CZ497290A3

CZ497290A3 - Isoformy erythropoietinu

Info

Publication number: CZ497290A3
Application number: CZ19904972A
Authority: CZ
Inventors: Thomas Wayne Strickland; Thomas Edward Byrne; Steven George Elliott
Original assignee: Kirin-Amgen, Inc.
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-12
Publication date: 2000-08-16
Also published as: AU646822B2; ES2139764T3; CN1063796C; CZ291515B6; GR3032089T3; DE69033301D1; IL95971A0; PT95586A; NO912281D0; NZ235676A; JPH04502331A; CN1051936A; CZ291488B6; EP0668351A1; IL125175A; EP0428267A3; SK497290A3; JP3073905B2; JP2983629B2; ZA908166B

Description

isoformy erythropoietinu

Oblost techniky

nebo jejich směsí, farmaceutických přípravků, která tyto formy nebo jejich směsi obsahují a způsobu léčení za použití takových isoforem a přípravků.

Dosavadηí. stav _techni kv

Ery thr op o i eti n je gly'-©proteinový hormon zjištěný při zrání erythrcidních progenitorových buněk na erythrocyty.mé podstatný význam při regulaci hladin červených krvinek v oběhu. Přirozeně se vyskytující erythropoietin je produkován játry bohem fetálního života a ledvinami u dospělých s cirkuluje v ki i a stimuluje produkci červených krvinek v kostní dřeni. Anenie je téměř vždy důsledek renéiního poškození, působícího snížení produkce erythropoietinu v ledvinách. 0 rekom; innntziím erethropoietinu, produkovaném technikami renovoho inženýrství, zahrnujícími expresi proteinového produktu hostitelskými buňkami transformovanými genem kódujícím erythropoietin bylo zjištěno, že je účinný jestliže se použije· při léčení anemie vzniklé z chronického renálního poškození.

^'osud byla dostupnost erythropoi eti nu velmi omezena.

když je protein přítomen v lidské moči, vylučované množství jsou příliš nízké p:

aktický zdroj ery thropoietinu pro terapeutické využití. Pacienti postižení aplastickou nnomií vykazují zvýšení hladiny urinárního erythropoietinu vo srovnání se zdravými individui ale omezené množství takové coče rovněž činí tento zdroj nepraktickým, ťurifikace lidského urinárního erythropcietinu podle iíiyakeho a spol, J.Biol.dhern., 252, 5558 (1977), používá jako výchozí materiál moč od osob ε aplsstickou aneciií.

Identifikace, klonování a exprese genů, kódujících erythropoietin je popsána v US patentu 6. 4703008 Linnem. Popis purifikace rekombinantního er.ythropoietinu z buněčného media, podporujícího růst savcích buněk, obsahujících rekombinantní erythropoietinové plasmidy je např. zahrnuta v US patentu č. 4667016 aie a spol.. Exprese a získání biologicky aktivního rekombinantního er.ythropoietinu ze savčích hostitelských buněk, obsahujících erythropoietinový gen v rekombinantr.ím plasmidu, poskytuje v první řadě dostatečné množství ervthronoietinu vhodného pro terapeuDále znalost genové sekvence a dostupnost purifikov-,róbo proteinu umožňuje lepší tické aplikace, votších množství pochopení působení tohoto proteinu.

-biologická aktivita proteinu je závislá na jeho struktuře. ^ejménn primární struktura proteinu (tj. jeho aminokys·linová sekvence) poskvtuje informaci, která umožňuje formaci sekundární (např. ρζ -helix nebo Q -list) a terciární (trojrozměrné přehyby) struktury polypeptidu během a po jeho syntéze. Přerušení vlastních sekundárních a terciárních struktur zavedením mutací n^bo chemickým nebo enzymatickým zpracováním, může vést ke snížení biologické aktivity.

V prskanýctních organismech jsou biologické aktivity proteinů z velké části ovládány výše uvedenými strukturami.

Na rozdíl od proteinů z prokaryotních buněk je mnoho buněčných povrchů a sekrstávaných proteinů produkovaných v eukaryot nich buňkách modifikováno jednou nebo více oligosacharidovými

3skupinarai. Tato modifikace označovaná jako glykosylace nůže výrazně ovlivhit také být důležité pro celulérr.í lokalizaci.

fyzikální vlastnosti proteinů a může stabilitu proteinu, sekreci a subVlastní ř- lýko sy láce nůže mít základní význam pro biologickou aktivitu, ^řkteré geny z eukaryotnich organismů, když jsou exprimovány v bakteriích (např. E.ccli), které postrádají celulórní procesy pro glykosylaci proteinů, poskytují proteiny, která mají malou nebo žádnou aktivitu díky nedostatku glykosylace.

Glykosylace se uskutečňuje při specifických sístech podál polypeptidováho hlavního řetězce a je obvykle dvou typů: O-vézané oligosacharidy jsou spojené se serinovými ne bo ikreor.inovými zbytky, zatímco H-vázuné oligosachnridy jsou připojeny k aspa částí sekvence *sn-Xnckyselina s výjimkou zených oligosacharidů ayincvýa zbytkům, jestliže jsou tyto er/Thr, kde X může být jakákoliv atr.iprolinu. Struktury 1-vázaných a O-váa cuki-cvých zbytků nelezené v Každém typu, jscu rozdílné. Jeden typ cukru je obvykle nalezen na obou, je jí re N-acetylneuraminové kyselina (dále nazývaná jako siolové kyselina), klanová kyselina jo obvykle terminálni zbytek obou f'-vázaných ? O-vázaných oligosacharidů a díky svému negativnímu náboji uděluje glykoproteinu kyselý charakter.

ní ani

Jok lidský z m-če získaný erythrepoietin i rekombinant ervthropoietin (oxprimovnný v savčích buňkách), sající nokyselinoveu sekvenci 1 - 165 lidského erythropoietinu, obsahují tři N-vázsná a tězec, kde tyto řetězce hmotnosti g1ykoprotninu asparaginových zbytcích jeden O-vázaný oligosacharidový retvoří os i 40 ceikovéh molekulové K-Váz má glykosylace probíhá na umístěných v pc.ohách 24, 3S a

83, zatímco 0-vázanó rlykosylace probíhá na serinovém zbyt ku ucístánéu' v poloze 126 (Lai a spol., J.Diol.Chem. 261,

-43116 (1986); Broudy a spol. Arch.Biochem.Biophys. 265,

3?9 (1988). Oligosacharidové řetězce nohou byt modifikovány terminálními zbytky sialové kyseliny, -nzymatické zpracování glykosylovaného orythropoietinu pro odstranění zbytků sialové kyseliny vede ko ztrát? in vivo aktivity, ale nepůsobí ztrátu aktivity in vitro (Lowy a spol., ature 185, 102 (1963) 4202 (1974)). loto

Goldwasser ? spol., J.Biol.Oheň. ?49, chování nůž? být využito při rychlém odstranénífasialoerythropoietinu z ob^yhu po interakci s heoatickýiE proteinem, který váže asialoglykoprotein (Morrell a spol. J.Biol.Chea. 243, 155 (1968); Briggs a spol. An.

J.Pbisiol. °?7, 1385 (1974); Ashi eli a spol., ílethods hnzyoiol. 50, 867 (1978)). Rrythrop^řetin tak vykazuje in vivo biologickou účinnost pouze když je sialylován a je tek zabráněno jeho vazbo hepatickýn vázacím proteinem.

ů.ol·?. defi novéno iných slož dcstatečně.

k v oligosechsridrvých řetězcích není Rylo zjičt*-no, že neglykosylovaný erythr^p néní s o oietin 'á velmi sníženou in vivo lykosy1ovanou formou, ale udržuje aktivitu ve srovsi aktivitu in vitro (Dordal o spol. patent v,vše). V další

Rndocrinoiogy 116, 2293 (1985); Línův studii nicméně- odstranění K-vázaných nebo O-vázených oligosachoridových řetězců jednotlivě nebo společně mutagenesí asporaginových nebo serinových zbytků, které jsou glykosylačními místy, výrazně snižuje in vitro aktivitu přeměněného er thropoietinu, který je produkován v savčích buňkách (Dube ilol.Che:

^63, 17516 (1988)).

Glykoproteiny jako je ervth opoietin nohou být separovány na různě nabité formy za použití technik jako je isoelektrické fokusace (IBF). Jsou uváděny IKK studie surov íh-φ částečně purif i kovaných er.ythropoi etinových přípravků (Lukowsky a spol., J.Biochen 50, 939 (1>72); Shelton a spol, Biochec. Led. 18, 45 (1975); Fuhr a spol. Biochen. Biophys, ^Aos.Comc. 93, 930 (1981)). Nanejvýš tři nebo čt^ři frakce mající erythropoietir.ovou aktiv! tu byly rozlišeny Π-F v těchto studiích a 2áIra nebyla charakterizování ohledem na obsah cukrů. bále ne bvl· .itanoven žá lnů vztah mezi iso· eloktri.ckvmi bcd.y frakcí a jejich biologickou aktivitou.

V průběhu puriflka.ee urinárního eryťnropcietinu z lidské moce, popisovaná v práci ííiyakeho a spol. supra, byly zjištěny dvě erythropoietinové frakce z chromatogrnfie no hydroxylapatitu označeno jako II a IIIA, mající stejn.u specifickou aktivitu. Následují..í analýzu cukrů frakce II a IIIA prokázala, že frakce II ná větší průměrný obsah siaiová kyseliny než frakce IIIA (ž-crdel a spol. suora).

předloženého vynálezu je poskytnout separované •a rs+ ί incvsnj čtiví. tu. larmaceu

3C7 o t; nu, obsah dolových kyselin a biologickou tické přípravky, obsahující takové molekuly by mokly být terapeuticky prospěšné.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká er.ythropoi eti nových isoforem. ‘aké poskytuje způsob přípravy erythropíctinévé isoforo.y, obsahující stupněoodrobe.ní čištěného er.ythropoi etinu preparativní isoelektrické fokušaci a eluce jednotlivých iso forem z £ⁿiu. Jsou toká poskytovány farmaceutické přípravky, •-•bsahující ertyhropietinové isoformy. Předmět vynálezu se také týká způsobů zvýšení h.adiny hematokritů u savců, zahrnujících podání terapeuticky přijatelného množství těchto přípravků prc zvýšení produkce retikulocytů a červených krvinek.

Předložený vynález se týká způsobu přípravy směsi — θ' erythropoietinových molekul, majících více než nebo alternativně méně nez preieterminovaný počet sialových kyselin na molekulu, který zahrnuje zpracování materiálu, obsahujícího erythropoietin iontov/nknnou chromatografií. rředmětea vynálezu je také způsob přípravy směsi erythropoietino vích molekul, majících polet sialových kyselin nc molekulu větší nebo alternativně menší než je předeterminovnný počet, zahrnující zpracování materiálu obsabujícího erythrop-^i etin chromatof skusací.

