DE20321793U1

DE20321793U1 - Hydroxyalkylstärke-Derivate

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Publication number: DE20321793U1
Application number: DE20321793U
Authority: DE
Original assignee: Fresenius Kabi Deutschland GmbH
Current assignee: Fresenius Kabi Deutschland GmbH
Priority date: 2002-09-11
Filing date: 2003-09-11
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2013-09-12

Abstract

Hydroxyalkylstärkederivat, erhältlich durch ein Verfahren umfassend das Umsetzen von Hydroxyalkylstärke (HAS) der Formel (I), wobei R₁, R₂ und R₃ unabhängig Wassserstoff oder eine lineare oder verzweigte Hydroxyalkylgruppe sind

an ihrem reduzierenden Ende, welches vor der Reaktion nicht oxidiert ist, mit einer Verbindung der Formel (II) R'-NH-R'' (II)durch reduktive Aminierung über die NH-Gruppe, die R' und R'' verbrückt, um ein erstes Hydroxyalkylstärkederivat zu ergeben, wobei R' H ist, und R'' eine funktionelle Gruppe X umfasst, welche die chemische Struktur -NH- umfasst und welche fähig ist, mit einer weiteren Verbindung vor oder nach der Reaktion von (I) und (II) umgesetzt zu werden, wobei das Verfahren weiterhin ein Umsetzen des ersten Hydroxyalkylstärkederivats mit einer weiteren Verbindung über Reaktion der funktionellen Gruppe X mit einer funktionellen Gruppe V, die in der weiteren Verbindung umfasst ist, umfasst, um ein zweites Hydroxyalkylstärkederivat zu ergeben, wobei die weitere Verbindung eine verknüpfende Verbindung ist umfassend die funktionelle Gruppe V,...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hydroxyalkylstärkederivate, insbesondere Hydroxyalkylstärkederivate, die durch ein Verfahren erhalten werden können, bei dem Hydroxyalkylstärke mit einer primären oder sekundären Aminogruppe einer Linkerverbindung reagiert wird. Gemäß einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Hydroxyalkylstärkederivate, die durch ein Verfahren erhalten werden können, dem gemäß Hydroxyalkylstärke mit einer primären oder sekundären Aminogruppe einer Linkerverbindung reagiert wird und das erhaltene Reaktionsprodukt mit einem Polypeptid, bevorzugt mit einem Glykoprotein und insbesondere bevorzugt mit Erythropoietin, über mindestens eine andere reaktive Gruppe der Linkerverbindung reagiert wird. Eine insbesondere bevorzugte Hydroxyalkylstärke ist Hydroxyethylstärke. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Hydroxyalkylstärke und bevorzugt die Hydroxyethylstärke mit der Linkerverbindung an ihrem reduzierenden Ende, das vor der Reaktion nicht oxidiert wird, reagiert.
Hydroxyethylstärke (HES) ist ein Derivat von natürlich vorkommendem Amylopektin und wird im Körper von alpha-Amylase abgebaut. HES ist ein substituiertes Derivat des Kohlehydratpolymers Amylopektin, das in einer Konzentration von bis zu 95 Gew.% in Maisstärke vorhanden ist. HES weist vorteilhafte biologische Eigenschaften auf und wird als Blutvolumen-Ersatzstoff sowie in der Hämodilutionstherapie in der Klinik verwendet (Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271–278; und Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494–498).
Amylopektin besteht aus Glucosegruppen, wobei in der Hauptkette alpha-1,4-glykosidische Bindungen gegenwärtig sind und an den Verzweigungsstellen alpha-1,6-glykosidische Bindungen zu finden sind. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften dieses Moleküls werden hauptsächlich vom Typ der glykosidischen Bindungen bestimmt. Aufgrund der offenen alpha-1,4-glykosidischen Bindung werden spiralförmige Strukturen mit etwa sechs Glucosemonomeren pro Windung erzeugt. Die physikalisch-chemischen sowie die biochemischen Eigenschaften des Polymers können durch Substitution modifiziert werden. Die Einführung einer Hydroxyethylgruppe kann durch alkalische Hydroxyethylierung erzielt werden. Durch Anpassen der Reaktionsbedingungen ist es möglich, die unterschiedliche Reaktivität der jeweiligen Hydroxygruppe im unsubstituierten Glucosemonomer in Bezug auf eine Hydroxyethylierung auszunutzen. Aufgrund dieser Tatsache kann eine Fachperson das Substitutionsmuster bis zu einem gewissen Grad beeinflussen.
Einige Arten der Herstellung eines Hydroxyethylstärkederivats sind auf dem Fachgebiet beschrieben.
Die DE 26 16 086 offenbart die Konjugation von Hämoglobin an Hydroxyethylstärke, wobei in einem ersten Schritt ein Vernetzungsmittel, z. B. Bromcyan, an Hydroxyethylstärke gebunden wird und anschließend Hämoglobin mit dem Zwischenprodukt verknüpft wird.
Ein wichtiges Gebiet, auf dem HES verwendet wird, ist die Stabilisierung von Polypeptiden, die beispielsweise auf das Kreislaufsystem angewendet werden, um eine bestimme physiologische Wirkung zu erzielen. Ein spezifisches Beispiel für solche Polypeptide ist Erythropoietin, ein saures Glykoprotein von etwa 34.000 kD, das für die Regulierung des Werts der roten Blutkörperchen im Kreislauf essentiell ist.
Ein bekanntes Problem bei der Anwendung von Polypeptiden und Enzymen ist, dass diese Proteine oft eine nicht zufriedenstellende Stabilität aufweisen. Insbesondere Erythropoietin hat eine relative kurze Plasmahalbwertszeit (Spivak und Hogans, 1989, Blond 73, 90; McMahon et al., 1990, Blond 76, 1718). Dies bedeutet, dass therapeutische Werte im Plasma rasch verloren gehen und wiederholte intravenöse Verabreichungen durchgeführt werden müssen. Zudem ist unter bestimmten Umständen eine Immunantwort gegen diese Peptide zu beobachten.
Es ist allgemein anerkannt, dass die Stabilität von Polypeptiden verbessert werden kann und sich die Immunantwort gegen diese Polypeptide vermindert, wenn die Polypeptide an polymere Moleküle gekoppelt sind. Die WO 94/28024 offenbart, dass physiologisch aktive Polypeptide, die mit Polyethylenglykol (PEG) modifiziert sind, eine verringerte Immunogenität und Antigenität aufweisen und beträchtlich länger in der Blutbahn zirkulieren als nicht konjugierte Proteine, d. h. eine längere Clearance-Rate aufweisen. PEG-Medikament-Konjugate weisen jedoch mehrere Nachteile auf, beispielsweise weisen sie keine natürliche Struktur auf, die von Elementen von In-vivo-Abbauwegen erkannt werden kann. Deshalb wurden neben PEG-Konjugaten auch andere Konjugate und Proteinpolymerate hergestellt. Eine Vielzahl von Verfahren zum Vernetzen von verschiedenen Proteinen und Makromolekülen, wie etwa Polymerase, wurde in der Literatur beschrieben (vgl. z. B. Wong, Chemistry of Protein conjugation and cross-linking, 1993, CRCS, Inc.).
Die auf dem Fachgebiet offenbarten HES-Konjugate weisen den Nachteil auf, dass HES nicht ortsspezifisch an das Medikament konjugiert wird. In der Folge führt die Konjugation zu einem stark heterogenen Produkt mit vielen Komponenten, die gegebenenfalls aufgrund der Zerstörung der dreidimensionalen Struktur während des Konjugationsschritts inaktiv sein können. Deshalb besteht Bedarf an weiter verbesserten HES-Polypeptid-Konjugaten mit verbesserter Stabilität und/oder Bioaktivität.
Ein Verfahren zur Herstellung dieser Konjugate verwendet eine oxidierte Form von HES als Ausgangsmaterial, das mit einer verknüpfenden Verbindung reagiert wird, wobei das erhaltene Produkt mit einem Polypeptid reagiert oder weiter modifiziert und dann mit einem Polypeptid reagiert wird. Ein bedeutender Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass das ursprüngliche HES in einem ersten Schritt selektiv oxidiert werden muss, im Allgemeinen an seinem reduzierenden Ende, durch Oxidieren der endständigen Aldehydgruppe und/oder Halbacetalgruppe zu einem Lacton, wodurch der Gesamtvorgang schwieriger und teurer wird.
Die WO 02/08079 A2 offenbart Verbindungen, die ein Konjugat aus einem Wirkstoff und einer Hydroxyalkylstärke umfassen, wobei der Wirkstoff und die Hydroxyalkylstärke entweder direkt oder über eine Linkerverbindung verknüpft sind. Was die direkte Verknüpfung betrifft, so wird die Reaktion des Wirkstoffs mit der Hydroxyalkylstärke in einem wässrigen Medium durchgeführt, das mindestens 10 Gew.% Wasser umfasst. Es sind keine Beispiele gegeben, die ein Hydroxyalkylstärkederivat betreffen, das durch Umsetzen von Hydroxyalkylstärke an ihrem reduzierenden Ende mit einer verknüpfenden Verbindung, umfassend die Struktureinheit -NH-, in einem wässrigen Medium hergestellt wird. Alle Beispiele betreffen Hydroxyalkylstärke, die vor einer weiteren Reaktion oxidiert wird, wodurch diese Lehre der WO 02/08079 A2 die zuvor genannten Nachteile aufweist.
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Hydroxyalkylstärkederivats be reitzustellen, das das Umsetzen von Hydroxyalkylstärke an ihrem reduzierenden Ende mit einer geeigneten Verbindung vorsieht, wobei das reduzierende Ende der Stärke vor der Reaktion nicht oxidiert ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Hydroxyalkylstärkederivats, das das Umsetzen von Hydroxyalkylstärke an ihrem reduzierenden Ende mit einer geeigneten Verbindung vorsieht, wobei das reduzierende Ende der Stärke vor der Reaktion nicht oxidiert ist, wobei das Verfahren ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass das Reaktionsprodukt der Reaktion von Hydroxyalkylstärke an ihrem reduzierenden Ende mit einer geeigneten Verbindung mit mindestens einer weiteren Verbindung weiter reagiert wird.
Noch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein wie oben beschriebenes Verfahren bereitzustellen, wobei die mindestens eine weitere Verbindung ein Polypeptid, bevorzugt ein Protein, noch bevorzugter Erythropoietin, ist.
Eine wiederum andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Hydroxyalkylstärkederivats, das erhältlich ist durch ein wie oben beschriebenes Verfahren, das das Umsetzen von Hydroxyalkylstärke an ihrem reduzierenden Ende mit einer geeigneten Verbindung umfasst, wobei das reduzierende Ende der Stärke vor der Reaktion nicht oxidiert ist.
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Hydroxyalkylstärkederivats, umfassend das Umsetzen von Hydroxyalkylstärke (HAS) der Formel (I)
an ihrem reduzierenden Ende, welches vor der Reaktion nicht oxidiert wird, mit einer Verbindung der Formel (II) R'-NH-R'' (II)wobei R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine lineare oder verzweigte Hydroxyalkylgruppe sind, und wobei entweder R' oder R'', oder R' und R'', mindestens eine funktionelle Gruppe X umfassen, welche die Fähigkeit besitzt, mit mindestens einer anderen Verbindung vor oder nach der Reaktion von (I) und (I) umgesetzt zu werden.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Terminus „Hydroxyalkylstärke” (HAS) auf ein Stärkederivat, das durch mindestens eine Hydroxyalkylgruppe substituiert wurde. Deshalb ist der Terminus Hydroxyalkylstärke, so wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nicht auf Verbindungen eingeschränkt, bei denen die endständige Kohlehydratkomponente Hydroxyalkylgruppen R₁, R₂ und/oder R₃ umfasst, wie der Einfachheit halber in Formel (I) dargestellt ist, sondern betrifft auch Verbindungen, bei denen mindestens eine Hydroxygruppe an einer beliebigen Stelle, also in der endständigen Kohlehydratkomponente und/oder im verbleibenden Teil des Stärkemoleküls, HAS', durch eine Hydroxyalkylgruppe R₁, R₂ oder R₃ substituiert ist.
In diesem Zusammenhang kann die Alkylgruppe eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe sein, die geeignet substituiert sein kann. Vorzugsweise enthält die Hydroxyalkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome, noch bevorzugter 1 bis 6 Kohlenstoffatome, noch bevorzugter 1 bis 4 Kohlenstoffatome, noch stärker bevorzugt 2 bis 4 Kohlenstoffatome. „Hydroxyalkylstärke” umfasst demnach vorzugsweise Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke und Hydroxybutylstärke, wobei Hydroxyethylstärke und Hydroxypropylstärke besonders bevorzugt sind.
Hydroxyalkylstärke, die zwei oder mehr unterschiedliche Hydroxyalkylgruppen umfasst, ist ebenfalls möglich.
Die zumindest eine Hydroxyalkylgruppe, die in HAS umfasst ist, kann zwei oder mehr Hydroxygruppen enthalten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die zumindest eine Hydroxyalkylgruppe, die in HAS umfasst ist, eine Hydroxygruppe.
Der Ausdruck „Hydroxyalkylstärke” schließt auch Derivate ein, bei denen die Alkylgruppe mono- oder polysubstituiert ist. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass die Alkylgruppe mit einem Halogen, insbesondere mit Fluor, oder mit einer Arylgruppe substituiert ist, mit der Maßgabe, dass die HAS in Wasser löslich bleibt. Außerdem kann die endständige Hydroxygruppe einer Hydroxyalkylgruppe verestert oder verethert sein.
Außerdem können anstatt von Alkylgruppen auch lineare oder verzweigte Alkengruppen, substituiert oder nicht substituiert, verwendet werden.
Hydroxyalkylstärke ist ein Etherderivat von Stärke. Neben diesen Etherderivaten können im Zusammenhang der Erfindung auch andere Stärkederivate verwendet werden. Beispielsweise sind Derivate nützlich, die veresterte Hydroxygruppen umfassen. Bei diesen Derivaten kann es sich beispielsweise um Derivate von unsubstituierten Mono- oder Dicarbonsäuren mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen oder von substituierten Derivaten dieser handeln. Besonders nützlich sind Derivate von unsubstituierten Monocarbonsäuren mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere Derivate von Essigsäure. in diesem Zusammenhang sind Acetylstärke, Butylstärke und Propylstärke bevorzugt.
Außerdem sind Derivate von unsubstituierten Dicarbonsäuren mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen bevorzugt.
Im Fall von Derivaten von Dicarbonsäuren ist es nützlich, dass auch die zweite Carboxygruppe der Dicarbonsäure verestert ist. Zudem sind auch Derivate von Monoalkylestern von Dicarbonsäuren im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung geeignet.
Bei den substituierten Mono- und Dicarbonsäuren können die Substitutionsgruppen vorzugsweise die gleichen sein, die oben für substituierte Alkylreste erwähnt wurden.
Verfahren zur Veresterung von Stärke sind auf dem Fachgebiet bekannt (vgl. z. B. Klemm D. et al., Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, insbesondere Kapitel 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9).
Hydroxyethylstärke (HES) ist für alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung am stärksten bevorzugt.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Hydroxyalkylstärke Hydroxyethylstärke ist.
HES ist hauptsächlich durch die Molekulargewichtsverteilung und den Substitutionsgrad gekennzeichnet. Es gibt zwei Möglichkeiten, um den Substitutionsgrad zu beschreiben:

1. Der Substitutionsgrad kann hinsichtlich des Abschnitts substituierter Glucosemonomere in Bezug auf alle Glucosegruppen beschrieben werden (DS).
2. Der Substitutionsgrad kann als „molare Substitution” (MS) beschrieben werden, wobei die Anzahl an Hydroxyethylgruppen pro Glucosegruppe beschrieben wird.

HES-Lösungen liegen als polydisperse Zusammensetzungen vor, wobei sich jedes Molekül von den anderen hinsichtlich des Polymerisationsgrads, der Anzahl und des Musters der Verzweigungsstellen und des Substitutionsmusters unterscheidet. HES ist daher ein Gemisch aus Verbindungen mit unterschiedlichem Molekulargewicht. Folglich wird eine bestimmte HES-Lösung durch das durchschnittliche Molekulargewicht mithilfe statistischer Mittel bestimmt. In diesem Zusammenhang wird M_n als arithmetisches Mittel in Abhängigkeit der Anzahl der Moleküle berechnet. Alternativ dazu steht M_w, das Gewichtsmittel, für eine Einheit, die von der Masse der HES abhängt.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung kann Hydroxyethylstärke ein mittleres Molekulargewicht (Gewichtsmittel) von 1 bis 300 kDa aufweisen, wobei ein mittleres Molekulargewicht von 5 bis 100 kDa stärker bevorzugt ist. Hydroxyethylstärke kann ferner einen molaren Substitutionsgrad von 0,1 bis 0,8 und ein Verhältnis zwischen C₂:C₆-Substitution im Bereich von 2 bis 20 in Bezug auf die Hydroxyethylgruppen aufweisen.
Was die Reste R₁, R₂ und R₃ gemäß Formel (I) betrifft, so liegen keine besonderen Einschränkungen vor, sofern Verbindung (I) dazu imstande bleibt, mit einer Verbindung gemäß Formel (II) reagiert zu werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Hydroxyalkylgruppe, eine Hydroxyarylgruppe, eine Hydroxyaralkylgruppe oder eine Hydroxyalkarylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Wasserstoff und Hydroxyalkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind bevorzugt. Die Alkyl-, Aryl-, Aralkyl- und/oder Alkarylgruppe kann linear oder verzweigt und geeignet substituiert sein.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine lineare oder verzweigte Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind.
R₁, R₂ und R₃ können Hydroxyhexyl, Hydroxypentyl, Hydroxybutyl, Hydroxypropyl, wie etwa 1-Hydroxypropyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, 1-Hydroxyisopropyl, 2-Hydroxyisopropyl, Hydroxyethyl, wie etwa 1-Hydroxyethyl, 2-Hydroxyethyl, oder Hydroxymethyl sein. Wasserstoff und Hydroxyethylgruppen sind bevorzugt, Wasserstoff und die 2-Hydroxyethylgruppe sind besonders bevorzugt.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes verfahren, wobei R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine 2-Hydroxyethylgruppe sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Hydroxyalkylstärke mit einer Verbindung der Formel (II) reagiert, wobei Verbindung (II) vor der Reaktion mit Verbindung (I) mit einer weiteren Verbindung reagiert werden kann, um ein Hydroxyalkylstärkederivat zu ergeben. Hinsichtlich Verbindung (II) liegen keine spezifischen Einschränkungen vor, sofern die Verbindung (II) dazu imstande ist, über die NH-Gruppe, die R' und R'' verbrückt, mit Verbindung (I) an ihrem reduzierten Ende, das nicht oxidiert ist, reagiert zu werden, um ein Hydroxyalkylstärkederivat zu ergeben.
Bevorzugte Reste R' der Verbindung (II) sind Wasserstoff und Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Arylcycloalkyl-, Alkaryl- oder Cycloalkylarylreste, wobei Cycloalkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Arylcycloalkyl-, Alkaryl- oder Cycloalkylarylreste direkt mit der NH-Gruppe, die R' und R'' der Verbindung (II) verbrückt, verknüpft sein können oder, gemäß einer weiteren Ausführungsform, über eine Sauerstoffbrücke mit der NH-Gruppe, die R' und R'' der Verbindung (II) verbrückt, verknüpft sein können. Die Alkyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Alkarylreste können geeignet substituiert sein. Als bevorzugte Substituenten können Halogene, wie etwa F, Cl oder Br erwähnt werden. Besonders bevorzugte Reste R' sind Wasserstoff, Alkyl- und Alkoxygruppen, und noch stärker bevorzugt sind Wasserstoff und nicht substituierte Alkyl- und Alkoxygruppen.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei R' Wasserstoff oder eine lineare oder eine verzweigte Alkyl- oder Alkoxygruppe ist.
Von den Alkyl- oder Alkoxygruppen sind Gruppen mit 1, 2, 3, 4, 5, oder 6 C-Atomen bevorzugt. Noch bevorzugter sind Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy- und Isopropoxygruppen. Insbesondere bevorzugt sind Methyl, Ethyl, Methoxy und Ethoxy, wobei Methyl oder Methoxy noch stärker bevorzugt sind.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei R' Wasserstoff oder eine Methyl- oder eine Methoxygruppe ist.
Abgesehen von der funktionellen Gruppe X kann R'' mindestens eine zusätzliche funktionelle Gruppe W umfassen. Diese mindestens eine zusätzliche funktionelle Gruppe W kann im Allgemeinen an einer beliebigen Stelle in R'' vorhanden sein. Vorzugsweise ist W direkt mit der NH-Gruppe verknüpft, mit der R' verknüpft ist.
Im Allgemeinen liegen keine spezifischen Einschränkungen hinsichtlich der funktionellen Gruppe W vor, solange die Verbindung (I) dazu imstande ist, mit Verbindung (II) reagiert zu werden. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die funktionelle Gruppe W die Struktureinheit -NH- und/oder die Struktureinheit -(C=G)-, wobei G gleich O oder S ist, und/oder die Struktureinheit -SO₂-. Gemäß stärker bevorzugten Ausführungsformen ist die funktionelle Gruppe W ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
wobei G, wenn es zweimal vorhanden ist, unabhängig voneinander O oder S ist.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wenn R' gleich H ist und W direkt mit der NH-Gruppe verknüpft ist, die R' und R'' verbrückt, bilden R' und die NH-Gruppe, die R' und R' verbrückt, zusammen mit W eine der folgenden Gruppen:
Hinsichtlich der mindestens einen funktionellen Gruppe X, die in R' und/oder R'', bevorzugt in R'', umfasst ist, liegen keine spezifischen Einschränkungen vor. Im Allgemeinen sind alle funktionellen Gruppen möglich, die eine Reaktion mit mindestens einer weiteren Verbindung zulassen.
Was diese Reaktion mit einer weiteren Verbindung betrifft, so sind verschiedenste Arten der Interaktionen der mindestens einen funktionellen Gruppe mit der mindestens einen weiteren Verbindung möglich. Unter anderem sind Reaktionen der mindestens einen funktionellen Gruppe X mit einer weiteren Verbindung möglich, die zu einer kovalenten Bindung, einer Ionenbindung und/oder einer Van-der-Waals-Bindung führen, wobei die kovalente Bondung besonders bevorzugt ist.
Unter anderem können die folgenden funktionellen Gruppen X erwähnt werden:

• C-C-Doppelbindungen oder C-C-Dreifachbindungen oder aromatische C-C-Bindungen;
• die Thiogruppe oder die Hydroxygruppen;
• Alkylsulfonsäurehydrazid, Arylsulfonsäurehydrazid;
• 1,2-Diole;
• 1,2-Aminoalkohole;
• die Aminogruppe -NH₂ oder Derivate der Aminogruppen, die die Struktureinheit -NH- umfassen, wie etwa Aminoalkylgruppen, Aminoarylgruppen, Aminoaralkylgruppen oder Alkarylaminogruppen;
• die Hydroxylaminogruppe -O-NH₂ oder Derivate der Hydroxylaminogruppen, die die Struktureinheit -O-NH- umfassen, wie etwa Hydroxylalkylaminogruppen, Hydroxylarylaminogruppen, Hydroxylaralkylaminogruppen oder Hydroxalalkarylaminogruppen;
• Alkoxyaminogruppen, Aryloxyaminogruppen, Aralkyloxyami nogruppen oder Alkaryloxyaminogruppen, jeweils umfassend die Struktureinheit -NH-O-;
• Reste mit einer Carbonylgruppe, -Q-C(=G)-M, wobei G gleich O oder S ist und M beispielsweise Folgendes ist:
• -OH oder -SH;
• eine Alkoxygruppe, eine Aryloxygruppe, eine Aralkyloxygruppe oder eine Alkaryloxygruppe;
• eine Alkylthiogruppe, eine Arylthiogruppe, eine Aralkylthiogruppe oder eine Alkarylthiogruppe;
• eine Alkylcarbonyloxygruppe, eine Arylcarbonyloxygruppe, eine Aralkylcarbonyloxygruppe, eine Alkarylcarbonyloxygruppe;
• aktivierte Ester, wie etwa Ester von Hydroxylaminen mit Imidstruktur, wie etwa N-Hydroxysuccinimid, oder mit einer Struktureinheit O-N, wobei N Teil einer Heteroarylverbindung ist, oder, wenn G = O und Q nicht gegenwärtig ist, wie etwa Aryloxyverbindungen mit einem substituierten Arylrest, wie etwa Pentafluorphenyl, Paranitrophenyl oder Trochlorphenyl; wobei Q nicht gegenwärtig oder NH oder ein Heteroatom, wie etwa S oder O, ist;
• -NH-NH₂ oder -NH-NH-;
• -NO₂;
• die Nitrilgruppe;
• Carbonylgruppen, wie etwa die Aldehydgruppe oder die Ketogruppe;
• die Carboxygruppe;
• die -N=C=O-Gruppe oder die -N=C=S-Gruppe;
• Vinylhalogenidgruppen, wie etwa die Vinyliodid- oder die Vinylbromidgruppe, oder Vinyltriflat;
• -C=C-H;
• -(C=NH₂Cl)-O-Alkyl
• Gruppen -(C=O)-CH₂-Hal, wobei Hal gleich Cl, Br oder I ist;
• -CH=CH-SO₂-;
• eine Disulfidgruppe, umfassend die Struktur -S-S-;
• die Gruppe
• die Gruppe

Von diesen Gruppen sind die Thiogruppe, die Aminogruppe, die Hydroxyalkylgruppe, die Alkoxyaminogruppen und die folgenden Gruppen insbesondere bevorzugt:
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die mindestens eine funktionelle Gruppe X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -SH, -NH₂, -O-NH₂, -NH-O-Alkyl, -(C=G)-NH-NH₂, -G-(C=G)-NH-NH₂, -NH-(C=G)-NH-NH₂ und -SO₂-NH-NH₂, wobei G gleich O oder S ist und, wenn G zweimal vorhanden ist, es unabhängig voneinander O oder S ist.
Was die Alkoxyaminogruppen betrifft, so sind die Propoxyaminogruppe, Ethoxyaminogruppe und die Methoxyaminogruppe besonders bevorzugt, wobei die Methoxyaminogruppe -NH-O-CH₃ insbesondere bevorzugt ist.
Gemäß einem wiederum anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die mindestens eine funktionelle Gruppe X eine Gruppe sein, die nicht imstande ist, direkt mit einer gegebenen weiteren Verbindung zu umsetzen, die aber chemisch modifiziert werden kann, um zum Umsetzen auf die gewünschte Weise imstande zu sein. Diese Modifikation der funktionellen Gruppe X, die in Verbindung (II) umfasst ist, kann entweder vor der Reaktion von Verbindung (II) mit Verbindung (I) oder nach der Reaktion von Verbindung (II) mit Verbindung (I) durchgeführt werden. Wenn Verbindung (II) mindestens zwei funktionelle Gruppen X, die optional chemisch unterschiedlich sind, umfasst, so ist es möglich, mindestens eine funktionelle Gruppe X vor der Reaktion von Verbindung (II) mit Verbindung (I) und mindestens eine funktionelle Gruppe X nach der Reaktion von Verbindung (II) mit Verbindung (I) zu modifizieren.
Als Beispiel für eine funktionelle Gruppe X, die vor der Reaktion mit einer weiteren Verbindung zu modifizieren ist, kann ein 1,2-Aminoalkohol oder ein 1,2-Diol erwähnt werden, das beispielsweise durch Oxidation zur Bildung eines Aldehyds oder einer Ketogruppe modifiziert wird.
Ein weiteres Beispiel für eine funktionelle Gruppe X, die vor der Reaktion mit einer weiteren Verbindung zu modifizieren ist, ist eine -NH₂-Gruppe, die durch die Reaktion mit beispielsweise einer Verbindung gemäß der folgenden Formel
modifiziert wird, um eine Struktur der folgenden Formel
zu ergeben, die beispielsweise zu einer Thiogruppe reaktiv ist.
Ein weiteres Beispiel für eine funktionelle Gruppe X, die vor der Reaktion mit einer weiteren Verbindung zu modifizieren ist, ist eine -NH₂-Gruppe, die durch die Reaktion mit beispielsweise einer Verbindung gemäß der folgenden Formel
modifiziert wird, um eine Struktur der folgenden Formel
zu ergeben, die beispielsweise zu einer Thiogruppe reaktiv ist.
Die mindestens eine funktionelle Gruppe X kann direkt mit der NH-Gruppe verknüpft sein, die R' und R'' verbrückt. Somit ist gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die funktionelle Gruppe X gleichwertig mit R''. Spezifische Beispiele für Verbindungen, bei denen X direkt mit der NH-Gruppe verknüpft ist, die R' und R'' verbrückt, sind unter anderem
Ein weiteres spezifisches Beispiel für eine solche Verbindung, das auch in der vorliegenden Erfindung umfasst ist, ist NH₃.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die NH-Gruppe, die R' und R'' verbrückt, von der mindestens einen funktionellen Gruppe X durch eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Cycloalkyl- oder Aryl- oder Aralkyl- oder Arylcycloalkyl- oder Alkaryl- oder Cycloalkylarylgruppe getrennt sein, wobei diese Gruppen mindestens ein Heteroatom, wie etwa N, O, S, umfassen können, und wobei diese Gruppen passend substituiert sein können. Die Größe der Gruppe, die die NH-Gruppe, welche R' und R'' verbrückt, und die mindestens eine funktionelle Gruppe X trennt, kann den spezifischen Bedürfnissen angepasst sein. Im Allgemeinen weist die trennende Gruppe 1 bis 60, bevorzugt 1 bis 40, noch bevorzugter 1 bis 20, noch bevorzugter 1 bis 10, noch bevorzugter 1 bis 6 und insbesondere bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome auf. Sind Heteroatome gegenwärtig, so umfasst die trennende Gruppe im Allgemeinen 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 8 und insbesondere bevorzugt 1 bis 4 Heteroatome. Gemäß besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst die trennende Gruppe 1 bis 4 Sauerstoffatome. Die trennende Gruppe kann eine optional verzweigte Alkylkette oder eine Arylgruppe oder eine Cycloalkylgruppe mit beispielsweise 5 bis 7 Kohlenstoffatomen umfassen oder eine Aralkylgruppe sein, eine Alkarylgruppe, wobei der Alkylteil eine lineare und/oder cyclische Alkylgruppe sein kann. Gemäß einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die trennende Gruppe eine Alkylkette mit 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 8, noch bevorzugter 1 bis 6, noch bevorzugter 1 bis 4 und insbesondere bevorzugt 2 bis 4 Kohlenstoffatomen. Falls Heteroatome gegenwärtig sind, ist eine Kette, die 1 bis 4 Sauerstoffatome umfasst, besonders bevorzugt.
Spezifische Beispiele für Verbindungen (II), wobei X von der NH-Gruppe, die R' und R'' verbrückt, getrennt ist, sind unter anderem:
Die Gruppe, die die NH-Gruppe, welche R' und R'' verbrückt, und die mindestens eine funktionelle Gruppe X trennt, kann geeignet substituiert sein. Bevorzugte Substituenten sind beispielsweise Halogenide, wie etwa F, Cl, Br oder I.
Die Gruppe, die die NH-Gruppe, welche R' und R'' verbrückt, und die mindestens eine funktionelle Gruppe X trennt, kann eine oder mehrere Spaltstellen umfassen, wie etwa
die eine leichte Spaltung einer erhaltenen Verbindung an einer vorbestimmten Stelle ermöglichen.
Gemäß einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung (II) O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin
oder Carbohydrazid
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Verbindung (II) O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin oder Carbohydrazid ist.
Falls die Verbindung (II) ein oder mehrere chirale Zentren umfasst, kann die Verbindung (II) in R-Konformation oder in S-Konformation oder als racemische Verbindung in Bezug auf jedes chirale Zentrum vorliegen.
Wie vorstehend beschrieben kann die Verbindung (I) mit Verbindung (II) als solche umgesetzt werden, oder mit Verbindung (II), welche vor der Reaktion mit Verbindung (I) mit mindestens einer weiteren Verbindung umgesetzt wurde.
Die Reaktion von Verbindung (I) mit Verbindung (II) als sol che kann in mindestens einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt werden. Das jeweilige Lösungsmittel oder Gemisch aus zwei oder mehr Lösungsmitteln kann den spezifischen Bedürfnissen der Reaktionsbedingungen und der chemischen Natur der Verbindungen (I) und (II) angepasst sein. Gemäß einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Wasser als Lösungsmittel verwendet, und zwar entweder allein oder in Kombination mit mindestens einem anderen Lösungsmittel. Als das mindestens eine andere Lösungsmittel können DMSO, DMF, Methanol und Ethanol erwähnt werden. Bevorzugte Lösungsmittel sind, abgesehen von Wasser, DMSO, DMF, Methanol und Ethanol.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Reaktion von Verbindung (I) mit Verbindung (II) in einem wässrigen System durchgeführt wird.
Der Begriff „wässriges System”, so wie er im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf ein Lösungsmittel oder ein Gemisch aus Lösungsmitteln, das Wasser im Bereich von mindestens 10 Gew.%, bevorzugt mindestens 50 Gew.%, noch bevorzugter mindestens 80 Gew.%, noch stärker bevorzugt mindestens 90 Gew.%, oder bis zu 100 Gew.% umfasst, basierend auf dem Gewicht der verwendeten Lösungsmittel. Das bevorzugte Reaktionsmedium ist Wasser.
Hinsichtlich der Temperaturen, die während der Reaktion angelegt werden, liegen keine spezifischen Einschränkungen vor, sofern die Reaktion zum gewünschten Hydroxyalkylstärkederivat führt.
Wird die Verbindung (I) mit Verbindung (II) reagiert, wobei Verbindung (II) ein Hydroxylamin oder ein Hydrazid ist, so liegt die Temperatur bevorzugt im Bereich von 5 bis 45°C, noch bevorzugter im Bereich von 10 bis 30°C und insbesondere bevorzugt im Bereich von 15 bis 25°C.
Wird die Verbindung (I) mit Verbindung (II) reagiert, wobei die Reaktion eine reduktive Aminierung ist, so liegt die Temperatur bevorzugt im Bereich von bis zu 100°C, noch bevorzugter im Bereich von 20 bis 95°C, noch bevorzugter im Bereich von 25 bis 90°C, noch bevorzugter im Bereich von 70 bis 90°C und insbesondere bevorzugt im Bereich von 75 bis 85°C.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Reaktion von Verbindung (I) und Verbindung (II), wobei Verbindung (II) ein Hydroxylamin oder ein Hydrazid ist, bei einer Temperatur von 5 bis 45°C durchgeführt wird.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, bei dem die Reaktion von Verbindung (I) und Verbindung (II), wobei die Reaktion eine reduktive Aminierung ist, bei einer Temperatur von 25 bis 90°C durchgeführt wird.
Während des Verlaufs der Reaktion kann die Temperatur variiert, bevorzugt in den oben genannten Bereichen, oder im Wesentlichen konstant gehalten werden.
Die Reaktionszeit für die Reaktion der Verbindung (I) mit (II) kann an die spezifischen Bedürfnisse angepasst sein und liegt im Allgemeinen im Bereich von 1 h bis zu 7 d.
Falls Verbindung (II) ein Hydroxylamin oder ein Hydrazid ist, so liegt die Reaktionszeit bevorzugt im Bereich von 1 h bis 3 d und noch bevorzugter von 2 h bis 48 h.
Falls die die Reaktion von Verbindung (I) und Verbindung (II) eine reduktive Aminierung ist, so liegt die Reaktionszeit bevorzugt im Bereich von 2 h bis 7 d.
Der pH-Wert für die Reaktion der Verbindung (I) mit (II) kann an die spezifischen Bedürfnisse, wie etwa die chemische Natur der Reaktionsteilnehmer, angepasst sein.
Falls Verbindung (II) ein Hydroxylamin oder ein Hydrazid ist, so liegt der pH-Wert bevorzugt im Bereich von 4,5 bis 6,5.
Falls die die Reaktion von Verbindung (I) und Verbindung (II) eine reduktive Aminierung ist, so liegt der pH-Wert bevorzugt im Bereich von 8 bis 12.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, bei dem die Reaktion von Verbindung (I) und Verbindung (II), wobei Verbindung (II) ein Hydroxylamin oder ein Hydrazid ist, bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6,5 durchgeführt wird.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, bei dem die Reaktion von Verbindung (I) und Verbindung (II), wobei die Reaktion eine reduktive Aminierung ist, bei einem pH-Wert von 8 bis 12 durchgeführt wird.
Spezifische Beispiele für die oben genannten Reaktionsbedingungen sind beispielsweise eine Reaktionstemperatur von etwa 25 °C und ein pH-Wert von etwa 5,5, wenn die Verbindung ein Hydroxylamin ist, sowie eine Reaktionstemperatur von etwa 80°C und ein pH-Wert von etwa 11, wenn die Reaktion von Verbindung (I) und Verbindung (II) eine reduktive Aminierung ist.
Der passende pH-Wert des Reaktionsgemischs kann eingestellt werden, indem mindestens ein geeigneter Puffer zugesetzt wird. Von den bevorzugten Puffern können Natriumacetatpuffer, Phosphat- oder Boratpuffer erwähnt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Reaktionsprodukt, das sich aus der Reaktion von Verbindung (I) mit Verbindung (II) ergibt, mit mindestens einer weiteren Verbindung über die mindestens eine funktionelle Gruppe X reagiert.
Falls notwendig kann die mindestens eine funktionelle Gruppe X vor der Reaktion der Verbindung (I) mit Verbindung (II) mit mindestens einer geeigneten Schutzgruppe geschützt werden. Hierbei sind alle denkbaren Schutzgruppen möglich, die verhindern, dass die geschützte Verbindung (II) mit Verbindung (I) über die mindestens eine funktionelle Gruppe X reagiert. Die Schutzgruppe kann somit in Abhängigkeit von der chemischen Natur der zu schützenden funktionellen Gruppe X, von beispielsweise dem Lösungsmittel, in dem die Reaktion durchgeführt wird, oder dem pH-Wert des Reaktionsgemischs, gewählt werden. Bevorzugte Schutzgruppen sind unter anderem die Benzyloxycarbonylgruppe, die tert-Butoxycarbonylgruppe, die Methoxyphenylgruppe, die 2,4-Dimethoxyphenylgruppe, Triarylmethylgruppen, Trityl, die Monomethoxytritylgruppe, die Dimethoxytritylgruppe, die Monomethyltritylgruppe, die Dimethyltritylgruppe, die Trifluoracetylgruppe, Phthaliminverbindungen, 2-(Trialkylsilyl)ethoxycarbonylverbindungen, Fmoc, die tert-Butylgruppe oder Trialkylsilylgruppen.
Falls zwei oder mehr unterschiedliche funktionelle Gruppen X in der Verbindung (II) vorhanden sind, so kann mindestens eine Gruppe geschützt werden, während mindestens eine andere Gruppe ungeschützt belassen werden kann.
Nach der Reaktion von Verbindung (I) mit Verbindung (II) kann die mindestens eine Schutzgruppe im Reaktionsprodukt belassen oder durch geeignete Verfahren, wie etwa die gewöhnlichen, Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, abgespalten werden. Falls zwei verschiedene funktionelle Gruppen X durch geeignete Schutzgruppen geschützt sind, ist es möglich, mindestens eine Schutzgruppe abzuspalten, damit mindestens eine funktionelle Gruppe X für das weitere Umsetzen mit mindestens einer weiteren Verbindung zur Verfügung steht, und mindestens eine andere funktionelle Gruppe geschützt zu belassen, bis das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) mit Verbindung (II) mit der weiteren Verbindung reagiert wird. Danach kann die Schutzgruppe der noch immer geschützten funktionellen Gruppe abgespalten werden, damit die verbleibende funktionelle Gruppe X für das Umsetzen mit noch einer weiteren Verbindung zur Verfügung steht.
Die Verwendung von mindestens einer Schutzgruppe kann wichtig sein, um zu verhindern, dass die Reaktion zu einem Hydroxyalkylstärkederivat führt, das aus einer Verbindung (II) besteht, die mit zwei oder mehr Verbindungen (I) reagiert worden ist, d. h. einer multiplen HAS-substituierten Verbindung (II). Das gleiche Ergebnis kann aber auch durch Umsetzen der Verbindung (I) mit einem Überschuss an Verbindung (II) erzielt werden. Wenn eine überschüssige Menge an Verbindung (II) im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, so liegt das Molverhältnis von Verbindung (II) zu Verbindung (I) bevorzugt im Bereich von 2 bis 100.
Sobald das Reaktionsprodukt der Reaktion der Verbindung (I) mit Verbindung (II) gebildet ist, kann es durch mindestens ein geeignetes Verfahren vom Reaktionsgemisch isoliert werden. Falls notwendig kann das Reaktionsprodukt vor der Isolierung durch mindestens ein geeignetes Verfahren ausgefällt werden.
Wird das Reaktionsprodukt zuerst ausgefällt, so ist es möglich, beispielsweise das Reaktionsgemisch mit mindestens einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, bei dem es sich nicht um das Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch handelt, das im Reaktionsgemisch vorhanden ist, bei geeigneten Temperaturen zu kontaktieren. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wenn Wasser als Lösungsmittel verwendet wird, wird das Reaktionsgemisch mit einem Gemisch aus Ethanol und Aceton, bevorzugt einem 1:1-Gemisch, was gleiche Volumen der besagten Verbindungen anzeigt, bei einer Temperatur bevorzugt im Bereich von –20 bis +50°C und insbesondere bevorzugt im Bereich von 0 bis 25°C kontaktiert.
Die Isolierung des Reaktionsprodukts kann durch ein geeignetes Verfahren durchgeführt werden, das einen oder mehrere Schritte umfassen kann. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Reaktionsprodukt zunächst durch ein geeignetes Verfahren, wie etwa Zentrifugation oder Filtration, vom Reaktionsgemisch oder dem Gemisch aus dem Reaktionsgemisch und beispielsweise dem Ethanol-Aceton-Gemisch getrennt. In einem zweiten Schritt kann das getrennte Reaktionsprodukt einer weiteren Behandlung unterzogen werden, etwa einer Nachbehandlung, wie etwa Dialyse, Zentrifugalfiltration oder Druckfiltration, Ionenaustauschchromatographie, HPLC, MPLC, Gelfiltration und/oder Lyophilisation. Gemäß einer noch stärker bevorzugter Ausführungsform wird das getrennte Reaktionsprodukt zuerst dialysiert, bevorzugt gegen Wasser, und dann lyophilisiert, bis der Lösungsmittelgehalt des Reaktionsprodukts den gewünschten Spezifikationen des Produkts entsprechend ausreichend niedrig ist. Die Lyophilisation kann bei einer Temperatur von 20 bis 35°C, bevorzugt von 25 bis 30°C, durchgeführt werden.
Das so isolierte Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) kann mit mindestens einer anderen Verbindung über die mindestens eine funktionelle Gruppe X, die im Reaktionsprodukt umfasst ist, reagiert werden.
Abhängig von der chemischen Natur der funktionellen Gruppe X kann jede vorstellbare Verbindung, die fähig zum Bilden einer chemischen Verknüpfung mit dieser Gruppe X ist, verwendet werden. Für diese Reaktion können ein oder mehrere geeignete Lösungsmittel verwendet werden, und alle Reaktionsparameter, wie etwa die Temperatur während der Reaktion, die Reaktionszeit, die Verhältnisse der Reaktionsteilnehmer oder der pH-Wert des Reaktionsgemischs, können den spezifischen Bedürfnissen angepasst werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine Verbindung, die dazu imstande ist, eine chemische Bindung mit der mindestens einen funktionellen Gruppe X zu bilden, ein Polypeptid oder ein Gemisch aus mindestens zwei verschiedenen Polypeptiden.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit einem Polypeptid über die funktionelle Gruppe X, die in der Verbindung (II) umfasst ist, reagiert wird.
Gemäß einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine weitere Verbindung, die dazu imstande ist, eine chemische Bindung mit der mindestens einen funktionellen Gruppe X zu bilden, eine verknüpfende Verbindung, die dazu imstande ist, eine erste chemische Bindung mit der mindestens einen funktionellen Gruppe X des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II) zu bilden und eine zweite chemische Bindung mit einer zweiten weiteren Verbindung.
Gemäß einer sogar noch stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die zweite weitere Verbindung ein Polypeptid oder ein Gemisch aus mindestens zwei verschiedenen Polypeptiden.
Im Zusammenhang dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II), das erste Hydroxyalkylstärkederivat, mit der verknüpfenden Verbindung umzusetzen, um ein zweites Hydroxyalkylstärkederivat zu erhalten. Dieses zweite Hydroxyalkylstärkederivat kann anschließend mit der zweiten weiteren Verbindung, bevorzugt einem Polypeptid, umgesetzt werden, um ein drittes Hydroxyalkylstärkederivat zu ergeben.
Es ist jedoch auch möglich, das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II), das erste Hydroxyalkylstärkederivat, mit einem Reaktionsprodukt der verknüpfenden Verbindung mit der zweiten weiteren Verbindung, bevorzugt einem Polypeptid, umzusetzen.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei das Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (II) mit einer weiteren Verbindung, wobei die weitere Verbindung eine verknüpfende Verbindung ist, umgesetzt wird, und zwar über die Reaktion einer funktionellen Gruppe V, die in der verknüpfenden Verbindung umfasst ist, und einer funktionellen Gruppe X, die im Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (11) umfasst ist.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren, wobei das Reaktionsprodukt von Verbindungen (I) und (II) mit einer weiteren Verbindung umgesetzt wird, wobei die weitere Verbindung eine verknüpfende Verbindung ist, durch eine Reaktion einer funktionellen Gruppe V. die in der verknüpfenden Verbindung umfasst ist, und einer funktionellen Gruppe X, die im Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (II) umfasst ist, wobei die verknüpfende Verbindung vor der Reaktion mit dem Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (II) mit einer zweiten weiteren Verbindung umgesetzt wurde.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren, wobei die zweite weitere Verbindung ein Polypeptid ist, bevorzugt Erythropoietin, welches mit der verknüpfenden Verbindung durch Reaktion einer funktionellen Gruppe X, umfasst in der verknüpfenden Verbindung, umgesetzt wird.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren, wobei Verbindung (II) mit einer ersten weiteren Verbindung umgesetzt wird, bevorzugt einer verknüpfenden Verbindung, um ein erstes Reaktionsprodukt zu ergeben, wobei das erste Reaktionsprodukt mit einer zweiten weiteren Verbindung umgesetzt wird, um ein zweites Reaktionsprodukt zu ergeben, und das zweite Reaktionsprodukt mit Verbindung (I) umgesetzt wird.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren, wobei eine erste weitere Verbindung, bevorzugt eine verknüpfende Verbindung, mit einer zweiten weiteren Verbindung, bevorzugt einem Polypeptid, umgesetzt wird, um ein erstes Reaktionsprodukt zu ergeben, wobei das erste Reaktionsprodukt mit Verbindung (II) umgesetzt wird, um ein zweites Reaktionsprodukt zu ergeben, und das zweite Reaktionsprodukt mit Verbindung (I) umgesetzt wird, um das Hydroxyalkylstärkederivat zu ergeben.
Gemäß insbesondere bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die verknüpfenden Verbindungen dazu verwendet, eine chemische Brücke zwischen Verbindung (II) oder dem Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (II) und einer zweiten weiteren Verbindung zu bilden, wobei die funktionelle Gruppe der zweiten weiteren Verbindung, die mit der verknüpfenden Verbindung reagiert, eine -SH-Gruppe oder eine Aldehydgruppe oder eine Ketogruppe ist und die funktionelle Gruppe der Verbindung (II) oder des Reaktionsprodukts der Verbindungen (I) und (II), die mit der verknüpfenden Verbindung reagiert, eine Gruppe ist, die die Struktur -NH-, bevorzugt -NH₂, umfasst.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „verknüpfende Verbindung” auf chemische Verbindungen, die fähig zum Bilden einer Bindung zwischen Verbindung (II) oder dem Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (II) und mindestens einer gegebenen zweiten weiteren Verbindung sind. Je nach chemischer Natur der zweiten weiteren Verbindung umfasst die verknüpfende Verbindung mindestens eine funktionelle Gruppe V, die dazu imstande ist, mit der funktionellen Gruppe X umgesetzt zu werden, die in Verbindung (II) oder im Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (II) umfasst ist, sowie mindestens eine weitere funktionelle Gruppe, die dazu imstande ist, eine chemische Bindung mit der zweiten weiteren Verbindung zu bilden. Diese mindestens eine weitere funktionelle Gruppe, die in der verknüpfenden Verbindung umfasst ist, kann eine funktionelle Gruppe von jenem Typ sein, der oben bereits in Bezug auf die funktionelle Gruppe X erörtert wurde.
Die verknüpfende Verbindung kann dazu verwendet werden, um die Länge der insgesamten chemischen Brücke zwischen Verbindung (I) und der zweiten weiteren Verbindung, bevorzugt einem Polypeptid, zu vergrößern und/oder um die chemische Natur des resultierenden Reaktionsprodukts zu beeinflussen, mit oder ohne zweiter weiterer Verbindung, und/oder um die Möglichkeit bereitzustellen, eine Bindung zwischen mehreren zweiten weiteren Verbindungen und dem Reaktionsprodukt aus Verbindung (I), (II) und der verknüpfenden Verbindung zu bilden, und/oder um die funktionelle Gruppe X, die im Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und (II) umfasst ist, derart zu modifizieren, dass dieses Reaktionsprodukt dazu imstande ist, mit einer gegebenen weiteren Verbindung zu reagieren.
Demnach sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die oben erörtert wurden und die die chemische Modifikation der funktionellen Gruppe X, die eine -NH₂-Gruppe ist, mit einer weiteren Verbindung, z. B.
oder
betreffen, um die Möglichkeit zur Reaktion mit einer -SH-Gruppe bereitzustellen, die in einer zweiten weiteren Verbindung, bevorzugt einem Polypeptid, umfasst ist, spezifische Beispiele für das Umsetzen des Reaktionsprodukts der Verbindungen (I) und (II) mit einer verknüpfenden Verbindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die funktionelle Gruppe V eine funktionelle Gruppe von jenem Typ sein, der oben als funktionelle Gruppe X erörtert wurde.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine der funktionellen Gruppen X oder V eine Thiogruppe, und die funktionelle Gruppe V oder funktionelle Gruppe X ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
wobei Hal gleich Cl, Br oder I, bevorzugt Br oder I, ist.
Gemäß einer wiederum anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine der funktionellen Gruppen X oder V ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aktivierten Estern, so wie oben beschrieben, oder eine Carboxygruppe, die optional in einen aktivierten Ester umgewandelt wird. In diesem besonderen Fall umfasst die funktionelle Gruppe V bzw. die funktionelle Gruppe X die chemische Struktur -NH-.
Deshalb ist die verknüpfende Verbindung eine Verbindung mit mindestens zwei funktionellen Gruppen, die gleich oder unterschiedlich sind. Im Falle zweier funktioneller Gruppen kann die verknüpfende Verbindung homobifunktionell oder heterobifunktionell sein. Eine homobifunktionelle verknüpfende Verbindung stellt beispielsweise die Möglichkeit bereit, eine Brücke zwischen dem Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) mit (II) und einer zweiten weiteren Verbindung zu bilden, wobei das Reaktionsprodukt und die weitere Verbindung den gleichen Typ funktionelle Gruppen aufweisen. Eine heterobifunktionelle verknüpfende Verbindung stellt beispielsweise die Möglichkeit bereit, eine Brücke zwischen dem Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) mit (II) und einer zweiten weiteren Verbindung zu bilden, wobei das Reaktionsprodukt und die weitere Verbindung funktionelle Gruppen aufweisen, die nicht imstande sind, miteinander umzusetzen.
Die mindestens zwei funktionellen Gruppen der verknüpfenden Verbindung können direkt miteinander verknüpft sein oder durch eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Cycloalkyl- oder Aryl- oder Aralkyl- oder Arylcycloalkyl- oder Alkaryl- oder Cycloalkylarylgruppe getrennt sein, wobei diese Gruppen mindestens ein Heteroatom, wie etwa N, O, S, umfassen können und wobei diese Gruppen passend substituiert sein können. Die Länge der Gruppe, die die mindestens zwei funktionellen Gruppen der verknüpfenden Verbindung trennt, kann den spezifischen Bedürfnissen angepasst sein. Im Allgemeinen weist die trennende Gruppe 1 bis 60, bevorzugt 1 bis 40, noch bevorzugter 1 bis 20, noch bevorzugter 1 bis 10, noch bevorzugter 5 bis 10 Kohlenstoffatome auf. Sind Heteroatome gegenwärtig, so umfasst die trennende Gruppe im Allgemeinen 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 8 und insbesondere bevorzugt 1 bis 4 Heteroatome. Gemäß einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die trennende Gruppe eine Alkyl- oder Aralkylkette mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen. Die verknüpfende Verbindung kann zudem mindestens eine Spaltstelle aufweisen, so wie oben mit Bezug auf Verbindung (II) erörtert wurde.

