ES2097753T5

ES2097753T5 - Isoformas de eritropoietina.

Info

Publication number: ES2097753T5
Application number: ES90311193T
Authority: ES
Inventors: Thomas Wayne Strickland; Thomas Edward Byrne; Steven George Elliott
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-12
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2010-10-12
Also published as: AU646822B2; ES2139764T3; CN1063796C; CZ291515B6; GR3032089T3; DE69033301D1; IL95971A0; PT95586A; NO912281D0; NZ235676A; JPH04502331A; CN1051936A; CZ291488B6; EP0668351A1; IL125175A; EP0428267A3; SK497290A3; JP3073905B2; JP2983629B2; ZA908166B

Abstract

SE EXPONEN LAS ISOFORMAS DE ERITROPOYETINA PROVISTAS DE UN NUMERO ESPECIFICO DE ACIDOS SIALICOS POR MOLECULA DE ERITROPOYETINA. TAMBIEN SE EXPONEN LAS MEZCLAS DE DICHAS ISOFORMAS, COMPUESTOS FARMACEUTICOS QUE LAS CONTIENEN O MEZCLAS DE LAS MISMAS Y METODOS PARA OBTENERLAS.

Description

Isoformas de eritropoietina.

La presente solicitud es en parte continuación de la solicitud US 421,444 presentada el 13 Octubre 1989, que se incorpora a modo de referencia. La presente invención se refiere a isoformas de eritropoietina o mezclas de las mismas, a los métodos para la preparación de isoformas específicas o mezclas de las mismas, a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas isoformas o mezclas de las mismas, y a métodos de tratamiento que utilizan dichas isoformas y composiciones.

La eritropoietina es una hormona de glucoproteína que interviene en la maduración de células progenitoras eritroides en eritrocitos. Es esencial para regular los niveles de glóbulos rojos en la circulación sanguínea. La eritropoietina natural es producida por el hígado durante la vida fetal y por el riñón de los adultos, y circula en la sangre, estimulando la producción de glóbulos rojos en la médula ósea. La anemia es casi siempre consecuencia de insuficiencia renal, debido a la disminución en la producción de eritropoietina por el riñón. Se ha comprobado que la eritropoietina recombinante producida por técnicas de ingeniería genética con la expresión de un producto de proteína de una célula anfitriona transformada con el gen de codificación de eritropoietina, era eficaz cuando se utilizaba en el tratamiento de la anemia resultante de la insuficiencia renal crónica.

Hasta hace muy poco, la disponibilidad de eritropoietina era muy limitada. Si bien la proteína está presente en la orina humana, los niveles excretados son demasiado reducidos para que pueda utilizarse como fuente práctica de eritropoietina para los usos terapéuticos. Los pacientes que presentan anemia aplásica tienen niveles elevados de eritropoietina urinaria, si se compara con personas sanas, si bien la pequeña cantidad de esta orina también hace que no se pueda recurrir a esta fuente. La purificación de la eritropoietina urinaria humana por Miyake et al., en J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977), utilizaba, como material de partida, orina procedente de personas con anemia aplásica.

La identificación, clonación y expresión de genes que codifican la eritropoietina se describen en la patente US 4,703,008 de Lin. En la patente US 4,667,016 de Lai et al., se describe la purificación de eritropoietina recombinante a partir de medio celular que apoyaba el crecimiento de células de mamífero que contenían plasmidos de eritropoietina recombinante, por ejemplo. La expresión y recuperación de eritropoietina recombinante, biológicamente activa, de células anfitrionas de mamífero que contienen el gen de la eritropoietina en plasmidos recombinantes ha hecho, por primera vez que se disponga de cantidades de eritropoietina suficientes para las aplicaciones terapéuticas. Además, el conocimiento de la secuencia génica y la disponibilidad de cantidades mayores de proteína purificada han contribuido a entender mejor la forma en que actúa esta proteína.

La actividad biológica de una proteína depende de su estructura. En particular, la estructura primaria de una proteína (es decir su secuencia de amino ácidos) proporciona información, que permite la formación de estructuras secundarias (por ejemplo una hélice o una hoja \beta) y terciarias (pliegue tridimensional global) por un polipéptido durante y después de su síntesis. La destrucción de estructuras secundarias y terciarias por la introducción de mutaciones o por tratamientos químicos o enzimáticos puede tener como resultado una reducción de la actividad biológica.

En los organismos procarióticos, las actividades biológicas de las proteínas se rigen en gran medida por las estructuras descritas anteriormente. A diferencia de las proteínas de las células procarióticas, muchas proteínas de superficie y secretoras de células producidas por células eucarióticas se modifican con uno o más grupos de oligo sacáridos. Esta modificación, que recibe el nombre de glicosilación, puede afectar en gran medida las propiedades físicas de las proteínas y puede ser también importante en la estabilidad de la proteína, la secreción y la localización sub-celular. Una glicosilación adecuada puede resultar esencial para la actividad biológica. De hecho, algunos genes de organismos eucarióticos, cuando se expresan en bacterias (p.e., E.coli) que carecen de procesos celulares para la glicosilación de proteínas, producen proteínas que presentan poca o ninguna actividad, debido a su falta de glicosilación.

La glicosilación se produce en lugares específicos del soporte del polipéptido y suele ser de dos tipos: los oligosacáridos ligados a O se unen a residuos de serina o treonina mientras que los oligo sacáridos ligados a N se unen a residuos de asparagina cuando forman parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier amino ácido salvo la prolina. Las estructuras de los oligosacáridos ligados a N y ligados a O y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se suele encontrar en ambos es el ácido N-acetil neuramínico (denominado en lo que sigue ácido siálico). El ácido siálico suele ser el residuo terminal de los dos oligosacáridos ligados a N y ligados a O y, debido a su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas a la glucoproteína.

Tanto la eritropoietina derivada de la orina humana como la eritropoietina recombinante (expresada en células de mamífero) que tiene la secuencia de amino ácidos 1-165 de la eritropoietina humana, contienen tres cadenas de oligoacáridos ligados a N y uno ligado a O, que comprenden juntos aproximadamente el 40% del peso molecular total de la glucoproteína. La glicosilación ligada a N, se produce en residuos de asparagina situados en las posiciones 24, 38 y 83 mientras que la glicosilación ligada a O se produce en un residuo de serinas situado en la posición 126 (Lai et al., J. Biol. Chem. 261 3116 (1986) Broudy et al., Arch. Biochem. Biophys. 265 329 (1988)). Se ha visto que las cadenas de oligosacáridos se modifican con residuos de ácido siálico terminales. El tratamiento enzimático de la eritropoietina glicosilada para quitar todos los residuos de ácido siálico tiene como consecuencia una pérdida de la actividad in vivo pero no afecta la actividad in vitro (Lowy et al., Nature 185, 102 (1960); Goldwasser et al., Biol. Chem. 249, 4202 (1974)). Este comportamiento se explica por la rápida depuración de la asialo eritropoietina de la circulación tras la interacción con la proteína que fija la asialo glucoproteína hepática (Morrell et al., J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Brig., et al., Am. J. Physiol 227, 1385 (1974) Ashwell et al., Methods Enzymol. 50, 287 (1978)). Por consiguiente, la eritropoietina posee actividad biológica in vivo únicamente si se ha "sialitado" para evitar su fijación por la proteína de fijación hepática.

