NO301832B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en isoform av erythropoietin - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en spesifikk isoform av erythropoietin.

Erythropoietin er et glycoproteinhormon involvert

ved modningen av erythroide stamceller til erythrocytter. Hormonet er vesentlig ved regulering av nivåer av røde blodceller i sirkulasjon. Naturlig forekommende erythropoietin produseres av leveren under fosterstadiet og av, nyrene hos voksne og sirkulerer i blodet og stimulerer produksjonen av røde blodceller i benmarg. Anemi er nesten utelukkende en konsekvens av nyresvikt som skyldes redusert produksjon av erythropoietin fra nyren. Rekombinant erythropoietin produsert ved hjelp av genteknologi som involverer ekspresjon av et proteinprodukt fra en vertcelle transformert med genet som koder for erythropoietin, er funnet å være effektivt ved behandling av anemi som resulterer fra kronisk nyresvikt.

Inntil nylig har tilgjengeligheten av erythropoietin vært meget begrenset. Selv om proteinet er til stede i human urin, er utskilte nivåer for lave for å gjøre dette til en praktisk kilde for erythropoietin for terapeutisk anvendelse. Pasienter som lider av aplastisk anemi, oppviser for-høyede nivåer av erythropoietin i urinen i forhold til friske individer, men begrensede tilførsler av denne urin gjør også en slik kilde upraktisk. Rensingen av humant erythropoietin fra urin av Miyake et al. i J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977), anvendte som startmateriale, urin fra aplastisk anemiske individer.

Identifisering, kloning og ekspresjon av gener som koder for erythropoietin, er beskrevet i US patentskrift nr. 4.703.008 av Lin. En beskrivelse av rensing av rekombinant erythropoietin fra cellemedium som understøttet veksten av pattedyrceller inneholdende rekombinante erythropoietin- plasmider, er f.eks. beskrevet i US patentskrift nr. 4.667.016 av Lai et al. Ekspresjon og gjenvinning av biologisk aktivt rekombinant erythropoietin fra pattedyrcelleverter inneholdende erythropoietingenet på rekombinante plasmider, har for første gang gjort egnede mengder erythropoietin tilgjengelig for terapeutiske anvendelser. I tillegg har kunnskap om gen-sekvensen og tilgjengeligheten av større mengder renset protein ført til en bedre forståelse av virkningsmåten for dette protein.

Den biologiske aktivitet av et protein er avhengig av dets struktur. Spesielt tilveiebringer den primære struktur av et protein (dvs. dets aminosyresekvens) informasjon som tillater dannelse av sekundære strukturer (f.eks. a-heliks eller |3-plate) og tertiære strukturer (total tredimensjonal folding) av et polypeptid under og etter dets syntese. Sammenbrudd av korrekte, sekundære og tertiære strukturer ved innføring av mutasjoner eller ved kjemiske eller enzymatiske behandlinger kan føre til en reduksjon i biologisk aktivitet.

I prokaryote organismer er de biologiske aktiviteter av proteiner for en stor del regulert av strukturene beskrevet ovenfor. I motsetning til proteiner fra prokaryote celler er mange celleoverflateproteiner og sekretoriske proteiner produsert av eukaryote celler, modifisert med én eller flere oligosaccharidgrupper. Denne modifikasjon, referert til som glycosylering, kan dramatisk påvirke pro-teiners fysikalske egenskaper og kan også være viktige for proteinstabilitet, utskillelse og subcellulær lokalisering. Korrekt glycosylering kan være vesentlig for biologisk aktivitet. Noen gener fra eukaryote organismer når de er uttrykt i bakterier (f.eks. E. coli) som mangler cellulære prosesser for glycosylering av proteiner, gir da også proteiner som gjenvinnes med liten eller ingen aktivitet på grunn av deres mangel på glycosylering.

Glycosylering foregår på spesifikke steder langs den primære polypeptidkjede og er vanligvis av to typer: 0-forbundne oligosaccharider er bundet til serinrester eller threoninrester, mens N-forbundne oligosaccharider er bundet til asparaginrester når de er del av sekvensen Asn-X-Ser/Thr hvor X kan være enhver aminosyre med unntak av prolin. Strukturene av N-forbundne og O-forbundne oligosaccharider og sukkerrestene funnet i hver type, er forskjellige. En type sukker som vanligvis finnes på begge typer oligosaccharider, er N-acetylneuraminsyre (i det etterfølgende referert til som sialinsyre). Sialinsyre er vanligvis den terminale rest av både N-forbundne og O-forbundne oligosaccharider, og på grunn av dens negative ladning, kan gi syreegenskaper til glycoproteinet.

Både erythropoietin fra human urin og rekombinant erythropoietin (uttrykt i pattedyrceller) inneholdende aminosyresekvensen 1-165 i humant erythropoietin, inneholder tre N-forbundne og én O-forbundet oligosaccharidkjede som til-sammen omfatter tilnærmet 40% av den totale molekylvekt av glycoproteinet. N-forbundet glycosylering forekommer ved asparaginrester lokalisert ved posisjonene 24, 38 og 83, mens O-forbundet glycosylering forekommer ved en serinrest lokalisert ved posisjon 126 (Lai et al., J. Biol. Chem. 261, 3116' (1986); Broudy et al., Arch. Biochem. Biophys. 265,

329 (1988)). Oligosaccharidkjedene er vist å være modifisert med terminale sialinsyrerester. Enzymatisk behandling av glycosylert erythropoietin for å fjerne alle sialinsyrerester fører til et tap av in vivo aktivitet, men påvirker ikke in vitro aktivitet (Lowy et al., Nature 185, 102 (1960); Goldwasser et al., J. Biol. Chem. 249, 4202 (1974)). Dette er blitt forklart ved at asialoerythropoietin hurtig fjernes fra sirkuleringen ved interaksjon med det hepatiske asialo-glycoprotein-bindingsprotein (Morrell et al., J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs et al., Am. J. Physiol. 227, 1385

(1974); Ashwell et al., Methods Enzymol. 50, 287 (1987)). Erythropoietin har således biologisk aktivitet in vivo kun når det er sialylert for å unngå dets binding med det hepatiske bindingsprotein.

De andre komponenters rolle i erythropoietinets oligosaccharidkjeder er ikke veldefinert. Det er vist at ikke-glycosylert erythropoietin har meget redusert in vivo aktivitet sammenlignet med den glycosylerte form, men at det beholder in vitro aktivitet (Dordal et al., Endocrinology 116, 2293 (1985); Lin patent, supra). I en annen undersøk-else medfører imidlertid fjerning av N-bundne eller O-bundne oligosaccharidkjeder alene eller sammen, ved hjelp av muta-genese av asparaginrester eller serinrester som er glycosyleringsseter, en markert reduksjon i in vitro aktivitet av det endrede erythropoietin som produseres i pattedyrceller (Dube et al., J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988)).

