 단편은 단백질의 일부이고, 몇개의 아미노산 길이의 펩티드 내지 거의 전체 단백질에 필적할 수 있다. 변이체는 뮤테인, 융합 단백질, 다른 비-단백질성 모이어티에 결합된 단백질 또는 펩티드 등일 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 분절 또는 변이체는 번역후 변형을 수용할 수 있다.
본 발명의 다른 관점에서, 방법은 (시알릴) 루이스 x 및/또는 LacdiNac 구조를 포함하는 N-결합 글리칸을 갖는 단백질성 분자에서 농축된 분획(fraction)을 생성하는 것을 제공하고, 하기의 단계를 포함한다: a) 아데노바이러스로부터 E1A를 암호화하는 핵산을 발현하는 세포에서 상기 단백질성 분자를 재조합적으로 발현하는 단계; 및 b) 그렇게 생성된 단백질성 분자를 분획화하고 그것으로 인하여 (시알릴) 루이스 x 및/또는 LacdiNac 구조를 포함하는 상기 N-연결 글리칸을 갖는 분자에서 농축된 분획을 얻는 단계. 상기 단백질성 분자는 본 발명의 이 관점에서 이로울 수 있다. HEK293 세포에서 생성된 다음 정제된 프로테인 C는 GalNAc-루이스 x 구조를 포함하는 특정 당화 구조를 갖는 것으로 알려져 있지만(Grinnell et al, 1994), 정제된 단백질은 이러한 형태의 당에 의도적으로 농축되지는 않으며 또한 E1A를 발현하는 생성 세포를 계획적으로 선택하는 것도 아니었다. 아미노바이러스성 E1A를 발현하는 포유동물 세포가 의도적으로 (시알릴) 루이스 x 및/또는 LacdiNAc 구조를 포함하는 N-연결 글리칸을 갖는 단백질을 생성하도록 그리고 추가로 이들 특정 분획에 대하여 농축하도록 사용될 수 있다는 것을 이해시키는 것이 본 발명의 장점이다. 바람직하게는 상기 분획은 (시알릴) 루이스 x 및/또는 LacdiNAc 구조를 포함하는 상기 N-연결 글리칸에 결합하는 모노클로날 항체 또는 렉틴에 결합시킴을 이용하는 것과 같이, 원하는 글리칸 구조를 이용하는 단계이다. 여기서는, 이들 방법을 사용하여, EPO 생성을 위하여 특정 당화 프로파일을 갖는 EPO의 분획을 얻을 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명의 한 관점은 에리트로포이에틴, 에리트로포이에틴의 하나 이상의 뮤테인 및 에리트로포이에틴의 하나 이상의 유도체로 이루어진 군으로부터 선별된 에리트로포이에틴-유사 분자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이고, 이것은 에리트로포이에틴-유사 분자당 N-결합 글리칸에서의 루이스 x 구조의 평균 개수가 약 2.2 이상인 것을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 에리트로포이에틴-유사 분자당 N-결합 글리칸에서의 루이스 x 구조의 평균 개수가 약 2.6, 2.7, 3.6, 4.1 또는 5.7 이상이다. 이러한 조성물은 여기서 개시한 바와 같이 의약 목적에서 유용할 수 있다.
더구나 본 발명은 포유동물에서 특히 인간에서 허혈/재관류 손상의 치료를 위한 인간 신경 세포에서 생성된 뇌형 단백질의 용도를 개시한다. 여기서 사용한 바와 같이, 허혈/재관류 손상은 이전에 생육할 수 있는 허혈성 조직의 재관류 후에 발생하는 세포의 손상으로서 정의된다. 허혈/재관류 손상은 예를 들어, 혈전용해의 치료에 제한되지는 않지만, 관상 혈관성형, 대동맥의 십자 클램핑(clamping), 심폐 바이패스(bypass), 기관 또는 조직 이식, 외상 및 쇼크와 연관된다.
본 발명은 뇌-형 올리고당류와 함께, 포유동물 세포에서 생성된, 치료적 단백질의 용도를 제공한다. 이들 뇌-형 올리고당류는 인간과 같은 포유동물 피험자에서 허혈/재관류 손상의 치료를 위하여, 특히 루이스 x 구조, 시알릴 루이스 x 구조, 또는 (시알릴) 루이스 x 구조를 함유하는 유도체를 포함한다. 재조합 단백질에서 (시알릭) 루이스 x 구조의 존재는 허혈/재관류의 손상 부위에 대한 이들 단백질을 목표로 삼고, 그것으로 인하여 (시알릴) 루이스 x 구조를 함유하지 않은 단백질 보다 더욱 효과적으로 그들의 허혈/재관류 보호적인 영향을 발휘한다. 재조합적으로 발현된 단백질에서 뇌-형 올리고당류의 존재는 에리트로포이에틴(EPO)에 의하여 본 발명에서 예시되고, PER.C6™에서 생성된다. EPO의 이 특정 형태는 루이스 x 뿐만 아니라 시알릴 루이스 x 구조를 함유한다. 본 발명에서, 개시된 실험은 심장 허혈/재관류 손상의 인 비보 모델에서 심장보호적인 기능 및 발작에 관하여 혈청-형(또는 신장-형) EPO와 비교하여 PER.C6™ 뇌-형(또는 신경형) EPO의 우월성을 보여준다.
본 발명에 의한 또 다른 이점은 PER.C6™-생성 인간 EPO가 향신경성 활성을 갖는 것이다. PER.C6™-생성 EPO는 향신경성 및/또는 신경-보호성 제제로서 기능하는 데에서 물리화학적인 및/또는 약력학적인 및/또는 약동학적인 이점인 EPO 단백질을 야기한다. PER.C6™-생성 EPO는 CHO 및 BHK 세포에서 생성되는 고도로 시알릴화된 혈청-형 당화 인간 재조합 EPO보다 신경 세포에 대하여, 그리고 신경 세포에서 EPO-R에 대하여 더 높은 친화도를 갖는다. 비-신경 세포에서 생성된 재조합 인간 EPO(Goto et al. 1988)는 적혈구계의 프로제니터(progenitor) 세포에서 EPO-R에 대한 것보다 신경 세포에서 EPO-R에 대하여 더 낮은 친화도를 갖는다(Musada et al. 1993 및 1994).
EPO의 신경보호적인 역할은 명백히 염증에 의해 또는 저산소증 및/또는 허혈에 의해, 또는 신경변성 장애에서 유발될 수 있는 독성 화학제품에 반응하여 신경보호적인 치료법으로서 재조합 인간 EPO의 용도에 대한 새로운 가능성을 연다. 그러나, 주요 단점은 신경보호제로서 적용되는 경우에 혈액 순환에서 존재하는 재조 합 EPO는 또한 적혈구 질량 또는 헤마토크리트의 증가를 초래한다. 이것은, 번갈아, 더 높은 혈액 점성도를 이끌고, 뇌 허혈에서 해로운 영향을 가질 수 있다(Wiessner et al. 2001).
본 발명은 신경보호제로서 지금까지 응용되고 있는 재조합 인간 EPO가 원하지 않는 혈액영양의 부작용을 갖는다는 문제점에 대한 해법을 제공한다(Wiessner et al. 2001). 그러므로, PER.C6™-생성 뇌-형 당화 재조합 인간 EPO가 신경조직발생제 및/또는 신경보호제로서 높은 잠재성을 갖는 반면에 적혈구생성을 자극하는 데에서 낮은 잠재성을 갖는다는 보여준다.
본 발명에 따르면, PER.C6™-생성 EPO와 같이, E1A를 발현하는 포유동물 세포에서 생성된 EPO는 예를 들어, 급성 머리 및 뇌 손상 또는 신경변성 장애로 야기되는 신경 손상을 억제하고, 예방하고 그리고/또는 복구하기 위하여 전신적으로(정맥내로, 복막내로, 피부내로)투여될 수 있다. 또한, 본 발명은 포유동물에서 중추- 및 말초 신경계, 망막 조직 및 심장 조직와 같이, 저산소증에 의하여 심하게 손상될 수 있는 조직의 기능을 조정하도록 사용될 수 있는 생성물을 제공한다. 본 발명에 의하여 제공되는 생성물에 의하여 치료될 수 있는 질환은 급성 머리-, 뇌- 및/또는 심장 손상, 신경변성 장애, 발작질환, 신경독 중독, 저혈압, 심박 정지, 방사, 및/또는 저산소증에 기인한 손상으로부터 다중 경변이 야기될 수 있다. 저산소증은 출생 전의 또는 출생 후의 산소 손실, 질식, 기종, 패혈성 충격, 심박 정지, 숨가쁨, 익사에 근접함, 겸상적혈구 위기, 성인 호흡기 고통 증후군, 부정율동, 질소 혼수상태, 수술 후 인식 기능장애, 일산화탄소 증독, 매연 흡입, 만성 폐쇄 폐 질병 아나필락시성 쇼크(chronic obstructive pulmonary disease anaphylactic shock) 또는 인슐린 쇼크의 결과일 수 있다. 뇌졸중 손상은, 여기에 한정하지 않지만, 간질, 만성 발작질환 또는 경련을 포함한다. 병리가 신경변성 질병으로부터 야기되는 경우에, 장애는 AIDS 치매, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 크로이츠펠트-야콥 병, 발작, 대뇌 마비, 척수 외상, 뇌 외상, 인식 기능의 나이-연관 손실, 근위축의 측생 경화, 알콜중독, 망막 허혈, 녹내장, 일반 신경 손실, 기억 손실 또는 노화에 기인할 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 생성물로 치료될 수 있는 질병의 다른 예는 자폐성, 우울, 불안 장애, 기분 장애, 주의력결핍 과잉행동 장애(ADHD) 및 인식 기능부전을 포함한다.
PER.C6™-EPO는 혈액-뇌 방벽 기능부전의 경우에 혈액-뇌 방벽을 수동적으로 통과할 수 있다. 혈액-뇌 방벽이 완전한 경우에, PER.C6™-EPO는 EPO-R을 통해 혈액-뇌 방벽을 넘어 활동적으로 수송된다고 생각된다. 다른 연구들은 재조합 EPO의 높은 투여량이 투여되는 경우에 EPO 그 자체가 혈액-뇌 방벽을 통과할 수 있다고 제안한다(WO 00/61164). 혈액-뇌 방벽을 통과하기 위한 재조합 PER.C6™-EPO에 대한 또 다른 예상 경로는 인간 뇌 미세혈관 내피 세포에서 존재하는 E-셀렉틴 분자를 이용하여 PER.C6™-생성 EPO에서 존재하는 (시알릴-) 루이스 x 글리칸 구조의 상호작용을 경유한다(Lou et al. 1996). E-셀렉틴 및 EPO 사이의 상호작용은 E-셀렉틴이 또한 CNS로 T 림프구의 이동에 관련되므로, 뇌의 내피 방벽을 통과하는 EPO의 수송을 촉진할 수 있다(Wong et al. 1999). 최상의 신경-보호를 위하여 필요하다면, PER.C6™-EPO가 훨씬 덜 효과적으로 단백질생성을 유도하기 때문에, PER.C6 ™-생성 EPO가 혈청-형 EPO보다 현저하게 높은 투여량으로 투여될 수 있으므로, 헤마토크리트 증가의 해로운 영향이 감소되거나 또는 없어진다.
본 발명의 또 다른 관점에서, PER.C6™-생성 EPO와 같이, E1A를 발현하는 포유동물 세포에서 생성된 EPO는 신경 손상을 억제하거나 또는 방해하기 위하여, 주입에 의해 경막내로(intrathecally) 또는 내재하는 배의 카테테르를 통해 또는 요추 주입을 통하여 투여될 수 있다. 다시, 혈청-형 EPO에 비하여 뇌-형 EPO를 사용하는 이점은 혈액-뇌 방벽 기능부전의 경우에 혈액 순환으로 누출되는 경우에, 즉시 발작에 기인하여, 적혈구생성의 면에서 원하지 않는 역효과가 발생하지 않을 것이다.
본 발명은 무-혈청 조건 하에서 매우 높은 밀도로 성장하는 그리고 PER.C6™과 같이, 신경 특질을 갖는 무한히 성장하는 형질변환된 세포는 이들 특질에서 그들의 기능성에 의존하는 인자를 생성하기에 매우 유용하다는 것을 입증한다. 이것은 또한 신경의 특성 또는 신경-관련된 기능을 갖는 것이 아니라 이러한 세포에 의해 가져다 주는 번역후 변형으로부터 이익이 되는 인자를 생성하기 위한 가능성을 제공한다. 어떤 인자들은 또한 비-신경 조직에서 중요한 역할을 하지만, 예를 들어, 본 발명에서 EPO에 대하여 기재한 바와 같이 루이스 x 구조 또는 푸코스 잔기를 포함하고 본 발명의 수단 및 방법에 의해 제공될 수 있는 당화 구조를 필요로 한다는 것을 예상할 수 있다. PER.C6™세포에 의해 생성될 수 있고 PER.C6™세포의 신경의 특질을 이용할 수 있는 인자의 예로는, 여기에 한정하지는 않지만, 뇌-형 에리트로포이에틴, 트랜스페린 및 상기 다른 인자들을 포함한다. 본 발명은 다른 재조합 향신경성 당단백질의 생성이 이러한 세포에서 일어나는 뇌-형 변경으로부터 이익이 될 가망성이 많다는 것을 보여준다.
본 발명에 따라서, 놀랍게도 평균적으로 낮은 단백질 골격 당 시알산 잔기의 수를 갖는 에리트로포이에틴-유사 분자는 다양한 장애의 치료 및/또는 예방에서 효과적이라는 것을 발견되었다. 이는 낮은 평균 시알릴화 정도 및/또는 낮은 관련된 적혈구생성 활성 때문에 분획화시 폐기되었던, 이에 한정되지는 않지만 재조합 포유동물 세포계에서 생성된 EPO 배치의 낮은-시알릴 EPO-분획을 포함하는, 지금까지 거의 또는 전혀 쓸모없다고 믿어져왔던 EPO 및 EPO-유사 분자를 사용하는 완전히 새로운 방법은 개시한다. 그러므로, 본 발명은 낮은 시알산 함량을 갖는 EPO는 더 높은 시알산 함량을 갖는 EPO로서 래트에서 실험적으로 유도된 발작에서 경색부의 크기를 줄이는 데 잠재력이 있다는 것을 예증한다. 높은 시알산 함량의 EPO가 더 긴 순환성 반감기 및 인 비보에서 증가된 적혈구생성 잠재력에 상호관련된다는 것이 당업자들에게 알려져 있다(Tsuda et al. 1990; Morimoto et al. 1996).