El papel de los demás componentes en las cadenas de oligosacáridos de la eritropoietina no está bien definido. Se ha visto que la eritropoietina no glicosilada reduce en gran medida la actividad in vivo comparado con la forma glicosilada pero no conserva actividad in vitro (Dordal et al. Endocrinology 116, 2293 (1985); Lin patent, supra). En otro estudio sin embargo, la eliminación de cadenas de oligosacáridos ligados a N o ligados a O, individualmente o juntos, por mutagénesis de residuos de asparagina o serina, que son zonas de glicosilación, reduce fuertemente la actividad in vitro de la eritropoietina alterada que se produce en las células de mamíferos (Dube et al. J. Biol. Chem. 263,17516 (1998)).

Las glucoproteínas como la eritropoietina se pueden separar en formas cargadas de modo diferente utilizando técnicas como la concentración isoeléctrica (IEF). Se conocen varios informes de estudios de IEF sobre preparaciones de eritropoietina cruda y parcialmente purificada (Lukowsky et al., J. Biochem 50, 909 (1972); Shelton et al. Biochem. Med. 12, 45 (1975); Fuhr et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930 (1981)). En estos estudios se distinguieron por IEF, como mucho, tres o cuatro fracciones con actividad de la eritropoietina, no se caracterizó ninguna con respecto al contenido de carbohidratos. Además, no se estableció ninguna correlación entre los puntos isoeléctricos de las fracciones y su actividad biológica.

Durante la purificación de la eritropoietina urinaria de la orina humana, tratada en Miyake et al. supra, se mencionan dos fracciones de eritropoietina de la cromatografía de hidroxil apatita, designadas II y IIIA, que tienen al parecer la misma actividad específica. Un análisis ulterior de los carbo hidratos de las fracciones II y IIIA reveló que la fracción II tenia un contenido de ácido siálico medio superior al de la fracción IIIA (Dordal et al. supra).

Uno de los objetos de la presente invención es ofrecer isoformas de eritropoietina separadas y aisladas, que tengan un contenido de ácido siálico y una actividad biológica definidos. Las composiciones farmacéuticas que contienen dichas moléculas tienen al parecer virtudes terapéuticas.

La invención se refiere a isoformas de eritropoietina. También se presenta un método de preparación de una isoforma de eritropoietina, que comprende las etapas de someter la eritropoietina purificada a concentración isoeléctrica preparativa, y eluir una isoforma única del gel. También se presentan composiciones farmacéuticamente aceptables, que comprenden isoformas de eritropoietina. Esta invención también se refiere a métodos para aumentar los niveles de hematocritos en mamíferos, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente aceptable de estas composiciones, para aumentar la producción de reticulocitos y glóbulos rojos.

La invención se refiere a un método de preparación de una mezcla de moléculas de eritropoietina, que tienen un número de ácidos siálicos por molécula mayor que o alternativamente menor que un número predeterminado, que consiste en someter el material que contiene la eritropoietina a cromatografía de intercambio iónico. La invención también comprende un método de preparación de una mezcla de moléculas de eritropoietina con un número de ácidos siálicos por molécula superior o alternativamente inferior a un número predeterminado de ácidos, que consiste en someter un material que contiene eritropoietina a concentración cromatográfica.

La fig. 1 muestra un gel de concentración isoeléctrica analítica de las isoformas separadas de eritropoietina recombinante. Las vías de gel 1-11 muestran isoformas que van desde menos ácido (pl superior) en la vía 1 a más ácido (pl inferior) en la vía 11. También se muestra eritropoietina recombinante purificada que contiene una mezcla de isoformas 9-14 en las vías derecha e izquierda extremas del gel.

La fig. 2 muestra la relación entre el número de ácidos siálicos por isoforma de eritropoietina y la actividad específica in vivo de cada isoforma, expresada como unidades por mg de polipéptido de eritropoietina. En la fig. 2A, se determinó con el análisis de proteína Bradford la concentración de cada isoforma de eritropoietina; en 2B, se determinó la concentración por absorbencia a 280 nm, en 2C, la concentración se determinó por RIA.

La fig. 3 muestra un gel de concentración isoeléctrica analítica de mezclas definidas de isoformas de eritropoietina recombinante, preparado por cromatografía de intercambio aniónico en condiciones diferentes. Las vías de gel 1-6 representan, respectivamente, isoformas de eritropoietina eluidas en un lavado con mucha sal, después de lavar la columna de flujo lento Q-Sepharose con 150 mM de ácido acético, pH 4,7, 150 mM de ácido acético (sin tampón), 200 mM de ácido acético, pH 4,7, 250 mM de ácido acético, pH 4,7, 300 mM de ácido acético, pH 4,7 o 300 mM de ácido acético (sin tampón). También se muestra en la vía extrema izquierda del gel, eritropoietina recombinante purificada que contiene una mezcla de isoformas obtenida utilizando los procedimientos descritos en el ej. 2 de Lai et al., supra, con la diferencia de que la cromatografía DEAE-agarosa se sustituye por cromatografía Q-Sepharose.

La fig. 4 muestra la separación de isoformas de eritropoietina 8 a 12 conseguidas sometiendo medio acondicionado celular aplicado a una columna de Q-Sepharose, a un gradiente de pH decreciente y aumentando la resistencia iónica. Las partes de fracciones pares numeradas desde la Fracción 2 a la Fracción 40 se sometieron a concentración isoeléctrica analítica. También se muestra en la vía extrema izquierda del gel eritropoietina recombinante purificada que contiene una mezcla de isoformas obtenidas utilizando los procedimientos descritos en el Ej. 2 de Lai et al., supra, con la diferencia de que la cromatografía DEAE-agarosa se sustituye por cromatografía Q-Sepharose.

Según la presente invención, se presentan isoformas de eritropoietina. La concentración isoeléctrica (IEF) separa proteínas sobre la base de la carga. Cuando se sitúan en un gradiente de pH y se someten a un campo eléctrico, las proteínas migran hacia el punto en el que no tienen carga neta y permanecen ahí. Este es el punto isoeléctrico (pl) de la proteína. Cada banda distinta observada en IEF representa moléculas que tienen un pl particular y por consiguiente la misma carga global, y recibe el nombre de isoforma. El término "isoforma de eritropoietina" utilizado aquí se refiere a preparados de eritropoietina que tienen un solo pl y la misma secuencia de amino ácidos.