Glycoproteiner som erythropoietin, kan adskilles i forskjellige ladede former ved anvendelse av teknikker som isoelektrisk fokusering (IEF). Flere grupper har rapportert IEF-undersøkelser av urensede og delvis rensede erythropoietinpreparater (Lukowsky et al., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shelton et al., Biochem. Med. 12, 45 (1975); Fuhr et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 98_, 930 (1981)). Høyst tre eller fire fraksjoner med erythropoietinaktivitet ble adskilt ved hjelp av IEF i disse undersøkelser, og ingen fraksjoner blekarakterisertmed hensyn til carbohydratinnhold. I tillegg ble det ikke utført noen korrelasjon mellom de isoelektriske punkter for fraksjonene og deres biologiske aktivitet.

Under rensingen av erythropoietin fra human urin diskutert i Miyake et al., supra, ble to erythropoietinfrak-sjoner fra hydroxylapatittkromatografi betegnet II og HIA, rapportert å ha den samme spesifikke aktivitet. En etter-følgende carbohydratanalyse av fraksjonene II og HIA av-slørte at fraksjon II hadde et høyere gjennomsnittlig sialinsyreinnhold enn fraksjon HIA (Dordal et al. , supra) .

Det er et mål for foreliggende oppfinnelse å til-veiebringe adskilte og isolerte isoformer av erythropoietin med et definert sialinsyreinnhold og biologisk aktivitet. Farmasøytiske blandinger inneholdende slike molekyler, vil

ha terapeutisk verdi.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en isoform av erythropoietin, kjennetegnet ved at det isoleres en isoform av erythropoietin med et enkelt isoelektrisk punkt og inneholdende et spesifikt antall sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl, hvor antallet er fra 10-14.

Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for fremstilling av et erythropoietinpreparat, kjennetegnet ved at den omfatter fremstilling av en blanding av mindre enn 4 erythropoietin-isoformer med et sialinsyreinnhold på mellom 10 og 14.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser en analytisk isoelektrisk fokuseringsgel av de adskilte isoformer av rekombinant erythropoietin. Gelfelt 1-11 viser isoformer varierende fra mindre sure (høyere pl) i bane 1 til mer sure (lavere pl), i bane 11. Renset, rekombinant erythropoietin inneholdende en blanding av isoformer 9-14, er også vist i gelfeltene ytterst til venstre og ytterst til høyre. Figur 2 viser forholdet mellom antall sialinsyrer pr. erythropoietin-isoform og den spesifikke aktivitet in vivo av hver isoform uttrykt som enheter pr. mg erythropoietin-polypeptid. I figur 2A ble konsentrasjonen av hver erythropoietin-isoform bestemt ved hjelp av Bradford-proteinbestemm-elsen; i 2B ble konsentrasjonen bestemt ved hjelp av absorpsjon ved 280 nm, i 2C ble konsentrasjonen bestemt ved hjelp av RIA. Figur 3 viser en analytisk isoelektrisk fokuseringsgel av definerte blandinger av rekombinante erythropoietin-isoformer fremstilt ved anionbyttekromatografi under forskjellige betingelser. Gelfelt 1-16 representerer hhv. erythropoietin-isoformer eluert i en vaskefraksjon med høyt saltinnhold etter vask av "Q-Sepharose fast flow"-kolonnen med 150 mM eddiksyre, pH 4,7, 150 mM eddiksyre (ubufret) , 200 mM eddiksyre, pH 4,7, 250 mM eddiksyre, pH 4,7, 300 mM eddiksyre, pH 4,7 eller 300 mM eddiksyre (ubufret). Renset, rekombinant erythropoietin inneholdende en blanding av isoformer som erholdt ved anvendelse av fremgangsmåter beskrevet i eksempel 2 av Lai et al., supra, med unntak av at DEAE-agarosekromatografi er erstattet med Q-Sepharose-kromatografi, er også vist i gelens ytterste venstre felt. Figur 4 viser adskillelse av erythropoietin-isoformer 8 til 12 erholdt ved at cellekondisjonert medium påført en kolonne av Q-Sepharose, underkastes en gradient med synkende pH og økende ionestyrke. Aliquoter fra partallsnummererte fraksjoner fra fraksjon 2 til fraksjon 40 ble underkastet analytisk, isoelektrisk fokusering. Renset, rekombinant erythropoietin inneholdende en blanding av isoformer erholdt ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 2 av Lai et al., supra, med unntak av at DEAE-agarosekromatografi er erstattet med Q-Sepharose-kromatografi, er også vist i gelens ytterste venstre felt. Figur 5 viser aminosyresekvensen av humant erythropoietin. Kvadrater indikerer asparaginrester til hvilke carbohydratkjeder er festet, og stjerner indikerer threoninrester og serinrester modifisert med carbohydrat. Ytterligere glycosyleringsseter tilveiebrakt i analogene av eksempel 6, er indikert ved mutasjoner for asparagin, serin og threonin. Figurene 6A, 6B og 6C viser serien av kloningstrinn anvendt ved dannelse av plasmider for oppbygning og analyse av analoger til humant erythropoietin. Disse analoger har endrede aminosyrer som vist i figur 5 som tilveiebringer ytterligere glycosyleringsseter. Figur 7 viser en Western blot-analyse av COS-celle-supernatanter av human erythropoietinsekvens og indikerte erythropoietinanaloger. Analogene [Asn<9>, Ser<11>] EPO, [Asn<69>] EPO, [Asn125, Ser127] EPO og [Pro<1>24,Thr<125>]EPOer opp-1 p c 19 7 bygget som beskrevet i eksempel 6. Analogene [Pro , Thr ] EPO, [Asn<126>, Ser<128>] EPO og [Thr125, Ser127]EPO som ikke inneholder ytterligere carbohydratkjeder, er vist som sammenligning.

Figur 8 viser en Western blot-analyse av COS-celle-supernatanter av humane erythropoietinsekvenser og indikerte erythropoietinanaloger etter behandling med N-glycanase. Analogene [Thr<125>] EPO og [Pro1<24>,Thr<125>]EPOer oppbygget som beskrevet i eksempel 6. Analogene [Val<126>] EPO, [Pro<124>] EPO, [Pro<125>] EPO, [Thr<127>] EPO, [Pro<125>,Ser<127>]EPO og

[Thr<125>, Ser<127>] EPO er vist som sammenligning.