그러므로, 일반적인 의미로, 본 발명은 허혈, 재관류 손상, 저산소증-유도 장애, 염증성 질병, 신경변성 장애, 및 중추- 또는 말초신경계에 대한 급성 상해로 이루어진 군에서 선택된 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위하여, 에리트로포이에틴, 하나이상의 에리트로포이에틴의 뮤테인, 하나이상의 에리트로포이에틴의 유도체 및 다양한 등급으로 시알릴화된 에리트로포이에틴 분자의 하나이상의 분획의 조성물으로 이루어진 군으로부터 선택된 에리트로포이에틴-유사 분자의 조성물의 용도를 제공하고, 여기서, 상기 에리트로포이에틴-유사 분자의 조성물은 에포에 틴 알파 및 에포에틴 베타보다 낮은 인 비보 에리트로포이에틴 활성에 기초한 단백질 함량을 갖는다. 본 발명의 구현예는 조성물 및 그것의 용도를 포함하고, 상기 인 비보에서 적혈구생성 활성은 에포에틴 알파(Eprex) 또는 에포에틴 베타의 것보다 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90%이상 더 낮다. 에리트로포이에틴-유사 분자는 예를 들어, EPO 뮤테인, EPO 유도체 또는 정성적인 및/또는 정량적인 관점에서 단백질 골격의 당화에서 차이나는 EPO 분자과 같이 EPO의 현재에 알려진 형태에 유사하거나 또는 동일한 단백질 골격을갖는 분자를 포함하는 것을 의미한다. 여기서 사용된 바와 같이 뮤테인은 에포에틴 알파의 단백질 골격에 관련된 아미노산의 결실, 첨가, 치환 및/또는 위치이동에 의하여 단백질 골격에서 하나이상의 돌연변이를 갖는 에리트로포이에틴-유사 분자로 이루어지는 것을 의미하고, 자연적으로 발생하는 대립형질의 변이체뿐만 아니라 유전적으로 및/또는 화학적으로 및/또는 효소적으로 얻어진 변이체를 포함한다. 이러한 분자는 EPO의 기능적인 활성으로 수여할 수 있을 것이다. 그것들은 당업자들에게 잘 알려진 분자생물학적인 표준기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이 유도체는 에리트로포이에틴 또는 에포이에틴 알파, 또는 그것의 화학적 또는 효소의 변형에 의한 에포이에틴 알파의 다른 기능적인 뮤테인으로부터 얻을 수 있다. 여기서 의미하는 바와 같이 에리트로포이에틴 활성은, 헤모글로빈 농도의 측정 또는 에리트로포이에틴-유사 분자의 인간 또는 동물 개체로 투여 후 어떤 시점에서 헤마토크리트값의 증가에 의해 측정될 수 있는(예를 들어, 실시예 9 참조), 인간 또는 동물 개체에서 적혈구 생성에서 EPO의 자극 효과를 의미한다. 이들 방법은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 에 포에틴 알파는 현재에 시판중인 Eprex-™에서 존재하는 재조합 인간 EPO 형태이고, 빈혈 환자의 소변으로부터 단리된 인간 에리트로포이에틴에 (아미노산 및 탄수화물 조성물에 관해서) 유사하거나 또는 동일하다. 적혈구생성 목적을 위한 치료 요양법은 잘 설립되어 있다. 일반적으로 EPO 투약량은 IU(국제 단위)에서 주어진 바와 같고 적혈구생성에서 EPO의 활성으로 간주한다. 이러한 IU는 EPO의 단백질 함량에 상호관련되지만, 조작상 한정되므로, 상호관계는 다른 배치(batch)에서 다를 수 있다. 경험에 의한 방법으로, 1 IU는 에포에틴 알파 8-10ng에 상응한다. 본 발명에서의 기재를 목적으로, 에리트로포이에틴-유사 분자의 적혈구생성 활성은 IU를 한정하는 것으로 도입된 변수를 없애기 위해서, 단백질 함량 기준으로 고려된다. 당업자에게는 비록 IU가 일반적으로 상업적인 EPO 조제물에서 주어질지라도, 이러한 조제물에서 EPO 분자의 농도는 표준 공정에 따라서 쉽게 정의될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 이것은 예를 들어, IU/g에서 관련된 특정 활성을 결정하도록 할 것이다(예로, EP 048267 참조). 이들 목적에 유용한 여러 인 비보 및 인 비트로 평가법은 또한 Storring et al. (1992)에 의해 기재되어 있다. 시판중인 EPO의 다른 형태의 예로는 Procrit 또는 Epogen (모두 에포에틴 알파) 및 Aranesp (다르베포에틴 알파, 순환성 반감기 및 적혈구생성 활성을 증가시키는 추가 N-당화 부위를 갖는 EPO)이다. 에리트로포이에틴 활성이 시판중인 다양한 에포에틴 알파 및 에포에틴 베타 제조법이 다소 다를 수 있을 지라도, 그것들은 일반적으로 높은 적혈구생성 활성에 대하여 최적화된다. 본 발명은 더 낮은 조혈성(hemopoietic) 또는 적혈구생성 활성을 갖고, 그것으로 인하여 이것이 원하여지지 않을 때에 증가된 적혈구생성 의 부작용을 줄이거나 방지하는 EPO-유사 분자 또는 EPO-형태의 용도를 개시한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 에리트로포이에틴-유사 분자의 조성물은 에포에틴 알파에서 에리트로포이에틴 분자 당 시알산 잔기의 평균 개수보다 10%이상 낮은 에리트로포이에틴-유사 분자 당 시알산 잔기의 평균 개수에 의해 특징화된다. 다른 구현예에 따르면, 상기 시알산 잔기의 평균 개수는 에포에틴 알파에서 EPO 단백질 골격 당 시알산 잔기의 평균 개수보다 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이상 더 낮도록 선택될 수 있다. 에리트로포이에틴-유사 분자에서 시알산 잔기의 상기 평균 개수는 바람직하게는 에포에틴 알파에서 EPO 분자 당 시알산 잔기의 평균 개수의 0 내지 90% 사이에 놓이지만, 정확한 퍼센트는 환자-장애 조합이 다른 것보다 높은 헤마토크리트 값에 덜 영향받기 때문에, 장애의 종류, 그리고 -때때로- 환자에 따라서 의존한다. 대체가능하게는, 시알산의 수는 예를 들어, EPO-유사 분자 당 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 시알산 잔기와 같이, EPO-유사 분자에 따라서 기재될 수 있다. 값이 시알릴화의 다양한 등급의 EPO-유사 분자로 이루어진 조성물에 대하여 계산된 평균이므로, 상기 값 사이의 비-정수값은 본 발명에 따른 분자를 정의하는 것도 가능하다. 최상의 범위는 당업자에 의해 과도한 부담없이 실험적으로 결정될 수 있다. 분자 또는 EPO의 시알산 함량 당 시알산 잔기의 평균 개수는 공표된 공정에 따라서 결정될 수 있고, 당업자들에게 잘 알려져 있다. 하나의 가능한 공정은 EP 0428267에서 기재되어 있다. 간략하게, 시알산 잔기는 80℃에서 30분동안 황산 0.35M로 가수분해하는 것으로 EPO-유사 분자로부터 분열되고, 상기 용액은 분석하기 이전에 수산화나트륨 으로 중성화된다. 대체가능하게는, 시알산은 표준 공정에 따라서 효소성 분열에 의해 제거될 수 있다. EPO의 양은 예를 들어, 시판 중인 단백질 평가법 키트(예를 들어, Bradford assay, Biorad) 및 기준으로 280㎚에서의 흡광도를 이용하는 ELISA, RIA 등의 재조합 인간 EPO를 사용하는 표준 곡선을 사용하는 것과 같이 잘 알려진 공정으로 평가된다. 시알산 함량은 Jourdian et al.(1971)의 방법으로 분석될 수 있다. 대체가능하게는, 시알산은 당업자들에게 잘 알려진 방법을 사용하여(예를 들어, Analysis of Sialic Acids using High-Performance Anion-Exchange Chromatography, Application note number TN41, Dionex), 고성능 음이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 분석될 수 있다. 시알산 함량은 EPO의 몰당 시알산의 몰로서, 또는 EPO-유사 분자 당 시알산 잔기의 평균 개수로 표현될 수 있다. EPO-유사 분자 당 시알산 잔기의 평균 개수에 대한 표시는 또한 pI를 측정하는 등전성 집속(iso-electric focusing)에 의하여 주어질 수 있다(실시예 4 참조).
에리트로포이에틴-유사 분자 당 시알산 잔기의 평균 더 낮은 값을 갖는 에리트로포이에틴-유사 분자를 얻기 위하여 여러 방법이 고찰될 수 있다. 이들은, 이들에 한정하지 않지만, 예를 들어, 뉴라미니다제와 같은 특히 시알산을 분열시키는 효소, 또는 예를 들어, N-글리카나제 F(모든 N-글리칸을 제거하는), 엔도글리코시다제 F2(2-안테나(biantennary) 구조를 제거하는), 엔도글리코시다제 F3(2-또는 3-안테나 구조) 등과 같은 당화 구조의 더욱 치환분(시알산을 포함하는)을 분열하는 효소를 사용하여, 예를 들어 어느 적절한 숙주세포주에서 재조합적으로 생성되는, EPO-유사 분자의 처리 또는 EPO-유사 분자 당 시알산 잔기의 평균 개수의 감소를 야기하는, 산에 제한하지 않는 화학물질을 갖는 EPO-유사 분자의 처리를 포함한다. 특히, 고도로 시알릴화된 EPO 분획은 탈시알릴화되고 본 발명에서 사용될 수 있다. 또 다른 하나의 구현예에서, 시알산 분자의 평균 더 낮은 값을 갖는 EPO-유사 분자는 더 높고 그리고 더 낮은 시알릴화 EPO 모두를 포함하는 혼합물로부터 이러한 형태를 분리하거나 또는 정제하는 것으로 얻어질 수 있다. 현재에 사용되는 생성 시스템은 일반적으로 이러한 혼합물을 야기하고, 적혈구생성의 목적을 위해 의도된 EPO는 시알산 잔기의 높은 평균 개수를 갖는 형태를 정제하는 것으로 제조된다. 본 발명은 이 공정으로부터 다른 분획의 용도, 즉, 시알산 잔기의 더 낮은 값을 갖는 EPO 형태의 용도를 개시한다. 이러한 분획의 분리 및 정제는 이온-교환, 친화성 정제 등과 같이, 당업자에게 잘 알려진 확립된 기술을 사용하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 에리트로포이에틴-유사 분자는 바람직하게는 재조합적으로 생성된다. 이것은, 여기에 한정하지는 않지만, 차이니스 햄스터 난소 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, HeLa, HEK293 또는 PER.C6™과 같은 인간 세포를 포함하는 적합한 발현 시스템에서 이루어질 수 있다. 곤충 세포 또는 효모와 같은 저급 진핵 세포에서의 발현도 또한 가능하다. 낮은 시알산 함량을 갖는 EPO-유사 분자의 생성은 특정 원핵생물의 숙주와 같은, 시알릴화하는 효소의 천연의 결핍에 의해서, 또는 시알릴화된 단백질을 생성할 수 있는 숙주의 유전적인 변형 또는 돌연변이 유발에 의해, 시알릴화-부족한 세포 시스템에서 수행될 수 있다. 재조합 단백질을생성하기 위한 방법 및 수단은 당업자들에게 잘 정리되어 알려져 있고, EPO-유사 분자에 대하여 다른 원천을 사용하는 것은 본 발명의 관점에서 분리되는 것 없이 가능하다는 것은 당업자들에게 명백하다. 본 발명의 하나의 관점에서, EPO-유사 분자는 본 발명에 따른 방법으로 생성되고, 그것으로 인하여 예비결정된 번역후 변형을 갖는 분자를 생성한다. 본 발명의 다른 관점에서, 에리트로포이에틴-유사 분자를 포함하는 조성물은 인간 또는 동물 개체에 비경구로 투여되는 에리트로포이에틴-유사 분자의 존재가 에포에틴 알파 및 에포에틴 베타보다 더 빠른 속도에서 혈류로부터 제거된다는 것으로 특성화된다. 혈류로부터의 제거는 당업자들에게 잘 알려진 방법으로, 예를 들어, 실시예 18에서 이루어진 것처럼 혈액에서 단백질의 반감기를 결정하는 것으로 측정될 수 있다. 건강한 지원자에서는, 에포에틴 알파는 반복된 정맥주사 후 약 4시간의 순환성 반감기를 갖는다. 만성 신장 부전증을 갖는 환자에서 약 5시간 동안의 반감기가 보고되고 있다. 실시예 8의 방법을 사용하여, 본 발명자들은 에포에틴 알파(Eprex)에 대한 180분의 반감기를 측정하였다. 이 방법이 본 발명의 조성물의 반감기를 결정하도록 그리고 시간 중 또는 표준 EPO(Eprex)의 반감기의 퍼센트 중 이 반감기를 발현하도록 사용될 수 있다는 것이 당업자들에게 명백할 것이다. 유사한 실험은 인간에서의 반감기를 결정하는 것이 인간에서 실현가능하다. 4-안테나 구조 대 2-안테나 구조의 더 낮은 비율을 갖는 에리트로포이에틴-유사 분자는 또한 원형질에서 더 짧은 반감기를 가질 것이다(Misaizu et al, 1995; Takeuchi et al, 1989). 이러한 더 낮은 비율을 일으키는, 세포주에서 EPO의 생성이 실현가능하거나 또는 대체가능하게는 이들 형태는 더 많은 4-안테나 구조를 함유하는 형태로부터 정제된다. 상대적으로 더 많은 2-안테나 구조를 포함하는 이러한 조성물 또한 본 발명에서 유용하다. 또한, 본 발명의 하나의 이점이 순환에서 에리트로포이에틴-유사 분자의 더 높은 최대 농도가 Eprex, Procrit, NESP와 같이 현재에 사용되는 EPO 형태에 비교하여 도달될 수 있다는 것임을 명백하게 할 것이다. EPO-유사 분자의 고농도가 상기 치료에서 원하여진다면, 이것은 예를 들어, 이러한 높은 투여량을 함유하는 약제학적인 조제물의 형태에서, 본 발명의 조성물의 높은 투여량을 투여햐는 것으로 이루어질 수 있다. 현재에 사용되는 EPO-유사 분자의 단백질 함량 기초하에서 유사한 투여량으로의 투여는 더 높은 적혈구생성을 이끌고, 이것은 상기 치료에 대한 원하지 않는 역효과이다. 본 발명은 또한 상기 에리트로포이에틴-유사 분자를 포함하는 약제학적인 조성물 및 상기 군으로부터 선택된 질환을 예방하거나 또는 치료하는 방법 뿐만 아니라, 인간 또는 동물 신체의 예방 및/또는 치료를 위한 에리트로포이에틴-유사 분자의 조성물을 제공한다.