Andere Beispiele für verknüpfende Verbindungen, die im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung zu erwähnen sind, können beispielsweise der folgenden Liste nach klassifiziert werden:

Art der verknüpfenden Verbindung	Funktionelle Gruppe, kann mit einer zweiten weiteren Verbindung, bevorzugt einem Polypeptid, umgesetzt werden	Funktionelle Gruppe V
A	Hydrazid (aldehydreaktiv)	Maleimido (SH-reaktiv)
B	Hydrazid (aldehydreaktiv)	Pydridyldithio (SH-reaktiv)
C	Iodalkyl (SH-reaktiv)	N-Succinimidester (aminreaktiv)
D	Bromalkyl (SH-reaktiv)	N-Succinimidester (aminreaktiv)
E	Maleimido (SH-reaktiv)	N-Succinimidester (aminreaktiv)
F	Pydridyldithio (SH-reaktiv)	N-Succinimidester (aminreaktiv)
G	Vinylsulfon (SH-reaktiv)	N-Succinimidester (aminreaktiv)

In Tabelle 1 am Ende der vorliegenden Beschreibung sind einige bevorzugte Beispiele für verknüpfende Verbindungen aufgelistet.
Wenn die mindestens eine weitere Verbindung, beispielsweise die verknüpfende Verbindung, ein oder mehrere chirale Zentren umfasst, so kann die mindestens eine weitere Verbindung in R-Konformation oder in S-Konformation oder als racemische Verbindung in Bezug auf jedes chirale Zentrum vorliegen.
Der Begriff „Polypeptid” bezieht sich, so wie er im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung verwendet wird, auf eine Verbindung, die mindestens zwei Aminosäuren umfasst, die über eine Peptidbindung, d. h. eine Bindung mit der Struktur -(C=O)-NH-, verknüpft sind. Das Polypeptid kann eine natürlich vorkommende Verbindung sein oder ein Polypeptid sein, das nicht natürlich vorkommt, wobei Letzteres natürlich vorkommende Aminosäuren und/oder mindestens eine Aminosäure, die nicht natürlich vor kommt, umfasst. Das Rückgrat des Polypeptids, die Polypeptidkette, kann ferner mit mindestens einem geeigneten Substituenten substituiert sein und somit mindestens eine Seitenkette aufweisen. Die mindestens eine funktionelle Gruppe Y kann Teil des Polypeptidrückgrats oder von mindestens einem Substituenten des Rückgrats sein, wobei Ausführungsformen möglich sind, die mindestens eine funktionelle Gruppe als Teil des Polypeptidrückgrats und mindestens eine funktionelle Gruppe als Teil von mindestens einem Substituenten des Polypeptidrückgrats umfassen.
Hinsichtlich des Polypeptids liegen keine Einschränkungen vor, sofern das Polypeptid mindestens eine funktionelle Gruppe Y umfasst. Die funktionelle Gruppe Y kann direkt mit dem Polypeptidrückgrat verknüpft sein oder Teil einer Seitenkette des Rückgrats sein. Die Seitenkette oder die funktionelle Gruppe Y oder beide können Teil eines natürlich vorkommenden Polypeptids sein oder vor der Reaktion mit der funktionellen Gruppe X in ein natürlich vorkommendes Polypeptid oder in ein Polypeptid, das zumindest teilweise nicht natürlich vorkommt, eingeführt worden sein.
Ferner kann das Polypeptid zumindest teilweise menschlicher oder tierischer Herkunft sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid menschlicher Herkunft.
Das Polypeptid kann ein Cytokin, insbesondere Erythropoietin, ein Antithrombin (AT), wie etwa AT III, ein Interleukin, insbesondere Interleukin-2, IFN-beta, IFN-alpha, G-CSF, CSF, Interleukin-6 und therapeutische Antikörper sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid ein Antithrombin (AT), bevorzugt AT III (Levy JH, Weisinger A, Ziomek CA, Echelard Y, Recombinant Antithrombin: Production and Role in Cardiovascular Disorder, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 4 (2001) 405–416; Edmunds T, Van Patten SM, Pollock J, Hanson E, Bemasconi R, Higgins E, Manavalan P, Ziomek C, Meade H, McPherson J, Cole ES, Transgenically Produced Human Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin, Blood 91, 12 (1998) 4661–4671; Minnema MC, Chang ACK, Jansen PM, Lubbers YTP, Pratt BM, Whittaker BG, Taylor FB, Hack CE, Friedman B, Recombinant human antithrombin III improves survival and attenuates inflammatory responses in baboons lethally challenged with Escherichia coli, Blood 95, 4 (2000) 1117–1123; Van Patten SM, Hanson EH, Bemasconi R, Zhang K, Manavaln P, Cole ES, McPherson JM, Edmunds T. Oxidation of Methionine Residues in Antithrombin, J. Biol. Chemistry 274, 15 (1999) 10268–10276).
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid menschliches IFN-beta, insbesondere IFN-beta 1a (siehe Avonex^®, REBIF^®) und IFN-beta 1b (siehe BETASERON^®).
Ein weiteres bevorzugtes Polypeptid ist menschliches G-CSF (Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor). Vergleiche beispielsweise Nagata et al., The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor, EMBO J. 5: 575–581, 1986; Souza et al., Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects an normal and leukemic myeloid cells, Science 232 (1986) 61–65; und Herman et al., Characterization, formulation, and stability of Neupogen® (Filgrastim), a recombinant human granulocyte-colony stimulating factor, in: Formulalion, characterization, and stability of Protein drugs, Rodney Pearlman and Y. John Wang, Hrsg., Plenum Press, New York, 1996, 303–328.
Wird ein Gemisch von mindestens zwei unterschiedlichen Polypeptiden verwendet, so können sich die mindestens zwei Polypeptide beispielsweise hinsichtlich der Molekülmasse, der Anzahl und/oder Sequenz von Aminosäuren, unterschiedlicher Grade der Glykosylierung, der Anzahl und/oder chemischen Natur der Substituenten oder der Anzahl an Polypeptidketten, die durch geeignete chemische Bindungen, wie etwa Disulfidbrücken, verknüpft sind, unterscheiden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II), optional weiter umgesetzt mit einer verknüpfenden Verbindung, isoliert, bevorzugt gemäß mindestens einem der oben genannten Verfahren, und anschließend mit einem Polypeptid umgesetzt, das mindestens eine funktionelle Gruppe Y aufweist, die dazu imstande ist, mit der mindestens einen funktionellen Gruppe X des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II), optional weiter umgesetzt mit einer verknüpfenden Verbindung, umgesetzt zu werden, um mindestens eine chemische Bindung zu bilden. Funktionelle Gruppen Y von Polypeptiden, wie etwa Proteinen, sind z. B.
oder eine Kohlehydratkomponente, die durch N-Glykosylierung oder O-Glykosylierung mit dem Polypeptid verknüpft sein kann.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Kohlehydratkomponente” auf Hydroxyaldehyde oder Hydroxyketone sowie auf chemische Modifikationen davon (vgl. Römpp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart, Deutschland, 9. Auflage 1990, Vol. 9, Seiten 2281–2285, und die darin zitierte Literatur). Ferner bezieht er sich auf Derivate natürlich vorkommender Kohlehydratkomponenten, wie etwa Glucose, Galactose, Mannose, Sialinsäure und dergleichen. Der Begriff umschließt auch chemisch oxidierte, natürlich vorkommende Kohlehydratkomponenten. Die Struktur der oxidierten Kohlehydratkomponente kann cyclisch oder linear sein.
Die Kohlehydratkomponente kann direkt mit dem Polypeptidrückgrat verknüpft sein. Die Kohlehydratkomponente ist vorzugsweise Teil einer Kohlehydratseitenkette. Noch bevorzugter ist die Kohlehydratkomponente die endständige Gruppe der Kohlehydratseitenkette.
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Kohlehydratkomponente ein Galactoserest der Kohlehydratseitenkette, bevorzugt der endständige Galactoserest der Kohlehydratseitenkette. Dieser Galactoserest kann für die Reaktion mit dem Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) durch Entfernen endständiger Sialinsäuren, gefolgt von Oxidation, so wie nachstehend beschrieben wird, verfügbar gemacht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und (II) mit einem Sialinsäurerest der Kohlehydratseitenketten verknüpft, bevorzugt dem endständigen Sialinsäurerest der Kohlehydratseitenkette.
Eine Oxidation von endständigen Kohlehydratkomponenten kann entweder chemisch oder enzymatisch durchgeführt werden.
Verfahren zur chemischen Oxidation von Kohlehydratkomponen ten von Polypeptiden sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen die Behandlung mit Perjodat (Chamow et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916–15922).
Durch chemisches Oxidieren ist es im Prinzip möglich, jedwede Kohlehydratkomponente, ob endständig angeordnet oder nicht, zu oxidieren. Durch Wählen milder Bedingungen (1 mM Perjodat, 0°C, im Gegensatz zu harschen Bedingungen von 10 mM Perjodat, 1 h lang bei Raumtemperatur) ist es jedoch möglich, die endständige Sialinsäure der Kohlehydratseitenkette bevorzugt zu oxidieren.
Alternativ dazu kann die Kohlehydratkomponente enzymatisch oxidiert werden. Enzyme zur Oxidation der einzelnen Kohlehydratkomponenten sind auf dem Fachgebiet bekannt, beispielsweise im Fall von Galactose das Enzym Galactose-Oxidase. Besteht die Absicht, endständige Galactosegruppen zu oxidieren, ist es schlussendlich notwendig, endständige Sialinsäuren (teilweise oder vollständig) zu entfernen, wenn das Polypeptid in Zellen hergestellt wurde, die zum Anfügen von Sialinsäuren an Kohlehydratketten imstande sind, beispielsweise in Säugerzellen oder in Zellen, die genetisch modifiziert wurden, um dazu imstande zu sein, Sialinsäuren an Kohlehydratketten anzufügen. Chemische oder enzymatische Verfahren zum Entfernen von Sialinsäuren sind auf dem Fachgebiet bekannt (Chaplin und Kennedy (Hrsg.), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, insbesondere Kapitel 5 Montreuill, Glycoproteins, Seiten 175–177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)).
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit dem Polypeptid über eine oxidierte Kohlehydratkomponente, die im Polypeptid umfasst ist, umgesetzt wird.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die funktionelle Gruppe des Polypeptids die Thiogruppe. Deshalb kann das Reaktionsprodukt der Verbindung (I) und (II) über eine Thioethergruppe mit dem Polypeptid verknüpft sein, wobei das S-Atom von jedweder Thiogruppe abgeleitet sein kann, die im Polypeptid umfasst ist.
Die Thiogruppe kann im Polypeptid als solches gegenwärtig sein. Zudem ist es möglich, eine Thiogruppe einem geeigneten Verfahren gemäß in das Polypeptid einzuführen. Unter anderem können chemische Verfahren erwähnt werden. Wenn eine Disulfidbrücke im Polypeptid vorhanden ist, so ist es möglich, die -S-S-Struktur zu reduzieren, um eine Thiogruppe zu erhalten. Es ist ebenfalls möglich, eine im Polypeptid vorhandene Aminogruppe in eine SH-Gruppe umzuwandeln, indem das Polypeptid über die Aminogruppe mit einer Verbindung umgesetzt wird, die mindestens zwei unterschiedliche funktionelle Gruppen aufweist, von denen eine dazu imstande ist, mit der Aminogruppe umgesetzt zu werden, und die andere eine SH-Gruppe oder ein Vorläufer einer SH-Gruppe ist. Diese Modifikation einer Aminogruppe kann als ein Beispiel betrachtet werden, bei dem das Protein zuerst mit einer Verbindung (L) umgesetzt wird, die mindestens zwei unterschiedliche funktionelle Gruppen aufweist, von denen eine dazu imstande ist, mit der Aminogruppe umgesetzt zu werden, und die andere eine SH-Gruppe ist, und bei dem das entstandene Reaktionsprodukt anschließend mit beispielsweise einem HAS-Derivat umgesetzt wird, das HAS und eine Verbindung (D) umfasst, wobei das Derivat eine funktionelle Gruppe umfasst, die dazu imstande ist, mit der SH-Gruppe umzusetzen. Es ist ebenfalls möglich, eine SH-Gruppe durch Mutation des Polypeptids einzuführen, wie etwa durch Einführen eines Cysteins oder einer geeigneten SH-funktionellen Aminosäure in das Polypeptid, oder wie etwa das Entfernen eines Cysteins aus dem Polypeptid, um ein anderes Cystein im Polypeptid zu blockieren, um eine Disulfidbrücke zu bilden.
Im Zusammenhang dieser Ausführungsform ist es besonders bevorzugt, das Polypeptid mit einem Reaktionsprodukt umzusetzen, das sich aus der Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und (II) mit einer verknüpfenden Verbindung ergibt.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit einer verknüpfenden Verbindung umgesetzt wird und das erhaltene Reaktionsprodukt weiter mit dem Polypeptid über eine oxidierte Kohlehydratkomponente und/oder eine Thiogruppe, die im Polypeptid umfasst ist, umgesetzt wird.
Als insbesondere bevorzugtes Polypeptid wird Erythropoietin (EPO) verwendet.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei das Polypeptid Erythropoietin ist.
Das EPO kann von beliebiger menschlichen Herkunft sein (vgl. beispielsweise Inoue, Wada, Takeuchi, 1994, An improved method for the purification of human erythropoietin with high in vivo activity from the urine of anemic patients, Biol. Pharm. Bull. 17(2), 180–4; Miyake, Kung, Goldwasser, 1977, Purification of human erythropoietin., J. Biol. Chem., 252(15), 5558–64) oder aus einer anderer Säugetierquelle stammen und kann durch Reinigung aus natürlich vorkommenden Quellen, wie etwa einer menschlichen Niere, einer embryonalen menschlichen Leber oder tierischen Leber, bevorzugt Affenleber, erhalten werden. Außerdem umfasst der Ausdruck „Erythropoietin” oder „EPO” auch eine EPO-Variante, bei der eine oder mehrere Aminosäuren (beispielsweise 1 bis 25, bevorzugt 1 bis 10, noch bevorzugter 1 bis 5, am stärksten bevorzugt 1 oder 2) mit einer anderen Aminosäure ausgetauscht wurden und die erythropoietische Aktivität aufweist (vgl. beispielsweise EP 640 619 B1 ). Die Messung der erythropoietischen Aktivität ist auf dem Fachgebiet beschrieben (zur Messung der Aktivität in vitro vgl. beispielsweise Fibi et al., 1991, Blond, 77, 1203 ff; Kitamura et al., 1989, J. Cell Phys., 140, 323–334; fzur Messung der Aktivität in vivo vgl. Ph. Eur. 2001, 911–917; Ph. Eur. 2000, 1316 Erythropoietini solutio concentrata, 780–785; European Pharmacopoeia (1996/2000); European Pharmacopoeia, 1996, Erythropoietin concentrated solution, Pharmaeuropa., 8, 371–377; Fibi, Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettlmeissl., 1995, N- and O-glycosylation muteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells, Blond, 85(5), 1229–36; (EPO und modifizierte EPO-Formen wurden in weibliche NMRI-Mäuse (gleiche Proteinmengen 50 ng/Maus) an Tag 1, 2 und 3 injiziert, an Tag 4 wurden Blutproben genommen und Reticulocyten bestimmt)). Weitere Publikationen, in denen Tests zur Messung der Aktivität von EPO beschrieben sind, sind Barbone, Aparicio, Anderson, Natarajan, Ritchie, 1994, Reticulocytes measurements as a bioassay for erythropoietin, J. Pharm. Biomed. Anal., 12(4), 515–22; Bowen, Culligan, Beguin, Kendall, Villis, 1994, Estimation of effective and total erythropoiesis in myelodysplasia using serum transferrin receptor and erythropoietin concentrations, with automated reticulocyte parameters, Leukemi, 8(1), 151–5; Delorme, Lorenzini, Giffin, Martin, Jacobsen, Bonne, Elliott, 1992, Role of glycosylation an the secretion and biological activity of erythropoietin, Biochemistry, 31(41), 9871–6; Higuchi, Oheda, Kuboniwa, Tomonoh, Shimonaka, Ochi, 1992, Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin, J. Biol. Chem., 267(11), 7703–9; Yamaguchi, Akai, Kawanishi, Ueda, Masuda, Sasaki, 1991, effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin an its produktion and biological properties, J. Biol. Chem., 266(30), 20434–9; Takeuchi, Inoue, Strickland, Kubota, Wada, Shimizu, Hoshi, Kozutsumi, Takasaki, Kobata, 1989, Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(20), 7819–22; Kurtz, Eckardt, 1989, Assay methods for erythropoietin, Nephron., 51(1), 11–4 (Deutsch); Zucali, Sulkowski, 1985, Purification of human urinarg erythropoietin an controlled-pore glass and silicic acid, Exp. Hematol., 13(3), 833–7; Krystal, 1983, Physical and biological characterization of erythroblast enhancing factor (EEF), a late acting erythropoietic stimulator in serum distinct from erythropoietin, Exp. Hematol., 11 (1), 18–31.
Vorzugsweise ist das EPO rekombinant produziert. Dies schließt die Produktion in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen, bevorzugt Säuger-, Insekten-, Hefe-, Bakterienzellen, oder in jedem anderen Zelltyp, der für die rekombinante Produktion von EPO zweckdienlich ist, ein. Außerdem kann das EPO in transgenen Tieren exprimiert werden (z. B. in Körperflüssigkeiten, wie etwa Milch, Blut usw.), in Eiern transgener Vögel, insbesondere Geflügel, bevorzugt Hühner, oder in transgenen Pflanzen.
Die rekombinante Produktion eines Polypeptids ist im Fachgebiet bekannt. Im Allgemeinen umfasst dies die Transfektion von Wirtszellen mit einem passenden Expressionsvektor, die Kultivierung der Wirtszellen unter Bedingungen, die die Produktion des Polypeptids zulassen, und die Reinigung des Polypeptids aus den Wirtszellen. Für detaillierte Informationen vgl. beispielsweise Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blond, 67(1), 71–9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blond, 74(2), 652–7; EP 640 619 B1 und EP 668 351 B1 .
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das EPO die Aminosäuresequenz von menschlichem EPO auf (vgl. EP 148 605 B2 ).
Das EPO kann eine oder mehrere Kohlehydratseitenketten, bevorzugt 1 bis 12, noch bevorzugter 1 bis 9, noch stärker bevorzugt 1 bis 6 und besonders bevorzugt 1 bis 4, insbesondere bevorzugt 4 Kohlehydratseitenketten, umfassen, die über N- und/oder O-verknüpfte Glykosylierung am EPO angefügt sind, d. h. das EPO ist glykosyliert. Üblicherweise wird bei der Produktion von EPO in eukaryotischen Zellen das Polypeptid posttranslational glykosyliert. Folglich könnten die Kohlehydratseitenketten während der Biosynthese in Säuger-, insbesondere Menschen-, Insekten- oder Hefezellen an das EPO angefügt worden sein. Die Struktur und die Eigenschaften von glykosyliertem EPO wurden auf dem Fachgebiet ausgiebig untersucht (vgl. EP 428 267 B1 ; EP 640 619 B1 ; Rush, Derby, Smith, Merry, Rogers, Rohde, Katta, 1995, Microheterogeneity of erythropoietin carbohydrate structure, Anal Chem., 67(8), 1442–52; Takeuchi, Kobata, 1991, Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoietins, Glycobiology, 1(4), 337–46 (Review).
Deshalb kann das Hydroxyalkylstärkederivat gemäß der vorliegende Erfindung mindestens ein, bevorzugt 1 bis 12, noch bevorzugter 1 bis 9, noch stärker bevorzugt 1 bis 6 und besonders bevorzugt 1 bis 4 HAS-Moleküle pro EPO-Molekül aufweisen. Die Anzahl der HAS-Moleküle pro EPO-Molekül kann durch quantitative Analyse der Kohlehydratzusammensetzung unter Verwendung von GC-MS nach Hydrolyse des Produkts und Derivatisierung der resultierenden Monosaccharide bestimmt werden (vgl. Chaplin und Kennedy (Hrsg.), 1986, Carbohydrate Analysis: a practical approach, IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3), insbesondere Kapitel 1, Monosaccharides, Seite 1–36; Kapitel 2, Oligosaccharides, Seite 37–53, Kapitel 3, Neutral Polysaccharides, Seite 55–96).
Gemäß einer insbesonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Kohlehydratkomponente, die mit EPO verknüpft ist, Teil einer Kohlehydratseitenkette. Noch bevorzugter ist die Kohlehydratkomponente die endständige Gruppe der Kohlehydratseitenkette. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Kohlehydratkomponente ein Galactoserest der Kohlehydratseitenkette, bevorzugt der endständige Galactoserest der Kohlehydratseitenkette. Dieser Galactoserest kann für die Reaktion mit dem Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) durch Entfernen endständiger Sialinsäuren, gefolgt von Oxidation, so wie nachstehend beschrieben wird, verfügbar gemacht werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und (II) mit einem Sialinsäurerest der Kohlehydratseitenketten verknüpft, bevorzugt dem endständigen Sialinsäurerest der Kohlehydratseitenkette. Die Sialinsäure wird so wie hierin beschrieben oxidiert.
Besonders bevorzugt wird dieser Galactoserest für die Reaktion mit dem Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (II) oder mit dem Reaktionsprodukt der Reaktion des Reaktionsprodukts der Verbindungen (I) und (II) und einer verknüpfenden Verbindung über die funktionelle Gruppe X durch Entfernen endständiger Sialinsäuren, gefolgt von Oxidation, verfügbar gemacht.
Wie oben erwähnt wurde, kann das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II), das optional mit einer verknüpfenden Verbindung umgesetzt wurde, mit einer Thiogruppe, die im EPO umfasst ist, umgesetzt werden.
Es ist ebenfalls möglich, das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II), das optional mit einer verknüpfenden Verbindung umgesetzt wurde, mit einer Thiogruppe sowie mit einer Kohlehydratkomponente umzusetzen, wobei jede dieser in der mindestens einen weiteren Verbindung, bevorzugt einem Polypeptid, noch bevorzugter Erythropoietin, umfasst ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann diese SH-Gruppe mit einer vorzugsweise oxidierten Kohlehydratkomponente verknüpft sein, beispielsweise durch Verwendung eines Hydroxylaminderivats, beispielsweise 2-(Aminooxy)ethylmercaptanhydrochlorid (Bauer L. et al., 1965, J. Org. Chem., 30, 949), oder durch Verwendung eines Hydrazidderivats, beispielsweise Thioglykolsäurehydrazid (Whitesides et al., 1977, J. Org. Chem., 42, 332).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Thiogruppe bevorzugt in einer oxidierten Kohlehydratkomponente von EPO, noch bevorzugter in einer oxidierten Kohlehydratkomponente, die Teil einer Kohlehydratseitenkette von EPO ist, eingeführt.
Vorzugsweise ist die Thiogruppe von einem natürlich vorkommenden Cystein oder oder einem hinzugefügten Cystein abgeleitet.
Noch bevorzugter weist das EPO die Aminosäuresequenz von menschlichem EPO auf, und die natürlich vorkommenden Cysteine sind Cystein 29 und/oder 33. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II), das optional mit einer verknüpfenden Verbindung umgesetzt wurde, mit Cystein 29 reagiert, während Cystein 33 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist. Alternativ dazu wird das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II), das optional mit einer verknüpfenden Verbindung umgesetzt wurde, mit Cystein 33 reagiert, während Cystein 29 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung gibt der Begriff „hinzugefügte Cysteine” an, dass die Polypeptide, bevorzugt EPO, einen Cysteinrest umfassen, der im Wildtyp-Polypeptid nicht vorhanden ist.
Im Zusammenhang dieses Aspekts der Erfindung kann das Cystein eine zusätzliche Aminosäure sein, die am N- oder C-Terminus von EPO hinzugefügt ist.
Außerdem können die hinzugefügten Cysteine hinzugefügt worden sein, indem eine natürlich vorkommende Aminosäure durch Cystein oder einem geeignet substituierten Cystein ersetzt wurde. Vorzugsweise ist im Zusammenhang dieses Aspekts der Erfindung das EPO menschliches EPO, und der ersetzte Aminosäurerest ist Serin 126.
Die Reaktionsbedingungen der Reaktion des Reaktionsprodukts der Verbindungen (I) und (II), optional umgesetzt mit einer verknüpfenden Verbindung, mit der mindestens einen weiteren Verbindung können an die spezifischen Bedürfnisse der jeweiligen Reaktion angepasst sein, wie im Fall, dass die mindestens eine weitere Verbindung ein Polypeptid ist, oder im Fall, dass die mindestens eine weitere Verbindung eine verknüpfende Verbindung ist, oder im Fall, dass die mindestens eine weitere Verbindung ein Reaktionsprodukt von einer verknüpfenden Verbindung und eines Polypeptids ist. Als Pufferverbindungen können bevorzugt mindestens eine der oben genannten Verbindungen verwendet werden. Als Lösungsmittel oder Gemisch aus Lösungsmitteln kann bevorzugt mindestens eines der oben genannten Lösungsmittel verwendet werden. Isolierung und/oder Nachbehandlung kann durchgeführt werden, wobei bevorzugte Verfahren aus den oben erörterten Verfahren ausgewählt werden.
Wird das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) beispielsweise mit einem Polypeptid als weitere Verbindung, bevorzugt EPO, weiter umgesetzt, so wird bevorzugt Wasser als Lösungsmittel für die Reaktion verwendet. Zusätzlich zu Wasser kann mindestens ein weiteres Lösungsmittel gegenwärtig sein. Als bevorzugtes mögliches weiteres Lösungsmittel können DMSO, DMF, Methanol oder Ethanol erwähnt werden.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit einem Polypeptid, bevorzugt EPO, in einem wässrigen System durchgeführt wird.
Hinsichtlich der Temperaturen, die während dieser Reaktion angelegt werden, liegen keine spezifischen Einschränkungen vor, sofern die Reaktion zum gewünschten Hydroxyalkylstärkederivat führt, das das Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (II) umfasst, reagiert mit dem Polypeptid über die mindestens eine funktionelle Gruppe X. Die Temperatur der Reaktion liegt bevorzugt im Bereich von 4 bis 37°C, noch bevorzugter im Bereich von 10 bis 30°C, insbesondere bevorzugt im Bereich von 15 bis 25°C.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit dem Polypeptid bei einer Temperatur von 4 bis 37°C durchgeführt wird.
Während des Verlaufs der Reaktion kann die Temperatur variiert werden, bevorzugt in den oben genannten Bereichen, oder im Wesentlichen konstant gehalten werden.
Die Reaktionszeit für die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit dem Polypeptid kann an die spezifischen Bedürfnisse angepasst sein und liegt im Allgemeinen im Bereich von 0,5 bis 48 h, bevorzugt im Bereich von 2 bis 24 h und insbesondere bevorzugt im Bereich von 10 bis 20 h.
Der pH-Wert für die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit dem Polypeptid kann an die spezifischen Bedürfnisse, wie etwa die chemische Natur der Reaktionsteilnehmer, angepasst sein.
Wird das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und (II) beispielsweise mit einer weiteren Verbindung umgesetzt über die Re aktion einer funktionellen Gruppe X, die eine Hydroxylaminogruppe -O-NH₂ mit mindestens einer Aldehydgruppe ist, die im Polypeptid umfasst ist, so liegt der pH-Wert bevorzugt im Bereich von 4,5 bis 6, noch bevorzugter bei etwa 5,5.
Wird das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) beispielsweise mit einer verknüpfenden Verbindung als weitere Verbindung weiter umgesetzt, bevorzugt EPO, so wird bevorzugt Wasser als Lösungsmittel für die Reaktion verwendet. Zusätzlich zu Wasser kann mindestens ein weiteres Lösungsmittel gegenwärtig sein. Als bevorzugtes mögliches weiteres Lösungsmittel können DMSO, DMF, Methanol oder Ethanol erwähnt werden.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit einer verknüpfenden Verbindung in einem wässrigen System durchgeführt wird.
Hinsichtlich der Temperaturen, die während dieser Reaktion angelegt werden, liegen keine spezifischen Einschränkungen vor, sofern die Reaktion zum gewünschten Hydroxyalkylstärkederivat führt, das das Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (II) umfasst, reagiert mit der verknüpfenden Verbindung über die mindestens eine funktionelle Gruppe X. Die Temperatur der Reaktion liegt bevorzugt im Bereich von 4 bis 37°C, noch bevorzugter im Bereich von 10 bis 30°C, insbesondere bevorzugt im Bereich von 15 bis 25°C.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit der verknüpfenden Verbindung bei einer Temperatur von 4 bis 37°C durchgeführt wird.
Während des Verlaufs der Reaktion kann die Temperatur variiert werden, bevorzugt in den oben genannten Bereichen, oder im Wesentlichen konstant gehalten werden.
Die Reaktionszeit für die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit der verknüpfenden Verbindung kann an die spezifischen Bedürfnisse angepasst sein und liegt im Allgemeinen im Bereich von 10 min bis 10 h, bevorzugt von 20 min bis 5 h und noch bevorzugter von 30 min bis 2 h.
Der pH-Wert für die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit der verknüpfenden Verbindung kann an die spezifischen Bedürfnisse, wie etwa die chemische Natur der Reaktionsteilnehmer, angepasst sein.
Wird das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und (II) beispielsweise mit einer verknüpfenden Verbindung, welche eine verknüpfende Verbindung ist, über die funktionelle Gruppe X umgesetzt, die im Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und (II) umfasst ist und eine Aminogruppe -NH₂ ist, so liegt der pH-Wert bevorzugt im Bereich von 7 bis 8,5, noch bevorzugter bei etwa 7,2.
Wird das Reaktionsprodukt der Reaktion des Reaktionsprodukts der Verbindungen (I) und (II) und einer verknüpfenden Verbindung beispielsweise mit eine Polypeptid, bevorzugt EPO, weiter umgesetzt, so wird bevorzugt Wasser als Lösungsmittel für die Reaktion verwendet. Zusätzlich zu Wasser kann mindestens ein weiteres Lösungsmittel gegenwärtig sein. Als bevorzugtes mögliches weiteres Lösungsmittel können DMSO, DMF, Methanol oder Ethanol erwähnt werden.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II), das mit einer verknüpfenden Verbindung weiter umgesetzt wurde, mit einem Polypeptid in einem wässrigen System durchgeführt wird.
Hinsichtlich der Temperaturen, die während dieser Reaktion angelegt werden, liegen keine spezifischen Einschränkungen vor, sofern die Reaktion zum gewünschten Hydroxyalkylstärkederivat führt, das das Reaktionsprodukt der Verbindungen (I) und (II) umfasst, reagiert mit einer verknüpfenden Verbindung und weiter reagiert mit einem Polypeptid über die mindestens eine funktionelle Gruppe X, die in der verknüpfenden Verbindung umfasst ist. Die Temperatur der Reaktion liegt bevorzugt im Bereich von 4 bis 37°C, noch bevorzugter im Bereich von 10 bis 30°C, insbesondere bevorzugt im Bereich von 15 bis 25°C.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie oben beschriebenes Verfahren, wobei die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II), das mit einer verknüpfenden Verbindung weiter umgesetzt wurde, mit dem Polypeptid bei einer Temperatur von 4 bis 37°C durchgeführt wird.
Während des Verlaufs der Reaktion kann die Temperatur variiert werden, bevorzugt in den oben genannten Bereichen, oder im wesentlichen konstant gehalten werden.
Die Reaktionszeit für die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II), das mit einer verknüpfenden Verbindung weiter umgesetzt wurde, mit dem Polypeptid kann an die spezifischen Bedürfnisse angepasst sein und liegt im Allgemeinen im Bereich von 0,5 bis 48 h, bevorzugt im Bereich von 2 bis 24 h und insbesondere bevorzugt im Bereich von 10 bis 20 h.
Der pH-Wert für die Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II), das mit einer verknüpfenden Verbindung weiter umgesetzt wurde, mit dem Polypeptid kann an die spezifischen Bedürfnisse, wie etwa die chemische Natur der Reaktionsteilnehmer, angepasst sein.
Wird beispielsweise das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und (II), das mit einer verknüpfenden Verbindung weiter umgesetzt wurde, mit einem Polypeptid über die funktionelle Gruppe X reagiert, die in der verknüpfenden Verbindung umfasst ist und eine Aminogruppe -NH₂ ist, so liegt der pH-Wert bevorzugt im Bereich von 7 bis 8,5, noch bevorzugter bei etwa 7,2.
Der passende pH-Wert des Reaktionsgemischs kann in jedem Einzelfall eingestellt werden, indem mindestens ein geeigneter Puffer zugesetzt wird. Von den bevorzugten Puffern können Natriumacetatpuffer, Natriumphosphatpuffer oder Boratpuffer erwähnt werden.
Das Reaktionsprodukt, das sich aus der Reaktion des Reaktionsprodukts von Verbindung (I) und Verbindung (II) mit der mindestens einer weiteren Verbindung ergibt, wobei die mindestens eine weitere Verbindung entweder ein Polypeptid oder eine verknüpfende Verbindung ist, und das Reaktionsprodukt, das ferner die Verbindungen umfasst, die sich aus den Reaktionen von Verbindung (I), Verbindung (II), einer verknüpfenden Verbindung und einem Polypeptid ergeben, können durch mindestens ein geeignetes Verfahren aus dem Reaktionsgemisch isoliert und mindestens einer weiteren Behandlung, wie etwa mindestens einer Nachbehandlung, wie etwa Dialyse und/oder Lyophilisation, unterzogen werden.
Sobald das oben genannte Reaktionsprodukt gebildet ist, kann es durch mindestens ein geeignetes Verfahren aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden.