Figur 9 viser en isoelektrisk fokuseringsgel av frak-sjonskombinasjonene 2, 3 og 4 erholdt ved Q-Sepharose-kromatografi og C4 revers-fase-kromatografi av cellemedium som understøttet veksten av CHO-celler transfektert med erythropoietin cDNA inneholdende [Thr<1>25]-mutasjonen. Renset, rekombinant erythropoietin inneholdende en blanding av isoformer og erholdt ved anvendelse av fremgangsmåter beskrevet i eksempel 2 av Lai et al., supra, med unntak av at DEAE-agarosekromatografi er erstattet med Q-Sepharose-kromatografi, er også vist i gelens venstre og høyre felt.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes isoformer av erythropoietin. Isoelektrisk fokusering (IEF) adskiller proteiner på basis av ladningen. Ved plassering i en pH-gradient og påføring av et elektrisk felt vil proteiner vandre til det punkt hvor de ikke har noen nettoladning og forbli der. Dette er det isoelektriske punkt (pl) for proteinet. Hvert distinkt bånd observert på IEF, representerer molekyler som har en spesiell pl og derfor den samme totale ladning, og er betegnet en isoform. Betegnelsen "erythropoietin-isof orm" som anvendt heri, refererer til erythropoietin'preparater med en enkel pl, og med den samme aminosyresekvens.

I en foretrukket utførelsesform er erythropoietinet produktet av ekspresjonen av en eksogen DNA-sekvens som er transfektert inn i en ikke-human, eukaryotisk vertcelle, dvs.

i en foretrukket utførelsesform er erythropoietinet "rekombinant erythropoietin". Rekombinant erythropoietin fremstilles fortrinnsvis i overensstemmelse med fremgangsmåtene beskrevet i US patentskrift nr. 4.703.008, herved inkorporert ved referanse. Rekombinant erythropoietin renses fortrinnsvis ifølge de generelle fremgangsmåter beskrevet i eksempel 2 i US patentskrift nr. 4.667.016, herved inkorporert ved referanse, eller alternativt ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2 hvori DEAE-agarosekromatografi er erstattet med Q-Sepharose-kromatografi. Ved modifikasjonen av Q-Sepharose-kolonnekromatografien erstatter 55 mM NaCl 25 mM NaCl i bufferløsningen som anvendes for å bringe kolonnen til nøy-tral pH, og 140 mM NaCl erstatter 75 mM NaCl i bufferløs-ningen som anvendes for å eluere erythropoietin fra kolonnen. Dette materiale, når det analyseres ved hjelp av natrium-dodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese, vandrer som en enkel forbindelse (dvs. bånd). Når renset erythropoietin

underkastes IEF, vises mange bånd i gelen, noe som indikerer at forskjellige ladede former av glycoproteinet er til stede.

Det er funnet at adskilte isoformer av rekombinant erythropoietin med samme aminsyresekvens som urin-avledet, humant erythropoietin, tilsvarer erythropoietinmolekyler med fra 1-14 sialinsyrer, og hver isoform som er til stede i renset, rekombinant erythropoietin, har en aktivitet in vivo som har sammenheng med antall sialinsyrer i isoformen. Betegnelsen "erythropoietin" som anvendt heri, innbefatter naturlig forekommende erythropoietin, urin-avledet, humant erythropoietin, såvel som ikke-naturlig forekommende polypep-tider med en aminosyresekvens og glycosylering som er tilstrekkelig lik naturlig forekommende erythropoietin for å til-late besittelse av biologiske egenskaper in vivo til å forår-sake benmargceller til å øke produksjon av reticulocytter og røde blodceller.

Urensede preparater av erythropoietin har mange isoformer, men renset materiale, f.eks. som i patentet av Lai et al., supra, eksempel 2, inneholder overveiende seks isoformer når det analyseres med IEF. I tillegg er det påvist minst én ytterligere isoform med høyere surhetsgrad ved anvendelse av de kromatografiske fremgangsmåter beskrevet i eksempel 4.

(Denne surere form som vandrer til et punkt på en IEF-gel som tilsvarer >14 sialinsyrer, kan inneholde negative ladninger som ikke skyldes sialinsyrer som vist ved resistensen av noe av ladningen overfor sialidaseoppslutning). Disse isoformer skiller seg fra hverandre ved sialinsyreinnhold. Som vist i eksemplene, demonstreres dette ved å isolere 10 av disse isoformer ved hjelp av preparativ IEF og bestemmelse av sialinsyreinnholdet i fem av isoformene. Av isoformene analysert med hensyn til sialinsyreinnhold, er det funnet at de fem isoformer inneholdt enten 9, 10, 11, 12 eller 13 sialinsyrerester.

Det foreligger et forhold mellom erythropoietinets relative, spesifikke aktivitet in vivo og antall sialinsyrerester pr. erythropoietinmolekyl fra isoformene 5 til 11

(hver isoform er heri betegnet ved antall sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl). Isoformene 11 til 14 har tilnærmet den samme relative, spesifikke aktivitet in vivo. Isoformene

5-14 er analysert for aktivitet in vivo ved hjelp av den ekshypoksiske, polycytemiske muse-bioanalysebestemme1se, og mengden av hver tilstedeværende isoform er bestemt ved hjelp av Bradford-proteinanalyse, absorpsjon ved 280 nm eller ved radioimmunanalyse (RIA) for erythropoietin. RIA-bestemm-elser (Egrie et al., Immunobiology r72, 213 (1986)), uttrykt som enheter/ml, divideres med 212.770 enheter/mg erythropoietin-polypeptid, den gjennomsnittlige, spesifikke aktivitet av renset erythropoietin som bestemt ved hjelp av RIA, for å gi proteinkonsentrasjoner av isolerte isoformer eller isoformblandinger, uttrykt som mg erythropoietin-polypeptid/ml. Som vist i eksemplene, øker de relative, spesifikke aktiviteter in vivo fra isoform 5 til isoform 11 (se tabell 2).