실시예
실시예 1. PER . C6 ™세포에서 마커 단백질의 발현에 관한 연구.
인간 아데노바이러스형 5의 E1 영역으로 형질전환되고 PER.C6™세포주(ECACC 제 96022940호로 기탁된)를 야기하는 세포는 인간 배아 망막으로부터 유래되었다. 망막은 일반적으로 신경 및 섬유아세포-유사 세포(Masland 2001)을 포함하는, 많은 수의 다른 세포형(55개 이상의 다른 신경 하위형)을 포함한다. PER.C6™의 세포 기원을 추적하기 위하여, 세포 내에서 또는 세포 상에서 마커 단백질의 발현을 시험하기 위한 연구를 수행하였다. 이들 마커는 특정 세포형 및/또는 조직에 대하여 특성화된다고 당업자들에게 알려져 있다. 마커 단백질은 표 1에 기재하였다.
마커 단백질 발현은 마커 단백질에 대한 항체를 사용하여 시험하였다. 각 실험에서, 음성 대조군(항체로 인큐베이션되지 않은 PER.C6™세포) 및 양성 대조군을 도입하였다. 이들 양성적인 대조군은 마커 단백질을 발현하는 것으로 알려진 인간 조직의 절편(section)이다(표 2).
PER.C6™세포를 배지 챔버(medium chamber) 내 유리 슬라이드에서 배양하였다(Life Technologies, Nunc Lab-Tek, Chamber Slide, 방사선 살균됨, 2 배지 챔버, cat.no.154464A). PER.C6™세포를 65-70% 콘플루엔시(confluency)에서 살포하고(배양 챔버당 2 웰), 37℃에서 24시간동안 배양하였다(10% CO2, 95% 대기). 상기 배지를 제거하고, 세포를 가진 유리 슬라이드를 살균된 PBS로 세척하고, 배지 챔버에서 제거하고, 공기-건조하였다. 상기 세포를 아세톤에서 2분동안 인큐베이션하여 유리 슬라이드에 고정하였다. 공기 건조 후, 슬라이드를 알루미늄 호일로 싸고, 사용하기 전에 -18℃미만의 온도에서 냉동시켰다.
양성 대조군 조직을 Academic Hospital Erasmus Univeristy(Rotterdam, The Netherlands)의 병리과에서 일상적인 용도로 제조된 조직 슬라이드의 뱅크(bank)로부터 얻었다. 냉동된 절편을 일반적인 방법에 따라서 준비(5㎛)하고 아세톤에서 고정시켰다.
일차 항체, 그것들의 개별적인 마커 단백질, 항체의 공급자 및 카탈로그 번호는 표 3에 나타내었다. 표 3에 나타낸 희석제는 인산염 완충 함염수(PBS), 1% 소혈청 알부민으로 제조하였다. 일차 항체로 슬라이드의 인큐베이션은 실온에서 30분 동안 이루어졌고, PBS로 헹구고 이차 항체로 인큐베이션하였다. 이들 이차 항체는 사용된 일차 항체의 천성에 의존하여, 염소 항 토끼(DAKO E0432; 1:50 희석) 또는 염소 항 마우스(DAKO E0433; 1:50 희석) 중 하나이었다. 이차 항체는 비오틴과 연계되었다. PBS로 헹군 후, 슬라이드를 알칼라인 포스페타제(DAKO, K0376)로 연계된 스트렙타비딘-아비딘/비오틴 복합체와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 30분 후, 샘플을 Tris/HCl pH 8.0으로 헹구고 30분동안 암실에서 푹신(puchsin) 기질 크로마겐(DAKO K0624)로 현상(develope)하였다. 이어서, 슬라이드를 흐르는 물(tap water)로 2분동안 헹구고 당업자에게 잘 알려진 일반적인 방법에 따라서 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 그 다음, 슬라이드를 미세하게 검사하고, 마커 단백질 발현에 대하여 점수화하였다(음성 또는 양성). 결과는 표 4로 나타내었다. 모든 PER.C6™세포가 아닌 신경미세섬유 염색(양성)인 경우, 세포 집단의 다른 세포 사이클- 또는 성숙 분열 상의 결과로서 양성으로 염색된다. 이것은 신경미세섬유 염색에 대한 일반적인 관찰이다.
얻어진 데이타로부터 PER.C6™세포는 세포가 비멘틴, 시납토피신, 신경미세섬유, GFAP 및 N-CAM에 양성으로 염색하므로 신경의 기원에 속한다고 결론내어진다.
실시예 2. Eprex 의 것과 비교한 PER . C6 ™- EPO 유래 N- 글리칸의 단당류 조성물.
PER.C6™에 의해 생성된 N-글리칸 구조를 특성화하는 첫번째 단계는 다양한 단당류의 몰비의 측정이다. 단당류 분석은 펄스된(pulsed) 전류탐지를 이용한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD)를 사용하여 수행하였다. DMEM 및/또는 JRH 배지에서 PER.C6™-유래 클론 P7, P8 및 C25(P7 및 P8는 WO 00/63403에서 기재되었고, C25는 선별 마커로서 네오마이신 내성 유전자(플라스미드 pEP02001/Neo)를 사용하는, 이들 방법에 따라서 일반적으로 생성되었다)에 의해 생성된 EPO 샘플은 이 분석을 위해 선별하였다. 시판중인 재조합 CHO-유래 에리트로포이에틴인 Eprex(Jansen Cilag)를 대비하여 분석하였고, 참고로서 사용하였다.
PER.C6™-EPO 샘플을 마우스 모노클로날 항-EPO(IgG1) 항체로 결합된 C4 세파로스 비드(bead)(충전부피 4㎖, Amersham Pharmacia Biotech)로 채워진 칼럼을 사용하는 친화도 크로마토그래피로 정제하였다. 결합된 EPO 분자는 0.1M 글리신-HCl, pH 2.7로 용출하고, 생성된 분획을 나트륨/칼륨 인산염 완충용액 pH 8.0을 첨가하는 것으로 즉시 중성화하였다. 이후로, EPO함유 분획을 풀(pool)화하였고, 버퍼를 Hiprep 26/10 탈염화 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)를 활용하여, 0.1%(v/v) Tween 20을 함유하는 20mM Tris-HCl로 교체하였다.
글리칸 분석을 위해, 정제된 EPO 샘플을 MilliQ-등급 물에 대하여 하룻밤동안 투석하고, Speedvac 증발기로 건조시켰다. 건조된 EPO 샘플(39 내지 105㎍)을 인큐베이션 완충용액(1:1 희석된 C3 프로파일화 완충용액, Glyko)에 용해하였다. 개별적으로 0.1%(w/v) 및 0.3%(v/v)의 최종 농도로 도데실황산나트륨(SDS) 및 베타-메르캅토에탄올을 첨가하여, 샘플을 100℃에서 5분동안 변성시켰다(denature). 그 후에, 노니데트(nonidet) P-40(BDH)를 0.75%(v/v)의 최종농도로 첨가하고, EPO를 N-글리카나제 F(mU, Glyko)를 사용하여, 37℃에서 하룻밤동안 탈당화(deglycosylation)하였다. 탈당화에서, 배출된 N-글리칸을 Packer et al.(1998) 에 따라서, 흑연화 탄소 블랙(Carbograph) SPE 칼럼(Alltech)을 사용하여 단백질, 염, 세척제로부터 분리하였다.
정제된 N-글리칸 사슬을 2M 트리플루오로아세트산(TFA)에서 100℃에 4시간동안 가수분해하였다. 가수분해 후, 단당류를 Speedvac 증발기로 건조하고, 물로 세척하고, 다시 Speedvac에서 증발시켰다. 건조된 단당류를 MilliQ-등급 물 26㎕로 용해하였다. 내부 표준으로 사용되는, 데옥시글루코스 6㎕를 첨가한 후, 샘플(24.5㎕)을 2㎜-직경의 CarboPac PA1 칼럼(Dionex)를 갖는 HPAEC-PAD BioLC 시스템에 적용하였다. 칼럼을 0.25㎖/분의 유속으로 16mM NaOH(Baker)에서 등용매적으로 작동시켰다. 단당류 조성물을 푸코스, 데옥시글루코스, 갈락토스아민, 갈락토스 및 만노스로 이루어진 단당류 표준 혼합물로 얻어진 것과 프로파일을 비교하는 것으로 계산하였다.
상기 단당류 분석은 PER.C6™-EPO의 당화 상태가 Eprex와 현저하게 다르다는 것을 보여준다(표 5). 나타낸 단당류(Man=만노스, Fuc=푸코스, GalNAc=N-아세틸-갈락토스아민, GlcNAc=N-아세틸-글루코사민, Gal=갈락토스)의 비율은 3 Man을 표준적으로 한다. 두플로(duplo) 값은 괄호 사이로 주어졌다. PER.C6™-EPO 샘플은 상당한 양의 GalNAc를 함유하는 반면에, Eprex의 N-연결 당은 이 잔기를 결핍한다. 이것은 PER.C6™-EPO가 소위 LacdiNAc(예를 들어, GalNAcβ1-4GlcNAc) 구조를 함유하는 것을 제안한다. PER.C6™-EPO의 또 다른 특색은 표 5에서 보여진 푸코스 잔기가 상대적으로 농축된다는 것이다. 이것은 PER.C6™-EPO의 N-글리칸에서의 루이스 구조의 존재를 강력하게 나타낸다. 대조적으로, Eprex는 루이스 구조가 없는 것으로 알려져 있다. 결과적으로, Eprex에서 발견되는 푸코스의 양은 N-글리칸 코어 푸코스화에 오로지 기여할 수 있다. 현저하게 단당류 분석에서의 데이타는 또한 배양조건이 PER.C6™에서 EPO의 당화 상태에 영향을 준다는 것을 예증한다. 배양조건이 생성된 단백질에서 존재하는 예비결정된 번역후 변형만을 초래한다고 결론되지는 않아야 한다. 물론 세포주는 트랜스페라제와 같은 어떤 특정 당화 효소의 존재를 통해 이러한 세포에서 생성된 단백질의 번역후 변형을 변형할 수 있어야 할 것이다. 배양조건은 첨가적인 활성을 발휘할 수만 있다. 예를 들어, EPO-생성 클론은 JRH Excell 525 배지에서(현탁액에서) 배양되고, EPO의 N-연결 글리칸은 DMEM에서 배양된(지지하는) 세포로부터 유도된 EPO의 N-연결 당에 비교하여 GlcNAc, GalNAc, Gal 및 Fuc의 더 높은 수준을 함유하는 것으로 발견되었다. 이 효과는 클론 P8의 경우 특히 분명하다. GlcNAc의 상승된 수준은 세포가 JRH 배지에서 배양되는 경우에, N-연결된 당의 분지화가 증가된다는 것 및/또는 N-연결된 당이 락토스아민 반복을 더 함유한다는 것을 제안할 수 있다. N-아세틸 글루코사민화에서 및 (N-아세틸-) 갈락토스화에서의 증가는 교대로 증가된 푸코스-수용체 부위를 발생시키고, 그것으로 인하여 Fuc 함량의 증가에 대한 설명을 제공한다.
실시예 3. PER . C6 ™- EPO 및 Eprex 의 N- 글리칸 사이의 구조적 차이점을 밝히기 위한 질량 분광 분석.
PER.C6™에 의해 생성된 N-글리칸의 구조에서 더욱 상세한 정보를 얻기 위하여, MALDI-MS에 의하여 PER.C6™-EPO의 완전한 당 사슬을 분석하였다. 이 분석을 위하여, 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분획되는, DMEM에서 PER.C6™- 유도 클론 P7 및 P8에 의해 생성된 친화성-정제 EPO 샘플을 활용하였다. 실시예 2에서 기재된 바와 같이 친화성-정제되고, 이어서 완충용액을 PBS로 교환되는, PER.C6™-EPO 샘플을 HiTrap 세파로스 Q HP 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 하였다. 세 개의 EPO 하위분획을 45mM NaCl로 시작하여(분획 1), 75mM NaCl로 이어지고(분획 2), 135mM NaCl로 끝나는(분획 3), 20mM Tris-HCl/20μM CuSO4에서의 단계별 구배를 적용하여 얻었다. 구배의 각 단계는 1㎖/분의 유속으로 10분간 이어졌다. 네 개의 실행 중 분획 1은 풀 A로 풀화하였고, 분획 2는 풀 B로, 분획 3은 풀 C로 풀화하였다. 생성된 풀 A, B 및 C를 이후로 HiPrep 26/10 탈염화 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)을 활용하여 탈염하였다. N-연결된 글리칸은 N-글리카나제 F 처리하여 EPO 풀에서 방출하고, 뉴라미니다제 처리에 통하여 탈시알릴화하였다. Eprex를 참고로서 대조하여 분석하였다. 다양한 EPO 샘플의 대표적인 질량 스펙트럼은 도 1a-g에서 나타내었다:Eprex 및 정제된, 분획된(음이온 교환 크로마토그래피 칼럼으로부터의 풀 A, B 및 C). DMEM에서 배양된 지시된 클론으로부터 유도된 PER.C6™-EPO 샘플을 글리카나제 F 및 뉴라미니다제로 처리하고, 그 후로 MALDI-MS로 분석하였다. 기호(Eprex의 스펙트럼에서 묘사된)에서 검은 사각형은 GlcNAc, 하얀 원은 Man, 검은 원은 Gal, 하얀 삼각형은 Fuc이다. Eprex(도 1a)의 N-연결 당의 질량 프로파일은 이전에 공표된 데이타에 상응하고, 락토스아민을 가지거나 또는 갖지 않은 4-안테나 당이 이 EPO 제조에서 우세하다는 것을 나타낸다. 비록 Eprex 및 PER.C6™-EPO가 유사한 질량을 갖는 당 구조를 함유할지라도(도 1b-g), 후자의 당 구조의 프로파일은 훨씬 더 복합하고, 이들 당이 많은 등급의 이종성을 표시한다는 것을 제안한다. ExPAsy 컴퓨터 프로그램은 관찰된 질량의 기초하에서 당 조성물을 예측하도록 사용된다(표 6 및 표 7). 각각의 풀에서 다른 올리고당류의 상대적인 농축 또한 나타내어진다. 데이타는 PER.C6™-EPO로부터 유도된 대부분의 N-연결 올리고당류가 다중 푸코스 잔기를 함유한다는 것을 예증한다(표 6 및 7, dHex 잔기의 수준을 참조). 특정 글리칸은 4중-푸코실화되었다. 따라서, 이들 데이타는 본 발명의 단당류 분석과 같이 하고, PER.C6™-EPO가 과잉-푸코스화되어 소위 루이스 구조를 갖는 N-글리칸으로 넓게 보유된다는 것을 강하게 제안한다. (시알릴화된) 루이스 x 에피토프(epitope)를 갖는 올리고당류는 염증 및 면역 반응 모두에서 세포-세포 부착을 중재하여 셀렉틴에 대한 핵심적인 인식 서열로서 알려져 있고(Verki et al. 1999), 그리고 뇌 당단백질에서 특징적으로 발견된다(Margolis and Margolis 1989). 그러므로, 이들 루이스 x 구조를 수행하는 많은 당단백질은 항-염증성 및 면역억제성 활성을 발현하는 것으로 치료상의 잠재력을 갖는 것을 나타내고 있다. 질량 신호가 항상 명백하게 특정 당구조에 부여될 수는 없다는 것을 여기서 나타낸다: 예를 들어, GlcNAc 및 GalNAc와 같은 잔기는 동일한 질량을 갖는다. PER.C6™-EPO의 단당류 분석이 N-연결 당에서 GalNAc의 발생을 드러내기 때문에, 피크의 일부는 소위 LacdiNAc(예를 들어, GalNAcβ1-4GlcNAc) 구조를 갖는 N-글리칸을 표현하는 것으로 예상된다. 예를 들어, m/z값 ~2038 및 ~2185를 갖는 피크(표 6 및 표 7)는 대부분 LacdiNAc 모티프(motif)를 갖는 N-글리칸을 표현하는 것이다. 그렇지 않으면, 이들 피크는 4- 안테나 구조를 나타낼 것이고, Gal 또는 GalNAc의 부재에 기인한 GlcNAc에서 종결된다. 이러한 구조가 불완전한 당화에 기인하여 나타날 수 있더라도, 기부의(proximal) Fuc의 존재는 당이 루이스 구조의 형성을 촉매하는 푸코실트랜스페라제(FUT)에 의해 인식되는 모티프를 형성하기에 필요한 Gal 또는 GalNAc 잔기를 함유한다는 것을 의미한다.