Die Isolierung des Reaktionsprodukts kann mithilfe eines geeigneten Verfahrens durchgeführt werden, das einen oder mehrere Schritte umfassen kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er findung wird das Reaktionsprodukt, wenn das Reaktionsprodukt kein Polypeptid umfasst, zunächst vorzugsweise durch Zentrifugalfiltration vom Reaktionsgemisch oder dem Gemisch des Reaktionsgemischs getrennt. In einem zweiten Schritt kann das getrennte Reaktionsprodukt einer weiteren Behandlung unterzogen werden, etwa einer Nachbehandlung, wie etwa Dialyse und/oder Lyophilisation. Gemäß einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform wird das getrennte Reaktionsprodukt zuerst dialysiert, bevorzugt gegen Wasser, und dann lyophilisiert, bis der Lösungsmittelgehalt des Reaktionsprodukts den gewünschten Spezifikationen des Produkts entsprechend ausreichend niedrig ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Reaktionsprodukt, wenn das Reaktionsprodukt das Polypeptid umfasst, vorzugsweise so wie in Beispiel 7.8 beschrieben isoliert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Verbindung (II) vor der Reaktion mit Verbidung (I) mit einer weiteren Verbindung umgesetzt, d. h. ein Derivat von Verbindung (II) wird vor der Reaktion mit Verbindung (I) durch die Reaktion von Verbindung (II) über die mindestens eine funktionelle Gruppe X mit mindestens einer weiteren Verbindung, die mindestens eine funktionelle Gruppe Y umfasst, wie vorstehend beschrieben hergestellt.
Wenn Verbindung (II) zuerst mit einer weiteren Verbindung umgesetzt wird, bevorzugt einem Polypetid, weiter bevorzugt EPO, wird Wasser bevorzugt als Lösungsmittel für die Reaktion verwendet. Zusätzlich zu Wasser kann mindestens ein weiteres Lösungsmittel vorhanden sein. Als bevorzugtes mögliches weiteres Lösungsmittel kann DMSO, DMF, Methanol und Ethanol genannt werden.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren, wobei die Reaktion von Verbindung (II), vor der Reaktion mit Verbindung (I), mit einer weiteren Verbindung, bevorzugt einem Polypeptid, sogar noch weiter bevorzugt EPO, in einem wässrigen System durchgeführt wird.
Was die Temperaturen betrifft, die während dieser Reaktion angewendet werden, liegen keine spezifischen Einschränkungen vor, sofern die Reaktion zum gewünschten Derivat von Verbindung (II) führt, das das Reaktionsprodukt der Verbindung (II) umfasst, umgesetzt mit mindestens einer weiteren Verbindung über die mindestens eine funktionelle Gruppe X, bevorzugt einem Polypeptid, weiter bevorzugt EPO. Die Temperatur der Reaktion liegt bevorzugt im Bereich von 4 bis 37°C, noch bevorzugter im Bereich von 10 bis 30°C, insbesondere bevorzugt im Bereich von 15 bis 25°C.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein wie vorstehend beschriebenes Verfahren, wobei die Reaktion Verbindung (II) mit der mindestens einen weiteren Verbindung bei einer Temperatur von 4 bis 37°C durchgeführt wird.
Während des Reaktionsverlaufs kann die Temperatur verändert werden, bevorzugt in den vorstehend angegebenen Bereichen, oder sie wird im Wesentlichen konstant gehalten.
Die Reaktionszeit, der pH-Wert für eine Reaktion von Verbindung (II) mit der mindestens einen weiteren Verbindung kann an die speziellen Bedürfnisse wie die chemische Natur der Reaktanden angepasst werden. Der geeignete pH-Wert der Reaktionsmischung kann durch Zugeben von mindestens einem geeigneten Puffer eingestellt werden. Unter den bevorzugten Puffern können Acetat-, Phosphat-, oder Boratpuffer wie Natriumacetat-, Natriumphosphat- oder Natriumboratpuffer erwähnt werden.
Das Reaktionsprodukt, das sich aus der Reaktion von Verbindung (II) mit der mindestens einen weiteren Verbindung ergibt, kann aus der Reaktionsmischung durch mindestens ein geeignetes Verfahren isoliert werden und mindestens einer weiteren Behandlung wie mindestens einer Nachbehandlung wie Dialyse und/oder Lyophilisieren unterzogen werden.
Sobald das Reaktionsprodukt der Reaktion Verbindung (II) mit mindestens einer weiteren Verbindung gebildet wird, kann es aus der Reaktionsmischung durch mindestens ein geeignetes Verfahren isoliert werden.
Eine Isolierung des Reaktionsproduktes kann durch eine geeignete Verfahrensweise durchgeführt werden, welche einen oder mehrere Schritte wie schon vorstehend beschrieben umfassen kann.
Wenn es gewünscht wird und/oder nötig ist, kann die NH-Gruppe, die R' und R'' der Verbindung (II) verbrückt, mit einer geeigneten Schutzgruppe vor der Reaktion von Verbindung (II) mit der mindestens einen weiteren Verbindung geschützt werden. Als Schutzgruppe kann eine der vorstehend erwähnten Schutzgruppen verwendet werden. Vor der Reaktion des Reaktionsproduktes von Verbindung (II) und der mindestens einen weiteren Verbindung wie einem Polypeptid, bevorzugt EPO, mit Verbindung (I), wird die Schutzgruppe durch mindestens ein geeignetes Verfahren entfernt.
Wenn Verbindung (II) zuerst mit einer verknüpfenden Verbindung oder einem Reaktionsprodukt einer verknüpfenden Verbindung und einem Polypeptid umgesetzt wird, können sämtliche Reaktionsbedingungen an die speziellen Bedürfnisse dieser Reaktionen angepasst werden. Unter anderem können die vorstehend erwähnten Puffersysteme und/oder Lösungsmittel verwendet werden.
In einem zweiten Schritt wird das Reaktionsprodukt der Reaktion von Verbindung (II) mit der mindestens einen weiteren Verbindung mit Verbindung (I) umgesetzt.
Aus diesem Grund können sämtliche Reaktionsbedingungen an die speziellen Bedürfnisse dieser Reaktionen angepasst werden. Unter anderem können die vorstehend erwähnten Puffersysteme und/oder Lösungsmittel verwendet werden.
Das Reaktionsprodukt, das sich aus der Reaktion des Reaktionsproduktes von Verbindung (II) und der mindestens einen weiteren Verbindung mit Verbindung (I) ergibt, kann aus der jeweiligen Reaktionsmischung durch mindestens ein geeignetes Verfahren isoliert werden und mindestens einer weiteren Behandlung wie mindestens einer Nachbehandlung wie Dialyse und/oder Lyophilisieren unterzogen werden. In diesem Zusammenhang kann jedes geeignete vorstehend beschriebene Verfahren verwendet werden.
Im Allgemeinen kann die Isolierung des HAS-Polypeptid-Konjugats, entweder mit oder ohne verknüpfender Verbindung, un ter Verwendung bekannter Verfahren zur Reinigung natürlicher und rekombinanter Polypeptide durchgeführt werden, wie etwa Größenausschluss-Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasen-HPLC, Hydroxyapatit-Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie oder Kombinationen von mindestens zwei dieser Verfahren.
Die kovalente Anfügung von HAS an das Polypeptid kann durch Analyse der Kohlehydratzusammensetzung nach Hydrolyse des modifizierten Proteins verifiziert werden.
Der Beweis der HAS-Modifikation an N-verknüpften Oligosacchariden des Polypeptids kann durch Entfernen der HAS-modifizierten N-Glykane und Beobachtung der vorhergesagten Veränderung hin zu höherer Mobilität in der SDS-PAGE +/– Western-Blot-Analyse erbracht werden.
Die HAS-Modifikation des Polypeptids an Cysteinresten kann durch Ausbleiben des Nachweises des entsprechenden proteolytischen Cys-Peptids in Umkehrphasen-HPLC und MALDI/TOF-MS in den proteolytischen Fragmenten des HAS-modifizierten Produkts bewiesen werden (Zhou et al., 1998, Application of capillary electrophoresis, liquid chromatography, electrospray-mass spectrometry and matrix-assisted laserdesorption/ionization – time of flight – mass spectrometry to the characterization of recombinant human erythropoietin, Electrophoresis, 19(13), 2348–55). Die Isolierung der HAS-haltigen Fraktion nach proteolytischem Verdau des Cys-modifizierten Polypeptids ermöglicht die Verifizierung in dieser Fraktion des entsprechenden Peptids durch herkömmliche Analyse der Aminosäurenzusammensetzung.
Alle Ausführungsformen, die oben in Bezug auf das HAS-Polypeptid der Erfindung hinsichtlich Eigenschaften des Polypeptids oder der HAS offenbart wurden, gelten auch für das Verfahren der Erfindung zur Herstellung eines HAS-Polypeptid-Konjugats. Zudem gelten auch alle Ausführungsformen, die oben in Bezug auf HAS-EPO oder dessen Herstellung offenbart wurden und Peptide im Allgemeinen oder HAS betreffen, für das Verfahren der Erfindung zur Herstellung eines HAS-Polypeptid-Konjugats.
Gemäß einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Hydroxyethylstärke mit einer Verbindung (II) umgesetzt, die bevorzugt aus den oben beschriebenen homo- und heterobifunktionellen Verbindungen ausgewählt ist, und das daraus resultierende Reaktionsprodukt wird mit einem Gly koprotein umgesetzt, bevorzugt Erythropoietin, bevorzugt mit der oxidierten endständigen Kohlehydratkomponente einer EPO-Kohlehydratseitenkette.
Gemäß einer weiteren insbesondere bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Hydroxyethylstärke mit einer Verbindung (II) umgesetzt, die bevorzugt aus den oben beschriebenen homo- und heterobifunktionellen Verbindungen ausgewählt ist, um ein erstes Hydroxyethylstärkederivat zu erhalten. Das erste Hydroxyethylstärkederivat wird anschließend mit einer verknüpfenden Verbindung umgesetzt, um ein zweites Hydroxyethylstärkederivat zu erhalten. Dieses zweite Hydroxyethylstärkederivat wird anschließend mit einem Glykoprotein, bevorzugt Erythropoietin, bevorzugt mit einer -SH-Gruppe, die im Glykoprotein umfasst ist, umgesetzt, um ein drittes Hydroxyethylstärkederivat zu erhalten. Vorzugsweise ist die verknüpfende Verbindung eine heterobifunktionelle Verbindung. Noch bevorzugter wird die verknüpfende Verbindung mit einer funktionellen Gruppe umgesetzt, die die Struktur -NH- umfasst und die im ersten Hydroxyethylstärkederivat umfasst ist. Noch bevorzugter ist diese funktionelle Gruppe -NH₂.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass es in mindestens einem Reaktionsschritt, bevorzugt in allen Reaktionsschritten, nicht notwendig ist, toxikologisch kritische Lösungsmittel zu verwenden, und es somit nicht notwendig ist, diese Lösungsmittel nach dem Herstellungsverfahren zu entfernen, um die Kontaminierung der Produkte mit dem Lösungsmittel zu vermeiden. Zudem ist es nicht notwendig, zusätzliche Qualitätskontrollen hinsichtlich Rückstande toxikologisch kritischer Lösungsmittel durchzuführen. Wenn organische Lösungsmittel, bevorzugt zusätzlich zu Wasser, verwendet werden, so ist es bevorzugt, toxikologisch nicht kritische Lösungsmittel, wie etwa Ethanol und/oder Propylenglykol, zu verwenden.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass in den Schritten, in denen ein wässriges System als Lösungsmittel verwendet wird, irreversible und reversible Strukturveränderungen vermieden werden, die sonst von organische Lösungsmitteln herbeigeführt werden. Folglich unterschieden sich Polypeptidderivate, die gemäß dem Verfahren der Erfindung erhalten werden, von jenen, die in organischen Lösungsmitteln, wie etwa DMSO, hergestellt werden.
Außerdem wurde überraschenderweise beobachtet, dass die Konjugation von HAS an Polypeptiden, wie etwa EPO, in einer wässrigen Lösung Nebenreaktionen minimiert oder verhindert. Folglich führt diese Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung zu verbesserten Hydroxyalkylstärkeprodukten von großer Reinheit.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch die Hydroxyalkylstärkederivate, die durch ein Verfahren erhältlich sind, umfassend das Umsetzen von Hydroxyalkylstärke (HAS) der Formel (I)
an ihrem reduzierenden Ende, welches vor der Reaktion nicht oxidiert wird, mit einer Verbindung der Formel (II) R'-NH-R'' (1)wobei R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine lineare oder verzweigte Hydroxyalkylgruppe sind, und wobei entweder R' oder R'', oder R' und R'', mindestens eine funktionelle Gruppe X umfassen, welche fähig ist, mit mindestens einer anderen Verbindung vor oder nach der Reaktion von (I) und (II) umgesetzt zu werden.
Wie bereits oben im Zusammenhang der Verfahren der vorliegende Erfindung beschrieben wurde, wird O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin als eine bevorzugte Verbindung (II) verwendet, und Hydroxyethylstärke wird als bevorzugte Hydroxyalkylstärke verwendet.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Hydroxyalkylstärkederivat, das durch ein Verfahren erhältlich ist, wobei Hydroxyethylstärke über ihr reduzierendes Ende mit O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin umgesetzt wird.
Abhängig von den jeweiligen Reaktionsbedingungen, dem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, das verwendet wird, und/oder den Resten R' und/oder R'' ist es möglich, dass das Hydroxyalkylstärkederivat, das durch das oder die oben beschriebenen Verfahren erhältlich ist, die folgenden Konstitutionen (IIIa) aufweist:
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie beschriebenes Hydroxyalkylstärkederivat, das eine Konstitution gemäß Formel (IIIa) aufweist.
Es ist ebenfalls möglich, dass, beispielsweise wenn R' Wasserstoff ist, das Hydroxyalkylstärkederivat, das durch das oder die oben beschriebenen Verfahren erhältlich ist, die folgenden Konstitutionen (IIIa) oder (IIIb) aufweist, wobei (IIIa) und (IIIb) beide im Reaktionsgemisch mit einer gewissen Gleichgewichtsverteilung vorhanden sein können:
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie beschriebenes Hydroxyalkylstärkederivat, das eine Konstitution gemäß Formel (IIIb) aufweist.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung auch ein so wie beschriebenes Hydroxyalkylstärkederivat, das in einer Mischung aus Konstitutionen gemäß den Formeln (IIIa) und (IIIb) vorhanden ist.
Je nach Reaktionsbedingungen und/oder der chemischen Natur von Verbindung (II), die für die Reaktion verwendet werden, können die Verbindungen gemäß Formel (IIIa) mit dem N-Atom in äquatorialer oder axialer Position vorhanden sein, wobei auch eine Mischung aus beiden Formen mit einer gewissen Gleichgewichtsverteilung vorhanden sein kann.
Je nach Reaktionsbedingungen und/oder der chemischen Natur von Verbindung (II), die für die Reaktion verwendet werden, können die Verbindungen gemäß Formel (IIIb) mit der C-N-Doppelbindung in E- oder in Z-Konformation vorhanden sein, wobei auch eine Mischung aus beiden Formen mit einer gewissen Gleichgewichtsverteilung vorhanden sein kann.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Verbindung gemäß Formel (IIIa) zu stabilisieren. Dies trifft insbesondere dann zu, wenn die Verbindung gemäß Formel (IIIa) in einer wässrigen Lösung hergestellt und/oder verwendet wird. Als Stabilisierungsverfahren ist die Acylierung der Verbindung gemäß Formel (IIIa) besonders bevorzugt, insbesondere dann, wenn R' Wasserstoff ist. Als Acylierungsreagenz können alle geeigneten Reagenzien verwendet werden, die zum gewünschten Hydroxyalkylstärkederivat gemäß Formel (IVa) führen:
Gemäß insbesondere bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der Rest Ra, der Teil des Acylierungsreangenz ist, Methyl. Als Acylierungsreagenzien werden Carbonsäureanhydride, Carbonsäurehalogenide und Carbonsäureaktivester bevorzugt verwendet.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Hydroxyalkylstärkederivat, das durch ein so wie oben beschriebenes Verfahren erhältlich ist, wobei das Derivat eine Konstitution gemäß Formel (IVa) aufweist.
Die Acylierung wird bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 30°C, bevorzugt im Bereich von 2 bis 20°C und insbesondere bevorzugt im Bereich von 4 bis 10°C durchgeführt.
In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, die Verbindung gemäß Formel (IIIb) zu stabilisieren. Dies trifft insbesondere dann zu, wenn die Verbindung gemäß Formel (IIIb) in einer wässrigen Lösung hergestellt und/oder verwendet wird. Als Stabilisierungsverfahren ist die Reduktion der Verbindung gemäß Formel (IIIb) besonders bevorzugt, insbesondere dann, wenn R' Wasserstoff ist. Als Reduktionsreagenz können alle geeigneten Reagenzien verwendet werden, die zum gewünschten Hydroxyalkylstärkederivat gemäß Formel (IVb) führen:
Gemäß insbesondere bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden als Reduktionsreagenzien Borhydride, wie etwa NaCNBH₃ oder NaBH₄, verwendet.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Hydroxyalkylstärkederivat, das durch ein so wie oben beschriebenes Verfahren erhältlich ist, wobei das Derivat eine Konstitution gemäß Formel (IVb) aufweist.
Die Reduktion wird bei einer Temperatur im Bereich von 4 bis 100°C, bevorzugt im Bereich von 10 bis 90°C und insbesondere bevorzugt im Bereich von 25 bis 80°C durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Gemische aus den Verbindungen (IIIa) und (IIIb), (IVa) und (IVb), (IIIa) und (IVa), (IIIa), und (IVb), (IIIb) und (IVa), (IIIb) und (IVb), (IIIa) und (IIIb) und (IVa), (IIIa) und (IIIb) und (IVb), (IVa) und (IVb) und (IIIa), und (IVa) und (IVb) und (IIIb), wobei (IIIa) and/oder (IVa) unabhängig voneinander in einer Konformation mit dem N-Atom in äquatorialer oder axialer Position vorhanden sein können, und/oder wobei (IIIb) mit der C-N-Doppelbindung in E- oder in Z-Konformation vorhanden sein kann.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Verbindung (I) mit Verbindung (II) umgesetzt, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erhalten. Das erste Reaktionsprodukt wird dann optional gemäß mindestens einem der oben beschriebenen Verfahren stabilisiert. Das erste, optional stabilisierte Reaktionsprodukt wird dann mit mindestens einer weiteren Verbindung über die Reaktion von mindestens einer funktionellen Gruppe X, die in R'' des ersten Reaktionsprodukt umfasst ist, mit mindestens einer funktionellen Gruppe Y. die in der mindestens einer weiteren Verbindung umfasst ist, reagiert, um ein zweites Reaktionsprodukt zu erhalten. Dieses Reaktionsprodukt wird dann optional gemäß mindestens einem der oben beschriebenen Verfahren stabilisiert.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine weitere Verbindung ein Polypeptid oder eine verknüpfende Verbindung oder ein Reaktionsprodukt einer verknüpfenden Verbindung mit einem Polypeptid. Wenn die mindestens eine weitere Verbindung ein Polypeptid ist, ist die funktionelle Gruppe Y im Polypeptid umfasst. Wenn die mindestens eine weitere Verbindung eine verknüpfende Verbindung ist, ist die funktionelle Gruppe Y in der verknüpfenden Verbindung und optional auch im Polypeptid umfasst. Wenn die mindestens eine weitere Verbindung ein Reaktionsprodukt einer verknüpfenden Verbindung mit einem Polpeptid ist, ist die funktionelle Gruppe Y in der verknüpfenden Verbindung umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Verbindung (II) mit mindestens einer weiteren Verbindung über die Reaktion von mindestens einer funktionellen Gruppe X, die in R'' von Verbindung (II) umfasst ist, mit mindestens einer funktionellen Gruppe Y, die in der mindestens einen weiteren Verbindung umfasst ist, umgesetzt, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erge ben. Die mindestens eine weitere Verbindung ist bevorzugt ein Polypeptid oder eine verknüpfende Verbindung oder ein Reaktionsprodukt einer verknüpfenden Verbindung mit einem Polypeptid wie vorstehend diskutiert. Das erste Reaktionsprodukt wird dann mit Verbindung (I) über die Reaktion des reduzierenden Endes von Verbindung (I) mit der NH-Gruppe des ersten Reaktionsproduktes, die die ursprünglichen Reste R' und R'' von Verbindung (II) verbrückt, umgesetzt, um ein zweites Reaktionsprodukt zu ergeben. Das zweite Reaktionsprodukt wird dann gegebenenfalls gemäß mindestens einem der vorstehend beschriebenen Verfahren stabilisiert.
Gemäß einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Hydroxyethylstärke als Verbindung (I), O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin als Verbindung (II) und EPO mit einer oxidierten endständigen Kohlehydratkomponente einer Kohlehydratseitenkette als weitere Verbindung verwendet. Noch bevorzugter wird Hydroxyethylstärke mit O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin umgesetzt, um ein erstes Hydroxyethylstärkederivat zu erhalten, und dieses erste Derivat wird weiter mit EPO, das eine oxidierte endständige Kohlehydratkomponente einer Kohlehydratseitenkette aufweist, umgesetzt, um ein zweites Hydroxyethylstärkederivat zu erhalten. In diesem spezifischen Fall muss keine Stabilisierungsreaktion durchgeführt werden.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Hydroxyalkylstärkederivat, das durch ein Verfahren erhältlich ist, wobei Hydroxyethylstärke über ihr reduzierendes Ende mit O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin umgesetzt wird, und das Reaktionsprodukt mit Erythropoietin über die oxidierte endständige Kohlehydratkomponente einer Kohlehydratseitenkette des Erythropoietins umgesetzt wird.
Gemäß einer weiteren insbesondere bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Hydroxyethylstärke als Verbindung (I) verwendet, O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin wird als Verbindung (II) verwendet, eine heterobifunktionelle verknüpfende Verbindung mit einer Maleimidgruppe und einer N-Hydroxysuccinimid-Aktivestergruppe wird verwendet, und EPO mit mindestens einer -SH-Gruppe (als ThioEPO bezeichnet) wird als Polypeptid verwendet. Noch bevor zugter wird Hydroxyethylstärke mit O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin umgesetzt, um ein erstes Hydroxyethylstärkederivat zu erhalten, dieses erste Derivat wird weiter mit der N-Hydroxysuccinimid-Aktivestergruppe der verknüpfenden Verbindung umgesetzt, um ein zweites Derivat zu erhalten, und dieses zweite Derivat wird über die Maleimidgruppe mit dem ThioEPO, umgesetzt, um ein drittes Hydroxyethylstärkederivat zu erhalten.
Das Hydroxyalkylstärkederivat, das im Folgenden als HAS-EPO-Konjugat bezeichnet wird und durch die Reaktion von Verbindung (I) mit Verbindung (II) und möglicherweise einer verknüpfenden Verbindung und Erythropoietin gebildet wird, bietet den Vorteil, dass es eine verbesserte biologische Stabilität als das Erythropoietin vor der Konjugation aufweist. Dies liegt in erster Linie daran, dass dieses Hydroxyalkylstärkederivat von den Beseitigungssystemen der Leber und der Niere weniger oder gar nicht erkannt wird und deshalb über einen längeren Zeitraum hinweg im Kreislaufsystem verbleibt. Außerdem ist die Gefahr der Zerstörung der biologischen In-vivo-Aktivität von EPO durch die Konjugation von HAS an EPO minimiert, da HAS ortsspezifisch angefügt wird.
Das HAS-EPO-Konjugat der Erfindung weist gegebenenfalls im Wesentlichen die gleiche biologische In-vitro-Aktivität wie rekombinantes natives EPO auf, da die biologische In-vitro-Aktivität nur die Bindungsaffinität zum EPO-Rezeptor misst. Verfahren zur Bestimmung der biologischen In-vitro-Aktivität sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Zudem weist das HAS-EPO-Konjugat eine größere In-vivo-Aktivität als das EPO, das als Ausgangsmaterial für die Konjugation verwendet wird (unkonjugiertes EPO), auf. Verfahren zur Bestimmung der biologischen In-vivo-Aktivität sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Das HAS-EPO-Konjugat der Erfindung kann eine In-vivo-Aktivität von 110% bis 300%, bevorzugt von 110% bis 200%, noch bevorzugter von 110% bis 180% oder von 110 bis 150%, am stärksten bevorzugt von 110% bis 140% aufweisen, wenn die In-vivo-Aktivität des unkonjugierten EPO als 100% festgesetzt wird.
Verglichen mit dem hoch sialylierten EPO von Amgen (vgl. EP 428 267 B1 ) weist das HAS-EPO bevorzugt mindestens 50%, noch bevorzugter mindestens 70%, noch stärker bevorzugt mindestens 85% oder mindestens 95%, mindestens 150%, mindestens 200% oder mindestens 300% der In-vivo-Aktivität des hoch sialylierten EPO auf, wenn die In-vivo-Aktivität von hoch sialyliertem EPO als 100% festgesetzt wird. Am stärksten bevorzugt weist es mindestens 95% der In-vivo-Aktivität des hoch sialylierten EPO auf.
Die hohe biologische In-vivo-Aktivität des HAS-EPO-Konjugats der Erfindung ergibt sich in erster Linie aus der Tatsache, dass das HAS-EPO-Konjugat länger als das unkonjugierte EPO im Kreislauf verbleibt, weil es von den Beseitigungssystemen der Leber weniger erkannt wird und weil die renale Clearance aufgrund des höheren Molekulargewichts reduziert ist. Verfahren zur Bestimmung der In-vivo-Halbwertszeit von EPO im Kreislauf sind auf dem Fachgebiet bekannt (Sytkowski, Lunn, Davis, Feldman, Siekman, 1998, Human erythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(3), 1184–8).
Folglich besteht ein großer Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, dass ein HAS-EPO-Konjugat bereitgestellt ist, das weniger häufig als die derzeit handelsüblichen EPO-Präparate verabreicht werden kann. Während Standard-EPO-Präparate mindestens alle 3 Tage verabreicht werden müssen, wird das HAS-EPO-Konjugat der Erfindung bevorzugt zweimal pro Woche, noch bevorzugter einmal pro Woche, verabreicht.
Des Weiteren bietet das Verfahren der Erfindung den Vorteil, dass ein wirksames EPO-Derivat mit geringerem Kostenaufwand hergestellt werden kann, da das Verfahren keine ausgiebigen und zeitaufwendigen Reinigungsschritte umfasst, die zu einer geringen Endausbeute führen, z. B. ist es nicht notwendig, untersialylierte EPO-Formen, von denen bekannt ist, dass sie eine geringe oder gar keine biologische In-vivo-Aktivität aufweisen, durch Reinigung zu entfernen.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das HAS-Polypeptid-Konjugat, bevorzugt das HAS-EPO-Konjugat, noch bevorzugter das HES-EPO-Konjugat, der vorliegenden Erfindung in einer therapeutisch wirksamen Menge umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung ferner mindestens einen pharmazeutisch annehmbaren Verdünner, Adjuvans und/oder Träger, die in der Erythropoietintherapie nützlich sind.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein so wie oben beschriebenes Hydroxyalkylstärkederivat in einer therapeutisch wirksamen Menge umfasst, wobei das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) mit Verbindung (II) über die mindestens eine funktionelle Gruppe X, die in Verbindung (II) umfasst ist, mit mindestens einer weiteren Verbindung umgesetzt wird, oder wobei Verbindung (II) über die mindestens eine funktionelle Gruppe X mit mindestens einer weiteren Verbindung vor der Reaktion mit Verbindung (I) umgesetzt wird, und wobei die mindestens eine weitere Verbindung ein Polypeptid ist.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid, bevorzugt Erythropoietin, mit Verbindung (II) oder mit dem Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) über eine Thiogruppe oder eine oxidierte Kohlehydratkomponente, die im Polypeptid umfasst ist, umgesetzt.
Gemäß einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid, bevorzugt Erythropoietin, mit Verbindung (II) oder mit dem Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) über eine oxidierte Kohlehydratkomponente, die im Polypeptid umfasst ist, umgesetzt.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung eine so wie oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung, wobei das Polypeptid mit Verbindung (II) oder mit dem Reaktionsprodukt von Verbindung (I) und Verbindung (II) über eine oxidierte Kohlehydratkomponente, die im Polypeptid umfasst ist, umgesetzt wird.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen ist das Polypeptid GCSF, AT III, IFN-beta oder Erythropoietin, stärker bevorzugt Erythropoietin.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch eine so wie oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung, wobei das Polypeptid Erythropoietin ist.
Gemäß einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die so wie oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung durch Umsetzen von Hydroxyethylstärke in einem wässrigen Medium mit einer Verbindung gemäß der folgen den Formel
und durch Umsetzen des Reaktionsprodukts mit Erythropoietin hergestellt.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Erythropoietin vor der oben genannten Reaktion mit Natriumperjodat oxidiert.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Erythropoietin vor der Reaktion teilweise desialyliert und anschließend mit Natriumperjodat oxidiert.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Hydroxyalkylstärkederivat umfassen und auf der Grundlage von vollständig reduziertem Thio-EPO gemäß Beispiel 5 hergestellt sind, ausgeschlossen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein so wie oben beschriebenes Hydroxyalkylstärkederivat in einer therapeutisch wirksamen Menge umfasst, wobei das Reaktionsprodukt von Verbindung (I) mit Verbindung (II) über die mindestens eine funktionelle Gruppe X, die in Verbindung (II) umfasst ist, mit mindestens einer weiteren Verbindung umgesetzt wird, oder wobei Verbindung (II) über die mindestens eine funktionelle Gruppe X mit mindestens einer weiteren Verbindung vor der Reaktion mit Verbindung (I) umgesetzt wird, und wobei die mindestens eine weitere Verbindung eine verknüpfende Verbindung ist, und das Reaktionsprodukt des Reaktionsprodukts der Verbindungen (I) und (II) mit der verknüpfenden Verbindung mit einem Polypeptid umgesetzt wird.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die zuvor genannte pharmazeutische Zusammensetzung, wobei das Polypeptid Erythropoietin ist.
Die oben genannte pharmazeutische Zusammensetzung ist besonders zur Behandlung von anämischen Störungen oder Störungen der Hämatopoese oder von damit in Zusammenhang stehenden Erkrankungen geeignet.
Eine „therapeutisch wirksame Menge” bezeichnet, so wie hierin verwendet, jene Menge, die eine therapeutische Wirkung für einen gegebenen Zustand und Verabreichungsplan bereitstellt. Die Verabreichung von Erythropoietinisoformen erfolgt vorzugsweise über parenterale Wege. Welcher Weg gewählt wird, hängt von dem zu behandelnden Zustand ab. Die Verabreichung von Erythropoietinisoformen erfolgt vorzugsweise als Teil einer Formulierung, die einen geeigneten Träger, wie etwa Humanserumalbumin, einen geeigneten Verdünner, wie etwa eine gepufferte Salzlösung, und/oder ein geeignetes Adjuvans umfasst. Die erforderliche Dosierung sind wohl Mengen, die ausreichend sind, um den Hämatokrit von Patienten zu heben, und hängt von der Schwere des behandelten Zustands, dem Verfahren der Verabreichung und dergleichen ab.
Ziel der Behandlung mit der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung ist vorzugsweise eine Steigerung des Hämoglobinwerts von über 6,8 mmol/l im Blut. Zu diesem Zweck kann die pharmazeutische Zusammensetzung derart verabreicht werden, dass der Hämoglobinwert zwischen 0,6 mmol/l und 1,6 mmol/l pro Woche steigt. Wenn der Hämoglobinwert 8,7 mmol/l überschreitet, sollte die Therapie vorzugsweise unterbrochen werden, bis der Hämoglobinwert unter 8,1 mmol/l liegt.
Die Zusammensetzung der Erfindung wird vorzugsweise in einer Formulierung verwendet, die zur subkutanen oder intravenösen oder parenteralen Injektion geeignet ist. Zu diesem Zweck sind beispielsweise Natriumdihydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumchlorat, Polysorbat 80, HSA und Wasser zur Injektion geeignete Arzneimittelträger und Träger. Die Zusammensetzung kann dreimal pro Woche, bevorzugt zweimal pro Woche, noch bevorzugter einmal pro Woche und am stärksten bevorzugt alle zwei Wochen verabreicht werden.
Vorzugsweise wird die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Menge von 0,01 bis 10 μg/kg Körpergewicht des Patienten, noch bevorzugter 0,1 bis 5 μg/kg, 0,1 bis 1 μg/kg oder 0,2–0,9 μg/kg, stärker bevorzugt 0,3 bis 0,7 μg/kg und am stärksten bevorzugt 0,4 bis 0,6 μg/kg Körpergewicht verabreicht.
Im Allgemeinen werden bevorzugt zwischen 10 μg und 200 μg, bevorzugt zwischen 15 μg und 100 μg, pro Dosis verabreicht.
Die Erfindung betrifft ferner ein HAS-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Be handlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines HAS-EPO-Konjugats der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von anämischen Störungen oder Störungen der Hämatopoese oder von damit in Zusammenhang stehenden Erkrankungen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, Tabellen und Figuren, die in keiner Weise dazu gedacht sind, den Umfang der vorliegenden Erfindung darauf einzuschränken, weiter veranschaulicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1
1 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse des RES-EPO-Konjugats, das gemäß Beispiel 4.1 hergestellt wurde.