De spesifikke aktiviteter in vivo referert til heri, er målinger av relative, spesifikke aktiviteter in vivo og er ikke målinger av absolutte, spesifikke aktiviteter in vivo. For formålene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes de spesifikke aktiviteter kun for å sammenligne relative aktiviteter av isoformer som er analysert ved anvendelse av den samme analysebestemmelse, ved anvendelse av de samme betingelser inkludert den samme interne standard, den samme type dyr, med den samme analyse av de anvendte data for å beregne spesifikk aktivitet, den samme analyse for bestemmelse av protein-innhold. Det er ikke ment at noen verdi for spesifikk aktivitet in vivo rapportert for noen isoform, representerer en iboende eller absolutt verdi for denne isoform.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isoformer av erythropoietin. De spesifikke isoformer av erythropoietin erholdt i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, og deres egenskaper, kan variere avhengig av kilden for startmaterialet. Isoformene av urin-avledet, humant erythropoietin er f.eks. forskjellig fra isoformene av rekombinant erythropoietin. I en foretrukket utførelsesform angår oppfinnelsen en isoform av erythropoietin med et spesifikt antall (dvs. et fast antall større enn 0) sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl, idet antallet er utvalgt fra 10-14.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også blandinger omfattende to eller flere erythropoietin-isoformer.

I én utførelsesform omfatter blandingene en blanding av iso- 14. I en annen utførelsesform omfatter blandingene blandinger av isoformer med et forhåndsbestemt antall sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl, f.eks. mindre enn 12, men former med et større antall sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl enn et forhåndsbestemt antall, f.eks. mer enn 11 sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl, eller mer enn 12 sialinsyrer pr. molekyl, f.eks. en blanding av isoformer 12, 13 og mer enn 10 sialinsyrer pr. molekyl, som i f.eks. en blanding av isoformer 10 og 11.

Fortrinnsvis omfatter blandingene blandinger med mindre enn fire isoformer, f.eks. en blanding av isoformer 11, 12 og 13, eller en blanding av 12 og 14, eller en blanding av 7 og 13.

Blandinger av erythropoietin-isoformer kan fremstilles ved anvendelse av fremgangsmåter for isolering av utvalgte erythropoietin-isoformer samtidig. Disse fremgangsmåter innbefatter isolering av individuelle isoformer ved hjelp av teknikker som preparativ, isoelektrisk fokusering eller fremstilling av blandinger av isoformer med et forhåndsbestemt antall sialinsyrer pr. molekyl (f.eks. mer enn 11) ved hjelp av teknikker som ionebytterkromatografi eller fokuserings-kromatografi. Alle disse teknikker har som basis adskillelse av proteiner etter ladning.

Generelt innbefatter ionebyttekromatografi og fokuser-ingskromatografi påføring av enten urenset, humant erythropoietin (cellekondisjonert medium) eller renset materiale på en kolonneharpiks under betingelser som tillater binding av noen eller alle erythropoietin-isoformene til harpiksen.

For urensede erythropoietinpreparater er det foretrukket å påføre proteinet på kolonnen ved en pH på tilnærmet 7, mens for rensede preparater kan proteinet påføres på kolonnen ved pH-verdier fra 7 til tilnærmet 4. Etter vask av kolonnen

med buffer ved pH 4 elueres de erythropoietin-isoformer som forblir bundet til ionebytterkolonnen, ved å øke pH og salt-konsentrasjonen av bufferen, eller ved å påføre en gradient med synkende pH og økende ionestyrke ved pH 4. For fokuser-

ingskromatografi elueres isoformene fra kolonnen ved hjelp av en gradient med synkende pH, eller ved vask av kolonnen med en høy konsentrasjon av salt.

Én utførelsesform av oppfinnelsen angår pattedyr-vertceller (f.eks. fra kinesisk hamsterovarium, CHO) som fortrinnsvis syntetiserer erythropoietin-isoformer med mer enn et spesifikt antall, f.eks. mer enn 10, sialinsyrer pr. molekyl. Erythropoietinmolekyler har N-bundne eller 0-bundne oligosaccharidstrukturer som kan begrense sialinsyreinnholdet av molekylet. Firearmede (fire-forgrenede), N-bundne oligosaccharider tilveiebringer f.eks. vanligvis fire mulige seter for sialinsyretilknytning, mens toarmede og trearmede oligosaccharidkjeder som kan erstatte den firearmede form ved asparagin-bundne seter, har vanligvis høyst tilknyttet to eller tre sialinsyrer. 0-bundne oligosaccharider tilveiebringer vanligvis to seter for sialinsyretilknytning. Erythropoietinmolekyler kan således romme totalt 14 sialinsyrerester forutsatt at alle tre N-bundne oligosaccharider er firearmede. Pattedyrcellekulturer screenes for de celler som fortrinnsvis tilfører firearmede kjeder til rekombinant erythropoietin, og derved maksimaliseres antall seter for sialinsyretilknytning.

De N-bundne oligosaccharider i erythropoietin fra urin inneholder sialinsyre i både en a 2,3-binding og en a 2,6-binding til galactose (Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 263, 3657 (1988)). Sialinsyren i a 2,3-bindingen adderes typisk til galactose på mannose a 1,6-forgreningen, og sialinsyren i a 2,6-bindingen adderes til galactosen på mannose a 1,3-forgreningen. Enzymene som adderer disse sialinsyrer ([3-galactosid a 2,3-sialyltransf erase og |3-galactosid a 2,6-sialyltransferase) er mest effektive ved addering av sialinsyre til hhv. mannose a 1,6- og mannose a 1,3-forgreningene.

Dihydrofolatreduktase (DHFR)-manglende kinesisk hamsterovarium (CHO)-celler er vanlig anvendte vertceller for produksjon av rekombinante glycoproteiner innbefattet rekombinant erythropoietin. Disse celler uttrykker ikke enzymet (3-galactosid a 2,6-sialyltransferase og adderer derfor ikke sialinsyre i oc 2,6-bindingen til N-bundne oligosaccharider i glycoproteiner produsert i disse celler. (Mutsaers et al., Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Takeuchi et al., J. Chroma-togr. 400, 207 (1987)). Rekombinant erythropoietin produsert i CHO-celler, mangler følgelig sialinsyre i 2,6-bindingen til galactose (Sasaki et al. (1987), supra; Takeuchi et al. (1987), supra). I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse fremstilles erythropoietinet som anvendes for å produsere isoformene, i CHO-celler som er transfektert med et funk-sjonelt (3-galactosid a 2,6-sialyltransf erasegen for å gi inkorporering av sialinsyre i en a 2,6-binding til galactose. Se Lee et al., J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989), herved inkorporert ved referanse, for en beskrivelse av teknikker til dannelse av modifiserte CHO-celler eller andre mammalske vertceller.