En una realización preferida, la eritropoietina es el producto de la expresión de una secuencia exógena de ADN, que ha sido transfectado en una célula anfitriona eucariótica no humana, es decir, en una realización preferida, la eritropoietina es "eritropoietina recombinante". La eritropoietina recombinante se produce ventajosamente según los procedimientos descritos en la patente US 4,703,008, de propiedad común de Lin, que se incorpora aquí a modo de referencia. La eritropoietina recombinante se purifica ventajosamente según los procedimientos generales descritos en el ej. 2 de la patente US 4,667,016, de los que son titulares Lai et al., que se incorporan aquí como referencia o alternativamente, el procedimiento descrito en el ej. 2 en el que la cromatografía DEAE-agarosa se sustituye por cromatografía Q-Sepharose. En la modificación de la columna Q-Sepharose, 55 mM NaCl sustituyen 25 mM NaCl en la solución tampón utilizada para llevar a la columna a un pH neutro, y 140 mM NaCl sustituyen 75 mM NaCl en la solución tampón utilizada para eluir eritropoietina de la columna. Este material, cuando se analiza por electrofóresis de gel de sodio dodecil sulfato poliacrilamida migra como una sola especie (es decir banda). Cuando se somete eritropoietina modificada a IEF, aparecen en el gel bandas múltiples, que indican que se encuentran presentes formas cargadas diferentemente de la glucoproteína.

Se ha visto que las isoformas separadas de eritropoietina recombinante, que tienen la secuencia de amino ácidos de la eritropoietina humana derivada de la orina, corresponden a moléculas de eritropoietina que tienen de 1 a 14 ácidos siálicos, y cada isoforma presente en eritropoietina recombinante purificada tiene una actividad in vivo relacionada con el número de ácidos siálicos que posee la isoforma. El término "eritropoietina" utilizado aquí incluye eritropoietinas naturales, eritropoietina humana derivada de la orina así como polipéptidos no naturales que tienen una secuencia de amino ácidos y una glicosilación suficientemente duplicativa de la eritropoietina natural para que pueda tener propiedades biológicas in vivo que favorecen el incremento, por parte de las células de la médula ósea, de la producción de reticulocitos y glóbulos rojos.

Las preparaciones crudas de eritropoietina tienen muchas isoformas pero el material purificado p.e., en la patente de Lai et al. anterior, ej. 2, contiene predominantemente seis isoformas cuando se analiza por IEF. Además, se ha detectado por lo menos una isoforma adicional de mayor acidez utilizando los procedimientos cromatográficos descritos en el ej. 4 (esta forma más ácida, que migra a >14 ácidos siálicos sobre un gel IEF puede contener cargas negativas de ácido no siálico como lo muestra la resistencia de alguna de las cargas a la digestión por sialidasa). Estas isoformas difieren entre sí por su contenido en ácido siálico. Como se puede ver en los ejemplos, esto se demuestra aislando 10 de estas isoformas por medio de IEF preparativo y determinando el contenido de ácido siálico de 5 de las mismas. Se ha visto que de las isoformas sometidas a análisis para determinar el contenido de ácido siálico, cinco de las mismas contenían 9, 10, 11, 12 ó 13 residuos de ácido siálico.

Existe una relación entre la actividad específica relativa in vivo de la eritropoietina y el número de residuos de ácido siálico por molécula de eritropoietina de las isoformas 5 a 11 (cada una de las isoformas se designa aquí por el número de ácidos siálicos por molécula de eritropoietina). Las isoformas 11 a 14 tienen aproximadamente la misma actividad específica relativa in vivo. Se analiza la actividad in vivo de las isoformas 5-14 mediante el bioanálisis de ratón exhipóxico policitémico y la cantidad de cada isoforma presente se determina mediante el análisis de proteína Bradford, la absorbencia a 280 nm o por radioinmunoanálisis (RIA) de eritropoietina. Las determinaciones de RIA (Egrie et al., Immunobiology 172, 213, (1986)), expresadas como unidades/ml, se dividen por 212,770 unidades/mg de polipéptido de eritropoietina, la actividad específica media de eritropoietina purificada determinada por RIA, dan concentraciones de proteína de isoformas aisladas o mezclas de isoformas expresadas como mg de polipéptido de eritropoietina/ml. Como se muestra en los ejemplos, las actividades específicas relativas in vivo aumentan gradualmente de la isoforma 5 a la isoforma 11 (véase cuadro 2).

Las actividades específicas in vivo aquí mencionadas son medidas de las actividades específicas relativas in vivo y no son medidas de las actividades específicas absolutas in vivo. A los efectos de la presente aplicación, las actividades específicas se utilizan únicamente para comparar actividades relativas de isoforma que han sido analizadas utilizando el mismo ensayo, utilizando las mismas condiciones, inclusive la misma norma interna, el mismo tipo de animales, con el mismo análisis de los datos utilizados para calcular la actividad específica, el mismo análisis para determinar el contenido de proteína. No se pretende que ningún valor de la actividad específica in vivo obtenido para una isoforma represente un valor inherente o absoluto de dicha isoforma.

La invención presenta isoformas de eritropoietina. Las isoformas de eritropoietina específicas, obtenidas según la presente invención y sus propiedades, pueden variar según la fuente del material de partida. Por ejemplo, las isoformas de eritropoietina humana derivada de la orina son diferentes a las isoformas de eritropoietina recombinante. En una realización preferida, la invención se refiere a una isoforma de eritropoietina que tiene un número específico (es decir un número fijo mayor que cero) de ácidos siálicos por molécula de eritropoietina, número elegido dentro del grupo 1-14. Ventajosamente dicho número es 9, 10, 11, 12, 13 ó 14. En otra realización, dicho número es superior a 14, ventajosamente 16-23.

La invención también ofrece composiciones que comprenden dos o más isoformas de eritropoietina. En una realización, las composiciones comprenden una mezcla de isoformas con un número de ácidos siálicos por molécula de eritropoietina superior a un número predeterminado, es decir superior a 11 ácidos siálicos por molécula de eritropoietina, o superior a 12 ácidos siálicos por molécula, p.e. una mezcla de isoformas 12, 13 y 14. En otra realización, las composiciones comprenden mezclas de isoformas que tienen un número predeterminado de ácidos siálicos por molécula de eritropoietina, menos de 12, aunque más de 8 ácidos siálicos por molécula como p.e. en una mezcla de isoformas 9, 10 y 11. La invención también presenta composiciones de isoformas de eritropoietina en las que las cantidades relativas de las isoformas son iguales o diferentes. Por ejemplo, una mezcla de isoformas 9, 10 y 11 puede tener las isoformas presentes en una diversidad de proporciones como: 1:1:1, 2:3:1 ó 20:20:1.

Ventajosamente, las composiciones comprenden mezclas de menos de cuatro isoformas, p.e. una mezcla de isoformas 11, 12 y 13, ó una mezcla de 12 y 14 ó de 7 y 13.

Con el objeto de producir mezclas de isoformas de eritropoietina, la presente invención ofrece también métodos para aislar simultáneamente isoformas de eritropoietina. Estos métodos incluyen el aislamiento de isoformas individuales por medio de técnicas tales como la concentración isoeléctrica preparativa o la preparación de mezclas de isoformas que tienen un número determinado de ácidos siálicos por molécula (p.e. más de 11) mediante técnicas como la cromatografía de intercambio fónico o la concentración cromatográfica. Todas estas técnicas se basan en la separación de proteínas según la carga.