V VZVÍLr Z t, O S A mající vátší počet, n íck.

/Asn než cá lidsk·

... cr .-, ..-

mu je sinal ony lidského	e r y thr op i. e t inu,
st pro při pojení korboh	ydrátového
erythropoietin, jako j	e /íVsn^^/lPO,
/Thr¹ ΆίΡΟ, a /fro¹^	Thr¹²⁵/TPO.

^£opÍ3 připojených obrázků:

Obr.l přeistovuje analytický isoelektriekofokusaSn S®1 s dělení rekombinantních erythropoietincvých^oforem. dělové dráhy 1-11 představují isoforsy rozmezí od méně kyselých (vyšší pl) ve dráze I kyselejším (nižší pí) ve dráze 11. čištěný rekoihantní erythropoietin obsahující směs isoforem j-'také uveden v poslední levé a pravé dráze gelu.

Obr.2 představuje vzt--.h mezi počtem sinlových J^lin na erythropoietinovcu i sofo mu a specif icko^tivi tu in vivo každé isoforsy, vyjádřenou jako --° o tky na mg erythropoietinevého polypeptidů. *’a ? 2A, byla k centsrce každí erythrc pcieti nové isodV stanovena r>r.-jdfordevru proteinovou zkouákou, °br. 28, byla koncentrace stanovena absorbsneí ' na obr.2C, byla konce; trnee stanovena poir^JlJ-^·

Obr.3 představuje analytický i soelektrofokusační gel dsfirov .ných směsí rekombinantních erythropoietinových isofcrem připravených aniontovýnSnnou chromatografií za r°zných polnínok. Gelové dráhy i-6 představují ervthropoietinové isoformy eluované při vysocesolném promývání po pr omývání Q-íepharosové kolony 150 aí! ky selirou octovou, př 4,7, 150 nd kyselinou octovou (nepufrováná), 200 mM kyselinou octovou, pí I 4,7,

250 mu kyselinou o.tovcu, ph 4,7, 300 nu kyselinou octovou , p^rt 4,7 nebo 300 itid kyselinou octovou (nepufrovanou). Čištěný rekombinantní erytbropoictin, obsahující směs isofnrem získaný za použití postupů popsaných v příkladu 7 práce -uaic a soc_. supra, ε -ím rozdílem, že DEAI—aoarozová ch:onatografie je nahrazena chromáterrnfií na C-vepharose, je znázorní' ve dráze zcc H vlevo no gelu.

Obr.4 představuje seporaoi erythropoiotinových isoforem 8 ;ískanýcb zpracování.; sedí a buněk na sloupci QSrpharosy li onto;

i ontov ύ si«>sajic-Lho prí a zvasujici se ly. -odíly z frakcí označených 2 ac 40 byly podrobeny analytické isoeloktrické fokusaci. čištěný rrkombinantní cx\ythropoietin obsahující směs isofopoužití postupu popsaných v přírBisřsnvcn z kladu 0 práce Laie a spol.supra, s tím rozdílem, že DEAO—agaros;vá chromá>tografie bylo nahrazena chromatoyrntií na t-íopharose, je uveden v poslední levé dráze tohoto g lu.

představuje aminekuseiinovou poietinu. Čtverečky označují kterým jsou připojeny/threoni sekvenci lidského erythro asparaminové zbytky, ke novo a serinové zbytky karboby írátov řetozce a hvězdičky označují

-εmodifikované karboh.ydrátem. Další glykosylnční místa poskytnutá v analozích z příkladu 6 jsou indikována □utaceci usparaginu, šeřinu a threoninu.

Obr. óA, 65 a 63 představují serie stupňů klonování při generování plasmidú pro konstrukci a analýzu analogů lidského erythropoietinu. Tyto analogy sají aminokyseliny změněné jak je uvedeno na obr. 5, které poskytují další glykosylační místa.

)br.7 představuje analýzy Western blot COS buněčných supernatantů sekvencí lidského erythropoieLinu a indikon váných erythropoietinových analogů. Analogy /Asn , ser

27 /Ε1Ό, /Asn°^/J;.ťO, /Asn¹”Λ Ser''''/SPO a /Pro

124 'Ί.

Thr' ^<'^J/EPS jsou konstruovány jak je popsáno v příSu.sdu b. Analos

Thr¹ y.oK;, /Asn'

Ser¹²⁶/

SPO a /Thr i 25 ”! >7

Ser'A

0, která neobsahují další irbehydrátoví řetězce jsou zde uvedeny pro srovnání.

Obr.S představuje Sestern blot analýzu COS buněčných supernatantů sekvencí lidského erythropoietinu a indikovaných erythrepoieti nových analogů po zpracování s N-gly\ '-.r- 4 < Ί Λ 4 n f ¹²⁴ Thr^12í?/řT0 kanasou. Analogy /Thr /KPO a /Pro js-u konstruovány jak je popsáno v příkladu 6. Analogy /V..1^{1 ?6}/FP0, /Pro^{1 4}/SlC, /Pro^12Í>/EPO, /Thr¹²⁷/ Ir or, /Pro ^r ' a /Thr

125

27

Ser /PPO jscu uvedeny pro srovnání.

Obr.S představuje isoí^ketroíl:kusaění gel. poolů 2,3 a 4 získaných, chromatografií na C-lepharose a C4 reverzní fázi zpracováním buněčného media, které podporuje inst CHO buněk transferovaných erythropoietinovou cDNA, 12 5 obsahující /Thr /mutaci. Čištěný rekombinantní eryth-3ropoietin, obsahující směs isoforeci je získán za použití postupů, popsaných v příkladu 8 práce Laie a spol., supra, s tím rozdílem, že DKAE-agarosové chromátografie jo nahrazena chromatografií na Q-Sepharose, tyto •rvxhropoi etiny jsou uvedeny v levých a pravých druhách gelu.

xodle předloženého vynálezu jsou poskytovány isoforn.y exytfcropoie linu. j-solelektri cká fukusace (UF) dělí pr-te^ny na základě náboje. Při umístění do gradientu pH a péscbením elektrického pole budou proteiny mirrovnt k bolu, ve kterém nenají náboj sítě a zůstávají na tomto míst' lote je is .el< ktri cký bod (pí) proteinu. Každý je notlivý pruh pí a : z oro var;.¹ .olekui.y rojící určitý tím Leky obecně i stejný náboj a jsou nazvány jako isofermy. mužitý výraz ervthir-poieLirové i se.farma označuje e r tyh.rrpoie t i nov é přxpr--:vky , rojící je<iná pí a mající stejné ami nokysa,.^: noví sekvence.

»e v>ncjr.2s prove mm jc eryurcpoictm procuict exprese exogcnaí ulA sekvence, která byla transfektována so jiných cukary-.-'tních hostitelských buněk než lidských, to jest, ve výhodném provedení je or.ythmpoietin ''rekombinantní erythropoietin. h-ekombinantní erythrcpcietin je výhodně produkován p stupen pop'

Linea, Uř patent č. 4703008, uvedeným z is íplncst. úokembinantní crythropoietin je výhodně či Stěn podle obecných oostupů pops/iných v příkladu v US z d e u v e 1 en ,i ak o v přikladu 2, kde putentu č. 1657016 laie a spol., kt^rý je oik-iz nebo alternativně postupem popsaným ch ro.uatograf i e aa ukal a^arose je nahrazena chrosatogrt.fií na C-^epharose. V modifikaci se sloupcem ú—-ephaxOsa se 55 mm NaCl nahradí 25 mk haCl v pufrovnnér. roztoku pro uvedení kolcnv no neutrální pH a 140 uh·.' 9 <

se nohrodí mM NaCl v pufr ováném roztoku pro elucí rrythropoirLinu z koleny. Tento materiál při analýze elektroforezou na polvakrylami-1 0dov_::n ge iu s dodecylsulfátem sodným, migruje jako jediný druh (tj. pruh). Jestliže se čištěný erythrcpoiotin podrobí iEF, jsou v gelu zřejmé násobné pruhy, které indikují, jsou pří temny různě nabité formy gl.ykoprotei nu.

zo o nalezeno, že jednotlivé isoformy rekonbinsntního erythr poi eti nu, mající aminokyselinovou sekvenci z moče získaného lidského erythropoietinu odpovídají erythropoietónovým molekulám, majícím od 1 do 14 sialových kyselin a každá iscforma přítomná v čištěném rekombinantnim erythropoietinu sé in vivo aktivitu, která má vztah k počtu sialových kyselin isoformy. Výraz ‘'erythropoietin·', jak je zde použit, zahrnuje přirozeně získaný erythropoietin, z moče získaný lidský erythropoietin jeko_ž i nepřirozeně se vyskytující polypeptidy, mající aminokyselinovou sekvenci a glykosylaci dostatečně duplikativní s přirozeně se vyskytujícím er.ythropoietinem pro získání in vivo biologických vlastností takových., že buňky kostní dřeně zvyšují produkci retikulceytů a S rvených krvinek.

Surové přípravky erythropoietinu mají mnoho isoforem, ale materiál čištěný například laien a spol. supra příklad 2, obsahuje převážně šest isoforem při analýze IFF. Dále byla dctegována nejméně jedna další isoforma vyšší kyselosti při použití chromatografických postupů popsaných v příkladu 4. (Tato více kyselé forma, migrující při >14 sikových kyselinách na IEF gelu může obsahovat negativní náboje nesia^ově kyseliny jak je zřejmé z odolnosti vůči štěpení sialidasou). ^Ayto isoformy se od sebe lisí obsahem siaiové kyseliny. ^unk je uvedeno v příkladech, je toto doloženo izolací li takových isoforem při preparativní 1EF a stanovením obsahu si.;i_ové kyseliny u pěti z nich. 2 isoforem zkoušených ns obsah sialcvé kyseliny bylo zjištěno, že pět isoforem obsahuje buď >,10, 11, 1? nebo 13 zbytků siaiové kyseliny.