다른 당의 상대적인 발생은 특정 피크의 상대적인 높이에서 차이에 의해 판단되는 것처럼 두개의 독립적인 PER.C6™클론으로부터 유도된 EPO 조제물 사이에서 다양하다. 특히, LacdiNAc 모티프를 갖는 추정 2-안테나 당(도 1; 표 6 및 표 7, m/z값 ~2038 및 ~2185를 갖는 신호)는 P8에서 유도된 EPO 샘플에서의 주요 당이지만, P7 샘플에서의 이들 구조는 훨씬 덜 풍부하다. 후자의 클론에서, 완전히 갈락토실화된 4-안테나 글리칸에 추정상 상응하는, m/z값 ~2541을 갖는 피크는 가장 풍부한 구조이었다. 이들 데이타는 본 발명의 단당류 분석에 따른 것이고, DMEM에서 성장된 경우, P8이 P7-EPO로부터 유도된 것들보다 더 낮은 등급의 분지화를 갖는 글리칸을 수행하는 EPO를 생성했다는 것을 이미 나타내었다.
실시예 4. PER . C6 ™- EPO 및 CHO - EPO 의 시알산 함량의 비교.
PER.C6™-EPO의 시알산 함량은 3-10의 선형 pH 구배를 갖는 IPG 스트립스(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하는 등전성 집속(IEF)으로 인하여 차이니스 햄스터 난소 세포로부터 유도된 에리트로포이에틴(CHO-EPO)과 비교하고 분석하였다. 집속 후, EPO 이성질형(isoform)은 수동적으로 니트로셀룰로스상에 블러트(blot)하고, EPO-특이 항체 및 ECL을 사용하여 시각화하였다(도 2). 네 개의 다 른 PER.C6™클론(레인 C, D, E 및 F) 및 EPO를 안정하게 발현하는 세 개의 다른 CHO 클론(레인 G, H 및 I)에 의해 만들어진 EPO는 시알산 함량을 결정하기 위하여 등전성 집속으로 분석되었다. EPO를 생성하는 CHO 및 PER.C6™세포주는 일반적으로 선별 마커로서 네오마이신-내성 유전자를 사용하여 WO 00/63403에 개시된 방법에 따라서 생성되었다. PER.C6™-EPO의 1000eU 및 CHO-EPO의 500eU는 스트립마다 적하(load)되었다. Eprex의 500IU(레인 A) 및 뉴라미니다제-처리된(부분적으로 탈시알릴화된) Eprex(레인 B)는 다양한 EPO 이성질형을 동정화하기 위하여 사용되었다. 집속 후, EPO는 니트로 셀룰로오스 필터(filter) 상에 블러트되고, EPO 및 ECL에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 시각화하였다. 시판중인 EPO를 표현하는, Eprex 샘플은 고도로 시알릴화된 이성질형을 함유하는 정형화(formulation)이고, 마커로서 사용하였다.
결과는 CHO 세포는 분자당 최대 12개이상의 시알산을 함유하는 EPO 이성질형을 만들 수 있고(레인 G-I), 이것은 Morimoto et al.(1996)에 의해서 데이타를 확인할 수 있다. 대조적으로, 8-10개의 시알산을 갖는 일부 이성질형이 PER.C6™에 의해 생성될지라도, 이들은 하위표현되고, 필름의 연장된 노출 후에서만 탐지가능하다(레인 C-F). 결과적으로, PER.C6™-EPO가 CHO-EPO보다 상당히 덜 시알릴화된다고 결론지울 수 있다.
실시예 5. PER . C6 ™세포에서 α1,3-, α1,6- 및 α1,2- 푸코실트랜스페라제 활성.
세포의 당화 잠재력은 크게는 N-및 O-연결 당의 단계별 생합성에서 포함되는 글리코실트랜스페라제의 광범위한 일람(index)에 의해 결정된다. 이들 글리코실트 랜스페라제의 활성은 세포주 사이에서 다양하고, 그러므로, 다른 세포주에서 생성된 당단백질은 다른 글리칸을 획득한다. 여기서 보여주는 데이타의 관점에서, PER.C6™-EPO 글리칸이 중하게 푸코실화되는 것을 예증하면서, N-연결 당의 합성에서 포함된 많은 푸코실트랜스페라제(FUTs)의 활성은 일반적으로 당업자들에게 잘 알려진 방법을 사용하여 분석되었다(Van den Nieuwenhof et al. 2000). 본 연구에서, 본 발명자들은 N-글리칸의 코어 푸코실화에서 포함하는 α1,6-FUT, 말단 갈락토스 잔기의 캡형성(capping)을 중재하고 소위 루이스 y 에피토프를 야기하는 α1,2-FUT 및 루이스 x 구조를 생성하는 α1,3-FUT의 활성을 연구하였다. 비교를 위하여, 본 발명자들은 또한 CHO 세포에서 존재하는, 상응하는 FUT 활성을 분석하였다.
PER.C6™-EPO 및 CHO의 세포-추출물에서 나타낸 FUT의 활성은 글리코실트랜스페라제 활성 평가법으로 측정하였다. 이 평가법은 당류(이 경우, 푸코스) 및 당 기질 사이의 글리코실트랜스페라제-촉매화된 반응을 측정한다. GalT 활성은 또한 내부 대조군으로 측정되었다. 값은 두 실험으로부터의 평균 개수를 나타낸다. 모든 값, 특히 PER.C6™의 것들은 두번째 실험에서 2-3배 더 낮았다. 명백하게, 상기 활성은 (세포 추출물에서 존재하는) 단백질 ㎎에 따라서 발현되었다. PER.C6™세포가 CHO 세포보다 현저하게 더 크기 때문에, CHO 및 PER.C6™세포의 FUT 및 GalT 활성 사이의 차이는 그것들이 나타내는 것보다 더 크거나 또는 더 작을 수 있다. 글리코실트랜스페라제 활성 평가법의 결과는 표 8에서 나타내고, PER.C6™뿐만 아니라 CHO도 두 세포주 모두가 코어-푸코실화된 글리칸 사슬을 생성할 수 있다는 것을 제 안하는, 현저한 α1,6-FUT 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 하지만, α1,3-FUT 활성은 CHO 세포에서 거의 탐지되지 않는 반면에, PER.C6™세포에서만 현저하였다. 두 개의 세포주의 어느것도 α1,2-FUT 활성을 나타내지 않았다. 이와 함께, 이들 데이타는 CHO 및 PER.C6™의 당화 잠재력 사이의 차이를 보여주고, 왜 PER.C6™-EPO가 CHO-생성된 EPO(Eprex)보다 더 푸코스를 함유하는가를 설명한다.
실시예 6. PER . C6 ™- EPO 에 존재하는 루이스 x 에피토프를 갖는 글리칸 .
PER.C6™가 α1,3-, 하지만 α1,2-가 아닌, 푸코실트랜스페라제 활성을 갖기 때문에, PER.C6™가 루이스 y 에피토프 대신에 루이스 x를 함유하는 N-글리칸 사슬을 생성하는 것이 매우 가능성이 있다. 본 발명자들은 웨스턴 블러팅(western blotting)을 사용하여, 루이스 x 구조를 특이적으로 인식하는 마우스 모노클로날 항체(항-루이스 x, 인간 IgM; Calbiochem)로 PER.C6™-EPO를 표지화하여 이것을 확인하였다. (여기서 P7.100으로 나타낸, 클론 P7로부터 유도된) PER.C6™-EPO 및 HCl로 처리되거나(+) 또는 처리되지 않은(-) Eprex의 동등한 양을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 연동시키고, 당업자들에게 잘 알려진 방법을 사용하여 니트로셀룰로스막 상에서 블러트하였다. 모노클로날 항체(항-마우스 IgM, Calbiochem) 및 ECL(Amersham Pharmacia Biotech)를 루이스 x 에피토프를 탐지하기 위하여 사용하였다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, PER.C6™-EPO만이 루이스 x 에피토프에 대한 특이 항체로 표지화할 수 있었다. 분자량 마커의 위치(52, 35 및 25 kDa)가 표시되었다. α1,3-푸코스 연결이 산-불안정하기 때문에, 신호는 HCl로 처리 후 손실되었다.
실시예 7. PER . C6 ™세포의 세포 표면에서 루이스 x 구조 발현.
루이스 x 구조가 일반적으로 PER.C6™세포에서 발생하는가를 알아내기 위하여, 본 발명자들은 CHO 및 정상의(즉, EPO 생성되지 않은) PER.C6™세포의 표면을 루이스 x 특이 항체(Calbiochem)로 표지화하였다. 상기 세포를 일차 항체(0.16㎍/㎖에서 사용된 mAb α루이스 x, 그리고 5㎍/㎖에서 사용된 mAb α시알릭-루이스 x)로 인큐베이션하였다. FITC-연계 항-IgM을 이차 항체로 사용하였다. 표지화된 세포를 FACS로 분석하였다. 점괘선은 이차 항체만으로 인큐베이션된 세포의 신호를 나타낸다(음성 대조군). 도 4에서 나타낸 결과는 PER.C6™세포가 이들 구조를 생성할 수 없는 CHO 세포와 대조적으로 항체로 강하게 표지화되었다. 현저하게, 본 발명자들은 PER.C6™세포가 루이스 x 구조로 염색된 이종 패턴을 나타냈다는 것을 반복적으로 나타냈다. 시알릭 루이스 x 구조에 대한 특이 항체(Calbiochem)로의 표지화는 매우 높은 농도의 항체가 사용되었을 때에 중간정도의 양성 신호를 가졌다.
실시예 8. 저산소증 조건 하에서 배양된 NT2 세포 및 hNT 세포에서 인 비트로에서 PER.C6™- EPO (뇌-형)에 의한 세포자멸사의 억제.
PER.C6™-생성된(뇌-형) EPO 및 혈청-형 EPO은 저산소증 조건하에서 그리고 글루코스 손실을 갖는 세포 죽음으로부터 래트-, 마우스- 및 인간 대뇌 피질성 신경 세포를 보호하기 위하여 그것들의 인 비트로 활성을 비교하였다. 이를 위하여, 신경 세포를 다른 인간들에 의해 기재된 바와 같이 래트 태아로부터 준비하였다(Koretz et al. 1994; Nagayama et al. 1999; White et al. 1996). PER.C6™-생성된 뇌-형 EPO 및 혈청-형 EPO의 영향을 평가하기 위하여, 세포를 최대 37℃에서 최대 48시간까지 물-포피화(water-jacketed) 인큐베이터에서의 모듈식 인큐베이터 챔버에서, 30mM 글루코스를 가진 무혈청 배지 및 가습된 95% 에어/5% CO2(정상산소증)에서 또는 글루코스가 없는 무혈청 배지 및 가습된 95% N2/5% CO2(저산소증 및 글루코스 손실)에서, 정제된 PER.C6™-생성된 뇌-형 EPO 30pM 또는 Eprex 30pM의 존재 또는 부재에서 유지하였다. 세포 배양은 24시간미만의 시간동안 저산소증 및 글루코스 손실에 노출되고, 그후에 24시간의 남은 시간동안 정상산소의 조건으로 회복되었다. 세포 독성은 대사 활성의 기능으로 세포 생존능력을 보고하는, Alamar 블루의 형광으로 분석하였다.
다른 방법에서, 신경 세포 배양은 정제된 PER.C6™-생성된 EPO 또는 Eprex의 다양한 농도의 존재 또는 부재하에서, 정상산소의 조건 하에서 1mM L-글루타메이트 또는 α-아미노-3-히드록시-5-메틸이소옥사졸-4-프로피온산(AMPA)에 24시간동안 노출되었다. 세포독성은 대사 활성의 기능으로서 세포-생존능력을 보고하는, Alamar 블루의 형광에 의해 분석하였다. PER.C6™-EPO로 처리된 세포의 생존능력은 Eprex로 처리된 세포의 생존능력에 유사한 것으로 예상된다.
실시예 9. 혈청-형 EPO 에 비교된 래트에서 적혈구생성을 자극하는 데에서 PER . C6 ™-EPO(뇌-형)의 활성.
적혈구의 생성을 자극하는 재조합 인간 EPO의 잠재력은 Barbone et al.(1994)에 의해 기재되고 있는 설치류 모델에서 관측될 수 있다. 이 모델에 따라서, 망상적혈구 수치에서의 증가는 재조합 인간 EPO 제조법의 생물학적인 활성에 대하여 측정으로 사용된다. 망상적혈구는 적혈구의 전구체이고, EPO에 감응하여, 그들의 생성은 적혈구의 생성을 자극하는 데에서 EPO의 잠재력을 위한 측정으로 사용될 수 있다. 적혈구의 증가된 생성은, 교대로, 더 높은 헤마토크리트 값을 이끈다.