En general, la cromatografía de intercambio fónico y la concentración cromatográfica supone la aplicación de eritropoietina humana natural (medios acondicionados de célula) o material purificado, a una resina de columna, en condiciones que permiten fijar algunas o todas las isoformas de la eritropoietina a la resina. Para las preparaciones de eritropoietina natural es preferible aplicar la proteína a la columna a aproximadamente pH 7, mientras que para preparaciones purificadas, la proteína se puede aplicar a la columna desde pH 7 hasta pH 4. Después de lavar la columna con tampón a aproximadamente pH 4, las isoformas de eritropoietina que permanecen unidas sobre la columna de intercambio fónico se eluyen incrementando el pH y la concentración salina del tampón o aplicando un gradiente de pH decreciente y aumentando la resistencia fónica a aproximadamente pH 4. Para la concentración cromatográfica, las isoformas se eluyen de la columna mediante un gradiente de pH decreciente o lavando la columna con una elevada concentración de sal.

En una realización, la invención se refiere a células anfitrionas de mamífero (p.e. ovario de hámster chino, CHO) que sintetizan preferentemente isoformas de eritropoietina con un número de ácidos siálicos superior a cierto número específico, p.e. superior a 10 ácidos siálicos por molécula. Las moléculas de eritropoietina tienen estructuras de oligosacáridos ligados a N ó ligados a O que pueden limitar el contenido de ácido siálico de la molécula. Por ejemplo, los oligosacáridos ligados a N tetra-antenarios (de cuatro ramificaciones) suelen proporcionar cuatro posibles zonas para la unión de ácido siálico, mientras que las cadenas de oligosacáridos bi- y tri-antenarias que pueden sustituir la forma tetra antenaria en zonas ligadas a la asparagina, suelen tener como mucho solamente dos o tres ácidos siálicos unidos. Los oligosacáridos ligados a O suelen proporcionar dos zonas para la fijación de ácido siálico. Por consiguiente, las moléculas de eritropoietina pueden acomodar un total de 14 residuos de ácido siálico, con tal de que los tres oligosacáridos ligados a N sean tetra-antenarios. Se criban cultivos celulares de mamífero para determinar aquellas células que añaden de preferencia cadenas tetra-antenarias a eritropoietina recombinante, maximizando el número de zonas para la fijación de ácido siálico.

Los oligosacáridos ligados a N de eritropoietina urinaria contienen ácido siálico en una unión de \alpha 2,3 y \alpha 2,6 con galactosa (Takeuchi et al. J. Biol. Chem. 263, 3657 (1988)). Por lo general, el ácido siálico en el enlace \alpha 2,3 se añade a galactosa sobre la ramificación \alpha 1.6 de manosa y el ácido siálico en el enlace \alpha 2,6 se añade a la galactosa en la ramificación \alpha 1,3 de manosa. Las enzimas que añaden estos ácidos siálicos (\beta-galactósido \alpha 2,3 sialiltransferasa y \beta-galactósido \alpha 2,6 sialiltransferasa) presentan eficacia máxima al añadir ácido siálico a las ramificaciones manosa \alpha 1,6 y manosa \alpha 1,3 respectivamente.

Las células de ovario de hámster chino (CHO) con déficit de dihidrofolato reductasa (DHFR) suelen ser una célula anfitriona, habitualmente utilizada para la producción de glucoproteínas recombinantes, inclusive eritropoietina recombinante. Estas células no expresan la enzima \beta-galactósido \alpha 2,6 sialiltransferasa y, por consiguiente, no añaden ácido siálico en el enlace \alpha 2,6 a oligosacáridos ligados a N de glucoproteínas producidas en estas células. (Mutsaers et al. Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Takeuchi et al. J. Chromatogr. 400, 207 (1987). Por consiguiente, la eritropoietina recombinante producida en células CHO carece de ácido siálico en el enlace 2.6 a galactosa (Sasaki et al. (1987), supra; Takeuchi et al. (1987), supra). En otra realización de la invención, la eritropoietina utilizada para producir las isoformas se produce en células CHO transfectadas con un gen funcional de \beta-galactósido \alpha 2,6 sialiltransferasa para permitir la incorporación de ácido siálico en el enlace \alpha 2,6 a galactosa. Véase Lee et al. J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989), que se incorpora aquí a modo de referencia y descripción de técnicas para la creación de células CHO modificadas u otras células anfitrionas de mamífero.

En la invención también se describen ciertos análogos de eritropoietina humana. Tal como se utiliza aquí, la expresión "análoga de eritropoietina humana" se refiere a eritropoietina con uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos de eritropoietina humana, que se traduce en un aumento del número de zonas para la fijación de ácido siálico. Los análogos son generados por mutagénesis, dirigidos a zonas que tienen adiciones, deleciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que alteran las zonas disponibles para la glicosilación. Estos análogos tienen un número de cadenas de carbohidrato mayor que la eritropoietina humana.

Los análogos que se traducen en una actividad biológica mayor se construyen aumentando el contenido de ácido siálico de la molécula de eritropoietina. Los análogos que tienen niveles de ácido siálico superiores a los encontrados en la eritropoietina humana se generan añadiendo zonas de glicosilación que no perturban la conformación secundaria o terciaria requerida para la actividad biológica. De forma ventajosa, el análogo de eritropoietina humana tiene 1, 2 ó 3 zonas adicionales para la glicosilación N ó la glicosilación O. Por ejemplo, una leucina en posición 69 es sustituida por una asparagina para dar la secuencia Asn-Leu-Ser, que sirve de cuarta zona para la glicosilación N. Este cambio suele proporcionar hasta cuatro ácidos siálicos adicionales por molécula.

Como ejemplos de otros cambios que generan glicosilación N u O adicional se pueden citar las alaninas en las posiciones 125 y 127 para asparagina y serina respectivamente, alanina en la posición 125 para treonina y alaninas en posiciones 124 y 125 para prolina y treonina, respectivamente. Según podrán apreciar los técnicos en la materia, la descripción incluye otros muchos análogos de eritropoietina humana con zonas adicionales para la glicosilación.

La invención también comprende composiciones farmacéuticas con una cantidad terapéuticamente eficaz de una isoforma específica o mezcla de isoformas junto con un diluyente, un adyuvante y/o un vehículo adecuados, útiles en la terapia de eritropoietina. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" como aquí se indica, se refiere a la cantidad que proporciona efecto terapéutico en una condición y en un régimen de administración determinado. La administración de isoformas de eritropoietina se realiza por lo general por vías parenterales. La vía específica elegida dependerá de la enfermedad tratada. La administración de isoformas de eritropoietina se realiza de preferencia como parte de una formulación que contiene un vehículo adecuado, como albúmina de suero humano, un diluyente adecuado, como una solución salina tampón y/o un adyuvante adecuado. Las dosis requeridas serán cantidades suficientes para aumentar los hematocrito del paciente y variarán según la gravedad de la enfermedad que se trata, el método de administración utilizado y similares.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar de forma más completa la invención aunque no se tienen que interpretar como limitación del ámbito de la misma. La eritropoietina standard utilizada en los bio-análisis in vivo utilizados en los ejemplos es una eritropoietina recombinante standard normalizada respecto de un standard de eritropoietina urinaria purificada. Por consiguiente, sólo se miden actividades específicas in vivo relativas. Las actividades específicas in vivo se expresan también en "unidades/ml", "unidades/mg" y unidades/A_{280}" y no como "IU/ml" "IU/mg" y IU/A_{280}", ya que el standard de eritropoietina utilizado no ha sido correlacionado directamente con ningún standard internacional existente.