Existuje vztah mezi relativní in vivo specifickou aktivitou er.y thr opci etinu o počtem zbytků sialové kyseliny na molekulu erythropoietinu cd. isoformy 5 io 11 (každá isoforma je zd označena počtem sialových kyselin na molekulu erythropoietinu). isoformy 11 až i 4 sejí přibližně stejnou in vivo specifickou aktivitu, Isofermy 5-14 byly studovány pokud jde o jejich in vivo e tivitu exhypoxickou polycyth.emickou biozkoužkou na cr/íích. a množství každá přítomné isofor.ry je stanoveno -ralfordovcu proteinovou zkouškou, absorbance při ⁹£0 nn nebo radioÍEunoztoučkou (ΠΙΑ) erythrepi etinu. ΠΙΑ stanovení (l.yrie a spol. Iirrtunohi o logy 172, 213 (196 ó)), vyjálřr-né jakc jodnctky/nl jsou rozděleny m«zi ?17,77v jednotko a; 1/iiig erythrepcietinového polypeptilu, primárné specifické ?.ktiv'ty ti íišr.éhc erythropciepon.ocí kikt udávají proteinové koncentrace f‘ ΟΧΆΓ ^yrbo 3 S ú? j V'/J án.PCMV-2 í 3fííCO tir.u stanovené iz'1-v :o;'o i' rn r kl rythrnpoietinuvíhc polypeptídu/al. °ak :cch, relativní in v^:vo nativita se poc “ri-uy b do i safnroy 11 (viz taculkn o).

po uvedeno v přx.upne zvyšuje od ^xn vivo specifické aktivity, které jsou X. uváděny, jsou moření relativních in vivo specifických, aktivit a rejdd ná se o absolutní in vivo specifické aktivity. ^Aro účely této přihlášky jsou specifické aktivity použity pouze prc srov nání relativních, aktivit, Isoforet, studiem za stejných podmí nek ve stejných, pek cech, zahrnujících stejné vnitřní standardy, stejný typ zvířat, mající stejné analv ické údaje použité pro výpočet specifické k ti v ty, stejnou zkoušku pro stanovení obsahu proteinu. -^:oní předpokládáno, že jakékoliv hodnota in vivo specifické aktivity uvedené pro jakoukoliv isoformu představujs základní nebo absolutní hodnotu pro tuto isofortu.

Předložený vynález poskytuje erythropoiotinovt isofoi‘my. tpecifické isofcr...y eryth.ropoi etinu. získané v souladu s předloženým vynálezem o jejich v_sstr.osti fe mohou měnit v závislosti na zdroji vvchozíh.c materiálu. Například isofermy z moče získaného lidského erythroooietinu jsou odlišné od isoforea rekomtinantního erythrcpoietinu. Ve výhodném provedení se vynález týká er.y thropoi e ti nové isofcrryy mající specificky .ocet (např. pevný počet vyčti než 0) číslových kyselin na mol „u erythrcpoietinu, uvedený pocel je zvolen ze skupiny zahrnující 1 a- 14, Výhodný je počet 3, 10, 11, 12, 13 nebo 14. v dalším provedení je počet vyšší než 14, výhodná 16 až 2J.

tento vynález také poskytuje přípravky, obsahující dvě nebo více erythropcietinovýeh iscforem. V jednom provedeni kompozice zahrnují směs isoforea, majících více než predeter Klínovaný počet sinlovýcH kvs^iir. na molekulu erythr-yaoietirru, např. vyšší 11 stolových kyselin nu molekulu erythropoietinu neb·'· vyšší než 1 ' sisiových kyselin na molekulu, sos

12, 13 a 14. V dalším provalení kompozice obsahují směsi isoforer., mající prodetcrninovaný počet slalovýci kyselin na ervthropoiesinovou molekulu, např méně než 12, ale víc- než δ sialových kyselin re. molekulu ja ko je např. směs isoferom 3, 13 a 11. Vynález také poskytuje přípravky obsahující erythroooiotinové isoforný, kde jsou relativní množství icoforem stejná nebo rozdílné. Například směsi i šoférem 3, 11 a 11 by mohly mít isoforný v r řznvch· co je 1:1:1, 2 :3 :' :OO než čtyř iroube směs 12 a

Výhodná přepravky obsahují směsi méně arem. 11, 12 a 13, torem, napři 14,nebo směs 7 9 •‘•ro přípravu směsí erythropoietových isoforeu vynález také poskytuje způsoby současná izolace vybraných erythropoietinových isoforem. Tyto postupy zahrnují izolaci indi1 3viduálních isofcrem takovými technikami j iko je isoelektrická fokusace nebo příprav-; směsí isoforem, majících přede terminovaný počet sialových kyselin n<

vyšší rmh 1 1 ) takovými, technikami j b::

rae.toyraf ie nebo chromatofokusace. ýsechny tyto techniky jsou založeny na coparuci proteinů podle neboje.

molekulu (například ie iontovýminná chronu

Ί kolonu pn 'i asi pH 4 ,v vážena na '.onc^ňntroci s

Obecně, i on to výměnná chromatografie a chroi?.:.tof o ku sace zahrnují aplikaci buď surového lidského erythropcfeti(buněčné kondici ovar.é medium) nebo čištěného materiálu na sloupec uryskyřics zs podmínek, kdy dochází k vázání některých nebo všech crythrcpoioíincvýc isofořem na pryskyřici. U surových erythrοροίetinových přípravků je výhod né aplik-vat protein na sloupec při eti oh 7 čilt-ný příoravky může být protoi pH 7 až asi p'! 4. řo promytí sloupce pudre se tv erothropoistineve i sof ?rty, kt^pré zo sloupci i onexu eluují při svvlujíeím se ph li pufru nebo aplikací gradientu snižujícího se pⁿ a zvyšující se iontové síly při pk asu 4. řři. chromatofckusaci jsou isoformy oluovány ze sloupce gradientem snižujícího se pd nebo promývánír. sxoupce vysokou koncentrací soli.

Jedno provedení vynálezu se týká savčích (např. z ovarya Čínského křečka, CHO) hostitelských buněk, které přednostně syntetizují erythrspoi.o tinové isoformy, mající více než specifický počet, např. více než 10 sislových kyselin na molekulu. hry threp ci o ti nov é m.clekulv mají h-vástns nebo 0vszané oligosach^ridová struktury, která mohou limitovat obsah sialově kysel’ny v rr-lckule. :’acfíklsd, tetraantennární (ótyř-rozvětvoné) N-vázané oligosachnridy nejobvykleji poskytují čtyři možná místa pro připojení šimlové kyseliny, zatímco bi- a triantennární oiiyosachsridcvé řetězce, ktoré mohou nahradit tetraantennárn. formu na asparaginových při-14pojovacích místech, mohou obvykle připojovat nejvýše dvě nebo tři sialové kyseliny. O-Vázané oligosacharidy obvykle poskytují Ivě místa pi o připojení sialové kyseliny, -rythropoietinová molekuly tak mohou akomodovat celkem 14 zbytků sialové kyseliny ε tím, že všechny tři h-vázané oligosacharidy jsou tetraantennární.Kultury savcích buněk jsou prohledávány na ty buňky, které mají přednostně připojeny tetraantennární řetězce k rekoabinantnímu erythropoietinu, a tedy maximalizovaný počet míst pro připojení sialové kyseliny.

z moče obsa3 a o4 z, o 263, 3667 (1988)). připojena ke kyselina ve i,3 rozvětvením

N-vézané oligosacharidy erythropoietinu hují sialovou kyselinu na obou spojeních 2, ke galaktoze (Takeuchi a spol., d.Biol.Chem. Typicky je sialové kyselina v 2,3 spojení galaktoze 1,6 rozvětvením manozy a sialová ek 2,6 spojení j« připojena ke galaktoze <X.

ca .nozy. enzymy, které připojují tyto sialové kyseliny (£>g-ílaktosid ':^ 2,3 sialyltransťeráza a β-gaiaktosid ¢^2,6 sial.vltransferáza) jsou nejúčinnéjái při připojování sialové kyseliny k manoze ďí 1 ,6 a marnoze «c. 1 ,3 větvení.

Jihydrofolát reduktázu (DhFR) postrádající buňky ovarya čínského křečka (ΰΠΟ) se obvykle používají jako hostitelské buňky pro produkci rekombinantních gl.ykoprotei nů včetně rekombnantního ery thropoietinu. *yto buňky neexorifQují enzym p -galaktosidaza 2,ó-sialyltransferázu a proto nepřidávají sialovcu kyselinu k 2,6 spojení N-vázaného oligosacharidu glykopreteinů. produkovaných v těchto buňkách, (iíutsaers a spol. kur.C.Biochem. 156, 631 Í19bb)j lakeuchi a spol. J.vhrocatogr. 4dd, ?d7 (1>ó7)). Následkem toho rekombinantní erythropoie tid produkovaný QHC buňkami, postrádá sialovou kyselinu na spojeních 2,6 ke galaktoze (Sasaki a spol., (1>87), supra; lakeuchi a spol., (1^2.7), supra). V dalším provedení vynálezu je erythropoietin použit pro produkci isoforem připravován v CHO buňkách, které jsou trsnsfektovány funkčním fi -raiaktosid 2,6-sialyltransferázovým genem pro získání inkorporece siaiové kyseliny do 4 2,6 vazby ke galuktoze. Viz Lee a spol. J.Biol.Chem. U9oý), práce· je zdn uvedena jako odkaz pro popis pro získání aodifikcv tných CLO buněk nebo jiných hostitelských buněk.

254, 13848 technik savčích č; vynálezu jsou :vně i ho erythropoietinu. Použitý poi cti nu pi o is tivuje t-nytkn ji v nrirokyseli nov 1 sezveme vele ke zv/hccí n d:u míz* c Analog,’'· jsou pes kyt ovány mís hrnujíeí -adice, dertce nebo zahrnuty některé analogy lidskévýraz analog lidského erythroopoietin s jedním nebo více náboi lils.<óho erythrupci etinu, ccž oc připojení siaiové kjzseiiny. ťč£, řízenou mutagenezí, 2asubstituce aminokyselinových zbytků, ccž ořem-zuje ní k-sylaci. -‘•a ková rniogy řetězců než lidský myt i

--u

V '^?í v ό i .n· jsou dostupná pro glypočet karbony dra tový ch jxCx z-.ýaonou biologickou aktivitu ováním obsahu si. šlové kyseliny v mo. analogy mající obsah siaiové kyseztztno u lidsncho er-y thr opci et inu jsou jsou k.-nstiuovány zvyš lekule rrythxTpoietinu líny vydán než bylo m přepravovány přidávání pcbkcz ovát sekundární pr·.? bf ol mý ckou uktivi

p.lykosylcčních míst, která nebudou nebe terciární konfor lži ei ei potřebnou tu. Výhodně analog lidského erethrop·· ie má 1 , nebo -'esy i sci. nepřen za v v j t e m i g v c tnout až čt dalších zrn tir.u

lační cista přídavná místa pro K-glykosylaci nebo apř-íklad ieucin. v poloze 69 je nahrazen zni ku sekvence ^sn-Leu-Ser, která srouží japfo L-yiykosyisci. iaková změna může obvykle .yři dsiuí siaiové kyše i iny na molekulu. Pří;dn, ktexé generují další Π- nebo O-glykosyiny v polohách 1 2> a 127 na asparagin