Spur A: Proteinmarker Roti^®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); Molekulargewichte (in kD) des Proteinmarkers von oben nach unten: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 und 17.
Spur B: Rohes Produkt nach Konjugation gemäß Beispiel 4.1.
Spur C: EPO-Ausgangsmaterial.

2
2 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse des HES-EPO-Konjugats, das gemäß Beispiel 4.3 hergestellt wurde.

Spur A: Rohes Produkt nach Konjugation gemäß Beispiel 4.3.
Spur B: EPO-Ausgangsmaterial.
Spur C: Proteinmarker Roti^®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); Molekulargewichte (in kD) des Proteinmarkers von oben nach unten: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 und 17.

3
3 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von HES-EPO-Konjugaten, die gemäß den Beispielen 6.1 und 6.4 hergestellt wurden.

Spur A: Proteinmarker Roti^®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); Molekulargewichte (in kD) des Proteinmarkers von oben nach unten: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 und 17.
Spur B: Rohes Produkt nach Konjugation gemäß Beispiel 6.4.
Spur C: Rohes Produkt nach Konjugation gemäß Beispiel 6.1.
Spur D: EPO-Ausgangsmaterial.

4
4 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von HES-EPO-Konjugaten, die gemäß den Beispielen 6.2, 6.3, 6.5 und 6.6 hergestellt wurden.

Spur A: Proteinmarker Roti^®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D); Molekulargewichte (in kD) des Proteinmarkers von oben nach unten: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 und 17.
Spur B: Rohes Produkt nach Konjugation gemäß Beispiel 6.6, basierend auf Beispiel 1.3 b).
Spur C: Rohes Produkt nach Konjugation gemäß Beispiel 6.5, basierend auf Beispiel 1.1 b).
Spur D: Rohes Produkt nach Konjugation gemäß Beispiel 6.6, basierend auf Beispiel 1.3 a).
Spur E: Rohes Produkt nach Konjugation gemäß Beispiel 6.5, basierend auf Beispiel 1.1 a).
Spur F: Rohes Produkt nach Konjugation gemäß Beispiel 6.2.
Spur G: Rohes Produkt nach Konjugation gemäß Beispiel 6.3.
Spur K: EPO-Ausgangsmaterial.

5
SDS-PAGE-Analysen von EPO-GT-1, das 5 min lang einer milden Säurebehandlung unterzogen wurde = Spur 2; 10 min = Spur 3; 60 min = Spur 4 und unbehandeltes EPO = Spur 1; die Mobilitätsveränderung von EPO nach der Entfernung von N-Glykanen ist dargestellt (+PNGASE).
6
HPAEC-PAD-Muster von Oligosacchariden, isoliert aus unbehandeltem EPO und aus EPO inkubiert 5 min, 10 min und 60 min lang unter milden Säurehydrolysebedingungen. Die römischen Ziffern I–V zeigen die Elutionsposition von I = desialylierte diantennäre Struktur, II = trisialylierte triantennäre Strukturen (zwei Isomere), III = tetrasialylierte tetraantennäre Struktur + 2 N-Acetyllactosamin-Wiederholungen, IV = tetrasialylierte tetraantennäre Struktur + 1 N-Acetyllactosamin-Wiederholung; V = tetrasialylierte tetraantennäre Struktur + ohne N-Acetyllactosamin- Wiederholung, an. Der Elutionsbereich von Oligosaccharidstrukturen ohne, mit 1–4 Sialinsäuren ist durch Klammern angezeigt.
7
HPAEC-PAD von N-verknüpften Oligosacchariden nach Desialylierung; die Elutionsposition von N-Acetylneuraminsäure ist gezeigt; die Ziffern 1 bis 9 zeigen die Elutionsposition von Standard-Oligosacchariden an: 1 = diantennär; 2 = triantennär (2–4 Isomer), 3 = triantennär (2–6 Isomer); 4 = tetraantennär; 5 = triantennär plus 1 Wiederholung; 6 = tetraantennär plus 1 Wiederholung; 7 = triantennär plus 2 Wiederholungen; 8 = tetraantennär plus 2 Wiederholungen und 9 = tetraantennär plus 3 Wiederholungen.
8
SDS-PAGE-Analyse von mild behandeltem und unbehandelten EPO, die einer Perjodatoxidation von Sialinsäureresten unterzogen wurden. 1 = perjodatoxidiert ohne Säurebehandlung; 2 = perjodatoxidiert, 5 min Säurebehandlung; 3 = perjodatoxidiert und Säurebehandlung 10 min; 4 = perjodatoxidiert ohne Säurebehandlung; 5 = BRP-EPO-Standard ohne Perjodat und ohne Säurebehandlung.
9
HPAEC-PAD-Muster von nativen Oligosacchariden, isoliert aus unbehandeltem EPO und aus EPO inkubiert 5 min und 10 min lang unter milden Säurehydrolysebedingungen und anschließende Perjodatbehandlung. Der Elutionsbereich von Oligosaccharidstrukturen ohne und mit 1–4 Sialinsäure ist durch die Klammern 1 bis 5 angezeigt.
10
SDS-PAGE-Analyse des Zeitverlaufs der HES-Modifikation von EPO-GT-1-A: 20-μg-Aliquote von EPO-GT-1-A wurden mit hydroxylaminmodifiziertem HES-Derivat X 30 min, 2, 4 und 17 Stunden lang reagiert. Spur 1 = 30 min Reaktionszeit; Spur 2 = 2 Stunden Reaktionszeit; Spur 3 = 4 Stunden Reaktionszeit; Spur 4 = 17 h Reaktionszeit; Spur 5 = EPO-GT-1-A ohne HES-Modifikation. Die linke Figur zeigt die Mobilitätsveränderung von EPO-GT-1-A mit zunehmender Inkubationszeit in der Gegenwart des hydroxylaminmodifizierten HES-Derivats (Flussrate: 1 ml·min^–1) X: Spur 1 = 30 min Reaktionszeit; Spur 2 = 2 Stunden Reaktionszeit; Spur 3 = 4 Stunden Reaktionszeit, Spur 4 = 17 Stunden Reaktionszeit; Spur 5 = EPO-GT-1-A mit HES-Modifikation. Die rechte Figur zeigt die Analyse derselben Proben nach ihrer Behandlung mit N-Glykosidase.
11
SDS-PAGE-Analyse von Q-Sepharosefraktionen von HES-EPO-Konjugaten. Jedes 1% des Durchflusses und 1% der Fraktion, die bei hohen Salzkonzentrationen eluiert, wurden in einem Speed-Vac-Konzentrator konzentriert und auf die Gele in Probenpuffer geladen. Das EPO-Protein wurde mit Coomassie Blau gefärbt. A = Probe I; B = Probe II; C = Probe III; K = Kontroll-EPO-GT-1; A1, B1, C1 und K1 zeigten die Durchflussfraktionen an; A2, B2, C2 und K2 zeigen die Fraktion an, die bei hoher Salzkonzentration eluierte.
12a
SDS-PAGE-Analyse der HES-modifizierten EPO-Probe A2 (siehe 7), Kontroll-EPO-Probe K2 und EPO-GT-1-A. Die EPO-Präparate wurden in Gegenwart von N-Glykosidase verdaut wurden, um N-verknüpfte Oligosaccharide zu entfernen. Alle EPO-Proben wiesen die Mobilitätsveränderung hin zu Formen mit geringem Molekulargewicht ohne oder mit O-Glykan auf. Ein geringeres Verhältnis der O-glykosylierten und nichtglykosylierten Proteinbande wurde für die HES-modifizierte EPO-Probe A2 nach De-N-Glykosylierung beobachtet, und eine diffuse Proteinbande wurde um 30 KDa nachgewiesen, die vermutlich die HES-Modifikation an der Sialinsäure des O-Glykanrests darstellt (siehe den mit Sternchen gekennzeichneten Pfeil).
12b
SDS-PAGE-Analyse nach milder Hydrolyse der HES-modifizierten EPO-Probe A2 (siehe 11), Kontroll-EPO-Probe K2 und EPO-GT-1A, die unbehandelt waren oder in Gegenwart von N-Glykosidase. verdaut worden waren, um N-verknüpfte Oligosaccharide zu entfernen (siehe 12a). Die beiden Formen mit hohem Molekulargewicht von A2 vor und A nach der N-Glykosidasebehandlung (siehe Klammern mit und ohne Pfeil) verschwanden nach der Säurebehandlung der Proben. Der BRP-EPO-Standard, der zum Vergleich lief, wurde keiner milden Säurebehandlung unterzogen.
13
HPAEC-PAD-Analyse von N-verknüpftem Oligosaccharidmaterial, freigesetzt von der HES-modifizierten Probe A, von EPO-GT-1-A und von einer Kontroll-EPO-Probe, inkubiert mit unmodifizierter HES (K). Die römischen Ziffern I–V zeigen die Elutionsposition von I = disialylierter diantennärer Struktur, II = trisialylierten triantennären Strukturen (zwei Isomere), III = tetrasialylierter tetraantennärer Struktur + 2 N-Acetyllactosamin-Wiederholungen, IV = tetrasialylierter tetraantennärer Struktur + 1 N-Acetyllactosamin-Wiederholung, V = tetrasialylierter tetraantennärer Struktur + ohne N-Acetyllactosamin-Wiederholung an; die Klammern zeigen den Elutionsbereich von di-, tri- und tetrasialylierten N-Glykanen, wie in den Bildtexten in 6 und 9 angeführt ist, an.
14
HPAEC-PAD-Analyse von N-verknüpftem Oligosaccharidmaterial, freigesetzt von der HES-modifizierten Probe A, von EPO-GT-1A und von einer Kontroll-EPO-Probe (K), inkubiert mit unmodifizierter HES. Die Verweilzeiten eines Gemischs aus Standard-Oligosacchariden sind dargestellt: Die Ziffern 1–9 zeigen die Elutionsposition von Standard-Oligosacchariden an: 1 = diantennär; 2 = triantennär (2-4-Isomer); 3 = triantennär (2-6-Isomer); 4 = tetraantennär; 5 = triantennär plus 1 Wiederholung; 6 = tetraantennär plus 1 Wiederholung; 7 = triantennär plus 2 Wiederholungen; 8 = tetraantennär plus 2 Wiederholungen und 9 = tetraantennär plus 3 Wiederholungen.
15 bis 21
Die 15 bis 21 stellen MALDI/TOF-Massenspektren der enzymatisch freigesetzten und chemisch desialylierten N-Glykane, isoliert von HES-modifizierten EPO- und Kontroll-EPO-Präparaten, dar. Größere Signale bei m/z 1809,7, 2174,8, 2539,9, 2905,0 und 3270,1 ([M + Na]⁺) entsprechen den di- bis tetraantennären komplexartigen N-Glykanstrukturen mit keiner, einer oder zwei N-Acetyllactosamin-Wiederholungen, begleitet von schwachen Signalen aufgrund eines Verlusts von Fucose oder Galactose, die auf die Säurehydrolysebedingungen zurückzuführen sind, die zur Desi alylierung von Proben für die MS-Analyse eingesetzt wurden.
15
MALDI/TOF-Spektrum: desialylierte Oligosaccharide von HES-modifiziertem EPO A2.
16
MALDI/TOF-Spektrum: desialylierte Oligosaccharide von EPO GT-1-A.
17
MALDI/TOF-Spektrum: desialylierte Oligosaccharide von EPO K2.
18
MALDI/TOF-Spektrum: desialylierte Oligosaccharide von EPO-GT-1.
19
MALDI/TOF-Spektrum: desialylierte Oligosaccharide von EPO-GT-1, die 5 min lang einer Säurehydrolyse unterzogen wurden.
20
MALDI/TOF-Spektrum: desialylierte Oligosaccharide von EPO-GT-1, die 10 min lang einer Säurehydrolyse unterzogen wurden.
21
MALDI/TOF-Spektrum: desialylierte Oligosaccharide von EPO-GT-1, die 60 min lang einer Säurehydrolyse unterzogen wurden.
Beispiele
Beispiel 1: Bildung von Hydroxyethylstärkederivaten durch reduktive Aminierung
Beispiel 1.1: Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1,3-Diamino-2-hydroxypropan

a) Einer Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke (HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4)) in 5 ml Wasser wurden 0,83 mmol 1,3-Diamino-2-hydroxypropan und 50 mg Natriumcyanoborhydrat NaCNBH₃ zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 17 h lang bei 80°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde 160 ml eines kalten 1:1-Gemischs aus Aceton und Ethanol (v/v) zugesetzt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren gesammelt und 4 d lang gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert.
b) Die Inkubation des Gemischs, das durch Zusetzen von 0,83 mmol 1,3-Diamino-2-hydroxypropan und 50 mg Natriumcyanoborhydrat NaCNBH₃ zur Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke erhalten wurde, war ebenfalls möglich und wurde 3 d lang bei 25°C durchgeführt.

Beispiel 1.2: Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1,2-Dihydroxy-3-aminopropan

a) Einer Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke (HES18/0,4 (MW = 18.000 D), DS = 0,4) in 5 ml Wasser wurden 0,83 mmol 1,2-Dihydroxy-3-aminopropan und 50 mg Natriumcyanoborhydrat NaCNBH₃ zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 17 h lang bei 80°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde 160 ml eines kalten 1:1-Gemischs aus Aceton und Ethanol (v/v) zugesetzt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren gesammelt und 4 d lang gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert.
b) Die Inkubation des Gemischs, das durch Zusetzen von 0,83 mmol 1,2-Dihydroxy-3-aminopropan und 50 mg Natriumcyanoborhydrat NaCNBH₃ zur Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke erhalten wurde, war ebenfalls möglich und wurde 3 d lang bei 25°C durchgeführt.

Die Reaktion von 1,2-Dihydroxy-3-aminopropan mit HES wurde indirekt durch die Quantifizierung von Formaldehyd bestätigt, das sich aus der oxidativen Spaltung des 1,2-Diols im Reaktionsprodukt durch Perjodat ergibt, wie von G. Avigad, Anal. Biochem. 134 (1983) 449–504 beschrieben ist. Beispiel 1.3: Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1,4-Diaminobutan

a) Einer Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke (HES 18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4)) in 5 ml Wasser wurden 0,83 mmol 1,4-Diaminobutan und 50 mg Natriumcyanoborhydrat NaCNBH₃ zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 17 h lang bei 80°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde 160 ml eines kalten 1:1-Gemischs aus Aceton und Ethanol (v/v) zugesetzt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren gesammelt und 4 d lang gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert.
b) Die Inkubation des Gemischs, das durch Zusetzen von 0,83 mmol 1,4-Diaminobutan und 50 mg Natriumcyanoborhydrat NaCNBH₃ zur Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke erhalten wurde, war ebenfalls möglich und wurde 3 d lang bei 25°C durchgeführt.

a) Einer Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke (HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4)) in 5 ml Wasser wurden 0,83 mmol 1-Mercapto-2-aminoethan und 50 mg Natriumcyanoborhydrat NaCNBH₃ zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 17 h lang bei 80°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde 160 ml eines kalten 1:1-Gemischs aus Aceton und Ethanol (v/v) zugesetzt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren gesammelt und 4 d lang gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert.
b) Die Inkubation des Gemischs, das durch Zusetzen von 0,83 mmol 1-Mercapto-2-aminoethan und 50 mg Natriumcyanoborhydrat NaCNBH₃ zur Lösung von 200 mg Hydroxyethylstärke erhalten wurde, war ebenfalls möglich und wurde 3 d lang bei 25°C durchgeführt.