Ejemplo 1 Aislamiento de isoformas de eritropoietina recombinantes

La eritropoietina recombinante se produce en la forma descrita en Lin, supra. La eritropoietina recombínante utilizada como material de partida para el primer y el tercer aislamiento de isoforma se purifica según el procedimiento descrito en el ejemplo 2, cuyos titulares son Lai et al. El material de partida para el segundo y el quinto aislamiento de isoformas se purifica según Lai et al., supra utilizando la modificación de cromatografía Q-Sepharose. Estas preparaciones contienen una mezcla de isoformas de eritropoietina recombinante que tienen la misma secuencia de aminoácidos que la eritropoietina humana derivada de la orina y contienen predominantemente isoformas 9 a 14. El material de partida para la cuarta preparación de isoformas es el material que se eluye durante el lavado de 5 mM ácido acético/1 mM glicina/6M urea de la columna de intercambio aniónico del ej. 2 de Lai et al. Esta fracción contiene isoformas en un número inferior o igual a 9 ácidos siálicos y se ha seguido purificando por cromatografía de filtración de gel según se describe en el ej. 2 de Lai et al, antes de utilizarla en el procedimiento de concentración isoeléctrica preparativa. La sexta preparación de isoforma utilizaba como material de partida una preparación purificada de eritropoietina recombinante que tiene de 4 a 13 residuos siálicos. Este material se purificó según el ej. 2 de Lai et al., con la excepción de una modificación en la columna de intercambio iónico (elusión de la eritropoietina recombinante con un gradiente de cloruro sódico a pH 8,4 y omisión del lavado ácido acético/urea) que tiene como resultado la retención de la mayoría de las isoformas presentes en el material de partida.

Se realizan seis preparaciones diferentes de isoformas individuales mediante concentración isoeléctrica preparativa en un lecho de gel granulado (Ultrodex, LKB) esencialmente según Nota de Aplicación de LKB 198. Se utilizan Pharmalyte (Pharmacia) 2.5-5 amfolitos (Pharmacia) y el lecho de gel contiene 5 M urea.

En la primera preparación se aplican al gel aproximadamente 20 mg de eritropoietina recombinante en 6,8 ml de 20 mM citrato sódico/100 mM cloruro sódico, pH 7,0 y se concentran a 8 vatios durante aproximadamente 16 horas. Después de la concentración isoeléctrica, se visualizan las bandas de isoforma en el gel mediante una impresión de contacto en papel del lecho de gel. La impresión se hace y luego se fija impregnando en tres cambios (aproximadamente 10 min. cada uno, temperatura ambiente) de solución de fijación (40% metanol/10 ácido acético/10% TCA/3,5% ácido sulfosalicílico), se someten a un cambios (aproximadamente 10 min.) de 40% metanol/10% ácido acético (30-60°C), se colorea durante 15 minutos a 60°C en 0,125% Coomassie Blue R-250/40% metanol/10% ácido acético, y luego se descolora en 7,5% de metanol/10% ácido acético con el objeto de visualizar las isoformas separadas. Se quita la región del lecho de gel granulado que contiene las isoformas (aproximadamente 50% de la resina), se añade agua (aproximadamente 16 ml), y se vierte la mezcla espesa en una bandeja de 5,5 x 24,5 pulgadas y se evapora hasta un peso neto de aproximadamente 40 g. Esta preparación se concentra una segunda vez y se realiza la forma indicada anteriormente en una impresión de contacto del lecho del gel. La parte de gel que contiene cada una de las seis isoformas discernibles se quita del lecho de gel.

Con el fin de eluir las isoformas del gel, se añade una solución de 10 mM Tris-HCl, pH 7,0/5 mM Chaps a cada isoforma para generar una mezcla espesa. Las pastas se colocan en pequeñas columnas y se lavan con el tampón Tris-Chaps. Se recogen lo que ha pasado a través y se aplica por separado pequeñas columnas (configuración de columna abierta) que contienen Vydac C4 resina de fase invertida equilibrada en 20% etanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Las columnas se desarrollan gradualmente con 20% de etanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 35% etanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0 y 65% etanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Se diluye 1:1 con 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 la fracción eluyente a 65% de etanol/10 mM Tris y se somete a concentración y luego se cambia el tampón por 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 utilizando un microcentrador Centricon-10 (Amicon). La concentración isoeléctrica analítica de esta preparación se realiza prácticamente en la forma descrita en la Nota Técnica LKB 250 utilizando Servalyte 3-5 amfolinas (Serva) en un gel de poliacrilamida que contiene 5 M de urea.

En una segunda preparación, se aplican aproximadamente 26 mg de eritropoietina recombinante en 6,5 ml de agua desionizada al gel y se concentra a 2,5 vatios durante 35 min. y 10 vatios durante aproximadamente 17 horas. Las bandas de proteína concentrada, que son visibles en el lecho de gel, se quitan para formar 11 grupos diferentes. Cada grupo se lleva hasta 7,5 ml con agua desionizada y 20 ml de cada uno de los sobrenadantes resultantes del grupo se somete a concentración isoeléctrica analítica según lo descrito anteriormente. A cada uno de los grupos se añaden 5 ml de 1,5 mM Tris-HCl, pH 8,8 y los lodos se colocan cada uno en pequeñas columnas, dejando que pase a través de las mismas la fase líquida. La resina se lava con aproximadamente 3 volúmenes de 0,5 M Tris-HCl, pH 7 y la solución de enjuague se combina con lo que pasa a través. La resina se lava con aproximadamente 3 volúmenes de 0,5 M Tris-HCl, pH 7 y la solución de enjuague se combina con lo que pasa a través. Los eluyentes se concentran y cambian de tampón a 20 mM citrato sódico/100 mM cloruro sódico, pH 7,0 utilizando dispositivos de ultrafiltración de un solo uso Amicon, que tienen un umbral de peso molecular de 10.000 dalton. Las soluciones concentradas (aproximadamente 0,5 ml) se hacen pasar entonces a través de un filtro de acetato de celulosa de un umbral de 0,22 \mu. Sobre la base de la concentración isoeléctrica analítica, se observa que 5 grupos contienen predominantemente las isoformas individuales 10, 11, 12, 13 y 14.