De følgende eksempler gir en nærmere illustrasjon av oppfinnelsen. Den anvendte erythropoietinstandard i eksemplenes in vivo bioanalysebestemmelser er en rekombinant erythropoietinstandard som ble standardisert mot en delvis renset erythropoietinstandard fra urin. Det er således kun målt relative in vivo spesifikke aktiviteter. De in vivo spesifikke aktiviteter uttrykkes dessuten i "enheter/ml", "enheter/mg" og "enheter/A280" og ikke som "IU/ml", "IU/mg"

og "IU/AOQ ", fordi den anvendte erythropoietinstandard ikke er direkte korrelert med noen eksisterende, internasjonal standard.

Eksempel 1; Isolering av rekombinant erythropoietin-isoformer

Rekombinant erythropoietin fremstilles som beskrevet

i Lin, supra. Rekombinant erythropoietin anvendt som startmateriale for isoleringer av den første og tredje isoform, renses i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2 ifølge US patentskrift nr. 4.667.016 av Lai et al., supra. Startmateriale for isolering av den andre og tredje isoform renses i overensstemmelse med Lai et al., supra,

under anvendelse av modifikasjonen av Q-Sepharose-kromatografi. Disse preparater inneholder en blanding isoformer av rekombinant erythropoietin med den samme aminosyresekvens som

urin-avledet, humant erythropoietin, og inneholder hovedsakelig isoformer 9 til 14. Startmateriale for fremstilling av den fjerde isoform er materialet som eluerer under vaske-prosedyren med 5 mM eddiksyre/1 mM glycin/6M urea av anion-byttekolonnen i eksempel 2 ifølge Lai et al. Denne fraksjon inneholder isoformer med færre enn eller lik 9 sialinsyrer og ble ytterligere renset ved gelfiltreringskromatografi som beskrevet i eksempel 2 ifølge Lai et al. forut for anvendelse i prosedyren for preparativ, isoelektrisk fokusering. Fremstilling av den sjette isoform anvendte som startmateriale et renset preparat av rekombinant erythropoietin med fra 4 til 13 sialinsyrerester. Dette materiale ble renset som i eksempel 2 ifølge Lai et al., med unntak av at betingelsene for ionebyttekolonnen ble modifisert (eluering av det rekombinante erythropoietin med en natriumkloridgradient ved pH 8,4, og utelatelse av vaskingen med eddiksyre/urea), noe som fører til tilbakeholdelse av de fleste isoformer til stede i startmaterialet.

Seks forskjellige fremstillinger av individuelle isoformer utføres ved preparativ, isoelektrisk fokusering i et granulert gelunderlag (Ultrodex, LKB) i det vesentlige ifølge LKB anvendelsesnotat 198. "Pharmalyte" (Pharmacia) 2,5-5 amfolytter (Pharmacia) anvendes, og gelunderlaget inneholder 5 M urea.

Ved den første fremstilling påføres tilnærmet 20 mg rekombinant erythropoietin i 6,8 ml 20 mM natriumcitrat/100 mM natriumklorid, pH 7,0, på gelen og fokuseres ved 8 watt i tilnærmet 16 timer. Etter isoelektrisk fokusering visualis-eres isoformbåndene i gelen ved hjelp av et papirkontakt-avtrykk av gelunderlaget. Avtrykket tas og fikseres deretter ved 3 neddyppinger (tilnærmet 10 minutter hver ved romtempera-tur) i fikseringsløsning (40% methanol/10% eddiksyre/10% TCA/3,5% sulfosalicylsyre), behandles én gang (tilnærmet

10 minutter med 40% methanol/10% eddiksyre (30-60°C), farges i 15 minutter ved 60°C i 0,125% Coomassie-blått R-250/40% methanol/10% eddiksyre, og avfarges deretter i 7,5% methanol/10% eddiksyre for å visualisere de adskilte isoformer. Området av det granulerte gelunderlag som inneholder isoformene (tilnærmet 50% av harpiksen) fjernes, vann tilsettes (tilnærmet 16 ml), og blandingen overføres til et 14 x 62 cm fat og inndampes til tilnærmet 40 g nettovekt. Dette preparat fokuseres for andre gang, og et kontaktavtrykk av gelen tas som angitt ovenfor. Gelporsjonen som inneholder hver av de seks skjelnelige isoformer, fjernes fra gelunderlaget.

For å eluere isoformene fra gelen tilsettes en løsning inneholdende 10 mM Tris-HCl, pH 7,0/5 mM Chaps til hver isoform for å danne en tykk suspensjon. Suspensjonene plasseres i små kolonner og vaskes med Tris-Chaps-bufferen. Eluatene innsamles og påføres adskilt på små kolonner (åpen kolonne-konfigurasjon) inneholdende "Vydac C4" reversert fase-harpiks ekvilibrert i 20% ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kolonnene elueres trinnvis med 20% ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 35% ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0 og 65% ethanol/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Fraksjonen som eluerer ved 65% ethanol/10 mM Tris, fortynnes 1:1 med 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, konsentreres, og bufferen byttes deretter til 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, ved anvendelse av en "Centricon-10" (Amicon) mikrokonsentrator. Analytisk, isoelektrisk fokusering av dette preparat utføres

i det vesentlige som beskrevet i LKB teknisk notat 250 ved anvendelse av "Servalyte" 3-5 amfoliner (Serva) i en poly-acrylamidgel inneholdende 5 M urea.

I en andre fremstilling påføres tilnærmet 26 mg rekombinant erythropoietin i 6,5 ml deionisert vann på gelen og fokuseres ved 2,5 watt i 35 minutter og 10 watt i tilnærmet 17 timer. Båndene av fokusert protein som er synlige i gelunderlaget, fjernes i form av 11 forskjellige samlefraksjoner. Hver samlefraksjon tilsettes deionisert vann til et volum på tilnærmet 7,5 ml, og 20 ml av hver av de resulterende super-natanter underkastes analytisk, isoelektrisk fokusering som beskrevet ovenfor. Til hver av samlefraksjonene tilsettes 5 ml 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, og suspensjonene plasseres hver for seg i små kolonner, og den flytende fase tillates å flyte gjennom. Harpiksen vaskes med tilnærmet 3 volumer 0,5 M Tris-HCl, pH 7, og vaskeløsningen kombineres med eluatet. Eluatene konsentreres, og bufferne byttes til 20 mM natriumcitrat/100 mM natriumklorid, pH 7,0, ved anvendelse av Amicon éngangs-ultrafiltreringsutstyr med en molekylvektsperre på 10.000 dalton. De konsentrerte løsninger (tilnærmet 0,5 ml) passeres deretter gjennom et celluloseacetatfilter med 0,22 mikron partikkelsperre. Basert på analytisk, isoelektrisk fokusering, observeres fem samlefraksjoner å inneholde hovedsakelig de enkle isoformer 10, 11, 12, 13 og 14.