Beispiel 2: Bildung von Hydroxyethylstärkederivaten durch Konjugation
Beispiel 2.1: Reaktion von Hydroxyethylstärke mit Carbohydrazid
0,96 g HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4) wurden in 8 ml wässrigem 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2, gelöst, und 8 mmol Carbohydrazid (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) wurden zugesetzt. Nach 18-stündigem Rühren bei 25°C wurde das Reaktionsgemisch 160 ml eines kalten 1:1-Gemischs aus Aceton und Ethanol (v/v) zugesetzt. Das Fällungsprodukt wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 40 ml Wasser erneut gelöst und 3 d lang gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert. Beispiel 2.2: Reaktion von Hydroxyethylstärke mit Adepindihydrazid
0,96 g HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4) wurden in 8 ml wässrigem 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2, gelöst, und 8 mmol Adepindihydrazid (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) wurden zugesetzt. Nach 18-ständigem Rühren bei 25°C wurde das Reaktionsgemisch 160 ml eines kalten 1:1-Gemischs aus Aceton und Ethanol (v/v) zugesetzt. Das Fällungsprodukt wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 40 ml Wasser erneut gelöst und 3 d lang gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert. Beispiel 2.3: Reaktion von Hydroxyethylstärke mit 1,4-Phenylen-bis-3-thiosemicarbazid
0,96 g HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4) wurden in 8 ml wässrigem 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2, gelöst, und 8 mmol 1,4-Phenylen-bis-3-thiosemicarbazid (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) wurden zugesetzt. Nach 18-stündigem Rühren bei 25°C wurden 8 ml Wasser dem Reaktionsgemisch zugesetzt, und die Suspension wurde 15 min lang mit 4.500 U/min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde dekantiert und wurde anschließend 160 ml eines kalten 1:1-Gemischs aus Aceton und Ethanol (v/v) zugesetzt. Das Fällungsprodukt wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 40 ml Wasser erneut gelöst und 15 min lang mit 4.500 U/min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 3 d lang gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert. Beispiel 2.4: Reaktion von Hydroxyethylstärke mit O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin
O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin wurde, so wie in Boturyn et al. Tetrahedon 53 (1997) S. 5485–5492 beschrieben, in zwei Schritten aus handelsüblichen Materialien synthetisiert.
0,96 g HES18/0,4 (MW = 18.000 D, DS = 0,4) wurden in 8 ml wässrigem 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2, gelöst, und 8 mmol O-[2-(2-Aminooxyethoxy)-ethyl]-hydroxylamin wurden zugesetzt. Nach 18-stündigem Rühren bei 25°C wurde das Reaktionsgemisch 160 ml eines kalten 1:1-Gemischs aus Aceton und Ethanol (v/v) zugesetzt. Das Fällungsprodukt wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 40 ml Wasser erneut gelöst und 3 d lang gegen Wasser dialysiert (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3,5-KD-Ausschlussgrenze, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) und lyophilisiert.
Beispiel 3: Oxidation von Erythropoietin
Oxidiertes Erythropoietin wurde so wie in Beispiel 7 be schrieben hergestellt. Als oxidiertes Erythropoietin wurde EPO-GT-1-A so wie in Beispiel 7.11(c) beschrieben verwendet (EPO-GT-1 ohne Säurehydrolyse, behandelt durch milde Perjodatoxidation).
Beispiel 4: Konjugation von Hydroxyethylstärkederivaten mit dem oxidierten Erythropoietin aus Beispiel 3
Beispiel 4.1: Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt aus Beispiel 2.1
Oxidiertes EPO (1,055 μg/μl) in 20 mM PBS-Puffer wurde mit 5 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2, auf einen pH-Wert von 5,3 eingestellt. Zu 19 μl der EPO-Lösung wurden 18 μl einer Lösung des HES-Derivats, hergestellt gemäß Beispiel 2.1 (MW 18 kD; 18,7 μg/μl in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2), zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 h lang bei 25°C inkubiert. Nach der Lyophilisation wurde das rohe Produkt mittels SDS-PAGE mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) analysiert, so wie dies in den von Invitrogen gelieferten Anleitungen beschrieben ist. Das Gel wird über Nacht mit einem Roti-Blue Coomassie-Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
Das Versuchsergebnis ist in 1 dargestellt. Eine erfolgreiche Konjugation wird durch die Migration der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten hin angezeigt. Die gesteigerte Bandenbreite ist auf die Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate sowie die Anzahl der mit dem Protein verknüpften HES-Derivate zurückzuführen.
Beispiel 4.2: Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt aus Beispiel 2.3
Oxidiertes EPO (1,055 μg/μl) in 20 mM PBS-Puffer wurde mit 5 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2, auf einen pH-Wert von 5,3 eingestellt. Zu 19 μl der EPO-Lösung wurden 18 μl einer Lösung des HES-Derivats, hergestellt gemäß Beispiel 2.3 (MW 18 kD; 18,7 μg/μl in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2), zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 h lang bei 25°C inkubiert. Nach der Lyophilisation wurde das rohe Produkt mittels SDS-PAGE mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) analysiert, so wie dies in den von Invitrogen gelieferten Anleitungen beschrieben ist.
Beispiel 4.3: Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt aus Beispiel 2.4
Oxidiertes EPO (1,055 μg/μl) in 20 mM PBS-Puffer wurde mit 5-M-Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2, auf einen pH-Wert von 5,3 eingestellt. Zu 19 μl der EPO-Lösung wurden 18 μl einer Lösung des HES-Derivats, hergestellt gemäß Beispiel 2.4 (MW 18 kD; 18,7 μg/μl in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2), zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 h lang bei 25°C inkubiert. Nach der Lyophilisation wurde das rohe Produkt mittels SDS-PAGE mit NuPAGE 10 Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) analysiert, so wie dies in den von Invitrogen gelieferten Anleitungen beschrieben ist. Das Gel wird über Nacht mit einem Roti-Blue Coomassie-Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
Das Versuchsergebnis ist in 2 dargestellt. Eine erfolgreiche Konjugation wird durch die Migration der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten hin angezeigt. Die gesteigerte Bandenbreite ist auf die Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate sowie die Anzahl der mit dem Protein verknüpften HES-Derivate zurückzuführen.
Beispiel 5: Bildung von Thio-EPO durch Reduktion von Erythropoietin
241,5 μg Erythropoietin (EPO-GT-1, siehe Beispiel 7) in 500 μl eines 0,1 M Natriumboratpuffers, 5 mM EDTA, 10 mM DTT (Lancaster, Morcambe, UK), pH-Wert 8,3, wurden 1 h lang bei 37°C inkubiert. Das DTT wurde durch Zentrifugalfiltration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 10 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D), mit 13.000 U/min, anschließendes 3-maliges Waschen mit dem Boratpuffer und 2-maliges Waschen mit einem Phosphatpuffer (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 7,2) entfernt.
Beispiel 6: Konjugation von Hydroxyethylstärkederivaten mit Thio-Erythropoietin unter Verwendung einer verknüpfenden Verbindung
In jedem der folgenden Beispiele wurde N-(alpha-Maleimidoacetoxy)succinimidester (AMAS)
als verknüpfende Verbindung verwendet.
Beispiel 6.1: Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt aus Beispiel 2.1 und der verknüpfenden Verbindung
Zu 50 nmol des HES-Derivats, das gemäß Beispiel 2.1 hergestellt wurde und in 200 μl eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 7,2) gelöst ist, wurden 10 μl einer Lösung von 2,5 μmol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO zugesetzt. Die klare Lösung wurde 80 min lang bei bei 25°C und 20 min lang bei 40°C inkubiert. Der verbleibende AMAS wurde durch Zentrifugalfiltration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D), mit 13.000 U/min und 4-maliges Waschen für jeweils 30 min mit dem Phosphatpuffer entfernt.
Der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, hergestellt gemäß Beispiel 5 (1 μg/μl in Phosphatpuffer), zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 h lang bei 25°C inkubiert. Nach der Lyophilisation wurde das rohe Produkt mittels SDS-PAGE mit NuPAGE 10 Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA) analysiert, so wie dies in den von Invitrogen gelieferten Anleitungen beschrieben ist. Das Gel wird über Nacht mit einem Roti-Blue Coomassie-Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
Das Versuchsergebnis ist in 3 dargestellt. Eine erfolgreiche Konjugation wird durch die Migration der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten hin angezeigt. Die gesteigerte Bandenbreite ist auf die Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate sowie die Anzahl der mit dem Protein verknüpften HES-Derivate zurückzuführen.
Beispiel 6.2: Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt aus Beispiel 2.2 und der verknüpfenden Verbindung
Zu 50 nmol des HES-Derivats, das gemäß Beispiel 2.2 hergestellt wurde und in 200 μl eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 7,2) gelöst ist, wurden 10 μl einer Lösung von 2,5 μmol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO zugesetzt. Die klare Lösung wurde 80 min lang bei bei 25°C und 20 min lang bei 40°C inkubiert. Der verbleibende AMAS wurde durch Zentrifugalfiltration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D), mit 13.000 U/min und 4-maliges Waschen für jeweils 30 min mit dem Phosphatpuffer entfernt.
Der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, hergestellt gemäß Beispiel 5 (1 μg/μl in Phosphatpuffer), zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 h lang bei 25°C inkubiert. Nach der Lyophilisation wurde das rohe Produkt mittels SDS-PAGE mit NuPAGE 10 Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA) analysiert, so wie dies in den von Invitrogen gelieferten Anleitungen beschrieben ist. Das Gel wird über Nacht mit einem Roti-Blue Coomassie-Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
Das Versuchsergebnis ist in 4 dargestellt. Eine erfolgreiche Konjugation wird durch die Migration der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten hin angezeigt. Die gesteigerte Bandenbreite ist auf die Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate sowie die Anzahl der mit dem Protein verknüpften HES-Derivate zurückzuführen.
Beispiel 6.3: Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt aus Beispiel 2.3 und der verknüpfenden Verbindung
Zu 50 nmol des HES-Derivats, das gemäß Beispiel 2.3 hergestellt wurde und in 200 μl eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 7,2) gelöst ist, wurden 10 μl einer Lösung von 2,5 μmol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO zugesetzt. Die klare Lösung wurde 80 min lang bei bei 25°C und 20 min lang bei 40°C inkubiert. Der verbleibende AMAS wurde durch Zentrifugalfiltration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D), mit 13.000 U/min und 4-maliges Waschen für jeweils 30 min mit dem Phosphatpuffer entfernt.
Der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, hergestellt gemäß Beispiel 5 (1 μg/μl in Phosphatpuffer), zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 h lang bei 25°C inkubiert. Nach der Lyophilisation wurde das rohe Produkt mittels SDS-PAGE mit NuPAGE 10 Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA) analysiert, so wie dies in den von Invitrogen gelieferten Anleitungen beschrieben ist. Das Gel wird über Nacht mit einem Roti-Blue Coomassie-Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
Das Versuchsergebnis ist in 4 dargestellt. Eine erfolgreiche Konjugation wird durch die Migration der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten hin angezeigt. Die gesteigerte Bandenbreite ist auf die Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate sowie die Anzahl der mit dem Protein verknüpften HES-Derivate zurückzuführen.
Beispiel 6.4: Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt aus Beispiel 2.4 und der verknüpfenden Verbindung
Zu 50 nmol des HES-Derivats, das gemäß Beispiel 2.4 hergestellt wurde und in 200 μl eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 7,2) gelöst ist, wurden 10 μl einer Lösung von 2,5 μmol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO zugesetzt. Die klare Lösung wurde 80 min lang bei bei 25°C und 20 min lang bei 40°C inkubiert. Der verbleibende AMAS wurde durch Zentrifugalfiltration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D), mit 13.000 U/min und 4-maliges Waschen für jeweils 30 min mit dem Phosphatpuffer entfernt.
Der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, hergestellt gemäß Beispiel 5 (1 μg/μl in Phosphatpuffer), zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 h lang bei 25°C inkubiert. Nach der Lyophilisation wurde das rohe Produkt mittels SDS-PAGE mit NuPAGE 10 Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA) analysiert, so wie dies in den von Invitrogen gelieferten Anleitungen beschrieben ist. Das Gel wird über Nacht mit einem Roti-Blue Coomassie-Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
Das Versuchsergebnis ist in 3 dargestellt. Eine erfolgreiche Konjugation wird durch die Migration der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten hin angezeigt. Die gesteigerte Bandenbreite ist auf die Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate sowie die Anzahl der mit dem Protein verknüpften HES-Derivate zurückzuführen.
Beispiel 6.5: Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt aus Beispiel 1.1 und der verknüpfenden Verbindung
Zu 50 nmol des HES-Derivats, das gemäß Beispiel 1.1 hergestellt wurde, bei Inkubationsbedingungen von 80°C und 17 h (Beispiel 1.1 a)) sowie von 25°C und 3 d (Beispiel 1.1 b)), und in 200 μl eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 7,2) gelöst ist, wurden 10 μl einer Lösung von 2,5 μmol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO zugesetzt. Die klare Lösung wurde 80 min lang bei bei 25°C und 20 min lang bei 40°C inkubiert. Der verbleibende AMAS wurde durch Zentrifugalfiltration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D), mit 13.000 U/min und 4-maliges Waschen für jeweils 30 min mit dem Phosphatpuffer entfernt.
Der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, hergestellt gemäß Beispiel 5 (1 μg/μl in Phosphatpuffer), zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 h lang bei 25°C inkubiert. Nach der Lyophilisation wurde das rohe Produkt mittels SDS-PAGE mit NuPAGE 10% Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA) analysiert, so wie dies in den von Invitrogen gelieferten Anleitungen beschrieben ist. Das Gel wird über Nacht mit einem Roti-Blue Coomassie-Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
Das Versuchsergebnis ist in 4 dargestellt. Eine erfolgreiche Konjugation wird durch die Migration der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten hin angezeigt. Die gesteigerte Bandenbreite ist auf die Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate sowie die Anzahl der mit dem Protein verknüpften HES-Derivate zurückzuführen.
Beispiel 6.6: Reaktion von oxidiertem Erythropoietin mit dem Reaktionsprodukt aus Beispiel 1.3 und der verknüpfenden Verbindung
Zu 50 nmol des HES-Derivats, das gemäß Beispiel 1.3 hergestellt wurde, bei Inkubationsbedingungen von 80°C und 17 h (Beispiel 1.3 a)) sowie von 25°C und 3 d (Beispiel 1.3 b)), und in 200 μl eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers (0,1 M. 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 7,2) gelöst ist, wurden 10 μl einer Lösung von 2,5 μmol AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) in DMSO zugesetzt. Die klare Lösung wurde 80 min lang bei bei 25°C und 20 min lang bei 40°C inkubiert. Der verbleibende AMAS wurde durch Zentrifugalfiltration mit einem VIVASPIN-0,5 ml-Konzentrator, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D), mit 13.000 U/min und 4-maliges Waschen für jeweils 30 min mit dem Phosphatpuffer entfernt.
Der verbleibenden Lösung wurden 15 μg ThioEPO, hergestellt gemäß Beispiel 5 (1 μg/μl in Phosphatpuffer), zugesetzt, und das Gemisch wurde 16 h lang bei 25°C inkubiert. Nach der Lyophilisation wurde das rohe Produkt mittels SDS-PAGE mit NuPAGE 10 Bis-Tris-Gelen/MOPS-Puffer (Invitrogen, Carlsbad, USA) analysiert, so wie dies in den von Invitrogen gelieferten Anleitungen beschrieben ist. Das Gel wird über Nacht mit einem Roti-Blue Coomassie-Färbereagenz (Roth, Karlsruhe, D) gefärbt.
Das Versuchsergebnis ist in 4 dargestellt. Eine erfolgreiche Konjugation wird durch die Migration der Proteinbande zu höheren Molekulargewichten hin angezeigt. Die gesteigerte Bandenbreite ist auf die Molekulargewichtsverteilung der verwendeten HES-Derivate sowie die Anzahl der mit dem Protein verknüpften HES-Derivate zurückzuführen.
Beispiel. 7: Präparative Herstellung von HES-EPO-Konjugaten
Zusammenfassung
HES-EPO-Konjugate wurden durch Koppeln von HES-Derivaten (mittleres MW von 18.000 Dalton; Hydroxyethyl-Substitutionsgrad von 0,4) an die teilweise (mit mildem Perjodat) oxidierten Sialinsäurereste an den Oligosaccharidketten von rekombinantem menschlichen EPO synthetisiert. Basierend auf der Analyse der Kohlehydratstruktur hatten die eingefügten Modifikationen keine Einfluss auf die Strukturintegrität der Kernoligosaccharidketten, da eine MALDI/TOF-MS der mild säurebehandelten HES-modifizierten Glykane intakte neutrale N-acetyllactosaminartige Ketten zeigte, die von jenen, die im unmodifizierten EPO-Produkt beobachtet wurden, nicht zu unterscheiden waren. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen an, dass beim EPO-Präparat, das der Modifikation ohne vorherige teilweise Sialinsäureentfernung unterzogen wurde, mindestens 3 modifizierte HES-Reste pro EPO-Molekül angefügt sind. Eine EPO-Variante, der in etwa 50 der Sialinsäurereste des vorherigen Proteins fehlten, wies im SDS-PAGE eine ähnliche offenkundig hohe Molekulargewichtsmobilität (60–110 KDa gegenüber 40 KDa für den BRP-EPO-Standard) auf. Das HES-modifizierte EPO ist unter Standardbedingungen der Ionenaustauschchromatographie bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 3 bis 10 stabil.
Der EPO-Bioassay am normocythämischen Maussystem zeigt an, dass das HES-modifizierte EPO in diesem Assay eine 2,5- bis 3,0- fach höhere spezifische Aktivität (IU/mg) aufweist, verglichen mit dem internationalen BRP-EPO-Referenzstandard, basierend auf Proteinbestimmung unter Verwendung des UV-Absorptionswerts der European Pharmacopeia und einem gegen das BRP-EPO-Standardpräparat kalibrierten Umkehrphasen-HPLC-EPO-Proteinbestimmungsverfahren.
Beispiel 7.1: Materialien und Methoden
(a) Freisetzung von N-verknüpften Oligosacchariden durch Verdau mit N-Glykosidase
Proben wurden mit 25 Einheiten (gemäß den Anleitungen des Herstellers, Roche Diagnostics, Deutschland) rekombinanter PNGase F über Nacht bei 37°C inkubiert. Der vollständige Verdau wurde über die spezifische Mobilitätsveränderung des Proteins im SDS-PAGE überwacht. Die freigesetzten N-Glykane wurden durch Zusetzen von 3 Volumen kaltem 100% Ethanol und Inkubieren mindestens 2 Stunden lang bei –20°C vom Polypeptid getrennt (Schroeter S et al., 1999). Das ausgefällte Protein wurde durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 4°C und 13.000 U/min entfernt. Das Pellet wurde dann zwei zusätzlichen Waschungen mit 500 μl eiskaltem 75% Ethanol unterzogen. Die Oligosaccharide in den vereinigten Überständen wurden in einer Vakuumzentrifuge (Speed Vac Concentrator, Savant Instruments Inc., USA) getrocknet. Die Glykanproben wurden unter Verwendung von Hypercarb-Cartridges (25 mg oder 100 mg HyperCarb) wie folgt vor Verwendung entsalzt: Die Säulen wurden mit 3 × 500 μl 80% Acetonitril (v/v) in 0,1% TFA gewaschen, gefolgt von Waschungen mit 3 × 500 μl Wasser. Die Proben wurden mit Wasser auf ein endgültiges Volumen von 300 μl bis 600 μl verdünnt, bevor sie auf die Cartridge geladen wurden, welche dann gründlich mit Wasser gewaschen wurde. Oligosaccharide wurden mit 1,2 ml (25-mg-Cartridges; 1,8 ml im Fall der 100-mg-Cartridges) 25% Acetonitril in Wasser, das 0,1% Trifluoressigsäure (v/v) enthielt, eluiert. Die eluierten Oligosaccharide wurden mit 2 M NH₄OH neutralisiert und in einem Speed-Vac-Konzentrator getrocknet. In einigen Fällen wurde das Entsalzen der durch N-Glykosidase freigesetzten Oligosaccharide mittels Adsorption des Verdaugemischs aus Proben < 100 μg des Gesamt(Glyko-)Proteins auf 100-mg-Hypercarb-Cartridges durchgeführt.
b) Analyse von Oligosacchariden durch Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Flugzeit-(Time-Of-Flight-)Massenspektrometrie (MALDI/TOF/TOF-MS)
Ein Bruker ULTRAFLEX Flugzeit-(TOF/TOF-)Instrument wurde verwendet: Native, desialylierte Oligosaccharide wurden unter Verwendung von 2,5-Dihydroxybenzoesäure als UV-absorbierendes Material sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus analysiert, wobei in beiden Fällen das Reflektron verwendet wurde. Für MS-MS-Analysen wurden ausgewählte Elternionen einer laserinduzierten Dissoziation (LID) unterzogen, und die erhaltenen Fragmentionen wurden durch die zweite TOF-Stufe (LIFT) des Instruments getrennt. Probenlösungen von 1 μl und mit einer Konzentration von in etwa 1–10 pmol·μl^-1 wurden mit gleichen Mengen der jeweiligen Matrix gemischt. Das Gemisch wurde auf ein Edelstahl-Target getüpfelt und vor der Analyse bei Raumtemperatur trocknen gelassen.