PER.C6™-EPO 및 Eprex의 활성은 세 마리의 Wag/Rij 래트의 6 그룹에서 비교하였다. PER.C6™-EPO(P7-EPO), Eprex 및 음성 대조군으로서 희석용 완충용액의 다양한 투여량을 0, 1 및 2일째에 음경 정맥에서 정맥주사로 주입하였다. PER.C6™-EPO를 시판중인 EPO-특이 R&D Elisa 키트로 결정한 바와 같이 5, 25 또는 125eU(Elisa 유니트)의 투여량으로 투여한 반면에, Eprex는 1 또는 5eU의 투여량으로 투여하였다. 모든 EPO 조제물은 총 용량 500㎕에서의 PBS/0.05% Tween 80에서 적절한 농도로 희석되었다. 3일째에, EDTA 혈액 250㎕을 혀 천자(tongue puncture)로 샘플화하였다. 같은 날에, 총 적혈구에서의 망상적혈구의 퍼센트를 결정하였다.
도 6(막대는 총 적혈구 집단에서 존재하는 망상적혈구의 퍼센트를 나타낸다)에서 나타낸 바와 같이, 총 3일동안의 기간동안, 래트로 Eprex 1eU의 매일 투여는 희석용 완충용액만을 받은 래트에서의 망상적혈구 수치와 비교하여 4일째에 망상적혈구 수치에서의 현저한 증가를 일으켰다. 상기 망상적혈구 수치는 Eprex 투여량을 5배 증가시키는 것으로도 더욱 상승되었다. 상기 망상적혈구 수치는 PER.C6™-EPO의 동등한 양을 사용하여 명확히 덜 증가되었다. 망상적혈구 수치에서의 유사한 증가는 Eprex 1eU 및 PER.C6™-EPO 25eU이 사용되는 경우에 PER.C6™-EPO가 적혈구 생성을 자극하는 데에서 Eprex보다 25배이상 덜 활성이라는 것을 나타내는 것으로 관측되었다. 적혈구 생성을 자극하는 데에서 Eprex 및 PER.C6™-EPO의 잠재력 사이의 차이점은 더 높은 투여량(즉, Eprex 5eU 및 PER.C6™-EPO 125eU)에서도 더욱 나타내었다.
실시예 10. 실험 지망막 하의( subarachnoid ) 출혈에 뒤이은 대뇌피질의 허혈에서 PER.C6™- EPO 의 영향.
PER.C6™-EPO이 혈청-형보다 대뇌피질의 허혈 중에 신경-보호에 더욱 효과적이라는 것을 보이기 위하여, 본 발명자들은 지망막 하의 출혈-유도된 급성 대뇌피질의 허혈의 토끼 모델에서 PER.C6™-생성된 뇌-형 EPO 및 혈청-형의 전신적인 투여의 영향을 비교하였다. 그러므로, 4 그룹으로 나누어진 32마리의 동물을 조사하였다.
그룹 1, 지망막 하의 출혈;
그룹 2, 지망막 하의 출혈 + 위약;
그룹 3, 지망막 하의 출혈 + 재조합 인간 혈청-형 EPO; 및
그룹 4, 지망막 하의 출혈 + 재조합 PER.C6™-생성된 EPO.
실험적인 지망막 하의 출혈이 동물을 마취한 후 대뇌조(cisterna magna)로 자가혈액의 경피 주입으로 생성되었다. 주입 후, 토끼를 복부로 누워있는 자세로 15분동안 위치하게 하여 복부 혈액-덩어리가 형성되도록 하였다. 그룹 2, 3 및 4의 동물은 지망막 하의 출혈을 유도 후 5분에, 희석용 완충용액, Eprex 및 정제된 PER.C6™-생성된 뇌-형 EPO로 개별적으로 주입하고, 그후 8, 16 및 24시간까지 계속하였다. 모든 주입은 복강내로 주입되었다. 희석용 완충용액은 혈청 알부민(2.5 ㎎/㎖), 염화나트륨(5.84㎎/㎖), 무수 시트르산(0.057㎎/㎖, H2O)로 이루어졌다. 상기 동물은 지망막 하의 출혈 후 24시간에 안락사시켰고, 그것들의 뇌는 제거되었다. 그후로, 상기 뇌를 전정(bregma)에서 시작하여 뒤쪽으로 계속하여 소뇌를 포함하도록, 영하의 마이크로톰(microtome)에서 10-25㎛으로 관상으로 절단하였다(Ireland and MacLeod 1993). 허혈-유도된 손상된 뉴런의 수를 평가하고 시각화하기 위하여, 상기 슬라이스를 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 고배율의 미세한 시역(100×) 당 핵농축성 핵을 함유하는 친에오신성 신경 프로파일의 수는 정전 이후의 여러 관상 수준에서 얻어진 측면 피질의 무작위적으로 선별된 절단부분에서 결정하였다. PER.C6™-EPO 처리된 동물은 처리되지 않거나 또는 위약으로 처리된 동물보다 더 낮은 수의 손상된 뉴런을 가질 것으로 기대된다.
실시예 11. 저산소증/재산소화( reoxygenation )에 이은 래트 신생아 심근세포에서 에리트로포이에틴 수용체 발현.
신생아 래트 심근세포의 일차 배양은 이전에 개시된 바(Simpson and Savion 1982)와 같이, 1일생의 Sprague-Dawley 래트의 심실에서 준비되었다. 저산소증은 Gas Pak Plus(BBL)를 사용하여 37℃에서 2시간동안 <1% O2 및 5% CO2/95% N2로 밀폐된 Plexiglas 챔버에서 심근세포를 인큐베이션하는 것으로 만들어졌다. 95% 대기 및 5% CO2로 포화된 배지를 교환하는 것으로, 상기 세포를 정상독성 대기(normotoxic atmosphere)에 노출하였다(재산소화).
심근세포를 얼음-냉각된 PBS로 두번 세척하고, 총 RNA는 Trizol(GIBCO)를 사 용하여 단리하고 클로로포름으로 추출하고 이소프로필 알콜로 침전시켰다. 노던 분석을 위하여, 총 RNA의 15㎍을 1.5% 포름알데히드/MOPS-아가로스 젤에서 분리하고, 니트로셀룰로스에 블러트하고, EPO 수용체에 대한 32P-표지된 탐침(probe)으로 혼성화하였다(±400bp cDNA 단편). 혼성화는 인산염 완충용액 pH 7.2에서 65℃에서 하룻밤동안 일어났고, 이어서 실온에서 2×SSC에서 2번의 세척, 65℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS에서 2번의 세척 및 실온에서 2×SSC에서 2번의 세척을 하였다. 혼성화 신호는 X-레이 필름(Kodak)에 막을 노출하는 것으로 시각화하였다. 발현 수준은 GAPDH mRNA 수준에 대하여 보정하였다.
실시예 12. 저산소증 조건하에서 배양된, 래트 신생아 심근세포에서의 세포자멸사 에서 뇌-형 PER . C6 ™- EPO 및 혈청-형 EPO ( Eprex )의 영향.
신생아 래트 심근세포의 일차 배양은 이전에 개시된 바(Simpson and Savion 1982)와 같이, 1일생의 Sprague-Dawley 래트의 심실에서 준비되었다. 저산소증은 Gas Pak Plus(BBL)를 사용하여 37℃에서 2시간동안 <1% O2 및 5% CO2/95% N2로 밀폐된 Plexiglas 챔버에서 심근세포를 인큐베이션하는 것으로 만들어졌다. 95% 대기 및 5% CO2로 포화된 배지를 교환하는 것으로, 상기 세포는 정상독성 대기에 노출되었다(재산소화). 실험에서 4 그룹으로 나누었다:
A) 정상독성 조건(95% 대기/5% CO2) 하에서 배양된 심근세포;
B) 30pM 정제된 PER.C6™-생성된 EPO의 존재 상태에서 저산소증/재산소화 조건하에서 배양된 심근세포;
C) 30pm 정제된 Eprex의 존재 상태에서 저산소증/재산소화 조건하에서 배양된 심근세포;
D) EPO의 부재 상태에서 저산소증/재산소화 조건하에서 배양된 심근세포;
모든 실험은 세 번씩 중복하여 실행하였다. 세포자멸사는 형태학적인 분석, DNA 래더링(laddering)에 의하여 그리고 말단 데옥시리보뉴클레오티드 트랜스페라제-중재된 dUTP 닉 엔드(nick end) 표지화 (TUNEL)에 의해 정량하였다. 형태학적인 분석을 위해 근육세포 단층을 고정하고 Hoechst 33324로 염색하였다. 세포자멸사의 형태학적인 특징(세포 수축, 염색질 응축 및 무사분열)을 형광 현미경검사법으로 관측하였다. 적어도 접시(dish) 당 12개의 무작위로 선택된 시역으로부터의 400개의 세포를 계수하였다.
(세포자멸사에 대하여 특징적인) DNA 래더링을 결정하기 위하여, 심근세포를 용해 완충용액에서 용해하였고 2% 아가로스 젤에서 전기연동하였다. 상기 젤을 에티듐 브로마이드로 염색하고, DNA 단편을 자외선 빛으로 시각화하였다. 세포자멸사의 심근세포의 원 위치에서 탐지는 원 위치에서 세포 죽음 탐지 키트(Boehringer Mannheim)을 갖는 TUNEL을 사용하는 것으로 수행하였다.
실시예 13. 심근의 허혈/ 재관류의 래트 모델에서의 경색 크기상의 PER . C6 ™- EPO 및 혈청- EPO 의 영향.
성체 수컷 Spraque-Dawley 래트(300 내지 400g)를 펜토바르비탈나트륨(20㎎/㎏ IP) 및 케타민 HCl(60㎎/㎏ IP)으로 마취시켰다. 경부 정맥 및 기관을 삽관하 고, 환기는 발산된 CO2가 3.5% 및 5%를 유지하도록 조정된 설치류 환기장치에 의하여 100% 산소로 유지되었다. 좌측 흉부절개를 수행하고, 봉합이 좌측 관상동맥의 기원으로부터 3 내지 4㎜에 위치되었다. 허혈 5분전에 다양한 농도의 PER.C6™-EPO, 혈청-형 EPO 또는 함염물을 무작위로 동물에 주었다(각 그룹 당 n=6). 허혈(30분)이 관상동맥 주위의 봉합을 단단히 하는 것으로 개시되고, 이어서 4시간동안 재관류하였다. 허위-처치된(sham-operated) 래트를, 봉합을 단단하게 하지 않는 것을 제외하고는, 동일하게 준비하였다(n=6).
재관류 후, 경색 크기를 페이턴트 블루 바이올렛(5%) 및 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 차별적인 염색으로 결정하였다. 관상 결찰을 다시 단단히 하고, 페이턴트 블루 바이올렛의 정맥주사 주입으로 심작의 일반적으로 관류되는 영역을 염색하였다. 그 다음, 심장을 제거하고, 심방, 대혈관 및 우심실을 제거하기 전에 얼음-냉각된 함염물에서 배쓰(bath)하였다. 좌심실을 얇은 절편으로 자르고, 위험부위에서(area at risk, AAR) 비염색된 영역을 일반적으로 관류된 푸른 영역으로부터 분리하고, 1-2㎣ 조각으로 자르고, TTC로 인큐베이션하였다. 해부 현미경(dissecting microscope)를 사용하여, 세포괴사성 영역(AN, 엷은)을 TTC-양성(연와 적색-염색된) 영역으로부터 분리하였다. 그 다음, 심근의 모든 영역을 각각 질량측정하고, 경색 크기를 계산하였다.
실시예 14. 고도의 α1,3-연결된 푸코스 함량을 함유하는 PER . C6 ™- EPO 글리코폼( glycoform )의 단리 및 분획화 .
푸코스-특이 Aleuria aurantia 렉틴(AAL)을 고도의 루이스 x 및/또는 시알릴-루이스 x 함량을 가진 PER.C6™-EPO 글리코폼을 우선적으로 정제하기 위하여 사용하였다. EPO-생성 PER.C6™세포에 의하여 배양 배지로 분비되는 EPO를 인간 EPO에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의하여 세포 잔해 및 다른 오염물질에서 우선 깨끗히 하였다(실시예 2 참조). 그후로, 정제된 EPO 약 270㎍(또는 27,000eU)을 두번째 크로마토그래피 공정에 도입하고, 여기서는 EPO 분자가 0.1㎖/분에서 고정화된 AAL을 함유하는 컬럼(AAL Hitrap 컬럼 1㎖, Bio Med Labs)에 결합하였다. EPO 글리코폼을 실행하는 푸코스를 AAL에 결합하기 위한 경쟁자로서 L-푸코스(Sigma)를 사용하는 것에 의하여 컬럼으로부터 용출하였다. 네 개의 EPO 하위분획을 60μM 푸코스로 시작하여(분획 1), 이어서 200μM 푸코스(분획 2), 이어서 400μM 푸코스(분획 3), 1000μM 푸코스로 종결되는(분획 4), PBS(Gibco, 154mM NaCl, 1.05mM KH2PO4 및 3.0mM Na2HPO4을 함유하고, pH=7.4인)에서 단계별 구배를 적용하여 얻었다. 0.5㎖/분의 유속으로 하여, 구배의 첫번째 단계는 10분간 지속되고 다른 단계들은 5분간 지속되었다. 크로마토그램의 214㎚에서의 UV 신호는 물질이 모든 분획에서 컬럼으로부터 용출되었다는 것을 나타냈다(도 9 참조). 0.5㎖ 부분을 수집하고 둘 또는 셋의 피크 분획을 풀화하였다(도 9 참조).