En una tercera preparación, se aplica aproximadamente 30 mg de eritropoietina recombinante en 21,8 ml de agua destilada al gel y se concentra a 2 vatios durante 25 min., 10 vatios durante 20 horas y 15 vatios durante 15 min. Se observan visualmente las bandas de proteína correspondientes a las isoformas individuales y se quitan del lecho de gel. Se añade agua destilada a las isoformas aisladas en el gel para generar una pasta y se analizan los sobrenadantes resultantes por concentración isoeléctrica analítica. Se añade un volumen igual de 1 M Tris-HCl, pH 7.2 a cada pasta, se colocan las suspensiones en pequeñas columnas separadas y se deja que la fase líquida pase a través de la columna para eluir las isoformas. Se concentra lo que ha pasado a través y se cambia de tampón, 20 mM citrato sódico/100 mM cloruro sódico, pH 7,0 utilizando dispositivos de ultrafiltración desechables Amicon que tienen un umbral de peso molecular de 10.000 dalton. Un gel de concentración isoeléctrica analítica reveló que se obtenían grupos que contenían predominantemente las isoformas individuales 9, 10, 11, 12, 13 y 14.

Una cuarta preparación de isoforma utilizaba como material de partida eritropoietina que contenía isoformas 3-9 (preparadas en la forma descrita anteriormente). Antes de realizar la concentración isoeléctrica preparativa prácticamente en la forma descrita para las preparaciones 1-3 anteriores, se pre-fraccionaron los amfolitos (Pharmalyte 2,5-5) en un Rotofor (Bio-Rad, Richmond, CA) célula de concentración isoeléctrica de fase líquida, para obtener una gama de amfolitos más adecuadas para los puntos isoeléctricos inferiores del material de partida. El pre-fraccionamiento se realizó mezclando 6,7 mL de Pharmalyte 2,5-5 con 15 g de urea y añadiendo agua purificada para llevar el volumen a 50 ml. Esta mezcla se fraccionó en el Rotofor a 10 vatios, 1°C durante 5 1/2 horas utilizando ácido fosfórico 0,1 M e hidróxido sódico 0,1 M como anolito y catolito, respectivamente. Las fracciones de amfolito que tenían pH medidos entre 4,5 y 6 aproximadamente se utilizaron en la concentración isoeléctrica de lecho plano.

Se quitaron amfolitos de las isoformas utilizando un Centrieluter (Amicon, Danvers, MA) y un Centricon (Amicon) de un umbral de peso molecular de 10.000 utilizando los siguientes parámetros: 0,18 tampón Tris pH 8,8, 100 voltios, 25-30 mA, durante 3 horas. Las isoformas intercambiaron tampón en cloruro sódico 0,1 M por filtración de gel utilizando Sephadex G-25 (Pharmacia). La concentración isoeléctrica analítica de los 5 grupos resultantes mostró que contenían isoformas 4, 5, 6, 7 y 8. La isoforma 4 apareció con diversas bandas, indicando que puede haber experimentado cierta degradación.

La quinta preparación de isoforma se modificó añadiendo una etapa de preconcentración al procedimiento de concentración isoeléctrica de lecho plano. En esta modificación, no se añadió la proteína a la mezcla de amfolito/urea/gel antes de la electrofóresis sino que se añadió al aparato de concentración isoeléctrica tras la generación del gradiente pH en el lecho de gel. Tras la pre-concentración durante 75 min. (1500 voltios/hora), se quitó la sección de lecho de gel de 2,25-4,25 cm del cátodo, se mezcló con la solución de eritropoietina y se volvió a añadir al lecho de gel. Tras la concentración isoeléctrica, se eluyeron del lecho de gel isoformas 10, 11, 12, 13 y 14 y se separaron de los amfolitos por ultrafiltración utilizando dispositivos Centricon-10 (Amicon).

La modificación de pre-concentración se realizó para hacer que las características de absorbencia ultravioleta de las preparaciones de isoformas fueran más similares a las de la eritropoietina recombinante inicial. Esta mejora en la característica espectral se puede ver en la proporción de absorbencia en 280 y 260 nm para las isoformas aisladas. La proporción media de absorbencia en 280 nm respecto de 260 nm (A280/A260) para isoformas de las preparaciones 2 y 3 (no pre-concentradas) es 1,36 \pm 0,11 mientras que la proporción media A280/A260 para la preparación 5 y 6 (pre-concentrada) es de 1,68 \pm 0,20. Cuando se excluyó la isoforma número 14 del cálculo, las relaciones medias A280/A260 son de 1,39 \pm 0,11 y 1,74 \pm 0,09 para las preparaciones 2 y 3 y 5 y 6, respectivamente. (La isoforma 14 puede tener el espectro más atípico, ya que está presente en las cantidades más pequeñas y está por lo tanto más sujeto a interferencias por contaminación de traza de componentes de amfolito o porque está más cerca del electrodo durante el procedimiento de concentración isoeléctrica de lecho plano). La relación media A280/A260 para eritropoietina recombinante preparada según el ej. 2 de Lai et al (modificada según lo descrito anteriormente utilizando Q-Sepharose como resina de intercambio aniónico) es de 1,91 \pm 0,04.

Según lo descrito anteriormente, el material inicial para la preparación de isoformas n° 6 era una preparación de eritropoietina recombinante que contenía las isoformas 4-13. Los amfolitos se pre-concentraron en el aparato Rotofor tal como se hizo en la cuarta preparación. Se utilizaron fracciones de amfolitos que tenían pH medidos comprendidos entre 3,7 y 4,8 para la concentración isoeléctrica de lecho plano. El lecho plano se pre-concentró como en la pasada n° 5 y se obtuvieron las isoformas 9, 10, 11, 12 y 13 después de ultrafiltración (Centricon-10) para quitar los amfolitos portadores.

Ejemplo 2 Contenido de ácido siálico de isoformas de eritropoietina recombinante

Las isoformas aisladas en la forma descrita en el ej. 1 y la eritropoietina purificada según los procedimientos descritos en Lai et al, supra (mezclas de isoformas 9 a 14) cambian de tampón, cloruro sódico 0,10-0,15 M y se analiza su contenido de ácido siálico mediante una modificación del procedimiento de Jourdian et al. J. Biol. Chem. 246, 430 (1971). Los residuos de ácido siálico se separan de las glucoproteínas por hidrólisis con ácido sulfúrico 0,35 M a 80°C durante 30 min. y las soluciones se neutralizan con hidróxido sódico antes del análisis. Para estimar la cantidad de proteína eritropoietina presente, se realiza, en la forma standard un análisis de proteína Bradford (Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) utilizando eritropoietina recombinante que tiene la secuencia de amino ácidos de la eritropoietina standard utilizando los reactivos de análisis y el procedimiento del micro-método facilitado por Bio-Rad. Los resultados, expresados como moles de ácidos siálicos por mol de eritropoietina se muestran en el cuadro 1. Las isoformas se designan según el número de ácidos siálicos por molécula y van desde menos ácida (isoforma 9) a más ácida (isoforma 13). En las vías de gel 6-10 de la fig. 1 se muestran las isoformas 9-13. Las cantidades de isoformas 14 son insuficientes para medir de forma precisa el contenido de ácido siálico. El contenido de ácido siálico de esta isoforma se deduce de su migración en geles IEF con respecto a otras isoformas. El contenido de ácido siálico de isoformas 5-8 (preparación n° 4) no se ha medido, aunque se deduce probablemente de su migración en geles IEF.