-16a šeřin, alanin v poloze 1?5 na fchreonin a alaniny v po•olin a threonin. *ro odborníky bude zřejmé, že předložený vynález zahrnuje mnohé další analogy lidského erythropoietinu, mající další místa pro glykosyInci.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají farmaceutické přípravky obsahující terapeuticky účinné množství specifické Í S of o rovy ^t'^t nebo sr.ě-s iseforoc společně se ihodnýs ředidlem, přísadou a/nebo nosičem vhodným při terapii erythropoietine. Výraz terapeuticky účinné množství , který je zde použit, zahrnuje množství, které vyvolává terapeutické účinek při daných. oolnínkách a r Sinu pelú.ní. bodání erythropoieti novech isoforen se výho I-v provádí parenterálnim způsoben. Cp^-oifický způsob bude záviset na podmínkách, které jsou oš^tř-v ny. Dořértí orythropoietrnových iseforem je výhodn^y prove Donn y části přípravku, který obsahuje vhodný nosič jako jo lidský sérový albumin, vhodné ředidlo jako je pufrovaný sodinic’^vý roztok a/ncbo vhodná přísada. Potřebná dávka bude tiková, že její množství dostačuje ke zvýšení hematokri t-° pa clem ta o bud^ záviset na obtížnosti podmínek, kt^ré mojí být mčítřovány, způsobu podaní a podobné.

clady slouží k ilustraci vynálezu, ale tinový smandard pouzich jo rekomxbinantní erythNásledující

nikterak jej	neomezují. /
tý v in vivo	7 5 o s ’ u ’ i í cl· v
ropei etinov’·'	standard, kte
Či Stěn éru er,	’ t hr ? o o i o t i nc v

osou conz

- n vivo s υ c c i f * o k

j. standardu z moče. Takto uze relativní in vivo specifické aktivity, ktivity jsou vyjádřeny v jednotkách/ xl, .iednotkách/ry a je dnotkách/A a ne jako iU/áflL’ c- C b‘

ΊΓ/χ-εγ a ΙΓ/Αχ_ς , oretogo použitý erythrcpoietinový ¹ tandord není přímo koře'.-ván k meziná.. odnízmu existujícínu standardu

-17Příklady provedeni

Příklad 1

Izolace isoforem rekombinantního erythropoietinu ^ňekombinantní erythropoietin je produkován jak je popsáno inem, supra. ^Aekombinantní erythropoietin použitý jako výchozí materiál pro izolace první a třetí isoformy je čištěn podle postupu popsaného v příkladu 2 práce Laie a spol., supra. Výchozí materiál pro izolaci druhé a páté isoformy je čišrěn podle Laie a spol., supra za použití modifikace Q-°epharosové chromatografie. ^xyto přípravky obsahují směs isoforem rekombinantního erythropoietinu majících stejné aminokyselinové sekvence jako lidský erythropoietin získaný z lidské moče a obsahují převážně isoformy > až 14. Výchozí materiál pro přípravu čtvrté isoformy je materiál, který je eluován během 5 kyselina octová/ mM glycin/óM močovinového promývání aniontovýmenné kolony v příkladu 2 práce Laie a spoll. 2-ato frakce obsahuje isoformy s méně než nebo obsahující 9 sialových kyselin a byla dále čištěna gelovou filtrační chromatografií jak je popsáno v příkladu 2 práce b_aie a spol. před použitím v preparativnín isoelektrickém fokusačním postupu. Příprava šesté isoformy používá jako výchozjfmateriál čištěný přípravek rekombinantního erythropoietinu mající od 4 do 13 sialových zbytků. Tento materiál byl čištěn j ’k je popsáno v příkladu

Laie a spol. s výjimkou pro modifikaci iontovýměnné kolony (eluce rekombinantního erythropoietinu gradientem chloridu sodného při pH 8,4 a vypuštění promývéní kyselinou octovou/močovinou), která vede k retenci nejvíce isoforem, přítomných ve výchozím materiálu.

Šest různých přípravků individuálních isoforem bylo zpracováno preparativní isoelektrickou fokusací na granulovaném gelu (Ultrodex, LKB) v podstatě jako LKB Application Notě 198. Pharmalyte (Pharmacia) 2,5-5 amfolyty (Phar\ macia) jsou používány a gelové lože obsahuje 5 M močoviny.

V první přípravě se na gel aplikuje přibližně 20 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,8 ml 20 mM citrátu sodném/100 mM chloridu sodném, pH 7,0 a zpracovává fokusací při 8 wattech po přibližně 16 hodin. Po isoelektrické fokusaci se proužky isoforem v gelu vizualizují přitisknutím papíru ke gelovému loži. Vyrobí se otisk a pak se fixuje namočením ve třech provedeních (přibližně 10 minut, teplota místnosti) do fixačního roztoku (40% methanol/10% kyselina octová/10% TCA/3,5% sulfosalicylová kyselina), podrobí další zrnině (asi 10 minut) - 40% methanol/10% kyselina octov? (30 až 60 °C), barví se 15 minut při 60 °C v 0,125% Coomasiie tílue B-250/40% methanol/10% kyselina octová a pak se odbarví v 7,5% methanolů/10% kyselině octové pro vizualizaci oddělených isoforem. ^ublast granulovaného gelového lože, obsahující isoformy ( /v 50 % pryskyřice) se odebere, přidá se voda (/y16 ml) a kaše se nalije na misku 5,5 x 24,5 ” a odpaří na asi 40 g čisté hmotnosti. Tento přípravek se zpracuje fokusací podruhé a otisk gelového lože se připraví jak bylo výše uvedeno. Část gelu, obsahující každou ze šesti rozlišitelných isoforem se odebere z gelového lože.

2a účelem eluce isoforem z gelu, se přidá ke každé isoformě roztok, obsahující 10 cul Tris-HCl, pH 7,0/ 5 mM Chaps pro přípravu kaše. Kaše se umístí do malých kolon a promyjí Tris-Chaps pufrem. Výtok kolonou byl odebrán a aplikován odděleně na malé kolony (otevřené uspořádáni kolony), obsahující Vydac C4 pryskyřici s reverzní fází ekvilibrovanou ve 20% ethylonu/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kolony se postupně vyvíjejí 20% ethanolem/10 mM Tric-Ηβΐ, pH 7,0, 35% ethanolem/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, a 65% ethanolem/10 mM TrisHCl, pH 7,0. Frakce euované 65% ethanolem/10 mM T_ris se zředí 1:1 10 m£á Tris-HCl, pH 7,0 a zahustí a pak se pufr nahradí 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 za použití Centricon-10 (Amicon) mikrokoncentrátoru. Analytická isoelektrickó foku

-19sace tohoto přípravku se provede v podstatě jak je popsáno v LKB technická poznámka 250 za použití Servalyte 3-5 ampholinů (Serva) v polyakrylamidovém gelu, obsahujícím 5 M močoviny.

Ve druhé přípravě se na gel aplikuje asi 2ó mg rekombinantního erythropoietinu v 6,5 ml deionizované vody a fokusuje se při 2,5 “attech po 35 minut a 10 Wattech asi 17 hodin. Proužky fokusovaného proteinu, které jsou viditelné v gelovém loži se odeberou jako 11 různých skupin. &aždá skupina se převede do asi 7,5 ml deionizované vody a 20 ml každého z výsledných supernatantů z těchto skupin se podrobí analytické isoelektrické fokušaci jak je popsáno výše. Ke každé ze skupin se přidá 5 mil 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 a kase se umístí každá do malé kolony a ponechá se vytéci kapalná fáze. Pryskyřice se promyje přibližně třemi objemy 0,5 M Tris-HCl, pH 7 a promývací roztok se spojí s proteklou kapalinou. Eluované roztoky se zahustí a pufr se vymění za 20 m&l citrátu soineho/100 mM chloridu sodného, pH 7,0 za použití Amicon ultrafiltračního zařízení kajícího průnik 10000 daltonů mol.hmotnosti. Koncentrované roztoky (asi 0,5 ml) pak procházejí 0,22 mikrometrovým filtrem z acetátu celulózy. Vzhledem k analytické isoelektrické fokušaci bylo nalezeno pět skupin, obsahujících převážně jednotlivé isoformy 10, 11» 12, 13 a 14.

Ve třetí přípravě se na gel aplikuje asi 30 mg rekombinantního erythropoietinu ve 21 ,8 ml destilované vody a fokusuje se při 2 Wattech po 25 minut, při 10 “attech po 20 hodin a 15 Wattech 15 minut. -Proužky proteinu, odpovídající individuálním isoformám jsou pozorovány vizuálně a odebrány z gelového lože. K isoformám izolovaným z gelu se přidá destilovaná voda, připraví se kaše a vzniklé supernatanty se analyzují analytickou isoelektrickou fokušaci. Ke každé kaši se přidá stejný objem 1 M Tris-HCl, pH 7,2., sus-2

0senze se umístí do oddělených malých kolon a kapalná fáze se nechá vytéci z kolony pro eluci isoforem. ^aždý výtok se zahustí a pufr se vymění za 20 mM sodný citrét/100 mM chlorid sodný, pH 7,0 za použití Amicon zařízení pro ultrafiltraci s dělením 10000 dalton mol. hmotnosti. Analytický isoleketrofokusační gel informuje o tom, že byly získány skupiny, obsahující zejména jednotlivé isoformy 9, 10,

11, 12, 13 a 14.

Čtvrtá příprava isoformy používá jako výchozí materiál erythropoietin, obsahující isoformy 3-9 (připravené výše). Před preparativní isoelektrickou fokusací provedenou v podstatě jak bylo popsáno výše pro přípravu 1 až 3, byly ampholyty (Pharmalyte 2,5-5) prefrakcionovány v Rotofor (BioRad, Richmond, CA) buňce pro isoelektrickou fokusací s kapalnou fází, pro získání ampholytú shodnějších pro nižší isoelektrické body výchozího materiálu. Pr^;frakcionace se provádí smísením 6,7 ml Pharmalytu 2,5-5 s 15 g močoviny a přidáním vody na objem 50 ml. Směs se frakcionuje v Rotofo ru při 10 wattech, 1°C po 5 1/2 hodiny za použití 0,1M kyseliny fosforečné a 0,1 M hydroxidu sodného jako anolytu a katolytu. Amfolytové frakce, mající zjištěné pH mezi 4,5 a asi 6 byly použity pro isoelektrickou fokusací plochého lože.

Amfolyty byly získány z isoforem za použití Centrielute ru (Amicon, Danvers, MA) a 10000 MW Centriconu (Amicon) za použití následujících parametrů: 0,18 Iris půfr 8,8, 100 Volt, 25-30 mA, po 3 hodiny. Isoformy byly pak pufrem převedeny do 0,1 M chloridu sodného gelovou filtrací za použití Sephadexu G-25 (Pharmacia). Analytická isoelektrické fokusace pěti výsledných ppolů prokázala, že obsahují isoformy

4,5,6,7 a 8. Isoforma 4 vykazuje několik proužků což indikuje, že prošla určitou degradací.