분획의 완충용액을 10kDa Microcon(Millipore)을 사용하여 20mM 인산염으로 교환하고, 분획을 동일한 Microcon으로 20-30㎕로 농축하였다. N-연결된 글리칸을 글리카나제 F 처리로 EPO 풀에서 구하고 및 뉴라미니다제 처리하여 탈시알릴화하였 다. 다양한 EPO 샘플의 전형적인 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 도 10a에 나타내었다. 각각의 풀에서 다른 올리고당류의 상대적인 농축됨도 나타내었다(표 9 참조). 상기 데이타는 AAL 컬럼으로부터 나중에 용출하는 분획이 상대적으로 더욱 푸코스 잔기를 함유한다는 것을 예증한다. 예를 들어, 컬럼으로부터 나중에 용출하는 분획은 3 또는 4개의 푸코스 잔기를 함유하는, 2507.9 및 2978.1 Dalton에서 피크가 발생하는 글리칸이 농축된 반면에, 1개의 푸코스 잔기만을 갖는, 1891.7 및 2215.8의 질량을 갖는 글리칸은 이들 분획에서 상대적으로 적게 나타낸다. 그러므로, 이들 분획은 소위 루이스 x 구조를 갖는 N-글리칸으로 농축된다. PNGaseF로 방출되고 MALDI-TOF MS로 탐지되는 N-연결된 글리칸에서 루이스 x 구조의 EPO-분자 당 평균 개수는 이 실험에서 분획 1의 경우에는 2.2, 분획 2의 경우에는 2.7, 분획 3의 경우에는 3.6, 분획 4의 경우에는 4.1이었다. EPO 분자 당 2.6개의 루이스 X 구조를 함유하였다. 클론 C25를 사용한 개별적인 실험에서는, 분획 4는 루이스 x 구조가 더욱 농축되고, EPO 분자 당 N-연결된 글리칸에서 5.7개의 루이스 x 구조를 갖는 것을 얻었다. 이 방법은 단백질이 생성되는 세포에 의하여 생기는 루이스 x 구조와 같이, 번역후 변형의 특정한 특징을 이용하는 것으로 배양 배지로부터 에리트로포이에틴을 정제하는 것을 가능하게 한다. 하지만, 이것은 다른 방법이 (예비결정된) 번역후 변형을 갖는 단백질의 적절한 정제를 사용할 수 없다는 것을 의미하지는 않는다.
분획 4에서 용출된 재료는 EPO의 신규한 형상을 나타낸다; ~2185kDa의 질량을 갖는 우세하게 N-연결된 글리칸을 함유하고, 교대로 양쪽 안테나에서 GalNAc-루 이스 x 구조를 갖는 복합 2-안테나 N-연결 당에 상응한다. 분획 4는 분획 1-4에서 용출되고 있는 총 EPO의 약 8%를 함유하였다. 이것은 우세하게 2-안테나 GalNAc-루이스 x 구조를 갖는 EPO의 신규한 형상이 EPO의 낮은 농축된 형상을 나타내고 상기 방법을 사용하여 농축될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 15. 고도의 LacdiNAc 함량을 갖는 PER . C6 ™- EPO 글리코폼의 단리 및 분획화 .
소위 lacdiNAc 올리고당류 구조를 실행하는 PER.C6™-EPO 글리코폼은 특이적으로 이들 lacdiNAc 구조에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 단리하였다. 99-2A5-B, 100-2H5-A, 114-2H12-C, 259-2A1 및 273-3F2와 같이 마우스 모노클로날 항체(Van Romoortere et al. 2000)는 특이적으로 lacdiNAc 구조를 인식하고 정제되고 당업자들에게 잘 알려진 방법에 따라서 CNBr-활성화된 세파로스 4B 비드에 결합된다. 인간 EPO-생성 PER.C6™세포에 의하여 배양 배지로 분비하는 PER.C6™-EPO는 인간 EPO에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의하여 세포 잔해 및 다른 오염물질로부터 우선 대략적으로 분리된다. 그후로, 정제된 EPO를 두번째 크로마토그래피 공정에 도입하고, 여기서는 lacdiNAc 구조를 실행하는 EPO 분자가 고정화된 lacdiNAc-특이 모노클로날 항체를 함유하는 컬럼에 결합되었다. lacdiNAc 구조를 결핍하는 EPO 글리코폼은 컬럼에 결합하지 않고, 흐름을 통해서 수집된다. lacdiNAc 구조를 실행하는 EPO 글리코폼을 lacdiNAc 특이 항체에 결합하기 위한 경쟁자로서 GalNAc 또는 합성 lacdiNAc 올리고당류를 사용하는 것에 의하여 컬럼으로부터 용출하였다. 상대적으로 높은 퍼센트의 lacdiNAc 구조를 실행하는 EPO 글리코폼은 용출 중에 서서히 또는 단계별로 GalNAc 또는 lacdiNAc 농도를 증가시키는 것에 의하여 컬럼으로부터 개별적으로 용출된다. 상대적으로 높은 퍼센트의 lacdiNAc 구조를 갖는 EPO 글리코폼은 상대적으로 낮은 퍼센트의 lacdiNAc 구조를 갖는 EPO 글리코폼보다 더 높은 농도의 GalNAc 또는 lacdiNAc에서 용출된다. 상기 방법에 따라서, 이 방법은 또한 단백질이 생성되는 세포에 의하여 생기는 루이스 x 구조와 같이, 번역후 변형의 특정한 특색을 이용하는 것으로 배양 배지로부터 에리트로포이에틴을 정제하는 것을 가능하게 한다.
실시예 16. 고도의 GalNAc -루이스 x 함량을 갖는 PER . C6 ™- EPO 글리코폼의 단리 또는 분획화 .
소위 GalNAc-루이스 x 올리고당류 구조를 실행하는 PER.C6™-EPO 글리코폼은 특이적으로 이들 GalNAc-루이스 x 구조에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 단리하였다. 114-5B1-A, 176-3A7, 290-2D9-A 및 290-4A8와 같이 마우스 모노클로날 항체(Van Romoortere et al. 2000)는 특이적으로 GalNAc-루이스 x 구조를 인식하고 정제되고 당업자들에게 잘 알려진 방법에 따라서 CNBr-활성화된 세파로스 4B 비드에 결합된다. 인간 EPO-생성 PER.C6™세포에 의하여 배양 배지로 분비하는 PER.C6™-EPO는 인간 EPO에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의하여 세포 잔해 및 다른 오염물질로부터 우선 대략적으로 분리된다. 그 후로, 정제된 EPO를 두번째 크로마토그래피 공정에 도입하고, 여기서는 GalNAc-루이스 x 구조를 실행하는 EPO 분자가 고정화된 GalNAc-루이스 x 특이 모노클로날 항체를 함유하는 컬럼에 결합되었다. GalNAc-루이스 x 구조를 결핍하는 EPO 글리코폼 은 컬럼에 결합하지 않고, 흐름을 통해서 수집된다. lacdiNAc 구조를 실행하는, 결합된 EPO 글리코폼은 GalNAc-루이스 x 특이 항체에 결합하기 위하여 경쟁자로서 합성 GalNAc-루이스 x를 사용하는 것에 의하여 또는 낮은 pH에서 컬럼으로부터 용출하였다. 높은 GalNAc-루이스 x 함량을 실행하는 EPO 글리코폼은 용출 중에 서서히 또는 단계별로 GalNAc 또는 lacdiNAc 농도를 증가시키는 것에 의하여 컬럼으로부터 개별적으로 용출된다. 높은 GalNAc-루이스 x 함량을 갖는 EPO 글리코폼은 낮은 GalNAc-루이스 x 함량을 갖는 EPO 글리코폼보다 더 높은 농도의 GalNAc-루이스 x에서 용출된다. 다시 말하면, 상기 방법에 따라서, 이 방법은 또한 단백질이 생성되는 세포에 의하여 생기는 루이스 x, lacdiNac 또는 GalNac-루이스 x 구조와 같이, 번역후 변형의 특정한 특색을 이용하는 것으로 배양 배지로부터 EPO를 정제하는 것을 가능하게 한다. 하지만, 이것은 (예비결정된) 번역후 변형을 갖는 다른 변형이 단백질의 적절한 정제를 사용할 수 없다는 것을 의미하지는 않는다.
본 발명이 EPO에 관하여 상세한 실시예로 예증하고 있더라도 본 발명이 뇌-형 특징을 갖는 EPO의 생성 및/또는 정제에 한정하지 않는다는 것을 당업자들은 이해할 것이다. 뇌의 장애 및 중추- 및 말초 신경계의 다른 부분 및/또는 다른 허혈/재관류 손상 조직의 치료에서의 용도를 밝힐 수 있는, 다른 다양한 다른(인간) 치료학적인 및/또는 진단성 펩티드 및 단백질은 본 발명의 방법 및 수단에 의해 생성될 수 있다.
실시예 17. 래트에서 중간 대뇌 동맥 폐색 후 경색 크기를 감소하는 데에서 높은 시알산 함량을 갖는 EPO 와 유사한 잠재성을 갖는 낮은 시알산 함량을 갖는 EPO .
실험적으로 중간 대뇌 동맥(MCA)의 폐색에 의하여 유도된, 뇌 경색의 크기에서 PER.C6™-EPO 및 Eprex의 영향은 Siren et al., 2001에 의해 확립된 방법과 유사한 방법을 사용하여, 질량이 200-250g인 F344/Ico 수컷 래트에서 조사하였다. 동물의 우측 경동맥 혈관을 영구적으로 폐색하지만 MCA는 금속 클립을 사용하여 60분동안 가역적으로 폐색하였다. 분자당 <6개의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 정제된 PER.C6™-EPO 또는 분자당 >9개의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 Eprex(Jansen-Cilag; 시판중인 EPO)를 몸무게 ㎏당 5000eU(ELISA 단위)의 투여량에서 MCA 폐색의 개시 5분 전에 정맥주사로 적용하였다. 현저하게, PER.C6™-EPO 조제물의 시알산 함량은 분자당 0-9개의 시알산의 범위인 반면에, Eprex는 분자당 8개이상의 시알산을 함유하였다. 60분의 기간후, 폐색을 MCA 주위의 금속 클립을 제거하는 것을 종결지었다. 클립을 제거한 후 현미경검사로 재관류를 관찰하였다. 24시간 후 살아있는 래트의 뇌를 외관 분산 계수(ADC) 및 T2 맵을 알아내기 위하여 MRI를 사용하여 검사하였다. 이들 맵은 경색 용적을 정량하기 위하여 사용하였다(도 7a 및 7b).
도 7a 및 7b에서의 결과는 PER.C6™-EPO 및 Eprex 조제물로 처리된 래트가 비-처리된 동물에 비교된 경색 크기에서 유사한 감소를 나타냈다는 것을 보여준다. PER.C6™-EPO 조제물이 Eprex 조제물보다 훨씬 낮은 시알산 함량을 가지므로, 이 결과는 높은 시알산 함량이 인 비보에서 EPO의 신경보호적인 활성에 핵심적이지 않다는 것을 예증한다.
실시예 18. 래트에서 EPO 의 반감기의 측정.
인 비보에서 Eprex의 반감기를 측정하기 위하여, 수컷 Wag/Rij 래트에 최종 용적이 500㎕이 되도록 PBS/0.05% Tween-80에서 희석된 150eU Eprex를 정맥 주사로 주입하였다. 기질, EPTA 200㎕을 투여하기 전에, 혈액을 Lab. Animals 34, 372에서 기재된 기술을 사용하여 음성 대조군으로 샘플화하였다. EDTA 200㎕의 주입 후 5, 15, 30, 60, 120, 180 ,240, 300, 360, 420, 480 및 540분에 혈액을 동일한 기술을 사용하여 동물로부터 얻었다. 최종 혈액 샘플화 후, 동물은 희생되었다. 표본을 수집 후 30분안에 실온에서 15분동안 760×g에서 원심분리하였다. 혈장 샘플을 EPO 특이 Elisa(R&D)에서 시험하여 각 샘플에서 EPO의 농도를 측정하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 혈장에서 Eprex의 농도에서의 감소는 분포상 및 정화치상을 나타내는 2-상 곡선을 표시한다. 이들 결과를 기초로 하여, Eprex는 정화치상 중에 약 180분의 반감기를 갖는다고 추정될 수 있다. PER.C6™-EPO의 반감기는 동일한 방법을 사용하여 측정된다.
실시예 19. HT1080 세포에서의 EPO 의 당화에서 E1A 발현의 영향.
HT1080 세포를 아데노바이러스형 5 E1A(pIg.E1A.neo) 또는 E1A＋E1B(pIg.E1A.E1B; 두 플라스미드 모두 미국특허 제 5,994,128호에 기재되었음) 유전자를 암호화하는 발현 벡터로 안정하게 트랜스펙션하여, 당화에서 아데노바이러스형 5 E1A 및/또는 E1A＋E1B 유전자의 발현의 영향을 결정하였다. 마커 단백질의 당화하기 위하여, 상기 세포를 EPO에 대하여 코드하는 발현 벡터(pEPO2001/neo)로 코-트랜스펙션하였다. 대조군 HT1080 세포는 EPO 발현 벡터만으로 트랜스펙션하였다.
트랜스펙션은 세포가 7.85㎠ 접시당 pE1A.neo 또는 pE1A.E1B 1.0㎍ 및 pEPO2001.neo 1.0㎍을 사용하여 70-90% 콘플루엔시에 도달하였을 때에 리포펙타민(Gibco)로 수행하였다. 배지는 DMEM, 1% NEAA(비-필수 아미노산, Invitrogen), Geneticin(Gibco) 250㎍/㎖ 및 10% FBS를 함유하는 선별 배지로 2, 3, 7, 10 및 13일째에 대체되었다. 안정한 E1A-트랜스펙션된 HT1080세포로의 예비 실험은 E1A 발현이 세포의 변경된 형태학을 초래한다는 것을 밝혀냈다. Frisch et al.(1991)에 의해 기재된 관측와 동일하게, 본 발명자들은 E1A 유전자의 안정한 발현이 평평한 형태를 유발한다는 것을 관측하였다. 이 지식으로, 본 발명자들은 평평한(flat) 클론을 고르는 것으로 E1A 발현하는 클론에 대한 대략적인 선별을 가졌다. 클론을 14일째에 골랐고, 37℃/10% CO2에서 선별 배지를 갖는 24-웰 플레이트에서 배양되었다.
EPO 생성 세포는 세포가 하위-콘플루엔시에 도달하였을 때에 배지에서 EPO의 존재를 기초로 하여 선별하였다. EPO는 EPO-특이 ELISA(Quantikine® IVD 인간 EPO -ELISA, R & D systems)를 사용하여 측정하였다. EPO-생성 배양은 E1A 발현을 위해 증가되고 분석되었다. 그러므로, 상기 세포는 10㎖ 당 1 타블렛(tablet) Complete Mini 프로테이나제 억제제(Roche Diagnostics)로 보충된 용해 완충용액(1% NP40, 0.5% 데옥시콜산, 0.5% SDS, 150mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.5)에서 용해되었다. 용해물을 14,000g에서 10분동안 원심분리로 정화하였다. 정화된 세포 용해물의 동일한 양(단백질 함량에 기초한)을 10% BisTris 젤(NuPAGE, Invitrogen)을 통하여 감소하는 조건에서 전기연동하였다. 그 후에, 단백질을 NuPAGE의 Trans-Blot 시스템(Invitrogen)을 사용하여 PDVF 막(P-Immobilon)으로 이동시켰다. 블러트를 TBST에서 5% Protifar(Nutricia)로 실온에서 1시간동안 또는 o/n 동안 차단하고 이어서, 실온에서 1시간동안 또는 4℃에서 o/n 동안, 5% Protifar/TBST에서 1:400 희석된, 모노클로날 마우스-항-인간 E1A IgG2(클론 M73, Santa Cruz)로 인큐베이션하였다. 상기 블러트를 TBST로 세척하고, 실온에서 45분동안, 5% Protifar/TBST에서 1:1000 희석된, 퍼옥시다제-결합 염소 항-마우스 IgG(Biorad)로 인큐베이션하였다. TBST로 세척한 후, 블러트를 ECL 플러스 시스템을 사용하여 염색하였다(Amersham Pharmacia Biotech). EPO 양성 E1A 클론 55% 및 EPO 양성 E1A.E1B 클론 68%은 E1A의 명백한 발현을 나타냈다(표 10). 고수준에서 E1A를 발현한 HT1080/E1A-EPO 및 HT1080/E1A.E1B-EPO 클론은 평평한 형태를 나타냈다(예를 들어, 도 11).