Beispiel 7.2: Herstellung und Charakterisierung von rekombinantem menschlichem EPO (EPO-GT-1)
EPO wurde aus rekombinanten CHO-Zellen exprimiert, so wie dies beschrieben wird (Mueller PP et al., 1999, Dorner AJ et al., 1984), und die Präparate wurden gemäß Verfahren, die in Eur. Phar. beschrieben sind (Ph. Eur. 4, Monography 01/2002: 1316: Erythropoietin concentrated solution), charakterisiert. Das Endprodukt wies einen Sialinsäuregehalt von 12 nMol (+/–1,5 nMol) pro nMol des Proteins auf. Die Strukturen von N-verknüpften Oligosacchariden wurden durch HPAEC-PAD und MALDI/TOF-MS bestimmt, so wie dies beschrieben wird (Nimtz et al., 1999, Grabenhorst, 1999). Die erhaltenen EPO-Präparate enthielten di-, tri- und tetrasialylierte Oligosaccharide (2–12%, 15–28% bzw. 60–80%, sulfatisierte und pentasialylierte Ketten waren in geringen Mengen vorhanden). Die allgemeinen Glykosylierungsmerkmale von EPO-Präparaten ähnelten jenen des internationalen BRP-EPO-Standardpräparats.
Das isoelektrische Fokussierungsmuster des rekombinanten EPO war mit jenem des internationalen BRP-Referenz-EPO-Standardpräparats vergleichbar, das die entsprechenden Isoformen aufweist. 25% des EPO-Proteins fehlte die O-Glykosylierung an Ser₁₂₆ der Polypeptidkette.
Beispiel 7.3: Herstellung von teilweise desialylierten EPO-Formen
EPO-GT-1-Protein (2,84 mg/ml) wurde in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, auf 80°C erwärmt, und anschließend wurden 100 μl 1 N H₂SO₄ pro 1 ml der EPO-Lösung zugesetzt; die Inkubation wurde für 5 min, 10 min bzw. 60 min fortgeführt, wodurch EPO-Präparate mit unterschiedlichem Sialylierungsgrad erhalten wurden. Die Quantifizierung von Oligosacchariden mit 0–4 Sialinsäuren wurde nach der Freisetzung der Oligosaccharide mit Polypeptid-N-Glykosidase durchgeführt, und die Isolierung von N-verknüpften Ketten wurde durch Entsalzen unter Verwendung von Hypercarb-Cartridges (25 mg HyperSep Hypercarb; ThermoHypersil-Keystone, UK) durchgeführt. Die EPO-Präparate wurden durch Zusetzen von 1 N NaOH neutralisiert, in flüssigem N₂ eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.
Beispiel 7.4: Perjodatoxidation von sialylierten EPO-Formen
Zu 10 mg unbehandeltem oder mild säurebehandeltem EPO, das in 3,5 ml 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, gelöst war, wurden 1,5 ml 0,1 M Na-Acetatpuffer, pH-Wert 5,5, zugesetzt, und das Gemisch wurde in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt; 500 μl 10 M Na-Perjodat wurden zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 60 min lang bei 0°C im Dunkeln gehalten. Dann wurden 10 μl Glycerol zugesetzt, und die Inkubation wurde weitere 10 min lang im Dunkeln fortgeführt. Die teilweise oxidierten EPO-Formen wurden durch Entsalzen von den Reagenzien getrennt, und zwar unter Verwendung von VIVASPIN-Konzentratoren (10.000 MWCO, PES Vivascience AG, Hannover, Deutschland) gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit 3.000 U/min in einer Laborzentrifuge, die mit einem Festwinkelrotor ausgestattet war. Nach dem Einfrieren in flüssigem Stickstoff wurden die EPO-Präparate in einem endgültigen Volumen von 4 ml bei –20°C gelagert.
100-μg-Aliquote des teilweise oxidierten EPO-Präparats wurden einer N-Glykosidasebehandlung unterzogen, und Oligosaccharide wurden unter Verwendung von Hypercarb-Cartridges so wie beschrieben isoliert. Die Oligosaccharide wurden durch milde Säurebehandlung desialyliert und mittels HPAEC-PAD analysiert, und ihre Verweilzeiten wurden mit jenen von authentischen Standard-Oligosacchariden verglichen, so wie dies beschrieben ist (Nimtz et al., 1990 und 1993).
Beispiel 7.5: Reduktion von EPO-Disulfiden mit Dithioetreitol
5 mg EPO-GT-1 wurden in 5 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH-Wert 8,1, in Gegenwart von 30 mM Dithioetreitol (DTT) 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert; die Entfernung des DTT wurde unter Verwendung eines Vivaspin-Konzentrators bei 4°C, 4 Zyklen Pufferwechsel, erzielt. Das fertige reduzierte EPO-Präparat wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und in 50 mM Na-Acetatpuffer, pH-Wert 5,5, bei –20°C gelagert.
Beispiel 7.6: EPO-Proteinbestimmung
Die quantitative Bestimmung von EPO-Protein wurde durch Messen der UV-Absorption bei 280 nm gemäß Eur. Phar. (European Pharmacopeia 4, Monography 01/2002: 1316: erythropoietin concentrated solution) in einer Küvette mit 1 cm Weglänge durchgeführt. Außerdem wurde EPO durch Anwenden eines Umkehrphasen-HPLC-Verfahrens unter Verwendung einer RP-C4-Säule (Vydac Protein C4, Cat.# 214TP5410, Grace Vydac, CA, US) quantifiziert; das HPLC-Verfahren wurde unter Verwendung des Erythropoietin-BRP-1-Referenzstandards kalibriert (European Pharmacopeia, Conseil de I'Europe B. P. 907-F67029, Strasbourg Cedex 1).
Beispiel 7.7: Oxidation von desialyliertem EPO mit Galactose-Oxidase
4,485 mg vollständig desialyliertes EPO wurden in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH-Wert 6,8, in Gegenwart von 16 μl Katalase (6214 Einheiten/200 ml) und 80 μl Galactose-Oxidase (2250 Einheiten/ml aus Dactylium dendroides (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland)) inkubiert; die Inkubation erfolgte bei 37°C über Nacht; zweimal 20 μl Galaktose-Oxidase wurden nach 4 Stunden und nach 8 Stunden ab Start der Inkubation zugesetzt.
Beispiel 7.8: EPO-Probenvorbereitung für Bioassays
Reinigung von EPO aus Inkubationen von perjodat- oder galactoseoxidaseoxidierten EPO-Proteinpräparaten mit aktivierter HES
Die Reinigung von EPO-Proben (Entfernen von unreagierten HES-Derivaten) wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die EPO-Inkubationsgemische (etwa 5 mg EPO-Protein) wurden mit Puffer A (20 mM N-Morpholinpropansulfonsäure [MOPS/NaOH] in H₂O bidest, pH-Wert 8,0) in einem Verhältnis von 1:10 verdünnt und auf eine Säule aufgebracht, die 3 ml Q-Sepharose HP (Pharmacia Code-Nr. 17-1014-03, Los-Nr. 220211) enthielt, äquilibriert mit 10 Säulenvolumen (CV) Puffer A, unter Verwendung einer Flussrate von 0,5 ml/min. Die Säule wurde mit 6–8 CV Puffer A (Flussrate = 0,8 ml/min.) gewaschen, und die Elution wurde unter Verwendung von Puffer B (20 mM Morpholinethansulfonsäure [MES/NaOH], 0,5 M NaCl in H₂O bidest, pH-Wert 6,5) mit einer Flussrate von 0,5 ml/min durchgeführt. Das EPO wurde mittels UV-Absorption bei 280 nm nachgewiesen und in etwa 6 ml eluiert. Die Säule wurde unter Verwendung von 3 CV Puffer C (20 mM MES, 1,5 M NaCl in H₂O, eingestellt auf einen pH-Wert von 6,5) regeneriert und unter Verwendung von 10 CV Puffer A (Flussrate = 0,7 ml/min.) erneut äquilibriert.
Der Pufferaustausch von EPO-Eluaten, die aus dem Q-Sepharoseschritt erhalten wurden, wurde unter Verwendung von VivaspinKonzentratoren und phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit je 3 Zentrifugationszyklen pro Probe durchgeführt; die Proben wurden mit PBS auf 2 ml eingestellt und bei –20°C gelagert.
Nur < 25% der teilweise desialylierten und anschließend mild perjodatoxidierten EPO-Formen, die einer HES-Modifikation unterzogen worden waren, wurden aus dem Q-Sepharose-Eluat gewonnen, da die basischen EPO-Formen unter den eingesetzten Bedingungen die Q-Sepharose nicht banden, sondern gemeinsam mit, unreagierten HES-Derivaten im Durchfluss zu finden waren.
Beispiel 7.9: HPAEC-PAD – Anionenaustauschchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (High-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection)
Gereinigte native und desialylierte Oligosaccharide wurden durch Anionenaustauschchromatographie bei hohen pH-Werten (HPAEC) unter Verwendung eines Dionex-BioLC-Systems (Dionex, USA), ausgerüstet mit einer CarboPac-PA1-Säule (0,4 × 25 cm) in Kombination mit einem Detektor zur gepulsten amperometrischen Detektion (PAD), analysiert (Schröter et al., 1999; Nimtz et al., 1999). Die Detektorpotentiale (E) und Pulsdauern (T) waren wie folgt: E1: +50 mV, T1: 480 ms; E2: +500 mV, T2: 120 ms; E3: –500 mV, T3: 60 ms, und der Ausgabebereich war 500–1500 nA. Die Oligosaccharide wurden dann auf die CarboPac-PA1-Säule injiziert, die mit 100% Lösungsmittel A äquilibriert worden war.
Für desialylierte Oligosaccharide wurde die Elution (Flussrate: 1 ml·min^–1) durchgeführt, indem ein linearer Gradient (0–20%) des Lösungsmittels B über einen Zeitraum von 40 min hinweg, gefolgt von einer linearen Zunahme von 20–100% des Lösungsmittels B über 5 min hinweg, angewendet wurde. Lösungsmittel A war 0,2 M NaOH in bidestilliertem H₂O, Lösungsmittel B bestand aus 0,6 M NaOAc in Lösungsmittel A. Für native Oligosaccharide wurde die Säule mit 100% Lösungsmittel C (0,1 M NaOH in bidestilliertem H₂O) äquilibriert, und die Elution (Flussrate: 1 ml·min^–1) wurde durchgeführt, indem ein linearer Gradient (0–35%) des Lösungsmittels D über einen Zeitraum von 48 min hinweg, gefolgt von einer linearen Zunahme von 35–100% des Lösungsmittels D über 10 min hinweg, angewendet wurde. Lösungsmittel D bestand aus 0,6 M NaAc in Lösungsmittel C.
Beispiel 7.10: Analyse der Monosaccharidzusammensetzung von N-Glykanen, HES-modifizierten N-Glykanen und EPO-Protein durch GC-MS
Monosaccharide wurden als die entsprechenden Methylglykoside nach Methanolyse, N-Reacetylierung und Trimethylsilylierung durch GC/MS analysiert [Chaplin, M. F. (1982) A rapid and sensitiv method for the analysis of cabohydrate. Anal. Biochem. 123, 336–341]. Die Analysen wurden an einem Finnigan-GCQ-Ionenfallen-Massenspektrometer (Finnigan MAT corp., San Jose, CA) durchgeführt, das im positiven Ionen-EI-Modus lief und mit einer 30-m-DB5-Kapillarsäule ausgestattet war. Temperaturprogramm: 2 min isotherm bei 80°C, danach 10 Grad min^–1 bis 300°C.
Monosaccharide wurden anhand ihrer Verweilzeit und ihres charakteristischen Fragmentierungsmusters identifiziert. Die unkorrigierten Ergebnisse der elektronischen Peak-Integration wurden für die Quantifizierung herangezogen. Monosaccharide, die aufgrund von Anomerie und/oder der Gegenwart von furanoiden und pyranoiden Formen mehr als einen Peak ergaben, wurden durch Addieren aller größeren Peaks quantifiziert. 0,5 μg Myo-Inosit wurden als interne Standardverbindung verwendet.
Beispiel 7.11: Ergebnisse
Beispiel 7.11(a): Charakterisierung von N-Glykanen von mild säurebehandeltem (teilweise desialyliertem) EPO-GT-1
EPO-GT-1-Präparate, die 5, 10 oder 60 min lang einer milden Säurebehandlung unterzogen worden waren, wurden vor und nach der Freisetzung von N-verknüpften Oligosacchariden durch Inkubation mit N-Glykosidase mittels SDS-PAGE analysiert, wie in 5 dargestellt ist. N-verknüpfte Oligosaccharide wurden einer HPAEC-PAD-Oligosaccharid-Kartierung unterzogen (6). Das unbehandelte EPO-GT-1 enthielt > 90% N-verknüpfte Oligosaccharide mit 3 oder 4 Sialinsäureresten, während nach 5 min Inkubation in Gegenwart von milder Säure < 40% der Kohlehydratketten 3 oder 4 Sialinsäurereste aufwiesen. Die HPAEC-PAD der desialylierten N-Glykane zeigte, dass das Verhältnis von neutralen Oligosacchariden, die für das unbehandelte EPO-GT-1 nachgewiesen wurden, in den Präparaten, die 5, 10 oder 60 min lang einer Säurebehandlung unterzogen wurden, stabil blieb. Die MALDI/TOF-MS der desialylierten Glykane zeigte, dass nach einer milden Säurebehandlung des Proteins < 90% der proximalen Fucose vorhanden war.
Beispiel 7.11(b): Charakterisierung von perjodatbehandeltem EPO-GT-1
Die SDS-PAGE-Mobilität von mild perjodatbehandelten EPO-Formen, die zuvor einer 5- und einer 10-minütigen Behandlung mit Säure unterzogen wurden oder nicht behandelt wurden, sind in 8 miteinander verglichen. Die Bedingungen, die für die Perjodatoxidation von Sialinsäuren verwendet wurden, veränderten das SDS-PAGE-Muster der EPO-Präparate nicht (vergleiche 5). Die Oxidation von Sialinsäuren führte zu einer Veränderung der Oligosaccharide in der HPAEC-PAD-Analyse hin zu früheren Elutionszeiten (vergleiche die 6 und 9).
Beispiel 7.11(c): Charakterisierung von HES-modifizierten EPO-Derivaten
(aa) Zeitverlauf der HES-Modifikation von EPO-GT-1-A mit hydroxylaminmodifiziertem HES-Derivat X, hergestellt gemäß Beispiel 2.4
400 μg hydroxylaminmodifiziertes HES-Derivat X wurden zu 20 μg EPO-GT-1-A (mild perjodatoxidiertes EPO, vor der milden Perjodatoxidation nicht säurehydrolysiert) in 20 μl 0,5 M NaOAc-Puffer, pH-Wert 5,5, zugesetzt, und die Reaktion wurde nach 30 min, 2, 4 bzw. 17 Stunden durch Einfrieren von Proben in flüssigem Stickstoff gestoppt. Anschließend wurden die Proben bis zur weiteren Analyse bei –20°C gelagert.
Ein SDS-PAGE-Probenpuffer wurde zugesetzt, und die Proben wurden auf 90°C erwärmt und auf SDS-Gele aufgebracht. Wie in 10 gezeigt ist, führte die Verlängerung der Inkubationszeiten zu einer stärkeren Veränderung hin zu höherem Molekulargewicht des Proteins. Nach 17 Stunden der Inkubation in Gegenwart des hydroxylaminmodifizierten HES-Derivats X wurde eine diffuse Coomassie-gefärbte Proteinbande nachgewiesen, die in einem Bereich zwischen 60 und 11 KDa wanderte, basierend auf der Position der Molekulargewichtsstandards (siehe linker Abschnitt von 10). Nach der Behandlung mit N-Glykosidase wurde der Großteil des Proteins zur Position von de-N-glykosyliertem EPO hin verändert (siehe 10, rechtes Gel; Pfeil A zeigt die Migrationsposition von N-Glykosidase an, Pfeil B zeigt die Migrationsposition von de-N-glykosyliertem EPO an; die diffuse Proteinbande, im Bereich zwischen den 28-KDa- und 36-KDa-Molekulargewichtsstandards zu sehen ist, stellt vermutlich EPO-Formen dar, die durch HES und die O-Glykosylierungsstelle des Moleküls modifiziert sind). Angesichts der Spezifität von N-Glykosidase ist aus diesem Ergebnis zu schließen, dass in der Tat eine HES-Modifikation an den perjodatoxidierten Sialinsäureresten des Glykans des EPO-Proteins stattfindet.
(bb) Charakterisierung von HES-EPO-Konjugaten
HES-EPO-Konjugate I (aus EPO-GT-1 nach milder Perjodatoxidation, d. h. aus EPO-GT-1-A), II (aus EPO-GT-1, das 5 min lang einer Säurehydrolyse und einer milden Perjodatoxidation unterzogen wurde), III (aus EPO-GT-1, das 10 min lang einer Säurehydrolyse und einer milden Perjodatoxidation unterzogen wurde) wurden so wie zuvor beschrieben synthetisiert. Eine Kontrollinkubation (K), die unmodifiziertes EPO-GT-1 unter den gleichen Pufferbedingungen enthielt und der eine gleichwertige Menge unmodifizierte HES zugesetzt wurde, wurde ebenfalls mit eingeschlossen. Die Inkubationsgemische wurden für eine nachfolgende biochemische Analyse der HES-EPO-Derivate einer weiteren Reinigung unterzogen.
Die Inkubationen der HES-EPO-Konjugate I, II und III sowie die Kontrollinkubation K wurden einem Q-Sepharose- Reinigungsschritt unterzogen, so wie unter ”Material und Methoden” (Beispiel 7.8) beschrieben ist, um den Überschuss an unreagiertem HES-Reagenz, der im Durchfluss der Ionenaustauschsäule zu erwarten war, zu entfernen. Aufgrund der großen Mengen an basischen EPO-Formen, die in den zuvor säurebehandelten Proben II und III enthalten waren, waren beträchtliche Mengen an modifiziertem EPO-Produkt aus diesen Inkubationen im Durchfluss zu erwarten. Wie in 11 dargestellt ist, wurde fast das gesamte EPO-Material aus den Proben I von der Q-Sepharosesäule zurückgehalten, während nur etwa 20–30% der Proben III und II in der mit hoher Salzkonzentration eluierenden Fraktion rückgewonnen wurden. Sowohl im Durchfluss als auch in den mit hoher Salzkonzentration eluierenden Fraktionen hatte das gesamte Proteinmaterial aus den Inkubationen mit HES-Derivat X, verglichen mit dem Kontroll-EPO, offenkundig im SDS-PAGE ein höheres Molekulargewicht.
Zum Zwecke einer detaillierteren Charakterisierung des HES-modifizierten EPO wurden die Proben A und K (siehe 11) mit der perjodatoxidierten Form EPO-GT-1-A verglichen. Die Proben wurden einer N-Glykosidasebehandlung unterzogen, und die Freisetzung von N-Glykanen führte zu den zwei Banden von niedrigem Molekulargewicht an der Position der O-glykosylierten und nicht glykosylierten EPO-Formen des Standard-EPO-Präparats, wie in den 12a und 12b dargestellt ist. Im Fall der Probe A wurde eine weitere Bande nachgewiesen, die an der Position des 28-KDa-MW-Standards wanderte, was auf eine HES-Modifikation am O-Glykan dieser EPO-Variante hinweist (vgl. Beispiel 7.11 (c)(aa)). Diese Bande (und auch die stark HES-modifizierte Form von hohem MW des N-glykosylierten EPO, siehe 12a und 12b) verschwand, nachdem die Proben einer milden Hydrolyse unterzogen wurden, was sich mit der Auffassung deckt, dass eine HES-Modifikation an den perjodatoxidierten Sialinsäureresten von Erythropoietin erzielt worden war.
Aliquote der N-Glykosidase-Inkubationsgemische wurden unter Verwendung von Bedingungen, die die vollständige Entfernung von Sialinsäureresten (und auch der sialinsäureverknüpften HES-Derivate) von Oligosacchariden ermöglichen, hydrolysiert; nach der Neutralisierung wurden die Gemische zum Entsalzen auf kleinen Hypercarb-Säulen absorbiert. Die Säulen wurden gründlich mit Wasser gewaschen, gefolgt von einer Elution von gebundenen neut ralen Oligosacchariden mit 40% Acetonitril in H₂O, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt. Die erhaltenen Oligosaccharide wurden einer MALDI/TOF-MS unterzogen. Die Spektren der desialylierten Oligosaccharidfraktionen von Probe A, EPO-GT-1-A und Probe K wiesen identische Massen für komplexartige Oligosaccharide bei m/z = 1810 Da (diantennär), 2174 = triantennär, 2540 = tetraantennär, 2906 = tetraantennär plus 1 N-Acetyllactosamin-Wiederholung und 3271 = tetraantennär plus 2 N-Acetyllactosamin-Wiederholung auf; kleine Signale, die einem Mangel an Fucose (–146) und Galactose (minus 162) entsprechen, wurden nachgewiesen und können auf die Bedingungen der Säurehydrolyse, die für die Entfernung der Sialinsäure eingesetzt wurden, zurückgeführt werden (siehe MALDI-Figuren 15, 16 und 17).
In einem Parallelexperiment wurde das N-Glykosidase-Verdaugemisch auf eine 1-ml-RP-C18-Cartridge (ohne vorherige Säurehydrolyse der Oligosaccharide) absorbiert, und die Elution wurde mit 5% Acetonitril in Wasser, das 0,1% TFA enthielt, durchgeführt; unter diesen Bedingungen wurde das EPO-Protein vollständig am RP-Material zurückgehalten, und Oligosaccharide wurden mit 5% Acetonitril in H₂O, das 0,1% TFA enthielt, aus der Säule gewaschen. Das de-N-glykosylierte EPO-Protein wurde mit 70% Acetonitril in Wasser, das 0,1% TFA enthielt, eluiert. Die Oligosaccharidfraktionen aus dem RP-C18-Schritt von der N-glykosidasebehandelten Probe A, EPO GT-1-A und Probe K wurden neutralisiert und unter Verwendung von Hypercarb-Cartridges so wie oben beschrieben entsalzt. Die isolierten Oligosaccharide wurden vor (siehe 13) und nach einer milden Säurebehandlung unter Bedingungen, die die quantitative Entfernung von Sialinsäuren von Glykanen ermöglichten, einer HPAEC-PAD-Kartierung unterzogen (siehe 14).
Das HPAEC-PAD-Profil für das native Material, das von der HES-modifizierten Probe A erhalten wurde, wies nur vernachlässigbare Signale für Oligosaccharide auf, während EPO-GT-1-A-abgeleitete Oligosaccharide das gleiche Glykanprofil wie das in 9 gezeigte aufwiesen (Probe bezeichnet als EPO-GT-1 nach milder Perjodatbehandlung). Das Elutionsprofil von Oligosacchariden, die von der Kontroll-EPO-Probe (K) erhalten wurden, ergab das erwartete Muster (vergleiche das Profil in 6). Zum Vergleich hiermit ist das native Oligosaccharidprofil des internationalen BRP-EPO-Standards zum Vergleich und als Referenzstan dard mit eingeschlossen.
Nach einer milden Säurehydrolyse hatten alle Oligosaccharidpräparate ein identisches Elutionsprofil neutraler Oligosaccharidstrukturen (siehe 14) mit der erwarteten qualitativen und quantitativen Zusammensetzung aus di-, tri- und tetraantennären, komplexartigen Kohlehydratketten, wie im Abschnitt über die Methoden zur Herstellung von EPO, das in der vorliegenden Studie als Ausgangsmaterial verwendet wurde, beschrieben ist. Dieses Ergebnis stellt unter Beweis, dass die HES-Modifikation der EPO-Probe zu einer kovalenten Bindung des HES-Derivats führt, die durch N-Glykosidase vom EPO-Protein abgelöst ist und säurelabil ist, da sie unter Verwendung von milden Säurebehandlungsbedingungen, von denen bekannt ist, dass sie Kohlehydrate desialylieren, vom N-Glykan entfernt wird (siehe 12a + b).
(cc) Analyse der Monosaccharidzusammensetzung von HES-EPO und HES-EPO-N-Glykanen durch GC-MS
Zur weiteren Bestätigung der HES-Modifikation von EPO an den N-Glykanen des Moleküls wurden EPO-Proben mit N-Glykosidase verdaut, und das EPO-Protein wurde auf RP-C18-Cartridges adsorbiert, wohingegen Oligosaccharidmaterial wie oben beschrieben abgewaschen wurde. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, wurden Glucose und hydroxyethylierte Glucosederivate nur in jenem EPO-Protein, das einer HES-Modifikation an Cysteinresten unterzogen worden war, und in Oligosaccharidfraktionen von EPO-Probe A2 nachgewiesen.
Beispiel 7.11(d): In-vivo-Assay der biologischen Aktivität von HES-modifiziertem EPO
Der EPO-Bioassay am normocythämischen Maussystem wurde gemäß dem in European Pharmacopeia beschriebenen Verfahren durchgeführt; das Labor, das den EPO-Assay durchführte, verwendete das internationale BRP-EPO-Referenzstandardpräparat. Für das HES-modifizierte EPO-A2-Präparat wurde ein mittlerer Wert der spezifischen Aktivität von 294.600 Einheiten pro mg EPO an Protein bestimmt, was eine in etwa 3-fach höhere spezifische Aktivität als beim internationalen BRP-EPO-Referenzstandardpräparat, das in den für die Aktivitätsassays eingesandten Proben mit eingeschlossen war, anzeigt.
Die Ergebnisse der Studie sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
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Tabelle 2 Analyse der Monosaccharidzusammensetzung von Glykanen aus HES-modifizierten EPO- und Kontrollproben