-21Příprava páté isoformy byla modifikována přídavkem prefokusačního stupně k postupu iaoelektrické fokusace na plochém loži. V této modifikaci nebyl přidán protein ke směsi amfolyt/močovina/gel před elektroforézou, ale byl přidán do isoelektrického fokusačního zařízení s následujícím vývojem gradientu pH v gelovém loži. Po prefokusaci po 75 minut (1500 volt/h) byly sekce gelového lože ve vzdáleností 2,25 -4,25 cm od katody odebrány, smíseny s roztokem erythropoietinu a přidány zpět ke gelovému loži. Po isoelektrické fokusaci byly isoformy 10, 11, 12, 13 a 14 eluovány z gelového lože a odděleny od amfolytů ultrafiltrací za použití zařízení Gentrécon-10 (Amicon).

ťrefokusaČní modifikace byly uskutečněny pro to, aby charakteristiky ultrafialové absorbance přípravků, obsahujícím isoformy byly podobnější těmto charakteristikám výchozího rekombinantního erythropoietinu. ^lepšení ve spektrálních charakteristikách může být zřejmé z poměru absorbance pri 280 a 260 nm u izolovaných isoforem. Průměrný poměr absorbance při ⁹80 nm k absorbanci při 260 nm (A280/A260) pro isoformy z přípravků 2 a 3 (ne-prefokusované) je 1,36 + ^w,11, zatímco průměrný poměr A280/A260 pro přípravky 5 a 6 (pre-fokusované) je 1,68+ 0,20. Jestliže je isoforma Č. 14 vyloučena z propočtů, průměrný A280/A260 poměry jsou 1,39 + ^,11 a 1,74 i 0,09 pro přípravky 2 a 3 a 5 a 6. (Isoforma 14 může mít nejatypičtější spektrum, protože je přítomna v nejmenších množstvích a je tak nx^více náchylná k interferencím stopovou kontaminací amfolytovými komponentami nebo protože je nejbližší elektrodě během provádění isoelektrické fokusace na plochém loži.). Průměrný A280/A260 poměr pro rekombinantní erythropoietin připravený podle příkladu 2 Laie a spol.(modifikovaný jak bylo popsáno použitím Q-Sepharosy jako aniontovýmšnné pryskyřice) je 1,91 i 0,04.

^ak je popsáno výše, výchozí materiál pro přípravu isoformy č.6 byl rekombinantní erythropoietinový přípravek obsahující isoformy 4-13. Amfolyty byly pre-fokusovány v zařízení Rotofor jako ve čtvrté přípravě. Pro isoelektrickou fokusaci na plochém loži byly použity amfolytové frakce, mající pil mezi 3,7 a 4,8. Ploché lože bylo prefokusováno postupem jako v přípravě č. 5 a isoformy 9, 1ΰ, 11, 12 a 13 byly získány po ultrafiltrací (Centricon-10) pro odstranění amfolytú.

Příklad 2

Obsah sialové kyseliny v isoformách rekombinantního erythropoietinu ‘•soformy izolované jak bylo popsáno v příkladu 1 a erythropoietin čištěný postupy popsanými Laiem a spol., supra ( (směs isoforem 9 až 14) jsou pufrem převedeny do 0,10 - 0,15 A6 chloridu sodného a analyzovány na obsah sialové kyseliny modifikací postupu podle Jourdiana a spol., J.Biol.Chem. 246, 430 (1971).Zbytky sialové kyseliny jsou odštěpeny od glykoprot-inů hydrolýzou 0,35 M kyselinou sírovou při 80 °C po 30 minut a roztoky jsou neutralizovány hydroxidem sodným před analýzou. Za účelem vyhodnocení množství přítomného erythropoietinového proteinu se provede stanovení proteinu podle Bradforda (Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) za použití rekombinantního erythropoietinu, majícího aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu jako standard za použití zkušebních reagencií a mikrozůsobu podle Bio-Rad. Výsledky, vyjádřené jako moly sialové kyse-iny na mol erythropoietinu, jsou uvedeny v tabulce 1. soformy jsou označeny podle počtu sialových kyselin na molekulu a rozsahu od málo kyselých (isoforma 9) do nejkyselejších (isoforma 13). ^soformy 9-13 jsou uvedeny v gelových drahách 6-1ϋ obr. 1. Množství isoformy 14 jsou nedostatečná k přesnému měření obsahu sialo-23vé kysexiny. Obsah siaiové kyseliny v této isoformě je odhadnut z její migrace na IEF gelech vzhledem k dalším isoformám. Obsah siaiové kyseliny isoforem 5-8 (přípravek č.4) nebyl měřen, ale je pravděpodobně pdhadnut z jejich migrací na IEF gelech.

Tabulka 1 lsoforma molyjsialové kyseliny/

e ry thr op o i e t inu	mol erythropoietinu
isoforma 13	12,9 + 0,5
isoforma 12	11,8 + 0,2
isoforma 11	11,0 + 0,2
iscforma 10	9,8 + 0,3
isoforma 9	8,9 + 0,6
směs isoforem 0-14)	11,3 + 0,2

Příklad 3

Aktivita isoforem rekombinantního erythropoietinu isoformy izolované jak bylo popsáno v příkladu 1 byly h'dnoceny podle absorbance při 280 nm, Sradfordovou proteinovou zkouškou a pomocí RIA pro erythropoietin pro stanovení množství přítomného rekombinantního erythropoietinu. Exhypoxická polycythemická biostádie na myších (Cotes a spol., Nátuře 191, 1065 (1961) se použije pro stanoveni in vivo biologické aktivita. Kvantifikace množství erythropoietinovcho proteinu přítomného podle radioimunozkoušky pro erythropoietin poskytuje výsledky myjící vyšší relativní in vivo specifickou aktivitu pro některé isoform_y, protože zjevně snížená imunoreaktivita isoforem, obsahujících velké množství siaiové kyseliny vede k podhodnocení koncentrace erythropoietinu a tak k nadhodnocení in vivo specifické aktivity pro nejvíce negativní isoformy. Stanovení z biostudie na myších, vyjádřené jako jednotky/ml, jsou

-24jsou děleny koncentracemi odpovídajících proteinů pro získání ín vivo specifických aktivit vyjádřených jako jednotky/mg erythropoietinového polypeptidu. ^Ayto specifické aktivity jsou uvedeny v tabulce 2.

V atbulce 2, je n počet nezávislých přípravků isoforem, který spolupůsobí hodnotu specifické aktivity. ^v nejvíce případech byly provedeny in vivo studie pro každý přípravek isoformy. Některé in vivo údaje pomáhají při výpočtech specifické aktivity ve všech třech sloupcích, ^wednotky^zmg erythropoietinového polypeptidu byly stanoveny z absorbance pri 280 nm, z hndnot radioimunozkoušky nebo z výsledků 3radfordovy proteinové zkoušky, čištěný rekombinantní erythrcpoietin, obsahující isoformy 9-14 byl použit jako standard v ^radfordově proteinové zkoušce, n může být menší pro výpočty provedené za použití ^radfordovy proteinové zkoušky, protože některé přípravky nebyly v době provádění Bradfordovy zkoušky dostupné.

Erythrcpoietin čištěný podle postupů popsaných Laiem a spol., supra a obsahující směs isoforem 9 až 14 hyl použit jako standard ve zkouškách RlA a in vivo.

^,uelativní specifické aktivity vyjádřené jako jednotky / mg erythropoietinového polypeptidu mohou být převedena na jednotky/A₂gQ násobením 0,607 mg erythropoietinového polypeptidu/A_2g0. rřepočítévací faktor je získán násobením extinkčního koeficientu erythropoietinu (1,345 mg/Άρθθ) obsahem proteinu v erythrcpoietinovám glykoproteinu (asi 60 λ hmotnostních, Davis a spol., Biochemistry 26, 2633 (1987)) pro vyjádření mg erythropoietinového polypeptidu/AggQ (tj.

1,345 mg erythropoietinu/ApgQ x 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinu = 0,807 mg polypeptídu/A₂gQ). Dále specific-25ké aktivity vyjádřené jako jednotky/mg erythropoietinového polypeptidu mohou být násobeny faktorem 0,60 mg pol.ypeptidu/mg erythropoietinového glykoproteinu pro získání specifických aktivit vyjádřených jako jednotky/mg erythropoietinového glykoproteinu.

Xsoforma U/mg polypeotiilu n U/t-tí polvýke^átidu n U/nng polypeptidu (Bradf o rdovu pro- (z A2B0) (3 RIA) ___toinová zkoušku)_ _

Al	LA	LÍO	xj-	co	AI	1—)	r-t	r-t
O	O	O	O	o	O
	p:	1	’^s	Ό		0	'-J	O
CÁ	c j	Ό	t>		ώ	0	0	O
•k		·*	·*	•k	•k	LA		LO
‘:O	'>	>4	J	r—t	co	«k	**	«k
	XT		LO	CA	co	c\	LA	rH
+ 1	+ 1	+ 1		+ 1	+ 1	+1	r\|	+ 1
0	o	0	0	O	o	0	O	0
0	0	0	0	O	0	0	O	0
r-	Al		v-t·	CÁ	lc	'* A	CO	LA
«k	•k	«k	•k	«k	«k	flk		•k
	c*-	r-	rH	H	co	rH	Oj	IfO
vo	'O	C-C		ř*-	rH	O		rH
co	CO	ej	CM	i—1	1—i
04	UO	LÍO		CO	04	rH	rH	rH

O	0		O		0
0	ě~\	0	O	0	o	O	0	O
*—	\r\		CO	íA		rH	0	'j
«k	«k	Λ	•k	«k	•k	•k
r-	CA	r-i	A-		0	•^ř	•k	«k
<A	•co		LO	“-Λ	'vt		Ό	rH
+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1
0	0	o	O	0	0	Ό	0	0
0	-A	A	1. i		0		--Ά	•-A
co			r£,	co	LO	co	CÁ	CA

CO 'Ό > lj <0

O LA -A irs f— CA f— LA r-t 'vt Aj Ai Ai Γ=1 | AI ·φ ·=4- CA (—I , f-H Η Η

O	0 o	O O	3		0	O	o
0	^ι·Ο	LC	r-t	^0		A
r—t	«k	•k	«k	0	có	ώ	r-
Λ	0	LA	rH	co	*k		«k
n	í*\	A	Ή	0k	co	LA	1—1
41	+ 1	+ 1	+ 1	1—í » }	1 Ή	+ 1	+ 1
O		A	·'.	Ό	Ό	A
O	ó	Ó	ó	ó	O	ó	b
	Al	r-	,·-*»	04	Ai	LO
k	•k	^k		^k	*	«k	·»
CA	r-	LA	;\i	Cj	. _A	vO	0
CO	0	c-	co	r-r-\	LO	Xt	rH
. 4	CA	Al	Al	ÍH

-Φ CA Al H O r4 ι—I I—1 r-t r-i lA

-27Údaje z tabulky 2 jsou také znázorněny na obr. ?A, a ?C. Tyto údaje ukazují, že relativní in vivo aktivita erythropoietinu se zvyšuje jako funkce obsahu sialové kyseliny až do isoforay č. li. 1 sof oraiy č. 11-14 mají v podstatě stejnou relativní in vivo bioaktivitu.(Toto je nejzjevnější, jestliže je koncentrace isoforný 14 vyjádřena použití hodnoty z Bradfordovy zk.usky. ^radfordova hodnoty může být pro isoformu 14 přesnější, protože jsou obecně získány nižší hodnoty a to vede k obtížím při stanovení pomocí A₉qq a nejzřejmnějšímu snížení reaktivity v RIA pro velmi negativní formy, jak bylo uvedeno dříve). Vyšší in vivo specifická aktivita erythropoietinových isoforem, majících více sialových kyselin je nejpravděpodobněji způsobena delším průběhem poločasu životnosti těchto forem, dsoformy 9 a 13 jsou značeny radioaktivním jodem ( I) a byla stanovena rychlost jejich štěpení u krys. -Poločas životnosti v oběhu byl výrazně delší pro isoformu 13 než pro isoformu 9.