EPO는 글리칸 분석을 위한 HT1080/EPO, HT1080/E1A-EPO 및 HT1080/E1A.E1B-EPO 클론으로 생성하였다. 그러므로, HT1080/E1A.EPO 클론 008, HT1080/E1A.E1B.EPO 클론 072 및 HT1080/EPO 클론 033(표 10)을 계대배양 수(pn) 7에서 175㎠의 플라스크에 살포하였다. 24시간 후, 세포가 60-80% 콘플루엔시로 도달하였을 때에, 선별 배지를 생성 배지로 대체하였다(DMEM, 1% NEAA). 이 배지는 3일 후에 채집하고, 세포는 용해 완충용액으로 용해하였다. EPO는 실시예 2에 따라서 배지로부터 정제하였다.
다양한 EPO 조제물의 N-연결 글리칸을 N-글리카나제 F 처리로 배출하고, 이어서 펄스된 전류탐지를 이용하는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC- PAD;Dionex)로 분석하였다. 이 특정 크로마토그래피 시스템에서, EPO 유도 글리칸 사슬을 그들의 전하를 기초로 하여 알칼리성 조건하에서 분리하였다. 도 12에서 예증한 바와 같이, HT1080/E1A-EPO 세포에 의해 생성된 EPO의 글리칸은 대조군 HT1080/EPO 세포에 의해 생성된 EPO의 것들보다 덜 전하되고, 후자의 세포에 의해 생성된 EPO가 E1A-발현 세포에 의해 생성된 EPO보다 더욱 광범위하게 시알릴화되는 것을 나타낸다. N-글리칸의 구조에서 더욱 자세한 정보는 EPO 조제물의 당 사슬의 MALDI-MS 분석으로 얻어졌다. N-연결 글리칸은 N-글리카나제 F 처리에 의해 EPO 조제물로부터 배출되고 뉴라미니다제 처리로 탈시알릴화되었다. 다양한 전형적인 EPO 조제물의 질량 스펙트럼을 도 13에서 나타내었다. GlycoMod 소프트웨어(www.expacy.ch/tools/glycomod)는 관찰된 질량을 기초로 하여 당 조성물을 예측하는 데 사용되었다(표 11). 데이타는 대조군 HT1080/EPO 세포에 의해 생성된 EPO의 글리칸의 질량 스펙트럼이 HT1080/E1A-EPO 및 HT1080/E1A.E1B-EPO 세포에 의해 생성된 EPO의 것들과 다르다는 것을 보여준다. 질량 스펙트럼은 후자의 세포에 의해 생성된 EPO가 대조군 세포에 의해 생성된 EPO에 비교하여 상대적으로 적은 헥소스 및 상대적으로 많은 데옥시헥소스를 갖는 것을 밝혀냈다. 게다가, 상대적으로 높은 양의 헥소사민 및 데옥시헥소스를 함유하는 상대적으로 낮은 질량을 갖는 글리칸 구조는 HT1080/E1A-EPO 및 HT1080/E1A.E1B-EPO 세포에 의해 생성된 EPO에서 발견되었다. 이들의 일부는 대조군 세포에 의해 생성된 EPO에서는 존재하지 않았다. E1A 및 E1A＋E1B 발현 HT1080 세포에 의해 생성된 EPO의 글리칸의 질량 프로파일은 PER.C6™세포에서 생성된 EPO의 글리칸의 것과 유사하고(실시예 3 참조), 이 것은 이전 세포에 의해 생성된 EPO의 글리칸은 루이스 x 및 LacdiNAc 구조를 함유하고, 말단 갈락토스를 결핍하는 구조를 함유한다는 것을 제안한다. E1A 및 E1A＋E1B 발현 HT1080 세포에 의해 생성된 EPO가 대조군 HT1080 세포에 의해 생성된 EPO보다 더욱 푸코스 및 GalNAc를 함유한다는 것을 확인하기 위하여 단당류 분석을 수행하였다. 그러므로, N-연결 글리칸은 N-글리카나제 F 뉴라미니다제 처리에 의하여 EPO 조제물로부터 배출되었고, 그 후에, 가수분해되고, HPAEC-PAD로 분석되었다. 도 14는 만노스의 양에 대하여 표준적으로 된, EPO 글리칸의 단당류 프로파일을 보여준다. 데이타는 E1A 및 E1A＋E1B 발현 세포에 의해 생성된 EPO의 N-연결 글리칸이 실제로 상대적으로 높은 양의 푸코스 및 GalNAc를 갖는다는 것을 보여준다.
질량 스펙트럼 및 단당류 데이타는 E1A 및 E1A＋E1B 발현 세포에 의해 생성된 EPO가 다중 푸코스 잔기를 함유한다는 것을 강하게 제안한다. 이들 데이타를 지지하기 위하여, EPO 조제물을 알파 1-3 및 알파 1-4 푸코스 잔기를 균열하는 알파-푸코시다제(아몬드 밀)로 처리하였다. 그 후에, 샘플을 Maldi-MS로 분석하고, 결과를 알파-푸코시다제 처리하지 않는 EPO 조제물로부터 얻어진 결과와 비교하였다. 도 15는 알파-푸코시다제 처리후 안테나 푸코스를 갖는 N-글리칸을 나타내는 피크가 감소되고 이들 구조로부터 유도된 피크가 증가했다는 것을 보여준다. 예를 들어, m/z값 ~2038 및 ~2184를 갖는 피크가 감소하는 반면에 ~1982의 피크는 증가했다.
공통적으로, 데이타는 단독으로 또는 E1B와 함께 한 아데노바이러스 E1A의 발현이 세포의 당화 프로파일을 변화시킬 수 있는 것을 보여준다. E1A 단독의 발현 이 이 변화에 충분하다는 관찰은 E1A가 이 변화를 초래한다는 것을 나타낸다. 당화에서의 변화는 루이스 x, LacdiNAc 및 GalNAc-루이스 x 구조의 형성을 포함한다. 많은 E1A 및 E1A＋E1B 발현 HT1080 세포는 특성화되고 있고, 이들 세포의 대부분은 이들 특징적인 글리칸 구조를 갖는 글리칸을 생성한다. 그렇지만, HT1080 모세포에 의해 생성된 글리칸 구조에 비교하여, 이들 구조의 농축은 다양하다(데이타는 나타내지 않음). 글리칸 구조의 농축은 E1A의 발현 수준에 크게 연관되었다. 이것은 당화 프로파일이 E1A에 의해 영향받는 정도는 E1A 유전자가 발현되는 수준에 크게 의존한다.
실시예 20. 높은 투여량에서 PER . C6 ™- EPO 및 CHO - EPO 의 조혈 활성의 비교.
PER.C6™-EPO의 조혈 활성은 래트에서 측정하고 차이니스 햄스터 난소 세포(CHO-EPO)로부터 유도된 EPO와 비교하였다. 두 개의 CHO-EPO 조제물을 선택하였다; (1) 높은 시알산 함량을 갖는 시판중인 재조합 CHO-EPO인, Eprex(Jansen Cilag) 및 (2) CHO 세포에 의하여 EPO를 생성한 다음 실시예 2 및 3, 및 EP 0428267에서 기재된 바와 같은 크로마토그래프 방법에 의해 이들 불충분하게 시알릴화된 이성질형을 정제한, 낮은 (PER.C6™-EPO의 것과 유사한) 시알산 함량을 갖는 CHO-EPO 조제물인, frCHO-EPO(도 16 참조).
상기 연구는 여섯 마리의 WAG/Rij 래트의 4 그룹으로 수행하였다. Eprex, frCHO-EPO, PERC6-EPO 또는 희석용 완충용액(대조군으로서) 질량 ㎏당 5000eU( ELISA 단위, 시판중인 EPO-특이 R&D Elisa Kit에 의해 측정됨)의 단일 투여량은 음경의 정맥에서 정맥주사로 주입되었다. 모든 EPO 조제물은 총 용적 500㎕에서 희석 용 완충용액(PBS, 0.03% Tween80, 0.5% 글리신)에서 적절한 농도로 희석하였다. 3일째에, EDTA 혈액 250㎕을 혀 천자로 샘플화하였다. 동일한 날에, 혈액 샘플은 자동 혈구계를 사용하여 총 적혈구 집단에서 망상적혈구의 퍼센트 및 해마토크리트에 대하여 분석하였다.
헤마토크리트 수준은 측정되고, 혈액을 원심분리하여 얻어진, 압축된 적혈구의 용적 퍼센트로 나타내었다(도 17). 결과는 PER.C6™-EPO 및 frCHO-EPO가 헤마토크리트를 유발하지 않지만 Eprex가 유발한다는 것을 예증한다.
도 18에서 나타낸 바와 같이, EPO는 희석용 완충용액만을 받은 래트와 비교하여 망상적혈구 수치에서 현저한 증가를 유발한다. Eprex 및 frCHO-EPO는 유사한 자극을 나타냈다; 이 자극은 PERC6-EPO 처리된 마우스에서보다 현저하게 높았다(p<0.001). 망상적혈구에서 RNA 함량의 평가는 본 발명자들이 그들의 성숙 정도를 측정하게 하였다. 미숙한 망상적혈구 분획(IRF)는 도 19에서 나타내었다. Eprex-처리된 래트는 대조군 래트에 비교하여 미숙한 적혈구의 현저하게 더 높은 퍼센트를 밝혀냈다. 이것은 Eprex에 의해 자극된 망상적혈구의 형성이 주입 4일 후에도 진행중이라는 것을 나타낸다. 이 영향은 개별적으로, frCHO-EPO 및 PER.C6™-EPO-처리된 래트에서 덜 나타나거나 또는 나타나지 않는다(도 19).
공통적으로, 데이타는 세 가지의 EPO 조제물 모두가 망상적혈구의 형성을 유발한다는 것을 보여준다. 그렇지만, 상기 영향의 기간은 Eprex에 대하여 가장 길고 PER.C6™-EPO에 대하여 가장 짧은 반면에 frCHO-EPO는 중간 정도의 영향을 나타냈다. 이것은 PER.C6™-EPO의 낮은 조혈 영향이 낮은 시알산 함량이 기인할 뿐만 아 니라 다른 글리칸 특징에도 기인한다.
실시예 21. PER . C6 ™- EPO 의 N-연결 글리칸의 상세한 구조 분석.
질량 분광계에 의해 얻어진 질량 신호는 다양한 이성질체성 구조가 존재할 수 있다는 사실에 기인하여, 항상 특정 당 구조에 명백하게 부여할 수는 없다. PER.C6™-EPO의 N-연결 글리칸의 구조에 대한 추가 정보를 얻기 위하여, PER.C6™-EPO의 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제 처리를 사용하였다.
첫째로, 엔도글시코시다제 F2를 사용하였다. 이 효소는 높은 만노스 또는 2-안테나 복합체 형태의 N-연결된 글리칸의 트리만노실 코어의 GlcNAc 잔기 사이를 균열한다. PNGase F와는 대조적으로, 엔도글시코시다제 F2는 3- 또는 4-안테나 글리칸을 균열하지 않으므로 2- 및 3-/4-안테나 글리칸 구조 사이를 구별하도록 사용될 수 있다. 도 21에서, MALDI 스펙트럼은 PNGase F로 또는 엔도프로테이나제 F2 중 하나로 처리된 PER.C6™-EPO를 가지는 것으로 나타낸다. 이들 스펙트럼을 비교할 때에, 엔도글리코시다제 F2에 의해 배출된 글리칸이 PNGase F로 배출된 글리칸보다 더 작은 것을 명심해야 한다. 이것은 GlcNAc 및 푸코스 잔기의 차이이고(349Da), 효소의 다른 균열 부위에 기인한다(도 20 참조).
m/z >2185에서 PNGase F 다이제스트(digest)에서 관찰되는 모든 구조는 이들 글리칸의 어느 것도 엔도글리코시다제 F2 다이제스트에서 관찰되지 않으므로 3- 또는 4-안테나 구조이다. 낮은 질량, 즉 m/z 1485, 1648, 1689, 1835, 1851, 1997, 2038 및 2185에서 대부분의 구조는 엔도글리코시다제 F2에서 상응하는 피크를 갖고, 2-안테나이다. 일부의 이성질체성 3- 또는 4-안테나 구조가 또한 존재하지만, 이것은 도 21에서 양쪽 스펙트럼에서 피크 비율이 크게 비교가능하므로, 많지는 않다. 엔도글리코시다제 F2 다이제스트의 스펙트럼은 PNGase F 스펙트럼에서 m/z 1892 및 2054에 상응하는 피크를 결실한다. 이것은 이들 피크가 2-안테나가 아니라 개별적으로, 하나의 갈락토스 잔기를 갖거나 또는 갖지 않은 4-안테나인 글리칸을 나타낸다는 것을 입증한다. 이들 데이타는 PER.C6™-EPO가 말단 GlcNAc를 갖는 글리칸을 함유한다는 것을 확증한다.
다음, 엑소글리코시다제는 N-글리칸 구조를 추가로 조사하는 데에 사용하였다. 글리칸은 PNGase F에 의해 PER.C6™-EPO으로부터 배출되고 뉴라미니다제를 사용하여 탈시알릴화하였다. 이어서, 샘플을 하기의 엑소글리코시다제의 구별되는 조합으로 처리하였다:
1) 비-감소하는 말단 Galβ1-4GlcNAc를 균열하는, β-갈락토시다제(Galβ1-4GlcNAc 및 더 높은 효소 비율에서의 Galβ1-3 연결).
2) N- 및 O-글리칸으로부터 α1-2,3,4 및 6 연결 푸코스를 균열하는, 소 신장 α-푸코시다제. 이것은 다른 α-푸코스 연결보다 더욱 효율적으로 N-연결 글리칸의 트리만노실 코어에서 α1-6 연결 푸코스를 균열한다.