CUADRO 1

Isoforma de eritropoietina	Moles de ácido siálico/mol de eritropoietina
Isoforma 13	12,9 \pm 0,5
Isoforma 14	11,8 \pm 0,2
Isoforma 11	11,0 \pm 0,2
Isoforma 10	9,8 \pm 0,3
Isoforma 9	8,9 \pm 0,3
Mezcla de isoformas (9-14)	11,3 \pm 0,2

Ejemplo 3 Actividad de isoformas de eritropoietina recombinante

Las isoformas aisladas según se describe en el ej. 1 se someten a análisis de absorbencia a 280 nm, con el análisis de proteína Bradford y RIA para la eritropoietina, con el objeto de determinar la cantidad de eritropoietina recombinante presente. Se utiliza el bioanálisis de ratón exhipóxico policitémico (Cotes et al. Nature 191, 1065 (1961)) para determinar la actividad biológica relativa in vivo. La cuantificación de la cantidad de eritropoietina proteína presente utilizando un radio-inmunoanálisis para eritropoietina dio resultados que presentaban una actividad específica relativa in vivo más elevada para ciertas isoformas, debido una aparente reducción de inmuno-reactividad de isoformas que contenían grandes cantidades de ácido siálico, lo cual conducía a una infra evaluación de la concentración de eritropoietina y por consiguiente una sobre evaluación de la actividad relativa específica in vivo para las isoformas más negativas. Las determinaciones del bioanálisis de ratón, expresadas como unidades/ml se dividen por las concentraciones de proteína correspondientes para dar las actividades específicas in vivo expresadas como unidades/mg eritropoietina polipéptido. Estas actividades específicas se muestran en el cuadro 2. En el cuadro 2, "n" es el número de preparaciones de isoformas independientes que contribuyen al valor de la actividad específica. En la mayoría de los casos se realizaron varios análisis in vivo sobre cada preparado de isoforma. Los mismos datos in vivo contribuyen a los cálculos de la actividad específica para las tres columnas; las unidades/mg de eritropoietina polipéptido se determinaron por la absorbencia a 280 nm, a partir de potencias de radioinmunoanálisis o de resultados del análisis de proteína Bradford. Se utilizó eritropoietina recombinante purificada que contenía isoformas 9-14 como standard en el análisis de proteína Bradford. "n" puede ser inferior para el cálculo realizado utilizando el análisis de proteína Bradford, ya que algunos preparados ya no se encontraban disponibles en el momento en que se realizaron los análisis Bradford.

La eritropoietina purificada según los procedimientos descritos en Lai et al., supra y que contienen una mezcla de isoformas 9 a 14 se utiliza como standard para los análisis RIA y los análisis in vivo.

Las actividades específicas relativas expresadas como unidades/mg de eritropoietina polipéptido se pueden convertir a unidades/A_{280} multiplicando por 0,807 mg eritropoietina polipéptido/A_{280}. El factor de conversión se obtiene multiplicando el coeficiente de extinción de eritropoietina (1,345 mg/A280) por el contenido de proteína de la eritropoietina glucoproteína (aproximadamente 60% en peso, Davis et al., Biochemistry 26, 2633 (1987)) para obtener mg eritropoietina polipéptido/A_{280} (es decir 1,345 mg eritropoietina/A_{280} x 0,60 polipéptido/mg eritropoietina = 0,807 mg polipéptido/A_{280}). Además se pueden multiplicar actividades específicas expresadas como unidades/mg de eritropoietina polipéptido por el factor 0,60 mg polipéptido/mg eritropoietina glucoproteína para obtener actividades específicas expresadas como unidades/mg eritropoietina glucoproteína.

CUADRO 2

1

Los datos del cuadro 2 se presentan también gráficamente en las figs. 2A, 2B y 2C. Estos datos muestran que la actividad relativa in vivo de la eritropoietina aumenta en función del contenido de ácido siálico hasta la isoforma n° 11. Las isoformas 11-14 tienen prácticamente la misma bioactividad relativa in vivo. (Esto se ve claramente cuando la concentración de isoforma 14 se expresa utilizando el valor del análisis Bradford. El valor Bradford puede ser más preciso para la isoforma 14 debido a los niveles, generalmente bajos, obtenidos y a la dificultad resultante en la determinación de A_{280} y la reducción muy aparente de reactividad en el RIA de formas muy negativas tratadas anteriormente). La mayor actividad específica relativa in vivo de las isoformas de eritropoietina que tienen más ácidos siálicos se debe con toda probabilidad a una semi-vida de circulación más larga de estas formas. Las isoformas 9 y 13 se marcaron con yodo radioactivo (^{125}I) y se determinó su tasa de aclaramiento en ratas. La semi-vida en circulación fue notablemente más larga para isoforma 13 que para la isoforma 9.

Ejemplo 4 Selección de mezclas de isoforma de eritropoietina recombinante por cromatografía O-Sepharose

Se concentran medios acondicionados celulares procedentes de la producción de eritropoietina recombinante según los procedimientos descritos en Lin, supra y se diafiltran contra 10 mM Tris, pH 7.2. Se determina la concentración de proteína por el análisis de microproteína Bradford utilizando como standard, albúmina de suero bovino. 19,6 ml de la solución que contiene 40 mg de proteína total se hace 20 \muM en CuSO_{4}, se filtra a través de un filtro de valor discriminatorio de 0,45 micras y se carga sobre una columna de 4 ml de volumen de lecho (1,05 cm de altura x 2,2 cm de diámetro) concentrado con Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) que se ha equilibrado con 10 mM Tris, pH 6,8 a 7,0 a 4°C. Después de la aplicación de la muestra, se lava la columna con dos volúmenes de columna del mismo tampón. El caudal de la columna es de aproximadamente 1 ml/min. Se instalan seis columnas separadas que utilizan este procedimiento para elegir mezclas de isoforma de eritropoietina definidas.

Se lavan las columnas con 6 a 9 volúmenes de columna de un tampón de bajo pH constituido por: columna n° 1, 150mM de ácido acético, 1 mM glicina, 20 \muM CuSO_{4}, 6 M urea ajustada a pH 4,7 con NaOH; col. n° 2, 200 mM ácido acético, 1 mM glicina, 20 \muM CuSO_{4}, 6 M urea ajustada a pH 4,7 con NaOH; col. n° 3, 250 mM ácido acético, 1 mM glicina, 20 \muM CuSO_{4}, 6 M urea ajustada a pH 4,7 con NaOH; col. n° 4, 300 mM ácido acético, 1 mM glicina, 20 \muM CuSO_{4}, 6 M urea ajustada a pH 4,7 con NaOH; col. n° 5, 150 mM ácido acético, 1 mM glicina, 20 \muM CuSO_{4}, 6 M urea; col. n° 6, 300 mM ácido acético, 1 mM glicina, 20 \muM CuSO_{4}, 6 M urea. El pH de las columnas se aumenta hasta aproximadamente pH 7 lavando cada una con 8 a 11 volúmenes de columna de 10 mM Tris-HCl, 55 mM NaCl, 20 \muM CuSO_{4}, pH 7. Las mezclas de isoforma de eritropoietina definida se eluyen de las columnas lavando con 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 \muM CuSO_{4}, pH 7.0.