Příklad 4 bělení směsí isoforem rekombinantního erythropoietinu chromatográfii na Q-Sepharose

Buněčná kondici ováná media z produkce rekombinantního erythropoietinu podle postupů popsaných Línem, supra, se koncentrují a disfiitrují proti 10 nL Tris, pH 7,2. Koncentrace proteinu se stanoví Bradfordovou mikroproteinovou zkouškou za použití hovězího sérového albuminu jako standardu. 19,6 ml roztoku, obsahujícího 40 mg celkového proteinu se přepraví ve 20 ^uM CuSO^*, filtruje přes 0,45 mikro metrový filtr a vloží na 4ml kolonu (1,05 cm výška x 2,2 cm průměr) plněnou náplní Q Sepharose ^£ast Flow (Pharmacia) která byla ekvilibrována 10 mM Tris, plí 6,8 až 7,0 při 4 °C

-28Po aplikaci vzorku se kolona promyje dvě objemy kolony pufru. •Průtok kolonou je asi 1 ml/min. -ťro dělení směsí isoforem erythropoietinu se použije šest oddělených kolon.

Kolony se promyjí 6 až 9 objemy pufru o nízkém pH: kolona č. 1, 150 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 yUM CuSO^,

M močovina, upraveno na pH 4,7 ^'aOH, kolona č. 2, 200 mM octové kyselina, 1 mM glycin, 20 yuM Gu30₄, 6 M močovina, upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 3, 250 mM octová kyselina, 1 mM glycin, 20 ^uM GuSO^, 6 M močovina upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 4, 300 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 OuSO^, 6 M močovina upraveno na pH 4,7 pomocí NaOH, kolona č. 5, 150 mM kyselina octová, 1 mM glycin, yuM OuSO^, 6 M močovina, kolona č. 6, 300 mM kyselina octové, 1 mM glycin, 20 ^uM GuSO^, o M močovina.pil kolon se zvyšuje na asi pH 7 promýváním každé kolony 8 až 11 objemy kolony 10 mM Tris-HCl, 55 mM NaCl, 20 ,uM CuSO₄, pH 7« •definované erythropoietinové isoformové směsi jsou z kolon eíuovány promýváním 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 CuS0₄, pH 7,0.

Eluované isoformové pooly z každé kolony se zahustí a rozpouštědlo se vymění vodou za použití Amico Gentricon10 mikrokoncentrátoru. Výsledky analytické isoelektrické fokusace těchto koncentrovaných poolů jsou uvedeny na obr.3. dělové dráhy 1-6 představují definované směsi erythropoietinových isoforem eluovaných z kolon 1-6. Isoformové směs” uvedené v posladní pravé dráze gelu na obr. 3 představuje buněčné medium, které je aplikováno na kolonu Q-Sepharosy jak je p psáno výše, kolona se promyje 5 mM kyseliny octové, mM glycinu, 20 ^uM CuSO_4> óM močoviny a směs isoforem erythropoietinu se eluuje z kolony za použití výše popsaných postupů. Tato eluovaná směs isoforem se dále čistí podle postupů popsaných v práci Laie a spol., supra, před analytickou isoelektrickou fokusací.

-’9Příklad 5

Frakcí onace isoforen rokombinantního erythropoietinu za použiti nízkého pil gradientu na Q-Cepharose

V dalším postupu jsou isoformy erythropoietinu separovány za použití gradientu snižování pil a zvyšování iontové síly. Koncentrovaná diafiltrované, erythropoietin obsahující medium se vnese na kolonu Q-Hepharosy v poměru asi 40 mg celkového proteinu/ml gelu. Kolona se pak promyje asi dvěma objemy kolony 10 mK Tris UG1, pH 7,0 a pak asi 10 objemy kolony ? itíí kyseliny octové/1 mM glycinu/20 CuSO^/6 M močoviny (pí! přibližně 4,8) pro odstranění kontaminujících proteinů a erythropoietinových isoforen, obsahujících méně než asi 7 zbytků sialové kyseliny. isoformy, obsahující od přibližně 8 do přibližně 17 sialových kyselin jsou z kolony eluovény za použití gradientu od počátečního 2, msi kyseliny octové v ó ií močoviny/1 mM glycinu/

Í0 ^uM CuSO^ a do až 40 mM kyseliny octové/β M močoviny/ mli gl,ycinu/20 ^uM CuSO^ (pH přibližně 4). Celkový objem gradientu je přibližně 40 objemů kolony a frakce přibližně jednoho objemu kolony se odebírají do nádob, obsahujících objem Tris pufru dostačující k uvedení pH do rozmezí 6 8,5 proto, aby se zabránilo dlouhodobému vystavení odebraných frakcí nízkému pH. Rodily frakcí se podrobí analytické isoelektrické fokusaci pro sledování separace. Obr.4 ukazuje separaci isoforem 8-11, které může být dosaženo tímto postupem, isoformy 1? - 14, které zůstávají vázány na koloně při konci gradientu, jscu eluovány promýváním pufrem, obsahujícím 1G mři Tris-HCl, 140 mil NaCl, 70 yuM CuSO^ (pH 7,C). Isoformy (separované působením gradientu nebo eluované roztokem chloridu sodného) jsou prosté kontaminujících proteinů při chromatografii na reverzní fází, následované filtrační gelovou chromatografii jak je popsáno v příkladu 2 v práci Laie a spol..

-30Příklad 6

Analogy lidského erythropoietinu, mající další glykosylační místa

A. Konstrukce analogů lidského erythropoietinu ^místění existujících a navržených míst pro připojení karbohydrétu v erythropoietinové aminokyselinové sekvenci jsou uvedena na obr. 5 a postup přípravy těchto dalších glykosylačních míst je shrnut na obrázcích 6A-C a je popsán dále.

Za použití in vitro mutagenese byly syntetizovány následující oligonukleotidové primery:

/Asn⁴, Ser^ó/EP0: 5*CGGCCAGGAAAGCTGAGGTGTGAGAGGGGA 3 /Asn⁹, Ser¹¹/ PPG: 5*ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3' /Asn⁶⁹/EP0: 5'GGGGCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3* /Asn¹²⁴/EP0: 5'TGGCGTGGAGATAATGGGTCAGGTGG 3* /Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO: 5ČAGATGGGAACTGATGTGGTGGAG 3* /Asn¹⁵³, Ser^1o5/EPC: 5'AGGGCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTTG 3* /Thr¹²⁵/SPO: 5ÍCGAGATGGGACCTGAGCTGGTC 3* /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/ZPO: 5'CCTCCAGAICCGAGCTCAGCTGC 3*

Podtržené kodony představuji nevhodné spojené oblasti, kde aminokyseliny uvedené v závorkách nahrazují divoký typ aminokyselin.

/Asn⁴, 5er⁵/EPO byl konstruován přidáním N-glykosyladního místa u Asn 4. /Asn⁹, Ser¹¹/EPC byl konstruován přidáním ^'-glykosylačního místa k Asn 9. /Asn⁵⁹/EPO byl kon• 1 25 struovén přidáním K-glykosylaSního místa k Asn 69. /Asn , 1 27

Ser /EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa k Asn 125. /Thr¹²⁵/EP0 a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO byly konstruovány přidáním C-glykosylačního místa u Thr 125.

Následující oligonuklectidcvó priméry jsou syntetizovány za použití in vitro mutagenese:

.71 /Asn⁶⁹, Thr⁷¹/EPO: 5'GGGGGTGGGGAAGGTGAGAGAAGGTGTG 3* _/c 68 » 69 r-. 71 /Ser , Asn , Thr /£

5'CAGGGCCTGTCCÁACCTGAGAGAAGCTGTC 3 * /Asn¹²⁵, Thr^1?7/EPO: 5*GAGATGCGAACTCAACGGGTGCAG 3* /Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, ?hr^13l/EPO:

*ATGGGAACTGAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3 * /Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO:

5ČQAGATGCAAATTCATGTGCTCCAGTC 3 * /rro^1<'⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷/EPO:

5'ggagatggaaattgaagaggtggagtg 3 * /Thr¹²⁵, Thr¹²⁶/PPO: 5*CGAGATGGGAGAACAGGTGCTGCA 3*

.. 1 ?4 1 ?5 tl 1⁹6 131/_L..a_n /Pro , Thr , ihr , Thr /EPO:

^ligonukleotidový primer 5*ACATGCGACCACCGCTGCTCGAC 3* je použit pro přípravu /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶/EPO za použití /.Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO cDNA jako výchozí látky. Oligonukleotidový primer 5*TGGTGGACTGAGAACAATCACTG 3* je pak použit pro přípravu /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹/EPO.