3) 비-감소하는 말단 α1-3 또는 α1-4 푸코시다제 잔기를 균열하는, 아몬드 밀 α-푸코시다제.
4) 복합 탄수화물로부터 비-감소하는 말단 β1-2,3,4,6-연결 N-아세틸글루코사민을 균열하는, β-N-아세틸글루코사미니다제(GlcNAc-ase). 그것은 N-아세틸갈락토스아민 잔기를 균열하지 않는다.
PER.C6™-EPO 글리칸에서 예상되는 연결-형은 도 22에서 나타낸다. 갈락토시다제 및 푸코시다제 인큐베이션을 동시에 실시하였다, 즉, 푸코시다제 인큐베이션 중에도 활성 갈락토시다제가 존재하였다. 추가 GlcNAc-ase 처리는 갈락토시다제 및 푸코시다제가 그들의 활성을 잃어버린 때에 실행하였다.
도 23에서, 결과는 갈락토시다제 처리에 대하여 나타낸다. 이 도에서, m/z값 및 상대적인 세기는 5% 또는 그 이상의 상대적인 세기(즉, 모든 피크의 요약된 높이로 나누어진 피크의 높이)를 갖는, 스펙트럼에서의 모든 피크에 대하여 주어졌다. 제안된 글리칸 구조는 잘 나타내어진다. 갈락토실화 구조에 부여된 피크는 갈락토시다제 처리 후 이동되었지만, 항상 완전하지는 않다. 그것은 푸코스가 GlcNAc 잔기 주위에 존재하는 경우에 갈락토시다제가 갈락토스를 배출하지 않는다는 것을 밝혀냈다. 일부의 3-안테나 글리칸은 갈락토시다제 처리 후에 나타나는 것으로 보여진다(m/z 1689). 이것은 표준적인 글리칸을 사용하는 갈락토시다제 조제물에서 존재되는 것으로 예증되는, 오염된 GlcNAc-ase에 의해 야기되었다(데이타는 나타내지 않음).
그 다음, 갈락토시다제-처리 글리칸을 푸코시다제 처리하였다(도 24 및 도 26). 소 신장 푸코시다제의 경우에, 이것은 스펙트럼에서 모든 피크의 146Da 이동으로 나타났다. 이것은 푸코스 잔기의 질량이다. 이 푸코시다제는 바람직하게는 α1-6 연결 푸코스 잔기를 균열하므로, 그리고 모든 피크가 하나의 146Da-유니트만을 잃으므로, 이것은 모든 글리칸이 코어 푸코스를 함유한다는 것을 나타낸다.
그 후에 아몬드 밀 푸코시다제와 함께 인큐베이션되는 갈락토시다제-처리 글 리칸 풀은 상대적인 간단한 스펙트럼을 나타냈다(도 25 및 26). 모든 푸코스 잔기는 안테나로부터 제거되고, 간단하게 (코어) 푸코실화 글리칸만을 주었다. 남아있는 말단 갈락토스 잔기는 또한 갈락토시다제가 푸코시다제 인큐베이션중에도 활성이기 때문에 제거되었다. 탈푸코실화 글리칸의 GlcNAc-ase 처리 후, 네 개의 피크만이 남았다. 주요 피크는 m/z 1079에서 관찰되었고, 푸코실화 트리만노실 코어를 나타낸다. m/z 1485 및 m/z 1891에서의 피크는 이 잔기가 GlcNAc-ase에 의하여 제거되지 않으므로, 안테나에서 GalNAc 잔기의 존재를 확인한다. m/z 1444에서의 피크는 락토스아민 반복의 존재를 입증한다: 갈락토스는 갈락토시다제 처리 중에 GlcNAc에 의해 보호되고 있어야 한다.
본 발명은 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성할 수 있는 포유동물 세포를 선별하기 위한 방법 및 포유동물 세포에서 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성하기 위한 방법을 제공하는 효과를 가진다.
참고문헌
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Figure 112006029322569-pat00002
Figure 112006029322569-pat00003
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표 1. 세포를 특성화하는 데에 사용할 수 있는 마커 단백질의 개관.
마커 단백질 설명
판-케라틴 거의 모든 사이토케라틴의 탐지 케라틴화된 및 각막 표피, 내부 기관의 계층화된 비늘모양의 상피, 계층화된 상피, 과증식적인 케라틴사이트, 및 단순한 상피를 표지함
EMA 상피 막 항원 정상 및 신생물의 상피를 표지함.
S100 EF-밴드형 Ca2+ 결합 단백질 신경 조직 및 다른 조직에서 발현됨.
비멘틴 세포골격의 중간의 섬유(= 구조 단백질) 간엽에서 유래되는 세포의 일반적인 마커임. 골격 근육 발전 중에 발현됨
데스민 세포골격의 중간의 섬유(= 구조 단백질) 골격 근육 발전 중에 발현됨
s.m. 액틴 평활근 세포 액틴 평활근 세포 및 근육-상피 세포를 염색함.
시납토피신 신경내분비선 세포와 반응함.
크로모그라닌 내분시선, 신경내분비선 및 신경 조직의 분비 과립안에서 넓게 발현되는 산성 당단백질.
NSE 뉴런 특이 에노라제 신경의 및 신경내분비선의 기원의 세포를 표지함.
신경미세섬유 인산화된 신경미세섬유 단백질과 반응하고 신경 진행 및 말초 신경 뿐만 아니라 교감신경의 신경절 세포 및 부신에 의한 척수를 표지함.
GFAP(폴리콘) 신경교의 원섬유성 산성 단백질 GFAP는 신경병학적인 상해에 고도로 감응하는, 아스트로글리아에서 특이적으로 발견된다. 아스트로글리오시스는 기계적인 외상, AIDS, 치매 및 프라이언 감염의 결과로서 발견되고, GFAP 발현에서의 증가에 수반된다. 중추신경계에서 신경교 기원의 양성 아스트로사이트 및 신생물성 세포를 위치화하기 위한 면역조직화학적인 마커.
CD31 PECAM-1과 반응함. 혈소판, 단세포, 과립구, 림프구, 내피 세포에 존재함.
CD34 O-당화 트랜스막 당단백질을 인식함. 조혈 줄기 세포, 혈관의 EC, 배아 섬유아세포, 태아의 성인 신경 조직에서 일부 세포 발현됨.
N-CAM 뉴런성 세포 접착 분자 N-CAM은 성장 중에 세포-세포 상호작용에 포함된다.
표 2. 표 1에서 나타낸 마커 단백질의 일부에 대하여 사용될 수 있는 양성 대조군 조직.
마커 단백질 대조군 조직
판-케라틴 결장 암
EMA 결장 암
S100 췌장
비멘틴 편도선
데스민 결장
s.m. 액틴 편도선
시납토피신 췌장
크로모그라닌 췌장
NSE 췌장
신경미세섬유 결장
GFAP(폴리콘) 뇌
CD31 췌장
CD34 편도선
N-CAM (CD56) 결장
표 3. PER.C6™세포주를 특성화하는 데에 사용될 수 있는 마커 단백질에 대한 항체의 상세한 설명(공급자 및 카탈로그 번호).
마커 단백질 공급자 항체 카탈로그 번호 항체 희석
판-케라틴 Biogenex 마우스 IgG1 MU071-UC 1:200
EMA Dako 마우스 IgG2a M0613 1:50
S100 Dako 토끼 Z0311 1:3000
비멘틴 Biogenex 마우스 IgG1 MU074-UC 1:3200
데스민 Sanbio 마우스 IgG MON 3001 1:50
s.m. 액틴 Biogenex 마우스 IgG2a MU128-UC 1:150
시납토피신 Dako 마우스 IgG1 MO776 1:50
크로모그라닌 Biogenex 마우스 IgG1 MU126-UC 1:150
NSE Dako 마우스 IgG1 MO873 1:250
신경미세섬유 Sanbio 마우스 IgG MON3004 1:300
GFAP(폴리콘) Dako 마우스 IgG1 MO761 1:200
CD31 Dako 마우스 IgG1 MO823 1:60
CD34 Biogenex 마우스 IgG1 MU236-UC 1:20
N-CAM(CD56) Neomarkers 마우스 IgG1 MS.204.P 1:10
표 4. PER.C6™에서 마커 단백질의 존재의 점수화.
마커 단백질 평가
판-케라틴 음성
EMA 음성
S100 음성
비멘틴 양성
데스민 음성
s.m. 액틴 음성
시납토피신 양성
크로모그라닌 음성
NSE 음성
신경미세섬유 양성
GFAP(폴리콘) 양성
CD31 음성
CD34 음성
N-CAM (CD56) 양성
표 5. PER.C6™-EPO 및 Eprex의 N-연결된 당의 단당류 조성물.
Figure 112006029322569-pat00007
표 6. EPO 생성 PER.C6™클론 P7에 의하여 DMEM에서 생성된 EPO로부터 N-글리카나제 F에 의해 배출된 탈시알화된 N-글리칸의 분자 이온에 대하여 관측된 MS 피크의 지정. Eprex에서 발견되는 질량값(m/z)를 갖는 피크는 밑줄그었고 볼드체로 나타내었다.
Figure 112006029322569-pat00008
표 7. EPO 생성 PER.C6™클론 P8에 의하여 DMEM에서 생성된 EPO로부터 N-글리카나제 F에 의해 배출된 탈시알화된 N-글리칸의 분자 이온에 대하여 관측된 MS 피크의 지정. Eprex에서 발견되는 질량값(m/z)를 갖는 피크는 밑줄그어 볼드체로 나타내었다.
Figure 112006029322569-pat00009
표 8. CHO 및 PER.C6™세포에서 FUT 활성
Figure 112006029322569-pat00010
표 9. 높은 및 낮은 푸코스 함량을 위해 선택하기 위하여 AAL 컬럼에서 분획화된 EPO로부터 N-글리카나제 F에 의해 배출된 탈시알화된 N-글리칸의 분자 이온에 대하여 관측된 MS 피크의 지정.
Figure 112006029322569-pat00011
표 10. EPO 생성 E1A.EPO 및 E1A.E1B.EPO HT1080 클론의 개별적인 E1A 발현 및 형태학적인 구조. E1A 발현의 양은 웨스턴 블러트 분석에 의해 사정된다. * 표시된 클론은 EPO 생성 평가를 위해 선별되었다.
Figure 112006029322569-pat00012
표 11. HT1080/EPO 클론 033, HT1080/E1A-EPO 클론 008, 및 HT1080/E1A.E1B-EPO 클론 072로부터 얻어진 EPO의 N-연결 당의 질량 프로파일의 개별적인 존재. ExPAsy 컴퓨터 프로그램은 당 조성물을 예측하는 데에 사용되었다. 글리칸 및 제안된 구조의 안테나에서 존재하는 헥소사민, 헥소스 및 데옥시헥소스는 표에서 나타내었다.
Figure 112006029322569-pat00013

Claims (15)

  1. 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성할 수 있는 포유동물 세포를 선별하기 위한 방법으로, 상기 방법은:
    a) 상기 포유동물 세포에서 또는 상기 포유동물 세포의 세포 표면 상에서 조직 특이 마커 또는 조직 특이 마커의 조합의 존재 유무를 분석하는 단계, 여기서 마커 또는 상기 마커의 조합은 상기 예비결정된 번역후 변형이 상기 단백질성 분자에 존재함을 나타내는 것이고; 그리고
    b) 상기 조직 특이 마커의 존재 유무를 기초로 하여 상기 포유동물 세포를 선별하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 예비결정된 번역후 변형이 당화를 포함하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 당화는 루이스(Lewis) x, 시알릴 루이스 x, GalNac 구조, GlcNac 구조, LacdiNAc 구조, N-아세틸-글루코사민에 부착된 α1,3-연결 푸코스, 말단 N-아세틸-글루코사민, 말단 갈락토스, 바이섹트(bisecting) N-아세틸-글루코사민, 설페이트기 및 시알산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 당화는 루이스 x 또는 시알릴 루이스 x 구조를 포함 하는 방법.
  5. 이종 세포 집단(population)에서 포유동물 세포를 얻기 위한 방법으로, 상기 포유동물 세포는 루이스 x 또는 시알릴 루이스 x 구조를 포함하는 단백질성 분자를 생성할 수 있고, 상기 방법은:
    a) 상기 이종 세포 집단에서 상기 세포에 의해 생산된 단백질의 루이스 x 또는 시알릴 루이스 x 구조에 기초하여 세포들을 분류하는 단계; 및
    b) 상기 루이스 x 또는 시알릴 루이스 x 구조를 포함하는 단백질을 생산할 수 있는 세포를 선별하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 신경계 기원인 방법.
  7. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 세포인 방법.
  8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 발현가능한 형태로 핵산을 보유하는(harbor) 방식으로, 상기 포유동물 세포에 인간 아데노바이러스로부터 E1 영역을 암호화하는 핵산 또는 그것의 일부를 제공하는 방법.
  9. 포유동물 세포에서 예비결정된 번역후 변형을 포함하는 단백질성 분자를 생성하기 위한 방법으로, 상기 방법은 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 상기 포유동물 세포를 동정하거나, 선별하거나, 또는 얻는 단계, 및 상기 포유동물 세포에서 상기 단백질성 분자를 발현하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 Center for Applied Microbiology and Research의 European Collection of Animal Cell Cultures에 제 96022940호로 기탁된 세포로부터 유래되는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 포유동물 세포 배양으로부터 상기 단백질성 분자를 정제하는 추가 단계를 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 정제는 상기 예비 결정된 번역후 변형을 이용하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 정제는 상기 예비결정된 번역후 변형에 존재하는 에피토프에 특이적인 항체가 이용되는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 정제는 렉틴-결합 단계를 포함하는 방법.
  15. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질성 분자는 에리트로포이에틴인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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TWI604850B (zh) * 2009-10-05 2017-11-11 菲瑞茵國際中心股份有限公司 藥學製劑
CN102818896B (zh) * 2011-06-09 2014-12-17 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种基于特异抗体的硝基化修饰位点的检测方法及特异识别scot硝基化位点的抗体
EP3382014A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-03 CEVEC Pharmaceuticals GmbH Recombinant glycoproteins with reduced antennary fucosylation
EP4219537A1 (en) * 2020-09-22 2023-08-02 Jecho Laboratories, Inc. Glycosylation-modified erythopoietin and use thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5789247A (en) 1994-04-01 1998-08-04 Ballay; Annick Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector
EP1012319B1 (en) * 1997-03-27 2005-03-02 The University Of British Columbia Insect expression vectors
EP1533380B1 (en) * 1999-04-15 2009-11-04 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell comprising at least one E1 protein of adenovirus

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