**	I.	II.	III.	III.	IV.	V.	VI.
Monosaccharide	Glykane aus A2	Glykane aus EPO-GT-1A	Glykane aus K2	Glykane aus A2	Glykane aus EPO-GT-1A	Glykane aus K2	cysteinmodifiziertes EPO-Protein*
Fucose	1.935	3.924	2.602	2.246	4.461	2.601	2.181
Mannose	6.028	11.020	9.198	6.379	11.668	6.117	6.260
Galactose	8.866	19.935	14.427	10.570	16.911	11.555	10.386
Glucose	17.968	-	-	21.193	Spuren	Spuren	33.021
GlcNAc	7.839	21.310	14.440	11.360	15.953	10.503	10.498
GlcHe1	5.583		-	5.926		-	14.857
GlcHe2	1.380		-	1.552	-	-	3.775
NeuNAc	5.461	822	4.540	3.895	4.871	13.562	13.003
Inosit	1.230	2.310	1.620	2.050	1.320	1.134	1.087
* das Äquivalent von Cys-HES-modifiziertem EPO-Protein wurde einer Zusammensetzungsanalyse unterzogen; das EPO-Protein wurde durch Chromatographie an einer Q-Sepharose-Säule wie oben beschrieben aus dem HES-Inkubations gemisch isoliert und durch Zentrifugieren unter Verwendung einer Vivaspin-5-Trennvorrichtung entsalzt.
** Monosaccharidbestimmungen wurden aus einzelnen GC-Durchläufen der pertrimethylsilylierten Methylglykoside durchgeführt; die Werte der elektronischen Integration von Peaks sind ohne Korrektur für Verluste während des Derivatisierungsverfahrens und Rückgewinnungen einer jeden Verbindung angegeben.

Tabelle 3

Proben-Nr.	Probenbeschreibung	Berechnete spezifische Aktivität der EPO-Probe (basierend auf A280 nm und RP-HPLC-Bestimmung)
850247	1. HES-modifiziertes EPO A2	344.000 U/mg
850248	2. EPO-GT-1-A	82.268 U/mg
850249	3. Kontroll-EPO K2	121.410 U/mg
850250	4. BRP-EPO-Standard	86.702 U/mg
850251	1. verdünnt mit 4 Volumen PBS	309.129 U/mg
850252	2. verdünnt mit 4 Volumen PBS	94.500 U/mg
850253	3. verdünnt mit 4 Volumen PBS	114.100 U/mg
850254	4. verdünnt mit 4 Volumen PBS	81.200 U/mg
850255	1. verdünnt mit 4 Volumen PBS	230.720 U/mg

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Hydroxyalkylstärkederivat, erhältlich durch ein Verfahren umfassend das Umsetzen von Hydroxyalkylstärke (HAS) der Formel (I), wobei R₁, R₂ und R₃ unabhängig Wassserstoff oder eine lineare oder verzweigte Hydroxyalkylgruppe sind
an ihrem reduzierenden Ende, welches vor der Reaktion nicht oxidiert ist, mit einer Verbindung der Formel (II) R'-NH-R'' (II)durch reduktive Aminierung über die NH-Gruppe, die R' und R'' verbrückt, um ein erstes Hydroxyalkylstärkederivat zu ergeben, wobei R' H ist, und R'' eine funktionelle Gruppe X umfasst, welche die chemische Struktur -NH- umfasst und welche fähig ist, mit einer weiteren Verbindung vor oder nach der Reaktion von (I) und (II) umgesetzt zu werden, wobei das Verfahren weiterhin ein Umsetzen des ersten Hydroxyalkylstärkederivats mit einer weiteren Verbindung über Reaktion der funktionellen Gruppe X mit einer funktionellen Gruppe V, die in der weiteren Verbindung umfasst ist, umfasst, um ein zweites Hydroxyalkylstärkederivat zu ergeben, wobei die weitere Verbindung eine verknüpfende Verbindung ist umfassend die funktionelle Gruppe V, welche ein aktivierter Ester ist, der fähig ist, mit der im ersten Hydroxyalkylstärkederivat umfassten funktionellen Gruppe X umgesetzt zu werden, und umfassend eine weitere funktionelle Gruppe, welche fähig zum Bilden einer chemischen Verknüpfung mit einer in einer zweiten weiteren Verbindung umfassten -SH-Gruppe ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach Anspruch 1, wobei die Hydroxyalkylstärke Hydroxyethylstärke ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die reduktive Aminierung bei einer Temperatur von 25 bis 90°C durchgeführt wird.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Reaktionszeit der reduktiven Aminierung im Bereich von 2 h bis 7 d ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei in der reduktiven Aminierung der pH im Bereich von 8 bis 12 ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach Anspruch 5, wobei der pH durch Zufügen eines Boratpuffers eingestellt wird.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei abgesehen von der funktionellen Gruppe X, R'' keine zusätzliche funktionelle Gruppe W umfasst, die direkt mit der NH-Gruppe verknüpft ist, mit der R' verknüpft ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, wobei die funktionelle Gruppe X eine NH₂-Gruppe ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, wobei die NH-Gruppe, die R' und R'' verbrückt, von der funktionellen Gruppe X durch eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Cycloalkyl- oder Aryl- oder Aralkyl- oder Arylcycloalkyl- oder Alkaryl- oder Cycloalkylarylgruppe mit von 1 bis 60 Kohlenstoffatomen getrennt ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 9, wobei die NH-Gruppe, die R' und R'' verbrückt, von der funktionellen Gruppe X durch eine Alkylkette mit von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen getrennt ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 10, wobei die funktionelle Gruppe V ein N-Succinimidester ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach Anspruch 11, wobei die weitere funktionelle Gruppe, welche fähig zum Bilden einer chemischen Verknüpfung mit der in der zweiten weiteren Verbindung umfassten -SH-Gruppe ist, eine Iodalkyl-, eine Bromalkyl-, eine Maleimido-, eine Pyridylthio- oder eine Vinylsulfongruppe ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach Anspruch 11, wobei die weitere funktionelle Gruppe, welche fähig zum Bilden einer chemischen Verknüpfung mit der in der zweiten weiteren Verbindung umfassten -SH-Gruppe ist, eine Maleimidogruppe ist.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 13, wobei die zwei funktionellen Gruppen der verknüpfenden Verbindung durch eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Cycloalkyl- oder Aryl- oder Aralkyl- oder Arylcycloalkyl- oder Alkaryl- oder Cycloalkylarylgruppe mit von 1 bis 60 Kohlenstoffatomen getrennt sind.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 14, wobei die zwei funktionellen Gruppen der verknüpfenden Verbindung durch eine Alkyl- oder Aralkylkette mit von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen getrennt sind.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15, wobei die verknüpfende Verbindung GMBS(N-gamma-Maleimidobutyryloxysuccinimidester) ist
Hydroxyalkylstärkederivat nach Anspruch 1, wobei die Hydroxyalkylstärke Hydroxyethylstärke ist, erhältlich durch ein Verfahren umfassend das Umsetzen von Verbindung (I)
an ihrem reduzierenden Ende, welches vor der Reaktion nicht oxidiert ist, mit einer Verbindung der Formel (II), wo R' H ist R'-NH-R'' (II)durch reduktive Aminierung über die NH-Gruppe, die R' und R'' verbrückt, um ein erstes Hydroxyalkylstärkederivat zu ergeben, wobei R'' eine funktionelle Gruppe -NH₂ umfasst, welche von der NH-Gruppe, die R' und R'' verbrückt, durch eine Alkylkette mit von 2 bis 4 Kohlenstoffatomen getrennt ist, wobei das Verfahren weiterhin ein Umsetzen des ersten Hydroxyalkylstärkederivats über funktionelle Gruppe NH₂ umfasst, die in R'' umfasst ist, mit einer N-Succinimidestergruppe einer verknüpfenden Verbindung
welche fähig zum Bilden einer chemischen Verknüpfung mit einer in einer zweiten weiteren Verbindung umfassten -SH-Gruppe ist, um ein zweites Hydroxyalkylstäwkederivat zu ergeben.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Verfahren weiterhin ein Umsetzen des zweiten Hydroxyalkylstärkederivats mit der -SH-Gruppe der zweiten weiteren Verbindung umfasst, um ein drittes Hydroxyalkylstärkederivat zu ergeben.
Hydroxyalkylstärkederivat nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 18, wobei die zweite weitere Verbindung ein Polypeptid ist, umfassend mindestens 2 Aminosäuren, die über eine Peptidbindung verknüpft sind.