/Asn⁶⁹, Thr⁷¹/EPO a /Ser⁶^, Asn⁶⁹, Thr⁷¹/EPO jsou konstruovány přidáním N-glykosylačníbo místa k Asn 69 a zvýšenín N-glykosyl ^jce na tomto místě. /Asn¹''⁵, Thr¹²⁷/EP0, /Asn¹'⁵,

Thr¹²⁷, Thr¹³¹/EPC, /Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EP0 a /Pro¹²⁴,

125 197

Asn * , Thr ‘ /EPO jsou konstruovány přidáním N-glykosylač-32 ního místa na ^ňsn 125 a zvýšením glykosylac tě. /Thr¹²⁵, Thr¹²⁶/E?0 a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, jsou konstruovány přidáním O-glykosylsčního 125 a zvýšením glykcsylace na tomto místě.

e na tomto mísThr¹²⁰, 8er^13l/EP0 místa ke Thr

Zdrojem erythropoietinové DNA pro in vitro mutagenesi byl plasmid ^íxu13, klonxix cDNA lidského erythropoietinu v pUC 8 (Law a spol. Proč kati.Acad.8ci.83, 6920 (1986)). Plasmidová DNA odvozená od dul 3 byl© štěpena BstEII a BglII restrikčními enzymy, výsledné fragmenty DNA byly podrobeny elektrofořeze na agarosovém gelu a z gelu byl izolován

TM

810 bp fragment er'thropoietinové DNA za použití GeneClean kitu a postupy doporučenými výrobcem (BIO 101, Inc.). Plasmid pBRgHuEPO obsahuje erythropoietinový genomový gen jako ^amHI fragment inzertovaný do derivátu pBP322, jek je popsáno ve zveřejněném patentu Lina, supra. pBRgHuEPO byl také štěpen pomocí BstEII a BglII a byl získán vektorový fragment 6517 bp. Ligace těchto dvou fragmentů vede k IGT1. Pro konstrukci pLC-1 , byl pDSVL (popsaný ve zveřejněném patentu Lina., supra) štěpen BamHI a k němu byl lisován izolovaný BamHI fragment velikosti 2,8 kilobazí (kb) z IGT1 , obsahující erythropoietinocou cDNA.

Z© účelem přípravy jednořetězccvé DNA pro mutagenesi in vitro, byl pLG-1 štěpen BamHI a BglII a byl izolován fragment 880 bp erythropoietinové cDNA. Byl ligován k BamHI místu m13mp18 zs vzniku m13-SC-1. ^uednořetězcová DNA byla získána ze supernatantů E.coli kmen P.Z1G32, infikovaného m13-HC-1 jak popsal ^unkel a spol. Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) a Aessing, Methods in Enzymol. 161, 20 (1983). Pro nutagensi in vitro bylo smíseno přibližně 1 ^ug jednořetězcové DNA o 0,2 pmol jednoho ze syntetických primerů popsaných výše se ó ml pufru (?50 nm Iris pH 7,8, 50 mM

-33ígCl₂ a 50 ml dithiothreitoiu). Pro připojení primeru k templétu byl objem reakční směsi upraven na 10 yul vodou, sm?s bylo zahřívána na 55 °3 po dobu 5 minut a pak nechána zchladnout na teplotu místnosti. fro prodlužovací reakci bylo přidáno 2,5 ml dTTř, dATP, dOTP a AT? (všechny s 10 yuM), dálo 1 ^ul (1 jednotka) E.coli DNA polymerázy (Xlenowůvf řrag ment) a 1 ^ul (1 je natká) T4 DNA ligázy. 3m?s pak byla inkubována přes noc při 14 a použita pro transformování N. coli JLI 109 (Yanisch-Perron a spol., Gene 33, 103 (19C5)) jak je popsáno (llessing, supra).

?ro identifikaci mutsntríck klonů rozlišovací hybridia icíjbyly plaky na nutričním ogaru přeneseny na Gene Bcrsan filtry (New řnglund Nuclcor). filtry byly sušeny pod tepelnou lampou a pak inkubovány pc dobu jedné hodiny v 6x CSC, i SDS při 60 °d. ?ro hybridi žnci byly oligoorimery uvedené výše (8 pnol) koncově označeny 3 ⁹

T4 polynuklecti. lovou kor.áz.-cu a r-o znače ným ATP a inkubovány ε filtry přes noc v 6x ESC, 9,5% SDS a 100 mg/ml DNA lososího sperma při- 37 °C pro /Asn¹²⁴/autaci, 55 °C pro •⁴ 3er°/ mutaci, 65 °G pro /Thr^1,:5/ a /Pro¹“'⁴, Thr¹ . ,, 9 c- 11 / 163 165 o osnou,'i cm / Asn mutace a 70 C pro /Asn⁷, Ger / e /Asn , Ser / mutace. ?řiští den byly filtry třikrát promyty 6x SSC při teplotě místnosti a podrobeny autoradicgrafii. Je-li to nutné byly pak filtry promyty 6_X SEC při zvýšených teplotácr , dokud nebyla detegována malá nebo žádná hybridizace u pla ku | mci Jících erythropoieilrcvou cřfA sekvenci dikokého typu. R-l ony, které zn téchto

UUUi.

:ínek dávají pozitivní hybridizoční signály byly identifikovány a retransfektovány do J.Y109 k izolování čist ho klonu. Dideoxy řetězcová terminační sekvenční analýza dokládá, že jsou přítomny mutace u asparaginovýho, serinovóho, threoni nov -ho a přeli nového zbytku.

Dvojřetčzcovó n1 3 DJ-1 DNA nesoucí /Asn⁴, Ser⁶/, /Asn⁹, Ser¹¹/, /Asn⁶⁹/, /Asn¹²⁴/, /Asn¹²⁵/, /Ser¹²⁷/,/Asn¹⁶³

-34^er¹^/ /Thr¹²⁵/ a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/ změny byly získány z JMI05 transfektovaných buněk varnou metodou (Holmes a spol. Anal. Biochem 117, 193 (1981)). DNA byly Štěpeny pomocí ostEII a Xholl a byl izolovány 810 bp fragmenty erythropoie tinové DMA. pEC-1 byly štěpeny BstSII s následujícím parciálním štěpením Bg1II a 5*kcnce výsledných fragmentů se de f orf oly latu jí bakteriální alkalickou fosfatézou v 1 0 mil Iris, pH 8 při 60 °C po 60 minut. Byl izolován 7 kb vektorový fragment postrádající 610 bp ^stEII-BglII a ligovén k erythropoietinovým fragmentům uvedeným výše. Výsledné plzsmidy (označené pEG-X, kde X znamená parciální mutaci) obsahují lidský erythropoietin se změněnými aminokyselinovými zbytky v označených pozicích.

cDNA klony sekvence lidského erythropoietinu a analogů odpovídajících /Asn⁴, Ser V, /Asn^, Ser¹¹/, /Asn^/,

27/ z, 163 ner /, /Asn ,

25

Thr / erythropoietrnových cDNA klonů byly transSer¹⁶⁵/, /Thr¹²⁵/ a /Asn¹’⁴/, /Asn¹²⁵, .1 24 / rro fektovány do COS-1 buněk (ATC3 č. GD1-1650) elektrokorporací. COS-1 buňky byly z polotekut'ch disků odebrány, promyty mediem (modifikované .Dúlbecco základní medium, obsahující / fetálního telecího sera t 1 / L-glutasinu/penicilinu/ streptomycinu (Irvine Scientific) a resuspendují na 4 x 10 buněk/ml.Jeden mililitr buněk se přenese do elektroporační

ΠΊ lf kyvety (Bio-Bad) a elektroporuje Bio-Bad Gene Pulserenr při ?5 /uEaradech a 1600 voltech za přítomnosti 100 až 200 ^ug nosiče DNA a 2 až 20 ^ug plasmidové DNA kódující erythropoietinový analog. í-lektroporované buňky se umístí v kon6 centraci 2x10 buněk na 60 mm misku pro tkáňovou kulturu v 5 ml media. Po dvou až čtyřech hodinách po umístění se me dium nahradí 5 ml čerstvého media. Kondiciované medium se oddělí 3 až 5 dnů po elektroporaci.

-35A. Zkouška aktivity erythropoietinového analogu

PIA byly provedeny podle Egrie a spol., supra. In vivo biologická aktivita erythropoietinových analogů byla stanovena exhypoxickou polycythemickou biostudií na myších (lotos a spol., supra).

in vitro erythropoietlnová aktivita byla stanovena zkouškou tvorby erythroidních kolonií jak je popsáno l3covem a spol., J.Cell Physiol. 83, 309-320 (1974) s modifikacemi. Jednojaderné buňky z huněk lidské kostní dřené byly částečně čištěny na ficol-papue vložce a promyty Iscovým mediem pře< umístěním na plotnu pro odstranění adherentních buněk. K-ulti· vační medium obsahuje 0,9 / methylcelulozy a neobsahuje jakýkoliv hovězí sérový albumin. Srythrodní kolonie byly spočteny po 8 až 10 dnech kultivace.

^rythropoiPtinové analogy transfektované a exprimované v COS buňkách jak je popsáno v sekci A, byly analyzovány v sur-v ^zeh supernatantech COS buněk pomocí RIA a zkouškou tvorby eryth.roidních kolonií. Lidská erythropoietinová sekvence ná in vitro aktivitu srovnatelnou s RIA aktivitou stanovenou ve výše uvedeném pokusu. Analogy /Asn VEPO, /Asn¹²⁵, 3er¹²⁷/EP0, /Thr¹²⁵/EPO a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO vykazují In vitro aktivitu srovnatelnou s RIA aktivitou a poskytuje důkaz o dalších karboh.ydrátových řetězcích (jak je stanoveno v sekci C). Tyto analogy jscu dále analyzovány transfekcí cDNA klonem kódujícím erythropoietinový analog do CLO buněk, Čištěním erythropoietinového analogu a měřením in vivo biologické aktivity čištěného analogu.

C. Analýza Western Blot ^ubjem suspernatantu, obsahující 5-20 jednotek z COS bu-36něk transfektova ných cDNA erythropoietinových analogů jak je popsáno v sekci A, byl imunoprecipitován přes noc při teplotě místnosti s králičí antierythropoietinovou polyklonální protilátkou. K imunoprecipitátu bylo přidáno 20 až 80 yul 1:1 proteinu A-^epharosy v salinickém roztoku pufrcvnnéfls fosfátem (PBS) a ponecháno inkubovat jednu hodinu při teplotě místnosti. Vzorky byly odstředěny, promyty PBS a kde je to indikováno, byl$r peleta zpracována s N-glykanázou pro odstranění N-vázaného karbohydrátového řetězce· V Vzorky byly analyzovány elektroforezou na t5% SDS-polyakrylamidovém gelu, přeneseny na nitrocelulozu a podrobeny Westernově analýze jak je popsáno (Burnette a spol., Anal. Biochem 112, 195-203 (1981); Elliot a spol. Gene 79, 167-180 (1>8>)) za použití směsi myších antierythropietinových monoklonálních protilátek. Jedna z te.kových protilátek, 5G8A, je popsána Elliotea a spol. (1989) Blood 74, Supp.1, A.

22S.