Los grupos de isoformas eluidas de cada columna se concentran y se cambia el disolvente por agua utilizando un micro concentrador Amicon Centricon-10. Los resultados de la concentración isoeléctrica analítica de estos grupos concentrados se muestran en la fig. 3. Las vías de gel 1-6 representan mezclas de isoforma de eritropoietina definida eluidas de la columna 1, 5, 2, 3, 4 y 5 respectivamente. La "mezcla de isoforma" mostrada en la vía de gel más a la izquierda de la fig. 3 representa el medio celular que se aplica a una columna Q-Sepharose según lo descrito anteriormente, se lava la columna con 5 mM ácido acético, 1 mM glicina, 20 \muM CuSO_{4}, 6 M de urea y la mezcla de isoforma de eritropoietina se eluye de la columna utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Esta mezcla eluida de isoformas se sigue purificando según los procedimientos descritos en Lai et al., supra antes de la concentración isoeléctrica analítica.

Ejemplo 5 Fraccionamiento de isoformas de eritropoietina recombinante utilizando un gradiente de pH bajo sobre O-Se-pharose

En otro procedimiento, se separan isoformas de eritropoietina utilizando un gradiente de pH decreciente y resistencia iónica creciente. La eritropoietina dia-filtrada concentrada que contiene el medio se carga en una columna de Q-Sepharose con una proporción de aproximadamente 40 mg total de proteína/ml de gel. La columna se lava entonces con aproximadamente 2 volúmenes de columna de 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 y luego aproximadamente 10 volúmenes de columna de 2 mM ácido acético/1 mM glicina, 20 \muM CuSO_{4}, 6 M urea (pH aproximado 4,8) para quitar las proteínas contaminantes y las isoformas de eritropoietina que contienen menos de aproximadamente 7 residuos de ácido siálico. Las isoformas que contienen de 8 a 12 ácidos siálicos aproximadamente se eluyen de la columna utilizando un gradiente que comienza aproximadamente en 2 mM ácido acético en 6 M urea/1 mM glicina/20 \mum CuSO_{4} y llega hasta 40 mM ácido acético/6 M urea/1 mM glicina, 20 \muM CuSO_{4} (pH aproximado 4). El volumen total del gradiente es de aproximadamente 40 volúmenes de columna y se recogen fracciones de aproximadamente 1 volumen de columna cada una en recipientes que contienen 1 volumen de tampón Tris suficiente para llevar al pH a 6-8,5, con el fin de evitar la exposición durante largo tiempo de las fracciones recogidas a un pH bajo. Se someten partes de las fracciones a concentración isoeléctrica analítica para controlar y seguir la separación. La fig. 4 muestra la separación de isoformas 8-11 que se puede realizar con este procedimiento. Las isoformas 12-14 que permanecen unidas a la columna al final del gradiente se eluyen lavando con un tampón que consta de 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 \muM CuSO_{4} (pH 7,0). Las isoformas (separadas durante el gradiente o eluidas por la solución de cloruro sódico) se liberan de proteínas contaminantes por cromatografía de fase inversa seguida de cromatografía por filtración de gel tal como se describe en el ej. 2 de Lai et al.

Claims

1. Método de preparación de una isoforma de eritropoietina, biológicamente activa, método que comprende el aislamiento de una isoforma de eritropoietina biológicamente activa que tiene un solo punto isoeléctrico y un número específico de ácidos siálicos por molécula de eritropoietina, número que se elige dentro del grupo formado por
1 a 14.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la citada isoforma es el producto de la expresión de una secuencia de ADN exógena en una célula anfitriona eucariótica no humana.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la citada isoforma comprende eritropoietina que tiene la secuencia de amino ácidos de la eritropoietina humana 1-165 ó 1-166.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la citada isoforma tiene 14 ácidos siálicos por molécula de eritropoietina.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la citada isoforma tiene 13 ácidos siálicos por molécula de eritropoietina.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la citada isoforma tiene 10 ácidos siálicos por molécula de eritropoietina.

7. Método según la reivindicación 2, en el que la citada célula anfitriona eucariótica es una célula CHO.

8. Método de preparación de una composición farmacéutica, método que comprende la combinación de una cantidad terapéuticamente eficaz de una isoforma de eritropoietina, preparada según la reivindicación 1, con un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Método de preparación de eritropoietina, que consiste esencialmente en preparar moléculas de eritropoietina biológicamente activas que tienen un número idéntico de ácidos siálicos por molécula, eligiéndose dicho número dentro del grupo formado por 1 a 14.

10. Método según la reivindicación 9, en el que hay 14 ácidos siálicos por molécula de eritropoietina.

11. Método según la reivindicación 9, en el que hay 13 ácidos siálicos por molécula de eritropoietina.

12. Método según la reivindicación 9, en el que hay 10 ácidos siálicos por molécula de eritropoietina.

13. Método según la reivindicación 9, en el que dicha molécula es el producto de la expresión de una secuencia de ADN exógena en una célula anfitriona eucariótica no humana.

14. Método de preparación de una composición farmacéutica, método que comprende la combinación de una cantidad terapéuticamente eficaz de eritropoietina, preparada según el método de la reivindicación 9, con un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Método de preparación de una isoforma de eritropoietina según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes: someter una eritropoietina purificada a una concentración isoeléctrica preparativa y eluir una sola isoforma del gel.

16. Método de preparación de una mezcla de isoformas de eritropoietina que tienen un número predeterminado de ácidos siálicos por molécula, siendo dicho número superior a 11, en el que se somete material que contiene eritropoietina a cromatografía de intercambio iónico.

17. Método de preparación de una mezcla de isoformas de eritropoietina que tiene un número predeterminado de ácidos siálicos por molécula, siendo dicho número superior a 11, en el que se somete un material que contiene eritropoietina a concentración cromatográfica.

18. Método de obtención de una composición de eritropoietina que tiene un número predeterminado de ácidos siálicos por molécula, que comprende la preparación de una mezcla de dos o más isoformas de eritropoietina, preparadas según el método de la reivindicación 1, en el que dicha mezcla consta esencialmente de por lo menos dos isoformas, que tienen menos de 12 ácidos siálicos por molécula, o donde dicha mezcla consta esencialmente de isoformas de eritropoietina que tienen 9, 10 y 11 ácidos siálicos por molécula, o donde dicha mezcla consta esencialmente de por lo menos dos isoformas que tienen más de 11 ácidos siálicos por molécula.

19. Método de la reivindicación 18, en el que dicha mezcla consta esencialmente de isoformas de eritropoietina que tienen 13 y 14 ácidos siálicos por molécula.

20. Método según la reivindicación 18, que se usa en un método para aumentar el nivel de hematocrito en mamíferos.

21. Método según la reivindicación 19, en el que dicha eritropoietina tiene la secuencia de amino ácidos de la eritropoietina humana.