I en tredje fremstilling påføres tilnærmet 30 mg rekombinant erythropoietin i 21,8 ml destillert vann på gelen og fokuseres ved 2 watt i 25 minutter, 10 watt i 20 timer og 15 watt i 15 minutter. Proteinbånd tilsvarende de individuelle isoformer, observeres visuelt og fjernes fra gelunderlaget. Destillert vann tilsettes til gelisolerte isoformer for å danne en tykk suspensjon, og de resulterende super-natanter analyseres ved hjelp av analytisk, isoelektrisk fokusering. Et likt volum 1 M Tris-HCl, pH 7,2, tilsettes til hver suspensjon, suspensjonene plasseres i adskilte, små kolonner, og den flytende fase tillates å strømme gjennom kolonnen for å eluere isoformene. Hvert eluat konsentreres, og bufferen byttes til 20 mM natriumcitrat/100 mM natriumklorid, pH 7,0, ved anvendelse av Amicon éngangs-ultrafiltreringsutstyr med en molekylvektsperre på 10.000 dalton. En analytisk, isoelektrisk fokuseringsgel avslørte at samlefraksjoner inneholdende hovedsakelig de enkle isoformer 9,

10, 11, 12, 13 og 14, ble erholdt.

I en fjerde isoformfremstilling ble det som startmateriale anvendt erythropoietin inneholdende isoformer 3-9 (fremstilt som beskrevet ovenfor) . Forut for preparativ, isoelektrisk fokusering utført i det vesentlige som beskrevet for fremstillinger 1-3 ovenfor, ble amfolyttene ("pharmalyte 2,5-5") forhånds fraksjonert i en "Rotofor" (Bio-Rad, Richmond, CA) flytende fase-isoelektrisk fokuseringscelle for å gi et mer egnet amfolyttområde for de lavere isoelektriske punkter av startmaterialet. Forhåndsfraksjoneringen ble utført ved blanding av 6,7 ml "Pharmalyte 2,5-5" med 15 g urea og til-setning av renset vann for å bringe volumet til 50 ml. Denne blanding ble fraksjonert i Rotoforen ved 10 watt, 1°C, i 5 1/2 time ved anvendelse av 0,1 M fosforsyre og 0,1 M natriumhydroxyd som hhv. anolytt og katolytt. Amfolyttfraksjonene med målte pH-verdier mellom 4,5 og tilnærmet 6, ble anvendt i den plategel-isoelektriske fokusering.

Amfolytter ble fjernet fra isoformene ved anvendelse av en "Centrieluter" (Amicon, Danvers, MA) og en "Centricon"

(Amicon) med en molekylvektsperre på 10.000 dalton ved anvendelse av de følgende parametre: 0,18 Tris-buffer, pH 8,8, 100 volt, 25-30 mA, i 3 timer. Isoformenes buffer ble deretter byttet til 0,1 M natriumklorid ved hjelp av gelfiltrer-ing ved anvendelse av "Sephadex G-25" (Pharmacia). Analytisk, isoelektrisk fokusering av de fem resulterende samlefraksjoner viste at de inneholdt isoformer 4, 5, 6, 7 og 8. Isoform 4 eluerte som flere bånd, noe som tydet på at den kan ha vært utsatt for noe nedbrytning.

Den femte isoformfremstilling ble modifisert ved til-føyelse av et forhåndsfokuseringstrinn til plategel-isoelektrisk fokuseringsprosedyren. I denne modifikasjon ble proteinet ikke tilsatt til amfolytt/urea/gelblandingen før elektroforese, men ble tilsatt til den isoelektriske fokuser-ingsapparatur etter dannelse av pH-gradienten i gelplaten. Etter prefokusering i 75 minutter (1500 volt-time) ble ut-snittet av gelplaten fra 2,25 til 4,25 cm fra katoden fjernet, blandet med erythropoietinløsningen og tilbakeført til gelplaten. Etter isoelektrisk fokusering ble isoformer 10, 11, 12, 13 og 14 eluert fra gelplaten og adskilt fra amfolyttene ved ultrafiltrering ved anvendelse av "Centricon-10" (Amicon) utstyr.

Prefokuseringsmodifikasjonen ble utført for å oppnå at de ultrafiolette absorpsjonskarakteristika for isoform-preparatene ble mer lik de tilsvarende karakteristika for det rekombinante erythropoietin-startmateriale. Denne forbedring i spektrale karakteristika kan observeres i forholdet mellom absorpsjon ved 280 og 260 nm for de isolerte isoformer. Det gjennomsnittlige forhold mellom absorpsjon ved 280 nm og 260 nm (A280/A260) for isoformer fra fremstillinger 2 og 3 (ikke-prefokusert) er 1,36 0,11, mens det gjennomsnittlige A280/A260-forhold for fremstillinger 5 og 6 (prefokusert) er 1,6 8 0,20. Når isoform nr. 14 utelukkes fra beregningen, er de gjennomsnittlige A280/A260-forhold 1,39 - 0,11 og 1,74 0,09 for hhv. preparater 2 & 3 og 5 & 6. (Isoform 14 kan ha det mest atypiske spektrum fordi den er til stede i de minste mengder og således er mer utsatt for forstyrrelser fra sporstoff-forurensning av amfolyttbestanddeler, eller fordi denne isoform er nærmest elektroden under den isoelektriske gelplatefokuseringsprosedyre). Det gjennomsnittlige A280/A260-forhold for rekombinant erythropoietin fremstilt i overensstemmelse med eksempel 2 ifølge Lai et al. (modifisert som beskrevet ovenfor ved anvendelse av Q-Sepharose som anion-bytteharpiksen), er 1,91 - 0,04.

Som beskrevet ovenfor, var startmaterialet for iso-formpreparat nr. 6 et rekombinant erythropoietinpreparat inneholdende isoformer 4-13. Amfolyttene ble prefokusert i Rotofor-apparaturen som ved den fjerde fremstilling. Amfolytt-fraksjoner med målte pH-verdier mellom 3,7 og 4,8 ble anvendt for den isoelektriske plategelfokusering. Plategelen ble prefokusert som i fremstilling nr. 5, og isoformer 9, 10, 11, 12 og 13 ble erholdt etter ultrafiltrering ("Centricon-10") for å fjerne bæreramfolytter.