Analýza supernatuntů COf buněk trar.sfektovaných /Asn BPD a /Asn^ 5, s_er 1'-7/EPQ cDNA dokládá zvýšení velikosti proteinu v<? srovnání se sekvencí lidského erythrcpoietinu. Zvýšená velikost svědčí o přítomnosti dalšího N-vázaného karbohydrátového řetězce (obr.7). Zpracování supernatantů z DOS buněk transfektovaných /Thr¹^/EPO a /Pro¹ ‘fy Thr¹^^/ SPO cDNA ε K-glykanézou dokládá zvětšenou velikost proteinu ve srovnání se sekvencí lidského erythropoietinu. Tato zvětšené velikost svědčí o přítomnosti dalšího O-vázeného karbohydrátového řetězce (obr.8).

D. Izolace isoforem erythropoietinových analogů ván nové

25 dr-ytbropoi et3 nový analog /Thr /BPC byl konstruoak je popsáno v sekci A. 610 bp fragment erythropoieti1 2b cDNA nesoucí /Thr /mutaci byl izolován štěpením plas-37aidu pl'1 obsahujícího /Thr^mutaci pomocí BstEII a BgUI a ligací fragmentu k pDDG£ ,derivátu pDS ?. pDSo(2 je obecně popsán v US patentové přihlášce č. 501 904, která je zde uvedena pro úplnost. pDECA byl připraven z pDS wý 2 následujícími kroky:

1) HindlII místo pDS d.2 bylo deletováno Štěpením pDSo^2 pomocí HindlII, zpracováním HindlII koho coli DNA poiycerázou (Klenot fragment) a

DNA ivních konců dNTP,a religací tupě zakončeného vektoru. Výsledný plasmid je pD5 £ 2

2) pDS íK2 A H byl štěpen pomocí Balí a syntetický oligonukle otid mající SV40 jeným ke 3*konci ticky eligonukleet spliee signál se Sáli linkerem připosplice signálu byl k němu ligován. Synteid měl následující sekvenci:

TOCAGGAACTGAAAAAGGAGAAAGTTAáGTGGTAAGTTTAGT G ITT 1I GIG TTITATTTG AGGTC CO GGATG GGGT GC-TGGTGO AA ATG A AAGAAGTGGTGGTGAGTGGATGTTGCGTTTACTTCTAGGCCTGTAGGG AAGTOTTACITCTGCTCTAAAAGCTCCTGCAACAAGCTGGTCGACC j

Výsledný plasmid byl pDS<2AH spoj.

3) pDS fikl &,H spoj byl štěpen Sáli a konce zpracovány na tupo zpracováním s kohezivníni konci s 14 DNA polynerázou a dNTP. 820 bp fragment BanHI-BglII lidské ertyhropoietinovs cDNA byl na koncích natupo zpracován stejným postupem q ligován k plasmidů. Výsledný plasmid byl pDBG.

4) pDEG byl Štěpán s Kpnl a PvuII a na na tupo zpracováním s kohezivníni konci ^lasmid byl religován k deletovánému ex fragmentu zá vzniku plasmidů pDEG .

kosích zpracován mung beán” nuklcázou cisovánému Kpnl-PvuII

-38·

Plasmid pDTC Δ , obsahující /'Thr '^?/ erythropoietinovou cDNA byl transfektován do DHFR-defioientníoh CHO buněk. 770 ml kondiciováného media CHO buněk byl znkoncentrován za pou žití dělící membrány 10000 daltonů molekulové hmotnosti a diafiltrován proti 10 nul Tris-HCl, pH 8,6 aa celkový objem 34 ml. I7ml podíl koncentrátu byl nanesen na Q-Sepharosovou kolonu ε rychlým průtokem (5 ml objem náplně) ekvilibrovanou stojným pufrem a eluovár. lineárním gradientem 0-250 mM NaCl v 10 mí! Tris-HCl, plí 8,6. Podíly frakci z kolony, bu3 nezpracované nebo štěpené N-glykanázou, byly analyzovány SDS-PAGE nebo ICF a pocly (označená 2,3 a 4) byly připra-₍vény na bázi ísoformy a/nebo karbohydrátového složení frakcí. Každý pool byl nanesen na Vydac C4 kolonu (214TPB 2030, cm průměr, 1,8-2,5 ml objem náplně, 0,34 ml/min) a promyt dvěma objemy kolony ?!.<·· ethanolu v 10 mi Tris-HCl, pH 7,3. kolony byly eluovány lineárními yrvdienty 20-941· ethanolu, mi Tris, pH 7,3. Pooly byly připraveny, r.aředěny do 10 mi Tris-HCl, pH 7,3 a naneseny na Q-Sepkarosová kolony s rychlým pr tokem. Následujícím promýváním 10 mm Tris-HCl, p.T 7,3. byly vzorky eluovány 20 ml citrátem sodným, 250 mM NaCl, pE 7,0. čištěné /Thr* ^/ pooly byly analyzovány IEF a jsou uvedeny na obr. j. EPO analog je analyzován na in vivo biologickou aktivitu jak je popsáno výše (Cotes a spol., supra).

Vynález je popsán svými výhodnými provedeními, která však ni _vak vyná.l. z neomezují, naopak, jsou v něm z hrnuty různé modifikace a ekvivalenty v rámci připojených nároků, provedené v nejáirším rozsahu tak, že zahrnují všechny takové modifikace a ekvivalenty.

Claims

PATENTOVé NÁROKY

1 . Isoforma
2. Isoforma erythropřetinu.

\ erythropoietinu podle nároku 1, která je produktem exprese excgonní DNA sekvence v eukeryotní hostitelské buňce nehumár.ního původu.
3. Isoforma erytropoietinu podle nároku 1, která zahrnuje erythropoietin mající aminokyselinovou sekvenci 1-165 nebo 1-166 lidského erythropoietinu.
4. Isofcrme erythropcietinu podle nároku 1, mající specifický počet fislc-vých kyselin na molekulu erythropoietinu, tento počet j« volen ze skupiny 1-14.
5. Isoforma er.ythropoietinu podle nároku 1 mající více než 14 sialových kyse.in na molekulu erythropoietinu.
6. Isc^orns erythropcietinu podle nároku 1, mající 14 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
7. ^Ascforna erythropoietinu podle nároku 1, sející 13 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
8. Isoforma erythropoietinu podle nároku 1, mající 10 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.

5 · 1 'w Π i* Ti ii 2? V t, T^{1 r}' P«P 2 ·^ηΑ ? — IX Ό ^A 1 2. Γ⁵ nou eukaryotní hostitelskou, buňkou je .nároku 2, GdO buňka kdo uvede10. Farmaceutick sáhuje terapeuticky prostředek, vyznačující se tím, že obúčinné množství isoformy erythropoietinu

-40podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo nosič.
11. Prostředek, obsahující směs méně než 4 isoforem erythropoietinu.
12. Prostředek, obsahující směs isoforem erythropoietinu, mající méně než 12 sialových kyselin na molekulu ery thropoi eti nu.
13. Prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, Že obsahuje směs isoforem erythropoietinu mající 9, 10 a 11 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
14. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje směs isoforem erythropoietinu, mající více než 11 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
15. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že obsahuje směs isoforem erythropoietinu mající 13-14 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
16. Erythropoietin, obsahující v podstatě erythropoietinové molekuly, mající specifický počet sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.
17. Erythropoietin, obsahující v podstatě erythropoietinovs molekuly, mající specifický počet sialových kyselin na molekulu erythropoietinu, tento počet je vybrán ae sku— piny zahrnující 1-14.
18. Erythropoietin, zahrnující erythropoietinová molekuly mající více než 14 sialových kyselin na molekulu erythro poi etinu.

4119. F.rythrcp ietin podle nároku 15, mající 14 si šlových kyselin na molekulu erythrcpoictinu.

25. -rythropoíetin podle nároku 15, mající 13 siaiových kyselin na molekulu erythropoietinu.
21. Lrythropoistin podle nároku 16, mající 1 kyzelin na molekulu erythropoietinu.

si a..ov.ven

52. Lrythropoietin podle nároku 16, kle uvedenou molekulou jc. produkt exprese oxogenní DNA sekvence v eukaryotních hostitelských buňkách nehumán.íího povedu.

'3. Erythrcpoietin podle nároku 15, který má aminokyselinovou sekvenci lidského er threpoietinu.

4. Earmsccutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství erythrepoietinu podle nároku 15 s íarnaccuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo íi u o a. '3 *

ť~ X · rrostředsk, vyzn au„j- se tx^., že obsahuje směs molekul ery t hrcp o i e t inu, majících, méně než 4 ciaiové kyse- xiny na molekulu eryuhro psic· ti nu. 5-5 . Prostředek, vyzn Ji 10 X 4j £> v lim. ) ze obsahuje směs molekul ory thr c^cie tinu, UjiCi IleM'. Π£ ž 1 . .5 šimlových kyše lín na c .olekulu erythrop sd 1 Ví v íx Ji ·

27.

mol kul kyselin

i. los cj. zz.., vy ..v,...ri.j. e txα., ze ery uhrepoi etinu, majících! více než nu molekulu erythropcietinu.

bsukuje směs 11 siúlových

-4228. Prostředek podle nároku 27, vyznačující se tím, še obsahuje směs isoforem erythropoietinu, majících 13 až 14 sial.vých kyselin na molekulu erythropoietinu.

29. Způsob přípravy isoformy erythropoietinu, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně zpracování čištěného erythrepoistínu preparativní isoelekt r i o kou fo ku s a cí a eluce jednotlivé 5sofořev z gelu.

30. Způsob příprav;/ sm*si jící více než pr«2et^rminoven molekulu, vyznačující so tím, erythrepoietin, zpracuje 'ntovýměnneu chromátografií.

molekul erythropoietinu, maý počet si šlových kyselin na čo se materiál, obsahující

31. Způsob přípravy směsi molekul erythropoietinu, majících více než přede terminovaný počet sialových kyselin na molekulu, vyznačující se tím, že se materiál, obsahující erythrcpoietin, zpracuje chromatofokušení.

35. Způsob zvýšení hladiny hematokrýtů u savců, vyznačující se tím, že zahrnuje polání terapeuticky účinného množství prostředku podle nároku 26.

33.

piny

Analog lidského erythropoietinu, vybraný ze skurnu.? ic i /Asn⁶⁹/7P0, /Asn íer /Thr^1?5/SPC a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/?PO.

125

34. čištěná ··.’ izolovaná statě ΊΧ’ά sekvenci kódující sekvence, obsahující v pod o'g li dského erythropoietinu :ny z^£ skup i ny ishrr.u/ř /Α₃η^υ>/ΞΡ0, /Asn¹ ‘3 , Ser^ '^/ΞΡΟ, /Thr¹²^/FPO a /*^Jro¹²⁴, Thr‘“⁵/SPO.