Eksempel 2: Sialinsyreinnhold av rekombinante erythropoietin-isoformer

Isoformene isolert som beskrevet i eksempel 1 og erythropoietin renset i overensstemmelse med fremgangsmåter beskrevet i Lai et al., supra (blanding av isoformer 9 til 14), ble bufferutbyttet til 0,10-0,15 M natriumklorid og analysert for sialinsyreinnhold ved hjelp av en modifikasjon av fremgangsmåten ifølge Jourdian et al., J. Biol. Chem. 246, 430

(1971). Sialinsyrerestene spaltes fra glycoproteinene ved hydrolyse med 0,35 M svovelsyre ved 80°C i 30 minutter, og løs-ningene nøytraliseres med natriumhydroxyd før analyse. For å beregne mengden av tilstedeværende erythropoietinprotein ble det utført en Bradford proteinanalyse (Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) ved anvendelse av rekombinant erythropoietin med samme aminosyresekvens som humant erythropoietin som standard, ved anvendelse av analysereagensene og mikrometode-prosedyren levert av Bio-Rad. Resultatene uttrykt som mol sialinsyre pr. mol erythropoietin, er vist i tabell 1. Isoformer er gitt betegnelser i overensstemmelse med antall sialinsyrer pr. molekyl og varierer fra lavest surhetsgrad (isoform 9) til høyest surhetsgrad (isoform 13). Isoformer 9-13 er vist i gelfelt 6-10 i figur 1. Mengder av isoform 14 er utilstrekkelig for nøyaktig å måle sialinsyreinnholdet. Sialinsyreinnholdet i denne isoform utledes fra dens vandring i IEF-geler i forhold til andre isoformer. Sialinsyreinnholdet av isoformer 5-8 (fremstilling nr. 4) er ikke målt, men er likeledes utledet fra deres vandring i IEF-geler.

Eksempel 3; Aktivitet av isoformer av rekombinant erythropoietin

Isoformene isolert som beskrevet i eksempel 1, analyseres ved absorpsjon ved 280 nm, ved Bradford-proteinanalyse og ved RIA for erythropoietin for å bestemme mengden tilstedeværende rekombinant erythropoietin. Den ekshypoksiske, polycytemiske muse-bioanalysebestemmelse (Cotes et al., Nature 191, 1065 (1961)) anvendes for å bestemme den relative biologiske aktivitet in vivo. Kvantifisering av mengden tilstedeværende erythropoietinprotein ved anvendelse av radio-immunanalysebestemmelse for erythropoietin ga resultater med høyere relative, spesifikke aktiviteter in vivo for visse isoformer på grunn av en tydelig redusert immunreaktivitet av isoformer inneholdende store mengder sialinsyre, noe som fører til en undervurdering av erythropoietinkonsentrasjonen og således en overvurdering av den relative spesifikke aktivitet in vivo for de mest negative isoformer. Muse-bioanalysebestemmelser, uttrykt som enheter/ml, divideres med de tilsvarende proteinkonsentrasjoner for å gi spesifikke aktiviteter in vivo uttrykt som enheter/mg erythropoietin-polypeptid. Disse spesifikke aktiviteter er vist i tabell 2.

I tabell 2 er "n" antall uavhengige isoformpreparater som bidrar til den spesifikke aktivitetsverdi. I de fleste tilfeller ble flere in vivo analyser utført på hvert isoform-preparat. De samme in vivo data bidrar til beregningene av den spesifikke aktivitet for alle tre kolonner, enheter/mg erythropoietin-polypeptid ble bestemt ved absorpsjonen ved 280 nm, fra radioimmunanalyseverdier, eller fra Bradford-proteinanalyseresultater. Renset, rekombinant erythropoietin inneholdende isoformer 9-14, ble anvendt som standard i Bradford-proteinanalysen. "n" kan være mindre for de utførte beregninger ved anvendelse av Bradford-proteinanalysen fordi noen preparater ikke lenger var tilgjengelige ved det tidspunkt Bradford-analysen ble utført.

Erythropoietin renset i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet i Lai et al., supra, og inneholdende en blanding av isoformer 9 til 14, anvendes som en standard for radioimmunanalysene og in vivo-analysene.

De relative, spesifikke aktiviteter uttrykt som enheter/mg erythropoietin-polypeptid, kan overføres til enheter/A2gQved multiplisering med 0,807 mg erythropoietin-polypeptid/A2gQ. Overføringsfaktoren erholdes ved å multi-plisere ekstinksjonskoeffisienten for erythropoietin (1,345 mg/A2g0) med proteininnholdet av erythropoietin-glycoproteinet (60 vekt%, Davis et al., Biochemistry _26, 2633

(1987)) for å erholde mg erythropoietin-polypeptid/A00l„

(dvs. 1,345 mg erythropoietin/A2gQx 0,60 mg polypeptid/mg erythropoietin = 0,807 mg polypeptid /A2g0). I tillegg kan spesifikke aktiviteter uttrykt som enheter/mg erythropoietin-polypeptid, multipliseres med faktoren 0,60 mg polypeptid/mg erythropoietin-glycoprotein for å gi spesifikke aktiviteter som enheter/mg erythropoietin-glycoprotein.

Dataene i tabell 2 er også vist grafisk i figurene 2A, 2B og 2C. Disse data viser at den relative aktivitet in vivo av erythropoietin øker som en funksjon i sialinsyreinnhold inntil isoform nr. 11. Isoformer 11-14 har i det vesentlige den samme relative bioaktivitet in vivo. (Dette fremgår tydeligst når konsentrasjonen av isoform 14 uttrykkes ved anvendelse av Bradford-analyseverdien. Bradford-verdien kan være mer nøy-aktig for isoform 14 på grunn av de generelt lave nivåer som erholdes og den resulterende vanskelighet med bestemmelse ved hjelp av & 280°9^en mest tydelig, reduserte reaktivitet i radioimmunanalysen av meget negative former diskutert tid-ligere) . Den høyere, relative, spesifikke aktivitet in vivo av erythropoietin-isoformer inneholdende mer sialinsyre, skyldes mest sannsynlig en lengre sirkulasjonshalvtid av disse former. Isoformer 9 og 13 ble merket med radioaktivt jod ( 125I), og deres utskillelseshastighet på rotter ble bestemt. Sirkulasjonshalveringstiden var vesentlig lengre for isoform

13 enn for isoform 9.

Eksempel 4: Utvelgelse av isoformblandinger av rekombinant erythropoietin ved Q- Sepharose- kromatografi

Cellekondisjonerte medier fra produksjonen av rekombinant erythropoietin i overensstemmelse med fremgangsmåtene beskrevet i Lin, supra, konsentrres og diafiltreres mot 10 mM Tris, pH 7,2. Proteinkonsentrasjon bestemmes ved Bradford-mikroproteinanalysen ved anvendelse av bovint serumalbumin som standard. 19,6 ml av løsningen inneholdende 40 mg totalt protein, tilsettes CuS04til 20 uM, filtreres gjennom et filter med partikkelsperre på 0,45 mikron, og appliseres på

en 4 ml kolonne (1,05 cm høyde x 2,2 cm diameter) pakket med "Q Sepharose Fast Flow"(Pharmacia) som er ekvilibrert med 10 mM Tris, pH 6,8 til 7,0 ved 4°C. Etter applisering av prøven vaskes kolonnen med to kolonnevolumer av den samme buffer. Kolonne-flythastigheten er tilnærmet 1 ml/min. Seks adskilte kolonner oppstilles ved anvendelse av denne fremgangsmåte for å utvelge definerte erythropoietin-isoformblandinger .

Kolonner vaskes med 6 til 9 kolonnevolumer av en buffer med lav pH bestående av: Kolonne nr. 1, 150 mM eddiksyre,

1 mM glycin, 20 uM CuSO^, 6 M urea justert til pH 4,7 medNaOH; kolonne nr. 2, 200 mM eddiksyre, 1 mM glycin, 20 uM CuS04, 6 M urea justert til pH 4,7 med NaOH; kolonne nr. 3, 250 mM eddiksyre, 1 mM glycin, 20 pM CuS04, 6 M urea justert til pH 4,7 med NaOH; kolonne nr. 4, 300 mM eddiksyre, 1 mM glycin, 20 uM CuS04, 6 M urea justert til pH 4,7 med NaOH; kolonne nr. 5, 150 mM eddiksyre, 1 mM glycin, 20 uM CuS04, 6 M urea; kolonne nr. 6, 300 mM eddiksyre, 1 mM glycin, 20 uM CuS04, 6 M urea. pH i kolonnene forhøyes til tilnærmet pH 7 ved å vaske hver kolonne med 8 til 11 kolonnevolumer 10 mM Tris-HCl, 55 mM NaCl, 20 uM CuS04, pH 7. De definerte erythropoietin-isof ormblandinger elueres fra kolonnene ved utvasking med 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 uM CuS04, pH 7,0.

De eluerte isoform-samlefraksjoner fra hver kolonne konsentreres og løsemiddelutbyttes med vann ved anvendelse av en Amicon "Centricon-lO" mikrokonsentrator. Resultatene fra analytisk, isoelektrisk fokusering av disse konsentrerte samlefraksjoner er vist i figur 3. Gelfelt 1-6 representerer definerte erythropoietin-isoformblandinger, hhv. eluert fra kolonnene 1-6. "Isoformblandingen" vist i det ytterste høyre gelfelt i figur 3, representerer cellemedier som er applisert på en Q-Sepharosekolonne som beskrevet ovenfor, kolonnen vaskes med 5 mM eddiksyre, 1 mM glycin, 20 uM CuS04, 6 M urea, og erythropoietin-isoformblandingen elueres fra kolonnen ved anvendelsene beskrevet ovenfor. Denne eluerte blanding av isoformer renses ytterligere i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet i Lai et al., supra, forut for analytisk, isoelektrisk fokusering.

Eksempel 5: Fraksjonering av rekombinante erythropoietin-isoformer ved anvendelse av en lav pH- gradient på Q- Sepharose

Ved en annen fremgangsmåte adskilles erythropoietin-isoformer ved anvendelse av en gradient med synkende pH og økende ionestyrke. De konsentrerte, diafiltrerte erythropoietin-holdige medier appliseres på en kolonne av Q-Sepharose i et forhold på tilnærmet 40 mg totalt protein/ml gel. Kolonnen vaskes deretter med tilnærmet to kolonnevolumer 10 mM Tris HC1, pH 7,0, og deretter med tilnærmet 10 kolonnevolumer 2 mM eddiksyre/1 mM glycin/20 uM CuSO^/6 M urea (pH tilnærmet 4,8) for å fjerne kontaminerende proteiner og erythropoietin-isoformer som inneholder færre enn tilnærmet 7 sialinsyrerester. Isoformer inneholdende fra tilnærmet 8 til 12 sialinsyrer, elueres fra kolonnen ved anvendelse av en gradient som starter ved tilnærmet 2 mM eddiksyre i 6 M urea/l mM glycin/20 uM CuSO^, og som slutter ved 40 mM eddiksyre/ 6 M urea/l mM glycin/20 uM CuS04(pH tilnærmet 4). Det totale volum av gradienten er tilnærmet 40 kolonnevolumer, og fraksjoner, hver på tilnærmet ett kolonnevolum, innsamles i beholdere inneholdende et tilstrekkelig volum Tris-buffer for å bringe pH til området 6-8,5 slik at de innsamlede fraksjoner ikke utsettes for lav pH i lang tid. Aliquoter av fraksjonene underkastes analytisk, isoelektrisk fokusering for å overvåke adskillelsen. Figur 4 viser adskillelsen av isoformer 8-11 som kan oppnås ved denne fremgangsmåte. Isoformer 12-14 som forblir bundet til kolonnen ved slutten av gradienten, elueres med vask med en buffer bestående av 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 uM CuS04(pH 7,0). Isoformene (adskilt under gradientelueringen eller eluert med natrium-kloridløsningen) befris for kontaminerende proteiner ved hjelp av revers-fase-kromatografi, etterfulgt av gelfiltreringskromatografi som beskrevet i eksempel 2 ifølge Lai et al.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en isoform av erythropoietin, karakterisert vedat det isoleres en isoform av erytrhopoietin med et enkelt isoelektrisk punkt og inneholdende et spesifikt antall sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl, hvor antallet er fra 10-14.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat isoformen fremstilles ved ekspresjon av en eksogen DNA-sekvens i en ikke-human, eukaryot vertcelle.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat isoformen omfatter erythropoietin med aminosyresekvensen ifølge 1-165 eller 1-166 humant erythropoietin.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat isoformen inneholder 10, 13 eller 14 sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat den eukaryote vertcelle er en CHO-celle.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et erythropoietinpreparat, karakterisert vedat den omfatter fremstilling av en blanding av mindre enn 4 erythropoietin-isoformer med et sialinsyreinnhold på mellom 10 og 14.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat blandingen av erythropoietin-isoformer inneholder færre enn 12 sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat blandingen av erythropoietin-isoformer inneholder 10 og 11 sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl .

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat blandingen av erythropoietin-isoformer inneholder mer enn 11 sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat blandingen av erythropoietin-isoformer inneholder fra 13-14 sialinsyrer pr. erythropoietinmolekyl.